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ALEXSANDRO FERNANDES MARINHO
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE
MÉTODO ANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO
DA WARIFTEÍNA EM EXTRATOS DE
Cissampelos sympodialis EICHL (Milona)
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS
BIOATIVOS
JOÃO PESSOA-PB
Março de 2008
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ALEXSANDRO FERNANDES MARINHO
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO
ANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA WARIFTEÍNA EM
EXTRATOS DE Cissampelos sympodialis EICHL (Milona)
João Pessoa – PB
2008
Dissertação apresentada à coordenação do Programa de
Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos da Universidade Federal da Paraíba, em
cumprimento às exigências para obtenção do Grau de
Mestre.
Área de concentração: Farmacoquímica
Orientador: Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira
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ALEXSANDRO FERNANDES MARINHO
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO
ANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA WARIFTEÍNA EM
EXTRATOS DE Cissampelos sympodialis EICHL (Milona)
Aprovado em _____/_____/_____
COMISSÃO EXAMINADORA
______________________________________________________
Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira (UFPB – Orientador)
______________________________________________________
Prof. Dr. Fábio Santos de Souza (UFPB – CCS)
______________________________________________________
Prof. Dr. Davi Antas e Silva (UFRPE)
DEDICATÓRIA
A Deus em primeiro lugar...
A meus pais João Marinho e Ioneide Fernandes
A minha esposa Carlane Marinho
A meus irmãos Alixandre Fernandes e Alex Fernandes
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira pela confiança, incentivo, dedicação e
orientação na minha formação acadêmica durante a realização deste trabalho.
Ao coordenador da Pós-Graduação o Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho
pelos seus conhecimentos na execução e orientação dos estudos fitoquímicos no
Laboratório de Fitoquímica.
Aos Diretores do LTF pelo incentivo a qualificação.
A amiga e Pós-Graduanda Gabriela Lemos de Azevedo pela sua valiosa
colaboração para a realização deste trabalho no Laboratório de Fitoquímica.
A meu amigo e funcionário do LTF Sócrates Golzio dos Santos pelo incentivo,
paciência e colaboração com seus conhecimentos de computação e instrumentais.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos pela contribuição na minha formação acadêmica.
A secretária da Pós-Graduação Tânia Maria Alves de Araújo pela sua grata e
completa disposição na execução da parte burocrática deste trabalho.
A estagiária Maria Joviania de Souza pela sua contribuição neste trabalho.
Aos meus amigos e funcionários do LTF Jéferson Macena, Vicente, Kazuko,
Nonato, Wellington, Brizola, Raquel, Francisca, Gilmar, Gilmário, Aloísio, Irene,
Célia, Aflredo, Severino (Bil), Vanderley, Carlos Santiago, Carlos, Francis Mary,
Ataíde pela amizade e incentivo.
Aos meus amigos e companheiros de Laboratório José Alves, José Wilson,
Steno, Ana Paloma, Adriana, Antônio, Viviane, Daniele, Roosevelt, Rafael, Ana
Cláudia, Cibele, Guedes, Marcelo, Harley, Roberto, Fernando.
A todos os funcionários da limpeza do Laboratório Socorro, Alvanir, Nevinha,
Dinho, Chico, Manuel, Mônica.
‘’Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, e
não tivesse amor, seria como o metal que soa ou como o sino
que tine.
E ainda que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos os
mistérios e toda a ciência, e ainda que tivesse toda a fé, de
maneira tal que transportasse os montes, e não tivesse amor,
nada seria.
E ainda que distribuísse toda a minha fortuna para sustento
dos pobres, e ainda que entregasse o meu corpo para ser
queimado, e não tivesse amor, nada disso me aproveitaria.
O amor é sofredor, é benigno; o amor não é invejoso; o amor
não trata com leviandade, não se ensoberbece.
Não se porta com indecência, não busca os seus interesses,
não se irrita, não suspeita mal;
Não folga com a injustiça, mas folga com a verdade;
Tudo sofre, tudo crê, tudo espera, tudo suporta.
Agora, pois, permanecem a fé, a esperança e o amor, estes
três, mas o maior destes é o amor’’.
S. Paulo, 1° Epístola aos Coríntios (Cap. XIII, v. 1 a 7).
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de
metodologia analítica para a quantificação de warifteína, um alcalóide
bisbenzilisoquinolínico presente nas raízes e nas folhas da espécie Cissampelos
sympodialis EICHL (Menispermaceae). O método desenvolvido fez uso de
cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta (246 nm),
utilizando uma coluna de fase reversa C-18 (250 x 4,6 mm, 5μm) e como fase móvel
uma mistura de água-acetonitrila-trietilamina (57:43:0,05, v/v) a um fluxo de 1,3
mL/min. Para o desenvolvimento do método, os alcalóides warifteína e
metilwarifteína foram isolados do extrato etanólico bruto das raízes da planta,
através de marcha de extração de alcalóides para obtenção de sua fração de
alcalóides totais (FAT-r). A warifteína separada por cromatografia em coluna,
recristalizada, e a sua pureza e identificação estrutural foi realizada por técnicas
espectroscópicas e físicas como RMN de
1
H e
13
C, espectrometria de massas,
espectrometria de infravermelho, ponto de fusão e HPLC. O método cromatográfico
desenvolvido foi validado segundo o preconizado na Resolução 899 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), e mostrou-se linear na faixa de
concentração utilizada (0-100 μg/mL), mostrando-se também preciso (RSD≤5%),
exato (99-102%), seletivo (frente a separação entre a warifteína e seu análogo
estrutural, a metilwarifteína) e robusto. O modelo de calibração utilizado foi o método
de adição de padrão, já que o efeito de matriz no caso de amostras complexas como
aquelas obtidas de extratos vegetais são presumidas ser significativo. A preparação
da amostra envolveu apenas a diluição do extrato, a filtração através de filtro com
membrana de 0,45 μm e a injeção direta da amostra diluída e filtrada. A warifteína
pôde ser quantificada no extrato hidroalcóolico das folhas (EBF), e também
diretamente no material vegetal fresco (folhas).
Palavras-chaves: Validação, warifteína, Cissampelos sympodialis EICHL
(Menispermaceae), HPLC, Desenvolvimento de método.
ABSTRACT
The aim of the present work was to develop and validate an analytical method
for the quantification of warifteine, a bisbenzylisoquinoline alkaloid from the roots and
leaves of Cissampelos sympodialis EICHL (Menispermaceae). The method used
reversed-phase high performance liquid chromatography with UV detection (246 nm).
Separation was achieved using a C-18 column (250 x 4,6 mm, 5μm) and a mobile
phase consisting of water-acetonitrile-triethylamine (57:43:0,05, v/v) delivered at a
flow rate of 1,3 mL/min. For method development, the alkaloids warifteine and
methylwarifteine were isolated from the crude ethanolic extract of the roots through a
systematic acid/base alkaloid extraction process which yield the total alkaloid fraction
of the roots (FAT-r). Warifteine was separated through classical column
chromatography, recrystalized and its purity was assayed through spectroscopic and
physical techniques, such as
1
H and
13
C NMR, mass spectrometry, infrared
spectroscopy, melting point and HPLC. The chromatographic method was validated
according to the requirements of the National Sanitary Agency of Brazil (ANVISA, RE
899, 2003). The method proved to be linear in the concentration range tested (0-100
μg/mL), being also precise (RSD≤5%), exact (99-102%), selective (as for the
separation between warifteine and its structural analog methylwarifteine) and robust.
The calibration was done through standard addition, since matrix effects from the
complex samples was anticipated. Sample preparation involved direct injection after
dilution and filtering of the extract through 0,45 μm membrane filter. Warifteine was
quantities in the hydroalcoholic extract of the leaves (EBF) and also in the fresh
vegetal material (leaves).
Keywords: Validation, warifteine, Cissampelos sympodialis EICHL
(Menispermaceae), HPLC, Method Development.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Foto da Cissampelos sympodialis EICHL
Figura 2 - Núcleo básico dos alcalóides isolados do gênero Cissampelos
Figura 3 - Alcalóides isolados de Cissampelos sympodialis
Figura 4 - Solução hidroalcóolica das folhas de Cissampelos sympodialis sendo
concentrada em evaporador rotatório sob pressão reduzida
Figura 5 - Placa de cromatografia em camada delgada analítica, mostrando as
frações de alcalóides (Fr 00-19) obtidas após cromatografia em coluna
Figura 6 - Placa de cromatografia em camada delgada analítica das frações de 20 a
38 obtidas após cromatografia em coluna da FAT-r
Figura 7 - Placa de cromatografia em camada delgada analítica das frações de 39 a
46 obtidas após cromatografia em coluna da FAT-r
Figura 8 - Placas de CCDA 4, 5 e 6 na seqüência da esquerda para a direita das
frações de alcalóides de número 47 a 88, obtidas após cromatografia em coluna
da FAT-r
Figura 9 - Fotos dos alcalóides isolados da FAT-r
Figura 10 - Espectro de RMN-
1
H da fração de alcalóides Fr 24-25 realizada com
equipamento de RMN de 200 MHz
Figura 11 - Espectro expandido de RMN-
1
H da figura 6 na região entre 2,0 – 4,0 ppm
Figura 12 - Espectro expandido de RMN-
1
H da figura 6 na região entre 5,0 – 7,0 ppm
Figura 13 - Espectro de RMN-
1
H da substância Sb1 realizada com equipamento de
200 MHz
Figura 14 - Espectro expandido de RMN-
1
H da figura 11 na região entre 1,0 – 4,0
ppm
Figura 15 - Espectro expandido de RMN-
1
H da figura 11 na região entre 5,0 – 7,5
ppm
Figura 16 - Espectro de infravermelho da fração Fr 24-25 de alcalóides da
Cissampelos sympodialis EICHL feita com pastilha de KBr
Figura 17 - Espectro no UV da fração Fr 24-25 diluída em acetonitrila (5 µg/mL )
Figura 18 - Espectro de massas da fração Fr 24-25 de alcalóides
Figura 19 - Processo de separação cromatográfica de quatro analitos em função do
tempo
Figura 20 - Diagrama esquemático de um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência
33
35
37
39
41
42
42
43
48
51
52
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55
56
58
59
61
65
(CLAE)
Figura 21 - Passos para desenvolvimento de método em HPLC
Figura 22 - Espectro DAD bidimensional da warifteína (WAR) (80 µg/mL) mostrado
na mancha vermelha em um tempo de retenção de 7,25 min usando uma
varredura completa do espectro de UV entre 200 e 400 nm
Figura 23 - Espectro de UV simples em CLAE/DAD da warifteína (80 µg/mL)
mostrando λ máximos em 224 e 283 nm
Figura 24 - Cromatograma 3D (CLAE/DAD) da warifteína (80 µg/mL ) na fase móvel
ACN:H
2
O:Trietilamina (60:40:0,1)
Figura 25 - Perfil de pureza do pico cromatográfico da warifteína (80 µg/mL)
mostrando uma pureza de 99%, o que provavelmente não esta coeluindo com outra
substância
Figura 26 - Perfil de pureza do pico cromatográfico da warifteína (80 µg/mL) avaliada
durante o processo de separação cromatográfica nos comprimentos de onda de 236,
241, 246, 251 e 256 nm
Figura 27 - Cromatograma (CLAE/DAD) da warifteína (WAR) na concentração de 80
µg/mL utilizando-se a fase móvel ACN:H
2
O:trietilamina (60:40:0,1) a λ de 246 nm
Figura 28 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da warifteína (WAR) (80 µg/mL) com fase
móvel ACN:H
2
O:trietilamina (60:40:0,1) e fluxo de 1,5 mL/min. a 246 nm
Figura 29 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da warifteína (WAR) (80 µg/mL) com fase
móvel ACN:H
2
O:trietilamina (50:50:0,1) e fluxo de 1,5 mL/min. a 246 nm
Figura 30 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da warifteína (WAR) (80 µg/mL) com fase
móvel ACN:H
2
O:trietilamina (40:60:0,1) fluxo de 1,5 mL/min. a 246 nm.
Figura 31 - Cromatograma de uma amostra de warifteína (WAR) a 80 µg/mL,
extraída do extrato etanólico, mostrando a presença de “ombro” próximo ao pico
cromatográfico em fase móvel ACN:H
2
O:trietilamina (40:60:0,1)
Figura 32 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da fração de alcalóides (WAR) extraída do
extrato etanólico bruto das raízes da milona com fase móvel ACN:H
2
O:trietilamina
(43:57:0,05) e fluxo de 1,3 mL/min. a 246 nm
Figura 33 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da fração de alcalóides extraída do
extrato etanólico bruto das raízes da milona, adicionado de 2,5 µg/mL do padrão
warifteína (WAR) com fase móvel ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05) e fluxo de 1,3
mL/min. a 246 nm
66
69
80
81
81
82
82
83
84
84
85
90
90
91
Figura 34 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da fração de alcalóides extraída do
extrato etanólico bruto das raízes da milona, adicionado de 80 µg/mL do padrão
warifteína (WAR) com fase móvel ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05) e fluxo de 1,3
mL/min. a 246 nm
Figura 35 - Cromatograma da microextração da warifteína (WAR) a 80 µg/mL no
extrato etanólico sem o problema de ombro no pico cromatográfico em fase móvel
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05)
Figura 36 – Adequabilidade do sistema cromatográfico (CLAE/UV/VIS) com uma
amostra de warifteína a 80 µg/mL com fase móvel: ACN:H
2
O:Trietilamina
(43:57:0,05) e fluxo de 1,3 mL/min. a 246 nm
Figura 37 – Adequabilidade do sistema cromatográfico (CLAE/UV/VIS) com uma
amostra de warifteína a 80 µg/mL com fase móvel: ACN:H
2
O:Trietilamina
(43:57:0,05) e fluxo de 1,3 mL/min. a 246 nm.
Figura 38 - Cromatograma da linearidade obtida com a primeira curva de calibração
por adição de padrão do ponto 0 µg/mL de warifteína (WAR)
Figura 39 - Cromatograma da linearidade obtida com a primeira curva de calibração
por adição de padrão do ponto 100 µg/mL de warifteína (WAR)
Figura 40 - Cromatograma da linearidade obtida com a segunda curva de calibração
por adição de padrão do ponto 0 µg/mL de warifteína (WAR)
Figura 41 - Cromatograma da linearidade obtida com a segunda curva de calibração
por adição de padrão do ponto 100 µg/mL de warifteína (WAR)
Figura 42 - Cromatograma da linearidade obtida com a terceira curva de calibração
por adição de padrão do ponto 0 µg/mL de warifteína (WAR)
Figura 43 - Cromatograma da linearidade obtida com a terceira curva de calibração
por adição de padrão do ponto 100 µg/mL de warifteína (WAR)
Figura 44 - Espectro de UV da metilwarifteína em CLAE/DAD na concentração de
100 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min. em fase móvel
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05) fluxo de 1,3 mL e λ em 223 nm
Figura 45 - Espectro de UV bidimensional da metilwarifteína (MWAR) em CLAE/DAD
na concentração de 100 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min. em fase móvel
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05), fluxo de 1,3 mL e λ=246 nm
Figura 46 - Espectro de UV tridimensional da metilwarifteína em CLAE/DAD na
concentração de 100 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min. em fase móvel
91
92
95
95
115
115
117
117
119
119
123
123
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05), fluxo de 1,3 mL e λ=246 nm
Figura 47 - Pureza de 99% do pico cromatográfico da metilwarifteína em CLAE/DAD
na concentração de 50 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min. em fase móvel
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05), fluxo de 1,3 mL e λ=246 nm
Figura 48 - Perfil de pureza do pico cromatográfico da metilwarifteína (50 µg/mL)
avaliada durante o processo de separação cromatográfica nos comprimentos de
onda de 227, 232 237, 242, 247 nm
Figura 49 - Espectros de UV da metilwarifteína (azul) e warifteína (preto) sobrepostos
em CLAE/DAD
Figura 50 - Cromatograma da metilwarifteína (MWAR) em CLAE/DAD na
concentração de 100 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min. em fase móvel
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05), fluxo de 1,3 mL e λ=246 nm
Figura 51 - Cromatograma dos padrões warifteína (WAR) e metilwarifteína (MWAR)
nas concentrações de 50 µg/mL
Figura 52 - Cromatograma dos padrões warifteína 25 µg/mL (WAR) e metilwarifteína
50 µg/mL (MWAR)
Figura 53 - Cromatograma da mistura de warifteína 0,5 mg/mL (WAR) e
metilwarifteína 0,5 mg/mL (MWAR) adicionados ao extrato
Figura 54 - Relatório da eficiência da separação dos padrões warifteína e
metilwarifteína
Figura 55 - Cromatograma do extrato filtrado adicionado de warifteína (WAR) padrão
sem sofrer degradação ácida com área do pico cromatográfico de 11339265
Figura 56 - Cromatograma 01 do extrato filtrado adicionado de warifteína (WAR)
padrão na degradação ácida com diminuição da área (5044124) e sem alteração da
simetria do pico cromatográfico da warifteína
Figura 57 - Cromatograma 02 do extrato filtrado adicionado de warifteína (WAR)
padrão na degradação ácida com diminuição da área (5353621) e sem alteração da
simetria do pico cromatográfico da warifteína
Figura 58 - Cromatograma da concentração Baixa da warifteína (WAR) na primeira
análise de precisão e exatidão
Figura 59 - Cromatograma da concentração Média da warifteína (WAR) na primeira
análise de precisão e exatidão
Figura 60 - Cromatograma da concentração Alta da warifteína (WAR) na primeira
124
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130
130
133
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análise de precisão e exatidão
Figura 61 - Cromatograma da concentração baixa da warifteína (WAR) na segunda
análise de precisão e exatidão
Figura 62 - Cromatograma da concentração média da warifteína (WAR) na segunda
análise de precisão e exatidão
Figura 63 - Cromatograma da concentração alta da warifteína (WAR) na segunda
análise de precisão e exatidão
Figura 64 - Cromatograma da concentração Baixa da warifteína (WAR) na terceira
análise de precisão e exatidão
Figura 65 - Cromatograma da concentração Média da warifteína (WAR) na terceira
análise de precisão e exatidão
Figura 66 - Cromatograma da concentração Alta da warifteína (WAR) na terceira
análise de precisão e exatidão
Figura 67 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) obtido na determinação do limite de
detecção da warifteína (WAR) na concentração de 0,027 µg/mL
Figura 68 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) obtido na determinação do limite de
quantificação da warifteína (WAR) na concentração de 0,09 µg/mL
Figura 69 - Cromatograma obtido na aplicação do método com a adição de 100
µg/mL de warifteína (WAR) na amostra
Figura 70 - Cromatograma da amostra (WAR) a 80 µg/mL no primeiro dia de análise
Figura 71 - Cromatograma da amostra (WAR) a 80 µg/mL no último dia de análise
134
137
137
138
140
141
141
148
148
150
154
154
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Curva de calibração da warifteína em comprimento de onda (λ) de 226
nm
Gráfico 2 - Curva de calibração da warifteína em comprimento de onda (λ) de 246
nm
Gráfico 3 - Curva de calibração da warifteína em comprimento de onda (λ) de 256
nm
Gráfico 4 - Curva de calibração da warifteína em comprimento de onda (λ) de 280
nm
Gráfico 5 - Curva de calibração da warifteína recristalizada com detecção em 246
nm
Gráfico 6 - Linearidade obtida com o processo de extração proposto para
quantificação da warifteína.
Gráfico 7 - Linearidade obtida com o processo de extração proposto para
quantificação da warifteína
Gráfico 8 - Linearidade obtida com o processo de extração proposto para
quantificação da warifteína, com mudança de uma base forte NaOH 0,1M por
uma base fraca NH
4
OH 0,3M
Gráfico 9 - Linearidade obtida com o procedimento de quantificação da warifteína
proposto com o extrato filtrado com todos os pontos: 0, 10, 20, 30, 50 e 100
µg/mL
Gráfico 10 - Linearidade obtida com o procedimento de quantificação da
warifteína proposto com o extrato filtrado com todos os pontos escolhidos: 0, 10,
20, 30, 50, 100 µg/mL para a primeira curva de calibração
Gráfico 11 - Linearidade obtida com o procedimento de quantificação da
warifteína proposto com o extrato filtrado com todos os pontos escolhidos: 0, 10,
20, 30, 50, 100 µg/mL para a segunda curva de calibração
Gráfico 12 - Linearidade obtida com o procedimento de quantificação da
warifteína proposto com o extrato filtrado com todos os pontos escolhidos: 0, 10,
20, 30, 50, 100 µg/mL para a terceira curva de calibração
Gráfico 13 - Gráfico das médias das 3 curvas de calibração com sua regressão
linear
78
78
79
79
86
87
88
89
94
114
116
118
121
Gráfico 14 - Gráfico de resíduos dos dados de linearidade
Gráfico 15 - Curva de calibração obtida no primeiro dia de análise para a precisão
e exatidão
Gráfico 16 - Curva de calibração obtida no segundo dia de análise para precisão
e exatidão
Gráfico 17 - Curva de calibração obtida no terceiro dia de análise para precisão e
exatidão
Gráfico 18 - Curva de calibração para obtenção do LOD e LOQ.
Gráfico 19 - Curva de calibração obtida na aplicação do método
122
132
135
139
147
150
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1 - Marcha sistemática para extração e isolamento dos alcalóides
de Cissampelos sympodialis EICHL (Menispermaceae) 44
Esquema 2 - Esquema mostrando os passos para se realizar pesquisa com
plantas medicinais com fins de registro de acordo com a RDC n° 48/2004 102
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Condições cromatográficas finais do método desenvolvido para a
quantificação de warifteína nos extratos de C. sympodialis 97
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Deslocamentos químicos de RMN de
1
H da Fr24-25 e da Sb1
comparados com dados da literatura para as substâncias warifteína e
metilwarifteína isoladas das raízes de Cissampelos sympodialis
Tabela 2 - Condições experimentais iniciais para separação em HPLC
Tabela 3 - Concentrações crescentes de warifteína (2,5; 5, 10, 20, 40, 80 µg/mL)
com as respectivas áreas do pico cromatográfico em 226, 246, 256 e 280 nm
quando analisadas por HPLC
Tabela 4 - Áreas dos picos cromatográficos da warifteína nas concentrações de
2,5; 5; 10; 20; 40; 80 µg/mL injetadas em triplicata
Tabela 5 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição de
padrão warifteína nos pontos 0; 2,5; 5; 10; 20; 40; 80 µg/mL.
Tabela 6 - Áreas dos picos cromatográficos da segunda curva de calibração por
adição de padrão warifteína nos pontos 0; 2,5; 5; 10; 20; 40; 80 µg/mL.
Tabela 7 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição de
padrão warifteína nos pontos 0; 2,5; 5; 10; 20; 40; 80 µg/mL.
Tabela 8 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição de
padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL
Tabela 9 - Áreas dos picos cromatográficos da primeira curva de calibração por
adição de padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL
Tabela 10 - Áreas dos picos cromatográficos da segunda curva de calibração por
adição de padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL
Tabela 11 - Áreas dos picos cromatográficos da terceira curva de calibração por
adição de padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL
Tabela 12 - Média das 3 curvas de calibração obtidas no estudo de linearidade
Tabela 13 -
A
valiação estatística da linearidade de acordo com ANOVA
Tabela 14 - Cálculo dos resíduos em relação às três curvas de calibração obtidas
na linearidade
Tabela 15 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição
de padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL no primeiro dia de
análise
Tabela 16 - Área dos picos cromatográficos das concentrações Baixa, Média e
A
lta do primeiro dia de análise
50
71
77
86
87
88
89
93
114
116
118
120
120
122
131
132
Tabela 17 - Valores obtidos para a precisão e exatidão intradia na primeira
análise
Tabela 18 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição
de padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL do segundo dia de
análise
Tabela 19 - Área dos picos cromatográficos das concentrações Baixa, Média e
Alta do segundo dia de análise
Tabela 20 - Valores obtidos para a precisão e exatidão intradia na segunda
análise
Tabela 21 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição
de padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL do terceiro dia de
análise
Tabela 22 - Área dos picos cromatográficos das concentrações Baixa, Média e
Alta do terceiro dia de análise
Tabela 23 - Valores obtidos para a precisão e exatidão intradia na terceira análise
Tabela 24 - Resultado da precisão interdias para as concentrações Baixa, Média
e Alta
Tabela 25 - Resultado da exatidão interdias para as concentrações Baixa, Média
e Alta
Tabela 26 - Média das concentrações Baixa (B), Média (M) e Alta (A)
Tabela 27 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com a
diminuição de 2% de fase orgânica
Tabela 28 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com o
aumento de 2% da fase orgânica
Tabela 29 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com a
diminuição da temperatura para 38°C
Tabela 30 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com o
aumento da temperatura para 42°C
Tabela 31 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com o
aumento para 0,1% de trietilamina
Tabela 32 - Limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) calculados pelo
sistema class-vp modo ASTM para o marcador warifteína
Tabela 33 - Área dos picos cromatográficos da curva de calibração
133
135
136
136
138
139
140
142
142
143
143
144
144
145
145
146
147
Tabela 34 - Área dos picos cromatográficos obtidos com a curva de calibração na
aplicação do método
Tabela 35 - Média das áreas do padrão de 2,5 µg/mL preparadas nos dias de
análise
Tabela 36 - Coeficiente de variação da amostra de 2,5 µg/mL ao longo dos 20
dias de análise
Tabela 37 - Coeficiente de variação da solução estoque de 2,5 µg/mL ao longo
dos dias de análise
Tabela 38 - Média das áreas do padrão de 80 µg/mL preparadas nos dias de
análise
Tabela 39 - Coeficiente de variação da amostra de 80 µg/mL ao longo dos 20
dias de análise
Tabela 40 - Coeficiente de variação da solução estoque de 80 µg/mL ao longo
dos dias de análise
149
151
151
152
152
153
153
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACN: Acetonitrila
AMPc: Adenosina monofosfato cíclico
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CCDP: Cromatografia em camada delgada preparativa
CCDA: Cromatografia em camada delgada analítica
CC: cromatografia em coluna
C
18
: Octadecilsilano
CLAE/DAD: Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de arranjo
de diodos
EEBR: Extrato etanólico bruto das raízes
EBF: Extrato etanólico bruto das folhas
FAR: Fração aquosa da raiz
FAF: Fração aquosa das folhas
FAT-r: Fração de alcalóides totais das raízes
FO: Folhas
FT-IR: Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
LOD: Limite de detecção
LOQ: Limite de quantificação
MWAR: Metilwarifteína
MS: Espectro de Massas
µL: microlitros
OVA: Ovalbumina
PDE: Fosfodiesterases
RA: Raiz
RDC: Resolução da diretoria colegiada
ROC: Canais operados por receptores
UV-VIS: Ultravioleta-visível
WAR: Warifteína
VOC: Canais operados por voltagem
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................24
2 OBJETIVO ......................................................................................................31
2.1 Geral ...........................................................................................................31
2.2 Específicos .................................................................................................31
CAPÍTULO I – Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
3 Revisão da literatura.......................................................................................33
3.1 Aspectos Botânicos de Cissampelos sympodialis ......................................33
3.2 Perfil químico da família Menispermaceae .................................................33
3.3 O Gênero Cissampelos ...............................................................................34
3.4 A espécie Cissampelos sympodialis ...........................................................36
4 Material e métodos.........................................................................................38
4.1 Materiais.....................................................................................................38
4.2 Material vegetal .........................................................................................38
4.3 Ensaios cromatográficos ..........................................................................38
4.4 Obtenção do extrato hidroalcóolico das folhas..........................................39
4.5 Obtenção dos marcadores da milona........................................................40
4.6 Recristalização da warifteína.....................................................................45
4.7 Caracterização espectroscópica................................................................45
4.8 Ponto de Fusão..........................................................................................47
5 Resultados e discussão................................................................................48
5.1 Obtenção dos marcadores da milona (warifteína e metilwarifteína).........48
5.2 Recristalização da warifteína....................................................................49
5.3 Ressonância Magnética Nuclear de
1
H ...................................................49
5.4 Espectro de infravermelho........................................................................57
5.5 Espectro no ultravioleta.............................................................................59
5.6 Espectro de massas..................................................................................60
5.7 Ponto de fusão..........................................................................................62
Capítulo II – Desenvolvimento do método cromatográfico
6 Revisão da literatura.......................................................................................64
6.1 Princípios da cromatografia........................................................................64
6.2 Cromatografia líquida de alta eficiência......................................................65
6.3 Desenvolvimento de métodos cromatográficos em HPLC..........................67
7 Material e métodos..........................................................................................73
7.1 Materiais......................................................................................................73
7.2 Escolha do comprimento de onda e avaliação da pureza do pico
cromatográfico......................................................................................................73
7.3 Escolha do fluxo e da fase móvel...............................................................74
7.4 Experimentos de pré-validação...................................................................74
7.4.1 Linearidade da resposta a warifteína em solução padrão.....................74
7.4.2 Linearidade da resposta a warifteína por adição de padrão ao extrato
etanólico bruto a 70% (EBF) com extração líquido-líquido...................................75
7.4.3 Linearidade da resposta a warifteína por adição de padrão ao extrato
etanólico bruto a 70% (EBF) com injeção direta do extrato..................................76
8 Resultados e discussão................................................................................77
8.1 Resultados das áreas dos picos cromatográficos para escolha do
comprimento de onda...........................................................................................77
8.2 Curvas de calibração da warifteína em diferentes comprimentos de
onda......................................................................................................................78
8.3 Grau de pureza e características espectrais do pico referente à
warifteína...............................................................................................................80
8.4 Cromatograma da warifteína no comprimento de onda selecionado.......83
8.5 Escolha da fase móvel...............................................................................83
8.5.1 Escolha do fluxo e da concentração da fase móvel...................................83
8.6 Linearidade da resposta a warifteína em solução padrão.........................85
8.7 Linearidade da resposta a warifteína por adição de padrão ao extrato
etanólico bruto a 70% (EBF) com extração líquido-líquido...................................87
8.8 Linearidade da resposta a warifteína por adição de padrão ao extrato
etanólico bruto a 70% (EBF) com injeção direta do extrato..................................93
Capítulo III – Validação do Método Analítico
9 Revisão da literatura..................................................................................101
9.1 Registro e validação de metodologias analíticas para medicamentos
fitoterápicos.........................................................................................................101
9.1.1 Especificidade e seletividade............................................................103
9.1.2 Linearidade.......................................................................................104
9.1.3 Intervalo...........................................................................................104
9.1.4 Precisão....................................................................................... ...104
9.1.5 Limite de detecção...........................................................................105
9.1.6 Limite de quantificação....................................................................106
9.1.7 Exatidão...........................................................................................106
10 Material e métodos.....................................................................................108
10.1 Materiais................................................................................................108
10.2 Linearidade...........................................................................................108
10.3 Seletividade...........................................................................................109
10.4 Degradação ácida.................................................................................109
10.5 Precisão e exatidão...............................................................................110
10.6 Robustez...............................................................................................111
10.7 Limite de detecção e limite de quantificação........................................111
10.8 Aplicação do método.............................................................................112
10.9 Verificação da estabilidade das soluções de trabalho da warifteína......113
11 Resultados e discussão ...........................................................................114
11.1 Linearidade...........................................................................................114
11.2 Seletividade...........................................................................................123
11.2.1 Degradação ácida..........................................................................129
11.3 Precisão e exatidão...............................................................................131
11.4 Robustez...............................................................................................143
11.5 Limite de detecção e limite de quantificação........................................146
11.6 Aplicação do método.............................................................................149
11.7 Verificação da estabilidade das soluções de trabalho da warifteína....151
12 CONCLUSÕES............................................................................................155
Capítulo IV – Referências
13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................157
Introdução e objetivos
24
1 INTRODUÇÃO
Comparativamente, o Brasil é um país com uma grande biodiversidade. Este
enorme patrimônio genético do país, especialmente aquele ligado à sua flora,
desperta o interesse econômico de países desenvolvidos, que visam a exploração
comercial de produtos e processos derivados do uso destas espécies. Uma das
principais vertentes deste interesse recente é a exploração do conhecimento
etnobotânico e etnofarmacológico sobre plantas medicinais detido pelas diversas
populações indígenas (MGBEOJI, 2007).
A utilização de plantas com finalidade terapêutica pelo homem já data de
muito tempo, gerando assim o conhecimento tradicional de suas indicações
terapêuticas e modo de uso, muitas vezes encurtando o tempo para o
desenvolvimento de um novo medicamento, antes mesmo de iniciarem os estudos
científicos para a validação de seu uso.
No Nordeste brasileiro, doenças como asma, gripe, bronquite e reumatismo
são tradicionalmente tratadas com infusões das cascas das raízes de Cissampelos
sympodialis, popularmente conhecida, na região, como milona, abuteira e orelha de
onça (CORREA, 1929).
Estudos fitoquímicos do extrato da raiz de C. sympodialis têm indicado a
presença de alcalóides aporfínicos, bisbenzilisoquinolínicos e protoberberínicos e
estes estudos culminaram com o isolamento de quatro alcalóides terciários
(warifteína, metilwarifteína, simpodialina β-N-óxido e milonina), um alcalóide
quaternário (laurifolina) e um alcalóide mostrando um esqueleto morfinâmico
(milonina) (ALENCAR, 1994; FREITAS et al., 1995; BARBOSA et al., 1997). A
warifteína demonstrou ser o alcalóide majoritário de C. sympodialis e apresentou
ação espasmolítica (BARBOSA et al., 1997). Recentemente foi isolado um novo
alcalóide bisbenzilisoquinolínico das raízes de Cissampelos sympodialis denominado
de roraimina (LIRA et al., 2002).
Estudos farmacológicos demonstraram que a fração hidrossolúvel do extrato
etanólico das cascas das raízes de Cissampelos sympodialis é capaz de causar
inibição do tônus espontâneo em traquéia de cobaia, similar à isoprelina e
aminofilina; os efeitos do extrato foram parcialmente revertidos pelo propranolol. A
referida planta também antagonizou, de forma inespecífica, as contrações induzidas
por carbacol, histamina, PGF
2α
e Substância P, em preparações de traquéia isolada
Introdução e objetivos
25
de cobaia e aumentou os níveis de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) em
leucócitos alveolares de cobaia (THOMAS et al., 1995).
A warifteína e a metilwarifteína também produziu efeitos espasmolíticos
sobre traquéia de cobaia, mas com potências bem inferiores à fração aquosa do
extrato etanólico das cascas das raízes (FAR) (CÔRTES et al., 1995; FREITAS et
al., 1996). A simpodialina β -N-óxido e a laurifolina foram inefetivos (ALENCAR,
1994) e a milonina não foi testada devido a pequena quantidade obtida (FREITAS,
1994).
A partir de estudos realizados com a warifteína, observou-se um antagonismo
reversível, não específico e não competitivo à histamina, carbacol e bradicinina em
íleo de cobaia. A warifteína também antagonizou contrações induzidas por ocitocina
e bradicinina em útero de rato, enquanto que, em traquéia de cobaia, o alcalóide
inibiu o tônus espontâneo (CÔRTES et al., 1995).
Segundo Côrtes (1992), em traquéia de cobaia a warifteína induziu um
relaxamento direto, que mostrou ser 5,1 vezes mais potente do que a aminofilina. A
ação relaxante da warifteína deve-se à sua ação inibitória dos canais de Ca
+2
operados por receptor (ROCs) e canais de Ca
+2
operados por voltagem (VOCs),
assim como da liberação de Ca
+2
intracelular, especificamente dos estoques
sensíveis à noradrenalina. Esta inespecificidade da warifteína indica que a ação
inibitória desta substância, no movimento intra e extracelular de Ca
+2
, podem derivar
da ativação ou inibição de mecanismos indiretos de controle deste movimento.
Corroborando com o trabalho realizado por Côrtes (1992), Freitas (1994)
concluiu que a warifteína exerce sua ação espasmolítica sobre músculo vascular
através da inibição dos canais de Ca
+2
de membrana, tanto dos operados por
voltagem quanto dos operados por receptores e ainda através da inibição da
liberação e da reestocagem do Ca
+2
intracelular somente dos estoques sensíveis à
noradrenalina.
Em musculatura esquelética a warifteína foi 1,4 vezes mais potente do que a
metilwarifteína, em inibir as contrações induzidas pela estimulação indireta do nervo
frênico do músculo diafragma de rato. A atividade espasmolítica não depende de
liberação de mediadores de células endoteliais ou epiteliais, ou da possível atividade
anestésica local da warifteína. Este efeito se dá por uma ação pós-sináptica sobre a
membrana do músculo esquelético, mas não sobre as fibras contráteis intracelulares
(ALENCAR, 1994).
Introdução e objetivos
26
Um outro estudo (THOMAS et al., 1997a) revelou que a fração aquosa do
extrato etanólico das folhas desta planta (FAF) teve potência similar àquela das
raízes em relaxar músculo liso de traquéia e ainda inibiu o broncoespasmo induzido
por histamina em cobaia normal e a resposta anafilática induzida por antígeno em
cobaia sensibilizada com ovalbumina (OVA), sugerindo que, provavelmente, a
warifteína não é a única substância ativa desta planta, devido a sua baixa
concentração nas folhas em comparação com as raízes, indicando a presença de
outros contituintes ativos. Além da potência da FAF ser similar a da FAR, em
camundongos, esta fração foi consideravelmente menos tóxica quando comparada
àquela obtida das raízes (DINIZ et al., 1995).
Em ensaios toxicológicos pré-clínicos da FAF em ratos para a determinação
da DL
50
, foi verificado que a administração de doses de até 5000 mg/kg via oral
(dose 555 vezes maior que a dose de uso popular) e 2000 mg/kg via intraperitoneal
(dose 222 vezes maior que a de uso popular) não provocou mortes. A análise
laboratorial do sangue não evidenciou alterações estatisticamente significantes nos
parâmetros hematológicos e nem sobre a contagem de plaquetas. Porém, houve
aumentos significativos dos níveis de aspartato transaminase (AST) e uréia. O
aumento dos níveis de AST foi atribuído a alterações hepáticas, enquanto o
aumento do nível sérico de uréia, foi devido à alteração renal, decorrente da maior
necessidade de trabalho deste órgão para eliminar grande quantidade da
substância. O estudo anatomopatológico não evidenciou alterações macroscópicas
nos órgãos examinados (coração, pulmão, fígado e rins). No entanto, o estudo dos
cortes histopatológicos do fígado e dos pulmões demonstrou reação inflamatória,
alterações microvasculares sinusoidais no fígado e necrose hepatocelular, sendo
estes efeitos atribuídos às altas doses administradas (DINIZ et al., 2004). Os
resultados demonstraram ser a FAF praticamente atóxica quando comparados aos
resultados obtidos para as raízes onde a DL
50
foi de 138,0 mg/kg por via
intraperitoneal de ratos. Em cães a FAF foi praticamente atóxica quando
administrada na dose de 45 mg/kg/dia (5 vezes a dose de uso popular), por via oral,
durante 30 dias (DINIZ, 2000).
Em estudos preliminares sobre migração celular foi observado que cobaias
sensibilizadas com OVA e tratadas com FAF, apresentaram no lavado
broncoalveolar, um aumento significativo de células mononucleares sem que
houvesse alterações no percentual de eosinófilos ou neutrófilos, sugerindo, portanto,
Introdução e objetivos
27
uma atividade quimiotática para células mononucleares. As investigações
posteriores indicaram que FAF inibe as fosfodiesterases (PDE) IV e V, obtidas dos
pulmões de cobaia e aumenta os níveis de AMPc em cultura de células do músculo
liso de traquéia (THOMAS et al., 1997b). Estudos com neutrófilos periféricos
humanos também indicaram que a FAF tem atividade inibitória sobre degranulação
induzida pelo peptídeo formil-metionina-leucina-prolina, e que também aumenta os
níveis de AMPc e a atividade da proteína quinase A dependente de AMPc em
neutrófilos (THOMAS et al., 1999).
Os estudos acima mostraram que a FAF tem atividade broncodilatadora tanto
in vivo como in vitro, inibe a liberação de medidores de neutrófilos e pode agir
através do aumento dos níveis de AMPc devido a estimulação direta da adenilato
ciclase ou por inibição de PDE, como o faz a teofilina. Além disso, estudos
adicionais mostraram que a FAF apresenta atividade antidepressiva em nível do
sistema nervoso central (ALMEIDA et al., 1998), contracturante vascular (FREITAS
et al., 2000) e hipertensiva (MEDEIROS et al., 1998).
A FAF também demonstrou ter um efeito imunomodulatório sobre a função
dos linfócitos B in vitro de ratos com a inibição de sua proliferação induzida por LPS,
anti-delta-dextran e anti-IgM, através do aumento intracelular dos níveis de AMPc.
Este efeito inibitório pode indicar o efeito antiinflamatório deste extrato
(ALEXANDRE-MOREIRA et al., 2003a).
Um outro estudo realizado com a FAF investigou a modulação da atividade
de macrófagos infectados com Trypanosoma cruzi pelo tratamento in vitro com o
extrato em ratos. A FAF aumentou significativamente a produção de IL-10
(interleucina) pelos macrófagos infectados pelo protozoário e com isso inibiu a
liberação de NO, fazendo com que aumentasse o crescimento de T. cruzi. Esta
inibição da função dos macrófagos pode demonstrar o efeito imunossupressor e
antiinflamatório do extrato através da diminuição de sua atividade (ALEXANDRE-
MOREIRA et al., 2003b).
Estes estudos farmacológicos e toxicológicos pré-clínicos corroboram a
indicação popular, demonstrando que C. sympodialis possui um grande potencial
para ser usada como agente antiasmático (DINIZ, 2000). Portanto é de grande
interesse a padronização do extrato hidroalcoólico bruto das folhas de C.
sympodialis e de formas farmacêuticas dele derivadas, visto que a quantificação de
marcadores químicos em extratos vegetais e nas formas farmacêuticas finais deles
Introdução e objetivos
28
derivadas é um importante requisito para obtenção de fitoterápicos eficazes e
seguros.
No segmento industrial, é nítido o ressurgimento do interesse em produtos
naturais como fonte de modelos para fármacos e como matéria-prima para o
desenvolvimento de fitoterápicos (SIMÕES & SCHENKEL, 2002).
A justificativa para tal interesse, poderia ser a busca pela população por
terapias menos agressivas, assim como os avanços ocorridos na área científica que
permitiram o desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos mais seguros e
eficazes.
No entanto, ainda existe uma falta de tradição das indústrias farmacêuticas
brasileiras em investir em Pesquisa e Desenvolvimento, principalmente no
desenvolvimento de novos medicamentos fitoterápicos. A quase totalidade dos
fitoterápicos produzidos com plantas nativas está fundamentada apenas no uso
popular dessas plantas, mas sem comprovação científica de eficácia e segurança de
uso. Essa situação, se não for revertida, fará com que as indústrias nacionais de
fitoterápicos enfrentem dificuldades para sobreviver no futuro. Apesar de o Brasil
possuir uma das maiores biodiversidades mundiais, corre o risco de tornar-se
importador de matérias-primas vegetais e reprodutor de formulações fitoterápicas, a
exemplo do que ocorre com a produção de medicamentos sintéticos (SIMÕES &
SCHENKEL, 2002).
Um dos grandes problemas no uso de produtos naturais com fins terapêuticos
é o fato de a população acreditar erroneamente que não existem contra-indicações
nem restrições ao seu uso, o que contribui muito para a prática da automedicação.
Além disso, os medicamentos fitoterápicos constituem um desafio no que se refere à
demonstração da sua segurança e eficácia, não raro sendo alvo de adulterações e
contaminações. Um dos casos mais evidentes é o grande uso de preparações com
alegação anorexígena para dietas de emagrecimento, com existência de
propagandas enganosas pelas indústrias farmacêuticas que visam somente o seu
lucro. Vários casos já foram confirmados de aulterações desses produtos com a
adição em sua formulação de substâncias anorexígenas sintéticas podendo levar à
dependência química e síndrome de abstinência.
Para contornar essa situação faz-se necessário uma maior fiscalização pelos
órgãos competentes como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), e
principalmente a existência de técnicas analíticas que possam identificar a presença
Introdução e objetivos
29
de produtos de outra natureza em extratos vegetais utilizados como base para a
obtenção dos fitoterápicos.
O controle de qualidade de medicamentos fitoterápicos é um desafio analítico
pela complexidade da matriz vegetal e muita vez faz-se necessário o uso de
técnicas cromatográficas capazes de avaliar as características qualitativas e
quantitativas da droga vegetal. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
acoplada ao detector de ultravioleta com arranjo de fotodiodos (CLAE/UV-DAD),
permite avaliar a seletividade do método de detecção, gerando informações a
respeito de possíveis marcadores presentes nas plantas através de uma
comparação espectral na região do ultravioleta/visível. Outras técnicas confiáveis e
que dão a mesma segurança nos resultados também podem ser utilizadas como a
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um espectrômetro de massas
(CLAE/EM), ou CLAE acoplada a Ressonância Magnética Nuclear de
1
H ou
13
C
(CLAE/RMN-
1
H /
13
C).
Estudos de validação constituem uma exigência da Resolução da Diretoria
Colegiada, n° 48 de 16 de março de 2004, da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA) que normatiza o registro de medicamentos fitoterápicos, de
modo a garantir a sua qualidade e eficácia (BRASIL, 2004). Para os requisitos de
validação do método analítico foi criada a Resolução-RE nº 899, de 29 de Maio de
2003 estabelecendo o Guia para Validação de Métodos Analíticos e
Bioanalíticos. Esta Resolução estabelece que um método para ser validado deve
apresentar precisão, exatidão, linearidade, sensibilidade, especificidade e
reprodutibilidade adequada à análise (RE 899, 2003).
Devido à complexibilidade química que um extrato vegetal representa e a sua
enorme variância regional em termos de quantidade e muitas vezes identidade dos
seus componentes químicos, há a necessidade de padronização de matérias-primas
vegetais, como a milona, através do desenvolvimento e validação de métodos
analíticos específicos que quantifiquem os seus marcadores no extrato etanólico
bruto e em outras formulações derivadas, para garantir a qualidade e eficácia do
fitoterápico deles derivado.
Frente a todas as atividades farmacológicas e aos resultados de testes pré-
clínicos e clínicos com os extratos de Milona, torna-se imperativo o desenvolvimento
de uma metodologia analítica validada que seja capaz de quantificar de forma
precisa, exata e seletiva a warifteína, como principal marcador desta planta, tanto
Introdução e objetivos
30
nos extratos do material vegetal, quanto nos potenciais produtos farmacêuticos
deles derivados. O único trabalho anterior dirigido a este fim foi aquele de Aragão
(ARAGÂO, 2002), que desenvolveu um método para quantificação de warifteína em
extratos secos nebulizados de C. sympodialis. Entretanto, o método desenvolvido
tem o incoveniente de utilizar extração líquido-líquido para a preparação da amostra
com uma recuperação bastante variável do procedimento de extração (67-85%).
Além disso, o método utilizou um modelo de calibração que não leva em conta os
efeitos de matriz na resposta à warifteína, e não foi validado em completa
conformidade às exigências da resolução RE 899/03 da ANVISA.
Introdução e objetivos
31
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Validar uma metodologia analítica para padronização de extratos de
Cissampelos sympodialis EICHL (Milona) através de técnicas cromatográficas, com
observância à Resolução-RE nº 899 de 29 de Maio de 2003 da ANVISA.
2.2 Específicos
1 Quantificação da warifteína no extrato etanólico das folhas de C. sympodialis
(Milona);
2 Avaliar técnicas de extração para análise do marcador warifteína da milona;
3 Isolamento, purificação e caracterização estrutural dos marcadores warifteína
e metilwarifteína das raízes da milona;
4 Desenvolvimento de metodologia analítica empregando análise
cromatográfica (CLAE) para separação, identificação e quantificação da
warifteína;
5 Padronização e validação do método;
6 Aplicação do método a amostras do material vegetal.
CAPÍTULO I
Obtenção dos marcadores e do extrato
etanólico bruto
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
33
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Aspectos Botânicos de Cissampelos sympodialis
A espécie C. sympodialis é uma trepadeira encontrada nas regiões Nordeste
e Sudeste do país, do Ceará a Minas Gerais. Frequentemente ocorre em áreas
abertas como subarbusto escandente em solo argiloso. Constitui-se de ramos
volúveis, pubérulos, acinzentados. Possui folhas alternas, notadamente peltadas,
glabras; pecíolo com cerca de 2 cm de comprimento, espessado no ápice e na base;
lâmina cartácea oval, triangular-lanceolada ou sub-ovada, com base truncada, ápice
e margem levemente revoluta. Com inflorescências dióicas, axilares em panículas
fasciculatas, com 8-10 cm de comprimento. Flor masculina com quatro pétalas e dois
estames concrescidos em sinândrio. Flor feminina com duas pétalas, alvacentas;
ovário unicarpelar. Fruto drupáceo, obovado, vermelho alaranjado quando maduro,
cerca de 1,0-1,5 cm de diâmetro (Figura 1) (EICHLER, 1887).
Figura 1 - Foto da Cissampelos sympodialis EICHL (DINIZ, 2000).
3.2 Perfil químico da família Menispermaceae
A família Menispermaceae é responsável pela produção de uma grande
variedade de alcalóides. A última revisão da família Menispermaceae, publicada por
Barbosa-Filho e colaboradores (BARBOSA-FILHO et al., 2000) revela que o perfil
dos alcalóides desta família é constituído por vinte e três grupos de alcalóides. Um
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
34
total de 1522 alcalóides foram isolados no período de 1970 a 1997. Destacam-se em
abundância os alcalóides bisbenzilisoquinolínicos (604 do total) isolados durante
este período, seguido pelos aporfínicos (303) e os protoberberínicos (275) em cento
e sessenta espécies diferentes (ARAGÃO, 2002).
A família Menispermaceae é constituída por aproximadamente 72 gêneros e
400 espécies, entre os quais, os gêneros mais predominantes em número de
espécies são: Stephania formado por 43 espécies, Tinospora 35, Abuta 33, Tiliacora
22, Cissampelos e Cyclea ambos com 19 espécies. No Brasil a família está
representada por um total de 12 gêneros com 106 espécies (LIRA, 2001).
3.3 O Gênero Cissampelos
O gênero Cissampelos compreende 19 espécies, das quais nove ocorrem no
Brasil (SANTOS, 2002; ARAGÃO, 2002). Das três espécies encontradas na Paraíba,
C. sympodialis, C. glaberrima e C. ovalifolia, as duas primeiras foram as mais bem
estudadas, devido a sua maior disponibilidade. Segundo BARBOSA e colaboradores
(BARBOSA et al., 1997), os alcalóides presentes neste gênero são quimicamente
conhecidos como derivados de núcleo isoquinolínico e todas as 53 bases descritas
na literatura pertencem a 7 tipos de esqueletos diferentes mostrados na Figura 2:
- Alcalóide tipo Benzilisoquinolínico (BIQ)
- Alcalóide tipo Bisbenzilisoquinolínico (BIS-BIQ)
- Alcalóide tipo Aporfínico (APORFIN)
- Alcalóide tipo Morfinândienônico (MORFIN)
- Alcalóide tipo Tetrahidroprotoberberínico (PROTOB)
- Alcalóide tipo Tropoloisoquinolínico (TROPOLI)
- Alcalóide tipo Azafluorantênico (AZAFLU)
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
35
NH
N
N
O
O
NH
O
NH
N
N
O
N
Benziltetrahidroisoquinolínico
Bisbenziltetrahidroisoquinolínico
Aporfínico
Morfinândienônico
Tetrahidroprotoberberínico
Tropoloisoquinolínico
Azafluorantênico
Figura 2 - Núcleo básico dos alcalóides isolados do gênero Cissampelos.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
36
3.4 A espécie Cissampelos sympodialis
O estudo químico da espécie C. sympodialis no Laboratório de Tecnologia
Farmacêutica (LTF) levou ao isolamento de seis alcalóides. Quatro destes alcalóides
são terciários: warifteína (1), metilwarifteína (2), simpodialina β,N-óxido (3)
(bisbenzilisoquinolínicos), milonina (4) (morfinâmico), e um quaternário, do tipo
aporfínico: a laurifolina (5) (CÔRTES, 1992; ALENCAR, 1994; FREITAS, 1994;
FREITAS et al., 1996). O alcalóide isolado em maior quantidade foi a warifteína, que
foi encontrada nas raízes com um alto rendimento, correspondente a 1,4%,
permitindo ao mesmo tempo um estudo farmacológico (BARBOSA-FILHO et al.,
1997). Na raiz da mesma planta, além destes cinco alcalóides ocorreu o isolamento
e a elucidação estrutural de um novo alcalóide bisbenzilisoquinolínico, denominado
de roraimina (6) (Figura 3) (LIRA et al., 2002).
.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
37
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OH
H
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OMe
H
N
H
2
C
MeO
OH
H
H
Me
H
N
OH
O
O
OMe
O
O
N
OH
MeO
MeO
Me
H
N
OH
OH
CH
3
CH
3
MeO
MeO
H
H
H
H
H
H
H
N
O
OCH
3
OH
O
O
N
H
3
CO
H
3
CO
H
2
C
CH
3
A
B
C'
A'
B'
C
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
14'
13'
11'
10'
12'
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
10'
11'
12'
13'
14'
β
α
α′
β
α
+
4
4a
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
9'
10'
11'
12'
14'
1'
3'
4'5'
4a'
6'
7'
8'
8a'
8a
simpodialina
N - óxido
α′
β
Milonina
1
2
3
4
12
5
6
7
8
13
14
9
16
10
11
15
warifteína (WAR) (1)
metilwarifteína
(MWAR) (2)
α′
(3)
(4)
Laurifolina
+
1
2
3
3a
4
5
6a
11c
7
7a
8
9
10
11
11a
11b
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'5'
4a'
6'
7'
8'
8a'
9'
10'
11'
12'
13'
14'
roraimina
α
α′
(5)
(6)
Figura 3 - Alcalóides isolados de Cissampelos sympodialis.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
38
4 Materiais e métodos
4.1 Materiais
- Etanol 96GL – Toscano – engarrafado por Danquímica – LTDA;
- Água destilada;
- Ácido clorídrico, HCl a 3%; (MERCK);
- Hidróxido de amônio, NH
4
OH; (MERCK);
- Clorofórmio; (VETEC);
- Diclorometano; (VETEC);
- Metanol; (SYNTH);
- Sulfato de magnésio anidro, MgSO
4
; (MERCK);
- Sílica gel 60 PF
254
(M= 60,09 g/mol) com gesso para CCDA, (MERCK);
- Óxido de alumínio 90 (Al
2
O
3
) (M= 101,94 g/mol) seg. (BROCKMAN, MERCK).
4.2 Material vegetal
As folhas e as raízes da Cissampelos sympodialis EICHL (Menispermaceae)
utilizadas neste trabalho foram coletadas por raizeiros no sítio Riacho dos Xavies,
que fica no Município de Vieirópolis, a 20 km do Município de Souza, no mês de
agosto de 2006. A identificação botânica foi realizada pela botânica Prof. Dra. Maria
de Fátima Agra, e uma amostra encontram-se depositada no herbário Lauro Pires
Xavier desta Universidade com o código Agra 1456.
4.3 Ensaios cromatográficos
As cromatografias em camada delgada preparativa (CCDP) e em camada
delgada analítica (CCDA) foram realizadas utilizando-se sílica gel 60 PF
254
da Merck
(Alemanha, M= 60,09 g/mol) na espessura de 1,0 e 0,25 mm, respectivamente. A
sílica foi sendo adicionada em um béquer (capacidade 500mL) com água destilada
até formar uma suspensão na proporção de 35g de sílica para três vezes o volume
de água na CCDA e 80g de sílica para três vezes o volume de água na CCDP,
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
39
distribuída sobre placas de vidro através de um espalhador do tipo ‘’Quick fit’’, secas
ao ar e ativadas em estufa a 110°C por 2 horas. A cromatografia em coluna (CC) foi
utilizada tendo como adsorvente o óxido de alumínio 90 (Al
2
O
3
) (M= 101,94 g/mol)
seg. (BROCKMAN, Alemanha, MERCK).
4.4 Obtenção do extrato hidroalcóolico das folhas
As folhas (FO) da Cissampelos sympodialis frescas foram secas em estufa de ar
circulante a 40°C, trituradas (3.370 g), e submetidas a três macerações consecutivas
com etanol a 70% em um percolador durante um tempo total de 26 dias, com
intervalo entre uma extração e outra de uma semana. A solução hidroalcóolica foi
evaporada sob pressão reduzida em rotavapor a 60°C resultando em um extrato
bruto (EBF), concentrado de coloração verde-escura (459 g, 13,62%) (Figura 4).
Figura 4 - Solução hidroalcóolica das folhas de Cissampelos sympodialis sendo
concentrada em evaporador rotatório sob pressão reduzida.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
40
4.5 Obtenção dos marcadores da milona
As raízes (RA) da Cissampelos sympodialis secas e pulverizadas (1.750 g) foram
submetidas à extração com etanol a 70% por três semanas e a solução
hidroalcóolica foi concentrada a vácuo em um Evaporador rotatório sob pressão
reduzida, com temperatura de 60°C resultando em um extrato etanólico bruto das
raízes (EEBR) concentrado, de coloração marrom escura (315 g, 18%). Este extrato
foi submetido a uma marcha sistemática para isolamento de alcalóides (Esquema 1).
O EEBR (315 g) foi tratado com uma solução de ácido clorídrico a 3% (1000 mL)
sob agitação até pH 2,0-3,0. Em seguida a solução ácida foi filtrada em um funil de
Buchner com celite, fornecendo uma solução ácida que foi submetida a várias
extrações com diclorometano para remover, principalmente, substâncias graxas e
outras impurezas apolares. A fase diclorometano foi concentrada em evaporador
rotatório e armazenada para estudos futuros. A fase aquosa (600 mL) foi basificada
com hidróxido de amônio sob forte agitação até chegar a pH = 9,0, e extraída
exaustivamente com clorofórmio até reação negativa com o reagente de
Dragendorff.
A fase aquosa basificada foi descartada e a clorofórmica foi lavada com água,
seca com MgSO
4
anidro, filtrada e evaporada sob pressão reduzida a 55°C em
evaporador rotatório. Com isso foi obtida a fração de alcalóides terciários totais
(FAT-r) (58 g, 3,31%).
Para preparação da coluna cromatográfica (CC) suspendeu-se a alumina (Al
2
O
3
)
(400 g) em uma mistura de clorofórmio: hexano (1:1, v/v) e esta suspensão foi sendo
adicionada à coluna de vidro com a ajuda de um funil aos poucos e tomando
cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. A coluna foi então condicionada
com um volume de 500 mL da mistura de solventes clorofórmio:hexano (1:1, v/v).
Cinqüenta gramas da FAT-r foram pulverizadas com Al
2
O
3
em grau com pistilo,
fazendo-se uma ‘’farofa’’. A ‘’farofa’’ foi colocada com bastante cuidado na coluna
que já estava com solvente suficiente para encobri-la e depois se colocou mais um
pouco de Al
2
O
3
para evitar o refluxo. A eluição teve início com clorofórmio e as três
primeiras frações foram coletadas a cada 50 mL, depois foram coletadas de 100 em
100 mL até que o solvente se mostrou incolor (19 frações), mudando-se o sistema
de solvente para clorofórmio:metanol (98:2) (12 frações), depois clorofórmio:metanol
(95:5) (20 frações) e por último clorofórmio:metanol (93:7) (19 frações), aumentando-
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
41
se gradativamente a polaridade da fase móvel
As primeiras 19 frações obtidas foram codificadas como Fr 00-19, e sua
composição foram monitorados com a finalidade de reunir as frações com
composições similares. Para isto, foi realizada cromatografia em camada delgada
analítica com um sistema de eluentes constituído de clorofórmio:metanol (98:2, v/v) .
Depois de eluída, revelou-se a placa com reagente de Dragendorff, adquirindo as
manchas uma coloração avermelhada e as seguintes frações foram reunidas, pois
apresentavam manchas com os mesmos Rfs: Fr 00, Fr 1-2, Fr 3-8, Fr 9-19.
Figura 5 - Placa de cromatografia em camada delgada analítica, mostrando as
frações de alcalóides (Fr 00-19) obtidas após cromatografia em coluna.
Foram eluídas mais duas placas, a placa 2 e a 3. Na placa 2 (Figura 6) foram
colocados as amostras referentes às seguintes frações da cromatografia em coluna:
20 a 38. E na placa 3 (Figura 7) as amostras referentes às frações de número 39 a
46. As duas placas foram eluídas em um sistema de solventes constituído de
clorofórmio: metanol (95:5, v/v), para obter uma melhor separação dos alcalóides.
Revelando-se as placas com o reagente de Dragendorrf e observando seus Rfs foi
possível reunir as seguintes frações: Fr 20-23, Fr 24-25, Fr 26-28, Fr 29-31, Fr 32-
36, Fr 37-39, Fr 40-46.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
42
Figura 6 - Placa de cromatografia em camada delgada analítica das frações de 20 a
38 obtidas após cromatografia em coluna da FAT-r.
Figura 7 - Placa de cromatografia em camada delgada analítica das frações de 39 a
46 obtidas após cromatografia em coluna da FAT-r.
Foram eluídas mais três placas analíticas (placas 4, 5 e 6) (Figura 8) para tentar
reunir as outras frações que restaram, agora com outro sistema de solventes:
clorofórmio: metanol (93:7, v/v). Revelando-se as placas com reagente de
Dragendorff e observando seus Rfs foram reunidas as seguintes frações: Fr47-51,
Fr52-55, Fr56-57, Fr58-66, Fr67-88.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
43
Figura 8 - Placas de CCDA 4, 5 e 6 na seqüência da esquerda para a direita das
frações de alcalóides de número 47 a 88, obtidas após cromatografia em coluna da
FAT-r.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
44
Esquema 1 - Marcha sistemática para extração e isolamento dos alcalóides de
Cissampelos sympodialis EICHL (Menispermaceae).
Casca da raiz seca e pulverizada (1.750 g)
- extração com etanol a 70%
- evaporação do solvente
Extrato etanólico bruto
das raízes (EEBR) (315 g,
18%)
- solução ácida de HCl a 3%
- filtração
Solução ácida
Fase Diclorometano Fase ácida
Torta
(
Descartada
)
- alcalinização com NH
4
OH
até pH 9
- extração com CHCl
3
Fase aquosa
Fase CHCl
3
Fração de alcalóides
totais (FAT-r, 58 g,
3,31%)
- MgSO
4
anidro
- filtração
- evaporação
Resíduo
- Extração com diclorometano
Fr 24-25 (4,66g,
0,2665%)
Fr 01-02
CC
Sb1 (0,03g,
0
,
0017%
)
CCDP
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
45
4.6 Recristalização da warifteína
Para recristalizar a warifteína (0,3039 g) esta foi solubilizada em
aproximadamente 10 mL de metanol em erlenmeyer de 50 mL. A amostra foi
aquecida sob agitação em um agitador magnético e foi adicionado etanol p.a. gota a
gota até a solução ficar turva. Após a solução se tornar turva, a amostra foi
novamente aquecida até que a solução se tornasse límpida. Quando a solução,
após a adição de etanol e posterior aquecimento permaneceu límpida, algumas
gotas de metanol foram adicionadas e a solução foi transferida para geladeira (12
ºC). Depois de dois dias a amostra foi retirada da geladeira e o material sólido
precipitado foi filtrado com funil de Buckner e papel de filtro. O sólido resultante do
processo de recristalização foi seco em uma pistola de secagem com auxílio de
etanol p.a. e depois pesado para o cálculo do rendimento do processo.
4.7 Caracterização espectroscópica
Foi realizado espectro de infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR) no
Centro de Equivalência Farmacêutica (EQFAR-04) do LTF para análise e
confirmação da estrutura da warifteína. O equipamento utilizado para a realização do
espectro foi um espectrofotômetro de infravermelho com transformada de Fourier
(IR-FT) da marca BOMEN, modelo MB 100 M.
Para a realização do espectro de ultravioleta (UV) foi preparada uma solução
estoque de 1 mg/mL com a fração Fr 24-25 de alcalóides dissolvida em acetonitrila,
a qual foi diluída para uma concentração de 5 µg/mL com o mesmo solvente. O
equipamento utilizado foi um espectrofotômetro UV/ VIS (Vankel, VK 7010).
O espectro de massas da substância presente nas frações Fr 24-25 foi realizado
no Centro de Bioequivalência Farmacêutica (BIOEQFAR) do LTF, em um
espectrômetro de massas de triplo quadrupolo (MICROMASS, QUATTRO LC)
acoplado a um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (Shimadzu, Class Vp). A
substância em análise foi dissolvida em fase móvel (ACN:NH
4
OH 0,1%, 60:40, v/v),
na concentração de 10 μg/mL. Os seguintes parâmetros foram utlizados:
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
46
• Fase Móvel: 60% ACN : 40% H
2
O com 0,1% de NH
4
OH;
• Coluna cromatográfica: C18, 5 µm de partícula, 250 mm x 4,60 mm (usada).
• Fluxo: 1 mL/min.
• Faixa de massa: 250-700 u.m.a.
• Modo: Full Scan (MS Scan)
Condições de Ionização em modo ESI + (eletrospray positivo):
• Voltagem do capilar (KV): 3,40
• Voltagem do cone de amostragem (V): 28
• Voltagem do cone extrator (V): 5
• Voltagem da lente de RF (V): 0,1
• Temperatura da fonte (°C): 110
• Temperatura do gás de dessolvatação (°C): 110
Condições de Resolução e energia do filtro de íons:
• Resolução de massa baixa do primeiro quadrupolo (V): 13,5
• Resolução de massa alta do primeiro quadrupolo (V): 12,5
• Energia dos íons no primeiro quadrupolo (V): 1,0
• Energia de entrada (V): 40
• Energia de colisão (V): 3
• Energia de saída (V): 40
• Resolução de massa baixa do segundo quadrupolo (V): 12,5
• Resolução de massa alta do segundo quadrupolo (V): 12,5
• Energia dos íons no segundo quadrupolo (V): 1,0
• Eletromultiplicadora (V): 400
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
47
4.8 Ponto de fusão
O ponto de fusão não corrigido da warifteína foi verificado em um Medidor de
Ponto de fusão (GEHAKA, modelo PF 1500). Foram colocados três capilares de
vidro contendo amostra nas três câmaras de aquecimento e o ponto de fusão de
cada amostra foi registrado assim que cada uma delas passou para o estado líquido.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
48
5 Resultados e Discussão
5.1 Obtenção dos marcadores da milona (warifteína e metilwarifteína)
A fração reunida Fr 24-25 (4,6629g, 0,2665%) mostrou-se com pureza adequada
para obtenção de um espectro de Ressonância Magnética Nuclear de
1
H (RMN-
1
H),
já que depois de secar adquiriu uma forma de pó amarelado, amorfo, que fornecia
uma única mancha quando eluído em cromatografia em camada delgada analítica.
Já a fração Fr01-02 demonstrava aparentemente a presença de duas substâncias,
que poderiam ser a warifteína e metilwarifteína juntas. Portanto, para esta fração foi
realizada cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) para o possível
isolamento da metilwarifteína (Figura 9). O resultado foi o isolamento de um pó
amarelado, amorfo codificado por Sb1. As outras frações foram armazenadas para
estudos futuros.
Figura 9 - Fotos dos alcalóides isolados da FAT-r.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
49
5.2 Recristalização da warifteína
Foram pesados exatamente 0,3039 g de warifteína e depois do procedimento de
recristalização foram obtidos 204,4 mg da warifteína recristalizada dando um
rendimento para o processo de recristalização de 67,26%.
5.3 Ressonância Magnética Nuclear de
1
H
A fração Fr 24-25 (Figura 10) e a Sb1 (Figura 13) foram diluídas em clorofórmio
deuterado (CDCl
3
), nas quais foram solúveis, e obtidos os seus espectros de RMN-
1
H no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF) da Universidade Federal da
Paraíba (UFPB), no setor de pesquisa. As expansões desses espectros são
apresentadas nas Figuras 11 (2,0 - 4,0 ppm) e 12 (5,0 - 7,0 ppm) para Fr 24-25 e
nas Figuras 14 (1,5 - 4,0 ppm) e 15 (5,0 - 7,5 ppm) para Sb1. A fração Fr 24-25 e a
Sb1 foram facilmente identificadas como sendo a warifteína (WAR) e a
metilwarifteína (MWAR), respectivamente, através da comparação dos dados
espectroscópicos de RMN de
1
H com os dados espectroscópicos destas substâncias
(Tabela 1) obtidos anteriormente através do isolamento a partir das raízes desta
espécie em trabalho prévio realizado nesta Instituição (CÔRTES, 1992; FREITAS,
1994; ALENCAR, 1994) em equipamento de ressonância magnética nuclear de 60
MHz.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
50
Tabela 1 - Deslocamentos químicos de RMN de
1
H da Fr24-25 e da Sb1
comparados com dados da literatura para as substâncias warifteína e metilwarifteína
isoladas das raízes de Cissampelos sympodialis (CÔRTES, 1992).
Warifteína
δ em ppm*
Fr24-25
δ em ppm**
Metilwarifteína
δ em ppm
*
Sb1
δ em ppm**
H-1, 3, 4, αα’,
3’ e 4’
H-5
H-5’
H-β
H-11 e H-13,
H-10’ e H-14’
H-11’ e H-13’,
H-10 e H-14
OCH
3
NCH
3
m; 2,23 – 3,73
s; 6,63
s; 6,63
s; 5,13
m; 6,93 – 7,07
d; 7,13
s; 3,86
s; 3,93
s; 2,00
m; 2,4 – 2,6
s; 6,46
s; 6,22
d; 5,01
d; 6,9
d; 7,15
s; 3,87
s; 3,96
s; 2,03
m; 2,27 – 3,57
s; 6,62
s; 6,20
s; 5,16
m; 6,93 – 7,07
d; 7,20
s; 3,77
s; 3,87
s; 3,93
s; 2,00
m; 2,20 – 3,50
s; 6,51
s; 6,17
s; 5,10
d; 6,9
d; 7,06
s; 3,70
s; 3,84
s; 3,93
s; 1,93
*dados espectroscópicos a 60 MHz
**dados espectroscópicos a 200 MHz
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
51
Figura 10 - Espectro de RMN-
1
H da fração Fr 24-25 realizada com equipamento de RMN de 200
MHz.
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OH
H
A
B
C'
A'
B'
C
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
14'
13'
11'
10'
12'
β
α
α′
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
52
Figura 11 - Espectro expandido de RMN-
1
H da figura 10 na região entre 2,0 – 4,0 ppm.
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OH
H
A
B
C'
A'
B'
C
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
14'
13'
11'
10'
12'
β
α
α′
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
53
Figura 12 - Espectro expandido de RMN-
1
H da figura 10 na região entre 5,0 – 7,0 ppm.
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OH
H
A
B
C'
A'
B'
C
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
14'
13'
11'
10'
12'
β
α
α′
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
54
Figura 13 - Espectro de RMN-
1
H da substância Sb1 realizada com equipamento de 200 MHz.
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OMe
H
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
10'
11'
12'
13'
14'
β
α
α′
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
55
Figura 14 - Espectro expandido de RMN-
1
H da figura 13 na região entre 1,5 – 4,0 ppm.
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OMe
H
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
10'
11'
12'
13'
14'
β
α
α′
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
56
Figura 15 - Espectro expandido de RMN-
1
H da figura 13 na região entre 5,0 – 7,5 ppm.
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OMe
H
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
10'
11'
12'
13'
14'
β
α
α′
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
57
5.4. Espectro de Infravermelho (FT-IR)
As bandas mais características para a warifteína foram em: 3453,51 cm
-1
característico de estiramento de hidroxila fenólica (-OH), 2936,55 cm
-1,
típica de
estiramento da ligação C-H de CH
3
, 2844,07 cm
-1
, sugerindo estiramento da ligação
C-H de CH
2
, e de 1400-1600 cm
-1
referente a estiramento C-H
de anel aromático
(Figura 16).
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
58
Figura 16 - Espectro de infravermelho da fração Fr 24-25 de alcalóides da Cissampelos sympodialis EICHL feita
com pastilha de KBr.
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
59
5.5 Espectro no Ultravioleta
A Figura 17 revela os comprimentos de onda de máxima absorção (λ
max
) da
warifteína, que ocorrem em: 224 nm e 280 nm.
Figura 17 - Espectro no UV da fração Fr 24-25 diluída em acetonitrila (5 µg/mL).
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OH
H
A
B
C'
A'
B'
C
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
14'
13'
11'
10'
12'
β
α
α′
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
60
5.6 Espectro de Massas
A Figura 18 mostra o espectro de massas obtido por electrospray em modo
positivo (ESI
+
). O espectro mostra um pico correspondente ao íon quasimolecular
[M-H]
+
em m/z 593,58 para a Fração Fr24-25, confirmando o peso molecular da
warifteína, que possui fórmula molecular C
36
H
36
N
2
O
6
(massa exata calculada:
592,2575). Outro íon característico é o íon correspondente à cisão das duas ligações
éter da molécula que fornecem um fragmento em m/z 297 [M-295].
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
61
Figura 18 - Espectro de massas da fração Fr 24-25.
N
N
O
O
OMe
OH
Me
MeO
OH
H
A
B
C'
A'
B'
C
1
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
1'
3'
4'
4a'
5'
6'
7'
8'
8a
9'
14'
13'
11'
10'
12'
β
α
α′
Obtenção dos marcadores e do extrato etanólico bruto
62
5.7 Ponto de Fusão
Para o ponto de fusão da warifteína foram encontrados os seguintes resultados:
no primeiro capilar a amostra se liquefez em 174,7°C, no segundo em 178,6°C, e no
terceiro em 181,7°C. Fazendo-se a médias das três medidas temos um Ponto de
Fusão da warifteína em 178,3°C, com uma faixa de fusão média em torno de 3 ºC.
CAPÍTULO II
Desenvolvimento do método cromatográfico
Desenvolvimento do método cromatográfico
64
6 Revisão de Literatura
6.1 Princípios da Cromatografia
A técnica da cromatografia foi descoberta em 1906 pelo botânico italiano
naturalizado russo Mikahail Tswett, porém não foi muito utilizada até os anos 30.
Tswett separou pigmentos de plantas (clorofilas e carotenóides) adicionando um
extrato de folhas verdes em éter de petróleo sobre uma coluna com carbonato de
cálcio em pó em um tubo de vidro vertical. Enquanto a solução percolou através da
coluna, os componentes individuais da mistura migraram para baixo em diferentes
velocidades e então a coluna apresentou-se marcada com gradientes horizontais de
cores. A esse gradiente deu-se o nome de cromatograma (COLLINS et al., 1990).
A cromatografia funciona pelo fato das moléculas apresentarem polaridades
em comum e tenderem a se atrair mutuamente. Uma molécula polar possui uma
região rica em elétrons (-) e uma outra região que é pobre em elétrons (+).
Moléculas polares são unidas por forças de atração entre cargas opostas de átomos
diferentes. Por exemplo, as moléculas da água possuem regiões ricas em elétrons
nos átomos de oxigênio e pobres em elétrons nos átomos de hidrogênio.
Cromatografia é um processo físico de separação, no qual os componentes a
serem separados distribuem-se em duas fases: uma fase estacionária e outra móvel.
A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido disposto sobre um suporte
sólido com grande área superficial. A fase móvel, que pode ser um gás, um líquido
ou ainda um fluido supercrítico, passa sobre a fase estacionária eluindo consigo os
diversos componentes da mistura. De maneira mais completa, a técnica se baseia
no princípio da adsorção seletiva (PERES, 2002).
Estas diferenças no gradiente de migração dependerão das características
físico-químicas da fase móvel, da fase estacionária e também dos analitos
(NASCIMENTO, 2004). A Figura 19 mostra um processo de separação por
cromatografia de forma simples.
Desenvolvimento do método cromatográfico
65
Figura 19 - Processo de separação cromatográfica de quatro analitos em função do
tempo (NASCIMENTO, 2004).
Os componentes da amostra da Figura 19 (A, B, C e D) são separados pela
distribuição entre as duas fases: móvel e estacionária. Estes componentes são
introduzidos no tempo zero, e são eluídos pela fase móvel até entrar em contato
com a fase estacionária, na qual eles se distribuem ou particionam-se entre as duas
fases dependendo de suas afinidades relativas com as mesmas como determinado
por suas estruturas moleculares e pelas forças intra-moleculares.
Existem quatro principais tipos de cromatografia: cromatografia em papel,
cromatografia em camada delgada, cromatografia gasosa e cromatografia líquida de
alta eficiência. A seleção do tipo de cromatografia adequada depende do material a
ser isolado (PERES, 2002).
6.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Segundo CIOLA (CIOLA, 1998) a HPLC (High Performance Liquid
Chromatography), ou CLAE em Português (Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência), é uma técnica que emprega um conjunto de equipamentos especiais,
que poderão diferir em características e grau de automação (Figura 20). Os
aparelhos empregados para realizar a cromatografia a líquido são chamados de
cromatógrafos a líquido. Uma das principais características da técnica é a utilização
Desenvolvimento do método cromatográfico
66
de colunas empacotadas com suportes a base de sílica pelicular, que possui
diâmetros de 3-5 μm, o que garante uma elevada área superficial para a fase
estacionária e colunas com elevada eficiência.
Um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência se caracteriza por ter,
em sua configuração básica, os seguintes componentes:
1 Reservatório e sistema de bombeamento da fase móvel;
2 Sistema de bombeamento da fase móvel;
3 Sistema de introdução da amostra (injetor);
4 Coluna cromatográfica de separação;
5 Sistema de detecção (UV, por exemplo)
6 Sistema de registro e tratamento de dados.
Figura 20 - Diagrama esquemático de um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência
(CLAE).
O solvente (fase móvel) encontrado no reservatório é bombeado com o
auxílio da bomba através do sistema de introdução da amostra até a coluna
cromatográfica que pode estar situada dentro de um termostato. A separação dos
componentes da mistura é efetuada de acordo com a natureza da fase móvel, fase
estacionária e a natureza dos componentes analisados. A fase móvel sai da coluna
e passa por um sistema de detecção, que detecta alterações de alguma propriedade
Desenvolvimento do método cromatográfico
67
física específica. Esta variação é transformada num sinal elétrico, que é registrado e
tratado matematicamente por um processador, obtendo-se um gráfico que se chama
de cromatograma.
6.3 Desenvolvimento de métodos cromatográficos em HPLC
De acordo com SNYDER (SNYDER et al., 1997) o desenvolvimento de
métodos cromatográficos é baseado em várias considerações como, por exemplo,
no conhecimento da natureza da amostra a ser analisada e das condições
experimentais de separação. Em muitos casos uma boa separação pode ser
alcançada com apenas poucos experimentos, enquanto que em outros casos uma
quantidade considerável de experimentos pode ser necessária. No entanto, o
desenvolvimento do método segue uma série de etapas resumidas na Figura 21.
Uma completa descrição da amostra é importante para se obter uma boa
separação cromatográfica. Sua composição química pode nos dar uma valiosa pista
para a melhor escolha das condições iniciais para separação em HPLC. Outras
considerações relevantes a respeito da amostra são: número de compostos
presentes, estrutura química dos compostos e sua função, peso molecular, valor do
PKa, espectro de ultravioleta, concentração e solubilidade.
Outra consideração importante no desenvolvimento do método é o pré-
tratamento da amostra e sua detecção. As amostras que podem potencialmente ser
analisadas por CLAE podem ter várias apresentações:
• Amostras prontas para injeção;
• Soluções que requerem diluições, tamponação, adição de um padrão interno,
ou outras manipulações volumétricas;
• Sólidos que devem ser primeiro dissolvidos ou extraídos;
• Amostras que requerem um pré-tratamento para removerem interferentes e
proteger a coluna ou equipamento de danos.
Obviamente que a injeção direta da amostra é preferível pela conveniência e
uma melhor precisão, no entanto, muitas amostras para serem analisadas em HPLC
precisam ser pesadas e diluídas antes da injeção. Os melhores resultados são
obtidos quando o solvente utilizado para solubilizar a amostra é a própria fase
Desenvolvimento do método cromatográfico
68
móvel, já que este procedimento diminui ruídos na linha de base e outros problemas,
como a assimetria da banda cromatográfica.
Algumas amostras necessitam de um pré-tratamento para remover seus
interferentes antes de serem injetadas no HPLC. Isto significa que é muito
importante conhecer a natureza da matriz da amostra e as concentrações dos vários
analitos. Em muitos casos o desenvolvimento de um método adequado para o pré-
tratamento da amostra pode ser mais complicado do que obter uma boa separação.
Desenvolvimento do método cromatográfico
69
Figura 21 - Passos para o desenvolvimento de método em HPLC (SNYDER, et al.,
1997).
1. Informações sobre a amostra e
definição de metas para a
separação
2. Necessidade de procedimentos
especiais, pré-tratamento da
amostra, etc?
3. Escolha do detector e de suas
configurações
4. Escolha do método; corridas
preliminares; estimativa das
melhores condições de separação.
5. Optimização das condições de
separação
6. Checar problemas ou necessidade
de procedimentos especiais
7a. recuperação do
material purificado
7b. Calibração
quantitativa
7c. método
qualitativo
8. Validação do método
para uso de rotina
Desenvolvimento do método cromatográfico
70
Antes de a primeira amostra ser injetada durante o desenvolvimento do
método, é necessário ter a certeza de que o detector selecionado irá ser sensível a
todos os componentes de interesse da amostra. Detectores de UV com
comprimentos de onda variável normalmente são a primeira escolha, por causa da
sua conveniência e aplicabilidade para várias amostras. Por esta razão, informações
sobre o espectro de UV pode ser uma importante ajuda para o desenvolvimento do
método. Espectros de UV podem ser encontrados na literatura, estimados pela
estrutura química dos componentes da amostra de interesse, medidos diretamente
(se a substância pura estiver disponível), ou obtidos durante a separação em HPLC
por meio do detector de arranjo de fotodiodos (PDA). Quando a resposta do UV da
amostra estiver inadequada, outros detectores são disponíveis (fluorescência,
eletroquímico, etc.), ou a amostra pode ser derivatizada para melhorar a detecção
(SNYDER et al., 1997).
A estratégia recomendada para escolher as condições iniciais na primeira
separação é classificar a amostra. As amostras são classificadas em: regulares e
especiais. As amostras regulares são misturas típicas de baixo peso molecular
(<2000 Da) que podem ser separadas por condições iniciais padronizadas, enquanto
que amostras especiais são geralmente melhor separadas com colunas diferentes e
condições adequadas às necessidades (SNYDER et al., 1997).
As amostras regulares são classificadas em neutras e iônicas. As amostras
classificadas em iônicas incluem ácidos, bases, compostos anfotéricos e sais
orgânicos. A Tabela 2 mostra o resumo das condições experimentais iniciais para
separação de amostras regulares. Ácidos ou bases geralmente requerem a adição
de tampões na fase móvel. Para bases ou compostos catiônicos colunas de fase
reversa são recomendadas e aditivos básicos como aminas para a fase móvel
geralmente são utilizados para minimizar a interação com grupos silanóis residuais
em colunas de sílica. Se a amostra é neutra, tampões ou aditivos não são
requeridos na fase móvel (SNYDER et al., 1997).
Uma das bases da corrida exploratória inicial é o tipo de eluição que pode ser
isocrática ou através de eluição por gradiente, disponível em muitos sitemas de
HPLC. Neste ponto também pode ser aparente que condições típicas de fase
reversa podem causar retenção insuficiente da amostra, sugerindo o uso de
cromatografia por pareamento iônico ou cromatografia de fase normal.
Alternativamente, a amostra pode estar retida fortemente com 100% de acetonitrila
Desenvolvimento do método cromatográfico
71
na fase móvel, sugerindo o uso de cromatografia de fase reversa não aquosa
(NARP) ou com fase normal (SNYDER et al., 1997).
Tabela 2 - Condições experimentais iniciais para separação em HPLC
Variáveis de separação Escolha inicial
Coluna
Dimensões (comprimento, ID) 15 x 0,46 cm
Tamanho da partícula 5 µm
Fase estacionária C
8
ou C
18
Fase móvel
Solventes A e B tampão - acetonitrila
% B 80 – 100%
Tampão (composição, pH, concentração) 25 mM fosfato de
potássio, 2,0< pH <3,0
Aditivos (aminas, regentes de pareamento iônico) não é usado no início
Fluxo de corrida 1,5 - 2,0 mL/min.
Temperatura 35 - 45 °C
Amostra
Volume < 25 µL
Concentração < 100 µg
Com as condições iniciais da Tabela 2 para amostras regulares, resta apenas
uma decisão em relação à injeção da primeira amostra que é a porcentagem de
solvente orgânico, geralmente acetonitrila, na fase móvel (%B). Uma recomendação
é para o uso da força média do solvente na fase móvel isocrática (exemplo, 50% B).
No entanto, com essa concentração de solvente orgânico na fase móvel podem
acontecer problemas de coeluição ou dificuldades de visualização de picos com
tempo de eluição muito grandes. A melhor alternativa é o uso da primeira fase móvel
forte (ex., 80 – 100 % B), depois reduzindo a % B se necessário (SNYDER et al.,
1997).
Desenvolvimento do método cromatográfico
72
Uma alternativa para a separação inicial isocrática é o uso de eluição em
modo gradiente. Há várias vantagens para o uso inicial de um gradiente, como a
possibilidade de determinar se a eluição isocrática ou por gradiente é a melhor
escolha, e estimar a melhor força do solvente para a próxima tentativa (isocrática) de
separação. Uma separação inicial por gradiente é também vantajosa para o
desenvolvimento do método desde que mostre a melhor resolução da amostra que
irá ser obtida por separação isocrática com um solvente forte (SNYDER et al., 1997).
Separação ou resolução é o requerimento primário em análises quantitativas
por HPLC. Geralmente, para amostras que contém cinco ou menos componentes, a
resolução da linha de base (R
s
> 1,5) pode ser facilmente obtida para os picos de
interesse. Este nível de resolução favorece um máximo de precisão nos resultados.
A resolução diminui durante o tempo de vida da coluna e pode variar de dia para dia
com pequenas flutuações nas condições de separação. No entanto, valores de R
s
=
2 ou maiores deverá ser a meta para o desenvolvimento do método para misturas
simples. Tal resolução irá favorecer tanto os ensaios de precisão, quanto de
robustez do método. Amostras que contém dez ou mais componentes irão dificultar
a separação, e aqui a meta da separação deverá ser relaxada para R
s
> 1,0 a 1,5
(SNYDER et al., 1997).
Desenvolvimento do método cromatográfico
73
7 Materiais e métodos:
7.1 Materiais:
- Acetonitrila grau HPLC, J.T. Baker;
- Metanol grau HPLC (MERCK);
- Álcool etílico 95% P.A – ACS (Quimex);
- Trietilamina (MERCK);
- Água Mili-Q;
- Sistema de cromatografia a líquido de alta eficiência constituído de uma bomba LC-
10 ADvp, detector SPD-M10Avp, forno CTO-10Avp, controlador SCL-10Avp,
degaseficador DGU-14A, todos da Shimadzu;
- Sistema de cromatografia a líquido de alta eficiência constituído de uma bomba LC-
10 ADvp, detector SPD-10AVvp, autoinjetor SIL-10ADvp, forno CTO-10ASvp,
controlador SCL-10Avp, degaseficador DGU-14A, todos da Shimadzu.
7.2 Escolha do comprimento de onda e avaliação da pureza do pico
cromatográfico
Para a escolha do comprimento de onda mais adequado para a quantificação
da warifteína, foram preparadas soluções do alcalóide nas concentrações de 2,5, 5,
10, 20, 40 e 80 µg/mL e as soluções foram injetadas (20 μL) em um Cromatográfo
Líquido de Alta Eficiência com detector de Arranjo de Diodos. A área do pico
cromatográfico correspondente a warifteína foi monitorada nos comprimentos de
onda (λ) de 226, 246, 256 e 280 nm, baseados no intervalo do espectro de
Ultravioleta que foi obtido (192-280 nm). Além disso, a escolha do comprimento de
onda foi baseada também na seletividade espectral da região em relação a
possíveis interferentes.
A fase móvel inicialmente escolhida para este experimento foi ACN: H
2
O:
trietilamina (60:40:0,1), a coluna cromatográfica foi uma coluna de fase reversa
(Luna Phenomenex 250 x 4,60 mm, 5µm) operada a um fluxo de 1mL/min. Por
conveniência, a temperatura de 40°C para o forno foi selecionada.
Depois de obtidos os cromatogramas foi avaliada a linearidade da resposta do
Desenvolvimento do método cromatográfico
74
detector à warifteína em cada comprimento de onda avaliado, e o coeficiente de
correlação obtido após regressão linear foi utilizado para seleção do comprimento de
onda mais adequado.
A pureza do pico cromatográfico referente à warifteína foi avaliada utilizando-
se a rotina do software ClassVp, chamada de “Peak Profile” e também a rotina
conhecida como “Peak Purity”. Na ferramenta “peak profile” o perfil do pico
cromatográfico é comparado em diferentes comprimentos de onda para o pico
integrado que ocorra com o mesmo tempo de retenção, o que fornece uma idéia
preliminar da pureza do pico. Já a ferramenta “Peak Purity” compara os espectros de
ultravioleta ao longo do pico cromatográfico com o espectro no ápice do pico. Um
índice de pureza de 1,0 indica um grau de pureza de 100%, e valores que se
desviam de 1,0 mostram picos que coeluem com impurezas.
7.3 Escolha do fluxo e da fase móvel
Para escolha do melhor fluxo e da fase móvel a ser utilizada, foi preparada uma
solução de warifteína a 80 µg/mL e esta foi analisada utilizando-se diferentes
concentrações de acetonitrila em água (com 0,1% de trietilamina) e diferentes fluxos
de fase móvel (1,0-1,5 mL/min). A fase móvel e fluxo escolhido foram aqueles que
propiciaram a eluição da warifteína com um valor de fator de retenção adequado (em
torno de 10, ou seja, 0,5<k<20) e com uma pressão no sistema adequada (abaixo de
180 Kgf).
7.4 Experimentos de pré-validação
7.4.1 Linearidade da resposta à warifteína em solução padrão
Foi preparada inicialmente uma solução estoque de warifteína (a partir da
amostra recristalizada) a 1 mg/mL em acetonitrila e depois a partir desta solução
estoque foram feitas diluições seriais para 2,5; 5; 10; 20; 40 e 80 µg/mL, utilizando
sempre a fase móvel como solvente para diluição. As amostras foram injetadas no
cromatógrafo (20 µL) em triplicata através de injetor automático, e as médias das
Desenvolvimento do método cromatográfico
75
áreas dos picos cromatográficos foi utlizada para a construção da curva de
calibração e avaliação de linearidade.
7.4.2 Linearidade da resposta à warifteína por adição de padrão ao
extrato etanólico bruto a 70% (EBF) com extração líquido-líquido.
Para verificar a linearidade da warifteína em condições reais de análise, foram
realizados experimentos nos quais a warifteína padrão foi adicionada a alíquotas do
extrato etanólico bruto das folhas e as amostras resultantes foram extraídas através
de um método de microextração líquido-líquido para verificação da linearidade do
método de adição de padrão. A alíquotas de 250 µL de uma solução (a 25 mg/mL)
do extrato etanólico bruto das folhas, foram adicionadas alíquotas de 250 µL de
soluções de warifteína recristalizada (em fase móvel) para obter as seguintes
concentrações finais nominais de warifteína:
Concentração zero (adição de 250 µL de fase móvel apenas), 2,5 µg/mL (adição
de 250 µL de uma solução de 10 µg/mL), 5,0 µg/mL (adição de 250 µL de uma
solução de 20 µg/mL), 10,0 µg/mL (adição de 250 µL de uma solução de 40 µg/mL),
20,0 µg/mL (adição de 250 µL de uma solução de 80 µg/mL), 40,0 µg/mL (adição de
250 µL de uma solução de 60 µg/mL), 80,0 µg/mL (adição de 250 µL de uma
solução de 320 µg/mL).
Após preparo das soluções as amostras foram extraídas por um procedimento de
extração ácido/base que consistiu nas seguintes etapas
1. Adicionou-se a cada criotubo do procedimento descrito anteriormente, 250 µL
de HCl 0,1 M de pH =1,026 e agitou-se vigorosamente cada um;
2. Pipetou-se 500 µL de CHCl
3
(clorofórmio) e adicionou em cada criotubo e
agitou-se em seguida;
3. Com o uso de pipeta de Pasteur retirou-se e desprezou-se a fase orgânica
contida em cada criotubo;
4. Acrescentou-se 250 µL de NaOH 0,2 M de pH = 13,5;
5. Extraiu-se a fração de alcalóides com adição de 500 µL de CHCl
3
em cada
criotubo, após agitação;
6. Com auxílio da pipeta de Pasteur retirou-se e desprezou-se a fase aquosa;
Desenvolvimento do método cromatográfico
76
7. Fez-se a transferência da fase orgânica de cada criotubo para vials de 1,0
mL devidamente rotulados, que em seguida foram levados ao aquecimento
em um banho seco (tipo Dryblock) por 40 minutos em temperatura de 80 º C
a fim de evaporar o solvente;
8. Após a secagem das amostras fez-se a ressuspensão em fase móvel de
ACN:H
2
O:trietilamina (40:60:0,1), adicionando-se a cada vial 1 mL de fase
móvel;
7.4.3 Linearidade da resposta à warifteína por adição de padrão ao
extrato etanólico bruto a 70% (EBF) com injeção direta do extrato.
Os experimentos de linearidade por adição de padrão com injeção direta do
extrato foram realizados de maneira similar ao descrito no item anterior, ou seja,
através da adição de alíquotas de soluções de warifteína recristalizada a alíquotas
(desta vez previamente filtradas em filtro de membrana de 0,45 μm) do extrato
etanólico bruto das folhas. Após a preparação das amostras do extrato etanólico
bruto previamente filtrado, e fortificado com as soluções padrão de warifteína, as
amostras foram diretamente injetadas no cromatógrafo, sem prévia extração para
remoção dos interferentes.
Desenvolvimento do método cromatográfico
77
8 Resultados e discussão
8.1 Resultados das áreas dos picos cromatográficos para escolha do
comprimento de onda
A Tabela 3 mostra os resultados das áreas dos picos cromatográficos em
função de concentrações crescentes de warifteína em diferentes comprimentos de
onda. Com estes resultados foram realizadas curvas de calibração com os
respectivos comprimentos de onda e foi avaliado qual o comprimento de onda a
resposta à warifteína apresentava melhor linearidade.
Tabela 3 - Concentrações crescentes de warifteína (2,5; 5, 10, 20, 40, 80 µg/mL)
com as respectivas áreas do pico cromatográfico em 226, 246, 256 e 280 nm
quando analisadas por HPLC.
Conc.
(µg/mL)
Área do pico
226 nm 246 nm 256 nm 280 nm
2,5
148727 52998 40594 46963
5
234514 104109 69988 81314
10
423973 201679 129075 156207
20
831751 397540 263621 311918
40
574452 883177 529718 628191
80
3251112 1656812 1075889 1286359
Desenvolvimento do método cromatográfico
78
8.2 Curvas de calibração da warifteína em diferentes comprimentos de onda
226nm
y = 36854x - 56662
R
2
= 0,8691
0
1000000
2000000
3000000
4000000
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 1 - Curva de calibração da warifteína em comprimento de onda (λ) de 226
nm.
246nm
y = 20916x + 344,63
R
2
= 0,9985
0
500000
1000000
1500000
2000000
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 2 - Curva de calibração da warifteína em comprimento de onda (λ) de 246
nm.
Desenvolvimento do método cromatográfico
79
256nm
y = 13400x - 257,7
R
2
= 0,9998
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 3 - Curva de calibração da warifteína em comprimento de onda (λ) de 256
nm.
280nm
y = 16022x - 2094,7
R
2
= 0,9997
0
500000
1000000
1500000
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 4 - Curva de calibração da warifteína em comprimento de onda (λ) de 280
nm.
Desenvolvimento do método cromatográfico
80
Observando-se os gráficos com os seus respectivos coeficientes lineares, os
de melhores resultados foram: R
2
= 0,9985 (246nm); R
2
= 0,9998 (256 nm) e R
2
=
0,9997(280 nm), enquanto que o R
2
= 0,8691 de 226nm não atingiu o mínimo
especificado pela RE-899/2003. Como para os comprimentos de onda maiores (256
nm e 280 nm) a relação sinal:ruído tende a aumentar (apesar de muitas vezes haver
alguma perda na intensidade do sinal analítico), deu-se neste caso preferência ao
comprimento de onda de 246 nm, pois este representou um bom equilíbrio entre a
intensidade do sinal analítico para a warifteína e a minimização da possibilidade de
picos interferentes.
8.3 Grau de pureza e características espectrais do pico referente à warifteína
Figura 22 - Espectro DAD bidimensional da warifteína (WAR) (80 µg/mL) mostrado
na mancha vermelha em um tempo de retenção de 7,25 min usando uma varredura
completa do espectro de UV entre 200 e 400 nm. Condições cromatográficas são as
descritas no item 7.2.
1
WAR
Desenvolvimento do método cromatográfico
81
Figura 23 - Espectro de UV simples em CLAE/UV-DAD da warifteína (80 µg/mL)
mostrando λ máximos em 224 e 283 nm. Condições cromatográficas são as
descritas no item 7.2.
Figura 24 - Cromatograma 3D (CLAE/UV-DAD) da warifteína (80 µg/mL )na fase
móvel: ACN:H
2
O:Trietilamina (60:40:0,1). Condições cromatográficas são as
descritas no item 7.2.
Desenvolvimento do método cromatográfico
82
Figura 25 - Perfil de pureza do pico cromatográfico da warifteína (80 µg/mL)
mostrando uma pureza de 99%, o que provavelmente não está coeluindo com outra
substância. Condições cromatográficas são as descritas no item 7.2.
Figura 26 - Perfil de pureza do pico cromatográfico da warifteína (80 µg/mL)
avaliada durante o processo de separação cromatográfica nos comprimentos de
onda de 236, 241, 246, 251 e 256 nm. Condições cromatográficas são as descritas
no item 7.2.
Desenvolvimento do método cromatográfico
83
8.4 Cromatograma da warifteína no comprimento de onda selecionado para
análise
Figura 27 - Cromatograma (CLAE/UV–DAD) da warifteína (WAR) na concentração
de 80 µg/mL utilizando-se a fase móvel: ACN:H
2
O:Trietilamina (60:40:0,1) a λ de 246
nm.
8.5 Escolha da fase móvel
8.5.1 Escolha do fluxo e da concentração da fase móvel
O cromatograma da Figura 28 mostra a análise da warifteína nas condições
iniciais escolhidas para análise, que consistiu de uma fase móvel com
ACN:H
2
O:trietilamina (60:40:0,1, v/v) e um fluxo de 1,5 mL/min. Com esta fase móvel
a warifteína eluiu com um tempo de retenção de apenas 3,89 min., ou seja, com um
fator de retenção significativamente diferente de 10, embora a pressão com esta alta
concentração de acetonitrila na fase móvel foi a mais baixa entre as condições
analisadas, e estabilizou em 152 Kgf.
1
WAR
Desenvolvimento do método cromatográfico
84
Figura 28 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da warifteína (WAR) (80 µg/mL) com
fase móvel: ACN:H
2
O:trietilamina (60:40:0,1) e fluxo de 1,5 mL/min. a 246 nm.
Na segunda condição avaliada (Figura 29), o fluxo de fase móvel foi mantido em
1,5 mL/min. e, no intuito de aumentar a retenção de WAR, a porcentagem de ACN
foi diminuída para 50%. Com esta composição de fase móvel o tempo de retenção
de WAR foi de 4,9 minutos, o que ainda representa uma diferença significativa em
relação a um fator de retenção próximo de 10. A pressão do sistema registrada foi
de 170 Kgf.
Figura 29 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da warifteína (WAR) (80 µg/mL) com
fase móvel: ACN:H
2
O:trietilamina (50:50:0,1) e fluxo de 1,5 mL/min. a 246 nm.
A terceira condição de separação avaliada manteve o mesmo fluxo (1,5 mL/min.),
no entanto, a concentração da fase B foi reduzida para 40% de ACN (Figura 30). O
WAR
WAR
Desenvolvimento do método cromatográfico
85
tempo de retenção alcançou a meta (8,39 min.), porém a pressão ficou muito alta
(197 Kgf) o que poderia comprometer a coluna cromatográfica e o cromatógrafo.
Figura 30 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da warifteína (WAR) (80 µg/mL) com
fase móvel: ACN:H
2
O:trietilamina (40:60:0,1) fluxo de 1,5 mL/min. a 246 nm.
Com o intuito de reduzir a pressão observada com a fase móvel anterior
ACN:H
2
O:trietilamina (40:60:0,1), reduziu-se o fluxo de fase móvel para 1,3 mL/min.
8.6 Linearidade da resposta à warifteína em solução padrão
A Tabela 4 e o Gráfico 5 demonstram que os resultados obtidos com as áreas
dos picos cromatográficos estão diretamente proporcionais à concentração da
warifteína.
A linearidade foi obtida com o padrão da warifteína recristalizado com um
coeficiente linear de R
2
= 0,9998, resultado bastante positivo para se obter resposta
semelhante para a curva de calibração por adição de padrão interno, o que era mais
complicado, pois o método deve apresentar robustez e alcançar um coeficiente
linear de R
2
= 0,99 como preconiza a RE 899/2003.
WAR
Desenvolvimento do método cromatográfico
86
Tabela 4 - Áreas dos picos cromatográficos da warifteína nas concentrações de 2,5;
5; 10; 20; 40; 80 µg/mL injetadas em triplicata.
Conc.
(µg/mL)
2,5 µg/mL 5 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 40 µg/mL 80 µg/mL
1
65093 131752 255900 524566 1047331 2153250
2
61844 129369 256387 511939 1049792 2167231
3
62411 130860 261435 510412 1051854 2157044
Média
63116 130660 257907 515639 1049659 2159175
y = 27019x - 13223
R
2
= 0,9998
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
0,0 50,0 100,0
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 5 - Curva de calibração da warifteína recristalizada com detecção em 246
nm.
Desenvolvimento do método cromatográfico
87
8.7 Linearidade da resposta a warifteína por adição de padrão ao extrato
etanólico bruto a 70% (EBF) com extração líquido-líquido.
O método de microextração líquido-líquido da warifteína das amostras
preparadas por adição de padrão ao extrato etanólico bruto das folhas foi avaliado
através do estudo da linearidade obtida para estas amostras. Os resultados obtidos
para a quantificação da warifteína adicionada ao EBF em concentrações nominais
que variaram entre 0-80 µg/mL, são mostrados na Tabela 5 e no Gráfico 6, e
demonstram que o coeficiente de correlação obtido (0,913) está abaixo do limite
especificado pela RE 899/2003 que é de R
2
=0,99. O método foi repetido para
verificar a sua reprodutibilidade, e os resultados desta segunda análise estão
mostrados na Tabela 6 e no Gráfico 7.
Tabela 5 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição de
padrão warifteína nos pontos 0; 2,5; 5; 10; 20; 40; 80 µg/mL.
Conc
(µg/mL)
0 µg/mL 2,5 µg/mL 5 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 40 µg/mL 80 µg/mL
1
2114507 2443748 2892185 3306802 3448390 3544223 6704057
2
3161788 3366046 2366057 3289299 3421056 3428438 6489473
3
1992088 2817352 3596094 2413186 3004958 2994159 2998226
Média
2422794 2875715 2951445 3003096 3291468 3322273 5397252
y = 31887x + 3E+06
R
2
= 0,913
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 20406080100
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 6 - Linearidade obtida com o processo de extração proposto para
quantificação da warifteína.
Desenvolvimento do método cromatográfico
88
Tabela 6 - Áreas dos picos cromatográficos da segunda curva de calibração por
adição de padrão warifteína nos pontos 0; 2,5; 5; 10; 20; 40; 80 µg/mL.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 2,5 µg/mL 5 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 40 µg/mL 80 µg/mL
1
237258 360141 376594 406494 424825 529608 923377
2
164214 384318 338582 448075 594473 526537 614901
3
201853 336923 440869 454032 579371 503975 727224
Média
201108 360461 385348 436200 532890 520040 755167
y = 76031x + 151762
R
2
= 0,9043
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
02468
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 7 - Linearidade obtida com o processo de extração proposto para
quantificação da warifteína.
Este segundo resultado mostrou que o método não resultava em uma curva
com linearidade aceitável. Assim, a metodologia de extração foi alterada e passou-
se a utilizar o hidróxido de amônio (NH
4
OH) ao invés do hidróxido de sódio como
base no processo de microextração. O mesmo procedimento de microextração foi
repetido só que agora substituindo uma base forte NaOH 0,1M por uma base mais
fraca e volátil: NH
4
OH 0,3M. Os resultados deste procedimento de microextração
modificado estão mostrados na Tabela 7 e no Gráfico 8.
Desenvolvimento do método cromatográfico
89
Tabela 7 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição de
padrão warifteína nos pontos 0; 2,5; 5; 10; 20; 40; 80 µg/mL.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 2,5 µg/mL 5 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 40 µg/mL 80 µg/mL
1
1286893 1615716 1713502 4975303 2072962 2739332 3253151
2
1446576 1781206 1653271 1919557 2068438 2328488 6879470
Média
1366735 1698461 1683387 3447430 2070700 2533910 5066311
y = 38738x + 2E+06
R
2
= 0,7307
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 20406080100
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 8 - Linearidade obtida com o processo de extração proposto para
quantificação da warifteína, com mudança de uma base forte NaOH 0,1M por uma
base fraca NH
4
OH 0,3M.
Surgiram dois problemas com o método testado: o primeiro foi a resposta não
linear à concentração da warifteína no extrato e o outro foi o surgimento de um
interferente que coeluía com a warifteína, formando um “ombro” (Figura 31). O
surgimento deste interferente levou a necessidade de alterar-se novamente a fase
móvel para a análise, de forma a não prejudicar as análises de precisão e exatidão.
Desenvolvimento do método cromatográfico
90
Figura 31 - Cromatograma de uma amostra de warifteína (WAR) a 80 µg/mL,
extraída do extrato etanólico, mostrando a presença de “ombro” próximo ao pico
cromatográfico em fase móvel ACN:H
2
O:trietilamina (40:60:0,1).
Então, para corrigir o problema, foi verificado o pH da fase móvel e observado
que este estava alto (pH=11,0). A concentração de trietilamina foi assim diminuída
para 0,05% em água alcançando um pH em torno de 10,0, e simultaneamente a
concentração de acetonitrila foi aumentada ligeiramente para 43%, principalmente
para corrigir o aumento do tempo de retenção da warifteína. O resultado foi bastante
positivo, uma vez que o interferente foi deslocado completamente da região de
eluição da warifteína (Figuras 32-35).
Figura 32 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da fração de alcalóides (WAR) extraída
do extrato etanólico bruto das raízes da milona com fase móvel:
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05) e fluxo de 1,3 mL/min. a 246 nm.
WAR
WAR
Desenvolvimento do método cromatográfico
91
Figura 33 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da fração de alcalóides extraída do
extrato etanólico bruto das raízes da milona, adicionado de 2,5 µg/mL do padrão
warifteína (WAR) com fase móvel: ACN:H
2
O:Trietilamina (43:57:0,05) e fluxo de 1,3
mL/min. a 246 nm.
Figura 34 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) da fração de alcalóides extraída do
extrato etanólico bruto das raízes da milona, adicionado de 80 µg/mL do padrão
warifteína (WAR) com fase móvel: ACN:H
2
O:Trietilamina (43:57:0,05) e fluxo de 1,3
mL/min. a 246 nm.
WAR
WAR
Desenvolvimento do método cromatográfico
92
Figura 35 - Cromatograma da microextração da warifteína (WAR) a 80 µg/mL no
extrato etanólico sem o problema de ombro no pico cromatográfico em fase móvel
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05).
No entanto, devido ao problema de falta de reprodutibilidade deste método
proposto, foi necessário mudar a metodologia de quantificação da warifteína no
extrato etanólico bruto, provavelmente devido ao fato do método ser bastante
complexo, sendo conseqüentemente minucioso, o que dificilmente daria uma
reprodutibilidade adequada a este tipo de análise. O próximo passo no
desenvolvimento do método foi uma tentativa de eliminar por completo o
procedimento de extração da amostra, uma vez que por tratar-se de um
procedimento que envolve múltiplos passos de transferência de amostra, tem o
potencial se realizado manualmente, de introduzir imprecisões na análise, a menos
que se utilize um padrão interno.
WAR
Desenvolvimento do método cromatográfico
93
8.8 Linearidade da resposta à warifteína por adição de padrão ao extrato
etanólico bruto a 70% (EBF) com injeção direta do extrato.
Para obter a quantidade verdadeira de warifteína no extrato bruto, sem perdas
por processos de extração, era necessário injetá-lo diretamente no HPLC, porém
isso não seria possível pela quantidade de produtos insolúveis e impurezas no
extrato que poderiam danificar a coluna, ou mesmo o HPLC. Para resolver este
problema, foram utilizados filtros de 0,45 µm de tamanho de poro para filtrar o
extrato antes de injetá-lo no HPLC e com isso foi possível a quantificação da
warifteína no extrato bruto, surgindo assim um novo método de quantificação, sem
extração prévia da amostra.
Seguindo o procedimento de injeção direta descrito no item 7.4.3 foram
preparados 6 pontos num intervalo de 0 a 100 µg/mL nas concentrações de: 0, 10,
20, 30, 50 e 100 µg/mL, todas em triplicatas, sendo depois alocadas ao HPLC e
injetadas. Os resultados estão mostrados na Tabela 8 e no gráfico de linearidade
(Gráfico 9).
Tabela 8 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição de
padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1
1644257 1928633 2314152 2615709 3107537 4020238
2
1725326 2023868 2264574 2604642 2668433 4371284
3
1702112 1992222 2308359 2460685 2722189 3890562
Média
1690565 1981574 2295695 2560345 2832720 4094028
Desenvolvimento do método cromatográfico
94
y = 23306x + 2E+06
R
2
= 0,992
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
0 50 100 150
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 9 - Linearidade obtida com o procedimento de quantificação da warifteína
proposto com o extrato filtrado com todos os pontos: 0, 10, 20, 30, 50 e 100 µg/mL..
Portanto, os pontos escolhidos para demonstrar a linearidade da warifteína
adicionada ao extrato bruto foram: 0, 10, 20, 30, 50 e 100 µg/mL.
Para relatar as condições cromatográficas finais foi efetuado uma injeção do
padrão warifteína a 80 µg/mL no HPLC com detector de UV e Vis. e em seguida
depois da obtenção do cromatograma foi solicitado ao software Class VP, um
relatório com os seguintes parâmetros: área percentual, número de pratos teóricos,
assimetria, resolução e fator de capacidade do pico cromatográfico (Figuras 36 e
37).
Desenvolvimento do método cromatográfico
95
Figura 36 – Adeqüabilidade do sistema cromatográfico (CLAE/UV/VIS) com uma
amostra de warifteína a 80 µg/mL analisada com fase móvel: ACN:H
2
O:Trietilamina
(43:57:0,05) e fluxo de 1,3 mL/min. a 246 nm.
Figura 37 – Adeqüabilidade do sistema cromatográfico (CLAE/UV/VIS) com uma
amostra de warifteína a 80 µg/mL com fase móvel: ACN:H
2
O:Trietilamina
(43:57:0,05) e fluxo de 1,3 mL/min. a 246 nm.
Desenvolvimento do método cromatográfico
96
As melhores condições para identificação e quantificação do alcalóide
bisbenzilisoquinolínico e marcador da Cissampelos sympodialis EICHL (WAR) são
apresentadas no Quadro 1.
Desenvolvimento do método cromatográfico
97
Quadro 1 - Condições cromatográficas finais do método desenvolvido para a
quantificação de warifteína nos extratos de C. sympodialis.
Sistema Método cromatográfico
Coluna
Temperatura
Detector
Comprimento de onda (λ)
Fluxo
Volume de injeção
Fase móvel
Bomba
Sistema de dados
Phenomenex, 5µ C-18 (2) granulometria de
100 A° (250 X 4,6 mm d.i.) com pré-coluna
C-18.
40°C
Detector com UV e Visível da Shimadzu,
modelo SPD-M 10Avp.
246 nm
1,3 mL/min.
20 µL
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05), modo
isocrático.
LC-10 ADvp da Shimadzu com
degaseificador DGU-14A.
Class-VP
CAPÍTULO III
Validação do Método Analítico
Validação do método analítico
101
9 Revisão de Literatura
9.1 Registro e Validação de Metodologias Analíticas para Medicamentos
Fitoterápicos
A importância de se regularizar o uso de medicamentos fitoterápicos no Brasil
é uma realidade, e para isso são criadas Portarias e Resoluções que ditam como se
deve registrar um fitoterápico para sua comercialização.
Fitoterápico é todo medicamento obtido empregando-se exclusivamente
matérias-primas ativas vegetais. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e
dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade, e constância de sua
qualidade. Sua eficácia e segurança é validada através de levantamentos
etnofarmacológicos de utilização, documentações tecnocientíficas em publicações
ou ensaios clínicos fase 3 (Esquema 2). Não se considera medicamento fitoterápico
aquele que, na sua composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer
origem, nem as associações destas com extratos vegetais (BRASIL, 2004).
Como produto final de uma série de sugestões apresentadas por diferentes
segmentos da sociedade, foi estabelecida uma legislação para a área de
fitoterápicos (Portaria 6/SVS de 31/01/1995), que definiu claramente que fitoterápico
é um medicamento com componentes ativos exclusivamente de origem vegetal, e
que deve apresentar comprovação de eficácia, segurança e qualidade. Também
importante foi o estabelecimento no Ministério da Saúde, e posteriormente na
Agencia Nacional de Vigilância Sanitária-ANVISA, de uma divisão direcionada
especificamente para fitoterápicos (SIMÕES & SCHENKEL, 2002).
Revogando-se a Resolução RDC nº 17 de 25 de Fevereiro de 2000 e o art. 18
da RDC 134 de 28 de Maio de 2003, a Resolução-RDC nº 48 de 16 de Março de
2004 dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Este regulamento
abrange medicamentos cujos princípios ativos são exclusivamente derivados de
drogas vegetais. Não é objeto de registro ou cadastro planta medicinal ou suas
partes, após processos de coleta, estabilização e secagem, podendo ser íntegra,
rasurada, triturada ou pulverizada (BRASIL, 2004).
Validação do método analítico
102
FARMACOLOGIA E TOXICOLOGIA PRÉ CLÍNICA E CLÍNICA
OU OU
SELEÇÃO DE PLANTA MEDICINAL
ESTUDOS PRÉ CLÍNICOS : IN VIVO E/OU IN VITRO
A) ENSAIOS FARMACOLÓGICOS B) ENSAIOS TOXICOLÓGICOS
INVESTIGAÇÃO DA EFICÁCIA INVESTIGAÇÃO DA SEGURANÇA
ROTEIRO DE ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS (RE N° 90/2004 ANVISA)
E CLÍNICOS- CEME
ESTUDOS CLÍNICOS
(NO SER HUMANO)
A) ENSAIOS TOXICOLOGICOS B) ENSAIOS FARMACOLÓGICOS
INVESTIGAÇÃO DA SEGURANÇA INVESTIGAÇÃO DA EFICÁCIA
(RESOLUÇÃO 196/96 CNS-MS) (RESOLUÇÃO 196/96 CNS-MS)
(RESOLUÇÃO 251/97 CNS-MS) (RESOLUÇÃO 251/97 CNS-MS)
FASE I FASE II, FASE III, FASE IV
Esquema 2 - Esquema mostrando os passos para se realizar pesquisa com plantas
medicinais com fins de registro de acordo com a RDC n° 48/2004 (DINIZ, 2006).
PLANTA MEDICINAL
INDICAÇÃO DE USO
POPULAR
SCREENING FARMACOLÓGICO
Validação do método analítico
103
É exigência da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Resolução
(RDC nº 48), a elaboração de um relatório de controle de qualidade, incluindo
análises qualitativas e quantitativas dos princípios ativos e/ou marcadores, quando
conhecidos, ou classes de compostos químicos característicos da espécie (LIMA et
al., 2006).
A validação é parte integrante da garantia da qualidade. E define-se como
validação um ato documentado que atesta se qualquer procedimento, processo,
equipamento, material, operação ou sistema realmente conduza aos resultados
esperados. Portanto, a validação de procedimentos analíticos têm por objetivo
demonstrar que os métodos de ensaio utilizados apresentam resultados que
permitam avaliar objetivamente a qualidade dos medicamentos, conforme os
parâmetros especificados (BRASIL, 2003).
Segundo a Resolução-RE nº 899, de 29 de Maio de 2003, a validação deve
garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das
aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve
apresentar especificidade e seletividade, linearidade, intervalo, precisão, limite de
detecção, limite de quantificação e exatidão adequadas à análise (RE 899, 2003).
Ainda de acordo com a RESOLUÇÃO nº 899/2003, ela define estes
parâmetros analíticos da seguinte forma:
9.1.1 Especificidade e seletividade:
É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em
presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e
componentes da matriz.
A avaliação da seletividade do método é um importante modo para
demonstrar a especificidade do método. Um método é dito específico se ele produz
apenas uma resposta para um simples analito. Seletividade de um método é a
capacidade do método de produzir respostas para um analito alvo distinguindo-o de
todas as outras respostas. Já que os métodos cromatográficos não produzem
respostas apenas para um analito de interesse, mas também para outras
substâncias de interesse, o termo seletividade é sempre mais apropriado neste
contexto que especificidade (NASCIMENTO, 2004).
Validação do método analítico
104
9.1.2 Linearidade:
É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os
resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na
amostra, dentro de um intervalo especificado. Recomenda-se que a linearidade seja
determinada pela análise de no mínimo 5 concentrações diferentes.
Os dados podem ser tratados por regressão linear pelo método dos mínimos
quadrados dos pontos médios de 3 (três) curvas de calibração autênticas (LIMA,
2006).
O critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve ser = 0,99.
9.1.3 Intervalo:
É a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um método
analítico. Normalmente é derivado do estudo de linearidade e depende da aplicação
pretendida do método.
9.1.4 Precisão:
É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de
medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta se divide em
três níveis:
Repetibilidade (precisão intra-corrida): concordância entre os resultados
dentro de um curto período de tempo com o mesmo analito e mesma
instrumentação.
A repetibilidade do método é verificada por no mínimo 9 determinações, ou
seja, 3 concentrações: baixa, média e alta, com 3 réplicas cada ou mínimo de 6
determinações a 100% da concentração teste.
Validação do método analítico
105
Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância entre os
resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas
diferentes e/ou equipamentos diferentes. Recomenda-se um mínimo de 2 dias
diferentes com analistas diferentes.
Reprodutibilidade: concordância entre os resultados obtidos em laboratórios
diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de
metodologia analítica.
A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou
coeficiente de variação (CV%), segundo a fórmula:
DPR = DP x 100,
CMD
em que DP é o desvio padrão e CMD a concentração média determinada. Não se
admite valores superiores a 5%.
9.1.5 Limite de Detecção (LOD):
É a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser
detectada, porém não necessariamente quantificada, sob condições experimentais
estabelecidas. O limite de detecção é estabelecido por meio da análise de soluções
de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível
detectável.
Com métodos instrumentais como CLAE a estimativa do limite de detecção
pode ser feita com base na relação 3 vezes o ruído da linha de base. Pode ser
determinado pela equação:
LD = DPa x 3
IC
em que DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo y de, no mínimo, 3 curvas
de calibração construídas com as concentrações do fármaco próximas ao suposto
limite de quantificação e IC é a inclinação da curva de calibração.
Validação do método analítico
106
9.1.6 Limite de Quantificação (LOQ):
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada
com precisão e exatidão aceitáveis sob condições experimentais estabelecidas.
O Limite de Quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções
contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível determinável
com precisão e exatidão aceitáveis. Pode ser expresso pela equação:
LD = DPa x 10
IC
em que DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo y de, no mínimo, 3 curvas
de calibração construídas com as concentrações do fármaco próximas ao suposto
limite de quantificação e IC é a inclinação da curva de calibração.
Também pode ser determinado por meio do ruído, considerando a
concentração que produza relação sinal-ruído superior a 10 : 1.
9.1.7 Exatidão:
É a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação
ao valor verdadeiro.
A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da quantidade
conhecida do analito adicionado à amostra, ou como a diferença porcentual entre as
médias e o valor verdadeiro aceito, acrescido dos intervalos de confiança.
É determinado através de 3 concentrações: baixa, média e alta, com 3
réplicas cada, perfazendo um total de 9 determinações. A exatidão é expressa pela
relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a
concentração teórica correspondente:
Exatidão = concentração média experimental x 100
concentração teórica
Validação do método analítico
107
De modo geral, quanto menor o número de etapas que constituem o método e
quanto maiores a homogeneidade e uniformidade da composição do material
analisado, menor será o erro inerente acumulado e, consequentemente o rigor será
atingido. Durante a prática da validação é também importante observar a
regularidade da produção. Os riscos de heterogeneidade são variáveis: número de
fases, natureza dos produtos (características físicas, concentração e instabilidade),
preparação e secagem, além do método de extração (ARAGÃO, 2002).
Validação do método analítico
108
10 Material e métodos
10.1 Materiais
- Acetonitrila grau HPLC, J.T. Baker;
- Metanol grau HPLC, (MERCK);
- Álcool etílico 95% P.A– ACS, (Quimex);
- Trietilamina, (MERCK);
- Água Mili-Q, (Millipore);
- Sistema de cromatografia a líquido de alta eficiência constituído de uma bomba LC-
10 ADvp, detector SPD-10AVvp, autoinjetor SIL-10ADvp, forno CTO-10ASvp,
controlador SCL-10Avp, degaseficador DGU-14A, todos da Shimadzu.
10.2 Linearidade
A alíquotas de 250 µL de uma solução (a 25 mg/mL) do extrato etanólico
bruto das folhas, foram adicionadas soluções de warifteína recristalizada a 1 mg/mL
e completadas com fase móvel para 1 mL para obter as seguintes concentrações
nominais de warifteína:
Concentração zero (adição de 750 µL de fase móvel apenas), 10,0 µg/mL
(adição de 10 µL), 20,0 µg/mL (adição de 20 µL), 30,0 µg/mL (adição de 30 µL), 50,0
µg/mL (adição de 50 µL), 100,0 µg/mL (adição de 100 µL).
As amostras foram injetadas no cromatógrafo (20 µL) em triplicata através de
injetor automático, e as médias das áreas dos picos cromatográficos foram utlizadas
para a construção da curva de calibração e avaliação de linearidade.
O método pode ser considerado livre de tendências (unbeased) se o corredor
de confiança da reta de regressão linear contiver a origem. Como os desvios da
linearidade são muitas vezes difíceis de serem detectados visualmente, verificou-se
a sua adequação por meio do cálculo dos resíduos entre os valores medidos e os
valores calculados a partir da equação de regressão.
Validação do método analítico
109
Calcula-se o valor de t por:
t calculado = resíduo, onde:
Sn/√n
Resíduos: módulo de Xmedido – Xcalculado(teórico);
Sn: desvio padrão dos resíduos;
n: número de pontos.
10.3 Seletividade
Foi preparado uma solução de metilwarifteína padrão na concentração de 100
µg/mL e injetado em HPLC/DAD com fase móvel ACN:H2O:trietilamina (43:57:0,05),
fluxo de 1,3 mL e λ de 246 nm para observar seu tempo de retenção e os perfis dos
espectros de UV. Depois foram misturados warifteína e metilwarifteína nas
concentrações de 100 µg/mL cada e injetados. Depois foram misturados 25 µg/mL
de warifteína com 50 µg/mL de metilwarifteína e injetados para observar a
separação cromatográfica.
10.4 Degradação ácida
Em 250 µL do extrato foi adicionado 500 µL de warifteína padrão a 1 mg/mL
mais 250 µL de HCl 0,4 M e 2 mL de solução tampão pH=7,0. Esta solução ficou
durante 10 min. no aparelho Dry Block aquecendo a 80°C. Depois as amostras
foram injetadas em HPLC/DAD.
Validação do método analítico
110
10.5 Precisão e Exatidão
Para análise da Precisão e Exatidão foram escolhidas três concentrações de
warifteína: baixa (20 µg/mL), média (50 µg/mL) e alta (80 µg/mL). Essas amostras
foram preparadas em quintuplicatas juntamente com a curva de calibração por
adição de padrão warifteína (descrito no item 10.2 Linearidade) e injetadas em
HPLC/UV e Vis. Foram realizadas as análises em três dias diferentes. Para o
preparo das amostras de Precisão e Exatidão seguiu-se o seguinte procedimento:
A alíquotas de 250 µL de uma solução (a 25 mg/mL) do extrato etanólico bruto
das folhas, foram adicionadas soluções de warifteína recristalizada a 1 mg/mL e
completadas com fase móvel para 1 mL para obter as seguintes concentrações
nominais de warifteína:
Concentração baixa, 20,0 µg/mL (adição de 20 µL), média, 50,0 µg/mL (adição
de 50 µL), alta, 80,0 µg/mL (adição de 80 µL).
Para o cálculo do valor teórico de cada uma das concentrações no extrato, foi
somada a quantidade de warifteína adicionada ao extrato com sua quantidade já
pré-existente. Com a curva de calibração obtida foi efetuada a regressão linear para
poder obter a equação da reta e calcular a concentração de warifteína pré-existente
na amostra do extrato, igualando y a zero, da seguinte forma:
y= ax + b
x= (y-b)/a x= |- b/a| µg/mL de warifteína na
amostra do extrato.
Para calcular os valores verdadeiros de warifteína no extrato foi substituído a
incógnita y da equação da reta pelos valores das áreas dos picos cromatográficos
obtidos para as concentrações Baixa, Média e Alta e estes resultados foram
somados com a quantidade de warifteína pré-existente no extrato.
Através destes valores foi calculada a precisão, com o desvio padrão relativo
(RSD%), e a exatidão (E) dividindo a concentração média experimental (CME) pela
concentração teórica (CT) e multiplicando por 100 (E= CME/CT x 100).
Validação do método analítico
111
10.6 Robustez
Foram preparadas três amostras de baixa, média e alta concentração: 10, 50
e 100 µg/mL e depois realizadas 4 injeções de cada amostra na concentração da
fase móvel ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05); com 2% a mais da fase orgânica
(43.9:56.14:0,05) e 2% a menos (42.14:57.86:0,05). Depois a robustez foi analisada
em relação à temperatura e foram injetadas as amostras em: 38°C, 40°C e 42°C. E
por último foi alterado o pH da fase móvel com o aumento da concentração de
trietilamina para 0,1%. Para calcular o coeficiente de variação (CV%) dividiu-se a
média da área da amostra (Aa) pela média da área padrão (Ap), multiplicou-se por
100 e depois se subtraiu de 100:
CV% = (Aa/Ap x 100) – 100.
10.7 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ)
Para análise do limite de detecção e de quantificação foram preparadas
amostras do padrão warifteína nas seguintes concentrações: Branco (apenas fase
móvel), 0,25 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL, 5 µg/mL. Depois de
preparadas, foram injetadas duas vezes cada amostra e assim obtidos os
cromatogramas. Com os dados dos cromatogramas e a altura de cada pico
cromatográfico, foi solicitado ao sistema class-vp para calcular os resultados de LOD
e LOQ. O LOD foi identificado como a concentração que produziu uma relação
sinal:ruído de 3:1, enquanto o LOQ é a concentração que gerou uma relação
sinal:ruído de 10:1. O sistema tem duas opções para o cálculo do LOD e LOQ: o
ASTM e o RMS. Foi escolhido o mais utilizado que é o ASTM. A fórmula que o
sistema utiliza para calcular o LOD e o LOQ é a seguinte:
LOD (LOQ) = C x (S/N) x (N/H) em que;
Validação do método analítico
112
S/N = relação sinal-ruído (S/N LOQ = 10; S/N LOD = 3,3);
C = concentração da amostra;
H = valor do sinal quando a amostra foi analisada;
N = valor do ruído quando o branco foi analisado.
10.8 Aplicação do método
Para o preparo do macerado etanólico das folhas de C. sympodialis foi realizado o
seguinte procedimento:
1) Foram coletadas as folhas frescas no horto do LTF e em seguida secadas em
estufa a 40°C por 24 horas;
2) Depois de secas as folhas foram rasuradas;
3) As folhas rasuradas foram pesadas e anotadas o seu peso: 80g;
4) Em uma ampola de separação foi colocado algodão para filtrar o macerado e
logo depois as folhas rasuradas;
5) Foram vertidos 438 mL de álcool a 70%, até cobrir as folhas e deixado em
maceração por 6 dias;
6) Depois foi coletado o filtrado em frasco erlenmeyer e deixado sonicar por 30 min.;
7) Filtrou-se o macerado com seringa de vidro de 10mL e filtro com diâmetro de
poro de 0,46 µm;
8) Construiu-se uma curva de calibração com os seguintes pontos: 0, 10, 20, 30, 50 e
100 µg/mL da Linearidade, com duas injeções de cada amostra;
9) Após obtenção das áreas dos picos cromatográficos foi-se efetuado a regressão
linear e com a equação da reta obtida foi extrapolado o valor de y a zero obtendo-se a
quantidade de warifteína nas folhas.
Validação do método analítico
113
10.9 Verificação da estabilidade das soluções de trabalho da warifteína
A estabilidade das soluções de trabalho foi verificada por meio da observação
do aparecimento de outros picos cromatográficos, além do marcador warifteína, e da
perda de área dos picos deste marcador ao longo do tempo.
As condições cromatográficas escolhidas foram as mesmas utilizadas na
validação do método analítico e elas se encontram descritas no Quadro 1 do
Capítulo II, com exceção apenas da concentração da fase móvel que foi
ACN:H
2
O:Trietilamina (40:60:0,1).
A warifteína foi analisada durante 30 dias nos pontos: zero dia, 5 dias, 10 dias,
15, dias, 20 dias, 25 dias e 30 dias. No ponto zero dia foi preparada uma solução
estoque (E) de warifteína a 1 mg/mL e desta solução foram preparadas duas
amostras, uma de baixa concentração e outra de alta concentração a partir de sua
diluição que foram as de 2,5 µg/mL e 80 µg/mL. Mais duas soluções com as
mesmas concentrações foram preparadas para servir de padrão. Foram feitas três
injeções com volume de 20 µL de cada amostra em um HPLC com detector de
UV/Vis. Com isso, foram obtidas as áreas dos picos cromatográficas das amostras e
dos padrões.
A partir das análises do ponto zero dia até o ponto trinta dias as amostras foram
armazenadas em dois locais distintos: as amostras (A) de 2,5 µg/mL e 80 µg/mL
ficaram na prateleira da geladeira e a solução estoque (E) de 1mg/mL preparada no
ponto zero dia ficou armazenada no congelador da geladeira.
Tanto a solução estoque que se encontra no congelador como as amostras que
se encontram na geladeira foram sempre usadas nos dias em que houve análises e
estas foram comparadas com uma solução padrão (Pa) preparada no dia da análise
sempre nas concentrações de 2,5 e 80 µg/mL..
Durante os trinta dias de análises foram verificados e anotados todos os dias as
temperaturas da geladeira e do congelador.
Validação do método analítico
114
11 Resultados e Discussão
11.1 Linearidade
A Tabela 9 mostra o resultado obtido para a primeira curva de calibração da
warifteína adicionada ao extrato etanólico bruto que, por regressão linear, obteve um
coeficiente linear de R
2
=0,9908 (Gráfico 10).
Tabela 9 - Áreas dos picos cromatográficos da primeira curva de calibração por
adição de padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1
1895593 2431383 2801054 3081026 3670022 5306714
2
1873101 2477178 2755373 3135088 3787787 5190897
3
1766003 2366803 2802384 3158621 3825423 5324049
Média
1844899 2425121 2786270 3124912 3761077 5273887
y = 33069x + 2E+06
R
2
= 0,9908
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 20406080100120
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 10 - Linearidade obtida com o procedimento de quantificação da warifteína
proposto com o extrato filtrado com todos os pontos escolhidos: 0, 10, 20, 30, 50,
100 µg/mL para a primeira curva de calibração.
Validação do método analítico
115
Alguns cromatogramas obtidos com este procedimento de análise da
linearidade na primeira curva de calibração da warifteína adicionada ao extrato bruto
das folhas estão demonstrados nas Figuras 38 e 39.
Figura 38 - Cromatograma da linearidade obtida com a primeira curva de calibração
por adição de padrão do ponto 0 µg/mL de warifteína (WAR).
Figura 39 - Cromatograma da linearidade obtida com a primeira curva de calibração
por adição de padrão do ponto 100 µg/mL de warifteína (WAR).
WAR
WAR
Validação do método analítico
116
Foi repetido o mesmo procedimento em mais dois dias e os resultados estão
demonstrados nas Tabelas 10 e 11 e nos Gráficos 11 e 12.
Tabela 10 - Áreas dos picos cromatográficos da segunda curva de calibração por
adição de padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1
1786149 2235625 2470012 2850345 3499100 5270996
2
1760709 2204399 2584876 2918914 3557252 5281883
3
1816728 2126312 2423406 2884338 3415935 4958610
Média
1787862 2188779 2492765 2884532 3490762 5170496
y = 33486x + 2E+06
R
2
= 0,9993
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 50 100 150
Conc. (µg/mL)
Área
Gráfico 11 - Linearidade obtida com o procedimento de quantificação da warifteína
proposto com o extrato filtrado com todos os pontos escolhidos: 0, 10, 20, 30, 50,
100 µg/mL para a segunda curva de calibração.
As Figuras 40 e 41 são de alguns cromatogramas obtidos com a segunda
curva de calibração por adição de padrão warifteína ao extrato bruto das folhas.
Validação do método analítico
117
Figura 40 - Cromatograma da linearidade obtida com a segunda curva de calibração
por adição de padrão do ponto 0 µg/mL de warifteína (WAR).
Figura 41 - Cromatograma da linearidade obtida com a segunda curva de calibração
por adição de padrão do ponto 100 µg/mL de warifteína (WAR).
WAR
WAR
Validação do método analítico
118
Tabela 11 - Áreas dos picos cromatográficos da terceira curva de calibração por
adição de padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1
1798198 2158665 2595094 2757280 3526075 5230167
2
1827671 2218008 2624530 2886734 3639085 5425842
3
1864483 2123160 2654468 2939215 3571237 5279278
Média
1830117 2166611 2624697 2861076 3578799 5311762
y = 34664x + 2E+06
R
2
= 0,9989
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 50 100 150
Conc. (µg/mL)
Área
Gráfico 12 - Linearidade obtida com o procedimento de quantificação da warifteína
proposto com o extrato filtrado com todos os pontos escolhidos: 0, 10, 20, 30, 50,
100 µg/mL para a terceira curva de calibração.
Alguns cromatogramas obtidos com a terceira curva de calibração por adição
da warifteína no extrato bruto das folhas estão demonstrados nas Figuras 42 e 43.
Validação do método analítico
119
Figura 42 - Cromatograma da linearidade obtida com a terceira curva de calibração
por adição de padrão do ponto 0 µg/mL de warifteína (WAR).
Figura 43 - Cromatograma da linearidade obtida com a terceira curva de calibração
por adição de padrão do ponto 100 µg/mL de warifteína (WAR).
WAR
WAR
Validação do método analítico
120
Reunindo todos estes resultados foi feito a media geral de todos os picos
cromatográficos das 3 curvas de calibração demonstrados na Tabela 12. Com isso,
foi construído o gráfico da curva de calibração e feito a regressão linear obtendo-se
a equação da reta que, extrapolando o valor de y para zero, foi encontrado a
concentração da warifteína no extrato etanólico bruto das folhas da milona (Gráfico
13). A Tabela 13 demonstra a avaliação estatística entre as médias das três curvas
de calibração de acordo com ANOVA, sendo observado que não houve diferença
significativa entre as médias nas colunas com um intervalo de 95% de confiança.
Tabela 12 - Média das 3 curvas de calibração obtidas no estudo de linearidade.
Conc.
(µg/mL)
media 1 media 2 media 3 media geral
0
1844899 1787862 1830117 1820959
10
2425121 2188779 2166611 2260170
20
2786270 2492765 2624697 2634577
30
3124912 2884532 2861076 2956840
50
3761077 3490762 3578799 3610213
100
5273887 5170496 5311762 5252048
Tabela 13 – Avaliação estatística da linearidade de acordo com ANOVA.
Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 1,27E+11 2 6,34E+10 0,042323 0,958674 3,68232
Dentro dos
grupos 2,25E+13 15 1,5E+12
Total 2,26E+13 17
Validação do método analítico
121
y = 33740x + 2E+06
R
2
= 0,9983
59,27 µg/mL
-1000000
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
-100 -50 0 50 100 150
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 13 - Gráfico das médias das 3 curvas de calibração com sua regressão
linear.
Fazendo a extrapolação para zero com a equação da reta aqui obtida, ou
seja, quando y= 0 foi encontrado o valor de 59,27 µg/mL de warifteína. Como foi
pipetado 250 µL do extrato e diluído para 1mL, isso significa que a amostra foi
diluída 4 vezes e ao invés de 59,27 µg/mL tem-se uma concentração 4 vezes maior,
que representa 237,08 µg/mL de warifteína na amostra. Na preparação do extrato
foi pesado 250 mg e diluído em 10mL, então para 10mL tem-se 2370,8 µg/mL ou
2,37 mg de warifteína em 250 mg do extrato. Isto representa 0,948 % de warifteína
no extrato.
A Tabela 14 mostra o resultado para o cálculo dos resíduos entre os valores
medidos e os valores calculados a partir da equação de regressão linear. Os valores
de t calculado variaram entre 4,08 - 16,50, resultando em um baixo nível de desvios
da linearidade. O Gráfico 14 mostra que não houve uma tendência de distribuição
não aleatória dos resíduos, confirmando a validade do modelo de calibração
adotado.
Validação do método analítico
122
Tabela 14 – Cálculo dos resíduos em relação às três curvas de calibração obtidas
na linearidade.
Conc.
(µg/mL)
Xcalculado
media 1
(Xm-Xcal)
media 2
(Xm-Xcal)
media 3
(Xm-Xcal)
media
(Xm-Xcal)
Sn* t cal.**
0
2000000 155101 212138 169883 179040,7 29600,71 14,8158
10
2337400 87721 148621 170789 135710,3 43012,64 7,728451
20
2674800 111470 182035 50103 114536 66019,42 4,249579
30
3012200 112712 127668 151124 130501,3 19362,11 16,50965
50
3687000 74077 196238 108201 126172 63032,1 4,903169
100
5374000 100113 203504 62238 121951,7 73121,24 4,085261
* Sn = desvio padrão dos resíduos
** t cal. = (resíduo)/Sn/√n, n = 6
Gráfico dos Resíduos
25 50 75 100 125
-100000
-75000
-50000
-25000
0
25000
50000
75000
Concentração (μg/mL)
Resíduo
Gráfico 14 - Gráfico de resíduos dos dados de linearidade.
Validação do método analítico
123
11.2 Seletividade
O objetivo da seletividade foi verificar se o método era eficiente o suficiente na
separação da warifteína de outros alcalóides de estrutura química semelhante como
a metilwarifteína. Também foram verificados os perfis de UV da metilwarifteína e a
pureza do pico cromatográfico, demonstrados nas Figuras 44 – 48. A Figura 49
revela a similaridade entre os espectros de UV da warifteína e da metilwarifteína
através de sua sobreposição em HPLC/DAD.
Figura 44 - Espectro de UV da metilwarifteína em HPLC/DAD na concentração de
100 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min. em fase móvel
ACN:H2O:trietilamina (43:57:0,05) fluxo de 1,3 mL e λ 223 nm.
Figura 45 - Espectro de UV bidimensional da metilwarifteína (MWAR) em
HPLC/DAD na concentração de 100 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min.
em fase móvel ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05), fluxo de 1,3 mL e λ=246 nm.
MWAR
Validação do método analítico
124
Figura 46 - Espectro de UV tridimensional da metilwarifteína em HPLC/DAD na
concentração de 100 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min. em fase móvel
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05) fluxo de 1,3 mL e λ=246 nm.
Figura 47 - Pureza de 99% do pico cromatográfico da metilwarifteína em HPLC/DAD
na concentração de 50 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min. em fase móvel
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05), fluxo de 1,3 mL e λ=246 nm.
Validação do método analítico
125
Figura 48 - Perfil de pureza do pico cromatográfico da metilwarifteína (50 µg/mL)
avaliada durante o processo de separação cromatográfica nos comprimentos de
onda de 236, 241, 246, 251, 256 nm.
Figura 49 - Espectros de UV da metilwarifteína (azul) e warifteína (preto)
sobrepostos em HPLC/DAD.
Nos cromatogramas obtidos com a injeção do padrão da metilwarifteína foi
observada a presença de uma impureza no tempo de retenção de 17 min., mas que
não interferiu com o pico cromatográfico da metilwarifteína, cujo tempo de retenção
foi de 30 min. (Figura 50). Como o objetivo deste trabalho não foi quantificar a
metilwarifteína e sim o alcalóide majoritário da C. sympodialis que é a warifteína, a
meta da seletividade foi atingida com êxito como pode ser observado na separação
Validação do método analítico
126
cromatográfica demonstrada nas Figuras 51 - 53. O relatório da eficiência da
separação demonstra com clareza a resolução de 12,78 min., o que dá garantia que
o método proposto é seletivo para quantificação da warifteína no extrato bruto das
folhas (Figura 54).
Figura 50 - Cromatograma da metilwarifteína (MWAR) em HPLC/DAD na
concentração de 100 µg/mL com um tempo de retenção de 30 min. em fase móvel
ACN:H
2
O:trietilamina (43:57:0,05), fluxo de 1,3 mL e λ=246 nm.
MWAR
Validação do método analítico
127
Figura 51 - Cromatograma dos padrões warifteína (WAR) e metilwarifteína (MWAR)
nas concentrações de 50 µg/mL.
Figura 52 - Cromatograma dos padrões warifteína 25 µg/mL (WAR) e metilwarifteína
50 µg/mL (MWAR).
WAR
MWAR
WAR
MWAR
Validação do método analítico
128
Figura 53 - Cromatograma da mistura de warifteína 0,5 mg/mL (WAR) e
metilwarifteína 0,5 mg/mL (MWAR) adicionados ao extrato.
Figura 54 - Relatório da eficiência da separação dos padrões warifteína e
metilwarifteína.
WAR
MWAR
Validação do método analítico
129
11.2.1 Degradação ácida
Outra técnica que avalia a especificidade de um método é por meio da
degradação deliberada da amostra para observar o aparecimento de outros picos no
cromatograma. Outros picos freqüentemente aparecem com a degradação da
amostra, mas não afetarão o ensaio desde que a amostra tenha o pico de interesse
bem resolvido. Estudos de degradação geralmente usam reações que envolvem
ácidos, bases, temperatura, luz e oxidação. Estes estudos são designados até que
10 a 30% da amostra sejam degradados. Em adição, estudos de degradação tais
como estes irão informar quais picos de degradação que se formam e aonde eles
irão eluir. Estas informações também podem ser usadas para o desenvolvimento de
estudos de estabilidade (SNYDER et al., 1997).
Neste estudo de degradação ácida foi verificada a especificidade da
warifteína à hidrólise ácida e à temperatura. Como é observado nos cromatogramas
das Figuras 55-57 a warifteína não sofreu nenhum tipo de alteração na simetria do
pico cromatográfico, o que demonstra sua especificidade. Porém, a área do pico da
warifteína diminuiu em 45%, ou seja, a amostra foi degradada acima de 30% e
mesmo assim não surgiram picos de degradação comprovando mais uma vez a
especificidade do método proposto e a estabilidade da warifteína adicionada ao
extrato.
Figura 55 - Cromatograma do extrato filtrado adicionado de warifteína (WAR)
padrão sem sofrer degradação ácida com área do pico cromatográfico de 11339265.
WAR
Validação do método analítico
130
Figura 56 - Cromatograma 01 do extrato filtrado adicionado de warifteína (WAR)
padrão na degradação ácida com diminuição da área (5044124) e sem alteração da
simetria do pico cromatográfico da warifteína.
Figura 57 - Cromatograma 02 do extrato filtrado adicionado de warifteína (WAR)
padrão na degradação ácida com diminuição da área (5353621) e sem alteração da
simetria do pico cromatográfico da warifteína.
WAR
WAR
Validação do método analítico
131
11.3 Precisão e Exatidão
Para o primeiro dia de análise os resultados obtidos para a curva de
calibração estão demonstrados na Tabela 15. Como mostra o Gráfico 15 a
quantidade de warifteína pré-existente encontrada no extrato foi de 69,20 µg/mL.
Com este resultado foram obtidos os valores teóricos de warifteína no extrato que
foram de: 89, 119 e 149 µg/mL para as concentrações Baixa, Média e Alta,
respectivamente.
O resultado de precisão para a Baixa concentração foi de 5%, na Média 3% e
na Alta 2%, ou seja, todos dentro do que é especificado pela norma de métodos
analíticos (RSD%≤ 5%). Para a exatidão os valores foram de 104, 101 e 103% para
a Baixa, Média e Alta concentração, respectivamente, dentro dos limites aceitáveis
estabelecidos pela a ANVISA (85% ≤ Exatidão ≤ 115%) como estão demonstrados
na Tabela 17. Também estão demonstrados alguns dos cromatogramas obtidos
para a concentração Baixa (Figura 58), Média (Figura 59) e Alta (Figura 60).
Tabela 15 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição de
padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL no primeiro dia de análise.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL 50 µg/mL 100µg/mL
1
2045991 2360416 2542623 2812938 3298237 4929157
2
2048644 2355245 2542623 2804517 3539280 4941751
Média
2047318 2357831 2542623 2808728 3418759 4935454
Validação do método analítico
132
y = 28901x + 2E+06
R
2
= 0,9974
69,20 µg/mL
-1000000
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
-100 -50 0 50 100 150
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 15 - Curva de calibração obtida no primeiro dia de análise para a precisão e
exatidão.
Tabela 16 - Área dos picos cromatográficos das concentrações Baixa, Média e Alta
do primeiro dia de análise.
Conc.
(µg/mL)
20 µg/mL 50 µg/mL 80 µg/mL
1
2840272 3615631 4393728
2
2556565 3561831 4378103
3
2637837 3399647 4431730
4
2569750 3459527 4547349
5
2824719 3428970 4563311
Validação do método analítico
133
Tabela 17 - Valores obtidos para a precisão e exatidão intradia na primeira análise.
Valor
teórico
(µg/mL)
89 µg/mL 119 µg/mL 149 µg/mL
98 125 152
88 123 151
91 118 153
89 120 157
98 119 158
Media 93 121 154
DSP 5 3 3
RSD% 5% 3% 2%
exatidão 104% 101% 103%
Figura 58 - Cromatograma da concentração Baixa da warifteína (WAR) na primeira
análise de precisão e exatidão.
WAR
Validação do método analítico
134
Figura 59 - Cromatograma da concentração Média da warifteína (WAR) na primeira
análise de precisão e exatidão.
Figura 60 - Cromatograma da concentração Alta da warifteína (WAR) na primeira
análise de precisão e exatidão.
WAR
WAR
Validação do método analítico
135
Para o segundo dia de análise os resultados obtidos com a curva de
calibração estão demonstrados na Tabela 18. A quantidade de warifteína encontrada
no extrato foi de 65,99 µg/mL como mostra o Gráfico 16. A área dos picos
cromatográficos das concentrações Baixa, Média e Alta estão mostradas na Tabela
19. Os valores teóricos de warifteína no extrato foram de 86, 116 e 146 µg/mL. O
resultado de precisão para a Baixa concentração foi de 1%, na Média 1% e na Alta
1%. Para a exatidão os valores foram de 108, 105 e 103%, para a Baixa, Média e
Alta concentração, respectivamente como mostra a Tabela 20. Os cromatogramas
das concentrações Baixa, Média e Alta estão demonstrados nas Figuras 61 – 63.
Tabela 18 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição de
padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL do segundo dia de
análise.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL 50 µg/mL
100
µg/mL
1
2126291 2557743 2860841 3177757 3704796 5207114
2
2049207 2588968 2858011 2980720 3690159 5215361
Média
2087749 2573356 2859426 3079239 3697478 5211238
65,99 µg/mL
-1000000
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
-100 -50 0 50 100 150
Conc (µg/mL)
Área
y = 30305x + 2E+06
R
2
= 0,9964
Gráfico 16 - Curva de calibração obtida no segundo dia de análise para precisão e
exatidão.
Validação do método analítico
136
Tabela 19 - Área dos picos cromatográficos das concentrações Baixa, Média e Alta
do segundo dia de análise.
Conc.
(µg/mL)
20 µg/mL 50 µg/mL 80 µg/mL
1
2796829 3751511 4597278
2
2844619 3697175 4618694
3
2819536 3711662 4497157
4
2794873 3649820 4563609
5
2758860 3641153 4565515
Tabela 20 - Valores obtidos para a precisão e exatidão intradia na segunda análise.
Valor teórico
(µg/mL)
86 µg/mL 116 µg/mL 146 µg/mL
92 124 152
94 122 152
93 122 148
92 120 151
91 120 151
Média 93 122 151
DSP 1 2 2
RSD% 1% 1% 1%
exatidão 108% 105% 103%
Validação do método analítico
137
Figura 61 - Cromatograma da concentração baixa da warifteína (WAR) na segunda
análise de precisão e exatidão.
Figura 62 - Cromatograma da concentração média da warifteína (WAR) na segunda
análise de precisão e exatidão.
WAR
WAR
Validação do método analítico
138
Figura 63 - Cromatograma da concentração alta da warifteína (WAR) na segunda
análise de precisão e exatidão.
Para o terceiro dia os resultados obtidos na curva de calibração estão
mostrados na Tabela 21. A área dos picos cromatográficos das concentrações
Baixa, Média e Alta são mostrados na Tabela 22. Foi encontrado 56,16 µg/mL de
warifteína no extrato (Gráfico 17). As concentrações teóricas de warifteína no extrato
foram de 76, 106 e 136 µg/mL. O resultado de precisão para a Baixa concentração
foi de 3%, na Média 1% e na Alta 4%. Para a exatidão os valores foram de 95, 93 e
90%, respectivamente como pode ser observado na Tabela 23. As Figuras 64 - 66
mostram os cromatogramas obtidos com as concentrações Baixa, Média e Alta.
Tabela 21 - Áreas dos picos cromatográficos da curva de calibração por adição de
padrão warifteína nos pontos 0; 10; 20; 30; 50; 100 µg/mL do terceiro dia de análise.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL 50 µg/mL
100
µg/mL
1
1837277 2341254 2674702 2971120 3443059 5431116
2
1682358 2142341 2639632 2993396 3613885 5421846
Média
1759818 2241798 2657167 2982258 3528472 5426481
WAR
Validação do método analítico
139
56,16 µg/mL
-2000000
-1000000
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
-100 -50 0 50 100 150
Conc (µg/mL)
Área
y = 35609x + 2E+06
R
2
= 0,996
Gráfico 17 - Curva de calibração obtida no terceiro dia de análise para precisão e
exatidão.
Tabela 22 - Área dos picos cromatográficos das concentrações Baixa, Média e Alta
do terceiro dia de análise.
Conc.
(µg/mL)
20 µg/mL 50 µg/mL 80 µg/mL
1
2574954 3509212 4437257
2
2522984 3492581 4337370
3
2523807 3559172 4421537
4
2652976 3571695 4599428
5
2672790 3474228 4096827
Validação do método analítico
140
Tabela 23 - Valores obtidos para a precisão e exatidão intradia na terceira análise.
Valor teórico
(µg/mL)
76 µg/mL 106 µg/mL 136 µg/mL
72 99 125
71 98 122
71 100 124
74 100 129
75 98 115
Média 73 99 123
DSP 2 1 5
RSD% 3% 1% 4%
exatidão 95% 93% 90%
Figura 64 - Cromatograma da concentração Baixa da warifteína (WAR) na terceira
análise de precisão e exatidão.
WAR
Validação do método analítico
141
Figura 65 - Cromatograma da concentração Média da warifteína (WAR) na terceira
análise de precisão e exatidão.
Figura 66 - Cromatograma da concentração Alta da warifteína (WAR) na terceira
análise de precisão e exatidão.
WAR
WAR
Validação do método analítico
142
Reunindo os dados da precisão nos três dias de análise foi calculado a média
obtendo-se para as concentrações Baixa 3%, Média 2% e Alta 2%, enquanto que
para a exatidão os valores encontrados foram: 102%, 100% e 99% para as
concentrações Baixa, Média e Alta, respectivamente como demonstram as Tabelas
24 e 25.
Tabela 24 - Resultado da precisão interdias para as concentrações Baixa, Média e
Alta.
Dias
20 µg/mL
(RSD%)
50 µg/mL
(RSD%)
80 µg/mL
(RSD%)
1 5% 3% 2%
2 1% 1% 1%
3 3% 1% 4%
Média 3% 2% 2%
Tabela 25 - Resultado da exatidão interdias para as concentrações Baixa, Média e
Alta.
Dias 20 µg/mL 50 µg/mL 80 µg/mL
1 104% 101% 103%
2 108% 105% 103%
3 95% 93% 90%
Média 102% 100% 99%
Validação do método analítico
143
11.4 Robustez
A Tabela 26 mostra a média da área dos picos cromatográficos das
concentrações Baixa (B) 10 µg/mL, Média (M) 50 µg/mL e Alta (A) 100 µg/mL obtidas
com a metodologia usada durante o desenvolvimento e validação do método analítico
que foi ACN:H
2
O:triet. (43:57:0,05) e temperatura de forno de 40°C. Estas médias
foram utilizadas para calcular o coeficiente de variação das concentrações B, M e A
por meio da mudança destes parâmetros. A Tabela 27 mostra os valores do
coeficiente de variação (CV%) para as concentrações B (-3%), M (2%) e A (5%)
obtidas com a diminuição de 2% da concentração da fase orgânica ACN:H
2
O:triet.
(42,14:57,86:0,05).
Tabela 26 - Média das concentrações Baixa (B), Média (M) e Alta (A).
Conc. (µg/mL) 10 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 2380305 3620590 4811621
2 2494753 3584095 4789200
3 2461735 3581921 5013878
4 2446207 3590491 4981112
Média 2445750 3594274 4898953
Tabela 27 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com a diminuição
de 2% de fase orgânica.
Conc. (µg/mL) 10 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 2360592 3656846 5133768
2 2421010 3670080 5174069
3 2301326 3654719 5147834
4 2385340 3660081 5151187
Média 2367067 3660432 5151715
CV% -3% 2% 5%
Validação do método analítico
144
A Tabela 28 revela o CV% obtido nas concentrações B (3%), M (4%) e A (5%)
através do aumento de 2% na concentração da fase orgânica ACN:H
2
O:triet.
(43,9:56,1:0,05). Além de variar a concentração da fase móvel foi também mudada a
temperatura do forno do HPLC/UV/Vis para avaliar a robustez do método analítico. A
Tabela 29 apresenta os resultados de CV% para as concentrações B (-1%), M (9%) e
A (9%), obtidas com a redução da temperatura para 38°C, sendo mantida a fase
móvel do método analítico desenvolvido.
Tabela 28 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com o aumento de
2% da fase orgânica.
Conc. (µg/mL) 10 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 2437222 3687019 5071121
2 2536775 3814962 5218830
3 2543244 3682422 5146776
4 2545443 3728133 5151649
Média 2515671 3728134 5147094
CV% 3% 4% 5%
Tabela 29 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com a diminuição
da temperatura para 38°C.
Conc. (µg/mL) 10 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 2327708 3942762 5314702
2 2300182 3924027 5325973
3 2374743 3820138 5332014
4 2651641 4039532 5326291
Média 2413569 3931615 5324745
CV% -1% 9% 9%
Validação do método analítico
145
A Tabela 30 mostra os resultados obtidos com o CV% de 1%, -4% e 3% para
as concentrações B, M e A, respectivamente, com o aumento da temperatura para
42°C. O último parâmetro a avaliar foi o pH da água com a adição de 0,1% de
trietilamina na água como revela a Tabela 31. Pode-se observar que dos três
parâmetros alterados o que mais influenciou na robustez do método foi o parâmetro
pH, principalmente na concentração de A com o maior CV% de 11% .
Tabela 30 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com o aumento da
temperatura para 42°C.
Conc. (µg/mL) 10 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 2489114 3406506 5076972
2 2477719 3500261 5066869
3 2445330 3493776 5048665
4 2452428 3466840 5065160
Média 2466148 3466846 5064417
CV% 1% -4% 3%
Tabela 31 - Coeficiente de variação das concentrações (B, M e A) com o aumento
para 0,1% de trietilamina.
Conc. (µg/mL) 10 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 2253353 3530361 5593320
2 2470764 3783693 5552626
3 2413089 3478863 5308720
4 2146045 3888071 5312446
Média 2320813 3670247 5441778
CV% -5% 2% 11%
Validação do método analítico
146
11.5 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ)
Os valores revelados pela Tabela 32 apresentam duas concentrações (0,25
µg/mL e 0,5 µg/mL) que ficaram fora dos pontos da curva de calibração (Tabela 33 e
Gráfico 18) por ter dado os valores de LOD e LOQ discrepantes com relação aos
demais resultados, portanto eles foram descartados da curva. Com os outros pontos
da curva de calibração (1, 2, 3 e 5 µg/mL) foi calculado a média do limite de detecção
(LOD) que foi de 0,026984 µg/mL e do limite de quantificação (LOQ) que foi de
0,089946 µg/mL para o marcador warifteína. Já foi relatado em outro estudo o limite
de detecção para a warifteína de 0,008 µg/mL (ARAGÂO, 2002). Esta diferença de
concentração pode ser devido à fase móvel usada no estudo ou a diferença de
comprimento de onda utilizado. As Figuras 67 e 68 mostram os cromatogramas
obtidos com as injeções do LOD (0,027 µg/mL) e do LOQ (0,09 µg/mL) com suas
respectivas áreas. Substituindo o valor de Y da equação da reta obtida na curva de
calibração pelas áreas dos picos cromatográficos foram encontrados os valores de
0,05 µg/mL e 0,06 µg/mL .
Tabela 32 - Limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) calculados pelo
sistema class-vp modo ASTM para o marcador warifteína.
Concentração
(µg/mL)
LOD
(µg/mL)
LOQ
(µg/mL)
0,25 0,176739 0,589131
0,25 0,173289 0,57763
0,5 0,177327 0,591089
0,5 0,147587 0,491958
1 0,026035 0,086785
1 0,026396 0,087986
2 0,027445 0,091483
2 0,027719 0,092395
3 0,026481 0,08827
3 0,026568 0,088559
5 0,027356 0,091187
5 0,027871 0,092903
Média 0,026984 0,089946
Validação do método analítico
147
Tabela 33 - Área dos picos cromatográficos da curva de calibração.
Conc.
(µg/mL)
1 µg/mL 2 µg/mL 3 µg/mL 5 µg/mL
1
116339 230510 366086 595235
2
115500 231144 365326 596637
Média
115920 230827 365706 595936
y = 120720x - 4883,5
R
2
= 0,9991
0
200000
400000
600000
800000
0246
Conc (µg/mL)
Área
Gráfico 18 - Curva de calibração para obtenção do LOD e LOQ.
Validação do método analítico
148
Figura 67 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) obtido na determinação do limite de
detecção da warifteína (WAR) na concentração de 0,027 µg/mL.
Figura 68 - Cromatograma (CLAE/UV/VIS) obtido na determinação do limite de
quantificação da warifteína (WAR) na concentração de 0,09 µg/mL.
WAR
2982
WAR
2056
Validação do método analítico
149
11.6 Aplicação do método cromatográfico
A Tabela 34 mostra os resultados da curva de calibração obtida com as
concentrações encontradas na linearidade do método proposto. Com estes resultados
foi realizada uma curva de calibração que, por regressão linear, foi obtida a equação
da reta para o cálculo da concentração de warifteína (Gráfico 19). Por extrapolação
para o eixo Y foi encontrado o valor de 0,138 µg/mL de warifteína na amostra. Se foi
pipetado 250 µL da solução etanólica e diluída para 1 mL, significa que a amostra foi
diluída 4 vezes e no lugar de 0,138 µg/mL tem-se uma concentração 4 vezes maior,
ou seja, 0,552 µg/mL de warifteína na amostra. Na preparação do macerado foi
pesado 80 g de folhas rasuradas e encobertos com 438 mL de etanol a 70%, então
para 438 mL tem-se uma concentração 438 vezes maior que fica em torno de 241,77
µg/mL ou 0,241 mg de warifteína em 80 g de folhas. Isto representa 0,3% de
warifteína nas folhas. A Figura 69 mostra um dos cromatogramas obtidos na aplicação
do método.
Tabela 34 - Área dos picos cromatográficos obtidos com a curva de calibração na
aplicação do método.
Conc.
(µg/mL)
0 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL 50 µg/mL 100µg/mL
1 45438 238210 431361 660128 1075481 2307064
2 45104 235913 433680 659064 1164794 2316797
Média 45271 237062 432521 659596 1120138 2311931
Validação do método analítico
150
y = 22867x + 731,32
R
2
= 0,9987
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
-50 0 50 100 150
Conc (µg/mL)
Área
0,138 µg/mL
Gráfico 19 - Curva de calibração obtida na aplicação do método.
Figura 69 - Cromatograma obtido na aplicação do método com a adição de 100
µg/mL de warifteína (WAR) na amostra.
WAR
Validação do método analítico
151
11.7 Verificação da estabilidade das soluções de trabalho da warifteína
As Tabelas 35 e 38 mostram a média das áreas dos picos cromatográficos
obtidos para as concentrações de 2,5 µg/mL e 80 µg/mL do padrão warifteína (Pa)
preparadas a cada dia de análise. A Tabela 36 mostra a variação de área da
amostra (A) de 2,5 µg/mL preparada nos 20 dias de análise e armazenada na
geladeira em comparação com a área obtida do padrão. A menor variação foi de 0%,
enquanto que a maior variação foi de -31%. Para a solução estoque (E) de 2,5
µg/mL a menor variação foi de 15% e a maior de -30% (Tabela 36).
Tabela 35 - Média das áreas do padrão de 2,5 µg/mL preparadas nos dias de
análise.
Padrão 03/09/07 08/09/07 13/09/07 18/09/07
(2,5 µg/mL)
5 dias 10 dias 15 dias 20 dias
1 62017 86145 66243 55402
2 61245 87307 71395 55456
3 61585 86667 67316 55491
Média 61616 86706 68318 55450
Tabela 36 - Coeficiente de variação da amostra de 2,5 µg/mL ao longo dos 20 dias
de análise.
Amostra
03/09/07 08/09/07 13/09/07 18/09/07
(2,5 µg/mL)
5 dias 10 dias 15 dias 20 dias
1 62692 59755 59302 64608
2 61653 60519 59527 61826
3 59909 60061 60042 62174
Média 61418 60112 59624 62869
CV% 0 -31 -13 13
Validação do método analítico
152
Tabela 37 - Coeficiente de variação da solução estoque de 2,5 µg/mL ao longo dos
20 dias de análise.
Estoque 08/09/07 13/09/07 18/09/07
(2,5 µg/mL)
10 dias 15 dias 20 dias
1 61668 82506 63186
2 60653 83409 64209
3 59980 81029 63895
Média 60767 82315 63763
CV% -30 20 15
A Tabela 39 apresenta os resultados obtidos para a amostra de 80 µg/mL
comparadas com o seu padrão. Pode-se observar que o menor resultado de
variação obtida foi de 9%, enquanto a maior variação foi de 21%. Para a solução
estoque (Tabela 40) a menor variação foi de -5% e a maior de -26%. As Figuras 70 e
71 mostram os cromatogramas da amostra de warifteína a 80 µg/mL no primeiro dia
e no último dia de análise da estabilidade.
Tabela 38 - Média das áreas do padrão de 80 µg/mL preparadas nos dias de
análise.
Padrão 03/09/07 08/09/07 13/09/07 18/09/07
80 µg/mL
5 dias 10 dias 15 dias 20 dias
1 1916226 1848427 2068571 2034466
2 1934398 1853683 2074962 2072928
3 1906285 1850882 2078570 2065914
Média 1918970 1850997 2074034 2057769
Validação do método analítico
153
Tabela 39 - Coeficiente de variação da amostra de 80 µg/mL ao longo dos 20 dias
de análise.
Amostra
03/09/07 08/09/07 13/09/07 18/09/07
80 µg/mL
5 dias 10 dias 15 dias 20 dias
1 2166658 2247551 2276099 2325213
2 2175959 2230283 2270408 2336000
3 2159046 2250064 2248395 2317966
média 2167221 2242633 2264967 2326393
CV% 13 21 9 13
Tabela 40 - Coeficiente de variação da solução estoque de 80 µg/mL ao longo dos
20 dias de análise.
Estoque 08/09/07 13/09/07 18/09/07
80 µg/mL
10 dias 15 dias 20 dias
1 1980924 1955793 2167000
2 1981443 1964474 2168590
3 1975532 1984361 216677
média 1979300 1968209 1517422
CV% 7 -5 -26
Validação do método analítico
154
Figura 70 - Cromatograma da amostra (WAR) a 80 µg/mL no primeiro dia de
análise.
Figura 71 - Cromatograma da amostra (WAR) a 80 µg/mL no último dia de análise.
WAR
WAR
Validação do método analítico
155
12 CONCLUSÕES
• A warifteína foi isolada, recristalizada, purificada e seu grau de pureza
determinado por análises físicas e espectroscópicas.
• As condições analíticas do método para analisar a warifteína em relação à
metilwarifteína foram seletivas tanto na mistura dos dois marcadores quanto
na adição ao extrato etanólico bruto das folhas.
• As condições analíticas do método permitiram a quantificação de warifteína
com precisão (intradia 1-5%, interdias 2-3%) e exatidão (intradia 90-108% e
interdias 99-102%).
• O método mostrou-se robusto frente às variações de fase móvel com 2% a
mais (CV%≤5), 2% a menos (CV%≤5); temperatura com 2°C a mais
(CV%≤4) e 2°C a menos (CV%≤9); e ao pH com adição de 0,1% de
trietilamina (CV%≤11).
• A warifteína mostrou-se estável em temperatura de 12°C armazenadas na
geladeira por 20 dias nas concentrações de 2,5 µg/mL e 80 µg/mL.
• O método pôde ser aplicado com sucesso à determinação de warifteína no
EBF e no material vegetal fresco.
CAPÍTULO IV
Referências
Referências bibliográficas
157
13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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