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Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-graduação em Parasitologia
Tese de Doutorado
Adriana Coelho Soares
Belo Horizonte, agosto de 2008
Alterações vasculares na pele do hospedeiro, influência
das
lipocalinas salivares e do ambiente intestinal durante o processo de
hematofagia dos triatomíneos (Hemiptera, Reduviidae).
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Adriana Coelho Soares
Alterações vasculares na pele do hospedeiro, influência das
lipocalinas salivares e do ambiente intestinal durante o processo de
hematofagia dos triatomíneos (Hemiptera, Reduviidae).
Tese apresentada ao programa de Pós-graduação
em Parasitologia, Departamento de Parasitologia
do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais como
requisito para a obtenção do grau de Doutor em
Ciências.
Área de concentração: Entomologia
Aluna: Adriana Coelho Soares
Orientador: Dr. Marcos Horácio Pereira
Co –orientador: Dr. Ricardo Nascimento Araujo
Belo Horizonte, agosto de 2008
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043 Soares, Adriana Coelho.
S676a Alterações vasculares na pele do hospedeiro, influência das
lipocalinas salivares e do ambiente intestinal durante o processo de
hematofagia dos triatomíneos (Hemiptera, Reduviidae). [manuscrito]/
Adriana Coelho Soares.-2008.
100 f.: Il.; 29cm.
Orientador: Marcos Horácio Pereira. Co-orientador: Ricardo
Nascimento Araujo.
Tese (doutorado)-Universidade Federal de Minas Gerais,
Departamento de Parasitologia.
1. Relação hospedeiro- parasito-Teses. 2. Rhodnius prolixus-
Teses. 3. Triatoma brasiliensis. 4. Hematofagia. 5. Saliva -Teses. 6.
Microcirculação- Teses. 7. Lipocalina. I. Pereira, Marcos Horácio. Ii.
Araujo, Ricardo Nascimento. III. Universidade Federal de Minas
Gerais. Departamento de Parasitologia. IV Título. CDU: 576. 88/ 89
Aos meus pais e avós pelo amor e sacrifício
Às minhas irmãs pelo companheirismo
Ao Bráulio pelo carinho e incentivo todos esses anos
Agradecimentos
Agradeço especialmente ao meu orientador, professor Marcos Horácio Pereira, pela orientação
e pela grande oportunidade.
Ao professor Nelder de Figueiredo Gontijo pelas idéias, boa vontade e paciência.
Ao meu co-orientador e bom colega Ricardo Nascimento Araujo pela orientação e parceria.
Ao prof. Mike J Lehane e à Stella Lehane pelo acolhimento e por toda a experiência adquirida
no lab da University of Bangor e na Liverpool School of Tropical Medicine.
Aos grandes amigos Maurício e Juliana por me ensinarem bio mol com muita paciência e por
me acolherem com grande consideração em Bangor e Liverpool.
Aos grandes amigos e colegas de moradia, Sally Roberts e Xavier Francis Bruno, em especial à
Teresa Zanatta Coutinho, grande companheira.
Aos doutores Antônio Valadão (CETEC) e Alessandra Aparecida Guarneri (René Rachou-
Fiocruz) pela valiosa contribuição na qualificação.
À profa. Juliana Carvalho-Tavares (ICB-UFMG) e ao prof. Rogério Amino (UNIFESP) pela
valiosa colaboração.
Ao prof. Alberto de Figueiredo Gontijo pelo desenvolvimento dos softwares para a análise do
eletromiograma.
Ao programa de Pós-Graduação em Parasitologia e ao professor Pedro Marcos Linardi pela
relatoria.
Aos estagiários Rafaela Paim, Lucas Dohm, e Iâncor Pereira pela parceria no trabalho no lab.
A todos os amigos do LFIH pela convivência agradável e por estarem sempre prontos a ajudar.
A todos os meus familiares pelo sacrifício e pelo amor por toda a vida.
Ao Bráulio e família pela atenção e apoio nesta longa caminhada.
Lista de figuras
Figura 1- Espécies de triatomíneos de interesse no presente estudo.......................................3
Figura 2 - Corte transversal próximo à base da probóscida de uma ninfa de quinto estádio
de R. prolixus ..........................................................................................................................5
Figura 3- Esquema da movimentação das maxilas dos triatomíneos durante a fase de
sondagem na pele do hospedeiro.............................................................................................5
Figura 4 - Esquema do corte transversal da cabeça de espécime de R. prolixus....................6
Figura 5- Mecanismo do RNAi em célula eucariótica..........................................................15
Figura 6- Thrichomys apereoides (Rodentia, Echimyidae)..................................................20
Figura 7- Arena utilizada na alimentação natural de ninfas de T. brasiliensis.....................30
Figura 8- Área de aumento de permeabilidade vascular na microcirculação da pele da
orelha de camundongos hairless após o final do processo alimentar de ninfas de terceiro
estádio de R. prolixus............................................................................................................35
Figura 9- Sinais elétricos produzidos pelas contrações da bomba cibarial e a variação na
área (diâmetro) da vênula durante o período de ingestão de uma ninfa de terceiro estádio de
R. prolixus.............................................................................................................................36
Figura 10- Relação entre a freqüência de contrações da bomba cibarial (linha pontilhada) e
a variação no diâmetro do vaso (linha contínua) durante o processo alimentar de uma entre
cinco ninfas de terceiro estádio de R. prolixus analisadas......................................................40
Figura 11– Liberação de material translúcido (setas) pelas maxilas na corrente sangüínea
influenciando na representação gráfica do diâmetro do vaso durante a fase de
ingurgitamento de uma de cinco ninfas de R. prolixus analisadas........................................42
Figura 12- Agregação plaquetária na microcirculação da pele do camundongo hairless 30
minutos após o fim do processo alimentar de R. prolixus.....................................................43
Figura 13 - Interação leucócito-endotélio após o processo alimentar de ninfas de terceiro
estádio de R. prolixus na pele da orelha de camundongo hairless........................................44
Figura 14- Expressão das NPS 1-4 na glândula salivar de ninfas de quinto estádio do grupo
controle de R. prolixus quantificada por qPCR.....................................................................45
Figura 15- Quantificação de proteínas totais, hemeproteínas, atividade anticoagulante e
atividade da enzima apirase de glândulas salivares de ninfas de terceiro e quinto estádios de
R. prolixus do grupo controle e do grupo silenciado.............................................................48
Figura 16- Glândulas salivares extraídas de ninfas de quinto estádio R. prolixus do grupo
controle e do grupo silenciado mostrando a coloração do seu conteúdo..............................49
Figura 17- Perfil eletroforético (SDS-PAGE- 15%) de 10 µg de proteínas salivares de um
pool de 14 glândulas extraídas de ninfas de R. prolixus silenciadas ou controles sete dias
após a muda para o quinto estádio........................................................................................50
Figura 18- Ranqueamento do tempo cumulativo de sondagem de ninfas de quinto estádio
de R. prolixus dos grupos controle e silenciado alimentadas sobre a pele do dorso de
camundongos swiss...............................................................................................................53
Figura 19- Espectro das freqüências versus tempo produzido pelos sinais elétricos gerados
pelas contrações da bomba cibarial de ninfas de quinto estádio de R. prolixus....................56
Figura 20- Parâmetros do comportamento alimentar de ninfas de quarto estádio de T.
brasiliensis em alimentação artificial contendo sangue, suspensão de hemácias ou plasma
de R. norvegicus ou de T. apereoides....................................................................................60
Figura 21- Conteúdo intestinal de T. brasiliensis após a alimentação natural com sangue ou
em alimentador artificial contendo suspensão de hemácias de R. norvegicus ou de T.
apereoides.............................................................................................................................62
Figura 22- Ação do conteúdo intestinal de T. brasiliensis sobre o sangue de R. norvegicus e
de T. apereoides....................................................................................................................64
Figura 23- Cinética da aglutinação eritrocitária promovida pelo conteúdo intestinal de T.
brasiliensis sobre o sangue de R. norvegicus.......................................................................65
Lista de tabelas
Tabela 1- Iniciadores utilizados nas PCRs............................................................................26
Tabela 2- Iniciadores utilizados na PCR em tempo real.......................................................27
Tabela 3- Alterações no diâmetro dos vasos desencadeadas pelo processo alimentar de
ninfas de terceiro estádio de R. prolixus na microcirculação da pele da orelha de
camundongos hairless..........................................................................................................41
Tabela 4- Verificação do silenciamento das NPs na glândula salivar de ninfas de quinto
estádio de R. prolixus por qPCR.........................................................................................46
Tabela 5 – Parâmetros do comportamento alimentar avaliados pelo eletromiograma da
bomba cibarial de ninfas de quinto estádio de R. prolixus dos grupos silenciado e controle
alimentadas sobre a pele do dorso ou sobre a veia da cauda de camundongos
swiss......................................................................................................................................54
Tabela 6- Parâmetros do comportamento alimentar de ninfas de quarto estádio de T.
brasiliensis alimentadas de forma natural ou em alimentador artificial contendo dietas
provenientes de R. norvegicus ou de T. apereoides..............................................................58
Abstract
This study discusses triatomine-mammalian host interactions and empathizes the
dynamics of salivary protein and cibarial pump of the insects with skin microcirculation of
the host. The influence of the intestinal environment in the feeding competence in different
hosts was also discussed. We evaluated alterations in the vertebrate host skin
microcirculation triggered by Rhodnius prolixus feeding process, such as the increase in
vascular permeability, microhaemorrhages, platelet aggregation and recruitment of
leukocytes. We developed a novel image analysis that associates the electromyogram of the
cibarial pump and the intravital microscopy records for the study of triatomines feeding
process. This association allowed a satisfactory and better comprehension of the
haematofagy process, identifying phenomena that occurred during feeding, including vessel
wall diameter changes, regurgitation-like movements, different electrical signals from
cibarial pumping and others. This new analysis is a very useful tool in the studies of
triatomines feeding physiology. We also investigated the influence of nitrophorins in R.
prolixus feeding process in the live host. These proteins were very important to obtain a
successful meal in small vessels as those from the dorsal skin microcirculation in
comparison with larger vessels as the mouse tail lateral vein. The probing time, non
ingestive time, frequence of pumping and effective ingestion rate were the main affected
parameters that interfered in the feeding performance after NPs silencing. In a third part of
our experiments, we compared the feeding performance from Triatoma brasiliensis on
Thrichomys apereoides and Rattus norvegicus. We observed an important phenomenon that
influenced the feeding competence: the erythrocyte agglutination. This finding reinforces
the importance of intestinal environment in the amount of blood ingested by the bugs. For
the first time, the erythrocyte agglutination activity was analyzed in feeding process
context. These findings may help to elucidate aspects related with vector-host interactions
and the real implication of different factors influencing the hematofagy, specially those that
occur in the intestinal environment that were neglected until now by the majority of the
studies.
Resumo
Este estudo versa sobre a interação triatomíneo-hospedeiro mamífero e enfoca a
dinâmica de proteínas salivares e a mecânica da bomba cibarial do inseto com a
microcirculação da pele do hospedeiro, além da influência do ambiente intestinal na
competência alimentar em diferentes hospedeiros. Foram identificadas alterações na
microcirculação do camundongo causadas pelo processo alimentar de Rhodnius prolixus,
como aumento de permeabilidade vascular, hemorragia, agregação plaquetária e
recrutamento de leucócitos. Foi desenvolvida uma forma de análise associando o
eletromiograma da bomba cibarial com as imagens das paredes dos vasos, produzidas nos
experimentos de microscopia intravital, para o estudo do processo alimentar dos
triatomíneos. Tal associação permitiu o entendimento do processo de hematofagia de forma
mais consistente, com a identificação de vários fenômenos ocorridos durante a alimentação
dos insetos, incluindo a variação no diâmetro dos vasos, movimentos de regurgitação,
diferentes sinais elétricos produzidos pelos músculos dilatadores da bomba cibarial, entre
outros. Esta nova análise se mostrou uma ferramenta de grande utilidade para estudos sobre
a fisiologia alimentar dos triatomíneos. Também foi investigada a influência das
nitroforinas no processo alimentar de R. prolixus no hospedeiro vivo. Essas proteínas foram
importantes para o sucesso na obtenção do repasto em pequenos vasos, como os da
microcirculação da pele, em comparação com vasos grandes, como a veia lateral da cauda.
O tempo de sondagem, o tempo não ingestivo, a freqüência de contração da bomba cibarial
e a taxa de ingestão efetiva foram os principais parâmetros afetados e que interferiram na
performance alimentar após o silenciamento das nitroforinas. Em uma terceira parte dos
experimentos, comparando-se a performance alimentar de Triatoma brasiliensis em Rattus
norvegicus e Thrichomys apereoides, observou-se um importante fenômeno que interferiu
na competência: a aglutinação eritrocitária. Este achado reforça a importância do ambiente
intestinal na quantidade de sangue ingerido pelos triatomíneos. Esta é a primeira vez que a
atividade aglutinante de hemácias foi analisada no contexto do processo alimentar. Os
achados podem ajudar a elucidar aspectos relacionados com a interação vetor-hospedeiro e
a real implicação de fatores que influenciam na hematofagia, sobretudo, os que ocorrem no
ambiente intestinal e que foram negligenciados até o presente momento pela maioria dos
estudos.
Sumário
1-Introdução............................................................................................................................1
1.1- Hematofagia e capacidade vetorial dos triatomíneos...............................................1
1.2- Os triatomíneos de interesse no presente estudo......................................................2
1.3-Metodologias empregadas no estudo do comportamento alimentar dos
triatomíneos......................................................................................................................4
1.4- A ação de biomoléculas salivares no processo alimentar dos triatomíneos.............7
1.5- Lipocalinas salivares.................................................................................................9
1.6- A influência do ambiente intestinal no comportamento alimentar de T.
brasiliensis.....................................................................................................................12
1.7- RNA interferente...................................................................................................13
2- Justificativa.......................................................................................................................16
3- Objetivos...........................................................................................................................17
3.1- Objetivo geral.........................................................................................................17
3.2- Objetivos específicos..............................................................................................17
4- Material e Métodos...........................................................................................................19
4.1- Delineamento experimental....................................................................................19
4.2.- Insetos utilizados...................................................................................................20
4.3- Hospedeiros mamíferos..........................................................................................20
4.4- Parte 1 - Estudo das alterações vasculares na pele do hospedeiro durante o
processo alimentar de R. prolixus .................................................................................21
4.4.1- Microscopia intravital.....................................................................................21
4.4.2- Análise das imagens obtidas nos experimentos de microscopia
intravital....................................................................................................................21
4.4.3- Alterações na permeabilidade vascular e ocorrência de hemorragias............22
4.4.4- Agregação plaquetária e recrutamento de leucócitos.....................................22
4.4.5- Eletromiograma da bomba cibarial ...............................................................23
4.5 - Parte 2 - Caracterização funcional das nitroforinas expressas na glândula salivar
do R. prolixus ...............................................................................................................25
4.5.1- Extração de RNA e síntese de cDNA ..........................................................25
4.5.2- Síntese de RNA de fita dupla........................................................................25
4.5.3- Administração de dsRNA ............................................................................26
4.5.4- Verificação do silenciamento pela PCR em tempo real.................................27
4.5.5- Ensaio do tempo de recalcificação do plasma citratado ................................28
4.5.6- Ensaio de atividade da enzima apirase ..........................................................28
4.5.7- Quantificação de proteínas ............................................................................29
4.5.8- Quantificação de hemeproteínas....................................................................29
4.5.9- Eletromiograma da bomba cibarial.................................................................29
4.6 – Parte 3 – Influência do ambiente intestinal durante o processo de hematofagia de
T. brasiliensis...............................................................................................................30
4.6.1- Experimentos de comportamento alimentar ................................................30
4.6.2- Suspensões alimentares oferecidas no alimentador artificial........................31
4.6.3- Comparação da performance alimentar de ninfas de T. brasiliensis na
alimentação natural e artificial.................................................................................31
4.6.4- Ação do conteúdo intestinal de T. brasiliensis sobre o empacotamento de
hemácias...................................................................................................................32
4.7- Análise estatística..................................................................................................33
5.0- Resultados.....................................................................................................................34
5.1- Parte 1 - Estudo das alterações vasculares na pele do hospedeiro durante o
processo alimentar de R. prolixus.................................................................................34
5.1.1- Utilização de vasos sangüíneos no processo alimentar, alterações na
permeabilidade vascular e a ocorrência de hemorragias..........................................34
5.1.2- Análise da movimentação da parede dos vasos durante o processo de
bombeamento do sangue...........................................................................................35
5.1.3- Agregação plaquetária e recrutamento de leucócitos......................................43
5.2- Parte 2 - Caracterização funcional das nitroforinas expressas na glândula salivar
do R. prolixus ................................................................................................................45
5.2.1- Níveis de expressão das nitroforinas...............................................................45
5.2.2- Silenciamento das NPs mediado por RNAi....................................................46
5.2.3- Influência do silenciamento das nitroforinas no comportamento alimentar de
R. prolixus sobre a pele do dorso..............................................................................51
5.2.4- Influência do silenciamento das nitroforinas no comportamento alimentar de
R. prolixus sobre a veia lateral da cauda...................................................................53
5.2.5- Influência do sítio de alimentação no comportamento alimentar de R.
prolixus......................................................................................................................55
5.3- Parte 3– Influência do ambiente intestinal durante o processo de hematofagia de T.
brasiliensis ....................................................................................................................57
5.3.1-Performance alimentar de ninfas de T. brasiliensis na alimentação
natural........................................................................................................................57
5.3.2- Performance alimentar de ninfas de T. brasiliensis no alimentador
artificial.....................................................................................................................59
5.3.3- Análise do conteúdo intestinal de T. brasiliensis após alimentação natural ou
artificial.....................................................................................................................61
5.3.4- Ação do conteúdo intestinal sobre as hemácias de R. norvegicus ou de T.
apereoides.................................................................................................................63
6.0- Discussão .....................................................................................................................66
6.1- Estudo das alterações vasculares na pele do hospedeiro durante o processo
alimentar de R. prolixus................................................................................................66
6.2- Caracterização funcional das nitroforinas expressas na glândula salivar de R.
prolixus .........................................................................................................................71
6.3- Influência do ambiente intestinal de T. brasiliensis durante o processo de
hematofagia...................................................................................................................78
7.0- Conclusões...................................................................................................................82
8.0- Referências..................................................................................................................84
Anexo I- Manuscrito: “The host skin microcirculation during blood feeding by Rhodnius
prolixus (Hemiptera; Reduviidae)”.
Anexo II - Manuscrito: “The role of salivary nitrophorins in the ingestion of blood by the
triatomine bug Rhodnius prolixus (Reduviidae; Triatominae)”.
1
1-Introdução
1.1- Hematofagia e capacidade vetorial dos triatomíneos
Os triatomíneos são insetos hematófagos, vetores do Trypanosoma cruzi, o agente
causador da doença de Chagas nas Américas. Todos os estádios ninfais e os adultos
alimentam-se do sangue de vertebrados. O contato com seus hospedeiros ocorre apenas
durante a alimentação que leva geralmente de 20 a 30 minutos. Espécies grandes como
Dipetalogaster maxima (Uhler, 1894) podem ingerir mais de 1 ml de sangue em um único
repasto.
A performance alimentar dos triatomíneos varia grandemente entre as espécies e é
influenciada por inúmeros fatores, entre eles, as características do aparato alimentar e da
composição salivar do inseto, bem como a fisiologia do seu hospedeiro vertebrado
(GUARNERI et al., 2000; 2003). Triatoma infestans (Klug, 1834) e Rhodnius prolixus
Stal, 1859, os principais vetores nas Américas, estão entre as espécies estudadas que
apresentam as maiores taxas de ingestão de sangue (SANT’ANNA et al., 2001).
Em julho de 2006, o Brasil foi certificado pela (Organização Pan-Americana de
Saúde como “livre da transmissão da doença de Chagas pelo T. infestans” (SCHOFIELD et
al., 2006). No começo dos anos 80, esta espécie, sozinha, era responsável por
aproximadamente 80% dos casos de transmissão vetorial do T. cruzi. Mas não foi sempre
assim. O T. infestans é uma espécie introduzida que se dispersou pelo país durante o século
passado (FORATTINI et al., 1977). A análise dos levantamentos entomológicos realizados
sugere que o T. infestans substituiu, no ambiente artificial, vetores autóctones importantes
como o Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835) e o Triatoma brasiliensis Neiva, 1911.
Estudos recentes sugerem que a maior competência vetorial e a capacidade de atingir
maiores densidades nas habitações relacionam-se com o fato do T. infestans ser a espécie
mais eficiente em obter repasto sanguíneo dos hospedeiros vertebrados (PEREIRA et al.,
2006). Um estudo comparativo, utilizando camundongos não anestesiados como
hospedeiros, mostrou que T. infestans se alimenta melhor do que P. megistus em diferentes
densidades e esta maior eficiência em se alimentar poderia explicar o fato da primeira
espécie desenvolver maiores densidades dentro das habitações (PEREIRA et al., 1995).
2
De modo geral, o tamanho da população de triatomíneos dentro do domicílio
humano está relacionado com o número de hospedeiros disponíveis e o status nutricional
desta população depende do número de insetos por hospedeiro (SCHOFIELD, 1980 a, b).
Já foi demonstrado que a quantidade média de sangue ingerido por T. infestans e P.
megistus, em hospedeiros não anestesiados, é inversamente proporcional à densidade de
insetos (SCHOFIELD, 1982; PIESMAN et al., 1983). Um aumento na densidade de
triatomíneos induz a uma maior percepção das picadas sofridas pelo hospedeiro, o que,
provavelmente, diminui a quantidade média de sangue ingerido, uma vez que provoca
interrupções mais freqüentes no repasto sangüíneo (SCHOFIELD et al., 1986). Esta
redução na tomada de sangue acarreta um prolongamento do estágio ninfal, redução da
fecundidade das fêmeas e aumento da probabilidade de dispersão dos insetos adultos. Estes
fatores atuariam conjuntamente na regulação da densidade populacional dos triatomíneos
(SCHOFIELD, 1985).
Outra implicação da melhor exploração do recurso alimentar pelos triatomíneos
seria quanto à dinâmica de dejeções e, conseqüentemente, a transmissão do T. cruzi.
Segundo TRUMPER e GORLA (1991), o momento da dejeção não só depende da espécie
de triatomíneo, como também da quantidade de sangue ingerido, pois os barbeiros que
fazem repastos sangüíneos maiores tendem a defecar mais rapidamente que aqueles que
fazem repastos menores.
1.2- Os triatomíneos de interesse no presente estudo
Triatoma brasiliensis (Fig. 1A) (Triatominae, Triatomini) é um importante vetor do
T. cruzi no nordeste do Brasil, predominantemente nas zonas secas, sendo encontrado
atualmente nos estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco,
Tocantins, Goiás e norte da Bahia e Minas Gerais. No ambiente silvestre, T. brasiliensis é
encontrado associado com ninhos de roedores, gambás e pássaros, assim como abrigos de
várias espécies de morcegos. Ele transmite o T. cruzi entre roedores e gambás e também é
capaz de colonizar tanto o domicílio quanto o peridomicílio, espoliando sangue dos
humanos e dos animais domésticos (ALENCAR, 1987). Isso aumenta a importância do T.
brasiliensis como vetor, uma vez que espécimes silvestres podem recolonizar as habitações
3
humanas onde tenha havido, anteriormente, um controle destes insetos pela aspersão de
inseticidas (DIOTAIUTI et al., 2000).
Rhodnius prolixus (Fig. 1B) (Triatominae, Rhodniini) é o principal vetor do gênero
no norte da América do Sul (Venezuela e Colômbia), onde é encontrado em habitats
silvestres, principalmente na copa de palmeiras (SCHOFIELD, 1994), ou também,
estabelecido no domicílio (LENT e WYGODZINSKY, 1979). Também é importante
espécie vetora da doença de Chagas em algumas partes da América Central, como
Guatemala, Honduras e El Salvador, onde apresenta hábitos quase que exclusivamente
domésticos (SCHOFIELD, 1994). R. prolixus é um dos mais importantes modelos
experimentais sob o qual os fundamentos da fisiologia dos insetos foram construídos.
Figura 1- Espécies de triatomíneos de interesse no presente estudo. A: Triatoma
brasiliensis; B: Rhodnius prolixus.
B
Ovos ninfa 1 ninfa 2 ninfa 3 ninfa 4 ninfa 5 fêmea adulta macho adulto
Ovos ninfa 1 ninfa 2 ninfa 3 ninfa 4 ninfa 5 macho adulto fêmea adulta
A
4
1.3- Metodologias empregadas no estudo do comportamento alimentar dos
triatomíneos
Os primeiros estudos visando avaliar o comportamento alimentar de insetos
hematófagos tiveram início no final da década de 1930. GORDON e LUMSDEN (1939)
desenvolveram um aparato simples de microscopia para descrever o processo alimentar de
mosquitos através da transparência da membrana interdigital de rã. Mais tarde, GRIFFITHS
e GORDON (1952) mostraram que a orelha depilada de camundongos também era
apropriada para o estudo de tal mecanismo, permitindo a observação da movimentação das
peças bucais na pele. Muito do que é conhecido a respeito do processo de alimentação dos
insetos também provém dos estudos de BARTH (1952), LAVOIPIERRE et al. (1959) e de
FRIEND e SMITH (1971).
Os triatomíneos são ectoparasitos solenofágicos, isto é, que obtêm o sangue
diretamente dos vasos (vênulas ou arteríolas) da pele dos vertebrados. Suas mandíbulas
serrilhadas perfuram e ancoram o aparato bucal na região superficial da pele, enquanto as
maxilas penetram até a derme. Imediatamente após a introdução do fascículo (um par de
mandíbulas e um par de maxilas; Fig. 2) na pele do hospedeiro, inicia-se a fase de
sondagem, em que as maxilas realizam movimentos oscilatórios (LAVOIPIERRE et al.,
1959), como um chicote, até penetrarem em um vaso sangüíneo (Fig. 3), passando, então, à
fase de ingurgitamento.
5
Figura 2- Corte transversal próximo à base da probóscida de uma ninfa de quinto estádio de
R. prolixus (LAVOIPIERRE et al., 1959).
Figura 3- Esquema da movimentação das maxilas dos triatomíneos durante a fase de
sondagem na pele do hospedeiro (LAVOIPIERRE et al., 1959).
Na fase de ingurgitamento, o sangue passa do canal alimentar ao tubo digestivo
devido à pressão negativa gerada pela bomba cibarial que é formada por um complexo de
fortes músculos (Fig. 4) que ocupam grande parte da cabeça do inseto (BENNET-CLARK,
Lábio
6
1963). Durante a ingestão de líquidos, os músculos cibariais dilatadores se contraem e
deformam a parede dorsal do cibário, a qual retorna à posição original devido à elasticidade
de suas paredes após o relaxamento desses músculos (BARTH, 1952).
Parâmetros como a pressão negativa produzida pela bomba cibarial, as dimensões
do canal alimentar, a viscosidade sangüínea, o tamanho das hemácias dos hospedeiros e sua
capacidade de deformação também podem influenciar na taxa de ingestão dos insetos
(KINGSOLVER e DANIEL, 1995).
Figura 4- Esquema do corte transversal da cabeça de espécime de R. prolixus. 2 e 5:
músculos dilatadores da bomba cibarial; 3 e 4: paredes da bomba cibarial; 1: bomba salivar
(PÉREZ, 1969).
SMITH (1979) e GUARNERI et al. (2000) utilizaram o registro dos sinais gerados
pela musculatura da bomba cibarial para estudar as diferentes fases do comportamento
alimentar dos triatomíneos. Esta técnica baseou-se no trabalho pioneiro de SMITH e
FRIEND (1971) que registrou as mudanças de resistência elétrica entre o inseto e sua fonte
alimentar. Mais recentemente, outras modificações na técnica permitiram o registro dos
sinais produzidos durante o processo alimentar de ninfas pequenas, com as de primeiro
estádio, a partir da colocação do inseto em contato com uma malha de metal, ao invés da
fixação de eletrodos em seu tórax (GUARNERI et al., 2003).
Com base nesta metodologia, diversos estudos têm demonstrado que a taxa de
ingestão (IR) é o principal parâmetro que determina o tempo total de contato (TT) entre
uma espécie de triatomíneo em particular e um hospedeiro imobilizado. Os valores da IR
7
para ninfas de quinto estádio variam de 3,2 mg/min para Rhodnius neglectus Lent, 1954
alimentados em camundongo, a 28,0 mg/min para T. infestans alimentados em pombos. Os
maiores valores de IR em camundongos foram observados para T. infestans (21,3 mg/min)
e R. prolixus (11,9 mg/min), respectivamente (GUARNERI et al., 2000; SANT’ANNA et
al., 2001). A IR também varia consideravelmente entre estádios ninfais da mesma espécie,
por exemplo, de 0,4 mg/min para o primeiro estádio a 11,3 mg/min para o quinto estádio de
T. brasiliensis alimentados em humanos (GUARNERI et al., 2003). A análise destes
trabalhos mostrou que a performance alimentar é influenciada por características mecânicas
e salivares do triatomíneo, bem como pela fisiologia do hospedeiro utilizado como fonte
alimentar (GUARNERI et al., 2000; SANT’ANNA et al., 2001). Em R. prolixus, o tempo
necessário para completar o repasto sangüíneo aumenta com o aumento da viscosidade da
dieta que resulta no declínio na freqüência de funcionamento da bomba cibarial e na
diminuição de seu volume funcional médio (SMITH, 1979).
Recentemente, GUARNERI (2004) demostrou que o T. brasiliensis apresenta uma
baixa performance alimentar em uma espécie de roedor silvestre (Thrichomys apereoides)
comumente encontrado no nordeste brasileiro ocupando fendas de rochas que também são
habitadas por esta espécie de triatomíneo.
1.4- A ação de biomoléculas salivares no processo alimentar dos triatomíneos
A hematofagia nos triatomíneos é um processo complexo que envolve tanto
adaptações sensoriais, como a detecção de emissões de infravermelho provenientes do
hospedeiro (FERREIRA et al., 2007), quanto adaptações na morfologia do aparato
alimentar (BARTH, 1952, 1953; KRAUS, 1957) e adaptações fisiológicas, como a
presença de diversas moléculas bioativas na sua saliva (RIBEIRO, 1995) que auxiliam na
ingestão do sangue (RIBEIRO e GARCIA, 1980).
Recentemente, utilizando a técnica de microscopia intravital, nosso grupo
demonstrou que R. prolixus libera saliva na pele do hospedeiro ao longo de toda a fase de
sondagem e de ingurgitamento (SOARES et al., 2006). A constante deposição de saliva e a
movimentação das peças bucais na pele do hospedeiro desencadeiam uma série de respostas
fisiológicas de reparo, dentre elas a agregação plaquetária, a constrição do vaso lesado, a
8
coagulação sangüínea (os três componentes da hemostasia), além do aumento da
permeabilidade vascular e a quimiotaxia leucocitária (RIBEIRO, 1995).
As espécies de triatomíneos estudadas até o momento apresentaram diferenças no
repertório de moléculas salivares e nas suas atividades. Enquanto as proteínas salivares
mais abundantes em Rhodnius são as nitroforinas, em Triatoma, as mesmas não são
observadas (CHAMPAGNE et al., 1995). Também, a apirase salivar e as atividades
anticoagulante e vasodilatadora mostraram diferenças quantitativas e qualitativas entre as
espécies de tritomíneos estudadas (RIBEIRO et al., 1998).
Várias substâncias farmacológicas ativas, que auxiliam na hematofagia, têm sido
descritas na saliva dos triatomíneos, tais como anticoagulantes (HELMANN e HAWKINS,
1964; 1965; RIBEIRO et al., 1995; 1998; CHAMPAGNE et al., 1995; PEREIRA et al.,
1996; GUDDERRA et al., 2005), vasodilatadores (RIBEIRO et al., 1990; 1993; RIBEIRO
e NUSSENZVEIG, 1993; YUDA et al., 1996), antihistamínicos (RIBEIRO e SARKIS,
1982; RIBEIRO e WALKER, 1994), bloqueador de canal de sódio (DAN et al., 1999),
inibidores de agregação plaquetária induzida por ADP (RIBEIRO e GARCIA, 1980;
SARKIS et al., 1986; FRANCISCHETTI et al., 2000; FAUDRY et al, 2004), trombina
(NOESKE-JUNGBLUT et al., 1995; GOLODNE et al., 2003), colágeno (RIBEIRO e
GARCIA, 1981; NOESKE-JUNGBLUT et al., 1994; ANDERSEN et al., 2003), ácido
araquidônico (RIBEIRO e SARKIS, 1982; FRANCISCHETTI et al., 2000) ou PAF
(GOLODNE et al., 2003). Além destas substâncias que facilitam a localização dos vasos e
a manutenção do fluxo sanguíneo, também foram descritos compostos com atividade
imunossupressora (KALVACHOVA et al., 1999), uma sialidase (AMINO et al., 2001) e
uma proteína formadora de poro (AMINO et al., 2002), além da atividade anti-
complemento (CAVALCANTE et al., 2003) que auxiliam no processo de alimentação,
reduzindo a resposta imune e inflamatória do hospedeiro.
Uma vez que a saliva dos artrópodes hematófagos afeta a fisiologia do hospedeiro
vertebrado no local da picada, ela pode facilitar a infecção deste por parasitos ou patógenos
carreados pelo vetor (VALENZUELA, 2002). TITUS e RIBEIRO (1988) demonstraram
que a saliva do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis Lutz & Neiva, 1912 aumenta a
infecção por Leishmania major quando o parasito é inoculado juntamente com a saliva do
vetor. Resultados similares foram obtidos na interação carrapato-vírus (JONES et al., 1989;
9
LABUDA et al., 1993) e também na associação mosquito-vírus (EDWARDS et al., 1998;
LIMESAND et al., 2000). Diferentemente do Trypanosoma rangeli, que é inoculado
juntamente com a saliva dos triatomíneos, o T. cruzi é depositado na pele juntamente com
as fezes do inseto. No entanto, o local da picada do triatomíneo é considerado um
importante sítio para a penetração do T. cruzi (SCHUSTER e SCHAUB, 2000). É provável
que algumas atividades descritas na saliva dos triatomíneos, como a atividade
anticomplemento (CAVALCANTE et al., 2003) por exemplo, facilite a infecção.
1.5- Lipocalinas salivares
Os sialomas (transcriptomas de glândulas salivares) de triatomíneos publicados até o
momento têm mostrado que estes insetos apresentam, majoritariamente, na sua saliva, um
grande número e variedade de proteínas da família das lipocalinas. Entre as proteínas
secretadas nas glândulas salivares, as lipocalinas representaram 55% em T. infestans
(ASSUMPÇÃO et al., 2008), 83,7% em R. prolixus (RIBEIRO et al., 2004) e 93,8% em T.
brasiliensis (SANTOS et al., 2007).
As lipocalinas constituem um grande grupo de moléculas presentes nas glândulas
salivares dos triatomíneos. São proteínas tipicamente extracelulares, de baixo peso
molecular e que compartilham algumas propriedades moleculares, como a ligação a
pequenas moléculas, principalmente as hifrofóbicas; ligação a receptores específicos de
superfície; formação de complexos covalentes e não-covalentes com outras moléculas
solúveis. Embora tenham sido descritas principalmente como proteínas de transporte, as
lipocalinas exercem grande variedade de funções. Apesar de possuírem a mesma estrutura
tridimensional clássica, de uma molécula em forma de barril abrigando uma cavidade
central, as lipocalinas apresentam diversidade quanto à seqüência de aminoácidos, com
geralmente apenas 20% de identidade entre os membros da família (FLOWER et al., 2000).
As lipocalinas salivares foram adquiridas pelos triatomíneos e pelos carrapatos ao
longo da evolução resultando em um grande valor adaptativo na evolução convergente dos
artrópodes para a hematofagia (CALVO et al., 2006). Estudos de proteômica e genômica
10
funcional têm sido realizados para investigar o papel das lipocalinas salivares nos
artrópodes hematófagos. Foram observadas diversas moléculas com atividades
anticoagulante, antiplaquetária, antiinflamatória e vasodilatadora (ANDERSEN et al.,
2005).
Dentre as lipocalinas de R. prolixus, as moléculas mais abundantes e mais estudadas
são as nitroforinas, perfazendo aproximadamente 50% das proteínas salivares. Elas foram
nomeadas como NP1, NP2, NP3 e NP4 (CHAMPAGNE et al., 1995) de acordo com sua
abundância relativa nas glândulas salivares. Devido à presença de um grupamento heme na
sua molécula, as NPs conferem cor vermelho vivo típica da saliva das espécies do gênero
Rhodnius. Nos últimos anos, foram identificadas outras NPs na saliva do R. prolixus, como
a NP5, NP6 (MOREIRA et al., 2003) e a NP7 (KNIPP et al., 2007). No entanto, suas
propriedades foram pouco estudadas e suas atividades ainda não foram totalmente
esclarecidas.
A seqüência de nucleotídeos e aminoácidos da NP1 e da NP4 foram determinadas,
sendo que NP1 e NP4 possuem 90% de identidade e NP2 e NP3 apresentam 80%. Por outro
lado, o grupo NP1-4 possui apenas 42% de identidade com o grupo NP 2-3
(CHAMPAGNE et al., 1995; ANDERSEN e MONTFORT, 2000). O estudo da estrutura
cristalina da NP2 veio confirmar que as nitroforinas possuem semelhança estrutural com as
lipocalinas, sendo caracterizadas por oito folhas pregueadas β antiparalelas que envolvem
uma ampla cavidade onde se situa o único grupamento heme que se liga à proteína, através
do contato com 10 resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, além da coordenação da cadeia
lateral da histidina proximal (His 59) com o átomo de ferro (ANDERSEN e MONTFORT,
2000).
Uma característica marcante das nitroforinas é a sua habilidade de armazenar e
transportar o óxido nítrico. O NO caracteriza-se por ser uma molécula extremamente
reativa, com meia-vida de menos de um minuto em soluções contendo oxigênio, tióis e
várias hemeproteínas, mas que pode prontamente atravessar membranas e ativar células
situadas longe da região onde é produzido ou liberado (BREDT e SNYDER, 1994). O NO
liga-se ao grupamento heme das diferentes globinas. Entretanto, o sítio de ligação ao ferro
das nitroforinas contém o átomo de ferro em estado de oxidação 3 (Fe III) onde a ligação ao
11
óxido nítrico torna-se reversível (Kd~10
-6
M). Nas demais moléculas de globina, onde o
átomo de ferro é encontrado em estado ferroso (Fe II), a ligação do grupamento heme ao
óxido nítrico é irreversível (Kd~10
12
M) (ANDERSEN et al., 1998).
A confirmação de que o NO era produzido nas glândulas salivares de R. prolixus
veio com o encontro da atividade característica da enzima NO sintase nas glândulas
salivares deste triatomíneo. Esta atividade é dependente de NADPH, FAD,
tetrahidrobiopterina, calmodulina e Ca
2+
, produzindo citrulina e NO a partir de L-arginina
(RIBEIRO e NUSSENZVEIG, 1993). De acordo com os experimentos de NUSSENZVEIG
et al. (1995), o NO é produzido intracelularmente e difunde-se através de vesículas lipídicas
até o lúmen da glândula, onde se liga às nitroforinas.
Uma vez que as NPs perfazem aproximadamente 50% do conteúdo total das
proteínas salivares de R. prolixus, a maior parte das atividades biológicas da saliva estão
relacionadas ao NO. Na glândula salivar de R. prolixus (pH≤ 6.0), as NPs estão ligadas ao
NO mas, quando a saliva é injetada no sítio da picada na pele do mamífero, o pH de cerca
de 7.4 permite a pronta liberação deste composto (CHAMPAGNE et al.,1995). Ao entrar
em contato com o endotélio dos vasos sangüíneos do hospedeiro, o NO promove
vasodilatação e, na microcirculação, é capaz de inibir a agregação plaquetária. O efeito
vasodilatador é possível pelo fato do NO ser uma molécula capaz de regular o tônus
vascular pela estimulação das vias de sinalização que resulta em relaxamento da
musculatura lisa da parede vascular (ANDERSEN et al., 2005). Já a inibição da agregação
plaquetária é devido à ativação da enzima guanilato ciclase citosólica pelo NO
(MONCADA et al., 1991 in RIBEIRO, 1995). É provável que R. prolixus sintetize as várias
nitroforinas para que todas elas trabalhem funcionalmente juntas. O fato das NPs possuírem
diferentes taxas de liberação do NO deve garantir uma liberação contínua deste composto
durante todo processo de alimentação (ANDERSEN et al., 1997; 2000).
As NPs também apresentam atividades biológicas não relacionadas ao NO. ZHANG
et al. (1998), trabalhando com a NP2 isolada de glândulas salivares de R. prolixus,
mostraram que esta proteína atua como um inibidor específico da ativação do complexo
Fator Xase da via intrínseca da coagulação. A NP2 foi capaz de inibir a ativação do fator
Xase na presença de fosfolípides, do fator VIII, mas não na ausência destes dois fatores.
Esses resultados sugerem que a NP2 interage mais favoravelmente com o fator IXa quando
12
o mesmo se encontra ligado ao complexo fator VIIIa/ superfície de membrana/ fator X.
Posteriormente, estudos realizados por ISAWA et al. (2000) demonstraram que a NP2 liga-
se diretamente aos fatores IX e IXa na presença de íons Ca
2+
, inibindo tanto a ação
catalítica do fator XIa sobre o fator XI quanto a ativação do complexo Xase da via
intrínseca pela interação do fator IXa com o fator VIIIa e os fosfolípedes de membrana.
Além disso, a NP2 também inibiu a ativação do fator IX em IXa pela inibição da ligação do
fator IX com o fator VIIa complexado com fator tissular da coagulação (fator III),
demonstrando que essa proteína também interfere na via extrínseca da coagulação.
A confirmação de que as NPs são responsáveis pela atividade anti-histamínica,
observada nos homogenatos salivares de R. prolixus, veio com o trabalho realizado por
RIBEIRO e WALKER (1994), onde os autores mostraram que a histamina e outros
compostos imidazólicos ligam-se fortemente às nitroforinas, sendo que essa ligação desloca
o NO. A histamina pode ser encontrada no sítio da picada de um inseto hematófago, sendo
liberada por mastócitos previamente sensibilizados por antígenos salivares causando rubor,
aumento de temperatura e coceira no local da picada. A neutralização da ação da histamina,
no sítio de alimentação do inseto, é de fundamental importância, constituindo em uma
vantagem em prol do inseto no sentido de facilitar sua alimentação sangüínea.
Nenhuma proteína contendo grupo heme foi descrita na saliva de espécies do gênero
Triatoma que apresenta a glândula salivar de cor esbranquiçada.
1.6- A influência do ambiente intestinal no comportamento alimentar de T. brasiliensis
Tem-se relatado na literatura que os potentes inibidores de trombose produzidos
pelos invertebrados hematófagos têm, provavelmente, a função de facilitar a aquisição de
sangue (LEDIZET et al., 2005). Neste contexto, nosso grupo demonstrou que o inibidor de
trombina intestinal de T. brasiliensis, chamado brasiliensina, tem papel importante na
obtenção do repasto por inibir a coagulação do sangue no intestino médio do inseto
(ARAUJO et al., 2006). Ao comparar um grupo de insetos cujo gene fora silenciado com
insetos controles, ao se alimentarem em hospedeiro vivo, o primeiro grupo ingeriu
quantidade de sangue significativamente menor (54,2 ± 6,4 mg e 88,9 ± 9,3 mg,
respectivamente). Ao comparar insetos previamente alimentados com trombina adicionada
13
à solução artificial, com aqueles que ingeriram apenas a solução artificial, constatou-se uma
redução de 55% na quantidade de sangue ingerido após alimentação ad libitum em
hamsters anestesiados (26 ± 6 mg e 57 ± 9 mg, respectivamente). Uma explicação para o
fato foi a observação de grandes e consistentes coágulos formados no interior do intestino
médio apenas dos insetos silenciados.
1.7- RNA interferente
O silenciamento gênico é uma tecnologia cujo uso vem crescendo rapidamente nos
últimos anos, sendo uma das técnicas mais utilizadas a do RNA interferente (RNAi).
O termo “RNA interference” foi empregado pela primeira vez por FIRE et al.
(1998) e refere-se ao silenciamento pós-transcricional da expressão gênica em resposta à
introdução de um RNA de fita dupla (dsRNA) na célula. O sucesso da técnica de RNAi se
deve à simplicidade, conveniência e custo relativamente baixo para a produção e a
introdução de dsRNA nos organismos. O fenômeno foi demonstrado em animais, pela
primeira vez de uma forma clara, em Caenorhabditis elegans, no qual o silenciamento foi
atingido pela injeção de dsRNA no verme, através da alimentação com bactérias
expressando o dsRNA ou simplesmente pelo fornecimento de dsRNA diretamente na
alimentação do verme (FIRE et al., 1998).
O RNAi vem sendo adaptado para o uso em insetos, incluindo Anopheles gambiae
(BLADIN et al., 2002), Drosophila melanogaster (KENNERDELL e CARTHEW, 1998;
ST JOHNSTON, 2002), Manduca sexta (VERMEHREN et al., 2001), Periplaneta
americana (MARIE et al., 2000), Oncopeltus fasciatus (HUGHES e KAUFMAN, 2000). A
técnica já foi também empregada para a redução da expressão de genes salivares nos
carrapatos Ixodes scapularis (NARASIMHAN et al., 2004) e Amblyomma americanum
(KARIM et al., 2004).
No nível molecular, a técnica de RNAi é um mecanismo de interferência pós-
transcricional (MONTGOMERY et al., 1998; NGO et al., 1998) altamente específico
(DUXBURY et al., 2004) que permite estudar a função de um gene pela clivagem do RNA
mensageiro de interesse (MONTGOMERY et al. 1998; NGO et al. 1998; ZAMORE et al.
14
2000) através de uma nuclease chamada RISC (“RNA-induced silencing complex”)
presente nas células de um vasto número de organismos eucariotos. Foi proposto que esta
maquinaria constitui-se em um mecanismo celular fisiológico de defesa contra a infecção
viral e de proteção do genoma contra a instabilidade gerada pelo acúmulo de transposons e
seqüências repetitivas (ZAMORE et al., 2000).
Há um consenso atual de que os dsRNAs são clivados pela endonuclease RNAse III
chamada Dicer, no citoplasma da célula, gerando fragmentos de 21 a 25 pares de base, os
siRNAs (“small interfering RNA”). Estes são então incorporados à RISC formando um
complexo que é guiado pelos siRNAs ao longo do RNAm, onde ocorre o reconhecimento e
a clivagem dos sítios complementares aos siRNA, inativando a expressão gênica no nível
pós-transcricional (Fig. 5). Logo, de acordo com a célula ou organismo alvo, é possível
induzir o silenciamento usando dsRNA, siRNA and shRNA (“short hairpin”, uma fita
simples e palindrômica de RNA que forma um grampo).
Recentemente, nosso grupo padronizou a técnica do RNAi para triatomíneos
(ARAUJO et al., 2006). Tendo em vista a quantidade e diversidade de genes com função
desconhecida identificada no seqüenciamento das bibliotecas de cDNA de triatomíneos, o
RNAi constitui-se em uma valiosa ferramenta que pode ser amplamente empregada em
estudos de genômica funcional.
15
Figura 5- Mecanismo do RNAi em célula eucariótica. Adaptado de Barbosa e Lin, 2004.
16
2- Justificativa
A hematofagia nos artrópodes surgiu pelo menos 20 vezes em ocasiões
independentes (WHEELER et al., 2001). A evolução para a hematofagia resultou em uma
série de adaptações, dentre elas a morfologia do aparato alimentar (BLACK e
KONDRATIEFF, 2005) e a mudança da saliva que contém potentes substâncias
farmacológicas ativas que alteram a hemostasia do hospedeiro, o sistema imune e
inflamatório (VALENZUELA, 2004).
A alimentação sobre os vertebrados é uma tarefa que pode implicar em risco para os
artrópodes, uma vez que eles ficam muito expostos, por exemplo, à predação. Pressões
evolutivas atuam sobre os insetos para minimizar o tempo de contato com o hospedeiro
(ROSSIGNOL et al., 1985).
Atualmente, o número de seqüências gênicas de artrópodes vetores de doenças
depositadas nos bancos de dados vem aumentando consideravelmente. Entretanto, muito
trabalho ainda deve ser realizado para identificar e caracterizar, no nível molecular, o papel
dos genes que podem interferir na competência vetorial e/ou na dinâmica populacional
destes insetos. Dentre estes, temos os genes relacionados à hematofagia, pois é geralmente
durante este processo que o agente etiológico circula entre o hospedeiro vertebrado e o seu
vetor. Além disso, o sangue obtido pode representar o único alimento como no caso dos
triatomíneos e carrapatos, ou pode atuar como fonte suplementar de nutrientes para a
produção de ovócitos, como nos mosquitos e flebotomíneos.
Neste contexto, a proposta deste trabalho visa caracterizar detalhadamente o processo
de alimentação de R. prolixus e de T. brasiliensis, correlacionando as alterações observadas
na microcirculação da pele do hospedeiro com a performance alimentar dos insetos, bem
como determinar a função de proteínas salivares e a influência da aglutinação eritrocitária
no processo de hematofagia.
17
3- Objetivos
3.1- Objetivo geral
Estudar as alterações vasculares na pele do hospedeiro e a influência das lipocalinas
salivares e do ambiente intestinal durante o processo de hematofagia dos triatomíneos.
3.2- Objetivos específicos
Parte 1
a) Identificar e caracterizar as alterações vasculares na microcirculação da pele de
camundongos durante e logo após o processo alimentar dos triatomíneos.
b) Realizar registros simultâneos de microscopia intravital e do eletromiograma da bomba
cibarial durante o processo alimentar dos triatomíneos na pele do hospedeiro.
c) Desenvolver uma metodologia para a análise de imagens que permita identificar
fenômenos que ocorrem nos vasos da pele durante a hematofagia, correlacionando-os com
os perfis dos sinais elétricos produzidos pela bomba cibarial dos triatomíneos.
Parte 2
a) Estudar o nível de expressão das nitroforinas (1-4) nas glândulas salivares de R. prolixus.
b) Determinar a influência das nitroforinas na performance alimentar de R. prolixus em
camundongos.
c) Estudar a influência do sítio da alimentação (dorso ou veia lateral da cauda) na
performance alimentar dos triatomíneos.
18
Parte 3
a) Comparar a performance alimentar de T. brasiliensis em roedor silvestre (Thrichomys
apereoides (Rodentia, Echimyidae) e em rato sinantrópico (Rattus norvegicus albinus
(Rodentia, Mammalia).
b) Estudar a influência do plasma e das hemácias destes roedores na performance alimentar
de T. brasiliensis em alimentador artificial.
c) Estudar a participação do conteúdo do intestino médio anterior de T. brasiliensis no
empacotamento das hemácias.
19
4- Material e Métodos
4.1- Delineamento experimental
Inicialmente, descrevemos aspectos da interação vetor-hospedeiro vertebrado, com o uso
da microscopia intravital, enfatizando as alterações na microcirculação da pele do camundongo
ocorridas durante e após o processo alimentar de ninfas de R. prolixus. Alguns dos experimentos
de microscopia intravital foram realizados concomitantemente com os de eletromiograma da
bomba cibarial para que a análise sincronizada dos resultados possibilitasse a identificação de
fenômenos vasculares que se correlacionam com certos perfis elétricos gerados pelo
funcionamento da bomba cibarial durante o repasto na microcirculação da pele do hospedeiro
mamífero. Para isso, foi indispensável o desenvolvimento de uma nova metodologia para a análise
das imagens obtidas em ambos os experimentos de uma forma associada (parte 1).
Em seguida, determinamos o papel das nitroforinas na performance alimentar de R.
prolixus. O nível de expressão das NPs 1-4 em insetos normais foi determinado por PCR em
tempo real. Depois, silenciou-se a expressão destas proteínas para que fossem comparados os
parâmetros do processo alimentar de ninfas silenciadas e controles obtidos pelo eletromiograma da
bomba cibarial durante a alimentação sobre a pele do dorso ou sobre a veia ateral da cauda de
camundongos swiss (parte 2).
Finalmente, a performance alimentar de ninfas de T. brasiliensis na alimentação natural
(com os hospedeiros vivos Rattus norvegicus ou Thrichomys apereoides) e no alimentador
artificial (contendo sangue ou hemácias ou plasma dos roedores) foram comparadas pela
determinação do ganho de peso, do tempo total de contato e da taxa de ingestão. Após a
alimentação natural e artificial com suspensão de hemácias, as ninfas foram imediatamente
dissecadas para a observação do aspecto do conteúdo intestinal ao microscópio ótico para
identificar qual fenômeno estaria influenciando na ingestão de sangue. Hemácias de cada roedor,
com hematócrito ajustado, foram dispostas em lâminas acrescidas de conteúdo intestinal de T.
brasiliensis para verificar se haveria a confirmação do fenômeno verificado in vivo (parte 3).
O uso de ninfas de R. prolixus de diferentes estádios nas partes 1 e 2 deste estudo foi
devido ao fato de, na técnica de microscopia intravital, a ninfa de terceiro estádio ter o tamanho
mais apropriado (SOARES et al., 2006).
20
4.2- Insetos utilizados
Ninfas de R. prolixus (Honduras) e de T. brasiliensis ( Ceará, Brasil) foram mantidas no
insetário do Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos do Departamento de Parasitologia
do ICB/ UFMG, sob condições controladas de temperatura (26 ± 2ºC), umidade (65 ± 10%) e
fotoperíodo de 12h claro/escuro. A alimentação semanal foi feita em galinha ou em rato (Rattus
norvegicus).
4.3- Hospedeiros mamíferos
Camundongos hairless (HRS/ J), swiss e Rattus norvegicus foram obtidos no biotério do
Departamento de Parasitologia-ICB/ UFMG. Os espécimes de Thrichomys apereoides (Fig. 6)
foram provenientes de capturas em Crateús, Ceará (5°07’S – 40°45’W), sob permissão do Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (licença n. 076/2000-DIFAS/
DIREC).
Todos os roedores foram mantidos em condição padrão e livre acesso a água e ração
comercial. Neste estudo, os animais não tiveram contato prévio com qualquer triatomíneo.
Figura 6- Thrichomys apereoides. O exemplar da foto mediu aproximadamente 20cm sem a cauda.
21
4.4- Parte 1- Estudo das alterações vasculares na pele do hospedeiro durante o processo
alimentar de R. prolixus
4.4.1- Microscopia intravital
Os camundongos hairless foram anestesiados via intraperitoneal (i.p.) com uma mistura de
ketamina 150 mg/kg (Cristalia- Brasil) e xilazina 10 mg/kg (Bayer- Brasil). A veia da cauda foi
canulada para a administração de reagentes ou anestésicos quando necessário. Os experimentos
foram feitos na superfície convexa dorsal da orelha de camundongos hairless, esticada contra uma
pequena plataforma de Plexiglas utilizando uma gota de água. Durante os experimentos, os
camundongos foram mantidos a 37
o
C sobre uma manta térmica (Fine Science Tools, Vancouver,
Canada). A pele da orelha foi examinada utilizando-se microscópio de epifluorescência (Olympus
BX50) ou microscópio estereoscópico (Wild Heerbrug M5-89797). As imagens foram capturadas
com uma câmera (Olympus U-PMTVC) conectada a um gravador de DVD (LG DR175B) e
armazenadas em discos para posterior análise dos resultados.
Vinte e quatro horas antes dos experimentos, as ninfas de R. prolixus de terceiro estádio,
com jejum de 10 dias após a muda, foram fixadas pelo tórax (esterno), individualmente, a uma tira
de papel para que fosse reduzida sua mobilidade sob o campo de observação do microscópio.
4.4.2- Análise das imagens obtidas nos experimentos de microscopia intravital
As imagens produzidas pela microscopia intravital de ninfas de terceiro estádio de R.
prolixus foram analisadas utilizando-se o programa Image J (ABRAMOFF et al., 2004;
RASBAND, 2007).
As variações na área do vaso nas imagens gravadas (estimativa da variação do diâmetro do
vaso) foram medidas ao longo de todo o repasto num trecho que incluiu o sítio de canulação. O
programa calculou a área do vaso para cada imagem dos vídeos (~25 imagens/s) e os valores
foram plotados no Microsoft excel e SigmaPlot 2002 para Windows versão 8.0 para a análise e
construção dos gráficos.
22
Para esta análise, foram escolhidos cinco experimentos nos quais os triatomíneos se
alimentaram em vênulas por um período mínimo de 15 minutos.
4.4.3- Alterações na permeabilidade vascular e ocorrência de hemorragias
As alterações na permeabilidade vascular, resultantes do processo de alimentação dos
triatomíneos, foram investigadas usando-se o corante Azul de Evans (Merck, 20 mg/Kg) em
solução salina (NaCl 0,9%) injetado via intravenosa (i.v.) imediatamente antes dos experimentos
(MATOS et al., 1999).
A superfície dorsal da pele da orelha sem o contato prévio com triatomíneos foi utilizada
como controle. Para isso, foram gravadas imagens durante cinco minutos após a injeção da
solução com o corante. No grupo experimental, ninfas de terceiro estádio de R. prolixus (uma por
orelha) foram removidas da pele 60 segundos após o início da fase de sondagem. Os insetos foram
posicionados para picar junto à borda da orelha onde há apenas vasos pequenos (BARKER et al.,
1989), prevenindo, assim, a canulação durante os experimentos. A observação do extravasamento
do corante para os tecidos foi feita 15 minutos após o término do período de sondagem.
Para auxiliar na visualização da vasculatura em alguns experimentos, 100 µl de FITC-
Dextran 5% (Sigma-Aldrich, mol wt 282,000) em solução salina (NaCl 0.9%) foram
administrados via i.v.. O fluorocromo funcionou como marcador de plasma e sua fluorescência foi
visualizada por epi-iluminação (450-490 nm excitação/535 nm emissão) (HICKEY et al., 2002).
Nestes experimentos, permitiu-se que os insetos realizassem o processo alimentar por completo,
tanto para observar o extravasamento do corante, quanto para observar a ocorrência de eventos
hemorrágicos nos vasos (arteríolas ou vênulas) lesados pelas maxilas dos insetos.
4.4.4- Agregação plaquetária e recrutamento de leucócitos
Para observar as interações plaquetas-endotélio e o recrutamento de leucócitos, rhodamina
6G (Sigma, mol wt 479,02) (0,5 mg/ kg) em solução salina (NaCl 0,9%) foi administrada via i.v..
A rhodamina 6G marca plaquetas e leucócitos que são observados por epi-iluminação (510-560
nm excitação/ 590 nm emissão) (HICKEY et al., 2002).
Leucócitos em rolamento foram definidos como células brancas se movendo a uma
23
velocidade menor que aquela dos eritrócitos no mesmo vaso. Foram considerados leucócitos
aderidos ao endotélio venular aqueles que permaneceram estacionários por um período igual ou
superior a 30 segundos em um segmento de vênula de 100 µm (CARVALHO-TAVARES et al.,
1999). No grupo controle, o comportamento dos leucócitos foi registrado durante 60 segundos
antes do início do processo alimentar de ninfas de terceiro estádio de R. prolixus. O
comportamento dos leucócitos e a agregação plaquetária foram gravados em diferentes momentos:
logo ao término da fase de ingurgitamento e aos 10 e 30 minutos seguintes.
4.4.5- Eletromiograma da bomba cibarial
A técnica utilizada para o estudo do comportamento alimentar dos triatomíneos, através do
registro elétrico da atividade da bomba cibarial, foi modificada a partir da protocolo utilizado por
GUARNERI et al. (2003).
Um eletrodo de níquel cromo foi conectado à fonte alimentar e outro, conectado a uma
malha de metal que recobre internamente o pequeno frasco cilíndrico no qual o inseto é mantido
durante os experimentos. A extremidade do eletrodo que fica em contato com a pele do hospedeiro
e a tela que serve de substrato para as patas do inseto foram recobertas com uma fina camada de
gel eletrolítico (Regisgraf-Gel®) para facilitar a transmissão do sinal elétrico produzido pelos
músculos da bomba cibarial. Os sinais produzidos durante o processo alimentar foram filtrados,
rejeitando-se freqüências acima de 17 Hz com inclinação de −45 dB/octave (para minimizar os
ruídos elétricos externos), amplificados 210 vezes e digitalizados por uma placa de aquisição
(ADC100®-Pico Technology Limited) conectada a um microcomputador IBM-AT compatível.
Registrou-se a alimentação das ninfas até que removessem suas peças bucais da pele sem
que tentassem sondar novamente dentro de um minuto. Os insetos foram pesados imediatamente
antes (peso inicial; IW, mg) e logo após o término do ingurgitamento para a determinação do
ganho de peso (WG, mg). Todos os insetos que pelo menos dobraram seu peso inicial foram
incluídos nas análises.
A fase de ingurgitamento foi definida como o período de tempo iniciado após pelo menos
10 sinais consecutivos típicos atribuídos às contrações da bomba cibarial. O tempo total de contato
(TT; min) foi definido como o tempo em que as peças bucais permaneceram em contato com a
pele do hospedeiro.
24
O tempo cumulativo de sondagem (PT; min) consiste no período que vai da inserção das
peças bucais na pele até o início da fase de ingurgitamento. Quando o inseto finaliza a sondagem
inicial e recomeça outra, picando novamente, o tempo relativo à primeira sondagem é adicionado
ao da segunda e assim por diante.
Durante o ingurgitamento, a bomba cibarial pode parar o seu funcionamento e depois
retomá-lo, sem que o inseto retire suas peças bucais da pele, caracterizando, assim, uma
interrupção. O tempo de interrupção (IT; min) foi definido como um intervalo de tempo no qual o
inseto não está bombeando o sangue após já ter iniciado a fase de ingurgitamento.
O tempo não ingestivo (NIT; min) é resultante da soma do TP e IT. A taxa de ingestão total
(IR; mg/min) e a taxa de ingestão efetiva (EIR; mg/min) foram calculadas pela divisão do WG
pelo TT ou pelo tempo de contato efetivo (TCE; min), respectivamente. A quantidade de líquido
ingerido por contração da bomba cibarial (QLC, µg) foi obtida dividindo-se o WG (mg) pelo
número total de contrações da bomba cibarial durante o ingurgitamento. A freqüência de
contrações da bomba cibarial (F; contrações/s) representa o número total de contrações dividido
pelo tempo no qual a bomba está efetivamente em funcionamento (TCE), descontando-se o tempo
relativo às sondagens e interrupções (GUARNERI et al., 2000; SANT’ANNA et al., 2001).
Nesta parte, os experimentos de eletromiograma da bomba cibarial e os de microscopia
intravital foram realizados conjuntamente sobre a orelha de camundongos hairless a fim de
possibilitar a análise simultânea de parâmetros obtidos com estas duas metodologias.
25
4.5 - Parte 2 - Caracterização funcional das nitroforinas expressas na glândula salivar de R.
prolixus
4.5.1- Extração de RNA e síntese de cDNA
O RNA total de seis glândulas salivares (três pares) de R. prolixus de segundo ou quarto
estádio foi extraído com o RNeasy
Micro Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do
fabricante. O RNA foi eluído em 11µl de água milliQ e 8 µl foram utilizados para a síntese de
DNA complementar (cDNA) usando 0,5 µg de hexâmeros randômicos (Promega) e o sistema da
transcriptase reversa M-MLV (Promega) em um volume final de 12,5 µl. Este procedimento foi
empregado na produção de cDNA para a PCR em tempo real (qPCR) e para a PCR.
4.5.2- Síntese de RNA de fita dupla
Um microlitro do cDNA das glândulas salivares foi amplificado pela PCR utilizando
iniciadores específicos (Tab. 1) conjugados com 23 bases do promotor da T7 RNA polimerase na
extremidade 5’ (5´TAATACGACTCACTATAGGGAGA 3´). O PCR foi feito em 35 ciclos (94ºC
por 30 s, 60ºC por 30 s, 72ºC por 45 s) com 200 nM de cada iniciador, 200 µM de dNTPs e 1
unidade de Taq polimerase (Phoneutria) em um volume final de 20 µl. Os produtos da PCR foram
utilizados como molde para a síntese do RNA de fita dupla (dsRNA) usando o T7 Ribomax
Express RNAi System (Promega) segundo as recomendações do fabricante. Após a síntese, o
dsRNA foi precipitado em isopropanol, dissolvido em água milliQ e quantificado
espectrofotometricamente a 260 nm. A pureza e integridade do dsRNA foram determinadas por
eletroforese em gel de agarose a 2,5%. O dsRNA foi mantido a -80ºC até o uso.
26
Tabela 1- Iniciadores utilizados nas PCRs.
Gene Senso
5’ →
→→
→ 3’
Anti-senso
5’ →
→→
→ 3’
Produto (pb)
Nitroforina 1 (NP1) tttgctgcagtgggtgtaag agttgcccgacgttacatct 334
Nitroforina 2 (NP2) gccgtgaccattctctgtct tcacggcgcttttaactttt 502
Nitroforina 3 (NP3) tggaaccgtactcagctttg gcgtttttaaccgttgcact 520
Nitroforina 4 (NP4) cgtagccattctgtgcctgt gcagatacggcgctttta ac 501
rRNA 18s (RR18s) cctgcggcttaatttgactc gtacaaagggcagggacgta
468
4.5.3- Administração de dsRNA
A administração do dsRNA foi feita por duas injeções, lateralmente na hemocele do tórax
de R. prolixus, com o intervalo de 48 horas (ARAUJO et al., 2006). Cada ninfa de segundo estádio
do grupo silenciado (teste) foi injetada duas vezes com 3 µg de dsRNA das NPs 1- 4, diluídos em
0,4 µl de solução salina (NaCl 0,9%), ao passo que cada ninfa de quarto estádio foi injetada duas
vezes com 10,5 µg de dsRNA das NPs 1-4, diluídos em 1,4 µl de solução salina 0,9%. Os
preparados das NPs 1-4 continham quantidades equivalentes de dsRNA das quatro proteínas. Os
insetos do grupo controle receberam 0,4 ou 1,4 µl de solução salina apenas. Quarenta e oito horas
após a segunda injeção, parte das ninfas foi alimentada em hamsters e utilizada nos experimentos
após a muda para o estádio subseqüente (ARAUJO et al., 2006).
27
4.5.4- Verificação do silenciamento pela PCR em tempo real
A PCR foi feita com sete pools de cDNA, sendo que cada um deles era composto por três
pares de glândulas salivares de insetos do grupo controle ou do grupo silenciado. Os iniciadores
utilizados na qPCR estão mostrados na Tabela 2.
As reações da qPCR foram realizadas utilizando o Power SYBR
Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems) e a detecção dos resultados foi feita pelo ABIPRISM 7300 Sequence
Detection System (Applied Biosystems). Cada reação foi feita em duplicata para cada gene,
contendo 0,5 µl dos produtos da reação de síntese de cDNA, 300 nM de cada iniciador, 17,5 µl do
Power SYBR
Green PCR Master Mix em um volume final de 25 µl. As condições de
amplificação foram: 95
o
C por 10 min, 40 ciclos de 95
o
C por 15 s e 60
o
C por 1 min. Durante as
reações, foi realizada a análise da curva de dissociação dos amplificados de cada amostra para
verificar se as qPCRs estavam produzindo mais de um produto.
Todos os produtos de qPCR tiveram sua especificidade confirmada pela análise da
eletroforese em gel de agarose a 2,5%. A quantidade de transcritos-alvo em cada amostra foi
determinada usando o método 2
-∆∆Ct
(LIVAK and SCHMITTGEN, 2001) e o RNA ribosomal 18s
(RR18s) foi empregado como controle interno das reações.
Tabela 2- Iniciadores utilizados na qPCR
Gene Senso
5’ →
→→
→ 3’
Anti-senso
5’ →
→→
→ 3’
Produto
(pb)
NP1 tttgctgcagtgggtgtaag agttgcccgacgttacatct 334
NP2 catatgtttgcgggaaggat atcgtactggcacccaagat 163
NP3 aacccagtgcaacggttaaa ctccaccaattggcattttt 185
NP4 ttaaaagcgccgtatctgct agaacgtcaaatgtctctttacct 248
RR 18s cctgcggcttaatttgactc gtacaaagggcagggacgta 468
28
4.5.5- Ensaio do tempo de recalcificação do plasma citratado
Ninfas de terceiro ou quinto estádio de R. prolixus (silenciadas ou não) foram dissecadas
em solução salina (NaCl 0,9%) e as suas glândulas salivares transferidas para um tubo de micro
centrífuga, em gelo, contendo 30 µl de tampão HEPES/NaCl (HEPES 20 mM – NaCl 100 mM,
pH 7,5). As glândulas foram rompidas por sonicação e centrifugadas a 12000 g por 3 min. O
sobrenadante contendo a saliva foi transferido para um novo tubo e diluído em tampão
HEPES/NaCl a 1:4 e 1:8 para o terceiro e o quinto estádio, respectivamente. Para o ensaio, 30 µl
das amostras diluídas foram distribuídas em uma placa de 96 poços e incubadas com 30 µl de
plasma humano citratado (0,38 % trisódio citrato) a 37
o
C por 5 min. Após a incubação, a
coagulação do plasma foi disparada pela adição de 30 µl de CaCl
2
25 mM pré-aquecido a 37ºC.
Uma vez que a coagulação provoca um aumento na turbidez, foi possível monitorar a reação pelo
leitor de ELISA a 37°C e absorbância de 655 nm, com leituras a cada 10 s. O valor do tempo de
coagulação do plasma foi definido como o tempo necessário para que a turbidez atinja a
absorbância de A
655
= 0,025 unidades. A absorbância no tempo zero foi considerada como zero
unidade de absorbância (RIBEIRO, 2000).
4.5.6- Ensaio de atividade da enzima apirase
A glândula salivar de cada ninfa de terceiro ou quinto estádio (silenciada ou não) foi
extraída e rompida em 30 µl de tampão HEPES/NaCl (HEPES 20 mM– NaCl 100 mM, pH 7,5) e
centrifugada por três minutos a 12000g. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Para o
ensaio, foram utilizados 0,5 µl do homogenato salivar de ninfa de quinto estádio e 1 µl do
homogenato de ninfa de terceiro estádio, adicionados ao tampão HEPES/NaCl pH 7,4 para o
volume final de 20 µl. Estas alíquotas de 20 µl foram adicionadas a 80 µl de tampão HEPES/NaCl
contendo 2 mM de ATP e 5 mM de CaCl
2 ,
incubados a 37
0
C por 20 min (Ribeiro et al., 1998).
Após as incubações, o fosfato inorgânico foi medido utilizando o kit comercial (Labtest
Diagnostica) que se baseia no método descrito por BAGINSKI et al., (1967).
29
4.5.7- Quantificação de proteínas
A quantidade total de proteínas extraídas das glândulas salivares de ninfas de terceiro e
quinto estádio de R. prolixus foi determinada pelo método de BRADFORD (1976) utilizando soro
albumina bovina (BSA) para a confecção da curva padrão.
4.5.8- Quantificação de hemeproteínas
A glândula salivar de cada ninfa de terceito e quinto estádio foi coletada e individualmente
rompida em 30 µl de tampão HEPES/NaCl. Para o ensaio, 1 µl do homogenato foi diluído 1:70
com PBS, pH 7,4 e lido no espectrofotômetro a 404 nm. Os valores da absorbância absoluta foram
comparados entre o grupo silenciado e controle.
4.5.9- Eletromiograma da bomba cibarial
A metodologia utilizada nos experimentos de eletromiograma da bomba cibarial foram
realizados conforme descrito no item 4.4.5.
Nestes experimentos foram utilizadas ninfas de quinto estádio de R. prolixus, normais ou
silenciadas, com jejum de 12 dias após a muda. Os insetos foram colocados para se alimentar
sobre o dorso ou sobre a veia lateral da cauda de camundongos swiss. Também se tomou o
cuidado de minimizar odores, luz, barulho, vibração e a manipulação dos insetos.
Para a construção do gráfico de espetro dos sinais elétricos produzidos pela bomba cibarial,
foi desenvolvido um software pelo professor Alberto de Figueiredo Gontijo (Coltec-UFMG) que
funciona no ambiente Matlab versão 6.5.0.
30
4.6 – Parte 3 – Influência do ambiente intestinal durante o processo de hematofagia de T.
brasiliensis
4.6.1- Experimentos de comportamento alimentar
Os parâmetros relativos ao comportamento alimentar de T. brasiliensis foram obtidos em
hospedeiros vivos (alimentação natural) ou em alimentador artificial. Os experimentos foram
realizados com ninfas de quarto estádio (ARAUJO et al., 2007) apresentando um jejum de 12 dias
após a muda.
Na alimentação natural, os roedores (R. norvegicus ou T. apereoides) com
aproximadamente 200 g, previamente anestesiados com uma mistura de ketamina 150 mg/kg
(Cristalia) e xilazina 10 mg/kg (Bayer), foram mantidos a 37°C sobre uma manta térmica. Para
delimitar o sítio de alimentação dos insetos, foi fixado, sobre o dorso do roedor, uma arena
(recipiente plástico de 11,5 x 8,0 x 2,5 cm) com um orifício em forma de elipse (eixos de 7 e 3 cm
com uma área aproximada de 20 cm
2
) (Fig. 7). Foram utilizadas 10 ninfas de quarto estádio por
roedor.
A alimentação artificial foi realizada em alimentadores de vidro conectados a um
termocirculador (PolyScience) para a manutenção constante da temperatura da dieta a 37°C.
Figura 7- Arena utilizada na alimentação natural das ninfas de T. brasiliensis.
31
4.6.2- Suspensões alimentares oferecidas no alimentador artificial
No alimentador artificial, foram oferecidas diferentes dietas às ninfas, como sangue,
suspensão de hemácias ou plasma de cada roedor (R. norvegicus ou de T. apereoides).
Para tal, os roedores foram previamente anestesiados com Tiopental (100 mg/kg) e o
sangue foi retirado diretamente do ventrículo esquerdo com uma seringa contendo EDTA (300
mM; 20 µl/ml de sangue) como anticoagulante. O hematócrito médio foi estimado a partir da
dosagem de amostras de sangue de três hospedeiros de cada espécie.
Para a preparação da suspensão de hemácias, o sangue foi centrifugado por 15 min a 5000
g. As hemácias foram lavadas por três vezes em solução salina (NaCl 0,9%) para a retirada total
do plasma. Em seguida, foram diluídas em solução de alimentação artificial (NaCl 125 mM, KCl
30 mM, MgCl
2
2 mM, CaCl
2
1 mM, NaHCO
3
5 mM, NaH
2
PO
4
2 mM, glicose 1 mM e ATP 1 mM,
pH 7.4) para o ajuste da concentração a 40% (concentração média dos hematócritos dos roedores
aqui utilizados).
O plasma separado após a centrifugação do sangue foi estocado a –20
0
C até o uso.
Durante todos os experimentos, tanto o sangue quanto a suspensão de hemácias foram
submetidos à agitação constante com auxílio de um agitador magnético acoplado ao alimentador
artificial.
4.6.3- Comparação da performance alimentar de ninfas de T. brasiliensis na alimentação
natural e artificial
Para comparar a performance alimentar de T. brasiliensis em diferentes fontes alimentares,
todos os experimentos foram gravados com uma câmera (Panasonic Palmrecord IQ) conectada a
um gravador de DVD (LG DR175B) e estocados em discos para que o tempo total de contato (TT)
de cada ninfa fosse calculado. Para o cálculo do ganho de peso (WG), cada ninfa foi pesada
individualmente antes e logo após o repasto. A taxa de ingestão (IR) foi calculada pela divisão do
WG pelo TT.
32
4.6.4- Ação do conteúdo intestinal de T. brasiliensis sobre o empacotamento de hemácias
Como observações preliminares mostraram que T. brasiliensis apresentava maior
dificuldade em se alimentar no roedor silvestre (GUARNERI, 2004), buscou-se investigar o que
estaria provocando tal dificuldade. Inicialmente, ninfas de quarto estádio alimentaram-se ad
libitum de forma natural com sangue ou em alimentador artificial contendo suspensão de hemácias
de T. apereoides ou de R. norvegicus. Imediatamente após a alimentação, cada ninfa foi dissecada
para a observação do aspecto do conteúdo do intestino médio anterior. Para tal, o conteúdo de
cada intestino foi isolado e colocado em um orifício de uma placa de seis poços contendo 1,5 ml
de solução salina (NaCl 0,9%). Após uma leve agitação, 10 µl foram montados entre lâmina e
lamínula de vidro para a observação do aspecto do conteúdo intestinal ao microscópio ótico.
Posteriormente, o intestino médio anterior de cada ninfa de quarto estádio, com jejum
aproximado de 12 dias, foi extraído em 10 µl de solução salina, sonicado e centrifugado por três
minutos a 12.000 g. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e alíquotas de 0,5 µl foram
adicionadas a 9 µl de sangue ou de suspensão de hemácias de R. norvegicus ou de T. apereoides e
examinadas entre lâmina e lamínula ao microscópio.
Nesses experimentos, o hematócrito normal (~41%) foi reduzido para 20% para facilitar a
visualização do fenômeno ao microscópio. A suspensão de hemácias foi preparada de acordo com
o item 4.6.2. e o hematócrito ajustado com solução salina. O sangue teve o hematócrito ajustado
com o próprio plasma.
Para avaliar a cinética do fenômeno, 100 µl de suspensão de hemácias, com hematócrito
ajustado para 5% com solução salina 0,9%, foram adicionados ao orifício de uma placa de 96
poços. O fenômeno foi disparado pela adição de 5 µl de homogenato intestinal de T. brasiliensis,
equivalente a meio intestino (proveniente de um pool de 5 insetos), preparado conforme acima. No
grupo controle, o homogenato foi substituído por 5 µl de salina. A variação na turbidez em cada
amostra foi avaliada a 655 nm em um leitor de ELISA (BioRad Benchmark) por leituras realizadas
a cada 13 segundos, com agitação de cinco segundos nos intervalos de cada leitura.
33
4.7- Análise estatística
O teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para testar a distribuição normal de cada
variável. As variáveis que seguiam uma distribuição normal foram comparadas pelo teste t de
Student ou pela análise de variância (ANOVA), identificando-se, no caso da análise de variância,
os grupos responsáveis pelas diferenças através do teste Tukey honest significant difference
(HSD) quando as comparações eram feitas entre todos os grupos, ou o teste de Dunnett quando as
comparações dos grupos teste eram feitas com o controle. Em caso de variáveis com distribuição
não-normal, foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. Os resultados foram
apresentados como média ± EP. O nível de significância aceito foi de p<0,05 (95%).
34
5.0- Resultados
5.1- Parte 1 - Estudo das alterações vasculares na pele do hospedeiro durante o processo
alimentar de R. prolixus
5.1.1- Utilização de vasos sangüíneos no processo alimentar, alterações na permeabilidade
vascular e a ocorrência de hemorragias
Durante o processo alimentar, as ninfas de R. prolixus canularam, em média, 3,4 ± 1,2
vasos (n=8). Os insetos canularam mais vênulas (63%) do que arteríolas. Entretanto, o tempo que
o inseto permaneceu com as peças bucais dentro de cada vaso foi bastante variado.
Um aumento na permeabilidade vascular, caracterizado pelo extravasamento do corante
azul de Evans para os tecidos, foi visualizado em todos os experimentos (n=10) após a fase de
sondagem de R. prolixus (Fig. 8A).
Foi constatado um extravasamento progressivo de FITC-Dextran, a partir da fase de
sondagem, indicando que o aumento de permeabilidade teve continuidade ao longo da fase de
ingurgitamento dos triatomíneos (n= 10; Fig. 8B).
Microhemorragias foram freqüentemente observadas (15 eventos em oito experimentos)
durante o processo alimentar, a maioria ocorrendo durante a fase de sondagem (80%). As
microhemorragias ocorridas nas arteríolas foram mais extensas do que aquelas ocorridas nas
vênulas.
35
Figura 8- Área de aumento de permeabilidade vascular na microcirculação da pele da orelha de
camundongos hairless decorrente do processo alimentar de ninfas de terceiro estádio de R.
prolixus. A: extravasamento de corante de Azul de Evans quinze minutos após a fase de
sondagem. B: extravasamento de FITC-Dextran durante a fase de ingurgitamento. A: arteríola; V:
vênula; P: probóscida.
5.1.2- Análise da movimentação da parede dos vasos durante o processo de bombeamento do
sangue
A análise dos movimentos da parede das vênulas (40-47µm de diâmetro), realizada em
cinco experimentos, permitiu a identificação de vários fenômenos ocorridos durante o processo
alimentar de R. prolixus.
Durante a fase de ingurgitamento, foi comum observar os insetos executando pequenos
movimentos com as maxilas no interior dos vasos. Alguns desses movimentos foram
caracterizados por uma lenta migração das maxilas pelo lúmen do vaso, mudando a posição da
abertura do canal alimentar (a favor ou contra a corrente sangüínea) em relação à ponta da
probóscida. No sítio de alimentação, durante o esforço de sucção associado ao ingurgitamento,
tanto o sangue a favor da corrente quanto à contracorrente apareceram abruptamente direcionados
para a ponta das peças bucais.
As paredes dos vasos canulados pulsaram devido à pressão negativa gerada pela bomba
cibarial. Um grande sincronismo entre as contrações da bomba cibarial e a movimentação da
parede do vaso canulado foi observado quando o eletromiograma e o experimento de microscopia
36
intravital foram realizados simultaneamente (Fig. 9).
A
37
C
B
38
Figura 9- Sinais elétricos produzidos pelas contrações da bomba cibarial e a variação na área
(diâmetro) da vênula durante o período de ingestão de uma ninfa de terceiro estádio de R. prolixus.
Cada 25 pontos representam um segundo. As linhas vermelhas pontilhadas mostram o período de
tempo gasto para uma contração da parede do vaso. A: início do processo alimentar com a bomba
cibarial em alta freqüência; B: movimentos de regurgitação (setas); C: final do processo alimentar
com a bomba cibarial em baixa freqüência. P: pico único; PP: pico duplo; IP: pico com sinal
intermediário; R: regurgitação; A: artefato produzido pela filtração dos sinais.
39
A análise das imagens desses experimentos mostrou que as retrações ritmadas da parede da
vênula foram devido à sucção do sangue para o canal alimentar do inseto em resposta às
contrações da bomba cibarial. A duração da retração da parede do vaso é uma estimativa do tempo
necessário para a bomba cibarial encher-se de sangue.
No início da fase de ingurgitamento, os sinais elétricos produzidos pela bomba cibarial
apareceram majoritariamente como um único pico (Fig. 9A). No entanto, ao longo da alimentação,
apareceram com maior freqüência os sinais com dois picos completamente separados ou com
formatos intermediários entre estes dois (Fig. 9C).
A redução da freqüência de bombeamento do sangue foi observada ao longo do processo
em todos os experimentos (n=5). A redução ocorreu concomitantemente com o aumento do tempo
necessário ao enchimento da bomba com o sangue (estimado pelo número de pontos paralelos à
linha vermelha que representa a trajetória da parede do vaso durante o movimento de contração) e
ao aumento da ocorrência de distúrbios (picos duplos) no formato do sinal do eletromiograma
(Fig. 9A, B e C).
A freqüência de contrações da bomba cibarial foi inversamente proporcional à média da
área do vaso (diâmetro funcional; Fig 10A). Nos primeiros instantes do processo de alimentação,
logo após a canulação da vênula, a bomba cibarial apresentava alta freqüência de contração e a
vênula, um baixo diâmetro funcional. Ao longo da fase de ingurgitamento, com a redução da
freqüência de bombeamento, observou-se um aumento do diâmetro funcional do vaso. Quando a
atividade da bomba cibarial era drasticamente reduzida ou interrompida (Fig. 10B), no final do
processo alimentar, um aumento no diâmetro do vaso era então observado.
40
Figura 10- Relação entre a freqüência de contrações da bomba cibarial (linha pontilhada) e a
variação no diâmetro do vaso (linha contínua) durante o processo alimentar de uma entre cinco
ninfas de terceiro estádio de R. prolixus analisadas. A área da vênula antes da canulação foi
B
A
41
considerada como 100%. As setas indicam as interrupções durante a alimentação. A: fase de
ingurgitamento completa; B: detalhe da área selecionada em A (caixa vermelha) mostrando a
variação no diâmetro funcional (FD) do vaso em três períodos com diferentes freqüências de
contração da bomba cibarial.
Comparações do diâmetro inicial do vaso com aquele imediatamente após a remoção das
peças bucais do inseto mostraram que o achado mais usual para R. prolixus foi a vasodilatação nas
vênulas canuladas, enquanto, nas arteríolas, o achado mais comum foi a vasoconstrição (Tab. 3;
n=8).
Tabela 3- Alterações no diâmetro dos vasos desencadeadas pelo processo alimentar de ninfas de
terceiro estádio de R. prolixus na microcirculação da pele da orelha de camundongos hairless.
Alterações no diâmetro dos vasos
Vênulas canuladas
(n=10)
Arteríolas canuladas
(n=9)
C=20%
D=50%
E=30%
C=67%
D=22%
E=11%
C= constrição; D=dilatação; E=sem mudanças no diâmetro
A análise da pulsação das paredes do vaso também permitiu identificar movimentos de
regurgitação durante o processo alimentar de R. prolixus. Estes movimentos foram caracterizados
por um súbito aumento do diâmetro do vaso aparentemente devido ao refluxo sangüíneo do canal
alimentar do inseto para o interior da vênula (Fig. 9B). Algumas vezes, observou-se o refluxo de
material translúcido que apareceu na análise das imagens como uma imagem negativa, sendo
representada graficamente como uma abrupta redução da área do vaso (Fig. 11). Apenas pelos
sinais do eletromiograma da bomba cibarial, não foi possível identificar os movimentos de
regurgitação. Os movimentos de regurgitação ocorreram durante todo o processo de alimentação,
42
mas com maior freqüência na segunda metade da fase de ingurgitamento. Quando os movimentos
de refluxo ocorriam, geralmente eram seguidos de uma redução da freqüência de bombeamento do
sangue.
Figura 11– Liberação de material translúcido (setas) pelas maxilas na corrente sangüínea
influenciando na representação gráfica do diâmetro do vaso durante a fase de ingurgitamento de
uma de cinco ninfas de R. prolixus analisadas. A área do vaso antes da canulação foi considerada
como 100%.
43
5.1.3- Agregação plaquetária e recrutamento de leucócitos
Em todos os experimentos nos quais se empregou rhodamina 6G (n= 10), foram
observados agregados de plaquetas junto ao endotélio venular, imediatamente após a retirada das
peças bucais de R. prolixus (tempo 0), tornando-se mais conspícuo com o passar do tempo. Esta
deposição de plaquetas extendia-se geralmente além do sítio de alimentação do inseto (Fig. 12).
Nesses experimentos, também foi observado o recrutamento de leucócitos. Um aumento no
número de leucócitos em rolamento (Dunnett; p< 0,01) foi observado aos 10 minutos (10,4 ± 2,2)
e 30 minutos (12 ± 3,1) após o fim do repasto, quando comparados com o controle (1,9 ± 0,8)
(Fig. 13A). O número de leucócitos aderidos também foi maior (Dunnett; p<0,05) aos 10 minutos
(2,9 ± 0,6) e aos 30 minutos (4 ± 0,7) após o término da fase de ingurgitamento, em relação ao
grupo controle (1,1 ± 0,4) (Fig. 13B).
Figura 12- Agregação plaquetária na microcirculação da pele do camundongo hairless 30 minutos
após o fim do processo alimentar de R. prolixus. V: vênula; P: plaquetas; L: leucócitos; PV: área
de permeabilidade vascular aumentada.
200
µ
m
L
V
P
PV
44
Figura 13 - Interação leucócito-endotélio após o processo alimentar de ninfas de terceiro
estádio de R. prolixus (n=10) na pele da orelha de camundongo hairless. O número de
leucócitos em rolamento (A) e em adesão (B) foi quantificado durante 30s em um segmento
de vênula de 100µm. * P< 0,05 comparado ao grupo controle (antes do contato com o
triatomíneo).
B
A
45
5.2- Parte 2 - Caracterização funcional das nitroforinas expressas na glândula salivar
de R. prolixus
5.2.1- Nível de expressão das nitroforinas
O nível de expressão das NPs foi verificado por qPCR. A análise mostrou que a
NP2 é o transcrito mais abundante nas glândulas salivares das ninfas de quarto estádio de R.
prolixus, sendo em torno de 1,3 vezes maior que NP1 e NP4. A NP1 é um pouco mais
expressa que a NP4, em torno de 1,2 vezes (Fig. 13). A nitroforina menos expressa é a NP3,
com níveis de expressão mais de 100 vezes menores quando comparado com qualquer
outra NP (Fig. 14).
Figura 14- Expressão das NPS 1-4 na glândula salivar de ninfas de quarto estádio do grupo
controle de R. prolixus quantificada por qPCR. A expressão foi apresentada em relação ao
nível de expressão da NP2 que foi considerado como 100%. Foram feitas sete replicatas
para cada gene. Cada replicata consistiu em um pool de três ninfas (três pares de
glândulas).
46
5.2.2- Silenciamento das nitroforinas mediado por RNAi
Para a análise do papel das NPs na alimentação sangüínea in vivo, ninfas de segundo
e quarto estádio de R. prolixus tiveram estas proteínas silenciadas nas glândulas salivares
empregando-se a técnica de RNAi. A redução na expressão foi monitorada pelo qPCR e por
análises fenotípicas do conteúdo das glândulas salivares após a mudança de estádio.
A expressão de NPs, verificada 48 horas após a segunda injeção de dsRNA nas
ninfas de quarto estádio, apresentou uma redução de mais de 100 vezes nos níveis de
mRNA no grupo silenciado quando comparado ao grupo controle (Tab. 4).
Tabela 4- Verificação do silenciamento das NPs na glândula salivar de ninfas de quinto
estádio de R. prolixus por qPCR. Os dados estão representados como a razão entre a
expressão de cada gene no grupo controle em relação ao grupo silenciado.
NP1 NP2 NP3 NP4
*Redução na
expressão gênica
101,8±9,0
630,1±41,0
242,8±25,0
204,7±10,6
*Foram feitas sete replicatas para cada gene. Cada replicata consistiu em um pool de três
ninfas (três pares de glândulas).
A redução das NPs na saliva foi confirmada após a alimentação das ninfas em
hamsters e a muda para o terceiro e quinto estádios. Este processo é necessário para que a
saliva estocada seja gasta e reposta por nova saliva com quantidade reduzida de NPs
(ARAUJO et al., 2006).
Sete dias após a muda, a quantidade de hemeproteínas nas glândulas salivares foi
reduzida (teste T; p< 0,001) no grupo silenciado, apresentando quase cinco vezes menos
hemeproteínas que o grupo controle. Entretanto, não houve diferença (teste T; n.s.) entre o
conteúdo total de proteínas salivares do grupo controle em relação ao grupo silenciado (Fig.
15A). Como mostrado na figura 15B, a redução da atividade anticoagulante do conteúdo
salivar das ninfas silenciadas (teste T; p<0,001) reflete a redução na quantidade de NP2,
47
uma vez que esta é a principal molécula responsável por esta ação. Este achado reforça o
sucesso obtido no silenciamento das NPs neste estudo.
Para verificar se o silenciamento afetou a atividade de outras proteínas salivares, foi
realizado o ensaio da atividade da enzima apirase, cujos resultados foram semelhantes
(teste T; n.s.) para a saliva de insetos silenciados e controles (Fig. 15D).
Os ensaios fenotípicos realizados para ninfas de terceiro estádio tiveram resultados
semelhantes aos observados para as ninfas de quinto, indicando que o silenciamento
também é efetivo nesta fase do desenvolvimento.
48
Figura 15– Quantificação de proteínas totais (A), hemeproteínas (B), atividade
anticoagulante (C) e atividade da enzima apirase (D) de glândulas salivares de ninfas de R.
prolixus do grupo controle e grupo silenciado. As glândulas foram extraídas sete dias após
a muda para o terceiro ou quinto estádio. O tempo de coagulação foi definido como o
tempo necessário para que a turbidez atinja a absorbância de 0,025 unidades. A absorbância
lida no tempo zero foi considerada como zero unidade de absorbância. * P< 0,05
comparado ao grupo controle.
n=16 n=12
n=15 n=10
n=16 n=13
n=16 n=16
*
*
*
*
49
Estes resultados corroboram com o fenótipo de cor observado para as glândulas
salivares das ninfas do grupo silenciado que apresentaram cor vermelho claro a branca,
enquanto os controles apresentaram cor vermelho vivo, característica da presença das NPs
(Fig. 16).
Figura 16– Glândulas salivares extraídas de ninfas de quinto estádio R. prolixus do grupo
controle (A) e do grupo silenciado (B) mostrando a coloração do seu conteúdo. As
glândulas foram extraídas sete dias após a muda para o quinto estádio.
O perfil eletroforético (SDS-PAGE) do conteúdo salivar de ninfas de quinto estádio
de R. prolixus também mostrou diferenças entre os insetos silenciados e controles,
sobretudo nas bandas de aproximadamente 20 kDa que se apresentaram bastante reduzidas
no conteúdo salivar do grupo silenciado (Fig. 17). Curiosamente, bandas com outros pesos
moleculares como, por exemplo, as de aproximadamente 26 e 38 kDa apresentaram maior
intensidade nos insetos silenciados.
50
Figura 17- Perfil eletroforético (SDS-PAGE- 15%) de 10 µg de proteínas salivares de um
pool de 14 glândulas extraídas de ninfas de R. prolixus silenciadas ou controles sete dias
após a muda para o quinto estádio. O mesmo gel foi fotografado em dois diferentes
momentos da revelação com nitrato de prata, sendo que o gel superior foi corado por um
tempo maior. As setas indicam as bandas que aparecem mais fortes no grupo silenciado. P:
padrão de peso molecular; 1: grupo controle; 2: grupo silenciado.
P 1 2
51
5.2.3- Influência do silenciamento das nitroforinas no comportamento alimentar de R.
prolixus sobre a pele do dorso
Uma vez que o silenciamento das NPs foi efetivo, conforme demonstrado nos
resultados acima, ninfas de quinto estádio silenciadas e controles foram alimentadas sobre a
pele do dorso ou sobre a veia lateral da cauda de camundongos swiss e tiveram sua
performance alimentar comparada a partir da análise do eletromiograma da bomba cibarial
(Tab. 5).
Para melhor analisar os resultados dos experimentos, inicialmente comparou-se os
grupos visando identificar os efeitos dos tratamentos na performance alimentar das ninfas
e, em seguida, foi dada ênfase à comparação frente ao sítio de alimentação (dorso ou
cauda).
A comparação da performance alimentar das ninfas controles e silenciadas
alimentadas sobre a pele do dorso mostrou diferenças marcantes entre os grupos quanto aos
parâmetros referentes ao número de picadas e ao tempo cumulativo de sondagem inicial
(até a primeira canulação).
As ninfas do grupo controle picaram apenas uma vez, enquanto as ninfas do grupo
silenciado picaram mais (teste T; p<0,05), em média 5,5 ± 1,7 vezes durante todo o
processo alimentar (Tab. 5). Foi necessário que estas ninfas picassem 4,5 ± 1,6 vezes para
que canulassem o primeiro vaso. Cinco ninfas do grupo silenciado interromperam o
ingurgitamento removendo as peças bucais da pele, seguido de outra picada e uma nova
canulação. Um destes insetos canulou vasos por três vezes após um número variável de
picadas durante um mesmo experimento. O tempo cumulativo de sondagem inicial foi mais
longo (teste T; p<0,01) no grupo silenciado (5,1 ± 1,2 min), sendo cerca de 3,5 vezes maior
que no grupo controle (1,1 ± 0,3 min). Entretanto, o tempo gasto entre a última picada até a
canulação do primeiro vaso (LP; Fig 18B) foi semelhante ao observado no grupo controle
(teste T; n.s.) (Tab. 5).
Até o segundo minuto de sondagem na pele do dorso do camundongo, 82% dos
insetos (nove ninfas) do grupo controle já haviam iniciado a ingestão de sangue, ao passo
que apenas quatro dos 13 insetos silenciados haviam encontrado um vaso (Fig. 18A).
52
Os grupos que se alimentaram sobre a pele do dorso apresentaram ganhos de peso
semelhantes (teste T; n.s.) (Tab. 5). No entanto, as ninfas silenciadas apresentaram menor
taxa de ingestão (teste T; p<0,05). Este parâmetro foi influenciado principalmente pelo
tempo não ingestivo (que contribuiu para o aumento do tempo em contato com a pele do
dorso até atingir o ingurgitamento) e pela freqüência de contração da bomba cibarial. O
tempo não ingestivo foi maior (Mann-Whitney; p<0,05) nas ninfas silenciadas devido aos
parâmetros relativos à sondagem inicial. Apesar de não termos encontrado diferenças no
número e na duração das interrupções (Mann-Whitney; n.s.), duas ninfas do grupo controle
e seis do grupo silenciado apresentaram algum tipo de interrupção durante o processo
alimentar. Foi interessante observar que, das seis ninfas silenciadas que interromperam a
alimentação, cinco canularam mais de um vaso até completar o ingurgitamento. Foi
verificado que a ausência de NPs interferiu negativamente na freqüência de contrações da
bomba cibarial que foi menor nos insetos do grupo silenciado (teste T; p<0,05) (Tab. 5).
53
Figura 18– Ranqueamento do tempo cumulativo de sondagem (PT) e da última sondagem
(LP) antes da primeira canulação do vaso por ninfas de quinto estádio de R. prolixus dos
grupos controle e silenciado alimentadas sobre a pele do dorso de camundongos swiss.
5.2.4- Influência do silenciamento das nitroforinas no comportamento alimentar de R.
prolixus sobre a veia lateral da cauda
A comparação entre o grupo silenciado e o grupo controle, alimentados sobre a veia
da cauda, mostrou que não houve diferença nas taxas de ingestão, nem nos tempos não
ingestivos, bem como em nenhum dos outros parâmetros alimentares avaliados (Tab. 5).
Como, nos experimentos realizados neste sítio, os insetos foram colocados para alimentar
diretamente sobre o vaso, todos eles picaram apenas uma vez e o tempo de sondagem foi
extremamente reduzido nos dois grupos, não sendo possível a sua quantificação. Os insetos
não apresentaram qualquer interrupção durante o repasto sangüíneo sobre a veia lateral da
cauda dos camundongos (Tab. 5).
54
Tabela 5 – Parâmetros do comportamento alimentar avaliados pelo eletromiograma da bomba cibarial de ninfas de quinto estádio de R.
prolixus silenciadas e controles alimentadas sobre a pele do dorso ou sobre a veia da cauda de camundongos swiss.
Pele do dorso Veia da cauda
Grupos Controle
(n=11)
Silenciado
(n=13)
Controle
(n=18)
Silenciado
(n=10)
Peso inicial (IW; mg)
52,1
±
5,7 50,0
±
1,8 45,9
±
2,0 51,0
±
3,3
Número total de picadas
1,0
±
0,0 5,5
±
1,7
1 1
Picadas antes das canulação
1,0
±
0,0 4,5
±
1,6
1 1
Número de interrupções (I)
0,5
±
0,3 1,7
±
0,6
0 0
Tempo das interrupções (IT; min)
0,3
±
0,2 1,8
±
0,8
0 0
Tempo não ingestivo (NIT; min)
1,4
±
0,3 6,9
±
1,5
0 0
Tempo total de contato (TT; min)
20,7
±
1,7 43,9
±
7,8 17,4
±
1,0 18,1
±
1,9
Freqüência (F; contrações/s)
3,7
±
0,2 2,7
±
0,4 4,7
±
0,1 4,5
±
0,2
Ganho de peso (WG; mg)
237
±
18 229
±
16 270
±
9 242
±
13
Taxa de ingestão efetiva (EIR; mg/min)
12,8
±
0,9 8,6
±
1,2 16,0
±
0,7 14,8
±
1,6
Taxa de ingestão total (IR; mg/min)
11,8
±
0,9 7,3
±
1,2 16,0
±
0,7 14,8
±
1,6
.
55
5.2.5- Influência do sítio de alimentação no comportamento alimentar de R. prolixus
Na análise da influência do sítio de alimentação (dorso ou cauda) sobre a
performance alimentar, os grupos controles e silenciados alimentados sobre a veia da cauda
foram comparados com seus respectivos grupos alimentados sobre a pele do dorso. Nesta
análise foram considerados apenas os parâmetros não relacionados à sondagem (I, IT, F,
WG e EIR), uma vez que esta foi praticamente inexistente nos grupos alimentados sobre a
veia lateral da cauda.
Após a alimentação na veia da cauda, ninfas controles e silenciadas apresentaram o
mesmo ganho de peso (ANOVA; n.s) dos grupos alimentados sobre a pele do dorso (Tab.
5).
A taxa de ingestão efetiva (Tukey; p<0,05) e a freqüência de contração da bomba
cibarial (Tukey; p<0,05) das ninfas alimentadas na veia lateral da cauda foi maior que
aquela observada na pele do dorso dos camundongos (Tab. 5). Não houve interrupções
durante o repasto sobre a veia lateral da cauda.
Além da baixa freqüência de contração da bomba cibarial, a dificuldade em obter
sangue nos vasos do dorso também ficou evidente na análise do ritmo das contrações e no
formato dos sinais elétricos gerados pela bomba durante o ingurgitamento (Fig. 19).
Quando as contrações eram arrítmicas e os sinais elétricos eram irregulares (por exemplo,
com dois picos ou com formato intermediário entre pico único e pico duplo), um grande
ruído era observado no gráfico do espectro de freqüência ao longo do tempo, como
observado para as ninfas alimentadas sobre o dorso (Fig. 19A e B). A bomba cibarial das
ninfas alimentadas na veia lateral da cauda contraiu ritmicamente, gerando sinais elétricos
regulares (pico único) que causaram baixo ruído no espectro, como observado nas figuras
19C e D. Os diferentes padrões de funcionamento da bomba cibarial puderam ser
evidenciados na análise do espectro de freqüência versus tempo das ninfas que mudaram de
vaso durante a fase de ingurgitamento (Fig. 19E). Naqueles experimentos, o perfil da
alimentação inicialmente mostrou altos níveis de ruído (Fig. 19E1) e foi repentinamente
modificado para um espectro de baixo ruído (Fig. 19E2). Esta mudança, provavelmente,
deveu-se ao fato dos insetos reiniciaram a alimentação em um vaso de maior diâmetro.
56
Figura 19- Espectro da freqüência ao longo do tempo produzido pelos sinais elétricos
gerados pelas contrações da bomba cibarial de ninfas de quinto estádio de R. prolixus.
Grupo silenciado (A) e grupo controle (B) alimentados sobre o dorso; grupo silenciado (C)
e grupo controle (D) alimentados sobre a veia lateral da cauda. Mudança no ruído no
espectro de freqüência da bomba cibarial de uma ninfa do grupo silenciado alimentada
sobre o dorso (E). Perfis elétricos gerados pelas contrações da bomba ciabarial mostrando
contrações arrítmicas com sinal elétrico irregular (E1) e contrações rítmicas com sinal
elétrico regular (E2). Além dos dois eixos do gráfico, as cores representam a magnitude da
ocorrência de cada freqüência na escala representada no topo da figura. Cada figura é
referente ao espectro de uma ninfa que melhor representou a média observada no grupo.
57
5.3- Parte 3 – Influência do ambiente intestinal durante o processo de hematofagia de
T. brasiliensis
5.3.1- Performance alimentar de ninfas de T. brasiliensis na alimentação natural
Para comparar a performance alimentar de T. brasiliensis em diferentes
hospedeiros, ninfas de quarto estádio foram alimentadas de forma natural sobre a pele do
dorso T. apereoides ou de R. norvegicus previamente anestesiados. A análise mostrou que
as ninfas ingeriram quantidades semelhantes de sangue (Tukey; n.s) nos dois hospedeiros
(Tab. 6; Fig. 20). No entanto, o tempo total de contato foi maior (Tukey; p<0,001) e a taxa
de ingestão foi menor (Tukey; p= 0,001) para as ninfas alimentadas no roedor silvestre
(Tab. 6; Fig. 20). Foi interessante observar que as ninfas permaneceram mais tempo
tentando se alimentar em T. apereoides, mesmo que a alimentação neste hospedeiro fosse
mais difícil (como demonstrado pela diferença na taxa de ingestão).
O hematócrito do sangue dos hospedeiros variou de 38 a 42%, sendo a média de
41,0 ± 2,6% para rato (n=3) e 41,3 ± 2,1% para T. apereoides (n=3).
58
Tabela 6- Parâmetros do comportamento alimentar de ninfas de quarto estádio de T. brasiliensis alimentadas de forma natural ou artificial
com dietas provenientes de R. norvegicus ou de T. apereoides.
Hospedeiro
R. norvegicus
T. apereoides
Parâm\dieta SN(20) SA(21) HA(14) PA(19) SN(26) SA(18) HA(13) PA(17)
IW (mg)
40,5
±
1,7 35,4
±
1,5 33,6
±
1,6 33,3
±
2,0 37,1
±
1,5 35,1
±
1,7 32,2
±
2,0 35,5
±
2,2
WG (mg)
138,6
±
7,8 61,4
±
4,5 84,1
±
10,2 47,6
±
7,4 119,5
±
8,9 27,6
±
2,3 78,2
±
13,2 30,8
±
2,6
TT (min)
27,1
±
2,9 12,7
±
1,0 16,7
±
3,0 12,1
±
1,5 42,8
±
3,3 7,5
±
0,7 23,0
±
3,7 6,4
±
0,7
IR (mg/min)
5,8
±
0,5 5,3
±
0,5 6,3
±
0,9 4,6
±
0,6 3,0
±
0,2 4,0
±
0,4 3,6
±
0,5 5,7
±
0,7
IW: peso inicial, WG: ganho de peso, TT: tempo de contato total, IR: taxa de ingestão, S: sangue, H: suspensão de hemácias, P: plasma,
N: alimentação natural, A: alimentação artificial.
59
5.3.2- Performance alimentar de ninfas de T. brasiliensis no alimentador artificial
Quando o sangue de rato foi oferecido no alimentador artificial, o ganho de peso foi
aproximadamente 2,2 vezes maior que o observado na alimentação com sangue de T.
apereoides (Tukey; p<0,05). Não foram observadas diferenças no tempo total de contato ou
na taxa de ingestão (Tukey; n.s.) entre os grupos alimentados com sangue de rato ou com
sangue de roedor silvestre (Tab. 6; Fig. 20).
A fim de investigar quais componentes do sangue poderiam estar influenciando nos
parâmetros alimentares observados na alimentação natural, as ninfas foram submetidas à
alimentação em alimentador artificial contendo suspensão de hemácias ou plasma
provenientes de cada um dos hospedeiros.
Quanto aos resultados da performance alimentar com suspensão de hemácias, não
foram observadas diferenças no ganho de peso ou no tempo total de contato (Tukey; n.s.).
Entretanto, a taxa de ingestão foi maior (Tukey; p< 0,05) naquelas ninfas alimentadas com
suspensão de hemácias de rato, quando comparado com a suspensão de hemácias de T.
apereoides.
Ao contrário das alimentações com suspensão de hemácias, quando o plasma de rato
ou de T. apereoides foi oferecido às ninfas, não foi observada diferença entre as taxas de
ingestão (Tukey; n.s.) (Tab. 6). O ganho de peso e o tempo total de contato também foram
semelhantes para os dois grupos (Tukey; n.s.).
60
Figura 20- Parâmetros do comportamento alimentar de ninfas de quarto estádio de T.
brasiliensis alimentadas de forma natural ou em alimentador artificial contendo sangue,
suspensão de hemácias ou plasma de R. norvegicus ou de T. apereoides. S: sangue, H:
suspensão de hemácias, P: plasma, N: alimentação natural, A: alimentador artificial.
*
*
*
*
61
5.3.3- Análise do conteúdo intestinal de T. brasiliensis após alimentação em T.
apereoides ou em R. norvegicus
Após a alimentação natural (Fig. 21A1; n=5) ou artificial (Fig. 21A2; n=5) com
suspensão de hemácias de R. norvegicus, vários grumos foram visualizados no conteúdo
intestinal de T. brasiliensis que, quando observado em maior aumento, mostrou
aglomerados de hemácias isolados da parte líquida do sangue.
A análise do conteúdo intestinal das ninfas alimentadas de forma natural em T.
apereoides (Fig. 21B1; n=5) ou em alimentador artificial (Fig. 21B2; n=5), não mostrou
qualquer alteração hemostática aparente no sangue quando visto ao microscópio. As
hemácias permaneceram espalhadas, sem qualquer sinal de agregação.
62
Figura 21 – Conteúdo intestinal de T. brasiliensis após a alimentação natural com sangue
(1) ou em alimentador artificial contendo suspensão de hemácias (2) de R. norvegicus (A)
ou de T. apereoides (B). 400X
A1 A2
B1 B2
63
5.3.4- Ação do conteúdo intestinal de T. brasiliensis sobre as hemácias de R. norvegicus
ou de T. apereoides
Para verificar os possíveis fenômenos responsáveis pela formação dos grumos
observados no item anterior, o conteúdo do intestino médio anterior de ninfas de quarto
estádio, com jejum de aproximadamente 12 dias, foi extraído e adicionado ao sangue de
rato ajustado para o hematócrito 20%. Ao entrar em contato com o sangue do rato, o
conteúdo do intestino médio anterior induziu uma severa aglutinação eritrocitária com a
formação de vários aglomerados de hemácias que precipitaram e se separaram da parte
líquida do sangue (Fig. 22A2). O fenômeno ocorreu rapidamente, em até 2 minutos, e se
estabilizou em torno de 10 a 12 minutos (Fig. 23), mostrando-se mais intenso e muito mais
rápido do que a agregação eritrocitária observada naturalmente no sangue de rato (Fig.
22A1).
O fato da aglutinação também ocorrer com suspensão de hemácias de rato lavadas,
com hematócrito 20% ajustado com solução salina (Fig. 22A3), sugere que os fatores
plasmáticos não estão envolvidos no processo.
O fenômeno de aglutinação eritrocitária provocado pelo conteúdo intestinal de T.
brasiliensis não foi observado quando em contato com sangue ou suspensão de hemácias de
T. apereoides (Fig. 22B2-3). Os preparados continuaram similares aos observados nas
lâminas controle (Fig. 22B1) (apenas com adição de solução salina).
64
Figura 22 – Ação do conteúdo intestinal de T. brasiliensis sobre o sangue de R. norvegicus
(A) ou de T. apereoides (B) 1: 9µl de sangue com hematócrito 20% ajustado com plasma,
adicionado de 1µl de solução salina 0,9%. 2: 9µl de sangue com hematócrito 20% ajustado
com plasma, adicionado de 0,5 µl de salina 0,9% e 0,5µl de conteúdo intestinal de T.
brasiliensis. 3: 9µl de suspensão de hemácias com hematócrito 20% ajustado com solução
salina 0,9%, adicionado de 0,5 µl de solução salina 0,9% e 0,5 µl de conteúdo intestinal de
T. brasiliensis (0,5 µl de conteúdo intestinal equivale a 5% do extrato total em salina).
A 1 A 2 A 3
B1 B 2 B 3
200X
200X
400X
65
Figura 23- Cinética da aglutinação eritrocitária desencadeada pelo conteúdo intestinal de T.
brasiliensis sobre as hemácias de R. norvegicus. Os experimentos foram feitos em
duplicata.
66
6- Discussão
6.1- Estudo das alterações vasculares na pele do hospedeiro durante o processo
alimentar de R. prolixus
Os triatomíneos são insetos hematófagos que se alimentam exclusivamente de
sangue. Para isso, eles apresentam um aparelho bucal especializado para retirar o sangue
diretamente dos vasos da pele dos seus hospedeiros. Para obter o repasto sangüíneo, eles
introduzem as peças bucais na pele, movimentando-as na derme até a penetração em um
vaso. Durante a fase de sondagem e a fase de ingurgitamento, também ocorre a liberação
constante de saliva. Esses processos induzem várias alterações na microcirculação da pele
na tentativa de reparar os danos causados pelo triatomíneo no sítio de alimentação.
Neste trabalho, com o uso da microscopia intravital, foi possível observar e
caracterizar fenômenos que ocorrem na microcirculação da pele do hospedeiro mamífero,
durante e após o processo alimentar de R. prolixus, como o aumento de permeabilidade
vascular, as hemorragias, a agregação plaquetária, o recrutamento de leucócitos e a
movimentação das paredes dos vasos.
Em todos os experimentos, foi observado um aumento de permeabilidade vascular
(Fig. 8A) que teve início após a fase de sondagem. Já foi descrito que as NPs salivares de
R. prolixus liberam o NO quando a saliva entra em contato com a pele do hospedeiro (~pH
7,4). O NO é uma molécula com múltiplos efeitos biológicos, como o aumento de
permeabilidade vascular in vivo (GONZALEZ et al., 2003; TEIXEIRA et al., 1993). A
liberação do NO, no sítio de alimentação, poderia explicar o extravasamento do corante
azul de Evans após a sondagem e também do FITC-Dextran (Fig. 8B) para o tecido
adjacente ao vaso ao longo do repasto. O extravasamento do plasma e de moléculas para o
tecido adjacente poderia simplesmente indicar a presença de um vaso sangüíneo nas
proximidades e/ou poderia auxiliar no seu encontro, direcionando as maxilas do inseto,
seguindo o gradiente químico criado.
Os experimentos nos quais se verificou a permeabilidade vascular foram feitos
individualmente (um inseto por orelha), na borda da orelha do camundongo, onde a
disponibilidade de arteríolas ou vênulas para a alimentação do inseto é bastante reduzida
(BARKER et al., 1989). Nestes experimentos, os insetos realizaram apenas a sondagem
67
com o objetivo de evitar que vasos fossem canulados ou que a movimentação das maxilas
causasse danos mecânicos nos vasos. Embora nestes experimentos tenham ocorrido
pequenos pontos hemorrágicos após a sondagem, o extravasamento do corante ocorreu em
todas as regiões onde houve a passagem das maxilas do inseto (Fig. 8).
Nos experimentos nos quais se empregou FITC-Dextran, os insetos realizaram
repastos completos, mostrando que as hemorragias mais extensas ocorreram principalmente
nas arteríolas após a retirada das peças bucais ao fim do repasto. A ocorrência de
microhemorragias, principalmente durante a fase de sondagem ou na remoção das peças
bucais dos vasos, foi previamente observada por LAVOIPIERRE et al. (1959). Pontos
hemorrágicos mais evidentes observados na pele de coelhos, após a sondagem de R.
prolixus com glândulas salivares intactas, comparados com insetos salivarectomizados,
reforçam a influência das atividades antihemostáticas salivares neste fenômeno (RIBEIRO
e GARCIA, 1981).
Durante o processo alimentar, R. prolixus canulou cerca de 3,5 vasos sangüíneos,
sendo que a maior parte foram vênulas (63%). Na microcirculação da pele da orelha do
camundongo, arteríolas e vênulas correm paralelamente, sendo que as vênulas ocupam uma
maior área (ERIKSSON et al., 1980). Isso poderia explicar porque R. prolixus canula
vênulas mais freqüentemente, aliado ao fato do NO, liberado pelas NPs no sítio da
alimentação, ter contribuído para a dilatação principalmente destes vasos (Tab. 3).
O número de vasos picados em cada experimento foi variável. O que acontece
algumas vezes é que o inseto pode retirar as maxilas do vaso logo após a canulação ou
pouco depois de iniciada a fase de ingurgitamento, realizando nova sondagem, seguido de
nova canulação. Esta mudança de vaso poderia ocorrer devido a alguma dificuldade
provocada, por exemplo, por reações hemostáticas que prejudicam o fluxo sangüíneo do
vaso para o canal alimentar.
As arteríolas possuem paredes mais espessas que as das vênulas, com menor
capacidade de deformação, o que faz com que a redução no diâmetro das arteríolas seja
mais sutil, conseqüentemente, menos visível. Logo, neste estudo, a análise da
movimentação das paredes dos vasos foi feita apenas nas vênulas canuladas.
A análise da variação da área das vênulas, durante o ingurgitamento, mostrou que há
um sincronismo entre os sinais elétricos gerados pela bomba cibarial e a movimentação
provocada nas paredes dos vasos. Os sinais elétricos registrados podem ser ligeiramente
68
anteriores às contrações dos músculos da bomba cibarial, sugerindo que deve haver uma
pequena diferença no perfeito sincronismo entre os músculos da bomba e os movimentos
da parede do vaso. Mesmo assim, a análise mostrou que cada contração dos músculos
dilatadores da bomba produz uma contração da parede do vaso (Fig. 9). Além disso,
também foram identificados fenômenos que ocorreram durante o processo de alimentação,
como movimentos de regurgitação, variações na taxa de ingestão e no tempo de enchimento
da bomba cibarial.
Durante o seu funcionamento, a bomba cibarial produziu sinais elétricos com
diferentes formatos. Os sinais variaram de um pico único (Fig. 9A) a dois picos
completamente separados (Fig. 9C). Os picos duplos e aqueles com formatos
intermediários foram mais freqüentes quando a bomba cibarial estava funcionando em
baixa freqüência. Estes achados poderiam ser um indicativo do esforço para a contração dos
músculos da bomba, sugerindo que o conjunto de músculos está trabalhando fora de
sincronismo. SMITH e FRIEND (1970) também observaram tal diferença no formato dos
sinais produzidos pela bomba durante o processo alimentar de R. prolixus e relataram no
seu trabalho: “It is noteworthy that in our records we observed not two but many spike
shapes during the course of one feeding. It is not possible to see any pattern to their
occurrence, and as yet we have no explanation for the variability”.
A grande variação no diâmetro do vaso, após a canulação, foi diretamente
correlacionada com as altas taxas de ingestão de sangue (alta freqüência de bombeamento)
que aparentemente impediu que o lume do vaso fosse completamente preenchido com
sangue, forçando o vaso a permanecer com baixo diâmetro funcional (Fig. 10).
LAVOIPIERRE et al. (1959) descreveram a presença de movimentos de
regurgitação durante o processo alimentar do triatomíneo, especialmente nos momentos em
que o inseto interrompeu a ingestão, o que acontecia até poucos minutos depois de iniciado
o repasto. No presente estudo, os movimentos de regurgitação (Fig. 9B) foram observados
durante todo o repasto, mas foram mais freqüentes na segunda metade da fase de
ingurgitamento.
A análise simultânea dos registros do eletromiograma da bomba cibarial e da
movimentação das paredes das vênulas mostrou que a regurgitação é um evento
involuntário e está provavelmente associada a uma dificuldade momentânea em direcionar
o sangue sugado pela bomba para o intestino do inseto. O correto direcionamento do fluxo
69
de sangue para o intestino médio anterior depende de uma sincronização finamente ajustada
entre os músculos da bomba (semelhante aos movimentos peristálticos) e a válvula
faringeana (BARTH, 1952). Considerando que os triatomíneos não possuem uma válvula
anterior à bomba cibarial que impeça o refluxo sangüíneo, a ocorrência de regurgitação
poderia estar relacionada a problemas de sincronização deste sistema.
Em alguns experimentos, um material translúcido (claro) foi liberado da ponta das
maxilas para a corrente sangüínea (Fig. 11). Como este fenômeno ocorreu associado com
os sucessivos movimentos de regurgitação, é improvável que o material claro tenha sido
saliva. Se isto assim fosse, os movimentos de regurgitação deveriam ser coincidentes com o
momento no qual a saliva é liberada pela ação da bomba salivar.
Nos vasos com diâmetro igual ou inferior a 300 µm, as interações mecânicas entre
as células e as paredes dos vasos geralmente resultam na formação de uma camada de
plasma na região próxima à parede do vaso, ou seja, uma camada de baixo hematócrito (ou
mesmo livre de células) e um aumento do hematócrito na região próxima ao centro do vaso,
por onde circulam os eritrócitos (COKELET e GOLDSMITH, 1991). A diminuição da
viscosidade aparente do sangue, devido à diminuição do diâmetro do vaso, é chamada
efeito Fahraeus-Lindqvist. Conseqüentemente, a habilidade de R. prolixus em reposicionar
a abertura do canal alimentar no lume do vaso poderia ser usado pelo inseto como uma
forma de controlar o hematócrito e/ou a viscosidade do sangue que é ingerido durante o
processo alimentar.
Um estudo prévio, utilizando alimentador artificial, mostrou que o aumento da
viscosidade da dieta causou um declínio tanto na freqüência quanto no volume médio de
líquido ingerido por contração da bomba cibarial (SMITH, 1979). A redução na freqüência
de bombeamento, observada ao longo do processo de alimentação, associada ao maior
tempo de enchimento da bomba e ao aumento da ocorrência de picos duplos no sinal
elétrico descritos neste trabalho, são indicativos do aumento do esforço para a ingestão do
sangue. Esse esforço poderia estar relacionado a fenômenos ocorridos em qualquer parte do
canal alimentar ou no sítio de canulação no vaso sangüíneo, uma vez que, quando tem
início à sucção, a coluna de sangue forma um ducto único entre vaso, canal alimentar e o
intestino do inseto.
Entre os fenômenos que poderiam aumentar o esforço de sucção estão as reações
hemostáticas disparadas no sangue antes ou durante a ingestão (ARAUJO et al., 2007) e a
70
pressão causada na cutícula do abdômen devido ao grande volume de sangue ingerido já
próximo do final da alimentação (GUARNERI et al., 2000). Esta hipótese é reforçada pelo
fato de que o aporte de sangue ao redor da abertura da boca funcional do inseto aumenta ao
longo do repasto, coincidindo com o constante aumento do diâmetro funcional do vaso.
ARAUJO et al. (2007) demonstraram a influência do ambiente intestinal na
alimentação dos triatomíneos após o silenciamento da brasiliensina (proteína anticoagulante
do intestino médio anterior), causando a redução na quantidade de sangue ingerido pelos
insetos. O dano mecânico causado no endotélio pela inserção das peças bucais, a repentina
pulsação da parede do vaso e a forte oscilação do fluxo poderiam explicar o recrutamento
de leucócitos e a deposição de plaquetas observados nos experimentos. Este microambiente
criado no sítio de alimentação é suficiente para o disparo da agregação plaquetária e da
cascata de coagulação que também poderiam contribuir para o aumento da viscosidade
sangüínea (PUCKETT et al., 2005). Na verdade, algumas vezes, foi possível observar
êmbolos formados no interior dos vasos no sítio da alimentação de R. prolixus.
O recrutamento de leucócitos foi observado após a remoção das peças bucais do
lume do vaso. O recrutamento caracteriza o processo inflamatório que foi certamente
influenciado pela interrupção da deposição de saliva no vaso no fim do repasto. Entretanto,
o fenômeno deve ter começado no início do processo alimentar e é similar aos achados de
LAVOIPIERRE et al. (1959) que observaram, em cortes histológicos da pele do
hospedeiro, um “marcante acúmulo de leucócitos rodeando a porção intracapilar dos
estiletes de R. prolixus”. Certamente, o processo inflamatório, aqui caracterizado pelo
recrutamento de leucócitos, teria sido mais pronunciado caso R. prolixus não contasse com
certas proteínas salivares, como as nitroforinas, por exemplo, que, ao liberarem o NO no
sítio da alimentação, ficam livres para ligar a histamina liberada pelos mastócitos no local
da injúria (RIBEIRO 1982; RIBEIRO e WALKER, 1994), reduzindo o processo
inflamatório.
71
6.2- Caracterização funcional das nitroforinas expressas na glândula salivar de R.
prolixus
A partir das observações acima, o nosso objetivo foi estudar a influência de algumas
proteínas salivares no processo alimentar de R. prolixus. As Nps foram escolhidas pelo fato
de serem as proteínas mais abundantes na saliva deste inseto e por serem capazes de
neutralizar reações hemostáticas e inflamatórias dos hospedeiros. Além disso, embora bem
caracterizadas molecularmente e biologicamente in vitro, a influência das NPs durante o
processo alimentar ainda foi pouco estudada.
Para este estudo, induzimos o silenciamento das NPs 1-4 utilizando a técnica do
RNA interferente (ARAUJO et al., 2006) e realizamos experimentos de comportamento
alimentar in vivo para determinar se ausência das NPs poderia influênciar na performance
dos insetos alimentados sobre a pele do dorso ou sobre a veia lateral da cauda de
camundongos.
Os resultados da qPCR mostraram que a NP2 é o transcrito mais abundante nas
glândulas salivares das ninfas de quarto estádio (Fig. 14). Seu nível de expressão é
ligeiramente superior ao da NP1 e da NP4, enquanto a NP3 é muito menos expressa que as
demais. A razão entre estas hemeproteínas e a ocorrência de mRNA da NP3 no quarto
estádio ninfal difere da dosagem cromatográfica realizada por MOREIRA et al. (2003).
Estas diferenças na abundância relativa das NPs poderiam estar relacionadas a populações
distintas de triatomíneos utilizadas em cada trabalho, como visto por SOARES et al.
(1998).
As duas injeções de dsRNA induziram uma redução significativa nas NPs nas
glândulas salivares, tanto nos níveis de mRNA (Tab. 4) quanto no de proteínas (Fig. 15),
como verificado pelo qPCR e pela análise fenotípica. O silenciamento foi confirmado pelo
ensaio do tempo de recalcificação do plasma citratado (Fig. 15), pela quantificação de
hemeproteínas (Fig. 15) e pela análise do SDS-PAGE (Fig. 17) que mostraram uma
redução significativa das NPs. Em um trabalho anterior, injeções de dsRNA da NP2
também reduziram os níveis de expressão de genes de grande similaridade, como das NPs
1,3 e 4 (ARAUJO et al., 2006) . Entretanto, a expressão de outros genes (RPMYS3 e
RPP450) não foi alterada na glândula salivar. Também foi mostrado que a injeção de um
72
dsRNA inespecífico não exerce efeito significativo sobre a expressão de mRNA ou sobre o
conteúdo da glândula salivar (ARAUJO et al., 2006). Contudo, no presente estudo, não
utilizamos controle inespecífico.
A análise do SDS-PAGE mostrou uma redução nas bandas em torno de 20kDa e um
aumento na intensidade de algumas bandas com outros pesos moleculares. Esses achados
corroboram com a dosagem de proteínas nos insetos do grupo silenciado que não foi
significativamente reduzida em relação ao controle, mesmo levando-se em conta que as
NPs compreendem cerca de 50% do conteúdo total de proteínas salivares (CHAMPAGNE
et al., 1995) e que a redução das hemeproteínas foi em torno de 80%.
Esses achados sugerem que outras proteínas poderiam ter sido sintetizadas em altos
níveis para compensar a falta das NPs nas glândulas salivares. Apesar do RNAi ter se
mostrado específico para os genes alvo, tal fenômeno poderia modificar a composição e a
concentração de proteínas não desejadas na saliva, especialmente quando proteínas
importantes ou múltiplos genes são silenciados. Quando isso ocorre, os resultados devem
ser interpretados com cautela, particularmente nos experimentos em que genes são
silenciados para o estudo de funções desconhecidas.
A redução do conteúdo de hemeproteínas nas glânduals salivares só foi possível
após a alimentação das ninfas em hamsters anestesiados e a muda dos insetos para o estádio
subseqüente (ARAUJO et al., 2006). A alimentação faz com que as ninfas gastem
aproximadamente metade do conteúdo salivar antigo armazenado na glândula e que
continha NPs. Após a muda, a glândula salivar aumenta consideravelmente de volume,
tornando-se repleta (GUARNERI et al. , 2003), desta vez, por novas proteínas.
A performance alimentar dos insetos controles e testes foi então avaliada pelo
eletromiograma da bomba cibarial (Tab. 5). Já foi demonstrado que a taxa de ingestão de
sangue pelos insetos pode ser influenciada por diversos parâmetros, como a pressão
negativa produzida pela bomba cibarial, as dimensões do canal alimentar do inseto, a
viscosidade da dieta e o tamanho e capacidade de deformação dos eritrócitos
(KINGSOLVER e DANIEL, 1995). A eficiência alimentar também pode ser diretamente
influenciada pela saliva. A saliva contém vários componentes antihemostáticos e pode
auxiliar na localização do vaso durante a sondagem e na manutenção do fluxo sangüíneo na
passagem pelo canal alimentar (RIBEIRO, 1987).
73
No presente estudo, o eletromiograma da bomba cibarial de ninfas alimentadas
sobre a pele do dorso dos camundongos mostrou diferenças significativas entre o grupo
silenciado e controle, principalmente nos parâmetros relacionados à sondagem (Tab. 5; Fig.
18). Tais parâmetros não foram comparados nas ninfas alimentadas sobre a veia da cauda
pelo fato dos insetos terem sido posicionados para picar diretamente sobre o vaso.
No grupo controle alimentado sobre a pele do dorso, todas as ninfas apresentaram
apenas uma sondagem. No grupo silenciado, a maioria das ninfas (oito de 13) picou de duas
a 20 vezes até a canulação do primeiro vaso, o que contribuiu para um tempo cumulativo de
sondagem mais longo neste grupo. Entretanto, o tempo gasto entre a última picada e a
canulação do primeiro vaso foi semelhante àquele observado no grupo controle (Tab. 5).
Esses resultados sugerem que as ninfas silenciadas tiveram problemas em encontrar um
vaso. O aumento no tempo de sondagem foi previamente observado em R. prolixus
salivarectomizados (Ribeiro e Garcia , 1981) ou com as glândulas salivares infectadas com
Trypanosoma rangeli (GARCIA et al., 1994). Esses resultados sugerem que R. prolixus
poderia se comportar como mosquitos quando buscam um vaso. Fêmeas de Aedes aegypti
sondam em intervalos de sete segundos. Se a busca é bem sucedida, tem início o
ingurgitamento. Alternativamente, o mosquito desiste, os estiletes são retirados da pele e o
inseto tenta se alimentar em um novo local (RIBEIRO et al., 1985). O tempo de sondagem
e a desistência foram associados com uma adaptação ao hospedeiro. Os mosquitos
interrompem uma sondagem mal-sucedida para evitar que sejam predados ou mortos pelo
hospedeiro após a irritação devido à resposta imune desencadeada pela saliva (GILLETT,
1967).
Nos mosquitos, a inibição da agregação plaquetária tem sido associada com tempos
de sondagem mais curtos (LI e ROSSIGNOL, 1992). Em Anopheles stephensi, o tempo de
sondagem correlaciona-se negativamente com a atividade apirásica (LI e ROSSIGNOL.,
1992). R. prolixus também possui uma potente atividade apirásica, mas a agregação
plaquetária também é inibida pelas NPs. Além dessas atividades, o NO promove o aumento
da permeabilidade vascular (GONZALEZ et al., 2003) e dilatação (CHAMPAGNE, 2005)
que poderiam acelerar o encontro de um vaso. O extravasamento dos componentes
plasmáticos para os tecidos adjacentes poderia ajudar na localização do sangue
simplesmente indicando a presença de um vaso na vizinhança e/ou poderia ajudar a
74
direcionar as maxilas do inseto para o vaso seguindo um gradiente químico criado,
conforme abordado anteriormente.
Independentemente se o inseto foi silenciado ou não, a performance alimentar foi
melhor naqueles que se alimentaram diretamente sobre a veia lateral da cauda do
camundongo. Este vaso é uma veia calibrosa (diâmetro superior a 500 µm), enquanto as
vênulas e arteríolas encontradas na pele do dorso têm um diâmetro médio de 37,7 e 20µm,
respectivamente (KALAMBUR et al., 2004). Como o fluxo está diretamente relacionado ao
diâmetro do vaso (USHIYAMA et al., 2004), isso significa que existe uma grande diferença
no fluxo sangüíneo ao redor das peças bucais quando o barbeiro se alimenta nestes dois
sítios. O maior fluxo de sangue presente na veia lateral da cauda provavelmente explica
porque, mesmo na ausência das NPs, os barbeiros silenciados não apresentaram as mesmas
dificuldades em se alimentar como observado sobre a pele do dorso.
A maior taxa de ingestão efetiva observada na veia da cauda foi devido à
inexistência de interrupções durante o repasto e principalmente devido à maior freqüência
de contrações da bomba cibarial quando comparado aos insetos que se alimentaram sobre a
pele do dorso dos camundongos. Neste sítio de alimentação, observamos que também o
ritmo e o perfil dos sinais elétricos gerados pela bomba cibarial foram diferentes (Fig. 19).
Estes resultados sugerem que o inseto modula a freqüência inicial da bomba cibarial
baseado na quantidade de sangue disponível ao redor de suas peças bucais.
Neste trabalho, demonstramos que a performance alimentar depende de fatores
relacionados à microcirculação da pele do hospedeiro, como discutido acima, bem como
pela composição da saliva. Tanto a comparação entre os sítios (dorso e cauda), quanto a
comparação entre os grupos silenciado e controle alimentados no dorso mostraram
diferenças na performance alimentar. Entretanto, em ambos os casos, essas diferenças não
interferiram no ganho de peso, mas sim no tempo necessário para completar o repasto,
explicando a diferença na taxa de ingestão. A importância da saliva na performance
alimentar in vivo com R. prolixus foi demonstrada por RIBEIRO e GARCIA (1981) que
utilizaram insetos salivarectomizados para mostrar que estes apresentavam dificuldades em
obter o repasto sangüíneo de coelhos, apresentando um tempo total de contato muito longo,
mas sem diferença no ganho de peso em relação aos insetos controles. Isso reforça a
importância da saliva na habilidade de completar o repasto sangüíneo em um tempo total de
75
contato curto com pequeno número de picadas, especialmente em hospedeiros não
anestesiados, reduzindo a probabilidade de sejam percebidos e mortos pelos hospedeiros.
Vimos que a ausência das NPs também afetou a freqüência de contrações da bomba
cibarial que foi menor nos insetos silenciados alimentados sobre a pele do dorso dos
camundongos (Tab. 5). Isso reflete a maior dificuldade destes insetos em manter um fluxo
sangüíneo adequado ao redor das peças bucais. As NPs dilatam os vasos e são capazes de
manter o diâmetro aumentado durante todo o processo alimentar, aumentando o fluxo
sangüíneo próximo às maxilas no sítio de alimentação, reduzindo o tempo total de contato
até o completo ingurgitamento dos insetos controles, como visto neste estudo (Champagne ,
1995).
As quatro NPs se agrupam em duas subfamílias baseadas na análise da seqüência de
aminoácidos, com a NP1 e a NP4 em uma subfamília e a NP2 e a NP3 em outra
(ANDERSEN et al., 2000). Experimentos mostraram que NP1 e NP4 liberam o NO
rapidamente em pH 8 e esta liberação é mais lenta que na liberação de NO pela NP2 e NP3.
Portanto, a NP1 e a NP4 dissociam o NO imediatamente no sítio da picada, enquanto a NP2
e a NP3 precisam ser muito mais diluídas, implicando numa difusão a partir do sítio da
picada onde a liberação da saliva antecedeu a liberação do NO (CHAMPAGNE, 2005).
Coletivamente, este sistema resulta na vasodilatação ao longo de uma grande extensão do
vaso e durante longos períodos, agindo na área ao redor do local picado, incluindo os vasos
adjacentes. Além disso, a saliva liberada durante todo o processo alimentar (SOARES et
al., 2006) aumenta a ação do NO na vasodilatação.
A agregação plaquetária é a primeira linha de defesa contra a perda sangüínea em
vasos de pequeno calibre (RIBEIRO e FRANCISCHETTI, 2003), como aqueles da pele do
dorso dos camundongos (KALAMBUR et al., 2004). Assim, a manutenção da freqüência
de contração da bomba cibarial poderia estar relacionada com a atividade antiplaquetária
que também é desempenhada pelo NO (MONCADA et al., 1991).
Foi interessante observar que a taxa de ingestão obtida pelos insetos na veia lateral
da cauda do camundongo (16±0,7 mg/min) foi semelhante à taxa de ingestão observada em
pombo (19,5±5 mg/min) por SANT’ANNA et al. (2001). Este hospedeiro, diferentemente
do mamífero, possui trombócitos que são menos responsivos aos indutores de agregação
plaquetária. Além disso, esses hospedeiros parecem carecer de certos fatores da coagulação,
particularmente da via intrínseca (LEWIS, 1996).
76
A facilidade com que as ninfas alimentam-se na veia da cauda permite que este
sistema seja utilizado como um modelo com condições de alimentação favoráveis ao estudo
do comportamento alimentar de insetos hematófagos solenofágicos. O alimentador artificial
foi previamente utilizado como o melhor modelo de fonte alimentar, entretanto, algumas
espécies de triatomíneos não se alimentam bem neste aparato artificial (GUARNERI,
2000).
Na alimentação sobre a pele do dorso, as ninfas tiveram uma gama de vasos com
diâmetros diversos para canular (USHIYAMA et al., 2004; KALAMBUR et al., 2004).
Experimentos anteriores já haviam relatado a grande variabilidade dos dados obtidos a
partir do eletromiograma da bomba cibarial (GUARNERI et al., 2000, 2003; SANT`
ANNA et al., 2001). Os autores relataram que isso provavelmente deveu-se a diferentes
fatores não controlados, associados com os insetos ou com o hospedeiro. Os resultados do
presente estudo reforçam esta afirmativa, indicando que um destes fatores não controlados
poderia ter sido o tamanho do diâmetro do vaso canulado. Como visto na figura 18
A, as
ninfas também podem mudar de vaso durante o processo alimentar, portanto, modificando
consideravelmente diversos parâmetros analisados pelo eletromiograma.
A presença das NPs já havia sido relatada para insetos hematófagos dos gêneros
Rhodnius e Cimex. O percevejo de cama Cimex lectularius possui um sistema semelhante
de estocagem de NO e liberação por NPs, apesar da análise das seqüências demonstrar que
a única Np não possui relação alguma com as NPs de Rhodnius (VALENZUELA e al.,
1998). Cimex possui um notável sistema para o transporte de duas moléculas de NO em
cada NP, o que não é conhecido para nenhum outro organismo (WEISCHEL et al., 2005 in
CHAMPAGNE, 2005). É interessante salientar que outros triatomíneos do gênero
Triatoma, como T. rubida, T. brasiliensis e T. infestans e do gênero Panstrongylus, como
P. megistus, possuem glândulas salivares translúcidas sem nitrovasodilatadores. Isto sugere
que o NO e as hemeproteínas carreadores de NO teriam surgido apenas no gênero Rhodnius
(RIBEIRO et al., 2004). Em vez disso, eles produzem outras biomoléculas capazes de
realizar atividades semelhantes a aquelas desempenhadas pelas NPs.
No gênero Rhodnius, o perfil de hemeproteínas difere entre as espécies (SOARES et
al., 2000). Esta diferença, aliada aos parâmetros mecânicos das peças bucais e da bomba
cibarial, poderiam ajudar a explicar a performance alimentar diferenciada entre espécies do
gênero, como em R. robustus, R. nasustus e R. neglectus (SANT`ANNA e al., 2001).
77
O ambiente intestinal também poderia estar envolvido na competência alimentar.
Recentemente, nosso grupo mostrou a influência do anticoagulante intestinal na
determinação da quantidade de sangue ingerido por T. brasiliensis (ARAUJO et al., 2007).
Uma vez que os insetos ingerem saliva juntamente com o sangue (SOARES et al., 2006), o
ambiente intestinal deve ser regulado pelas moléculas intestinais e salivares.
Com o acréscimo de novas seqüências de moléculas salivares e intestinais nos
bancos de dados, o desafio é definir a função destes novos alvos e, para isso, o
silenciamento pelo RNA interferente, conforme realizado neste estudo, mostra-se como
uma estratégia poderosa. Para insetos hematófagos, as moléculas de particular interesse são
aquelas associadas a aspectos como capacidade vetorial, tais como aquelas relacionadas à
busca pelo hospedeiro, à hematofagia e à interação vetor-hospedeiro. Um melhor
entendimento desses processos irá elucidar fatores relacionados às interações vetor-
hospedeiro e apontará novos alvos para o controle da transmissão vetorial.
78
6.3- Influência do ambiente intestinal de T. brasiliensis durante o processo de
hematofagia
A competência alimentar de uma espécie de triatomíneo varia de acordo com a fonte
alimentar disponível. Os triatomíneos apresentam maior taxa de ingestão quando se
alimentam em pombos do que em camundongos. Esta diferença deve-se principalmente à
maior freqüência de contração da bomba cibarial quando os insetos se alimentam em aves.
Freqüências médias de 3,99 ± 0,2 Hz para insetos alimentados em pombos e 3,09 ± 0,2 Hz
para aqueles alimentados tanto em camundongos quanto em humanos foram observadas
para T. brasiliensis (GUARNERI et al., 2000; 2003). Isto pode estar relacionado às
diferenças nos mecanismos hemostáticos entre as diferentes classes de vertebrados
(GUARNERI et al., 2000; SANT’ANNA et al., 2001).
No presente trabalho, nós comparamos a performance alimentar de ninfas de T.
brasiliensis alimentadas de forma natural em rato, com ninfas alimentadas em T.
apereoides. O rato foi empregado pelo fato de ter a fisiologia semelhante à do roedor
silvestre. Nossas observações confirmaram que T. brasiliensis apresenta maior dificuldade
em se alimentar no roedor silvestre, conforme observado previamente por Guarneri (2004).
Este fato foi confirmado pela menor taxa de ingestão e menor ganho de peso quando as
ninfas se alimentaram no T. apereoides (Tab. 6, Fig. 20). Os insetos permanceram mais
tempo em contato com este roedor tentando se alimentar, provavelmente devido a pistas
olfativas que estimularam os insetos a picarem novamente após uma interrupção que foi
seguida da retirada das peças bucais da pele.
Esta maior dificuldade do T. brasiliensis em se alimentar em T. apereoides também
foi confirmada pelos resultados obtidos na alimentação artificial com sangue. O plasma ou
a suspensão de hemácias de T. apereoides também foram oferecidos no alimentador
artificial para verificar qual componente do sangue estaria influenciando na performance
alimentar do inseto neste roedor. A comparação dos parâmetros alimentares entre estas
duas dietas mostrou que a taxa de ingestão foi semelhante na alimentação com o plasma
dos dois hospedeiros, mas foi menor na suspensão de hemácias e no sangue total do T.
apereoides, sugerindo que esta diferença possa estar relacionada com os eritrócitos. O fato
de o inseto ter ingerido maior quantidade de suspensão de hemácias deste roedor do que de
79
plasma, provavelmente deveu-se ao fato da solução de alimentação artificial, utilizada para
diluir as hemácias, conter ATP, um fagoestimulante.
Diversos parâmetros que interferem na ingestão de sangue foram anteriormente
descritos, entre eles as reações hemostáticas desencadeadas pelo processo de hematofagia e
a viscosidade da dieta. SMITH et al. (1979) descreveram que a viscosidade da dieta poderia
influenciar na quantidade de alimento ingerido principalmente devido à redução na taxa de
ingestão de ninfas de R. prolixus. Quando o triatomíneo pica o hospedeiro na tentativa de
obter sangue, ele dispara reações hemostáticas no sítio da picada. Uma vez que o inseto
ingere uma série de fatores ativados juntamente com o sangue, diversas reações ocorrem no
intestino médio anterior, onde o sangue é estocado. A inibição de reações hemostáticas,
tanto na pele (RIBEIRO et al., 1998) quanto no intestino (ARAUJO et al., 2007), é
importante para que se obtenha sucesso na hematofagia. No presente estudo, a variação na
viscosidade da dieta não deve ter influenciado o comportamento alimentar de T.
brasiliensis, uma vez que os valores dos hematócritos dos hospedeiros R. norvegicus e de
T. apereoides foram muito semelhantes (41,0 ± 2,6% e 41,3 ± 2,1%, respectivamente). Tal
diferença quanto ao hematócrito também não ocorreu na alimentação artificial, uma vez
que as suspensões de hemácias dos dois roedores tiveram o hematócrito ajustado. As
reações hemostáticas da pele também não foram os fatores determinantes das diferenças
observadas na alimentação nos dois roedores, uma vez que as diferenças observadas na
alimentação natural continuaram sendo observadas quando o sangue com anticoagulante foi
oferecido no alimentador artificial.
Os resultados aqui obtidos com o alimentador artificial, no qual não há influência de
reações hemostáticas da pele do hospedeiro, indicam que os principais fatores relacionados
com a dificuldade em obter sangue do T. apereoides poderiam estar ligados a traços
morfofisiológicos do sangue dos hospedeiros e também a fenômenos ocorridos no ambiente
intestinal. Além disso, a comparação da alimentação das ninfas com plasma ou com
suspensão de hemácias indicou que características particulares dos eritrócitos são a chave
das diferenças observadas, uma vez que todas as alimentações com dietas contendo
eritrócitos apresentaram a taxa de ingestão significativamente maior para ninfas ingerindo
as dietas derivadas do sangue do rato (Tab. 6).
A análise dos conteúdos intestinais, após a ingestão de sangue dos dois hospedeiros,
mostrou que a diferença mais evidente estava relacionada com a formação de grumos de
80
eritrócitos que se separaram da fase líquida do sangue do rato (Fig. 21). A formação dos
grumos foi mais bem visualizada quando o conteúdo intestinal de T. brasiliensis foi
adicionado ao sangue do rato ou à suspensão de hemácias em lâminas de vidro observadas
ao microscópio (Fig. 22). Este achado é um forte indício de que a aglutinação de eritrócitos
é o fator chave na competência alimentar de T. brasiliensis.
Trabalhos anteriores já haviam descrito a presença da capacidade de aglutinação
contra o sangue de coelho e de camundongo para R. prolixus e T. infestans (GREGORIO e
RATCLIFFE, 1991; HYPSA e GRUBHOFFER, 1995; GRUBHOFFER et al., 1997). Este
fenômeno sempre foi associado com lectinas, mas, em T. infestans, este fenômeno não foi
exibido para nenhum dos 20 mono ou oligossacarídeos testados (GREGORIO e
RATCLIFFE, 1991). Embora a atividade tenha sido observada em muitos tecidos,
incluindo o intestino médio anterior, em trabalhos prévios, a atividade aglutinante dos
eritrócitos foi discutida em face da interação com parasitos, principalmente o T. cruzi. Esta
é a primeira vez que a atividade aglutinante é descrita em T. brasiliensis, enfocando a
interação vetor-hospedeiro e a associação com a competência alimentar.
Considerando a influência da aglutinação eritrocitária na taxa de ingestão total,
nossa hipótese é que a separação do fluído da parte sólida do sangue, após a ingestão, é
importante para permitir a regulação do ambiente intestinal para comportar mais sangue.
Esta separação induz a formação de uma fase sólida, composta por células (zona de maior
viscosidade). A fase líquida permite um melhor remodelamento/distensão do intestino
médio anterior e também evita a formação de uma solução de alta viscosidade que
retardaria a entrada de sangue para o intestino. Uma vez que o canal alimentar é composto
por um tubo único, qualquer distúrbio que ocorra em qualquer ponto dele, incluindo o
intestino médio, deve interferir na sucção de sangue pela bomba cibarial. Se os
componentes sólidos e líquidos não fossem separados, a alta viscosidade do sangue dentro
do intestino médio impediria o pronto ajustamento do intestino para receber mais alimento.
ARAUJO et al. (2007) descreveram a influência do processo de coagulação (provavelmente
aumentando a viscosidade da dieta) na quantidade de sangue ingerido por T. brasiliensis.
Trabalhos anteriores, estudando aglutininas em triatomíneos, descreveram que a
atividade não é induzida pelo repasto (GRUBHOFFER et al., 1997). Tal padrão de
expressão foi recentemente descrito para a brasiliensina intestinal de T. brasiliensis
(ARAUJO et al., 2007), reforçando, assim, a importância dessas moléculas na obtenção do
81
repasto sangüíneo. Tais moléculas precisam ser expressas e estarem ativas no intestino
antes da chegada do sangue (ARAUJO et al., 2007), senão, o inseto não seria capaz de
inibir os processos de hemostasia (coagulação) ou desencadear a aglutinação e, portanto,
não obteria quantidade de sangue suficiente para o ingurgitamento.
Os espécimes que se alimentaram no roedor silvestre apresentaram muitas
interrupções durante o ingurgitamento. Isso faz com que os insetos piquem mais vezes até a
obtenção de quantidade suficiente de sangue para a muda ou para a produção de ovos, por
exemplo, além de aumentar a probabilidade de serem percebidos pelos hospedeiros.
Embora as fontes de sangue disponíveis para T. brasiliensis no seu ambiente natural ainda
não sejam completamente conhecidas, T. apereoides são certamente importantes
hospedeiros, uma vez que esses indivíduos são abundantes nos esconderijos de T.
brasiliensis.
Os resultados aqui obtidos indicam que a maior dificuldade de alimentação em T.
apereoides poderia estar relacionada às possíveis diferenças existentes entre as hemácias
deste roedor silvestre e do rato. A diferente performance alimentar de T. brasiliensis nos
dois hospedeiros deve estar relacionada à diferença observada na aglutinação eritrocitária.
Isto sugere que fatores próprios do intestino desempenham importante papel no processo
alimentar, uma vez que o empacotamento das hemácias do rato pareceu ser o fator
determinante da maior taxa de ingestão.
82
7- Conclusões
a) Ninfas de terceiro estádio de R. prolixus canulam mais vênulas do que arteríolas
durante o processo alimentar na pele da orelha de camundongos.
b) Durante o processo alimentar, R. prolixus provoca um aumento de permeabilidade
vascular no sítio da picada tanto na fase de sondagem quanto na fase de
ingurgitamento.
c) As microhemorragias são freqüentes no sítio de alimentação dos triatomíneos e
ocorrem principalmente na fase de sondagem.
d) O processo alimentar de R. prolixus induz uma reação inflamatória em
camundongos (não sensibilizados) observada pela presença de leucócitos e
plaquetas aderidos ao endotélio do vaso logo após a retirada das peças bucais.
e) A análise de imagens proposta no presente trabalho, conjuntamente com os sinais
produzidos pela bomba cibarial, durante o processo de alimentação dos
triatomíneos, permite identificar vários fenômenos como a variação no diâmetro do
vaso, movimentos de regurgitação, bem como o ritmo e a freqüência de contração
da musculatura associada à bomba cibarial.
f) Movimentos de regurgitação de material provenientes do canal alimentar podem
ocorrer durante todo o processo de alimentação, entretanto, são mais freqüentes
próximo ao final do repasto.
g) A técnica de RNA interferente pode ser utilizada em estudos sobre o papel de
proteínas salivares no processo de alimentação in vivo.
h) A utilização do espectro de freqüência versus tempo permite avaliar o ritmo de
contração da bomba cibarial durante o processo de alimentação.
i) As NPs salivares são importantes para o processo alimentar de R. prolixus e a
redução na sua quantidade diminui a performance alimentar do triatomíneo quando
83
alimentado em vasos pequenos, interferindo sobretudo nos eventos relacionados ao
processo de sondagem e à freqüência da bomba cibarial.
j) O sítio de alimentação é um fator importante na performance alimentar dos
triatomíneos. A alimentação sobre vasos grandes (veia lateral da cauda de
camundongos) é mais fácil para a obtenção do repasto do que sobre vasos de
pequeno diâmetro (vasos da pele do dorso de camundongos).
k) T. brasiliensis apresenta maior dificuldade em se alimentar sobre o roedor silvestre
(T. apereoides) do que sobre o rato (R. norvegicus). O fato das hemácias do roedor
silvestre não se aglutinarem no intestino médio anterior do barbeiro pode explicar
em parte esta maior dificuldade.
l) O conteúdo intestinal de T. brasiliensis induz a aglutinação das hemácias do R.
norvegicus, mas não do T. apereoides.
m) O extrato solúvel do intestino médio anterior de T. brasiliensis é capaz de aglutinar
in vitro as hemácias de rato, tanto no sangue total quanto na suspensão de hemácias.
Este fato demonstra que as proteínas plasmáticas do sangue não são necessárias para
que a aglutinação ocorra.
84
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Anexo I
The host skin microcirculation during blood feeding by Rhodnius prolixus (Hemiptera;
Reduviidae).
Adriana Coelho Soares
a
, Ricardo Nascimento Araujo
a
, Juliana Carvalho-Tavares
b
, Rogério
Amino
c
, Nelder de Figueiredo Gontijo
a
, Mauro Martins Teixeira
d
, Michael J. Lehane
e
,
Marcos Horácio Pereira
a*
a
Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil, caixa postal 486, CEP 31270-901.
b
Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Minas Gerais.
c
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de São Paulo.
d
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Minas Gerais.
e
Liverpool School of Tropical Medicine, Pembroke Place, Liverpool L3 5QA, UK
* Corresponding author. Address: Departamento de Parasitologia, Universidade Federal de
Minas Gerais, Avenida Antônio Carlos, 6627, Pampulha, Belo Horizonte, MG, CEP 31270-
901, Brasil. Fone: +55 31 3499 2867. Fax: +55 31 3499 2970.
E-mail address: [email protected]g.br (M.H. Pereira)
Note: Supplementary data associated with this article (2 Videos).
SUMMARY
The objective of the present work was to use the cibarial pump electromyogram and
a novel image analysis applied to the intravital microscopy to better characterize
phenomena occurring during the feeding process of Rhodnius prolixus third instar nymphs
on the mouse ear skin. Venules were cannulated more than arterioles and increase in
vascular permeability was found in all experiments. The cibarial pump electrical signals
were synchronized with the movements caused in the venule wall by the pump contractions
during the engorgement phase. Frequency reduction was observed during the feeding
process. The reduction was probably due to an increase in the cibarial pump blood-filling
time and not to the blood flow around the mouthparts, once the frequency was inversely
proportional to the vessel diameter. The electrical signals of the cibarial pump appeared in
several formats, varying from one single peak to two separated peaks that were common at
the second half of the feeding. These latter signal shapes indicated that the cibarial pump
muscles were not synchronized, probably due to an increased effort to pump the blood to
the digestive tract. The lack of synchrony could have generated the apparently involuntary
regurgitation-like movements, which were also more frequent at the end of the feeding
process. Platelet deposition and leukocyte recruitment were observed on the venular
endothelium after removal of the mouthparts. The findings suggest that phenomena
occurring during the blood passage through the feeding canal and/or reactions occurring in
the intestinal environment of the insect interfere with the feeding process.
Keywords: Rhodnius prolixus, blood feeding, microcirculation, platelet deposition,
leukocyte recruitment, intestinal environment, host-vector interaction.
INTRODUCTION
Haematophagy in arthropods has arisen on at least 20 independent occasions
(Wheeler et al., 2001). The evolution of haematophagy resulted in a series of adaptations,
among them, morphology of the feeding apparatus (Black and Kondratieff, 2005) and the
change to saliva containing potent pharmacologically active products that alter the host
haemostatic, inflammatory and immune system (Valenzuela, 2004). The arthropods, when
faced with a common set of problems associated with gaining access to vertebrate blood,
have adopted many molecularly independent but functionally convergent paths (Black and
Kondratieff, 2005).
Triatomine bugs are vessel feeders, obtaining their blood meals directly from the
blood vessels (venules or arterioles) of their vertebrate hosts in all nymphal instars as well
as adults (Lavoipierre et al., 1959). Contact with the host occurs only during feeding, which
usually takes 20-30 min. For larger species such as Dipetalogaster maxima, the fifth instar
can ingest more than 1 ml of blood in a single feeding. The contact time is influenced by
the blood ingestion rate, which varies among species and developmental stage as well as
the physiology of the host (Guarneri et al., 2003; Guarneri et al., 2000; Sant'Anna et al.,
2001). Triatoma infestans and Rhodnius prolixus, the main vectors of Trypanosoma cruzi in
Americas, have higher ingestion rates which enable them to reach higher population
densities inside human dwellings (Pereira et al., 2006).
The ingestion of blood through the bugs food canal is aided by the negative pressure
produced by the cibarial pump, whose contractions are promoted by a complex of strong
muscles occupying much of the insect head. The ingestion of liquids is achieved by the
contractions of the cibarial dilator muscles that distort the superior wall of the cibarium
which recoils to the original position by elasticity of its wall after relaxation of these
muscles (Barth, 1952).
Most knowledge about the triatomine bug feeding process comes from Lavoipierre
et al. (1959) using intravital microscopy and Friend and Smith (1971) using cibarial pump
electromyograms. However, these works identified several phenomena that are not well
understood. Among them, regurgitation-like movements and interruptions during the
feeding process (Lavoipierre et al., 1959) and variations in the shape of the spike potential
(Friend and Smith, 1971).
Most of these phenomena were also observed in works performed by our group
using cibarial pump electromyograms (Guarneri et al., 2003; Guarneri et al., 2000;
Sant'Anna et al., 2001) and intravital microscopy (Soares et al., 2006). In order to identify
the occurrence and elucidate the causes of these phenomena, we have developed a novel
method to analyze the images produced by the intravital microscopy. This image analysis,
in synchrony with cibarial pump electomyograms, allows novel insights into the R. prolixus
feeding process.
MATERIAL AND METHODS
Host animals
Hairless mice (HRS/J) 6-7 weeks old were obtained from the Animal Care
Facilities, Parasitology Department – ICB/UFMG. The animals were housed under standard
conditions and had free access to commercial food and water. They had no contact with
triatomines prior to the experiments.
Insects
Third instar specimens of R. prolixus (Honduras) were obtained from our insectary
colonies, maintained at 28 ± 2ºC and 65 ± 10% relative humidity. The insects were fed
weekly on chickens or hamsters.
Cibarial pump Electromyogram
The electronic monitoring of the activity of the cibarial pump was performed with
triatomine nymphs according to Guarneri et al. (2003). Briefly, one electrode was fixed to
the host and a second electrode was connected to the dorsal surface of the bug thorax. The
signals produced during the feeding process were filtered, rejecting frequencies above 17
Hz, with a slope of −45 dB/octave, amplified 210 times and digitalized for the data
acquisition plate (ADC100
®
-Pico Technology Limited) connected to an IBM-AT
compatible microcomputer. In some experiments, the cibarial pump electromyogram was
performed simultaneously with the intravital experiments.
Intravital microscopy
Mice were anaesthetized intraperitonealy with a mixture of 150 mg/kg ketamine
hydrochloride (Cristalia) and 10 mg/kg xylazine (Bayer) and the tail vein was cannulated to
administer fluorescent stains as required. Experiments were carried on the convex dorsal
surface of the mouse ear, flattened in a drop of water against a small Plexiglas platform.
Throughout the experiment, the mouse was maintained at 37
o
C with a heating pad (Fine
Science Tools Inc). The skin of the ear was examined using an epifluorescence microscope
(Olympus BX50) or a stereoscope microscope (Wild Heerbrug M5-89797). The images
were captured with a camera (Olympus U-PMTVC) and recorded for offline analysis.
Twenty-four hours before the experiments, the insects (third instar nymphs) were attached
to a paper strip in order to reduce their mobility in the microscope visual field.
Vascular permeability alterations
Changes in vascular permeability were investigated using Evans blue dye (Merck,
20 mg/Kg) in 0.9% saline solution injected intravenously (i.v.) just prior to the experiments
(Matos et al., 1999). In the experimental group, the insects (one per ear) were removed
from the skin 1 minute after the beginning of the probing phase. The insects were
positioned to bite close to the ear border, where there are only small vessels (Barker et al.,
1989), to prevent vessel cannulation during this time. The observation of stain leakage was
done 15 minutes after insect skin contact. Ear skin without insect contact was used as
control.
In some experiments, to aid in visualization of the vasculature, 100 µl of 5% FITC-
Dextran (Sigma-Aldrich; mol wt 282,000) in 0.9% saline solution was administered i.v. as a
plasma marker and its fluorescence was visualized by epi-illumination (450-490 nm
excitation/ 535 nm emission filter) (Hickey et al., 2002).
Platelet aggregation and recruitment of leukocytes
To observe the platelet-endothelium interactions and leukocyte recruitment, 50 µl of
0.05% rhodamine 6G (Sigma, mol wt 479.02) in 0.9% saline solution was administered i.v..
Rhodamine 6G labels leukocytes and platelets which are then visualized by epi-
illumination (510-560 nm excitation / 590 nm emission filter) (Hickey et al., 2002). Rolling
leukocytes were defined as those white cells moving at a speed lower than that of
erythrocytes within a given vessel. Leukocytes were considered adherent to the venular
endothelium when they remained stationary for 30 seconds or longer in a 100 µm-length of
the venule. In the control, movements of the leukocytes were recorded in the same vessel
for 60s before the R. prolixus feeding process began. The leukocyte behavior and platelet
aggregation were recorded at different times: right at the end of the engorgement phase and
10 and 30 min later.
Analysis of vessel wall movements
The images produced by the intravital microscopy were analyzed using ImageJ
software (Abramoff et al., 2004; Rasband, 2007). The variations in the vessel area in the
images (an estimation of the vessel diameter) were measured during the whole triatomine
feeding process for the area surrounding the cannulation site. The software calculates the
vessel area for each frame of the recorded videos (~25 frames/s) and the values were
transferred to Microsoft excel and SigmaPlot 2002 for Windows Version 8.0 for analysis
and graphic construction. For this analysis, five experiments, in which triatomines remained
feeding in venules for at least 15 minutes, were chosen.
Statistical analysis
Statistical analysis of leukocyte recruitment was performed using GraphPad Instat
TM for windows. Analysis of variance (ANOVA) was used to verify differences between
groups, post hoc comparisons were made using the Dunnett test. Data was presented as
mean ± s.e.m.. Statistical significance was set at p<0.05.
RESULTS
Vessel preference and vascular permeability alterations
The mean number of vessels used during feeding by R. prolixus (n=8) was 3.4 ± 1.2.
Insects cannulated more venules (63%) than arterioles. A substantial increase in vascular
permeability in the probing phase, characterized by Evans blue leakage into tissues (Fig.
1A), was visualized in all experiments performed (n=10). There was also FITC-Dextran
leakage from the vessel, an indicator of increased plasma extravasation during the feeding
process (Fig. 1B). Microhaemorrhages were frequently observed during blood feeding (15
events in 8 experiments), most occurring during the probing phase (80%).
During the engorgement phase, it was common to see the insects executing small
movements of the maxillae inside the vessels. Some of these movements were
characterized by a slow migration of the maxillae through the lumen of the vessel changing
the position of the feeding canal aperture (upstream or downstream) (Video 1).
Analysis of vessel wall movement during the blood pumping process
The analysis of venule (40-47 µm diameter) wall movements in the intravital
microscopy experiments identified several phenomena that occurred during the triatomine
feeding process. At the feeding site, during the suction associated with feeding, both
upstream and downstream blood is abruptly directed to the tip of the mouthparts and the
wall of the cannulated vessels pulsated due to the negative pressure generated by the
cibarial pump contraction. A close synchrony between the contractions of the cibarial pump
and vessel wall movements was visualized when the electromyogram and the intravital
microscopy were performed simultaneously (Fig. 2).
The analysis of the images from these experiments showed that the rhythmic
retractions in the venule wall were due to blood removal by the insect. The duration of
vessel wall retractions indicates the time necessary to fill the cibarial pump with blood. A
reduction in the blood pumping frequency was observed during the feeding process in all
experiments (n=5). The reduction occurred concomitant with the increased time to blood
fill the cibarial pump (estimated by the number of points that represents the trajectory of the
wall during the contraction movement) and the increased occurrence of disturbances in the
spike potential shape along the electromyograms (Fig. 2A, B and C). At the beginning of
the process, the electrical signals produced by the cibarial pump appeared as a single peak
(Fig. 2A). However, during the feeding process, the spike potential shape was also seen as
two completely separated peaks or as any of the intermediary shapes between these two
(Fig. 2C).
The frequency of activity of the cibarial pump was inversely proportional to the
average of the vessel area (functional diameter; Fig. 3A). At the beginning of the feeding
process, right after the cannulation of the venule, the cibarial pump was at its higher
frequency resulting in a low functional diameter of the vessel. When the cibarial pump
activity was reduced or interrupted, which could be seen during the engorgement phase
(Fig. 3B) or at the end of the feeding process, an increase in the vessel diameter was
observed.
Comparisons of the initial diameter of the vessel to the one immediately after the
removal of the insect mouthparts showed that the most usual finding in R. prolixus was
vasodilatation in the cannulated venules while in the cannulated arterioles the commonest
finding was vasoconstriction (Table 1).
The analyses of the vessel wall pulsation also permitted to distinguish regurgitation-
like movement during the feeding process. These movements were characterized by a
sudden increase in the diameter of the vessel, apparently due to blood reflux from the insect
mouthparts into the venule (Fig. 2B). Sometimes, a colorless reflux was also observed in
the analysis. In consequence, the program interpreted the images as a sudden reduction in
the vessel area (Fig. 4), although the vessel area increased during the phenomenon. It was
not possible to identify the regurgitation-like movements solely by the signals of the
cibarial pump electromyogram. Regurgitation-like movements occurred at any moment of
the feeding process but were most common at the second half of the engorgement phase,
when they were seen repeatedly and were usually followed by a reduction of blood
pumping frequency.
Platelet aggregation and recruitment of leukocytes
In all experiments using rhodamine 6G (n=10), platelet aggregation was observed
on the venular endothelium immediately after removal of the mouthparts of R. prolixus,
turning more conspicuous over 10 to 30 min (Video 2). Platelet deposition in the vessel
wall usually extended beyond the point of insertion of the maxillae (Fig. 5). In these
experiments, a significant increase in the number of rolling leukocytes (P<0.01) occurred at
10 min (10.4 ± 2.2) and at 30 min (12.0 ± 3.1) relative to the control (1.9 ± 0.8) (Fig. 6A).
The number of adherent leukocytes increased significantly (p<0.05) at 10 (2.9 ± 0.6) and 30
min (4.0 ± 0.7) after engorgement, compared to the control (1.1 ± 0.4) (Fig. 6B).
DISCUSSION
R. prolixus are haematophagous insects that take blood directly from the vessel. In
order to obtain a sufficient meal, they induce several alterations in the microcirculation of
the host at the bite site that are mainly induced by saliva and the mechanical damage
resulted from the introduction and movements of the mouthparts. In all experiments
reported here, an increase in vascular permeability was observed at the feeding site during
the whole feeding process. Beside the mechanical tissue damage produced by mouthparts
movements, R. prolixus releases nitric oxide into the skin of the host (Ribeiro et al., 1993).
NO is a molecule with multiple biological effects that increases skin vascular permeability
in vivo (Gonzalez et al., 2003; Teixeira et al., 1993). The presence of NO in the feeding site
could explain the leakage of Evans blue stain and FITC-Dextran observed. The leakage of
plasma components into the adjacent tissues during vessel localization could simply
indicate the presence of a vessel in the neighborhood and/or could help to direct the insect
maxillae to the blood vessels following the chemical gradient created. The leakage of
plasma was so intense that impaired the use of FITC-Dextran to facilitate the measurement
of the vessel diameter after the feeding process.
The experiments to analyze vascular permeability during probing phase were
performed separately, in the border of the ear, where no venules or arterioles are suitable for
cannulation by insects. Vessel cannulation could also cause microhaemorrhagy, once
mechanical components are also involved in the process.
The occurrence of microhaemorrhages, mainly during probing and after removal of
the maxillae from the vessel, was previously observed by Lavoipierre et al. (1959). The
more evident microhemorrhagic points observed in rabbit skin after probing by R. prolixus
with intact salivary glands compared to salivarectomised bugs reinforce the influence of the
salivary antihemostatic activities in this phenomenon (Ribeiro and Garcia, 1981).
Arterioles and venules run parallel to each other in the mouse ear microcirculation
with the latter occupying a greater space (Eriksson et al., 1980). This fact could explain why
triatomines cannulate venules more frequently. As arterioles have thicker walls with less
capacity to deform, reductions in the lumen diameter as a consequence of cibarial pumping
are much less perceived. Therefore, in the present work, the analysis of vessel wall
movements was performed only in bugs feeding on venules.
The analysis of the vessel area variation during the engorgement phase showed the
synchronization between the cibarial pump electrical signals and the movements caused in
the vessel wall. The electrical signals could lag slightly behind the movements of the
cibarial pump muscles suggesting that there may be a small difference from absolute
synchrony between the cibarial pump muscles and the vessel wall movements. Even
though, the analysis showed that each signal of the cibarial pump produces one contraction
in the vessel wall. Moreover, the analysis also identified phenomena that occurred during
the feeding process such as regurgitation-like movements, variations in the blood ingestion
rate and the cibarial pump blood-filling time.
The cibarial pump produced electrical signals with different shapes during the
engorgement phase. They varied from a single peak to two completely separated peaks. The
double peaks and intermediary shapes were more often observed when the cibarial pump
frequency was lower. These findings could indicate an effort to contract the cibarial pump
muscles suggesting that the set of muscles are out of synchrony. Smith and Friend (1970)
also observed such difference in the spike shape of the signals produced by the cibarial
pump during the R. prolixus feeding process and stated in their work “it is noteworthy that
in our records we observed not two but many spike shapes during the course of one
feeding. It is not possible to see any pattern to their occurrence, and as yet we have no
explanation for the variability”.
The diameter of vessels used in the present study was compatible to the ones observed
in the dorsal surface of mice (Kalambur et al., 2004), which are usually used in blood feeding
studies in vector insects (Ribeiro, 2000). In these vessels, the strong reduction of the diameter
after cannulation was directly related to higher blood ingestion rates (higher pumping
frequency) that apparently prevented the vessel lumen completely filling with blood, forcing
the vessel to remain at a low functional diameter.
Lavoipierre et al. (1959) described the presence of regurgitation-like movements
during the triatomine feeding process especially at moments in which the insect interrupts
blood ingestion and starts to look for another vessel in order to continue feeding. In the
present work, the occurrence of regurgitation was observed throughout feeding, but was
more frequent in the second half of the engorgement phase.
Until this moment, we don’t know the origin of the regurgitated material that
apparently presents variation in composition. It could contain either saliva or even material
deriving from the anterior midgut. If it includes saliva, the reflux could be a mechanism to
disperse its molecules through the vessel. In case of contamination with intestinal material,
the phenomenon could have implications in the transmission of T. cruzi if the insect
interrupts the feeding process in an infected host and change to a second host in a short
time.
The simultaneous analysis of the electromyograms and the vessel wall movements
showed that the regurgitation is an involuntary event and is probably associated to a
momentary difficulty to redirect the blood to the intestine. The correct blood flow through
the anterior intestine depends on a finely tuned synchronisation between the cibarial pump
muscles (similar to a peristaltic movement) and the pharyngeal valve (Barth, 1952).
Considering that in triatomines there is no valve anterior to the cibarial pump avoiding
blood reflux, the occurrence of regurgitation could be related to problems in the
synchronization of this system.
In some experiments, a clear material released from the insect salivary canal into the
bloodstream was observed always with isolated or successive regurgitation-like
movements. When these phenomena occurred associated with successive regurgitation-like
movements, it is unlikely that the clear material is composed in part by saliva. If it were
saliva then the regurgitation-like movements would need to be coincident with the moment
in which saliva is released by the action of the salivary pump. One possibility is the
regurgitation of blood in a very low hematocrit, composed mostly by plasma.
In the vessels, the circulating blood was shown to be found in a specific gradient of
erythrocyte concentration, due to migration to the mainstream flow and away from the wall
of the vessel (Fahraeus-Lindqvist effect). The physical reason behind the Fahraeus-
Lindqvist effect is the formation of a cell-free layer near the wall of the tube (Cokelet and
Goldsmith, 1991). The layer is devoid of RBCs and has a reduced local viscosity. The core
of the tube, on the contrary, is rich with RBCs and has a higher local viscosity (Long et al.,
2004). The extent of the cell-free layer, which depends on the vessel size and hematocrit, is
a major factor that determines the apparent viscosity of blood. Therefore, the ability to
accurately locate the aperture of the feeding canal inside the vessel could be used by the
insect to control the haematocrit value and/or the viscosity of the ingested blood during the
feeding process. A previous study using an artificial feeding apparatus showed that an
increase in the viscosity of the diet caused a decline in both the frequency of the cibarial
pump and the average stroke volume of the pump (Smith, 1979).
Reduction in the blood pumping frequency observed during the feeding process in
all experiments (associated with the increased time to fill the cibarial pump) and the
changes in the spike potential shape of the electromyogram described in the present work
could be associated to changes occurring in the intestinal environment. Among these could
be haemostatic reactions triggered in the blood before or during ingestion (Araujo et al.,
2007) or the pressure caused in the abdomen by the volume of blood ingested (Guarneri et
al., 2000). This hypothesis is enforced by the fact that the blood supply increases at the
aperture of the maxillae during the feeding process, as seen by the constant increase in
vessel functional diameter. Araujo et al. (2007) has previously shown the influence of the
intestinal environment during triatomine feeding by depleting brasiliensin (an anterior
midgut anticoagulant) thus causing a reduction in the amount of blood ingested by the bugs.
Endothelium layer damage due to insertion of the insect mouthparts, abrupt vessel
wall pulsation and strong flow oscillation could explain the platelet deposition and the
leukocyte recruitment observed in the experiments. This microenvironment in the feeding
site is suitable for triggering blood coagulation and platelet aggregation that could also
cause an increase in blood viscosity (Puckett et al., 2005). In fact, sometimes it was
possible to observe the presence of an embolus inside the vessel in the feeding site (data not
shown). A significant increase in leukocyte recruitment was observed after removing the
bug mouthparts from the vessel lumen. The increase of leukocyte recruitment was possibly
influenced by the interruption of saliva deposition. However, this phenomenon may have
started at the beginning of the feeding process and is similar to the findings of Lavoipierre
et al. (1959) who observed in histological sections of host skin a “marked accumulation of
leukocytes surrounding the intracapillary portion of the R. prolixus stylets”.
Finally, the present work describes for the first time an association of the
electromyogram of the cibarial pump with a novel analysis of the images produced by the
intravital microscopy to study the feeding process of R. prolixus. Such association enables
the identification and a more in depth analysis of several phenomena seen during
haematophagy (including variation in vessel diameter, regurgitation-like movements and
different electrical signals produced by muscles of the cibarial pump). This forms an
important tool for elucidating parameters influencing insect blood feeding.
Acknowledgments
We would like to thank Alberto de Figueiredo Gontijo from Coltec/UFMG for the
help with the analysis of the electrical signals of the cibarial pump. This work was
supported by a grant from the Wellcome Trust (UK) and by the brazilian research agencies
FAPEMIG, CNPq and CAPES.
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Figure Legends
Fig. 1. Area showing vascular permeability alterations in the microcirculation of the ear
skin. A: leakage of Evans blue stain observed 15 min after R. prolixus probing. B: FITC-
Dextran leakage during R. prolixus bloodmeal. A- arteriole; V- venule; P- proboscide tip;
S- bite site.
Fig. 2. Electrical signals produced by the contractions of the cibarial pump and variation in
the vessel area (diameter) during the ingestion period of one of the five R. prolixus nymphs
analyzed. The venule area before cannulation was considered 100%. Each 25 points
represents one second. The red dashed line shows the time taken for the contraction of the
vessel wall. A: beginning of the feeding process, cibarial pump showing high frequency
activity; B: regurgitation-like movements (arrows); C: end of the feeding process, cibarial
pump showing low frequency activity. Legend: A – Artifact produced by the low pass
filter, P- single peak signal; PP- doubled peak signal; IP- intermediary peak signal; R-
regurgitation-like movements.
Fig. 3. Relationship between the frequency of contractions of the cibarial pump (dashed
line) and vessel diameter (continuous line) during the feeding process of one of the five R.
prolixus nymphs analyzed. The venule area before cannulation was considered 100%.
Arrows indicate the interruptions during feeding. A: Relationship throughout the whole
ingestion period of R. prolixus; B: Close view of the selected area in A (red box) showing
the variation in the functional diameter (FD) of the vessel during three periods with
different frequencies of cibarial pump contractions.
Fig. 4. Release of colourless material (arrows) by the maxillae inside the blood stream
influencing vessel diameter during the feeding process of one of the five R. prolixus
nymphs analyzed. Vessel area before cannulation was considered 100%.
Fig. 5. Platelet aggregation and leukocytes adhesion in the venule endothelium at 30 min
after completion of the R. prolixus blood-meal. V- venule; P- platelets; L- leukocytes.
Fig. 6. Leukocyte-endothelium interaction after R. prolixus third instar nymphs feeding in
the mouse ear (n=10). Leukocyte was quantified during 30 s in a 100 µm vessel segment.
A: rolling leukocytes. B: adherent leukocytes. * p<0.05 compared to the control group
(before contact with triatomines).
Video 1. Broad and slow movements of the maxillae inside the venule during the
engorgement phase. The original length of the video is 3 minutes, but it was condensed in
order to improve the visualization of the movements of the maxillae.
Video 2. Register of the feeding site 30 minutes after the R. prolixus bloodmeal showing
that platelet and leukocytes attached in the venule endothelium as well as one leukocyte
rolling.
Figure 1
Figure 2A
Figure 2B
Figure 2C
Figure 3A
Figure 3B
Figure 4
Figure 5
Figure 6A
Figure 6B
Table 1. Vessel diameter alterations (C=constriction; D=dilatation; NC=no change) elicited
by R. prolixus bugs after blood-feeding in the mice skin microcirculation.
Vessel diameter alterations
cannulated
venules
cannulated
arterioles
C=20%
D=50%
NC=30%
(n=10)
C=67%
D=22%
NC=11%
(n=9)
Anexo II
The role of salivary nitrophorins in the ingestion of blood by the triatomine bug Rhodnius
prolixus (Reduviidae; Triatominae)
Ricardo N. Araújo
1
, Adriana Soares
1
, Rafaela M. M. Paim
1
, Nelder F. Gontijo
1
, Alberto F.
Gontijo
2
, Michael J. Lehane
3
, Marcos H. Pereira
1*
1
Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
Minas Gerais, Av. Antônio Carlos 6627, Belo Horizonte, MG, Brazil, CEP 3120-901.
2
Colégio Técnico da Universidade Federal de Minas Gerais, Av Antônio Carlos, 6627,
31270-901, Belo Horizonte, MG, Brazil.
3
Liverpool School of Tropical Medicine, Pembroke Place, Liverpool, L3 5 QA, U.K.
*Corresponding author: Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas,
UFMG, Bloco I4, Sala 177, Av. Antônio Carlos 6627, Belo Horizonte, MG, Brazil, CEP
3120-901. Tel: +55 31 3499-2867; Fax: +55 31 3499-2970; email: marcoshp@icb.ufmg.br
Abstract
To assist haematophagy, Rhodnius prolixus produces several bioactive molecules in its
saliva which it injects into the host skin. The most abundant of these molecules are the
nitrophorins (NPs). In this work, we reduced the expression of NP1-4 in the saliva of R.
prolixus by RNAi and evaluated the subsequent feeding performance of the bugs using the
cibarial pump electromyogram either on the dorsal skin or the tail vein of the mice. NPs
salivary mRNA was reduced by >99% in comparison to controls. Saliva from knockdown
nymphs also presented 82% less haemproteins while the total protein was not reduced.
Knockdown nymphs feeding on the skin had lower ingestion rates mainly due to the longer
cumulative probing time and lower cibarial pump frequency. Another difference was that
knockdown insects bit ~5 times more. No differences were observed between groups fed on
the tail vein. When the feeding sites were compared, nymphs fed on the tail vein had higher
effective ingestion rates. These findings endorse the importance of the NPs for the ability of
bugs to complete the meal in a short total contact time with a low number of bites,
decreasing the perception of the insect by the host.
Keywords: Rhodnius prolixus, saliva, Nitrophorin, RNAi, Feeding performance, vector,
electromyogram.
1. Introduction
Triatomines are haematophagous insects and the vectors of Trypanosoma cruzi, the
causative agent of Chagas’ disease in the Americas. All nymphal and adult stages feed
exclusively on blood.
Feeding from vertebrates is a dangerous business and evolutionary pressures act on
insects to minimize contact time (Rossignol et al., 1985). Triatomine bugs are vessel
feeders, obtaining their blood meals directly from the blood vessels (venules or arterioles)
of their vertebrate hosts (Lavoipierre et al., 1959). Contact with the host occurs only during
feeding, which usually takes 20-30 min. The contact time is influenced by the blood
ingestion rate, which varies among triatomine species and developmental stage as well as
physiology of the host (Guarneri et al., 2000; Sant'Anna et al., 2001; Guarneri et al., 2003).
Triatoma infestans and Rhodnius prolixus, the main vectors of T. cruzi in Americas, have
higher ingestion rates which enable them to reach higher population densities inside human
dwellings (Pereira et al., 2006).
In order to enhance the efficiency of the feeding process the triatomine bugs
produce several bioactive molecules in their salivary glands which they inject into the host
skin (Ribeiro e Garcia, 1980). Among these molecules, the most abundant in R. prolixus
are four haemproteins called nitrophorins (NPs). There are seven different NPs named 1 to
7 that comprise about 50% of the salivary gland content. The most studied are NPs 1 to 4,
which are multifunctional molecules with a reddish colour because of the presence of the
haem group which is capable of binding nitric oxide (NO) (Champagne et al., 1995). At the
pH of saliva the NPs are found bound to NO, but when saliva is injected into the skin
during blood-feeding the pH shifts to about 7.4 causing the release of NO from NPs
(Champagne, 2005). Most of the NPs biological activities are related to NO which, once
released in the host tissues, can act as vasodilator and platelet aggregation inhibitor
(Andersen et al., 2005). NPs also have biological activities that are not related to NO. NPs
can bind histamine released by mast cells preventing swelling and pain that would
otherwise elicit host defensive responses (Andersen et al., 2005). Also, NP2 is a potent
anticoagulant acting by binding directly with factor Xa and interfering in its interaction
with factor VIIIa or with the phospholipid membrane (Ribeiro et al., 1995).
Most of the NP activities were described and identified using saliva or recombinant
proteins that were assayed in vitro. Despite the number of studies on the NPs, there is a lack
of knowledge about the influence of the proteins during hematophagy in live hosts. In order
to study the influence of specific salivary genes in the feeding process, our group developed
the RNAi technique for use in triatomines bugs (Araujo et al., 2006). Here we have used
RNAi to knock down expression of the four salivary NPs. As in this study RNAi can be
linked to other methods of studying feeding performance, such as the electromyogram of
the cibarial pump (Friend and Smith, 1971; Guarneri et al., 2000), giving a powerful
method of performing in vivo studies on salivary gland proteins in the feeding process.
2. Methodology
2.1. Triatomine bugs
Rhodnius prolixus (Honduras) were reared under conditions of controlled
temperature (28 ± 2.0ºC) and humidity (60 ± 5.0%) in 12/12 hours light/dark and fed
weekly on chickens or rats. The fourth instar specimens used in the experiments had similar
physiological status (10 ± 2 days after moult).
2.2. RNA extraction and cDNA synthesis
RNA from six salivary glands was extracted using the RNeasy Micro Kit (Qiagen)
according to the manufacturers instructions. The RNA was eluted in 11 µl of ultra pure
water and 8 µl were used for cDNA synthesis with 0.5 µg of random hexamers (Promega)
using the M-MLV reverse transcriptase system (Promega) in a final volume of 12.5 µl. This
procedure was used to produce cDNA for both PCR and qPCR.
2.3. Double stranded RNA synthesis
One microliter of the cDNA from the salivary glands was amplified by PCR using
specific primers (Araujo et al., 2006) conjugated with 23 bases of the T7 RNA polymerase
promoter at the 5’ end (5’ taatacgactcactatagggaga 3’). PCR was carried out for 35 cycles
(94ºC for 30 s, 60ºC for 30 s, 72ºC for 45 s) in the presence of 200 nM of each primer, 200
µM of deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) and 1 unit of Taq Phoneutria (Phoneutria)
in a final volume of 20 µl. The PCR products were used as template for double-stranded
RNA (dsRNA) synthesis using the T7 Ribomax Express RNAi System (Promega). After
synthesis, the dsRNA was isopropanol-precipitated, eluted in ultra pure water and
quantified by 260 nm wavelength spectrophotometry. The quality of the dsRNA products
was verified by 2.5% agarose gel eletrophoresis. The dsRNA was kept at -80ºC until use.
2.4. Delivery of dsRNA
Nymphs were injected laterally into the thoracic hemocoel with a 48-h interval
between injections (Araujo et al., 2006). Each fourth instar in a knockdown group was
injected twice with 2.6 µg of each NP1-4 dsRNA (10.5 µg of NPs dsRNA on total) diluted
in 1.4 µl of saline solution (0.9% NaCl). Bugs from the control group received two
injections of 1.4 µl of saline alone. Forty-eight hours after the second injection, nymphs
were fed on hamsters or had their glands extracted for RNA isolation.
2.5. Verification of knockdown by qPCR
PCR was carried out using cDNA pools of three nymphs (six salivary glands) from
each group. Each of these pools represented one replicate. Primers used for qPCR are
shown in Table 1. Reactions were performed using the Power SYBR
Green PCR Master
Mix (Applied Biosystems) and the ABI PRISM 7300 Sequence Detection System (Applied
Biosystems). Each reaction was run in duplicate and contained 0.5 µl of reverse
transcription reaction along with 300 nM primers in a final reaction volume of 25 µl.
Amplification conditions were: 95
o
C for 10 min, then 40 cycles of 95
o
C for 15 s and 60
o
C
for 1 min. To ensure that only a single product was amplified, the melting curve analysis
was performed and all PCR products were run on a 2.5% agarose gel. The relative amount
of gene product in each sample was determined using the established 2
-∆∆Ct
method (Livak
and Schmittgen, 2001) using the 18s ribosomal RNA (RR18s) housekeeping gene as a
loading control.
2.6. Citrated plasma recalcification time assay
Salivary glands were dissected in saline solution (0.9% NaCl) and transferred to ice-
cold microcentrifuge tubes containing 30 µl of HEPES/NaCl buffer (20 mM HEPES–
100 mM NaCl, pH 7.4). Glands were disrupted and centrifuged for 3 min at 12,000g. The
supernatant containing the saliva was transferred to a new tube and diluted to 1:4 with
HEPES/NaCl buffer. For the assay, 30 µl of the diluted samples was added to 96-well
plates and incubated with 30 µl citrated (0.38% trisodium citrate) human plasma at 37
o
C for
5 min. After incubation, coagulation was triggered by addition of 30 µl of pre-warmed 25
mM CaCl
2
. Since plasma clotting provokes an increase in the turbidity, it was possible to
follow the reaction with a microplate reader (Bio-Rad Benchmark) adjusted to kinetic mode
with readings at 655 nm every 10 s at 37
o
C. The coagulation time value was defined as the
time taken for the turbidity to achieve an absorbance reading of 0.025 absorbance units.
The absorbance at zero time was taken as zero absorbance units (Ribeiro, 2000).
2.7. Apyrase activity assay
Salivary glands were dissected in saline solution (0.9% NaCl) and transferred to ice-
cold microcentrifuge tubes containing 30 µl of HEPES/NaCl buffer pH 7.4. Glands were
disrupted and centrifuged for 3 min at 12,000g. The supernatant containing the saliva was
transferred to a new tube. For the assay, 0.5 µl of samples were added to HEPES/NaCl
buffer pH 7.4 to a final volume of 20 µl. These 20 µl aliquots were added to 80 µl
HEPES/NaCl buffer pH 7.4 containing 2 mM ATP and 5 mM CaCl
2
and incubated at 37
o
C
for 20 min (Ribeiro et al., 1998). After incubations, inorganic phosphate was measured
using a commercial kit (Labtest Diagnostica, Brazil) based on the method described by
Baginski et al. (1967).
2.8. Salivary haemprotein content
Salivary glands from individual bugs were collected and disrupted in 30 µl of
HEPES/NaCl buffer pH 7.4. For the measurements, 1 µl of samples were diluted to 1:70
with PBS pH 7,4 and read at 404 nm wavelength in a spectrophotometer (Shimadzu UV-
1650 PC) (Velenzuela et al., 1995). The absolute absorbance values were compared
between knockdown and control groups.
2.9. Protein quantification
The total amount of protein in samples was quantified (Bradford, 1976) using BSA
as control.
2.10. Electromyogram of the cibarial pump
The technique used to study feeding behaviour was modified from Guarneri et al.
(2003). Swiss mice, anesthetized intraperitoneally with a mixture of Ketamine and
Xylazine (Agener União; 150 and 10 mg/kg, respectively), were used as hosts. One
electrode was fixed to the host and a second electrode was connected to a metal mesh,
which was fixed inside a container used as substrate for the insects. These two electrodes
detected an electrical signal from the cibarial pump that was recorded via a digital data
acquisition plate (ADC100†-Pico Technology Limited, UK) connected to an IBMAT
compatible microcomputer. The insects were fed on the dorsal surface or lateral tail vein of
the host. The insects were weighed immediately before (initial weight, mg) and after
feeding to determine weight gain (mg). Each insect was allowed to feed until it removed its
mouthparts without trying to probe again within 1 minute. The engorgement phase was
defined as beginning after at least ten consecutive characteristic peak-like signals attributed
to the cibarial pump contractions. From the cibarial pump records, the total contact time
was defined as the time during which the insect mouthparts remained inserted into the host
skin. Non-ingestive time, initial cumulative probing time and interruption time was also
determined. Non-ingestive time was defined as the time when insects were not pumping, so
probing time plus any interruption to feeding comprised this time. Initial cumulative
probing time was defined as the sum of the times from the first insertion of the mouthparts
into the host up to the beginning of the engorgement phase and the last probing time being
the time from the last bite until the start of the engorgement phase. If the bug ended an
initial probing and restarted another one elsewhere, the first probing time was added to the
second and so on. The interruptions were defined as a stop for more than 4 seconds in the
blood pumping after the engorgement phase had begun. Interruption time was defined as
the sum of time from all interruptions. Pump frequency represents the total number of
cibarial pump contractions divided by the effective contact time (time in which the pump
was effectively working, without probing or interruptions). Total ingestion rate was
calculated by dividing the weight gain by the total contact time and the effective ingestion
rate by dividing the weight gain by the effective contact time. The number of bites was also
counted for each insect.
Software that works under a Matlab (version 6.5.0) environment was developed to
analyze the records of the electromyogram of the cibarial pump. This software enables the
analysis of the frequency spectrum from signals generated by the cibarial pump in relation
to the time of feeding.
2.11. Data and statistical analysis
Data is represented as average ± standard error. The Kolmogorov-Smirnov test was
used to identify variables with normal distribution which were then compared by Student’s
t test or analysis of variance (ANOVA). In the case of ANOVA, post hoc comparisons were
made using the Tukey test. The non-parametric Mann-Whitney test was used for variables
with non-normal distribution. P<0.05 was considered significant.
3. Results
3.1. Expression of NPS
The level of expression of the NPs in fourth instar nymph salivary glands was
verified by qPCR (Fig. 1). The analysis showed that the most abundant transcripts were
NP2, NP1 and NP4 all of which were expressed at similar levels compared to NP3 which is
expressed at levels more than 100 fold lower than any of the other NPs.
3.2. RNAi mediated knockdown of NPs
To analyze, in vivo, the role of the NPs in blood feeding, we produced a knockdown
phenotype in R. prolixus using RNAi. All 4 NPs were knocked down simultaneously in the
same bugs. The mRNA levels determined by qPCR of salivary glands 48 hours after the
second injection detected a reduction greater than 99% in the mRNA of all four NPs from
knockdown nymphs when compared to the saline controls (Fig. 1).
Reduction of the NPs in the saliva was confirmed after nymphs were fed on
anesthetized hamsters and subsequently moulted to the next instar. This process is
necessary in order to force the nymph to deplete the stocked saliva and replenish the gland
with new saliva lacking in NPs (Araujo et al., 2006). Seven days after the moult, the glands
were extracted and the colour phenotype for knockdown nymphs appeared a light red while
controls remained the normal dark red colour characteristic of the presence of NPs in the
salivary glands (Fig. 2A). The total protein content was similar between groups (t test, not
significant - n.s.; Table 2). On the other hand, the amount of haemproteins in the salivary
glands was significantly reduced (t test, p<0.01) in the knockdown group with
spectrophotometric readings 82% lower than controls (Table 2). The reduction of about
three fold in the inhibition effect on plasma recalcification (t test, p<0.01) reflects the
reduction in NP2 (the unique NP with anticoagulant activity) in the knockdown group
(Table 2). We tested whether the knockdown of NPs might have affected the levels of
apyrase enzyme in saliva, but the activity remained unchanged (t test, n.s.) (Table 2).
The SDS-PAGE analysis of salivary contents also showed that bands of
approximately 20 kDa (estimated molecular weight of NPs) were less intense in the
knockdown group (Fig. 2B). As expected, other bands appeared stronger in the gel of the
knockdown group, as easily seen in the bands at ~ 26, 38, 60 and 75 kDa.
3.3. Feeding performance of knockdown and control groups fed on the dorsal surface of the
mouse
Feeding behaviour analyzed by cibarial pump electromyogram is shown in Table 3.
After feeding on the dorsal surface of the mouse, nymphs from control and knockdown
groups had similar weight gains (t test, n.s.). However, knockdown nymphs had a
significantly lower ingestion rate (t test, p<0.01) needing longer total contact time (t test,
p<0.05) to ingest the same amount of blood. The ingestion rate was mainly influenced by
the non-ingestive time and cibarial pump frequency. The non-ingestive time was
significantly higher (MannWhitney, p<0.05) in knockdown bugs, mostly due to an increase
in parameters related to initial probing in this group.
The parameters related to the number of bites (Table 3) and initial cumulative
probing time (Fig. 3A) showed great differences between groups. On average, nymphs
from the control group bite only once compared to 5.5 ± 1.7 times in the knockdown group
(t test, p<0.05). For the knockdown group 4.5 ± 1.6 bites were necessary to cannulate the
first vessel. Five nymphs from the knockdown group stopped the feeding process by
removing their mouthparts from the host and bit again cannulating a second vessel; one of
them performed three cannulations. The initial cumulative probing time was significantly
longer (t test, p<0.01) in the knockdown group (5.1 ± 1.2 min) being about 3.5 fold longer
than the control (1.1 ± 0.3 min). However, the time spent between the last bite and the
cannulation of the first vessel (last probing) was similar to the one observed for the control
group (t test, n.s.; Fig. 3B). Within the second minute of probing on mice, 82% of the bugs
(nine nymphs out of 11) from the control group started to ingest blood, whereas only four
knockdown insects from the 13 tested found the vessel (Fig. 3).
Knockdown of NPs also lowered the frequency of contraction of the cibarial pump
in knockdown bugs (t test, p<0.05). Although there was no statistical difference between
groups in the number or time of interruptions (t test, n.s.), it is interesting to note that two
nymphs from the control and six nymphs from the knockdown group presented some kind
of interruption during feeding. These six knockdown insects included the five nymphs that
cannulated more than one vessel to complete haematophagy.
3.4. Feeding performance of knockdown and control groups fed on the lateral tail vein of
the mouse
Given that bugs were placed directly on the top of the lateral tail vein, it is perhaps
not surprising that they bite only once and showed practically no probing (Table 3). None
of the other feeding parameters analyzed showed a significant difference between
knockdown and control groups fed on the lateral tail vein (Table 3). Not even in the
frequency, which in addition to parameters related to probing, was significantly affected by
the lack of NPs when nymphs fed on the dorsal surface. These findings suggest that the
lateral tail vein is an easier feeding site.
3.5. Influence of the feeding site on bugs performance
After feeding on the mouse lateral tail vein, nymphs from control and knockdown
groups had similar weight gains (ANOVA, n.s.). The significantly higher effective
ingestion rates (Tukey, p<0.05) observed in nymphs fed on the tail vein was due to the lack
of interruptions during feeding and the significantly higher frequency of the cibarial pump
(Tukey, p<0.05) compared to bugs fed on the dorsal surface of the mouse.
In addition to the lower cibarial pump frequency, the difficulty in obtaining blood
from the dorsal surface was also evident in the rhythm of contractions and shape of the
electrical signals generated by the cibarial pump during the feeding process. When the
contractions were arrhythmic and the electrical signal showed irregular shapes (two peaks
or intermediary forms between one or two peaks) a strong noise is observed in the graph of
the frequency spectrum with time, as observed for nymphs fed on the dorsal surface (Fig.
4A and B). The cibarial pump from nymphs fed on the lateral tail vein contracted
rhythmically and generated regular electrical signals (single peak signals) that generated
lower noise on the frequency spectrum with time, as shown in figures 4C and D. These
different patterns of cibarial pump functioning were clear when the frequency spectrum
from nymphs that changed vessel during the engorgement phase were analyzed (Fig. 4E).
In these experiments, the feeding profile initially showed high levels of noise and was
suddenly modified to a low noise spectrum in consequence to a change in the signals
generated by the contraction of the cibarial pump (Fig. 4E1 and 4E2). This modification
normally occurred when the bugs cannulated and started feeding on a second vessel and
suggests that nymphs changed to a vessel with a larger diameter.
4. Discussion
R. prolixus obtain their blood-meals directly from arterioles or venules of their
vertebrate hosts. The feeding efficiency is directly influenced by activities of the saliva
(Ribeiro et al., 1998), which is continuously released into the host skin and vessels during
the whole feeding process (Soares et al., 2006).
The salivary SDS-PAGE analysis showed a reduction in bands around 20 kDa but
an increase in the intensity of bands of other molecular weights. This finding demonstrates
that knockdown bugs maintain the total protein dosage in their saliva. This compensation is
remarkable as NPs comprise about 50% of the total salivary proteins (Champagne et al.,
1995) and the level of NP reduction was about 82%. These findings suggest that
knockdown of abundant proteins like NPs may free the cellular machinery and resources to
overproduce other proteins.
In the control group fed on the mouse’s dorsal surface, all nymphs required just a
single probe. Conversely, most knockdown nymphs (8 out of 13) probed from 2 to 20 times
before cannulating the first vessel. This made the initial cumulative probing time longer for
knockdown bugs than controls. However, the time spent between the last probe and the
cannulation of the first vessel was similar in knockdown and control groups. These results
clearly demonstrate that knockdown nymphs had problems in finding the vessel. Increase in
probing time has been previously observed in R. prolixus with salivary glands removed
(Ribeiro and Garcia, 1981) or with the salivary gland infected by T. rangeli (Garcia et al.,
1994). The data surrounding probing suggests that R. prolixus may behave similarly to
mosquitoes when looking for a vessel. A. aegypti females thrust at seven second intervals.
If this search results in success, feeding ensues. Alternatively, the mosquito “desists”, the
mouthparts stylets are withdrawn, and the mosquito attempts to feed at another site (Ribeiro
et al., 1985a).
In Anopheles mosquitoes, shorter probing times have been associated with
inhibition of platelet aggregation during the feeding process (Li et al., 1992) and correlated
negatively with apyrase activity (Ribeiro et al., 1985b). R. prolixus has a potent apyrase
but NPs also have a role in platelet aggregation inhibition. Besides these activities, NO
promotes an increase in vascular permeability (Gonzalez et al., 2003) and dilation that
could accelerate discovery of the vessel (Champagne, 2005). The leakage of plasma
components into the adjacent tissues could assist blood location by simply indicating the
presence of a vessel in the neighborhood and/or could help to direct the insect maxillae to
the blood vessels following the chemical gradient created.
In both knockdown and control nymphs, feeding performance was better on the
lateral tail vein. The mouse lateral vein is a thick vessel (diameter > 500 µm) while the
venules and arterioles in the skin of the mouse dorsal surface measure on average 38 and 20
µm, respectively (Kalambur et al., 2004). Blood flow is directly related to the diameter of
the vessel (Ushiyama et al., 2004) so that higher blood flows near the mouthparts can be
achieved when bugs are feeding in larger vessels. This fact probably explains why
knockdown nymphs lacking in NPs have no difficulty in feeding from the tail. These
findings suggest that the insect modulates the initial frequency of the cibarial pump based
on the blood availability around its mouthparts.
The ease with which nymphs feed on the tail vein enables this system to be used as
a model of favorable feeding condition when studying feeding behaviour of hematophagous
solenophagic insects. The artificial feeder was previously used as the best feeding source,
but the tail vein approach is preferable for triatomine species that do not feed well on an
artificial apparatus (Guarneri et al., 2000).
The lack of NPs also affected the frequency of cibarial pump contractions which
was lower in knockdown bugs fed on the dorsal surface of the mice. This fact reflects the
difficulty these insects had in maintaining a satisfactory blood flow around the mouthparts.
NPs are able to induce vasodilatation along a greater length of the vessel and during longer
periods of time, acting in the area surrounding the skin environment including adjacent
vessels (Champagne, 2005). Moreover, saliva is released during the whole feeding process
(Soares et al., 2006) increasing the action of NO in vessel dilatation. As platelet
aggregation was previously described as most important in small vessels (Mustard and
Packham, 1977; Ribeiro and Francischetti, 2003) such as the ones from the dorsal surface
of the mice (Kalambur et al., 2004), the maintenance of the frequency could be also related
to the NPs anti-platelet aggregation activity modulated through NO (Moncada et al., 1991).
By feeding on the dorsal surface of the mice, nymphs had a diverse range of vessel
diameters to cannulate (Kalambur et al., 2004, Ushiyama et al., 2004). This diversity also
occurs in other areas of the host where previous feeding behaviour experiments were
performed, such as the ventral surface, and could explain the great variation in the
electromyogram results among different specimens (Guarneri et al., 2000; Sant'Anna et al.,
2001; Guarneri et al., 2003). In addition, nymphs can also change the vessels they are
cannulating during the feeding process, hence modifying substantially several parameters
analyzed by the electromyogram.
In the genus Rhodnius, the haemprotein profile is different between species (Soares
et al., 2000). This difference in NP profile, in addition to other mechanical parameters of
the mouthparts and cibarial pump, could help to explain the differential feeding
performance observed between species such as why R. prolixus is more effective in
ingesting blood in mammals and birds than other species such as R. robustus, R. nasustus
and R. neglectus (Sant’Anna et al., 2001). The intestinal environment could also be
involved in these differences in efficiency as our group has demonstrated the influence of
intestinal anticoagulant in determining the efficiency of blood ingestion by T. brasiliensis
(Araujo et al., 2007).
Overall feeding performance depends on factors related to skin microcircultation as
discussed above, as well as on the composition of the saliva. However, under the
circumstances of our studies differences in feeding performance did not result in
differences in nutrition as measured by weight gain of the bugs. However, difference in
feeding performance did affect total contact time necessary for successful feeding. Similar
findings were also reported by Ribeiro and Garcia (1981). This is important as reproductive
success of bugs in the field will not only be determined by how much blood they ingest but
also by their survival through the feeding process. Clearly increased host contact time will
be inversely related to bug survival and NPs play a central role in minimizing host contact
time.
Aknowledgements
This work was supported by the Wellcome Trust and the Brazilian agencies CAPES,
FAPEMIG and CNPq.
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carrying hemoprotein) in the bedbug Cimex lectularius. J Exp Biol 198, 1519-1526.
Figure Captions
Fig. 1. Relative levels of NP transcripts in the salivary glands from fourth instar nymphs of
the control and knockdown group as measured by qPCR 48 hours after the second
injection. The results are represented as mean ± standard error of seven replicates. Each
replicate consisted of a pool of three nymphs (three pairs of glands). NP2 expression was
arbitrarily set to 100%.
Fig. 2. (A) Salivary glands from control and knockdown groups showing the change in
colouration following RNAi knockdown of NPs. (B) 15% SDS-PAGE analysis of the
salivary contents from control and knockdown groups. A pool of 14 salivary glands was
prepared and 1/3 of a gland was loaded in each gel. Brackets indicate proteins of around 20
kDa (NPs estimated molecular weight) – note the decrease in band intensity in RNAi
knockdown bugs. Arrows indicate bands stronger in the knockdown group. Glands were
extracted 7 days after moult to the fifth instar.
Fig. 3. Rank order of initial cumulative probing time (A) and last probing time (B) for fifth
instar nymphs of R. prolixus from control and RNAi knockdown groups fed on the dorsal
surface of the mouse.
Fig. 4. Frequency spectrum with time produced by cibarial pump contractions from
knockdown (A) and control (B) nymphs fed on dorsal surface and knockdown (C) and
control (D) nymphs fed on the lateral tail vein. (E) shows a change in the noise of the
frequency spectrum in a knockdown nymph fed on the dorsal surface. (E1-2) shows the
electrical profiles of the cibarial pump contractions observed in (E). Arrhythmic
contractions with irregular electrical signal are shown in (E1) and rhythmic contractions
with regular electrical signal are shown in (E2). Besides the information in the two axes
plot, the colours represent the magnitude of occurrence of each frequency in the scale
presented in the top of the figure.
Figure 1
Figure 2A
Figure 2B
Figure 3A
Figure 3B
Figure 4
Tables
Table 1 – Primers used for qPCR.
Gene
Forward
5’ → 3’
Reverse
5’ → 3’
Amplicom
(bp)
NP1
tttgctgcagtgggtgtaag
agttgcccgacgttacatct
334
NP2
catatgtttgcgggaaggat
atcgtactggcacccaagat
163
NP3
aacccagtgcaacggttaaa
ctccaccaattggcattttt
185
NP4
ttaaaa
gcgccgtatctgct
agaacgtcaaatgtctctttacct
248
rRNA 18s
cctgcggcttaatttgactc
gtacaaagggcagggacgta
468
Table 2 – Protein quantification, haemprotein analysis, anticoagulant and apyrase activities
from salivary glands of knockdown and control groups (average ± standard error; n=13).
Glands were extracted 7 days after moult to fifth instar.
Control
Knockdown
t test
Salivary gland protein (ug/nymph)
60.9
±
5.0 50.9
±
5.4
n.s.*
Salivary gland hemeprotein (Abs 404 nm)
0.72
±
0.09 0.13
±
0.02
p<0.01
Saliva coagulat
ion time (sec)
940
±
110 355
±
67
p<0.01
Salivary apyrase activity (ug of Pi released)
5.3
±
0.7 6.0
±
0.7
n.s.
*n.s. – not significant, p>0.05.
Table 3 – Feeding behaviour, evaluated by cibarial pump electromyogram, of R. prolixus on mice.
Feeding site
Dorsal
surface
Lateral tail vein
Group
Control
(n=11)
Knockdown
(n=13)
Control
(n=18)
Knockdown
(n=10)
Initial weigh (mg)
52.1
±
5.7 50.0
±
1.8 45.9
±
2.0 51.0
±
3.3
Total number of bites
1.0
±
0.0 5.5
±
1.7
1
1
Bites until first cannulation
1.0
±
0.0 4.5
±
1.6
1
1
Number of interruptions
0.5
±
0.3 1.7
±
0.6
0
0
Interruption time (min)
0.3
±
0.2 1.8
±
0.8
0
0
Non ingestive time (min)
1.4
±
0.3 6.9
±
1.5
0
0
Total contact time (min)
20.7
±
1.7 43.9
±
7.8 17.4
±
1.0 18.1
±
1.9
Frequency (contractions/se
c)
3.7
±
0.2 2.7
±
0.4 4.7
±
0.1 4.5
±
0.2
Weigh gain (mg)
237
±
18 229
±
16 270
±
9 242
±
13
Total ingestion rate (mg/min)
11.8
±
0.9 7.3
±
1.2 16.0
±
0.7 14.8
±
1.6
Effective ingestion rate (mg/min)
12.8
±
0.9 8.6
±
1.2 16.0
±
0.7 14.8
±
1.6
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