( PDF ) Desenvolvimento e validação de metodologias analíticas para quantificação de tibolona manipulada por farmácias magistrais da Paraíba

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA – LTF

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS

E SINTÉTICOS BIOATIVOS

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS

ANALÍTICAS PARA QUANTIFICAÇÃO DE TIBOLONA

MANIPULADA POR FARMÁCIAS MAGISTRAIS DA

PARAÍBA

ALUNO: JOSÉ ALVES CÂNDIDO

ORIENTADOR: Prof. Dr.EDUARDO DE JESUS OLIVEIRA

JOÃO PESSOA – 2008

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

JOSÉ ALVES CÂNDIDO

ORIENTADOR: Prof. Dr.EDUARDO DE JESUS OLIVEIRA

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS

ANALÍTICAS PARA QUANTIFICAÇÃO DE TIBOLONA

MANIPULADA POR FARMÁCIAS MAGISTRAIS DA PARAÍBA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: FARMACOQUÍMICA

JOÃO PESSOA - 2008

Dissertação apresentada à coordenação

do Programa de Pós-Graduação em

Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos da

Universidade Federal da Paraíba, em

cumprimento às exigências para obtenção

do Grau de Mestre.

ads:

JOSÉ ALVES CÂNDIDO

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS

ANALÍTICAS PARA QUANTIFICAÇÃO DE TIBOLONA

MANIPULADA POR FARMÁCIAS MAGISTRAIS DA

PARAÍBA

Aprovada em: ______ / ______ / ______

COMISSÃO EXAMINADORA

_______________________________________________________

Prof. Dr.Eduardo de Jesus Oliveira (UFPB - Orientador)

_______________________________________________________

Prof. Dr. Fábio Santos de Souza (UFPB – CCS)

_______________________________________________________

Profª. Drª. Sayonara Maria Lia Fook (UEPB – DF)

A minha esposa Miriam.

Ao meu filho Gabriel.

Aos meus pais Cinira e Antônio “in memoriam”.

Aos meus tios Anésia e José “in memoriam”.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira por aceitar a orientação deste trabalho e

pela contribuição com as relevantes sugestões.

A Agência Estadual de Vigilância Sanitária da Paraíba (AGEVISA), nas pessoas

do Prof. Hermano Toscano, Diretor Geral, pela compreensão nas minhas

ausências e a Jorge Molina, quando Diretor Geral, pela mesma razão.

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) pela cooperação técnica.

Aos amigos Sócrates e Roberto, sem a colaboração dos quais este trabalho não

teria sido realizado.

A minha irmã Maria, minhas sobrinhas e sobrinhos, meu irmão Abelson e em

especial ao meu irmão Everaldo, pela força, incentivo, pelas importantes

sugestões e a preciosa colaboração na digitação e formatação deste trabalho.

Em particular ao sobrinho Dimas, pela estimulante companhia nas corridas, para

aliviar o estresse das atividades diárias.

Aos professores Givaldo do Departamento de Farmácia, e José Rodrigues do

Departamento de Química, pela importante e significativa contribuição na minha

formação acadêmica.

Aos colegas da AGEVISA, em especial aos da DTMAPT, pela compreensão nos

momentos das minhas ausências, especialmente ao colega e amigo João

Peixoto, pela força e incentivo para que eu realizasse este projeto.

Ao Prof. Dr. Fábio Souza dos Santos pelas valiosas e importantes sugestões.

A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos pelos ensinamentos recebidos.

A Coordenação da Pós-Graduação e a secretária Tânia Maria Alves pela

execução da parte burocrática deste trabalho.

Aos estagiários, Eugênia, Victor, Michelle, Marcela e Sanclayver pela valiosa

colaboração neste trabalho.

Aos funcionários do LTF, Wellington e Kazuko, pelo apoio técnico.

Aos colegas Alexsandro e Joviânia pela companhia e colaboração durante as

longas jornadas do trabalho experimental.

A todos os colegas da minha turma de Mestrado, e demais colegas do Doutorado

pelo companheirismo, pela solidariedade nas horas difíceis, pelos momentos de

descontração e pelas amizades que construímos.

O melhor soldado não ataca.

O lutador superior vence sem violência.

O maior dos conquistadores vence sem esforço.

O gerente mais bem-sucedido dirige sem impor.

Isso é chamado não-agressividade inteligente.

Isso é chamado superioridade dos homens.

Lao-Tsé, Tao Te King.

RESUMO

A tibolona (



Livial, Organon) é um fármaco utilizado principalmente na

terapia de reposição hormonal para o tratamento dos sintomas da menopausa,

sendo também comercializada no Brasil em farmácias magistrais na forma de

cápsulas de 2,5 mg. Não há metodologias de análise para formulações a base de

tibolona descritas na literatura, nem métodos oficiais farmacopéicos para

quantificação deste fármaco. Sendo assim, o presente trabalho descreve o

desenvolvimento, a validação e a aplicação de metodologias analíticas à

avaliação da uniformidade de conteúdo de cápsulas de tibolona manipuladas em

farmácias magistrais do Estado da Paraíba. Foram desenvolvidas duas

metodologias analíticas para quantificação da tibolona, sendo a primeira utilizando

CLAE e derivatização pré-coluna com dansilhidrazina e detecção por

fluorescência, e a segunda utilizando CLAE e detecção direta no ultravioleta (207

nm). Todavia, pela simplicidade da técnica, apenas a metodologia por detecção

em UV foi validada e aplicada. Utilizou-se um desenho fatorial fracionário e

análise de regressão linear multivariada a fim de investigar os efeitos das

condições de derivatização da tibolona com dansilhidrazina sobre o rendimento

da reação. Os melhores rendimentos foram obtidos com uma razão molar entre a

dansilhidrazina e a tibolona de 40, um tempo de reação de 20 minutos e uma

temperatura de 48ºC. O método desenvolvido utilizou para a separação do

derivado fluorescente uma coluna monolítica Merck Chromolith C-18

(100mmx4,6mm de DI), e uma fase móvel isocrática que consistiu de um tampão

acetato de amônio 50mM, pH 6.8 e acetonitrila (92,5:7,5 v/v),a um fluxo de 3

mL/min. A detecção do derivado fluorescente (tempo de retenção = 6,69min.) foi

feita utilizando-se um comprimento de onda de excitação de 350nm e de emissão

de 520 nm. O método de quantificação por detecção direta no ultravioleta foi

desenvolvido e validado de acordo com a Resolução RE 899/2003/ANVISA, e

mostrou-se específico, linear na faixa de concentração utilizada (0,001-0,5

mg/mL), preciso (CV% ≤ 5%); exato (85 a 120%) e robusto, dentro das condições

especificadas. A aplicação do método foi realizada através da determinação do

teor da uniformidade de conteúdo das cápsulas de treze farmácias magistrais do

Estado da Paraíba. Os resultados obtidos pela aplicação do método

demonstraram que das farmácias analisadas, apenas 38% tiveram suas cápsulas

em conformidade com as especificações de uniformidade de conteúdo (teor entre

85 a 115%). Já com relação ao peso médio, todas as amostras analisadas

estavam dentro dos limites de variação farmacopéicos estabelecidos (± 10%) para

formas de dosagem menores que 300 mg. Conclui-se a partir dos dados obtidos

que as tecnologias de mistura de pós e excipientes utilizados em escala magistral

não estão fornecendo a uniformidade de mistura necessária para a obtenção de

cápsulas de tibolona com dosagem uniforme, e que a falta de uniformidade de

conteúdo nas cápsulas não é reflexo de variações no seu peso médio.

Palavras chave: Tibolona; Farmácia Magistral; Cápsulas; Derivatização;

Dansilhidrazina; CLAE; Uniformidade de Conteúdo.

ABSTRACT

Tibolone (



Livial, Organon) is a drug used chiefly as hormone

replacement therapy for treatment of menopausal symptoms and is also marketed

in Brazil by compounding pharmacies as 2.5 mg capsules. There are no methods

for the analysis of tibolone dosage forms described in the literature or in official

compendia. Thus the present work describes the development, validation and

application of an analytical method for the quantification of this drug to evaluate

the uniformity of dosage forms (2.5 mg hard gelatin capsules) of tibolone sold by

compounding pharmacies in the sate of Paraiba. Two methods were developed for

tibolone quantification, the first one being an HPLC assay after pre-column

derivatization of tibolone with dansylhydrazine and fluorescence detection, and the

second one using HPLC with direct detection in the UV (207 nm). However,

because of its simplicity, only the second method was fully validated and further

used. A fractional factorial design and multiple linear regression were used in

order to evaluate the effects of reaction conditions in the derivatization of tibolone

with dansylhydrazine. The best reaction yield was obtained using a molar ratio of

dansylhydrazine to tibolone of 40, a reaction time of 20 minutes and a temperature

of 48 ºC. The developed method used for the separation of the fluorescent

hydrazone, a monolithic column (Merck Chromolith C-18, 100mmx4,6mm of ID ), a

mobile phase consisting of a 50mM ammonium acetate buffer pH 6.8 and

acetonitrile (92.5:7,5 v/v) delivered isocratically at a flow rate of 3 mL/min. The

detection of the fluorescent derivative (retention time= 6,69 min.) was done using

an excitation wavelength of 350 nm and an emission wavelength of 520 nm. The

method using direct detection in the UV was developed and validated as directed

by the Brazilian regulatory authority (RE 899/2003/ANVISA) and proved to be

selective, linear (from 0,001-0,5 mg/mL), precise (CV% ≤ 5%); exact (85 to 120%)

and rugged. The method was used to determine the uniformity of dosage forms

obtained in 13 compounding pharmacies in the state of Paraiba. The results

demonstrated that only 38% (5 pharmacies) met the specifications of uniformity of

solid dosage forms (assay of individual capsules between 85 to 115%). As for the

weight determination of the dosage forms all pharmacies complied with the

specifications (± 10% for dosage forms with weight below 300 mg). From the

results obtained it is possible to conclude that the procedures in use for powder

mixing in compounding pharmacies are not being able to result in uniform powder

for the filling of the capsules, and that the lack of uniformity is not related to weight

variation.

Key words: Tibolone; ketosteroids; hormonal replacement; derivatization;

dansylhydrazine; HPLC

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Estrutura química da tibolona ........................................................ 37

FIGURA 2 – Principais metabólitos da tibolona ................................................. 38

FIGURA 3 – Reação de derivatização da tibolona com dansilhidrazina ............ 42

FIGURA 4 – Cromatograma da reação de derivatização mostrando a eluição do

pico da tibolona no volume morto. ...................................................................... 46

FIGURA 5 – Cromatograma mostrando picos duplos obtidos para hidrazonas syn

e anti quando uma solução de progesterona padrão a 400 μM foi derivatizada com

dansilhidrazina .................................................................................................... 50

FIGURA 6 – Formação de hidrazonas syn e anti diastereoisoméricas .............. 51

FIGURA 7 – Cromatograma representativo da separação do derivado

fluorescente obtido a partir de uma solução de tibolona a 3 μg/mL, (TR = 6,7 min)

............................................................................................................................. 51

FIGURA 8 – Espectro UV da tibolona na faixa de 190 a 600 nm na concentração

de 0,1 mg/mL em solução de metanol/água (70:30) .......................................... 58

FIGURA 9 – Cromatograma da tibolona com ACN/H

O (90:10) ........................ 58

FIGURA 10 – Cromatograma da tibolona com ACN/H

O (50:50) ..................... 59

FIGURA 11 – Cromatograma tibolona com ACN/H

O (70:30) .......................... 59

FIGURA 12 – Cromatograma representativo da tibolona padrão não degradada

............................................................................................................................ 64

FIGURA 13 – Cromatograma representativo da tibolona padrão submetida à

degradação térmica a 50 ºC ............................................................................... 65

FIGURA 14 – Superposição dos cromatograma representativos da tibolona não

degradada e degradada a 50 ºC ........................................................................ 65

FIGURA 15 – Superposição dos cromatogramas representativos das curvas de

calibração da tibolona padrão obtidas no 1º dia de análise. ............................. 66

FIGURA 16 – Superposição dos cromatogramas representativos das curvas de

calibração da tibolona padrão obtidas no 2º dia de análise. .............................. 67

FIGURA 17 – Superposição dos cromatogramas representativos das curvas de

calibração da tibolona padrão obtidas no 3º dia de análise. .............................. 68

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1 – Modelamento dos dados da reação de derivatização de tibolona

por regressão linear multivariada (RLM) mostrando os valores de rendimento

previstos versus observados ............................................................................... 48

GRÁFICO 2 – Efeito das interações dos parâmetros de reação investigados sobre

o rendimento da reação de derivatização ........................................................... 48

GRÁFICO 3 a e b – Mapas de resposta de superfície mostrando os efeitos da

razão molar dansilhidrazina X tibolona, em relação ao tempo de reação (a) e a

temperatura (b), sobre o rendimento da reação de derivatização ....................... 49

GRÁFICO 4 – Curva de calibração da tibolona padrão para determinação da

linearidade obtida para o 1º dia, no intervalo das concentrações estabelecidas..67

GRÁFICO 5 – Curva de calibração da tibolona padrão para determinação da

linearidade obtida para o 2º dia, no intervalo das concentrações estabelecidas.. 68

GRÁFICO 6 – Curva de calibração da tibolona padrão para determinação da

linearidade obtida para o 3º dia, no intervalo das concentrações estabelecidas.. 69

GRÁFICO 7 – Gráfico das médias das três curvas de calibração ....................... 70

GRÁFICO 8 – Gráfico de resíduos dos dados de linearidade ............................. 71

GRÁFICO 9 – Curva de calibração para determinação da precisão e exatidão

obtida no 1º dia .................................................................................................... 72

GRAFICO 10 – Curva de calibração para determinação da precisão e exatidão

obtida no 2º dia .................................................................................................... 73

GRÁFICO 11 – Curva de calibração para determinação da precisão e exatidão

obtida no 3º dia .................................................................................................... 74

GRÁFICO 12 – Resultado da variação individual da uniformidade de conteúdo

nas farmácias analisadas .................................................................................... 83

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Classificação dos testes de validação segundo a resolução RE nº

899/ANVISA ........................................................................................................ 32

TABELA 2 – Afinidade da tibolona e seus metabólitos por receptores de

esteróides sexuais .............................................................................................. 39

TABELA 3 – Métodos de detecção para quantificação da tibolona em estudos

farmacocinéticos ................................................................................................. 41

TABELA 4 – Parâmetros experimentais sugeridos pelo desenho fatorial

fracionário usando um programa Modde v.4.0 (Umetrix) para derivatização da

Tibolona .............................................................................................................. 45

TABELA 5 – Rendimentos previstos para derivatização da tibolona nas condições

experimentais sugeridas pelo desenho fatorial fracionário usando um programa

Modde v.4.0 (Umetrix) ........................................................................................ 47

TABELA 6 – Condições cromatográficas desenvolvidas para quantificação da

tibolona por derivatização com detecção por fluorescência ............................... 52

TABELA 7 – Condições cromatográficas desenvolvidas para quantificação da

tibolona por detecção direta com UV .................................................................. 60

TABELA 8 – Resolução dos picos cromatográficos da tibolona não degradada e

termodegradada e suas porcentagens de degradação ...................................... 65

TABELA 9 – Áreas dos picos cromatográficos obtidos para construção da curva

de calibração da tibolona padrão no 1º dia ......................................................... 67

TABELA 10 – Áreas dos picos cromatográficos obtidos para construção da curva

de calibração da tibolona padrão no 2º dia ......................................................... 68

TABELA 11 – Áreas dos picos cromatográficos obtidos para construção da curva

de calibração da tibolona padrão no 3º dia ......................................................... 69

TABELA 12 – Média das áreas dos picos cromatográficos obtidos nos três dias

para construção da curva de calibração da tibolona padrão .............................. 70

TABELA 13 – Cálculo dos resíduos em relação às três curvas de calibração

obtidas na determinação da linearidade ............................................................. 71

TABELA 14 – Valores de precisão e exatidão obtidos para as concentrações B, M

e A no 1º dia ........................................................................................................ 72

TABELA 15 – Valores de precisão e exatidão obtidos para as concentrações B, M

e A no 2º dia ........................................................................................................ 73

TABELA 16 – Valores de precisão e exatidão obtidos para as concentrações, B,

M e A no 3º dia .................................................................................................... 74

TABELA 17 – Valores médios de precisão e exatidão obtidos para as

concentrações B, M e A nos três dias (inter-dias) .............................................. 75

TABELA 18 – Valores das concentrações B, M e A obtidas na determinação da

robustez utilizando 68% de acetonitrila na fase móvel no 1º dia ........ ............... 76

TABELA 19 – Valores das concentrações B, M e A obtidas na determinação da

robustez utilizando 72% de acetonitrila na fase móvel no1º dia ......................... 76

TABELA 20 – Valores das concentrações B, M e A obtidas na determinação da

robustez utilizando 68% de acetonitrila na fase móvel no 2º dia ........................ 77

TABELA 21 – Valores das concentrações B, M e A obtidas na determinação da

robustez utilizando 72% de acetonitrila na fase móvel no 1º dia ........................ 77

TABELA 22 – Valores médios das concentrações, B, M e A obtidas utilizando

68% de acetonitrila na fase móvel nos dois dias, juntamente com a média DP e

coeficiente de variação (CV%) ............................................................................ 78

TABELA 23 – Valores médios das concentrações, B, M e A obtidas utilizando

72% de acetonitrila na fase móvel nos dois dias, juntamente com a média DP e

coeficiente de variação (CV%) ............................................................................ 78

TABELA 24a – Resultados obtidos na determinação do Peso Médio das cápsulas

de tibolona (2,5 mg), manipuladas nas Farmácias A, B, C, D, E, F e G ............. 81

TABELA 24b – Resultados obtidos na determinação do Peso Médio das cápsulas

de tibolona (2,5 mg), manipuladas nas Farmácias H, I, J, K, L e M ................... 82

TABELA 25 – Resultados obtidos nas determinações de uniformidade de

conteúdo das cápsulas de tibolona (2,5 mg) manipuladas nas Farmácias A, B, C,

D, E, F, G, H, I, J, K, L e M ................................................................................. 84

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACN Acetonitrila

AGEVISA Agência Estadual de Vigilância Sanitária

ANFARMAG Associação Nacional de Farmacêuticos Magistrais

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BP, 2000 British Pharmacopoeia, 2000

Octadecilsilano

CG/EM Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas

CLAE Cromatografia Líquida de alta eficiência

CLAE/DAD Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de

arranjo de diodo

CLAE/EM Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria

de massas

CV Coeficiente de Variação

DAD Detector com Arranjo de Diodos

D.O.U. Diário Oficial da União

DP Desvio Padrão

DSH Dansilhidrazina

EM Espectrometria de massas

ENSP Escola Nacional de Saúde Pública

FB, 1998 Farmacopéia Brasileira, 1998

FB, 2004 Farmacopéia Brasileira, 2004

FDA Food and Drug Administration

INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

IV Infravermelho

LOD Limite de detecção

LOQ Limite de quantificação

NIRS Near Infrared Spectroscopy

PAT Processos analíticos tecnológicos

PF Ponto de fusão

RDC Resolução da diretoria colegiada

RE Resolução específica

RSD Desvio-padrão relativo

SQR Substância química de referência

USP United States Pharmacopeia

USP, 2000 The United States Pharmacopeia USP 24, 2000

UV Ultravioleta

UV-VIS Ultravioleta-visível

SUMÁRIO

CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 19

1.1 JUSTIFICATIVA ........................................................................................... 22

1.2 OBJETIVOS .................................................................................................. 23

1.2.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 23

1.2.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 23

CAPÍTULO II - REVISÃO DA LITERATURA

2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................... 25

2.1 SITUAÇÃO ATUAL DOS MEDICAMENTOS MANIPULADOS NO BRASIL . 25

2.2 PROCESSO DE MISTURA E HOMOGENEIDADE DE CONTEÚDO DE

CÁPSULAS ......................................................................................................... 27

2.3 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS 31

2.4 UTILIZAÇÃO DA ANÁLISE FATORIAL COMO FERRAMENTA ESTATÍSTICA

............................................................................................................................. 35

2.5 CARACTERÍSTICAS FISOCOQUÍMICAS E FARMACOLÓGICAS DA

TIBOLONA .......................................................................................................... 36

2.5.1 Características químicas ....................................................................... 37

2.5.2 Ação farmacológica ................................................................................ 37

2.5.3 Indicações ................................................................................................ 39

2.5.4 Apresentações e Dosagens .................................................................... 39

2.5.5 Farmacocinética da Tibolona ................................................................. 39

2.6 TIBOLONA E MÉTODOS PARA SUA DETECÇÃO ..................................... 40

CAPÍTULO III - QUANTIFICAÇÃO DA TIBOLONA POR

DERIVATIZAÇÃO COM DETECÇÃO POR FLUORESCÊNCIA

3 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO .............................................................. 44

3.1 MATERIAIS ................................................................................................... 44

3.2 METODOLOGIA ........................................................................................... 45

3.3 RESULTADOS e DISCUSSÃO ..................................................................... 46

CAPÍTULO IV - QUANTIFICAÇÃO DA TIBOLONA POR

DETECÇÃO DIRETA NO UV

4 DESENVOLVIMENTO, VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DO MÉTODO ............. 55

4.1 MATERIAIS ................................................................................................... 54

PARTE I

4.2 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ........................................................... 56

4.2.1 Metodologia .............................................................................................. 56

4.2.2 Resultados e Discussão .......................................................................... 57

PARTE II

4.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO .......................................................................... 61

4.3.1 Metodologia .............................................................................................. 61

4.3.2 Resultados e Discussão .......................................................................... 63

PARTE III

4.4 APLICAÇÃO DO MÉTODO: ANÁLISE DE CÁPSULAS DE TIBOLONA

MANIPULADA ..................................................................................................... 79

4.4.1 Metodologia .............................................................................................. 79

4.4.2 Resultados e Discussão.......................................................................... 80

CAPÍTULO V - CONSIDERAÇÕES FINAIS

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................. 88

REFERÊNCIAS

ANEXOS

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

A utilização de formulações medicamentosas pelo homem o acompanha

desde os primórdios da humanidade. No mundo primitivo algumas pessoas já

demonstravam um significativo conhecimento terapêutico, utilizando sistemas que

combinavam elementos empíricos, racionais, religiosos e mágicos. Foi na

Mesopotâmia, antes de Cristo que se produziu o primeiro Compêndio

Farmacêutico. A parte traduzida consiste em uma série de fórmulas incluindo seu

modo de preparação. No antigo Egito, foi encontrado o Papiro de Ebers, o mais

importante papiro encontrado, escrito em aproximadamente 1500 a.C. contendo

811 prescrições e 700 drogas mencionadas. Os precursores das farmácias

modernas surgiram no início do Século X, quando ainda eram denominadas de

apotecas ou boticas.

Até a revolução Industrial a farmácia tinha uma importância fundamental na

sociedade, pois os farmacêuticos manipulavam e produziam todos os

medicamentos disponíveis, de acordo com as farmacopéias e as prescrições

médicas. Com o advento da industrialização, as farmácias foram perdendo o

prestígio adquirido do ponto de vista da saúde pública e social, tendo os

farmacêuticos a partir daí se voltado para as atividades industriais (ANTUNES

JÚNIOR, 2002).

Na década de 90 fatos preocupantes aconteceram no mercado

farmacêutico brasileiro; como a descoberta da comercialização de medicamentos

falsificados, fato que se constituiu em um verdadeiro atentado à saúde pública

brasileira, uma vez que levou à morte muitos usuários destes medicamentos.

Como a então Secretaria Nacional de Vigilância Sanitária, órgão responsável pela

regulação sanitária no país, não conseguiu reagir à altura a esta nova realidade

nacional, por não possuir autonomia financeira e administrativa, foi criada a

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), apresentando um novo

modelo de gestão, caracterizado por autonomia financeira e administrativa, com

objetivo de promover e proteger a saúde da população. A ANVISA, com o seu

poder regulador, colocou em prática várias atividades e novas regulamentações,

apoiada neste período pela então recém-criada Lei dos Genéricos (BRASIL,

ANVISA, 1999e).

Com o padrão de qualidade adquirido com os genéricos, os medicamentos

similares passaram a ser o “nó crítico” do Sistema Nacional de Vigilância

Sanitária, tendo em vista que tais produtos não tinham a mesma eficácia

comprovada obtida pelos genéricos. A ANVISA, em consonância com a política

nacional de medicamentos do Ministério da Saúde redefiniu as regras para o

registro de medicamentos. Estas mudanças foram baseadas em alguns critérios,

como verificação da qualidade quanto à reprodutibilidade, segurança e eficácia

terapêutica; exigência de certificação das Boas Práticas de Fabricação para a

concessão de registro para cada linha de produção de medicamentos; controle da

matéria-prima; ampliação do monitoramento da qualidade dos medicamentos em

comercialização; redução do número de associações irracionais e participação

nas estratégias que facilitam o acesso a medicamentos pela maioria da

população. Todavia, em 2003, a Agência conseguiu estabelecer a transição de

todo mercado de similares para as mesmas exigências de segurança e eficácia

aplicadas aos genéricos, (BRASIL, ANVISA, 2005g).

A manipulação farmacêutica magistral no país passou por grandes

transformações no que se refere a sua regulamentação. Mesmo assim, muitos

dos processos de mudanças ocorridos na indústria farmacêutica não foram

acompanhados pelos medicamentos manipulados, tendo em vista que a análise

dos mecanismos de controle de qualidade, existentes nas farmácias magistrais,

nos leva a supor que são insuficientes para garantir a comprovação da eficácia e

segurança deste tipo de medicamentos, pois os mesmos não passam por testes

de biodisponibilidade, bioequivalência ou mesmo teste de equivalência

farmacêutica.

Os problemas relacionados a desvios de qualidade de medicamentos

manipulados que provocaram diversas internações hospitalares e a morte de

várias pessoas, inclusive crianças (BRASIL, ANVISA, 2008h), fizeram a

autoridade sanitária federal (ANVISA), intervir de forma a aumentar o rigor dos

ensaios de controle da qualidade através de suas resoluções, no sentido de

minimizar os riscos provenientes de manipulações mal feitas devido à falta de

controle nos seus processos de manipulação desde a matéria prima até o produto

acabado, para que o segmento magistral possa garantir a eficácia e segurança

desses medicamentos.

Essas dificuldades passam pela característica particular do processo

magistral, que é produzir o medicamento de forma individualizada, aliada à

situação vigente no Brasil, onde ao contrário de outros paises, as farmácias

manipulam todos os grupos de medicamentos – hormônios, antibióticos e

antineoplásicos, inclusive os de alto risco sanitário como os de baixo índice

terapêutico; daí a exigência de se aumentar cada vez mais o rigor nas análises de

controle da qualidade de todo o processo de manipulação.

1.1 JUSTIFICATIVA

Para a realização do presente trabalho de pesquisa, foi escolhido o fármaco

tibolona por ser considerado um fármaco de baixa dosagem (2,5 mg) e por estar

entre os mais manipulados desta categoria nos estabelecimentos de manipulação

do Estado. Além disso, não existe nenhuma especificação farmacopéica para o

desenvolvimento de metodologias analíticas na determinação de tibolona em

formulações farmacêuticas. Este trabalho pretende assim, dar uma contribuição

importante na determinação do monitoramento da qualidade do medicamento

tibolona manipulado pelas farmácias magistrais da Paraíba, bem como socializar

o trabalho realizado, informando os resultados obtidos e abrindo possibilidades de

colaboração com a AGEVISA, no sentido de que a mesma possa intervir no setor,

de forma educativa, nos casos de resultados de desvios de qualidade, a fim de

que sejam estabelecidas as ações corretivas pelos referidos estabelecimentos e

para que eles possam garantir a qualidade e eficácia dos seus produtos, trazendo

confiança e tranqüilidade para o usuário de medicamentos manipulados.

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo Geral

 Desenvolver e validar metodologias analíticas para quantificar

o medicamento tibolona em cápsulas gelatinosas duras,

manipulado pelas farmácias magistrais da Paraíba.

1.2.2 Objetivos Específicos

 Desenvolver metodologia analítica para a quantificação de tibolona

em formulações farmacêuticas;

 Avaliar diferentes estratégias de detecção para a quantificação da

tibolona por CLAE (fluorescência e ultravioleta);

 Avaliar se a uniformidade de conteúdo das cápsulas de tibolona,

adquiridas em farmácias com manipulação no Estado da Paraíba,

encontra-se dentro dos parâmetros farmacopéicos exigidos;

 Identificar os principais desvios de qualidade encontrados neste

medicamento.

CAPÍTULO II

REVISÃO DA LITERATURA

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 SITUAÇÃO ATUAL DOS MEDICAMENTOS MANIPULADOS NO BRASIL

Apesar de Anderson de Oliveira Ferreira afirmar que a suposta ausência de

um controle de qualidade mais rigoroso nas matérias-primas e produtos

acabados, bem como a ausência de controle do processo de produção ser o

maior obstáculo para o crescimento das farmácias magistrais (FERREIRA, 2002)

este segmento no Brasil teve um crescimento bastante significativo nos últimos

oito anos (2000 a 2008). Estima-se que existam na atualidade cerca de cinco mil

e quinhentas farmácias magistrais em todo Brasil (SINAMM, 2008), sendo que na

Paraíba, segundo o cadastro da AGEVISA nesse mesmo período este número

passou de cerca de dezessete para cinqüenta e cinco estabelecimentos, um

crescimento de 323%.

Todo este crescimento deveria ter sido aliado à implantação de sistemas

de garantia da qualidade, à informatização, ao emprego de novas tecnologias e

ao cumprimento das legislações sanitárias, que dentre outros fatores, são alguns

dos caminhos recomendáveis para o crescimento sustentado do setor

(FERREIRA, 2002).

De acordo com Luís Felipe Moreira Lima:

[...] prescrição de formulações magistrais é feita levando-se em conta as

características individuais do paciente e a sua patologia, daí os produtos

resultantes desta manipulação são específicos para cada caso, estando

a sua preparação limitada a poucas unidades, de acordo com as

exigências terapêuticas. Por isso, a realização dos testes de

biodisponibilidade e bioequivalência, torna-se praticamente inviável,

tanto do ponto de vista técnico quanto do ponto de vista da viabilidade

econômica [...] (LIMA et al., 1993).

Até o ano 2000 não existiam normas específicas no âmbito nacional que

regulamentassem o setor magistral, e contemplassem procedimentos

operacionais padronizados no sentido de atender às Boas Práticas de

Manipulação. Somente naquele ano, a ANVISA publicou a resolução RDC-

33/ANVISA, de 19 de abril de 2000, que aprova o regulamento técnico sobre as

Boas Práticas de Manipulação de Medicamentos em Farmácias (BRASIL,

ANVISA, 2001a). Apesar de esta resolução ter sido considerada um avanço na

regulamentação da manipulação no Brasil, ainda assim deixou algumas lacunas,

dando margem para que as farmácias pudessem manipular qualquer tipo de

medicamento, como aqueles de baixa dosagem incluindo os de baixo índice

terapêutico, sem apresentar um mecanismo de controle adequado que pudesse

garantir a qualidade dos mesmos. Também deu margem para a manipulação de

medicamentos com indicações terapêuticas diferentes daquelas registradas junto

ao órgão sanitário (ANVISA), a exemplo da clonidina, que se encontra registrado

com a única indicação de antihipertensivo e que vinha sendo prescrita e

manipulada na maioria dos casos para uso em crianças e adolescentes, com

baixa estatura, para promover o crescimento (BRASIL, ANVISA, 2003i). A

manipulação da clonidina com este desvio de indicação teve trágicas implicações,

inclusive com o óbito de uma criança de 12 anos, após fazer uso de cápsulas de

clonidina manipuladas em uma farmácia no Distrito Federal no ano de 2003, que

após análise foi constatado um teor de princípio ativo cem vezes maior do que o

declarado (BRASIL, ANVISA, 2003j).

Artigo publicado no site da ANVISA relata que os pesquisadores Gisele Ruf

da Escola Nacional de Saúde Pública (ENSP) e Francisco José Roma

Paumgartten do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS),

em palestra proferida como parte da oficina Medicamentos manipulados: Um

desafio para a Vigilância Sanitária, apresentaram dados preocupantes sobre

resultados de laudos laboratoriais de amostras de medicamentos manipulados.

A pesquisadora Gisele Ruf revelou também que entre os anos de 2000 e

2005 o INCQS recebeu amostras de medicamentos manipulados para análises,

relacionados ao relato de 51 casos de gravidade elevada com respeito ao

consumo destes medicamentos, inclusive oito sendo de óbitos, a maioria

crianças, e pelo menos 14 internações hospitalares. Gisele afirma ainda que em

todos os casos, os medicamentos apresentavam ou excesso de quantidade das

substâncias prescritas ou até mesmo algumas que não constavam na prescrição

original.

Já o pesquisador Francisco Paumgartten relatou que em 2003, foram

registrados óbitos de quatro crianças por uso inapropriado de medicamentos

manipulados contendo teores de princípios ativos acima do limite estabelecido.

Ainda segundo estes pesquisadores, em 2004 novas mortes ocorreram na Bahia

e em São Paulo. Na sua apresentação, o pesquisador mostrou alguns desvios de

qualidade mais freqüentes, como: excesso ou quantidade insuficiente de princípio

ativo; falta de análise das matérias-primas; heterogeneidade de conteúdo - com

acentuada divergência de quantidade de princípio ativo entre unidades de um

mesmo frasco (BRASIL, ANVISA, 2008d).

A ocorrência destes casos gravíssimos de desvios de qualidade, que

causaram a morte de pessoas pelo uso de medicamentos manipulados, somada a

outros resultados aonde as concentrações de princípio ativo chegavam a mais de

30.000% acima do valor nominal (BRASIL, ANVISA, 2008d), levou a ANVISA a

abrir novas discussões no âmbito nacional, através de consulta pública, sobre a

definição de novas regras, que resultaram na criação da resolução RDC 67,

publicada no Diário Oficial da União (D.O.U.), em 08 de outubro de 2007, que

dispõe sobre Boas Práticas de Manipulação de Preparações Magistrais e

Oficinais Para Uso Humano em Farmácias (BRASIL, ANVISA, 2008b). Mesmo

trazendo um aumento significativo no rigor dos parâmetros de controle de

qualidade, torna-se necessário criar outras alternativas que visem ampliar mais o

rigor das análises desses controles, no sentido de contribuir para tornar os

medicamentos manipulados cada vez mais seguros, eficazes e com qualidade.

2.2 PROCESSO DE MISTURA E HOMOGENEIDADE DE CONTEÚDO DE

CÁPSULAS

Cápsulas são preparações farmacêuticas sólidas, protegidas por um

invólucro normalmente de gelatina ou de outras substâncias adequadas,

apresentando-se em formatos e tamanhos diversos, contendo uma unidade

posológica (dose unitária) do fármaco ativo e destinadas à administração oral.

Podem ser duras ou moles dependendo da natureza do seu invólucro. Nas

farmácias com manipulação, é mais freqüente o emprego de cápsulas de gelatina

duras constituídas por dois elementos independentes perfeitamente encaixados.

São muito versáteis podendo ser preparadas extemporaneamente com uma

ampla faixa de dosagem, permitindo ao farmacêutico realizar composições e

individualizar a dose (fórmulas magistrais) de acordo com as necessidades e as

solicitações clínicas.

As vantagens da manipulação na forma de cápsulas incluem a proteção do

fármaco contra agentes externos como pó, ar e luz; elevada resistência física e

mascaramento de características organolépticas desagradáveis dos fármacos.

Por requererem um número de adjuvantes reduzido, o controle de

incompatibilidades é facilitado. Proporcionam estabilidade ao fármaco, devido ao

baixo número de componentes e à ausência de água nas etapas de sua

elaboração, permitindo a incorporação de substâncias incompatíveis. Apresentam

boa biodisponibilidade, visto que o invólucro se dissolve rapidamente no

estômago (10-20 minutos), liberando o material de enchimento (FERREIRA,

2002).

As cápsulas devem atender às exigências de variação de peso e teor de

princípios ativos descritos nas monografias. Para isso devem conter uma

quantidade determinada e uniforme das substâncias ativas, estáveis e

biodisponíveis nesta forma. É, portanto muito importante que a mistura dos

fármacos com os excipientes seja homogênea, para garantir a uniformidade de

dosagem (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988).

Um dos fatores que afetam o processo de homogeneização é a

segregação dos pós, considerado um efeito oposto a mistura, onde os

componentes tendem a separação. Esse efeito é muito importante na preparação

de produtos farmacêuticos, sendo responsável por desvios no processo de

manipulação, provocando alteração no resultado do teste de uniformidade de

conteúdo.

A segregação origina-se do fato que as misturas de pós normalmente são

constituídas de partículas que diferem no tamanho, na forma e na densidade;

assim as partículas que apresentam propriedades semelhantes unem-se umas às

outras criando na mistura regiões com concentrações maiores do que um

determinado componente da mistura.

Efeito do tamanho da partícula: A diferença de tamanho das partículas

dos componentes de uma formulação é a principal causa de segregação em

mistura de pós. As menores tendem a cair através dos espaços vazios entre as

maiores afetando a homogeneização (segregação por percolação). Por outro lado

as partículas maiores têm energia cinética maior e por isso deslocam-se a

distâncias maiores antes de chegar ao estado de repouso recaindo nas

extremidades da mistura (segregação de trajetória).

Efeito da densidade das partículas: Quando os componentes da mistura

têm densidades diferentes, as partículas mais densas deslocam-se para baixo

mesmo quando de tamanhos iguais. Neste caso, a segregação por percolação

pode ser potencializada se as partículas mais densas também forem as menores

e a segregação de trajetória pode ser aumentada para as partículas de igual

tamanho mas com densidades diferentes.

Efeito da forma das partículas: As partículas esféricas apresentam as

melhores características de fluxo sendo por isso mais fáceis de serem misturadas,

mas podem com facilidade sofrer segregação quando comparadas às não

esféricas. Já as partículas irregulares, ou de forma acicular, permitem

entrelaçamentos, reduzindo a tendência de separação depois de pronta a mistura.

Na mistura de dois pós que se encontram numa formulação em

quantidades desiguais deve-se primeiro triturar o princípio ativo com igual volume

do diluente, reduzindo-se tudo a um pó da mesma tenuidade. A operação é

repetida adicionando-se a mistura de cada vez um volume de diluente igual ao

que ela já ocupa até que todo diluente seja incorporado. Esse processo, chamado

de diluição geométrica, garante que pequenas quantidades de fármacos sejam

distribuídas uniformemente em uma mistura e é utilizado para facilitar e aumentar

a segurança e a precisão da pesagem de fármacos com baixa dosagem e difíceis

de pesar com exatidão (DIVISÃO, 2008).

As diluições geométricas normalmente empregadas dependem da faixa de

dosagem do fármaco, podendo ser de 1:10 (acima de 1mg); 1:100 (0,11 a

0,99mg) e 1:1000 (até 0,1mg), (FERREIRA, 2002).

A etapa de mistura é, provavelmente, a unidade operacional mais delicada

no processo de produção de medicamentos. Pois tem como objetivo produzir uma

mistura final com uma distribuição completamente uniforme de princípios ativos e

excipientes, suficientemente homogênea para ser subdividida em doses

individuais garantindo uma dosagem correta, assegurando que cada dose

contenha a proporção correta de cada componente. Assim, o grau de mistura é

um parâmetro importante e a homogeneidade da mistura deve ser rigorosamente

monitorada (SANCHES, 1995).

A espectroscopia no infravermelho próximo, Near Infrared Spectroscopy

(NIRS), é uma ferramenta poderosa na análise não destrutiva, qualitativa e

quantitativa para vários tipos de amostras. Nos últimos cinco anos, o uso da NIRS

aumentou significativamente sua área de aplicação nas análises farmacêuticas,

para identificação de excipientes, matéria-prima e produtos acabados; para

determinação de água em vários ingredientes; para análise de diversas

propriedades em comprimidos e para o controle do processo de fabricação (LI,

2005); (SEKULIC et al., 1998). A NIRS é um sistema de monitoramento on-line

não invasivo medido com base no desvio padrão do espectro obtido. As

informações proporcionadas por imagens químicas de NIRS de diferentes

intervalo de tempo durante todo ciclo de mistura podem ser analisadas

estatisticamente de forma a permitir avaliações quantitativas da uniformidade de

conteúdo resultante do processo de mistura (YIN, 2007).

Tradicionalmente a uniformidade em formulações farmacêuticas é

controlada pela coleta de amostras em diferentes estágios do processo, no

sentido de determinar o princípio ativo usando um método cromatográfico ou

espectroscópico (UV/VIS). Recentemente a espectroscopia de reflectância no

infravermelho próximo (NIRS) vem sendo usada para monitorar o processo de

mistura no sentido de assegurar a uniformidade de misturas constituídas por

alguns excipientes e um princípio ativo. O desempenho desse método em

comparação com outros métodos empregados rotineiramente para acompanhar o

processo de mistura e homogeneização, demonstrou ser bastante eficiente

(BLANCO, 2002).

Devido aos métodos convencionais de coleta de amostras, testes e

verificações laboratoriais, serem considerados trabalhosos por muitos fabricantes

e os resultados serem muitas vezes não reprodutíveis, este tipo de processo

analítico tecnológico (PAT), oferece uma solução que proporciona um processo

de controle on-line em tempo real sem ter que coletar amostras; assim, as

desvantagens do equipamento tradicional, tal como o erro de coleta manual pode

ser eliminado e, portanto reduzido o erro de amostragem (YIN, 2007).

Entre os ensaios a que devem submeter-se as cápsulas preparadas,

destacam-se a determinação do peso médio e a uniformidade da dose

(FERREIRA, 2002). A uniformidade das formas de dosagem (doses

unitárias/unidades posológicas) pode ser demonstrada por dois métodos:

Variação de peso e uniformidade de conteúdo.

O método de variação de peso deve ser aplicado para cápsulas somente

no caso de o teor de princípio ativo ser igual ou superior a 50,0 mg por unidade,

ou quando este compreender mais do que 50% em peso da dose unitária

(FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1988; THE UNITED STATES

PHARMACOPOEIA, 2004).

2.3 UTILIZAÇÃO DA ANÁLISE FATORIAL COMO FERRAMENTA ESTATÍSTICA

Das etapas do trabalho cientifico, a otimização de parâmetros

experimentais, talvez seja a mais crítica. A otimização desses parâmetros em

química analítica, tem sido feita tradicionalmente através da técnica univariada.

Esse tipo de tratamento estatístico que envolve um grande número de

experimentos, fornece condições que permitem um valor otimizado da resposta.

Porem, as principais desvantagens dessa técnica são o tempo gasto na

otimização individual de cada parâmetro e a falta de avaliação sobre as

interações entre as variáveis que afetam o processo em estudo, tendo como

resultado uma otimização ineficiente.

Para isto existe uma explicação muito simples. As variáveis nos sistemas

químicos se correlacionam fortemente através de mecanismos sinérgicos e

antagônicos. Caso este fato seja ignorado o processo de otimização apresenta

pouco valor.

Atualmente as técnicas que envolvem otimização multivariada são as

preferidas para aplicação em química analítica, por permitirem a otimização

simultânea de todos os fatores envolvidos no sistema com um menor número de

experimentos. Mesmo diante dessas vantagens, a utilização de forma efetiva e

crescente das técnicas multivariada na otimização de métodos analíticos, só

ocorreu nas ultimas décadas, demonstrando sua utilidade nos mais variados

campos do conhecimento. Das varias alternativas existentes, as que mais vêm se

destacando, são os sistemas de planejamento fatorial, pois permitem avaliar

simultaneamente o efeito de um grande número de variáveis a partir de certo

número de ensaios experimentais.

Este fato é corroborado pelo grande número de trabalhos encontrados na

literatura consultada, nas mais variadas áreas de estudos, que utilizam a análise

fatorial como ferramenta para o tratamento estatístico dos dados como, por

exemplo, derivatização de esteróides (APPELBLAD et al., 1997), estudos

farmacocinéticos (BEHRE, NIESCHLAG, 1992); (BURGER et al., 1998), (DAVIES,

1991); (GEHRING et al., 2005); (PITSIU et al., 2003); (SASAKI et al., 2005);

(WAJIMA et al., 2003); nível de álcool no sangue (TEPLIN; ABRAN; MICHAELS,

1989), influência dos adjuvantes e da técnica de enchimento sobre as

características de cápsulas (PETRY et al., 1998); e caracterização de misturas de

pós farmacêuticos por infravermelho próximo (MA; ANDERSON, 2008).

Porém, uma grande desvantagem dos planejamentos fatoriais é o aumento

drástico do número de experimentos que acompanha o aumento do número de

variáveis analisadas. Entretanto, o aumento do número de experimentos, sem

haver perda substancial de informações, pode ser reduzido pelo uso dos

planejamentos fatoriais fracionários. Nestes casos, com quatro ou mais fatores, os

de integração de ordem mais elevadas podem ser ignorados e somente os efeitos

principais e as interações de dois fatores são analisados (PERALTA-ZAMORA et

al., 2005).

2.4 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS

A validação de métodos para quantificação de fármacos é normatizada

pela Resolução RE nº. 899 da ANVISA, publicada no Diário Oficial da União em

29 de maio de 2003, que determina a publicação do “Guia para validação de

métodos analíticos e bioanalíticos” (BRASIL, ANVISA, 2003f).

De acordo com esta resolução, o objetivo de uma validação é demonstrar

que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação

qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias

em produtos farmacêuticos. As informações contidas neste guia se aplicam às

técnicas analíticas que façam uso de métodos cromatográficos (CG e CLAE) e

não cromatográficos.

Devem-se utilizar substâncias de referência oficializadas pela Farmacopéia

Brasileira ou, na ausência destas, por outros códigos autorizados pela legislação

vigente e no caso da inexistência dessas substâncias, será admitido o uso de

padrões de trabalho, desde que a identidade e o teor sejam devidamente

comprovados.

No caso de metodologia analítica não descrita em Farmacopéias ou em

Formulários Oficiais que consistam em ensaios quantitativos, destinados à

determinação de princípios ativos em produtos farmacêuticos ou matérias primas

devidamente reconhecidos pela ANVISA (TABELA 1), a metodologia será

considerada validada, desde que sejam avaliados os seguintes parâmetros:

Especificidade e Seletividade; Linearidade; Intervalo; Precisão; Limite de detecção

(Sensibilidade); Limite de quantificação; Exatidão e Robustez.

TABELA 1 – Classificação dos testes de validação

segundo a resolução RE nº 899/ANVISA.

CATEGORIA FINALIDADE DO TESTE

Testes quantitativos para a

determinação do principio ativo em

produtos farmacêuticos ou matérias-

primas.

Testes quantitativos ou ensaio limite

para determinação de impurezas e

produtos de degradação em produtos

farmacêuticos e matérias-primas.

III

Testes de performance (p. ex.:

dissolução e liberação de principio

ativo).

Teste de identificação.

Fonte: BRASIL,ANVISA, 2003f.

Desta forma, os ensaios analíticos regulados na RE 899, são classificados

em quatro categorias conforme a Tabela 1. Sendo que para cada categoria é

exigido um conjunto de testes de acordo com a sua finalidade (BRASIL, ANVISA,

2003f). A determinação quantitativa de tibolona em produtos farmacêuticos se

enquadra na categoria

I da Tabela 1. Assim, para validação do método foram

validados os seguintes parâmetros:

Especificidade – Este parâmetro tem a capacidade de medir exatamente

um composto em presença de outros componentes como impurezas, produtos de

degradação e componentes da matriz. Para análises quantitativas e de

impurezas, a especificidade pode ser determinada pela comparação dos

resultados obtidos de amostras contaminadas com impurezas ou excipientes e

amostras não contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste não é

afetado por esses materiais. No caso de não serem disponíveis as impurezas e os

padrões, podem-se comparar os resultados dos testes com os de um segundo

procedimento bem caracterizado (metodologia farmacopéica ou procedimento

validado), incluindo nessas comparações amostras armazenadas sob condições

de estresse, como luz, calor, umidade, hidrólise ácido-básica ou oxidação”

(BRASIL, ANVISA, 2003f).

Linearidade – Determina a capacidade de uma metodologia analítica

demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à

concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo estabelecido. É

determinada pelo coeficiente de correlação (r), obtido a partir do gráfico que

relaciona à resposta cromatográfica em função das várias concentrações do

analito ensaiadas através de métodos estatísticos apropriados utilizando o

coeficiente angular, e a soma dos quadrados mínimos da regressão linear. Sendo

adotado como critério mínimo aceitável para (r) um valor maior ou igual a 0,99

(BRASIL, ANVISA, 2003f).

Intervalo – É derivado do estudo da linearidade e depende da aplicação

pretendida do método. É estabelecido através da confirmação de que o método

apresenta exatidão, precisão e linearidade adequadas, quando aplicados a

amostras contendo quantidades de substâncias dentro do intervalo especificado.

É considerada com sendo a faixa entre os limites de quantificação superior e

inferior de um método analítico (BRASIL, ANVISA, 2003f).

Precisão – É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma

serie de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. É

considerada em três níveis: Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial),

precisão intermediaria (precisão inter-corrida) e repetibilidade (precisão intra-

corrida):

A repetibilidade ou precisão intra-corrida é estabelecida pela avaliação da

concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o

mesmo analista e a mesma instrumentação. A repetibilidade do método é

verificada com, no mínimo nove determinações, contemplando o intervalo linear

do método, ou seja, três concentrações (baixa, média e alta), com três réplicas

cada ou o mínimo de seis determinações a 100% da concentração do teste.

A precisão de um método analítico pode ser expressa como o desvio

padrão ou o desvio padrão relativo - DPR (coeficiente de variação – CV%) de uma

serie de medidas segundo a formula:

x100

CMD

DPR 

Onde: DP é o desvio padrão e CMD a concentração média determinada.

O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia

empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade

do método, não se admitindo valores superiores a 5% (BRASIL, ANVISA, 2003f).

Exatidão – Mede a proximidade dos resultados obtidos pelo método em

estudo, em relação ao valor verdadeiro. Deve ser determinada após o

estabelecimento da linearidade, do intervalo e da especificidade do mesmo,

sendo verificada a partir de, no mínimo nove determinações contemplando o

intervalo linear, ou seja; três concentrações, uma baixa, uma média e uma alta

com quatro réplicas cada. (BRASIL, ANVISA, 2003f).

Robustez – É a medida da capacidade do método em resistir a pequenas

e deliberadas variações dos parâmetros analíticos, indicando a confiança do

método no seu uso normal. Constatando-se susceptibilidade à variações nas

condições analíticas; estas devem ser controladas e as precauções necessárias

incluídas no procedimento (BRASIL, ANVISA, 2003f).

Os fatores que devem ser considerados na determinação da robustez são:

Preparo da amostra, espectrofotometria e cromatografia líquida. Com relação a

cromatografia líquida um dos parâmetros que pode ser avaliado entre outros, é

variação da composição da fase móvel.

2.5 CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS E FARMACOLÓGICAS DA

TIBOLONA.

Não foi encontrada monografia oficial da tibolona em nenhuma farmacopéia

e nem em outros compêndios oficiais.

2.5.1 Características químicas

A Tibolona (Figura 1) é um 3-cetoesteróide sintético de fórmula molecular

, peso molecular 312.45 g/mol registrada no Chemical Abstracts sob o

número CAS 5630-53-5 com a denominação química (7α, 17α)-17-Hidroxi-7-metil-

19-norpreg-5(10)-en-20-in-3-ona (BUDAVARI, S., 1996), também conhecida como

7-metil-noretinodrel (ZUO et al., 2005). É comercialmente disponível como Livial



(Organon), Libian



(Libbs), Reduclim



(FQM), Tibial



(Neoquímica). Apresenta-se

como um pó cristalino de coloração branca ou esbranquiçada, estável sob as

condições usuais, ponto de fusão 163 ~ 169 ºC, rotação ótica +103° ~ +130°,

praticamente insolúvel em água e solúvel em clorofórmio e metanol (BUDAVARI,

1996).

CC H

FIGURA 1 – Estrutura química da tibolona.

2.5.2 Ação farmacológica

Apresenta propriedades androgênicas, estrogênicas e progestagênicas

fracas, que mimetizam a atividade do estrogênio e da progesterona, sendo

utilizado para aliviar os sintomas decorrentes da menopausa.

A tibolona possui três metabólitos primários: 3α e 3β-hidroxitibolona e o

isômero Δ

-tibolona, com grande especificidade tecidual. A conversão da tibolona

em seus metabólitos é rápida e quase completa, ocorrendo principalmente no

fígado e intestinos, produzindo o metabólito Δ-4 e principalmente os metabólitos

3α e 3β-hidroxi. O nível do metabólito 3α é três vezes maior que o do 3 β-hidroxi,

enquanto o da tibolona e do metabólito Δ-4 é muito baixo (TABELA 2). Após a

tibolona ser metabolizada, os metabólitos têm efeito muito fraco sobre as enzimas

do citocromo P450 e são rapidamente sulfatados e mais de 75 % circulam como

sulfatos que são ativados pelas sulfatases teciduais. (SPEROFF; CLARKSON,

2003

CC H

TIBOLONA

CC H



- tibolona

(Progestagënico e Adrogënico)

CC H

3 - hidroxi-tibolona

(Estrogënico)

3 - hidroxi-tibolona

(Estrogënico)

CC H

FIGURA 2 – Principais metabólitos da tibolona.

Estes metabólitos têm afinidades por receptores diferentes: 3α e 3β-

hidroxitibolona ligam-se a receptores de estrógeno, induzindo respostas

semelhantes às do esteróide natural, enquanto que o isômero Δ

tem elevada

afinidade por receptores de progesterona e andrógenos (BLOOM et al., 2006);

(VERHEUL et al., 2007b).

TABELA 2 – Afinidade da tibolona e seus metabólitos por receptores de

esteróides sexuais.

Fonte: SPEROFF; CLARKSON, 2003

2.5.3 Indicações

Utilizada na terapia de reposição hormonal para o tratamento dos sintomas

da menopausa e pós-menopausa e como profilaxia contra o desenvolvimento de

osteoporose (ALBERTAZZI; DI MICCO; ZANARDI, 1998).

2.5.4 Apresentações e Dosagens

A tibolona 2,5 mg, com o nome de Livial, é comercializada no Brasil pela

Organon, na forma de comprimidos.

É manipulada na forma cápsula. As doses

normalmente utilizadas na terapia de reposição hormonal são de 1,25mg a 2,5

mg/dia.

2.5.5 Farmacocinética da Tibolona

Após a administração oral, a tibolona é rápida e extensamente absorvida.

Por isso os níveis plasmáticos de tibolona e dos seus metabólitos (isômeros Δ

3α e 3β hidróxi) também são baixos, sendo que os níveis dos isômeros 3α e 3β

hidróxi, são mais elevados, porém não ocorre acumulação. O consumo de

Tibolona e

metabólitos

Receptores

estrogênicos

Receptores

progestagênicos

Receptores

androgênicos

Tibolona

1.3% 4.9% 3.2%

Metabólito 3 -OH

3.2% — —

Metabólito 3ß-OH

1.7% — —

Isômero

- 4

— 12.9% 39.2%

alimentos não tem efeitos significativos sobre o grau de absorção. Sua excreção

se dá principalmente na forma de metabólitos conjugados (principalmente

sulfatados); e embora uma parte da quantidade administrada seja excretada na

urina, a maioria é eliminada pelas fezes (VERHEUL et al., 2007a); (VERHEUL et

al., 2007b).

2.6 TIBOLONA E MÉTODOS PARA SUA DETECÇÃO

A estrutura da Tibolona não possui grupos funcionais cromofóricos

suficientemente estendidos, sendo por isso freqüentemente quantificada por

espectrometria de massas. Não há metodologias de análise para a tibolona

descritas na literatura, nem métodos oficiais farmacopéicos e não farmacopéicos

para quantificação deste fármaco em formulações farmacêuticas; embora existam

métodos para estudos de farmacocinética (ZUO et al., 2005).

A Tabela 3 na pagina seguinte, mostra os métodos descritos na literatura

para quantificação da tibolona e seus metabólitos no plasma, na urina, fezes e

tecidos, bem como os meios de detecção utilizados em estudos farmacocinéticos.

É fácil perceber que a detecção para quantificação da tibolona e seus metabólitos,

é feita exclusivamente pelo método de espectrometria de massas. Esse método é

considerado bastante oneroso, por isso não está disponível para uso de rotina na

maioria dos laboratórios analíticos.

Esses fatos sinalizam para a necessidade de se investigar outras

metodologias de quantificação deste fármaco desenvolvendo métodos de

quantificação com detecção por UV ou estratégia de derivatização que permitam

a produção de um derivado detectável por fluorescência, uma técnica

extremamente seletiva e sensível, que encontrará utilidade tanto no controle da

qualidade de medicamentos a base de tibolona, quanto para detecção desta em

fluidos biológicos, como por exemplo, em estudos de

biodisponibilidade/bioequivalência e quando da ocorrência de intoxicações.

A reação de derivatização de vários esteróides com função carbonila pela

dansilhidrazina usando ácido trifluorometanosulfônico como catalisador já foi

descrita (APPELBLAD et al., 1997). O método descrito por Appelblad apresentou

algumas limitações, sendo as mais importantes: (a) a necessidade de uma coluna

de concentração para a separação cromatográfica da hidrazona formada e (b) a

formação de hidrazonas diastereoisoméricas

syn e anti com alguns dos

esteróides investigados.

TABELA 3 – Métodos de detecção para quantificação da tibolona em estudos

farmacocinéticos.

Método de

extração

Método de

detecção

Matriz

Limite de detecção/

quantificação

Referência

Líquido-

líquido

CG – EM Plasma

0,10-0,94 ng/mL

(tibolona)

0,10-0,73 ng/mL (Isom. Δ

)

0,1 ng/mL

(isom. 3α, e 3β hidroxi)

(Quantif.)

TIMMER;

DOORSTAM,

2002

Líquido-

líquido

Fase-sólida

CG – EM

Derivatização

Plasma

0,1 ng/mL (tibolona, isom.

, 3α e 3β hidroxi)

(Quantifi.)

TIMMER;

VERHEUL;

DOORSTAM,

2002

Fase-sólida

CG – EM

CL – EM/EM

Tecidos

(cérebro, fígado

e coração)

0,1 ng/mL (metab. tibolona)

0,25 ng/mL (tibolona e

metab. sulfatados)

(Quantifi.)

VERHEUL;

KLOOSTERBOER,

2006

Fase-sólida

CG – EM

CL – EM/EM

Derivatização

Plasma, urina,

bile e fezes

0,1-0,5 ng/mL

(plasma e urina)

0,5-2,0ng/g

(fezes e bile) (Detecção)

VERHEUL, et al.,

2007 b

Fase-sólida

Líquido-

líquido

CG – EM

CL – EM

Plasma e tecidos

(cérebro, vagina,

útero e mama)

0,1-0,5 ng/mL

(plasma)

0,5-2,0 ng/g

(tecidos) (Detecção)

VERHEUL, et al.,

2007 a

Líquido-

líquido

CG – EM

CG – EMAR

Derivatização

Plasma

0,02ng/mL/mL

(Quantifi.)

SON, 2006

Líquido-

líquido

CL – EM

Derivatização

Plasma

100 ng/mL

(Quantifi.)

ZUO et al., 2005b

Deste modo, a derivatização da tibolona, utilizando dansilhidrazina,

produzindo a hidrazona correspondente (FIGURA 3) e permitindo assim sua

detecção por fluorescência, parece vantajosa e perfeitamente viável.

CCH

Dansilhidrazina

Tibolona

Aduto (derivado fluorescente)

FIGURA 3 – Reação de derivatização da tibolona com dansilhidrazina.

Tomando como ponto de partida o trabalho de Appelblad e colaboradores,

resolveu-se investigar a reação de derivatização da tibolona com dansilhidrazina

(FIGURA 4), como estratégia para sua detecção por fluorescência. Foi assim

utilizada uma ferramenta de desenho fatorial (com o software Modde, v. 4,0) para

otimizar as condições de reação (temperatura, tempo de reação e razão molar

entre a tibolona e a dansilhidrazina) de modo a alcançar o melhor rendimento.

CAPÍTULO III

QUANTIFICAÇÃO DA TIBOLONA POR

DERIVATIZAÇÃO COM DETECÇÃO POR

FLUORESCÊNCIA

3 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO

3.1 MATERIAIS

Padrões e Reagentes

A tibolona padrão, foi gentilmente cedida pelo laboratório Organon USA,

lote LZ 0655K1. Foram usadas também, água purificada através de um sistema

Milli-Q; Acetonitrila (TEDIA - USA); Metanol (MERCK - Alemanha);

Dansilhidrazina – 5-[dimetilamino]-1-naftalenosulfônil-hidrazina (Sigma-Aldrich -

EUA), Ácido trifuorometanosulfônico (Sigma-Aldrich - EUA), e ainda; Acetato de

amônio. Os solventes eram em grau HPLC.

Equipamentos

Cromatógrafo líquido constituído de um sistema de gradiente de baixa

pressão, equipado com os seguintes módulos: Forno de coluna (CTO - 10AS);

degaseificador (DGU - 14A); detector de fluorescência (RF - 10A); módulo

controlador (SCL-10A); bomba (LC - 10 AD) com válvula solenóide (FCV - 10AL),

todos de marca (SHIMADZU – Tóquio – Japão); e um injetor manual provido

com um loop de amostra de 20 μL (Rheodyne).

3.2 METODOLOGIA

A derivatização da tibolona foi realizada com dansilhidrazina usando ácido

trifluorometanosulfônico como catalisador como sugerido por Appelblad (1977).

Soluções estoque de tibolona e dansilhidrazina (1mg/mL) foram preparadas em

metanol e armazenadas em freezer, mantendo-se estáveis durante todo o período

de armazenamento. As diluições foram realizadas com o mesmo solvente para

obter as concentrações finais necessárias para cada experimento. A

concentração do catalisador variou de 3 a 7 %, uma vez que os dados da

literatura (APPELBLAD et al., 1997) mostram que este parâmetro não influencia

significativamente o rendimento da reação, tendo sido por isso fixada em 3% para

os experimentos finais. As reações foram realizadas usando frascos de vidro de

2mL de capacidade e um termobloco para aquecimento.

Para otimização do método, um desenho fatorial fracionário experimental

foi implementado usando o programa Modde v.4.0 (Umetrix) a fim de investigar os

efeitos da Razão molar de dansilhidrazina para Tibolona (20 a 50) a temperatura

de reação (37 a 50 ºC) e o tempo de reação (17 a 30 minutos), no rendimento da

reação de derivatização. Regressão Linear Multivariada foi usada para avaliar os

efeitos de cada parâmetro e suas combinações no rendimento da reação. Depois

de fixar os limites para cada uma das variáveis a serem investigadas, o programa

sugeriu um total de 11 experimentos, variando cada um dos três parâmetros

investigados (TABELA 4). A área do derivado fluorescente nos cromatogramas

obtidos em cada um dos 11 experimentos foi calculada e alimentou o programa

como rendimento a ser otimizado.

TABELA 4 – Parâmetros experimentais sugeridos pelo desenho

fatorial fracionário usando um programa Modde v.4.0 (Umetrix)

para derivatização da Tibolona.

(*) Razão molar de dansilhidrazina para 1 mol de Tibolona

(**) Área do pico da Tibolona (/100.000).

As amostras derivatizadas foram previamente diluídas (1:1) com tampão

fosfato 1M, pH 7.0, para neutralizar o excesso de ácido e diretamente injetadas

em duplicata no cromatógrafo e então cromatografadas usando uma coluna

monolítica (Merck Chromolith comprimento de 100 mm x 4.6 mm DI) com uma

pressão de 117 ± 3 Kgf/cm

, com fluxo de 3 mL/min e um volume de injeção de 20

μ L, utilizando-se como fase móvel, um tampão acetato de amônio 50mM, pH 6.8

Nº de

Experimentos

Razão

Molar (*)

Temperatura

(ºC)

Tempo

(min.)

Ordem

1 20 37 17,0 7

2 50 37 17,0 8

3 20 50 17,0 1

4 50 50 17,0 11

5 20 37 30,0 6

6 50 37 30,0 4

7 20 50 30,0 9

8 50 50 30,0 5

9 35 35 23,5 3

10 35 35 23,5 10

11 35 35 23,5 2

e acetonitrila (92,5:7,5 v/v). O detector de fluorescência foi configurado para usar

um comprimento de onda de excitação de 320 nm e de 520 nm para emissão.

3.3 RESULTADOS e DISCUSSÃO

No sentido de confirmar se a estratégia de derivatização para a tibolona

seria uma metodologia eficiente para sua quantificação, foram tomados como

base os resultados obtidos anteriormente por Appleblad (1997), que estudou o

uso de ácido trifluorometanosulfônico como catalisador na reação de

derivatização de vários esteróides com dansilhidrazina, adotando a razão molar

de 50:1, entre o reagente derivatizante e a tibolona, como a melhor proporção.

Appelblad (1997) e seus colaboradores demonstraram que a concentração

do catalisador não é um fator importante na determinação do rendimento desta

reação, porém no presente trabalho a concentração de ácido mostrou ser

fundamental para um tempo de retenção adequado do derivado fluorescente

formado. Por isso, os experimentos foram conduzidos com uma concentração do

ácido fixada em 3%, uma vez que concentrações mais altas causaram uma queda

crucial no tempo de retenção tendo o pico do derivado, nessas concentrações,

eluído no volume morto da coluna (FIGURA 4).

FIGURA 4 – Cromatograma da reação de derivatização mostrando a eluição do pico

da tibolona no volume morto quando usada concentrações do ácido, maiores que 3%.

Detector: Ex: 350 nm; Em: 520 nm

Tempo: 18,0032 min

Amplitude: 0,909 mAU

Não foi observada variação no tempo de retenção com a mudança na

proporção do solvente orgânico, indicando provavelmente que o derivado

encontrava-se totalmente ionizado pelo excesso de ácido do meio reacional.

O uso de um desenho fatorial fracionário permitiu uma investigação

sistemática dos parâmetros de reação sobre o rendimento da derivatização como

pode ser observado na Tabela 5 abaixo.

TABELA 5 – Rendimentos previstos para derivatização da tibolona nas condições

experimentais sugeridas pelo desenho fatorial fracionário usando um programa Modde

v.4.0 (Umetrix).

(*) Razão molar de dansilhidrazina para 1 mol de Tibolona

(**) Área do pico da Tibolona (/100.000).

O gráfico 1 mostra os resultados do modelamento dos dados da reação de

derivatização da tibolona por Análise de Regressão Linear Multivariada, onde no

eixo das abscissas encontram-se os valores do rendimento observado, e nos

eixos das ordenadas encontram-se os valores do rendimento previsto, oriundos

dos dados da tabela 5. De acordo com os resultados, é possível notar que houve

uma proximidade muito grande entre os valores previstos e os valores

observados, e um coeficiente de correlação linear R

= 0,9856. Estes resultados

demonstram uma excelente previsibilidade do modelo.

Nº de

Experimentos

Razão

Molar (*)

Temperatura

(ºC)

Tempo

(min.)

Ordem

Rendimento

(**)

1 20 37 17,0 7 8,15

2 50 37 17,0 8 53,5

3 20 50 17,0 1 38,1

4 50 50 17,0 11 57,5

5 20 37 30,0 6 20,1

6 50 37 30,0 4 26,2

7 20 50 30,0 9 56,5

8 50 50 30,0 5 40,2

9 35 35 23,5 3 45,6

10 35 35 23,5 10 45,6

11 35 35 23,5 2 45,6

N = 11 R

= 0.9856

GRÁFICO 1 – Modelamento dos dados da reação de derivatização de

tibolona por regressão linear multivariada (RLM) mostrando os valores de

rendimento previstos versus observados.

O Gráfico 2 mostra o efeito das interações dos parâmetros investigados

sobre o rendimento da reação de derivatização. De acordo com o gráfico, a razão

molar (RM) e a temperatura (Te) influenciaram de forma relevante quando

MR*MR

MR*Te

MR*TI

-15

-10

-5

Área

N = 11 R

= 0.9856

GRÁFICO 2 – Efeito das interações dos parâmetros de reação investigados sobre o

rendimento da reação de derivatização.

PREVISTO

OBSERVADO

consideradas de forma isolada, apresentando um efeito positivo. Porém, as

interações entre razão molar/razão molar (RM*RM); razão molar/temperatura

(RM*Te) e razão molar/tempo de reação (RM*TR) mostraram efeitos negativos,

em relação ao rendimento da reação.

(a) (b)

GRÁFICO 3 a e b – Mapas de resposta de superfície mostrando os efeitos da razão

molar dansilhidrazina:tibolona, e tempo de reação (a) e temperatura (b), sobre o

rendimento da reação de derivatização.

O Gráfico 3 (a) e (b) mostra que os fatores mais relevantes no rendimento

da reação de derivatização foram à razão molar e a temperatura da reação (b),

concordando com os dados apresentados por Appelblad (1997) para os outros

esteróides. Uma razão molar de 40, um tempo de reação de 20 minutos e uma

temperatura de 48 ºC mostraram-se ideais.

A duração da reação também provou ser um fator importante, tendo em

vista que tempos de reação maiores que 20 minutos conduziram claramente a um

baixo rendimento.

Progesterona

FIGURA 5 – Cromatograma mostrando picos duplos obtidos para hidrazonas syn e

anti quando uma solução de progesterona padrão a 400 μM foi derivatizada com

dansilhidrazina.

Fonte: APPELBLAD et al., 1997, p. 4910.

Vale a pena notar aqui, como pode ser observado na figura 6 na página

seguinte que a reação da dansilhidrazina com tibolona não parece formar as

hidrazonas sin e anti-diastereoisoméricas que foram relatadas por Appelblad e

colaboradores (1997) para outros esteróides. (FIGURA 5).

Já que a tibolona não apresenta carbonila α-insaturada, provavelmente

seja essa a causa da formação de apenas uma única hidrazona. Isto é muito

vantajoso para os propósitos de quantificação, desde que apenas um único pico é

integrado em vez de ter que usar a soma de dois picos diastereisomericamente

integrados.

Tem

o de Reten

ão

(

min

)

syn

anti

Aduto (derivado fluorescente)

CCH

Syn e anti ?

FIGURA 6 – Formação de hidrazonas syn e anti diastereoisoméricas.

Este aspecto da reação precisa de confirmação através de técnicas de

espectroscópicas e espectrométricas; embora cálculos de computador já tenham

sugerido diferenças na estereoquímica da carbonila que poderiam explicar as

diferenças de regioseletividade observadas entre progesterona e tibolona na

reação com a dansilhidrazina.

FIGURA 7 – Cromatograma representativo da separação do derivado fluorescente

obtido a partir de uma solução de tibolona a 3 μg/mL, (TR = 6,69 min.).

Detector: Ex: 320 nm; Em: 520 nm

Tempo: 10,9905 min

Amplitude: 0,081 mAU

Minutos

mAU

Nas condições cromatográficas estabelecidas na metodologia desenvolvida

(TABELA 6), o tempo de corrida pôde ser reduzido de 20 para 11 minutos

permitindo ao derivado fluorescente da tibolona, o pico de interesse, eluir num

tempo de retenção de 6,69 ± 0,2 min, (FIGURA 7) usando uma fase móvel com

7,5% de acetonitrila, sendo sua absorção proporcional ao aumento da

concentração do analito.

TABELA 6 – Condições cromatográficas desenvolvidas para quantificação da tibolona

por derivatização com detecção por fluorescência.

Foi possível realizar a reação de derivatização da tibolona usando

condições moderadas, com rendimento quase quantitativo. Este método pode ser

ainda modificado para se obter tempos de retenção ainda mais curtos usando, por

exemplo, uma proporção mais alta do solvente orgânico na fase móvel e assim,

CARACTERÍSTICAS

DESCRIÇÃO

 Cromatógrafo

¾ Shimadzu Série 10A vp configurado com os seguintes

módulos:

Forno (CTO – 10 AS vp), Bomba (LC – 10 AD vp) com

válvula solenóide, Degaseificador (DGU 14 A vp), Interface

(SCL 10A vp),

 Detector

¾ Florescência (RF – 10 A). Regulado para ex=350 nm;

em=520 nm.

 Coluna

¾ Monolítica, Merck Chromolith (performance 100 mm x

4.6 mm ID).

 Injetor

¾ Manual.

 Volume de injeção

¾ 20 μL.

 Fase móvel

¾ Solvente orgânico (acetonitrila) 7,5% com 92,5% de

tampão acetato de amônio 50 mM e pH = 6,8.

 Tipo de eluição

¾ Isocrática

 Vazão de fluxo

¾ 3 mL/min.

 Temperatura

¾ 40 ºC

diminuir o tempo de análise. Tomando os resultados em conjunto, pode-se

concluir que o método demonstra ser bastante eficiente para quantificação da

tibolona, necessitando para isso ser devidamente validado.

Apesar das vantagens da detecção por fluorescência, em especial a

seletividade e sensibilidade, a necessidade de derivatização pré-coluna e o uso

de um ácido forte como o ácido trifluorometanosulfônico, são inconvenientes

relevantes para aplicação de rotina do método. Por isso resolveu-se avaliar a

possibilidade de desenvolver um método com detecção por ultravioleta para a

quantificação do esteróide.

CAPÍTULO IV

QUANTIFICAÇÃO DA TIBOLONA POR

DETECÇÃO DIRETA NO UV

4 DESENVOLVIMENTO, VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DO MÉTODO

4.1 MATERIAIS

Padrões e Reagentes

A tibolona padrão, foi cedida pelo laboratório Organon USA, lote LZ

0655K1. Foram usados também, água purificada através de um sistema Milli-Q;

Acetonitrila (TEDIA - USA); Metanol (MERCK - Alemanha). Os solventes eram em

grau HPLC.

Equipamentos

 Cromatógrafo líquido (SHIMADZU - Japão), Série 10A vp, com os

módulos: Forno de coluna (CTO - 10AS); degaseificador (DGU - 14h); detector

UV/Vis (SPD - 10AV); módulo controlador (SCL - 10A); bomba (LC - 10AD) com

válvula solenóide (FCV - 10AL); e auto-injetor (SIL - 10AD).

 Cromatógrafo líquido (SHIMADZU - Japão), série 10A vp. Com os

módulos: Forno de coluna (CTO - 10A); degaseificador (DGU - 14A); detector com

arranjo de diodos (SPD - M10A); módulo controlador (SCL - 10A); bomba (LC -

10AD); e Injetor manual provido com um loop de amostra de 20 μL (Rheodyne).

 Espectrofotômetro UV-Vis (VARIAN), modelo Cary 50.

 Balança analítica (SHIMADZU – Japão), modelo AW 220 (Carga

Máxima: 220g, d = 0,1mg).

 Sistema Milli-Q Ultra-Pure Water (MILLIPORE – EUA).

PARTE I

4.2 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO

4.2.1 Metodologia

Como já descrito anteriormente, o único método descrito na literatura para

quantificação da tibolona (Zuo et al., 2005), utiliza espectrometria de massas, uma

técnica relativamente cara e especializada, fora do alcance de muitos laboratórios

de controle da qualidade. O desenvolvimento de uma metodologia de análise com

detecção no ultravioleta é importante, pois possibilitará o controle deste

medicamento por laboratórios que não dispõem de equipamentos de

espectrometria de massas.

Inicialmente, o padrão de tibolona foi preparado como uma solução

estoque a 1 mg/mL em uma mistura de metanol/água (70:30) que foi armazenada

sob refrigeração. No sentido de otimizar a concentração ideal para obtenção de

uma boa área de pico cromatográfico para a tibolona, confirmou-se o λ

max

obtendo-se experimentalmente seu espectro no UV, utilizando um

espectrofotômetro para a faixa do UV-Vis, e ensaiando soluções do analito nas

concentrações de 0.100 mg/mL, 0,050 mg/mL, e 0,025 mg/mL em metanol,

obtidas a partir da solução estoque.

A RE-899/ANVISA recomenda que a linearidade das curvas de calibração

para desenvolvimento de métodos analíticos seja determinada com um intervalo

de, no mínimo, cinco concentrações diferentes do analito a ser testado (BRASIL,

ANVISA, 2003f). Desta forma foi estabelecido um intervalo de oito concentrações

tomando como base a dosagem de 2,5 mg das cápsulas de tibolona manipuladas.

Baseado nesta dosagem (2,5 mg) fez-se uma diluição da solução estoque de

tibolona (1 mg/mL) com acetonitrila:H

O para obter uma solução de concentração

de 0,05 mg/mL a partir da qual estabeleceu-se um intervalo de concentrações de:

0,001; 0,005; 0,010; 0,025; 0,050; 0,100; 0,200 e 0,500 mg/mL diluindo-se esta

solução com o mesmo solvente de formas a contemplar o intervalo de 80-120%

da concentração teórica, conforme a RE 899/2003 (BRASIL, ANVISA, 2003f).

Para o desenvolvimento da curva de calibração foi empregada a técnica

cromatográfica de CLAE e como a tibolona dispõe de um cromóforo detectável

(λ

max

207 nm), foi possível desenvolver o método baseado na detecção por UV,

tendo em vista que os detectores de UV de comprimento de onda variável são

considerados convenientes e aplicáveis (SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997).

A fim de conseguir uma melhor separação do pico cromatográfico da

tibolona para o desenvolvimento do método foi escolhida a acetonitrila como

solvente orgânico para a fase móvel e a proporção ideal, acetonitrila:água,

Inicialmente foi testada, através de uma corrida cromatográfica em módulo

isocrático, com 90%, 50% e 70% de ACN. Conseguindo-se a melhor separação

com maior pureza do pico da tibolona, com 70% de acetonitrila.

Sendo assim o método foi desenvolvido com a fase móvel acetonitrila:

água (70:30) na forma de eluição isocrática, através de uma coluna Phenomenex

de aço inox com 25 cm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e

tamanho de partícula de 5 μm, equipada com uma pré-coluna de 5 cm de

comprimento, com as mesmas especificações, com fluxo de 1 mL/min e utilizando

um detector UV regulado para 207 nm.

O desenvolvimento foi operacionalizado em duplicata e a curva de

calibração foi construída plotando-se os valores médios das áreas dos picos

cromatográficos obtidos em função das concentrações ensaiadas.

4.2.2 Resultados e Discussão

Espectro UV da Tibolona

A figura abaixo mostra o espectro da tibolona na concentração de 0,1

mg/mL, considerada ideal por produzir o melhor espectro com os máximos de 207

e 241 nm sendo o λ

max

207 nm, com um ε

max

perfeitamente observável.

FIGURA 8 – Espectro UV da Tibolona na faixa de 190 a 600 nm na concentração

de 0,1 mg/mL em solução de metanol/água (70:30).

A acetonitrila foi escolhida por ser considerada a melhor alternativa para

escolha inicial de solvente para fase móvel em HPLC de fase reversa (SNYDER;

KIRKLAND; GLAJCH, 1997). Misturas de acetonitrila/água são recomendadas

quando se trabalha com detecção por UV em comprimentos de onda baixo (185 a

210nm), como é o caso da tibolona (207nm). Estas misturas têm viscosidades

muito baixas, resultando em número de pratos um pouco maiores e pressões

menores na coluna, fatores estes bastante vantajosos para separação. (SNYDER;

KIRKLAND; GLAJCH, 1997).

Minutes

5 10 15 20 25 30 35

100

200

300

100

200

300

FIGURA 9 – Cromatograma da tibolona com ACN/H

O (90:10).

A corrida cromatográfica utilizando 90% de ACN (FIGURA 9) não se

mostrou satisfatória, porque o tempo de retenção foi muito baixo (4,34min) e

próximo do tempo morto da coluna, devido à alta força eluotrópica da mistura.

4,34 min

Minutos

200 nm 400 nm 600 nm

Comprimento de onda

Este efeito pode levar a sobreposição do pico da tibolona com outros

componentes, como produtos de degradação ou impurezas.

Minutes

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

100

200

100

200

FIGURA 10 – Cromatograma da tibolona com ACN/H

O (50:50).

Já o 2º cromatograma obtido com 50% de ACN (FIGURA 10), exibiu um

tempo de retenção relativamente alto (12,44 min), e a resolução entre o pico da

tibolona e o pico adjacente ainda permite uma alteração no sistema eluente para

uma concentração intermediaria com 70% de acetonitrila.

Minutes

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

100

200

100

200

FIGURA 11 – Cromatograma tibolona com ACN/H

O (70:30).

O desenvolvimento com 70% de ACN (FIGURA 11), revelou-se ideal,

apresentando uma ótima resolução entre a tibolona e o pico adjacente, alem de

fornecer um tempo de corrida pequeno (6,74 min) que é também outro fator

importante para quantificação de amostras.

Minutos

TR = 12,44 min

Minutos

TR = 6,74 min

TABELA 7 – Condições cromatográficas desenvolvidas para quantificação da tibolona por

detecção direta com UV.

CARACTERÍSTICAS

DESCRIÇÃO

 Cromatógrafo líquido

¾ Shimadzu Série 10A vp,, configurado com os seguintes

módulos:

Forno de coluna (CTO - 10AS); degaseificador (DGU – 14A);

interface controladora (SCL - 10A); bomba (LC - 10AD) com

válvula solenóide (FCV - 10AL).

Forno de coluna (CTO - 10AS); degaseificador (DGU - 14A);

interface controladora (SCL - 10A); bomba (LC - 10AD);

 Detector

¾ UV/Vis (SPD - 10AV) regulado para 207nm.

¾ DAD (SPD - M10A).

 Coluna

¾ C

Phenomenex de aço inox (performance 250 mm X

4,6 mm DI, tamanho de partícula de 5 μm) equipada

com pré-coluna (5 cm de comprimento), nas mesmas

especificações.

 Injetor

¾ Automático (SIL - 10AD).

¾ Manual, provido com um loop de amostra de 20 μL

(Rheodyne).

 Volume de injeção

¾ 20 L

 Fase móvel

¾ Acetonitrila/água (70:30).

 Tipo de eluição

¾ Isocrática.

 Vazão de fluxo

¾ 1 mL/min.

 Temperatura

¾ 40 ºC

PARTE II

4.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO

4 .3.1 Metodologia

A validação do método proposto foi realizada por meio da avaliação dos

parâmetros de especificidade e seletividade, linearidade

, intervalo, precisão e

robustez para o método cromatográfico desenvolvido.

Especificidade e seletividade

A especificidade foi determinada diluindo-se a solução estoque de tibolona

padrão com metanol para a concentração final de 0,025 mg/mL. Esta solução foi

filtrada e submetida à ultrasom por vinte minutos para homogeneização e parte

dela, transferida quantitativamente para um tubo de Eppendorf, sendo submetida

à degradação térmica, em termobloco, a uma temperatura de 120ºC por trinta

minutos. Após resfriamento, foi injetada diretamente em um cromatógrafo líquido

CLAE-DAD/UV-Vis regulado para um λ

max

de 207 nm nas mesmas condições

cromatográficas estabelecidas anteriormente no desenvolvimento do método

(Tabela 6), em duas repetições para cada amostra analisada. Para avaliar a

especificidade do método foi também cromatografada uma amostra da solução

não degradada (branco), nas mesmas condições.

Linearidade

Para a determinação da linearidade, repetiu-se a curva de calibração

previamente construída, em três dias consecutivos, partindo-se de diluições da

solução estoque da Tibolona padrão com acetonitrila/água (70:30) dentro da faixa

de concentrações (0,001; 0,005; 0,010; 0,025; 0,050; 0,100; 0,200 e 0,500

mg/mL), e cromatografadas nas condições já estabelecidas no desenvolvimento

do método.

As curvas obtidas em cada dia tiveram seus coeficientes de correlação

calculados através da equação da reta, pelo método dos mínimos quadrados e

avaliados dentro dos critérios mínimos de aceitação (R

≥ 0,99) da RE 899

(BRASIL, ANVISA, 2003f). A análise estatística dos dados das curvas obtidas em

dias consecutivos foi realizada utilizando-se análise de variância (ANOVA) e teste

de Tukey a um nível de significância de 95%, utilizando-se o software GraphPad

Prism 4.0.

Precisão (Repetibilidade intra-dia)

Após preparar a curva de calibração anteriormente desenvolvida com as

oito concentrações da solução de tibolona padrão estabelecidas (0,001; 0,005;

0,010; 0,025; 0,050; 0,100; 0,200 e 0,500 mg/mL) e constatada sua linearidade,

repetibilidade

intra-dia foi verificada utilizando-se três concentrações baixa,

média e alta, 0,025; 0,100 e 0,500 mg/mL respectivamente. As soluções nessas

concentrações foram obtidas a partir da solução estoque de tibolona por diluição

com acetonitrila/água (70:30) e cromatografadas em CL/UV, em quatro réplicas

para cada concentração, perfazendo um total de 12 determinações. O ensaio foi

repetido em três dias consecutivos.

Com a obtenção da curva de calibração, efetuou-se a regressão linear no

sentido de obter-se a equação da reta. Para calcular os valores reais de tibolona,

substituiu-se o valor de y da equação pelos valores das áreas dos cromatogramas

obtidos para as concentrações, baixa, média e alta. Com esses valores calculou-

se a precisão através do coeficiente de variação aplicando a seguinte fórmula

CV%= DP/média x100.

A precisão

inter-dia foi calculada através da média das concentrações

baixa (0,025mg/mL), média (0,1mg/mL) e alta (0,5mg/mL), ensaiadas nos três

dias consecutivos.

Exatidão

Para verificar a exatidão utilizou-se a mesma curva de calibração e

regressão linear da precisão; utilizando-se os mesmos dados, as mesmas

condições e os resultados obtidos no experimento anterior, desenvolvido para a

determinação da precisão. A exatidão é expressa pela relação entre a

concentração média experimental e a concentração teórica correspondente, e foi

calculada pela diferença porcentual entre as médias das concentrações

experimentais e o valor da concentração teórica de acordo a fórmula abaixo:

x100

teórica ãoConcentraç

lexpeimenta média ãoConcentraç

Exatidão 

A exatidão

inter-dia foi calculada através da média dos resultados

encontrados para cada uma das concentrações baixa, média e alta, ensaiadas em

cada dia ao longo dos três dias consecutivos.

Robustez

Construída a curva de calibração anteriormente desenvolvida com as oito

concentrações da solução de tibolona padrão (0,001; 0,005; 0,010; 0,025; 0,050;

0,100; 0,200 e 0,500 mg/mL) estabelecidas e constatada sua linearidade,

robustez foi verificada utilizando-se soluções com três concentrações: Baixa,

média e alta, 0,025; 0,100 e 0,500 mg/mL respectivamente, obtidas a partir da

solução estoque de tibolona por diluição com acetonitrila/água (70:30) e

cromatografadas em CL UV-Vis, em três réplicas cada perfazendo um total de 9

determinações, variando-se a fase móvel, na proporção de 68 e 72 % de

acetonitrila para 32 e 28 % de água, respectivamente. O ensaio foi repetido em

dois dias consecutivos. A robustez foi avaliada através do cálculo do coeficiente

de variação.

4.3.2 Resultados e Discussão

A validação de um método analítico deve garantir por meio de estudos

experimentais, que o método atenda as exigências das aplicações analíticas,

assegurando a confiabilidade dos resultados, devendo para tanto apresentar:

especificidade, linearidade, intervalo, precisão, robustez, sensibilidade, limite de

quantificação e exatidão adequadas à análise (BRASIL, ANVISA, 2003f).

Os parâmetros avaliados no processo de validação foram: especificidade

(seletividade), linearidade, precisão e exatidão, intervalo e robustez.

Especificidade e seletividade

As ilustrações a seguir mostram os resultados da especificidade e

seletividade que foram avaliadas por meio de degradação forçada do fármaco,

sob condições térmicas (termodegradação) utilizando uma solução de tibolona

padrão na concentração final de 0,025 mg/mL.

A Figura 12 mostra o cromatograma da tibolona não degradada na

concentração de 0,025 mg/mL (tempo de retenção de 6,57 minutos e área

202770) e a Figura 13 mostra o cromatograma da mesma solução de tibolona

termodegradada a 50 ºC (tempo de retenção de 6,56 minutos e área de 37254).

FIGURA 12 – Cromatograma representativo da tibolona padrão 0,025mg/ml

não degradada.

Min ute

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0,000

0,005

0,010

0,000

0,005

0,010

6,555 37254

FIGURA 13 – Cromatograma representativo da tibolona padrão ( 0,025

mg/mL) submetida a degradação térmica 50 ºC.

Na Figura 12 que representa a tibolona sem sofrer processo degradativo,

percebe-se que existe um pico pequeno próximo ao da tibolona, que eluiu entre

5,49 minutos (pico 3) e na Figura 13 este pico aparece com uma intensidade maior

Tibolona

e no mesmo tempo de retenção da figura 12, e o pico da tibolona degradada

aparece com sua intensidade visivelmente menor do que antes da degradação. Ao

compararmos os cromatogramas antes e depois da degradação pode-se afirmar

que o pico 3, pode ser atribuído ao principal produto de degradação da tibolona.

A Figura 14 abaixo mostra a superposição dos cromatogramas da tibolona

degradada e não degradada, demonstrando que a termodegradação reduziu a área

inicial do pico da tibolona de

82,90% para 16,40% (TABELA 8).

0 1

3 4

6 7 8 9

0,00

0,01

0,02

0,00

0,01

0,02

M I N U T O S

FIGURA 14 – Cromatograma representativo da superposição da tibolona não

degradada e degradada a 50 ºC.

A Tabela 8 abaixo mostra os resultados dos cálculos da resolução dos

picos cromatográficos da termodegradação da tibolona demonstrando que a

porcentagem de degradação foi de 66,50 %.

TABELA 8 – Resolução dos picos cromatográficos da tibolona não

degradada e termodegradada e suas porcentagens de degradação.

Picos

Tempo de

retenção

(min)

Resolução %

3 5,49 12,71 3,06

(Tib.) 6,55 3,84 82,90

3 5,49 2,69 48,88

Tibolona

não

degradada

(Tib.) 6,55 4,03 16,40

% Degradação = % tibolona não degradada – % tibolona degradada

% = 82,90 – 16,40 = 66,50 %

Tibolona

O método desenvolvido apresentou-se adequado à análise da tibolona e

seus respectivos produtos de degradação, no qual as resoluções correspondentes

ao pico principal das soluções das amostras degradada e não degradada

apresentam valores superiores a dois, demonstrando que o método é especifico

nas condições pré-estabelecidas, não evidenciando nenhuma interferência entre

os picos. Observou-se também a separação individual dos interferentes

relevantes, neste caso confirmada pela resolução dos analitos que eluem

próximos.

O método mostrou-se especifico nas condições analisadas

demonstrando uma resolução adequada entre os picos referentes à tibolona

degradada em relação ao do produto de degradação. Desta forma a

especificidade consiste no parâmetro fundamental nos testes de determinação

quantitativa do teor e seus respectivos produtos de degradação e impurezas.

Linearidade

As ilustrações (figuras, tabelas e gráficos) seguintes apresentam o

resultado da determinação da linearidade da curva de calibração da tibolona nas

concentrações de 0,001; 0,005; 0,010; 0,025; 0,050; 0,100; 0,200 e 0,500 mg/mL

obtida em três dias consecutivos.

As Figuras 15,16 e 17 representam à superposição dos cromatogramas

representativos das curvas de calibração da tibolona padrão, obtidas,

respectivamente nos três dias de análises.

3 4 5

250

500

FIGURA 15 – Superposição dos cromatogramas representativos das curvas de calibração

da tibolona padrão obtidas no 1º dia de análise.

Minutos

mAU

Dia 26_12_2007

TABELA 9 – Áreas dos picos cromatográficos obtidos para construção da curva de

calibração da tibolona padrão no 1º dia.

Conc.

(mg/mL)

0,001 0,005 0,010 0,025 0,050 0,100 0,200 0,500

8964 67141 113748 136975 311653 1364737 2112114 5411531

8964 61274 116399 126867 155104 1372597 2361156 5489261

10146 67503 149523 149848 686988 1456682 2587339 5529764

Área

8468 67141 141086 116051 675544 1320145 2589931 5536652

Média

9135,5 63572,25 130189 132435,25 457322,25

1378540,25

2412635 5491802

y = 1E+07x + 19185

= 0,9907

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Concentração (mg/mL)

Area

GRÁFICO 4 – Curva de calibração da tibolona padrão para

determinação da linearidade obtida para o 1º dia, no intervalo das

concentrações estabelecidas.

0 1 2 3 4 5 6 7

250

500

FIGURA 16 – Superposição dos cromatogramas representativos das curvas de

calibração da tibolona padrão obtidas no 2º dia de análise.

Minutos

mAU

Dia 28_12_2007

TABELA 10 – Áreas dos picos cromatográficos obtidos para construção da curva de

calibração da tibolona padrão no 2º dia.

Conc.

(mg/mL)

0,001 0,005 0,010 0,025 0,050 0,100 0,200 0,500

15088 74885 155130 326243 547982 1137650 2095643 5597119

5318 76019 160287 330915 545537 1168085 2317151 5612179

8952 80690 159608 320749 569613 1145977 2367180 5581165

Área

9480 82227 167569 326890 576554 1171772 2383121 5638391

Média

9709,5

78455,25

160648,5

326199,3

559921,5

1155871

2290774

5607214

y = 1E+07x + 28517

= 0,9993

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Concentração (mg/mL)

Area

GRÁFICO 5 – Curva de calibração da tibolona padrão para

determinação da linearidade obtida para o 2º dia, no intervalo

das concentrações estabelecidas.

Mi t

0 1 2 3 4 5 6 7

250

500

FIGURA 17 – Superposição dos cromatogramas representativos das curvas de

calibração da tibolona padrão obtidas no 3º dia de análise.

Minutos

mAU

TABELA 11 – Áreas dos picos cromatográficos obtidos para construção da curva de

calibração da tibolona padrão no 3º dia.

Conc.

(mg/mL)

0,001 0,005 0,010 0,025 0,050 0,100 0,200 0,500

9722 49927 117000 292436 538102 1062325 2083181 5416179

10963 53082 109571 293818 545126 1062816 2123416 5434189

10363 56989 135217 281231 549504 1066387 2152576 5223643

Área

10365 54486 114073 275376 553044 1074330 2141187 5107007

Média

10353,25 53621

118965,25

285715,25 546444

1066464,5

2125090

5295254,5

y = 1E+07x + 10231

= 0,9991

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Concentração (mg/mL)

Area

GRÁFICO 6 – Curva de calibração da tibolona padrão para

determinação da linearidade obtida para o 3º dia, no intervalo

das concentrações estabelecidas.

Os Gráficos 4, 5 e 6, mostram os resultados da avaliação da linearidade

dos três dias. O método é considerado linear para as concentrações analisadas

na faixa de 0,001 a 0,500 mg/mL. A resposta do sinal analítico em relação aos

valores correspondentes das curvas obtidas nos três dias apresentaram o

coeficiente de correlação (r

) variando entre 0,9907 e 0,9903, todos superiores a

0,99 conforme preconiza a RE 899 (BRASIL, ANVISA, 2003f).

A Tabela 12 mostra a média geral dos picos cromatográficos das três

curvas de calibração referente aos três dias. Dessa forma, construiu-se o gráfico

da curva de calibração (Gráfico 7) e fez-se a regressão linear obtendo-se a

equação da reta, sendo o coeficiente de correlação r

= 0,9994. A análise de

variância (ANOVA) dos dados médios (3 dias consecutivos), com pós teste

(Tukey), mostra que não há diferença significativa na resposta entre os 3 dias

consecutivos, e que as variâncias são iguais (p>0,05).

TABELA 12– Média das áreas dos picos cromatográficos obtidos nos três dias para

construção da curva de calibração da tibolona padrão.

Conc.

mg/mL)

Média

(1º dia)

Média

(2º dia)

Média

(3º dia)

Media

Geral

CV%

0,001

9136

10353 9710

9733,0 608,8 6,2553

0,005

63572

53621

60575

59256,0 5104,9 8,6151

0,010

130189

118965 160649

136601,0 21569,1 15,7898

0,025

317629

285715 326199

309847,7 21334,3 6,8854

0,050

457322

546444

559922

521229,3 55754,1 10,6967

0,100

1359625

1066465 1155871

1193987,0 150250,9 12,5840

0,200

2412635

2125090 2290774

2276166,3 144328,0 6,3408

0,500

5491802

5295255 5607214

5464757,0 157728,2 2,8863

y = 1E+07x + 28020

= 0,9994

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500

Concentração (mg/mL)

Ár e

GRÁFICO 7 – Gráfico das médias das três curvas de calibração.

A análise de variância mostra ainda que, enquanto há diferença

significativa na resposta entre as linhas (níveis de concentração, p<0.0001), não

há diferença significativa entre as colunas (p=0,0927).

A Tabela 13 mostra o resultado para o cálculo dos resíduos entre os

valores medidos e os valores calculados a partir da equação de regressão linear.

Os valores de t calculado variaram entre 2,375778 - 87,05821.

TABELA 13 – Cálculo dos resíduos em relação às três curvas de calibração obtidas na

determinação da linearidade.

Conc.

(mg/mL)

Xcalculado

(teórico)

Média 1

(X1-Xt)

Média 2

(X2-Xt)

Média 3

(X3-Xt)

media

(Xm-Xt)

Sn*

t cal.**

0,001

28484 19348,5 18130,75 18774,5 18751,25 609,2078 87,05821

0,005

68484 4911,75 14863 9971,25 9915,333 4975,861 5,63617

0,010

118484 11705 481,25 42164,5 18116,92 21568,68 2,375778

0,025

268484 136048,8 17231,25 57715,25 70331,75 60405,15 3,293233

0,050

518484 61161,75 27960 41437,5 43519,75 16698,53 7,371454

0,100

1018484 341141,3 47980,5 137387 175502,9 150251,2 3,303782

0,200

2018484 394151 106606 272289,8 257682,3 144328 5,049856

0,500

5018484 473318 276770,5 588729,5 446272,7 157728,2 8,002688

Limites aceitáveis: * Sn = desvio padrão dos resíduos

** t cal. = (resíduo)/Sn/√n, n = 8.

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

-50000

50000

100000

GRÁFICO 8 – Resíduos dos dados de linearidade.

O Gráfico 8 mostra que não houve uma tendência de distribuição não

aleatória dos resíduos, confirmando a validade do modelo de calibração adotado.

Precisão/Exatidão

As tabelas e gráficos abaixo representam a precisão/exatidão

determinadas através do parâmetro repetibilidade (intra-dia), avaliada pelo

coeficiente de variação percentual obtido na determinação das áreas dos picos

cromatográficos da Tibolona nas concentrações baixa (B), média (M) e alta (A)

respectivamente (0,025; 0,100 e 0,500 mg/mL) obtidos em três dias consecutivos

(inter-dias).

TABELA 14 – Valores de precisão e exatidão obtidos para as

concentrações B, M e A no 1º dia.

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

0,0237 0,0934 0,4725

0,0256 0,0990 0,4805

0,0252 0,0998 0,4838

Concentrações

experimentais

0,0244 0,1005 0,4692

Média

0,0247 0,0982 0,4765

0,0009 0,0032 0,0068

Precisão (%)* 3,4770 3,3074 1,4247

Exatidão (%)** 98,8144 98,1704 95,3008

Limites aceitáveis: * ≤ 5 % (RE 899 – ANVISA/2003)

** 85 a 120 % (RE 899 – ANVISA/2003)

y = 2E+07x - 8014,7

= 0,9986

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500

Concentração (mg/mL)

Area

GRÁFICO 9 – Curva de calibração para determinação da precisão

e exatidão obtida no 1º dia.

TABELA 15 – Valores de precisão e exatidão obtidos para as

concentrações B, M e A no 2º dia.

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

0,0237 0,1022 0,4809

0,0235 0,1018 0,4736

0,0229 0,1018 0,4842

Concentrações

experimentais

0,0218 0,1025 0,4867

Média

0,0230 0,1021 0,4813

0,0009 0,0004 0,0057

Precisão (%)*

3,8331 0,3455 1,1792

Exatidão (%)**

91,8982 102,0648 96,2680

Limites aceitáveis: * ≤ 5 % (RE 899 – ANVISA/2003)

** 85 a 120 % (RE 899 – ANVISA/2003)

y = 2E+07x + 23303

= 0,9998

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500

Concentração (mg/mL)

Area

GRAFICO 10 – Curva de calibração para determinação da precisão e

exatidão obtida no 2º dia.

TABELA 16 – Valores de precisão e exatidão obtidos para as

concentrações B, M e A no 3º dia.

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

0,0232 0,1026 0,5006

0,0232 0,1017 0,5050

0,0236 0,1020 0,5118

Concentrações

experimentais

0,0240 0,1061 0,5083

Média

0,0235 0,1031 0,5064

0,0004 0,0020 0,0048

Precisão (%)

1,5885 1,9856 0,9395

Exatidão (%)

94,0135 103,1215 101,2825

Limites aceitáveis: * ≤ 5 % (RE 899 – ANVISA/2003)

** 85 a 120 % (RE 899 – ANVISA/2003)

y = 2E+07x + 45128

= 0,9989

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500

Concentração (mg/mL)

Area

GRÁFICO 11 – Curva de calibração para determinação da precisão

e exatidão obtida no 3º dia.

A análise das Tabelas 14, 15 e 16 demonstra que o método é preciso e

exato. Foi avaliada a precisão intermediária em três dias e os resultados foram

calculados através do coeficiente de variação. A média dos valores do CV% por

cada dia de análise foi respectivamente, 2.7364%, 1,7859% e 1,5045%,

encontrando-se todos abaixo de 5%, conforme as especificações da RE-899. Já a

exatidão, foi avaliada calculando a relação entre a concentração teórica do

fármaco e a concentração média experimental, durante os três dias consecutivos.

A média dos resultados por cada dia de análise foi de 97,4285%, 96,7437% e

99,4725% respectivamente, Estes resultados encontram-se também dentro do

limite permitido pela RE-899, que é de 85% a 115%. (BRASIL, ANVISA, 2003f).

TABELA 17 - Valores médios de precisão e exatidão obtidos para as

concentrações B, M e A nos três dias (inter-dias).

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

1º Dia

0,0247 0,0982 0,4765

2° Dia

0,0230 0,1021 0,4813

3º Dia

0,0235 0,1031 0,5064

Média 0,0237 0,1011 0,4881

0,0009 0,0026 0,0161

PRECISÃO (%)* 3,6813 2,5601 3,2900

EXATIDÃO (%)** 94,9333 101,1333 97,6133

Limites aceitáveis: * ≤ 5 % (RE 899 – ANVISA/2003)

** 85 a 120 % (RE 899 – ANVISA/2003)

A precisão inter-dia foi calculada através do coeficiente de variação

utilizando a média dos três dias das concentrações baixa, média e alta, cujos

valores foram 3,6813, 2,5601 e 3,2900 respectivamente. Todos os valores

encontram-se com coeficiente de variação inferiores a 5%, dentro do limite

preconizado pela RE899. Já a exatidão inter-dia foi calculada através da relação

entre a concentração média experimental e a concentração teórica, utilizando à

média dos três dias das concentrações baixa, média e alta, cujos valores foram

respectivamente, 94,9333%; 101,1333% e 97,6133%, conforme

a Tabela 17.

Estes resultados também se encontram de acordo com o que preconiza a RE899,

demonstrando a precisão e exatidão do método. (BRASIL, ANVISA, 2003F).

Robustez

A robustez foi avaliada através da variação da composição da fase móvel,

variando a fase orgânica em 68% e 72%.

As Tabelas 18, 19, 20 e 21 abaixo, mostram a média das áreas dos picos

cromatográficos das concentrações baixa (B), média (M) e alta (A), 0,25 mg/ml,

0,100 mg/mL e 0,500 mg/mL respectivamente, quando se variou a proporção de

acetonitrila na fase móvel para 68% e 72% ao longo de dois dias consecutivos.

TABELA 18 – Valores das concentrações, B, M e A obtidas na

determinação da robustez utilizando 68% de acetonitrila na fase móvel

no1º dia, juntamente com a média DP e coeficiente de variação (CV%).

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

0,0305 0,1218 0,6051

0,0317 0,1255 0,6148

Concentrações

experimentais

(mg/mL)

0,0291 0,1251 0,6175

média

0,0304 0,1241 0,6125

0,0013 0,0020 0,0065

CV%

4,3230 1,6134 1,0660

TABELA 19 – Valores das concentrações, B, M e A obtidas na

determinação da robustez utilizando 72% de acetonitrila na fase móvel

no1º dia, juntamente com a média DP e coeficiente de variação (CV%).

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

0,0234 0,0912 0,4386

0,0224 0,0924 0,4403

Concentrações

experimentais

0,0222 0,0930 0,4443

média 0,0227 0,0922 0,4411

DP 0,0007 0,0009 0,0030

CV% 2,8856 0,9740 0,6700

TABELA 20 – Valores das concentrações, B, M e A obtidas na

determinação da robustez utilizando 68% de acetonitrila na fase móvel no

2º dia, juntamente com a média DP e coeficiente de variação (CV%).

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

0,0247 0,0998 0,4917

0,0268 0,1000 0,4930

Concentrações

experimentais

0,0244 0,0976 0,4845

média 0,0253 0,0991 0,4898

DP 0,0013 0,0013 0,0046

CV% 5,2191 1,3179 0,9399

TABELA 21 – Valores das concentrações, B, M e A obtidas na

determinação da robustez utilizando 72% de acetonitrila na fase móvel no

2º dia, juntamente com a média DP e coeficiente de variação (CV%).

Com os resultados encontrados nas Tabelas 18, 19, 20 e 21, a robustez foi

avaliada utilizando as concentrações da exatidão e calculada através do CV%,

onde os valores de áreas foram adequados nos diferentes níveis de concentração

interdia. Enquanto nos níveis de concentração extremos, os valores de precisão

apresentaram-se maiores que 5%, em relação aos dados intradia. Os dados de

robustez em relação à concentração experimental versus concentração nominal,

apresentaram valores porcentuais acima de 100%, na condição analítica de 68%

no primeiro de análise. Porém, no cálculo da média inter-dia, os valores médios

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

0,0208 0,1052 0,5537

0,0189 0,1088 0,5220

Concentrações

experimentais

0,0208 0,1093 0,6005

média 0,0202 0,1077 0,5587

DP 0,0011 0,0023 0,0394

CV% 5,4114 2,0879 7,0606

dos coeficientes de variação quando se variou à concentração para 68% foram de

4,8%, 1,5% e 1%, nas concentrações nominais de 0,025%, 0,1% e 0,5%,

respectivamente (TABELA 22). Para a variação de 72% foram de 4,1%, 1,5% e

3,9%, para as mesmas concentrações nominais anteriores (TABELA. 23). Estes

resultados mostram que os valores médios do CV% ficaram abaixo de 5%,

mesmo nos níveis de concentrações extremos.

TABELA 22 – Valores médios das concentrações, B, M e A obtidas

utilizando 68% de acetonitrila na fase móvel nos dois dias, juntamente

com a média DP e coeficiente de variação (CV%).

TABELA 23 – Valores médios das concentrações, B, M e A obtidas

utilizando 72% de acetonitrila na fase móvel nos dois dias, juntamente

com a média DP e coeficiente de variação (CV%).

O método proposto foi considerado robusto no que se refere à precisão e

exatidão quando respeitadas as condições analíticas, como temperatura da

coluna, fluxo da fase móvel, proporções da relação orgânico/aquoso da fase

móvel (acetonitrila/água 70:30) admitindo-se variação de aproximadamente ± 2%.

Sendo assim, estes resultados confirmam que o método pode ser aplicado

garantindo a confiabilidade na quantificação da tibolona.

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

1º Dia

0,0305 0,1242 0,6125

2º Dia

0,0253 0,0991 0,4898

Média 0,0279 0,1116 0,5511

CV% 4,8 1,5 1,0

Concentração

(mg/mL)

0,025 0,100 0,500

1º Dia

0,0227 0,0922 0,4411

2º Dia

0,0202 0,1077 0,5587

Média 0,0214 0,1000 0,4999

CV% 4,1 1,5 3,9

PARTE III

4.4 APLICAÇÃO DO MÉTODO: ANÁLISE DE CÁPSULAS DE TIBOLONA

MANIPULADA

4.4.1 Metodologia

Amostra - Cápsulas de Tibolona 2,5 mg.

Como amostra, foi utilizada tibolona manipulada na concentração de 2,5

mg, na forma farmacêutica de cápsulas, procedentes dos treze estabelecimentos

farmacêuticos magistrais que manipulam este medicamento nas cidades de

Campina Grande e João Pessoa no Estado da Paraíba. De cada farmácia

adquiriu-se 20 cápsulas, das quais 10 foram analisadas e as outras 10 foram

mantidas como testemunho. As amostras foram codificadas como FarmA, FarmB,

FarmC, FarmD, FarmE, FarmF, FarmG, FarmH, FarmI, FarmJ, FarmK, FarmL e

FarmM, representando as amostras de cada farmácia analisadas.

Determinação do Peso médio

O peso médio das cápsulas foi determinado segundo a Farmacopéia

Brasileira, pesando-se individualmente 10 cápsulas cheias e em seguida

esvaziando-se quantitativamente cada uma delas em balões volumétricos

individuais de 25mL de capacidade, tendo-se o cuidado de retirar todo conteúdo

restante com auxílio de algodão, que foi imediatamente lavado com uma mistura

acetonitrila/água (70:30) como solvente. Após isso, as cápsulas vazias foram

pesadas e o peso de cada uma foi determinado por diferença

seguido da

determinação da variação porcentual do conteúdo das cápsulas em relação à

média. O limite de variação aceitável é de ± 10%, por tratar-se de cápsulas com

até 300mg (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1988).

Uniformidade de conteúdo

Os dez balões contendo cada um o conteúdo individual de cada cápsula

tiveram então seus volumes completados com o mesmo solvente até o limite de

sua capacidade, de forma a obter uma concentração final de 0,1 mg/mL. Filtrou-

se cada solução obtida e após isso, retirou-se 1mL de cada e diluiu-se para 2mL

com o mesmo solvente, a fim de obter uma solução final de concentração igual a

0,05 mg/mL. Preparou-se a curva de calibração com as oito concentrações da

tibolona padrão conforme já estabelecido e as soluções finais das amostras foram

injetadas em CLAE/UV-VIS em duas réplicas cada, sendo registrados os valores

das áreas dos picos cromatográficos e calculando-se a uniformidade de conteúdo

através da determinação do teor de cada cápsula, bem como a média das áreas,

o desvio padrão e o desvio padrão relativo (coeficiente de variação) das soluções

finais das 13 farmácias amostradas, observando-se que, segundo a Farmacopéia

Brasileira o limite de valor aceitável para uniformidade de conteúdo é de 85% a

120% (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1988).

4.4.2 Resultados e Discussão

Determinação do peso médio

A distribuição heterogênea de fármaco em uma cápsula deve ser um dos

fatores de atenção na manipulação de medicamentos, principalmente para

aqueles de baixo índice terapêutico e de baixa dosagem. Por isso a farmácia deve

melhorar cada vez mais o seu processo de mistura e homogeneização, no sentido

de garantir a qualidade dos medicamentos, tornando-os eficazes e seguros.

De acordo com a Farmacopéia Brasileira, o limite de variação do peso

permitido para cápsulas duras e com doses menores que 300 mg é de ±10% do

peso médio dos pós (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1988).

As tabelas seguintes mostram os resultados dos pesos médios, desvios

padrão e coeficiente de variação das cápsulas manipuladas na concentração de

2,5 mg obtidos pela pesagem de 10 unidades de cada uma das 13 farmácias

analisadas.

Os resultados descritos nas Tabelas 24a e 24b nas páginas seguintes

permitem observar que os pesos médios das amostras analisadas encontram-se

dentro dos limites de variação especificados uma vez que das treze amostras

TABELA 24a – Resultados obtidos nas determinações do peso médio das cápsulas de tibolona (2,5 mg), manipuladas nas Farmácias A, B, C, D,

E, F e G.

Limite aceitável:(*) ± 10% (FB 4. ed. 1988)

FarmA FarmB FarmC FarmD FarmE FarmF

FarmG

Amostras

(cápsula)

Peso

(g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

0,0835 -2,3392 0,1489 -3,0788 0,1472 2,7502 0,1477 -6,4064 0,1210 5,0895

0,1507 41,8219

0,2418 0,6117

0,0850 -0,5848

0,1644 7,0103

0,1404 -1,9964

0,1680 6,4571

0,1105 - 4,0299 0,0972 - 8,5263

0,2312

3,7989

0,0858 0,3509 0,1512 -1,5817 0,1383 -3,4622 0,1504 -4,6955 0,1181 2,5708 0,1019 - 4,1031 0,2364

1,6353

0,0845 -1,1696 0,1574 2,4539 0,1472 2,7502 0,1670 5,8235 0,1146 - 0,4690 0,0977 - 8,0557

0,2482 3,2747

0,0844 -1,2865 0,1539 0,1757 0,1440 0,5165 0,1611 2,0848 0,1089 - 5,4195 0,1018 - 4,1973 0,2411 0,3204

6 0,0791 -7,4854 0,1487 -3,2090 0,1475 2,9597

0,1634 3,5422 0,1133 - 1,5981 0,1071 0,7905 0,2479 3,1498

7 0,0884 3,3918

0,1565 1,8681 0,1443 0,7260

0,1467 -7,0401 0,1222 6,1317

0,1011 - 4,8560 0,2372

1,3024

0,0881 3,0409 0,1490 -3,0137

0,1363 -4,8583

0,1523 -3,4915 0,1162 0,9206 0,1068 0,5082 0,2395

0,3454

0,0878 2,6901 0,1529 -0,4752 0,1463 2,1220 0,1609 1,9581

0,1074 - 6,7223

0,1019 - 4,1031 0,2341

2,5923

10 0,0884 3,3918

0,1534 -0,1497 0,1411 -1,5077 0,1606 1,7679 0,1192 3,5261

0,0964 - 9,2791

0,2459 2,3176

PM 0,0855 0,1536 0,1433 0,1578 0,1151 0,1063 0,2403

DP 0,0029 0,0049 0,0040 0,0079 0,0051 0,0160 0,0058

CV% 3,4072 3,1675 2,8094 4,9923 4,4343 15,0869 2,4068

Limite de

variação

0,0769 – 0,0940 g 0,1382 – 0,1690 g 0,1289 – 0,1576 g 0,1420 – 0,1736 g

0,1036 – 0,1266 g 0,0957 – 0,1169 g 0,2163 – 0,2643 g

TABELA 24b – Resultados obtidos nas determinações do peso médio das cápsulas de tibolona (2,5 mg), manipuladas nas

Farmácias H, I, J, K, L e M.

(*) Limite de variação FB ± 10% (FB 4. ed. 1988)

FarmH FarmI FarmJ FArmK FArmL

FArmM

Amostras

(cápsula)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

Peso (g)

Variaçã

o em

relação

ao PM

(%)

0,2379 - 2,4240 0,1393 - 1,2687

0,0648 2,5154

0,0674 - 3,8928 0,1918 - 1,1187

0,1136 - 4,8098

0,2477 1,5955

0,1347 - 4,5290

0,0628 - 0,6486 0,0724 3,2368

0,1857 - 4,2635

0,1143 - 4,2232

0,2415 - 0,9475 0,1422 0,7867 0,0636 0,6170 0,0693 - 1,1835 0,1861 - 4,0573 0,1230 3,0669

0,2473 1,4314 0,1346 - 4,5999 0,0641 1,4080

0,0661 - 5,7465 0,2122 9,3984 0,1271 6,5024

5 0,2376 - 2,5471

0,1400 - 0,7726 0,0639 1,0916

0,0745 6,2313

0,1900 - 2,0467 0,1150 - 3,6367

6 0,2489 2,0877

0,1426 1,0702

0,0605 - 4,2873

0,0706 0,6702 0,1959 0,9950 0,1243 4,1562

0,2437 - 0,0451 0,1416 0,3615 0,0647 2,3572 0,0696 - 0,7557 0,1958 0,9434 0,1170 -1,9608

0,2461 0,9393

0,1529 8,3705

0,0623 - 1,4396 0,0738 5,2331 0,1947 0,3763 0,1211 1,4748

0,2425 - 0,5373 0,1403 - 0,5599 0,0639 1,0916 0,0706 0,6702 0,1942 0,1186 0,1199 0,4692

0,2449 0,4471 0,1427 1,1411 0,0615 - 2,7053 0,0670 - 4,4631 0,1933 - 0,3454 0,1181 -1,0390

PM 0,2438 0,1411 0,0632 0,0701 0,1940 0,1193

DP 0,0039 0,0051 0,0014 0,0028 0,0074 0,0045

CV% 1,6189 3,6125 2,2317 4,0505 3,8088 3,8075

Limite de

variação *

0,2194 – 0,2682 g 0,1270 – 0,1552 g 0,0569 – 0,0695 g 0,0631 – 0,0771 g 0,1746 – 0,2134 g 0,1074 – 0,1312 g

analisadas doze apresentaram coeficiente de variação entre 1,6189% e 4,9923%,

e apenas uma (FarmF) ultrapassou esses valores atingindo 15,0869% para uma

unidade, embora o peso médio dessa amostra tenha permanecido dentro do

limite de variação estabelecido, demonstrando haver uniformidade de

enchimento das cápsulas de todas as amostras analisadas.

Determinação da uniformidade de conteúdo

Segundo a Farmacopéia Brasileira os valores individuais para uniformidade

de conteúdo podem variar de 85% a 115% e o coeficiente de variação (CV%) em

até 6%.

A Tabela 25 na página seguinte ilustra os valores referentes à

determinação da uniformidade de conteúdo nas amostras manipuladas,

analisadas na concentração de 0,05 mg/mL.

GRÁFICO 12 – Resultado da variação individual da uniformidade

de conteúdo nas farmácias analisadas.

O Gráfico 12 acima mostra os resultados obtidos, indicando que do total

das amostras analisadas, as cápsulas de cinco de farmácias (FarmB, FarmC,

FarmE, FarmF e FarmG) encontraram-se com teores entre 85% e 115% com os

TABELA 25 – Resultados obtidos nas determinações de uniformidade de conteúdo das cápsulas de tibolona (2,5 mg) manipuladas nas

Farmácias A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L e M.

Nº

Experimentos

FarmA FarmB FarmC FarmD FarmE FarmF FarmG FarmH FarmI FarmJ FarmK FarmL FarmM

104,7 100,0 95,8

62,1

99,7 98,4 96,6

115,8 134,0

106,6

115,6

95,1

141,8

113,7 113,8 91,2

73,7

90,5 95,9 93,3 101,8

129,5 148,3 123,4

84,3

269,7

115,8

98,4 89,8

65,2

97,2 102,3 99,4 95,1

132.0 134,5 151,9

99,2

145,3

109,9 109,5 96,0 80,1 98,1 98,4 104,5 97,4

141,5 273,2

108,4

116,6

85,1

109,5 106,4 91,5

74,1

101,0 102,4 102,6

115,6 194,5

107,8 118,0

115,2

89,1

109,2 99,9 88,6

75,4

100,8

116,8

110,7 133,1

156,5

110,5

115,1 118,5 74,8

129,3

96,5 91,7

68,4

103,4 101,9 100,3 141,6

150,5

102,9 115,0

134,5 62,7

117,6

108,2 96,4

63,5

98,3 104,5 106,2

115,9 166,4

99,8

133,3 115,1

96,3

118,0

108,7 93,9

76,6

91,2 100,3 102,2 111,4

148,0 157,0 150,3 158,1 119,2

126,2

100,6 95,9

71,7

98,3 96,7 108,9 100,8

405,9 147,1 127,2

105,7

132,0

Media

115,4 104,2 93,1 71,1 97,9 101,8 102,5 112,9 175,9 138,8 125,8 114,2 121,6

7,8 5,8 2,9 6,0 4,1 6,0 5,4 15,2 83,1 51,8 15,1 20,9 59,4

CV%

6,7 5,6 3,1 8,5 4,2 5,9 5,2 13,5 47,2 37,4 12,0 18,3 48,8

104,7 96,5 88,6 62,1 90,5 95,9 93,3 95,1 129,5 99,8 108,4 84,3 62,7

129,3 113,8 96,4 80,1 103,4 116,8 110,7 141,6 405,9 273,2 151,9 158,1 269,7

(*) Limite aceitável: 85 – 115% (FB 4. ed. 2004)

valores do desvio padrão relativo (CV%) baixos, menores que 6%, resultante de

uma boa homogeneidade da mistura entre as cápsulas individuais, indicando que

os parâmetros de qualidade exigidos foram cumpridos. Em relação às oito

amostras restantes analisadas, apresentaram seus teores e respectivos

coeficientes de variação fora dos limites especificados pela (FARMACOPEIA

BRASILEIRA, 1988).

Analisando estes resultados é possível observar que não foi evidenciada

nenhuma diferença da correlação entre a variação do peso médio e a variação da

uniformidade de conteúdo em função da relação fármaco excipiente, haja vista

que as formulações dos estabelecimentos FarmI, FarmJ, FarmK, FarrmL e

FarmM, com seus valores de pesos médios,141,1mg; 63,2; 70,1 mg; 194.0 mg e

119,3 mg, com seus desvios padrão relativos (CV%), 3,6%; 2,2%; 4,1%; 3,8% e

3,8% em comparação com os dados de uniformidade de conteúdo e seus

correspondentes desvios padrão relativos (CV%) 47,2%; 37,4%; 12,0%; 18,3% e

48,8%, mostrou que as variações na uniformidade de conteúdo, não foram

influenciadas pela variação do processo de enchimento, já que todos os valores

dos pesos médios estão dentro dos limites especificados.

Os dados apresentados na Tabela 25 indicam que os principais fatores que

influenciaram na variação dos teores, estão relacionados com os parâmetros

tecnológicos de mistura e as características físicas e químicas dos componentes

da fórmula. Estes dados nos permitem afirmar que não houve erro de pesagem,

podendo ter ocorrido, falha na homogeneização da mistura, causada por uma

possível segregação dos pós, parâmetro este que depende do tamanho,

densidade e da forma das partículas dos pós envolvidos na mistura. A

segregação fará com que aumente a variação do conteúdo nas amostras

retiradas da mistura, causando a reprovação no teste de uniformidade (AULTON,

2005), além de outros fatores, como nos casos onde a proporção de princípio

ativo é muito pequena em relação aos excipientes, nestes casos a etapa de

mistura é ainda mais crítica e a tendência de ocorrer uma falta de uniformidade

em certas partes da mistura dos pós é muito grande. (MENEGHINI; ADAMS,

2007). Estes resultados se assemelham aos de outros trabalhos publicados que

utilizaram à mesma abordagem e os mesmos critérios de aceitação dos limites

especificados pelos compêndios farmacopéicos, em termos de análises de

uniformidade de conteúdo e peso médio de cápsulas manipuladas. (MARCATTO,

et al., 2005); (SILVACOSTA, et al., 2008); (MIOTTO JÚNIOR; ADAMIS, 2004);

(PINHEIRO, et al., 2008)

CAPÍTULO V

CONSIDERAÇÕES FINAIS

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os medicamentos manipulados no Brasil passaram por grandes

modificações nos últimos anos, principalmente no que se refere ao aumento

significativo do número de prescrições a serem manipuladas, pertencentes a

todos os grupos terapêuticos, inclusive os que são considerados de alto risco

sanitário para os usuários, se preparados de maneira a comprometer as Boas

Práticas de Manipulação. Como exemplos podem ser citados aqueles de baixo

índice terapêutico, hormônios, psicotrópicos, antibióticos, onde qualquer desvio ou

erro na manipulação desses produtos poderá causar ineficácia terapêutica, ou

mesmo ser fatal para os usuários.

Casos de intoxicação por medicamentos pertencentes aos grupos citados

foram relatados levando a morte de pessoas inclusive crianças. Estes casos

foram constatados através de resultados de análises laboratoriais no

INCQS/FIOCRUZ, onde mostraram teores de PA variando entre 1.000 a 30.000%

do valor nominal.

Alem disso, estas variações do teor diferem bastante em relação às

cápsulas de uma mesma formulação, como 40 a 180% do valor declarado,

segundo os resultados das análises do INCQS.

Sendo a tibolona um fármaco de baixa dosagem e bastante manipulado e

não apresentando monografia oficial para sua quantificação nas formas

farmacêuticas disponíveis, o desenvolvimento e validação de um método para

esta finalidade foram fundamentais para serem aplicados em farmácias magistrais

e em estudos de bioequivalência.

Os dois métodos desenvolvidos demonstraram ser confiáveis, embora o

método por derivatização com detecção por fluorescência apresente maiores

dificuldades, é fundamental que se aprofunde no sentido de promover sua

validação. Em relação ao método por detecção direta no UV, além de

desenvolvido foi também validado e aplicado, apresentando-se confiável,

adequado e sensível, atendendo a todos os parâmetros de validação.

Os resultados da aplicação nas amostras manipuladas nos fazem levar a

algumas reflexões importantes, no tocante ao processo de manipulação magistral

referente aos desvios encontrados na uniformidade de conteúdo. Cerca de 62%

das farmácias analisadas estão com seus teores fora dos limites farmacopéicos

exigidos, onde as possíveis causas podem estar relacionadas aos tipos de

excipientes utilizados e aos processos de mistura de pós.

Independente das causas, esses resultados sinalizam que os usuários

desses medicamentos podem está fazendo uso de doses maiores ou menores do

que as estabelecidas, caracterizando um risco considerável para a saúde,

podendo levar inclusive a processos de intoxicação medicamentosa e até mesmo

a morte.

Apesar de esses resultados serem de apenas um medicamento, eles

coincidem com aqueles analisados pelo INCQS, na detecção de teores fora do

limite permitido pelos compêndios oficiais. . Por outro lado, podemos dizer que o

processo de manipulação é viável, tendo em vista que 38% das farmácias

analisadas estavam dentro dos padrões farmacopéicos que foram estabelecidos

para a realização das análises. Estes fatos nos leva a pensar que as farmácias

precisam reformular os seus processos de manipulação, no que se refere às

técnicas de mistura e homogeneização, sendo mais rigorosa no tocante ao

controle da qualidade, no sentido de obter medicamentos seguros, eficazes e com

qualidade.

Dentro das condições que os métodos foram desenvolvidos e baseados

nos resultados obtidos pode-se afirmar que:

Método indireto por derivatização com detecção por fluorescência:

 A redução na concentração do catalisador (ácido

trifluorometanosulfônico) foi importante para obter-se retenção cromatográfica das

hidrazonas formadas.

 Não foi observada a formação de hidrazonas diastereoisoméricas

syn

e anti

na reação de derivatização da tibolona.

 Os fatores mais relevantes no rendimento da reação de derivatização

foram à razão molar e a temperatura da reação, em acordo com os dados da

Appelblad para os outros esteróides.

 Uma razão molar de 40, um tempo de reação de 20 minutos e uma

temperatura de 48 ºC mostraram-se ideais.

 O método por derivatização desenvolvido mostrou-se adequado, por

isso é fundamental que haja um aprofundamento maior no sentido de que o

mesmo seja validado e possa ser aplicado, apontando para mais uma opção de

quantificação do fármaco tibolona, diante da inexistência, até então, de

metodologias analíticas desenvolvidas para o referido fármaco.

Método direto com detecção por UV

 O método demonstrou ser específico linear dentro das faixas de

concentrações estabelecidas, preciso, exato e robusto, nas condições

especificadas.

 Foi aplicado com êxito na quantificação das amostras de tibolona

manipuladas

pelas farmácias magistrais da Paraíba.

 Das farmácias analisadas, apenas cerca de 38% estavam com os

teores de uniformidade de conteúdo dentro dos parâmetros farmacopéicos

exigidos, portanto 62% dessas farmácias estão em desacordo com os parâmetros

farmacopéicos e também com a RDC 67/2007/ANVISA, em relação a

uniformidade de conteúdo.

 Os desvios encontrados na uniformidade de conteúdo podem ser

atribuídos aos tipos de excipientes utilizados, bem como aos parâmetros

tecnológicos dos processos de mistura do pós, como falha na homogeneização da

mistura, causada por uma possível segregação dos pós ou por não utilização da

técnica da diluição geométrica no processo, além de outros fatores, como nos

casos onde a proporção de princípio ativo é muito pequena em relação aos

excipientes.

 Esse trabalho é mais uma contribuição na perspectiva de assegurar a

confiabilidade dos medicamentos magistrais, no que se refere a sua eficácia,

segurança e qualidade, desde que sejam manipulados utilizando técnicas

adequadas, em obediência aos compêndios farmacopéicos utilizados e as

legislações sanitárias vigentes.

REFERÊNCIAS

ALBERTAZZI, P.; DI MICCO, R.; ZANARDI, E. Tibolone: A review.

Maturitas The

European Menopause Journal, v. 30, p. 299-305, 1998.

ANTUNES JUNIOR, D.

Farmácia de Manipulação: Noções Básicas. São Paulo:

Tecnopress, 2002. 140p.

APPELBLAD, P. et al. Derivatization of Steroids with Dansylhydrazine Using

Trifluormethanesulfonic Acid as Catalyst.

Analytical Chemistry, v. 69. n. 23, p.

4905-4511, Dec. 1, 1977.

AQUINO NETO, F. R. de; NUNES, D. da S. e S.

Cromatografia: Princípios

Básicos e Técnicas Afins. Rio de Janeiro: Interciencia, 2003. 187p.

AULTON, M. E.

Delineamento de Formas Farmacêuticas. 2. ed. Porto Alegre:

Artmed, 2005. 677p.

BARROS NETO, B. de; SCARMINIO, I. S.; BRUNS, R. E.

Como Fazer

Experimentos: Pesquisa e desenvolvimento na ciência e na Tecnologia. 3. ed.

Campinas: UNICAMP, 2007. 480p.

BARROS, C. B. de. Validação de Métodos Analíticos.

Biológico, São Paulo, v.

64, n. 2, p. 175-177, jul./dez. 2002.

BEHRE, H. M.; NIESCHLAG, E. Testosterone Buciclate (20 Aet-1) in

Hypogonadal Men: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of the New Long-

Acting Androgen Ester.

Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. v.

75, n. 5, p. 1204-1210, 1992.

BLANCO, M.; BAÑO, R. G.; BERTRAN, E. Monitoring Blending in Pharmaceutical

Processes by Use of Near Infrared Spectroscopy.

Talanta, v. 56, n. 1, p. 203-212,

4 Jan. 2002.

BLOOM, M. et al. Metabolism of Tibolone and its Metabolites in Uterine and

Vaginal Tissue or Rat and Human Origin.

Journal of Steroidal Biochemistry &

Molecular Biology, v. 101, p. 42-49, 2006.

BRASIL, ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RDC nº. 33 de 19 de

abril de 2000. Regulamento Técnico sobre Boas Práticas de Manipulação de

Medicamentos em Farmácias e seus Anexos.

Diário Oficial da União, Brasília, 8

jan. 2001. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/e-legis/

>. Acesso em: 19 jul.

2008.

______ . RDC nº. 67 de 08 de outubro de 2007. Dispõe sobre Boas Práticas de

Manipulação de Preparações Magistrais e Oficinais para Uso Humano em

farmácias. Diário Oficial da União, Brasília, 09 out. 2007. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/e-legis/

>. Acesso em: 19 jul. 2008.

______ . Consulta Pública nº. 31, de 15 de abril de 2005. Proposta de

Regulamento Técnico sobre “Boas Práticas de Manipulação de Medicamentos

para Uso Humano em Farmácias, e seus Anexos”.

Diário Oficial da União,

Brasília, 18 abr. 2005. n. 73, Seção I, p. 85. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/e-legis/

>. Acesso em: 28 ago. 2008.

______ .

Fármacos manipulados têm sido consumidos cada vez mais.

Texto da Escola Nacional de Saúde Pública (ENSP). Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/divulga/artigos/farmacos.htm

>. Acesso em: 15 jun.

2008.

______ . Lei nº. 9787, de 10 de fevereiro de 1999. Altera a Lei nº. 6.360, de 23 de

setembro de 1976, que dispõe sobre a vigilância sanitária estabelece o

medicamento genérico, dispõe sobre a utilização de nomes genéricos em

produtos farmacêuticos e dá outras providências.

Diário Oficial da União, Poder

Executivo, de 11 de fevereiro de 1999. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/e-legis/

>. Acesso em: 15 abr. 2008.

______ . Resolução RE 899, de 29 de maio de 2003. Determina a publicação do

"Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos”.

Diário Oficial da

União, Brasília, 2 jun. 2003. Disponível em: < http://www.anvisa.gov.br/e-legis/>.

Acesso em: 19 abr. 2008.

______ .

Subsídios à discussão sobre a proposta de regulamentação para

farmácias magistrais. Texto apresentado pela Diretoria Colegiada da Anvisa em

Audiência Pública realizada na Câmara dos Deputados. Brasília, jun. 2005.

Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/divulga/artigos/subsidios.pdf

>. Acesso

em: 15 jun. 2008.

______ .

Uma melhor regulamentação para os medicamentos manipulados

no Brasil. Texto da Escola Nacional de Saúde Pública (ENSP). Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/divulga/artigos/farmacos_1.htm>. Acesso em: 28 ago.

2008.

______.

CLONIDINA - medicamento manipulado. Alerta SNVS/Anvisa/Ufarm nº

9, de 3 de outubro de 2003. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/

farmacovigilancia/alerta/federal/2003/federal_9_03.htm>. Acesso em: 09 jun.

2008.

______ .

Proibida a manipulação da Clonidina em todo o País. Texto da

Escola Nacional de Saúde Notícias da Anvisa.

Disponível em:<http://www.anvisa.

gov.br/DIVULGA/noticias/2003/031003.htm>. Acesso em: 15 mar. 2008.

BRESSOLLE, F.; BROMET-PETIT, M.; AUDRAN, M. Validation of Liquid

Chromatographic and Gas Chromatographic Methods: Applications to

Pharmacokinetics.

Journal of Chromatography B, v. 686, p.3-10, 1996.

BRITISH PHARMACOPOEIA. London: Her Magesty’s Stationary Office, v. I, 2003.

BUDAVARI, S. (Ed.).

The Merck Index. 12. ed. New Jersey: Merck & Co., 1996.

1741p.

BURGER, D. M. et al. Low plasma concentration of indinavir are related to

virological treatment failure in HIV-1-infected patients on indinavir-containing triple

therapy.

Antiviral Therapy. v. 3, n. 4, p. 215-220, Nov. 1998.

CAZEDEY, E. C. L. et al. Desenvolvimento e Validação de Métodos Analíticos

para Determinação de Itraconazol em Produtos Farmacêuticos por CLAE.

Química Nova, Rio de Janeiro, v. 30, n. 4, p. 774-776, 2007.

COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BOMNATO, P. S. (Coord.)

Introdução a

Métodos Cromatográficos. 4. ed. Campinas: UNICAMP, 1990. 279p.

DAVIS, R. L. et al. Amikacin pharmacokinetics in patients receiving high-dose

cancer chemotherapy.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy. v. 25, n. 5, p.

944-947, 1991.

DIVISÃO Geométrica e Homogeneização de pós.

ANFARMAG Revista do Setor

Farmacêutico Magistral, São Paulo, v. 14, n. 70, p. 11-14, jan./fev. 2008.

Encarte Técnico n. 22.

DUBEY, R. K. et al. Tibolone and Its Metabolites Induce Antimitogenesis in

Human Coronary Artery Smooth Muscle Cells: Role of Estrogen, Progesterone

and Androgen Receptors.

Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, v.

89, n. 2, p. 852-859, 2004.

EL-HAGRASY, A. S. et al. Near-infrared Spectroscopy and Imaging for the

Monitoring of Powder Blend Homogeneity.

Journal of Pharmaceutical Sciences.

v. 90, n. 9, p. 1298-1307, 2001.

ERMER, J.; MILLER, J. H. McB. (Eds.)

Method Validation in Pharmaceutical

Analysis:

A Guide to Best Practice. Weinheim: Willey-VCH, 2005. 527p.

FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 4. ed. Parte

I. São Paulo: Atheneu, 1988.

FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 4. ed. Parte

II. São Paulo: Atheneu, 1996.

FERREIRA, A. de O.

Guia Prático da Farmácia Magistral. 2.ed. Juiz de Fora:

OESP Gráfica. 2002. 845p.

GEHRING, R. et al. Multivariate meta-analysis of pharmacokinetics studies of

ampicillin trihydrate in cattle.

American Journal of Veterinary Research. v. 66, n.

1, p. 108-112, Jan. 2005.

GIL, E. de S. (Org.).

Controle físico-químico de Qualidade de Medicamentos.

2. ed. São Paulo: Pharmabooks, 2007.485p.

HARRIS, D. C. Cromatografia Liquida/Espectrometria de Massa. In:_Análise

Química Quantitativa. 5. ed. Rio de Janeiro: LTC, 2001. 862p. Cap. 25, p. 640-

649.

HYYTIAINEN, M. et al. Trifluoromethanesulfonic Acid as a Catalist for the

Formation of Dansylhydrazone Derivatives.

Journal of Chromatography A, v.

740, p.279-283, 1996.

ITO, M. et al. Development of a Method for the Determination of Caffeine

Anhydrate in Various Designed Intact Tablets by Near-infrared Spectroscopy: A

Comparison Between Reflectance an Transmittance Technique.

Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 47, p. 819-827, 2008.

KACHIGAN, S. K.

Multivariaate Statistical Analisys: A conceptual Introduction.

2. ed. Neuw York: Radius Press, 1991. 303p.

LACHMAN, L.; LIEBERMAN, H. A.; KANIG, J.L.

Teoria e pratica na Industria

Farmacêutica. Lisboa: Calouste Gulbenkian, 2001. v. 1 e 2, 1517p.

LI, W.; WOROSILA, G. D. Quantification of Active Pharmaceutical Ingredientes

and Calibration Models by Near-Infrared Spectroscopy.

International Journal of

Pharmaceutics, v. 295, p.213-219, 2005.

LIMA, L. F. M. et al.

Vigilância Sanitária de Medicamentos e Correlatos. Rio de

Janeiro: Qualitymark, 1993. 329p.

MA, H.; ANDERSON, C. A. Caracterization of Pharmaceutical Powder Blends by

NIR Chemical Imaging.

Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 97, n. 8, p.

3305-3320, Aug. 2008.

MATHEWS, L. et al. Monitoring Blend Uniformity with Effusivity.

Pharmaceutical

Technology,

p. 80-84, Abr. 2002.

MENDHAM, J. et al. (Rev.).

Vogel Análise Química Quantitativa. 6. ed. Rio de

janeiro: LTC, 2002. 462p.

MILLER, J. N.; MILLER, J. C.

Estadistica y Químiometria para Química

Analitica. 4. ed. Madrid: Prentice Hall, 2002. 196p.

X DA MANIPULAÇÃO. ANVISA Boletim Informativo, Brasília, n. 56, p.6-8,

jun. 2005.

PAUMGARTTEN, F. J. Papel das farmácias magistrais deve ser complementar.

ANVISA Boletim Informativo, Brasília, n. 56, p.4-5, jun. 2005.

PERALTA-ZAMORA, P.; MORAIS, J. L.; NAGATA, N. Por Que Otimização

Multivariada?

Engenharia Sanitária e Ambiental, Rio de Janeiro, v. 10, n. 2 p.

106-110, abr./jun. 2005.

PETRY, R. D. et al. Influencia de Adjuvantes e Técnica de Enchimento Sobre as

Características Farmacêuticas de Cápsulas de Gelatina Duras contendo Teofilina.

Caderno de Farmácia, v. 14, n. 1/2, p. 13-19, 1998.

PITSIU, M. et al. Retrospective population pharmacokinetic analysis of cetrizine in

children aged months to 12 years.

British Journal of Clinical Pharmacology. v.

57, n. 4, p. 402-411, Apr. 2004.

PORTA, V. et al. Método Analítico para a Determinação de Meloxican em Plasma

humano por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).

Revista Brasileira

de Ciências Farmacêuticas, São Paulo, v. 41, n. 2, p. 215-222, abr./jun., 2005.

RILEY, C. M.; ROSANSKE, T. W. (Eds.).

Development and Validation of

Analitycal Methods. Oxford: Pergamon, 1996. 442p.

SAKAMOTO, T.; FUJIMAKI, Y.; HIYAMA, Y. Studies on the Influence of Uniformity

of Particle Size of Powder, Trapping and Sample Replacement for Diffusion

Reflectance Quantitative NIR Spectrometric Analysis.

Pharmazie, v. 62, n. 11, p.

841-846, Nov. 2007.

SÁNCHES, F. C. et al. Monitoring Powder Blending by NIR Spectroscopy.

Fresenius Journal of Analytical Chemistry, v. 352, p. 771-778, 1995.

SASAKI, Y. et al. A Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of CTP-11

and its Active Metabolite SN-38.

Cancer Science. v. 86, n. 1, p. 101-110, Aug.

2005.

SEKULIC, S. S. et al. Automated System for the on-Line Monitoring of Powder

Blending Processes Using Near-Infrared Spectroscopy. Part II: Quantitative

Approaches to Blend Evaluation.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis,

v. 17, p. 1285-1309, 1998.

SILVA, A. V. da; GOMES, S. F. de O. Desenvolvimento e Validação de

Metodologia Analítica.

ANFARMAG Revista do Setor Farmacêutico Magistral,

São Paulo, v. 14, n. 70, p. 2-10, jan./fev. 2008. Encarte Técnico n. 22.

SINAMM: Novos Paradigmas para a Farmácia Magistral.

ANFARMAG Revista

do Setor Farmacêutico Magistral, São Paulo, v. 14, n. 72, p. 8-21, mai./jun.

2008.

SKOOG, D. A. et al.

Fundamentos de Química Analítica. 8.ed. São Paulo:

Tomson, 2006. 999p.

SNYDER, L. R.; KIRKLAND, J. J. GLAJCH, J. L.

Practical HPLC Method

Development. 2. ed. New York: Willwy & Sons, 7997.745p.

SON, J. et al. Improved Detectability in Pharmacokinetic Study of Tibolone by Gás

Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry with selected Íon

Monitoring.

Talanta, v. 70, p. 37-42, 2006.

SPEROFF, L.; CLARKSON, T. B. Cover Story: Is tibolone a viable alternative to

HT?

Contemporary Ob/Gyn. V. 48, n.1, p. 54-68, Aug. 2003.

SWEGLE, J. M. Tibolone: A Unique Version of Hormone Replacement Therapy.

The Annals of Pharmacotherapy. v. 38, n.. 5, p. 874-881, 2004.

TAPLIN, L. A.; ABRAN, K. M.; MICHAELS, S. K. Blood alcohol level among

emergency room patients: a multivariate analysis.

Journal of Studies on

Alcohol. v. 50, n. 5, p. 441-447, Sep. 1989.

THE UNITED STATES PHARMACOPOEIA. 28. ed. Rockville: United States

Convention, 2004.

TIMMER. C. J.; DOORSTAM, D. P. Effect of Renal Impairment on the

Pharmacokinetics of a Single oral Dose of Tibolone 2,5 mg in Early

Postmenopausal Women.

Pharmacotherapy, v. 22, n.2, p. 184-153, 2002.

TIMMER. C. J.; VERHEUL, H. A. M.; DOORSTAM, D. P. Pharmacokinetics of

Tibolone in Early and Late Postmenopausal Women.

British Journal of Clinical

Pharmacology, v. 54, n. 2, p. 101-106, Aug. 2002.

TU, WEI-DA et al. The Effect of Powder S on Induction Behavior and Binder

Distribution During High Shear Melt Agglomeration of Calcium Carbonate.

Powder

Technology, v. 184, p. 289-312, 2008.

VERHEUL, H. A. M. et al. Pharmacokinetic Parameters of Tibolone and

Metabolites in Plasma, Urine, Feces and Bile from Ovariectomized Cynomolgus

Monkeys after a Single Dose or Multiple Doses of Tibolone.

Drug Metabolism

and Disposition, v. 35, n. 7, p. 1112-1118, 2007.

______ . Selective Tissue Distribution of Tibolone Metabolites in Mature

Ovariectomized Female Cynomolgus Monkeys after Multiple Doses of Tibolone.

Drug Metabolism and Disposition, v. 35, n. 7, p. 1105-1111, 2007.

VERHEUL, H. A. M.; KLOOSTERBOER, H. J. Metabolism of Exogenous Sex

Steroids and Effect on Brain Functions with Focus on Tibolone.

Journal of

Steroidal Biochemistry & Molecular Biology, v. 102, p. 195-204, Dec. 2006.

VOS, R. M. E. et al. The in Vivo Human Metabolism of Tibolone.

Drug

Metabolism and Disposition, v. 30, p. 106-112, 2002.

WAJIMA, T. et al. Prediction of human pharmacokinetics from animal data and

molecular structural parameters using multivariate regression analysis: Oral

clearance.

Journal of Pharmaceutical Sciences. v. 22, n. 12, p. 2427-2440, Sep.

2003.

WARGO, D. J.; DRENNEN, J. K. Near-Infrared Spectroscopic Characterization of

Pharmaceutical Powder Blends.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, v. 14, p. 1415-1423, 1996.

YIN, T. A Guide to Blend Uniformity. Journal of GXT Compliance, 10 Out. 2007.

YU, W.; HANCOCK, B. C. Evaluation of Dynamic Image Analysis for

Characterizating Pharmaceutical Excipient Particles.

International Journal of

Pharmaceutics. v. 361, p. 150-157, 2008.

ZARBIELLI, M. G.; MACEDO, S.; MENDEZ, A. L. Controle de Qualidade de

Cápsulas de Piroxicam Manipuladas em Farmácias do Município de Erechim

(RS).

Infarma, v. 10, n. 1/2, 2007.

ZUO, M. et al. p-Toluenesulfonyl Isocianate as a Novel Reagent to Enhance the

Eletrospray Ionization and its Application in the Determination of Two Stereo

isomers of 3-Hydroxyl-7-methyl-norethylnodrel in Plasma.

Journal of

Chromatography B, v. 814, p.331-337, 2005.

______ . Stereoseletivity in Metabolic 3-reduction of Tibolone in Healthy Chinese

Female Volunteers.

Acta Pharmacologica Sinica, v. 26, n. 12, p. 1527-1530,

Dec. 2005.

A N E X O S

100

ANEXO a

Derivatization of tibolone with dansylhydrazine using trifluoromethanesulfonic acid

as a catalyst: Quantification by HPLC with fluorescence detection

Cândido J.A., Figueiredo E.A. and Oliveira, E.J.

Programa de Pós Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos: Laboratório de

Tecnologia Farmacêutica,Universidade Federal da Paraíba, Caixa Postal 5080, CEP:

58051-970, João Pessoa, Paraíba, Brazil.

Introduction

Tibolone (®Livial, Organon) is a synthetic steroid (1) used in hormone replacement

therapy for the relief of menopausal symptoms (Swegle, 2004). Tibolone has a poor

chromophore and thus it is often quantified using mass spectrometric detection. The

derivatization of several steroids with dansyl hydrazine using trifluoromethanesulfonic

acid as a catalyst has been described (Appleblad et. al., 1997). While the derivatization

reaction can be accomplished using mild reaction conditions, with almost quantitative

yield, the method described by Applebad had several limitations, the most important ones

being: (a) the need for a concentration column for the chromatographic separation of the

hydrazone and (b) the formation of diastereomeric syn- and anti-hydrazones with some of

the steroids investigated. Our aim was to develop a sensitive and simple method for

quantification of tibolone using fluorescence detection by investigating the derivatization

of tibolone with dansyl hydrazine (2) in order to form a fluorescent hydrazone adduct (3),

without the limitations previously described for other steroids.

Methods

Derivatization of the steroid Tibolone (kindly donated by Organon) was derivatized

with dansyl hydrazine (Sigma-Aldrich) using trifluoromethanesulfonic acid (Sigma-

Aldrich) as a catalyst. Tibolone and dansylhydrazine stock solutions (1mg/mL) were

prepared in methanol and then diluted to give the final concentrations needed for each

experiment. The concentration of the catalyst was fixed at 5%. The reactions were done

using 2mL screw-capped vials and a termoblock for heating. A fractional factorial

experimental design was implemented using Modde v.4.0 (Umetrix) to investigate the

effects of the following parameters on the yield of the derivatization reaction: molar ratio

of dansyl hydrazine to tibolone (range: 20 to 50), reaction temperature (range: 37 to 50 ºC)

and reaction time (range: 17 to 30 minutes). Multivariate linear regression was used to

evaluate the effects of each parameter and their combinations on the reaction yield. After

setting the limits for each parameter to be investigated, the software suggested a total of 11

experiments (Table 1) varying each of the 3 parameters investigated. The area of the

fluorescent derivative in the chromatogram obtained by injecting samples from each of the

11 experiments was calculated and fed to the software as yield to be optimized.

Chromatographic separation The HPLC system consisted of a low gradient

chromatograph (from Shimadzu, Japan) with a column oven (CTO-10AS), a degasser

(DGU-14A), a fluorescence detector (RF-10A), a controller module (SCL-10A) and a

101

manual injector fitted with a 20 L sample loop. The derivatization samples were

chromatographed using a monolithic column (Merck Chromolith performance 100 mm x

4.6 mm ID) with a flow rate of 3 mL/min and an injection volume of 20 L. The mobile

phase consisted of 50mM ammonium acetate buffer pH 6.8 and acetonitrile (92,5:7,5,v/v).

Samples of the reaction medium were diluted 1:1 with 1M phosphate buffer pH 7.0 and

directly injected into the chromatograph. The fluorescence detector was configured to use

an excitation wavelength of 320 nm and an emission wavelength of 520 nm.

Results

Table 1. Experimental conditions suggested for the derivatization of tibolone using a

fractional factorial design with Modde v.4.0 (Umetrix)

Exper. Number Molar ratio* Temperature (ºC) Time(min.) Order

1 20 37 17.0 7

2 50 37 17.0 8

3 20 50 17.0 1

4 50 50 17.0 11

5 20 37 30.0 6

6 50 37 30.0 4

7 20 50 30.0 9

8 50 50 30.0 5

9 35 35 23.5 3

10 35 35 23.5 10

11 35 35 23.5 2

* Molar ratio of dansyl hydrazine to tibolone.

102

Figure 1. Surface response maps showing the effects of molar ratio of dansylhydrazine to

tibolone, temperature and reaction time, on the yield of the derivatization reaction.

Dansilhidrazina

Tibolona

Aduto (derivado fluorescente)

(

)

Fluorescent adduct

(

)

Dans

l h

drazine

(1) Tibolone

103

Figure 2. Chromatogram showing the detection of the fluorescent derivative of tibolone (3

g/mL, rt = 6.7 minutes).

Figure 3. Multivariate linear regression (MLR) modeling of data showing predicted versus

observed values for yield

The use of a fractional factorial design allowed a systematic investigation of

reaction parameters on the yield of the derivatization reaction. Figure 1 shows the

relationship between these parameters and yield using surface response maps. The highest

reaction yield was achieved using temperatures at around 40-47 ºC, and molar ratio of

dansyl hydrazine to tibolone of 30-40. The duration of the reaction proved to be an

important factor, with reaction times greater than 20 minutes clearly leading to poor yield.

It is worth noting that the reaction of dansyl hydrazine with tibolone does not appear to

104

form the diastereomeric syn- and anti-hydrazones that were detected with other steroids,

for example progesterone (Appelblad et. al., 1997). Indeed, the single peak in the

chromatogram of the reaction medium (Figure 2) suggests that a single isomer is formed.

This is advantageous for quantification purposes, since a single peak is integrated instead

of having to use the sum of two integrated diastereomeric peaks. This aspect of the reaction

needs confirmation by spectroscopic techniques, but computer calculations suggests

differences in the stereochemistry of the carbonyl that could explain the differences in

regioselectivity observed. In our work the concentration of trifluoromethanesulfonic acid

proved to be crucial for a proper retention of the fluorescent derivative formed. Since

Appelbad (Appelblad et al., 1997) showed that the catalyst concentration is not an

important factor in determining the yield of this reaction, our experiments were conducted

with a fixed concentration of the acid (5%). Higher concentrations caused a marked drop in

retention, with the peak of the derivative eluting at the void volume of the column. The

modelling of data by multivariate linear analysis showed an excellent predictability of the

model (r2=0,99). Finally, the use of a monolithic column with a flow rate of 3mL/min.

allowed tibolone to elute at 6.9 min. using a mobile phase with 7.5% of acetonitrile. The

method can be optimized to have shorter retention times using a higher proportion of

organic modifier, decreasing even further analysis time.

Conclusions

1. The reaction of tibolone with dansylhydrazine using trifluoromethanesulfonic acid as a

catalyst does not appear to form diastereomeric syn- and anti-hydrazones .

2. The concentration of trifluoromethanesulfonic acid (catalyst) at 5% is crucial for the

proper retention of the derivative formed.

3. The optimum yield was achieved using a molar ratio of dansyl hydrazine to tibolone of

40, a reaction time of 20 minutes and a temperature of 48 ºC.

Acknowledgements

The authors wish to thank Organon for donating tibolone reference standard and CNPq for

financial support

References

Swegle, J.M. (2004). Tibolone: A Unique Version of Hormone Replacement Therapy. The

Annals of Pharmacotherapy. 38 (5), 874-881.

Appelblad, P. et al. (1997). Derivatization of Steroids with Dansylhydrazine Using

Trifluoromethanesulfonic Acid as Catalyst. Analytical Chemistry. 69, 4905-4911.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 