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CONTRIBUIÇÃO À AVALIAÇÃO FARMACOGNÓSTICA
DAS PRINCIPAIS ERVAS CIDREIRAS UTILIZADAS NO
BRASIL
JOSÉ LUIZ PINTO FERREIRA
NPPN/UFRJ - DOUTORADO
ANA CLÁUDIA FERNANDES AMARAL
DOUTORA EM CIÊNCIAS
RICARDO MACHADO KUSTER
DOUTOR EM CIÊNCIAS
RIO DE JANEIRO
2008
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iii
Ficha Catalográfica
Ferreira, José Luiz Pinto
Contribuição à avaliação farmacognóstica das
principais ervas cidreiras utilizadas no Brasil./ José
Luiz Pinto Ferreira.- Rio de Janeiro: UFRJ/NPPN,
2008.
xix, 203 p.; 142 il.
Tese (doutorado) – UFRJ/NPPN - Programa de Pós-
graduação em Química de Produtos Naturais, 2008.
Orientadores: Ana Claudia Fernandes Amaral e
Ricardo Machado Kuster.
1. Cymbopogon citratus 2. Lippia alba 3. Melissa
officinalis 4. Anatomia vegetal. 5. Perfil
cromatográfico
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iv
ESTE TRABALHO FOI REALIZADO SOB A ORIENTAÇÃO DOS
PROFESSORES ANA CLÁUDIA FERNANDES AMARAL DE
FARMANGUINHOS/FIOCRUZ E RICARDO MACHADO KUSTER DO
NÚCLEO DE PESQUISAS DE PRODUTOS NATURAIS DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
v
Dedico a memória dos meus pais, Nicéa Pinto Ferreira e João Ferreira e
ao meu irmão Fernando Luiz Pinto Ferreira pela presença constante e
apoio irrestrito em todos os momentos dessa longa caminhada.
vi
AGRADECIMENTOS
Aos professores Dra. Ana Cláudia Fernandes Amaral e Dr. Ricardo Machado
Kuster pela orientação, amizade, confiança, incentivo e apoio indispensáveis para o
desenvolvimento deste trabalho.
Às Farmacêuticas Renata Bastos de Araújo e Dra. Naomi Kato Simas pelo
auxílio incansável nos trabalhos de bancada.
Ao Farmacêutico Alexandre Xavier pelos espectros ESI e por colaborar com
toda paciência e cuidado extremo na diagramação do formato final do trabalho.
Ao Químico Licínio de Almeida Fontoura pela ajuda na reprodução gráfica dos
espectros e cromatogramas.
À Técnica Química Antônia Eliete Soares de Paula e a Química Industrial Eliane
Velasco Simões pela colaboração nos trabalhos iniciais de bancada.
Às alunas do Programa de Iniciação científica de Farmanguinhos e formandas da
Faculdade de Farmácia da UFF Arith Ramos de Souza e Luíza Ferreirinha pelo apoio na
obtenção dos óleos essenciais.
À bióloga Dra. Sandra Aparecida Padilha Magalhães Fraga e sua equipe do
Laboratório de Produção de Biomassa e de Matéria-Prima Vegetal pela obtenção das
amostras das espécies botânicas.
À Central Analítica da unidade pela realização dos espectros das substâncias
isoladas.
Aos colegas e amigos da Faculdade de Farmácia da UFF, Professores: Dra
Eliane Souza Carvalho, Dr. Leandro Machado Rocha e Dr. Wilson da Costa Santos
(Diretor da Unidade) pelo estímulo na realização do trabalho.
Às memórias de Ottília Gitahy e Didi por toda a contribuição afetiva
demonstradas ao longo da vida.
À todos os amigos que de alguma forma contribuíram para a elaboração deste
trabalho.
vii
RESUMO
Neste trabalho, as folhas de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (Poaceae), Lippia
alba (Mill.) N.E.Br. ex Britt. & Wilson (Verbenaceae) e Melissa officinalis L.
(Lamiaceae), cultivadas em canteiros experimentais e denominadas popularmente, entre
outros nomes, como “ervas cidreiras”, foram estudadas quanto aos aspectos químico e
anatômico. Os seus óleos essenciais, obtidos por hidrodestilação, foram analisados por
CG/EM, resultando em perfis cromatográficos que contribuíram para relacioná-los com
as suas origens específicas. Da mesma forma, os seus extratos polares (aquosos e
hidroalcoólicos), obtidos por decocção, infusão e maceração em álcool (70%) das folhas
frescas e secas, foram analisados por CLAE/DAD ao longo de coletas sazonais e os
respectivos perfis cromatográficos demonstraram ocorrer variações nos teores de suas
principais substâncias fenólicas (derivados flavonóides e fenilpropanóides). Para a
diferenciação química destes perfis foram isoladas as substâncias isoorientina (C.
citratus), verbascosídeo (L. alba) e ácido rosmarínico (M. officinalis) que serviram
como referência dos respectivos extratos. Durante as etapas de isolamento foram
também obtidos o ácido trans-p-cumárico e o fenilpropanóide isoverbascosídeo.
Adicionalmente, com o intuito de definir critérios morfológicos que auxiliem o controle
da qualidade de produtos que apresentem em sua composição biomassa das ervas
cidreiras estudadas, foram realizados cortes histológicos das folhas e caules e analisadas
as características anatômicas de cada uma em conjunto com o estudo micrográfico do
material pulverizado.
viii
ABSTRACT
The present work focused on the chemical and anatomical aspects of the leaves of
Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (Poaceae) and Lippia alba (Mill.) N.E.Br. ex Britt. &
Wilson (Verbenaceae) and Melissa officinalis L. (Lamiaceae), popularly known as
"ervas cidreiras", which were cultivated in experimental plots. Their essential oils,
obtained by hydrodistillation, were analyzed by GC/MS and have presented
chromatographic profiles that have contributed to relate them to their specific origins.
Similarly, their polar extracts (aqueous and hydroalcoholics), obtained by decoction,
infusion and alcohol maceration (70%) of the dried and fresh leaves, were analyzed by
CLAE/DAD across season harvests and the respective chromatographic profiles showed
the occurrence of variations on the contents of their main phenolic substances
(flavonoid and phenylpropanoid constituents). For the sake of chemical diferentiation of
these profiles, there were isolated the substances isoorientin (C. citratus), verbascoside
(L. alba) and rosmarinic acid (M. officinalis), which served as reference for the related
extracts. During the isolation processes, trans-p-coumaric acid and the isoverbascoside
phenylpropanoid were also obtained. Additionally, aiming to define the morphological
criteria that may help assuring the quality control of products that contain a biomass of
the “ervas cidreiras” presently under study, there were made histological sections of the
leaves and stems and an analysis of the anatomical characteristics of each one together
with the micrograph study of the powdered botanical material.
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E FÓRMULAS
CCD-Si - Cromatografia em camada delgada de gel de sílica
CCD-RP-18 - Cromatografia em camada delgada em fase reversa RP-18
d
- Sinal duplo
dd
- Duplo dubleto
s
- Sinal largo
s
- Sinal simples
t
- Sinal triplo
m
- Sinal múltiplo
q
- Sinal quadruplo
Hz - Hertz
ppm - Parte por milhão
J - Constante de acoplamento
Pg. - Página
Tab. - Tabela
UV - Ultravioleta
VS - Vanilina sulfúrica
OS - Orcinol sulfúrico
NP/PEG - Natural Products-Polyethyleneglycol
MHz - Megahertz
Da - Daltons
CG/EM - Cromatografia gasosa acoplada ao espectômetro de massas
COSY - Correlated Spectroscopy
EM - Espectro de massas
RMN
1
H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN
13
C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
HMQC - Heteronuclear Single-Quantum Coherence
HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation Experiment
AcOEt - Acetato de etila
MeOH - Metanol
CH
2
Cl
2
- Diclorometano
CDCl
3
- Clorofórmio deuterado
CD
3
OD - Metanol deuterado
DMSO - Dimetilsulfóxido
EtOH - Etanol
H
2
O - Água
x
ÍNDICE DE TABELAS
TABELA 1: Rendimentos dos óleos essenciais das ervas cidreiras cultivadas
em Jacarepaguá (Rio de Janeiro/RJ)
43
TABELA 2 - Determinação da rotação óptica e índice de refração dos óleos
essenciais das folhas de L. alba
72
TABELA 3 - Determinação do índice de refração e da rotação óptica do óleo
essencial das folhas de C. citratus e comparação com os dados encontrados na
literatura
81
TABELA 4 – Teores de geranial e neral ao longo de duas coletas em C.
citratus, L. alba (quimiotipo citral) e M. officinalis.
89
TABELA 5 - Primeira Coleta/Folha Fresca (C. citratus) 90
TABELA 6 - Primeira Coleta/Folha Seca (C. citratus) 91
TABELA 7 - Segunda Coleta/Folha Fresca (C. citratus) 92
TABELA 8 - Segunda Coleta/Folha Seca (C. citratus) 92
TABELA 9 - Correlações dos teores em área% total para flavonóides e
fenilpropanóides obtidos pelos métodos extrativos selecionados, de acordo
com os perfis cromatográficos estabelecidos para a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª coletas de
Cymbopogon citratus. FL (flavonóide), FP (fenilpropanóide), FF (folhas
frescas), FS (folhas secas).
93
TABELA 10 - Primeira Coleta/Folha Fresca (L. alba quimiotipo linalol) 96
TABELA 11 - Primeira Coleta/Folha Seca (L. alba quimiotipo linalol) 96
TABELA 12 -: Segunda Coleta/Folha Fresca (L. alba quimiotipo linalol) 97
TABELA 13 - Segunda Coleta/Folha Seca (L. alba quimiotipo linalol) 97
TABELA 14 - Terceira Coleta/Folha Fresca (L. alba quimiotipo linalol) 98
TABELA 15 - Terceira Coleta/Folha Seca (L. alba quimiotipo linalol) 98
TABELA 16 - Quarta Coleta/Folha Fresca (L. alba quimiotipo linalol) 99
TABELA 17 - Quarta Coleta/Folha Seca (L. alba quimiotipo linalol) 99
TABELA 18 - Correlações dos teores em área% total para flavonóides e
fenilpropanóides obtidos pelos métodos extrativos selecionados, de acordo
com os perfis cromatográficos estabelecidos para a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª coletas do
quimiotipo linalol de Lippia alba. FL (flavonóide), FP (fenilpropanóide), FF
(folhas frescas), FS (folhas secas).
100
TABELA 19 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
1
H em DMSO-d
6
obtidos para FLCCH02 e os encontrados na literatura
no mesmo solvente.
136
TABELA 20 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
13
C obtidos para FLCCH02 com suas multiplicidades e os encontradosna
literatura para o mesmo solvente.
137
TABELA 21 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
1
H em CD
3
OD obtidos para CC10-20-2 e os encontrados na literatura,
no mesmo solvente, para o malato de trans-cumarila
144
TABELA 22 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
13
C obtidos para CC10-20-2 com suas multiplicidades e os encontrados
na literatura para o maleato de trans-cumarila.
144
TABELA 23 - Correlações encontradas no espectro HMQC de CC10-20-2.
145
xi
TABELA 24 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
1
H em DMSO obtidos para LAB-03-02/43 e os encontrados na literatura.
151
TABELA 25 - Correlações atribuídas aos hidrogênios no espectro COSY de
LAB-03-02/43
152
TABELA 26 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
13
C obtidos para LAB-03-02/43 com suas multiplicidades e os
encontrados na literatura
154
TABELA 27 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
1
H em CD
3
OD obtidos para LaA1FVC144-148-5e os encontrados na
literatura.
162
TABELA 28 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
13
C em CD
3
OD obtidos para LaA1FVC144-148-5 com suas
multiplicidades e os encontrados na literatura
163
TABELA 29 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
13
C em CD
3
OD entre o verbascosídeo da literatura e o isoverbascosídeo
isolado de L. alba (LaA1FVC144-148-5) com as suas multiplicidades.
164
TABELA 30 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
1
H em CD
3
OD entre o verbascosídeo da literatura e o isoverbascosídeo
isolado de L. alba (LaA1FVC144-148-5).
164
TABELA 31 - Correlações encontradas no espectro HMQC de
LaA1FVC144-148-5
165
TABELA 32 - Correlações encontradas no espectro HMBC de LaA1FVC144-
148-5
166
TABELA 33 - Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
1
H em DMSO-d
6
obtidos para “MoAF FAQ p/p maj” e os encontrados
na literatura.
178
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1 – Cymbopogon citratus (DC.) Stapf 3
FIGURA 2 – Lippia alba (Mill.) N.E.Br. ex Britt. & Wilson (quimiotipo
citral)
15
FIGURA 3 – Melissa officinalis L. 30
FIGURA 4 - Cymbopogon citratus. Aspecto geral 52
FIGURA 5 – Folhas de Cymbopogon citratus. Detalhes das faces superior
(esquerda) e inferior (direita) – (10X)
53
FIGURA 6 – Secção transversal da lâmina foliar de Cymbopogon citratus.
Detalhe da região mediana – (100X)
54
FIGURA 7 – Secção transversal da lâmina foliar de Cymbopogon citratus.
Detalhe do feixe vascular – (200X)
54
FIGURA 8 – Aspecto do material pulverizado da folha de Cymbopogon
citratus – (400X)
55
FIGURA 9 – Lippia alba quimiotipo citral. Aspecto geral 56
FIGURA 10 - Lippia alba quimiotipo carvona. Aspecto geral 56
FIGURA 11 - Lippia alba quimiotipo citral. Ramo foliar 57
FIGURA 12 - - Lippia alba quimiotipo linalol. Ramo foliar 57
FIGURA 13 - Lippia alba quimiotipo carvona. Ramo foliar 57
FIGURA 14 – Secção transversal da lâmina foliar de Lippia alba. Detalhe da
região do mesofilo com tricomas tectores unicelulares – (100X)
58
FIGURA 15 – Secção transversal da lâmina foliar de Lippia alba. Detalhe da
região da nervura central – (100X)
59
FIGURA 16 – Secção transversal da nervura central da folha de Lippia alba.
Detalhe dos tricomas tectores e glandulares – (600X)
59
FIGURA 17 – Aspecto do material pulverizado da folha de Lippia alba -
(400X)
60
FIGURA 18 – Melissa officinalis. Aspecto geral 61
FIGURA 19 - Melissa officinalis. Aspecto macroscópico das folhas 62
FIGURA 20 - Secção transversal da lâmina foliar de Melissa officinalis.
Detalhe da região do mesofilo com tricomas tectores unicelulares e
glandulares – (600X)
63
FIGURA 21 - Secção transversal da lâmina foliar de Melissa officinalis.
Detalhe da região do mesofilo com tricoma tector unicelular – (200X)
63
FIGURA 22 - Secção transversal da lâmina foliar de Melissa officinalis.
Detalhe da região do mesofilo e da nervura central – (100X)
64
FIGURA 23 – Aspecto do material pulverizado da folha de Melissa officinalis
– (300X)
65
FIGURA 24 – Fotomicrografias de secções transversais do caule de Lippia
alba
68
FIGURA 25 - Fotomicrografias de secções transversais do caule de Melissa
officinalis
70
FIGURA 26 – Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Lippia alba quimiotipo carvona (1ª coleta)
73
FIGURA 27 – Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Lippia alba quimiotipo carvona (2ª coleta)
74
xiii
FIGURA 28 – Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia
alba (quimiotipo carvona)
75
FIGURA 29 – Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Lippia alba quimiotipo citral (1ª coleta)
76
FIGURA 30 - Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Lippia alba quimiotipo citral (2ª coleta)
77
FIGURA 31 - Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia
alba (quimiotipo citral)
78
FIGURA 32 - Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Lippia alba quimiotipo linalol (1ª coleta)
79
FIGURA 33 - Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Lippia alba quimiotipo linalol (2ª coleta)
80
FIGURA 34 - Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia
alba (quimiotipo linalol)
81
FIGURA 35 - Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Cymbopogon citratus (1ª coleta)
83
FIGURA 36 - Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Cymbopogon citratus (2ª coleta)
84
FIGURA 37 - Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de
Cymbopogon citratus
85
FIGURA 38 - Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Melissa officinalis (1ª coleta)
86
FIGURA 39 - Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de
Melissa officinalis (2ª coleta)
87
FIGURA 40 - Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de
Melissa officinalis
88
FIGURA 41 – Teor de flavonóides em folhas frescas de Cymbopogon citratus 94
FIGURA 42 – Teor de fenilpropanóides em folhas frescas de Cymbopogon
citratus
94
FIGURA 43 – Teor de flavonóides em folhas secas de Cymbopogon citratus 95
FIGURA 44 – Teor de fenilpropanóides em folhas secas de Cymbopogon
citratus
95
FIGURA 45 – Teor de flavonóides em folhas frescas de Lippia alba
(quimiotipo linalol)
101
FIGURA 46 – Teor de fenilpropanóides em folhas frescas de Lippia alba
(quimiotipo linalol)
101
FIGURA 47 – Teor de flavonóides em folhas secas de Lippia alba
(quimiotipo linalol)
102
FIGURA 48 – Teor de fenilpropanóides em folhas secas de Lippia alba
(quimiotipo linalol)
102
FIGURA 49 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 1ª coleta
103
FIGURA 50 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 1ª coleta
103
FIGURA 51 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 1ª coleta
104
FIGURA 52 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 1ª coleta
104
xiv
FIGURA 53 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
frescas de Cymbopogon citratus – 1ª coleta
105
FIGURA 54 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
secas de Cymbopogon citratus – 1ª coleta
105
FIGURA 55 - Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 2ª coleta
106
FIGURA 56 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 2ª coleta
106
FIGURA 57 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 2ª coleta
107
FIGURA 58 - Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 2ª coleta
107
FIGURA 59 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
frescas de Cymbopogon citratus – 2ª coleta
108
FIGURA 60 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
secas de Cymbopogon citratus – 2ª coleta
108
FIGURA 61 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 1ª coleta
109
FIGURA 62 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 1ª coleta
109
FIGURA 63 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 1ª coleta
110
FIGURA 64 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 1ª coleta
110
FIGURA 65 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
frescas de Lippia alba quimiotipo linalol – 1ª coleta
111
FIGURA 66 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
secas de Lippia alba quimiotipo linalol – 1ª coleta
111
FIGURA 67 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 2ª coleta
112
FIGURA 68 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 2ª coleta
112
FIGURA 69 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 2ª coleta
113
FIGURA 70 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 2ª coleta
113
FIGURA 71 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
frescas de Lippia alba quimiotipo linalol – 2ª coleta
114
FIGURA 72 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
secas de Lippia alba quimiotipo linalol – 2ª coleta
114
FIGURA 73 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 3ª coleta
115
FIGURA 74 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 3ª coleta
115
FIGURA 75 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 3ª coleta
116
FIGURA 76 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 3ª coleta
116
xv
FIGURA 77 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
frescas de Lippia alba quimiotipo linalol – 3ª coleta
117
FIGURA 78 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
secas de Lippia alba quimiotipo linalol – 3ª coleta
117
FIGURA 79 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 4ª coleta
118
FIGURA 80 – Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 4ª coleta
118
FIGURA 81 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 4ª coleta
119
FIGURA 82 – Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de Lippia
alba quimiotipo linalol – 4ª coleta
119
FIGURA 83 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
frescas de Lippia alba quimiotipo linalol – 4ª coleta
120
FIGURA 84 – Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas
secas de Lippia alba quimiotipo linalol – 4ª coleta
120
FIGURA 85 – Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do
extrato por infusão de folhas secas de Cymbopogon citratus. Detalhe: espectro
na região de UV da isoorientina
124
FIGURA 86 – Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do
extrato etanólico 70% de folhas secas de Cymbopogon citratus. Detalhe:
espectro na região de UV da isoorientina
125
FIGURA 87 – Cromatograma e espectro UV do flavonóide isoorientina
isolado de Cymbopogon citratus
126
FIGURA 88 – Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do
extrato por infusão de folhas secas de Lippia alba quimiotipo linalol.. Detalhe:
espectro na região de UV do verbascosídeo
126
FIGURA 89 – Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do
extrato etanólico 70% de folhas secas de Lippia alba quimiotipo linalol..
Detalhe: espectro na região de UV do verbascosídeo
127
FIGURA 90 – Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do
extrato por infusão de folhas secas de Lippia alba quimiotipo citral. Detalhe:
espectro na região de UV do verbascosídeo
128
FIGURA 91 – Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do
extrato etanólico 70% de folhas secas de Lippia alba quimiotipo citral.
Detalhe: espectro na região de UV do verbascosídeo
129
FIGURA 92 – Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do
extrato por infusão de folhas secas de Lippia alba quimiotipo carvona.
Detalhe: espectro na região de UV do verbascosídeo
130
FIGURA 93 – Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do
extrato etanólico 70% de folhas secas de Lippia alba quimiotipo carvona.
Detalhe: espectro na região de UV do verbascosídeo
131
FIGURA 94 – Cromatogramas e espectro UV do fenilpropanóide
verbascosídeo (pico 1) isolado de Lippia alba. Detalhe: (pico 2)
correspondente ao isoverbascosídeo
132
FIGURA 95 – Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do
extrato etanólico 70% de folhas secas de Melissa officinalis. Detalhe: espectro
na região de UV do ácido rosmarínico
133
xvi
FIGURA 96 – Cromatograma e espectro UV do fenilpropanóide do ácido
rosmarínico isolado de Melissa officinalis
134
FIGURA 97 - Espectro de RMN
1
H (DMSO-D6, 500MHz) da substância
isolada isoorientina
139
FIGURA 98 - Espectro de RMN
13
C (DMSO-D6, 500MHz) da substância
isolada isoorientina
139
FIGURA 99 - Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância isolada
isoorientina
140
FIGURA 100 - Ultravioleta da substância isoorientina isolada 141
FIGURA 101 - Ultravioleta da substância isoorientina isolada + reagente de
deslocamento acetato de sódio
141
FIGURA 102 - Ultravioleta da substância isoorientina isolada + reagente de
deslocamento cloreto de aluninio
142
FIGURA 103 - Ultravioleta da substância isoorientina isolada + reagente de
deslocamento cloreto de alumínio + ácido clorídrico
142
FIGURA 104 - Espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 400MHz) da substância
isolada Ácido trans-p-cumárico
145
FIGURA 105 - Ampliação do espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 400MHz) da
substância isolada Ácido trans-p-cumárico
146
FIGURA 106 - Espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 400MHz) da substância
isolada Ácido trans-p-cumárico
146
FIGURA 107 - Espectro de HMQC (CD
3
OD, 400MHz) da substância isolada
Ácido trans-p-cumárico
147
FIGURA 108 - Ampliação do espectro de COSY (CD
3
OD, 400MHz) da
substância isolada Ácido trans-p-cumárico
147
FIGURA 109 - Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância isolada
Ácido trans-p-cumárico
148
FIGURA 110 - Cromatograma de CLAE/UV da substância isolada
verbascosídeo
155
FIGURA 111 - Espectro de RMN
1
H (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância
isolada verbascosídeo
156
FIGURA 112 - Espectro de RMN
13
C (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância
isolada verbascosídeo
156
FIGURA 113 - Espectro de DEPT (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância
isolada verbascosídeo
157
FIGURA 114 - Espectro de COSY (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância
isolada verbascosídeo
157
FIGURA 115 - Ampliação 1 do espectro de COSY (DMSO-D
6
, 200MHz) da
substância isolada verbascosídeo
158
FIGURA 116 - Ampliação 2 do espectro de COSY (DMSO-D
6
, 200MHz) da
substância isolada verbascosídeo
158
FIGURA 117 - Espectro de Infravermelho da substância isolada
verbascosídeo
159
FIGURA 118 - Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância isolada
verbascosídeo
159
FIGURA 119 - Espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
167
xvii
FIGURA 120 - Ampliação 1 do espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
167
FIGURA 121 - Ampliação 2 do espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
168
FIGURA 122 - Ampliação 3 do espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
168
FIGURA 123 - Espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
169
FIGURA 124 - Ampliação 1 do espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
169
FIGURA 125 - Ampliação 2 do espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
170
FIGURA 126 - Ampliação 3 do espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
170
FIGURA 127 - Ampliação 4 do espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
171
FIGURA 128 - Espectro de COSY (CD
3
OD, 500MHz) da substância isolada
isoverbascosídeo
171
FIGURA 129 - Ampliação 1 do espectro de COSY (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
172
FIGURA 130 - Ampliação 2 do espectro de COSY (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
172
FIGURA 131 - Espectro de HMQC (CD
3
OD, 500MHz) da substância isolada
isoverbascosídeo
173
FIGURA 132 - Ampliação 1 do espectro de HMQC (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
173
FIGURA 133 - Ampliação 2 do espectro de HMQC (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
174
FIGURA 134 - Ampliação 3 do espectro de HMQC (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
174
FIGURA 135 - Espectro de HMBC (CD
3
OD, 500MHz) da substância isolada
isoverbascosídeo
175
FIGURA 136 - Ampliação 1 do espectro de HMBC (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
175
FIGURA 137 - Ampliação 2 do espectro de HMBC (CD
3
OD, 500MHz) da
substância isolada isoverbascosídeo
176
FIGURA 138 - Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância isolada
isoverbascosídeo
176
FIGURA 139 - Espectro de RMN
1
H (DMSO-D
6
, 500MHz) da substância
isoladaÁcido rosmarínico
179
FIGURA 140 - Ampliação 1 do espectro de RMN
1
H (DMSO-D
6
, 500MHz)
da substância isolada Ácido rosmarínico
179
FIGURA 141 - Ampliação 2 do espectro de RMN
1
H (DMSO-D
6
, 500MHz)
da substância isolada, Ácido rosmarínico
180
FIGURA 142 - Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância
isolada, Ácido rosmarínico
180
xviii
SUMÁRIO
Resumo vii
Abstract viii
Lista de abreviaturas e fórmulas ix
1. Introdução 1
2. Objetivos 36
3. Material e Métodos 37
3.1. Coleta e identificação de Cymbopogon citratus, Lippia alba (quimiotipos
linalol, citral e carvona) e Melissa officinalis
37
3.2. Preparo da matéria-prima vegetal para execução dos cortes, montagem
das preparações e análises morfológicas (macro e microscópicas).
37
3.3. Obtenção dos extratos 38
3.4. Perfil cromatográfico dos extratos 39
3.4.1. Cromatografia Liquída de Alta eficiência (CLAE) 39
3.4.2.Cromatografia de camada Delgada (CCD) 40
3.4.3. Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) acoplada a
Espectrometria de Massas (EM)
42
3.5. Obtenção dos óleos essenciais 42
3.6. Determinação da rotação ótica e do índice de refração 43
3.7. Obtenção das substâncias polares 43
3.7.1. Lippia alba 43
3.7.1.1. Verbascosídeo e Isoverbascosídeo 43
3.7.2. Cymbopogon citratus 44
3.7.2.1. Isoorientina 44
3.7.2.2. Ácido trans-p-cumárico 45
3.7.3. Melissa officinalis 46
3.7.3.1. Ácido Rosmarínico 46
3.8. Equipamentos usados na identificação espectroscópica das substâncias
isoladas
46
3.9. Organogramas de isolamento das substâncias 48
4. Resultados e Discussão 52
4.1. Aspectos botânicos 52
4.1.1. Cymbopogon citratus 52
4.1.1.1. Descrição macroscópica 52
4.1.1.2. Descrição microscópica 53
4.1.1.3. Análise do material pulverizado 54
4.1.2. Lippia alba 56
4.1.2.1. Descrição macroscópica 56
4.1.2.2. Descrição microscópica 57
4.1.2.3. Análise do material pulverizado 59
4.1.3. Melissa officinalis 61
4.1.3.1. Descrição macroscópica 61
4.1.3.2. Descrição microscópica 62
4.1.3.3. Análise do material pulverizado 64
4.1.4.Diferenciação morfológica entre as três espécies de “ervas cidreiras” 65
4.1.5. Análise morfológica dos caules de Lippia alba e Melissa officinalis 67
xix
4.2. Aspectos químicos 71
4.2.1. Perfis químicos dos óleos essenciais das principais ervas cidreiras no
Brasil
71
4.2.1.1. Lippia alba 71
4.2.1.2. Cymbopogon citratus 81
4.2.1.3. Melissa officinalis 85
4.2.2. Perfis cromatográficos dos extratos polares das principais ervas
cidreiras no Brasil
89
4.2.2.1. Cymbopogon citratus (capim cidreira, capim limão) 90
4.2.2.1.1. Primeira coleta (folhas frescas e secas) 90
4.2.2.1.2. Segunda Coleta (folhas frescas e secas) 92
4.2.2.2. Lippia alba (erva cidreira brasileira) 96
4.2.2.2.1. Quimiotipo linalol 96
4.2.2.2.1.1. Primeira coleta (folhas frescas e secas) 96
4.2.2.2.1.2. Segunda coleta (folhas frescas e secas) 97
4.2.2.2.1.3. Terceira coleta (folhas frescas e secas) 98
4.2.2.2.1.4. Quarta coleta (folhas frescas e secas) 99
4.2.2.3. Cromatogramas por CLAE dos extratos polares de C. citratus e Lippia
alba (quimiotipo linalol)
103
4.2.3. Análise por CLAE acoplada a detector de arranjo de diodos dos extratos
polares das ervas cidreiras, utilizando as substâncias de referência isoladas.
121
4.2.3.1. Cymbopogon citratus 121
4.2.3.2. Lippia alba 122
4.2.3.3. Melissa officinalis 122
4.2.3.4. Cromatogramas por CLAE dos extratos polares, utilizando as
substâncias de referência
124
4.2.4. Substâncias isoladas dos extratos polares das espécies vegetais
denominadas “ervas cidreiras”
135
4.2.4.1. Cymbopogon citratus 135
4.2.4.1.1. Isoorientina 135
4.2.4.1.2. Ácido trans-p-cumárico 143
4.2.4.2. Lippia alba 148
4.2.4.2.1. Verbascosídeo 148
4.2.4.2.2. Isoverbascosídeo 160
4.2.4.2.3. Ácido Rosmarínico 177
5. Conclusões 181
6. Referências Bibliográficas 184
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Principais espécies vegetais no Brasil com o nome popular de “erva cidreira”
As folhas de Melissa officinalis L. (Lamiaceae), droga de origem mediterrânica e
oficinal em diversas farmacopéias pelas suas atividades calmante e antiespasmódica,
são muitas vezes substituídas ou mesmo falsificadas com matérias-primas vegetais que
apresentam propriedades organolépticas semelhantes e que como ela recebem, entre
outros nomes, a designação popular de “erva cidreira”. Destacam-se como as de maior
uso no Brasil as folhas de Lippia alba (Mill.) N.E.Br. ex Britt. & Wilson (Verbenaceae)
e de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (Poaceae). As características macroscópicas e
microscópicas dos cortes transversais de suas folhas bem como a análise micrográfica
destas depois de secas e moídas, ajudam a diagnosticar as alterações. A composição
química das suas frações voláteis encontra-se já razoavelmente conhecida, sendo
constituída principalmente por mono e sesquiterpenóides, embora a existência de
diversos quimiotipos em Lippia alba dificulte a sua caracterização. Os seus usos
terapêuticos também são atribuídos na maioria das vezes aos componentes existentes
nas suas frações voláteis. Além do óleo essencial, a população brasileira utiliza estas
plantas através da obtenção dos seus “chás” e tinturas, prática antiga difundida geração
a geração pelas suas propaladas atividades antiespasmódicas, depressoras do sistema
nervoso central, antimicrobianas e em doenças do aparelho respiratório. Não obstante,
até hoje pouco se conhece da composição química das substâncias não voláteis que
predomina nas preparações destas duas espécies vegetais, espontâneas ou mesmo
cultivadas em território brasileiro, bem como a relação entre elas e suas pretensas
atividades terapêuticas. O trabalho ora em desenvolvimento procura contribuir para
preencher estas lacunas.
2
1.1.1. Cymbopogon citratus
1.1.1.1.Dados botânicos
A família Poaceae possui distribuição cosmopolita, contendo 50 a 60 tribos, com
cerca de 660 gêneros e 9000 espécies (FOLORUNSO e OYETUNJI 2007), sendo que
no Brasil ocorrem cerca de 180 gêneros e 1500 espécies. É composta por ervas
geralmente rizomatosas, às vezes lenhosas (bambus), perenes ou anuais, com caules
cilíndricos ou achatados. As folhas são alternas dísticas ou muito raramente espiraladas,
com bainha geralmente aberta, paralelinérveas, com lígula entre a bainha e o limbo. A
inflorescência básica do tipo espigueta, subtendida na base por um par de brácteas
(glumas), está reunida em diversos tipos de inflorescência. As flores (flósculos),
subtendidas por um par de brácteas (glumelas, sendo a inferior e mais externa
denominada lema e a superior, mais interna denominada pálea), não vistosas,
bissexuadas ou raramente unissexuadas (Zea), aclamídeas, possuem freqüentemente 2-3
pequenas escamas membranáceas (lodículas), interpretadas como sendo vestígio do
perianto; estames em pequeno número ou então numerosos (Bambusoideae), anteras
rimosas, nectários ausentes; gineceu gamocarpelar, ovário súpero, bicarpelar ou
tricarpelar, unilocular, placentação ereta ou pêndula, estigma geralmente plumoso. O
fruto é uma cariopse com semente, em geral, completamente aderida à parede interna
(SOUZA e LORENZI 2005 p. 177).
3
Figura 1: Cymbopogon citratus (DC.) Stapf
Esta é indubitavelmente a principal família de Angiospermas, do ponto de vista
econômico, não apenas pelo número de espécies utilizadas pelo homem, mas também
pela importância de algumas destas. Basta dizer que a alimentação de diversos povos do
mundo é baseada em plantas desta família onde se incluem os conhecidos “cereais”,
importantes para a nutrição humana. Destaca-se também na família espécies
ornamentais, forrageiras, invasoras de culturas e medicinais, entre estas últimas deve-se
mencionar as pertencentes ao gênero Cymbopogon (SOUZA e LORENZI 2005 p. 177).
O gênero Cymbopogon, do grego Kymbe (barco) e pogon (barba), compreende
cerca de 140 espécies distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais ao redor do
mundo, a maioria delas ocorrendo no estado selvagem ou mesmo cultivada como
importante fonte de óleo essencial tal como o capim limão, citronela, palma rosa,
ginger, entre outros.
A espécie botânica Cymbopogon citratus é conhecida no território brasileiro
pelas denominações de capim limão, capim santo, capim cheiroso, capim cidreira,
cidreira, erva cidreira, capim marinho, capim catinga, capim siri, cidrão e capim cidró.
No exterior aparece com os nomes de belgata, chá do gabão (Portugal), citronelle, jonc
4
odorant (França), lemongrass (Inglaterra), mirchá-gandh, surwai (India), la-sa (Sudeste
asiático) entre outros (CARRICONDE et al. 1996; COSTA 1978; PIO CORRÊA 1984,
DI STASI et al. 1989). A espécie é provavelmente de origem indiana, encontrando-se
aclimatada nas regiões tropicais (Índia, Sri Lanka, Indonésia, Angola, Madagascar,
Congo, América tropical). No Brasil é considerada subespontânea, aparecendo em todos
os estados como planta cultivável. (CARRICONDE et al.1996; COSTA, 1978;
CRAVEIRO et al. 1981). É uma espécie herbácea, perene, que pode atingir até dois
metros de altura; de caule curto do tipo colmo, com nós e entrenós bem delimitados,
formando uma touceira desenvolvida. Possui folhas alongadas, ásperas em ambas as
faces e inflorescência em panículas (tipo espigueta) com glumas avermelhadas (DI
STASI et al.1989; CORRÊA JUNIOR et al. 1994; RIZZINI e MORS 1995;
FARMACOPÉIA BRASILEIRA 2003).
Alguns sinônimos científicos têm sido sugeridos para Cymbopogon citratus,
entre eles pode-se destacar Andropogon citratus (DC.), A. schoenanthus L., A. Martini
Roxb., A. pachnodes Trin. e Cymbopogon citriodorus Link. (CARRICONDE et al.
1996; PIO CORRÊA 1984; LEWINSOHN et al. 1998)
Segundo o sistema de classificação botânica adotado por Cronquist (1981) e
modificado por Kubitzki em seu sistema de arranjo das plantas vasculares adotado por
Mabberley (1997) a espécie apresenta a seguinte posição taxonômica:
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Liliopsida (Liliatae)
Subclasse: Commelinidae
Ordem: Cyperales
Família: Poaceae (Gramineae)
Subfamília: Panicoideae
Gênero: Cymbopogon Spreng.
Espécie: Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (DI STASI e HIRUMA-LIMA 2002;
AGAREZ et al. 1994).
Recentemente, segundo A.P.G.II (2003) as Monocotiledôneas foram divididas
em dez ordens, nas quais Cyperales foi suprimida e introduzido o clado Poales onde são
consideradas 18 famílias, entre elas, Poaceae (SOUZA e LORENZI 2005 p. 12-13).
5
O estudo microscópico de C. citratus engloba principalmente as folhas, onde se
destacam as características morfológicas de uma monocotiledônea com uma anatomia
do tipo Kranz, com bainhas de feixe especializadas (METCALFE 1960; LEWINSOHN
et al. 1998; FERREIRA et al. 1999; BERTEA et al. 2003; FARMACOPÉIA
BRASILEIRA 2003). A localização histoquímica do citral (componente majoritário do
seu óleo essencial) foi estudada por Lewinsohn et al. (1998), e para garantir o controle
da qualidade botânico do material pulverizado da folha foram realizadas análises
micrográficas de diversos exemplares (FERREIRA et al. 1999b; FARMACOPÉIA
BRASILEIRA 2003; MARTINS et al. 2005). De um estudo realizado com material
proveniente da África (Nigéria) comparou-se a epiderme foliar com a de uma espécie
próxima, C. giganteus (Hochst.) Chiov. (FOLORUNSO e OYETUNJI 2007).
1.1.1.2. Dados Químicos
Cymbopogon citratus possui um óleo essencial conhecido internacionalmente
como “lemongrass” (0,2 a 0,6 % em média) que apresenta uma variedade de
constituintes químicos cujas concentrações variam em função de diversos fatores que
interferem diretamente na rota biossintética destes metabólitos ou nas etapas de preparo
da matéria-prima vegetal, durante e após a coleta, tais como o uso de folhas frescas para
a extração do óleo essencial, o modo de secagem das folhas, o período de estocagem, os
métodos e o tempo de extração do óleo, a origem geográfica da planta, a época da
colheita das folhas, as condições climáticas e edáficas, etc. O óleo possui uma coloração
levemente amarelada com forte odor cítrico e cuja qualidade é geralmente determinada
pelo seu conteúdo de aldeídos, especialmente o citral (mistura dos isômeros geranial e
neral) cujo teor varia em torno de 69 a 85 % em média. No comércio são conhecidos
dois tipos: “East Indian” e “West Indian” que diferenciam-se basicamente pelo teor de
substâncias terpênicas , em particular o mirceno. O tipo “West Indian”, produzido em
larga escala no Brasil, Guatemala, Haiti, Madagascar e Indochina, entre outros,
apresenta menor solubilidade em álcool, contendo maior concentração de mirceno. O
tipo “East Indian”, encontrado principalmente em Singapura, Sri Lanka, Camboja e
Índia, apresenta maior solubilidade em álcool e escassas quantidades de mirceno, ou
6
mesmo ausência deste constituinte (FURIA e BELLANCA 1971). De um modo geral,
além do citral e mirceno (FURIA e BELLANCA 1971; COSTA 1978; CRAVEIRO et
al. 1981; CICOGNA JUNIOR et al. 1986/1987; SOUZA et al. 1991; MATOS 1994;
CARRICONDE et al. 1996; ANSARI et al. 1996; CÁCERES 1996; LEWINSOHN et
al. 1998; FERREIRA et al. 1999; DUDAI et al. 2001; CARLSON et al. 2001;
SCHANEBERG et al. 2002; WILSON et al. 2002; SALEEM et al. 2003; KANKO et
al. 2004; RAUBER et al. 2005; MORONGIU et al. 2006; NHU-TRANG et al. 2006;
PIHLASALO et al. 2007; NEGRELLE e GOMES 2007) estão presentes em menores
quantidades outros constituintes monoterpênicos: α-pineno (CICOGNA JUNIOR et al.
1986/1987; SOUZA et al. 1991; NHU-TRANG et al. 2006; NEGRELLE e GOMES
2007), β-pineno (SOUZA et al. 1991; CÁCERES 1996; NHU-TRANG et al. 2006),
canfeno (SOUZA et al. 1991); limoneno (CICOGNA JUNIOR et al. 1986/1987;
SOUZA et al. 1991; CÁCERES 1996; CARLSON et al. 2001; SCHANEBERG et al.
2002; NHU-TRANG et al. 2006; NEGRELLE e GOMES 2007), p-cimeno (CÁCERES
1996; ; CARLSON et al. 2001); , mentol (SOUZA et al. 1991; NEGRELLE e GOMES
2007), citronelol, (CRAVEIRO et al. 1981; CICOGNA JUNIOR et al. 1986/1987;
SOUZA et al. 1991; ANSARI et al. 1996; CARLSON et al. 2001; NEGRELLE e
GOMES 2007) citronelal (FURIA e BELLANCA 1971; COSTA 1978; CICOGNA
JUNIOR et al. 1986/1987; SOUZA et al. 1991; CARRICONDE et al. 1996; ANSARI
et al. 1996; CARLSON et al. 2001; SCHANEBERG e KHAN 2002; NHU-TRANG et
al. 2006; NEGRELLE e GOMES 2007), acetato de citronelila (CÁCERES 1996;
CARLSON et al. 2001), linalol (FURIA e BELLANCA 1971; COSTA 1978;
CRAVEIRO et al. 1981; CICOGNA JUNIOR et al. 1986/1987; SOUZA et al. 1991;
CARRICONDE et al. 1996; ANSARI et al. 1996; CÁCERES 1996; CARLSON et al.
2001), acetato de geranila (CICOGNA JUNIOR et al. 1986/1987; SOUZA et al. 1991;
LEWINSOHN et al. 1998; CÁCERES 1996; DUDAI et al. 2001; CARLSON et al.
2001; NEGRELLE e GOMES 2007), nerol (FURIA e BELLANCA 1971; CRAVEIRO
et al. 1981; SOUZA et al. 1991; CARRICONDE et al. 1996; ANSARI et al. 1996;
FERREIRA et al. 1999; DUDAI et al. 2001; NEGRELLE e GOMES 2007), geraniol
(FURIA e BELLANCA 1971; COSTA 1978; CRAVEIRO et al. 1981; CICOGNA
JUNIOR et al. 1986/1987; SOUZA et al. 1991; CARRICONDE et al. 1996; ANSARI
et al. 1996; CÁCERES 1996; LEWINSOHN et al. 1998; FERREIRA et al. 1999;
7
DUDAI et al. 2001; CARLSON et al. 2001; SCHANEBERG et al. 2002; NEGRELLE
e GOMES 2007), isopulegol (CRAVEIRO et al. 1981; ANSARI et al. 1996), α-
terpineol (CRAVEIRO et al. 1981; SOUZA et al. 1991; CARLSON et al. 2001;
NEGRELLE e GOMES 2007) e dipenteno (FURIA e BELLANCA 1971; CRAVEIRO
et al. 1981) são alguns exemplos. Entre os constituintes sesquiterpenóides destacam-se
farnesol, (FURIA e BELLANCA 1971; CRAVEIRO et al. 1981; SOUZA et al. 1991;
ANSARI et al. 1996; NEGRELLE e GOMES 2007), elemol (CÁCERES 1996) e β-
cariofileno (CÁCERES 1996).
O seu óleo essencial pode conter ainda outros componentes não terpenoídicos
como isovaleraldeído, furfural, 3-metil-2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2-metil-
heptenol, decanal e ésteres dos ácidos valérico e caprílico (FURIA e BELLANCA 1971;
COSTA 1978; CRAVEIRO et al. 1981; SOUZA et al. 1991).
O
H
O
H
canfeno
neral
geranial
citral
β
-pineno
α
-pineno
mirceno
O
H
OH
OH
O
O
OH
limoneno
citronelal
-cimeno
mentol
citronelol
p
OH
O
OH
O
acetato de citronelila
linalol
geraniol
nerol
acetato de geranila
O
OH
O
OH
isovaleraldeído
isopulegol
α
-terpineol
O
O
H
CH
3
OH
H
H
6-metil-5-hepten-2-ona
elemol
O
β
-cariofileno
O
furfural
dipenteno
farnesol
3-metil-2-heptanona
H
OR
OR
O
O
éster do ácido caprílico
éster do ácido valérico
OH
metil-heptenol
H
H
OH
decanal
8
Além dos componentes presentes no óleo volátil, outras substâncias químicas
não voláteis foram isoladas de C. citratus. Estas aparecem como os principais
constituintes de infusões, decocções, tinturas e outros extratos polares ou de média
polaridade, preparados desta espécie. A maioria pertence às classes dos flavonóides,
fenilpropanóides, açúcares, triterpenóides, esteróis e álcoois acíclicos.
Matouschek e Stahl-Biskup (1991) identificaram no extrato hexânico das folhas
três álcoois graxos com 28, 30 e 32 átomos de carbono, respectivamente octacosanol,
triacontanol e dotriacontanol. Anteriormente, hexacosanol (16 Carbonos) já tinha sido
reconhecido por Olaniyi et al. (1975).
Crawford et al. (1975) e Hanson et al. (1976) isolaram dois triterpenóides do
material graxo das folhas de C. citratus, que foram identificados respectivamente com
os nomes de cimbopogona e cimbopogonol, cujas estruturas químicas foram
posteriormente corrigidas por Yokoyama et al. (1980).
CHMe
2
H
H
O
Me
Me
Me
Me
MeH
Me
Me
II
CH
2
HO
Me
HO
III
cimbopogona cimbopogonol
Olaniyi et al. (1975) trabalhando com folhas de origem nigeriana, descreveram a
presença de β-sitosterol.
Matouschek e Stahl-Biskup (1991) mencionaram o isolamento dos ácidos
fenilpropanóides reconhecidos como clorogênico, caféico e p-cumárico, obtidos do
extrato metanol-água das folhas.
CO
2
H
O
O
OH
HO
HO
CO
2
HCH CH
OH
HO
S
OH
OH
R
R
R
ácido clorogênico ácido caféico
9
CO
2
HCH CH
HO
ácido p-cumárico
Me
O
O
OH
O
OH
O
OH
O
HO
O
HO
HO
OH
HO
HO
H
S
R
S
R
S
S
R
R
S
R
A mesma dupla de pesquisadores utilizaram uma partição do extrato anterior em
acetato de etila, da qual isolaram os flavonóides luteolina-7-O-β-D-glicosídeo, luteolina
7-O-neohesperidosídeo, homoorientina (isoorientina), homoorientina 2’’-O-
rhamnosídeo e luteolina, este último já isolado anteriormente por Gunasingh e
Nagarajan (1981). Posteriormente, Cheel et al. (2005) isolaram junto com o 1º, 3º e 4º
flavonóides descritos anteriormente, os C-glicosídeos isoescoparina, swertiajaponina e
orientina. Miean e Mohamed (2001) indicaram o isolamento de miricitina, quercetina,
Kaempferol e apigenina.
O
O
OH
O
OH
O
OH
OH
HO
HO
HO
S
R
R
S
S
luteolina-7-O-β-D-glicosídeo luteolina 7-O-neohesperidosídeo
Me
OH
O
O
O
HO
O
O
HO
O
HO
HO
OH
OH
OH
HO
HO
H
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S
S
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S
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OH
HO
O
O
O
HO
HO
HO
HO
OH
OH
S
R
R
R
S
homoorientina (isoorientina) homoorientina 2’’-O-rhamnosídeo.
10
OMe
OH
O
O
HO
O
HO
HO
HO
HO
OH
S
R
R
R
S
O
O
OH
HO
OH
OH
luteolina isoescoparina
HO O
O
OH
OH
O
OH
HO
OH
OH
OH
S
R
R R
S
MeO
OH
O
O
OH
O
HO
HO
HO
OH
OH
S
R
R
R
S
swertiajaponina orientina
O
OH
O
OH
HO
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
HO
OH
OH
miricitina quercetina
O
OH
O
OH
HO
OH
O
O
OH
HO
OH
kaempferol apigenina
Matouschek e Stahl-Biskup (1991) descreveram a presença dos açúcares frutose
e sacarose.
11
1.1.1.3. Dados Farmacológicos
Atividade analgésica periférica
Lorenzetti et al. (1991) e Viana et al. (2000) comprovaram a ação analgésica
periférica utilizando ensaios de hiperalgia na pata de rato induzida por carragenina,
isoprenalina ou prostaglandina E2 (PGE2); contorções em camundongos induzidas por
ácido acético, pelo teste da placa quente e pela freqüência de lamber a pata após a
injeção de formalina. No caso do trabalho de Lorenzetti et al. (1991) esta analgesia foi
demonstrada em ratos com a administração oral de infusões de folhas da planta. A ativi-
dade também foi observada pelos autores com o uso do óleo essencial e especificamente
com o mirceno (Lorenzetti et al. 1991). Estes autores limitam a ação do mirceno a um
nível periférico já que a infusão das folhas frescas não agiu na hiperalgia induzida pelo
derivado dibutírico do AMP cíclico – N6,2´-O-dibutiriladenosina-3´,5´-monofosfato
cíclico (DbcAMP, bucladesina), sugerindo uma ação periférica, enquanto que Viana et
al (2000) sugerem que o óleo essencial do capim-limão pode ter uma ação tanto nos
níveis central ou periférico. Deve-se destacar que Viana e colaboradores (2000), usaram
a planta das Índias Ocidentais, onde a presença de neral era de 60.3% e a de geranial de
25%, e livre de mirceno, enquanto que a concentração deste último no trabalho de
Lorenzetti et al. (1991), era de 15-20%. Além disso, Viana e colaboradores (2000)
administraram o óleo essencial por via intraperitoneal o que seria algo substancialmente
diferente da administração oral tanto em relação à dose quanto ao modo de ação
(GILBERT et al. 2005).
Atividade depressora central
Matos (1998) cita os principais constituintes do óleo essencial (mirceno e citral)
e outros componentes minoritários como 1,8-cineol, citronelal, geraniol e linalol como
tendo propriedades sedativas, mas os dados obtidos por Silva et al. (1991), demonstram
12
que o mirceno não apresenta atividade ansiolítica e que uma atividade sobre o sistema
nervoso central (antidepressiva ou antipsicótica) é improvável.
Carballo (1995) demonstrou clinicamente uma atividade sedativa discreta
quando a decocção da folha fresca (15-25 g/L) era bebida na razão de 240 mL a cada 6
horas.
Atividade antiespasmódica
Ferreira et al. (1983), Sousa et al. (1991) e Lorenzetti et al. (1991) observaram
atividade antiespasmódica experimental em animais para o mirceno e para o óleo
essencial obtido das folhas frescas normalmente contendo 10-12% deste componente
químico. O mirceno e a luteolina (que seria liberada do seu glicosídeo no estômago),
constam na literatura como tendo propriedades espasmolíticas (GILBERT et al. 2005).
Uma decocção de folhas frescas (15-25 g/L) em dose de 250 mL, de 6 em 6
horas, mostrou uma atividade antiespasmódica gastro-intestinal, aliviando o desconforto
passageiro em pacientes sadios (CARBALLO 1995; GILBERT et al. 2005).
Atividade antimicrobiana
Onawunmi et al. (1984), Onawunmi e Ogunlana (1986), encontraram as
seguintes espécies de bactérias sensíveis ao óleo essencial de C. citratus:
Staphylococcus aureus, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Streptococcus pneumoniae, S. faecalis, S. enteritidis, e B. cereus. Lemos et al.
(1990), também relataram a ação do óleo essencial de C. citratus contra E. coli, S.
aureus, P. aeruginosa, B. subtilis e M. smegmatis. Segundo autores citados por Cáceres
(1996), entretanto, a tintura das folhas não possui atividade contra enterobactérias nem
contra S. aureus ou S. pyogenes.
Usando uma metodologia similar (20 μL aplicado a um disco sobre uma placa de
ágar) E-citral, Z-citral e α-pineno presentes nas folhas, inibiram 81% das linhagens dos
fungos dermatófitos Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Microsporum canis e
13
Epidermophyton floccosum. O efeito na maioria dos casos excedeu a inibição observada
com cetoconazol (100 μg/mL) (Lima et al. 1992, 1993). O desenvolvimento de
Aspergillus flavus (CE100 mínima: 1000 ppm) e de uma larga variedade de outros
fungos também é inibido pelo óleo essencial, sendo que a atividade varia com a época
da coleta (CÁCERES 1996). Inouye et al. (1998) mostraram que a esporulação dos
fungos filamentosos Aspergillus fumigatus, Penicillium expansum, Fusarium solani e
Rhyzopus oryzae foi inibida pelo contato do vapor do óleo essencial do capim limão.
Entretanto, este efeito não foi observado quando os óleos essenciais foram aplicados
como solução.
Atividade hipotensora
A injeção endovenosa, em ratos, de uma decocção (10%) de folhas secas (0,6
mL/min) provocou um decréscimo imediato da pressão sangüínea. O efeito, transitório
na dose de 1-2 mL/kg do decocto se tornou duradouro (>35min) na dose de 3 mL/kg
(CÁCERES 1996, CARBAJAL et al. 1989).
Atividade diurética
Carbajal et al. (1989) demonstraram que o decocto a 10% das folhas de C.
citratus produz um aumento de 11% no índice de excreção urinária, enquanto que o
decocto a 20% o aumentou em 15%.
Biologia molecular
Tanto o mirceno, como o óleo essencial de C. citratus, inibem a mutagênese
provocada por alguns agentes genotóxicos como ciclofosfamida e aflatoxina B1 em
células de mamíferos e no ensaio de mutação microssomal de Salmonella, porém não
foram ativos contra carcinógenos aromáticos policíclicos como benzo[a]pireno. A
14
explicação sugerida para este resultado seria a inibição da enzima citocromo P-450
mono-oxigenase, confirmada por Oliveira et al. (1997) que identificaram a enzima
como CYP2B1. No mesmo ensaio feito com pentoxirufina-O-despentilase (PROD), o
citral foi bem menos ativo, com um IC
50
de 1,19 μM contra 0,14 μM para o mirceno.
Por outro lado, o citral é um inibidor eficiente da síntese de ácido retinóico através da
inibição da enzima aldeído desidrogenase (KIKONYOGO et al. 1999, SCHUH et al.
1993). Este ácido é um mediador da transcrição genética e está associado à renovação
da pele e no espessamento da epiderme em animais adultos como também no
brotamento dos membros em embriões.
Atividade sobre o sistema pulmonar
Uma decocção de folhas frescas (15-25 g/L), quando administrada na dose de 240 mL, a
cada 4 a 6 horas produziu em adultos e crianças uma atividade expectorante e
descongestionante das vias respiratórias (CARBALLO 1995).
1.1.2. Lippia alba
1.1.2.1. Dados botânicos
A família Verbenaceae possui distribuição pantropical, mas principalmente
neotropical, incluindo cerca de 36 gêneros e 1000 espécies. No Brasil ocorrem 17
gêneros e próximo de 250 espécies. É uma família composta por ervas ou arbustos,
menos frequentemente árvores ou lianas, muitas vezes aromáticas, com ramos
geralmente quadrangulares. As folhas são opostas, raramente verticiladas, simples, sem
estípulas e com margem geralmente serreada. A inflorescência, do tipo racemosa, possui
flores pouco vistosas, bissexuadas, zigomorfas, diclamídeas; com cálice gamossépalo,
geralmente pentâmero; corola também pentâmera, gamopétala, bilabiada; estames em
número de 4, neste caso didínamos, raramente 2 com dois estaminódios; ovário súpero,
15
bicarpelar, geralmente com lóculos divididos por um falso septo, tornando-o tetralocular
ou bilocular, quando um dos carpelos é atrofiado (Lantana), estilete terminal,
placentação ereta, óvulos em número de dois por cada carpelo. O fruto pode ser uma
drupa ou um esquizocarpo (SOUZA e LORENZI, 2005 p. 529).
Figura 2: Lippia alba (Mill.) N.E.Br. ex Britt. & Wilson
quimiotipo citral
Recentemente a circunscrição desta família foi redefinida, com a restrição das
Verbenaceae apenas para o que tradicionalmente era reconhecido como sendo a
subfamília Verbenoideae. Trabalhos recentes em filogenia evidenciaram que Lamiaceae
apenas formaria um grupo monofilético com a inclusão de alguns gêneros
tradicionalmente reconhecidos em Verbenaceae, os quais apresentam estilete terminal,
característica utilizada anteriormente para distinção destas duas famílias. De acordo
com esse critério, a família Lamiaceae poderia ser distinta de Verbenaceae por possuir
inflorescência cimosa e pólen com exina não espessada próximo às aberturas.
O gênero Lippia L. reúne cerca de 200 táxons com distribuição pantropical. O
maior número de espécies se encontra no Brasil, cerca de 150, com ocorrência
especialmente nos campos rupestres e cerrados. A taxonomia de Lippia tem-se
16
mostrado bastante confusa, seguindo princípios distintos. Schauer propôs os primeiros
tratamentos taxonômicos para o gênero, reconhecendo cinco seções válidas. Moldenke
(1965) propôs duas novas subseções para a seção Rhodolippia: Mexicanae e
Brasilianae, baseado em diferenças na coloração das brácteas, organização das
inflorescências e distribuição geográfica. Troncoso (1974) considerou oito seções para o
gênero: estas foram delimitadas levando-se em consideração a morfologia das
inflorescências e brácteas. Silva e Salimena (2002) transferiram para o gênero todas as
espécies de Lantana sect. Sarcolippia, baseado nas características do fruto. Novos
sinônimos foram propostos por Múlgura de Romero e Salimena-Pires (1997) baseados
em distintos estados fenológicos, o que vem demonstrar a complexidade dos problemas
taxonômicos. O elevado número de táxons descritos para o gênero, incluindo espécies,
variedades e formas sem um posicionamento infragenético, tem contribuído para muitas
dificuldades taxonômicas e inviabilizando tratamentos filogenéticos. (SALIMENA,
2002).
A espécie Lippia alba é uma planta perene, subarbustiva, ereta ou de ramos
ascendentes que enraízam quando em contato com o solo, pouco ramificada, fortemente
aromática, de 50 a 150 cm de altura, típica de solos arenosos e úmidos de margens de
rios e lagoas de todo o litoral brasileiro.
De acordo com o sistema de classificação de Engler, revisto por Melchior
(1964), a espécie ocupa a seguinte posição taxonômica:
Divisão: Angiospermae
Classe: Dicotyledoneae
Subclasse: Metachlamydeae
Ordem: Tubiflorae
Família: Verbenaceae
Subfamília: Verbenoideae
Tribo: Lantaneae
Gênero: Lippia (Houst.) ex L.
Espécie: Lippia alba (Mill.) N.E.Brown ex Britt. & Wilson (CORRÊA, 1990).
17
Considerando-se o sistema de Cronquist (1981), a espécie apresenta a seguinte
ordenação hierárquica:
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopsida
Subclasse: Asteridae
Ordem: Lamiales
Família: Verbenaceae
Gênero: Lippia (Houst.) ex L.
Espécie: Lippia alba (Mill.) N.E.Brown ex Britt. & Wilson (CORRÊA, 1990)
Alguns sinônimos têm sido atribuídos para L. alba. Segundo Pascual et al.
(2001) uma revisão do gênero Lippia feita por Moldenke (1971, 1980) lista a seguinte
sinonímia: L. asperifolia A. Rich.; L. crenata Sessé & Moc.; L. geminata var.
microphylla Griseb.; L. germinata H.B.K.; L.glabriflora Kuntze; L.havanensis Turcz.;
L. lantanoides Coult.; L. trifolia Sessé & Moc.; Lantana alba Mill.; L. canescens Hort.;
L. geminata (H.B.K.) Spreng.; L. geminata Spreng.; L. lippioides Hook. & Arn.; Phyla
geminata H.B.K. e Verbena lantanoides Willd.
Para Lippia alba var. globiflora (L’Hér.) Moldenke são descritos: L. balsamea
Mart.; L. citrata Cham.; L. citrata Wild.; L. geminata Kunth; L. geminata H.B.K. e L.
globiflora Kuntze (PASCUAL et al. 2001).
Oliveira et al. (2006) citam cinco sinônimos para a nomenclatura botânica de
Lippia alba: L. geminata Kunth; L. geminata var. microphylla Griseb. Lantana alba
Mill.; (descritas por Pascual et al. (2001)) e acrescenta Lantana geminata (Kunth)
Spreng. e Lippia globiflora var. geminata (Kunth) Kuntze.
A literatura científica descreve a existência de diversos quimiotipos para esta
espécie, observando-se uma grande diversidade qualitativa e/ou quantitativa entre os
componentes químicos de seus óleos essenciais, como será visto adiante. Em trabalho
recente, Hennebelle et al. (2006) procura relacionar alguns destes quimiotipos com
certas características morfológicas. Alguns táxons subespecíficos têm sido descritos: L.
alba f. alba, L. alba f. scabra Moldenke, L. alba f. intermedia Moldenke, L. alba f.
macrophylla Moldenke, L. alba var. carterae Moldenke e L. alba var. globiflora (L’
Her.) Moldenke. Destes, L. alba var. carterae parece ter uma composição química
18
específica para o seu óleo essencial (quimiotipo estragol) e uma evidente característica
morfológica (flores amarelas, enquanto a cor usual é branca ou rosa). Dois quimiotipos
da Guatemala descritos por Fischer et al. (2004) diferem pela forma das folhas, largura
da folha e comprimento do caule floral. O quimiotipo mircenona foi caracterizado por
possuir formas angulares de folhas, significantemente mais largas e caules florais mais
curtos que o quimiotipo citral. Esta observação pode suportar um morfotipo
correspondente ao nome mais antigo Lippia asperifolia Rich., rejeitado por Moldenke e
considerado atualmente como sinônimo de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown.
Não obstante, diversidades morfológicas e químicas entre algumas amostras de
L. alba podem não estar relacionadas a subespécies ou sinônimos. Assim, um dos
quimiotipos descritos por Matos (1996b) em que o óleo essencial é considerado rico em
citral/mirceno, difere morfologicamente dos outros dois descritos por ter folhas mais
estreitas e compridas, e maior tamanho de inflorescência. Por outro lado, Fester,
considerado o principal autor de numerosos artigos sobre este assunto, nunca
mencionou qualquer diferença morfológica entre os quimiotipos (HENNEBELLE et al.
2006).
O estudo anatômico abrange principalmente as folhas, que corresponde à parte
do vegetal mais empregada na terapêutica (CORRÊA, 1992; MATOS, 1996;
FERREIRA et al., 2000 e 2002; GILBERT et al., 2005) e mais raramente os outros
órgãos, como o caule, descrito por Ferreira et al. (2003). Entre as características
microscópicas analisadas, as que mais auxiliam na caracterização específica são o
tamanho, a forma e a densidade dos tricomas, como foi proposto por Bassols e Gurni
(2000) para a diferenciação entre as folhas de quatro espécies de Lippia de origem
argentina, usadas na medicina folclórica. Posteriormente, Julião et al. (2002)
quantificaram os tricomas glandulares de L. alba.
1.1.2.2. Dados químicos
Diversos constituintes químicos de diferentes órgãos de Lippia alba já foram
isolados, muitos dos quais são relacionados ao seu uso terapêutico na medicina
tradicional..
19
Terpenóides
Da fração volátil obtida das folhas várias substâncias terpenoídicas foram
identificadas, compondo os aromas peculiares da espécie. A principal característica
destes óleos é a variação na composição química, dependente da origem da matéria-
prima, estágio de desenvolvimento da planta e parte selecionada para a extração do óleo
essencial. Esta alternância pode ser devido a fatores ambientais, diferentes metodologias
para a obtenção da essência, assim como a variabilidade genética dos exemplares
coletados (ZOGHBI et al. 1998; CASTRO et al. 2002; OLIVEIRA et al. 2006). A
variação química é tão freqüente que Matos et al. (1996b) sugeriu a divisão em
diferentes quimiotipos. São conhecidos aqueles onde predominam os seguintes
constituintes: citral (MATOS, et al. 1996; TAVARES et al. 2005), linalol
(FRIGHETTO et al. 1998; SIANI et al. 2002; TAVARES et al. 2005), carvona
(MATOS et al. 1996b; TAVARES et al. 2005), limoneno (PINO et al. 1997), γ-
terpineno, (GOMES et al. 1993), citral-mirceno (MATOS 1996b), citral-limoneno
(MATOS 1996b), citral-β-cariofileno (CRAVEIRO et al. 1981b), citral-germacreno D
(ZOGHBI et al. 1998), carvona-limoneno (MATOS 1996b), 1,8-cineol-limoneno
(ZOGHBI et al. 1998), limoneno-piperitona (SENATORE e RIGANO 2001);
tagetenona (FISCHER et al. 2004; HENNEBELLE et al. 2006), mirceno
(HENNEBELLE et al. 2006), cânfora-1,8-cineol (HENNEBELLE et al. 2006), estragol
(HENNEBELLE et al. 2006).
1-8 Cineol
O
Carvona
O
gama-Terpineno
Piperitona
O
Cânfora
O
Estragol
O
Germacreno D
20
Iridóides
Das raízes de L. alba foram isolados os glicosídeos de natureza iridóide,
theviridosídeo, mussaenosídeo e gardosídeo (SENA FILHO et al. 2007). O segundo
iridóide mencionado (SILVEIRA e PESSOA 2005; HENNEBELLE et al. 2006) e mais
seis outros membros do grupo, foram isolados das folhas: geniposídeo (RIMPLER et al.
1986; HEINRICH et al. 1992; PASCUAL et al. 2001; HENEBELLE et al. 2006), o
éster metílico do shanzhisídeo, (SILVEIRA e PESSOA 2005; BARBOSA et al. 2006;
HENNEBELLE et al. 2006), thevesídeo (HENNEBELLE et al. 2006), ácido
geniposídico (HENNEBELLE et al. 2006), caryoptosídeo (HENNEBELLE et al. 2006)
e 8-epi-loganina (HENNEBELLE et al. 2006).
MeO
OH
O
O
O
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theviridoside mussaenoside
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gardosídeo geniposide
21
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CH
2
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éster metílico do shanzisídeo thevesídeo
HO
2
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ácido geniposídico
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S
S
caryoptosídeo
8-epi-loganina
Flavonóides
A análise fitoquímica das folhas do quimiotipo limoneno-carvona de Lippia
alba, coletado na região nordeste brasileira, levou ao isolamento de dois biflavonóides:
5,5’’-diidroxi-6,4’,6’’,3’’’,4’’’-pentametoxi-[C
7
-O-C
7’’
]-biflavona e 4’,4,5,5’’-
22
tetraidroxi-6,6’’,3’’’-trimetoxi-[C
7
-O-C
7’’
]-biflavona (BARBOSA et al. 2005;
SILVEIRA e PESSOA. 2005; BARBOSA et al. 2006; HENNEBELLE et al. 2006). Um
novo constituinte de origem natural, apigenina-7-O-[(3-O-acetil)β-D-
glicopiranuronil(1→2)]-β-D-glicopiranuronideo, e quatro outros flavonóides isolados
pela primeira vez no gênero Lippia são descritos por Hennebelle et al. (2006). São eles:
apigenina-7-O-glicuronídeo, luteolina-7-O-glicuronídeo, apigenina-7-O-diglicuronídeo
e luteolina-7-O-diglicuronídeo.
Apigenina - 7 - O - glicuronídeo
O
O
OH
OH
O
O
H
H
OH
H
H
H
OH
OH
OH
O
Luteolina - 7 - O - glicuronídeo
O
O
OH
OH
O
O
H
H
OH
H
H
H
OH
OH
OH
O
OH
Fenilpropanóides
Do quimiotipo rico em linalol cultivado em canteiros experimentais de
Farmanguinhos (FIOCRUZ) no Rio de Janeiro, foi isolado o fenilpropanóide
verbascosídeo (acteosídeo) a partir do extrato aquoso das folhas frescas (FERREIRA et
al. 2001). O mesmo constituinte foi também obtido do extrato etanólico das folhas do
táxon infra-específico L. alba f. intermedia Moldenke (OLIVEIRA et al. 2005) e do
extrato metanólico das folhas de uma amostra coletada em Gourbeyre, na ilha de
Guadalupe (França) (HENNEBELLE et al. 2006). Por sua vez, isoverbascosídeo
23
(isoacteosídeo) foi isolado das folhas dos quimiotipos existentes no Horto de Plantas
Medicinais “Prof. Francisco José de Abreu Matos”, da Universidade Federal do Ceará
(UFC), em Fortaleza (SILVEIRA e PESSOA 2005) e das folhas do exemplar de
Guadalupe (HENNEBELLE et al. 2006). O derivado, decafeoil verbascosídeo
(decafeoil acteosídeo) foi posteriormente descrito por Barbosa et al. (2006) nas folhas
frescas do quimiotipo mirceno-citral, coletado em Fortaleza e por Silveira e Pessoa
(2005) nos três quimiotipos do Horto da UFC. Outros constituintes pertencentes à classe
dos fenilpropanóides também já foram isolados das folhas de L. alba: isonuomiosídeo,
um derivado apiosil-glicosídeo, dos quimiotipos cultivados em Fortaleza (SILVEIRA e
PESSOA 2005) e do mesmo quimiotipo mirceno-citral de Fortaleza, descrito
anteriormente (BARBOSA et al. 2006); 2-acetil acteosídeo (2-acetil verbascosídeo);
calceolariosídeo E (nuomiosídeo); forsythosídeo B e cistanosídeo F, obtidos do material
coletado em Guadalupe (HENNEBELLE et al. 2006).
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Decafeoil verbascosídeo
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forsythosídeo B
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S
R
R
S
R
cistanosídeo F
26
1.1.2.3. Dados Farmacológicos
Algumas propriedades terapêuticas atribuídas à espécie possuem apoio
experimental, tanto no que diz respeito ao seu óleo essencial quanto aos seus
constituintes não voláteis.
Atividade antimicrobiana
A atividade antibacteriana foi demonstrada in vitro contra Staphylococcus
aureus e Streptococcus pneumoniae pelo ensaio do halo de inibição em placa. Foram
aplicados em discos de 6 mm, 50 μL de solução etanólica contendo 25 mg de extrato
seco feito por extração de 50 g de folhas com 500 mL de etanol a 88% (GILBERT et al.
2005; CÁCERES et al. 1991). A atividade antibacteriana pode estar relacionada, pelo
menos em parte, com a presença de fenilpropanóides como verbascosídeo que mostra
atividade moderada contra Proteus mirabilis e Staphylococcus aureus, inclusive
linhagens resistentes a meticilina (DIDRY et al. 1999). Lemos et al. (1990) relataram a
atividade do óleo essencial contra bactérias Gram-negativas (E. coli, S. aureus, P.
aeruginosa, B. subtilis e M. smegmatis) e contra fungos (S. cerevisiae, C. neofarmans, e
A. flavus). A ação contra Candida albicans foi demonstrada por Holetz et al. (2002).
Atividade antiviral
Em experiências frente a Herpes simplex HSV-1, Abad et al. (1997) mostraram
que o extrato etanólico de L. alba foi eficaz numa concentração que variou de 12,5 a 50
μg/mL.
Bettega et al. (2000) determinaram a atividade antiviral com extratos
hidroalcoólicos a 80% (rico em flavonóides) e a 40% (com baixa concentração de
flavonóides). Desses extratos foram obtidas quatro frações: diclorometano, acetato de
etila, butanol e água. As frações butanólica e aquosa, obtidas do extrato a 80%, foram as
mais ativas na inibição da replicação da cepa 29R do vírus herpético humano do tipo 1
27
(HSV-1, cepa resistente ao aciclovir), enquanto que as frações diclorometano e acetato
de etila, de ambos os extratos, foram as mais ativas contra o vírus da poliomielite do
tipo 2 (GILBERT et al. 2005).
Ação sedativa
Propriedades sedativas têm sido demonstradas com o citral como também com o
verbascosídeo (GILBERT et al. 2005; RAKOLOARISON et al. 2000 FERREIRA et al.
2001). Klueger et al. (1996) demonstraram uma atividade depressora inespecífica sobre
o sistema nervoso central em camundongos, utilizando aplicação intraperitoneal, a qual
não pode ser comparada à via oral. Este efeito ocorreu com a infusão, mas não com o
óleo essencial destilado das folhas, evidenciando-se a importância dos componentes
polares da planta. Estes autores, como também Furtado et al. (2000), não encontraram
evidência de atividade ansiolítica, embora Vale et al. (1999) considerem os seus
resultados com camundongos nos ensaios do labirinto em cruz elevada, indicativos de
um efeito ansiolítico dos óleos essenciais de três variedades de L. alba. Furtado et al.
(2000), empregando o mesmo modelo, relataram uma discreta ação depressora central
para o citral administrado por via intraperitoneal.
Uma investigação dos efeitos sobre o comportamento de camundongos com
óleos essenciais usando-se variedades de L. alba contendo outros componentes
principais, evidenciaram atividades discretas por via intraperitoneal (VALE et al. 1999).
Quando extratos hidroalcoólicos (40% e 80% de etanol, em doses de 0,1 e 0,2 g/kg
respectivamente) foram aplicados em camundongos por via oral, foi observado um
efeito depressor central, atribuído aos flavonóides presentes no extrato feito com etanol
a 80%, os quais não foram identificados (SANTOS et al. 1998, ZETOLA et al. 2002).
Extratos aquosos das folhas secas, onde os componentes mais polares devem
predominar, reduziram o tempo de indução do sono barbitúrico em 49,3% e
aumentaram a duração de sono em 70% (ANGELUCCI et al. 1990). No entanto, o
extrato hidroalcoólico com maior conteúdo de etanol (80%) produziu uma depressão
maior do SNC em termos destes dois efeitos, novamente atribuída a flavonóides não
identificados (CAMPESTRINI et al. 2000, SANTOS et al. 1998).
28
Recentemente Vale e colaboradores (2002) mostraram que componentes do óleo
essencial de L. alba , como limoneno (200 mg/kg), citral (100 mg/kg) e mirceno (200
mg/kg) aumentam o tempo de sono induzido pelos barbituratos. Embora o citral não
afete o início do sono, ele aumenta a sua duração. Nas doses de 100 mg/kg e 200 mg/kg,
o citral aumenta em 2,3 e 3,5, respectivamente o tempo de sono induzido pelos
barbituratos em camundongos. Efeitos semelhantes foram obtidos com o mirceno e o
limoneno (ambos na concentração de 200 mg/kg). O aumento do tempo do sono foi
nestes casos, de 2,6 vezes.
Ação analgésica
Vale et al.(1999) mostraram a ação analgésica de Lippia geminata (espécie
muito próxima a L. alba) e o efeito antinociceptivo foi confirmado para os óleos
essenciais de dois quimiotipos de L. alba por Viana et al. (1998). Destaca-se nestas
experiências o β-mirceno para o qual esta atividade foi demonstrada em estudos sobre
Cymbopogon citratus (FERREIRA 1984, RAO et al. 1990). O efeito antinociceptivo
não se limita à ação do mirceno, o que é evidenciado pelos estudos de Di Stasi et al.
(1986) e Costa et. al. (1989), que indicaram um efeito analgésico discreto mas
significativo (medido por ensaios de contorção e de movimento caudal) com sólidos
derivados do extrato hidroetanólico (50%). Estes foram administrados por via oral em
doses de 18 a 24 mg/kg, equivalentes a aproximadamente 1 g/kg das folhas, em ratos
que receberam peróxido de benzoila (i.p.), 60-90 min após a administração da droga. O
uso popular contra reumatismo seria apoiado nesta ação analgésica (GILBERT et al.
2005).
Atividade estomáquica
Embora efeitos citoprotetor e antiinflamatório sobre a mucosa gástrica tenham
sido demonstrados para β−cariofileno em ratos por via oral, em um modo dose
dependente, este sesquiterpeno, normalmente presente em L. alba, não inibe
29
ulcerogênese provocada por indometacina (TAMBE et al. 1996). A infusão das folhas,
no entanto, inibe a ulcerogênese, igualmente induzida por indometacina, em um prazo
curto (1 dia) ou longo (5 dias), o que sugere a presença, no infuso, de um outro
componente ativo responsável por esta ação (GILBERT et al. 2005; PASCUAL 2001b).
Atividades cardioativa e tônica
O uso popular de Lippia alba contra palpitações e como estimulante
(CRAVEIRO 1981-2) poderia estar relacionado com a presença do verbascosídeo que
induz, em coração de rato, um efeito cardioativo, possivelmente devido ao aumento do
nível de prostaciclina (PENNACCHIO et al. 1999). O verbascosídeo também reduz o
stress oxidativo nos músculos, causado por excesso de exercícios, através da redução de
oxidação de lipídeos mediante o seqüestro de radicais livres (GILBERT et al. 2005;
GAO et al. 1999).
Atividade antiinflamatória
Usando-se o modelo da indução inflamatória da orelha de camundongos, foi
avaliada a propriedade antiinflamatória dos extratos hidroalcoólico e éter etílico, assim
como do próprio óleo essencial puro do quimiotipo carvona-limoneno de L. alba. A
administração tópica do óleo essencial mostrou uma resposta significativa na
inflamação induzida por TPA e uma baixa potência no edema provocado pelo ácido
araquidônico. O efeito antiinflamatório dos extratos hidroalcoólico e etéreo foram
melhor observados no edema induzido pelo segundo agente inflamatório (79,51% e
74,92%), respectivamente (BADILLA et al. 2007).
30
1.1.3. Melissa officinalis
1.1.3.1. Dados Botânicos
Lamiaceae é uma família que possui distribuição cosmopolita, incluindo cerca
de 300 gêneros e 7500 espécies. No Brasil ocorrem 26 gêneros e cerca de 350 espécies.
É uma família constituída por ervas ou arbustos, menos freqüentemente árvores,
comumente aromáticas, com ramos geralmente quadrangulares. As folhas são opostas
ou menos freqüentemente verticiladas ou alternas, simples, raramente compostas, sem
estípulas, geralmente serreadas. A inflorescência é geralmente cimosa, freqüentemente
congesta; as flores, bissexuadas, zigomorfas, diclamídeas, com cálice pentâmero,
gamossépalo, prefloração gerlmente imbricada, em geral persistente na frutificação;
corola pentâmera, gamopétala geralmente bilabiada, com 2 ou 4 estames, neste caso
didínamos, epipétalos, anteras rimosas; ovário súpero, bicarpelar, bilocular ou
tetralocular pelo desenvolvimento de um falso septo, geralmente profundamente
tetralobado e, neste caso, estilete geralmente ginobásico; com dois óvulos por carpelo.
O fruto é quase sempre uma baga ou um esquizocarpo. Podem se encontradas além de
ervas aromáticas, espécies ornamentais e invasoras de culturas. (SOUZA e LORENZI
2005, p. 523).
Figura 3: Melissa officinalis L.
31
Trabalhos recentes em filogenia evidenciaram que Lamiaceae apenas formaria
um grupo monofilético com a inclusão de alguns gêneros tradicionalmente reconhecidos
em Verbenaceae, os quais apresentam estilete terminal, característica usada
anteriormente para a distinção destas duas famílias. Com isso, ampliou-se a
circunscrição e o número de gêneros em Lamiaceae. De acordo com a circunscrição
atualmente aceita, esta família poderia ser distinta de Verbenaceae por possuir
inflorescência cimosa e pólen com exina não espessada próximo às aberturas (SOUZA e
LORENZI 2005, p. 523)
A espécie botânica Melissa officinalis é indígena no oeste da Ásia e na região
oriental do mediterrâneo, sendo cultivada nas regiões central, oriental e ocidental da
Europa e também nos Estados Unidos da América do Norte (WHO 2002). No Brasil, foi
introduzida e cultivada principalmente nas regiões Sudeste e Sul. Morfologicamnte é
bem conhecida (BRITISH HERBAL PHARMACOPOEIA 1983; FARMACOPEA
UFFICIALE DELLA REPUBBLICA ITALIANA 1991), sendo considerada uma planta
arbustiva de 0,2 a 0,8 metros de altura, vivaz, com caule em tufo, ramificado a partir da
base, ereta. As folhas são ovais, pecioladas, serradas, com nervuras salientes, reticuladas
na face inferior. As flores podem ser amarelas, tornando-se brancas ou rosadas, de 6 a
12 verticilos ao nível das folhas. O fruto tem quatro cerdas marcadas e as sementes são
de cor pardo-escura e brilhantes (CORRÊA JUNIOR et al. 1994, p. 110).
Microscopicamente, é característico o indumento piloso das folhas, com tricomas
tectores e glandulares de diversos aspectos (WHO 2002).
Segundo o sistema adotado por Cronquist (1981), modificado por Kubitzki em
seu sistema de arranjo das plantas vasculares, adotado por Mabberley (1997), a espécie
apresenta a seguinte posição taxonômica:
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopsida
Subclasse: Asteridae
Ordem: Lamiales
Família: Lamiaceae (Labiatae)
Subfamília: Nepetoideae
Gênero: Melissa L.
Espécie: Melissa officinalis L. (DI STASI e HIRUMA-LIMA 2002, p. 413)
32
São descritas algumas subespécies: M. officinalis ssp. inodora; M. officinalis ssp.
officinalis, M. officinalis ssp. altissima (BASER 1994).
1.1.3.2. Dados Químicos
Os principais constituintes químicos são os ácidos hidroxicinâmicos, como o
ácido rosmarínico (até 6%), ácido p-cumárico, ácido caféico e ácido clorogênico. Possui
também derivados do ácido p-hidroxibenzóico como o ácido gálico, ácido p-
hidroxibenzóico, ácido protocatéquico, ácido gentísico, ácido vanílico e ácido siríngico.
O seu óleo essencial (0,02-0,37) é constituído por mais de 40% de monoterpenos e
cerca de 35% de sesquiterpenos. Os constituintes terpenoídicos mais importantes são o
citral (mistura dos isômeros geranial e neral), citronelal, geraniol, nerol, linalol,
carvacrol, acetato de farnesila, acetato de geranila, citronelato de metila, trans-
β
-
ocimeno, germacreno D, eugenol, humuleno,
β
-cariofileno, eremofileno e sabineno.
Outros constituintes incluem flavonóides (luteolina 3’-glicuronido, cynarosídeo,
cosmosiina, rhamnocitrina, isoquercitrina), taninos e triterpenos (ácidos ursólico e
oleanólico) (ZIVANOVIC et al. 1990; SCHULTZE et al. 1993; BASER 1994; ESCOP
1996; BLUMENTHAL et al. 1998; PDR 1998; HEITZ et al. 2000; WHO 2002;
ZIAKOVÁ et al. 2003; KARASOVÁ e LEHOTAY 2005).
O
H
O
H
neral
geranial
citral
H
H
β
-cariofileno
OH
OH
O
O
OH
linalol
geraniol
nerol
acetato de geranila
33
Luteolina 3 ' - glicuronídeo
O
O
OH
OH
OH
O
O
H
H
OH
H
H
H
OH
OH
OH
O
O
O
O
OH
H
OH
OH
OH
OH
Ácido Rosmarínico
1.1.3.3. Dados Farmacológicos
Atividade antiespasmódica
O óleo essencial de M. officinalis mostrou atividade espasmolítica quando
testado no íleo de cobaias, no duodeno de ratos e no jejuno e aorta de coelhos
(DEBELMAS e ROCHAT 1967; WAGNER e SPRIKMEYER 1973; ESCOP 1996;
WHO 2002). O óleo mostrou efeitos relaxantes no músculo traqueal em cobaias (EC
50
de 22 mg/L) e também inibiu as contrações fásicas do músculo longitudinal do plexo
mesentérico do íleo estimulado eletricamente (EC
50
de 7,8 mg/L) (REITER e BRANDT
1985; ESCOP 1996; WHO 2002). Não obstante, as doses de 2,5 mL e 10 mL por litro
de um extrato etanólico a 30% (3,5 partes por uma parte de planta) não mostrou
atividade antiespasmódica significativa quando testado em íleo de cobaias estimulado
por acetilcolina e histamina (FORSTER et al. 1980; ESCOP 1996; WHO 2002).
Atividade antiviral
Extratos aquosos produziram efeitos antivirais contra o vírus da doença de
Newcastle, vírus de influenza, mixoviroses e vírus do Herpes simplex (KUCERA e
HERRMANN JR. 1967; MAY e WILLUHN 1978; VLIETINCK e DOMMISSE 1985;
KÖNIG e DUSTMANN 1985; ESCOP 1996; WHO 2002). Propriedades antioxidantes
34
e sequestrantes de radicais livres têm também sido descritas (VAN KESSEL et al. 1985;
VERWEIJ-VAN VAUGHT et al. 1987; LAMAISON et al. 1990; LAMAISON et al.
1991; LAMAISON et al. 1991b; ESCOP 1996).
Em um teste clínico envolvendo 115 pacientes, um creme contendo 1% de um
extrato aquoso liofilizado (70:1) reduziu significativamente o tempo de cicatrização de
lesões cutâneas provocadas por herpes simplex. Observou-se ainda um aumento
significativo nos intervalos entre os períodos de recorrência da infecção, quando
comparado com outras preparações virustáticas contendo idoxuridina ou hidrocloreto de
tromantidina (p<0,01) (WÖLBLING e MILBRADT 1984; WÖLBLING e
LEONHARDT 1994; ESCOP 1996; WHO 2002). Estes resultados foram confirmados
por um teste clínico duplo-cego controlado com placebo em 116 pacientes, onde
observou-se uma redução significativa no tamanho das lesões no período de 5 dias
(p=0,01) (VOGT et al. 1991; WÖLBLING e LEONHARDT 1994; ESCOP 1996; WHO
2002).
Atividade sedativa
Estudos in vivo mostraram um efeito sedativo de um extrato hidroalcoólico
liofilizado a 30% administrado intraperitonealmente em camundongos. O efeito
resultante mostrou-se dose-dependente até 25 mg/Kg do peso corpóreo. Doses menores
(3-6 mg/Kg) do extrato induziram o sono em camundongos tratados com uma dose
infra-hipinótica de pentobarbital e ainda prolongou o sono induzido por este reagente.
Doses mais elevadas (400 mg/Kg) foi observado um efeito analgésico periférico no teste
de contorção induzida por ácido acético (SOULIMANI et al. 1991; SOULIMANI et al.
1993; ESCOP 1996).
O óleo essencial administrado intraperitonealmente em camundongos não
mostrou resultados no teste da escadaria como também não foi ativo em prolongar o
sono induzido por pentobarbital (SOULIMANI et al. 1991; ESCOP 1996). Quando,
porém, dado oralmente a camundongos, ele apresentou efeitos sedativo e narcótico nas
doses acima de 3,16 mg/Kg (WAGNER e SPRINKMEYER 1973; ESCOP 1996).
35
Atividade antiinflamatória
O ácido rosmarínico reduziu o edema de pata de rato e inibiu a anafilaxia
cutânea passiva em ratos (ESCOP 1996). Aplicado topicamente (5% em veículo) em
macacos rhesus, este mesmo constituinte diminuiu os índices de gengivite e de placa em
um estudo realizado durante três semanas, quando comparado com placebo (p<0,001)
(VAN DYKE etal. 1986; ESCOP 1996).
Adicionalmente, o ácido rosmarínico tem sido indicado inibir outras reações
inflamatórias (GRACZA e LÖFFLER 1985; RAMPART et al. 1986; ESCOP 1996).
36
2- OBJETIVOS
Elaborar critérios científicos que permitam diferenciar de formas segura, rápida
e eficaz, produtos comerciais e suas matérias-primas de origem vegetal que tenham na
sua composição as espécies botânicas Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (Poaceae) e
Lippia alba (Mill.) N.E.Br. ex Britt. & Wilson (Verbenaceae), denominadas
vulgarmente como “ervas cidreiras”.
Objetivos específicos:
1. estudar exemplares de ervas cidreiras oriundos do cultivo experimental;
2. contribuir com a necessidade em definir parâmetros que individualize produtos
derivados de C. citratus e L. alba com relação à Melissa officinalis L.(Lamiaceae) (erva
cidreira verdadeira);
3. avaliar os aspectos morfológicos intrínsicos de cada espécie vegetal;
4. avaliar a fração volátil de cada espécie, visando suas identificações diferenciais por
meio do perfil cromatográfico em CG/EM;
5. avaliar extratos polares quanto aos seus perfis cromatográficos em CLAE-DAD,
objetivando as especificações individuais;
6. escolher a substância de referência para cada erva cidreira cultivada de acordo com a
técnica cromatográfica.
37
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Coleta e identificação de Cymbopogon citratus, Lippia alba (quimiotipos linalol,
citral e carvona) e Melissa officinalis
No ano de 2003 exemplares de Lippia alba (quimiotipos linalol, citral e
carvona), de Cymbopogon citratus e de Melissa officinalis, cultivadas em canteiros
experimentais do Laboratório de Produção de Biomassa e de Matéria-Prima Vegetal de
Farmanguinhos (FIOCRUZ) localizado no bairro de Jacarepaguá, foram enviados ao
Jardim Botânico do Rio de Janeiro, classificados taxonomicamente e suas exsicatas
depositadas no herbário desta instituição científica, respectivamente com os códigos
RB327301, RB377575, RB377576, RB340208 e RB340344 Amostras foram separadas
em cada coleta para a análise anatômica (folhas de todas as espécies e caules de L. alba
(quimiotipo linalol)
3.2. Preparo da matéria-prima vegetal para execução dos cortes, montagem das
preparações e análises morfológicas (macro e microscópicas).
Utilizou-se para todas as análises, no caso de Lippia alba, fragmentos do terço
médio das lâminas de folhas frescas do quarto nó (por volta de 5cm de comprimento por
3cm de largura). Para a espécie Cymbopogon citratus foram usados fragmentos do terço
médio de folhas frescas, da periferia e do centro da touceira (em torno de 60cm de
comprimento por 3cm de largura).Em Melissa officinalis foram obtidos fragmentos do
terço médio da lâmina de folhas frescas do terceiro e quarto nós (ao redor de 4 cm de
comprimento por 2 cm de largura. Foram realizados cortes transversais no micrótomo
manual tipo Ranvier com o auxílio de navalha histológica plano-côncava e os mesmos
submetidos a técnica de coloração dupla segundo Dop e Gautié (1928), onde foram
diafanizados com hipoclorito de sódio (10%), tratados com solução acética a 1% e água
destilada, corados com verde iodo e vermelho do congo, lavados com água destilada e
montados em glicerina entre lâmina e lamínula microscópicas. O estudo micrográfico
38
consistiu na análise do material seco a temperatura ambiente, grosseiramente
pulverizado e posterior montagem em solução de hipoclorito de sódio a 1%, água ou
glicerina. Para observação de todo o material empregou-se microscópio estereoscópico
Olympus BX-40 com sistema acoplado de microfotografia e ampliações de 150, 300,
400 e 600 X. Para as respectivas espécies vegetais foram coletadas 5 folhas de cada três
exemplares dos canteiros e realizados 10 a 15 cortes por folha.
3.3. Obtenção dos extratos
As amostras foram divididas em dois grupos: um para processamento como
planta fresca e o outro na forma de planta seca. Este último grupo foi manipulado para
secagem em estufa e posterior moagem.
A secagem consistiu na desidratação dos respectivos materiais em estufa com ar
ventilado durante aproximadamente dois dias (48 horas) a uma temperatura de 40
0
C. A
moagem foi realizada com a matéria-prima seca em liquidificador blindado de aço inox
Foram preparados os mesmos extratos das amostras de planta fresca e de planta seca,
usando-se dois sistemas de solventes: solução hidroalcoólica a 70% (v/v) e água
destilada. Os extratos hidroalcoólicos (solução etanol-água destilada a 70% v/v) foram
obtidos por maceração dinâmica e os extratos aquosos por decocção e por infusão.
Maceração Dinâmica: foi realizada em duas etapas, ambas de 24 horas de duração. Na
primeira etapa a planta ficou em contato com o solvente na proporção de uma parte de
planta para cinco partes de solvente em mesa agitadora. Após as primeiras 24 horas
ocorreu a troca do solvente usado, agora em proporção de uma parte da planta para duas
a quatro partes de solvente, permanecendo em agitação pelo mesmo período de tempo.
Ao término da extração, o extrato foi filtrado e o resíduo da planta prensado, retirando-
se desta forma todo o solvente. As frações obtidas foram reunidas e levadas sob pressão
reduzida até a completa secagem.
Decocção: foi usada a proporção de uma parte da planta para cinco partes do solvente.
Água destilada fervente foi vertida na amostra moída ou rasurada e a mistura obtida
mantida em ebulição durante 15 minutos. Após este tempo a solução extrativa foi
filtrada a quente, resfriada e levada à secura por processo de liofilização.
39
Infusão: foi usada a proporção de uma parte da planta para cinco partes do solvente.
Água destilada fervente foi vertida na amostra moída ou rasurada, tampada e deixada
esfriar até alcançar a temperatura ambiente. Após este tempo a solução extrativa foi
filtrada e levada à secura por processo de liofilização.
3.4. Perfil cromatográfico dos extratos
3.4.1. Cromatografia Líquída de Alta Eficiência (CLAE)
As análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE/DAD) pelo
método analítico, foram efetuadas em um sistema integrado a um detector de feixe de
diodos (DAD – SPD-M10ADvp Shimadzu) na região de 200-500 nm e fluxo de 1,0
mL/min e pelo método preparativo, feito em CLAE/UV (UV-VIS Detector SPD-10A-
Shimadzu) nos comprimentos de onda de 210, 254 ou 365 nm. Todas as análises de
CLAE foram realizadas em fase inversa (C-18) com coluna Lichrospher de dimensões
25 cm x 4,6 mm x 5 μm (analítico) e Shimpack RP-18 de dimensões 45 mm x 250 mm
x 10 μm (preparativo) utilizando-se acetonitrila, MeOH, H
2
O + TFA 0,05% e H
2
O
combinados em sistemas de eluentes.
Os solventes, metanol ou acetonitrila, utilizados nas diversas análises por CLAE
foram de grau CLAE/UV – Tedia ou JT Baker. A água foi obtida por destilação em
sistema Milli-Q. Todos os solventes de grau UV/HPLC foram filtrados em filtro 0,45
μm (marca Millipore) antes da utilização. As programações de cada método
desenvolvido para avaliação das coletas de Cymbopogon citratus (C.c.) e Lippia alba
(L.a.) foram:
40
TEMPO (min) CH
3
CN (%)
C.c. L.a.
10 3 3
17 8 12
35 14 20
40 27 35
42 36 54
48 42 70
62 65 90
A programação do método desenvolvido para avaliação das coletas únicas de
Cymbopogon citratus e Lippia alba, Melissa officinalis e suas respectivas substâncias
de referência foram:
TEMPO (min) CH
3
CN (%)
3 3
6 15
13 20
19 35
28 35
36 60
42 90
46 90
Obs: os perfis cromatográficos foram obtidos no comprimento de onda 305 nm.
3.4.2. Cromatografia de camada Delgada (CCD)
As cromatografias em camada delgada (CCD) analíticas foram feitas em
cromatofolhas de gel de sílica 60 F
254
(Merck)
de fase normal
e fase inversa (C-18) em
suporte de alumínio com 0,2 mm de espessura.
As cromatografias em camada fina preparativa foram elaboradas em placas
cromatográficas de vidro (20 x 20 cm ou 10 x 10 cm) nas fases de modo normal (Si-60
F
254
) e inverso (C-18).
41
As cromatoplacas de camada fina analítica foram analisadas a partir de exposição à
lâmpada ultravioleta (λ = 254 e 365 nm) e/ou mediante borrifação das seguintes
soluções reveladoras:
Vanilina Sulfúrica (VS):
• Revelador para óleos essenciais, terpenóides, derivados fenilpropanóides,
derivados fenólicos, etc.
• Composição:
Solução I : Solução a 5% de ácido sulfúrico em etanol.
Solução II: Solução a 1% de vanilina em etanol.
• Modo de uso:
Borrifar a cromatoplaca com a solução I, seguida da solução II e posteriormente
aquecer a 110°C.
Orcinol Sulfúrico (OS):
• Revelador para substâncias glicosiladas e açúcares de um modo geral.
• Modo de uso:
Dissolver 2g de orcinol em 100 mL de ácido sulfúrico concentrado e adicionar
lentamente a um volume de 900 mL de etanol, com resfriamento em banho de gelo.
O cromatograma é borrifado e aquecido a 100ºC por alguns minutos.
NP/PEG (Natural Products + Polietilenoglicol)
• Revelador para flavonóides e substâncias aromáticas.
42
Composição:
Solução I: 0,5g de NP (difenilboriloxietilamina) dissolvido em 10 mL de etanol.
Solução II: 1g de PEG (polietilenoglicol 4000) dissolvido em 10 mL de etanol.
• Modo de uso:
Inicialmente a cromatoplaca é borrifada com a solução I e após sua secagem natural
com a solução II. A cromatoplaca é observada em lâmpada ultravioleta a 365nm
(WAGNER et al. 1984).
3.4.3. Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) acoplada a
Espectrometria de Massas (EM)
A análise por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR) foi realizada em
cromatógrafo HP-6890 agilent.; detector por ionização de chama (DIC); gás carreador
H
2
; temperatura programada, injeção com divisão de fluxo e sem divisão de fluxo;
coluna capilar de sílica fundida, fase estacionária DB-1, 30m, d
ext
= 0,3 mm, d
fase
=0,2
nm.
A análise por cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a espectrometria
de massas (CGAR-EM) foi realizada com um cromatógrafo à gás HP-6890N acoplado a
um espectrômetro de massas computadorizado HP-5973, com analisador de íons
quadrupolo e ionização por impacto de elétrons, 70 eV. Temperatura programada 70 -
320
˚
C (5
˚
C/min); split 1:10, volume de injeção 10 μL coluna capilar de sílica fundida,
fase estacionária DB-5MS, 30m.
3.5. Obtenção dos óleos essenciais
Os óleos essenciais das respectivas espécies estudadas foram obtidos pelo
método de hidrodestilação, empregando-se a aparelhagem descrita pela Farmacopéia
Brasileira (4ª Edição). Utilizou-se 500 g de folhas frescas fragmentadas de cada espécie
vegetal, recentemente colhidas dos canteiros do Laboratório de Produção de Biomassa e
43
de Matéria-Prima Vegetal de Farmanguinhos. Adicionou-se 5 litros de água destilada e
a mistura foi aquecida por 8 horas consecutivas em destilador com sistema refrigerado
de água.. O óleo volátil arrastado durante o processo foi recolhido e guardado no
congelador em ampolas de vidro âmbar sob vácuo. Os rendimentos alcançados estão
indicados na tabela a seguir:
C. citratus L. alba
quimiotipo
linalol
L. alba
quimiotipo
citral
L. alba
quimiotipo
carvona
M.
officinalis
Biomassa
500 g 500 g 500 g 500 g 500 g
Óleo volátil
(em
gramas)
1,9 1,5 1,6 1,4 0,2
Rendimento
(%)
0,38 0,30 0,32 0,28 0,04
Tabela 1: Rendimentos dos óleos essenciais em folhas frescas das ervas cidreiras
cultivadas em Jacarepaguá (Rio de Janeiro/RJ)
3.6. Determinação da rotação ótica e do índice de refração
Para a determinação da rotação ótica de cada óleo essencial foi utilizado o
polarímetro JASCO 370 (célula de 10 mm), a 25 °C.
O índice de refração foi determinado no refratômetro de Abbé (Carl Zeiss)
termostato a 25 °C, a partir do óleo sem diluição.
3.7. Obtenção das substâncias polares
3.7.1. Lippia alba
3.7.1.1. Verbascosídeo e Isoverbascosídeo
Folhas frescas (100 g) de L alba (quimiotipo linalol) foram extraídas por
decocção em água destilada (700 mL) durante 15 minutos e posterior filtração à quente.
44
O filtrado foi resfriado e liofilizado, obtendo-se um material pastoso amarelo-escurecido
(3,81 g). Retirou-se uma fração alíquota (2,00 g) que foi submetida a uma cromatografia
em coluna (1,50 metros de comprimento por 2,0 cm de largura) com Sephadex LH-20
(120 g) da Pharmacia. O material foi eluído em MeOH, onde foram coletadas 95 frações
de 25 mL cada. A partir desta fração, foram sendo adicionados volumes crescentes de
água destilada (10%) até alcançar 100% de água (fração nº 110). Todas as frações foram
analisadas por CCD-Si em AcOEt: AcOH: HCOOH: H
2
O (10:1,1:1,1:2,7) e
posteriormente reunidas as frações metanólicas 50 a 67 que resultaram em um sólido
castanho-claro (216 mg). Este material foi submetido a uma cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE) em escala preparativa (coluna de 25 cm x 45 mm x 10 μm em
sílica C-18) com detector DAD em sistema isocrático acetonitrila:água (18%, com
0,05% de ácido trifluoracético e fluxo de 8 mL/min.). Foram obtidas 53 frações, das
quais as de nº 35 a 42 (23,9 mg, correspondendo a 1,19% de rendimento a partir do peso
do extrato bruto ou 0,045% de rendimento a partir do peso das folhas frescas) e de nº 45
a 51 (10,2 mg, correspondendo a 0,51% de rendimento a partir do peso do extrato bruto
ou 0,019% de rendimento a partir do peso das folhas frescas) foram reunidas e o
solvente evaporado à pressão reduzida. Os respectivos sólidos branco-amarelados foram
dissolvidos em DMSO-d
6
e submetidos as análises espectroscópicas (RMN
1
H,
RMN
13
C, COSY, DEPT, HMQC, HMBC, IV, UV, ESI) que indicaram respectivamente
as estruturas do verbascosídeo ou acteosídeo (LAB-03-02/43) e do isoverbascosìdeo ou
isoacteosídeo (LaA1FVC144-148-5).
3.7.2. Cymbopogon citratus
3.7.2.1. Isoorientina
Folhas secas de C. citratus (500 g) foram extraídas por decocção em água
destilada (2,5 L) e posteriormente a solução extrativa foi filtrada à temperatura
ambiente. O filtrado foi então resfriado e liofilizado, obtendo-se um sólido castanho-
escuro (4,22 g). Este material foi redissolvido em etanol aquoso a 50% (400 mL) e
45
lavado com hexano (3X 200 mL). A solução hidroalcoólica, após lavagem com o
solvente apolar, foi extraída com n-BuOH (3X 150 mL), obtendo-se após reunião das
frações e evaporação do solvente, um extrato butanólico que foi submetido a uma
cromatografia em coluna usando-se sephadex LH-20 em MeOH. Foram obtidas 14
frações, das quais às de nº 7 a 12 foram reunidas e posteriormente a nova fração
resultante foi submetida a CLAE/UV em escala preparativa (coluna de 25 cm x 45 mm
x 10 μm em sílica C-18) e eluída com MeOH aquoso a 43%. Nesta etapa do processo de
fracionamento resultaram 18 frações, das quais às de nº 7 a 9 foram reunidas e secas a
pressão reduzida, obtendo-se um sólido amarelado (5,7 mg) em 0,13% de rendimento a
partir do peso do extrato bruto ou em 0,0011% de rendimento considerando-se o peso
de folhas secas. O material analisado por técnicas espectroscópicas (RMN
1
H, RMN
13
C,
UV e ESI) mostrou ter a estrutura química da isoorientina ou homoorientina
(FLCCH02).
3.7.2.2. Ácido trans-p-cumárico
Folhas frescas de C. citratus (400 g) foram maceradas em uma solução
hidroalcoólica a 70% (2 L), resultando após evaporação do solvente (evaporação a
pressão reduzida e liofilização) em um material sólido de cor verde-escura (5,9 g). Este
sólido redissolvido em etanol aquoso a 50% (450 mL) foi então submetido a um
esgotamento sucessivo com solventes de polaridade crescente (hexano 3 x 150 mL;
acetato de etila 3 x 150 mL e n-BuOH 3 x 100 mL). As soluções em acetato de etila
foram reunidas e o solvente evaporado à pressão reduzida. O sólido obtido (1,28 g) foi
fracionado em uma cromatografia em coluna de fase inversa, com sílica C-18, usando-
se como sistema eluente a mistura MeOH/H
2
O (1:1). Deste fracionamento resultaram 67
frações, das quais as de nº 47 a 51, analisadas por CCD-Si em AcOEt/HCOOH/H
2
O
(8,8:0,6:0,6), foram reunidas e submetidas a um novo fracionamento em uma coluna de
menor diâmetro, empregando-se as mesmas condições anteriores. Das 22 frações
obtidas as de nº 4 e 5 foram reunidas e secas a pressão reduzida. O sólido branco
resultante (2,43 mg) foi analisado espectroscopicamente (RMN
1
H, RMN
13
C, HMQC e
ESI) e definida a estrutura química do ácido trans-p-cumárico (CC10-20-2). O
46
rendimento a partir do peso do extrato bruto foi de 0,041% e de 0,0006% quando levado
em consideração o peso de folhas frescas.
3.7.3. Melissa officinalis
3.7.3.1. Ácido Rosmarínico
Folhas frescas de M. officinalis (300 g) foram extraídas com etanol-água
destilada 70% (1,5 L) pelo processo de maceração. A solução hidroalcoólica foi
evaporada e liofilizada, obtendo-se um sólido castanho-amarelado (2,03 g). Este
material foi fracionado em coluna com Sephadex LH-20 (250 g) e MeOH/H
2
O (95:5)
até a fração nº 53, a partir da qual o teor de água foi sendo aumentado em 5% em
gradiente de eluição até MeOH/H
2
O 50%. Foram obtidas 92 frações, das quais as de nº
39 a 45,após análise por CCD-Si em AcOEt: AcOH: HCOOH: H
2
O (10:1,1:1,1:2,7)
foram reunidas e a nova fração resultante (1,10 mg) submetida a duas colunas flash
sucessivas com sílica em fase inversa C-18 e eluente acetonitrila/água (7:3). Na 1ª
coluna as frações de nº4 a 9, das 12 frações obtidas, foram reunidas e re-
cromatografadas nas mesmas condições. Foram recolhidas na 2ª coluna 15 frações de
onde as de nº 8 a 10 foram reunidas e o solvente evaporado a pressão reduzida. Obteve-
se um sólido amarelado (0, 80 mg) que aanálise por RMN
1
H e ESI indicou ter a
estrutura do ácido rosmarínico (MoAF FAQ p/p;maj). A substância foi obtida em
pequena quantidade com um rendimento de 0,04% em relação ao peso do extrato bruto
e em 0,0002% em relação ao peso das folhas frescas.
3.8. Equipamentos usados na Identificação espectroscópica das substâncias
isoladas
Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN
1
H) foram
registrados em espectrômetros Bruker (400 MHz e 500 MHz), com os solventes
47
deuterados, utilizando-se o tetrametilsilano (TMS) ou o próprio solvente como
referência interna, sendo os deslocamentos químicos (δ) expressos em unidades ppm e
as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz).
Os espectros de ressonância magnética nuclear de carbono (RMN
13
C) foram
registrados nos aparelhos descritos acima, nas freqüências de absorção apropriadas e
nos solventes indicados, utilizando-se TMS ou o próprio solvente como referência
interna. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em unidades ppm e as
constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz).
Os espectros de infravermelho (IV) foram obtidos em espectrômetro Nicolet de
feixe duplo, com transformada de Fourier, modelo Magna IR-760. As análises foram
feitas usando-se pastilhas comprimidas em brometo de potássio anidro (KBr). Os
comprimentos de onda das absorções estão expressos em centímetros recíprocos (cm
-1
).
Os espectros de absorção na região do ultravioleta foram registrados em
espectrofotômetro Shimadzu UV-1601 no solvente indicado. As reações de
deslocamento com NaOAc, NaOAc/H
3
BO
3
, AlCl
3
e AlCl
3
/HCl foram efetuados
segundo o procedimento proposto por Mabry.
A análise por cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a espectrometria
de massas (CGAR-EM) foi realizada com um cromatógrafo à gás HP-5880 acoplado a
um espectrômetro de massas computadorizado HP-5897 A com analisador de íons
quadrupolo e ionização por impacto de elétrons, 70 eV. Temperatura programada de
acordo com a amostra; coluna capilar de sílica fundida, fase estacionária DB-1 ou DB-5,
30m.
Os espectros de massas das substâncias polares foram obtidos pela técnica de
ionização por “eletrospray” (ESI) em aparelho LC Micromass ZQ 4000, triplo-
quadrupólo, pelo modo positivo ou negativo, com voltagens variadas e por inserção
direta.
48
3.9. Organogramas de isolamento das substâncias
Esquema 1
FOLHAS FRESCAS DE
Lippia alba
(quimiotipo linalol)
1. DECOCÇÃO
2. LIOFILIZAÇÃO
MATERIAL
LIOFILIZADO
3. CROMATOGRAFIA EM COLUNA
SEPHADEX (95 FRAÇÕES)
FRAÇÕES
DE 50 a 67
4. CLAE/UV PREPARATIVA
FRAÇÕES 35 A 42
VERBASCOSÍDEO
FRAÇÕES DE 45 A 51
ISOVERBASCOSÍDEO
49
Esquema 2
FOLHAS SECAS DE
Cymbopogon citratus
1. DECOCÇÃO
2. LIOFILIZA
Ç
ÃO
MATERIAL
LIOFILIZADO
3. PARTIÇÃO
HEXANO n-BuOH
4. CROMATOGRAFIA EM
COLUNA SEPHADEX
FRAÇÕES
DE 7 A 12
5. CLAE/UV PREPARATIVA
FRAÇÕES 7 A 9
ISOORIENTINA
50
Esquema 3
FOLHAS FRESCAS DE
Cymbopogon citratus
1. MACERAÇÃO EM 70% EtOH/H
2
O
2. CONCENTRAÇÃO DO EXTRATO
3. LIOFILIZAÇÃO
MATERIAL SECO
4. PARTIÇÃO
HEXANO AcOEt n-BuOH
5. EVAPORAÇÃO
6. CROMATOGRAFIA EM COLUNA C-18
FRAÇÕES DE
47 A 51
7. CROMATOGRAFIA EM COLUNA C-18
FRAÇÕES 4 e 5
ÁCIDO trans-p-CUMÁRICO
51
Esquema 4
FOLHAS FRESCAS DE
Melissa officinalis
1. MACERAÇÃO EM 70% EtOH/H
2
O
2. CONCENTRAÇÃO DO EXTRATO
3. LIOFILIZAÇÃO
MATERIAL SECO
4. CROMATOGRAFIA EM COLUNA
SEPHADEX
FRAÇÕES
DE 39 a 45
5. CROMATOGRAFIAS SUCESSIVAS (2X)
EM COLUNA FLASH
FRAÇÕES 8-10
ÁCIDO ROSMARÍNICO
52
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Aspectos botânicos
As folhas das espécies vegetais coletadas no Laboratório de Produção de
Biomassa da Matéria-Prima Vegetal (LPBMPV) pertencente a Farmanguinhos
(FIOCRUZ) e localizado no bairro de Jacarepaguá (Rio de Janeiro/RJ) apresentaram as
seguintes características morfológicas:
4.1.1. Cymbopogon citratus
Figura 4: Cymbopogon citratus
Aspecto geral
4.1.1.1. Descrição macroscópica
As folhas íntegras foram alternas, compridas, de limbo áspero, linear-lanceolado,
bainha larga, base ligulada, ápice agudo e margens inteiras. O padrão de nervação foi do
53
tipo paralelinérveo, com uma nervura central espessa e canaliculada, saliente na face
dorsal. Observou-se uma tênue camada de cera branca recobrindo as lâminas foliares.
FIGURA 5: folha de Cymbopogon citratus.
Detalhes das faces superior (esquerda) e inferior (direita) – (10X)
4.1.1.2. Descrição microscópica
Em secção transversal do limbo foliar, esta gramínea apresentou uma epiderme
adaxial uniestratificada, cutinizada, com células de paredes ondeadas e outras do tipo
buliforme, de maiores dimensões. Notou-se pequenas papilas características (tricomas
silicosos, curtos). A epiderme abaxial, cutinizada e uniestratificada, mostrou células de
contorno mais arredondado e os mesmos anexos epidérmicos descritos acima. O
mesofilo apresentou, na parte superior, várias camadas de células grandes, de contorno
circular, de natureza parenquimática, enquanto na parte inferior observou-se células de
menores dimensões, com paredes mais espessadas e diversas nervuras paralelas
constituídas por feixes vasculares colaterais envolvidos por uma bainha de feixe
parenquimática e um revestimento fibroso na região basal, próximo ao floema. As
nervuras de maior tamanho podem apresentar uma bainha esclerenquimática que está
diretamente unida, ou não, ao feixe vascular e em geral encontra-se associada à
epiderme adaxial. Entre as nervuras mais calibrosas notou-se uma seqüência de três a
cinco pequenos feixes vasculares ligados apenas à epiderme abaxial (figuras 6 e 7, p.
54).
54
Figura 6: Secção transversal da lâmina foliar de Cymbopogon citratus
Detalhe da região mediana (100X)
Figura 7: Secção transversal da lâmina foliar de Cymbopogon citratus
Detalhe do feixe vascular (200X)
4.1.1.3. Análise do material pulverizado
O material foliar (figura 8, p. 55) quando pulverizado possui coloração verde
escura e um odor e sabor cítricos. Microscopicamente podem ser observados fragmentos
da lâmina foliar contendo células epidérmicas do tipo buliforme, de contorno
55
arredondado, com camada cuticular espessa; fragmentos do mesofilo com células
justapostas, volumosas, sem cristais no interior. Destacam-se vários feixes vasculares e
fibras em grande quantidade. Não foram observados tricomas glandulares, entretanto
pequenas papilas (tricomas silicosos) ocorreram no tecido epidérmico (figura 8, p. 55).
Figura 8: Aspecto do material pulverizado da folha
de Cymbopogon citratus (400X)
56
4.1.2. Lippia alba
Figura 9: Lippia alba quimiotipo citral Figura 10: Lippia alba quimiotipo carvona
Aspecto geral Aspecto geral
4.1.2.1. Descrição macroscópica
As folhas dos três quimiotipos estudados apresentaram um contorno do limbo
oval (linalol), oval-lanceolado (citral), ovado-oblongo ou simplesmente oblongo
(carvona). A base é cuneada, de pecíolo curto, o ápice é agudo ou obtuso e as margens
são regularmente serreadas. A superfície adaxial é rugosa e áspera, de cor verde muito
escuro ou acinzentado, enquanto a página abaxial é vilosa, mais clara, com um sistema
de venação reticulado bem aparente (figuras 11, 12 e 13, p. 57).
57
Figura 11: Lippia alba quimiotipo citral Figura 12: Lippia alba quimiotipo linalol
Ramo foliar Ramo foliar
Figura 13: Lippia alba quimiotipo carvona
Ramo foliar
4.1.2.2. Descrição microscópica
Em secção transversal da lâmina foliar observou-se externamente um tecido
epidérmico uniestratificado tanto do lado adaxial quanto do abaxial, com células de
paredes onduladas, grossas, revestidas por cutícula espessa. Podem ser observados
estômatos paracíticos, diacíticos, anomocíticos, e numerosos tricomas tectores
unicelulares, muito compridos, agudos, de paredes espessas e finamente granulosas,
58
mais largos na base e estreitando para o ápice. Junto a estes aparecem tricomas
glandulares captados, sésseis ou sub-sésseis, pequenos ou mais volumosos,
apresentando cabeça glandulosa unicelular ou pluricelular, neste último caso com duas,
três ou quatro células secretoras envolvidas por uma cutícula comum. O mesofilo
dorsiventral apresenta geralmente duas camadas de células paliçádicas e um parênquima
lacunoso com elementos arredondados. A nervura central possui um contorno
biconvexo e contém sobre a epiderme dos dois lados os mesmos tricomas descritos para
a região do mesofilo. Mais internamente situa-se um colênquima angular desenvolvido,
especialmente do lado adaxial. Segue-se uma região parenquimática com células
maiores, de paredes delgadas e que ao se aproximarem da região vascular diminuem de
tamanho. Os feixes vasculares, colaterais, dispõem-se em semicírculo na zona central da
nervura e um pouco acima aparecem quatro a cinco feixes menores (figuras 14, 15 e 16,
pp. 58 e 59).
Figura 14: Secção transversal da lâmina foliar de Lippia alba
Detalhe da região do mesofilo com tricomas tectores unicelulares (100X)
59
Figura 15: Secção transversal da lâmina foliar de Lippia alba
Detalhe da região da nervura central (100X)
Figura 16: Secção transversal da nervura central da folha de Lippia alba
Detalhe dos tricomas tectores e glandulares (400X)
4.1.2.3. Análise do material pulverizado
O material proveniente da folha seca pulverizada apresentou ao microscópio
fragmentos de tecido epidérmico contendo tricomas tectores unicelulares, compridos, de
paredes espessas e granulosas. Esporadicamente, notam-se tricomas glandulares
60
captados, unicelulares ou pluricelulares; fragmentos de tecido parenquimático com
células de paredes finas e vasos xilemáticos de paredes lignificadas (figura 17, p. 60).
Figura 17: Aspecto do material pulverizado da folha
de Lippia alba (400X)
61
4.1.3. Melissa officinalis
Figura 18: Melissa officinalis
Aspecto geral
4.1.3.1. Descrição macroscópica
As folhas da erva cidreira européia são opostas, pecioladas, ovais, arredondadas
ou cordiformes na base, crenado-serreadas nas margens, membranosas e de superfícies
pubescentes. A página superior, de cor verde mais escuro mostra diversas saliências,
muito características, que emprestam a esta face um aspecto ondulado. A página
inferior, de tonalidade mais clara, possui as nervuras secundárias salientes (figura 19, p.
62).
62
Figura 19: Melissa officinalis
Aspecto macroscópico das folhas
4.1.3.2. Descrição microscópica
Em secção transversal do limbo foliar observou-se uma epiderme nos lados
adaxial e abaxial com cutícula estriada, formada por um único estrato de células de
contorno poligonal e contendo estômatos diacíticos, mais raramente anisocíticos,
paracíticos e anomocíticos. Foram visualizados tricomas tectores unicelulares, curtos, de
paredes espessas, importantes para a diagnose do material vegetal seco. Encontraram-se
ainda tricomas tectores compridos, pluricelulares, unisseriados, caducos. Uns e outros
podem apresentar paredes estriadas. Os tricomas glandulares são sésseis ou de pedicelos
curtos, constituídos por uma porção glandulosa uni ou bicelular. São freqüentes também
aqueles que suportam uma grande glândula pluricelular envolvida por uma cutícula
comum, típico da família Lamiaceae. O mesofilo dorsiventral contém um único estrato
de tecido paliçádico enquanto o parênquima lacunoso mostra três a quatro estratos de
células, sem cristais de oxalato de cálcio. Encontraram-se nesta região inúmeros grãos
de amido, isolados ou agrupados. A nervura mediana apresenta contorno biconvexo,
plano-convexo ou até mesmo côncavo-convexo, sendo a convexidade mais acentuada
na face abaxial. A epiderme nas duas faces é semelhante à descrita para o mesofilo,
possuindo os mesmos anexos epidérmicos. Segue-se um colênquima angular e um
parênquima fundamental com células isodiamétricas e de conteúdo amiláceo. Na região
correspondente ao periciclo, observam-se células parenquimatosas de pequeno
63
diâmetro. Os feixes vasculares colaterais, no centro da nervura, apresentam-se dispostos
em arco aberto, com o floema contínuo ou exibindo um maciço de células e o xilema
em séries radiais de vasos separados por estreitos raios parenquimáticos, em geral com
uma série de células (figuras 20, 21 e 22, pp. 63 e 64).
Figura 20: Secção transversal da lâmina foliar de Melissa officinalis
Detalhe da região do mesofilo com tricomas tectores unicelulares e glandulares (400X)
Figura 21: Secção transversal da lâmina foliar de Melissa officinalis
Detalhe da região do mesofilo com tricoma tector unicelular (200X)
64
Figura 22: Secção transversal da lâmina foliar de Melissa officinalis
Detalhe da região do mesofilo e da nervura central (100X)
4.1.3.3. Análise do material pulverizado
As folhas secas pulverizadas observadas ao microscópio apresentam diversos
fragmentos de tecido epidérmico contendo principalmente tricomas tectores unicelulares
e tricomas glandulares, ambos já descritos. Fragmentos do mesofilo podem se
identificados, contendo uma camada paliçádica e restos de vasos xilemáticos de paredes
lignificadas (figura 23, p.65).
65
Figura 23: Aspecto do material pulverizado da folha
de Melissa officinalis (300X)
4.1.4. Diferenciação morfológica entre as três espécies de “ervas cidreiras”
As folhas da erva cidreira (M. officinalis) coletadas em Jacarepaguá mostraram
características macroscópicas bem distintas das outras duas e que quando inteiras em
produtos comerciais não deixaram dúvidas quanto a sua integridade. O mesmo pode ser
dito em relação ao aspecto anatômico da lâmina foliar, suficiente para dirimir qualquer
margem de dúvida quanto a possíveis falsificações. Assim, chamou atenção em 1º lugar
a consistência e o aspecto da face superior da folha de M. officinalis, macia ao tato, com
saliências na lâmina foliar, que fornecem um aspecto particular, ondulado a este lado.
Em L. alba esta superfície mostra-se rugosa e áspera, de cor verde mais escuro, algumas
vezes tendendo para uma tonalidade acinzentada. A margem é crenado-serreada na erva
cidreira européia; em L. alba regularmente serreada. Os pecíolos são geralmente
maiores em M. officinalis e a base do limbo, diferente de L. alba, freqüentemente
cordiforme. As folhas de C. citratus por serem compridas e apresentarem nervação
paralelinérvea (monocotiledônea) dispensam qualquer dificuldade no seu diagnóstico
66
diferencial. Anatomicamente a epiderme mostra-se semelhante nas duas espécies
estudadas de Dicotiledôneas, com paredes ondeadas, um pouco mais poligonais em M.
officinalis, uni-estratificadas e cutinizadas. A epiderme superior de C. citratus apresenta
várias células grandes, do tipo buliforme, o que a distingue das demais. Em relação aos
anexos epidérmicos, a análise do indumento piloso caracteriza-se como a melhor fonte
de informação na diagnose diferencial entre os três tipos de “erva cidreira”. Em M.
officinalis os tricomas tectores são predominantemente unicelulares, curtos, de paredes
espessas e estreitos no ápice. Tricomas longos, pluricelulares, unisseriados, são pouco
característicos em virtude de se fragmentarem ou mesmo se desprenderem do tecido
epidérmico durante o corte. As folhas de L. alba possuem tricomas tectores longos e
unicelulares, distintos portanto dos de M. officinalis. A epiderme de C. citratus
(principalmente a do lado abaxial) apresentou no máximo pequenas papilas (tricomas
silicosos, unicelulares, curtos, de paredes espessas). A região do mesofilo, embora seja
do tipo dorsiventral nas duas Dicotiledôneas estudadas, contém parênquima paliçádico
uniestratificado em M. officinalis e com duas camadas em L. alba, embora a literatura
indique (CORRÊA, 1992) ser possível para esta última a presença de apenas uma fileira
de células em plantas de regiões sombreadas. Esta característica não chega a ser
considerada uma anormalidade já que o número de camadas de células em paliçada
pode ser influenciado pelo meio ambiente. O mesofilo de C. citratus é pouco
diferenciado, como é comum em Monocotiledôneas, apresentando grandes células
arredondadas próximas a face adaxial (parênquima fundamental) e elementos menores
do lado abaxial constituindo um clorênquima na vizinhança dos feixes vasculares. As
células oleosas do mesofilo não diferem morfologicamente das outras células vizinhas,
exceto pelo seu conteúdo secretor. As paredes lignificadas funcionam como uma
barreira impermeabilizante para manter o citral e conseqüentemente o óleo essencial
que o contém, compartimentalizados (LEWINSOHN et al, 1998). O contorno da
nervura mediana em Lippia alba foi sempre biconvexo, observando-se um grande
conjunto de feixes ao centro, disposto em arco e quatro a cinco grupos menores situados
mais acima. Já em M. officinalis, nota-se apenas um único conjunto de feixes vasculares
em semi-círculo na região mediana da nervura. C. citratus, espécie de gramínea do tipo
C
4
, possui nervação paralela embora apresente ao centro da folha uma nervura mais
calibrosa que as demais. Os seus feixes vasculares estão envolvidos por uma bainha
67
especializada do tipo Kranz, de natureza parenquimática, e contêm abaixo da região
floemática um conjunto de fibras que os unem a epiderme abaxial. Os feixes de maiores
dimensões também apresentam uma bainha fibrosa do lado superior, características
estas que não são observadas nas duas outras ervas cidreiras estudadas.
4.1.5. Análise morfológica dos caules de L. alba e M. officinalis
O caule em estágio de desenvolvimento primário de Lippia alba, de contorno
quadrangular, apresentou em secção transversal uma epiderme uniestratificada, de
cutícula estriada e pubescente, com células de contorno aproximadamente poligonal. Os
tricomas tectores foram quase sempre unicelulares (raramente pluricelulares), na
maioria das vezes longos, agudos no ápice e de paredes espessadas. Os curtos, uni ou
bicelulares, foram pouco frequentes. Os tricomas glandulares observados foram sésseis
ou de pedicelo muito pequeno, suportando cabeça glandulosa uni ou pluricelular, neste
último caso geralmente bicelular, raramente apresentando quatro células. O colênquima
analisado foi do tipo angular, com 3 a 6 estratos de células de tamanhos e formas
variáveis. O parênquima cortical mostrou 2 a 4 camadas de células isodiamétricas, onde
puderam ser visualizados grãos de amido isolados ou agrupados e cristais de oxalato de
cálcio em forma de prismas. A região vascular apresentou feixes bicolaterais com um
floema externo de maior desenvolvimento, possuindo todos os seus elementos (tubos
crivosos, células companheiras e parênquima). O floema interno, pouco desenvolvido,
estava distribuído em pequenos grupos. O xilema apareceu em vários conjuntos
dispostos radialmente, separados por largas faixas de parênquima, cada feixe sendo
constituído geralmente por 1 a 4 elementos bem nítidos. Ao centro notou-se um
parênquima medular desenvolvido, de células poligonais contendo grãos de amido
isolados ou agrupados e raros cristais prismáticos de oxalato de cálcio(Figura 24, letra
A, p. 68). O caule em crescimento secundário, de contorno aproximadamente circular,
mostrou um súber pouco desenvolvido; parênquima cortical com células de formato e
dimensões variáveis contendo grupos de células pétreas, grãos de amido isolados ou
agrupados e grandes maciços de fibras de paredes muito espessas e lignificadas. Pode
ser observado um floema externo (mais desenvolvido) e outro interno (bem discreto),
68
com células crivosas, companheiras e parênquima. O câmbio vascular com 2 a 3
estratos de células tabulares delimitou externamente o xilema, o qual continha vasos de
paredes com perfuração areolada, dispostos em fileiras radiais que estavam separadas
por longas faixas de fibras e parênquima. A região central estava ocupada por
parênquima rico em grãos de amido (Figura 24, letras B-D, p. 68).
Figura 24: Fotomicrografias de secções transversais do caule de Lippia alba (A – D). A
– Visão geral do caule jovem com numerosos tricomas; B e C – Córtex e início da
região vascular do caule adulto; D – Final da região vascular do caule adulto com
xilema radial e parênquima medular (Valores em μm).
O caule em crescimento primário de Melissa officinalis, de contorno
quadrangular, em secção transversal apresentou epiderme uniestratificada com células
de contorno poligonal e cutícula estriada. Observou-se com frequência tricomas tectores
curtos, cônicos, unicelulares, de paredes espessas e superfície finamente granulosa.
Ocasionalmente apareceram tricomas longos, pluricelulares, com 3, 4 ou 5 células,
caducos. Os tricomas glandulares foram geralmente sésseis ou de pedicelo curto,
suportando cabeças glandulosas uni, bi, ou octocelulares, envolvidas por camada
A B
200
100
C D
100
100
69
cuticular. O colênquima foi do tipo angular, com maior espessamento nos ângulos do
caule. O parênquima cortical estava representado por células arredondadas de tamanhos
variáveis, com cerca de 4 a 5 estratos celulares, as quais apresentaram inclusões de
amido, e nas proximidades do feixe vascular, uma autêntica bainha amilífera. O floema
externo estava constituído de células crivosas, companheiras e parênquima, enquanto o
interno estava disposto em pequenos maciços separados por células de parênquima. O
xilema, nos feixes maiores, apresentou várias séries de 2 a 8 elementos vasculares de
meta e protoxilema arrumados em fileiras radiais, entre os quais estava situado o
parênquima radial. A região medular, muito desenvolvida, estava constituída de células
parenquimáticas, poligonais, de paredes finas, podendo conter grãos de amido, porém
sem a presença de cristais (Figura 25, letras E e F, p. 70). O caule em crescimento
secundário, de contorno quadrangular, apresentou um súber de células tabulares ou
contendo em seu lugar, em alguns cortes, uma epiderme uniestratificada de células
poligonais, revestida por uma cutícula espessa e estriada. O colênquima angular foi
bastante desenvolvido nos ângulos do caule, sendo seguido por um parênquima cortical
que mostrou às vezes pequenos espaços intercelulares. A região vascular estava
delimitada externamente por uma camada descontínua de fibras que protegia o floema
externo, muito desenvolvido. O floema interno apresentou-se em pequenos núcleos
discretos, separados por células parenquimáticas. Notou-se que a região cambial era
descontínua em alguns trechos. Os vasos xilemáticos estavam distribuídos em fileiras
radiais, separadas por fibras e parênquima. A medula, de células isodiamétricas, com
paredes espessas, continha grãos de amido (Figura 25, letras G e H, p. 70).
70
Figura 25: Fotomicrografias de secções transversais do caule de Melissa officinalis (E –
H). E – Visão geral do caule jovem; F – Saliência do caule jovem com tricomas; G –
Córtex e início da região vascular do caule adulto; H – Final da região vascular do caule
adulto com xilema radial e parênquima medular ( Valores em μm).
F
159
E
159
100
HG
159
71
4.2. Aspectos Químicos
4.2.1. Perfis químicos dos óleos essenciais das principais ervas cidreiras no Brasil
Na primeira etapa do trabalho foram comparadas às ervas cidreiras mais
utilizadas no território brasileiro: os três quimiotipos (linalol, citral e carvona) de Lippia
alba (erva cidreira brasileira) e Cymbopogon citratus (capim limão). Duas coletas foram
realizadas com espaço de 6 meses (março e setembro) para extração dos óleos
essenciais. Os primeiros ensaios realizados com os óleos da primeira coleta consistiram
na determinação das propriedades físico-químicas, seguido das análises cromatográficas
(nas duas coletas), visando o estabelecimento de parâmetros de diferenciação das
espécies existentes nos nossos canteiros, localizados no Laboratório de Produção de
Biomassa e de Matéria-Prima Vegetal de Farmanguinhos, em Jacarepaguá (Rio de
Janeiro).
4.2.1.1. Lippia alba
As folhas dessa espécie apresentam em geral, odor de limão, porém isso pode
variar de acordo com o quimiotipo infraespecífico. Até o momento existem relatos de
pelo menos dezesseis quimiotipos (ver introdução, p. 17). O aroma do quimiotipo é
utilizado como uma primeira diferenciação. Por exemplo, o do tipo citral-limoneno
apresenta odor forte de limão, enquanto o quimiotipo citral-mirceno apresenta um odor
de limão mais suave. O quimiotipo carvona-limoneno apresenta um odor forte,
adocicado, mas que ainda “lembra” o aroma de limão, diferentemente daquele
observado para o quimiotipo linalol (com odor de rosas). Esses parâmetros foram
observados nos quimiotipos estudados nesse trabalho, sendo que foi fácil diferenciar o
que continha carvona devido o odor característico desse terpeno.
72
Na tabela 2 constam os valores de rotação ótica determinados para os óleos dos
diferentes quimiotipos de Lippia alba.
Óleo essencial de L. alba
quimiotipo
[α]
D
(20°C)
óleo puro
Índice de refração
(20°C)
Lit.
Carvona 0,080 1,46168 N.E.
Citral 0,392 1,48657 N.E.
Linalol 0,351 1,48778 0,126 a 0,710
Tabela 2: Determinação da rotação óptica e índice de refração dos óleos essenciais das
folhas de L. alba
N.E. = não encontrado
Os dados obtidos acima estão de acordo com aqueles do quimiotipo linalol
coletado anteriormente no Rio de Janeiro (SIANI et al., 2002), enquanto para os demais
não foram encontrados valores de referência na literatura. Os constituintes em maior
proporção relativa definiram o nome do grupo dos quimiotipos coletados e a análise dos
cromatogramas obtidos por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
(CG-EM) dos óleos essenciais de L. alba possibilitou a classificação apresentada como:
Carvona, Citral e Linalol.
A maior ou menor quantidade de substâncias identificadas em uma amostra está
ligada principalmente à extração do óleo, apesar de existirem outras variáveis. Nossa
aparelhagem levou a obtenção das substâncias que são normalmente as principais
encontradas nos óleos comerciais e naqueles descritos nos trabalhos da literatura
(VALE et al., 1999).
As análises cromatográficas dos óleos essenciais do quimiotipo carvona
apresentaram a predominância de limoneno (t
R
= 6,819 min , 12,75%) e carvona (t
R
=
12,655 min, 70,10%) na primeira coleta e limoneno (t
R
= 6,826 min 16,84%) e carvona
(t
R
= 12,655 min 75,77%) na segunda, mantendo assim praticamente a mesma
proporção entre os principais constituintes nas duas coletas (Figuras 26 e 27, pp. 73 e
74).
73
Figura 26: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Lippia alba
quimiotipo carvona (1
a
coleta).
74
Figura 27: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Lippia alba
quimiotipo carvona. (2
a
coleta)
75
Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de
Lippia alba
(quimiotipo carvona)
12,75
16,84
70,10
75,77
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
1ª 2ª
COLETA
%
Limoneno
Carvona
Figura 28: Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia alba
(quimiotipo carvona).
No quimiotipo citral, foram encontrados na primeira coleta o
β
-mirceno (t
R
=
5,852 min, 8,07%) , neral (t
R
= 12,506 min, 26,66%) e geranial (t
R
= 13,330 min,
31,23%) e na segunda as mesmas substancias majoritárias nas concentrações de 22,31%
(t
R
= 5,859 min,), 20,14% (t
R
= 12,506 min) e 22,58% (t
R
= 13,331 min),
respectivamente (Figuras 29 e 30, pp. 76e 77).
76
Figura 29: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Lippia alba
quimiotipo citral (1
a
coleta)
77
Figura 30: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Lippia alba
quimiotipo citral (2
a
coleta)
78
Neste caso, apesar de serem encontradas as mesmas substâncias majoritárias
para as duas coletas, foi observado um aumento substancial no teor de mirceno (quase 3
vezes o valor encontrado na primeira coleta. Como os indivíduos de todos os
experimentos estavam em floração na época das coletas, a única diferença observada foi
um maior ataque de herbívoros a esse quimiotipo, quando comparado a coleta anterior,
o que poderia ter influenciado a biossíntese desses monoterpenos para uma maior defesa
da planta, conforme relatos existentes na literatura (GARLET; et al., 2007)
Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de
Lippia alba
(quimiotipo citral)
8,07
22,31
26,65
20,14
31,23
22,57
8,53
4,44
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
12
COLETA
%
β-Mirceno
Neral
Geranial
Trans-Cariofileno
Figura 31: Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia alba
(quimiotipo citral).
No quimiotipo linalol foi encontrado na primeira coleta 1,8-cineol (t
R
= 7,106
min, 4,18%), l-linalol (t
R
= 8,814 min, 60,56%) e trans-cariofileno (t
R
= 18,364 min,
10,43%) e na segunda 3,70% (t
R
= 6,911 min), 81,69% (t
R
= 8,696 min) e 3,32% (t
R
=
17,368 min,) respectivamente. Esses dados estão de acordo com a relação de
substâncias majoritárias apresentada para esse quimiotipo na literatura (TAVARES et
al., 2005)) e a variação dos teores entre as coletas foi significativa em relação ao linalol,
que teve um aumento considerável, e ao trans-cariofileno, cujo teor foi reduzido para a
terça parte, aproximadamente do que foi encontrado na 1ª coleta. A maior quantidade de
flores presentes na primavera (2ª coleta) pode ter influenciado o aumento no teor de
linalol, a fim de estimular, pelo seu forte aroma, uma maior freqüência dos
polinizadores da espécie, embora ocorresse floração (em menor grau) no período da 1ª
coleta.
79
Figura 32: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Lippia alba
quimiotipo linalol (1
a
coleta)
80
Figura 33: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Lippia alba
quimiotipo linalol (2
a
coleta)
81
Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de
Lippia alba
(quimiotipo Linalol)
4,18
3,70
60,56
81,69
10,43
3,32
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
1ª 2ª
COLETA
%
1,8 Cineol
L-Linalol
Trans-Cariofileno
Figura 34: Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia alba
(quimiotipo linalol).
4.2.1.2. Cymbopogon citratus
Esta gramínea possui um óleo essencial conhecido internacionalmente como
“lemongrass” (0,2 a 0,6 % em média). O óleo possui uma coloração levemente
amarelada com forte odor de limão, cuja qualidade geralmente é determinada pelo seu
conteúdo de aldeídos (especialmente o citral), em torno de 69 a 85 % em média (FURIA
e BELLANCA, 1971).
Na tabela 3 constam os valores de rotação óptica e do índice de refração
determinados para o seu óleo coletado em nossos canteiros experimentais de
Jacarepaguá e a comparação com os valores encontrados na literatura.
Tabela 3: Determinação do índice de refração e da rotação óptica do óleo essencial das
folhas de C. citratus e comparação com os dados encontrados na literatura (FURIA e
BELLANCA 1971)
Análise Amostra C. citratus (Lit.)
índice de refração a 20
0
C 1,48577 1,483 - 1,4890
rotação óptica a 20
0
C - 3,0260 - 3
0
a + 1
0
No comércio são conhecidos dois tipos de óleo para esta gramínea: o “East
Indian” e o “West Indian”, que diferenciam-se basicamente pelo teor de substâncias
terpênicas presentes, em particular o mirceno. O tipo “West Indian” produzido em larga
82
escala no Brasil, Guatemala, Haiti, Madagascar e Indochina, entre outros, apresenta
menor solubilidade em álcool, contendo maior concentração de mirceno. O tipo “East
Indian”, identificado como proveniente de Cymbopogon flexuosus (Ness et Steud) W.
Wats. encontrado principalmente em Singapura, Sri Lanka, Camboja e Índia, apresenta
maior solubilidade em álcool e escassas quantidades de mirceno ou mesmo ausência
deste constituinte. Essas informações devem ser atreladas a outras variáveis como a
volatilidade do mirceno e a correta identificação botânica, para que não aconteça falha
na atribuição da espécie botânica. Nos dados obtidos nesse trabalho, nas duas coletas,
não se conseguiu encontrar o mirceno, entretanto a espécie foi identificada
botanicamente e em outras análises oriundas desse indivíduo foi verificada a presença
deste monoterpeno. Deve-se destacar que durante os experimentos a touceira foi
totalmente atacada pelo fungo Curvularia andropogonis (MONTEIRO e BARRETO,
2002), tornando as folhas avermelhadas, as quais algum tempo depois caíram. Ambas as
amostras do óleo de C. citratus foram obtidas na mesma época dos outros óleos
relatados aqui e extraídas com a mesma aparelhagem e durante o mesmo tempo. As
amostras posteriormente tiveram igual tratamento e modo de preparo. A coleta foi
realizada no período da manhã e as duas foram realizadas após uma semana de tempo
estável. A primeira coleta forneceu o neral (t
R
= 12,506 min, 43,41%), geranial (t
R
=
13,338 min, 46,88%) e trans-cariofileno (t
R
= 17,368 min, 2,75%) e na segunda as
mesmas substancias majoritárias nas proporções de 43,17% (t
R
= 12,506 min,), 49,06%
(t
R
= 13,330 min) e 1,78% (t
R
= 17,361 min), respectivamente (Figuras 35 e 36, pp.83 e
84), denotando uma certa estabilidade na composição química do seu óleo.
83
Figura 35: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Cymbopogon
citratus (1
a
coleta)
84
Figura 36: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Cymbopogon
citratus (2
a
coleta)
85
Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de
Cymbopogon citratus
43,41
43,17
46,88
49,06
2,75
1,79
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
12
COLETA
%
Neral
Geranial
Tran-Cariofileno
Figura 37: Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de Cymbopogon
citratus.
4.2.1.3. Melissa officinalis
Os exemplares de M. officinalis oriundos do nosso cultivo não apresentaram
rendimento de óleo suficiente para realização do índice de refração e rotação óptica. A
literatura descreve rendimento de óleo para essa espécie de 0,1 a 0,3% (ref). As análises
cromatográficas foram realizadas para as duas coletas e as condições estão descritas na
parte experimental. O perfil cromatográfico da primeira coleta apresentou como
constituintes majoritários neral (t
R
= 21,520 min, 35,41%), geranial (t
R
= 22,633 min,
53,28%) e acetato de geranila (t
R
= 26,482 min, 2,41%) e na segunda os majoritários
apareceram nas proporções de 35,95% (t
R
= 21,520 min,), 54,44% (t
R
= 22,640 min) e
0,42% (t
R
= 26,482 min), respectivamente (Figuras 38 e 39, pp. 86e 87). Os resultados
condizem com os relatos existentes para Melissa officinalis cultivada na Europa, no que
se refere aos constituintes majoritários.
86
Figura 38: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Melissa
oficinallis (1
a
coleta).
87
Figura 39: Cromatograma de íons totais e tabela do óleo essencial de Melissa
oficinallis (2
a
coleta)
88
Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de
Melissa oficinallis
35,41
35,95
53,28
54,44
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
1ª 2ª
COLETA
%
Neral
Geranial
Figura 40: Teor dos constituintes majoritários do óleo essencial de Melissa officinalis.
Os resultados obtidos no estudo dos perfis cromatográficos dos respectivos
óleos essenciais das ervas cidreiras estudadas neste trabalho demonstraram ser possível
a diferenciação química entre eles. O óleo de C. citratus continha como constituintes
majoritários o geranial e o neral (denominados em conjunto como citral) cujos teores
variaram, respectivamente, de 46,88% a 49,06% e 43,41% a 43,17%, ao longo das duas
coletas. No quimiotipo citral de L. alba, os monoterpenóides geranial e neral também
foram as substâncias predominantes, entretanto os teores de geranial variaram de
31,23% a 22,58% e os de neral em 26,66% a 20,14%; consequentemente em
quantidades inferiores às encontradas em C. citratus nas duas coletas realizadas.
Adicionalmente, os teores de trans-cariofileno em C. citratus foram inferiores aos
encontrados no quimiotipo citral de L. alba. O óleo de M. officinalis apresentou também
a mistura de geranial e neral como predominante, com os teores do 1º constituinte
variando nas duas coletas entre 53,28% e 54,44% (valores mais próximos aos
encontrados no óleo de C. citratus para este isômero) e os de neral entre 35,41% e
35,95%, inferiores aos do óleo de capim limão (tabela 4, p. 89).
Os dois outros quimiotipos de L. alba possuem óleos essenciais cujos
constituintes majoritários (linalol e carvona, separadamente) permitem as suas
identificações inequívocas.
89
Espécie vegetal
geranial neral
1º coleta 2º coleta 1º coleta 2º coleta
C. citratus
46,88% 49,06% 43,41% 43,17%
L. alba (quimiotipo citral) 31,23% 22,58% 26,66% 20,14%
M. officinalis
53,28% 54,44% 35,41% 35,95%
Tabela 4: teores de geranial e neral ao longo de duas coletas em C. citratus, L. alba
(quimiotipo citral) e M. officinalis
4.2.2. Perfis cromatográficos dos extratos polares das principais ervas cidreiras no
Brasil
Serão descritos aqui os perfis cromatográficos dos extratos polares (decocção,
infusão e maceração em etanol a 70%) relativos às substâncias fenólicas (flavonóides e
fenilpropanóides) obtidos das folhas frescas e secas das principais ervas cidreiras
consumidas pela população brasileira em substituição à espécie Melissa officinalis.
Os produtos comerciais contendo derivados destas ervas cidreiras podem ser
facilmente identificados se em seus conteúdos existirem quantidades detectáveis dos
principais componentes voláteis e de alguns outros marcadores desta fração,
nomeadamente o citral, o linalol, a carvona, o citronelal, o limoneno e o mirceno. Não
obstante, se no preparo da matéria-prima o procedimento de secagem for muito intenso
ou o tempo de estocagem for demasiadamente longo estas substâncias voláteis podem
não estar mais presentes, sendo então necessário a procura de componentes mais
polares, que na maioria das vezes são também hidrossolúveis. Nas ervas cidreiras
mencionadas neste estudo (C. citratus e L. alba) tais constituintes são
predominantemente fenólicos e açúcares . Entre os fenólicos se destacam dois grupos de
substâncias que são responsabilizados em parte pelas atividades terapêuticas dos seus
preparados aquosos: os derivados flavonoídicos e aqueles com um radical
fenilpropanóide. Estes derivados podem representar excelentes marcadores químicos em
uma análise de perfil cromatográfico dos extratos polares por CLAE-DAD, uma vez que
pode-se rapidamente identificar a presença de cada um pelas respectivas absorções na
região do ultravioleta do espectro eletromagnético dos sinais do cromatograma que os
representam. Assim, é característico para os derivados flavonóides, absorções entre 240
90
e 285 nm (banda II), referentes ao sistema benzoíla, enquanto absorções entre 300 e 400
nm (banda I) são relativas à metade cinamoíla da molécula. As substâncias que possuem
o radical fenilpropanóide apresentam uma forte absorção entre 320 e 350 nm e outra
menos intensa, unida a primeira na forma de um “ombro”, por volta de 280 nm, que
caracterizam o anel aromático com uma extensão contendo uma dupla ligação
conjugada.
Spectrum at tim e 26.19 m in.
nm
300 400 500
mAU
0
100
200
300
mAU
0
100
200
300
26.19 m in
Lam bda m ax : 202 193 346 270 430
Lam bda m in : 194 250 300 429 433
S p ectru m at tim e 19.97 m in .
nm
300 400 500
mAU
0
50
100
mAU
0
50
100
19.97 min
Lam bda m ax : 324 217 199 231 192
Lam bda m in : 206 230 194 262 401
Espectro UV padrão de um flavonóide Espectro UV padrão de um fenilpropanóide
Desta forma foram desenvolvidos perfis cromatográficos de todos os extratos
pela técnica mencionada, visando a caracterização inequívoca destes constituintes.
4.2.2.1. Cymbopogon citratus (capim cidreira, capim limão)
Foram feitas duas coletas de folhas cultivadas em canteiros experimentais
do Laboratório de Produção de Biomassa e de Matéria-Prima Vegetal (LPBMPV) de
Farmanguinhos (FIOCRUZ), localizado em Jacarepaguá (RJ).
3.2.2.1.1. Primeira coleta (folhas frescas e secas)
Datada da coleta: 23/01/2002
Extratos Peso de
Folha
Fresca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 25 0,3799 1,52
Infuso 25 0,1954 0,78
Macerado em álcool (70%) 25 0,5785 2,31
Tabela 5: Primeira Coleta/Folha Fresca (C. citratus)
91
Extratos Peso de
Folha
Seca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 25 1,3146 5,26
Infuso 25 1,1588 4,64
Macerado em álcool (70%) 25 2,1134 8,45
Tabela 6: Primeira Coleta/Folha Seca (C. citratus)
Na 1ª coleta de folhas, realizada no mês de janeiro (planta não-florida), o teor de
flavonóides (em área% total) dentro do decocto das folhas frescas alcançou o pequeno
valor de 3,48%, enquanto o de fenilpropanóides ficou em 29,99%. No infuso das folhas
frescas os valores tenderam para um maior equilíbrio (11,28% para os primeiros e
12,84% para os últimos), indicando que neste extrato, obtido por um método menos
agressivo (temperatura mais baixa), o rendimento extrativo total foi um pouco menor,
porém com maior preservação das substâncias flavonoídicas. O macerado em etanol a
70% das folhas frescas apresentou um teor de flavonóides (17,20%) superior ao do
infuso, sugerindo uma menor degradação destes constituintes em virtude do não-
aquecimento do meio durante o processo de extração. Por outro lado, o sistema de
solventes empregado aqui não mostrou ser adequado na dissolução das substâncias
contendo o radical fenilpropanóide (2,65%).
Após a secagem das folhas, os mesmos extratos obtidos revelaram que ocorreu
um maior poder de penetração dos respectivos solventes na matéria-prima desidratada.
O decocto continha 14,14% de flavonóides e 32,64% de fenilpropanóides. O infuso
mostrou um teor de fenilpropanóides muito alto (67,68%) e apenas 7,88% de
flavonóides, sugerindo que, embora possam estar mais preservados nos infusos, a
secagem prévia da matéria-prima pode de alguma forma ter contribuído para a
degradação destes constituintes. O macerado apresentou um teor mais baixo de
flavonóides (8,51%) em relação ao resultado obtido com as folhas frescas, porém
superior (13,29%) em fenilpropanóides.
92
4.2.2.1.2. Segunda Coleta (folhas frescas e secas)
Data da coleta: 24/06/2002
Extratos Peso de
Folha
Fresca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 25 0,5983 2,39
Infuso 25 0,4060 1,62
Macerato em álcool (70%) 25 1,16 4,64
Tabela 7: Segunda Coleta/Folha Fresca (C. citratus)
Extratos Peso de
Folha
Seca (g)
Peso do
Extrato
(g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 25 1,0507 4,20
Infuso 25 1,1297 4,52
Macerado em álcool (70%) 25 1,0991 4,40
Tabela 8: Segunda Coleta/Folha Seca (C. citratus)
A segunda coleta de folhas realizada no mês de junho, com a planta não-florida,
foi submetida aos mesmos processos extrativos. O decocto das folhas frescas mostrou
um teor de flavonóides (20,87%) bem superior ao encontrado no decocto da 1ª coleta.
Os fenilpropanóides tiveram apenas uma pequena variação (26,28%) em relação à 1ª
coleta. Possivelmente na estação do inverno (época desta 2ª coleta) a planta necessite no
seu metabolismo secundário, talvez devido ao estresse térmico, de uma maior
quantidade de substâncias flavonóides. No infuso das folhas frescas o teor de
flavonóides se manteve estável em relação ao obtido no decocto, porém superior ao
encontrado no infuso da 1ª coleta. No macerado das folhas frescas o teor de flavonóides
(29,87%) foi superior ao do infuso, entretanto o de fenilpropanóides reduziu-se para
5,28%, proporção esta já verificada aproximadamente no macerado da 1ª coleta.
Nos extratos das folhas secas, o decocto continha 16,09% de flavonóides
(mantendo-se desta forma razoavelmente estável em relação ao teor da 1ª coleta), porém
reduziu drasticamente o teor de fenilpropanóides (2,58%). No infuso, ocorreu um
pequeno aumento do conteúdo flavonoídico (10,36%), comparando-se as duas coletas,
porém observou-se uma redução considerável no teor de fenilpropanóides (22,19%). O
macerado das folhas secas mostrou-se enriquecido em flavonóides (52,44%) e não
apresentou qualquer sinal significativo da presença de fenilpropanóides.
93
1ª coleta 2ª coleta
FL FP FL FP
Decocção
3,48 FF
14,14 FS
29,99 FF
32,64 FS
20,87 FF
16,09 FS
26,28 FF
2,58 FS
Infusão
11,28 FF
7,88 FS
12,84 FF
67,68 FS
20,36 FF
10,36 FS
9,45 FF
22,19 FS
Maceração em etanol
17,20 FF
8,51 FS
2,65 FF
13,29 FS
29,87 FF
52,44 FS
5,28 FF
0,00 FS
Tabela 9: Correlações dos teores em área% total para flavonóides e fenilpropanóides
obtidos pelos métodos extrativos selecionados, de acordo com os perfis cromatográficos
estabelecidos para a 1ª e 2ª coletas de Cymbopogon citratus. FL (flavonóide), FP
(fenilpropanóide), FF (folhas frescas), FS (folhas secas).
94
Teor de flavonóides em folhas frescas de
Cymbopogon citratus
3,48
20,87
11,28
20,36
17,20
29,87
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
1ª 2ª
COLETA
%
DECOÇCÃO
INFUSÃO
MACERAÇÃO
(ETOH/H2O 70%)
Figura 41: Teor de flavonóides em folhas frescas de Cymbopogon citratus.
Teor de fenilpropanóides em folhas frescas de
Cymbopogon citratus
29,99
26,28
12,84
9,45
2,65
5,28
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
1ª 2ª
COLETA
%
DECOÇCÃO
INFUSÃO
MACERAÇÃO
(ETOH/H2O 70%)
Figura 42: Teor de fenilpropanóides em folhas frescas de Cymbopogon citratus.
95
Teor de flavonóides em folhas secas de
Cymbopogon citratus
14,14
16,09
7,88
10,36
8,51
52,44
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
1ª 2ª
COLETA
%
DECOÇCÃO
INFUSÃO
MACERAÇÃO
(ETOH/H2O 70%)
Figura 43: Teor de flavonóides em folhas secas de Cymbopogon citratus.
Teor de fenilpropanóides em folhas secas de
Cymbopogon citratus
32,64
2,58
67,68
22,19
13,29
0,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
1ª 2ª
COLETA
%
DECOÇCÃO
INFUSÃO
MACERAÇÃO
(ETOH/H2O 70%)
Figura 44: Teor de fenilpropanóides em folhas secas de Cymbopogon citratus.
96
4.2.2.2. Lippia alba (erva cidreira brasileira)
4.2.2.2.1. Quimiotipo linalol
Foram feitas quatro coletas de folhas do cultivo estabelecido em canteiros
experimentais do Laboratório de Produção de Biomassa e de Matéria-Prima Vegetal
(LPBMPV) de Farmanguinhos (FIOCRUZ) localizado em Jacarepaguá (RJ).
4.2.2.2.1.1. Primeira coleta (folhas frescas e secas)
Data da Coleta: 06/02/2001
Extratos Peso de
Folha
Fresca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 50 3,8776 7,76
Infuso 50 2,9744 5,95
Macerado em álcool (70%) 50 2,4368 4,87
Tabela 10: Primeira Coleta/Folha Fresca (L. alba quimiotipo linalol)
Extratos Peso de
Folha
Seca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 50 3,3529 6,71
Infuso 50 2,4053 4,81
Macerado em álcool (70%) 50 6,1212 12,24
Tabela 11: Primeira Coleta/Folha Seca (L. alba quimiotipo linalol)
Na 1ª coleta de folhas, realizada na metade da estação do verão (planta em
floração), o teor de flavonóides em área% total ficou abaixo da metade (25,30%) do
valor encontrado para o grupo de derivados fenilpropanóides (69,30%) em relação ao
decocto das folhas frescas. Esta diferença se acentuou ainda mais no caso do infuso,
onde o valor encontrado para os flavonóides regrediu para 21,01% contra 79,00% de
fenilpropanóides, indicando que os extratos aquosos obtidos deste quimiotipo podem
97
variar o conteúdo destes fenólicos em função do método extrativo. Por outro lado, no
macerado das folhas em etanol a 70%, ocorreu uma inversão dos resultados, com
72,26% de flavonóides e apenas 13,08% de fenilpropanóides. Neste caso o sistema de
solventes empregado mostrou-ser um melhor dissolvente para o primeiro grupo de
fenólicos. Os extratos obtidos com as folhas secas apresentaram um padrão de resultado
diferente daquele das folhas frescas. O decocto, em área% total, mostrou valores mais
equilibrados para estes grupos de substâncias: 46,59% de flavonóides e 45,25% de
fenilpropanóides. O infuso apresentou basicamente o mesmo resultado em flavonóides
(47,90%), porém não acusou qualquer sinal de ultravioleta que designasse com
segurança a presença de derivados fenilpropanóides. O macerado em etanol a 70%
continuou mostrando possuir um sistema que facilita uma maior dissolução de
flavonóides (54,40%) em relação ao grupo de fenilpropanóides (29,40%).
4.2.2.2.1.2. Segunda coleta (folhas frescas e secas)
Data da Coleta: 28/06/2001
Extratos Peso de
Folha
Fresca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 20 0,4237 2,12
Infuso 20 0,6178 3,09
Macerado em álcool (70%) 20 0,6197 3,10
Tabela 12: Segunda Coleta/Folha Fresca (L. alba quimiotipo linalol)
Extratos Peso de
Folha
Seca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 4 0,3145 7,86
Infuso 4 0,2569 6,42
Macerado em álcool (70%) 4 0,2857 7,14
Tabela 13: Segunda Coleta/Folha Seca (L. alba quimiotipo linalol)
Na segunda coleta realizada na metade da estação do inverno, com a planta
contendo flores, verificou-se para o decocto das folhas frescas uma proporção relativa
98
semelhante à descrita para a primeira coleta, já que o teor em área% total de flavonóides
ficou em 26,65% e para os fenilpropanóides 68,58%. O percentual de flavonóides
aumentou para 34,27% no infuso, diminuindo o de fenilpropanóides (49,00%),
entretanto estes valores tenderam mais ao equilíbrio quando comparados aos do infuso
da primeira coleta. O macerado em etanol a 70% apresentou, como esperado, um alto
valor em flavonóides (85,54%) e, ao contrário, não indicou a existência consistente de
sinais para os derivados fenilpropanóides. Os extratos das folhas secas apresentaram os
seguintes resultados: 39,04% de flavonóides e 56,96% de fenilpropanóides para o
decocto, fugindo um pouco do equilíbrio de valores obtidos para o decocto na primeira
coleta; 46,67% de flavonóides e 53,33% de fenilpropanóides para o infuso, onde
manteve-se a estabilidade dos valores em área% total do primeiro grupo em relação a
primeira coleta, porém acusou um resultado expressivo em fenilpropanóides quando
comparado ao infuso das folhas secas da primeira coleta. O macerado em etanol a 70%
mostrou 32,69% de flavonóides e 56,45% de fenilpropanóides, invertendo a proporção
encontrada no macerado das folhas secas da primeira coleta.
4.2.2.2.1.3. Terceira coleta (folhas frescas e secas)
Data da Coleta: 10/10/2001
Extratos Peso de
Folha
Fresca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 15 0,8082 5,39
Infuso 15 0,4234 2,82
Macerado em álcool (70%) 15 0,7528 5,02
Tabela 14: Terceira Coleta/Folha Fresca (L. alba quimiotipo linalol)
Extratos Peso de
Folha
Seca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 5 0,4045 8,09
Infuso 5 0,7706 15,41
Macerado em álcool (70%) 5 0,4015 8,03
Tabela 15: Terceira Coleta/Folha Seca (L. alba quimiotipo linalol)
99
A terceira coleta realizada no mês de outubro, na estação da primavera (planta
florida), mostrou os extratos das folhas frescas compatíveis com os da primeira e
segunda coletas, embora com evidentes variações entre os teores. Os valores atribuídos
para o decocto consistiram em 27,33% para os flavonóides e 68,87 para os
fenilpropanóides. O infuso apresentou valores de 32,28% e 66,65%, respectivamente;
enquanto o macerado em etanol a 70% revelou valores de 76,21% de flavonóides e
apenas 1,01% em fenilpropanóides. Nos extratos das folhas secas, o decocto apresentou
mais que o dobro de fenilpropanóides, diferente do observado na primeira e segunda
coletas. O infuso mostrou 35,64% de flavonóides e 58,36% de fenilpropanóides,
resultado muito diferente da primeira coleta , que não mostrou no infuso a presença de
fenilpropanóides, porém foi mais condizente com os resultados do infuso da segunda
coleta. No macerado em etanol a 70% o teor de flavonóides foi de 32,60 de flavonóides
e de 56,45% de fenilpropanóides, resultado oposto ao observado na primeira coleta,
porém próximo ao da segunda coleta.
4.2.2.2.1.4. Quarta coleta (folhas frescas e secas)
Data da coleta: 25/04/2002
Extratos Peso de
Folha
Fresca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 25 1,2613 5,04
Infuso 25 0,9374 3,75
Macerado em álcool (70%) 25 1,5491 6,20
Tabela 16: Quarta Coleta/Folha Fresca (L. alba quimiotipo linalol)
Extratos Peso de
Folha
Seca (g)
Peso do
Extrato (g)
Rendimento
Bruto (%)
Decocto 8 0,3946 4,93
Infuso 8 0,4395 5,49
Macerado em álcool (70%) 16 1,5144 9,46
Tabela 17: Quarta Coleta/Folha Seca (L. alba quimiotipo linalol)
100
A quarta coleta realizada no mês de abril do ano seguinte, na estação do outono
(planta florida), apresentou para os extratos das folhas frescas um decocto enriquecido
em flavonóides (76,10%), enquanto a área% total encontrada para os derivados
fenilpropanóides ficou em 21,76%. O resultado mostra a grande variabilidade existente
entre estes fenólicos no quimiotipo linalol de L. alba, sugerindo que a planta ao longo
do ano utiliza estas substâncias nas suas etapas metabólicas em diferentes intensidades e
um “chá” obtido por este processo extrativo conterá evidentemente um teor variado
destes fenólicos em função do período de coleta da matéria-prima. O infuso confirmou o
enriquecimento dos derivados flavonoídicos em abril (ao contrário da 1ª, 2ª e 3ª
coletas), com um valor de 60,61% para os flavonóides e apenas 24,53% de
fenilpropanóides. O macerado em etanol a 70% não apresentou sinais para os derivados
fenilpropanóides, enquanto o teor de flavonóides alcançou 54,67%. Os extratos das
folhas secas foram todos enriquecidos nos seus conteúdos em flavonóides, apresentando
valores de 64,42% na decocção, 84,00% na infusão e 88,49% na maceração em etanol a
70%.
A tabela abaixo sumariza melhor estes resultados:
1ª coleta 2ª coleta 3ª coleta 4ª coleta
FL FP FL FP FL FP FL FP
Decocção
25,30 FF
46,59 FS
69,30 FF
45,25 FS
26,65 FF
39,04 FS
68,58 FF
56,96 FS
27,33 FF
30,62 FS
68,87 FF
67,04 FS
76,10 FF
64,42 FS
21,76FF
26,04 FS
Infusão
21,01 FF
47,90 FS
79,00 FF
0,00 FS
34,27 FF
46,67 FS
49,00 FF
53,33 FS
32,28 FF
35,64 FS
66,65 FF
58,36 FS
60,61 FF
84,00 FS
24,53 FF
17,89 FS
Maceração
em etanol
72,26 FF
54,40 FS
13,08 FF
29,40 FS
85,54 FF
32,69 FS
0,00 FF
56,45 FS
76,21 FF
24,82 FS
1,01 FF
63,49 FS
54,67 FF
88,49 FS
0,00 FF
0,00 FS
Tabela 18: Correlações dos teores em área% total para flavonóides e fenilpropanóides
obtidos pelos métodos extrativos selecionados, de acordo com os perfis cromatográficos
estabelecidos para a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª coletas do quimiotipo linalol de Lippia alba. FL
(flavonóide), FP (fenilpropanóide), FF (folhas frescas), FS (folhas secas).
101
Teor de flavonóides em folhas frescas de
Lippia alba
25,30
26,65
27,33
76,10
21,01
34,27
32,28
60,61
72,26
85,54
54,67
76,21
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
1ª 2ª 3ª 4ª
COLETA
%
DECOÇCÃO
INFUSÃO
MACERAÇÃO
(ETOH/H2O 70%)
Figura 45: Teor de flavonóides em folhas frescas de Lippia alba (quimiotipo linalol).
Teor de fenilpropanóides em folhas frescas de
Lippia alba
69,30
68,58 68,87
21,76
79,00
49,00
66,65
24,53
13,08
0,00 0
1,01
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
1ª 2ª 3ª 4ª
COLETA
%
DECOÇCÃO
INFUSÃO
MACERAÇÃO
(ETOH/H2O 70%)
Figura 46: Teor de fenilpropanóides em folhas frescas de Lippia alba (quimiotipo
linalol).
102
Teor de flavonóides em folhas secas de
Lippia alba
46,59
39,04
30,62
64,42
47,90
46,67
35,64
84,00
54,40
32,69
88,49
24,82
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1ª 2ª 3ª 4ª
COLETA
%
DECOÇCÃO
INFUSÃO
MACERAÇÃO
(ETOH/H2O 70%)
Figura 47: Teor de flavonóides em folhas secas de Lippia alba (quimiotipo linalol).
Teor de fenilpropanóides em folhas secas de
Lippia alba
45,25
56,69
67,04
26,04
0,00
53,33
58,36
17,89
29,40
56,45
0,00
63,49
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
1ª 2ª 3ª 4ª
COLETA
%
DECOÇCÃO
INFUSÃO
MACERAÇÃO
(ETOH/H2O 70%)
Figura 48: Teor de fenilpropanóides em folhas secas de Lippia alba (quimiotipo
linalol).
Analisando-se a tabela 18 (p. 100) nota-se que o teor de flavonóides sofreu uma
variação nos seus teores ao logo do ano, em um intervalo de quatro meses entre as
coletas. A última coleta feita após seis meses à 3ª apresentou um aumento substancial
destes constituintes, sugerindo uma possível resposta das plantas ao procedimento de
retirada das folhas durante o período de estudo, uma vez que é conhecida a ação de
flavonóides como substâncias de defesa para o organismo vegetal.
103
4.2.2.3. Cromatogramas por CLAE dos extratos polares de C. citratus e L. alba
(quimiotipo linalol)
Figura 49: Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 1ª Coleta
Figura 50: Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 1ª Coleta
104
Figura 51: Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 1ª Coleta
Figura 52: Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 1ª Coleta
105
Figura 53: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 1ª Coleta
Figura 54: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 1ª Coleta
106
Figura 55: Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 2ª Coleta
Figura 56: Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 2ª Coleta
107
Figura 57: Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 2ª Coleta
Figura 58: Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 2ª Coleta
108
Figura 59: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas frescas de
Cymbopogon citratus – 2ª Coleta
Figura 60: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas secas de
Cymbopogon citratus – 2ª Coleta
109
Figura 61: Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol – 1ª Coleta
Figura 62: Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol – 1ª Coleta
110
Figura 63: Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol – 1ª Coleta
Figura 64: Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol – 1ª Coleta
111
Figura 65: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 1ª Coleta
Figura 66: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 1ª Coleta
112
Figura 67: Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 2ª Coleta
Figura 68: Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 2ª Coleta
113
Figura 69: Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 2ª Coleta
Figura 70: Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 2ª Coleta
114
Figura 71: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 2ª Coleta
Figura 72: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 2ª Coleta
115
Figura 73: Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 3ª Coleta
Figura 74: Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 3ª Coleta
116
Figura 75: Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 3ª Coleta
Figura 76: Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 3ª Coleta
117
Figura 77: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 3ª Coleta
Figura 78: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 3ª Coleta
118
Figura 79: Cromatograma CLAE da decocção de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 4ª Coleta
Figura 80: Cromatograma CLAE da decocção de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 4ª Coleta
119
Figura 81: Cromatograma CLAE da infusão de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 4ª Coleta
Figura 82: Cromatograma CLAE da infusão de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 4ª Coleta
120
Figura 83: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas frescas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 4ª Coleta
Figura 84: Cromatograma CLAE da maceração em ETOH 70% de folhas secas de
Lippia alba quimiotipo linalol - 4ª Coleta
121
4.2.3. Análise por CLAE acoplada a detector de arranjo de diodos dos extratos
polares das ervas cidreiras, utilizando as substâncias de referência isoladas.
Para as ervas cidreiras estudadas neste trabalho foram desenvolvidos os perfis
cromatográficos por CLAE-DAD para os extratos polares obtidos por infusão (extrato
aquoso) e por maceração em etanol-água 70% (extrato hidroalcoólico). A escolha destes
extratos baseou-se no fato da população brasileira empregá-los predominantemente em
sua rotina de uso destas plantas, assim como as folhas secas foram preferidas por serem
normalmente encontradas em produtos comerciais contendo as espécies mencionadas.
4.2.3.1. Cymbopogon citratus
A análise dos perfis cromatográficos por CLAE-DAD e os respectivos espectros
na região do ultravioleta dos sinais existentes nos extratos das folhas de C. citratus, em
paralelo com o levantamento das principais substâncias descritas na literatura para a
espécie, indicou que a escolha de uma substância de referência que pudesse auxiliar na
caracterização diferencial de produtos contendo esta gramínea teria que incluir uma
substância flavonoídica, não só pela presença de vários representantes deste grupo de
produtos naturais nos extratos, bem como pelas suas diversidades estruturais
conhecidas. Em nossos trabalhos de isolamento e identificação dos constituintes de C.
citratus, obtivemos o flavonóide isoorientina em 0,13% de rendimento, o qual foi
facilmente identificado nos perfis cromatográficos dos extratos polares. O estudo dos
dados existentes na literatura indicou a sua ausência nas composições químicas de
Lippia alba e de Melissa officinalis, qualificando a escolha.
No infuso das folhas secas, o perfil cromatográfico por CLAE-DAD (figura 85,
p.124) apresentou o sinal nº 10 com valor de tempo de retenção (t
R
= 18,42 min) e o
espectro ultravioleta compatíveis com o sinal do cromatograma obtido nas mesmas
condições para a substância isolada (figura 87, p. 126). O macerado em etanol a 70%
igualmente apresentou este sinal (nº 14, t
R
= 18,23 min), com espectro ultravioleta
característico ao de isoorientina (figura 86, p.125) Embora este flavonóide não fosse a
122
substância majoritária nos perfis cromatográficos dos extratos, o mesmo apresentou
maior facilidade no isolamento e quantidade razoável no extrato.
4.2.3.2. Lippia alba
A análise da composição química desta Verbenaceae na literatura científica
mostrou como sua característica principal a existência de ésteres do ácido caféico
contendo um radical feniletanóide, os quais foram utilizados como substâncias de
referência. Entre estes derivados, aquele que aparece em maior proporção é o
verbascosídeo, o qual não é descrito nas duas outras ervas cidreiras estudadas. Na busca
de substâncias deste grupo, este constituinte foi isolado com um rendimento de 1,19%,
bem como o isômero denominado isoverbascosídeo. O primeiro foi utilizado como
referência devido estar presente em maior quantidade.
Nos perfis cromatográficos encontrados para os extratos das folhas secas,
infusos (figura 88, p. 126; figura 90, p. 128 e figura 92, p. 130) e macerados em etanol-
água 70% (figura 89, p. 127; figura 91, p. 129 e figura 93, p. 131), respectivamente, dos
quimiotipos linalol; citral e carvona de Lippia alba, o sinal correspondente ao
verbascosídeo foi compatível com aquele obtido nas mesmas condições para a
substância isolada (figura 94, p. 132).
4.2.3.3. Melissa officinalis
Segundo a literatura científica (WHO, 2002), a substância característica para os
extratos polares de M. officinalis é o ácido rosmarínico, derivado éster do ácido caféico
que pode atingir até 6% da sua composição química. Este constituinte não é descrito
como fazendo parte da composição de C. citratus e L. alba e foi utilizado como
substância de referência nos estudos. As tentativas empregadas no seu isolamento a
partir de exemplares de M. officinalis cultivados em nossos canteiros experimentais de
Jacarepaguá resultaram em baixo rendimento (0,04%) devido à pequena disponibilidade
de biomassa para os experimentos, uma vez que o cultivo dessa espécie produziu
123
exemplares pouco desenvolvidos. Não obstante, essa substância foi utilizada como
referência para o extrato polar de M. officinalis. Devido a quantidade do produto ser
muito pequena foi obtido o perfil cromatográfico, nas mesmas condições estabelecidas
para as outras ervas cidreiras, do extrato etanol-água 70%, o qual é o mais utilizado
comercialmente.
O extrato etanol-água 70% de Melissa officinalis (figura 95, p. 133) mostrou um
sinal com tempo de retenção de 24,42 min, que associado ao espectro na região do
ultravioleta, foi coerente com aquele obtido da análise da substância pura(figura 96, p.
134).
Por conseguinte, o estudo dos perfis cromatográficos e dos espectros ultravioleta
resultantes dos extratos polares de Cymbopogon citratus, Lippia alba e Melissa
officinalis, obtidos por CLAE-DAD, mostrou ser possível a diferenciação entre eles,
auferindo-se a presença de isoorientina nos extratos da 1ª espécie, verbascosídeo nos
extratos da 2ª e ácido rosmarínico na última espécie. Estes resultados auxiliam no
controle da qualidade destas matérias-primas vegetais, pois muitas vezes os produtos do
comércio se encontram esgotados dos principais componentes voláteis que os
caracterizam e que não são suficientes para diferenciá-los. Os aspectos (“fingerprint”)
dos perfis cromatográficos de cada extrato obtido nas mesmas condições metodológicas
são parâmetros importantes para a análise das ervas cidreiras mencionadas neste
trabalho.
124
4.2.3.4. Cromatogramas por CLAE dos extratos polares, utilizando-se as
substâncias de Referências
0 10 20 30 40 50 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
mA U
305nm,8nm (1.00)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
250 500 nm
0
100
200
300
mA U
18.29/ 1.00
299
257
558
196
328
274
581
Figura 85: Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do extrato por
infusão de folhas secas de Cymbopogon citratus. Detalhe: espectro na região de UV da
isoorientina.
125
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
mA U
305nm,8nm (1.00)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
250 500 nm
0
250
500
750
1000
1250
mA U
18.22/ 1.00
211
296
248
215
271
335
Figura 86: Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do extrato etanólico
70% das folhas secas de Cymbopogon citratus. Detalhe: espectro
na região de UV da isoorientina
126
250 500 nm
0
250
500
750
1000
1250
mA U
18.22/ 1.00
211
296
248
215
271
335
Figura 87: Cromatograma e espectro UV do flavonóide isoorientina isolado de
Cymbopogon citratus
200 300 400 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mA U
21.89/ 1.00
264
562
208
331
Figura 88: Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do extrato por
infusão de folhas secas de Lippia alba quimiotipo linalol. Detalhe: espectro na
região de UV do verbascosídeo.
127
200 300 400 500 nm
0
500
1000
1500
mA U
22.07/ 1.00
195
264
566
199
331
Figura 89: Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do extrato etanólico
70% obtido de folhas secas de Lippia alba quimiotipo linalol. Detalhe: espectro
na região de UV do verbascosídeo.
128
200 300 400 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mA U
21.94/ 1.00
264
559
205
332
581
Figura 90: Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do extrato por
infusão de folhas secas de Lippia alba quimiotipo citral. Detalhe: espectro na
região de UV do verbascosídeo.
129
200 300 400 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mA U
21.86/ 1.00
264
202
329
Figura 91: Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do extrato etanólico
70% obtido de folhas secas de Lippia alba quimiotipo citral. Detalhe: espectro
na região de UV do verbascosídeo.
130
200 300 400 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mA U
21.86/ 1.00
264
202
329
Figura 92: Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do extrato por
infusão de folhas secas de Lippia alba quimiotipo carvona. Detalhe: espectro
na região de UV do verbascosídeo.
131
200 300 400 500 nm
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
mA U
22.08/ 1.00
264
551
331
581
Figura 93: Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do extrato etanólico
70% obtido de folhas secas de Lippia alba quimiotipo carvona. Detalhe: espectro
na região de UV do verbascosídeo.
132
200 300 400 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mA U
21.86/ 1.00
264
202
329
200 300 400 500 nm
0
500
1000
1500
mA U
22.07/ 1.00
195
264
566
199
331
Figura 94: Cromatogramas e espectro UV do fenilpropanóide
verbascosídeo (pico 1) isolado de Lippia alba.
Detalhe: (pico 2) corresponde ao isoverbascosídeo.
133
Figura 95: Perfil cromatográfico (CLAE) e tabela correspondente do extrato etanólico
70% de folhas secas de Melissa officinalis. Detalhe: espectro na região
de UV do ácido rosmarínico
134
0 10 20 30 40 50 min
-200
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
mA U
305nm,8nm (1.00)
1/26.780
250 500 nm
0
1000
2000
3000
4000
mA U
26.79/ 1.00/smth
194
264
462
206
330
Figura 96: Cromatograma e espectro UV do fenilpropanóide do ácido rosmarínico
isolado de Melissa officinalis
135
4.2.4. Substâncias isoladas e identificadas dos extratos polares das espécies vegetais
denominadas “ervas cidreiras”
As substâncias obtidas dos extratos brutos de C. citratus, L. alba e M. officinalis
foram isoladas e identificadas conforme os procedimentos descritos a seguir. A
princípio, todas elas seriam utilizadas para diferenciar os perfis cromatográficos dos
extratos das ervas cidreiras, entretanto o isoverbascosídeo foi excluído devido ao
respectivo sinal estar parcialmente sobreposto à outros sinais nos cromatogramas.
Adicionalmente, o ácido trans-p-cumárico não foi escolhido por ser um dos
constituintes encontrado tanto em C. citratus quanto em M. officinalis,
conseqüentemente não servindo para diferenciar as espécies. Outras substâncias obtidas
não foram acrescentadas ao trabalho, pois após análise do perfil cromatográfico dos
extratos as mesmas não possuíam os sinais destacados nos cromatogramas.
4.2.4.1. Cymbopogon citratus
4.2.4.1.1. Isoorientina
O
OH
H
H
H
H
OH
OH
OH
O
2'
OH
OH O
OH
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
3'
4'
5'
6'
Isoorientina
A substância codificada FLCCH02 foi isolada do decocto das folhas secas de C.
citratus, coletadas no mês de junho, na estação do inverno de 2002 em canteiros
136
experimentais do Laboratório de Matéria-Prima Vegetal de Farmanguinhos (FIOCRUZ)
localizado no bairro de Jacarepaguá (Rio de Janeiro).
O material foi obtido na forma de um precipitado amarelo, que analisado por
CCD-Si em AcOEt:AcOH: HCOOH: H
2
O (100:11:11:27), sob revelação com NP-PEG
e UV (365 nm), se apresentou como uma mancha de cor amarela., característica de um
flavonóide.
A análise da substância por CLAE-DAD, seguido pela comparação do t
R
e do
espectro na região do UV permitiu identificá-la como sendo o sinal nº 10 do perfil
cromatográfico do infuso e o de nº 14 do extrato etanol-água 70% das folhas secas desta
gramínea. (figuras 85 e 86, pp. 124 e 125).
O espectro de RMN
1
H (figura 97, p. 139) em DMSO-d
6
apresentou sinais de
hidrogênios aromáticos que confirmaram a estrutura de um flavonóide. Dois sinais
duplos em 7,39 ppm (1H, J = 2,15 Hz) e a 6,88 ppm (1H, J = 8,35 Hz) e um duplo sinal
duplo em 7,42 ppm (1H, J = 2,15 Hz e 8,35 Hz) evidenciaram que o anel “B” do núcleo
flavonoídico era orto-di-oxigenado e tri-substituído e foram atribuídos, respectivamente,
aos hidrogênios H-2’, H-5’ e H-6’. Um sinal simples (1H) em 6,47 ppm foi relacionado
ao hidrogênio H-8. Outro sinal simples em 6,68 ppm (1H) foi atribuído ao hidrogênio
H-3, caracterizando a estrutura como uma flavona.. O sinal duplo em 4,57 ppm (1H, J =
9,85 Hz) foi indicativo do hidrogênio anomérico de uma unidade de açúcar em ligação
C-C com a aglicona flavônica (PENG et al. 2005). O sinal em campo baixo a 13,58 ppm
foi relacionado ao hidrogênio do grupo hidroxila em C-5-OH.
H δ (ppm) Isoorientina
em DMSO-d
6
da
literatura. J (Hz)
(PENG et al.2005;
RINALDO 2007)
δ (ppm) FLCCH02
em DMSO-d
6
J (Hz)
3 6,64 (s) 6,68 (s)
8 6,50 (s) 6,47 (s)
2’ 7,38 (d – 2,50) 7,39 (d - 2,15)
5’ 6,90 (d – 9,0) 6,88 (d – 8,35)
6’ 7,44 (dd – 2,50 e 9,0) 7,42 (dd – 2,15 e 8,35)
1’’ 4,58 (d – 10,0) 4,57 (d - 9,85)
C-5-OH 13,55 13,58
Tabela 19: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN
1
H em
DMSO-d
6
obtidos para FLCCH02 e os encontrados na
literatura no mesmo solvente.
137
O espectro de RMN
13
C da substância FLCCH02 (figuras 98, p. 139) apresentou
20 sinais (um deles estava sobreposto a outro sinal), correspondentes aos carbonos da
flavona e aos do açúcar, identificado como β-D-glicose.
O sinal em 181,7 ppm foi associado ao carbono carbonílico de uma flavona (C-
4), enquanto os sinais a 108,7 ppm e 93,3 ppm atribuídos, respectivamente aos carbonos
C-6 e C-8 mostraram que o radical β-glicosídico devia estar ligado ao carbono C-6 do
anel “A” (PENG et al., 2005). Os demais sinais encontram-se listados na tabela 18,
abaixo, onde estão incluídas as suas multiplicidades.
C δ (ppm)
Isoorientina em
DMSO-d
6
da
literatura
(PENG et al.2005;
RINALDO 2007)
δ (ppm) FLCCH02
em DMSO-d
6
Multiplicidades
2 163,4 163,4 C
3 102,4 102,6 CH
4 181,4 181,7 C
5 160,6 160,5 C
6 108,9 108,7 C
7 163,4 163,4 C
8 93,7 93,3 CH
9 156,3 156,0 C
10 102,8 103,2 C
1’ 121,6 121,2 C
2’ 112,9 113,1 CH
3’ 145,9 145,6 C
4’ 150,4 149,6 C
5’ 116,0 115,8 CH
6’ 118,8 118,8 CH
1’’ 73,2 72,8 CH
2’’ 70,5 70,4 CH
3’’ 78,9 78,8 CH
4’’ 70,2 70,0 CH
5’’ 81,3 81,4 CH
6’’ 61,3 61,3 CH
2
Tabela 20: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN
13
C
obtidos para FLCCH02 com suas multiplicidades e os encontrados
na literatura para o mesmo solvente.
138
O espectro ultravioleta de FLCCH02 (figura 100, p. 141) apresentou absorções
em 348 nm (relativa a metade cinamoíla da molécula – banda I) e 256 nm (relacionada
ao sistema benzoíla – banda II), características de flavonóides. (MABRY et al.,1970).
A adição de acetato de sódio (AcONa) à solução contendo a substância
FLCCH02 (figura 101, p. 141) resultou em um deslocamento batocrômico na banda I da
ordem de 28 nm, comprovando a presença de um grupo hidroxila ligado ao carbono C-7
e consequentemente descartando a possibilidade de um 7-O- glicosídeo
No espectro de ultravioleta, após a adição de AlCl
3
(figura 102, p. 142),
observou-se um deslocamento batocrômico da banda I para 421 nm e após a adição de
HCl (figura 103, p. 142), um deslocamento hipsocrômico para 359 nm, na realidade um
deslocamento batocrômico, quando comparado ao espectro sem AlCl
3,
da ordem de 11
nm. Este resultado confirmou a presença de um grupo hidroxila em C-5 e de dois grupos
hidroxilas orto, em C-3’e C-4’.
O espectro de massas [ESI, íons negativos] (figura 99, p. 140) apresentou o íon
de m/z = 447, compatível com a fórmula molecular (C
21
H
20
O
11
) correspondente ao íon
molecular (M) menos 1 hidrogênio (M-1).
De acordo com as análises espectrais realizadas, bem como a comparação dos
dados obtidos com aqueles da literatura, a substância codificada como FLCCH02 foi
identificada como luteolina-6-C- β-D-glicopiranosídeo (isoorientina ou homoorientina).
139
Figura 97: Espectro de RMN
1
H (DMSO-D6, 500MHz) da substância isolada
isoorientina
Figura 98: Espectro de RMN
13
C (DMSO-D6, 500MHz) da substância isolada
isoorientina
140
Figura 99: Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância isolada isoorientina
141
Figura 100: Ultravioleta da substância isoorientina isolada
Figura 101: Ultravioleta da substância isoorientina isolada + reagente
de deslocamento acetato de sódio
142
Figura 102: Ultravioleta da substância isoorientina isolada + reagente
de deslocamento cloreto de alumínio
Figura 103: Ultravioleta da substância isoorientina isolada + reagente de deslocamento
cloreto de alumínio + ácido clorídrico
143
4.2.4.1.2. Ácido trans-p-cumárico
OH
O
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Ácido trans-p-cumárico
A substância denominada CC10-20-2 foi isolada do macerado em etanol-água
70% das folhas frescas de Cymbopogon citratus, coletadas no mês de agosto, na estação
do inverno de 1998, em canteiros experimentais do Laboratório de Matéria-Prima
Vegetal de Farmanguinhos (FIOCRUZ) localizado no bairro de Jacarepaguá (Rio de
Janeiro).
O material foi obtido na forma de um precipitado branco que analisado por
CCD-Si em AcOEt:HCOOH:H2O(8,8;0,6;0,6), sob revelação com NP/PEG se
apresentou como uma mancha azul fluorescente na revelação com lâmpada UV a 365
nm.
A análise do seu espectro de RMN
1
H (figura 104, p. 145) em CD
3
OD e
comparação dos dados obtidos com os da literatura (LIANG et al., 2006) para o malato
do ácido trans-p-cumárico, resultaram nas seguintes informações sobre a natureza
química de sua estrutura:
•Presença de um sistema AA’XX’, característico de quatro hidrogênios
aromáticos magneticamente não-equivalentes de um anel benzênico p-dissubstituído. O
sinal duplo em 7,44 ppm (2H, J = 8,6 Hz) acoplado com outro sinal duplo em 6,80 ppm
(2H, J = 8,6 Hz) foram atribuídos aos dois pares de hidrogênios H-2, H-6 e H-3, H-5,
respectivamente.
•O sinal duplo em 6,27 ppm (1H, J = 15,8 Hz) acoplado a outro sinal duplo em
7,59 ppm (1H, J = 15,8 Hz) foram relacionados aos hidrogênios olefínicos da cadeia
lateral (H-8 e H-7, respectivamente) que se encontram em disposição trans.
144
H δ (ppm) malato de
cumarila em CD
3
OD
da literatua (LIANG
et al. 2006)
δ (ppm) CC10-20-2 em
CD
3
OD
2 7,46 (d – 8,8 Hz) 7,44 (d – 8,6 Hz)
3 6,79 (d – 8,8 Hz) 6,80 (d – 8,6Hz)
5 6,79 (d – 8,8 Hz) 6,80 (d – 8,6 Hz)
6 7,46 (d – 8,8 Hz) 7,44 (d – 8,6 Hz)
7 7,63 (d – 16,0 Hz) 7,59 (d – 15,8 Hz)
8 6,38 (d – 16,0 Hz) 6,27 (d – 15,8 Hz)
Tabela 21: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN
1
H em
CD
3
OD obtidos para CC10-20-2 e os encontrados na literatura, no mesmo
solvente, para o malato de trans-cumarila
A análise do espectro de RMN
13
C (figura 106, p. 146) em CD
3
OD indicou a
existência de seis sinais, cujos valores de deslocamento químico foram coerentes com
os descritos na literatura (LIANG et al., 2006) para o malato de trans cumarila, não
sendo possível, entretanto, detectar a presença do sinal correspondente ao carbono
carboxílico. Os sinais a 127,4 ppm, 131,2 ppm, 116,9 ppm, 161,3 ppm; 116,9 ppm e
131,2 ppm foram atribuídos, respectivamente, aos carbonos do anel aromático C-1, C-2-
H, C-3-H, C-4-OH, C-5-H e C-6-H. Os sinais a 146,7 ppm e 115,8 ppm foram
relacionados aos carbonos da dupla ligação conjugada ao anel benzênico
C δ (ppm) malato de
trans-cumarila em
CD
3
OD da
literatua (LIANG
et al. 2006)
δ (ppm) CC10-20-
2 em CD
3
OD
multiplicidades
1 127,5 127,4 C
2 131,1 131,2 CH
3 116,6 116,9 CH
4 161,1 161,3 C
5 116,6 116,9 CH
6 131,1 131,2 CH
7 146,8 146,7 CH
8 115,2 115,8 CH
9 168,3 nd
Tabela 22: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN
13
C
obtidos para CC10-20-2 com suas multiplicidades e os encontrados na literatura
para o maleato de trans-cumarila.
145
As correlações encontradas na técnica de HMQC (figura 107, p. 147)
confirmaram os assinalamentos propostos nos espectros de RMN
1
H e RMN
13
C (tabela
23).
Nº H (δ ppm) C (δ ppm)
2 7,44 131,2
3 6,80 116,9
5 6,80 116,9
6 7,44 131,2
7 7,59 146,7
8 6,27 115,8
Tabela 23: Correlações encontradas no espectro HMQC de CC10-20-2.
O espectro de massas [ESI, íons negativos] (figura 109, p. 148) apresentou o íon
de m/z = 163, compatível com a fórmula molecular (C
9
H
8
O
3
) correspondente ao íon
molecular (M) menos 1 hidrogênio (M-1).
De acordo com as análises espectrais realizadas, bem como com a comparação
dos dados obtidos com aqueles da literatura, a substância codificada como CC10-20-2
foi identificada como o ácido trans-p-cumárico.
Figura 104: Espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 400MHz) da substância isolada
Ácido trans-p-cumárico
146
Figura 105: Ampliação do espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 400MHz) da substância
isolada Ácido trans-p-cumárico
Figura 106: Espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 400MHz) da substância isolada
Ácido trans-p-cumárico
147
Figura 107: Espectro de HMQC (CD
3
OD, 400MHz) da substância isolada
Ácido trans-p-cumárico
Figura 108: Ampliação do espectro de HMQC (CD
3
OD, 400MHz) da substância
isolada Ácido trans-p-cumárico
148
Figura 109: Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância isolada
Ácido trans-p-cumárico
4.2.4.2. Lippia alba
4.2.4.2.1. Verbascosídeo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
O
O
OH
OH
5''
O
H
OH
H
H
H
H
O
O
OH
OH
OH
O
H
OH
H
OH
OH
H
CH
3
1''
2''
3''
4''
6''
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''
6'''
Verbascosídeo
149
A substância codificada LAB-03-02/43 foi isolada do decocto das folhas frescas
de Lippia alba (quimiotipo linalol), coletadas no mês de agosto, na estação do inverno
de 1998, em canteiros experimentais do Laboratório de Matéria-Prima Vegetal de
Farmanguinhos (FIOCRUZ) localizado no bairro de Jacarepaguá (Rio de Janeiro).
O material, sob a forma de um sólido branco-amarelado, foi analisado por CCD-
Si e CCD-Si-C18. Após eluição com AcOEt:AcOH:HCOOH:H
2
O (10:1,1:1,1:2,7) e
acetonitrila:água (1:3), respectivamente e revelação com NP-PEG sob fonte de radiação
ultravioleta (365 nm), observou-se nos dois sistemas cromatográficos uma mancha
azulada que não era característica para um constituinte de natureza flavonóide.
A análise da substância por CLAE-DAD, seguido pela comparação do T
R
e do
espectro no UV permitiu identificá-la como sendo os sinais de números 15 no infuso e
macerado em etanol-água 70% do quimiotipo linalol; os de números 13 e 20 nos
respectivos extratos do quimiotipo citral e os de números 12 e 16 do quimiotipo carvona
encontrados nos perfis cromatográficos desta erva cidreira (ver pp. 124 - 134)
A análise do espectro de RMN
1
H (figura 111, p. 156) em DMSO-d
6
e
comparação dos dados obtidos com os da literatura para o verbascosídeo (ANDARY et
al., 1982; OWEN et al., 2003; PINAR SAHIN et al., 2004) junto com as correlações
entre os hidrogênios (tabela 25, p. 152), definidas pelo espectro COSY (figura 114, p.
157), permitiu as seguintes observações em relação a estrutura química da substância:
•Presença de dois sistemas “ABX” característicos de hidrogênios aromáticos, um
deles pertencente a um radical de ácido caféico e o outro ao de um radical 3,4-diidroxi-
feniletila.
•O sinal simples a 7,02 ppm foi atribuído ao hidrogênio H-2 do radical do ácido
caféico. Os sinais duplos a 6,74 ppm (1H, J = 8 Hz) e a 6,97 ppm (1H, J = 8 Hz) foram
relacionados respectivamente a H-5 e H-6. Os sinais duplos a 7,42 ppm (1H, J = 16 Hz)
e 6,24 ppm (1H, J = 16 Hz) por sua vez foram, nesta ordem, atribuídos a H-7 e H-8.
•Em relação à análise do radical 3,4-diidroxi-feniletila, o sinal simples a 6,62
ppm foi sugerido estar relacionado ao H-2’, enquanto os sinais duplos a 6,48 ppm (1H, J
= 8 Hz) e 6,62 ppm (1H, J = 8 Hz) foram atribuídos nesta seqüência ao H-5’ e H-6’. Um
sinal triplo a 2,70 ppm (2H, J = 8 Hz) foi atribuído ao grupo α-CH
2
da cadeia lateral. Os
dois sinais múltiplos a 3,61 ppm e 3,87 ppm foram relacionados aos dois hidrogênios
não-equivalentes do grupamento β-CH
2
.
150
•O hidrogênio anomérico H-1’’’ do radical de rhamnose foi relacionado ao sinal
duplo em 5,03 ppm, possuindo uma constante de acoplamento de pequeno valor (1H, J
= 1 Hz). Os hidrogênios do grupo metila terminal foram facilmente reconhecidos pelo
sinal duplo em 0,97 ppm (3H, J = 6 Hz). Os demais valores (tabela 24, p. 151) foram
condizentes apenas com a configuração “α” para o radical de rhamnopiranose descritos
segundo a literatura (ANDARY et al., 1982; OWEN et al., 2003; PINAR SAHIN et al.,
2004). Assim, os duplos sinais duplos em 3,70 ppm (1H, J = 1 e 2,5 Hz) e 3,31 ppm
(1H, J = 2,5 e 9,5 Hz) foram atribuídos nesta seqüência para H-2’’’ e H-3’’’, bem como
o sinal triplo em 3,10 ppm (1H, J = 9,5 Hz) e o sinal múltiplo em 3,36 ppm relacionados
respectivamente aos hidrogênios H-4’’’ e H-5’’’.
•A constante de acoplamento (J
H-1’’-H-2’’
;
7,5 Hz) do hidrogênio anomérico
relacionado ao radical de glicopiranose que apareceu na forma de um sinal duplo em
4,34 ppm estava de acordo com a configuração “β” proposta. Os valores dos demais
hidrogênios foram atribuídos conforme descrito na literatura (ANDARY et al., 1982
OWEN et al., 2003; PINAR SAHIN et al., 2004). Desta forma, o duplo sinal duplo em
3,21 ppm (1H, J = 7,5 e 9,0 Hz) foi relacionado ao hidrogênio H-2’’. O sinal triplo em
3,70 ppm (1H, J = 9,5 Hz) foi atribuído ao hidrogênio H-3’’, bem como o sinal triplo
em 4,71 ppm (1H, J = 9,5 Hz) e o sinal múltiplo em 3,58 ppm foram nesta ordem
relacionados aos hidrogênios H-4’’ e H-5’’. Os dois duplos sinais duplos em 3,75 ppm e
3,45 ppm, por sua vez, foram atribuídos aos hidrogênios do grupo metilênico terminal.
151
H δ (ppm) verbascosídeo
Literatura (DMSO +
CF
3
CO
2
H)
ANDARY et al. 1982
LAB-03-02/43
(DMSO)
ácido. caféico
2 7,00 7,02
5 6,74 6,74
6 6,93 6,97
7 7,43 7,42
8 6,18 6,24
3,4-diidroxi-feniletila
2’ 6,62 6,62
5’ 6,48* 6,48*
6’ 6,62* 6,62*
7’ 2,72 2,70
8’ 3,60 e 3,88 3,61 e 3,87
glicose
1’’ 4,33 4,34
2’’ 3,22 3,21
3’’ 3,70 3,70
4’’ 4,72 4,71
5’’ 3,45 3,58
6’’ 3,70 e 3,45 3,75 e 3,45
rhamnose
1’’’ 5,03 5,03
2’’’ 3,70 3,70
3’’’ 3,30 3,31
4’’’ 3,12 3,10
5’’’ 3,36 3,36 (solvente)
6’’’ 1,01 0,97
Tabela 24: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN
1
H em
DMSO obtidos para LAB-03-02/43 e os encontrados na literatura.
* Segundo Owen et al., (2003) os assinalamentos dos hidrogênios 5’ e 6’ propostos por
Andary et al., (1982) devem ser trocados.
Obs. O sinal a 3,36 ppm ficou sobreposto ao sinal do solvente
152
H (ppm) H (ppm)
H-5 (6,74) H-6 (6,97)
H-7 (7,42) H-8 (6,24)
H-5’(6,48)* H-6’ (6,62)*
H
2
-7’(2,70) H
2
-8’ (3,61 e 3,87)
H-1’’ (4,34) H-2’’ (3,21)
H-2’’ (3,21) H-3’’ (3,70)
H-3’’ (3,70) H-4’’ (4,71)
H-4’’ (4,71) H-5’’ (3,58)
H-5’’ (3,58) H
2
-6’’ (3,75 e 3,45)
H-1’’’ (5,03) H-2’’’ (3,70)
H-2’’’ (3,70) H-3’’’ (3,31)
H-3’’’ (3,31) H-4’’’ (3,10)
H-4’’’ (3,10) H-5’’’ (3,36)
H-5’’’ (3,36) H-6’’’ (0,97)
Tabela 25: Correlações atribuídas aos hidrogênios no espectro COSY de LAB-03-
02/43
* Segundo Owen et al., (2003) os assinalamentos dos hidrogênios 5’ e 6’ propostos por
Andary et al,. (1982) devem ser trocados
A análise do espectro de RMN
13
C (figura 112, p. 156) em DMSO-d
6
, indicou a
presença de 29 sinais, alguns dos quais parcialmente sobrepostos e cujos valores de
multiplicidade, obtidos pela técnica DEPT (figura 113, p. 157), estão listados na tabela
24. Os valores atribuídos foram condizentes com aqueles descritos na literatura para o
verbascosídeo (ANDARY et al., 1982; OWEN et al., 2003; PINAR SAHIN et al.,
2004).
Os átomos de carbono aromáticos pertencentes ao radical de ácido caféico foram
atribuídos aos sinais 125,47 ppm (C-1); 114,67 ppm (C-2-H); 145,50 ppm (C-3); 148,1
ppm (C-4); 113,56 (C-5-H) e 121,34 ppm (C-6-H). Os átomos de carbono sp
2
(metínicos) da cadeia lateral foram assinalados com os valores de 144,93 ppm e 115,74
ppm. Por sua vez, o átomo de carbono quaternário do grupo carboxila da extremidade
da cadeia, em ligação éster com o C-4’’ do radical glicopiranose, foi relacionado ao
sinal a 165,62 ppm, totalizando até aqui 5 átomos de carbono metínicos e 4 átomos de
carbono quaternários segundo a multiplicidade atribuída pelo espectro DEPT.
O radical 3,4-diidroxi-feniletila apresentou os átomos de carbono com
deslocamentos químicos e multiplicidades condizentes com os valores esperados para
hidroxitirosol (OWEN et. al.,.2003). Aos átomos de carbono aromáticos C-1’, C-2’-H,
153
C-3’, C-4’, C-5’-H e C-6’-H foram atribuídos os sinais a 129,10 ppm; 116,25 ppm;
145,50 ppm; 143,40 ppm; 115,42 ppm e 119,46 ppm respectivamente. Os carbonos C-
7’-H
2
e C-8’-H
2
da cadeia lateral etanóide foram relacionados aos sinais a 34,96 ppm e
70,36 ppm, nesta ordem. Desta forma, podemos acrescentar mais 3 átomos de carbono
metínicos, 3 quaternários e 2 metilênicos, conseqüentemente restando para completar a
estrutura química do verbascosídeo a quantia de 10 carbonos metínicos, um carbono
metilênico e outro pertencente a um grupo metílico.
O radical de glicopiranose apresentou o seu carbono anomérico C-1’’-H com um
valor de 102,25 ppm coerente com a ligação do tipo éter ao radical feniletanóide. O
sinal a 74,46 ppm foi atribuído ao carbono C-2’’-H que possui um grupo hidroxila livre.
Adicionalmente, o sinal em campo mais baixo a 79,18 ppm foi condizente com o
carbono C-3’’-H que, por sua vez, está ligado por um átomo de oxigênio ao átomo de
carbono C-1’’’-H do radical de rhamnopiranose. O carbono C-4’’-H, cujo sinal foi
atribuído o valor de 69,13 ppm, foi coerente com a sua ligação ao radical de ácido
caféico. Os sinais a 74,46 ppm e 60,71 ppm foram respectivamente relacionados aos
carbonos C-5’’-H e C-6’’-H
2
OH.
O radical de rhamnose apresentou o seu carbono anomérico C-1’’’-H com o
valor de 101,15 ppm. Os sinais a 70,36 ppm; 70,18 ppm; 71,65 ppm e 68,65 ppm foram
atribuídos, nesta ordem, aos carbonos C-2’’’-H; C-3’’’-H; C-4’’’-H e C-5’’’-H.
Finalmente, o sinal a 18,07 ppm foi relacionado com o grupo metila terminal em C-6’’’-
H
3
, completando assim a fórmula estrutural proposta como a do verbascosídeo em
relação as multiplicidades dos átomos de carbono que restavam conferir.
154
carbono δ (ppm) verbascosídeo
Literatura (DMSO +
CF
3
CO
2
H)
ANDARY et al. 1982
LAB-03-02/43
(DMSO)
multiplicidades
ácido caféico
1 125,62 125,47 C
2 114,70 114,67 CH
3 145,64 145,50 C
4 148,53 148,41 C
5 113,68* 113,56* CH
6 121,54 121,34 CH
7 145,64 144,93 CH
8 115,86* 115,74* CH
9 165,81 165,62 C
3,4-diidroxi-feniletila
1’ 129,31 129,10 C
2’ 116,39 116,25 CH
3’ 145,04 145,50 C
4’ 143,58 143,49 C
5’ 115,52 115,42 CH
6’ 119,65 119,46 CH
7’ 35,07 34,96 CH
2
8’ 70,37 70,36 CH
2
glicose
1’’ 102,44 102,25 CH
2’’ 74,61 74,46 CH
3’’ 79,18 79,03 CH
4’’ 69,18 69,13 CH
5’’ 74,61 74,46 CH
6’’ 60,78 60,71 CH
2
rhamnose
1’’’ 101,25 101,15 CH
2’’’ 70,61 70,36 CH
3’’’ 70,52 70,18 CH
4’’’ 71,80 71,65 CH
5’’’ 68,82 68,65 CH
6’’’ 18,18 18,07 CH
3
Tabela 26: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
13
C obtidos para LAB-03-02/43 com suas multiplicidades
e os encontrados na literatura
* Segundo Owen et al., (2003) os assinalamentos dos carbonos C-5 e C-8 propostos por
Andary et al., (1982) devem ser trocados.
155
A análise do espectro de infravermelho, cujas absorções foram condizentes com
as descritas na literatura (PINAR-SAHIN et al., 2004) para o verbascosídeo (figura 117,
p. 159) indicou a presença de uma banda larga a 3421 cm
-1
característica de vibrações
axiais dos grupamentos hidroxilas. A absorção em 1691 cm
-1
foi atribuída as vibrações
axiais da ligação C=O da carboxila do éster. α,β-insaturado. As vibrações axiais da
ligação C-O de éter alifático foi relacionada a absorção em 1160 cm
-1
.
O espectro ultravioleta apresentou bandas de absorção intensas entre 230 e 330
nm, indicativo da existência de um grupo fenólico com uma cadeia lateral insaturada.
O espectro de massas [ESI, íons negativos] (figura 118, p. 159) apresentou o íon
de m/z = 623, compatível com a fórmula molecular (C
29
H
36
O
15
) correspondente ao íon
molecular (M) menos 1 hidrogênio (M-1).
Desta forma os dados obtidos pelos espectros de RMN
1
H, RMN
13
C, DEPT,
COSY, IV, UV e ESI junto a comparação com os dados existentes na literatura,
permitiu a identificação da substância isolada LAB-03-02/43 como o fenilpropanóide
“β-(3’,4’-diidroxifenil)etil-O-α-L-rhamnopiranosil(1→3)-β-D-(4’-O-cafeoil)-
glicopiranosídeo” (verbascosídeo ou acteosídeo).
Figura 110: Cromatograma de CLAE/UV da substância isolada verbascosídeo
156
Figura 111: Espectro de RMN
1
H (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância isolada
verbascosídeo
Figura 112: Espectro de RMN
13
C (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância isolada
verbascosídeo
157
Figura 113: Espectro de DEPT (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância isolada
Verbascosídeo
Figura 114: Espectro de COSY (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância isolada
verbascosídeo
158
Figura 115: Ampliação 1 do espectro de COSY (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância
isolada verbascosídeo
Figura 116: Ampliação 2 do espectro de COSY (DMSO-D
6
, 200MHz) da substância
isolada verbascosídeo
159
Figura 117: Espectro de Infravermelho da substância isolada verbascosídeo
Figura 118: Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância isolada
verbascosídeo
160
4.2.4.2.2. Isoverbascosídeo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
1''
2''
3''
4''
6''
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''
6'''
Isoverbascosídeo
5''
O
H
OH
H
H
H
H
O
O
O
OH
OH
O
H
OH
H
OH
OH
H
CH
3
O
OH
OH
OH
A substância codificada LaA1FVC 144-148-5 foi isolada do decocto das folhas
frescas de Lippia alba (quimiotipo citral), coletadas no mês de agosto, na estação do
inverno de 1998, em canteiros experimentais do Laboratório de Matéria-Prima Vegetal
de Farmanguinhos (FIOCRUZ) localizado no bairro de Jacarepaguá (Rio de Janeiro).
O material, sob a forma de um sólido branco-amarelado, foi analisado por CCD-
Si e CCD-Si-C18. Após eluição com MeOH:HCOOH:H
2
O (6:0,05:0,5) e revelação com
NP/PEG sob fonte de radiação ultravioleta (365 nm), observou-se uma mancha azulada
que não era característica para substância de natureza flavonóide, mas similar a do
verbascosídeo isolado.
A análise do espectro de RMN
1
H (figura 121, p. 168) em CD
3
OD e comparação
dos dados obtidos com os da literatura para o isoverbascosídeo (OWEN et al., 2003;
SILVEIRA e PESSOA, 2005) junto com as correlações entre os hidrogênios, definidas
pelo espectro COSY (figura 128, p. 171), permitiu as seguintes observações em relação
a estrutura química da substância:
•Os valores atribuídos aos hidrogênios para a substância isolada LaA1FVC 144-
148-5 foram muito semelhantes àqueles indicados pela literatura para o
isoverbascosídeo e também para o verbascosídeo. A identidade química correta foi
possível observando-se as diferenças mais significativas relacionadas aos deslocamentos
químicos dos hidrogênios H-3’’ H-4’’ e H
2
-6’’ do radical de glicose, e H-5’’’ e H
3
-6’’’
do radical de rhamnose. Para o isoverbascosídeo da literatura H-3’’ apresenta um valor
161
em CD
3
OD igual a 3,52 ppm (mesmo valor encontrado para a substância isolada)
enquanto no verbascosídeo este valor passa para 3,80 ppm. Os hidrogênios H-4’’ e H
2
-
6’’ possuem, por sua vez, no isoverbascosídeo valores de 3,53 ppm para o primeiro e
4,48 e 4,34 ppm para o segundo (mesmos valores encontrados para LaA1FVC 144-148-
5), enquanto o verbascosídeo na literatura apresenta para estes hidrogênios, valores de
4,90 ppm (H-4’’) e 3,61 e 3,51 ppm para H
2-
6’’. Adicionalmente, para os hidrogênios
H-5’’’ e H
3
-6’’’ do radical de rhamnose do isoverbascosídeo da literatura são indicados
os valores de 3,99 ppm e 1,23 ppm, respectivamente (3,94 e 1,24 ppm em LaA1FVC
144-148-5), valores estes que estão deslocados para campo alto no verbascosídeo (3,55
e 1,08 ppm). Estes resultados estão sumarizados na tabela 27 p. 162.
As correlações atribuídas aos hidrogênios no espectro COSY de LaA1FVC 144-
148-5 foram as mesmas encontradas para a substância isolada LAB-03-02/43 (tabela 27,
p. 162), sugerindo fortemente a obtenção dos dois isômeros.
A análise do espectro de RMN
13
C (figura 125, p. 170) em CD
3
OD, indicou a
presença de 29 sinais, alguns dos quais parcialmente sobrepostos e cujos valores de
deslocamento químico foram condizentes para o fenilpropanóide isoverbascosídeo,
embora apresentasse um perfil muito semelhante ao espectro do verbascosídeo. Os
critérios usados na diferenciação de ambos basearam-se nos valores de deslocamento
químico para os carbonos do radical de glicose C-3’’ (83,99 ppm no isoverbascosídeo
da literatura; 83,84 ppm em “LaA1FVC 144-148-5” e 81,64 ppm no verbascosídeo da
literatura) e C-6’’ (64,63 ppm para o isoverbascosídeo da literatura; 64,64 ppm para
“LaA1FVC 144-148-5” e 62,40 ppm no verbascosídeo da literatura). Os carbonos C-
1’’’ e C-6’’’ do radical de rhamnose mostraram igualmente diferenças nos valores de
deslocamento químico que contribuíram na correta identificação de LaA1FVC 144-148-
5. O isoverbascosídeo da literatura apresenta um sinal para C-1’’’ no valor de 102,72
ppm (102,74 ppm para LaA1FVC 144-148-5) e 103,03 ppm no verbascosídeo da
literatura, enquanto C-6’’’ apresenta valores de 17,87 ppm para o isoverbascosídeo da
literatura (17,91 ppm em LaA1FVC 144-148-5) e 18,45 ppm para o verbascosídeo da
literatura. A comparação dos resultados estão sumarizados na tabela 28, p. 163.
162
H δ (ppm) isoverbascosídeo
Literatura (CD
3
OD)
(OWEN et al. 1982)
LaA1FVC144-148-5
(CD
3
OD)
ácido. caféico
2 7,02 7,03
5 6,76 6,76
6 6,88 6,89
7 7,55 7,56
8 6,27 6,29
3,4-diidroxi-feniletila
2’ 6,66 6,66
5’ 6,62 6,63
6’ 6,52 6,53
7’ 2,77 e 2,76 2,77
8’ 3,95 e 3,70 3,97 e 3,70
glicose
1’’ 4,32 4,33
2’’ 3,30 3,30
3’’ 3,52 3,52
4’’ 3,39 3,39
5’’ 3,53 3,53
6’’ 4,48 e 4,34 4,48 e 4,34
rhamnose
1’’’ 5,16 5,17
2’’’ 3,93 3,92
3’’’ 3,69 3,69
4’’’ 3,38 3,38
5’’’ 3,99 3,94
6’’’ 1,23 1,24
Tabela 27: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de
RMN
1
H em CD
3
OD obtidos para LaA1FVC144-148-5
e os encontrados na literatura.
163
carbono δ (ppm)
isoverbascosídeo
Literatura (CD
3
OD)
(OWEN et al. 2003)
LaA1FVC144-148-5
(CD
3
OD)
multiplicidades
ácido caféico
1 127,70 127,67 C
2 115,10 115,05 CH
3 146,80 146,81 C
4 149,65 149,67 C
5 116,56 116,55 CH
6 123,14 123,22 CH
7 147,25 147,31 CH
8 114,86 114,82 CH
9 169,13 169,17 C
3,4-diidroxi-feniletila
1’ 131,42 131,36 C
2’ 117,09 117,08 CH
3’ 146,14 146,15 C
4’ 144,67 144,68 C
5’ 116,37 116,36 CH
6’ 121,26 121,29 CH
7’ 36,69 36,72 CH
2
8’ 72,41 72,49 CH
2
glicose
1’’ 104,41 104,41 CH
2’’ 75,70 75,76 CH
3’’ 83,99 83,84 CH
4’’ 70,41 70,35 CH
5’’ 75,43 75,43 CH
6’’ 64,63 64,64 CH
2
rhamnose
1’’’ 102,72 102,74 CH
2’’’ 72,36 72,37 CH
3’’’ 72,27 72,25 CH
4’’’ 74,01 74,00 CH
5’’’ 70,05 70,04 CH
6’’’ 17,87 17,91 CH
3
Tabela 28: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN
13
C
em CD
3
OD obtidos para LaA1FVC144-148-5 com suas multiplicidades
e os encontrados na literatura
164
carbono δ (ppm)
verbascosídeo
Literatura (CD
3
OD)
(OWEN et al. 2003)
LaA1FVC144-148-5
(CD
3
OD)
isoverbascosídeo
isolado
multiplicidades
glicose
3’’ 81,64 83,84 CH
6’’ 62,40 64,64 CH
2
rhamnose
1’’’ 103,03 102,74 CH
6’’’ 18,45 17,91 CH
3
Tabela 29: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN
13
C em
CD
3
OD entre o verbascosídeo da literatura e o isoverbascosídeo isolado de L. alba
(LaA1FVC144-148-5) com as suas multiplicidades.
H δ (ppm) verbascosídeo
Literatura (CD
3
OD)
(OWEN et al. 1982)
LaA1FVC144-148-5
(CD
3
OD) isoverbascosídeo isolado
glicose
3’’ 3,80 3,52
4’’ 4,90 3,39
6’’ 3,61 e 3,51 4,48 e 4,34
rhamnose
5’’’ 3,55 3,94
6’’’ 1,08 1,24
Tabela 30: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN
1
H
em CD
3
OD entre o verbascosídeo da literatura e o isoverbascosídeo isolado
de L. alba (LaA1FVC144-148-5).
As correlações obtidas nos espectros bidimensionais do HMQC (figura 131, p.
173) e HMBC (figura 135, p. 175) permitiram confirmar os assinalamentos feitos nos
espectros de RMN
1
H e RMN
13
C. As tabelas a seguir apresentam estas correlações:
165
Nº H (δ ppm) C (δ ppm)
2 7,02 115,05
5 6,76 116,55
6 6,88 123,22
7 7,56 147,31
8 6,29 114,82
2’ 6,66 117,08
5’ 6,63 116,36
6’ 6,52 121,29
7’ 2,77 36,72
8’ 3,97 e 3,70 72,49
1’’ 4,33 104,41
2’’ 3,30 75,76
3’’ 3,52 83,84
4’’ 3,39 70,35
5’’ 3,53 75,43
6’’ 4,48 e 4,34 64,64
1’’’ 5,17 102,74
2’’’ 3,92 72,37
3’’’ 3,69 72,25
4’’’ 3,38 74,00
5’’’ 3,99 70,04
6’’’ 1,24 17,91
Tabela 31: Correlações encontradas no espectro HMQC de LaA1FVC144-148-5
166
carbono Correlação com hidrogênio
C-1 H-5; H-7; H-8
C-2 H-6; H-7
C-3 H-2; H-5
C-4 H-5; H-6
C-5 H-6
C-6 H-5; H-7; H-2
C-7 H-2; H-6
C-8 H-7
C-9 H
2
-6’’; H-7; H-8
C-1’ H-2’; H-7’; H-6’; H
2
-8’
C-2’ H-7’; H-6’
C-3’ H-2’; H-5’
C-4’ H-2’; H-5’; H-6’
C-5’ H-6’
C-6’ H-5’; H-2’; H
2
-7’
CH
2
-7’ H-2’; H-6’; H
2
-8’
CH
2
-8’ H
2
-7’; H-1’’
C-1’’ H
2
-8’; H-2’; H-5’
C-2’’ H-1’’; H-3’’; H-4’’
C-3’’ H-2’’; H-1’’; H-4’’; H-5’’H-1’’’
C-4’’ H-5’’; H
2
-6’’; H-3’’; H-2’’
C-5’’ H-4’’; H
2
-6’’; H-1’’; H-3’’
CH
2
-6’’ H-5’’
C-1’’’ H-3’’’; H-2’’’; H-5’’’; H-3’’’
C-2’’’ H-1’’’; H-3’’’; H-4’’’
C-3’’’ H-2’’’; H-1’’’; H-4’’’; H-5’’’
C-4’’’ H-3’’’; H-2’’’; H-5’’’; H
2
-6’’’
C-5’’’ H
2
-6’’’; H-1’’’; H-4’’’; H-3’’’
CH
3
-6’’’ H-5’’’; H-4’’’
Tabela 32: Correlações encontradas no espectro HMBC de LaA1FVC144-148-5
O conjunto de dados obtidos, associados com aqueles descritos na literatura,
permitiram identificar a substância codificada como LaA1FVC144-148-5 como o
derivado fenilpropanóide “β-(3’,4’-diidroxifenil)etil-O-α-L-rhamnopiranosil(1→3)-β-D-
(6’’-O-cafeoil)-glicopiranosídeo” (isoverbascosídeo ou isoacteosídeo)
167
Figura 119: Espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 500MHz) da substância isolada
isoverbascosídeo
Figura 120: Ampliação 1 do espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
168
Figura 121: Ampliação 2 do espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
Figura 122: Ampliação 3 do espectro de RMN
1
H (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
169
Figura 123: Espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da substância isolada
isoverbascosídeo
Figura 124: Ampliação 1 do espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
170
Figura 125: Ampliação 2 do espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
Figura 126: Ampliação 3 do espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
171
Figura 127: Ampliação 4 do espectro de RMN
13
C (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
Figura 128: Espectro de COSY (CD
3
OD, 500MHz) da substância isolada
isoverbascosídeo
172
Figura 129: Ampliação 1 do espectro de COSY (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
Figura 130: Ampliação 2 do espectro de COSY (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
173
Figura 131: Espectro de HMQC (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
Figura 132: Ampliação 1 do espectro de HMQC (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
174
Figura 133: Ampliação 2 do espectro de HMQC (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
Figura 134: Ampliação 3 do espectro de HMQC (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
175
Figura 135: Espectro de HMBC (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
Figura 136: Ampliação 1 do espectro de HMBC (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
176
Figura 137: Ampliação 2 do espectro de HMBC (CD
3
OD, 500MHz) da substância
isolada isoverbascosídeo
Figura 138: Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância isolada
isoverbascosídeo
177
4.2.4.2.3. Ácido Rosmarínico
O
O
O
OH
H
OH
OH
OH
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9'
Ácido Rosmarínico
A substância codificada “MoAF FAQ p/p maj” foi isolada do macerado em
etanol-água 70% das folhas frescas de Melissa officinalis, coletadas no mês de agosto,
na estação do inverno de 1998, em canteiros experimentais do Laboratório de Matéria-
Prima Vegetal de Farmanguinhos (FIOCRUZ) localizado no bairro de Jacarepaguá (Rio
de Janeiro).
O material, sob a forma de um sólido branco-amarelado, foi analisado por CCD-
Si e CCD-Si-C18. Após eluição com AcOEt:AcOH:HCOOH:H
2
O (10:1,1:1,1:2,7) e
acetonitrila:água (1:3), respectivamente e revelação com NP-PEG sob fonte de radiação
ultravioleta (365 nm), observou-se nos dois sistemas cromatográficos uma mancha
azulada que não era característica para um constituinte de natureza flavonóide.
A análise do espectro de RMN
1
H (figura 139, p. 179) em DMSO-d
6
e
comparação dos dados obtidos com os da literatura para o ácido rosmarínico (KHUNT
et al., 1994; EXARCHOU et al., 2001) levou as seguintes observações em relação a
estrutura química da substância:
•Presença de dois sistemas “ABX” característicos de hidrogênios aromáticos, um
deles pertencente a um radical de ácido caféico e o outro ao de um radical aromático
contendo a cadeia lateral saturada.
•O sinal simples a 7,02 ppm foi atribuído ao hidrogênio H-2 (1H, sl) pertencente
ao radical do ácido caféico. Os sinais duplos a 6,76 ppm (1H, d, J = 8,5 Hz) e a 6,98
ppm (1H, d, J = 8,5 Hz) foram relacionados respectivamente aos hidrogênios H-5 e H-6
do anel aromático do radical do ácido caféico. Os sinais a 7,42 ppm (1H, d, J = 16,0 Hz)
e a 6,24 ppm (1H, d, J = 16,0 Hz) foram atribuídos aos hidrogênios da cadeia lateral
insaturada, respectivamente, H-7 e H-8.
•Os sinais relativos ao outro sistema aromático foram atribuídos em 6,67 ppm
(1H, sl); 6,62 ppm (1H, J = 8,0 Hz) e 6,52 ppm (1H, d, J = 8,0 Hz) correspondente aos
hidrogênios H-2’, H-5’ e H-6’, nesta ordem. Os hidrogênios do grupo metilênico da
cadeia lateral saturada, H
2
-7’, ficaram parcialmente encobertos pelo sinal do solvente.
Por sua vez o sinal a 4,95 ppm (1H, sl) foi relacionado ao hidrogênio H-8’, vizinho ao
grupo carboxila.
178
O espectro de massas [ESI, íons negativos] (figura 142, p. 180) apresentou o íon
de m/z = 360, compatível com a fórmula molecular (C
18
H
16
O
8
) correspondente ao íon
molecular (M) menos 1 hidrogênio (M-1).
H δ (ppm) ácido
rosmarínico
Literatura (CD
3
OD)
(EXARCHOU et al.
2001)
MoAF FAQ p/p maj
2 7,02 7,02 (sl)
5 6,76 6,76 (d, J = 8,5 Hz)
6 6,94 6,98 (d, J = 8,5 Hz)
7 7,53 7,42 (d, J = 16,0 Hz)
8 6,24 6,24 (d, J = 16,0 Hz)
2’ 6,67 (sl)
5’ 6,62 (d, J = 8,0 Hz)
6’ 6,52 (d, J = 8,0 Hz)
8’ 5,12 4,95 (sl)
Tabela 33: Comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN
1
H
em DMSO-d
6
obtidos para “MoAF FAQ p/p maj”
e os encontrados na literatura.
179
Figura 139: Espectro de RMN
1
H (DMSO-D
6
, 500MHz) da substância isolada
Ácido rosmarínico
Figura 140: Ampliação 1 do espectro de RMN
1
H (DMSO-D
6
, 500MHz) da substância
isolada Ácido rosmarínico
180
Figura 141: Ampliação 2 do espectro de RMN
1
H (DMSO-D
6
, 500MHz) da substância
isolada Ácido rosmarínico
Figura 142: Espectro de massas (ESI íons negativos) da substância isolada Ácido
rosmarínico
181
181
5 - CONCLUSÕES
Os perfis cromatográficos por CG/EM relativos aos óleos essenciais permitiram
determinar a origem específica de cada um deles. Os isômeros geranial e neral foram os
principais constituintes dos óleos de Cymbopogon citratus, Lippia alba (quimiotipo
citral) e Melissa officinalis. O critério usado para as suas diferenciações baseou-se nas
proporções relativas dos dois isômeros: aproximadamente iguais em C. citratus;
proporções também não muito diferentes no quimiotipo citral de L. alba, porém com
valores absolutos inferiores (quase a metade) aos encontrados em C. citratus. Os valores
obtidos no óleo de M. officinalis mostraram uma grande diferença entre os respectivos
isômeros: maiores teores para o geranial (próximos aos encontrados em C. citratus),
menores para o neral (bem inferiores aos de C. citratus). Adicionalmente, os teores
encontrados para o trans-cariofileno foram menores que os do quimiotipo citral de L.
alba.
A identificação dos óleos essenciais dos dois outros quimiotipos de L. alba,
baseou-se nos principais constituintes de cada um (linalol e carvona) os quais definiram
as respectivas origens específicas.
Entre os três quimiotipos, também devem ser levados em consideração os
maiores teores de limoneno (quimiotipo carvona), β-mirceno (quimiotipo citral) e 1,8-
cineol (quimiotipo linalol).
Foram observadas, nos perfis cromatográficos obtidos por CLAE/DAD,
variações significativas das substâncias fenólicas (flavonóides e fenilpropanóides) nos
extratos polares de C. citratus e L. alba, levando-se em consideração três critérios de
análise: os diferentes métodos de extração, as coletas efetuadas e a secagem prévia das
folhas.
No caso de C. citratus:
Quanto aos métodos de extração.
1 – os flavonóides foram mais facilmente extraídos pela solução hidroalcoólica, tanto
nas folhas frescas quanto nas secas. (exceção feita para o macerado da primeira coleta
de folhas secas).
2 – os fenilpropanóides foram melhor extraídos pelas soluções aquosas (decocção e
infusão), tanto nas folhas frescas quanto nas secas.
182
Quanto às coletas efetuadas.
1 – na 1º coleta (janeiro) o teor de flavonóides foi inferior àquele encontrado na 2º
(junho), tanto nas folhas frescas quanto nas secas.
2 – na 1º coleta (janeiro) o teor de fenilpropanóides foi superior àquele encontrado na 2º
coleta (exceção feita para o macerado das folhas frescas).
Quanto a secagem das folhas.
1 – os teores de flavonóides (em área % total) variaram em função do tipo de extração
realizada, entretanto considerando-se a média do somatório dos valores encontrados
para os três extratos nas folhas secas (18,23%) e frescas (17,17%) observou-se um
pequeno aumento no teor destas substâncias nas folhas desidratadas.
2 – os teores de fenilpropanóides foram mais elevados nas folhas secas (23,06%) que
nas frescas (14,41%), utilizando-se a mesma metodologia anterior.
Para o quimiotipo linalol de L. alba:
Quanto aos métodos de extração.
1 – os flavonóides foram melhor extraídos pela solução hidroalcoólica das folhas frescas
obtidas nas três primeiras coletas. Na 4º coleta ocorreu um ligeiro declínio no teor de
flavonóides do macerado em relação às soluções aquosas empregadas nos demais
extratos. Para as folhas secas, os flavonóides foram melhor extraídos pela solução
hidroalcoólica na 1º e 4º coleta.
2 – os fenilpropanóides foram extraídos em maior quantidade pelas soluções aquosas
obtidas das folhas frescas. Por outro lado, os resultados encontrados para as folhas secas
indicaram que estes constituintes foram bem extraídos quer nas soluções aquosas quanto
nas hidroalcoólicas, considerando-se os valores resultantes da 2º e 3º coleta. Na 1º e
última coleta, respectivamente, os sinais com absorções características de flavonóides
não foram encontrados tanto no infuso quanto no macerado.
Quanto ao número de coletas.
1- a área % total de flavonóides e fenilpropanóides variou ao longo das coletas em
função do método extrativo. Não obstante, considerando-se a média do somatório dos
valores encontrados para os três extratos obtidos, pudemos verificar que o valor da área
% total de flavonóides manteve-se estável na 1º (44,57%) e 2º coleta (44,14%).
Posteriormente decresceu na 3º coleta (37,81%) e subiu significativamente na 4º coleta
(71,38%). A área % total para os fenilpropanóides na 1º coleta (39,33%) foi inferior
183
àquela encontrada para os flavonóides; em seguida aumentou na 2º coleta (47,38%),
superando levemente o valor encontrado para os flavonóides. Na 3º coleta observou-se
um crescimento no teor para 54,23%, bem superior àquele atribuído aos flavonóides. Na
última coleta, ocorreu uma diminuição acentuada (15,03%), em contraste ao valor
elevado encontrado para os flavonóides.
Quanto à secagem das folhas.
Igualmente os teores de flavonóides e fenilpropanóides variaram em função do tipo de
extração realizada, tanto nas folhas frescas quanto nas secas, entretanto observou-se
uma estabilidade nos teores destes derivados fenólicos quando considerada a média do
somatório dos valores das áreas % totais relativas aos três métodos extrativos. Os
valores encontrados para os flavonóides foram 49,35% e 49,60%, respectivamente para
as folhas frescas e secas, enquanto os fenilpropanóides apresentaram valores de 38,48%
e 39,51%, respectivamente, antes e após a secagem das folhas.
Os constituintes isolados das folhas das ervas cidreiras cultivadas (isoorientina,
verbascosídeo e ácido rosmarínico), utilizados respectivamente em C. citratus, L. alba e
M. officinalis como substâncias de referência, permitiram a distinção entre os infusos e
macerados das espécies estudadas por meio dos seus perfis cromatográficos por
CLAE/DAD.
A respeito das análises morfológicas ficou evidente que os parâmetros mais
importantes para a distinção entre as ervas cidreiras estudadas foram os tricomas
tectores presentes nas três espécies: poucos e curtos, unicelulares, na forma de pequenas
papilas, em C. citratus; predominantemente longos, numerosos, unicelulares, nos três
quimiotipos de L. alba e curtos, cônicos, unicelulares, numerosos em M. officinalis,
espécie vegetal onde também foram observados tricomas longos, pluricelulares,
caducos, que não foram facilmente encontrados no material seco ou pulverizado.
Os resultados apresentados estão relacionados aos exemplares cultivados em
nossos canteiros experimentais localizados no bairro de Jacarepaguá, na cidade do Rio
de Janeiro. Análises adicionais devem ser realizadas com exemplares cultivados em
outras regiões geográficas do país, bem como com espécimes espontâneos para que seja
possível a abrangência dos resultados obtidos neste trabalho.
184
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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