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Universidade Federal da Paraiba
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica
Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos
HELOINA DE SOUSA FALCÃO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DO EXTRATO ETANÓLICO
BRUTO E FASE CLOROFÓRMICA OBTIDOS DAS PARTES AÉREAS DE Praxelis
clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson EM MODELOS ANIMAIS
João Pessoa - PB
2007
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HELOINA DE SOUSA FALCÃO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DO EXTRATO ETANÓLICO
BRUTO E FASE CLOROFÓRMICA OBTIDOS DAS PARTES AÉREAS DE Praxelis
clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson EM MODELOS ANIMAIS
ORIENTADORA: Profa. Dra. Leônia Maria Batista
João Pessoa - PB
2007
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos do Laboratório de Tecnologia
Farmacêutica Prof. Delby Fernandes de
Medeiros da Universidade Federal da Paraíba
como requisito para a obtenção do título de
mestre em Farmacologia.
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F178a
Falcão, Heloina de Sousa.
Avaliação da atividade antiulcerogênica do extrato
etanólico bruto e fase clorofórmica obtidos das partes aéreas
de Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson em
modelos animais. Heloina de Sousa Falcão. – João Pessoa,
2007.
110 p.: il.
Orientadora: Leônia Maria Batista
Dissertação (mestrado) – UFPB/LTF
1. Produtos naturais. 2. Praxelis clematidea – Planta
medicinal. 3. Praxelis clematidea - Atividade antiulcerogênica.
UFPB/BC
CDU: 547.9 (043)
HELOINA DE SOUSA FALCÃO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DO EXTRATO ETANÓLICO
BRUTO E FASE CLOROFÓRMICA OBTIDOS DAS PARTES AÉREAS DE Praxelis
clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson EM MODELOS ANIMAIS
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Profa. Dra. Leônia Maria Batista
Orientadora - UFPB
____________________________________
Profa. Dra. Liana Clébia Soares Lima de Morais
Examinadora interna - UFPB
____________________________________
Profa. Dra. Teresinha Gonçalves da Silva
Examinadora externa – Departamento de Antibióticos - UFPE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos do Laboratório de Tecnologia
Farmacêutica Prof. Delby Fernades de
Medeiros da Universidade Federal da Paraíba
como requisito para a obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
“Porque na muita sabedoria há muito enfado;
e o que aumenta em ciência, aumenta em trabalho.”
(Eclesiastes 1:18)
Dedico esse trabalho aos meus pais (Manoel Falcão e Zilda Falcão),
irmão e cunhada (Emanuel Falcão e Viviane Medeiros)
e sobrinho (Henrique Falcão).
A
AA
AGRADECIMENTOS
GRADECIMENTOSGRADECIMENTOS
GRADECIMENTOS
A todos os meus familiares pelo apoio, compreensão e até mesmo pela ajuda
durante a elaboração deste trabalho;
À Profa. Dra. Leônia M. Batista pela orientação, incentivo e apoio;
À equipe de pesquisa em úlcera gástrica – Juliana Moura, Jacqueline Alves, Igara
Lima, Sabrina Melo, Guilherme Eduardo, Vanda Lúcia Santos e Kelly Lira – por ter
compartilhado os momentos alegres e difíceis durante todo o desenvolvimento
dessa pesquisa.
À Profa. Dra. Alba R. M. Souza Brito e sua equipe de pesquisa em úlcera gástrica da
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) por terem contribuído para a
realização deste trabalho;
Ao Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho por ter fornecido o material fitoquímico para a
investigação farmacológica;
À Profa. Dra. Maria de Fátima Agra por ter se disponibilizado em identificar a espécie
vegetal em estudo;
À Profa. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz e sua equipe de pesquisa por
terem dividido o espaço físico do laboratório para que a nossa equipe trabalhasse;
A todos os funcionários do LTF por proporcionar condições de trabalho para a
realização dessa pesquisa;
À Fundação de Apoio às Pesquisas do Estado da Paraíba (FAPESQ), pelo suporte
financeiro ao nosso grupo de pesquisa.
RESUMO
RESUMORESUMO
RESUMO
Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Rob., espécie pertencente a
família Asteraceae, é uma erva nativa da América do Sul e no Brasil é encontrada
nos estados do Mato Grosso, Bahia, Alagoas, Paraíba e Pernambuco. Não
apresenta indicação terapêutica popular, no entanto, é confundida pela população
com espécies do gênero Ageratum que tem indicação para tratamento de processos
inflamatórios, úlcera péptica e dores reumáticas. A espécie P. clematidea foi
selecionada para estudo porque dados quimiotaxonômicos da família apontavam a
presença de flavonóides, que possuem atividades biológicas relevantes, entre as
quais, atividade antiulcerogênica. O extrato etanólico bruto (EEtOH) e a fase
clorofórmica (FCHCl
3
) obtidos das partes aéreas de P. clematidea foram
investigados quanto a toxicidade e aos efeitos farmacológicos frente a atividade
antiulcerogênica, bem como os prováveis mecanismos de ação relacionados. O
EEtOH de P. clematidea foi utilizado para ensaio de toxicidade através de triagem
comportamental e determinação da dose letal 50% (DL
50
) em camundongos Swiss
machos nas doses crescentes até 5000 (v.o.) e 2000 (i.p.) mg/kg. O EEtOH não
demonstrou sinais de toxicidade nas doses avaliadas, com ausência de mortes dos
animais impossibilitando a determinação da DL
50
. O EEtOH nas doses 250, 500 e
750 mg/kg e a FCHCl
3
nas doses 125, 250 e 500 mg/kg via oral foram estudados em
modelos de indução aguda de úlcera (etanol, estresse e antiinflamatório não-
esteroidal) em camundongos Swiss e ratos Wistar machos. Tanto o extrato quanto a
fase nas diferentes doses avaliadas reduziram significativamente o índice de lesão
ulcerativo sugerindo que os mesmos apresentam atividade antiulcerogênica.
Também foram avaliados os parâmetros bioquímicos do suco gástrico (pH,
concentração de H
+
e volume do suco gástrico) através do modelo de ligadura do
piloro, administrando-se por via intraduodenal EEtOH e FCHCl
3
nas doses 500 e 125
mg/kg, respectivamente. Os resultados demonstraram que o EEtOH e a FCHCl
3
não
alteraram os parâmetros bioquímicos sugerindo-se, portanto, que os mesmos não
apresentam atividade anti-secretória nas doses e via avaliadas. Na perspectiva de
elucidação dos prováveis mecanismos de ação envolvidos com a atividade
antiulcerogênica do EEtOH (500 mg/kg) e da FCHCl
3
(125 mg/kg), foram avaliadas
as participações dos grupamentos sulfidrílicos e do óxido nítrico na citoproteção
gástrica através do modelo de indução de úlcera gástrica por etanol em ratos,
utilizando-se bloqueador de compostos sulfidrílicos (N-etilmaleimida 10 mg/kg – i.p.)
e inibidor da enzima sintase de óxido nítrico (L-NAME 70 mg/kg – i.p.). Os dados
sugerem que a proteção da mucosa gástrica produzida pelo extrato e fase frente à
atividade antiulcerogênica é dependente de sulfidrila e independente de óxido
nítrico. Outro mecanismo de ação avaliado foi a síntese de muco em ratos,
utilizando-se a FCHCl
3
na dose 125 mg/kg. Foi possível observar que essa amostra
vegetal aumenta
a síntese de muco, provavelmente, estimulada por prostaglandinas.
Portanto, é possível sugerir a participação do mecanismo de citoproteção na
atividade antiulcerogênica desenvolvida por P. clematidea. Diante desses
resultados, sugere-se que a atividade antiulcerogênica promovida por P. clematidea
poderá envolver mecanismos citoprotetores e anti-secretores, provavelmente, devido
a ação de compostos fenólicos, como os flavónoides que possuem atividades
antiulcerogênica, antiinflamatória e antioxidante comprovadas cientificamente.
Palavras-chave: Praxelis clematidea. Planta medicinal. Úlcera gástrica. Atividade
antiulcerogênica.
ABSTRACT
ABSTRACTABSTRACT
ABSTRACT
Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. KING & H. Rob. (Asteraceae) is a native
herb to South America and it is found in Brazilian states (Mato Grosso, Bahia,
Paraiba and Pernambuco). This plant species is not popular therapeutic indication,
but it is confused by the population with species of the Ageratum gender which has
indication for the treatment of inflammation, peptic ulcer and rheumatic pains. The
species P. clematidea was selected for study because chemotaxonomic dates of
family indicated flavonoids. The crude ethanol extract (EtOHE) and the chloroform
phase (CHCl
3
P) obtained from the aerial parts of the Praxelis clematidea were
investigated through of the studies toxicity, antiulcer activity and mechanism of action
involved. The EtOHE was used to investigate the toxicity through behavior screen
and determination of the lethal dose 50% (LD
50
) in male Swiss mice, which receive
increasing doses up to 5000 (p.o.) and 2000 (i.p.) mg/kg. The EtOHE did not
demonstrate toxicity signs, as the absence of deaths, disabling the determination of
LD
50
. The EtOHE (250, 500 and 750 mg/kg) and the CHCl
3
P (125, 250 and 500
mg/kg) were tested on the antiulcer activity by models of sharp induction of gastric
ulcer (ethanol, stress and non steroidal anti-inflammatory) in male Swiss mice and
Wistar rats. Both plant products reduce significantly the ulcerative index on the doses
used. The biochemical parameters of the gastric juice (pH, concentration of H+ and
gastric juice volume) were evaluated after pylorus ligature, administrant
intraduodenally EtOHE (500 mg/kg) and CHCl
3
P (125 mg/kg). The results showed
that biochemical parameters of the gastric juice were not alter and both plant
products did not promote anti-secretor activity in the appraised conditions. On the
perspective to investigate the mechanism of action involved with antiulcer activity
promoted by EtOHE (500 mg/kg) and the CHCl
3
P (125 mg/kg), the participation of
sulphydryl compounds and nitric oxide on the cell protection were evaluated after
induction of gastric ulcer by ethanol and action the inhibitors of sulphydryl
compounds (N-ethilmaleimide 10 mg/kg – i.p.) and nitric oxide sintetase enzyme (L-
NAME 70 mg/kg – i.p.). The results showed that the EtOHE and the CHCl
3
P probably
protect the gastric mucous through of the dependent participation of sulphydryl
compounds and independent of nitric oxide. The action of CHCl
3
P (125 mg/kg) on
the production of the mucus was evaluated. The CHCl
3
P of the P. clematidea
protected the gastric mucous against ulcer formation to increase the production of
the mucus probably stimulated by prostaglandin and it is possible to suggest the
participation of the citoprotection mechanism in the antiulcer activity. Therefore, it is
suggested that the antiulcer activity promoted by P. clematidea can involve cell
protection and anti-secretor mechanisms, probably due to action of phenolic
compositions, like the flavonoids that possess scientifically proven antiulcer, anti-
inflammatory and antioxidant activities.
Key-Words: Praxelis clematidea. Medicinal plants. Gastric ulcer. Antiulcer activity.
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURASLISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Anatomia (A) e camadas teciduais do estômago (B) ...................... 24
Figura 2 - Composição celular de uma glândula gástrica ............................... 25
Figura 3 - Regulação da secreção ácida gástrica ........................................... 27
Figura 4 - Formação do HCl gástrico .............................................................. 28
Figura 5 - Úlcera péptica: (A) úlcera esofágica; (B) úlcera gástrica e (C) úlcera
duodenal ........................................................................................................... 35
Figura 6 - Estrutura básica de flavonóides ...................................................... 41
Figura 7 - Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson ................ 44
Figura 8 - Constituintes ativos isolados de P. clematidea ............................... 45
Figura 9 - Marcha fitoquímica de obtenção do EEtOH e FCHCl
3
de P.
clematidea ........................................................................................................ 51
Figura 10 - Animais utilizados nos experimentos: Ratos Wistar (A) e
Camundongos Swiss (B) .................................................................................. 52
Figura 11 - Lesões ulcerativas em estômago de rato ..................................... 53
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELASLISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Efeito da administração oral de lansoprazol e EEtOH obtido das
partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por etanol em
ratos ............................................................................................................... 62
Tabela 2 - Efeito da administração oral de lansoprazol e FCHCl
3
obtida das
partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por etanol em
ratos ............................................................................................................... 63
Tabela 3 - Efeito da administração oral de cimetidina e EEtOH obtido das
partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por estresse
(imobilização e frio) em camundongos .......................................................... 64
Tabela 4 - Efeito da administração oral de cimetidina e FCHCl
3
obtida das
partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por estresse
(imobilização e frio) em camundongos .......................................................... 64
Tabela 5 - Efeito da administração oral de cimetidina e EEtOH obtido das
partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por
antiinflamatório não-esteroidal (piroxicam 30 mg/kg) em camundongos ...... 65
Tabela 6 - Efeito da administração oral de cimetidina e FCHCl
3
obtida das
partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por
antiinflamatório não-esteroidal (piroxicam 30 mg/kg) em camundongos ...... 66
Tabela 7 - Efeito da administração intraduodenal de cimetidina, EEtOH e
FCHCl
3
obtidos das partes aéreas de P. clematidea sobre os parâmetros
bioquímicos do suco gástrico após a ligadura do piloro em ratos ................. 67
LISTA DE
LISTA DE LISTA DE
LISTA DE GRÁFIC
GRÁFICGRÁFIC
GRÁFICOS
OSOS
OS
Gráfico 1 - Efeito da administração oral de carbenoxolona e FCHCl
3
obtida das
partes aéreas de P. clematidea sobre o conteúdo de muco gástrico após
ligadura do piloro em ratos................................................................................ 68
Gráfico 2 - Efeito da administração oral de carbenoxolona, EEtOH e FCHCl
3
obtidos das partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por
etanol em ratos pré-tratados com L-NAME ...................................................... 69
Gráfico 3 - Efeito da administração oral de carbenoxolona, EEtOH e FCHCl
3
obtidos das partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por
etanol em ratos pré-tratados com N-etilmaleimida ........................................... 70
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE ABREVIATURASLISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE ABREVIATURAS
AINE = Antiinflamatório não-esteroidal;
AMPc = Adenosina 3’, 5’ - monofosfato cíclica;
CAT = Catalase;
CCK
2
= Receptor de colecistocinina e gastrina tipo 2;
CGRP = Peptídeo relacionado ao gene calcitonina;
COX = Enzima ciclooxigenase;
DAG = Diacilglicerol;
DL
50
= Dose letal 50 %;
d.p. = Desvio padrão;
ECL = Célula semelhante à enterocromafin;
EEtOH = Extrato etanólico bruto;
EGF = Fator de crescimento epidermal;
FCHCl
3
= Fase clorofórmica;
FGF = Fator de crescimento fibroblasto;
GMPc = Guanosina 3’,5’ - monofosfato cíclica;
GSH-Px = Glutationa peroxidase;
GR = Glutationa redutase;
GSH = Glutationa reduzida;
GSSG = Glutationa oxidada;
GST = Glutationa transferase;
H
+
/K
+
ATPase = Bomba próton potássio ATPase;
HCl = Ácido clorídrico;
HGF = Fator de crescimento hepatócito;
IL = Interleucina;
IP
3
= Trifosfato de inositol;
L-NAME = N
ω
-nitro-L-arginina-metil-éster;
LT = Leucotrieno;
NEM = N-etilmaleimida;
NO = Óxido nítrico;
NOS = Enzima sintase de óxido nítrico;
PAF = Fator de agregação plaquetária;
PDGF = Fator de crescimento derivado de plaquetas;
PG = Prostaglandina;
PKA = Proteína fosfoquinase A;
PKB = Proteína fosfoquinase B;
PPI = Inibidores irreversíveis de bomba H
+
/K
+
ATPase;
ROS = Espécies reativas de oxigênio;
SH = Grupamentos sulfidrila ou tiol;
SOD = Superóxido dismutase;
SST
2
= Receptor de somatostatina tipo 2;
TGF = Fator de crescimento transformador;
TNF = Fator de necrose tumoral;
VEGF = Fator de crescimento endotelial.
SUMÁRIO
SUMÁRIOSUMÁRIO
SUMÁRIO
I – INTRODUÇÃO..................................................................................................... 21
1.1 - Considerações gerais ....................................................................................... 22
1.2 - Fisiologia gástrica ............................................................................................. 23
1.2.1 - Secreção ácida .............................................................................................. 26
1.2.2 - Defesa da mucosa gástrica ........................................................................... 29
1.3 - Úlcera péptica .................................................................................................. 35
1.3.1 - Tratamento da úlcera .................................................................................... 38
1.3.1.1 - Úlcera x produtos naturais ......................................................................... 41
1.4 - Planta selecionada para estudo ....................................................................... 43
II – OBJETIVOS ....................................................................................................... 47
2.1 - Objetivo geral ................................................................................................... 48
2.2 - Objetivos específicos ....................................................................................... 48
III – MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 49
3.1 - LOCAL DA PESQUISA .................................................................................... 50
3.2 - ESPÉCIE VEGETAL ESTUDADA .................................................................... 50
3.3 - ANIMAIS ........................................................................................................... 51
3.4 - DROGAS UTILIZADAS .................................................................................... 52
3.5 - AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES TOXICOLÓGICA E FARMACOLÓGICA ...... 53
3.5.1 - Triagem farmacológica comportamental e determinação da dose letal 50%
(DL
50
) ........................................................................................................................ 54
3.5.2 - Investigação da atividade antiulcerogênica de Praxelis clematidea (Griseb.) R.
M. King & H. Robinson ............................................................................................. 54
3.5.2.1 - Indução de úlcera gástrica pelo etanol ...................................................... 55
3.5.2.2 - Indução de úlcera gástrica por estresse (imobilização e frio) .................... 55
3.5.2.3 - Indução de úlcera gástrica por antiinflamatório não-esteroidal (piroxicam)
................................................................................................................................... 56
3.5.3 - Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico através do modelo
ligadura do piloro ...................................................................................................... 56
3.5.4 - Avaliação dos mecanismos de ação envolvidos na atividade antiulcerogênica
de Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson .................................... 57
3.5.4.1 -
Determinação do muco aderido à mucosa gástrica ................................. 57
3.5.4.2 - Participação do óxido nítrico (NO) na citoproteção .................................... 58
3.5.4.3 - Participação de grupamentos sulfidrílicos (SH) na citoproteção ................ 58
3.6 - ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 59
IV – RESULTADOS ................................................................................................. 60
4.1 - AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES TOXICOLÓGICA E FARMACOLÓGICA ...... 61
4.1.1 - Triagem farmacológica comportamental e determinação da dose letal 50 %
(DL
50
) ........................................................................................................................ 61
4.1.2 - Investigação da atividade antiulcerogênica de Praxelis clematidea (Griseb.) R.
M. King & H. Robinson ............................................................................................. 61
4.1.2.1 - Indução de úlcera gástrica pelo etanol ...................................................... 62
4.1.2.2 - Indução de úlcera gástrica por estresse (imobilização e frio) .................... 63
4.1.2.3 - Indução de úlcera gástrica por antiinflamatório não-esteroidal (piroxicam)
................................................................................................................................... 65
4.1.3 - Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico através do modelo
ligadura do piloro ...................................................................................................... 67
4.1.4 - Avaliação dos mecanismos de ação envolvidos na atividade antiulcerogênica
de Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson .................................... 68
4.1.4.1 - Determinação do muco aderido à mucosa gástrica ................................... 68
4.1.4.2 - Participação do óxido nítrico (NO) na citoproteção .................................... 69
4.1.4.3 - Participação de grupamentos sulfidrílicos (SHs) na citoproteção .............. 70
V – DISCUSSÃO ...................................................................................................... 72
VI – CONCLUSÃO ................................................................................................... 85
VII – PERSPECTIVAS ............................................................................................. 87
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 89
ANEXO ................................................................................................................... 111
ANEXO A – Protocolo experimental para triagem farmacológica comportamental
................................................................................................................................. 111
I
II
I-
--
-
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
1.1 - Considerações gerais
As plantas medicinais são empregadas pelo homem na prevenção e cura das
enfermidades desde que a história da humanidade é conhecida. No entanto, as
plantas não são destituídas de efeitos tóxicos podendo oferecer riscos a saúde de
quem as utilizam inadequadamente (VEIGA JÚNIOR; PINTO; MACIEL, 2005).
Nos últimos anos, as plantas medicinais têm apresentado uma importância
global, visto que são utilizadas por uma grande parte da população, em especial a
classe desfavorecida, com intuito de suprir a carência de medicamentos, muitas
vezes, pouco eficazes e de custos elevados (RATES, 2001; KINGHORN, 2002).
A pesquisa envolvendo plantas é importante tanto para a descoberta de
substâncias ativas úteis na terapêutica, como para o entendimento da fisiopatologia
de determinadas doenças e elucidação de novos mecanismos de ação sendo
necessário que os estudos sejam realizados de forma multidisciplinar e
interdisciplinar (SOUZA BRITO; NUNES, 1997).
As áreas profissionais que normalmente se integram para a elaboração
dessas pesquisas são constituídas pelos antropólogos, botânicos, químicos e
farmacólogos a fim de viabilizar os estudos de eficácia e segurança das espécies
vegetais ou outro produto de origem natural, minimizando as dificuldades em
elucidar os componentes ativos e correlacioná-los às atividades farmacológicas
(MACIEL et al., 2002). É importante ressaltar que os extratos das plantas possuem
vários constituintes pertencentes a classes fitoquímicas distintas e que podem
apresentar efeitos sinérgicos ou antagônicos.
Estima-se que 25 % dos US$ 8 bilhões de faturamento da indústria
farmacêutica brasileira, registrados em 1996, advêm de medicamentos derivados de
plantas (GUERRA; NODARI, 2003). Considera-se que as vendas nesse setor
crescem 10 % ao ano, com estimativa de terem alcançado a cifra de US$ 550
milhões no ano de 2001 (KNAPP, 2001).
O Brasil é considerado o país que apresenta maior diversidade genética
vegetal do mundo, com cerca de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado
entre 350.000 e 550.000 espécies (SANDES; DI BLASI, 2000).
Dados contidos na literatura revelam que essa alta diversidade florística
encontrada nos biomas brasileiros representa 20 a 22 % do total mundial com
22
espécies úteis ao homem (PINTO et al., 2002; BRITO, 2003) e que apenas 8 % da
flora nativa tiveram seus compostos bioativos estudados, o que equivale a 1.100
espécies vegetais avaliadas quanto as propriedades medicinais (GUERRA;
NODARI, 2003). No entanto, o Brasil não tem atuação destacada no mercado
mundial de medicamentos fitoterápicos situando-se atrás de países menos
desenvolvidos tecnologicamente (YUNES; PEDROSA; CECHINEL-FILHO, 2001).
Portanto, existe a necessidade de maior integração entre os pesquisadores,
as instituições e o seguimento industrial (público e privado) para garantir acesso e
uso racional de plantas medicinais e dos produtos derivados com segurança,
eficácia e qualidade.
Seguindo esse princípio, o grupo de investigação em úlcera péptica do
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba tem
procurado contribuir para o uso seguro de plantas, através da pesquisa científica
com metodologias padronizadas internacionalmente e que avaliam a capacidade das
plantas atuarem no trato gastrointestinal, sobretudo sobre doenças ulcerativas.
1.2 - Fisiologia gástrica
O sistema digestório supre continuamente o organismo com água, eletrólitos
e nutrientes através do funcionamento dos órgãos e glândulas anexas que o
constituem: boca, glândula sublingual, glândulas submaxilar e parótida, esôfago,
estômago, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas, vesícula biliar e fígado.
Esses órgãos são controlados pelos sistemas nervoso e hormonal, permitindo a
movimentação do alimento ao longo de todo o trato gastrointestinal, secreção de
enzimas digestivas, manutenção do fluxo sanguíneo local e absorção dos produtos
da digestão, água e eletrólitos (GUYTON; HALL, 1998).
Dentre os órgãos do trato gastrointestinal, o estômago é responsável por
armazenar o alimento, absorver ferro, vitamina B
12
e cálcio, digerir proteínas, formar
o quimo, permitir lentamente a passagem do bolo alimentar para o intestino delgado
e eliminar microorganismos (SCHUBERT, 2003; MÖSSNER; CACA, 2005). O
estômago, para exercer suas funções, secreta cerca de 1,5 litros de suco gástrico
23
favorecendo um pH luminal correspondente a 1 (GUYTON; HALL, 1998; RANG et
al., 2004).
Anatomicamente, o estômago é dividido nas regiões: cárdia, fundo, corpo e
antro e, histologicamente, é composto pelas camadas teciduais: mucosa,
submucosa, musculatura externa (circular e longitudinal) e serosa (Figura 1 A e B). A
mucosa gástrica é composta por tecido epitelial prismático, que reveste a superfície
externa do estômago e origina as fossetas gástricas originando pequenas glândulas
na porção terminal, lâmina própria formada de tecido conjuntivo frouxo e muscular
da mucosa (SILVERTHORN et al., 2003).
Figura 1. Anatomia (A) e camadas teciduais (B) do estômago (AIRBRUSH ILLUSTRATIONS;
SILVERTHORN et al., 2003).
As principais secreções estomacais são provenientes das células que
compõem as glândulas gástricas (Figura 2), como: pepsinogênio transformado em
pepsina no meio ácido e secretado pelas células principais ou pépticas; ácido
clorídrico, bicarbonato e fator intrínseco, produzidos pelas células parietais ou
oxínticas; muco e bicarbonato, secretados pelas células epiteliais e do colo das
glândulas; gastrina, liberada pelas células G; histamina, secretada pelas células
semelhantes às enterocromafins (ECL) e somatostatina, liberada pelas células D
(WALDUM; BRENNA; SANDVIK, 1998; FLEMSTRÖM; ISENBERG, 2001; SUN et
al., 2002; BERNE et al., 2004).
Cárdia
Corpo
Fundo
Antro
(
A
)
(B)
24
Figura 2. Composição celular de uma glândula gástrica (SILVERTHORN et al., 2003).
A motilidade, secreções de hormônios e mediadores químicos no estômago
são controlados pelo sistema nervoso autônomo simpático e parassimpático e pelo
sistema nervoso entérico, composto pelos plexos de Meissner (Submucoso) e
Mioentérico (Auerbach) (BERNE et al., 2004).
O estômago, assim como todo trato gastrointestinal, é inervado por neurônios
aferentes extrínsecos e intrínsecos (HOLZER, 2000; BERNE et al., 2004).
Os neurônios aferentes extrínsecos são originados de gânglios nodosos
(vagal) e das raízes dorsais (espinhal). Esses neurônios são responsáveis pela
liberação de neuropeptídeos que agem como mensageiros químicos para o sistema
nervoso central informando sobre sensações dolorosas e desconfortantes, ainda
podem provocar reações endócrinas e autonômicas, liberar neuropeptídeos
vasoativos nas terminações periféricas, além de permitir a resistência e reparo do
tecido às injúrias. Os principais neuropeptídeos liberados são: peptídeo relacionado
ao gene calcitonina (CGRP), taquicininas, substância P e neurocinina A (HOLZER,
2000).
Os neurônios intrínsecos constituem o plexo miontérico, que inerva as
camadas musculares e regula a função motora, e o plexo submucoso, que inerva a
mucosa regulando a absorção e secreções gastrointestinais (SCHUBERT;
SHAMBUREK, 1990).
Abertura da
glândula gástrica
ECL
Células principais
Células D
Células G
Células do colo
da glândula gástrica
Células parietais
Células
superficiais
ou epiteliais prismáticas
25
1.2.1 - Secreção ácida
O estômago secreta continuamente suco gástrico composto de muco fluido,
eletrólitos, bicarbonato (HCO
-
3
), ácido clorídrico (HCl) e pepsinogênio cuja forma
ativa é a enzima pepsina (HERSEY; SACHS, 1995).
A regulação da secreção ácida é distribuída didaticamente nas fases:
a) cefálica - estimulada pelo odor, sabor e visão de alimentos, bem como da
distensão do órgão. As informações sensoriais do estômago são transmitidas para o
sistema nervoso central através de fibras aferentes vagais, localizadas nas camadas
de músculo liso e na mucosa do estômago, e fibras aferentes simpáticas localizadas
na musculatura lisa dos vasos sangüíneos em resposta aos estímulos citados
anteriormente (HERSEY; SACHS, 1995);
b) gástrica - iniciada pela estimulação mecânica dos receptores por distensão
gástrica. Essa fase é mediada por impulsos vagais e também está relacionada com
a liberação de gastrina pelas células G, induzida por aminoácidos e peptídios
luminais, além do próprio estímulo vagal. A liberação de gastrina é regulada pelo
hormônio inibidor da acidez, somatostatina (LIU; CRAWFORD, 2005);
c) intestinal - ocorre quando o alimento contendo proteínas digeridas no
estômago chega ao intestino delgado proximal. Nesse momento, alguns
polipeptídios são liberados, como: gastrina, aumentando a liberação de ácido
gástrico e ativação do pepsinogênio em pepsina para facilitar a digestão; secretina e
colecistocinina (CCK), liberadas por células intestinais com a finalidade de regular a
secreção ácida quando em excesso (LIU; CRAWFORD, 2005).
O estímulo primário da acidez gástrica é o alimento e, secundariamente, os
três principais secretagogos: acetilcolina, histamina e gastrina, enquanto que o
principal inibidor da secreção ácida no estômago é a somatostatina, seguido das
prostaglandinas (WALDUM; BRENNA; SANDVIK, 1998; SCHUBERT, 2003).
Os secretagogos ligam-se a receptores específicos existentes na membrana
plasmática das células parietais, promovendo a secreção de HCl através de
mecanismos neurócrinos, parácrinos e endócrinos (WOLFE; SANCHS, 2000).
De acordo com Waldum, Brenna e Sandvik (1998), a secreção ácida pela
célula parietal pode ocorrer por duas vias (Figura 3): estímulo direto sobre a célula
parietal onde os receptores para histamina (H
2
), acetilcolina (M
3
) e gastrina (CCK
2
)
26
são ativados e promovem diretamente a formação do ácido clorídrico; estímulo
indireto, em que as ECL sofrem estímulo da gastrina e acetilcolina, quando estes se
ligam aos respectivos receptores CCK
2
e M
3
, e promovem a liberação de histamina,
a qual juntamente com acetilcolina e gastrina ativam os seus receptores
correspondentes localizados nas células parietais e promovem liberação do ácido
clorídrico.
Figura 3. Regulação da secreção ácida gástrica. Ach: Acetilcolina; ECL: Células semelhantes às
enterocromafins; G: Célula G; D: Célula D; PGE
2
: prostaglandina E subtipo 2; M
3
: receptor
muscarínico subtipo 3; H
2
: receptor histaminérgico subtipo 2; CCK
2
: receptor colecistocinina/gastrina
subtipo 2 (Ativação:___ e inibição:___) (Adaptado de COLLARES-BUZATO; ARANA, 2005).
Durante a estimulação da secreção ácida, ocorre o aumento no citosol dos
segundos mensageiros adenosina 3’, 5’ - monofosfato cíclica (AMPc) e cálcio (Ca
2+
)
pela estimulação dos receptores H
2
e M
3
/CCK
2
,
ativando as proteínas fosfoquinases
A (PKA) e C (PKC), respectivamente, com capacidade de fosforilar proteínas e
outras enzimas intracelulares, como as bombas de próton potássio ATPases (H
+
/K
+
ATPase) localizadas nas células parietais (RANG et al., 2004).
Célula oxín
tica
H
+
H
+
, K
+
ATPase
M
3
H
2
CCK
2
ACh
Histamina
Gastrina
ECL
G
D
PGE
2
Somatostatina
27
O HCl é liberado para o lúmen gástrico através das H
+
/K
+
ATPase acopladas
a membrana plasmática apical das células parietais responsáveis pela troca dos
íons hidrogênio para o lúmen e potássio para o citosol (Figura 4) (SACHS et al.,
1995).
O íon hidrogênio é liberado a partir do ácido carbônico (H
2
CO
3
), proveniente
da reação entre dióxido de carbono (CO
2
) e água (H
2
O) que, sob a ação da anidrase
carbônica, origina o H
+
e bicarbonato (HCO
3
-
), este último íon é trocado pelo cloreto
(Cl
-
) por um transportador antiporte através da membrana basal (HIRSCHOWITZ et
al., 1995; RANG et al., 2004), o Cl
-
chega ao lúmen gástrico por transporte passivo e
se combina com H
+
para formar o HCl e para que isso ocorra, o aumento de K
+
no
lúmen gástrico permite a troca desse íon com o H
+
para o meio intracelular através
da bomba H
+
/K
+
ATPase, correspondendo a etapa final da secreção ácida que é de
grande importância para as funções do estômago (HIRSCHOWITZ et al., 1995;
BERNE et al., 2004).
Figura 4. Formação do HCl gástrico. CA: Anidrase carbônica (SILVERTHORN et al., 2003).
A somatostatina, hormônio produzido pelas células D, tem como função
principal regular a secreção ácida atuando diretamente sobre as células parietais,
impedindo a formação do ácido, e indiretamente sobre as células G e ECL,
impedindo que secretem gastrina e histamina, respectivamente (Figura 3). Dessa
28
forma, ativa o receptor SST
2
e influencia na redução do bombeamento de ácido
clorídrico para o lúmen gástrico pelas células parietais e também na diminuição da
ativação do pepsinogênio em pepsina (WALDUM; BRENNA; SANDVIK, 1998;
SCHUBERT, 2003; KONTUREK et al., 2004).
O receptor SST
2
é acoplado à proteína G
i
, que inibe a via acoplada ao G
s
, e
em algumas células, tais como as ECL, podem também inibir vias acopladas ao G
q
.
A inibição da via de sinalização na célula ECL, que depende da G
q
, explica o efeito
do receptor SST
2
no bloqueio da estimulação da secreção ácida pela gastrina
(ATHMANN et al 2000).
Além do controle da secreção ácida, a somatostatina também pode inibir o
peristaltismo do estômago e intestino, diminuir a secreção biliar e proliferação
celular, reduzir o fluxo sanguíneo no trato gastrointestinal e a absorção de água e
eletrólitos (SUN et al., 2002).
As prostaglandinas E
2
, derivado do ácido araquidônico, regulam a acidez
gástrica por estimular os correspondentes receptores EP
3
localizados nas células
parietais e quando ativados inibem a formação do segundo mensageiro AMPc,
impedem o influxo de Ca
2+
e abrem os canais para efluxo de K
+
(GOODMAN
GILMAN et al., 2005).
1.2.2 - Defesa da mucosa gástrica
A defesa gástrica contra a secreção ácida-péptica e fatores exógenos é
subdividida didaticamente em pré-epitelial, epitelial e subepitelial (KAUNITZ; AKIBA,
2004).
Os fatores defensivos pré-epiteliais são barreira muco-bicarbonato,
fosfolipídios hidrofóbicos da mucosa e junções intercelulares gástricas; os epiteliais
constituem da capacidade de renovação e proliferação celular, regulado por fatores
de crescimento, além do sistema antioxidante enzimático e não enzimático,
enquanto que a proteção subepitelial está relacionada à homeostasia da
microvasculatura mantendo o fluxo sangüíneo local (RICH; SCHEIMAN, 2000).
O mecanismo de proteção ao estômago contra fatores agressores como o
ácido clorídrico, bile, antiinflamatórios não-esteroidas e estresse consiste
29
principalmente de fatores funcionais, humorais e neuronais. A secreção muco-
alcalino, camada de fosfolipídios, microcirculação e motilidade são os fatores
funcionais, as prostaglandinas, óxido nítrico (NO) e sistema antioxidante endógeno
atuam como fatores humorais e os neurônios aferentes sensoriais atuam como
fatores neuronais (TSUKIMI; OKABE, 2001).
O muco constitui uma camada viscosa e elástica contínua de 0,5 mm, que
juntamente com o bicarbonato e fosfolipídios liberados sobre essa camada, mantêm
um pH aproximadamente 7 na superfície das células epiteliais, servindo como
primeira linha de defesa estomacal contra a ação ácida-péptica e fatores exógenos
(WALLACE; GRANGER, 1996; PHILLIPSON et al., 2002; BI; KAUNITZ, 2003).
O muco é formado por 5 % de glicoproteínas (mucinas) de alto peso
molecular, que formam pontes dissulfeto garantindo a rigidez e aderência do
mesmo, e 95 % de água juntamente com pequenas quantidades de lipídios, ácidos
nucléicos e proteínas (ALLEN; GARNER, 1980; SATCHITHANANDAM et al., 1996;
FLEMSTRÖM; ISENBERG, 2001), capaz de agir como antioxidante e redutor dos
danos à mucosa promovidos por radicais livres (REPETTO et al., 2003). Essa
atividade deve-se as glicoproteínas, uma vez que os açúcares são potentes
seqüestradores de espécies reativas de oxigênio (EROs) (MOJZIS et al., 2000).
O bicarbonato é formado através da ação da enzima anidrase carbônica que
dissocia carbonato em HCO
3
-
e H
+
dentro das células epiteliais e parietais. O HCO
3
-
proveniente das células parietais chega a camada de muco através da circulação
sanguínea local, enquanto os originados das células epiteliais são trocados pelo Cl
-
através de transportadores antiporte localizados na membrana apical da célula
(FLEMSTRÖM; ISENBERG, 2001).
A produção e liberação de muco e bicarbonato são reguladas por
prostaglandinas E
2
e acetilcolina através do aumento intracelular dos segundos
mensageiros AMPc e Ca
2+
após ativação dos receptores EP e M
3
, respectivamente
(FLEMSTRÖM; ISENBERG, 2001; TANI et al., 2002).
Prostaglandinas são metabólitos ativos do ácido araquidônico formadas após
ação de enzimas ciclooxigenases (COX). No organismo humano, são apresentadas
pelo menos três isoformas dessa enzima, ou seja, COX-1, 2 e 3, sendo as duas
primeiras isoformas importantes durante proteção e agressão gástrica (PESKAR,
2001; KONTUREK; KONTUREK; BRZOZOWSKI, 2005).
30
A COX-1 é expressa no organismo constitutivamente em níveis elevados,
enquanto que COX-2 é expressa em níveis menores. Em momentos de danos à
mucosa, ou seja, estímulos pró-inflamátorios ou mitogênicos, essa proporcionalidade
é revertida e a expressão de COX-2 é induzida para que ocorra um aumento nos
níveis da mesma (KUJUBU et al., 1991; O’NEIL; FORD-HUTCHINSON, 1993).
As prostaglandinas formadas sob ação da COX-1 estão envolvidas com a
citoproteção gástrica a qual é constituída de regulações da acidez gástrica, fluxo
sanguíneo e motilidade, além das produções de muco e bicarbonato, enquanto que
as provenientes de COX-2 são responsáveis pelo processo inflamatório, regulação
da aderência leucocitária nos vasos, angiogênese e reparo celular através de fatores
de crescimento (KONTUREK; KONTUREK; BRZOZOWSKI, 2005).
O efeito biológico das prostaglandinas é mediado por receptores de
membranas específicos, denominados receptores EP (EP
1
, EP
2
, EP
3
e EP
4
), que
são acoplados as proteínas G de membrana e responsáveis por diferentes vias de
transdução de sinal intracelular (SUGIMOTO; NARUMIYA; ICHIKAWA, 2000).
Ligantes dos receptores EP
1
resultam na liberação intracelular de trifosfato de
inositol (IP
3
), diacilglicerol (DAG) e cálcio, os ligantes de EP
2
e EP
4
ativam o sistema
AMPc, enquanto que os ligantes de EP
3
inibem esse último sistema (PAWLIK et al.,
2002).
Um dos mecanismos pelo qual a prostaglandina pode causar diminuição da
resposta inflamatória e danos à mucosa é através da modulação da atividade de
imunócitos. PGE
2
é um potente supressor do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
(KUNKEL et al., 1986) e regulador da liberação de interleucinas tipo 1 (IL-1)
provenientes de macrófagos (KUNKEL et al., 1988) e a liberação de leucotrienos
LTB
4
dos neutrófilos (HAM, 1983). Esse metabólito também é capaz de inibir a
liberação de fator de agregação plaquetária (PAF), histamina e TNF-α de células na
mucosa intestinal (HOGABOAN et al., 1993).
Outro importante fator de proteção para a mucosa gástrica é o óxido nítrico. O
NO é um gás incolor altamente lipossolúvel originado de reações que converte o
aminoácido arginina em citrulina pela ação da enzima sintase de óxido nítrico (NOS).
No organismo humano, são conhecidas pelo menos três isoformas dessa enzima:
duas constitutivas, NOS-1 (neuronal) e NOS-3 (endotelial) e uma induzida, NOS-2
(macrofágica) (BEGNAMI et al., 2004).
31
Fisiologicamente, NOS-1 e NOS-3 são responsáveis pelos baixos níveis de
NO no organismo, todavia na presença de danos, NOS-2 é induzida e níveis
elevados de NO são mantidos o que facilita a reação dessa molécula com o radical
superóxido (O
2
-
) produzindo o oxidante peroxinitrito e tornando-se lesivo para o
organismo (POTOKA et al., 2002; BEGNAMI et al., 2004; KRISTJÁNSSON et al.,
2005).
Na mucosa gástrica normal, NO é responsável por inibir a secreção ácida,
estimular a produção de muco e bicarbonato, elevar o fluxo sanguíneo por
vasodilatação, inibir o acúmulo de neutrófilos inflamatórios por regular a expressão
de moléculas de adesão no vaso e favorecer o processo de cicatrização de úlceras
(BROZOZOWSKI et al., 1997; KATO et al., 1998; TATEMICHI et al., 2003).
Durante estimulação nervosa para proteção gástrica, o NO atua sozinho ou
em combinação com as prostaglandinas para promover seus efeitos benéficos a
mucosa (PESKAR, 2001). O efeito biológico do NO depende em parte de guanosina
3’, 5’- monofosfato cíclica (GMPc) produzida após estímulo da enzima guanilato
ciclase solúvel pelo gás biológico (MONCADA et al., 1991). Nas células musculares
lisas do endotélio essa estimulação resulta em relaxamento, uma vez que o NO
pode atuar diretamente sobre canais de potássio levando a uma hiperpolarização e,
consequentemente, em vasodilatação (BOLOTINA et al., 1994).
A microcirculação local gástrica é essencial para mecanismos de proteção a
mucosa gástrica, sendo possivelmente um dos mais importantes componentes de
defesa (ABDEL-SALAM et al., 2001; MARTIN; WALLACE, 2006).
O fluxo sanguíneo determina a capacidade do estômago em regular a
secreção gástrica, remover ou neutralizar o ácido evitando, assim, danos ao epitélio
devido a fragilidade da camada protetora de muco/bicarbonato mediante aos fatores
indutores da úlcera (etanol, estresse e antiinflamatórios) com consequentemente
desenvolvimento das ulcerações (ABDEL-SALAM et al., 2001), além de suprir a
mucosa com oxigênio, nutrientes e hormônios, bem como participar da produção e
secreção de muco e bicarbonato (WALLACE et al., 2001).
Esse fluxo é regulado pelo sistema nervoso extrínseco e intrínseco e por
mediadores inflamatórios, como leucotrienos (LT) e PGs. A inervação extrínseca
aferente proveniente de neurônios espinhais liberam CGRP e substância P na
vizinhança das arteríolas localizadas na submucosa resultando em vasodilatação.
Outros vasoativos protetores endógenos são PGE
2
e NO que promovem
32
vasodilatação e mantêm a homeostasia, oxigenação e nutrição tecidual (HOLZER,
2000; MARTIN; WALLACE, 2006).
Espécies reativas de oxigênio estão envolvidos em vários eventos patológicos
incluindo úlceras e inflamação gastrointestinal (YOSHIDA et al., 1995). São gerados
a partir do metabolismo do ácido araquidônico, constituinte das membranas
lipofílicas de macrófagos, neutrófilos e organelas intracelulares, e causam danos as
mucosas (ROSEN et al., 1995). Os seqüestradores de EROs são utilizados para
proteger a mucosa gástrica do dano oxidativo e acelerar a cicatrização de úlceras.
O sistema antioxidante endógeno impede o desenvolvimento de
EROs/radicais livres ou diminui suas concentrações teciduais, protengendo a
mucosa gástrica da peroxidação de lipídios e alterações das proteínas e ácidos
nucléicos, o que resultaria em morte celular (HALLIWELL et al. 1995; HOGG;
KALYANARAMAN, 1999).
Os antioxidantes são classificados em primário, os que retardam o início da
formação radicalar ou seqüestram estas espécies, e secundário, aqueles que
bloqueiam a propagação radicalar em cadeia (ROVER JÚNIOR et al., 2001).
Quanto à classe funcional, os antioxidantes endógenos podem ser
distribuídos em grupos enzimáticos que compreendem: superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-Px), e não enzimáticos:
glutationa reduzida (GSH), NADPH, vitamina C e vitamina E (ROVER JÚNIOR et al.,
2001).
Quando ocorre a produção de radicais superóxido (O
2
.-
), a enzima SOD é
ativada e transforma esse radical em peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) brevemente
degradado em água (H
2
O) e oxigênio molecular (O
2
) pela enzima CAT. O H
2
O
2
, por
sua vez, é degradado em H
2
O através da enzima GSH-Px. A molécula de água
participa da reação de oxidação de GSH em glutationa oxidadada (GSSG) através
da ação da enzima glutationa oxidase. Por intermédio da glutationa redutase
(GSSR) na presença de NADPH, GSSG é transformada na forma reduzida
(KWIECIEN; BRZOZOWSKI; KONTUREK, 2002).
Glutationa é um tripeptídeo (g-L-glutamil-L-cisteinil-glicina), constituída de
grupamento tiol ou sulfidrila, que pode ser encontrado no organismo nas formas
reduzida e oxidada, atuando direta ou indiretamente em processos biológicos, como
síntese de proteínas, manutenção do fluxo sanguíneo, integridade da camada de
muco-bicarbonato gástrico, metabolismo e proteção celular contra espécies reativas.
33
As alterações na síntese e metabolismo da glutationa estão associadas a doenças
provenientes de estresse oxidativo (ROVER JÚNIOR et al., 2001).
O estresse oxidativo é o desequilíbrio entre a formação e a remoção dos
radicais livres no organismo, decorrente da diminuição dos antioxidantes endógenos
ou do aumento da geração de espécies oxidantes, gera um estado pró-oxidante que
favorece a ocorrência de lesões oxidativas em macromoléculas e estruturas
celulares, o que pode resultar na morte celular (GUTTERDGE, 1993).
Uma condição endógena importante para a proteção da mucosa gástrica é a
capacidade contínua de reconstituição celular do epitélio gástrico, uma vez que é
exposto às agressões química e mecânica causadas pelo ácido clorídrico e fatores
exógenos. O epitélio gástrico humano renova-se completamente a cada 2-4 dias
(WALLACE et al., 1996).
A reconstituição está relacionada ao processo de reparo epitelial da mucosa,
envolvendo migração de células cicatrizantes para os locais lesionados. A
cicatrização das ulcerações requer reconstituição da estrutura glandular epitelial (re-
epitelização), restauração da lâmina própria incluindo uma rede microvascular na
mucosa, nervos e células de tecidos conectivos (MILANI; CALABRO, 2001).
A cicatrização das úlceras é acompanhada de um aumento no fluxo
sangüíneo, gastrina plasmática (TSUJI et al., 2002) e citocinas pró-inflamatórias
como TNF-α e IL-1
β
regulados por fatores de crescimento (SHIN et al., 2002). No
entanto, ocorre uma redução desses fatores endógenos com a evolução da
cicatrização (BROZOZOWSKI et al., 2001).
O maior estímulo para a divisão, migração, proliferação e re-epitelização da
úlcera é promovido pela ação autócrina e/ou parácrina de fatores de crescimento,
como: fator de crescimento epidermal (EGF), fator de crescimento endotelial
(VEGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento do
hepatócito (HGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e fator de
crescimento transformador (TGF
β
) (VAWIJCK, 2001).
34
1.3 - Úlcera péptica
A humanidade tem convivido com a úlcera péptica por muitos séculos. Há
relatos das primeiras descrições dessa doença por volta do século IV antes de Cristo
(HOOGERWERF; PASRICHA, 2005).
A úlcera péptica é caracterizada por inflamação severa composta de pontos
hemorrágicos e lesões necrotizantes na mucosa esofágica (úlcera esofágica),
gástrica (úlcera gástrica) ou duodenal (úlcera duodenal) que podem atingir camadas
teciduais profundas como a muscular da mucosa, além de vasos e nervos (Figura 5)
(CALAM; BARON, 2001; MILANI; CALABRO, 2001; BERNE et al., 2004); é uma
afecção crônica e recorrente considerada a mais predominante das doenças
gastrointestinais (WILLIAMS, 1997).
(A) (B) (C)
Figura 5. Úlcera péptica: (A) úlcera esofágica; (B) úlcera gástrica e (C) úlcera
duodenal (www.fluvium.org/imagenes/UlceraDuodeno.jpg).
Essa doença conseguiu alcançar elevadas taxas de morbidade e mortalidade
mundial em décadas passadas (CHAN; LEUNG, 2002; YUAN; PADOL; HUNT,
2006), no entanto, com os avanços na compreensão fisiopatológica, terapêutica e
intervenções cirúrgicas tem-se observado uma redução desses índices.
Segundo Berstand e Berstand (1993), a úlcera péptica tornou-se objeto de
estudo nas últimas décadas, uma vez que acomete aproximadamente 8 a 10% da
população mundial ao longo de suas vidas (CALAM; BARON, 2001). O sexo
masculino é mais susceptível ao desenvolvimento dessa doença e a proporção
desse sexo e do feminino para úlceras duodenais é cerca de 3:1 e para as úlceras
35
gástricas é cerca de 2:1 (LIU; CRAWFORD, 2005). Na média populacional o risco de
complicação com úlcera aumenta quatro vezes, resultando em 1,25 hospitalizações
adicionais para cada 100 pacientes por ano (HAWKEY, 2000).
As úlceras gástricas são mais freqüentes nos países orientais, especialmente
no Japão, enquanto que as úlceras duodenais são mais freqüentes em populações
ocidentais (YUAN; PADOL; HUNT, 2006).
A úlcera gástrica acomete cerca de 5 % da população mundial e acreditava-
se que a principal causa dessa doença seria o excesso de acidez e pepsina no
lúmen gástrico (BANDYOPADHYAY et al., 2001). Contudo, com o avanço das
pesquisas, sugere-se, nos dias atuais, que as lesões gástricas são provenientes de
um desequilíbrio entre fatores citodestrutivos e citoprotetores (BROZOZOWSKI,
2003).
Os fatores citodestrutivos são classificados em endógeno (HCl, pepsina, sais
biliares, leucotrienos e radicais livres) e exógeno (álcool, antiinflamatórios esteroidais
e não-esteroidais, maus hábitos alimentares, fumo, estresse e infecção por
Helicobacter pylori), enquanto que os fatores citoprotetores endógenos estão
relacionados com a barreira muco-bicarbonato, fosfolipídios ativos superficiais,
prostaglandinas, fluxo sanguíneo local, sistema antioxidante, fatores de crescimento
e capacidade de reparação tecidual (KONTUREK et al., 1998; WOLFE; SANCHS,
2000; BANDYOPADHYAY et al., 2001; CALAM; BARON, 2001).
As doenças do trato gastrointestinal relacionadas a ação lesiva do álcool são
desenvolvidas devido a diminuição da função da barreira de muco, aumento da
permeabilidade epitelial ao ácido retrodifundido, distúrbios vasculares e diminuição
do fluxo sanguíneo local (SIEGMUND, 2003), indução de estresse oxidativo com
danos ao DNA celular, peroxidação lipídica e diminuição de grupamentos sulfidrílicos
(REPETTO; LLESUY, 2002).
Sob condições de estresse, o sistema nervoso central é alterado com
estimulação do hipotálamo e do centro medular causando alterações na motilidade
gastrointestinal, aumento da secreção ácida e ativação de pepsinogênio em pepsina,
alteração na liberação de substâncias endógenas como histamina, catecolaminas e
glicocorticóides provocando isquemia e, consequentemente, morte celular por
necrose originando as ulcerações (PACHALY et al., 1993).
Os antiinflamatórios não-esteroidais (AINEs) estão entre os agentes
farmacológicos mais utilizados clinicamente e são uma das principais causas de
36
ulceração do trato gastrointestinal (WALLACE, 2001). Esses medicamentos, quando
utilizados por longo prazo, são capazes de promover lesões através de ação local
sobre a mucosa e, principalmente, quando não seletivos, por inibir as enzimas COX-
1 e COX-2 responsáveis pela síntese de prostaglandinas (ATAY et al., 2000).
Espécies reativas de oxigênio têm sido relatadas como mediadores dos
distúrbios microvasculares que precedem as lesões da mucosa gástrica induzidas
por estresse, AINEs e etanol (RASTOGI et al., 1998; REPETTO; LLESUY, 2002). O
aumento intracelular de ROS provoca estresse oxidativo e favorece as lesões por
causar insuficiência no sistema antioxidante endógeno (CNUBBEN et al., 2001).
Atualmente, as pesquisas científicas envolvendo úlcera péptica estão
direcionadas ao estudo de Helicobacter pylori, bactéria Gram negativa na forma de
bastão provenientes da flora normal e considerada uma das maiores responsáveis
pela incidência dessa doença no homem através da sua disseminação pelas vias
oral-oral e fecal-oral (WATANABE; CHIBA, 2002). Entretanto, apenas algumas
cepas desenvolvem fator de virulência.
A bactéria H. pylori resiste a acidez gástrica através de um mecanismo
intrínseco, envolvendo a hidrólise de uréia em amônia pela enzima urease, gerando
um pH neutro ao redor da mesma (WEEKS; SACHS, 2001). Esse microorganismo é
capaz de sintetizar lipases e proteases, com a finalidade de degradar e atravessar a
camada de muco gástrico garantido sua permanência no lúmen (LADEIRA et al.,
2003); também sintetiza enzimas como superóxido dismutase, catalase e arginase
conferindo sua proteção contra a ação de macrófagos e neutrófilos (HAZELL;
EVANS; GRAHAM, 1991).
Existem pelo menos 40 tipos de cepas de H. pylori e essa variedade é
responsável pela codificação de diferentes fatores de virulência e diversos tipos de
lesões no hospedeiro (BLASER; BERG, 2001). Os fatores de virulência são:
antígenos associados à citotoxinas (gene CagA) que estimulam citocinas, citotoxina
vacuolizante (gene VacA) responsável pela formação de canais seletivos de ânions
nas células epiteliais levando a exsudação de uréia para a mucosa gástrica e fatores
de aderência ao epitélio (gene BabA, gene CagE, gene IceA e gene HP-NAP)
(EVANS JÚNIOR et al., 1995; LIVER et al., 1998; PEEK et al., 1999; DEBELLIS et
al., 2001; NAITO; YOSHIKAWA, 2002).
O fumo é um hábito comum e está associado a uma das causas de úlcera
gastroduodenal, não apenas contribuindo para o seu desenvolvimento como
37
também dificultando o tratamento e facilitando a reincidência (EASTWOOD, 1997).
Os danos gástricos causados pelo fumo estão relacionados com o aumento da
degranulação de mastócitos, aumento na formação de ROS (SALIM, 1992; WONG;
OGLE, 1995), estimulação do nervo vago para liberação de acetilcolina e,
consequentemente, aumento da secreção ácida e pepsinogênio, aumento da
motilidade, redução do fluxo sanguíneo e desestabilização do muco (LIGNY, VAN
CCAUTER; HENRY, 1989; ENDOH; LEUNG, 1994).
1.3.1 - Tratamento da úlcera
O tratamento da úlcera péptica está relacionado com a utilização de
medicamentos que diminuem a acidez gástrica e com os citoprotetores, além de
processos cirúrgicos quando a ulceração é considerada do tipo hemorrágica,
obstrutiva ou perfurativa (KOROLKOVAS; FRANÇA; CUNHA, 2004; LIPOF;
SHAPIRO; KOZOL, 2006).
A princípio, se pensava que as ulcerações gastrointestinais eram apenas
provocadas por alterações ácido-péptica, o que levou a descoberta de fármacos que
agem diminuindo a acidez. Estudiosos comprovaram que carbonato de cálcio
(CaCO
3
), um composto natural, apresentava ação antiácida, ou seja, neutralizava a
acidez e aumentava o pH luminal gástrico. Visto esse fato, antiácidos, como
bicarbonato de sódio, carbonato de cálcio, hidróxido de alumínio, hidróxido de
magnésio ou preparações combinadas (magaldrato) foram sintetizadas e
introduzidas na clínica (AIHARA et al., 2003). No entanto, esse efeito neutralizante
tinha um tempo muito curto no homem (MÖSSNER; CACA, 2005) e os sintomas
desconfortantes (dores, queimor) logo reapareciam juntamente com efeitos
colaterais, entre os quais: diarréia e constipação (KOROLKOVAS; FRANÇA;
CUNHA, 2004).
Na seqüência, os compostos anticolinérgicos, como pirenzepina e
telenzepina, foram utilizados na clínica em associação com antiácidos ou anti-
histamínicos H
2
para reduzir produção basal de ácido em cerca de 40 – 50 %, mas
devido a sua eficácia relativamente baixa, uma vez que interagem com receptores
muscarínicos M
1
e possuem acentuados efeitos colaterais (secura de boca, visão
38
enevoada, diarréia, cefaléias, confusão mental), esses medicamentos foram
considerados obsoletos para o tratamento da úlcera péptica (HOOGERWERF;
PASRICHA, 2005).
Posteriormente, outra classe terapêutica redutora da acidez, os antagonistas
do receptor H
2
(anti-histamínicos H
2
)
,
foi introduzida na clínica, se apresentando mais
eficaz que os antiácidos e responsável por 50 % da redução de cirurgias gástrica
(LIPOF; SHAPIRO; KOZOL, 2006). Os representantes dessa classe terapêutica são
cimetidina, ranitidina, nizatidina, famotidina, roxatidina e lafutidina (AIHARA et al.,
2003; KOROLKOVAS; FRANÇA; CUNHA, 2004). Esses fármacos atuam competindo
com a histamina pelos receptores H
2
nas células parietais, impedindo que ocorra a
estimulação ácida por esse mediador químico endógeno (MÖSSNER; CACA, 2005).
Contudo, o efeito anti-secretor de antagonistas H
2
não era totalmente eficaz devido a
necessidade de uso prolongado para cicatrização das úlceras e alguns pacientes
não respondiam ao tratamento, além disso, causavam inúmeros efeitos colaterais,
entre eles: diarréia, ansiedade, náusea, vômitos, cefaléia, sonolência, ginecomastia
e impotência (KOROLKOVAS; FRANÇA; CUNHA, 2004).
Em seguida, foram introduzidos na clínica os inibidores irreversíveis de
bomba H
+
/K
+
ATPase, medicamento de escolha nos dias atuais (LIPOF; SHAPIRO;
KOZOL, 2006). Os representantes desse grupo são omeprazol, lansoprazol,
pantoprazol e rabeprazol (AIHARA et al., 2003; KOROLKOVAS; FRANÇA; CUNHA,
2004). Esses são compostos benzimidazólicos e atuam como pró-fármacos,
mostrando-se mais eficazes que os antagonistas H
2
por inibirem o final da cascata
de formação do ácido na célula parietal (AIHARA et al., 2003; MÖSSNER; CACA,
2005). Semelhante às classes terapêuticas citadas anteriormente, os inibidores de
bomba H
+
/K
+
ATPase também apresentam efeitos colaterais, como: astenia,
cefaléia, hipertensão, taquicardia, insuficiência renal, tumores carcinóides gástrico,
anemia, leucopenia e eosinofilia (KOROLKOVAS; FRANÇA; CUNHA, 2004).
Com o avanço dos estudos, foi constatada a relação existente entre úlcera
péptica e infecção gastrointestinal provocada pela bactéria Helicobacter pylori
(MARSHALL; WARREN, 1984). Diante dessa nova descoberta, os clínicos passaram
a combinar os antagonistas H
2
ou inibidores de bomba H
+
/K
+
ATPase com
antibióticos que pudessem erradicar esse microorganismo. As combinações até hoje
aplicadas na clínica são: inibidores de bomba H
+
/K
+
ATPase/claritromicina/amoxicilina, inibidores de bomba H
+
/K
+
39
ATPase/claritomicina/metronidazol, ranitidina/metronidazol/tetraciclina ou
tetraciclina/metronidazol/quelatos de bismuto (MÖSSNER; CACA, 2005).
Medicamentos citoprotetores que visam promover cicatrização das ulcerações
por aumentar fatores protetores da mucosa também foram produzidos e introduzidos
na clínica, como: análogos de prostaglandinas (misoprostol), subcitrato de bismuto
coloidal e sucralfato (GOODMAN GILMAN et al., 2005).
O misoprostol é um análogo de PGE
1
que age no organismo semelhante as
PGE
2
endógenas aumentando a proteção gástrica através da produção de muco e
bicarbonato, regulando o fluxo sanguíneo local e motilidade gástrica, além de
apresentar a capacidade de inibir a secreção ácida via receptores EP
3
na célula
parietal (KOROLKOVAS; FRANÇA; CUNHA, 2004; GOODMAN GILMAN et al.,
2005). Atualmente, no Brasil, esse medicamento é exclusivamente utilizado em
ambientes hospitalares, uma vez que a população o utiliza para induzir ao aumento
das contrações uterinas culminando para o efeito abortivo.
O subcitrato de bismuto coloidal é um complexo coloidal do sal amônio
potássico de oxoidrocitratobismutato III. Promove atividade antiulcerogênica por
formar um precipitado abundante sobre as lesões impedindo a ação de agentes
agressores e facilitando a cicatrização. No entanto, esse medicamento pode causar
efeitos colaterais, como: anemia, náuseas, vômitos, cefaléia, encefalopatias
reversíveis e erupções cutâneas (KOROLKOVAS; FRANÇA; CUNHA, 2004).
O sucralfato é um complexo de sacarose sulfatada e hidróxido de alumínio
capaz de proteger a mucosa gástrica contra agentes lesivos por formar uma camada
viscosa sobre a mesma (RANG et al., 2004). Alguns efeitos colaterais estão
associados ao uso desse medicamento, como: constipação, sonolência, tonturas,
náuseas e cólicas (KOROLKOVAS; FRANÇA; CUNHA, 2004).
Atualmente, não há no mercado farmacêutico, um medicamento que produza
100 % de remissão das úlceras gastroduodenais (ALPER, 1993). A terapêutica é
composta por medicamentos de ação específica sobre receptores, enzimas e canais
iônicos e essas ações foram possíveis devido a contribuição dos produtos naturais,
toxinas e microorganismos (CALIXTO, 2003).
40
1.3.1.1 - Úlcera x produtos naturais
Estudos que visam identificar e viabilizar o uso de novos anti-secretores e
citoprotetores gástrico mais eficazes e com menos efeitos colaterais que as classes
existentes no mercado têm sido alvo de grande interesse pelos pesquisadores e
indústrias farmacêuticas. Considerando essa afirmação, os produtos naturais,
sobretudo as espécies vegetais, são os principais alvos farmacêuticos devido aos
inúmeros constituintes ativos existentes nas plantas que continuam desconhecidos
ou que não possuem estudos pré-clínicos e clínicos comprovados, mas podem ser
úteis no tratamento de muitas doenças entre as quais, a úlcera péptica.
Dentre as classes de compostos existentes nas plantas que apresentam
atividade antiulcerogênica, podem ser citadas: alcalóides, lignóides, saponinas,
sesquiterpenos, taninos e flavonóides (BORRELI; IZZO, 2000).
Os flavonóides são compostos polifenólicos sintetizados a partir do
aminoácido fenilalanina, conferem as colorações naturais das plantas e possuem
diversos efeitos bioativos considerados importantes para a saúde humana. São
utilizados constantemente pela população mundial através do consumo de vegetais,
frutas e remédios a base de plantas medicinais (DI CARLO et al., 1999).
Existem aproximadamente 4.000 tipos de flavonóides presentes nas espécies
vegetais. Estruturalmente, esses compostos são derivados benzo-γ-pirano com
baixo peso molecular, constituído de três anéis fenólicos centrais ou pirano referidos
como A, B e C (Figura 6), e diferem entre eles de acordo com as saturações,
substituintes dispostos nos anéis e possível presença de glicosídios. Portanto,
podem ser classificados em: flavonóide propriamente dito, isoflavonóide,
antocianidinas, chalcona, flavona, flavonol, flavanona e flavanol (DI CARLO et al.,
1999).
O
O
C
B
A
Figura 6. Estrutura básica de flavonóides (ZUANAZZI; MONTANHA, 2004).
3’
4’
3
4
2
5
8
7
6
5’
6’
2’
41
Quando absorvidos, esses compostos polifenólicos podem influenciar na
síntese de proteínas, diferenciação e proliferação celular e angiogênese,
apresentando benefícios marcantes no tratamento e prevenção de inúmeras
doenças. Esses compostos podem apresentar efeitos, como: protetor da integridade
vascular, antiosteoporótico, antineoplásico, antimutagênico, hepatoprotetor,
antiinflamatório, analgésico, antidiabético, anti-histamínico, antidiarréico,
antiespasmódico e gastroprotetor (DI CARLO et al., 1999; ZUANAZZI; MONTANHA,
2004). Muitos desses efeitos devem-se a atividade antioxidante apresentada pelos
flavonóides devido a capacidade de “varrerem” os radicais livres, doarem hidrogênio,
quelarem metais iônicos e impedirem a ação de oxigênios singletes e com elétrons
desemparelhados (PASTRADA-BONILLA et al., 2003).
O efeito gastroprotetor de alguns flavonóides pode ser mediado pela secreção
de muco e bicarbonato, aumento das PGs endógena, inibição das bombas H
+
/K
+
ATPases das células parietais impedindo a secreção ácida, “varredura” de radicais
livres e inibição de mediadores inflamatórios como leucotrienos e óxido nítrico (DI
CARLO et al., 1999; PARK et al., 2004; ZAYACHKIVSKA et al., 2005).
Dentre os flavonóides estudados com atividade antiulcerogênica, podem ser
citados: flavona, kaempferol, rutina, quercetina, luteolina e hipolaetina-8-glicosídeo
(IZZO, 1996; LA CASA et al., 2000).
Portanto, na pesquisa envolvendo plantas com atividade antiulcerogênica,
devem-se considerar como relevantes os seguintes dados:
1- A úlcera péptica é uma doença que apresenta considerável incidência mundial;
2- É uma doença crônica, quase sempre reincidente, que requer uma intervenção
terapêutica e/ou cirúrgica, acarretando transtornos financeiros para o indivíduo e
também para o sistema de saúde;
3- Não existe no mercado farmacêutico nenhum medicamento com 100% de
eficácia; além disso, apresentam efeitos limitados nas afecções crônicas, efeitos
colaterais e os medicamentos existentes são de alto custo;
4- A matéria-prima utilizada na produção dos produtos terapêuticos é importada, o
que representa dependência para a indústria farmacêutica nacional;
5- As plantas são fontes de constituintes terapêuticos potencialmente ativos, o que
se constitui uma grande estratégia para a descoberta de novos fármacos.
42
1.4 - Planta selecionada para estudo
A família Asteraceae é considerada uma das maiores famílias do reino
vegetal, possuindo aproximadamente 23.000 espécies distribuídas em 1.535
gêneros encontradas em quase todos os continentes, com exceção do Antártico. A
América Latina é considerada um centro diversificado dessa família e a América do
Sul comporta cerca de 20 % dos gêneros existentes. No Brasil, são estimados
aproximadamente 180 gêneros e 3.000 espécies distribuídas em todas as regiões
(SOUSA, 2007).
Dentre as espécies vegetais pertencentes à família Asteraceae que foram
investigadas cientificamente quanto à atividade antiulcerogênica podem ser citadas:
Ageratum conyzoides Linn. (SHIRWAIKAR; BHILEGAONKAR; MALINI; SHARATH
KUMAR, 2003; MAHMOOD; SIDIK; SALMAH; SUZAINUR; PHILIP, 2005), Artemisia
annua L. (DIAS et al., 2001); Artemisia douglasiana Besser (REPETTO et al., 2003);
Aster squamatus (Spreng.) Hieron. (GHEDININ et al., 2002); Baccharis genistelloides
Pers. (GONZALES et al., 2000); Baccharis illinita DC (BAGGIO et al., 2003);
Baccharis rubricaulis Rusby. (GONZALES et al., 2000); Baccharis teindalensis L.
(VIDARI et al., 2003); Bidens pilosa L. var radiata Schult. Bip. (AVALOS et al., 1984;
ALVAREZ et al., 1999); Bidens subalternans DC. (ORTEGA et al., 2000); Franseria
artemisioides Willd. (GONZALES et al., 2000); Neurolaena lobata (L.) R. Br.
(GRACIOSO et al., 2000); Tanacetum vulgare L. (TOURNIER et al., 1999) e
Vernonia condensate Baker (FRUTUOSO et al., 1994). A atividade antiulcerogênica
dessas espécies está relacionada com possíveis mecanismos antioxidante,
citoprotetor ou anti-secretor.
A planta selecionada para estudo, Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King &
H. Robinson (Figura 7) pertence a tribo Eupatorieae, uma das tribos da família
Asteraceae e que consiste de aproximadamente 2.400 espécies distribuídas em 170
gêneros (HSU; PENG; WANG, 2006). Essa espécie possui como sinonímias
científicas: Eupatorium clematideum Griseb. e Eupatorium urticifolium var.
clematideum (Griseb.) Hieron. ex Kuntze.
43
Figura 7. Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson.
Praxelis clematidea é uma erva perene e nativa da América do Sul, havendo
relatos de sua distribuição na Bolívia, Peru, Argentina e Brasil (principalmente, nos
estados da Bahia, Alagoas, Pernambuco, Paraiba, Amazonas e Mato Grosso). No
entanto, essa erva está sendo disseminada no mundo, uma vez que pode ser
destacado relatos de invasões à pastos e vegetações nativas na Austrália e China
(POLLOCK et al., 2004; PACIFIC ISLAND ECOSYSTEMS AT RISK – PIER, 2005;
WANG et al., 2007).
As principais características físicas de P. clematidea que podem ser
visualizadas são: normalmente possui 40 - 80 cm de altura, mas pode alcançar até 1
m; seus talos são peludos e frágeis, as folhas são opostas e triangulares com ápices
agudos, peludas e dentadas ao longo das extremidades; as flores são agrupadas no
final dos talos e possuem coloração que variam de lilás a azul (QUEENSLAND
GOVERNMENT, 2001).
Praxelis clematidea não apresenta indicação popular, no entanto, é
confundida pela população com espécies do gênero Ageratum devido a semelhança
nos aspectos físicos e estas espécies possuem indicação para febre, dores
articulares, inflamações, úlcera péptica e diarréia (CORLETT; SHAW, 1995; NOUMI;
DIBAKTO, 2000; QUEENSLAND GOVERNMENT, 2001; POLLOCK et al., 2004).
44
Bohlmann e colaboradores (1984) isolaram e sintetizaram de P. clematidea o
composto N-(acetoxi)-jasmonoilfenilalanina-metil-éster (Figura 8) pertencente a
classe dos terpenóides, enquanto que a equipe do Prof. Dr. Barbosa-Filho
(LTF/UFPB) isolou da fase clorofórmica obtida das partes aéreas dessa espécie 5’-
hidroxi-4’,7-dimetoxiflavona, 4’,5,6,7-tetrametoxiflavona, 4’,5,7-trimetoxiflavona e
4’,5-dihidroxi-7-metoxiflavona, flavonóides do tipo flavonas (Figura 8).
Através de análise por cromatografia gasosa, Wang e colaboradores (2006)
detectaram sesquiterpenos e monoterpenos no óleo essencial extraído de P.
clematidea. Esses pesquisadores observaram os efeitos inibidores do óleo essencial
sobre o crescimento de duas espécies vegetais, Lactuca sativa e B. campestris, e
também sobre o crescimento de colônias fúngicas, Fusarium oxysporum e
Phytophthora capsici.
OH
CO
2
H
O
O
O
MeO
OMe
OH
O
O
O
H
OH
MeO
O
O
MeO
OMe
OMe
O
O
MeO
OMe
OMe
MeO
Figura 8. Constituintes ativos isolados de P. clematidea. (A) N-(acetoxi)-jasmonoilfenilalanina-metil-
éster; (B) 5-Hidroxi-7,4’-dimetoxiflavona; (C) 5,4’-dihidroxi-7-metoxiflavona; (D) 5,7,4’-trimetoxiflavona
e (E) 5,6,7,4’-tetrametoxiflavona.
No entanto, levantamentos sobre a existência de estudos toxicológicos e
farmacológicos de Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson não
constam nos bancos de dados de pesquisas científicas.
(A) (B)
(C)
(D)
(E)
45
Considerando que essa espécie vegetal não possui relatos de estudos
farmacológicos, é utilizada de forma equivocada no tratamento de doenças pela
população e ainda apresenta compostos ativos como flavonas, potencialmente
ativas contra úlcera péptica, decidimos investigar possíveis efeitos antiulcerogênicos
de Praxelis clematidea, tomando por base o critério quimiotaxonômico.
46
II
II II
II –
––
–
OBJETIVOS
OBJETIVOSOBJETIVOS
OBJETIVOS
2.1 - Objetivo geral
Esse trabalho teve como objetivo principal contribuir com o entendimento da
fisiopatologia da úlcera gástrica através da investigação da atividade
antiulcerogênica de P. clematidea, na perspectiva de encontrar uma nova alternativa
terapêutica.
2.2 - Objetivos específicos
Realizar triagem farmacológica comportamental com o extrato etanólico
bruto obtido das partes aéreas da espécie vegetal Praxelis clematidea
(Griseb.) R. M. King & H. Robinson em animais;
Determinar a dose letal 50 % (DL
50
) do extrato etanólico bruto;
Avaliar a atividade antiulcerogênica do extrato etanólico bruto e da fase
clorofórmica nos modelos clássicos de indução aguda de úlcera gástrica
em animais;
Definir a dose do extrato etanólico bruto e da fase clorofórmica que produz
melhor efeito farmacológico nos modelos de indução aguda de úlcera
gástrica;
Avaliar os parâmetros bioquímicos da secreção gástrica mediante
tratamento com o extrato etanólico bruto e fase clorofórmica;
Avaliar os prováveis mecanismos envolvidos com a atividade
antiulcerogênica.
48
III
III III
III –
––
–
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS E MÉTODOSMATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - LOCAL DA PESQUISA
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado da
Paraíba (FAPESQ), desenvolvido no Laboratório de Ensaios Toxicológicos
(LABETOX), localizado no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF) Prof. Dr.
Delby Fernandes de Medeiros da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), e no
Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais da Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP) no período de Março 2006 a Setembro de 2007.
3.2 - ESPÉCIE VEGETAL ESTUDADA
O material botânico utilizado para os experimentos de investigação da
atividade antiulcerogênica em animais foram às partes aéreas de Praxelis
clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson coletada na Lagoa do Paturi,
localizada no Município de Santa Rita – Paraíba.
A espécie vegetal Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson foi
identificada botanicamente pela Profa. Dra. Maria de Fátima Agra e colaboradores
(JPB). Uma amostra da espécie foi depositada no Herbário de Coleção de
Referência do LTF com o n. 6894.
O extrato etanólico bruto (EEtOH) e a fase clorofórmica (FCHCl
3
) obtidos das
partes aéreas de Praxelis clematidea, conforme a marcha fitoquímica de extração
visualizada na Figura 9, foram fornecidos pelo Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho,
pesquisador do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica nesta instituição.
50
Figura 9. Marcha fitoquímica de obtenção do EEtOH e FCHCl
3
de P. clematidea.
3.3 - ANIMAIS
Para a realização desse trabalho, todos os protocolos experimentais foram
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal – CEPA/LTF/UFPB com o
registro n. 0209/06.
Os animais foram provenientes do Biotério Prof. Dr. Thomas George (BTG) do
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica – LTF e do Centro de Bioterismo da
UNICAMP (CEMIB). Os animais foram aclimatados às condições do biotério local
sob temperatura 21 ± 1 ºC, ciclo claro-escuro de 12 h, alimentados com ração Purina
tipo pellets e água à vontade.
Os animais utilizados nos experimentos foram camundongos Swiss (Mus
musculus) e ratos Wistar (Rattus novergicus) albinos machos pesando entre 25-40 g
e 180-250 g, respectivamente (Figura 10).
Maceração em EtOH a 95% (3x)
Concentração em rotaevaporador sob pressão reduzida
Material seco e pulverizado – Partes aéreas de P. clematidea (3,8 kg)
Extrato etanólico bruto (EEtOH
-
338 g)
Partição com éter etílico,
Sob agitação mecânica (3x) 500ml
Extrato Etéreo
Resíduo Insolúvel
1- Concentração em rotaevaporador
2- Solubilização do resíduo em MeOH:H2O (3 : 2)
3- Partição com hexano
4- Partição com clorofórmio
Fase Hexânica
Fase Clorofórmica (FCHCl
3
- 15,41 g)
51
Figura 10. Animais utilizados nos experimentos: Ratos Wistar (A) e Camundongos Swiss (B).
Para a realização dos experimentos, os animais foram submetidos a um jejum
(12 – 36 h) que variou de acordo com o preconizado nas metodologias empregadas.
Todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Os animais (5 – 10)
foram distribuídos em grupos controle negativo, controle positivo e amostra vegetal
testada.
3.4 - DROGAS UTILIZADAS
Para a realização dos experimentos, foram utilizadas as seguintes drogas:
carbenoxolona (SIGMA Chemical Co, U.S.A), cimetidina (SIGMA Chemical Co,
U.S.A), lansoprazol 30 mg (ACHÉ, Brasil), piroxicam 20 mg (HEXAL, Brasil), N-
etilmaleimida (SIGMA Chemical Co, U.S.A), N
ω
-nitro-L-arginina-metil-ester (SIGMA
Chemical Co, U.S.A), cloreto de sódio P.A. (QUIMEX-MERCK, Brasil), hidróxido de
sódio (QUIMEX-MERCK, Brasil), fenoftaleína (RIEDEL-DE HAËN, Germany), tween
80 (MERCK, Germany), etanol (MERCK, Germany) e Alcian Blue (SIGMA Chemical
Co, U.S.A).
O EEtOH e a FCHCl
3
foram solubilizados em solução tween 80 a 12 % e
todas as substâncias foram preparadas imediatamente antes de cada experimento.
(A)
(B)
52
3.5 - AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES TOXICOLÓGICA E FARMACOLÓGICA
Inicialmente, o EEtOH obtido das partes aéreas de P. clematidea foi
submetido a um estudo de avaliação de toxicidade através de triagem
comportamental e determinação da dose letal 50 %. Além disso, com a realização
desse estudo, foi possível inferir as doses do EEtOH que seriam utilizadas nos
estudos farmacológicos.
Para avaliar a atividade antiulcerogênica do EEtOH e FCHCl
3
foram
realizados experimentos de indução aguda de úlcera gástrica pelos agentes lesivos:
etanol, estresse e antiinflamatório não-esteroidal. Para corroborar aos dados, foi
realizada a avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico (pH,
concentração de H
+
e volume do suco gástrico) baseando-se em modelo de ligadura
do piloro. Os mecanismos de ação envolvidos gastroproteção foram investigados a
partir da quantidade de muco gástrico, participação dos compostos sulfidrílicos e de
óxido nítrico. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e o estômago
aberto ao longo da grande curvatura.
Através de uma lupa OLYMPUS Optical TL3 - SZ40, as lesões ulcerativas
(Figura 11) foram macroscopicamente quantificadas e expressas como índice de
lesão ulcerativo (ILU), conforme o número e a severidade (SZELENYI; THIEMER,
1978):
nível 1: pontos hemorrágicos e ulcerações até 1 mm;
nível 2: ulcerações com 2 mm;
nível 3: ulcerações profundas a partir de 3 mm.
ILU = ∑ (lesões nível 1 x 1) + (lesões nível 2 x 2) + (lesões nível 3 x 3)
Figura 11: Lesões ulcerativas em estômago de rato.
53
3.5.1 - Triagem farmacológica comportamental e determinação da dose letal
50% (DL
50
)
Os experimentos foram realizados de acordo com o protocolo experimental
descrito por Almeida e colaboradores (1999). Foram utilizados camundongos
machos (n = 10) distribuídos em grupos de acordo com a via de administração do
EEtOH de P. clematidea. Pela via intraperitoneal (i.p.), foram administradas as doses
2000, 1000, 500, 250 e 125 mg/kg e pela via oral (v.o.), as doses administradas
foram 5000, 2500, 1250, 625 e 312,5 mg/kg.
Uma série de comportamentos descritos no protocolo experimental (anexo A)
foram observados durante as 4 primeiras horas: intervalos de 30 minutos, 1 hora, 2
horas, 3 horas e 4 horas. A ocorrência de alguma alteração comportamental nos
animais, em decorrência do tratamento com o EEtOH de Praxelis clematidea,
permitiria inferir uma relação com a atividade no sistema nervoso central e,
consequentemente, sinais de toxicidade.
Os animais permaneceram sendo observados por cada 24 horas até que se
completasse um período de 72 horas com a finalidade de verificar se haveria alguma
morte e, consequentemente, determinar a DL
50
do EEtOH de P. clematidea nas duas
vias de administração empregadas.
3.5.2 - Investigação da atividade antiulcerogênica de Praxelis clematidea
(Griseb.) R. M. King & H. Robinson
Os modelos de indução aguda de úlcera gástrica em animais são
considerados clássicos para estudo da atividade antiulcerogênica por serem
capazes de mimetizar as principais causas de úlcera no homem.
54
3.5.2.1 - Indução de úlcera gástrica pelo etanol
Para a realização desse experimento, foi seguido o modelo de Morimoto e
colaboradores (1991), porém com algumas modificações. Ratos Wistar machos (n =
6) foram submetidos a jejum de 24 horas e, posteriormente, divididos em grupos,
conforme o pré-tratamento (v.o.): solução tween 80 a 12% (controle negativo),
lansoprazol 30 mg/kg (controle positivo), EEtOH (250, 500 e 750 mg/kg) e FCHCl
3
(125, 250 e 500 mg/kg) de P. clematidea. Após 60 minutos, foram administrados 4
mL/kg de etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via oral. Os animais foram
sacrificados 1 hora após a administração do agente lesivo, os estômagos foram
retirados, abertos ao longo da grande curvatura e as lesões foram quantificadas para
que se determinasse o índice de lesão ulcerativo (ILU) de cada animal.
3.5.2.2 - Indução de úlcera gástrica por estresse (imobilização e frio)
Esse experimento foi baseado no modelo de Levine (1971) com modificações.
Após jejum de 24 horas, camundongos (n = 5 - 6) foram distribuídos em grupos
conforme o pré-tratamento (v.o.): solução tween 80 a 12% (controle negativo),
cimetidina 100 mg/kg (controle positivo), EEtOH (250, 500 e 750 mg/kg) e FCHCl
3
(125, 250 e 500 mg/kg) de P. clematidea. Após 30 minutos do pré-tratamento, os
animais foram imobilizados pelas patas dianteiras e traseiras, colocados em
contensores de PVC (9 cm de comprimento x 3,5 cm de diâmetro) e submetidos a
uma temperatura de 4 ± 1 ºC por um período de 3 horas para indução das úlceras
gástricas. Ao final deste período, os animais foram sacrificados, os estômagos foram
retirados, abertos ao longo da grande curvatura e as lesões foram quantificadas para
que se determinasse o índice de lesão ulcerativo (ILU) de cada animal.
55
3.5.2.3 - Indução de úlcera gástrica por antiinflamatório não-esteroidal
(piroxicam)
Esse experimento foi baseado no modelo de Puscas e colaboradores (1997)
com modificações. Após jejum 24 horas, camundongos (n = 5 - 6) foram distribuídos
em grupos conforme o pré-tratamento (v.o.): solução tween 80 a 12 % (controle
negativo), cimetidina 100 mg/kg (controle positivo), EEtOH (250, 500 e 750 mg/kg) e
FCHCl
3
(125, 250 e 500 mg/kg) de P. clematidea. Após 30 minutos, a ulceração
gástrica foi induzida por administração subcutânea (s.c.) de piroxicam 30 mg/kg.
Cerca de 4 horas após a indução das lesões, os animais foram sacrificados, os
estômagos foram retirados, abertos ao longo da grande curvatura e as lesões
ulcerativas foram quantificadas para que se determinasse o índice de lesão
ulcerativo (ILU) de cada animal.
3.5.3 - Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico através do
modelo ligadura do piloro
Esse experimento foi baseado no modelo descrito por Shay e colaboradores
(1945), modificado. Após jejum de 36 horas, ratos (n = 5) foram anestesiados com
cloridrato de xilazina 2 % (5 U/100g) e cloridrato de quetamina 5 % (10 U/100g),
administrados por via intramuscular (i.m.). Os animais foram submetidos a uma
incisão longitudinal abaixo da apófise xifóide. Em seguida, foi realizada a ligadura do
piloro, e as substâncias foram administradas por via intraduodenal (i.d.): solução
tween 80 a 12 % (controle negativo), cimetidina 100 mg/kg (controle positivo),
EEtOH 500 mg/kg e FCHCl
3
125 mg/kg de P. clematidea. Após 4 horas da
administração das substâncias, os animais foram sacrificados, as incisões reabertas,
os estômagos pinçados na cárdia para que não houvesse perdas do conteúdo
gástrico e abertos ao longo da grande curvatura. Todo o conteúdo estomacal foi
retirado para determinação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico: volume do
suco gástrico, pH e concentração de íons hidrogênio (H
+
).
56
O conteúdo do estômago foi pesado e, em seguida, calculado o volume do
suco gástrico expresso em g/4h. O pH foi verificado com o auxílio de um pHmetro
digital PG 2000 (GEHAKA, Brasil) após centrifugação do conteúdo estomacal a 3000
rpm por 10 minutos. Sendo expresso em unidades. Foram retirados 10 ml do
sobrenadante, sendo esse distribuído em alíquotas de 5 mL em 2 erlenmeyer para
que fosse prosseguida a titulação do suco gástrico e determinada a concentração de
H
+
expressa em mEq/mL/4h. Para a titulação foi utilizada solução de hidróxido de
sódio (NaOH) 0,01 N e fenolftaleína como solução indicadora com auxílio de uma
bureta digital Solarus
®
(HIRSCHMANN LABORGERATE, U.S.A).
3.5.4 - Avaliação dos mecanismos de ação envolvidos na atividade
antiulcerogênica de Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson
3.5.4.1 -
Determinação de muco aderido à mucosa gástrica
Para a realização desse experimento, foi seguido o modelo modificado de
Raffatullah e colaboradores (1990). Após jejum 24 horas, ratos (n = 9 - 10) foram
anestesiados, o abdômen incisado e feita a ligadura do piloro, de acordo com o
modelo anterior. Os animais foram divididos em grupos, conforme a administração
intraduodenal das substâncias para o pré-tratamento: solução tween 80 a 12 %
(controle negativo), carbenoxolona 200 mg/kg (controle positivo) e FCHCl
3
125
mg/kg da espécie em estudo. Após 4 horas da administração, os animais foram
sacrificados por deslocamento cervical, os estômagos retirados e abertos ao longo
da grande curvatura.
A porção glandular do estômago foi separada, pesada e imersa em 10 mL de
solução de alcian blue por 2 horas. O excesso de alcian blue foi removido lavando-
se o estômago com 7 mL de solução de sacarose 0,25 mol/L por duas vezes
sucessivas (por 15 minutos e por 45 minutos); O corante complexado ao muco
aderido à parede gástrica foi extraído com 10 mL de cloreto de magnésio 0,5 mol/L,
agitando-se intermitentemente por um minuto, a cada 30 minutos, durante 2 horas.
57
Uma alíquota de 4 mL da mistura foi retirada, na qual foram adicionados 4 mL
de éter etílico, seguida de agitações por 2 minutos. A emulsão obtida foi centrifugada
por 10 minutos a 3600 rpm e o sobrenadante foi descartado. As absorbâncias foram
lidas em espectrofotômetro (modelo Multiscan, marca Labsystems) a 598 nm. A
determinação da concentração de alcian blue foi feita por intercalação em uma curva
padrão com várias concentrações de Alcian Blue. Os resultados foram expressos em
mg de alcian blue/g de tecido (porção glandular).
3.5.4.2 - Participação do óxido nítrico (NO) na citoproteção
Esse experimento foi realizado baseando-se no modelo modificado de Sikiric
e colaboradores (1997). Ratos (n = 6) foram submetidos a jejum de 24 horas e
distribuídos em oito grupos. Conforme o pré-tratamento, 4 grupos receberam
veículo (solução tween 80 a 12 %) e os outros 4 grupos receberam N
ω
-nitro-L-
arginina-metil-éster (L-NAME) 70 mg/kg (i.p.), um bloqueador da enzima sintase de
óxido nítrico. Após 30 minutos dessa administração, cada quatro grupos foram
tratados oralmente com solução tween 80 a 12 % (controle negativo), carbenoxolona
100 mg/kg (controle positivo), EEtOH 500 mg/kg e FCHCl
3
125 mg/kg de P.
clematidea. Após 60 minutos desse tratamento, as lesões gástricas agudas foram
induzidas por etanol (4 mL/kg - v.o.). Decorrido 1 h da indução das lesões, os
animais foram sacrificados, os estômagos foram retirados, abertos ao longo da
grande curvatura e as ulcerações foram quantificadas para que se determinasse o
índice de lesão ulcerativo (ILU) de cada animal.
3.5.4.3 - Participação de grupamentos sulfidrílicos (SH) na citoproteção
Para a realização desse experimento, foi utilizado o modelo modificado de
Matsuda e colaboradores (1999). Ratos (n = 6) foram submetidos a jejum de 24
horas e distribuídos em oito grupos. Conforme o pré-tratamento, 4 grupos
receberam veículo (solução tween 80 a 12 %) e os outros 4 grupos receberam N-
58
etilmaleimida (NEM) 10 mg/kg (i.p.), inibidor de grupamentos sulfidrílicos. Após 30
minutos dessa administração, cada quatro grupos foram tratados oralmente com
solução tween 80 a 12 % (controle negativo), carbenoxolona 100 mg/kg (controle
positivo), EEtOH 500 mg/kg e FCHCl
3
125 mg/kg de P. clematidea. Após 60 minutos
desse tratamento, as lesões gástricas agudas foram induzidas por etanol (4 mL/kg -
v.o.). Decorrido 1 h da indução das lesões, os animais foram sacrificados, os
estômagos foram retirados, abertos ao longo da grande curvatura e as ulcerações
foram quantificadas para que se determinasse o índice de lesão ulcerativo (ILU) de
cada animal.
3.6 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para os modelos que investigam a atividade antiulcerogênica, o ILU de cada
animal foi submetido à análise de variância de uma via (ANOVA) seguido de um
pós-teste, teste de Dunnett (para comparação dos grupos tratados com o grupo
controle negativo) ou teste de Tukey-Kramer (para comparação entre os grupos
tratados e escolha da melhor dose do EEtOH e FCHCl
3
). O nível de significância
mínimo considerado foi 0,05 (p < 0,05). O ILU para cada grupo foi expresso como
média ± desvio padrão (d.p.). O programa estatístico utilizado foi o GraphPad Prism
versão 4 de Abril de 2003.
59
IV
IV IV
IV –
––
–
RESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOS
4.1 - AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES TOXICOLÓGICA E FARMACOLÓGICA
4.1.1 - Triagem farmacológica comportamental e determinação da dose letal 50
% (DL
50
)
Seguindo os parâmetros citados por Almeida e colaboradores (1999), quando
comparados ao grupo controle (solução tween 80 a 12%), os animais não
apresentaram alterações de comportamento após a administração do EEtOH,
preparado a partir das partes aéreas de P. clematidea, pelas vias oral e
intraperitoneal nas doses crescentes até 5000 e 2000 mg/kg, respectivamente,
durante o tempo de observação preconizado. Esses resultados indicam que o
EEtOH, em nossas condições experimentais, não apresentou toxicidade uma vez
que não houve alterações sobre o sistema nervoso central.
Foi possível observar também que não houve mortes de animais durante 72
horas após a administração do EEtOH de P. clematidea, impossibilitando a
determinação da DL
50
.
4.1.2 - Investigação da atividade antiulcerogênica de Praxelis clematidea
(Griseb.) R. M. King & H. Robinson
Diante dos resultados dos experimentos que avaliaram a toxicidade do EEtOH
de P. clematidea, foi possível estabelecer as doses para os experimentos de
investigação da atividade antiulcerogênica.
De acordo com Souza Brito (1994), quando não existe uma DL
50
estabelecida,
o extrato bruto vegetal deverá ser avaliado em estudos farmacológicos utilizando-se
doses até o valor máximo de 1000 mg/kg. Diante desse relato, as doses do EEtOH
da espécie vegetal em estudo foram definidas fracionando 1000 mg/kg em doses
capazes de inibirem o número de lesões gástricas, portanto, foram selecionadas
250, 500 e 750 mg/kg.
61
A escolha das doses para a FCHCl
3
foi baseada nos efeitos antiulcerogênicos
apresentados pelo EEtOH de P. clematidea, portanto, foram selecionadas 125, 250
e 500 mg/kg.
4.1.2.1 - Indução de úlcera gástrica pelo etanol
Os resultados obtidos para a espécie P. clematidea, após realização do
modelo de indução de úlcera gástrica etanol (v.o.) em ratos, demonstraram que o
lansoprazol (30 mg/kg) e o EEtOH (250, 500 e 750 mg/kg) inibiram
significativamente o ILU em 54, 77, 95 e 94 %, respectivamente, quando
comparados ao grupo controle negativo, solução tween 80 a 12 %. Esses dados
estão compilados na tabela 1.
Tabela 1. Efeito da administração oral de lansoprazol e EEtOH obtido das partes
aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por etanol em ratos
Tratamento (v.o.) n ILU (média ± d.p.) Inibição das lesões (%)
Solução tween 80 (12 %) 6 177 ± 29 -
Lansoprazol 30 mg/kg 6 81 ± 21 ** 54
EEtOH 250 mg/kg 6 41 ± 12 ** 77
EEtOH 500 mg/kg 6 9 ± 4 ** 95
EEtOH 750 mg/kg 6 10 ± 3 ** 94
ANOVA: F
(4,25)
= 101 (p < 0,05), seguido do teste de Dunnett **p < 0,01
Os resultados obtidos nesse mesmo modelo para a FCHCl
3
obtida de P.
clematidea demonstraram que o lansoprazol e a fase nas doses 125, 250 e 500
mg/kg também inibiram significativamente as lesões ulcerativas em 49, 75, 83 e 88
% respectivamente nas mesmas condições. Esses resultados encontram-se
dispostos na tabela 2.
62
Tabela 2. Efeito da administração oral de lansoprazol e FCHCl
3
obtida das partes
aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por etanol em ratos
Tratamento (v.o.) n ILU (média ± d.p.) Inibição das lesões (%)
Solução tween 80 (12 %) 6 100 ± 8 -
Lansoprazol 30 mg/kg 6 51 ± 13 ** 49
FCHCl
3
125 mg/kg 6 25 ± 9 ** 75
FCHCl
3
250 mg/kg 6 17 ± 5 ** 83
FCHCl
3
500 mg/kg 6 12 ± 3 ** 88
ANOVA: F
(4,25)
= 116 (p < 0,05), seguido do teste de Dunnett **p < 0,01.
Portanto, o EEtOH e a FCHCl
3
obtidos das partes aéreas de Praxelis
clematidea apresentaram significativa atividade antiulcerogênica frente aos danos
gástricos provocados pelo etanol. Nesse modelo, comparando entre si os grupos
tratados com o EEtOH e também com a FCHCl
3
nas doses empregadas, observou-
se que não existe diferença significativa na proteção entre elas, o que permitiu
indicar a dose efetiva de 500 mg/kg para o EEtOH e de 125 mg/kg para a FCHCl
3
,
representando cerca de 95 e 75 % de inibição das lesões ulcerativas,
respectivamente.
4.1.2.2 - Indução de úlcera gástrica por estresse (imobilização e frio)
No modelo de indução aguda de úlcera gástrica pelo agente lesivo estresse
que é induzido por imobilização e frio utilizando camundongos, os resultados
demonstraram que a cimetidina (100 mg/kg) e EEtOH (250, 500 e 750 mg/kg) obtido
de P. clematidea reduziram significativamente o ILU, protegendo a mucosa gástrica
em 87, 87, 89 e 87 %, respectivamente, quando comparados ao grupo controle
negativo, solução tween 80 a 12 %. Os dados estão expressos na tabela 3.
63
Tabela 3. Efeito da administração oral de cimetidina e EEtOH obtido das partes
aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por estresse (imobilização e
frio) em camundongos
Tratamento (v.o.) n ILU (média ± d.p.) Inibição das lesões (%)
Solução tween 80 (12 %) 5 95 ± 12 -
Cimetidina 100 mg/kg 5 12 ± 4 ** 87
EEtOH 250 mg/kg 5 12 ± 4 ** 87
EEtOH 500 mg/kg 5 10 ± 4 ** 89
EEtOH 750 mg/kg 5 12 ± 3 ** 87
ANOVA: F
(4,20)
= 188 (p < 0,05), seguido do teste de Dunnett **p < 0,01.
Em outro experimento em que foi avaliado o efeito da FCHCl
3
, foi observado
que a cimetidina (100 mg/kg) e a FCHCl
3
(125, 250 e 500 mg/kg) reduziram
significativamente as lesões gástricas provocadas pelo estresse, protengendo a
mucosa em 57, 74, 58 e 59 % de inibição das lesões quando comparados ao grupo
controle negativo, tween 80 a 12 %, respectivamente. Esses dados podem ser
visualizados na tabela 4.
Tabela 4. Efeito da administração oral de cimetidina e FCHCl
3
obtida das partes
aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por estresse (imobilização e
frio) em camundongos
Tratamento (v.o.) n ILU (média ± d.p.) Inibição das lesões (%)
Solução tween 80 (12 %) 6 108 ± 35 -
Cimetidina 100 mg/kg 6 46 ± 4,2 ** 57
FCHCl
3
125 mg/kg 6 28 ± 4,0 ** 74
FCHCl
3
250 mg/kg 6 45 ± 4,0 ** 58
FCHCl
3
500 mg/kg 6 44 ± 14 ** 59
ANOVA: F
(4, 20)
= 20 (p < 0,05), seguido do teste de Dunnett **p < 0,01.
64
Portanto, o EEtOH e a FCHCl
3
obtidos das partes aéreas de Praxelis
clematidea apresentaram significativa atividade antiulcerogênica frente aos danos
gástricos provocados pelo estresse.
4.1.2.3 - Indução de úlcera gástrica por antiinflamatório não-esteroidal
(piroxicam)
Na tabela 5, podem ser observados os resultados da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e do EEtOH (250, 500 e 750 mg/kg) obtido de P. clematidea
em camundongos, quando esses animais foram submetidos a indução de úlcera
gástrica por antiinflamatório não-esteroidal, piroxicam 30 mg/kg (s.c.). Os resultados
corresponderam à redução significativa do ILU em 65, 88, 75 e 76 % quando
comparados ao controle negativo.
Tabela 5. Efeito da administração oral de cimetidina e EEtOH obtido das partes
aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por antiinflamatório não-
esteroidal (piroxicam 30 mg/kg) em camundongos
Tratamento (v.o.) n ILU (média ± d.p.) Inibição das lesões (%)
Solução tween 80 (12 %) 5 51 ± 15 -
Cimetidina 100 mg/kg 5 18 ± 9 ** 65
EEtOH 250 mg/kg 5 6 ± 1 ** 88
EEtOH 500 mg/kg 5 13 ± 3 ** 75
EEtOH 750 mg/kg 5 12 ± 4 ** 76
ANOVA: F
(4, 20)
= 23 (p < 0,05), seguido do Teste de Dunnett **p < 0,01
Semelhantemente, foram avaliados os efeitos da administração oral de
cimetidina e da FCHCl
3
(125, 250 e 500 mg/kg) obtida de P. clematidea em
camundongos submetidos aos danos gástricos provocados pelo antiinflamatório
não-esteroidal. Nessas condições, os resultados demonstraram que houve
65
significativa redução no número de lesões em 83, 67, 67 e 56 % quando
comparados ao grupo tratado com solução tween 80 a 12 %. Esses dados estão
compilados na tabela 6.
Tabela 6. Efeito da administração oral de cimetidina e FCHCl
3
obtida das partes
aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por antiinflamatório não-
esteroidal (piroxicam 30 mg/kg) em camundongos
Tratamento (v.o.) n ILU (média ± d.p.) Inibição das lesões (%)
Solução tween 80 (12 %) 5 18 ± 1,1 -
Cimetidina 100 mg/kg 5 3 ± 1,1 ** 83
FCHCl
3
125 mg/kg 5 6 ± 1,1 ** 67
FCHCl
3
250 mg/kg 5 6 ± 2,0 ** 67
FCHCl
3
500 mg/kg 5 8 ± 2,2 ** 56
ANOVA: F
(4, 20)
= 68 (p < 0,05), seguido do Teste de Dunnett **p < 0,01
Assim, diante dos resultados apresentados com a realização desse
experimento, o EEtOH e a FCHCl
3
obtido das partes aéreas de Praxelis clematidea
apresentaram significativa atividade antiulcerogênica, uma vez que foram capazes
de reduzir o desenvolvimento das úlceras gástricas provocadas normalmente pela
ação do piroxicam quando administrado de forma aguda.
Analisando a proteção promovida tanto pelo EEtOH quanto pela FCHCl
3
obtidos de P. clematidea nos modelos de indução aguda de úlcera gástrica que
avaliam a existência de possível atividade antiulcerôgenica, foi possível definir as
melhores doses efetivas para que fosse investigado as vias envolvidas na proteção.
Portanto, para o EEtOH a dose foi de 500 mg/kg e para a FCHCl
3
foi de 125 mg/kg,
uma vez que os modelos seguidos para investigação dos mecanismos de ação
tinham como agente lesivo da mucosa gástrica o etanol e os animais utilizados
foram ratos.
66
4.1.3 - Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico através do
modelo ligadura do piloro
No modelo de ligadura do piloro foram avaliados os parâmetros bioquímicos
gástrico, como pH, concentração de H
+
e volume do suco gástrico após
administração intraduodenal de solução tween 80 a 12%, cimetidina 100 mg/kg,
EEtOH (500 mg/kg) e FCHCl
3
(125 mg/kg) em ratos. Os resultados para esse
experimento estão expressos na tabela 7.
Os resultados indicam que o EEtOH e a FCHCl
3
obtidos das partes aéreas de
Praxelis clematidea, nas doses empregadas, não foram capazes de alterar o pH,
concentração de H
+
e volume do suco gástrico quando comparados ao grupo
controle negativo, solução tween 80 a 12 %. Entretanto, os animais que foram
tratados com cimetidina apresentaram uma redução na acidez gástrica, refletido no
aumento do pH e redução na concentração de H
+
.
Tabela 7. Efeito da administração intraduodenal de cimetidina, EEtOH e FCHCl
3
obtidos das partes aéreas de P. clematidea sobre os parâmetros bioquímicos do
suco gástrico após a ligadura do piloro em ratos
Tratamento (
i.d.
)
n
pH
(unidades)
Concentração de H
+
(mEq/mL/4h)
Volume do suco
gástrico (g/4h)
Solução tween 80 (12 %) 5 2,7 ± 0,09 14,1 ± 3,70 0,8 ± 0,10
Cimetidina 100 mg/kg 5 4,1 ± 0,32 ** 6,0 ± 1,20 ** 0,8 ± 0,32
EEtOH 500 mg/kg 5 2,8 ± 0,25 12,5 ± 1,4 0,7 ± 0,15
FCHCl
3
125 mg/kg 5 2,7 ± 0,10 14 ± 0,9 0,6 ± 0,11
ANOVA: F
(3, 13)
= 52 para pH; F
(3, 16)
= 17 para concentração de H
+
; F
(3, 16)
= 0,8 para volume gástrico
(p<0.05), seguido do teste de Dunnett **p < 0,01. Resultados expressos como média ± d.p.
67
4.1.4 - Avaliação dos mecanismos de ação envolvidos na atividade
antiulcerogênica de Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson
4.1.4.1 - Determinação de muco aderido à mucosa gástrica
Nesse experimento, foi avaliada a capacidade da FCHCl
3
obtida de P.
clematidea aumentar a quantidade de muco gástrico após a realização de ligadura
do piloro em ratos. Portanto, os resultados para os grupos tratados por via oral com
solução tween 80 a 12 %, carbenoxolona (200 mg/kg) e FCHCl
3
(125 mg/kg) foram
expressos de acordo com a quantidade de Alcian blue ligado ao muco e constam no
Gráfico 1.
0
10
20
30
40
Solução tween 80 a 12%
Carbenoxolona 200 mg/kg
FCHCl
3
125 mg/kg
Tratamento
**
*
Alcian Blue
[mg/peso da porção glandular (g)]
Gráfico 1. Efeito da administração oral de carbenoxolona e FCHCl
3
obtida das
partes aéreas de P. clematidea sobre o conteúdo de muco gástrico após ligadura do
piloro em ratos.
ANOVA: F
(2, 25)
= 6,4 (p<0,05), seguido do teste de Dunnett ** p<0,01; * p<0,05.
Os resultados indicam que carbenoxolona e FCHCl
3
aumentaram
significativamente a quantidade de muco gástrico quando comparados ao grupo
controle negativo, solução tween 80 a 12 %.
68
4.1.4.2 - Participação do óxido nítrico (NO) na citoproteção
O efeito antiulcerogênico de carbenoxolona 100 mg/kg, EEtOH 500 mg/kg e
FCHCl
3
125 mg/kg foi avaliado após pré-tratamento dos animais por via
intraperitoneal com solução tween 80 a 12% ou o inibidor da enzima sintase de
óxido nitrico L- NAME 70 mg/kg utilizando o etanol como agente lesivo. Os
resultados para esse experimento estão demonstrados no Gráfico 2.
0
50
100
150
200
250
300
350
Carbenoxolona 100 mg/kg
Solução tween 80 a 12 %
EEtOH 500 mg/kg
FCHCl
3
125 mg/kg
Solução tween 80 12 %
L-NAME
***
64%
***
68%
***
59%
+++
73%
+++
64%
+++
70%
p < 0,001
p > 0,05
p > 0,05
p > 0,05
Tratamento
ILU (média
±
±
±
±
d.p.)
Gráfico 2. Efeito da administração oral de carbenoxolona, EEtOH e FCHCl
3
obtidos
das partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por etanol em
ratos pré-tratados com L-NAME.
ANOVA: F
(7, 40)
= 75 (p<0,05), seguido do teste de Dunnett ***
p<0,001 comparando-se ao grupo solução tween 80 a 12% + solução tween 80 12%;
+++
p<0,001
comparando-se ao grupo L-NAME + solução tween 80 a 12%; teste de Tukey-Kramer, comparando
os grupos que receberam o mesmo tratamento p<0,001.
Nos grupos de animais que foram tratados previamente com solução tween
80 a 12 %, carbenoxolona, EEtOH e FCHCl
3
inibiram significativamente as lesões
ulcerativas provocadas pelo etanol em 64, 68 e 59 %, respectivamente, quando
comparados ao grupo controle negativo.
69
Nos grupos de animais que foram tratados previamente com o inibidor L-
NAME observou-se que não houve aumento das lesões provocadas pelo etanol para
os grupos que receberam por via oral carbenoxolona, EEtOH e FCHCl
3
,
permanecendo o percentual significativo de inibição das lesões em 64, 70 e 73 %,
respectivamente, quando comparados ao grupo controle negativo.
4.1.4.3 - Participação de grupamentos sulfidrílicos (SHs) na citoproteção
O efeito antiulcerogênico de carbenoxolona 100 mg/kg, EEtOH 500 mg/kg e
FCHCl
3
125 mg/kg foi avaliado após pré-tratamento dos animais por via
intraperitoneal com solução tween 80 a 12% ou o bloqueador de componentes
sulfidrílicos N-etilmaleimida (NEM) 10 mg/kg utilizando o etanol como agente lesivo.
Os resultados para esse experimento estão demonstrados no Gráfico 3.
0
50
100
150
200
250
300
350
Solução tween 80 a 12%
Carbenoxolona 100 mg/kg
EEtOH 500 mg/kg
FCHCl
3
125 mg/kg
p < 0,001
***
66%
+++
35%
p < 0,001
p < 0,001
p < 0,001
***
45%
***
37%
+++
30%
+++
26%
Solução tween 80 a 12%
NEM
Tratamento
ILU (média
±
±
±
±
d.p.)
Gráfico 3. Efeito da administração oral de carbenoxolona, EEtOH e FCHCl
3
obtidos
das partes aéreas de P. clematidea em úlceras gástricas induzidas por etanol em
ratos pré-tratados com N-etilmaleimida.
ANOVA: F
(7, 40)
= 50 (p<0,05), seguido do teste de
Dunnett *** p<0,001 comparando-se ao grupo solução tween 80 a 12% + solução tween 80 12%;
+++
p<0,001 comparando-se ao grupo NEM + solução tween 80 a 12%; teste de Tukey-Kramer,
comparando os grupos que receberam o mesmo tratamento p<0,001.
70
Nos grupos de animais que foram tratados previamente com solução tween
80 a 12 %, carbenoxolona, EEtOH e FCHCl
3
inibiram significativamente as lesões
ulcerativas provocadas pelo etanol em 66, 45 e 37 %, respectivamente, quando
comparados ao grupo controle negativo, solução tween 80 a 12%.
Nos grupos de animais que foram tratados previamente com NEM, foi
observado um aumento nas lesões ulcerativas induzidas pelo etanol quando
comparados aos grupos tratados previamente com solução tween 80 a 12%. Nessas
condições experimentais, carbenoxolona, EEtOH e FCHCl
3
nas doses empregadas
não foram capazes de impedir o desenvolvimento das lesões na mucosa gástrica
provocadas pelo etanol, uma vez que as percentagens de inibição das lesões foram
35, 30 e 26 %, respectivamente.
71
V
V V
V –
––
–
DISCUSSÃO
DISCUSSÃODISCUSSÃO
DISCUSSÃO
As plantas medicinais têm ampla contribuição no desenvolvimento de uma
larga escala de fármacos empregados na clínica, como por exemplo, salicilatos,
morfina, vincristina e vimblastina provenientes das espécies Salix alba L., Papaver
somniferum e Catharanthus roseus conhecidos popularmente por salgueiro, ópio e
boa-noite, respectivamente (KAPLAN; GOTTLIEB, 1990; GOODMAN GILMAN,
2005).
No mercado mundial, cerca de 80 % da população fazem uso de plantas
para curar suas enfermidades e, no Brasil, 60 % dos medicamentos são consumidos
por 23 % da população, sendo a maioria dos brasileiros usuários de plantas
medicinais (ELISABETSKY, 1991; CECHINEL FILHO; YUNES, 1998).
Segundo Calixto (2000), não há dados suficientes na literatura que
garantam a eficácia, qualidade e segurança da maioria das plantas utilizadas pela
população. Portanto, a sociedade não está isenta de possíveis intoxicações
provocadas por plantas, uma vez que essas apresentam uma variedade de
substâncias ativas.
De acordo com o Decreto n. 5813/2006 sancionado pela Presidência da
República do Brasil, a população deve ter garantido o acesso seguro e racional a
plantas medicinais e fitoterápicos. Diante dessas informações, é de grande interesse
científico estudar produtos naturais, sobretudo plantas medicinais, e o processo de
seleção da planta é certamente de grande importância para o sucesso de um estudo
farmacológico. Dentre os métodos de seleção descritos na literatura
(etnofarmacológico, quimiotaxonômico e aleatório), pode ser destacado o
quimiotaxonômico que se baseia no critério de classes de compostos ativos
existentes em um gênero ou família. Esse método é o segundo mais utilizado pelos
pesquisadores e têm mostrado resultados satisfatórios (YUNES; CALIXTO, 2001).
Os compostos obtidos de plantas com atividade antiulcerogênica apresentam
estruturas químicas diversas e distintos mecanismos de ação. Dentre as classes de
compostos relacionados a essa atividade têm-se os flavonóides, saponinas, taninos,
terpenóides, entre outros (BORRELLI; IZZO, 2000).
Os flavonóides estão presentes, em larga escala, na dieta alimentar do
homem e seus efeitos benéficos estão relacionados ao tratamento de doenças,
como: câncer, diabetes mellitus, cardiopatias, hepatopatias, fragilidade capilar,
osteoporose e úlcera péptica (HARBONE; WILLIANS, 2000). Esses efeitos devem-
se a atividade antioxidante dos flavonóides, os quais agem “varrendo” os radicais
73
livres (PASTRADA-BONILLA et al., 2003), pela atividade flebotônica, inibição de
mediadores inflamatórios, inibição da bomba H
+
/K
+
ATPase na célula parietal
gástrica e aumento da secreção de muco e bicarbonato (DI CARLO et al., 1999;
PARK et al., 2004; ZAYACHKIVSKA et al., 2005).
As doenças ulcerativas do trato gastrointestinal são exemplos clássicos de
agravos à saúde. Sabe-se que as lesões ulcerativas encontram-se associadas à
presença excessiva de ácido na mucosa e a fatores predisponentes relacionados à
redução das defesas naturais desta mucosa (HIRSCHOWITZ et al., 1995).
Vários fatores estão implicados na patogênese da ulceração gástrica e que
podem agir sinergicamente na produção dessas lesões. Os principais fatores
envolvidos são predisposição genética, secreção ácida alterada, rápido
esvaziamento gástrico, problemas com os mecanismos de defesa da mucosa,
estresse psicológico e físico, além do tabagismo (QUAN; TALLEY, 2002). Assim, o
aumento da secreção ácida gástrica e pepsina, diminuição do fluxo sanguíneo,
supressão de PG endógena, inibição de fatores do crescimento e proliferação celular
da mucosa, alteração da motilidade gástrica, presença de agentes infecciosos e de
radicais livres são alguns dos mecanismos envolvidos na ulcerogênese e se
constituem alvo de ação terapêutica (HIRSCHOWITZ et al., 1995; ANDREOLI, 2000;
WOLFE; SANCHS, 2000).
Intervenções farmacológicas, principalmente a utilização de antagonistas de
receptor H
2
e de inibidores da bomba H
+
/K
+
ATPase, são consideradas estratégias
eficazes contra desordens gástricas e tem substituído os procedimentos cirúrgicos
no tratamento da úlcera péptica (BRZOZOWSKI, 2003). Entretanto, no mercado
nacional existem diversos produtos farmacêuticos utilizados no tratamento das
doenças ulcerativas, mas não há fármacos que apresentem 100 % de eficácia,
impeçam recidivas das lesões e possuam poucos ou ausência de efeitos colaterais.
Portanto, diante dos efeitos benéficos promovidos pelas plantas e,
principalmente, pelos princípios ativos isolados como os flavonóides, é importante
investigar as atividades biológicas e elucidar os possíveis mecanismos de ação
apresentados por esses produtos, especialmente quando se busca novos avanços
na compreensão da fisiopatologia e cura da úlcera péptica.
Dentro desse contexto, a espécie vegetal Praxelis clematidea foi investigada
farmacologicamente quanto à atividade antiulcerogênica através de modelos de
indução aguda de úlcera gástrica, que mais se assemelham a origem das úlceras
74
gástricas no homem, como a ingestão de álcool, estresse e uso indiscriminado de
antiinflamatórios não-esteroidais, e modelos que permitem avaliar os mecanismos
de ação envolvidos.
Para investigar a atividade farmacológica em estudo, foi necessário avaliar a
toxicidade de P. clematidea através de triagem comportamental e determinação da
dose letal 50 %. A toxicidade é um evento complexo que apresenta um amplo
espectro de efeitos, desde morte celular até alterações metabólicas complexas. A
avaliação de toxicidade de substâncias através de triagem comportamental e
determinação da DL
50
possibilitam o direcionamento do estudo farmacológico para a
utilização de testes que levem a caracterização de um efeito específico
correlacionado com as doses utilizadas, estabelecendo uma margem de segurança
para a realização de experimentos farmacológicos (GRACIOSO et al., 1998;
ALMEIDA et al., 1999).
Na triagem comportamental realizado com o EEtOH de Praxelis clematidea,
não foram observadas alterações nos parâmetros avaliados, o que demonstra que
não ocorreu intoxicação até as doses de 5000 ou 2000 mg/kg nas vias de
administração oral e intraperitoneal, respectivamente. Portanto, P. clematidea pode
ser considerada de baixa toxicidade nas condições avaliada.
Diante desses resultados, P. clematidea passou a ser investigada quanto à
atividade antiulcerogênica, sem a preocupação de que possíveis interferentes
relacionados à ação tóxica da espécie pudesse alterar os resultados dessa atividade
farmacológica. Em geral, extratos brutos de vegetais são testados até a dose de
1000 mg/kg em triagens farmacológicas (SOUZA BRITO, 1994). Portanto, em nosso
estudo essa dose máxima foi fracionada conforme a presença da atividade
antiulcerogênica, sendo estabelecidas as doses de 250, 500 e 750 mg/kg do EEtOH.
Diante dessa proposta, a dose de 500 mg/kg do EEtOH foi selecionada como a que
apresentou melhor efeito antiulcerogênico e que passou a ser utilizada nos modelos
de investigação dos mecanismos de ação relacionados a essa atividade.
Segundo Milani e Calabro (2001), úlcera péptica é uma lesão profunda da
mucosa onde componentes dos tecidos epitelial e conjuntivo, incluindo
miofibroblastos subepiteliais, células do músculo liso, vasos e nervos podem ser
destruídos. Normalmente, a integridade funcional da mucosa gástrica depende do
equilíbrio entre fatores agressores e mecanismos protetores da mucosa gástrica,
porém quando esse processo é alterado, as ulcerações podem ser desenvolvidas.
75
Para que se tenha um tratamento adequado dessas lesões não basta apenas inibir a
secreção ácida, mas também estimular os fatores protetores na mucosa gástrica, ou
seja, promover citoproteção (SZABO; GOLDBERG, 1990; DAJANI; KLAMUT, 2000;
MARTIN; WALLACE, 2006).
O modelo de indução aguda de úlcera por etanol absoluto avalia a
capacidade de substâncias em impedirem a ação danosa do etanol sobre a mucosa
gástrica. O etanol provoca danos gástricos na mucosa por esfoliação e inflamação
severa quando ingeridos acentuadamente.
A esfoliação é caracterizada por fragilidade nas pontes dissulfetos do muco
gástrico, com conseqüente aumento na permeabilidade de membrana das células
superficiais ao ácido clorídrico gástrico e ao próprio etanol causando formação de
radicais livres e, consequentemente, peroxidação lipídica juntamente com a
depleção de componentes dos sistemas antioxidantes enzimático (ex.: superóxido
dismutase - SOD, glutationa peroxidase - GSH-Px e glutationa transferase - GST) e
não enzimático (ex.: glutationa reduzida - GSH) devido ao estresse oxidativo
mitocondrial e morte celular (KVIETYS et al., 1990; LUTNICKI et al., 1992;
HIROKAWA et al., 1998).
Juntamente com o acetaldeído (metabólito proveniente do etanol), o etanol
pode alterar a vasculatura da mucosa gástrica por aumentar a produção e liberação
de mediadores vasoativos como leucotrienos LTC
4
e histamina pelos mastócitos
causando estase do fluxo sanguíneo, diminuição da liberação de NO e,
consequentemente, provocando hiperemia, recrutamento e infiltração de neutrófilos,
formação de radicais livres e hemorragia (SZABO; TRIER; FRANKEL, 1981; OATES;
HAKKINEN et al., 1988; KAY; GRINDER; MAGNESS, 2000).
De acordo com os resultados obtidos nesse modelo experimental, foi
possível observar que o EEtOH e a FCHCl
3
obtidos das partes aéreas de P.
clematidea nas doses empregadas protegeram significativamente a mucosa gástrica
dos ratos contra a ação lesiva do etanol e esse efeito não se mostrou dose
dependente. Além disso, o efeito antiulcerogênico observado poderá envolver a
diminuição da peroxidação lipídica, estimulação dos sistemas antioxidantes
endógenos, aumento na produção de NO, restabelecimento do fluxo sanguíneo
local, aumento na produção de PGs constitutivas e aumento da produção de muco e
bicarbonato.
76
Como o EEtOH e a FCHCl
3
de P. clematidea apresentaram significativa
atividade antiulcerogênica frente ao etanol, importante agente lesivo da mucosa
gástrica, passou-se a investigar se as amostras vegetais poderiam apresentar
resultados semelhantes quando as lesões fossem induzidas pelo estresse e AINEs,
dois modelos de indução de úlcera que avaliam a ação de substâncias sobre lesões
estimuladas, principalmente, pelo reflexo vago-vagais e sobre a diminuição do
principal fator citoprotetor gástrico, PGs.
Úlceras provocadas por estresse são clinicamente caracterizadas como
hemorragias gastrointestinais superiores e lesões em todo o trato gastrointestinal
como conseqüência de traumas por queimaduras, danos intracraniais, choque
séptico, estados pós-cirúrgico ou alterações psíquicas (GLAVIN; SZABO, 1992).
Estresse agudo em animais pode ser induzido por vários agentes
estressantes, como: imobilização, baixas temperaturas, ruídos, nado forçado,
radiação, cirurgias abdominais e craniais, exposição ao éter e choque (TACHÉ et al.,
2001). No entanto, o modelo de indução aguda de úlcera gástrica por estresse mais
eficaz para investigar a atividade antiulcerogênica de novas substâncias é o que
utiliza como agente agressor a imobilização dos animais e baixas temperaturas
(GLAVIN; SZABO, 1992).
Nesse modelo de estresse, as úlceras parecem ser mediadas por histamina
que é capaz de acentuar a secreção ácida, reduzir a produção de muco, provocar
distúrbios na microcirculação da mucosa e na motilidade contribuindo ainda mais
para a depleção de muco. Estímulos acentuados do sistema nervoso autonômico
simpático e parassimpático também estão envolvidos na produção de ulcera gástrica
por estresse (BANDYOPADHYAY et al., 2001), no entanto, a atividade vagal tem
sido sugerida como principal fator da ulceração, uma vez que a realização de
vagotomia pode prevenir parcialmente ou inteiramente as lesões na mucosa gástrica
(GOA; MONK, 1987).
Em humanos e também em animais, o estresse causa ulceração
aumentando a atividade vagal, motilidade gástrica, secreção ácida gástrica e
degranulação de mastócitos, bem como diminuindo o fluxo sanguíneo por
venoconstricção devido a liberação de leucotrienos e histamina, nível de
prostaglandinas por inibição da COX e produção de muco-bicarbonato. Além disso,
o sistema antioxidante enzimático sofre alterações devido superprodução de radicais
livres, como: diminuição de SOD/CAT e aumento na estimulação da enzima sintase
77
de NO provocando exacerbação na produção de NO, o qual se torna radical livre
passando a agredir a mucosa gástrica (BAGCHI et al., 1998; KWIECIEN;
BRZOZOWSKI; KONTUREK, 2002).
No modelo experimental de úlcera gástrica induzida por estresse
imobilização e frio, o EEtOH e a FCHCl
3
de P. clematidea protegeram
significativamente a mucosa gástrica possivelmente através da regulação da
secreção ácida, seja por controlar a produção excessiva do ácido seja inibindo ou
bloqueando os receptores específicos; ainda podem exercer papel fundamental na
integridade da mucosa gástrica, aumentando a produção de muco e bicarbonato,
restabelecendo o fluxo sanguíneo e/ou impedindo a depleção de componentes
antioxidantes endógenos por diminuir ou impedir a formação de radicais livres.
Portanto, é possível sugerir que a atividade antiulcerogênica esteja envolvida com
mecanismos antioxidante, anti-secretório ou citoprotetor.
É sabido que tanto as drogas que inibem a secreção gástrica quanto
aquelas que aumentam os mecanismos de defesa da mucosa gástrica auxiliam na
prevenção do aparecimento de lesões ulcerativas induzidas pelo estresse, porque
restabelecem a circulação na mucosa gástrica e modulam ou abolem o estímulo
para liberação ácida (LEWIS; HANSON, 1991; HIRSCHOWITZ et al., 1995;
BRUNTON, 1996; EVANS, 1996; WOLFE; SANCHS, 2000).
No entanto, os resultados obtidos com a realização dos dois experimentos
anteriores não apontavam para nenhum mecanismo de ação em especial, uma vez
que são modelos inespecíficos. Diante dessa situação, passamos a investigar o
efeito do EEtOH e da FCHCl
3
em animais submetidos a úlcera gástrica por
antiinflamatório não-esteroidal, importante por avaliar uma das causas de úlcera no
homem que está relacionada, principalmente, com a diminuição da citoproteção.
Os antiinflamatórios não-esteroidais, semelhantes ao piroxicam,
indometacina, aspirina e diclofenaco, exercem atividade sobre a homeostasia
estomacal por bloquear consideravelmente a atividade enzimática das COXs 1 e 2,
diminuindo a produção de PGs, de forma que o substrato ácido araquidônico torna-
se mais susceptível à ação das enzimas lipooxigenases levando a superprodução de
leucotrienos e radicais oxigenados derivados do ácido hidroperoxieicosatetraenóico
provocando danos à microvasculatura da mucosa gástrica. Além disso, diminuem o
fluxo sanguíneo local, a produção de muco e bicarbonato e alteram o processo de
renovação celular (KONTUREK et al., 2005) .
78
Outro processo agressor da mucosa gástrica provocado por AINEs é a ação
irritativa a mucosa. Esses se dissociam formando altas concentrações de íons
ácidos orgânicos fracos que, em relação ao pH intracelular, causam desestruturação
da barreira protetora de muco-bicarbonato e da membrana das células epiteliais
provocando retrodifusão de ácido, desequilíbrio iônico, formação de radicais livres e
morte celular (HAYDEN et al., 1978; GLAVIN; SZABO, 1992; ROEDIGER;
MOLLARD, 1995; WALLACE; BELL, 1996).
Segundo Hawkins e Hanks (2000), a prostaglandina é um importante
mediador da inflamação e de outras funções fisiológicas normais. Tem um papel vital
no estômago, onde mantém o fluxo sanguíneo, estimula a secreção de bicarbonato
e muco, além de regular o reparo das células da mucosa. A perda da proteção, após
inibição da síntese de prostaglandinas, torna o estômago vulnerável aos danos
induzidos pelo ácido gástrico.
Diante das alterações provocadas pelo antiinflamatório não-esteroidal
(piroxicam) na homeostasia gástrica, sugere-se que a significativa atividade
antiulcerogênica promovida tanto pelo EEtOH quanto pela FCHCl
3
obtidos de
Praxelis clematidea no modelo de indução aguda por esse agente lesivo poderá
envolver ações antioxidante, anti-secretória e citoprotetoras, principalmente.
Com isso pudemos concluir até aqui que o EEtOH e a FCHCl
3
obtidos de P.
clematidea, inibiram as úlceras gástricas induzidas por agentes lesivos que
aumentavam os níveis de fatores agressores à mucosa relacionado a secreção
ácida por agentes que diminuem os fatores defensivos da mucosa. Portanto, os
resultados inéditos e promissores obtidos com EEtOH e FCHCl
3
de P. clematidea,
frente aos severos agentes indutores de úlcera gástrica, levaram-nos a investigar se
as amostras da espécie em estudo alteravam os parâmetros bioquímicos do suco
gástrico quando administrados por via intraduodenal após a realização de ligadura
do piloro em ratos.
A ligadura do piloro causa hipersecreção por mecanismos ainda não
totalmente elucidados, no entanto, é citado na literatura que o reflexo vago-vagal
proveniente da distensão estomacal, sobretudo na região antral gástrica, causa
ativação de receptores que aumenta secreção ácida gástrica, ativação de
pepsinogênio em pepsina com participação dos secretegogos: acetilcolina, gastrina
e histamina, podendo ocorrer autodigestão da mucosa devido a fragilidade da
barreira de muco-bicarbonato, além de aumentar o tônus muscular (SHAY et al.,
79
1945; BRODIE, 1966; ISHII, 1969; DAUGHERTY; LUCEY; YAMADA, 1991; SAIRAM
et al., 2002).
A hipersecreção ácida pelas células parietais é um fator potencialmente
agressor para a mucosa gástrica. A inibição da secreção ácida tem importante
função na gastroproteção e a secreção de muco-bicarbonato é importante para
manter a integridade da mucosa neutralizando o ácido que poderá retrodinfundir em
direção ao epitélio gástrico (FLEMSTROM; GARNER, 1982; TAKEUCHI; OKABE,
1995).
Ao realizar a ligadura de piloro escolhendo a via intraduodenal para
administração do EEtOH e da FCHCl
3
obtidos de P. clematidea, avaliou-se a
possibilidade de uma atividade anti-secretória e sistêmica analisando alterações nos
seguintes parâmetros do suco gástrico: pH, concentração de H
+
e volume do suco
gástrico. Os resultados indicaram que o EEtOH e a FCHCl
3
não foram capazes de
alterar o pH, acidez total e volume do suco gástrico, sugerindo-se portanto que
ambos não apresentaram atividade anti-secretória sistêmica quando administrados
pela via selecionada. No entanto, essa atividade anti-secretória não pode ser
descartada para P. clematidea, uma vez que a amostra vegetal não foi avaliada
nesse modelo por via oral e não foram determinados os níveis dos hormônios
gastrina e somatostatina.
Os resultados obtidos até esse momento, explicaram, ao menos parcialmente,
o efeito benéfico das preparações obtidas de Praxelis clematidea. Assim, o próximo
passo foi avaliar a ação do EEtOH e da FCHCl
3
sobre mecanismos de ação
citoprotetores, como possíveis alterações na produção de muco, participação de
grupamentos sulfidrílicos e óxido nítrico.
O muco gástrico ou mucina é um importante fator protetor da mucosa
estomacal por ser lubrificante e antioxidante contra ações do suco gástrico, álcool,
alimentos hipertônicos ou hipotônicos e xenobióticos (PENISSI; PIEZZI, 1999; TANI
et al., 2002). Consiste em um gel glicoprotéico transparente de alto peso molecular
com viscoelasticidade e aderência, formado por 95 % de água juntamente com
pequenas quantidades de lipídios, ácidos nucléicos e imunoglobulinas que recobre
todo o trato gastrointestinal (CORFIELD et al., 2000; FLEMSTROM; ISENBERG,
2001).
De acordo com sua constituição, o muco pode estar aderido ao epitélio
gástrico formando uma barreira protetora ao ácido ou pode se apresentar livre e
80
solúvel, de forma que aumentando o muco aderido a mucosa gástrica, também
estará aumentando a quantidade de muco livre no lúmen estomacal (BOLTON et al.,
1978; REPETTO; LLESUY, 2002).
Segundo Grisham e colaboradores (1987), o muco possui atividade
antioxidante exercendo um importante papel na proteção da mucosa gástrica. Essa
atividade se deve a elevada concentração de glicoproteínas na sua constituição
(CROSS et al.,1984), além disso, segundo Gong e colaboradores (1990), tanto as
glicoproteínas do muco possuem propriedades anti-radicais livres, como também os
lipídios ligados à mucina gástrica são capazes de proteger as células da mucosa do
ataque de radicais livres. Estudos desenvolvidos por Mojzis e colaboradores (2001),
indicam que drogas que estimulam a produção de muco também possuem grande
atividade antioxidante.
As PGE
2
e o NO são responsáveis pela produção e liberação de muco das
células epiteliais e células do colo das glândulas gástricas, enquanto os compostos
sulfidrílicos mantêm a estabilidade do muco por formar pontes dissulfeto (AVILA et
al., 1996; CHANDRANATH et al., 2002). A diminuição do muco gástrico torna a
mucosa susceptível a injúrias induzidas pelo ácido gástrico, por AINEs e estresse
produzido pelo frio (PRICE et al., 1994).
O modelo experimental que determinou a quantidade de muco gástrico
avaliou a capacidade da FCHCl
3
de P. clematidea na citoproteção investigando o
possível envolvimento da mesma na síntese de muco. Os resultados indicaram que
FCHCl
3
é capaz de aumentar significativamente a quantidade de muco, portanto,
sugerindo a participação desse mecanismo de ação na citoproteção promovida por
P. clematidea. Entretanto, novos experimentos deveriam ser realizados para avaliar
as vias envolvidas com a produção de muco, como as vias da PG e de NO.
Nos últimos anos o NO assumiu um importante papel como modulador
endógeno de inúmeras funções fisiológicas. Essa molécula está envolvida na
regulação do fluxo sangüíneo, manutenção do tônus vascular, integridade da
mucosa, controle de agregação plaquetária e modulação da atividade de mastócitos
(MOTILVA et al, 2001).
A síntese de NO a partir do grupo guanidina da L-arginina ocorre por ação da
enzima sintase de NO constitutiva, processo esse dependente de Ca
2+
; o NO assim
formado é citoprotetor. Já a sintase de NO induzida, tem sua ação não dependente
81
de Ca
2+
, e o NO assim formado tem ações citotóxicas (NISHIDA et al., 1997;
NAHAVANDI et al., 1999).
A inibição de NO aumenta o estresse oxidativo, o qual ativa mastócitos. Essas
células são encontradas em grandes quantidades no trato gastrointestinal, as quais
liberam mediadores como histamina e fator ativador de plaquetas, causando
aumento da permeabilidade epitelial e infiltração de neutrófilos; esse evento é
rapidamente revertido pela liberação exógena de NO que restabelece o fluxo
sanguíneo e inibe o recrutamento celular (KAWAI et al.,1994; KUBES et al., 2000).
É bem conhecido que o óxido nítrico (NO) medeia uma variedade de efeitos
inibitórios no trato gastrointestinal: relaxamento do fundo do estômago, relaxamento
do esfíncter gastrointestinal, fase descendente de reflexo peristáltico, inibição tônica
da motilidade intestinal (KORTEZOVA et al, 2004). Ainda é relatado que o NO regula
a síntese de PG para a defesa da mucosa gástrica estimulando a atividade da COX
(SALVEMINI et al, 1993). Isso levanta a possibilidade de que drogas possam ser
desenvolvidas através da estimulação de produção de PGs e/ou NO, as quais
aumentariam a habilidade da mucosa gástrica para resistir às lesões induzidas por
irritantes presentes no lúmen.
No trato gastrointestinal, o NO além de participar de mecanismos de defesa,
também contribui para danos da mucosa gástrica quando, em concentrações
elevadas, reage com o superóxido produzindo peroxinitrito, o qual causa injúria
celular (KUBES et al., 2000). O resultado desse duplo papel no desenvolvimento de
drogas que modulam a síntese de NO tem sido amplamente estudada (MUSCARÁ
et al., 1999).
Dentro desse contexto, o EEtOH e a FCHCl
3
obtidos de P. clematidea foram
avaliados quanto a sua proteção na mucosa gástrica através de modelos que
investigam a participação do óxido nítrico no mecanismo de ação citoprotetor. Para
essa avaliação, foi utilizado o N
ω
-nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME), um inibidor
da enzima sintase de NO (endotelial, induzida e neuronal), que acentua as lesões da
mucosa gástrica induzida pelo etanol (ALY, 1995). A exposição ao etanol parece
induzir ao estresse oxidativo, que pode acontecer pela diminuição da liberação do
NO o qual se constitui um importante varredor de radicais livres. A expressão
aumentada da enzima sintase de NO pode ser uma resposta ao aumento da
demanda de NO (MENCONI et al., 1998).
82
Assim, os resultados demonstraram que o EEtOH e a FCHCl
3
obtidos de P.
clematidea permaneceram protegendo a mucosa gástrica das lesões ulcerativas
pelo etanol nos grupos de animais previamente tratados com L-NAME. Portanto,
pode-se sugerir que ambas as amostras vegetais utilizadas nas doses empregadas
não depedem das ações do NO para promover citoproteção e, possivelmente, o
aumento na produção de muco pela fase cloróformica da planta em estudo deve ser
regulado pelas prostaglandinas.
Outro parâmetro avaliado na citoproteção promovida por essa espécie vegetal
foi à participação de grupamentos sulfidrílicos (SHs). Esses grupamentos estão
implicados na manutenção da integridade gástrica, particularmente quando espécies
reativas de oxigênio estão envolvidas na gênese das ulcerações, exercendo
atividade antioxidante (SZELENYI; BRUNE, 1988). São capazes de remover
peróxidos de outra natureza e proteger o organismo contra radiações ionizantes
(HAYES; MCLELLAN, 1999; LOGUERCIO; DI PIERRO, 1999).
Os grupos sulfidrílicos são classificados em não protéicos e protéicos. A
primeira classe compõe os peptídeos de baixo peso molecular, como o tripeptídeo
glutationa reduzida - GSH, enquanto a segunda constitui as proteínas de alto peso
molecular, como a glutationa complexada a proteína albumina. (FAURE; LAFOND,
1995).
No ciclo redox homeostático, GSH é oxidada a GSSG pela enzima glutationa
oxidase na presença de H
2
O proveniente da ação da GSH-Px sobre peróxidos de
hidrogênio. Os níveis de GSH são restabelecidos através da ação da glutationa
redutase (GR), utilizando NADPH, sobre a GSSG (RASTOGI; PATNAIK; DIKSHIT,
1998).
Em modelos experimentais agudos, quando ocorre aumento de peroxidação
lipídica estimulada por estresse oxidativo, os níveis de GSH tendem a reduzir
juntamente com enzimas antioxidantes, como: SOD, GST e GSH-Px. O etanol tem
importante ação sobre o sistema redox GSH gástrico causando lesões na mucosa
(RASTOGI; PATNAIK; DIKSHIT, 1998) e pode ter ação potencializada quando esse
sistema é inibido previamente por bloqueadores específicos como N-etilmaleimida
(RASTOGI; PATNAIK; DIKSHIT, 1998).
Ao realizar o modelo que investiga o papel de grupamentos sulfidrilas na
citoproteção, buscou-se avaliar a sua participação na proteção gástrica refletida na
atividade antiulcerogênica produzido pelo EEtOH e FCHCl
3
de P. clematidea. Nesse
83
experimento, como esperado, o agente bloqueador de grupamentos sulfidrilas (N-
etilmaleimida) agravou as lesões ulcerativas induzidas pelo etanol no grupo de
animais tratados com solução tween 80 a 12 %. O EEtOH e a FCHCl
3
da planta
nesse estudo não foram capazes de inibir o desenvolvimento das lesões, o que nos
levou a sugerir que uma das vias de proteção a mucosa gástrica promovida por P.
clematidea esteja relacionada participação de grupamentos sulfidrílicos.
No entanto, consideramos que os mecanismos de ação do EEtOH e da
FCHCl
3
obtidos de P. clematidea sobre a atividade antiulcerogênica apresentam-se
parcialmente esclarecidos, necessitando da realização de outros modelos para
melhor elucidação.
84
VI
VI VI
VI –
––
–
CONCLUSÃO
CONCLUSÃOCONCLUSÃO
CONCLUSÃO
A análise dos resultados permite concluir que o extrato etanólico bruto
(EEtOH) de Praxelis clematidea não apresentou efeito tóxico nas condições
avaliadas por não alterar os comportamentos dos animais e não causar mortes.
O extrato etanólico bruto (EEtOH) e a fase clorofórmica (FCHCl
3
) de Praxelis
clematidea nas doses avaliadas apresentaram:
- Atividade antiulcerogênica frente aos agentes indutores de lesões agudas gástrica:
etanol, antiinflamatório não-esteroidal e estresse;
- Proteção a mucosa gástrica independente da ação de óxido nítrico;
- Proteção a mucosa gástrica dependente de grupamentos sulfidrílicos.
O extrato etanólico bruto (EEtOH) e a fase clorofórmica (FCHCl
3
) de P.
clematidea
não alteraram os valores basais de pH, concentração de H
+
e volume do
suco gástrico nas condições avaliadas.
A FCHCl
3
de P. clematidea
protegeu a mucosa gástrica por
aumentar a
produção de muco gástrico.
O EEtOH e a FCHCl
3
obtidos de P. clematidea protegeram a mucosa gástrica
possivelmente através de mecanismos citoprotetor e anti-secretor.
Assim, a atividade antiulcerogênica pode estar relacionada a ação dos
compostos polifenólicos que compõem essa espécie vegetal, uma vez que foram
identificados flavonas metoxiladas nas partes aéreas de P. clematidea e essas
substâncias possuem atividade antiulcerogênica comprovada cientificamente.
86
VII
VII VII
VII –
––
–
PERSPECTIVAS
PERSPECTIVASPERSPECTIVAS
PERSPECTIVAS
Baseado nos resultados obtidos da investigação da atividade antiulcerogênica
do EEtOH e da FCHCl
3
obtidos das partes aéreas de Praxelis clematidea, propõem-
se as seguintes perspectivas para complementar esse estudo:
Determinar o envolvimento das prostaglandinas na proteção produzida pela
FCHCl
3
;
Determinar os níveis séricos de somatostatina e gastrina;
Determinar os parâmetros bioquímicos do suco gástrico quando avaliada a
via oral de administração;
Avaliar os fatores envolvidos no processo de cicatrização de lesões
ulcerativas em modelos crônicos de úlcera gástrica.
Avaliar mecanismos de ação antioxidante das frações clorofórmica e acetato
de etila.
88
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110
A
AA
ANEXO
NEXONEXO
NEXO
ANEXO A - Protocolo experimental para triagem comportamental.
Fonte: ALMEIDA et al., 1999.
111
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