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ANDREZA OLIVEIRA DOS SANTOS
RELAÇÃO ENTRE OS TÍTULOS DE ANTICORPOS ANTI LDLox E MARCADORES
DO RISCO CARDIOVASCULAR
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina para
Obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde
São Paulo
2008
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2
Andreza Oliveira dos Santos
RELAÇÃO ENTRE OS TÍTULOS DE ANTICORPOS ANTI LDLox E MARCADORES
DO RISCO CARDIOVASCULAR
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina para
Obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde
São Paulo
2008
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3
Andreza Oliveira dos Santos
RELAÇÃO ENTRE OS TÍTULOS DE ANTICORPOS ANTI LDLox E MARCADORES
DO RISCO CARDIOVASCULAR
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo para Obtenção do título de Mestre
em Ciências da Saúde
Orientadora: Prof. Dra Maria Cristina de Oliveira Izar
Co-Orientador: Prof. Dr. Francisco Antônio Helfenstein Fonseca
São Paulo
2008
4
Santos, Andreza Oliveira dos
Relação entre os títulos de anticorpos anti LDLox e marcadores do risco
cardiovascular/ Andreza Oliveira dos Santos. -- São Paulo, 2008.
xvii, 48f
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Cardiologia.
Título em inglês: Relationship between titers of anti-oxLDL and markers of
cardiovascular risk.
1. Doença arterial coronariana. 2. LDL oxidada.3. Anticorpos anti LDL oxidada.
4. HDL oxidada
5
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Prof. Angelo Amato Vincenzo de Paola
Coordenador do Programa de Pós-Graduação: Valdir Ambrósio Moisés
6
Andreza Oliveira dos Santos
RELAÇÃO ENTRE OS TÍTULOS DE ANTICORPOS ANTI LDLox E MARCADORES
DO RISCO CARDIOVASCULAR
Presidente da banca:
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr._____________________________________________________
Prof. Dr._____________________________________________________
Prof Dr.______________________________________________________
7
Dedicatória
À Maria Odete, Edson José e
Fabinho
8
Agradecimentos
Agradeço, primeiramente a Deus por todas as obras e oportunidades.
Aos meus pais, Edson José e Maria Odete e meu irmão Fábio por todo o incentivo, pela
torcida e por serem meu porto seguro nas horas mais difíceis.
Agradeço a minha querida orientadora Prof Maria Cristina de Oliveira Izar pela amizade,
confiança nestes anos, pela orientação nesta dissertação, pelo incentivo e apoio.
Ao Prof. Francisco Antônio Helfenstein Fonseca pela oportunidade, incentivo e
orientação, mas principalmente pelo exemplo.
A grande amiga Simone Cristina Pinto Matheus Fischer pela companhia, apoio, pelas
broncas e essencial ajuda ensaios laboratoriais.
A Ana Maria Máximo Cardoso e Cristina Biava pela dedicação e carinho com os
pacientes participantes desta e pela prontidão em me ajudarem sempre.
Aos amigos Carlos Manoel Monteiro e Sergio Bueno Brandão por permitirem e
compartilharem comigo os dados de suas teses.
9
Aos amigos do Setor de Lípides e Hipertensão: Darce Costa, Thereza Monteiro, Mônica
Rizzo, Altamira, Edson Bibiano, Dr Rui Povoa e Dra Thereza Bombig pelo apoio e
carinho em todos esses anos.
Aos amigos do Laboratório de Imunologia da USP: Prof Magnus Gidlund, Andrea
Monteiro, Eduardo Ramos, Gabriela Tonini e Silvana Silva que foram de grande ajuda
nas dosagens dos anticorpos.
Aos amigos Camila Regina, Alberto Andrade, André Inocêncio, Jonathas Tinti, Daniel
Castilho, Dra Marjorie Colombini, Najla Chehade, Ruth Mizuta, Izolete Baptista, Ananias
Silva e Bianca Dantas, por todas as risadas, compreensão e colaboração para a
realização desta.
Ao meu querido Bruno, por todo carinho, atenção e paciência.
10
Esta dissertação foi realizada com auxilio financeiro da CAPES – Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CNPq e Fapesp.
11
Sumário
Dedicatória.........................................................................................................................v
Agradecimentos................................................................................................................vi
Lista de figuras..................................................................................................................x
Lista de tabelas.................................................................................................................xi
Lista de abreviaturas.......................................................................................................xii
Resumo...........................................................................................................................xiv
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................................1
2 OBJETIVO....................................................................................................................14
3 MÉTODOS...................................................................................................................15
3.1 Casuística.......................................................................................................15
3.2 Análises Laboratoriais....................................................................................17
3.2.1 Dosagens Bioquímicas.....................................................................17
3.2.2 Avaliação do estresse oxidativo no plasma......................................17
3.3 Anticorpos Anti LDLox....................................................................................18
3.4 Análise Estatística..........................................................................................19
4 RESULTADOS.............................................................................................................21
5 DISCUSSÃO................................................................................................................34
6 CONCLUSÃO...............................................................................................................41
7 REFERÊNCIAS............................................................................................................42
12
Lista de Figuras
Figura 1. Box plot para idade nos dois grupos................................................................22
Figura 2. Box plot para valores de IMC e CA nos dois grupos........................................22
Figura 3. Box plot para valores de PAS e PAD nos dois grupos.....................................23
Figura 4. Box plot para valores de perfil lipídico nos dois grupos...................................25
Figura 5. Box plot para valores de glicemia nos dois grupos..........................................26
Figura 6. Box plot para valores de TBARS e anti LDLox nos dois grupos......................27
Figura 7. Box plot para valores PCRus nos dois grupos.................................................27
Figura 8. Box plot para valores de Apo A1 e Apo B nos dois grupos..............................28
Figura 9. Gráfico da correlação entre PCRus e títulos de anti LDLox.............................29
Figura 10. Gráfico da correlação entre glicemia e títulos de anti LDLox.........................29
Figura 11. Gráfico da correlação entre HDL-c e títulos de anti LDLox............................30
Figura 12. Gráfico da correlação entre IMC e títulos de anti LDLox...............................30
Figura 13. Gráfico da correlação entre CA e títulos de anti LDLox.................................31
Figura 14. Gráfico da correlação entre PAS e títulos de anti LDLox...............................31
Figura 15. Gráfico da correlação entre PAD e títulos de anti LDLox...............................32
Figura 16. Gráfico da correlação entre Apo A1 e títulos de anti LDLox..........................32
Figura 17. Gráfico da correlação entre Apo B e títulos de anti LDLox............................33
Figura 18. Mecanismos postulados para explicar o papel dos anticorpos anti-LDLox na
SCA.................................................................................................................................40
13
Lista de Tabelas
Tabela 1. Caracterização das principais espécies reativas de oxigênio formadas in
vivo....................................................................................................................................6
Tabela 2. Distribuição dos indivíduos dos grupos quanto ao sexo, idade, IMC e
CA....................................................................................................................................21
Tabela 3. Valores de pulso, pressão arterial sistólica e diastólica nos grupos...............23
Tabela 4. Valores do perfil lipídico, Apo A1, Apo B e glicose nos grupos.......................24
Tabela 5. Distribuição dos valores de tbars, pcr-as e anti-ldlox nos grupos...................26
Tabela 6. Modelo de regressão linear múltipla para as associações entre os títulos de
anti-LDL ox e demais variáveis metabólicas...................................................................28
14
Lista de abreviaturas
OMS Organização Mundial de Saúde
FR Fator de risco
IDF International Diabetes Federation
WHO World Health Organization
NCEP National Cholesterol Education Panel III
LDL Lipoproteina de baixa densidade
Apo B100 Apolipoproteína B100
Apo E Apolipoproteina E
MM-LDL-OX Lipoproteína de baixa densidade minimamente oxidada
ERO(s) Espécie(s) reativas de Oxigênio
ERN(s) Espécie(s) reativas de Nitrogênio
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo-P
ONOO Peroxido nitrito
•
NO Óxido nítrico
•
NO
2
Dióxido de Nitrogênio
ONOO Ânion peroxidonitrito
HOCL Ácido Hipocloroso
H
2
O
2
Peróxido de Hidrogênio
1
O
2
Oxigênio Singlet
O
3
Ozônio
15
GSH Glutationa reduzida
O
2
Oxigênio
LPO Peroxidação Lipidica
LO• Radical alcoxila
L• Radical alquila
LOO• Radical peroxila
- CH
2
- Grupo metileno
LOOH Hidroperoxido lipidico
LOX-1 Receptor endotelial para lipoproteína de baixa densidade oxidada
KDa Kilodalton
mLDL Lipoproteína de baixa densidade modificada
16
RESUMO
Objetivos: As lipoproteínas oxidadas e os anticorpos anti-LDL oxidada (anti-LDLox)
têm sido detectados no plasma e em lesões ateroscleróticas em humanos. No entanto,
o papel destes autoanticorpos na proteção vascular ou na patogênese das síndromes
coronarianas agudas (SCA) permanece não elucidado. Nós examinamos a relação
entre os títulos de IgG humana anti-LDLox com marcadores de risco para a doença
cardiovascular. Métodos: Títulos de autoanticorpos anti-LDLox foram mensurados em
indivíduos portadores de hipertensão arterial em estágio 1 (n=94), sem outros fatores
de risco, e em indivíduos com síndrome metabólica após recente síndrome coronariana
aguda (n=116). Os autoanticorpos contra a LDL oxidada pelo cobre foram avaliados por
ELISA. Resultados: pacientes com hipertensão arterial apresentaram menor índice de
massa corpórea e circunferência abdominal, maiores níveis de pressão arterial sistólica
e diastólica quando comparados aos portadores de SCA (p<0,001). O HDL-C e a Apo
A1 foram maiores, enquanto os triglicérides e a Apo B foram menores nos pacientes do
grupo hipertensão em estágio 1 (p<0,0001). Os títulos de anticorpos anti-LDLox foram
maiores no grupo hipertensão comparados aos do grupo SCA, e os hipertensos do
primeiro grupo apresentaram níveis de PCR menores do que indivíduos com SCA
(p<0,0001). A análise conjunta de ambos os grupos mostrou, em análise univariada,
significante correlação inversa para a PCR (r=-0,284), IMC (r=-0,256), circumferência
abdominal (r=-0,368), apo B (r=-0,191) e glicemia (r=-0,303) e correlações positivas
entre pressão arterial sistólica e diastólica (r=0,319 e r=0,167, respectivamente), HDL-C
17
e Apo A1 (r=0,224 e r=0,257, respectivamente), com os títulos de anticorpos anti-LDLox
(p<0,02). Regressão linear múltipla mostrou que a PCRas, glicemia e circunferência
abdominal permaneceram independente e negativamente associados com os títulos de
anticorpos anti-LDLox. Conclusões: nossos resultados sugerem que os títulos baixos
de anticorpos circulantes anti-LDLox possam estar associados com maior risco
cardiovascular.
18
ABSTRACT
Objectives: Oxidized lipoproteins and antibodies anti-oxidized LDL (anti-oxLDL) have
been detected in human plasma and in atherosclerotic lesions. However, the role of
these autoantibodies in the maintenance of health or in the pathogenesis of acute
coronary syndromes (ACS) remains unclear. We examined the relationship of human
IgG antibodies anti- ox LDL with cardiovascular disease risk markers. Methods: Titers
of human anti-oxLDL were measured in hypertensive subjects in stage 1 (n=94) without
other risk factors, and in individuals with metabolic syndrome after recent acute coronary
syndrome (n=116). Autoantibodies against copper ion oxidized LDL were measured by
ELISA. Results: Hipertensive patients presented lower BMI, waist circunference, higher
blood pressure levels than those with ACS (p<0.001). HDL-C and Apo A1 were higher,
whereas triglycerides and Apo B were lower in those with hypertension stage 1
(p<0.0001). Anti-oxLDL titers were higher in hypertensive patients compared to those
with acute coronary syndromes, and hypertensive patients presented lower hs-CRP than
those with ACS (p<0.0001). Taken into account both populations, univariate analysis
showed small, but significant inverse correlations between the hs-CRP (r=-0.284), BMI
(r=-0.256), waist circunference (r=-0.368), apo B (r= -0.191), and blood glucose (r= -
0.303) and positive correlations between systolic and diastolic blood pressure (r=0.319
and r=0.167, respectively), HDL-C and Apo A1 (r=0.224 and r=0.257, respectively), with
anti-ox LDL titers (p<0.02). After multiple linear regression, hs-CRP, fasting glycemia
and waist circunference remained independently associated with anti-oxLDL.
19
Conclusions: Our results suggest that low titers of circulating anti-oxLDL antibodies
may be associated with increased cardiovascular risk.
20
1. INTRODUÇÃO
As doenças cardiovasculares (DCV) responsáveis pela maior taxa de
morbidade e mortalidade na maioria dos países têm sido alvo de vários estudos e
despertado interesse especial por atingirem grandes contingentes populacionais, além
de representar elevados custos sociais e econômicos.
Relatórios da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2002 revelam que as
DCV foram responsáveis por cerca de 30% de todas as mortes que ocorreram no
mundo, o que corresponde a quase 15 milhões de óbitos por ano, sendo que a maioria
(9 milhões) é proveniente dos países em desenvolvimento (Brandão, 2000).
A aterosclerose é uma doença da parede arterial que está associada com a
diminuição progressiva da função das células endoteliais (Ross, 1999), acúmulo de
lípides em macrófagos e ativação de células do sistema imune (Frostegard et al, 1999).
A primeira manifestação da doença aterosclerótica pode ser, em um número cada vez
mais crescente de indivíduos, a morte súbita, o infarto do miocárdio, a doença cérebro
vascular, doença aneurismática da aorta ou mesmo insuficiência vascular periférica (IV
Diretriz Brasileira sobre Dislipidemias e Tratamento da Aterosclerose, 2007). Essas
manifestações tendem a acometer o homem na sua etapa mais produtiva para a
humanidade, para sua família e para si mesmo, e vem ocorrendo em idades mais
precoces.
Qualquer traço ou característica mensurável de um indivíduo que possa
predizer a probabilidade deste vir a manifestar uma determinada doença é definido
como fator de risco (FR). De acordo com o National Cholesterol Education Panel III
(NCEP III, 2001) e a IV Diretriz (2007), os fatores de risco clássicos para o
21
desenvolvimento da aterosclerose incluem a hipertensão arterial, altos valores de
colesterol, tabagismo, diabetes melito, obesidade, idade e o sedentarismo. Estes FR
podem induzir a um número de mecanismos que contribuem para a iniciação e
progressão da aterosclerose. Por esta razão, utiliza-se algoritmos de predição de risco
para estratificação do risco individual de um evento coronariano (NCEP III, 2001 e IV
Diretriz, 2007). A IV Diretriz também identifica critérios agravantes, entre eles a
presença de síndrome metabólica. Os portadores desta síndrome apresentam um maior
risco de morte coronariana, cardiovascular e mesmo de mortalidade em geral, quando
comparados aos não portadores da síndrome (Lakka et al, 2002). Existem vários
critérios para definir síndrome metabólica, entre eles o do NCEP III (2001) e o da
International Diabetes Federation (IDF, 2005), este último, assumindo valores de corte
mais rigorosos para a circunferência abdominal e níveis glicêmicos, além de utilizar uma
classificação da circunferência abdominal baseada nas características étnicas e biotipo
das populaçoes específicas. Os valores de corte mais rigorosos foram assumidos na
tentativa de identificar precocemente indivíduos com maior propensão a distúrbios
metabólicos e ao diabetes mellitus tipo 2.
1.1 LDL oxidada e Aterosclerose
Está atualmente bem estabelecido que níveis plasmáticos elevados de
lipoproteína de baixa densidade (LDL) constituem fator de risco capital para o
desenvolvimento da aterosclerose. Essa lipoproteína é a principal transportadora de
colesterol sérico (cerca de 70% circula ligado a ela) e fornecedora desse lipídio para os
tecidos extra-hepáticos, por meio da sua ligação ao receptor de LDL na membrana
22
plasmática. Apresenta, em média, 22 nm de diâmetro, sendo composta de uma parte
central com moléculas de colesterol esterificado (35% da partícula) e de triglicérides
(10%), ao redor da qual há uma capa de colesterol livre, fosfolipídios e
apolipoproteínas. Sua principal apolipoproteína é a Apolipoproteína B 100 (Apo B), mas
também possui traços de Apolipoproteína E (Apo E). Sua meia-vida plasmática é de
cerca de dois a três dias, e seu clareamento ocorre por meio da ligação das
apolipoproteínas com o receptor de LDL, principalmente nos hepatócitos (75%), mas
também em outros tecidos extra-hepáticos (Mahley et al, 2003).
As modificações na LDL vêm sendo estudadas por vários enfoques
metodológicos. Diversas patologias, incluindo infecções, inflamações e doenças
autoimunes são associadas com a modificação da partícula de LDL. Essas
modificações incluem a metilação, acetilação, glicação e a oxidação. A oxidação é um
dos processos de modificação mais estudados e pode ser induzida in vitro por metais
de transição como o cobre e o ferro (Chang et al, 1997).
A hipótese de que a oxidação torna a partícula de LDL mais aterogênica, foi
originalmente proposta por dois grupos vindos de direções completamente diferentes.
Um grupo em Cleveland observou que a LDL em cultura de células podia causar lesão
celular e mostrou que a injúria dependia da modificação oxidativa sobre a LDL (Morel et
al, 1984). Outro grupo da Universidade da Califórnia observou que as LDL nativas não
podiam induzir a formação de células espumosas, demonstrando em culturas de células
que era possível modificar a LDL na camada média da parede vascular para a forma
reconhecida pelos receptores de varredura dos macrófagos e mostrou que este foi o
resultado da modificação oxidativa (Steinbrecher et al, 1984).
In vivo a modificação oxidativa da LDL parece ocorrer em dois estágios. O
23
primeiro, antes que os monócitos sejam ativados, resulta na oxidação dos lípides da
LDL, com pequena alteração na Apo B (LDL minimamente oxidada ou MM-LDL-OX). O
segundo começa quando os monócitos são ativados e convertidos em macrófagos, que
contribuem com sua grande capacidade oxidativa. Nesse estágio, os lípides da LDL são
adicionalmente oxidados e a fração protéica (Apo B) também o é. Essas LDL altamente
oxidadas (LDLox) deixam de ser reconhecidas pelos receptores clássicos de LDL,
porém são reconhecidas pelos receptores de LDL acetilados (removedores) e/ou
receptores da LDL oxidada, que não são regulados pelo conteúdo celular de colesterol
(Sparrow et al, 1989).
Recentes estudos têm dado importância ao delineamento do mecanismo
pelo qual a LDL nativa pode ser convertida à forma reconhecida pela família de fatores
de crescimento e receptores de varredura (scavangers), assim levando à formação de
células espumosas (Esterbauer et al, 1992).
A oxidação nos lipídeos presentes na LDL gera uma grande quantidade de
subprodutos como aldeídos que são capazes de reagir com resíduos de lisina
presentes na apo B atacando a partícula, contribuindo para a formação da LDL
aterogênica.
Espécies reativas de Oxigênio (ERO) e Nitrogênio (ERN) são os principais
mediadores da modificação oxidativa da partícula. A modificação oxidativa da LDL
induz o aparecimento de epítopos imunogênicos na molécula de LDL e a presença de
anticorpos contra a LDL oxidada tem sido encontrada no soro humano (Paramus,
1990).
A terminologia espécies reativas de Oxigênio (EROs) inclui as espécies
radicais livres e outras que, embora não possuam elétrons livres, são muito reativas
24
devido à sua instabilidade. Por esta razão, esse termo tem sido mais utilizado.
Radical livre é definido como qualquer átomo, molécula ou íon que possui
um ou mais elétrons desemparelhados nas suas camadas de valência. Esses elétrons
desemparelhados ou livres têm uma instabilidade química muito grande, e sendo assim,
mesmo com uma meia vida de frações de segundos, são altamente reativos e capazes
de reagir com qualquer composto que esteja próximo, a fim de “roubar” desse
composto, seja ele uma molécula, uma célula, ou tecido, o elétron necessário para sua
estabilização, produzindo reações em cadeia de dano celular (Halliwell & Gutteridge,
1989). Esta definição engloba o átomo de Hidrogênio (que possui um elétron
desemparelhado), a maioria dos íons de metais de transição e o oxigênio molecular.
Os radicais livres de oxigênio são formados em ambientes de re-
oxigenação vindos da cadeia respiratória mitocondrial. As células também produzem
radicais livres de oxigênio por outras fontes: enzimas oxidantes (aldeído oxidase, flavina
desidrogenase, ciclooxigenase, NADPH oxidase e sistema citocromo P450 oxidase);
auto-oxidação de pequenas moléculas (catecolaminas, flavinas e hidroquinonas); e
sistema de carregadores de elétrons microssomais e das membranas nucleares, entre
outras (Yu, 1994).
Os radicais livres incluem todos os radicais do oxigênio. Há também as
espécies reativas de Nitrogênio (ERN) onde estão inclusos o peroxinitrito (ONOO
-
), o
oxido nítrico (
•
NO) e o radical dióxido de nitrogênio (
•
NO
2
). Embora não sejam radicais
livres, o ânion peroxinitrito (ONOO
-
), o ácido hipocloroso (HOCL), o peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
), o oxigênio singlet (
1
O
2
) e o ozônio (O
3
), podem induzir reações
radicalares no organismo, sendo por isso também considerados como espécies
reativas (Porter, 1984).
25
Tabela 1. CARACTERIZAÇÃO DAS PRINCIPAIS ESPÉCIES REATIVAS DE
OXIGÊNIO FORMADAS IN VIVO.
Intermediário Sítios de Formação Comentários
Radical Superoxido Reações de autoxidação
envolvendo flavoproteínas e
ciclos redox
Formado a partir da
redução parcial do oxigênio
molecular por um eletron.
Decomposição enzimática
na velocidade aproximada
de 5x10
5
M
-1
sec
-1
em pH
7,0.
Peróxido de Hidrogênio Vias catalisadas por
oxidases, e pela superoxido
dismutase
Formado a partir da
redução parcial do oxigênio
molecular por dois elétrons.
Decomposição enzimática
Radical Hidroxil Locais adjacentes à
formação de ânios
superoxido/peróxido de
hidrogênio na presença de
metais, principalmente ferro;
produto da reação de oxido
nítrico com o radical
superóxido. Meia-vida de
10
-9
segundos
Formado a partir da
redução do oxigênio
molecular, por três elétrons
nas Reações de Fenton e
Haber-Weiss, catalisada
por metais.
Radical alcoxil Intermediário na
peroxidação de lipídeos de
membrana.
Radical orgânico centrado
no oxigênio. Meia-vida de
10
-6
segundos
Radical peroxil Intermediário na
peroxidação de lipídeos de
membrana.
Formado a partir de
hidroperoxidos orgânicos.
Meia-vida de 7 segundos
Para se protegerem contra oxidações os organismos dispõem de
mecanismos químicos e enzimáticos. No primeiro caso, várias moléculas com
propriedades antioxidantes consumidas na dieta como o α-tocoferol (vitamina E), β-
caroteno, selênio, ácido ascórbico (vitamina C), glutationa reduzida (GSH) diminuem a
ação tóxica das EROs produzidas nos compartimentos intra- e extracelulares. No
segundo caso, quando são expostos às EROs os organismos sintetizam proteínas
26
antioxidantes como as superóxido dismutases, catalase e glutationa peroxidase para
decomporem respectivamente o ânion O2-, H2O2 e lipoperóxidos (Yu,1994). Apesar de
essas defesas antioxidantes reduzirem os riscos de lesões oxidativas por EROs, os
organismos podem vivenciar situações onde a proteção é insuficiente. Quando isso
acontece, ocorre estresse oxidativo. Algumas situações geradoras de estresse oxidativo
incluem: ativação de fagócitos (neutrófilos, macrófagos, monócitos e eosinófilos) por
micro-organismos, hiperóxia, alguns xenobióticos, radiação ionizante, isquemia e
exercício físico extenuante (Benzi, 1993). Além de os fagócitos produzirem grandes
quantidades de EROs quando são ativados, outras células como os fibroblastos,
linfócitos B e células endoteliais também liberam O2- e H2O2. As EROs produzidas por
estas células quando ativadas por microrganismos patogênicos atuam como
bactericidas sendo, portanto, um importante meio de proteção orgânica contra o
desenvolvimento de infecções oportunistas. Portanto, a manutenção das defesas
antioxidantes químicas e enzimáticas em equilíbrio dinâmico com a formação de EROs
no organismo é fundamental para a sua sobrevivência.
Normalmente existe um balanço entre a produção de radicais livres e sua
destruição por defesas antioxidantes. Estresse oxidativo é o desequilíbrio entre a
formação e a destruição de radicais livres. Ele pode ser causado pela diminuição de
defesas antioxidantes, pelo aumento de produção de radicais livres ou pelo aumento de
disponibilidade de metais de transição. Como conseqüência ocorrem danos às
biomoléculas como o DNA, os lipídios, as proteínas e os carboidratos.
O estresse oxidativo é considerado um evento celular importante em muitos
processos patológicos, sendo a hipótese oxidativa uma das mais atraentes, na área da
medicina, para explicar mecanismos moleculares de algumas doenças.
27
Hipótese oxidativa de doenças é um termo que deve ser entendido como a
ocorrência da condição oxidativa na célula durante o processo patológico e não
exclusivamente a existência do estresse oxidativo como etiologia da doença.
A associação do estresse oxidativo em várias condições patológicas é uma
realidade. A questão é a compreensão se ele é a causa ou a conseqüência da perda da
homeostase celular.
Um dos alvos susceptíveis de oxidação por EROs são os ácidos graxos
poliinsaturados, presentes nas membranas celulares. Esse fenômeno é conhecido
como peroxidação lipídica ou lipoperoxidação (LPO) que consiste em uma cascata de
eventos bioquímicos resultante da ação dos radicais livres sobre os lipídeos insaturados
das membranas celulares, gerando radicais alcoxila (LO•), alquila (L•) e peroxila
(LOO•), levando à destruição de sua estrutura, falência dos mecanismos de troca de
metabólitos e, numa condição extrema, à morte celular. As reações de peroxidação de
lipídios são as mais exploradas no campo da biologia (Benzie, 1996).
Uma característica das reações de peroxidação lipidica é a ocorrência de
reações em cadeia as quais, se não terminadas, ocorrem continuamente, destroem
fases lipídicas, alterando especialmente as membranas e modificam partículas de
lipoproteínas. Além das modificações, os produtos de quebra da peroxidação lipídica
são considerados tóxicos as células e podem alterar proteínas, criando regiões de
epítopos, que desencadeiam respostas imunológicas.
O processo da LPO dividide-se em iniciação, propagação e terminação. A
fase de iniciação é onde o ácido graxo poliinsaturado sofre ataque de uma espécie que
é suficientemente reativa para abstrair um átomo de hidrogênio a partir de um grupo
metileno (-CH2-), formando um radical de carbono. Este radical é estabilizado por um
28
rearranjo molecular formando um dieno conjugado, ou seja, duas duplas ligações
intercaladas por uma ligação simples. Em meio aeróbio, o radical alquila, inicialmente
formado, se combina com o oxigênio, dando origem ao radical peroxila, o qual pode
abstrair um hidrogênio de um outro ácido graxo, gerando outro radical de carbono e
promovendo a etapa de propagação.
A reação do radical peroxila com o átomo de hidrogênio abstraído gera um
hidroperóxido lipídico (LOOH). Quando o radical peroxila reage com uma dupla ligação
na mesma cadeia de ácido graxo, peróxidos cíclicos também podem ser formados, o
que também pode propagar a LPO (Halliwell and Gutteridge, 1999).
Íons de metais de transição, como ferro e cobre , podem participar do
processo catalisando a formação de radicais lipídicos alcoxila, peroxila e hidroxila a
partir dos hidroperóxidos.
A fase de terminação se dá pela aniquilação dos radicais formados
originando produtos não radicalares. Os radicais peroxila e alcoxila também podem
sofrer dismutação ou clivagem β formando aldeídos. Podem formar também uma
ligação covalente com resíduos de aminoácidos ou podem sofrer um rearranjo
formando produtos secundários da LPO (derivados hidroxi-, ceto-, cetohidroxi- e epoxi-
hidroxi-ácido graxo).
Presume-se que a peroxidação lipídica se inicie nos ácidos graxos
poliinsaturados dos fosfolípides da superficie de LDL e, a seguir, se propague aos
lípides do núcleo (core), resultando em modificações oxidativas tanto dos ácidos graxos
poliinsaturados, como do colesterol e fosfolípides e, finalmente, modificação e
degradação da ApoB (Steimbrecher , 1990).
29
A LDL oxidada apresenta características pró-aterogenicas, o que despertou
grande interesse sobre sua existência in vivo. Identificou-se a presença de LDL oxidada
(LDLox) em placas ateroscleróticas tanto em modelos animais como em humanos (Yla-
Herttuala et al, 1989).
A partícula de LDL oxidada possui características diferentes da LDL nativa
(LDLn): a LDL oxidada possui aumento da carga negativa; menor captação pelo
receptor da LDLn; atividade quimiotática para monócitos circulantes e inibitória para a
migração de macrófagos da parede arterial para a circulação; citoxicidade aumentada;
conteúdo aumentado de lisolecitina, óxidos de colesterol e hidroperoxidos lipídicos;
conteúdo diminuído de ácidos graxos poliinsaturados, como conseqüência da oxidação
de seus lipídeos; aumento da densidade e fragmentação da ApoB100 (Steinberg et al,
1989).
Uma das formas de avaliação no plasma da lipoperoxidação consiste na
determinação do malondialdeído (MDA) realizado pelo TBARS (Substâncias Reativas
ao Ácido Tiobarbitúrico).
O malondialdeído (MDA) é um dialdeído formado como um produto
secundário durante a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados por cisão β dos ácidos
graxos poliinsaturados (AGPI) peroxidados, principalmente o ácido araquidônico. É
volátil, possui baixo peso molecular (C3H4O2, P.M.=72,07), tem uma cadeia curta 1,3-
dicarbonil e é um ácido moderadamente fraco (pKa= 4,46). Em condições apropriadas
de incubação (meio ácido e aquecimento), reage eficientemente com uma variedade de
agentes nucleofílicos para produzir cromógenos com alta abortividade molar no
espectro visível (Benzie, 1996).
30
O MDA é utilizado como marcador bioquímico da peroxidação de lipídeos em
sistemas in vivo e in vitro. A sua condensação com o ácido tiobarbitúrico forma
produtos, que podem ser determinados por absorção no comprimento de onda visível
(535nm). Essa reação consiste na formação de um cromógeno róseo resultante da
reação do MDA com duas moléculas de ácido tiobarbitúrico sendo chamado de TBARS
(substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico). É uma técnica de mensuração indireta do
MDA utilizada amplamente pela sua simplicidade e baixo custo, porém é um método
inespecífico, mas que fornece informações sobre a extensão da peroxidação lipídica.
1.2 Anticorpos anti-LDLox
Vários estudos evidenciam a participação de mecanismos imunológicos na
modulação da patogênese da aterosclerose. Durante o processo aterosclerótico,
diferentes antígenos, dentre eles LDLox e seus produtos de degradação, desencadeiam
uma resposta inflamatória que resulta na ativação de diversos genes em células
endoteliais, células musculares lisas, monócitos/macrófagos, células B e T. Estes
eventos podem induzir o aumento ou diminuição de moléculas de adesão e co-
estimulatórias na secreção de citocinas, da expressão de receptores, na diferenciação
celular entre outras propriedades consideradas alvos em potencial para o tratamento e
prevenção da aterosclerose.
Os lípides modificados na superficie da LDL sao biologicamente ativos e
reconhecidos por vários receptores do sistema imune inato. A LDL ox é tambem capaz
de ativar o sistema imune adaptativo. A modificação oxidativa da LDL induz ao
aparecimento de epítopos imunogênicos e anticorpos contra LDL ox (anti LDL ox).
31
Linfócitos T CD4+, também já foram encontrados em placas ateroscleróticas.
Há evidencias que estas células estão envolvidas na secreção de citocinas
antinflamatorias/antiaterogenicas como IL-13 e IL10, funcionando assim na supressão
das células endoteliais e macrófagos (Sherer et al, 2002).
Linfócitos B em lesões ateroscleróticas são raros, porem tem-se
demonstrado que essas células apresentam uma participação importante nos
mecanismos envolvidos em proteção contra o desenvolvimento da aterosclerose. Os
seus subprodutos, os anticorpos, são facilmente encontrados em lesões, onde
predominam as IgGs (Zhou et al 1999).
Anticorpos contra LDLox estao presentes na circulação e seus níveis tem
sido correlacionados positivamente com a doença cardiovascular e suas complicações
(Nilsson, 2004).
A resposta imune humoral contra LDLox tem sido alvo de muitos estudos que
tentam correlacionar modificações oxidativas e seus produtos gerados, com o
desenvolvimento de placas ateroscleróticas. Existe uma grande uma grande dificuldade
neste tipo de estudo devido à variedade de componentes que podem ser gerados e
encontrados (polipeptídeos, peptídeos, lipídeos e formas mistas) durante o processo de
oxidação da partícula da LDL e consequentemente na variedade de anticorpos
potencialmente gerados contra esses produtos.
Estudos clínicos e estudos em modelos animais mostram que autoanticorpos
contra LDLox estão correlacionados com a modulação do processo aterosclerótico,
e/ou com o risco de desenvolvimento de patologias por conseqüência a aterosclerose.
Tendo em vista evidências recentes, tem-se especulado sobre a existência
de diferentes “famílias” de auto-anticorpos contra LDLox, os “pró-aterogênicos” e os
32
“anti-aterogênicos” (Sherer et al, 2002). Neste sentido é possível que os trabalhos
apresentados até hoje na literatura estejam analisando anticorpos com funções
diferentes e em respostas a compostos diferentes, o que de certa forma explicaria os
resultados contraditórios encontrados.
Avanços em biologia vascular mostraram que a inflamação desempenha um
papel crucial no desenvolvimento da doença cardiovascular. Estudos avaliando a
proteína C-reativa ultrassensível (PCR-as) demonstraram que esse marcador
inflamatório prediz o risco cardiovascular independentemente de fatores de risco
tradicionais e adiciona informação prognóstica à estratificação de risco e prediz o risco
cardiovascular de longo prazo em indivíduos sem evidência de doença cardiovascular
(Ridker, 2004). Níveis elevados de PCR-as e de LDLox podem indicar situação de alto
risco para aterosclerose acelerada (Tsimikas, 2006).
Dessa forma, cenários clínicos em que haja dano oxidativo, como na
presença de fatores de risco, em pacientes com alto risco de eventos cardiovasculares,
ou aqueles na vigência de uma síndrome coronariana aguda, o papel da LDL oxidada e
da resposta imune inata, com a produção de anticorpos anti-LDL oxidada pode ter
influência nas respostas da parede arterial e conseqüentemente na aterogênese e suas
complicações.
33
2. OBJETIVOS
Avaliar o papel dos auto-anticorpos anti-LDLox em diferentes cenários
clínicos e correlacioná-los com marcadores do risco cardiovascular.
Objetivos específicos:
Descrever o comportamento dos títulos de auto-anticorpos anti-LDLox em
duas populações de pacientes, sendo uma de indivíduos hipertensos recém
diagnosticados e em prevenção primária da doença cardiovascular e em pacientes de
alto risco, em prevenção secundária.
Correlacionar os títulos de auto-anticorpos anti-LDLox com variáveis clínicas
e laboratoriais.
Verificar as variáveis associadas aos títulos de auto-anticorpos anti-LDLox.
34
3. MÉTODOS
3.1 Casuística
Foram avaliados prospectivamente 116 pacientes de ambos os sexos que
apresentaram uma Síndrome Coronariana Aguda (SCA) com três ou mais critérios para
Síndrome Metabólica, baseados na NCEP III.
Nesse grupo, os critérios de inclusão foram:
1. Possuírem pelo menos três critérios para SM.
2. Perfil lipídico nas primeiras 24 horas da internação: LDL < 130 mg/dL, HDL
< 40 mg/dL
3. Homens e mulheres com idade entre 30 a 75 anos.
4. Compreensão e concordância em dar o consentimento livre e esclarecido
por escrito.
Os critérios de exclusão foram:
1. Uso de hipolipemiantes nos últimos 30 dias
2. Hipotiroidismo não controlado (TSH > 8,0 µU/mL)
3. Infecção ativa, doenças reumáticas ativas ou distúrbios da hemostasia
hereditários ou secundários à doença hepática ativa
4. Gestantes ou pacientes com programação de cirurgias, incluindo
revascularização miocárdica nas próximas seis semanas ou que tenha ocorrido durante
a internação.
35
Os pacientes elegíveis ao estudo foram encaminhados ao Setor de Lípides,
Aterosclerose e Biologia Vascular, dentro dos três primeiros dias após a alta hospitalar
para avaliação clínica e coleta de sangue para as dosagens laboratoriais.
Nesta visita os pacientes foram esclarecidos sobre todos os detalhes do
estudo e após a obtenção do consentimento informado foram colhidos os dados
demográficos, fatores de risco (NCEP III), realizou-se exame clínico, com dados
antropométricos (peso, estatura e medida da circunferência da cintura), medidas da
pressão arterial sistólica e diastólica (IV Diretriz, 2007; Chobanian, 2003).
Foram colhidas amostras de sangue para os estudos programados (exames
bioquímicos, perfil lipídico, estresse oxidativo e análise de anticorpos anti LDL oxidada)
após jejum de 12 horas.
Foram também avaliados 94 indivíduos com hipertensão arterial em estágio 1
(Chobanian, 2003) recém diagnosticada e sem tratamento medicamentoso no momento
da avaliação. Os pacientes hipertensos que participaram desse estudo não poderiam
apresentar outros fatores de risco, tais como, tabagismo, dislipidemia, diabetes mellitus.
Os demais critérios de exclusão foram semelhantes aos dos pacientes com síndrome
coronariana aguda. Estes assinaram o termo de consentimento informado e
submeteram-se às mesmas análises laboratoriais.
36
3.2 Análises Laboratoriais
3.2.1 Dosagens bioquímicas
a) Exame do perfil lipídico (colesterol total, LDL-c, HDL-c, triglicérides) por
meio da técnica enzimática, colorimétrica, automatizada, em aparelho Ópera (Bayer).
b) Dosagem das apolipoproteínas: Apo AI, Apo B realizada pela técnica
nefelométrica, em aparelho nefelômetro Array 360 da Beckmann.
c) Dosagem da proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) pela técnica de
imunoensaio por nefelometria (nefelômetro R100 analyser da Behringer).
3.2.2 Avaliação do estresse oxidativo do plasma
Foi realizada pela técnica dos TBARS. Esta técnica foi realizada conforme
descrito por Okhawa et al utilizando 2 séries de tubos, com seus respectivos tubos
brancos:
Série A: 1,0 mL de ádico tricloroacético (TCA) 20% + 200 µL de plasma
(sangue total colhido em tubo de EDTA e centrifugado, 10 minutos a 12000 rpm).
Série B: (em duplicata) 1,0 mL de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,86% (em TCA
20%) +200 µL de plasma.
Branco da série A: 1 mL de TCA 20%
Branco da série B: 1 mL de TBA 0,86% (em TCA 20%)
Agitou-se todos os tubos em vórtex e esses tubos foram colocados em
banho-maria a 100ºC durante 20 minutos e resfriada em banho de gelo por mais 20
37
minutos. Agitou-se em vórtex novamente e essas misturas foram transferidas para
tubos de polipropileno de1,5ml (Eppendorf), que foram centrifugados em
microcentrifuga (Centriguge 5415C, Eppendorf) a 8.000 rpm por 4 minutos, obtendo-se
um sobrenadante corado, resultante da reação de malondialdeído e outros subprodutos
liberados na lipoperoxidação. O sobrenadante foi colocado em cubeta de vidro para
leitura a 535 nm em espectofotômetro (Genesys 2, Spectronic).
O cálculo da medida de lipoperoxidação foi feito descontando o valor do
branco respectivo de cada série e subtraindo a absorbância da série de TCA da média
da série de TBA e dividindo pelo coeficiente de extinção molar do malondialdeído
(MDA):
LPO = (média da absorb. B – branco B) – (absorb. A – branco A) / 0,0312
Os resultados foram expressos em nanomoles de MDA por mililitros de
plasma (ηmoles/mL plasma).
3.3 Anticorpo anti LDLox
A técnica para a detecção de anticorpos anti-LDLox foi padronizada no
laboratório do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de São Paulo (ICB-
USP), sob a orientação do Professor Magnus Ake Gidlund. Placas de 96 poços (Costar,
EUA) foram sensibilizadas com 20 µL de LDL humana obtida de um doador saudável, e
oxidada in vitro pelo CuSO4, na concentração de 7,5 µg/ mL em tampão carbonato de
sódio, 0,1 M, pH 9,4, durante 18h, a 4° C. Após 4 ciclos de lavagens com 100 µL de
PBS, as placas foram bloqueadas com solução de gelatina a 3,0% (Gibco, EUA), em
temperatura ambiente, por 24h. Em seqüência, as placas foram lavadas 4 vezes com
PBS e os poços receberam, em triplicata, 20 µL das amostras dos diferentes grupos,
38
diluídas 1:400 em PBS. Após 2 horas de incubação, as placas foram lavadas 4 vezes
com 100 µL de PBS-T e incubadas com 20 µL de conjugado com peroxidase, por 1h,
em temperatura ambiente. Foi utilizado como conjugado IgG de cabra anti-IgG humana
marcada com peroxidase (KLP, EUA) na diluição 1:1000. Após 4 ciclos de lavagem,
com PBS-T, o processo de revelação foi realizado com a adição, em cada poço, de 75
µL de solução de TMB (250 µL de 3,3’5,5’-tetrametilbenzidina 6,5% em DMSO, 12 mL
de tampão citrato 0,1M, pH 5,5) e 10 µL de H2O2. A reação foi interrompida com a
adição de 25 µL de ácido sulfúrico 2M (Merck, Alemanha). Os resultados foram
avaliados por leitura espectrofotométrica em 450 nm em leitor de ELISA Multiskan
MCC/340 (Labsystems, Finlândia). Como as amostras não puderam ser analisadas em
uma única placa, e estas podem diferir quanto à sua sensibilização foi necessária uma
padronização interna. Em cada placa uma solução contendo um padrão interno de IgG
foi adicionada (densidade óptica, DO padrão). A relação entre a DO da amostra e a do
padrão foi calculada e definido o índice da reação (IR), que expressa os resultados (DO
da amostra – DO do branco) / (DO do padrão – DO do branco). Todas as amostras
foram analisadas em triplicata e os valores médios utilizados.
3.4 Análise estatística
Todas as análises foram realizadas utilizando-se o programa SPSS 11.5 for
Windows. As variáveis numéricas são expressas como média ± EPM. As variáveis
categóricas são expressas como número de pacientes e porcentagens. Aquelas
variáveis que não apresentaram distribuição normal (PCR-as, triglicérides, LDL-c, e
antiLDLox) foram logaritmizadas e comparadas por testes paramétricos.
39
A estatística descritiva utilizou teste t de Student para amostras não
relacionadas e qui-quadrado de Pearson. Utilizou-se o coeficiente de Pearson para
avaliar as correlações entre os auto-anticorpos anti-LDLox e as demais variáveis.
Regressão linear múltipla avaliou as variáveis independentemente associadas com os
auto-anticorpos anti-LDLox. Em todas as análises considerou-se o nível de significância
para valores de p<0,05.
40
4. RESULTADOS
As características dos indivíduos estudados, quanto ao sexo, idade, IMC e
circunferência abdominal encontram-se na tabela 2 e nas figuras 1 e 2 A e B.
Tabela 2. DISTRIBUIÇÃO DOS INDIVÍDUOS DOS GRUPOS DE ESTUDO QUANTO
AO SEXO, IDADE, IMC E CA.
Variável HAS
(n=94)
SCA
(n=116)
P
Idade
56±1 56±1 0,860
Sexo masculino (%)
46 (49) 73 (63) ns
IMC (kg/m
2
)
28,6±0,48 30,2±0,5 0,019
CA (cm)
95,6±1,2 104,4±1 <0,0001
HAS=Hipertensão, SCA=síndrome coronariana aguda, IMC=índice de massa corpórea, CA=
circunferência abdominal.
p<0,05, teste t de Student
41
11694N =
GRUPO
SCAHAS
IDADE (anos)
80
70
60
50
40
30
20
139
Figura 1 – Box plot (box 1º e 3º quartis; linha cheia = mediana; barra = maior e menor valores) para idade
nos dois grupos, p = ns, teste t de Student.
A B
11594N =
GRUPO
SCAHAS
IMCV (kg/m2)
50
40
30
20
10
30
11594N =
GRUPO
SCAHAS
CIRCUNFERÊNCIA ABDOMINAL (cm)
160
140
120
100
80
60
40
49
127
141
Figura 2 – Blox plot (box = 1º e 3º quartis; linha cheia = mediana; barra = maior e menor valores) do IMC
(A) e CA (B) para os dois grupos, p<0,05, teste t de Student.
42
A tabela 3 e figura 3 (A e B) representam os valores de pulso, pressão
arterial sistólica e diastólica nos grupos
Tabela 3. VALORES DE PULSO, PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA E DIASTÓLICA
NOS GRUPOS
Variável HAS
(n=94)
SCA
(n=116)
P
PAS (mm Hg) 154±1 132±2 <0,0001
PAD (mm Hg) 93±1 86±1 0,001
Pulso (bpm) 77±1 70±1 <0,0001
PAS=pressão arterial sistólica, PAD= pressão arterial diastólica.
p<0,05, teste t de Student
A B
11594N =
GRUPO
SCAHAS
PRESSÃO SISTÓLICA (mm Hg)
240
220
200
180
160
140
120
100
80
110
7149
116
85
11594N =
GRUPO
SCAHAS
PRESSÃO DIASTÓLICA (mm Hg)
140
120
100
80
60
40
163
139
Figura 3 - Box plot (box = 1º e 3º quartis; linha cheia = mediana; barra = maior e menor valores) para
PAS (A) e PAD (B) nos dois grupos. p<0,05, teste t de Student.
43
A tabela 4 e a figura 4 (A-D) apresentam os valores de Apo A1, Apo B, Col-t,
HDL-c, LDL-c, Triglicérides e Glicose nos dois grupos.
Tabela 4. VALORES DO PERFIL LIPÍDICO, APO A1, APO B E GLICOSE NOS
GRUPOS.
Variável HAS
(n=94)
SCA
(n=116)
P
Apo A1 (mg/dL) 127±3 107±2 <0,0001
Apo B (mg/dL) 98±3 115±3 <0,0001
Colesterol total (mg/dL)
196±4 192±4 0,378
HDL-C (mg/dL)
49±1 40±1 <0,0001
LDL-C (mg/dL)
119±3 116±3 0,579
Triglicérides(mg/dL)
137±8 178±7 <0,0001
Glicose (mg/dL)
92±2 126±4 <0,0001
p<0,05, teste t de Student
44
A B
c
11494N =
GRUPO
SCAHAS
HDL-C (mg/dL)
100
80
60
40
20
0
8038
74
181
D
11193N =
GRUPO
SCAHAS
LDL-C (mg/dL)
300
200
100
0
-100
57
81
133
147
181
197
204
183
11494N =
GRUPO
SCAHAS
TRIGLICÉRIDES (mg/dL)
600
500
400
300
200
100
0
87
90
95
56
27
7
61
191
139
117
195
154
11494N =
GRUPO
SCAHAS
COLESTEROL TOTAL (mg/dL)
400
300
200
100
0
5781
204
183
181
Figura 4 – Box plot (box =1º e 3º quartis; linha cheia = mediana; barra = maior e menor valores) do perfil
lipídico nos dois grupos.
A. Valores de HDL-c (mg/dL), B.Valores de LDL-c (mg/dL), C. Valores de triglicérides (mg/dL), D. Valores
de Colesterol (mg/dL). p<0,05, teste t de Student.
45
11594N =
GRUPO
SCAHAS
GLICEMIA (mg/dL)
400
300
200
100
0
82
105
8
64
7669
57
74
77
46
87
72
33
147
119
190118
117
Figura 5. Box plot (box =1º e 3º quartis; linha cheia = mediana; barra = maior e menor valores) para
glicemia nos dois grupos, p<0,05, teste t de Student.
A tabela 5 e as figuras 6-7 mostram os valores de TBARS, PCR-as e Anti LDLox.
Tabela 5. DISTRIBUIÇÃO DOS VALORES DE TBARS, PCR-as E ANTI-LDLox NOS
GRUPOS
Variável HAS
(n=94)
SCA
(n=116)
P
TBARS (ηmol/mL)
1,55±0,09 1,72±0,07 0,117
PCR-as (mg/L) 0,58±0,04 15,95±1,67 <0,0001
Anti LDLox (OD)
1,85±0,10 0,87±0,04 <0,0001
p<0,05; teste t de Student
46
A B
11590N =
GRUPO
SCAHAS
TBARS (nmol/mL)
6
5
4
3
2
1
0
-1
34
84112
48
100
157
141
11490N =
GRUPO
SCAHAS
anti-LDLox
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
49
48
6
111
7
1
155
203
132
191
Figura 6 – Box plots (box =1º e 3º quartis; linha cheia = mediana; barra = maior e menor valores) dos
valores de TBARS (A), test t de Student, p=0,117 e anticorpos Anti-LDLox (B) nos dois grupos.
test t de Student, p < 0,001.
11594N =
GRUPO
SCAHAS
PCRus (mg/L)
120
100
80
60
40
20
0
-20
15
58
4099
11294
38
69
86
153199
Figura 7 – Box plots (box =1º e 3º quartis; linha cheia = mediana; barra = maior e menor valores) dos
valores de PCR-as nos dois grupos, teste t de Student, p< 0,0001
47
A B
10994N =
GRUPO
SCAHAS
APOLIPOPROTEÍNA A1 (mg/dL)
300
200
100
0
24
91
74
116
38
181
10994N =
GRUPO
SCAHAS
APOLIPOPROTEÍNA B (mg/dL)
300
200
100
0
57
133
204
Figura 8 – Box plot (box =1º e 3º quartis; linha cheia = mediana; barra = maior e menor valores) dos
valores de Apo A1 (A) e Apo B (B) nos dois grupos; teste t de Student, p< 0,0001
Tabela 6 - CORRELAÇÕES ENTRE OS TÍTULOS DE ANTICORPOS ANTI-
LDLOXIDADA E AS DEMAIS VARIÁVEIS
Variável r P
anti-LDLox e PCR-as -0,284 <0,0001
anti-LDLox e glicemia -0,303 0,001
anti-LDLox e HDL-C 0,224 0,001
anti-LDLox e IMC -0,256 <0,0001
anti-LDLox e circunferência
abdominal
-0,368 <0,0001
anti-LDLox e PAS 0,319 <0,0001
anti-LDLox e PAD 0,167 0,017
anti-LDLox e Apo A1 0,257 <0,0001
anti-LDLox e Apo B -0,191 0,007
p<0,05; teste de correlação de Pearson
48
anti-LDLox (DO)
5
4
3
2
1
,5
,4
,3
,2
,1
,05
PCRus (mg/L)
200
100
50
40
30
20
10
5
4
3
2
1
,5
,4
,3
,2
,1
Figura 9 - Gráfico de correlação entre a PCR-as e os títulos de anticorpos anti-LDLox, r=-0,284; p=0,001,
teste de correlação de Pearson. Variáveis plotadas em escala logarítmica.
anti-LDLox (DO)
5
4
3
2
1
,5
,4
,3
,2
,1
,05
GLICEMIA (mg/dL)
400
300
200
100
90
80
70
60
Figura 10 - Gráfico de correlação entre a glicemia e os títulos de anticorpos anti-LDLox, r=-0,303;
p=0,001, teste de correlação de Pearson. Variáveis plotadas em escala logarítmica.
49
anti-LDLox (DO)
6543210
HDL-C (mg/dL)
80
70
60
50
40
30
20
10
Figura 11 - Gráfico de correlação entre HDL-c e os títulos de anticorpos anti-LDLox, r=-0,224; p=0,001,
teste de correlação de Pearson.
anti-LDLox (DO)
5
4
3
2
1
,5
,4
,3
,2
,1
,05
IMC (kg/m2)
50
40
30
20
10
Figura 12 - Gráfico de correlação entre IMC e os títulos de anticorpos anti-LDLox, r=-0,256; p=0,0001,
teste de correlação de Pearson. Variáveis plotadas em escala logarítmica.
50
anti-LDLox (DO)
6543210
CIRCUNFERÊNCIA ABDOMINAL (cm)
140
120
100
80
60
Figura 13 - Gráfico de correlação entre circunferência abdominal (CA) e os títulos de anticorpos anti-
LDLox r=-0,368; p= <0,0001, teste de correlação de Pearson.
anti-LDLox (DO)
6543210
PRESSÃO SISTÓLICA (mm Hg)
300
200
100
90
80
Figura 14 - Gráfico de correlação entre pressão sistólica e os títulos de anticorpos anti-LDLox
r=-0,319; p= <0,001, teste de correlação de Pearson.
51
anti-LDLox (DO)
5
4
3
2
1
,5
,4
,3
,2
,1
,05
PRESSÃO DIASTÓLICA (mm Hg)
200
100
90
80
70
60
50
Figura 15 - Gráfico de correlação entre pressão arerial diastólica e títulos de anticorpos anti-LDLox r=-
0,167; p=0,0001, teste de correlação de Pearson. Variáveis plotadas em escala logarítmica.
anti-LDLox (DO)
5
4
3
2
1
,5
,4
,3
,2
,1
,05
APOLIPOPROTEÍNA A1 (mg/dL)
200
100
90
80
70
60
50
40
Figura 16 - Gráfico de correlação entre apoliporpoteina A1 e os títulos de anticorpos anti-LDLox
r=-0,257; p=0,0001, teste de correlação de Pearson. Variáveis plotadas em escala logarítmica.
52
anti-LDLox (DO)
5
4
3
2
1
,5
,4
,3
,2
,1
,05
APOLIPOPROTEÍNA B (mg/dL)
200
100
90
80
70
60
50
40
30
Figura 17 - Gráfico de correlação entre apolipoproteina B e os títulos de anticorpos anti-LDLox
r=-0,0,191; p=0,0001, teste de correlação de Pearson. Variáveis plotadas em escala logarítmica.
Tabela 7- MODELO DE REGRESSÃO LINEAR MÚLTIPLA PARA AS ASSOCIAÇÕES
ENTRE OS TÍTULOS DE ANTI-LDL OX E DEMAIS VARIÁVEIS METABÓLICAS
Variável dependente: anti-LDLox, CA= circunferência abdominal,
Coeficientes T p
Intervalo de confiança 95% de
B
B
Erro
padrão inferior superior
(Constante)
3,748
0,459
8,166
<0,0001
2,843
4,654
Glicemia
-0,004
0,001
-2,634
0,009
-0,007
-0,001
CA
-0,019
0,005
-4,020
<0,0001
-0,029
-0,010
PCRas
-0,010
0,004
-2,785
0,006
-0,017
-0,003
53
5. DISCUSSÃO
Nos últimos anos, a base fisiopatológica da aterosclerose vem sendo mais
bem conhecida, notadamente pela aparente dependência da inflamação, não apenas a
partir de sua formação e desenvolvimento, envolvendo monócitos e linfócitos (Ross,
1998; Libby, 2002), mas por biomarcadores da resposta inflamatória, como a proteína C
reativa, hoje comprovadamente associada às principais complicações cardiovasculares
(Ridker, 2008). Entretanto, a participação da resposta imune parece mais complexa,
particularmente os títulos de autoanticorpos para LDL oxidada e sua relação com a
doença cardiovascular.
A LDL possui em sua estrutura a apolipoproteína B 100 (apoB100), uma
das maiores proteínas monoméricas (500 KDa), altamente insolúvel em soluções
aquosas. Acredita-se que a LDL não seja oxidada no plasma, devido à suas
propriedades antioxidantes. Entretanto, ao penetrar na íntima arterial, a LDL pode
encontrar ambiente mais intenso de substâncias prooxidantes, determinando
modificações oxidativas na sua estrutura, levando a oxidação de componentes lipídicos
e fragmentação da apo, induzindo a formação de pequenos peptídios (Stocker, 2004;
Witzum, 2001). Estas LDL modificadas, ainda podem deixar o vaso e reentrar na
circulação, deflagrando resposta imune caracterizada pela formação de anticorpos
(Matsuura, 2008). Neste cenário, a produção destes anticorpos pode levar a formação
de complexos imunes que podem contribuir para a depuração da circulação sem a sua
incorporação à parede vascular. Entretanto, nas situações clínicas onde houvesse
54
menor capacidade dos anticorpos em neutralizar a formação das LDL oxidadas, este
desequilíbrio poderia propiciar sua incorporação à parede vascular, via maior expressão
do receptor endotelial para a LDL oxidada (LOX-1), favorecendo a sua permanência na
íntima, onde retida e modificada adicionalmente, não deixaria mais a parede vascular,
mas determinaria maior recrutamento de células inflamatórias, levando à formação das
lesões típicas da aterosclerose.
Nossos achados sugerem fortemente que títulos baixos de anticorpos para
a LDL oxidada estejam associados à maior risco cardiovascular. De fato, as principais
variáveis bioquímicas analisadas relacionaram-se de maneira inversa ao seu papel
conhecido papel no risco cardiovascular. Neste contexto, em análise univariada, os
valores de proteína C reativa, glicemia, apo B, pressão arterial sistólica e diastólica,
índice de massa corpórea, circunferência abdominal e de maneira inversa os de apo A1
e HDL-C, mostraram a relação significante entre títulos mais elevados de anticorpos
para a LDL oxidada e proteção cardiovascular.
Em nosso modelo de regressão linear múltipla, as principais variáveis
correlacionadas aos títulos de anticorpos de anti-LDL oxidada foram a glicemia,
circunferência abdominal e proteína C reativa. Estas variáveis são componentes da
síndrome metabólica, uma condição reconhecida como altamente prevalente e
associada a maior mortalidade e morbidade cardiovascular (Lakka, estudo ARIC).
Entretanto, novos aspectos fisiopatológicos foram recentemente descritos,
envolvendo proteína C reativa, LDL oxidada e anticorpos anti-LDL oxidada.
A proteína C reativa, uma proteína da família das pentraxinas, com 118
KDa, inicialmente descrita em pacientes com infecções estreptocócicas, possui cinco
idênticos protômeros não covalentes de aproximadamente 23 KDa, arranjados
55
simetricamente. De forma interessante, esta proteína de fase aguda possui em cada
protômero um sítio de reconhecimento para a ligação com a fosfocolina e na face
oposta um sítio de ligação ao complemente C1q (Matsuura, 2008). Além de favorecer a
opsonização de macrófagos e células endoteliais, a proteína C reativa pode ser
sintetizada por estas células da parede vascular e também se liga a LDL oxidada,
aumenta a expressão de moléculas de adesão e, recentemente, foi descrito a formação
de complexos plasmáticos com os anticorpos anti-LDL oxidadas e proteína C reativa.
Existe também evidências de que estes complexos são muito expressos em indivíduos
diabéticos, mostrando um elo que parece explicar em nossos achados a associação
entre glicemia elevada, aumento de circunferência abdominal e da proteína C reativa e
redução dos títulos de anticorpos para LDL oxidada.
A teoria mais aceita para a aterosclerose se baseia nas proposições de
Ross (1976; 1999), sugerindo que o desenvolvimento da aterosclerose decorreria
primariamente da lesão endotelial induzida por fatores de risco. A partir da ativação da
célula endotelial, monócitos da circulação seriam recrutados para o espaço sub-intimal
onde sofreriam diferenciação em macrófagos. As modificações oxidativas da LDL
constituem evento crucial na gênese do processo inflamatório e imune da aterosclerose
(Steinberg, 1989). Modificações distintas da partícula podem ocorrer, entre elas,
oxidação, agregação e glicosilação, além de modificações causadas por digestão
enzimática. Estas modificações levam a uma completa desintegração da partícula, onde
títulos de anticorpos podem ser evidenciados no plasma (Esterbauer, 1992). A oxidação
de lipoproteínas deflagra a quimiotaxia, fagocitose e a liberação de citocinas pró-
inflamatórias. Esta resposta tem a capacidade de modificar a LDL e tornar os
macrófagos mais imunocompetentes, promovendo um upregulation de moléculas de
56
MHC classe II e a produção de substâncias quimiotácteis e citocinas (Folcik, 1997;
Frostegard, 1991; Libby, 2000). Dessa forma, o monócito/macrófago pode ser
considerado uma célula chave na geração das LDL modificadas e nas respostas a
essas partículas.
Os achados da presença de citocinas e quimiocinas, além de células da
resposta imune inata e adaptativa, e ainda de LDL modificada nas placas
ateroscleróticas trouxeram a base para a compreensão dos mecanismos de indução e
progressão da aterosclerose (Jonasson, 1986). O papel do sistema imune na
aterosclerose é, no entanto, pouco claro. Existem dados que sugerem que as
lipoproteínas oxidadas atuem como importantes antígenos locais, e que respostas
celulares mediadas pelas células T a estas LDL oxidadas possam induzir a ativação de
células B, com produção de anticorpos (Ross, 1999; Stemme, 1995; Zhou 1999). A
presença ou a ausência de anticorpos anti-LDL oxidada e LDL modificada (mLDL) tem
sido apontada como marcador independente para o desenvolvimento da aterosclerose
e da doença arterial coronariana, e estes achados foram observados tanto em estudos
experimentais, como em estudos clínicos (Shoenfeld, 2000; Palinski, 1990; Bui, 1996;
Puurunen, 1994).
Desta forma, as modificações oxidativas das lipoproteínas de baixa
densidade (LDL) tornam estas partículas mais aterogênicas do que em seu estado
nativo quer por serem mais rapidamente captadas por macrófagos, quer por serem
imunogênicas (Steinberg, 1997). A LDL oxidada está presente na circulação e em
placas ateroscleróticas humanas (Ylä-Herttuala, 1989), e os títulos de auto-anticorpos
anti-LDL oxidada foram documentados no plasma de animais e humanos e em lesões
ateroscleróticas (Palinski, 1989; Salonen 1992).
57
A literatura é controversa no que tange aos títulos de anticorpos anti-LDL
oxidada serem protetores ou não. Por um lado, existem estudos indicando que títulos
elevados se associaram com doença arterial coronariana, vascular periférica e com
hipertensão (Bui,1996; Maggi, 1995; Bergmark, 1995). Por outro lado, títulos mais
baixos foram também encontrados em fumantes e em pacientes com DAC, sugerindo
que haja correlação inversa entre os anticorpos e o risco de desenvolvimento de
doença (Zaratin, 2002; Shoji, 2000).
Nossos dados em pacientes com hipertensão arterial e doença
coronariana instável foram concordantes com estes últimos, onde títulos mais baixos
foram observados nos pacientes instáveis e maiores nos estáveis, livres de doença
coronariana.
Nossos achados em SCA e SM de um estado inflamatório, disglicemia,
dislipidemia mista com títulos mais baixos de anticorpos anti-LDL oxidada são
interessantes. Se por um lado a LDL oxidada está presente na formação, progressão da
aterosclerose e nos estados de instabilização da placa, acreditamos que sua presença
seja imunogênica, desencadeando ativação de linfócitos T e B com a produção de
autoanticorpos para distintos epítopos da partícula de LDL oxidada, especialmente para
resíduos de apolipoproteína B. Tais anticorpos podem ter um ciclo variável que
determine a estabilidade/instabilidade de lesões, favorecendo ou não as síndromes
isquêmicas agudas. Por exemplo, se houver uma boa defesa humoral, complexos
imunes podem ser formados e eliminados, sem agressão à parede arterial. Se por outro
lado, a produção de autoanticorpos for insuficiente, a presença de LDL oxidada e não
neutralizada pelos autoanticorpos pode ser um mecanismo de desenvolvimento e
progressão da doença. O estado metabólico caracterizado pela resistência à insulina,
58
diabetes e pela dislipidemia mista, compreende fatores que estimulam a produção de
TNF-alfa, e consequentemente, a síntese de interleucinas, proteína C-reativa, ativam
monócitos, e toda a cascata de eventos que culmina com o desenvolvimento da placa e
a inflamação sistêmica. Desta forma, uma hipótese plausível seria de que na síndrome
coronariana aguda, em portadores de síndrome metabólica o estresse inflamatório não
estivesse antagonizado por uma deficiência imunológica na produção de anticorpos e
as agressões à parede vascular estariam não antagonizadas nessa situação. A
presença de LDL oxidada na placa provocaria uma aceleração dos fatores inflamatórios
que levariam à sua ruptura/erosão e desencadeamento das SCAs. Por outro lado,
poderíamos ainda supor uma situação de consumo dos anticorpos na vigência de uma
SCA. Os complexos imunes formados pela LDL oxidada / anticorpos anti-LDL oxidada
migrariam para a placa aterosclerótica mais inflamada desses indivíduos e seriam os
responsáveis pela sua ruptura. Dessa forma, o consumo dos autoanticorpos na placa
caracterizaria situação de instabilidade. Para elucidar qual desses mecanismos seria o
mais plausível teríamos que analisar a presença dos anticorpos na placa e na
circulação de maneira dinâmica e verificar se ocorre uma depleção na concentração de
autoanticorpos circulantes e uma maior concentração na placa, na hipótese da segunda
teoria ser a mais plausível. Por outro lado, os títulos de anticorpos mais elevados em
hipertensos de baixo risco e sem outros fatores de risco, caracterizando uma população
de menor risco e sem tantos estímulos para a oxidação (perfil lipídico não aterogênico,
PCR baixa, ausência de disglicemia, entre outros), nos sugere que a condição protetora
se associe aos títulos maiores de anticorpos anti-LDL oxidada.
A figura abaixo exemplifica os mecanismos postulados. A) a presença de
complexos LDLox/anti-LDLox diminuída na circulação e aumentada na placa instável
59
favoreceria o mecanismo de ruptura; B) os títulos baixos de anticorpos anti-LDLox na
circulação e na placa refletiriam uma incapacidade de deter o processo oxidativo,
favorecendo sua ruptura.
A)
↑ LDLox/anti-LDLox SCA
B)
↓ anti-LDLox ↑ LDLox SCA
Figura 18 – Mecanismos postulados para explicar o papel dos anticorpos anti-LDLox na SCA.
Sumarizando, nossos achados sugerem que a presença de títulos elevados
de anticorpos para LDL oxidada constitua uma situação de relativo controle imunológico
favorecendo a estabilidade clínica. Por outro lado, a presença de baixos títulos destes
anticorpos pode sugerir uma situação de maior vulnerabilidade aos eventos
cardiovasculares. Embora a quantificação destes anticorpos não seja ainda uma
ferramenta prática de avaliação do risco cardiovascular, seu estudo pode permitir uma
visão mais avançada dos mecanismos envolvidos na formação e desestabilização das
lesões ateroscleróticas, contribuindo para ações preventivas e terapêuticas.
60
6. CONCLUSÃO
Os títulos dos auto-anticorpos anti-LDLoxidada são maiores em pacientes
hipertensos em prevenção primária da doença cardiovascular, os quais também
apresentam menores valores de PCR-as.
Esses anticorpos apresentam títulos mais baixos em pacientes em
prevenção secundária, como naqueles com síndrome coronariana aguda e síndrome
metabólica. Esses dados são corroborados pelos níveis elevados de PCR-as.
Na amostra global, os anticorpos anti-LDL oxidada apresentam correlação
inversa com marcadores inflamatórios (PCRas, glicemia, Apo B, circunferência
abdominal e IMC), e direta com HDL-C, Apo A1e valores de pressão arterial.
Houve associação independente e inversa entre a PCRas, glicemia e
circunferência abdominal com os autoanticorpos anti-LDL oxidada.
Nossos dados sugerem um papel protetor dos auto-anticorpos anti-LDL
oxidada com relação à doença cardiovascular.
61
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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