( PDF ) Respostas metabólicas e enzimáticas em jundiás Rhamdia quelen (Heptapteridae) e piavas Leporinus obtusidens (Anostomidae) expostos a herbicidas utilizados na cultura do arroz irrigado

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAS E EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA TOXICOLÓGICA

RESPOSTAS METABÓLICAS E ENZIMÁTICAS EM JUNDIÁS

Rhamdia quelen (HEPTAPTERIDAE) E PIAVAS Leporinus

obtusidens (ANOSTOMIDAE) EXPOSTOS A HERBICIDAS

UTILIZADOS NA CULTURA DO ARROZ IRRIGADO

TESE DE DOUTORADO

Denise dos Santos Miron

Santa Maria, RS, Brasil

2009

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RESPOSTAS METABÓLICAS E ENZIMÁTICAS EM JUNDIÁS

Rhamdia quelen (HEPTAPTERIDAE) E PIAVAS Leporinus

obtusidens (ANOSTOMIDAE) EXPOSTOS A HERBICIDAS

UTILIZADOS NA CULTURA DO ARROZ IRRIGADO

por

Denise dos Santos Miron

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas: Bioquímica Toxicológica, da Universidade Federal de Santa

Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para a obtenção do grau de

Doutor em Bioquímica Toxicológica

Orientadora: Profa. Dra. Vera Maria Morsch

Co-orientadora: Profa. Dra. Vânia Lucia Loro

Santa Maria, RS, Brasil

2009

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Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Ciências Naturais e Exatas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Tese de Doutorado

RESPOSTAS METABÓLICAS E ENZIMÁTICAS EM JUNDIÁS, Rhamdia quelen

(HEPTAPTERIDAE) E PIAVAS Leporinus obtusidens (ANOSTOMIDAE) EXPOSTOS

A HERBICIDAS UTILIZADOS NA CULTURA DO ARROZ

elaborada por

Denise dos Santos Miron

como requisito parcial para a obtenção do grau de

Doutora em Bioquímica Toxicológica

COMISSÃO EXAMINADORA:

____________________________________

Vera Maria Morsch

(Presidente/Orientador)

____________________________________

Leonardo José Gil de Barcellos, Dr. (UPF)

____________________________________

Nilda de Vargas Barbosa, Dra. (UFSM)

____________________________________

Juliano Ferreira, Dr. (UFSM)

____________________________________

Maribel A. Rubin, Dra. (UFSM)

Santa Maria, 15 de janeiro de 2009.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ...

... à minha filha, amor da minha vida Antonella Miron Nissola.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar sempre junto a mim... nas decisões e nas conquistas. Por isso,

meu mais sincero agradecimento, o meu muito obrigado!

À Universidade Federal de Santa Maria, através do Departamento de Química,

pela oportunidade de desenvolver este trabalho.

A Profa. Dra. Vera Morsh, pela oportunidade, pelas sugestões e orientações

prestadas durante este período.

A todos professores que participaram da finalização desta Tese, integrando a

Comissão Examinadora deste trabalho.

À minha co-orientadora, Profa. Dra. Vânia L. Loro, pela confiança, dedicação e

orientações. Quando foi difícil... você acreditou em mim...lembrou-me de sorrir e lutar.

Espero que você saiba o alcance de suas ações...

A todos os colegas do Laboratório de Bioquímica Adaptativa de Peixes (Bibiana,

Lissandra, Milene, Charlene, Roberta,...) e funcionários que de uma maneira ou de

outra me ajudaram no desenvolvimento desta. Em especial, a Alexandra Pretto (Ale),

pela competência e presença indispensável para o desenvolvimento desta tese.

Existem momentos onde nossos corações parecem não entender a própria vida...

Nesses momentos quem valoriza nossos sorrisos e aplaudem nossos sucessos?

Família... A vocês,... Muito obrigado! Tenho a felicidade de comemorar mais esta

conquista de nossas vidas.

RESUMO

Tese de Doutorado

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica

Universidade Federal de Santa Maria

RESPOSTAS METABÓLICAS E ENZIMÁTICAS EM JUNDIÁS, Rhamdia quelen

(HEPTAPTERIDAE) E PIAVAS Leporinus obtusidens (ANOSTOMIDAE) EXPOSTOS

A HERBICIDAS UTILIZADOS NA CULTURA DO ARROZ

AUTORA: DENISE DOS SANTOS MIRON

ORIENTADORA: VERA MARIA MORSCH

CO-ORIENTADORA: VÂNIA LUCIA LORO

Data e local de defesa: Santa Maria, 15 de janeiro de 2009.

Neste estudo, investigaram-se os efeitos toxicológicos da exposição de peixes aos

herbicidas COLOCAR CLASSE clomazone (isoxazolidinonas- Gamit®), quinclorac

(quinolinas- Facet®) e metasulfuron metil (sulfoniluréia- Ally®), utilizados na lavoura

de arroz. Primeiramente, foram realizados experimentos com jundiás (Rhamdia

quelen) para estabelecer uma concentração média letal em 96 horas (CL

-96h) de

exposição aos herbicidas e determinar a atividade da AChE cerebral e muscular

nesses peixes. Em experimentos adicionais, jundiás foram expostos por 45 dias em

águas retiradas do cultivo do arroz após a aplicação dos herbicidas. Foram

determinados parâmetros de sobrevivência, crescimento e metabólicos (glicose,

lactato, glicogênio e proteína) nestes peixes. Piavas (Leporinus obtusidens) foram

submetidas à exposição (96 e 192 h) do clomazone na concentração utilizada na

lavoura de arroz (0,5 mg/L) e, em seguida a testes de recuperação (192 h) em água

livre deste herbicida. Foram avaliados parâmetros enzimáticos (AChE e CAT),

formação de TBARS, carbonilação de proteínas e alguns metabólicos (glicogênio,

lactato, glicose e proteína) em diferentes tecidos. Os resultados demonstraram que

os valores de CL

-96h para os jundiás nos herbicidas foram: 7,32 mg/L para o

clomazone, 395 mg/L para o quinclorac e para o metasulfuron metil este valor não foi

obtido, pois os peixes sobreviveram em concentração máxima de 1200 mg/L deste

herbicida. Nossos resultados revelaram que o clomazone é um potente inibidor da

atividade da AChE em jundiás, mostrando uma inibição de até 83% em cérebro e de

89% em músculo. No entanto, quinclorac e metasulfuron metil causaram aumento da

AChE cerebral (98 e 179%, respectivamente) e diminuição dessa atividade no

músculo (88 e 56%, respectivamente). Depois de 45 dias de exposição aos

herbicidas, os jundiás expostos ao quinclorac demonstraram diminuição de 4% nos

índices de sobrevivência. E, em água com clomazone e com quinclorac ocorreu

redução no crescimento dos peixes. No tecido hepático dos jundiás expostos ao

clomazone e quinclorac houve aumento de glicogênio, redução nos níveis de lactato.

No tecido muscular verificou-se um aumento do lactato. Em piavas expostas ao

clomazone (96 e 192 h) houve diminuição na atividade da AChE, em cérebro e em

coração dos peixes. A atividade da AChE muscular diminuiu depois de 192 h de

exposição. Em relação à recuperação da atividade da AChE em piavas, observou-se

que a inibição persistiu após 192 h em água livre de herbicida em cérebro, músculo e

olho. Os níveis de TBARS apresentaram-se aumentados em cérebro de piavas nos

períodos de exposição, enquanto em fígado e em músculo foi observado o aumento

depois de 192 h de exposição. Em relação ao período de recuperação, verificou-se

que os níveis de TBARS não retornaram aos valores iniciais, com exceção do fígado.

A exposição de piavas resultou num aumento na formação de carbonilação proteíca

em fígado, que não foi recuperado. No fígado, a diminuição da atividade da CAT está

relacionada com o aumento de TBARS hepático, demonstrando que este herbicida

induz dano oxidativo. Além disso, no presente estudo os níveis de glicogênio em

fígado e em rins de piavas expostas ao clomazone mostraram um aumento, enquanto

os valores de lactato, glicose e de proteína obtido para esses tecidos diminuíram. No

tecido muscular de piavas expostas por 96 h ao clomazone foi demonstrado um

aumento do glicogênio que após o período de recuperação retornou aos valores do

controle. Nesse mesmo tecido, essas piavas apresentaram um aumento de lactato, a

diminuição de glicose e de proteína, sendo que o lactato não foi recuperado. Estes

resultados indicam que após a exposição de piavas ao clomazone (96 e 192 h)

algumas mudanças enzimáticas e metabólicas não podem ser recuperadas, mesmo

submetendo os peixes ao tratamento em água livre de herbicida (192 h). Contudo, os

resultados obtidos no presente estudo demonstraram que a exposição de peixes a

herbicidas utilizados na lavoura de arroz irrigado afeta o sistema colinérgico, os

parâmetros metabólicos e oxidativos causando uma condição de estresse oxidativo.

Portanto, os parâmetros avaliados em jundiás e piavas podem ser recomendados

para o monitoramento de contaminação da água por clomazone, quinclorac e

metasulfuron metil.

Palavras-chave: herbicidas, clomazone, quinclorac, metasulfuron metil, jundiá, piavas,

, metabolismo e enzimas.

ABSTRACT

Doctoral Thesis

Pos-Graduate Program in Toxicological Biochemistry

Universidade Federal de Santa Maria

METABOLIC AND ENZYMATIC RESPONSES ON SILVER CATFISH Rhamdia

Quelen (HEPTAPTERIDAE) AND PIAVAS Leporinus Obtusidens (ANOSTOMIDAE)

EXPOSURE TO HERBICIDES UTILIZED IN THE RICE FIELDS

AUTHOR: DENISE DOS SANTOS MIRON

ORIENTED BY: VERA MARIA MORSCH

CO-ORIENTED BY: VÂNIA LÚCIA LORO

Place and date: Santa Maria, January 15, 2009.

The effects of the toxic exposure of fish to the herbicides clomazone (isoxazolidinone-

Gamit®), quinclorac (quinoline-Facet®) and metsulfuron methyl (sulfonylurea-Ally®), used

in rice fields were investigated. Experiments were carried out with silver catfish (Rhamdia

quelen) to establish an average lethal concentration in 96 hours (LC

50 –

96 h) of exposure

to herbicides as well as to determine brain and muscle AChE activity in this specie. In

additional experiments, silver catfish were placed into water, for 45 days, taken from the

rice cultivation after the application of herbicides. Survival parameters as well as growth

and metabolic (glucose, lactate, glycogen and protein) were determined in this species.

Piava (Leporinus obtusidens) were exposed (96 and 192 h) to clomazone in the

concentration used for rice culture (0.5 mg/L) and recovery tests (192 h) in water free of

herbicide were performed. Enzymatic (AChE and CAT), formation of TBARS, protein

carbonylation and some metabolic parameters (glycogen, lactate, glucose and protein)

were evaluated in different tissues. Results showed that LC

-96 h values for silver catfish

were 7.32 mg/L for clomazone, 395 mg/L for quinclorac and no values were obtained for

metsulfuron methyl, the fish survived in maximum concentration of 1200 mg/L. Our

findings showed that clomazone is a potent inhibitor of AChE activity in silver catfish,

showing an inhibition up to 83% in brain and 89% in muscle. However, quinclorac and

metsulfuron methyl caused an increase of the brain AChE activity (98 and 179%,

respectively) and a decrease in the muscle AChE activity (88 and 56% respectively). After

45 days of quinclorac exposure, silver catfish showed a decrease of 4% in the survival

rates. In water with clomazone and quinclorac a reduction in the growth of fish was

observed. In the liver tissue of silver catfish exposed to clomazone and quinclorac a

glycogen increase and a reduction in the glucose and lactate levels were observed

indicating liver gluconeogenesis. In the muscle tissue, there was a decrease in the muscle

glycogen, with a lactate increase. There was a decrease in the AChE activity in brain and

heart of piava exposed to clomazone (96 and 192 h). AChE activity decreased in muscle

after 192 h of exposure. Regarding the recovery of the AChE activity in piava, the inhibition

persisted after 192 h in water free of herbicide in brain, muscle and eye. TBARS levels

were increased in the brain of piava during the exposure periods, whereas an increase in

liver and muscle was observed after 192 h of exposure. TBARS levels did not return to

controls values during the recovery period, except for liver. The exposure of piava resulted

in an increase in the formation of protein carbonyl in liver, which was not recovered. In

liver, the reduction in the CAT activity is related to the increase in liver TBARS, showing

that this herbicide causes oxidative damage. Furthermore, in this study the glycogen levels

in kidneys of piava exposed to clomazone showed an increase whereas lactate, glucose

and protein values to these tissues were decreased. In muscle tissue of piava exposed to

clomazone (96 h) was demonstrate a glycogen increased that after recovery returned to

the values of control. Muscle tissue of piavas also showed lactate increased, a decreased

glucose and protein, however lactate levels not were recovered. These results

demonstrate that after exposing piava to clomazone (96 and 192 h) some metabolic and

enzymatic changes could not be recovered, even exposing the fish to water free of

herbicide (192 h). The results of this study showed that the exposure of fish to herbicides

used in rice culture affects the cholinergic system, as well as the metabolic and oxidative

parameters causing a condition of oxidative stress. Therefore, the parameters evaluated in

piava and silver catfish may be recommended for the monitoring of water contamination by

clomazone, quinclorac and metsulfuron methyl.

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DE LITERATURA:

FIGURA 1- Exemplar de Jundiá (Rhamdia quelen) ................................................ 24

FIGURA 2- Exemplar de Piava (Leporinus obtusidens) .......................................... 25

FIGURA 3- Estrutura Química do Clomazone (Senseman, 2007) .......................... 26

FIGURA 4- Mecanismo de Ação do Clomazone em Plantas (Oliveira, 2001) .......... 27

FIGURA 5- Estrutura Química do Quinclorac (Senseman, 2007) ........................... 27

FIGURA 6- Estrutura Química do Metasulfuron Metil (Senseman, 2007) ............... 29

FIGURA 7- Mecanismo de Ação do Metasulfuron Metil em Plantas (Oliveira, 2001) 30

FIGURA 8- Sinapse Colinérgica (Adaptado de Soreq e Seidman, 2001) ............... 34

ARTIGO I:

FIGURA 1- Mortality of silver catfish exposed for 96 h to clomazone (a) and quinclorac

(b). Open circles indicate LC

, and circles indicate log-doses tested .................... 43

FIGURA 2- Effects on the AChE activity after 96-h exposure to 0 (control), 5, 10, and

20 mg/L of clomazone in the brain and muscle. AChE activity (μmol/AcSCh)/min/g

protein) is expressed as mean±SE (n = 3). Significant difference from control is

indicated: *P<0.05 ................................................................................................... 44

FIGURA 3- Effects on the AChE activity after 96 h exposure to 0 (control), 100, 375,

and 400 mg/L of quinclorac in the brain and muscle. AChE activity

(μmol/AcSCh)/min/g protein) is expressed as mean±SE (n=3). Significant difference

from control is indicated: *P<0.05 ........................................................................... 44

FIGURA 4- Effects on the AChE activity after 96-h exposure to 0 (control), 400, 800,

and 1200 mg/L of metsulfuron methyl in the brain and muscle. AChE activity

(μmol/AcSCh)/min/g protein) is expressed as mean±SE (n = 3). Significant difference

from control is indicated: *P<0.05 ........................................................................... 44

MANUSCRITO I:

FIGURA 1- Glucose and lactate (nmol mg

-1

protein) in the liver and muscle of silver

catfish (Rhamdia quelen) exposed 15 days at water from rice fields applied to the rice

fields. Seen as (GH) Glucose hepatic, (LH) Lactate hepatic, (GM) Glucose muscle and

(LM) Lactate muscle. Results are the means ± SD of then fish per group. (*) Indicates

significant difference from control group (P<0.05) .................................................. 60

FIGURE 2- Glucose and lactate (nmol mg

-1

protein) in the liver and muscle of silver

catfish (Rhamdia quelen) exposed 45 days at water from rice fields applied to the rice

fields. Seen as (GH) Glucose hepatic, (LH) Lactate hepatic, (GM) Glucose muscle and

(LM) Lactate muscle. Results are the means ± SD of then fish per group. (*) Indicates

significant difference from control group (P<0.05) .................................................. 61

ARTIGO II:

FIGURA 1- AChE activity (μmol AcSCh min

-1

protein) in brain, muscle, eye and

heart of Leporinus obtusidens after exposure to 0.5 mgL

-1

of clomazone (96h and

192h) and recovery (R - 192h). Data are reported as mean±SD (n = 15). *, Indicates

significant difference from control (P<0.05) ............................................................ 68

FIGURA 2- TBARS levels (nmol MDA mg

-1

protein) in brain, liver and muscle of

Leporinus obtusidens after exposure to 0.5 mgL

-1

of clomazone (96h and 192h) and

recovery (R - 192h). Data are reported as mean±SD (n = 15). * Indicates significant

difference between groups and control values (P<0.05) ......................................... 68

FIGURA 3- Protein carbonyl (nmol carbonyl mg

-1

protein) in liver of Leporinus

obtusidens after exposure to 0.5 mgL

-1

of clomazone (96h and 192h) and recovery (R

- 192h). Data are reported as mean±SD (n = 15). * Indicates significant difference

from control (P<0.05) .............................................................................................. 68

FIGURA 4- Catalase activity (μmol mg

-1

protein min

-1

) in liver of Leporinus obtusidens

after exposure to 0.5 mgL

-1

of clomazone (96h and 192h) and recovery (R - 192h).

Data are reported as mean±SD (n = 15). * Indicates significant difference from control

(P<0.05) .................................................................................................................. 68

MANUSCRITO II:

FIGURE 1- Glycogen and lactate (µmol g

-1

tissue) in liver of Leporinus obtusidens

after exposure to 0.5 mg L

-1

of clomazone (96 and 192 h) and recovery (R- 192 h).

Seen as (Control- GH) Glycogen hepatic control, (GH) Glycogen hepatic, (Control-

LH) Lactate hepatic control and (LH) Lactate hepatic. Results are the means ± SD of

then fish per group. (*) Indicates significant difference from control group (P<0.01).

Date are means ±SD (n=15); * Indicate a significant difference at P< 0.05 ............ 84

FIGURE 2- Glycogen and lactate (µmol g

-1

tissue) in muscle of Leporinus obtusidens

after exposure to 0.5 mg L

-1

of clomazone (96 and 192 h) and recovery (R- 192 h).

Seen as (Control- GM) Glycogen muscle control, (GH) Glycogen muscle, (Control-

LM) Lactate muscle control and (LM) Lactate muscle. Date are means ±SD (n=15); *

Indicate a significant difference at P< 0.05 ............................................................. 85

FIGURE 3- Glycogen and lactate (µmol g

-1

tissue) in kidney of Leporinus obtusidens

after exposure to 0.5 mg L

-1

of clomazone (96 and 192 h) and recovery (R- 192 h).

Seen as (Control- GK) Glycogen kidney control, (GK) Glycogen kidney, (Control- LK)

Lactate kidney control and (LK) Lactate kidney. Date are means ±SD (n=15); *

Indicate a significant difference at P< 0.05 ............................................................. 86

LISTA DE TABELAS

ARTIGO I:

TABELA 1- Lethal concentrations (96 h) and effect of different concentrations of

clomazone, quinclorac, and metsulfuron methyl on feeding behavior, activity, and

brain and muscle AChE activity in silver catfish fingerlings ..................................... 43

MANUSCRITO I:

TABELA 1- Concentration of herbicides applied to the rice fields as a function of time

................................................................................................................................. 62

TABELA 2- Weight, length, specific growth rate and biomass of silver catfish

(Rhamdia quelen) after 15, 30 and 45 days exposure to water from rice fields applied

to the rice fields ....................................................................................................... 63

TABELA 3- Glycogen (nmol/ mg protein), protein (mg/ mg tissue) in liver and muscle

tissues of silver catfish (Rhamdia quelen) after 15 ana 45 days exposure at water from

rice fields that received application of herbicides applied to the rice fields ............ 64

MANUSCRITO II:

TABELA 1- Changes in liver, muscle and kidney of Leporinus obtusidens exposed to

clomazone (96 and 192 h) and recovery period (192 h) ......................................... 87

LISTA DE ABREVIATURAS

ACh: acetilcolina

AChE: acetilcolinesterase

ALS: alanina aminotransferase

ATP: adenosina trifosfato

BuChE: butirilcolinesterase

CAT: catalase

: concentração letal média

DNA: ácido desoxirribonucléico

EROs : espécies reativas de oxigênio

GPx: glutationa peroxidase

LPO: peroxidação lipídica

SOD: superóxido dismutase

TBARS: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

RNA: ácido ribonucléico

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 16

1.1 Objetivos ..................................................................................................... 20

1.2 Objetivo Geral .............................................................................................. 20

1.3 Objetivos Específicos .................................................................................. 20

2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 22

2.1 Contaminação Ambiental ............................................................................. 22

2.2 Rizipiscicultura ............................................................................................. 23

2.3 Jundiá (Rhamdia quelen) ............................................................................. 23

2.4 Piava (Leporinus obtusidens) ...................................................................... 25

2.5 Herbicida Clomazone .................................................................................. 25

2.6 Herbicida Quinclorac ................................................................................... 27

2.7 Herbicida Metasulfuron Metil ....................................................................... 28

2.8 Concentração Média Letal (CL

) ................................................................ 30

2.9 Parâmetros de Crescimento ........................................................................ 32

2.10 A Atividade da Acetilcolinesterase ............................................................. 32

2.11 Intermediários Metabólicos ........................................................................ 34

2.12 Estresse Oxidativo e Defesa Antioxidante ................................................. 38

2.13 Capacidade de Recuperação ................................................................... 38

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 39

CAPÍTULO I ............................................................................................................ 40

CAPÍTULO II ........................................................................................................... 47

CAPÍTULO III .......................................................................................................... 65

CAPÍTULO IV ......................................................................................................... 71

4. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 88

5. CONCLUSÕES ................................................................................................... 96

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 98

1. INTRODUÇÃO

Na atividade agrícola é indispensável à adoção de procedimentos de manejo

para obter-se o aumento da produtividade. O controle de plantas daninhas na lavoura

permite um maior rendimento da área plantada e geralmente é realizado através de

agroquímicos (IRGA, 2001). O uso de herbicidas requer a aplicação cuidadosa das

quantidades adequada bem como, exige cuidados quanto á época indicada para o

agroquímico. Cuidados relativos a estes fatores melhoram a qualidade nas colheitas

e, minimizam a possibilidade de intoxicações (humanas, de animais domésticos, etc.).

A quantidade de herbicidas nos recursos hídricos varia entre regiões e depende da

dosagem aplicada, das características químicas do produto e das condições

ambientais durante a aplicação (HUBER et al., 2000). Dependendo das

características físico-químicas, o resíduo do químico pode se ligar ao material

particulado em suspensão, se depositar no sedimento do fundo ou ser absorvido por

organismos, podendo então ser detoxificado ou acumulado. Além disso, pode ser

transportado no sistema aquático por difusão nas correntes de água ou nos

organismos aquáticos, ou até mesmo retornar à atmosfera por volatilização,

evidenciando uma interação contínua dos químicos entre sedimento e água,

influenciada pelo movimento da água, turbulência e temperatura (NIMMO, 1985).

Alguns poluentes em ambientes aquáticos podem afetar a saúde e a

sobrevivência dos peixes (DEZFULI et al., 2003). Entretanto, há poucos trabalhos

relacionados á toxicidade de herbicidas utilizados em cultura de arroz irrigado, e

poucos dados relacionados à curva dose-efeito dos herbicidas com as espécies

nativas. Os herbicidas clomazone (isoxazolidinona), quinclorac (quinolina) e

metasulfuron metil (sulfoniluréia) são registrados no Brasil para o controle de plantas

daninhas em diferentes culturas, como em lavouras arrozeiras, nas concentrações

finais de 0,7; 0,003 e 0,75 mg/L, respectivamente (RODRIGUES & ALMEIDA, 1998,

2005). E, uma vez na água, o resíduo do agroquímico pode ser absorvido por

organismos, podendo então bioacumular-se ou sofrer detoxificação. Com relação aos

herbicidas de amplo uso em culturas de arroz irrigado no Rio Grande do Sul (RS), o

clomazone se apresenta como o menos tóxico para peixes quando comparado ao

quinclorac e ao metasulfuron metil (JONSSON et al., 1998). Testes de toxicidade em

peixes, feitos a partir da concentração média letal (CL

) permitem avaliar o potencial

deletério que algumas substâncias químicas podem exercer sobre organismos

aquáticos, em condições controladas de laboratório (RAND & PETROCELLI, 1985).

No peixe tetrarisca-negra (Hyphessobrycon scholzei) o valor da CL

-96 h para o

clomazone foi equivalente a 27,67 mg/L, enquanto a dose comercial normalmente

utilizada na lavoura é de 0,4 a 0,7 mg/L e, não houve evidências de alterações

significativas nos níveis de proteínas totais e de macro e microelementos nos tecidos

(JONSSON et al., 1998). No entanto, RESGALLA JUNIOR et al. (2002)

demonstraram que a exposição do clomazone sobre carpa comum (Cyprinus carpio)

oferece altos riscos ambientais, pois a diferença entre a CL

-96 h (13,94 mg/L) e a

concentração recomendada pelo fabricante estão próximas, indicando maior potencial

de risco no uso desse produto.

Vários parâmetros enzimáticos podem ser utilizados para avaliar a toxicidade

de herbicidas (FERNÁNDEZ-VEJA et al., 2002). Um destes é a medida da atividade

da acetilcolinesterase (AChE, EC 3.1.1.7), é uma enzima importante para o sistema

colinérgico. A medida da atividade da AChE tem sido utilizada como um indicador de

toxicidade causado pela exposição de compostos como organofosforados e

carbamatos em peixes (SANCHO et al., 2000). É descrito na literatura que a atividade

da AChE em peixes pode ser afetada também, por pesticidas de outras classes e por

esse motivo vem sendo amplamente utilizada como um indicador de efeitos tóxicos

(FERNÁNDEZ-VEGA et al., 2002; DUTTA & ARENDS, 2003; MIRON et al., 2005).

Algumas alterações fisiológicas devido à exposição de herbicidas também

podem ser analisadas através do estudo de parâmetros metabólicos em peixes (DAS

& MUKHERJEE, 2003). As mudanças no metabolismo de carboidratos de peixes

expostos a diferentes agrotóxicos, podem servir de bons indicadores secundários de

toxicidade (BEGUM, 2004). De acordo, foi constatado que a exposição de carpa

comum ao lindane (100 mg/L por 72 h) e de catfish indiano (Heteropneustes fossilis)

ao malation (8 mg/L por 96 h) aumenta significativamente o nível de glicose no

plasma e causa uma redução concomitante de glicogênio em músculo e em fígado

(GLUTH & HANKE, 1985; LAL et al., 1986). A exposição de jundiás ao herbicida 2,4-

D (ácido diclorofenoxiacético) (600 e 700 mg/L por 96 h) também causa alterações no

metabolismo de carboidratos, como aumento nos níveis de lactato muscular,

favorecendo o metabolismo anaeróbico (CATTANEO et al., 2008). SAHIB et al.

(1984) e FERNÁNDEZ-VEJA et al. (2002) sugerem que peixes expostos a

contaminantes podem alterar o conteúdo de proteína (hepática e muscular) indicando

uma resposta adaptativa fisiológica para compensar a condição de estresse ao tóxico.

Além disso, os poluentes podem provocar estresse oxidativo e levar a um

aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) em organismos

aquáticos (AHMAD et al., 2000; SEVGILER et al., 2004). Uma reação típica induzida

por EROs envolve a peroxidação de ácidos graxos poliinsaturados (LPO) que tem

sido observada em várias espécies de peixes. Estes apresentam vários sistemas

antioxidantes, tais como, as enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e

a glutationa peroxidase (GPx) (RADI et al., 1985). Assim, mudanças no conteúdo dos

antioxidantes podem também demonstrar a presença de contaminantes (AHMAD et

al., 2000).

Portanto, os peixes podem apresentar várias respostas à exposição de

agentes tóxicos, como herbicidas. Segundo ORUÇ & ÜNER (1999), mudanças

bioquímicas em peixes são influenciadas de acordo com a espécie exposta ao

herbicida, pelo tempo e também pela concentração de exposição. As respostas são

demonstradas através de testes de CL

(RAND & PETROCELLI, 1985), alterações

nos níveis de vários parâmetros enzimáticos, fisiológicos e metabólicos

(FERNÁNDEZ-VEJA et al., 2002). Segundo BEGUM (2004) algumas das alterações

causadas pela exposição a herbicidas podem ser revertidas. Considerando o exposto

acima, torna-se importante os estudos relacionados às respostas dos efeitos tóxicos

em peixes submetidos a um tratamento de recuperação e de detoxificação em água

sem adição de herbicida. Dessa forma é importante estabelecer subsídios para

auxiliar no cultivo de peixes nativos, como o jundiá (Rhamdia quelen) e a piava

(Leporinus obtusidens) já que são espécies promissoras no sistema de rizipiscicultura

devido à facilidade de cultivo e aceitação comercial. Além disso, o conhecimento dos

efeitos causado pela exposição ao clomazone, quinclorac e ao metasulfuron metil

proporcionará um maior embasamento no que diz respeito a aspectos relacionados a

respostas metabólicas, enzimáticas e, conseqüentemente de estresse oxidativo nas

espécies estudadas.

1.1 Objetivos

1.2 Objetivo Geral

O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos toxicológicos da exposição

de jundiás e piavas a três tipos de herbicidas utilizados na lavoura de arroz:

clomazone (isoxazolidinona- Gamit®), quinclorac (quinolina- Facet®) e metasulfuron

metil (sulfoniluréia- Ally®).

1.3 Objetivos Específicos

- Determinar a CL

50-

96 h para jundiás expostos aos herbicidas clomazone, quinclorac

e metasulfuron metil;

- Investigar os efeitos dos herbicidas sobre a atividade da enzima acetilcolinesterase

(AChE) em cérebro e em músculo de jundiás;

- Investigar os efeitos da água usada no cultivo do arroz após a aplicação do

clomazone, quinclorac e metasulfuron metil sobre a sobrevivência, crescimento e

parâmetros metabólicos (glicose, lactato, glicogênio e proteína) de jundiás;

- Verificar os efeitos causados pela exposição ao clomazone na concentração usada

na lavoura de arroz (0,5 mg/L), sobre AChE, TBARS, carbonilação de proteínas e

atividade da catalase (CAT) de piavas;

- Investigar os efeitos da exposição a 0,5 mg/L de clomazone sobre alguns

parâmetros metabólicos (glicogênio, lactato, glicose e proteínas totais) em fígado,

músculo e rim de piavas;

- Analisar se após a exposição do clomazone (96 e 192 h) as possíveis mudanças

(enzimáticas e metabólicas) podem ser recuperadas a níveis normais, submetendo os

as piavas ao tratamento em água livre de herbicida (192 h);

- Verificar se os parâmetros avaliados em jundiás e em piavas poderão ser

recomendados para o monitoramento de contaminação da água por herbicidas

utilizados nas lavouras de arroz irrigado.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Contaminação Ambiental

No Brasil são cultivados anualmente 1,3 milhões de hectares com arroz irrigado

dos quais cerca de 950 mil (73%) estão no Rio Grande do Sul (RS) (AGRIANUAL,

2000). O arroz (Oryza sativa L.) é um dos cereais mais cultivados do mundo e,

considerado a base da alimentação de boa parte da população mundial. O controle

de plantas daninhas na cultura de arroz irrigado permite um maior rendimento da área

plantada e geralmente é realizado através do uso de agroquímicos, principalmente

herbicidas (IRGA, 2001). O sistema pré-geminado de arroz caracteriza-se pela

drenagem da área irrigada, efetuada após o período de semeadura, podendo

desencadear graves problemas ambientais com a liberação de herbicidas que estão

em suspensão na água de irrigação. Esta água liberada no meio ambiente pode

afetar vários organismos, principalmente os aquáticos, como os peixes. Estes podem

absorver através das brânquias e superfície do corpo essas substâncias tóxicas

(SEIM et al., 1997). Salienta-se que o uso sem controle de herbicidas em culturas

irrigadas, como as lavouras de arroz, pode afetar diretamente a vida dos organismos

expostos aos mesmos, ou indiretamente quando seus habitats são alterados,

afetando, por exemplo, a qualidade da água, que pode ser influenciada pelas

interações entre os seus componentes químicos e os componentes dos herbicidas.

Com isso, muitos parâmetros físicos e químicos, tais como: temperatura, pH, oxigênio

dissolvido, dureza e turbidez podem sofrer alterações. Mudanças nestes parâmetros,

que influenciam as condições biológicas do ecossistema aquático, podem alterar a

produtividade do cultivo, bem como as respostas fisiológicas dos peixes (ARANA,

1997).

2.2. Rizipiscicultura

O Brasil destaca-se pelo uso de vários herbicidas, destes diversos são indicados

para uso nas culturas de arroz irrigado (IRGA, 2001). A lavoura arrozeira irrigada tem

sido alvo de estudos voltados para os efeitos nocivos causados sobre a qualidade da

água. Porém, a procura por parte de técnicos e produtores de alternativas para a

redução de custos da lavoura arrozeira está motivando a combinação do sistema

peixe e arroz irrigado, ou seja, a rizipiscicultura. Esta proporciona a possibilidade de

manejo reduzindo o uso de maquinária, conservando o meio ambiente e, ainda

aumentando a renda do produtor atravéz da venda do peixe (EMATER, 1999). Na

rizipiscicultura podem-se reduzir os custos da lavoura, pois são utilizadas algumas

espécies de peixes que preparam o solo para os próximos cultivos do arroz irrigado,

reciclam a matéria orgânica e consomem sementes de espécies invasoras no solo,

contribuindo também para a redução de larvas de insetos e caramujos (EMATER,

2001). A partir do estudo dos efeitos de herbicidas em peixes associados às lavouras

pode-se minizar a possibilidade de contaminação da água e dos organismos pelos

produtos químicos. Assim, torna-se importante determinar os efeitos tóxicos em

peixes de interesse comercial como os jundiás (Rhamdia quelen) e piavas (Leporinus

obtusidens), os quais poderiam ser utilizado no consórcio arroz-piscicultura.

2.3. Jundiá (Ramdia quelen)

O jundiá, Rhamdia quelen (Quoy & Gaimard, 1824; família Heptapteridae; ordem

Siluriforme) (Figura 1) é uma espécie de teleósteo nativa da região Sul da América do

Sul (GOMES et al., 2000). Sua coloração varia de marrom-avermelhado claro a cinza

ardósia. No Brasil, está presente na região da Depressão Central do Rio Grande do

Sul, entre outros locais (GUEDES, 1980). Na Argentina, é conhecido também como

bagre, bagre negro, bagre sapo e bagre sul-americano (GOMES et al., 2000). Esta

espécie tem preferência de viver em águas calmas, escondendo-se embaixo de

troncos e pedras. Têm hábitos noturnos e são considerados onívoros, alimentando-se

de invertebrados (crustáceos, insetos), restos vegetais e detritos orgânicos. Porém,

possui uma clara tendência a carnivoria (GUEDES, 1980; GOMES et al., 2000;

BALDISSEROTTO & RADUNZ NETO, 2004). Este peixe é considerado rústico, pois

suporta o intenso frio da região Sul do Brasil durante o inverno, bem como tem seu

crescimento potencializado durante o verão (BARCELLOS et al., 2003; SOSO et al.,

2007). Os alevinos são capazes de sobreviver a diversas alterações na água como

salinidade, pH, dureza, oxigênio e amônia (GOMES et al., 2000; MIRON et al., 2008).

De acordo com BARCELLOS et al. (2004), o jundiá quando cultivado a uma

densidade de 2 a 4 peixes/m

, pode alcançar 600 a 800 g em 8 meses de cultivo. As

fêmeas apresentam aproximadamente 66,5 cm e tem um tempo de vida de 21 anos;

os machos, atingem 52 cm e tem um tempo de vida de 11 anos. Devido às

características de sobrevivência desta espécie, ela se torna bastante favorável para

as práticas de aqüicultura que são bem freqüentes na região Sul do Brasil,

principalmente no Rio Grande do Sul (RS) (BARCELLOS et al., 2003; LAZZARI et al.,

2006). Além disso, esses peixes possuem uma carne de sabor agradável que é bem

aceita pelos consumidores (LAZZARI et al., 2006). Sendo assim, esta espécie

apresenta grande importância comercial e possui boas características para o cultivo

em nossa região.

FIGURA 1- Exemplar de Jundiá (Rhamdia quelen).

2.4. Piava (Leporinus obtusidens)

A piava, Leporinus obtusidens (Valenciennes, 1836; família Anostomidae; ordem

Characiforme) (Figura 2) é uma espécie de teleósteo nativa da região Sul do Brasil e

bem aceita pelos consumidores. Além disso, as espécies do gênero Leporinus são

recomendadas para o policultivo e consorcionamento, inclusive para rizipiscicultura

(ANDRIAN et al., 1994; BALDISSEROTTO et al., 2005). Podem ser encontradas nas

Bacias do São Francisco, do Paraná e do Uruguai (ZANIBONI FILHO & SCHULZ,

2003). No baixo Rio Uruguai, é uma espécie de elevada importância comercial e

recreativa. A alimentação é diversificada em juvenis e adultos, destacando-se, as

sementes, organismos aquáticos, crustáceos e moluscos (FRACALOSSI et al., 2002).

Em geral, as espécies do gênero Leporinus aceitam prontamente a ração e o

alimento preparado desde as primeiras fases de vida. O período reprodutivo se

concentra nos meses de dezembro e janeiro, apresentando desova total. São

encontrados em ambientes de água limpa.

FIGURA 2- Exemplar de Piava (Leporinus obtusidens)

2.5. Herbicida Clomazone

O clomazone (2- [(2-clorobenzil)]-4,4-dimetil-1,2-oxazolidin-3-ona), pertencente

ao grupo químico das isoxazolidinona, é encontrado na forma comercial de

concentrado emulsionável 36 ou 50% (GAMIT

) e apresenta a estrutura abaixo

(Figura 3).

FIGURA 3- Estrutura Química do Clomazone (Senseman, 2007).

É um herbicida seletivo, utilizado em pré ou pós-emergência inicial no controle

de várias espécies daninhas na cultura do arroz irrigado no sul do Brasil (ANDRES &

MACHADO, 2004) e também nas culturas de soja, mandioca, cana-de-açúcar e

algodão. Este produto possui grande solubilidade em água (1100 mg/L) e meia vida

de 28 a 84 dias, dependendo do tipo de solo e do nível de matéria orgânica (COLBY

et al., 1989).

Herbicidas desse grupo atuam de maneira geral na síntese dos pigmentos

carotenóides e apresentam o mecanismo de ação abaixo (Figura 4). O bloqueio da

síntese desses pigmentos é o fenômeno responsável pelo surgimento do sintoma

característico de “albinismo”. O uso do clomazone nas plantas inibe a biossíntese de

carotenóides e a folhagem produzida é totalmente branca após o tratamento, isto

pode ser chamado de "crescimento albino” (RODRIGUES & ALMEIDA, 1998). O

crescimento cessa e aparecem necroses. Este herbicida não inibe diretamente a

biossíntese de clorofila. A ocorrência da perda de clorofila resulta da destruição desta

pela luz (fotooxidação), ou talvez devido à falta de carotenóides indiretamente

causando a alteração da biossíntese normal de clorofila e do desenvolvimento do

cloroplasto (BRAMLEY & PALLET, 1993). Um papel importante dos carotenóides é o

de proteger a clorofila da fotooxidação. Normalmente a energia da forma reativa de

clorofila é dissipada através dos carotenóides. Quando os carotenóides não estão

presentes, estas clorofilas iniciam reações de degradação. No entanto, os herbicidas

que inibem a biossíntese de carotenóides não afetam os carotenóides pré-existentes.

Portanto os tecidos formados antes do tratamento não mostram os sintomas albinos

típicos (OLIVEIRA, 2001).

FIGURA 4- Mecanismo de Ação do Clomazone em Plantas (Oliveira, 2001).

2.6. Herbicida Quinclorac

O quinclorac (3, 7-dicloroquinolina-8- ácido carboxílico), um herbicida

pertencente ao grupo químico das quinolinas, é encontrado na forma comercial de

concentrado emulsionável 50% (FACET

) e apresenta a estrutura abaixo (Figura 5).

FIGURA 5- Estrutura Química do Quinclorac (Senseman, 2007).

Dentre os herbicidas seletivos utilizados na lavoura de arroz, o quinclorac,

mimetizador de auxina, reúne flexibilidade na aplicação (pré e pós-emergência),

eficiência de controle de Echinochloa spp., Digitaria spp. e Setaria spp., baixa

toxicidade ao homem e aos animais (GROSSMANN & KWIATKOWSKI, 2000). Este

produto possui solubilidade na água de 0,065 mg/L e meia vida de 21 dias na água

ou solo (ZANELLA et al., 2002). A ação inicial envolve o metabolismo de ácidos

nucléicos e a plasticidade da parede celular. Acredita-se que o herbicida quinclorac

possa causar a acidificação da parede celular através do estímulo da atividade da

bomba de prótons da ATPase, ligada à membrana celular. A redução no pH induz à

elongação celular pelo aumento da atividade de certas enzimas responsáveis pelo

afrouxamento celular. Baixas concentrações estimulam a RNA polimerase, resultando

em aumentos subseqüentes de RNA, DNA e biossíntese de proteínas. Aumentos

anormais nesses processos levam à síntese de auxinas e giberilinas, as quais

promoverão divisão e alongamento celular acelerado e desordenado nas partes

novas da planta, ativando seu metabolismo e levando ao seu esgotamento. Por outro

lado, em concentrações mais altas, esses herbicidas inibem a divisão celular e o

crescimento, geralmente nas regiões meristemáticas, que acumulam tanto

assimilados provenientes da fotossíntese quanto o herbicida transportado pelo

floema. Esses herbicidas estimulam a liberação de etileno que, em alguns casos,

pode produzir sintomas característicos de epinastia associados à exposição a esses

herbicidas (AHRENS, 1994).

2.7. Herbicida Metasulfuron Metil

O metasulfuron metil (methyl2-[[[(4-metoxi-6-methyl-1,3,5-triazine-2-)

amino]carbonyl]amino] sulfonyl-benzoate-), pertencente ao grupo químico das

sulfoniluréia, é encontrado na forma comercial de concentrado emulsionável 50%

(ALLY

) e apresenta a estrutura abaixo (Figura 6).

FIGURA 6- Estrutura Química do Metasulfuron Metil (Senseman, 2007).

Este composto é amplamente utilizado em lavouras de arroz no Sul do Brasil

contra gramíneas invasoras dessas culturas (ZANELLA et al., 2002). Metasulfuron

metil é uma nova classe de herbicida caracterizado pelo controle das plantas

daninhas em lavouras a baixas concentrações (2-75 g/ha) (ARUFE et al., 2004).

Segundo ZANELLA et al. (2002), o metasulfuron metil possui solubilidade na água de

9,5 mg/L e meia vida de 30 dias no solo ou, até de 30 a 120 dias (TREZZI et al.,

2001). Segundo OLIVEIRA (2001), os herbicidas inibidores da ALS (alanina

aminotransferase) foram responsáveis por 17% do mercado mundial de herbicidas

em 1994, mais do que qualquer outro grupo isoladamente. Uma grande variedade de

culturas é sensível às doses recomendadas de sulfuniluréias. Quando culturas são

plantadas em rotação com herbicidas desse grupo, a ocorrência de danos depende

da quantidade de herbicida persistente na estação seguinte, o que, por sua vez, é

influenciada pelo pH do solo, umidade e temperatura. A mesma cultura pode

responder de maneira diferente a um mesmo nível de resíduos de sulfuniluréias

dependendo de vários fatores ambientais e do solo. O mecanismo de ação desse

herbicida é a inibição da ALS, que é a enzima chave na rota de biossíntese de

aminoácidos valina, leucina e isoleucina (Figura 7). Após a absorção, esse herbicida

é rapidamente translocado para áreas de crescimento ativo (meristemas, ápices),

onde o crescimento é inibido em plantas suscetíveis. As plantas acabam morrendo

devido à incapacidade de produzir alguns aminoácidos essenciais de que necessita

(DURNER et al., 1991).

FIGURA 7- Mecanismo de Ação do Metasulfuron Metil em Plantas (Oliveira, 2001).

2.8. Concentração Letal Média (CL

)

A CL

-96h

é a concentração capaz de causar a mortalidade ou letalidade de

50% dos indivíduos até 96 horas após o início do teste de toxicidade. Estes testes

são recomendados para estudos preliminares a fim de estabelecer estimativas de

toxicidade das substâncias (SOLOMON, 1997). Os mesmos indicam que existe uma

variação entre os diferentes agroquímicos quanto a sua toxicidade (expressa pelos

valores de CL

), bem como quanto ao índice de segurança (estimado pela divisão da

pela concentração provável utilizada na lavoura). Assim, quanto maior o valor do

índice, menor é o risco desse produto de causar efeito letal sobre os organismos

(RESGALLA JÚNIOR, 2002). Segundo SOLOMON (1997), índices de segurança

superiores a 20 demonstram produtos com menor risco de impacto ambiental. Assim,

o uso de CL

para testes de toxicidade permite avaliar o potencial deletério que

alguns químicos exercem sobre os organismos, sob condições controladas de

laboratório (RAND & PETROCELLI, 1985). A classe toxicológica de determinado

produto também se baseia na integração de suas características fisicoquímicas,

envolvendo sua persistência ou degradação (meia-vida, constantes de hidrólise,

fotólise e outros) e a sua capacidade de bioconcentração.

É importante que na avaliação da toxicidade dos agroquímicos sejam utilizadas

espécie bioindicadoras, como os peixes, que ocupam o topo da cadeia alimentar.

Estes testes permitem a identificação dos produtos químicos que apresentam

menores riscos de impacto ambiental e toxicidade, além de reconhecer aqueles que

poderiam ser utilizados nas lavouras de arroz consorciado com peixes. O efeito tóxico

pode variar conforme a espécie testada, de acordo com o tipo de agroquímico e

tempo de exposição. Por exemplo, avaliou-se a toxicidade aguda do clomazone

determinando a CL

-96 h para os alevinos de tetrarisca-negra (Hyphessobrycon

scholzei) onde o valor foi equivalente a 27,67 mg/L, enquanto em truta arco-íris

(Salmo gairdineri) foi de 19 mg/L (JONSSON et al., 1998; VECIL et al., 2002). Em

juvenis de carpa comum (Cyprinus carpio) a CL

-96 h foi de 19,52 mg/L a exposição

do clomazone; 6,65 mg/L ao quinclorac e 26 mg/L para a exposição ao metasulfuron

metil (RESGALLA JÚNIOR et al., 2002). Estudos de toxicidade da carpa comum

exposta ao cypremetrin demonstram valores para CL

-96 h de 0,004 a 0,0022 mg/L

e após 48 h de exposição o valor da CL

é de 0,006 mg/L

(DAVID et al., 2004).

Contudo, trabalhos recentes indicam que não há uma relação constante entre

concentração letal e a concentração segura para a sobrevivência ou crescimento. Ela

varia de espécie para espécie, podendo ser em torno de 3% da concentração letal

para catfish de canal (Ictalurus punctatus) e 12% para Pimephales promelas

(TOMASSO, 1994). Contudo, os valores de CL

- 96h são muito superiores às

concentrações estabelecidas para efeitos metabólicos ou sub-letais (RESGALLA

JÚNIOR, 2002).

2.9. Parâmetros de Crescimento

Xenobióticos encontrados no ambiente podem gerar toxicidade às populações

expostas e causar alterações no crescimento dos organismos. Os testes de

toxicidade são baseados na sobrevivência, crescimento e na reprodução de peixes

(SOSO et al., 2007). NIEVES-PUIGDOLLER et al. (2007) demonstraram que em

Atlantic salmon smolts expostos a níveis subletais do herbicida atrazina (0,1 mg/L)

apresentam distúrbios na osmorregulação, na alimentação e no crescimento.

ALVAREZ et al. (2005) mostraram que a exposição a 0,004 e 0,008 mg/L de atrazine

por 96h reduz o crescimento de larvas de Red drum (Sciaenops ocellatus). Em

adição, estudos tem evidenciado uma diminuição na população de rotíferos

(Brachionus sp.) alimentados com microalgas expostas ao triazine; demonstrando

que a população pode acumular poluente através da cadeia alimentar (RIOBOON et

al., 2007).

2.10 A Atividade da Acetilcolinesterase

As colinesterases são enzimas importantes na neurotransmissão colinérgica

central e periférica, além de exercerem funções como a detoxificação de xenobióticos

(ROEX et al., 2003). De acordo com suas propriedades catalíticas e especificidade a

substratos, sensibilidade a inibidores e distribuição tecidual, as colinesterases podem

ser classificadas em dois tipos principais: acetilcolinesterase (AChE; E.C. 3.1.1.7) e

butirilcolinesterase ou pseudocolinesterase (BuChE; E.C. 3.1.1.8) (MASSOULIÉ et al.,

1993). A AChE é distribuída por todo o corpo e hidrolisa preferencialmente ésteres

com grupamento acetil, como a acetilcolina (ACh) (DUTTA & ARENDS, 2003). A

enzima AChE é responsável por degradar o neurotransmissor ACh, regulando seus

níveis no sistema nervoso (central e periférico), nas junções neuromusculares e nas

fendas sinápticas (Figura 8). MENDEL & RUDNEY (1943), demonstraram que carpas

(Cyprinus carpio) possuem apenas AChE no cérebro. Outros trabalhos também

relataram AChE cerebral em várias espécies de peixes (GAAL, et al., 1980;

KOZLOVSKAYA et al., 1993; CHUIKO, 2000). A atividade da AChE cerebral pode ser

afetada por fatores como: a temperatura ambiental, a espécie, o ciclo reprodutivo, o

sexo e a idade (YI et al., 2007). Assim, esta enzima tem sido utilizada como um

indicador para diagnosticar o efeito da exposição de compostos como carbamatos e

organofosforados (CHUIKO, 2000; SANCHO et al., 2000; FERNÁNDEZ-VEJA et al.,

2002). Estes pesticidas, ao inibirem a atividade da AChE induzem o acúmulo do

neurotransmissor ACh, nas sinapses colinérgicas (central e periféricas) e junções

neuromusculares, levando a uma super-estimulação das células-alvo. Como

conseqüência, várias alterações motoras, como distúrbios na locomoção, no

equilíbrio, tremores, convulsões e até morte dos peixes (SAGLIO & TRIJASSE, 1998;

BRETAUD et al., 2000; SANCHO et al., 2000; FERNÁNDEZ-VEGA et al., 2002;

ROEX et al., 2003). Em geral, os peixes intoxicados com inseticidas

anticolinesterásicos mostram sinais de paralisia muscular, hiperatividade e perda de

equilíbrio (CERÓN et al., 1996). O carbofuran é um inseticida, nematicida e acaricida

utilizado mundialmente e está incluído no grupo dos carbamatos. Este é considerado

um inibidor da AChE e muito tóxico para peixes e mamíferos (BRETAUD et al., 2000;

ALVES et al., 2002). Além disso, estudos têm verificado que outras classes de

pesticidas podem também causar alterações na atividade da AChE em peixes

(BRETAUD et al., 2000, DUTTA & ARENDS, 2003; MIRON et al., 2005; GLUSCZAK

et al., 2006; MORAES et al., 2007). DUTTA & ARENDS (2003) observaram inibição

da atividade da AChE cerebral em Lepomis macrochirus expostos ao organoclorado

endosulfan. Assim, a medida da atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) pode

ser utilizada como um parâmetro indicador para avaliar a toxicidade de pesticidas em

peixes.

Colina

acetato

ACh

FIGURA 8- Sinapse colinérgica (Adaptado de Soreq e Seidman, 2001).

Neurônio pós-sináptico

2.11. Intermediários Metabólicos

Diversas mudanças que ocorrem no metabolismo de peixes devido à exposição

a herbicidas estão sendo utilizadas para identificar o estresse gerado pela

contaminação ambiental devido à toxicidade do químico (JYOTHI & NARAYAN, 1999;

DAS & MUKHERJEE, 2003; BEGUM, 2004). Recentemente, tem sido demonstrado

que durante a exposição aos produtos químicos, a síntese e a degradação de

diferentes metabólitos podem ser ativadas diferentemente para suprir as

necessidades de energia dos peixes (AGUIAR, et al. 2004; SCOTT & SLOMAN,

2004; GLUSCZAK et al., 2007). Assim, os níveis de glicose, glicogênio, lactato e

proteína em diferentes tecidos de peixes expostos a herbicidas tem sido estudados

por vários autores (JYOTHI & NARAYAN, 1999; ORUÇ & ÜNER, 1999; SANCHO et

al., 2000; DAS & MUKHERJEE, 2003; BARCELLOS et al., 2004; CRESTANI et al.,

2006; GLUSCZAK et al., 2006,2007).

O fígado é considerado um órgão essencial nos processos de acumulação,

biotranformação e principalmente desintoxicação de toxinas químicas (SUAREZ &

MOMMSEN, 1987; PEIXOTO et al., 2006). Além disso, este desempenha papel

integrador entre os mecanismos energéticos do organismo, ajudando a regular as

taxas de glicose no sangue, estocando-a na forma de glicogênio. E, se o nível de

glicose no sangue diminui, este converte o glicogênio em glicose e devolve-o ao

sangue para que seja distribuído a todos os órgãos ou tecidos do organismo que

estejam necessitando. O glicogênio existe principalmente no fígado, mas este é

também presente no músculo. A exposição de jundiás ao herbicida clomazone

aumenta os níveis de glicogênio no fígado e diminui no músculo, demonstrando que

os peixes usam esta fonte de energia para compensar a situação de estresse à

exposição (CRESTANI et al., 2006). Assim, os peixes afetados por estresse

ambiental podem ter alterado os níveis de glicogênio, degradando-o, e ocasionando

grandes perdas dessa reserva de glicose. Isto reflete um mecanismo de

compensação fisiológica em resposta a exposição á químicos como agrotóxicos

(BIDINOTTO et al., 1997; JYOTHI & NARAYAN, 1999; ORUÇ & ÜNER, 1999;

BEGUM, 2004).

Além dos níveis de glicose e glicogênio as alterações metabólicas em peixes

expostos a herbicidas podem ser analisadas também nos níveis de lactato e proteína.

Através da gliconeogênese podem-se gerar moléculas de glicose a partir de outras

moléculas orgânicas como piruvato, lactato, glicerol e alguns aminoácidos (RAHAMI

& ABDOLLAHI, 2007). Então, ocasionalmente os peixes podem usar outros

precursores como o lactato, como uma fonte de energia (BEGUM &

VIJAYARAGHAVAN, 1999). Muitos pesticidas induzem condições de hipóxia tecidual

nos peixes, favorecendo o metabolismo anaeróbico para obtenção de energia (KNOX

et al., 1980; ORUÇ & ÜNER, 1999). Portanto, o aumento nos níveis de lactato

hepático, muscular e plasmático representa uma resposta rápida à necessidade de

energia através do metabolismo anaeróbico e, já foi observado em vários estudos

(BEGUM & VIJAYARAGHAVAN, 1999; CRESTANI et al., 2006; GLUSCZAK et al.,

2006; FONSECA et al., 2008). No geral, todas mudanças indicam desordens

metabólicas e são usadas como indicadores da toxicidade de herbicidas. Além disso,

uma grande parte do organismo dos peixes é formada por proteínas e estas também

podem ser utilizadas como o combustível preferido para fornecer a demanda de

energia durante uma situação de estresse (PEIXOTO et al., 2006). Nesse sentido, foi

observado que a exposição ao carbofuran causa uma diminuição no conteúdo

protéico hepático e muscular de Clarias batrachus (linn) (BEGUM, 2004). Assim, o

catabolismo de proteínas pode também indicar uma adaptação fisiológica dos peixes,

para compensar a condição de toxicidade gerada pela exposição ao produto químico

(SANCHO et al., 1998; VEJA et al., 2002).

2.12 Estresse Oxidativo e Defesa Antioxidante

As reações de oxidações são essenciais no metabolismo normal dos

organismos aeróbicos. Nas células aeróbicas, espécies reativas de oxigênio (EROs)

são produzidas durante o metabolismo oxidativo produzindo radicais livres, os quais

são produtos da redução parcial do oxigênio (BOVERIS & BERMÚDEZ, 1996). Estes

podem causar danos em componentes estruturais e funcionais das células, levando a

modificação ou perdas das funções celulares (VAL et al., 1996). Porém, essa

produção é equilibrada com uma produção equivalente de antioxidantes, que visa

neutralizar os efeitos deletérios dos Eros (AHMAD et al., 2000). As enzimas catalase

(CAT; EC, 1.11.1.6), superóxido dismutase (SOD) e Glutationa peroxidase (GPx) são

responsáveis pela proteção celular contra as EROs e, assim formam parte do sistema

antioxidante celular. Estas mostram maior atividade no fígado, órgão de

captação/transformação enzimática de EROs (LEMAIRE et al., 1994). As alterações

dessas enzimas em peixes podem ser usadas como indicadores de exposição aos

poluentes aquáticos (AHMAD et al., 2000; LI et al., 2003, MORAES et al., 2007).

Atualmente, várias classes de poluentes, entre eles os herbicidas, podem aumentar a

produção de EROs em diversos organismos aquáticos, como os peixes, ocasionando

assim uma situação de estresse oxidativo (WINSTON, 1991; AHMAD et al., 2000;

ÜNER et al., 2005). Com o aumento excessivo das EROs intracelulares, a

capacidade de atuação das defesas antioxidantes é prejudicada, ocorrendo um

desequilíbrio entre pró-oxidantes e antioxidantes (enzimático ou não enzimático).

Conseqüentemente, devido sobrecarga do mecanismo antioxidante, ocorre estresse

oxidativo (ÜNER et al., 2006). Em uma situação de estresse oxidativo pode ocorrer

ainda a peroxidação lipídica (LPO) que é observada pelo aumento de malondialdeído

(MDA) e a carbonização de proteínas que indica possíveis danos causados as

proteínas (PARVEZ & RAISUDDIN, 2005). A LPO e o aumento da carbonilação de

proteínas induzida por poluentes ambientais são algumas das principais causas de

doenças que ocorrem em peixes (LI et al., 2003; PARVEZ & RAISUDDIN, 2005).

Segundo, RADI et al. (1985), a formação de LPO induzida por poluentes tem sido

observada em espécies de peixes que apresentam vários sistemas antioxidantes,

entre eles as enzimas CAT e SOD. Assim, mudanças no conteúdo desses

parâmetros podem também refletir a presença de tóxicos (AHMAD et al., 2000).

2.13. Capacidade de Recuperação

As alternativas para minimizar o impacto dos herbicidas são várias.

Primeiramente é recomendada a utilização das doses mínimas na aplicação, o que

geralmente propicia uma redução de 30-50% em relação à dose máxima do

herbicida, mas pode chegar até 85% no caso do glifosato (IRGA, 2001). Também se

sugere manter estática a lâmina de água por um período mínimo de duas semanas

após a aplicação, o que pode proporcionar uma redução de 97% do clomazone

aplicado (NOLDIN, 2001), bem como construir adequadamente as taipas-ronda para

evitar extravasamento (MARCHESAN et al., 2007). Deste modo, estima-se que a

água da lavoura que for liberada para os rios e lagos apresentará uma quantidade

menor do agroquímico no ambiente. No entanto, é imprescindível obter informações

sobre os efeitos desses produtos químicos durante a exposição e sucessivamente

sobre um período de recuperação em água livre de produto químico, uma vez que as

alterações em peixes expostos a determinados químicos podem ser reversíveis, ou

menos prolongadas quando comparado a outros químicos (DEMBELÉ et al., 1999).

No entanto, o tempo de recuperação dos peixes depende de vários fatores, tais

como: o tipo, a concentração e o tempo de exposição ao pesticida e a espécie

testada (SANCHO et al, 2000; MIRON et al., 2005). O conteúdo de proteínas e o

glicogênio hepático, em peixes após a exposição ao carbofuran permanece

diminuídos em após três dias em água sem o inseticida. SANCHO et al. (1998)

observaram que a maioria das alterações metabólicas não persiste após o período de

recuperação de 8 dias. Estas informações são muito importantes para obter medidas

do potencial tóxico dos pesticidas, os quais quando aplicados em excesso ou de

maneira errônea, podem afetar o ecossistema aquático e exercer efeitos adversos em

outros organismos associados.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados e discussão deste trabalho serão apresentados em dois artigos

científicos e dois manuscritos, distribuídos em quatro capítulos, como segue:

Capitulo I: Efeitos dos herbicidas clomazone, quinclorac e metasulfuron metil sobre

atividade da acetilcolinesterase de jundiás (Rhamdia quelen) (Heptapteridae).

Artigo I: Effects of the herbicides clomazone, quinclorac, and metsulfuron

methyl on acetylcholinesterase activity in the silver catfish (Rhamdia quelen)

(Heptapteridae).

Capítulo II: Sobrevivência, crescimento e parâmetros metabólicos de jundiás

(Rhamdia quelen) expostos a herbicidas usados no arroz.

Manuscrito I: Survival, growth and metabolic parameters of silver catfish

(Rhamdia quelen) exposed to herbicides used in rice fields.

Capítulo III: Efeitos bioquímicos do herbicida clomazone sobre piavas (Leporinus

obtusidens).

Artigo II: Biochemical effects of clomazone herbicide on piava (Leporinus

obtusidens).

Capítulo IV: Formulação comercial contendo clomazone afeta alguns parâmetros

metabólicos de piavas (Leporinus obtusidens).

Manuscrito II: Commercial formulation containing clomazone affects some

metabolic parameters in piava (Leporinus obtusidens).

CAPÍTULO I

ARTIGO I:

Effects of the herbicides clomazone, quinclorac, and metsulfuron methyl on

acetylcholinesterase activity in the silver catfish (Rhamdia quelen)

(Heptapteridae)

Denise dos Santos Miron, Márcia Crestani, Maria Rosa Schetinger, Vera Maria Morsch,

Bernardo Baldisserotto, Miguel Angel Tierno, Gilberto Moraes, Vania Lucia Pimentel Vieira

(Publicado na Revista Ecotoxicology and Environmental Safety, v. 61, pp. 398-403, 2005)

CAPÍTULO II

MANUSCRITO I:

Survival, growth and metabolic parameters of silver catfish

(Rhamdia quelen) exposed to herbicides used in rice fields.

Denise dos Santos Miron, Bernardo Baldisserotto, Vânia Lucia Loro, Alexandra Pretto,

Bibiana Moraes, Sérgio Oliveira Machado, Enio Marchezan, Vera Maria Morsch

(Em fase de Redação)

Survival, growth and metabolic parameters of silver catfish (Rhamdia quelen)

exposed to herbicides used in rice fields

Miron, D. S.

; Baldisserotto, B.

; Loro, V. L.

; Moraes, B.

; Pretto, A.

; Machado, S.

; Marchezan, E.

; and Morsch, V. M.

Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), 97105-

900 Santa Maria, RS, Brazil;

Programa de Pós-graduação em Bioquímica

Toxicológica, Santa Maria, Brazil;

Departamento de Fisiologia e Farmacologia,

(UFSM), Santa Maria, RS, Brazil;

Departamento de Defesa Fitossanitária, (UFSM),

Santa Maria, RS, Brazil;

Departamento de Fitotecnia, (UFSM), Santa Maria, RS,

Brazil.

Corresponding Author:

(∗) Drª. Vera Maria Morsch.

Departamento de Química

Universidade Federal de Santa Maria

97105.900 - Santa Maria, RS, Brazil.

Phone: (55) 3220-8978

Fax: 55 (55) 3220-8240

E-mail: [email protected]

Abstract

The objective of the present study was to investigate in silver catfish (Rhamdia

quelen) the effects of water drained from rice fields 21 days after receiving application

of the commercial formulation of the herbicides clomazone (0.5 mg L

-1

), quinclorac

(0.375 mg L

-1

) and metsulfuron methyl (0.002 mg L

-1

). The parameters analysed after

of exposure to herbicides were: growth specific (15, 30 and 45 days); biomass and

survival (45 days); some metabolic parameters (15 and 45 days). Metsulfuron methyl

was not detected in the water seven days after the application in the rice field, while

quinclorac and clomazone were detected even after 14 and 28 days. The fish exposed

to quinclorac exhibited 96 % survival, while those exposed to the other treatments

presented 100% survival. The exposure to clomazone and quinclorac showed in the

fish significantly lower weight, length and specific growth rate after 45 days, while

significantly lower biomass was observed only in those exposed to quinclorac.

Clomazone and quinclorac resulted in higher glycogen levels in the liver, but lower

glucose and lactate in the fish as compared to control. Fish exposed to metsulfuron

methyl also showed the same responses, but only after 15 days exposure. Lower

glycogen and glucose and higher lactate levels were detected in exposure to all

herbicides after 45 days. The results obtained conclude that water drained from rice

fields that received an application of clomazone and quinclorac may affect normal

growth and metabolism of fish, while metsulfuron methyl appears to be safe.

Apparently silver catfish showed a mechanism glycogen storage in the hepatic tissue

as strategies to support the increased metabolic demand due to detoxification of the

herbicides. In the muscle it seems to occur a stressful condition with increased lactate

levels, indicating clear energy degradation.

Keywords: clomazone; quinclorac; metsulfuron methyl; rice-fish culture; metabolic

response

1. Introduction

The pollution of natural waters is one of the most critical environmental issues.

Several hundreds pesticides of different chemical structure are used worldwide in

agriculture. These pesticides are considered to be essential for agricultural

development, but some of them can provoke serious environmental contamination,

principally in water (Zanella et al., 2000). Rice is one of the major cereal crops and is

grown predominantly in the tropics and subtropics. This culture has been expanded

largely by mechanization of farming, higher yielding varieties of rice, high levels of

fertilizer, and widespread use of herbicides (Fernando, 1993). The practice of fish-

culture in rice fields has had a checkered history dating back to 2000 years in China.

Fish culture as an integrated and concurrent activity with rice culture in the same field

is important for the rational utilization of limited land resources, as well as a

sustainable source of fish protein, additional income and employment generation

(Jamu and Costa-Pierce, 1995). Due to their widespread distribution and toxic nature,

herbicides may have a serious impact on the aquatic environment, and can also affect

aquaculture species indirectly through their toxicity to phytoplankton. The EEC

Directive 80/778 concerning water quality for human consumption established a

maximum concentration of 0.1 μgL

-1

for each individual herbicide. The sum of total

residual toxicants cannot exceed 0.5 μgL

-1

(Aguillar et al., 1997). Clomazone

(isooxazolidinone), quinclorac (quinoline) and metsulfuron methyl (sulfonylurea) are

post-emergence herbicides widely used in paddy rice fields in Southern Brazil, with

activity against weeds and aquatic gramineae (Jonsson et al., 1998). Clomazone is

currently used for weed control in the cultivation of soybeans, cotton, rice, sugar cane,

corn, tobacco, and various vegetable crops (Liu et al, 1996). This herbicide possesses

a residual effect lasting up to 120 days and is highly soluble in water (1.100 mg L

-1

with a consequent potential for groundwater contamination (Rodrigues and Almeida,

1998). Quinclorac is used in post-emergence application to control some broad leaves

weeds in rice and turfelds (Zanella et al., 2002). Metsulfuron methyl is an herbicide

characterized by weed control at very low use rates (2-75 g/ha- converter para µg/L)

(Arufe et al., 2004).

Contamination of the environment by herbicides may cause several behavioral

and disorders in freshwater ecosystems. Chemical when applied in excess, due great

distribution and toxic nature can impact the aquatic ecosystem and exert adverse

effect in organisms associates (Bowmer, 1987). Herbicides may slow down reflexes,

swimming, feeding, survival, growth, and metabolic system of fish (Hussein et al.,

1996; Oruç and Uner, 1999; Scott et al., 2004; Miron et al., 2005). Alterations caused

in fish by the toxic effects of herbicides can be recognized also with measurements of

proteins and carbohydrates (Begum, 2004).

The silver catfish, Rhamdia quelen (Quoy and Gaimard, 1824; Heptapteridae),

occurs from southern Mexico to central Argentina, and was chosen for this experiment

due to its ecological importance. The culture of this fish is also interesting because it

presents a good growth rate, high fertilization rate and hatchery and is acceptable on

the consumer market (Piaia et al., 1999). Studies were made to determine the best

water conditions to improve culture of this species (Zaions and Baldisserotto, 2000;

Gomes et al., 2001; Baldisserotto and Radunz Neto, 2004; Baldisserotto and Gomes,

2005). Thus, the aim of this study was to determine the effect of water from rice fields

with herbicides in silver catfish growth, survival and some metabolic parameters. The

understanding of these effects can indicate if the water removed from the rice fields

and discharged into the rivers could impair fish life.

2. Material and methods

2.1 Herbicides and rice culture

A permanent flooded irrigation (10 cm water depth) of the rice crop was started 15

days after emergence of the plants. The following herbicides were applied separately

to the rice crops: 0.5 mg L

-1

clomazone (2-(2-chlorophenyl)methyl-4,4-dimethyl-3-

isooxazolidinone, Gamit, 50 % purity), 0.375 mg L

-1

quinclorac (3, 7-dichloroquinoline-

8-carboxylic acid, Facet, 50% purity) and 0.002 mg L

-1

metsulfuron methyl (methyl2-

[[[(4-metoxi-6-methyl-1,3,5-triazine-2-)amino]carbonyl]amino] sulfonyl-benzoate –

sulfonylurea, Ally, 50 % purity). The water for the control group received the same

treatment, but no herbicide was applied to the rice culture. Each treatment had three

replicates.

2.2. Fish

Silver catfish juveniles (weight, 3.15 ± 0.03 g; length, 7.06 ± 0.05 cm) were obtained

from a local commercial fish culture and transported to the Fish Physiology

Laboratory, Universidade Federal of Santa Maria, Santa Maria, southern Brazil. Fish

were acclimated in 250 L tanks at a stocking density of 400 fish.m

-3

for 15 days. After

acclimation, the water of these tanks was replaced for water removed from rice culture

ponds 21 days after herbicide application. The water used for this experiment was

removed from the rice culture only 21 days after herbicide application because at this

period farmers start draining the water with the herbicides into nearby rivers. Each 250

L tank contained a small funnel coated with a plastic mesh and positioned on the

bottom. This funnel was connected to a tube and discharged water into a filter made of

acrylic wool over the surface of the box. Continuous aeration with an air pump (20 W)

promoted water circulation through this system, which was used to reduce water

turbidity. Silver catfish were exposed for 45 days to water drained from rice culture.

Each fish tank received the water from a different replicate of the rice culture, and

consequently, there were three replicates for each treatment. Fish were fed three

times a day (08:30, 12:00, and 17:30 h) with commercial feed (28 % CP, Supra,

Brazil) (5 % total biomass). Feces and pellet residues were removed at three days

intervals by suction, and around 20% water was replaced by water collected from the

rice culture at the same day. Water parameters were as follows: temperature 21 ± 1

C, pH 7.2 ± 0.02 units, dissolved oxygen 7.4 ± 0.03 mg L

-1

, non-ionized ammonia 0.7

± 0.01 μl L

-1

, alkalinity 45 ± 1.4 mg L

-1

CaCO

and hardness 20 ± 0.5 mg L

-1

CaCO

Photoperiod was 12 h light – 12 h dark, with luminosity of 0.6 lux (measured with a LI-

COR photometer model LI-185B), since dark environments reduce stress of silver

catfish (Piaia et al., 1999).

2.3 Fish samples

Samples of 15 juveniles were collected from each replicate at 15, 30, and 45 days

after the beginning of the experiment to measure weight and length. Specific growth

rate (SGR) was calculated for each collect by the method of Jørgensen and Jobling

(1993). At day 45 all surviving fish were collected to determine survival and biomass

(individual mean weight x number of surviving fish).

2.4 Metabolic evaluation

The sampled fish at 15 and 45 days were killed by punching the spinal cord. Liver and

muscle were excised and immediately frozen in liquid nitrogen and then stored at –20

°C for metabolic assay. For determination 50-100 mg of these tissues were dissolved

in an equal volume of 20 % TCA using a Potter-Elvehjem homogenizer. The acid

homogenate was centrifuged at 3000g for 10 min and supernatant was used for the

determinations of glucose and lactate. Glucose was estimated by the method of

DuBoie (1956) and lactate by the method of Harrower and Brown (1972). Protein was

determined by the method of Lowry et al. (1951) after alkaline digestion of the tissues

with KOH. Tissue glycogen was determined after ethanol isolation followed by acid

hydrolysis (Bidinotto and Moraes, 1997).

2.5. Water evaluation

Through the experimental period, water parameters were analyzed daily. The pH was

measured with a pHmeter Oakton, total ammonia nitrogen (NH

+ NH

) and non-

ionized ammonia nitrogen (N-NH

) was determined by the method as described by

Boyd and Tucker (1992) Temperature and dissolved oxygen were determined with an

YSI oxygen meter (model Y5512), alkalinity using a kit from Alfa Tecnoquímica

(Florianópolis, Brazil) and water hardness by the EDTA titrimetric method. The

herbicide concentration in the water was measured by high-performance liquid

chromatography (HPLC) according to Zanella et al. (2002).

2.6. Statistical analysis

The experimental design was fully randomized, with three replicates per treatment. All

data are expressed as mean ± standard deviation (SD), with the level of significance

at P < 0.05. Weight, length, specific growth rate, total biomass, and metabolic

parameters were analyzed by one-way ANOVA and the Tukey-Kramer test. Survival

was analyzed by the chi-square test (Instat Program version 2.05).

3. Results

Waters collected from the rice fields that received application of clomazone,

quinclorac and metsulfuron methyl showed similar water quality parameters compared

to control water: temperature (22.0 ± 0.6 ºC), dissolved oxygen (6.5 ± 0.1 mg L

-1

), pH

(7.3 ± 0.2 units), total ammonia (0.8 ± 0.2 mg L

-1

), total alkalinity (87 ± 0.1 mg L

-1

CaCO

), and water hardness (75 ± 0.1 mg L

-1

CaCO

). Herbicides concentration in

the water from the rice fields decreased as time went by. The decrease in metsulfuron

methyl concentration was gradual and after 14 days of application it was not detected

in the water. Quinclorac and clomazone presented the highest concentration decrease

between 7 and 14 days after application, and were not detected after 21 and 60 days,

respectively (Table 1).

After 45 days exposure to herbicides the fish exposed to quinclorac presented

4% mortality. After exposed to clomazone was showed significantly lower weight,

length and SGR in fish after 15 and 45 days as compared to the control group. Fish

exposed to quinclorac presented lower weight, length and biomass than the control

group after 45 days, while those exposed to metsulfuron methyl showed higher weight

and length 30 days, but at 45 days these values were not significantly different from

the control group (Table 2).

In tissue of hepatic of silver catfish exposed to clomazone, quinclorac and

metasulfuron methyl was observed glycogen increased and lactate decreased after 15

days, but after 45 days glycogen hepatic increased only in fish exposed to clomazone

and quinclorac herbicide. (Figure 1, 2 and Table 3). The levels of muscle glycogen

increased after 45 days in fish exposed to all herbicides tested (Table 3). After 45

days muscle glucose levels decrease and lactate levels were significantly higher in

fish exposed to all herbicides used compared to control fish (Figure 2). Hepatic and

muscle protein content was not affected significantly by the treatments (Table 3).

4. Discussion

Water parameters were maintained at optimum levels for silver catfish culture

(Baldisserotto and Radunz Neto, 2004). Environmental pollutants such as herbicides

are harmful to aquatic organisms and a great deal of research has been conducted to

understand the effects of toxicants on the survival. In the water of rice used in this

studied with addition of clomazone and metsulfuron methyl exhibit 100% survival level.

Silver catfish was more sensitive to quinclorac because noted influence in proportion

of survival that decreased 4 % as compared to control. In according Miron et al.

(2004), this result suggests that concentration of quinclorac applicator in culture rice

can have affect in fish, such as behavior or survival.

The lethal concentration (LC

-96 h) of the studied herbicides for silver catfish

is well above the initial concentration applied to the rice fields (mg L

-1

): 7.32 for

clomazone and 390 to 400 for quinclorac and to metsulfuron methyl it was not

obtained, since all silver catfish survived even to 1.200 (Miron et al., 2004). In addition,

in the present study the water collected from the rice fields 21 days after application

showed quinclorac and metsulfuron methyl levels below detection limit, and

clomazone concentration was 0.003 mg L

-1

. These results are in agreement with

Zanella et al. (2000) which demonstrated that analysis of water from the experimental

rice field show that clomazone is persistent at 28 days after application the

concentration was still the limit normally for environmental waters (0.001 to 0.003 mg

-1

). In constrast the quinclorac its half-life in water is 21 days and metsulfuron methyl

is 30 days in the soil (Barceló and Hennion, 2002).

Exposure to clomazone and quinclorac (but not metsulfuron methyl) impaired

growth of silver catfish. Miron et al. (2004) observed decreased feeding in silver

catfish exposed to clomazone (20 and 50 mg L

-1

), quinclorac (390 and 400 mg L

-1

but not in those exposed to metsulfuron methyl (up to 1.200 mg L

-1

). Some xenobiotic

that in environment can cause damage at population affect growth. Alvarez et al.,

(2005) showed that Red drum larvae (Sciaenops ocellatus) exposed to atrazine for 96

h (40 and 80 mg L

-1

) reduced growth rate and demonstrated an elevated rate of

energy utilization in total metabolic rate that could reduce the population by as much

as 24% of fish larvae.

Nieves-Puigdoller et al. (2007) demonstrated sublethal levels

of the herbicide atrazine (0.1 mg L

-1

) in laboratory conditions alter normal physiological

functions of Atlantic salmon smolts, cause osmoregulatory disturbance, reduction in

food intake and growth of the fish. Decreased food consumption and increased

lethargy were observed in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and catfish

(Chrysichthyes auratus) after exposure to 3 and 6 mg L

-1

atrazine (Hussein et al.,

1996).

The present findings demonstrate clearly a disrupted metabolism in silver

catfish exposed to the herbicides. In fish the site of glycogen synthesis and storage is

the liver, which is also the metabolic center for detoxification and a source of glucose

(Suarez and Mommsen, 1987; Moon, 1998). In the hepatic tissue our results showed

that fish maintained in water from the rice fields that received clomazone and

quinclorac presented higher glycogen, but lower lactate levels as compared to control

fish. Silver catfish exposed to metsulfuron methyl also showed these responses in

hepatic tissue, but only after 15 days, and values returned to control levels after this

period. We suggest that this is a strategy of the liver in response to an increased

metabolic demand for detoxification. Cattaneo et al. (2008), observed that silver

catfish exposed to 700 mg L

-1

at 2, 4-D for 96h also decreased hepatic glucose levels.

Silver catfish showed muscle metabolic changes when exposed to waters

originating from the rice fields treated with all herbicides. These changes may be due

to utilization of carbohydrates for energy production as a response to stress toxicity,

such hypoxia condition or hyperexcitability that the fish shows after exposure

herbicides (Gimeno et. al., 1995; Oruç and Üner, 1999). These metabolic disorders

could also be due to a fermentative strategy, with glycogen mobilization to muscle

lactate elevation indicated energy depletion by herbicide exposure. Some authors

usually describe this strategy for other fishes exposed to herbicides (Verma et al.,

1983; Gill et al., 1991; Jyothi and Narayan, 1999; Aguiar, 2000). In agreement with

Ferrando and Andreu-Moliner (1991), who reported a decrease muscle glycogen level

in eels (Anguilla anguilla), after sublethal exposure to lindane. Studies have shown

that the stress caused by herbicides is frequently followed by depletion modification of

muscle and this is one of the many consequences of oxidative stress in fish (Oruç and

Üner, 1999; Sayeed et al., 2003).

5. Conclusion

The results obtained in the present study allow concluding that exposure of silver

catfish to water from rice fields that received the recommended concentration of

clomazone and quinclorac for rice culture may affect its growth and metabolism even if

this species is exposed to the water 21 days after herbicide application. The exposed

fish showed a mechanism of mobilizing energy from glucose and storage glycogen in

the hepatic tissue, due to the increased metabolic demand of the detoxification. In

addition, the glycogen degradation and increased lactate levels in the muscle of fish

exposed to the studied herbicides indicate clear energy degradation in response to

this stressful condition. In addition, metsulfuron methyl appears safer for silver catfish

than clomazone and quinclorac. The studied parameters indicate that silver catfish

can be a bioindicator for herbicides contamination.

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Chromatographia 55(9/10): 573-577.

Figure caption

Figure 1. Glucose and lactate (nmol mg

-1

protein) levels in the liver and muscle of

silver catfish (Rhamdia quelen) exposed 15 days at water from rice fields applied to

the rice fields. Seen as (GH) Hepatic glucose, (LH) Hepatic lactate, (GM) Muscle

glucose and (LM) Muscle lactate. Results are the means ± SD of ten fish per group. (*)

Indicates significant difference from control group (P<0.05).

Figure 2. Glucose and lactate (nmol mg

-1

protein) levels in the liver and muscle of

silver catfish (Rhamdia quelen) exposed 45 days at water from rice fields applied to

the rice fields. Seen as (GH) Hepatic glucose, (LH) Hepatic lactate, (GM) Muscle

glucose and (LM) Muscle lactate. Results are the means ± SD of ten fish per group. (*)

Indicates significant difference from control group (P<0.05).

Fig 1.

Fig 2.

Table 1. Concentration of herbicides applied to the rice fields as a function of time.

Herbicides (mg L

-1

)

Days Clomazone Quinclorac Metsulfuron-methyl

(nominal)

0.500 0.375 0.002

1 0.390 (0.342-0.430) 0.131(0.099-0.146) 0.0013

7 0.199 (0.081-0.323) 0.072 (0.040-0.126) 0.0014

14 0.006 (0.005-0.008) 0.003 (0.000-0.0047) nd

21 0.003 (0.002-0.004) nd nd

28 0.001 (0.001-0.002) nd nd

60 nd nd nd

Metsulfuron methyl, detection limit: 0.0005 mg L

-1

; nd: non detectable.

Table 2. Weight, length, specific growth rate, biomass and survival of silver catfish

(Rhamdia quelen) exposed to water from rice fields applied to the rice fields.

Herbicide (mg L

-1

)

Control

Clomazone

0.5

Quinclorac

0.375

Metsulfuron-

methyl

0.002

Weight (g)

Initial

3.15 ± 0.03 3.15 ± 0.03 3.15 ± 0.03 3.15 ± 0.03

15 days

4.77 ± 0.73 4.23 ± 0.17∗ 4.57 ± 0.99 4.96 ± 0.49

30 days

7.09 ± 1.05 7.05 ± 0.76 6.96 ± 1.11 7.19 ± 1.18∗

45 days

12.38 ± 1.52 10.55 ± 3.22∗ 9.89 ± 1.02∗ 12.80 ± 3.22

Length (cm)

Initial

7.06 ± 0.05 7.06 ± 0.05 7.06 ± 0.05 7.06 ± 0.05

15 days

7.70 ± 0.46 7.50 ± 0.06

∗

7.59 ± 0.21 7.72 ± 0.26

30 days

9.02 ± 0.28 9.07 ± 0.24 9.02 ± 0.46 9.70 ± 0.59

∗

45 days

10.75 ± 0.31 10.09 ± 0.76

∗

10.00 ± 0.29

∗

10.57 ± 0.10

Specific growth rate (%/day)

15 days

2.77 ± 1.03 1.96 ± 0.17

∗

2.48 ± 1.14

∗

3.03 ± 0.64

30 days

1.32 ± 1.01 1.70 ± 0.46 1.40 ± 0.52 1.23± 0.59

45 days

1.23 ± 1.95 0.83± 0.30

∗

0.78 ± 0.41

∗

1.28± 0.29

∗

Biomass (g)

45 days

1070 ± 69.38 1040 ±131.76 996 ± 53.00

∗

1060 ± 289.73

Survival (%)

45 days 100 100 96* 100

Values are means ± SD (n=15). (

) Indicate significant difference from control group (P

≤

0.05)

Table 3. Glycogen (nmol/ mg protein), protein (mg/ mg tissue) in liver and muscle

tissues of silver catfish (Rhamdia quelen) at water from rice fields that received

application of herbicides applied to the rice fields.

Values are means ±SD (n= 15). (*) Indicate significant difference from group (P

≤

0.01)

Herbicide (mg L

-1

)

Control Clomazone

0.5

Quinclorac

0.375

Metsulfuron methyl

0.002

Liver

15 days

Glycogen

72.04 ± 0.17

101.65 ± 0.34

∗

87.40 ± 0.11

∗

92.54 ± 0.34

∗

Protein

107 ± 0.003 112 ± 0.003 104 ± 0.003 109 ± 0.004

45 days

Glycogen

70.57 ± 0.17

99.89 ± 0.34

∗

79.11± 0.34

∗

75.77 ± 0.11

Protein

110 ± 0.003 115 ± 0.003

100.1 ±

0.003 120 ± 0.004

Muscle

15 days

Glycogen

5.27 ± 0.1 5.07 ± 0.1 5.04 ± 0.12 5.26 ± 0.15

Protein

74.1 ± 0.003 76 ± 0.003 74.4 ± 0.004 74 ± 0.005

45 da

Glycogen

0.75 ± 0.1

0.4 ± 0.1

∗

0.48 ± 0.12

∗

0.4 ± 0.15

∗

Protein

72 ± 0.003 72 ± 0.003 75 ± 0.004 71 ± 0.005

CAPÍTULO III

ARTIGO II:

Biochemical effects of clomazone herbicide on piava

(Leporinus obtusidens).

Denise dos Santos Miron, Alexandra Pretto, Márcia Crestani, Lissandra Glusczak,

Maria Rosa Shettinger, Vânia Lucia Loro, Vera Maria Morsh

(Publicado na Revista Chemosphere, v. 74, pp. 1-5, 2008)

CAPÍTULO IV

MANUSCRITO II:

Commercial formulation containing clomazone affects some

metabolic parameters in piava (Leporinus obtusidens)

Denise dos Santos Miron, Vania Lucia Loro, Alexandra Pretto, Lissandra Glusczak,

Maria Rosa Schetinger, Bernardo Baldisserotto, Vera Maria Morsch

(Em fase de redação)

Commercial formulation containing clomazone affects some metabolic parameters in

piava (Leporinus obtusidens)

Denise dos Santos Miron

, Vania Lucia Loro

, Alexandra Pretto

, Lissandra Glusczak

Maria Rosa Chitolina Schetinger

, Bernardo Baldisserotto

Vera Maria Morsch

1,∗

Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), 97105-900

Santa Maria, RS, Brazil.

Programa de Pós-graduação em Bioquímica Toxicológica,

Santa Maria, Brazil.

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal

de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brazil.

Corresponding Author:

(∗) Drª. Vera Maria Morsch.

Departamento de Química

Universidade Federal de Santa Maria

97105.900 - Santa Maria, RS, Brazil.

Phone: 55 –3220-9557

Fax: 55 (55) 3220-8240

E-mail: [email protected]

Abstract

This study aimed to assess the effects of a commercial formula containing clomazone

(0.5 mg L

-1

), at the concentration used in paddy rice fields, on metabolic parameters in

piava (Leporinus obtusidens). The effects of this herbicide in piava was tested at 96 and

192 h of exposure and after a recovery of 192 h in clean water. Liver glycogen levels

increased at all periods tested. In muscle glycogen levels was reduced only at 96 h of

exposure. Glucose and protein levels showed a decrease in all tissues tested at both

periods of exposure, but only in the muscle this decrease persists after the recovery

period. Muscle ammonia levels decreased at all periods tested. Lactate content

decreased in liver and kidney tissues at all exposure periods and increased in the

muscle. Our results demonstrated a preference for the anaerobic pathway of energy

production specially on the muscle tissue, in piavas exposed to clomazone. Considering

the alterations observed in the parameters studied, this fish species could be a good

bioindicator of clomazone toxicity on water in areas located near agricultural fields.

Keywords: Piava (Leporinus obtusidens); Herbicide; Clomazone; Metabolism; Exposure;

Recovery

1. Introduction

Environmental contamination by chemicals used in agricultural activities has

become a problem of worldwide importance (Bretaud et al., 2000; Oruç et al., 2004).

Although pesticides are recognized as an economical way to control pests, their

indiscriminate use can be toxic to other species in the environment, including fish (Oruç

and Üner, 1999; Rao, 2006). The presence of pesticide in water can cause several

alterations in metabolic parameters of fish, which may indicate an adaptation of the

organism or may affect fish health (Begum, 2004).

Clomazone (isooxazolidinone) is a highly effective herbicide that is extensively

used for crop protection in rice fields (Jonsson et al., 1998). Primel et al. (2005) reported

that the analysis of samples from farms in the Southern Region of Brazil demonstrated it

to be the most used herbicide in irrigated rice fields in this region. Due to fish sensitivity to

contaminated water, changes in their metabolism frequently indicate responses to a

stress situation. Recently, investigations demonstrated that during exposure to chemicals,

the synthesis and degradation of metabolic can be induced differently to meet fish energy

needs (Aguiar, et al., 2004; Scott and Sloman, 2004; Glusczak et al., 2007). Glycogen is

mainly stored in the liver or in the hepatopancreas and its content varies among species.

It has been reported that carbohydrates stored in liver and muscles are the first used in

response to a stress condition (Vijayavel et al., 2006). According to Crestani et al. (2006),

findings in silver catfish (Rhamdia quelen) exposed to clomazone suggested that

glycogen was stored in liver and muscular glycogen consumed demonstrating that the

fish used this energy source to compensate a stress situation.

The fish liver seems to be the central organ involved in the metabolism and,

together with the kidney, mostly responsible for glucose production. However, in the

occasional event of glucose unavailability, fish may use other precursors, such as lactate,

as a source of energy (Begum and Vijayaraghavan, 1999). These changes indicate

metabolic disorders and have been used as indicators of herbicide toxicity (Fonseca et

al., 2008). Moreover, as a large part of the fish organism is made up of proteins, proteins

may be the preferred fuel to supply the energy demand (Bhavan and Geraldine, 1997;

Peixoto et al., 2006). In this way, the exposure to carbofuran caused a decrease in

protein in the liver and muscle of Clarias batrachus (linn) (Begum, 2004). A reduction in

protein content indicates a physiological adaptability of fish, possibly to compensate the

stress generated by pesticide exposure (Vega et al., 2002).

Piava (Leporinus obtusidens), found in Southern Brazil, was chosen for this toxicity

test due to its ecological and commercial importance. Several studies have been carried

out to determine metabolic changes caused by herbicide contamination in fish species

(Begum, 2004; Crestani et al., 2006; Fonseca et al., 2008), but no studies on clomazone

toxicity have been performed for this native species. Thus, the purpose of this study was

to verify if an environmentally relevant concentration of a commercial clomazone formula

alter some metabolic parameters of L. obtusidens, in order to determine if this species

could be used as a bioindicator to determine herbicide toxicity in fish exposed to

contaminated water.

2. Material and methods

2.1. Fish

Piavas (Leporinus obtusidens) of both sexes with an average (weight of 8.0 ± 1.0

g; length of 6.0 ± 1.0 cm) were obtained from the Santa Maria Federal University (UFSM)

fish farm (RS, Brazil). The fish were acclimated to laboratory conditions for 15 days, in

tanks (250 L), in continuously aerated water in a static system and with a natural

photoperiod (12h light – 12h dark). All water parameters were checked every day and

determined according to Boyd and Tucker (1992) as follow: temperature 23 ± 2.0

C, pH

7.7 ± 0.2 units, dissolved oxygen 6.5 ± 1.0 mg L

-1

, non-ionized ammonia 0.007 ± 0.01 mg

-1

, nitrite 0.03 ± 0.01 mg L

-1

, alkalinity 66 ± 1.3 mg L

-1

CaCO

and hardness 20 ± 1.4 mg

-1

CaCO

. During the experimental period, fish were fed ad libitum two times a day (8:30

and 17:30 h) with commercial fish pellets (42% crude protein, Supra, Brazil). Fecal

remains and food residues were removed by suction every other day.

2.2. Experimental design

Clomazone herbicide used in this study was of commercial source (Gamit - 50%

purity) obtained from FMC Corporation (Philadelphia, USA). The concentration chose of

0.5 mg L

-1

was in accordance with the environmentally relevant concentration clomazone

used in rice fields (Rodrigues and Almeida, 1998). After the acclimation period, groups of

10 fish were transferred to glass boxes (45 L) and were controlled the water parameters.

The stock solutions were prepared by dissolving clomazone in water and added to the

experimental boxes. In each box 10 fish (in triplicate) were exposed for 96 h: 0.0 (control)

and 0.5 mg L

-1

with clomazone. In a second experiment, 10 fish by box (in triplicate) were

exposed to 0.0 (control) and 0.5 mg L

-1

clomazone for 192 h subsequently, 15 fish were

removed and transferred to clean water during 192 h. The concentration clomazone in

the experimental boxes was monitored every two days by high-performance liquid

chromatography (HPLC) (Zanella et al., 2002). Clomazone concentration in the water

after 48 h was approximately 90 % of the initial concentration (data not shown). The

water in the boxes was renewed every 48 h to maintain the concentration of clomazone

constant during the period of exposure. Water quality parameters during the treatment

period were the same as those for the acclimation period.

2.3. Analytical procedures

After exposure (96 and 192 h) and recovery period (192 h), fish was killed by

punching the spinal cord behind the opercula. Samples of liver, muscle and kidney tissue

were rapidly removed, washed in 150 mM saline solution, dried with filter paper, packed

in Teflon tubes and kept at -4°C for analyses of metabolic parameters. Glycogen was

determined according to Bidinotto et al., 1998. Protein analysis was determinate

according to Lowry et al., 1951. For lactate and glucose determination, tissues samples

were homogenized with 10 % trichloroacetic acid using a motor-driven teflon pestle and

centrifuged at 1000 x g for 10 min. Deproteinated supernatant was used for lactate

determination by Harrower and Brown, 1972. Glucose measured according to Duboie et

al. (1956) and total ammonia was determined according to Boyd and Tucker, 1992.

2.4. Statistical procedures

Statistical analyses were performed using a one-way analysis of variance

(ANOVA). Means were compared by Tukey test and expressed as mean ± standard

deviation (n = 15). The minimum significance level used was 95 % (P<0.05).

3. Results

As seen in Figure 1, was observed for all periods tested that the liver glycogen

concentration increase and reduction in hepatic lactate levels significantly. Fish exhibited

a decrease in protein and glucose levels in this tissue after both periods of exposure (96

and 192 h), which returned to control values after 192 h of recovery (Table 1).

Muscle tissue showed different clomazone-induced responses (Figure 2 and Table

1). Glycogen levels increased only after 96 h of exposure and this increase did not occur

at the other periods tested. The fish presented a significant increase in muscle lactate

levels for all periods tested, including the recovery period. After the exposure periods, fish

showed a reduction in muscle protein and glucose levels as seen in Table 1.

The influence of clomazone on biochemical changes in the kidney is shown in

Figure 3 and Table 1. Glycogen increased after of exposure periods. A significant

reduction in the lactate level was observed at all periods tested, including the recovery,

while glucose and protein decreased only at 96 and 192 h of exposure. Total ammonia

did not change at any experimental period (Table 1).

4. Discussion

This study clearly suggests a metabolic disruption in L. obtusidens exposed to a

commercial formula of clomazone. The increase in liver glycogen during exposure and

persisting after a recovery period in clean water shows the storage of an energy reserve.

On the contrary, the lactate level was found to be decrease, indicating liver

gluconeogenesis. In addition, hepatic glucose was reduced during exposure to

clomazone. Our results concerning liver metabolites are in accordance with studies in

which herbicide exposure resulted in glycogen synthesis and storage in the fish liver

(Crestani et al., 2006). According to other authors (Suarez and Mommsen, 1987; Peixoto

et al., 2006), the fish liver has been shown to be the main organ of accumulation,

biotransformation and detoxification of chemicals.

As fish white muscle constitutes more than 50 % of body mass, fish can use the

anaerobic process to obtain energy stores, such as glycogen (Knox et al., 1980). In the

present study, muscle glycogen was only decreased at 96 h of exposure and returned to

control values after the recovery period. Similar responses were observed in Cyprinus

carpio and R. quelen where muscle glycogen was reduced after exposure to 2,4- D

herbicide (Oruç and Üner, 1999; Cattaneo et al., 2008). In fact, fish species show

different metabolic responses to toxicity-induced stress and glycogen metabolism could

be specific to the tissue, species and time of exposure considered. Based on our results,

muscle glucose presented a reduction at 96 h of exposure to clomazone similar to that

observed for the glycogen level. This may indicate that in a period of stress generated by

herbicide toxicity, a rapid degradation of tissue glycogen is accompanied by the use of

glucose as a way of mobilizing energy.

These results show that clomazone induced metabolic disorders and a clear

response against energy depletion. The decrease in muscle glycogen and glucose

observed with a concurrent increase in lactate indicate a response against herbicide

toxicity. Similar findings was presented by Glusczak et al. (2007), in L. obtusidens

exposed to glyphosate herbicide and corroborate with the premise that metabolic

parameters in this fish species may be indicators of herbicide contamination. These

results are also in agreement with Begum and Vijayaraghavan (1999), who reported an

increase in lactate as a measure of anaerobic metabolism, which could indicate a

condition of stress in fish. Likewise, our studies demonstrated increased lactate levels as

a product of glycolysis, suggesting that exposure to clomazone caused a situation of

stress and demanded a great deal of energy from fish tissues.

The fish kidney is another important organ used to evaluate response to

clomazone. In this study, kidney glycogen levels showed an increase similar to that

obtained for liver glycogen levels. Both tissues are important for maintaining the body

water balance and toxic chemicals can temporarily or permanently disrupt their functions

(Miller, 2002; Oruç and Usta, 2006). In the present study, a reduction in kidney glycogen

after a recovery period in clean water probably indicates a compensatory response to an

herbicide-induced situation of stress. Thus, based on the present results, it can be

suggested that the glycogen stored in the kidney can be used to compensate or detoxify

in a situation of stress induced by herbicide exposure. Moreover, as the kidney receives

the post brachial blood flow, it is important in the detoxification or elimination of

contaminants in fish and can be a good site to evaluate toxicity in fish (Gallagher and Di

Giulio, 1992; Sancho et al., 1997; Üner et al., 2005).

5. Conclusion

It can be concluded that the metabolism was disrupted in piava (Leporinus

obtusidens) after exposure to a commercial formula of clomazone and that the effects

observed in fish depend of the exposure time considered. In addition, muscle tissue

showed a preference for the anaerobic pathway of energy production. There were some

similar patterns among tissues, as well as some differences, which were generally

consistent with differences in organ functions. The clomazone concentration used in this

study caused some metabolic disorders that persisted after a recovery period in clean

water. Therefore, this study with L. obtusidens provides information on the adverse

effects of clomazone and supports the theory that this fish species could be an early

bioindicator of toxicity in fish in areas located near agricultural fields.

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FIGURE CAPTIONS

Figure 1. Glycogen and lactate (µmol g

-1

tissue) levels in liver of Leporinus obtusidens

after exposure to 0.5 mg L

-1

of clomazone (96 and 192 h) and recovery (R- 192 h). Seen

as (Control- GH) Glycogen hepatic control, (GH) Glycogen hepatic, (Control- LH) Lactate

hepatic control and (LH) Lactate hepatic. Date are means ±SD (n=15); * Indicate a

significant difference at P< 0.05.

Figure 2. Glycogen and lactate (µmol g

-1

tissue) levels in muscle of Leporinus obtusidens

after exposure to 0.5 mg L

-1

of clomazone (96 and 192 h) and recovery (R- 192 h). Seen

as (Control- GM) Glycogen muscle control, (GM) Glycogen muscle, (Control- LM) Lactate

muscle control and (LM) Lactate muscle. Date are means ±SD (n=15); * Indicate a

significant difference at P< 0.05.

Figure 3. Glycogen and lactate (µmol g

-1

tissue) levels in kidney of Leporinus obtusidens

after exposure to 0.5 mg L

-1

of clomazone (96 and 192 h) and recovery (R- 192 h). Seen

as (Control- GK) Glycogen kidney control, (GK) Glycogen kidney, (Control- LK) Lactate

kidney control and (LK) Lactate kidney. Date are means ±SD (n=15); * Indicate a

significant difference at P< 0.05.

Fig 1.

Fig 2.

Control

Fig 3.

Control

Table 1

Changes in liver, muscle and kidney of Leporinus obtusidens exposed to clomazone

(96 and 192 h) and recovery period (192 h).

Exposure (h) Recovery (h)

96 192 192

Liver

Glucose

Control 18.04±0.44 18.08±0.35 17.80±0.40

0.5 mg L

-1

14.32±0.56* 14.27±0.48* 17.83±0.49

Protein

Control 67.98±6.75 68.79±1.35 69.04±6.33

0.5 mg L

-1

52.28±3.65*

51.41±4.43*

68.26±4.47

Muscle

Glucose

Control 1.43±0.07 1.42±0.02 1.41±0.02

0.5 mg L

-1

1.16±0.09* 1.01±0.08* 1.37±0.03*

Protein

Control 172.17±1.53 173.27±1.24 173.48±0.78

0.5 mg L

-1

166.73±1.64* 148.20±0.75* 146.98±4.93*

Ammonia

Control 0.16±0.006 0.18±0.002 0.14±0.005

0.5 mg L

-1

0.14±0.005* 0.14±0.001* 0.14±0.007

Kidney

Glucose

Control 2.91±0.07 2.92±0.05 2.92±0.02

0.5 mg L

-1

1.80±0.22* 1.59±0.13* 2.88±0.07

Protein

Control 173.02±7.05 174.05±4.24 173.50±2.78

0.5 mg L

-1

133.25±6.21* 137.35±6.48* 173.84±6.53

Ammonia

Control 0.07±0.01 0.07±0.008 0.07±0.01

0.5 mg L

-1

0.06±0.009 0.07±0.01 0.069±0.007

Glucose (μmol/g tissue); Protein (mg/g tissue) and Ammonia (μg/g tissue). Date are means ±

SD (n = 15). * Indicate a significant difference at P<0.05 compared to control group.

4. DISCUSSÃO

Neste estudo, os herbicidas clomazone, metasulfuron metil e quinclorac

usados na cultura da lavoura de arroz, induziram grandes variações de toxicidade,

em termos da CL

-96 h no peixe jundiá (Rhamdia quelen). Estes após a

exposição ao clomazone e ao quinclorac, apresentaram CL

de 7,32 mg/L e 395

mg/L, respectivamente. Entretanto, o Clomazone, para truta arco-íris (Salmo

gairdineri) e bluegil apresenta CL

-96 h de 19 e 34 mg/L, respectivamente

(VENCIL et al., 2002) e para o tetrarisca-negra (Hyphessobrycon scholzei) é de

27,3 mg/L (JONSSON et al., 1998). Segundo, RESGALLA JÚNIOR (2002), o

herbicida quinclorac (Cyprinus carpio) apresenta CL

-96 h de 6,65 mg/L para

carpa comum. Para o metasulfuron metil, a máxima concentração testada (1200

mg/L) para jundiás não causou mortalidade e, conseqüentemente parece menos

prejudicial para este peixe. Diferente, para truta arco-íris foi encontrado o valor de

-96h de 150 mg/L (VENCIL et al., 2002).

A medida da AChE em diferentes tecidos de peixes vem sendo estudada

como um possível biomarcador para monitorar a exposição aos poluentes tais

como os herbicidas (FERNANDEZ-VEGA et al., 2002; DUTTA & ARENDS, 2003).

Na literatura existem relatos que a exposição de peixes aos herbicidas

thiobencarb e diazinon causa 75% de inibição da AChE no cérebro de enguias

européias (Anguilla anguilla) (CÉRON et al., 1996; FERNÁNDEZ-VEGA et al.,

2002). No músculo, a atividade da AChE encontra-se aumentada (65%) em piavas

(MORAES et al., 2007) e inibida (45%) em jundiás expostos ao clomazone

(CRESTANI et al., 2007). Nesse estudo nós observamos que, no grupo controle

dos peixes (jundiás e piavas) expostos a todos herbicidas testados, a atividade da

AChE cerebral foi mais elevada do que nos demais tecidos analisados.

Resultados semelhantes foram observados em outros estudos com jundiás

expostos ao clomazone (CRESTANI et al., 2007) e com piavas expostas ao

glifosato (GLUSCZAK et al., 2006). Entretanto, em goldfish (Carassius auratus), a

atividade da AChE muscular do grupo controle foi mais elevada do que no cérebro

(BRETAUD et al., 2000).

Nossos resultados revelaram que o clomazone é um potente inibidor da

atividade da AChE cerebral. Em jundiás expostos às concentrações testadas

deste herbicida, durante 96 h, a atividade AChE em cérebro foi inibida em 83%.

E, a exposição de piavas a 0,5 mg/L causou uma diminuição da AChE de (%) nos

períodos de exposição (96h e 192h) e de recuperação (192 h). Trabalhos de

CERÓN et al. (1996) e DUTTA & ARENDS (2003) também observaram a

diminuição da AChE cerebral em enguias européias (0,042 mg/L de diazinon) e

em Lepomis macrochirus (0,001 mg/L de endosulfan). Com relação a AChE

muscular nos jundiás expostos (96 h) ao metsulfuron-metil e ao quinclorac foi

observado um aumento da atividade da AChE. Esse efeito foi igualmente obtido

em outras espécies, tais como enguias européias expostas a 22 mg/L do

thiobencarb (FERNÁNDEZ-VEGA et al., 2002) e em goldfish expostos a 0,050

mg/L do carbofuran (BRETAUD, 2000). Além disso, nestes estudos foram

identificadas alterações, tais como, tremores, letargia e a natação errática. Porém,

em piavas nossos resultados demonstraram uma redução da AChE muscular

somente após 192h de exposição, a qual persistiu no período de recuperação. A

ativação ou a inibição de AChE podem influenciar a concentração da acetilcolina

e, conseqüentemente causar alterações no processo de neurotransmissão

colinérgica, podendo promover efeitos no comportamento dos peixes. Em nossos

testes de CL

-96h, os jundiás expostos aos diferentes herbicidas apresentaram

mudanças comportamentais, tais como a diminuição da alimentação e nado

errático nas concentrações do clomazone de 20 e 50 mg/L. Nas concentrações do

quinclorac de 390 e 400 mg/L, além de diminuir a ingestão de alimentos, os peixes

apresentaram letargia. Porém, os peixes expostos ao metasulfuron metil

mostraram o comportamento de alimentação normal e comportamento hiperativo.

Esses dados indicam que a atividade da AChE parece ser importante para a

localização da presa, fuga do predador (natação) e também para a orientação da

alimentação em peixes (DUTTA & ARENDS, 2003).

Em piavas, expostas ao clomazone, o nível da atividade da AChE de olhos

foi reduzido somente durante o período de recuperação, sugerindo a presença de

herbicida nesse tecido. SANCHO et al. (2000), relataram uma diminuição da

atividade da AChE em olho de enguias européias após 96 h de exposição ao

thiobencarb (0.22 mg/L) e após 1 semana da recuperação o mesmo efeito

inibitório foi observado. Os resultados para a atividade da AChE em olho podem

estar relacionados à alta atividade do nervo óptico e à quantidade de acetilcolina

(HARLIN, 1991; SANCHO et al., 2000). Uma inibição da atividade da AChE foi

demonstrada também em coração de piavas após 96h de exposição ao

clomazone. Porém, em relação à recuperação da atividade da AChE estudada em

piavas expostas ao clomazone, observou-se que esta continuou inibida após 192

h em água isenta de herbicida em cérebro, músculo e olho. No coração a

atividade não foi recuperada. Estes resultados revelaram que a atividade da AChE

em coração também pode ser um biomarcador sensível para avaliar a toxicidade

do clomazone em piavas. Em outros estudos a recuperação da AChE cerebral e

muscular foi demonstrada em jundiás expostos a este herbicida (CRESTANI et al.,

2007). Assim, levando em consideração os resultados obtidos por SANCHO et al.

(2000) sugere-se que a atividade da AChE pode ser reversível e é influenciada por

vários fatores, entre eles: a classe química do herbicida, a espécie exposta e o

tecido analisado. A medida da atividade da AChE é considerada um indicador de

toxicidade para herbicidas em peixes.

Os resíduos dos herbicidas usados nas lavouras de arroz irrigado podem

causar interação desses com a água e, assim evidenciar as alterações no meio

ambiente (NIMMO, 1985). Porém, segundo BALDISSEROTTO & RADUNZ NETO

(2004) os parâmetros de qualidade de água foram mantidos em níveis aceitáveis

para a cultura de peixes durante todas as exposições realizadas neste estudo. No

entanto, nosso trabalho demonstrou que jundiás expostos em águas coletadas de

lavouras de arroz irrigado (após 21 dias da aplicação de herbicidas) sofreram

efeitos na sobrevivência e crescimento. No aspecto da sobrevivência, este peixe

mostrou ser mais sensível a exposição na água da lavoura com quinclorac, pois

se observou uma diminuição de 4% na sobrevivência. Assim, este resultado

demonstrou que a concentração de quinclorac na cultura de arroz irrigado pode

afetar os índices de sobrevivência desses peixes.

No presente estudo foi observado que o tempo de degradação dos

herbicidas aplicados na cultura de arroz irrigado variou entre 7-28 dias nas águas

amostradas. Sendo que, o clomazone permaneceu detectável até 28 dias nas

águas de arroz, o quinclorac até 14 dias e o metasulfuron metil foi detectado

somente até 7 dias após a aplicação. De acordo, BARCELÓ & HENION (2003)

demonstraram que o clomazone possui grande solubilidade na água (1100 mg/L)

e pode permanecer detectável até 30 dias. Similarmente, LAVY (1998)

demonstrou resíduos do quinclorac até 36 dias após a aplicação no estado de

Arkansas (EUA). Outros herbicidas que permanecem por um período longo de

tempo em águas de uso no arroz irrigado foram imazetapir (30 dias), quinclorac e

bentazon (21 dias) (MARCOLIN et al., 2003). Por outro lado, propanil e

metsulfuron metil foram detectados somente entre 7 a 10 dias após sua aplicação

(MACHADO et al., 2003; REIMCHE et al., 2008). Considerando os dados obtidos

pode-se inferir que o herbicida clomazone é potencialmente mais tóxico, pois sua

persistência na água é maior. De acordo com dados obtidos em áreas próximas

as lavouras de arroz no Rio Grande do Sul, este herbicida foi detectado em 90%

das amostras coletadas. A exposição de jundiás tanto em água com clomazone

como com quinclorac resultou em redução no crescimento em nossos testes.

ALVAREZ et al. (2005) demostraram que larvas de Red drum (Sciaenops

ocellatus) expostos ao atrazine durante 96 h (40 e 80 μg l

-1

) tiveram uma redução

na taxa de crescimento, diminuindo a população de larvas desses peixes em

aproximadamente 24%. NIEVES-PUIGDOLLER et al. (2007) demonstraram que o

herbicida atrazine altera funções fisiológicas dos Atlantic salmon smolts, causando

distúrbios que reduzem a ingestão de alimentos e, assim diminuindo o

crescimento dos peixes. Consumo diminuído de alimento e letargia aumentada

foram observados na tilapia do Nilo (Oreochromis niloticus) e em catfish

(Chrysichthyes auratus) após a exposição a 0,3 e 0,6 mg/L ao atrazine (HUSSEIN

et al., 1996).

Neste estudo foram também observadas alterações no metabolismo de

jundiás expostos a águas coletadas da lavoura de arroz. O fígado, além de ser

considerado o centro metabólico para a desintoxicação é uma rica fonte de glicose

para os peixes (SUÁREZ & MOMMSEN, 1987; MOON, 1998). No tecido hepático

nossos resultados mostraram que os jundiás mantidos por 45 dias na água com

clomazone e quinclorac apresentaram um aumento de glicogênio, e redução nos

níveis da glicose e de lactato, indicando uma gliconeogênese hepática

aumentada. Já os jundiás expostos ao metasulfuron metil mostraram as mesmas

respostas hepáticas, mas somente em 15 dias de exposição retornando aos níveis

dos controles no final do período experimental. Resultados semelhantes foram

observados em nossos experimentos com piavas expostas ao clomazone durante

96 e 192h e durante o período de recuperação. Nossos resultados estão de

acordo com outros estudos (SUÁREZ & MOMMSEN, 1987; PEIXOTO et al., 2006;

CRESTANI et al., 2006; CATTANEO et al. (2008). Portanto, sugere-se que o

aumento de glicogênio no tecido hepático em jundiás e piavas tenha sido uma

estratégia de armazenamento de energia devido o aumento da demanda

metabólica para o processo de detoxificação desses herbicidas, uma vez que o

fígado de peixes é o principal órgão de acumulação, de biotransformação e de

desintoxicação dos produtos químicos.

Uma vez que o músculo dos peixes constitui mais de 50% da massa do

corpo, os peixes podem usar o processo anaeróbico para obter energia, através

da oxidação do glicogênio (KNOX et al., 1980). No tecido muscular de jundiás

expostos às águas do arroz contendo clomazone, quinclorac e metasulfuron metil

verificou-se uma diminuição do glicogênio muscular, com aumento concomitante

do lactato neste tecido. Semelhantemente, nossos resultados monstram uma

diminuição do glicogênio muscular e da glicose seguido do aumento de lactato,

em piavas expostas ao clomazone (96 h), porém o glicogênio retornou aos valores

do controle após o período da recuperação. Esses resultados podem indicar uma

situação de estresse, com hipóxia tecidual gerado pela toxicidade do herbicida.

Consequentemente, uma rápida degradação do glicogênio acompanhada do uso

de glicose pode ser uma maneira de mobilizar a energia necessária para tal

condição de estresse. Estas mudanças sugerem que a utilização de carboidratos

para a produção energética, possa ser uma resposta à toxicidade induzida pela

exposição ao herbicidas (GIMENO et al., 1995; ORUÇ & ÜNER, 1999;

VIJAYAVEL et al., 2006).

Resultados similares referentes ao tecido muscular foram apresentados por

GLUSCZAK et al., (2007), em piavas expostas ao glifosato. FERRANDO &

ANDREU-MOLINER (1991), também relataram uma diminuição do glicogênio

muscular em enguias européias (Anguila Anguila), após a exposição ao lindane.

ORUÇ & ÜNER (1999) e CATTANEO et al. (2008) observaram em Cyprinus

carpio e R. quelen a diminuição de glicogênio do músculo após a exposição ao

2,4–D. Em relação ao aumento de lactato, estes resultados estão de acordo

comos observados por BEGUM & VIJAYARAGHAVAN (1999), e esta resposta

parece ser uma medida do metabolismo anaeróbico, indicando uma condição do

esforço dos peixes. Do mesmo modo, nossos estudos demonstraram níveis

aumentados do lactato muscular, sugerindo que a exposição ao clomazone causa

uma situação de estresse, e também ocorre hipóxia tecidual com aumento da

demanda energética.

O rim dos peixes é um outro órgão importante que pode ser usado para

avaliar a toxicidade de herbicidas. Este órgão recebe a circulação sanguínea

branquial do corpo nos peixes e, assim é importante na desintoxicação, na

eliminação dos contaminadores. Portanto, no rim pode ser avaliado a toxicidade

de produtos químicos em peixes (GALLAGHER & DI GIULIO, 1992; SANCHO et

al., 1997; ÜNER et al., 2005). No presente estudo, os níveis do glicogênio em rins

de piavas expostas ao clomazone foram aumentados similar ao obtido para o

fígado. Entretanto, no período de recuperação ocorreu a redução nos níveis de

glicogênio. Esta resposta parece indicar uma compensação a uma situação do

estresse induzido pelo clomazone. Então, os tecidos hepático e renal analisados

no presente estudo demonstraram ser importantes para manter o balanço de água

do corpo e produtos químicos tóxicos que podem temporariamente ou

permanentemente interromper suas funções (MILLER, 2002; ÜNER et al., 2006).

De fato, as espécies de peixes mostram diferentes respostas metabólicas ao

estresse induzido por contaminantes e o metabolismo do glicogênio pode ser

especifico considerando a espécie, o tecido e o tempo de exposição do peixe.

As variações nas atividades de enzimas antioxidantes também podem ser

indicadores do estresse oxidativo causado por poluentes (AHMAD et al., 2000;

SAYEED et al., 2003). A peroxidação lipídica (formação de TBARS) é um dos

principais processos induzidos pelo estresse oxidativo decorrentes de herbicidas,

em peixes (AHMAD et al., 2004). Em nosso estudo, os níveis de TBARS estavam

aumentados no tecido do cérebro de piavas depois de 96 e 192 h de exposição.

Em fígado e músculo também foi observado este aumento, mas somente depois

de 192 h de exposição. Em relação ao período de recuperação, verificou-se que

em todos os tecidos os níveis de TBARS retornaram aos valores iniciais, com

exceção do fígado. De acordo, CRESTANI et al. (2007) também observaram

níveis de TBARS aumentados em cérebro e fígado de jundiás após a exposição

ao clomazone. Similarmente, ÜNER et al. (2006) observaram elevados níveis de

TBARS em músculo do Cyprinus carpio exposto ao diazinon. A elevação do LPO

observada no estudo sugere uma situação de estresse oxidativo, a qual pode

induzir a formação de radicais livres mediada pela exposição ao clomazone. A

recuperação dos níveis de TBARS pode indicar um mecanismo compensatório

através do sistema antioxidante, e uma tentativa de adaptar-se a condição de

estresse induzido pelo herbicida. Estudos recentes associam um aumento dos

níveis de TBARS com a inibição da AChE indicando estresse oxidativo induzido

pelos pesticidas (SEVGILER et al., 2005; ÜNER et al., 2006; ÜNER et al 2007;

ORUÇ & USTA, 2007). Similar a estes estudos, nossos resultados demonstraram

um aumento em níveis de TBARS e uma inibição da AChE para o cérebro e o

músculo de piavas depois de 192 h de exposição e de recuperação. Estes

resultados sugerem que radicais livres em tecidos de piavas poderia induzir

mudanças na hiperatividade colinérgica, a qual pode levar a inibição da AChE.

Alguns autores consideram que a inibição da AChE induz peroxidação lipídica que

por sua vez pode levar ao dano celular. Este pode ser um resultado de um

sistema antioxidante eficaz que funciona como uma resposta adaptável dos peixes

(YANG et al., 1996; ÜNER et al., 2006; ORUÇ & USTA, 2007).

Proteínas são um dos alvos para a elucidação dos efeitos de pesticidas em

diversas espécies. Recentemente, mostrou-se que estes podem induzir

modificações oxidativas em proteínas sendo isso, também, uma de muitas

conseqüências do estresse oxidativo nos peixes (SAYEED et al., 2003). Sabe-se

que o radical hidroxila (OH

) é altamente reativo, ou seja, é uma espécie reativa de

oxigênio que é formado em uma situação de estresse oxidativo e é considerado

responsável pela formação de grupos carbonilados nas proteínas (OLIVER, 1987).

Portanto, o ensaio de grupos carbonil em proteínas constitui-se em uma técnica

adequada para quantificar modificações oxidativas em proteínas. Neste estudo, a

exposição de piavas ao clomazone resultou num aumento na carbonilação de

proteína no fígado, demonstrando uma condição de estresse oxidativo. Vários

pesticidas (deltamethrin, endosulfan e paraquat) também causaram aumento de

proteínas carboniladas em tecidos hepáticos, renais e branquiais de Channa

punctata (Bloch) (PARVEZ &RAISUDDIN, 2005).

No fígado, a diminuição observada na atividade da enzima catalase (CAT)

em piavas expostas ao clomazone demonstra que este herbicida induz dano

oxidativo no fígado causando alterações nos sistemas dos antioxidantes. PANDEY

et al. (2001) observaram resultados similares quando expôs C. punctatus (Bloch)

ao endosulfan. CRESTANI et al. (2007) mostraram que o clomazone (0,5 ou 1,0

mg/ L) causa redução da CAT em fígado de jundiás. A exposição de deltamethin

causou uma diminuição na atividade da CAT em fígado, rins e brânquias de C.

punctatus (SAYEED et al., 2003). Este declínio na atividade da CAT poderia ser

devido à produção excessiva de O

como indicado por BRAINY et al. (1996). Os

resultados do presente estudo indicam que piavas resistem ao estresse oxidativo

durante a exposição ao clomazone.

5. CONCLUSÕES

-A CL

-96h estimada para jundiás expostos ao herbicida clomazone e quinclorac

foi equivalente a 7,32 (I.C. de 5,68 a 9,03 mg/L) e 395 mg/L (I.C. de 394 a 395,9

mg/L), respectivamente. Para jundiás expostos ao metasulfuron metil, a CL

-96h

não foi obtida, pois os peixes sobreviveram a máxima concentração testada (1200

mg/L). Assim, o clomazone apresenta maior potencial de risco de contaminação

para jundiás e, o quinclorac e o metasulfuron metil apresentam menor risco.

- Os herbicidas estudados neste trabalho afetaram a atividade da AChE em

cérebro e músculo de jundiás. O clomazone mostrou-se um potente inibidor em

ambos tecidos. Assim, pode-se inferir que a medida da atividade da AChE em

cérebro e músculo pode ser um biomarcador primário da toxicidade para a

exposição ao quinclorac e metasulfuron metil.

- Depois de 45 dias de exposição aos herbicidas, os jundiás foram mais sensíveis

à sobrevivência quando expostos a água da lavoura com quinclorac. O clomazone

e o quinclorac foram prejudiciais ao crescimento dos peixes. Os herbicidas

afetaram também os parâmetros metabólicos dos jundiás, que utilizaram uma

estratégia de armazenamento energético através das reservas de glicogênio

hepático para compensar a demanda do processo de detoxificação destes

produtos químicos.

- Nossos estudos com piavas revelaram que o clomazone inibe aproximadamente

50% da atividade da AChE cerebral, mesmo com uma concentração aproximada a

utilizada nas lavouras. A elevação dos níveis de TBARS em cérebro, fígado e

músculo de piavas sugerem uma situação de estresse oxidativo induzindo a

formação de radicais livres mediada pela exposição ao clomazone. No fígado a

formação de proteínas carboniladas mostrou uma condição de estresse oxidativo.

A diminuição hepática da atividade da enzima CAT demonstra que o clomazone

induz dano oxidativo no fígado e causa alterações no sistema antioxidante.

- As piavas demonstraram alterações metabólicas semelhantes aos jundiás

expostos ao clomazone. A soma dos resultados obtidos permite concluir que o

fígado estoca glicogênio para suprir a demanda energética frente à intoxicação. O

tecido muscular demonstrou mobilização de energia através de uma estratégia

anaeróbica, onde glicogênio e glicose são oxidados até lactato. O tecido muscular

responde a uma hipóxia tecidual gerada pela exposição de piavas ao clomazone.

- Após período de recuperação das piavas em água livre de clomazone, a

atividade da AChE permaneceu diminuída em cérebro, músculo e olho. A

elevação dos níveis de TBARS em cérebro e em músculo, bem como a formação

de proteínas carboniladas e a atividade da CAT em fígado não foram recuperadas.

A exposição ao clomazone também causou alterações metabólicas que não foram

recuperadas, tais como, aumento do glicogênio hepático e do lactato muscular.

Portanto, após a exposição de piavas ao clomazone algumas mudanças

enzimáticas e metabólicas não podem ser recuperadas, mesmo submetendo os

peixes ao tratamento em água livre de herbicida por 192 h.

- Os parâmetros avaliados em jundiás e piavas podem ser recomendados para o

monitoramento de contaminação de águas por clomazone, quinclorac e

metasulfuron metil, considerando as condições laboratoriais deste estudo.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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