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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Análise da resposta antioxidativa de células in vitro de fumo (Nicotiana tabacum
cv BY-2) submetidas ao metal pesado níquel
Georgia Bertoni Pompeu
Piracicaba
2005
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Ecologia de Agroecossistemas. Àrea de
concentração: Ecologia de Agroecossistemas
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Georgia Bertoni Pompeu
Engenheira Agrônoma
Análise da resposta antioxidativa de células in vitro de fumo (Nicotiana tabacum cv BY-2)
submetidas ao metal pesado níquel
Piracicaba
2005
Orientador:
Prof. Dr. RICARDO ANTUNES DE AZEVEDO
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em
Ecologia de Agroecossistemas. Área de concentração: Ecologia
de Agroecossistemas
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Pompeu, Georgia Bertoni
Análise da resposta antioxidativa de células in vitro de fumo (Nicotiana tabacum cv
BY-2) submetidas ao metal pesado níquel / Georgia Bertoni Pompeu. - - Piracicaba, 2005.
97 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2005.
1. Antioxidante 2. Enzima 3. Estresse 4. Fumo 5. Metais 6. Níquel 7. Poluição do solo –
Remediação I. Título
CDD 633.71
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
4
"...O relógio
O relógio de Nasrudin vivia marcando a hora errada.
- Mas será que não dá para tomar uma providência? - alguém comentou.
- Qual providência? - falou Mullá.
- Bem, o relógio nunca marca a hora certa. Qualquer que seja a providência já será uma
melhora.
Nasrudin deu uma martelada no relógio. O relógio parou.
- Você tem toda a razão - disse ele. - De fato, já dá para sentir uma melhora.
- Eu não quis dizer "qualquer providência", assim literalmente. Como é que agora o
relógio pode estar melhor do que antes?
- Bem, antes ele nunca marcava a hora certa. Agora, pelo menos, duas vezes por dia ele
vai estar certo.
Moral: É melhor estar certo algumas vezes do que jamais estar certo.
Khawajah Nasr Al-Din
século XIV
Turquia
História da tradição Sufi ou sufismo, seita religiosa ou de sabedoria de vida, de antiga tradição
persa e que se espalha no mundo até hoje.
(Os 100 melhores contos de humor da literatura universal, Flávio Moreira da Costa, Ediouro,
546p., 4ª edição, 2001)."
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Ricardo Antunes de Azevedo, pelas oportunidades, pela confiança e pela amizade;
Ao Prof. Dr. Victor Alexandre Vitorello, pela colaboração e apoio;
Ao Dr. Renato Rodrigues Ferreira, pela amizade e pelo apoio;
À Dra. Salete Aparecida Gaziola, pela amizade e pelo apoio;
Aos amigos do Laboratório de Genética Bioquímica de Plantas, Yolanda, Cileide, Vanderlei,
Alejandro, Rafael, Bertha, Ariane, Zé Carmezini, Carol, Marina, Marston e em especial, Fabrício,
Rui, Priscila e Carlos;
Aos amigos do Laboratório de Biologia Celular e Molecular, Flávia, em especial e Vanderlei;
Aos professores e funcionários do programa;
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudo;
À Esalq, pela formação profissional e realização pessoal;
Aos meus pais, Jorgino e Ivone, pelo apoio e compreensão, aos meus irmãos, Ricardo e Marcelo,
pela amizade, ao André, pelo companheirismo e ao meu filho Lucas, pelo amor incondicional.
6
SUMÁRIO
RESUMO.........................................................................................................................................8
ABSTRACT.....................................................................................................................................9
1 INTRODUÇÃO...........................................................................................................................10
2 DESENVOLVIMENTO..............................................................................................................11
2.1 Revisão de literatura.................................................................................................................11
2.1.1 Metais pesados.......................................................................................................................11
2.1.2 O níquel nas plantas...............................................................................................................13
2.1.3 Mecanismos de defesa das plantas em resposta à exposição a metais pesados.....................16
2.1.3.1 Sistema oxidante de resposta..............................................................................................17
2.1.3.2 Enzimas antioxidantes........................................................................................................18
2.1.3.2.1 Superóxido dismutase (SOD)..........................................................................................18
2.1.3.2.2 Catalase (CAT)................................................................................................................19
2.1.3.2.3 Glutationa redutase (GR).................................................................................................21
2.1.3.2.4 Glutationa-S-transferase (GST).......................................................................................22
2.1.3.2.5 Guaiacol peroxidase (GPX).............................................................................................22
2.1.3.2.6 Ascorbato peroxidase (APX)...........................................................................................23
2.1.4 Nicotiana tabacum cv BY-2..................................................................................................24
2.2 Materiais e métodos..................................................................................................................25
2.2.1 Material biológico..................................................................................................................25
2.2.2 Meio de cultura......................................................................................................................25
2.2.2.1 Meio completo líquido........................................................................................................25
2.2.2.2 Soluções..............................................................................................................................26
2.2.2.2.1 Solução B1-Inositol.........................................................................................................26
2.2.2.2.2 Solução Mullers 1............................................................................................................26
2.2.2.2.3 2,4-D (estoque 10 mM)...................................................................................................26
2.2.3 Cultivo de células..................................................................................................................26
2.2.4 Experimento básico...............................................................................................................27
2.2.5 Extração protéica...................................................................................................................27
2.2.6 Determinação de proteínas....................................................................................................27
7
2.2.7 Atividade das enzimas antioxidantes.....................................................................................28
2.2.7.1 Atividade de superóxido dismutase (SOD)........................................................................28
2.2.7.1.1 Atividade em PAGE não-desnaturante............................................................................28
2.2.7.1.2 Determinação das isoenzimas de SOD............................................................................29
2.2.7.2 Atividade de catalase (CAT)..............................................................................................30
2.2.7.2.1 Atividade em espectrofotômetro.....................................................................................30
2.2.7.2.2 Atividade em PAGE não-desnaturante............................................................................30
2.2.7.3 Atividade de glutationa redutase (GR)...............................................................................30
2.2.7.3.1 Atividade em espectrofotômetro.....................................................................................31
2.2.7.3.2 Atividade em PAGE não-desnaturante............................................................................31
2.2.7.4 Atividade de glutationa-S-transferase (GST).....................................................................31
2.2.7.4.1 Atividade em espectrofotômetro.....................................................................................31
2.2.7.5 Atividade de guaiacol peroxidase (GPX)...........................................................................32
2.2.7.5.1 Atividade em espectrofotômetro.....................................................................................32
2.2.7.6 Atividade de ascorbato peroxidase (APX).........................................................................32
2.2.7.6.1 Atividade em espectrofotômetro.....................................................................................32
2.2.8 Peroxidação de lipídios..........................................................................................................32
2.2.9 Gel SDS-PAGE.....................................................................................................................33
2.2.10 Delineamento experimental.................................................................................................34
2.3 Resultados.................................................................................................................................34
2.3.1 Determinação das concentrações tóxicas e/ou estimuladoras do crescimento das células
in vitro...................................................................................................................................34
2.3.2 Atividade de superóxido dismutase em PAGE não-desnaturante.........................................42
2.3.2.1 Atividade de SOD em PAGE não-desnaturante................................................................42
2.3.2.2 Isoenzimas de SOD............................................................................................................42
2.3.3 Atividade de catalase em espectrofotômetro e PAGE não-desnaturante...............................43
2.3.4 Atividade de glutationa redutase em espectrofotômetro e em PAGE não-desnaturante.......47
2.3.5 Atividade de glutationa-S-transferase em espectrofotômetro................................................51
2.3.6 Atividade de guaiacol peroxidase em espectrofotômetro......................................................54
2.3.7 Atividade de ascorbato peroxidase em espectrofotômetro....................................................57
2.3.8 Peroxidação lipídica..............................................................................................................60
8
2.3.8.1 Quantificação de MDA em espectrofotômetro...................................................................60
2.3.9 Proteína..................................................................................................................................63
2.3.9.1 Quantificação de proteína em espectrofotômetro..............................................................63
2.3.9.2 Proteína em gel SDS-PAGE..............................................................................................65
2.4 Discussão..................................................................................................................................67
3 CONCLUSÕES..........................................................................................................................79
REFERÊNCIAS.............................................................................................................................80
9
RESUMO
Análise da resposta antioxidativa de células in vitro de fumo (Nicotiana tabacum cv BY-2)
submetidas ao metal pesado níquel
Células de Nicotiana tabacum cv BY-2 foram tratadas por cinco dias com 0,075 e 0,750
mM de NiCl
2
. A relação entre a toxidade do níquel (Ni) e as reações oxidativas foram estudadas
nas células durante a acumulação do metal. A atividade da superóxido dismutase não se alterou
na presença do Ni. Entretanto, as atividades da catalase e da guaiacol peroxidase aumentaram às
36 e 72h depois do tratamento com o metal. As atividades da glutationa redutase, da glutationa-S-
transferase e da ascorbato peroxidase aumentaram nas primeiras horas do tratamento. A
peroxidação lipídica da membrana aumentou somente às 24h do tratamento com o metal. Os
resultados sugerem que a desordem oxidativa é resultante dos efeitos da toxidade do Ni nas
células de Nicotiana tabacum cv BY-2.
Palavras chaves: Nicotiana tabacum cv BY-2; níquel; enzimas antioxidantes; estresse; EAO;
fitorremediação.
10
ABSTRACT
Antioxidant response of BY-2 Nicotiana tabacum cells to nickel stress
BY-2 Nicotiana tabacum cells were treated for five days with 0.075 and 0.750 mM NiCl
2
.
The relationship between nickel (Ni) toxicity and oxidative reactions were studied in cells during
metal accumulation. The activity of superoxide dismutase was unaffected by Ni stress. However,
catalase and guaiacol peroxidase activities increased from 36 and 72h after the metal treatment.
Glutathione reductase, glutathione-S-transferase and ascorbate peroxidase activities increased in
the first hours of the treatment. Membrane lipid peroxidation was enhanced only after 24h of the
metal treatment. The results suggest that oxidative disorder is part of the overall effect of Ni
toxicity in BY-2 Nicotiana tabacum cells.
Keywords: BY-2 Nicotiana tabacum; nickel; antioxidative enzymes; stress; ROS;
phytoremediation.
11
1 INTRODUÇÃO
A presença de metais pesados no ambiente (solo, água e ar), originários das atividades
industriais e o seu uso indiscriminado na agricultura, resulta em perdas na produção agrícola e
efeitos danosos ao homem e aos animais.
A entrada destes elementos na cadeia alimentar tem início através da sua bioacumulação
nas plantas. Estas, por sua vez, possuem mecanismos de defesa com a função de reduzir os danos
causados pelos metais pesados. Entre estes mecanismos, podem ser citados, o sistema
antioxidante não enzimático e o sistema de enzimas antioxidantes, que possuem a capacidade de
remover, neutralizar ou limpar espécies ativas de oxigênio e que inclui as enzimas superóxido
dismutase, catalase, glutationa redutase, glutationa-S-transferase, guaiacol peroxidase e ascorbato
peroxidase. O estudo da atividade enzimática pode ser utilizado como critério de avaliação da
fitotoxicidade de metais pesados em plantas.
O estudo do estresse em linhagens de células vegetais apresenta vantagens, pois, estas são
estabelecidas de forma relativamente fácil, com a obtenção de quantidades elevadas a partir dos
tecidos de plantas superiores, reduzindo o volume de solução contendo o metal pesado,
contribuindo para diminuir a geração de resíduos.
Sendo o níquel um micronutriente essencial para as espécies vegetais, porém, como outros
metais pesados, tóxico em altas concentrações, o estudo da atividade das enzimas antioxidantes,
resultantes da presença do metal, fornece informações através da via de desintoxicação da planta,
que podem ser utilizadas na fitorremediação de ambientes poluídos.
12
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão de literatura
2.1.1 Metais pesados
O crescimento populacional e a sua concentração nos centros urbanos geraram aumento
no consumo de alimentos e de produtos industrializados que resultou em um acréscimo nas
quantidades de resíduos urbanos e industriais, maior do que a capacidade do ambiente em
degradá-los, ocasionando problemas decorrentes do seu acúmulo.
O uso de resíduos na agricultura, como fonte alternativa de nutrientes, pode atenuar o
problema. Porém, esses resíduos possuem, além de características benéficas, metais pesados em
sua composição, devido ao uso destes elementos nas atividades industriais.
Os metais pesados representam o maior contaminante industrial de solos, plantas e
animais no ecossistema (GHOSHROY et al., 1998), com efeitos tóxicos ao homem e outros seres
vivos (DÖNMEZ; AKSU, 1999). O estudo da toxicidade de metais pesados em plantas atrai a
atenção de cientistas ambientalistas (PRASAD, 1995). Quantidades naturais de metais pesados no
ambiente são geralmente baixas, porém as atividades antropogênicas podem aumentar estes
níveis. Tais atividades incluem a mineração, fundição, utilização de lodo de esgoto para
fertilização na agricultura (CHAOUI et al., 1997a), gases liberados pela combustão de
combustíveis fósseis, pesticidas (LAGRIFFOUL et al., 1998), aplicação de fertilizantes (CHEN;
KAO, 1995; GALLI et al., 1996), fabricação de baterias, aplicações militares, aeroespaciais,
estabilização de plásticos e formulação de pigmentos (PRASAD, 1995), atividades automotivas e
industriais como a manufatura de ligas níquel-aço (aço inox), componentes eletrônicos e baterias
(SCHICKLER; CASPI, 1999).
A importância de se estudar os metais pesados deve-se aos seus efeitos tóxicos aos seres
vivos juntamente com a sua liberação no ambiente. O estudo da toxicidade destes, em plantas e
microrganismos, é importante porque estes são os organismos mais afetados pela contaminação,
o que os tornam potencialmente interessantes para recuperação de áreas contaminadas, através
das técnicas de biorremediação (GRATÃO, 2003).
13
O termo “metal pesado” é aplicado a um grupo de elementos que incluem metais,
semimetais e não metais (MELO et al., 1997), que possuem número atômico maior que 20 ou
peso específico maior que 5 g.cm
-3
(MALAVOLTA, 1994). Alguns são nutrientes essenciais aos
vegetais, como o cobre (Cu), ferro (Fe), manganês (Mn), níquel (Ni), molibdênio (Mo) e zinco
(Zn), outros são benéficos ao crescimento das plantas, como o cobalto (Co), e outros não são
essenciais ou não apresentam função, caso do alumínio (Al), cádmio (Cd), cromo (Cr), selênio
(Se), mercúrio (Hg) e chumbo (Pb) (MELO et al., 1997). Segundo Mattiazzo-Prezotto (1994), são
também conhecidos por “elementos traços” ou ainda “metais traços”, por serem naturalmente
encontrados em concentrações de poucas partes por milhão.
O Se é tóxico em altas concentrações, podendo ser incorporado em aminoácidos, devido a
sua similaridade estrutural com enxofre (S), alterando a estrutura e função das proteínas. De
forma geral, o Se atua como antioxidante em baixas concentrações e em altas, induz o estresse
oxidativo (MINORSKY, 2003; GOMES-JUNIOR, 2005). O Al é considerado o elemento em
maior abundância no solo e constitui fator limitante para o crescimento das plantas em solo ácido
(VITORELLO et al., 2005), causando inibição do crescimento da raiz, redução da respiração e
síntese de ATP (YAMAMOTO et al., 2003).
O Ni é um micronutriente essencial em certas espécies vegetais, especialmente quando
cultivadas em meio com uréia, pois, o Ni é constitutivo da enzima urease e sua deficiência leva a
redução da atividade enzimática, resultando em um acúmulo excessivo de uréia, que é tóxico
(POLACCO, 1977). Porém, como outros metais pesados, o Ni torna-se tóxico em altas
concentrações. O Cd pode causar sérios danos ao metabolismo celular, incluindo o estresse
oxidativo, devido a produção excessiva de espécies ativas de oxigênio, apresentando alterações
nas atividades de enzimas antioxidantes (VITÓRIA et al., 2001; GRATÃO et al., 2005).
O Cu e o Mn provocam estresse oxidativo em altas concentrações (DUCIC; POLLE,
2005), agindo sobre o fotossistema (KÜPPER et al., 2003). O Cr pode provocar danos severos a
plantas e animais. Sua fitotoxicidade pode causar inibição da germinação de sementes,
degradação da clorofila, alteração nos cloroplastos e nas estruturas das membranas (PANDA et
al., 2003; PANDA; CHOUDHURY, 2005).
Os metais pesados podem causar estresse oxidativo, porém o papel do sistema
antioxidante resultante deste estresse, é controverso, pois 1) os metais apresentam diferentes
mecanismos de indução do estresse oxidativo, 2) o sistema antioxidante das células possui
14
diversos componentes e é compartimentalizado, 3) o sistema de desintoxicação/complexação
pode reduzir os efeitos dos metais, sendo que o estresse oxidativo pode ser problemático depois
que este sistema esteja sobrecarregado, 4) a glutationa, componente do sistema antioxidante,
participa da síntese de fitoquelatinas, que são agentes complexantes de metais. Assim, o sistema
antioxidante e o sistema de desintoxicação de metais pesados da célula, podem competir entre si
(SCHUTZENDUBEL et al., 2001; GRATÃO, 2003).
As propriedades químicas dos metais pesados determinam mecanismos diferentes de
estresse oxidativo e sua resposta. O Ni é um elemento de transição, que participa das reações de
Haber-Weiss, gerando radicais livres, é o único metal que possui diferentes estados de oxidação.
O Cd e o Al possuem estado de oxidação 2+ e 3+, respectivamente, não sendo considerados
elementos de transição. Esta propriedade influência o mecanismo de geração de estresse
oxidativo (COWAN, 1998; CUYPERS et al., 1999; GRATÃO, 2003).
2.1.2 O níquel nas plantas
Descoberto em 1751 por Cronsted no mineral nicolita, este elemento químico pertence ao
grupo VIII da tabela periódica, juntamente com o Fe e o Co (MATTIAZZO-PREZOTTO, 1994).
Apesar de ser um poluente ambiental (SAJWAN et al., 1996) e fitotóxico em altas concentrações
(L’HUILLIER et al., 1996), o Ni é considerado menos tóxico a organismos vivos do que outros
metais, como o Cd (PERALTA-VIDEA et al., 2004) e o 24º metal em abundância na crosta
terrestre (McGRATH; SMITH, 1990).
Brown et al. (1987) consideram o Ni um micronutriente essencial em certas espécies
vegetais, especialmente quando cultivadas em meio com uréia, pois é constitutivo da enzima
urease (DIXON et al., 1975), e sua deficiência leva a redução da atividade desta, em tecidos de
soja (Glycine max (L) Merr.), arroz (Oriza sativa L.) e fumo (Nicotiana tabacum L.), resultando
em acúmulo excessivo de uréia, tornando-a fitotóxica (POLACCO, 1977).
Dentre outros aspectos positivos do Ni, destacam-se a influência no complexo enzimático
hidrogenase, que aumenta a eficiência da fixação do nitrogênio por leguminosas (KLUCAS,
1983) e a participação na síntese de fitoalexinas, aumentando a resistência das plantas às doenças
(WALKER et al., 1985; PAIVA et al., 2002).
15
Possui alta mobilidade no vegetal, encontrando-se em todos os tecidos das plantas tratadas
com o metal, e, principalmente, nas sementes (MALAN; FARRANT, 1998). A acumulação
ocorre de modo diferencial entre os tecidos e ao longo do ciclo vital da planta, sendo maior nos
grãos, nas folhas e nas partes jovens. O Ni é capaz de modificar a absorção e o transporte do
nitrato (NO
3
), alterando a atividade das enzimas nitrato redutase e glutamina sintase, essenciais
para a síntese de aminoácidos (PALACIOS; MATAIX, 1999).
Estudos sobre os efeitos do Ni no metabolismo de plantas demonstraram que o metal pode
induzir a produção de espécies ativas de oxigênio (EAOs) (FOYER et al., 1997). As EAOs estão
envolvidas na peroxidação de lipídios e na quebra da clorofila (SOMASHEKARAIAH et al.,
1992; STROINSKI, 1999). O Ni é capaz de inibir enzimas do Ciclo de Calvin, a biossíntese de
clorofila (VAN ASSCHE et al., 1990), o metabolismo do nitrogênio (BOUSSAMA et al., 1999),
a glicólise (CHUGH; SAWHNEY, 1999) e a assimilação do sulfato (LEE; LEUSTEK, 1999).
O Ni é um elemento que pode afetar o crescimento e o desenvolvimento das plantas
(MARSCHNER, 1995). Os sintomas mais comuns da sua fitotoxidade são a clorose, a inibição
da fotossíntese e da respiração, gerando redução da biomassa e da produção de sementes
(MALLAN; FARRANT, 1998), alterações nas atividades enzimáticas e metabólicas (GALLEGO
et al., 1996a,b; COBBETT, 2000; PERALTA-VIDEA et al., 2004) e danos no sistema radicular,
diminuindo a assimilação de nutrientes, como Fe, Zn e Mn (CROOKE; INKSON, 1956; YANG
et al., 1996; PALACIOS et al., 1998).
O aumento do conteúdo de pectina em raízes de aveia (Avena sativa L.) (CROOKE,
1955), a diminuição na concentração de clorofila em folhas de café (Coffea arabica L.)
(PAVAN; BINGHAM, 1982) e de milho (Zea mays L.) (BACCOUCH et al., 1998), a diminuição
da atividade da enzima fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase (MORGUTTI et al., 1984), o
aumento da atividade da enzima peroxidase, distúrbios mitóticos nas pontas das raízes de
algumas plantas (MISHRA; KAR, 1974), alterações nas estruturas das mitocôndrias de rabanetes
(Raphanus sativus L.) (PALACIOS et al., 1998) e necrose nas folhas de tomate (Lycopersicon
esculentum Mill.) (PALACIOS; MATAIX, 1999), são exemplos da fitotoxidade provocada pelo
Ni (PAIVA et al., 2002). Porém, os mecanismos que governam a toxidade por Ni não estão bem
esclarecidos (SCHICKLER; CASPI, 1999).
As plantas que crescem em ambientes contaminados pelo Ni, podem apresentar distúrbios
nutricionais. Os sintomas de toxidez pelo metal são confundidos com deficiência ou toxidez por
16
outros elementos essenciais (PAIVA et al., 2002). Segundo Kabata-Pendias; Pendias (1984), os
teores de Ni superiores a 100 mg.dm
-3
de solo são potencialmente fitotóxicos.
O efeito do Ni na absorção de Zn, Cu, Fe e Mn difere com as espécies. Plantas de couve
(Brassica oleracea L.), crescendo em solução nutritiva com 60 mM de Ni, tiveram a absorção de
Cu, Fe e Mn diminuída em 40, 70 e 20%, respectivamente, com relação à apresentada pelo
controle. A absorção de Zn diminuiu 80% e a de Cu, 60%, em plantas de trevo branco (Trifolium
repens L.), crescendo na mesma solução. Plantas de azevém (Lolium perenne L.) e de milho, que
cresceram em solução contendo 120 mM de Ni, não diminuíram a absorção de Zn, Fe, Mn e Cu.
A absorção de Ca foi inibida em azevém, cultivada em concentrações inferiores a 60 mM de Ni.
A redução na absorção de Ca e Mg é pronunciada com o aumento das doses de Ni, para todas as
espécies. A absorção de P e de S aumentou em milho e em azevém com a crescente concentração
de Ni (YANG et al., 1996; PAIVA et al., 2002).
Algumas plantas, denominadas de hiperacumuladoras podem crescer em solos contendo
metais pesados e são capazes de translocar o Ni das raízes para a parte aérea, onde o metal é
acumulado. Isto pode sugerir um possível uso destas na biorremediação de solos poluídos com
metais pesados (ZHU et al., 1999; BOOMINATHAN; DORAN, 2002).
Células de fumo, Nicotiana tabacum L. cv BY-2, selecionadas para a tolerância ao Ni, são
também mais tolerantes ao Co, porém, não ao Cd, quando comparadas a células não tolerantes.
Sugere-se que a histidina está envolvida nesta tolerância e na desintoxicação do metal nas células
tolerantes (NAKAZAWA et al., 2004).
Em raízes de milho, expostas ao Ni, a análise da atividade das enzimas antioxidantes
juntamente com a peroxidação lipídica demonstrou que ocorreu uma resposta a presença do metal
e que a peroxidação foi conseqüência primaria dos efeitos do Ni (BACCOUCH et al., 2001).
A germinação do pólen e o crescimento do tubo polínico em tabaco foram alterados na
presença dos metais Ni, Pb, Fe, Co, Cd, Hg, Al, Zn e Cu. Os metais considerados mais danosos
para a germinação do pólen foram o Cu, Hg e Ni e para o crescimento do tubo polínico, Hg, Cd e
Ni. Os efeitos tóxicos do Co, Al e Fe foram considerados baixos (TUNA et al., 2002).
O cedro (Cedrela fissilis Vell.) apresentou tolerância quando submetido a ambientes
contaminados, sendo, portanto, considerado promissor para a fitorremediação (MARQUES,
1996). A aplicação de Ni nestas plantas aumentou a absorção de P, reduziu a de Ca, Mg, Cu, Fe e
Mn, o teor de Zn foi pouco afetado e não afetou o teor de K e de S. O teor de Ni, na matéria seca
17
de raiz, caule e folha, elevou-se com o aumento das doses deste metal, que mostrou ser móvel nas
plantas analisadas (PAIVA et al., 2002).
2.1.3 Mecanismos de defesa das plantas em resposta à exposição a metais pesados
A contaminação por metais pesados é um problema mundial, devido as perdas na
produção agrícola e efeitos nocivos após inseridos na cadeia alimentar dos animais e do homem
(SALT et al., 1995). Os metais pesados tendem a se concentrar no solo tornando-o um
reservatório disponível para as raízes que são vulneráveis as variações de concentrações destes
elementos. Em ambientes aquáticos estes se disponibilizam tanto para as raízes quanto para a
parte aérea. A disponibilidade para as plantas é afetada por fatores como a textura do solo, tipo de
mineral de argila, pH do solo e da água, e outros parâmetros fisiológicos (PRASAD, 1995;
MELO et al., 1997).
As plantas desenvolveram mecanismos para reduzir a concentração de metais pesados
livres no citossol das células, os quais, incluem, a compartimentalização do metal em estruturas
sub-celulares, exclusão e/ou diminuição do transporte através da membrana e a formação de
peptídeos ricos em cisteínas, conhecidos como fitoquelatinas e metalotioneínas, que podem
complexar esses metais (LOZANO-RODRIGUEZ et al., 1997). Outro mecanismo desenvolvido
pelas plantas, é o sistema antioxidante de defesa, que inclui componentes de baixa massa
molecular, tais como glutationa e um sistema de enzimas antioxidantes, capazes de remover,
neutralizar ou limpar espécies ativas de oxigênio e que inclui as enzimas superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GR), glutationa-S-transferase (GST), guaiacol
peroxidase (GPX) e ascorbato peroxidase (APX) (SCANDALIOS, 1993; GRATÃO et al., 2005).
O estudo da atividade enzimática pode ser considerado como critério de avaliação da
fitotoxicidade de metais pesados em plantas (MENCH et al., 1994). Conhecendo-se a via
preferencial de desintoxicação destes metais, pode-se traçar estratégias de estudo e melhoramento
genético, como por exemplo, a manipulação de enzimas que possam condicionar tanto a
sensibilidade quanto a tolerância a metais, em diferentes cultivares (GRATÃO, 2003).
18
2.1.3.1 Sistema oxidante de resposta
Os organismos aeróbios dispõem de vantagens energéticas utilizando o oxigênio
molecular como um oxidante terminal na respiração. A presença do oxigênio no ambiente celular
pode provocar a oxidação das suas próprias estruturas devido ao seu potencial de agir como
redutor parcial, formando as espécies ativas de oxigênio (EAOs) (RICE-EVANS et al., 1991;
FOYER et al., 1997; MALLICK; MOHN, 2000).
As EAOs, como o radical superóxido (O
2
-
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), radical
hidroxila (OH
-
) e oxigênio "singlet" (
1
O
2
), são produtos gerados pelo metabolismo dos
organismos aeróbios e provocam estresse oxidativo devido a ação tóxica e mutagênica sobre as
células (ANGELOVA et al., 2000; MALLICK; MOHN, 2000).
Em plantas, a produção das EAOs é estimulada por fatores ambientais de estresse como a
exposição a níveis elevados de luminosidade, seca, metais pesados, concentração de sais,
temperatura, radiação ultravioleta (UV), poluição do ar, herbicidas, estresse físico e como
resposta a estresses bióticos, tais como, o ataque de patógenos (MALLICK; MOHN, 2000). A
produção de EAOs, ocorre também durante as reações fotoquímicas da fotossíntese (BOWLER et
al., 1994).
Os vegetais possuem mecanismos não enzimáticos que os protegem contra os danos
oxidativos. São compostos de baixa massa molecular, como glutationa reduzida (GSH), ascorbato
(AA), tocoferol, cisteínas, alcalóides, ferredoxina (Fd), vitaminas, flavonóides e pigmentos
carotenóides, que agem em conjunto com enzimas antioxidantes (BOWLER et al., 1992;
SCANDALIOS, 1993; FOYER et al., 1997; RUIZ, 1998; SAKAKI, 1998; ASADA, 1999).
Os O
2
-
são produzidos através da reação do oxigênio molecular (O
2
) dos fotossistemas na
reação de Meyer, sendo convertidos em H
2
O
2
pela SOD, associada ao tilacóide. O H
2
O
2
é
convertido pela CAT, nos peroxissomos e pela APX, nos cloroplastos, em água (H
2
O)
(SCANDALIOS, 1990; FOYER et al., 1994; ALLEN, 1995; FADZILLAH et al., 1996;
AZEVEDO et al., 1998). As moléculas de O
2
-
e H
2
O
2
que não foram degradadas nos tilacóides,
são degradadas no estroma pela SOD e APX. Os radicais monodesidroascorbato (MDHA),
produzidos pela APX, são convertidos a AA através da via Fd ou pela enzima
monodesidroascorbato redutase (MDHAR) (GRATÃO, 2003).
19
Em alisso (Alyssum maritimum L.), uma planta hiperacumuladora de Ni e Cd, quando em
presença de Ni, exibiu um típico mecanismo de defesa antioxidante, elevando a atividade das
enzimas SOD, GR e APX. Na presença de Cd, aumentou a atividade de SOD e reduziu a de GR
(SCHICKLER; CASPI, 1999).
As EAOs são altamente reativas e citotóxicas, podendo reagir com os ácidos graxos
insaturados da membrana, promovendo a peroxidação lipídica. Os metais pesados podem causar
danos oxidativos diretos, agindo como redutores e produzindo EAOs, ou indiretos, inativando o
sistema antioxidante da célula (MANNAZZU et al., 2000).
2.1.3.2 Enzimas antioxidantes
2.1.3.2.1 Superóxido dismutase (SOD)
A SOD (EC 1.15.1.1) foi isolada em eritrócitos bovinos em 1938 e sua função foi descrita
em 1969, por McCorde e Fridovick. Presente em organismos aeróbios e anaeróbios facultativos,
esta enzima caracteriza um grupo de metaloenzimas que catalisam a formação de H
2
O
2
a partir de
O
2
−
, livrando as células da oxidação por esses radicais.
A SOD é a primeira enzima de defesa contra danos provocados por EAOs nas células. É a
única cuja atividade interfere nas concentrações de O
2
−
e H
2
O
2
, os dois substratos da reação de
Haber-Weiss, que origina os radicais hidroxila (OH
−
) e, provavelmente por isso, representam o
mecanismo de defesa central dos organismos vivos (BOWLER et al., 1992; ALSCHER et al.,
2002).
Estas metaloenzimas multiméricas são classificadas em três grupos, de acordo com o
componente metálico de seu sítio ativo. O grupo cobre/zinco (Cu/Zn), o grupo manganês (Mn) e
o grupo ferro (Fe), sendo que a cobre/zinco superóxido dismutase (Cu/Zn-SOD) é considerada
mais abundante nos vegetais (WINGSLE et al., 1991; SCANDALIOS, 1993; NIYOGI, 1999;
MALLICK; MOHN, 2000).
A Cu/Zn-SOD é encontrada no citosol e no estroma dos cloroplastos e é sensível às
concentrações do radical cianeto (CN
−
) (HAYAKAWA et al., 1984; MALLICK; MOHN, 2000).
20
A manganês superóxido dismutase (Mn-SOD) e ferro superóxido dismutase (Fe-SOD) não são
sensíveis ao CN
−
e são encontradas na matriz mitocôndrial de células eucarióticas e em células
procarióticas, embora, Mn-SOD associada à membrana, foi observada nos cloroplastos de
algumas plantas. A Fe-SOD foi observada em algumas famílias de plantas e está associada
principalmente aos cloroplastos (MALLICK; MOHN, 2000).
As isoenzimas de SOD apresentam semelhanças entre as espécies vegetais, porém, o
número e grupo destas isoenzimas é variável. A Cu/Zn-SOD foi encontrada no citosol de arroz,
nas mitocôndrias de girassol (Helianthus annuus L.) e no cloroplasto de arabidopsis (Arabidopsis
thaliana L.) (CORPAS et al., 1991; PAN; YAU, 1991; KLIEBENSTEIN et al., 1998).
A Mn-SOD foi encontrada em mitocôndria de aveia e feijão (Phaseolus vulgaris L.)
(SEHMER; DIZENGREMEL, 1998; CORPAS et al., 1991). A Fe-SOD é rara em plantas, sendo
encontrada em arabidopsis, com a função de catalisar a produção de H
2
O
2
formado durante a β-
oxidação de ácidos graxos e nos peroxissomos das folhas, durante a fotorrespiração,
transformando o glicolato em glioxilato (KLIEBENSTEIN et al., 1998; HAVIR; McHALE,
1989; GRATÃO, 2003).
Em milho, verificou-se que o Ni foi capaz de inibir a atividade da SOD durante a primeira
hora de estresse (BACCOUCH et al., 1998). Em guandu (Cajanus cajan L.) ocorreu um aumento
na atividade da SOD, quando exposto ao metal, indicando que, provavelmente, a SOD é um
importante intermediário no processo de destoxificação do Ni (RAO et al., 2000).
2.1.3.2.2 Catalase (CAT)
A catalase (CAT, EC 1.11.1.6), descrita em 1901 por Loew (FRUGOLI et al., 1996), é
uma enzima tetramérica, que contém grupos heme e é encontrada em todos os organismos vivos.
Possui ampla distribuição e capacidade de degradar o H
2
O
2
. Foi proposto por vários
pesquisadores, que a CAT desempenha papel fundamental nos sistemas que capacitam os
organismos a viverem em ambientes aeróbios (MALLICK; MOHN, 2000).
Existem três tipos de isoenzimas de CAT, a Cat1, a Cat2 e a Cat3 (genes codificantes da
catalase 1, 2 e 3, respectivamente) (SCANDALIOS, 1993). Em plantas, a Cat1 é responsável por
21
80% da atividade total desta enzima e está localizada no interior dos peroxissomos, sendo
responsável pela transformação do H
2
O
2
produzido na fotorrespiração em H
2
O e O
2
(WILLEKENS et al., 1995). A Cat2 é encontrada nos tecidos vasculares, enquanto a Cat3 está
localizada no mesófilo das células (SCANDALIOS, 1990).
De acordo com Foyer et al. (1994), a CAT torna-se essencial para destruição de H
2
O
2
formado na fotorrespiração realizada em plantas C3. Em plantas C4, onde a fotorrespiração é
reduzida, ocorre uma diminuição da atividade da CAT. Segundo Willekens et al. (1995), a
ausência da atividade da CAT em plantas tornam-nas mais sensíveis a estresses.
A CAT, provavelmente, utiliza mecanismos de dois estágios para as reações peroxidativas
e catalíticas. No primeiro estágio, o Fe do grupo heme interage com o H
2
O
2
formando peróxido
de ferro, rico em O
2
, denominado componente I. Em baixas concentrações de H
2
O
2
, este
componente pode ser reduzido por doadores de hidrogênio (H), como o etanol e o ácido
ascórbico. Em elevadas concentrações, o componente I reage com outra molécula de H
2
O
2
,
produzindo H
2
O
e O
2
(SCANDALIOS, 1994).
Condições ambientais podem alterar a atividade da CAT. Em bactérias do gênero
Prochloron sp, a atividade da CAT é diretamente proporcional a radiação UV, enquanto que a
alteração na temperatura afeta a atividade da CAT em cianobactérias do gênero Synechocystis sp
(LESSER; STOCHAJ, 1990; RADY et al., 1994). Em eucalipto (Leucaena leucocephalla L.),
feijão-mungo (Vigna radiata L.) e milho, coletados em solos contaminados por Ni, foi observado
o aumento da atividade da CAT, após 24 horas de exposição ao metal (BACCOUCH et al., 1998;
ROUT et al., 1999; SAMANTARY et al., 1999).
Duas isoformas foram identificadas no fungo aspergilos (Aspergillus nidulans L.). A CAT
A, codificada pelo gene catA, cuja transcrição é induzida durante a esporulação e em resposta a
estresses e a CAT B, codificada pelo gene catB, presente no micélio, cuja expressão é induzida
pelo H
2
O
2
ou H
2
O
2
−
, não possuindo controle regulatório pós-transcricional. Estas enzimas
constituem mecanismos de defesa antioxidativa alternativo e específico para os diferentes
estágios do ciclo de vida do fungo (CALERA et al., 2000).
22
2.1.3.2.3 Glutationa redutase (GR)
A enzima glutationa redutase (GR, EC 1.6.4.2) (VALLEJOS, 1983) possui ocorrência
quase universal, distribuída em procariotos e eucariotos, desde bactérias heterotróficas e
fotossintetizantes até plantas e animais superiores (FOYER et al., 1994). A GR contém grupo
prostético flavina adenina dinucleotídeo (FAD), transferidor de elétrons, que catalisa a redução
dependente de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) da glutationa
oxidada (GSSG), para a glutationa reduzida (GSH) (VOET; VOET, 1995).
A GR tem importante papel na proteção do cloroplasto contra danos oxidativos, mantendo
a razão entre os níveis de GSH e GSSG (GALLEGO et al., 1996a,b). A GSH é o componente tiol
mais abundante dos vegetais, essencial para plantas e animais em resposta a estresses oxidativos,
possuindo papel importante como antioxidante e na síntese de fitoquelatinas (PCs), podendo
controlar a quantidade de Ni livre no citossol e promover a remoção do H
2
O
2
no cloroplasto e,
para isto, a GSH deve estar na sua forma reduzida. Essa oxi-redução é catalisada pela GR
(CREISSEN et al., 1994).
Os PCs são peptídeos ricos em cisteína, gama-glutamil-cistenil-glicina (γ-Glu-Cys)
n
-Gly,
sintetizados pela fitoquelatina sintase (γ-glutamil-cisteína dipeptidiltranspeptidase), que transfere
a γ-glutamil-cisteína de uma molécula de GSH para o polímero de γ-glutamil-cisteinil-glicina
(HOWDEN et al., 1995; MEJÁRE; BÜLOW, 2001; TSUJI et al., 2003).
Foram encontradas espécies de plantas capazes de sintetizar PCs na presença de metais
pesados (GRILL et al., 1985), sendo que apenas alguns metais podem formar complexos com
PCs (Cd, Cu, Ni, Zn, Ag, Hg e Pb). Em tomate, metais pesados alteraram os níveis de PCs nas
raízes e na parte aérea da planta, sugerindo que a síntese pode ser regulada apenas em resposta a
exposição ao metal. Em pesquisa realizada com feijão, onde foram aplicados Cd e Ni, verificou-
se que o Cd induziu a síntese de PCs, diferentemente do Ni, onde não foi observado resposta
(CHEN et al., 1997; GUO; MARSCHNER, 1995).
Em plantas de guandu tratadas com Ni, observou-se o aumento da atividade da enzima
GR após o início do tratamento (RAO et al., 2000). A alta concentração da enzima em raízes de
trigo (Triticum aestivum L.) contribui para aumentar a tolerância ao Ni, através da ação da GSH,
23
mediante a síntese de PCs (PANDOLFINI et al., 1996). Plantas do gênero Alyssum sp, expostas a
altas concentrações do metal, tiveram a atividade da GR aumentada (SCHICKER; CASPI, 1999).
2.1.3.2.4 Glutationa-S-transferase (GST)
As GSTs (EC 2.5.1.18) são enzimas que catalisam a adição de glutationa reduzida (GSH)
para substratos hidrofóbicos eletrofílicos (DIXON et al., 2002). Estas enzimas são induzidas em
resposta ao estresse oxidativo. A atividade de GST leva a uma desintoxicação dos produtos da
peroxidação lipídica, resultado da produção acelerada de EAOs. A GST remove metais pesados,
herbicidas e outros xenobióticos e é responsável pela principal via na eliminação de moléculas
endógenas, como metabólitos secundários (FOYER et al., 1997). A atividade de GST foi elevada
em seis vezes, a nível do controle, em resposta ao estresse oxidativo desencadeado pelo herbicida
oxyfluorfen em culturas in vitro de soja (KNÖRZER et al., 1996).
A identificação da GST em vegetais ocorreu devido a sua associação com mecanismos de
resistência ao herbicida atrazina em milho (MARRS, 1996). Outras classes de GST foram
classificadas após a exposição a estresses bióticos e abióticos, Phi, Zeta, Tau e Theta (DIXON et
al., 2002).
2.1.3.2.5 Guaiacol peroxidase (GPX)
As peroxidases são hemeproteínas que catalisam a oxidação do substrato
concomitantemente à redução do H
2
O
2
. Participam de processos metabólicos essenciais,
incluindo lignificação (GRISEBACH, 1981), regulação do crescimento celular (GOLDBERG et
al.,1986), oxidação fenólica, defesa contra patógenos e proteção contra estresses (FIELDES;
GERHARDT, 1998).
Nas espécies vegetais e em particular no linho (Linum usitatissimum L.), a GPX (EC
1.11.1.7) apresenta isoformas ácidas e básicas. A isoforma ácida está envolvida com a biossíntese
24
da parede celular, incluindo a formação de lignina. A isoforma básica participa da regulação da
degradação do ácido indol-acético (AIA) e da síntese de etileno (FIELDES; GERHARDT, 1998).
A GPX catalisa a oxidação dos doadores de H em experimentos in vitro, devido à
ausência de substrato específico. In vivo, a GPX utiliza o ascorbato como substrato para suas
reações, sugerindo que a desintoxicação possa ser a principal função das isoformas. As principais
funções das peroxidases não foram bem esclarecidas. Estudos das alterações provocadas pela
indução de estresses fisiológicos podem contribuir para a melhor compreensão da ação específica
das isoformas da GPX (FIELDES; GERHARDT, 1998; CAMPA, 1991).
Em raízes milho não ocorreu alteração da atividade da GPX, quando expostas à
concentração de 250 mM de NiCl
2,
por um período de cinco dias (BACCOUCH et al., 2001).
2.1.3.2.6 Ascorbato peroxidase (APX)
O substrato redutor mais importante na desintoxicação do H
2
O
2
em células vegetais é o
ascorbato (AA). A ascorbato peroxidase (EC 1.11.1.11) catalisa a reação na qual duas moléculas
de ascorbato são oxidadas reduzindo uma molécula de H
2
O
2
em H
2
O. A regeneração do
ascorbato envolve a oxidação da GSH, o que, por sua vez, é regenerada por ação da GR,
constituindo o ciclo ascorbato-glutationa (NOCTOR; FOYER, 1998).
A APX é específica para plantas e algas, é indispensável na proteção dos cloroplastos e
outros constituintes celulares aos danos causados pelo H
2
O
2
. As propriedades básicas da enzima
ascorbato peroxidase são distintas em relação às propriedades da guaiacol (GPX), possuindo
semelhança às peroxidases do citocromo c (ASADA, 1992). Isoenzimas de APX estão
distribuídas em quatro compartimentos celulares 1) no estroma e na membrana do tilacóide, 2)
nos cloroplastos, 3) nos microcorpos e 4) no citosol (ASADA, 1992; MIYAKE; ASADA, 1992).
Os cDNA que codificam as isoenzimas de APX foram isolados e caracterizados em várias
espécies vegetais (KUBO et al., 1995), sendo que uma segunda família de cAPX foi relatada em
espécies como espinafre (Spinacia oleracea L.), soja e arroz (SANTOSH et al., 1999).
Estudos visam examinar as alterações da atividade e do nível de expressão da APX, sob
condições de estresse ambiental, tais como ozônio, radiação UV, baixa temperatura associada à
25
alta luminosidade, estresse hídrico, infecção por patógenos e estresse gerado por metais pesados
(WILLEKENS et al., 1995; MITTLER et al., 1999; HERNÁNDEZ et al., 2004).
A atividade da APX aumentou nas plantas de cevada (Hordeum vulgare L.) e de feijão,
expostas ao Cd e Cu e diminuiu para girassol, Pinus sp e aveia (GALLEGO et al., 1996;
HEGEDUS et al., 2001; SCHÜTZENDÜBEL et al., 2001). A exposição da hiperacumuladora
do gênero Alyssum sp ao Cd e Ni alterou a atividade da enzima em altas concentrações
(SCHICKLER; CASPI, 1999).
2.1.4 Nicotiana tabacum cv BY-2
A cultura de tecidos é um processo onde células, fragmentos de tecidos e órgãos, que
foram obtidos de raízes, caules e folhas, originam brotos, raízes e até plantas inteiras, quando
cultivados em meio nutritivo. A cultura de células envolve o crescimento desorganizado de
massas celulares, denominadas calos ou células indiferenciadas. Estas células podem manter-se
neste estado por longos períodos, quando repicadas rotineiramente para novo meio, podendo
resultar em plantas regeneradas, quando tratadas com uma combinação adequada de fatores de
crescimento vegetal.
A capacidade das células de restabelecerem o crescimento a partir de um estágio latente
de diferenciação e iniciar a divisão na presença de concentrações hormonais apropriadas, facilita
o cultivo in vitro de espécies de plantas originárias de diferentes fontes teciduais (GRATÃO,
2003). As linhagens celulares possuem importante papel na compreensão da biologia celular e
molecular de células de mamíferos. A descoberta da imortalidade de linhagens celulares como
HeLa, permitiram elucidar o mecanismo de tumorogênese em células animais (NAGATA et al.,
1992).
A linhagem Bright Yellow-2 de Nicotiana tabacum L, estabelecida através da indução de
calos do caule, cultivados a partir de sementes e seedlings, foi a que mais proliferou entre as
quarenta espécies de Nicotiana e três espécies de Populus examinadas, sugerindo que esse
cultivar de fumo pode ter características específicas. Esta linhagem apresenta vantagem para o
estudo com metais pesados, devido ao fácil estabelecimento, obtenção em altas quantidades,
reduzindo o volume de solução contendo o metal, contribuindo para a diminuição de resíduos. A
26
BY-2 é considerada um modelo experimental para pesquisa da biologia vegetal, pois apresenta
altas taxas de crescimento e permite a obtenção de culturas altamente sincronizadas quanto ao
ciclo celular, o que é importante para a realização de estudos envolvendo as fases do ciclo
(NAGATA et al., 1992; GEELEN; INZÉ, 2001).
Células de BY-2 são utilizadas em estudos do citoesqueleto, regulação do ciclo celular e
crescimento celular, identificação do papel do AMP cíclico como mensageiro secundário, síntese
de celulose, síntese de isoprenóides, expressão gênica e resposta defensiva (VITORELLO;
HAUG, 1996; YAMAMOTO et al., 1996; NAKAGAWA; SAKURAI, 1998; ANDREA et al.,
2000; GEELEN; INZÉ, 2001; HOUOT et al., 2001; YANG et al., 2001).
2.2 Materiais e métodos
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética Bioquímica de Plantas, do
Departamento de Genética, pertencente à Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", da
Universidade de São Paulo (ESALQ-USP) em conjunto com o Laboratório de Biologia Celular e
Molecular, do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA-USP).
2.2.1 Material biológico
Foram utilizadas células não diferenciadas de fumo (Nicotiana tabacum L. cv Bright
Yellow-2 (BY-2)), para testar o efeito do metal níquel (Ni) no sistema antioxidante da célula. A
linhagem BY-2 é originária da University of Pennsylvania, EUA, e está estabelecida no
Laboratório de Biologia Celular e Molecular (CENA-USP). A suspensão celular utilizada foi
obtida a partir do mesófilo de folhas de fumo.
2.2.2 Meio de cultura
2.2.2.1 Meio completo líquido
O meio de cultura foi preparado de acordo com o descrito por Nagata et al. (1992) e
Vitorello; Haug (1996). Foram utilizados 0,5 g de MES, 4,3 g de sais MS, Murashige; Skoog
27
(1962), 30,0 g de sacarose, 10,0 mL de solução B1-Inositol, 3,0 mL de solução Mullers 1, 0,1 mL
de ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) e 1000,0 mL de água Milli-Q.
O pH foi ajustado para 5,7 com KOH e o meio foi esterilizado em autoclave sob 1 atm,
120°C, por 20 minutos.
2.2.2.2 Soluções
2.2.2.2.1 Solução B1-Inositol
Para esta solução foram utilizados 0,1 g de tiamina, 10,0 g de Mio-Inositol e 1000,0 mL
de água Milli-Q.
2.2.2.2.2 Solução Mullers 1
A solução de Mullers 1 contém 6,0 g de KH
2
PO
4
dissolvidos em 100,0 mL de água Milli-
Q.
2.2.2.2.3 2,4-D (estoque 10 mM)
Foram utilizados 0,1105 g de 2,4-D em 5,0 mL de etanol.
2.2.3 Cultivo de células
As células foram cultivadas de acordo com Nagata et al. (1992) e Vitorello; Haug (1996)
em incubadora-agitadora, à temperatura de 28°C, no escuro e subcultivadas em intervalos de 7
dias.
O crescimento celular foi avaliado através do volume de células compactadas após
centrifugação a 200 rpm. A viabilidade celular foi avaliada através da contagem de células
viáveis, por microscopia óptica.
28
2.2.4 Experimento básico
As células foram obtidas a partir do inóculo de 3,0 mL de suspensão celular por frasco
erlenmeyer contendo 50,0 mL de meio líquido completo e mantido à 28°C por 7 dias.
Foram realizados ensaios preliminares para estabelecer os períodos de tempo e de
concentração de cloreto de níquel (NiCl
2
) a serem utilizados. Em seguida, foram conduzidos os
experimentos utilizando-se células com 2 dias de crescimento. O período de exposição ao NiCl
2
foi de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h. As concentrações estabelecidas foram de 0; 0,075 e 0,750
mM.
Os experimentos foram repetidos 3 vezes e para cada tratamento, 3 repetições. Os ensaios
espectrofotométricos foram repetidos 3 vezes.
2.2.5 Extração protéica
As amostras de cada tratamento foram maceradas em mortar onde foi adicionado
nitrogênio líquido, até formar uma farinha. Em seguida, foi adicionado o tampão de extração (1 g
de tecido(p)/1,7 mL de tampão(v)).
O tampão de extração ou tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5) contém fosfato de
potássio dibásico (14,52 g K
2
HPO
4
/L de tampão), fosfato de potássio monobásico (2,27 g de
KH
2
PO
4
/L de tampão), 1 mM de ácido etileno diamino tetracético (0,372 g de EDTA/L de
tampão), 3 mM de ditiotreitol (0,462 g de DTT/L de tampão) e 4% (p/v) de polivinil
polipirrolidona (PVPP).
O homogeneizado foi centrifugado à 10.000 rpm, por 30 minutos, à 4°C. O sobrenadante
foi coletado, alíquotado e estocado em freezer -80°C até o momento das análises.
2.2.6 Determinação de proteínas
A determinação das concentrações de proteínas totais foi realizada pelo método de
Bradford (1976), utilizando-se soro albumina bovina (BSA) como padrão.
29
2.2.7 Atividade das enzimas antioxidantes
Para os ensaios enzimáticos foram utilizados extratos provenientes de amostras de células
de fumo expostas as concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12,
24, 36, 48, 72 e 96h, congelados a -80°C.
2.2.7.1 Atividade de superóxido dismutase (SOD)
A atividade de SOD foi determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
não-desnaturante.
2.2.7.1.1 Atividade em PAGE não-desnaturante
A atividade de SOD em PAGE não-desnaturante foi determinada através dos extratos
vegetais, cujas proteínas foram separadas por eletroforese em gel (8%). O gel possui espessura de
3,0 mm, altura de 6,5 cm e largura de 7,3 cm, contendo 4,0 mL de solução 40% de
acrilamida/bis-acrilamida (Sigma), 5,0 mL de tampão tris (hidroximetil)-aminometano (TRIS)
2,9 M (pH 8,9) e 11,0 mL de água deionizada (d.d.). Como catalisadores foram utilizados 38,0
µL de N, N, N', N'-tetrametilenodiamina (TEMED) e 50,0 µL de persulfato de amônia (PA)
(10%).
Após a polimerização, 9,0 mL de gel de empilhamento foram aplicados sobre o gel
principal. Foram utilizados para este gel 1,0 mL da solução 40% de acrilamida/bis-acrilamida
(Sigma), 2,5 mL de tampão TRIS 0,5 M (pH 6,8) e 5,5 mL de água d.d. Para a polimerização do
gel foram utilizados 20,0 µL de TEMED e 100,0 µL de PA (10%).
A eletroforese foi realizada a 4°C em corrente constante de 20 mA, por placa. O tampão
de eletrodo continha 15,2 g de TRIS 250 mM (pH 8,3) e 72,0 g de glicina (Gly) (192 mM), onde,
150,0 mL deste tampão foram misturados em 600,0 mL de água d.d. O padrão utilizado foi duas
unidades de SOD de fígado de boi (Sigma) e a concentração de proteínas das amostras foi de 60,0
µg.
30
Após a separação das proteínas por eletroforese, a atividade de SOD foi determinada
como descrito por Beuchamp; Fridovick (1971). Os géis foram lavados em água d.d. e incubados
no escuro à temperatura ambiente em uma mistura de reação contendo 50 mM de tampão fosfato
de potássio pH 7,8, 1 mM de EDTA, 0,05 mM de riboflavina, 0,1 mM de nitro blue tetrazolium
(NBT) e 0,3% de TEMED.
Depois de 30 minutos, a mistura da reação foi removida, os géis lavados com água d.d. e
colocados sob iluminação até o aparecimento das bandas negativas sob fundo roxo. Nestas
condições, ocorre a fotoxidação do gel com a formação de uma coloração púrpura e as bandas
correspondentes a atividade de SOD permanecem sem fotoxidar, promovendo uma revelação
negativa. A fotoxidação é interrompida com solução de água d.d. e ácido acético 7%.
2.2.7.1.2 Determinação das isoformas de SOD
Para a determinação das isoformas de SOD foi realizada uma eletroforese com 60,0 µg de
proteína do tratamento 0 mM de NiCl
2
, 36h, nas condições anteriormente descritas para SOD.
Em seguida, o gel foi dividido verticalmente em três partes. Uma delas foi mantida à 4°C em
tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 7,8. Outra foi imersa em 100,0 mL do mesmo tampão
contendo 0,0292 g de EDTA e 0,0130 g de KCN e a terceira, imersa em 100,0 mL do referido
tampão acrescido de 0,0292 g de EDTA e 70,0 µL de H
2
O
2
. Todos os passos descritos foram
realizados no escuro.
Após 20 minutos nestas soluções, os géis foram submetidos a revelação com NBT e
riboflavina, como citado anteriormente. Ao final da revelação, foi analisada a presença ou
ausência de bandas no controle, e nos tratamentos com KCN e H
2
O
2
. As bandas foram então
classificadas como Cu/Zn-SOD, Fe-SOD ou Mn-SOD. A Cu/Zn-SOD é inativada por KCN e
H
2
O
2
e em geral ocorre no citoplasma e no cloroplasto. Fe-SOD é inativada por H
2
O
2
e resistente
a KCN, ocorrendo no cloroplasto. A forma Mn-SOD é resistente a ambos (KCN e H
2
O
2
) e está
presente nas mitocôndrias (AZEVEDO et al., 1998).
31
2.2.7.2 Atividade de catalase (CAT)
A atividade de catalase foi determinada por espectrofotometria e em eletroforese em gel
de poliacrilamida (PAGE) não-desnaturante.
2.2.7.2.1 Atividade em espectrofotômetro
A atividade de catalase foi determinada segundo Kraus et al. (1995) com algumas
modificações conforme Azevedo et al. (1998).
Em espectrofotômetro, a catalase foi determinada à 25°C, em solução contendo 1,0 mL de
tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5) e 0,025 mL de H
2
O
2
(solução 0,25%) preparado
imediatamente antes do uso. A reação foi iniciada pela adição de 0,015 mL de extrato vegetal e a
atividade determinada seguindo-se a decomposição de H
2
O
2
por 1 minuto, através das alterações
na absorbância à 240 ηm. Os resultados são expressos em µmol/min/mg de proteína.
2.2.7.2.2 Atividade em PAGE não-desnaturante
A eletroforese foi realizada em PAGE (8%), como descrito para SOD. Para cada gel,
foram aplicadas amostras de 2 unidades de padrão de CAT de fígado de boi (Sigma) e 60,0 µg de
proteína dos extratos dos tratamentos de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
.
A revelação para a atividade de CAT foi realizada após a lavagem do gel por 45 minutos
em água d.d. (3x15 min) e incubação do mesmo por 10 minutos em H
2
O
2
(0,003%), à
temperatura ambiente, com agitação constante. Após este período, o gel foi lavado em água d.d. e
colocado em solução de cloreto férrico (FeCl
3
) 1% (p/v) e ferricianeto de potássio (K
2
Fe(CN
6
))
1% (p/v), por 10 minutos, com agitação. A solução foi retirada e o gel lavado com água d.d.. Para
a fixação, utilizou-se solução de ácido acético 7%.
2.2.7.3 Atividade de glutationa redutase (GR)
A atividade da GR foi determinada por espectrofotometria e em PAGE não-desnaturante.
32
2.2.7.3.1 Atividade em espectrofotômetro
A atividade da GR foi determinada de acordo com Smith et al. (1988), com algumas
modificações. Em espectrofotômetro, à 30°C, em uma solução contendo 1,0 mL de tampão
fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5), 0,5 mL de 5,5' ditiobis (2-ácido nitrobenzóico) (DTNB)
1mM, 0,1 mL de GSSG 1 mM e 0,1 mL de NADPH 0,1 mM. A reação inicia-se com a adição de
0,050 mL de extrato vegetal. A atividade da GR foi estimada pela redução da GSSG,
acompanhada por monitoramento na alteração da absorbância à 412 ηm. Os valores de atividade
foram expressos em µmol/min/mg de proteína.
2.2.7.3.2 Atividade em PAGE não-desnaturante
A atividade da GR foi revelada segundo Lee; Lee (2000). Depois da eletroforese em
PAGE (8%), como descrito em SOD, utilizando-se como padrão uma unidade de GR, o gel foi
lavado com água d.d. e incubado em temperatura ambiente em 50,0 mL de solução contendo 0,25
M de TRIS (pH 7,5) (1,514 g de TRIS), 10,0 mg de MTT, 10,0 mg de dicloroindolacético
(DPIP), 2,4 mM GSSG (0,1041g de GSSG) e 0,5 mM de NADPH (0,0208g de NADPH). A
reação foi interrompida com ácido acético 7%, após o aparecimento das bandas.
2.2.7.4 Atividade de glutationa-S-transferase (GST)
A atividade da GST foi determinada por espectrofotometria.
2.2.7.4.1 Atividade em espectrofotômetro
A atividade de GST foi determinada como descrito por Anderson (1995), com algumas
modificações. Em solução contendo 0,9 mL de tampão fosfato de potássio monobásico 100 mM
(pH 6,5) e 0,05 mL de GSH 100 mM foram adicionados 0,025 mL de amostra e 0,025 mL de 1-
cloro 2,4-dinitrobenzeno (CDNB) 40 mM, à 30°C. O monitoramento da absorbância foi feito por
10 minutos, à 340 ηm. A atividade foi expressa em µmol/min/mg de proteína.
33
2.2.7.5 Atividade de guaiacol peroxidase (GPX)
A atividade de GPX foi determinada por espectrofotometria.
2.2.7.5.1 Atividade em espectrofotômetro
A atividade de GPX foi determinada de acordo com Matsuno; Uritani (1972), padronizada
no Laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima Temperado.
A solução contendo 0,375 mL de tampão fosfato-citrato (solução fosfato de sódio
dibásico 0,2 M e ácido cítrico 0,1 M) (pH 5,0), 0,025 mL de extrato vegetal, 0,025 mL de
guaiacol 0,5% e 0,025 mL de H
2
O
2
3%, foi misturada em vortex e incubada por 15 minutos à
30°C. Em seguida, esta solução foi colocada em banho de gelo e adicionou-se 0,025 mL da
solução de metabissulfito de sódio 2%, sendo em seguida misturada em vortex e colocada em
repouso por 10 minutos. A leitura de absorbância foi em 450 ηm e a atividade enzimática
expressa em µmol/min/mg de proteína.
2.2.7.6 Atividade de ascorbato peroxidase (APX)
A atividade de APX foi determinada por espectrofotômetro.
2.2.7.6.1 Atividade em espectrofotômetro
A atividade de APX foi determinada segundo Nakano; Assada (1981). Em 0,650 mL de
tampão fosfato de potássio 80 mM (pH 7,0), à 30°C, foi adicionado 0,1 mL de ascorbato, 0,1 mL
de EDTA, 0,1 mL de H
2
O
2
e 0,05 mL de extrato vegetal. A atividade foi monitorado por 2
minutos, em uma absorbância de 290 ηm e expressa em µmol/min/mg de proteína.
2.2.8 Peroxidação de lipídios
A peroxidação de lipídios foi determinada através da produção de metabólitos reativos a
ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), principalmente o malonaldeído (MDA), segundo Heath; Packer
34
(1968) e Buege; Aust (1978). Amostras pesando 0,1 g foram maceradas com 1,3 mL de TCA
(0,1%) juntamente com 20% de PVPP. Após a homogeneização, 1,0 mL foi transferido para
tubos eppendorf e centrifugados a 10.000 rpm por 5 minutos. Do sobrenadante, foi retirado 0,25
mL ao qual foi adicionado 1,0 mL de TCA 20% e TBA 0,5%. A mistura foi colocada em banho
seco por 30 minutos, à 95°C e resfriada em gelo, na seqüência. As amostras foram centrifugadas
por 10 minutos à 10.000 rpm. A leitura foi realizada em espectrofotômetro à 535 e 600 ηm. A
quantidade de MDA é expressa em mmol/mg de tecido fresco.
2.2.9 Gel SDS-PAGE
A eletroforese em sistemas SDS-PAGE é empregada em estudos de proteínas, o qual
utiliza um agente dissociante para desnaturá-las em subunidades. O agente dissociante
comumente utilizado é o detergente iônico dodecil sulfato de sódio (SDS). A mistura de proteína
é desnaturada pelo aquecimento, na presença do SDS e mercaptoetanol, cuja função é quebrar as
ligações dissulfeto. Esta eletroforese ocorre em cuba vertical, em sistema de tampão descontínuo
e desnaturante, utilizando-se mini-gel no tamanho de 8,3 x 10,2 cm na concentração de
acrilamida de acordo com Laemmli (1970). As soluções estoques são descritas como segue.
O tampão de corrida (5x concentrado) contém 15,2 g de TRIS (25 mM), 72,0 g de glicina
(192 mM) (pH 8,3) e 1% SDS (10%). O tampão do gel principal contém 36,3 g de TRIS (pH 8,9)
e o tampão do gel de empacotamento, 6,0 g de TRIS (pH 6,7).
Para a preparação de 2 géis na concentração de 10% de acrilamida, foram utilizados no
gel de resolução (principal) 5,0 mL de acrilamida/bis-acrilamida (40%), 5,0 mL do tampão do gel
principal, 10,0 mL de H
2
O destilada, 200,0 µL SDS (10%), 38,0 µL de TEMED e 50,0µL de PA
(10%).
Para o gel de empacotamento, 1,0 mL de acrilamida/bis-acrilamida (40%), 2,5 mL de
tampão de empacotamento, 5,5 mL de H
2
O destilada, 100,0 µL de SDS (10%), 20,0 µL de
TEMED e 100,0 µL de PA (10%).
O tampão de amostra contém 3,0 mL de H
2
O destilada, 1,0 mL de tampão de
empacotamento, 1,6 mL de glicerol, 1,6 mL de SDS (10%), 0,4 mL de solução 0,5% de azul de
bromofenol e 0,4 mL mercaptoetanol. A corrida foi realizada em amperagem constante de 20 mA
por placa.
35
2.2.10 Delineamento experimental
Os tratamentos foram dispostos de forma inteiramente casualizada, com 3 repetições. Para
a análise estatística foi empregado o teste de Tukey, utilizando o programa ESTAT desenvolvido
pela Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária - UNESP, Jaboticabal.
2.3 Resultados
2.3.1 Determinação das concentrações tóxicas e/ou estimuladoras do crescimento das células
in vitro
Análises preliminares foram realizadas para a determinação dos períodos de exposição
das células e das concentrações de Ni a serem utilizadas. A Tabela 1 e a Figura 1 mostram as
concentrações analisadas e os tempos de exposição. A Tabela 2, referente à análise estatística
(análise fatorial com dois fatores, teste de Tukey, programa ESTAT), demonstrou que ocorreu
diferenças significativas entre as concentrações e entre os períodos analisados e que ocorreu
interação entre as concentrações e os tempos, com relação ao controle. As Tabelas 3 e 4 mostram
que todas as concentrações (3) e os tempos (4), com exceção do tempo 0h, apresentam pelo
menos um valor diferindo da média com relação ao tempo de exposição e às concentrações,
respectivamente.
A concentração de 0,750 mM de NiCl
2
foi escolhida por apresentar viabilidade celular,
através da contagem das células coradas com trypan blue, em torno de 62,8% para os períodos de
exposição. As concentrações de 1,000 mM e 2,000 mM resultaram na queda expressiva da
viabilidade, no decorrer do tempo de exposição ao metal, prejudicando as análises.
Consequentemente, foi escolhida a concentração de 0,075 mM por ser um valor 10x menor.
A viabilidade das células para as concentrações de Ni selecionadas, 0; 0,075 e 0,750 mM,
pode ser observada na Figura 2. A Tabela 5 fornece a média das células viáveis para cada
período, a Tabela 6 demonstra que ocorreu diferença significativa entre as concentrações e os
períodos de exposição e que também ocorreu interação entre estes fatores, com relação ao
controle. Nas Tabelas 7 e 8, observa-se que todas as concentrações (7) e os tempos (8), com
36
exceção do tempo 0h, apresentam pelo menos um valor diferindo da média com relação ao tempo
de exposição e as concentrações, respectivamente.
O efeito do metal pode ser comprovado pela análise da curva de crescimento, Figura 3.
Observou-se o crescimento gradativo das células do controle e da concentração de 0,075 mM, no
decorrer do tempo, as células expostas ao tratamento de 0,750 mM apresentaram redução no
crescimento.
A Tabela 9 fornece as médias do crescimento do número de células. Observa-se que
ocorreu diferenças significativas entre as concentrações e os períodos de exposição, além da
interação entre os fatores, como demonstra a Tabela 10. Entre todas as concentrações ocorreu
pelo menos um valor que difere da média para os diferentes tempos (Tabela 11) e o mesmo
ocorreu com os tempos, com exceção do tempo 0h, com relação as concentrações (Tabela 12).
37
Figura 1 - Viabilidade das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas às concentrações de 0; 0,050; 0,075;
0,100; 0,150; 0,200; 0,500; 0,750; 1,000 e 2,000 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 24, 48, 72 e 96h, em
porcentagem (%)
Tabela 1 - Média da viabilidade das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 expostas às concentrações de NiCl
2,
por
determinados tempos, em porcentagem (%)
Concentração
(mM NiCl
2
)
0
24
Tempo (h)
48
72
96
Controle 96,0 94,6 96,3 96,2 95,2
0,050 96,0 87,5 89,4 89,2 88,8
0,075 96,0 90,7 96,1 97,5 94,5
0,100 96,0 92,3 82,8 79,6 78,6
0,150 96,0 95,5 95,6 87,9 84,7
0,200 96,0 90,3 88,6 89,5 85,2
0,500 96,0 87,6 81,3 86,6 80,2
0,750 96,0 66,2 54,5 49,4 48,0
1,000 96,0 40,0 32,7 28,8 15,0
2,000 96,0 19,2 4,7 1,4 1,0
Tempo de exposição ao metal (h)
Viabilidade celular (%)
20
40
60
80
100
120
024487296
C
0,05
0,075
0,1
0,15
0,2
0,5
0,75
1
2
38
Tabela 2 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises da viabilidade
celular (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 9 83213,2721 9245,9191 397389,0739**
Tempo 4 15621,0471 3905,2618 167847,9269**
Conc x Tempo 36 22628,5756 628,5715 27015,9690**
Tratamentos 49 121462,8947 2478,8346
Resíduos 100 2,3267 0,0233
** 1% de significância; CV = 0,1994; DP = 0,1525
Tabela 3 - Análise de variância da Tabela 2 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 4 6,2640 1,5660 67,3066**
0,050 4 133,1560 33,2890 1430,7593**
0,075 4 81,4867 20,3717 875,5731**
0,100 4 732,7107 183,1777 7872,9656**
0,150 4 333,7400 83,4350 3586,0315**
0,200 4 185,1240 46,2810 1989,1547**
0,500 4 474,7307 118,6827 5100,9742**
0,750 4 4734,9493 1183,7373 50876,9628**
1,000 4 11721,7107 2930,4277 125949,6132**
2,000 4 19845,7507 4961,4377 213242,3066**
Tabela 4 - Análise de variância da Tabela 2 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 9 0,0000 0,0000 0,0000 NS
24 9 18871,7937 2096,8660 90123,1789**
48 9 26650,3013 2961,1446 127269,8249**
72 9 29110,5230 3234,5026 139018,7345**
96 9 31209,2297 3467,6922 149041,2114**
NS = não significativo
39
Figura 2 - Viabilidade das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas às concentrações de 0; 0,075 e 0,750
mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 24, 48, 72 e 96h, em porcentagem (%)
Tabela 5 - Média da viabilidade das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas as concentrações de 0; 0,075
e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 24, 48, 72 e 96h, em porcentagem (%)
Tempo (h) Controle 0,075 0,750
0 96,0 96,0 96,0
24 94,6 90,7 66,2
48 96,2 96,0 54,7
72 96,0 97,5 49,6
96 95,4 94,6 48,1
Tempo de exposição ao metal (h)
20
40
60
80
100
120
024487296
C
0,075
0,75
Viabilidade celular (%)
40
Tabela 6 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises da viabilidade
celular (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 2 10481,5696 5240,7847 298525,7089**
Tempo 4 1580,8209 395,2052 22511,6899**
Conc x Tempo 8 3205,8551 400,7319 22826,5000**
Tratamentos 14 15268,2453 1090,5890
Resíduos 30 0,5267 0,0176
** 1% de significância; CV = 0,1568; DP = 0,1325
Tabela 7 - Análise de variância da Tabela 6 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 4 4,9307 1,2327 70,2152**
0,075 4 78,9827 19,7457 1124,7532**
0,750 4 4702,7627 1175,6907 66969,7215**
Tabela 8 - Análise de variância da Tabela 6 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 2 0,0000 0,0000 0,0000NS
24 2 1426,9267 713,4633 40640,3165**
48 2 3416,9489 1708,4744 97318,1646**
72 2 4449,6200 2224,8100 126729,6835**
96 2 4393,9289 2196,9644 125143,5443**
NS = não significativo
41
Figura 3 - Crescimento das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas as concentrações de 0; 0,075 e 0,750
mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 24, 48, 72 e 96h, em porcentagem (%)
Tabela 9 - Média do crescimento das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas as concentrações de 0; 0,075
e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 24, 48, 72 e 96h, em porcentagem (%)
Tempo (h) Controle 0,075 0,750
0 15,5 15,5 15,5
24 26,8 28,8 25,0
48 43,7 45,5 32,2
72 61,6 64,5 36,6
96 70,4 67,8 38,2
Tempo de exposição ao metal (h)
Crescimento celular (%)
10
20
30
40
50
60
70
80
024487296
C
0,075
0,75
42
Tabela 10 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises do
crescimento celular (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 2 2110,4440 1055,2220 45658,6442**
Tempo 4 11940,8320 2985,2080 129167,6538**
Conc x Tempo 8 1552,4627 194,0578 8396,7332**
Tratamentos 14 15603,7387 1114,5528
Resíduos 30 0,6933 0,0231
** 1% de significância; CV = 0,3879; DP = 0,1520
Tabela 11 - Análise de variância da Tabela 10 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 4 6345,9240 1586,4810 68645,8125**
0,075 4 6095,6000 1523,9000 6537,9808**
0,750 4 1051,7707 262,9427 11377,3269**
Tabela 12 - Análise de variância da Tabela 10 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 2 0,0000 0,0000 0,0000NS
24 2 22,0689 11,0344 477,4519**
48 2 313,0289 156,5144 6772,2596**
72 2 1406,2467 703,1233 30423,6058**
96 2 1921,5622 960,7811 41572,2596**
NS = não significativo
43
2.3.2 Atividade de superóxido dismutase em PAGE não-desnaturante
2.3.2.1 Atividade de SOD em PAGE não-desnaturante
Os resultados da atividade de SOD em PAGE não-desnaturante demostraram que não
ocorreu variação expressiva da atividade da enzima tanto para as concentrações, como para os
períodos de exposição ao metal. Foi possível observar duas isoformas, Mn-SOD (I), resistente à
presença de KCN e H
2
O
2
e Fe-SOD (II), resistente à KCN e inativada na presença de H
2
O
2
,
através da análise das amostras do controle (0 mM) para o tempo de 36h.
Figura 4 - Atividade de SOD em PAGE não-desnaturante em células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas aos
tratamentos com NiCl
2
. Padrão (P) de SOD de fígado bovino; 1, 2 e 3 representam a concentração de 0
mM nos tempos 12, 36 e 72h; 4, 5 e 6 representam a concentração de 0,075 mM e 7, 8 e 9, a
concentração de 0,750mM, para os mesmos tempos
2.3.2.2 Isoenzimas de SOD
Figura 5 - Atividade das isoformas de SOD em PAGE não-desnaturante em células de Nicotiana tabacum cv BY-2.
Padrão (P) de SOD de fígado bovino; 1 (controle, 36h); 2 (controle, 36h, KCN) e 3 (controle, 36h, H
2
O
2
)
Mn-SOD
Fe-SOD
P 1 2 3 4 5 6 7 8 9
P 1 2 3
I
II
44
2.3.3 Atividade de catalase em espectrofotômetro e PAGE não-desnaturante
A atividade de catalase (Figura 6 e Tabela 13) apresentou diferenças significativas entre
as concentrações e durante o período de exposição ao metal, foi observado também a ocorrência
de interação entre as concentrações e os tempos, com relação ao controle (Tabela 14). Na
concentração de 0,075 mM ocorreu um aumento progressivo da atividade da enzima até às 48h,
seguido de queda até 72h, ocorrendo outro aumento da atividade até 96h. A concentração de
0,750 mM resultou também em um aumento da atividade, porém até às 36h de exposição ao
metal, após este período ocorreu uma diminuição até às 72h, seguida de aumento até 96h.
A maior atividade de CAT observada para o controle foi às 96h, para a concentração de
0,075 mM, foi às 48h e para a concentração de 0,750 mM, às 36h, sendo que esta concentração
possui, em média, a maior atividade detectada para a enzima, neste experimento.
A atividade de CAT em PAGE não-desnaturante (Figura 7) foi analisada nos tempos 12h,
36h e 72h, seguindo o padrão da análise em espectrofotômetro, sendo observada somente uma
isoforma.
Na Tabela 15 observa-se que todas as concentrações apresentaram pelo menos um valor
diferindo da média com relação aos períodos de exposição. Na Tabela 16, com exceção do
tempo 0h, os demais horários apresentaram pelo menos um valor diferindo da média para as
concentrações.
45
Figura 6 - Atividade específica de CAT (µmol/min/mg de proteína) em células de Nicotiana tabacum cv BY-2
submetidas às concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72
e 96h
Figura 7 - Atividade de CAT em PAGE não-desnaturante em células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas
aos tratamentos com NiCl
2
. Padrão (P) de CAT bovina; 1, 2 e 3 representam a concentração de 0 mM
nos tempos 12, 36 e 72h; 4, 5 e 6 representam a concentração de 0,075 mM e 7, 8 e 9, a concentração
de 0,750mM, para os mesmos tempos
P 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Atividade de CAT
(µmol/min/mg prote
ína)
Tempo de exposição ao metal (h)
5
10
15
20
25
0 3 6 122436487296
C
0,075
0,75
46
Tabela 13 - Média da atividade da enzima catalase das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetida às
concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h, em
µmol/min/mg de proteína
Tempo (h) Controle 0,075 0,750
0 8,614 8,614 8,614
3 6,487 7,578 9,675
6 6,197 7,015 7,609
12 7,026 8,256 9,125
24 8,546 11,439 10,322
36 8,274 13,462 19,232
48 11,972 16,651 12,200
72 4,203 2,237 5,093
96 12,938 12,991 12,057
Tabela 14 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises da atividade
enzimática da catalase (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 2 68,3139 34,1569 160687,1270**
Tempo 8 793,9664 99,2458 466889,8903**
Conc x Tempo 16 206,4248 12,9016 60693,7898**
Tratamentos 26 1068,7051 41,1040
Resíduos 54 0,0115 0,0002
** 1% de significância; CV = 0,1535; DP = 0,0146
47
Tabela 15 - Análise de variância da Tabela 14 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 8 183,7489 22,9686 108053,0758**
0,075 8 440,7774 55,0972 259197,9911**
0,750 8 375,8649 46,9831 221026,4030**
Tabela 16 - Análise de variância da Tabela 14 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 2 0,0000 0,0000 0,0000NS
3 2 15,7510 7,8755 37049,4179**
6 2 3,0172 1,5086 7097,0049**
12 2 6,6679 3,3340 15684,2307**
24 2 12,7784 6,3892 30057,2678**
36 2 180,2752 90,1376 424041,5490**
48 2 41,7747 20,8873 98261,9854**
72 2 12,8204 6,4102 30156,0634**
96 2 1,6537 0,8269 3889,9262**
NS = não significativo
48
2.3.4 Atividade de glutationa redutase em espectrofotômetro e em PAGE não-desnaturante
A atividade de GR (Figura 8 e Tabela 17) apresentou diferenças significativas entre as
concentrações e os períodos de exposição, além da interação entre os fatores, com relação ao
controle (Tabela 18). Para a concentração de 0,075 mM ocorreu um aumento progressivo da
atividade até às 36h, seguido de queda até 72h e significativo aumento até às 96h. No tratamento
de 0,750 mM de NiCl
2
a atividade da enzima aumentou durante as primeiras 6h de exposição e
em seguida houve uma queda da atividade até às 72h, seguida do aumento desta até 96h.
A maior atividade desta enzima, para o controle, foi observada às 96h. Para a
concentração de 0,075 mM, este pico ocorreu às 36h e às 6h de exposição das células a
concentração de 0,750 mM. A concentração de 0,750 mM de NiCl
2
possui, em média, a maior
atividade da enzima, neste experimento.
A atividade em PAGE não-desnaturante (Figura 9) foi observada nos três tratamentos,
para os tempos de 12h, 36h e 72h, seguindo o padrão da análise em espectrofotômetro.
Observou-se duas isoformas.
A Tabela 19 demonstra que todas as concentrações apresentaram pelo menos um valor
diferindo da média com relação aos períodos de exposição ao metal. Estes períodos, com
exceção do tempo 0h, apresentaram pelo menos um valor diferindo da média com relação as
concentrações (Tabela 20).
49
Figura 8 - Atividade específica de GR (µmol/min/mg de proteína) em células de Nicotiana tabacum cv BY-2
submetidas às concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48,
72 e 96h
Figura 9 - Atividade de GR em PAGE não-desnaturante em células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas
aos tratamentos com NiCl
2
. Padrão (P) de GR; 1, 2 e 3 representam a concentração de 0 mM nos
tempos 12, 36 e 72h; 4, 5 e 6 representam a concentração de 0,075 mM e 7, 8 e 9, a concentração de
0,750 mM, para os mesmos tempos
Tempo de exposição ao metal (h)
Atividade de GR
(µmol/min/mg prote
ína)
P 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 3 6 122436487296
C 0,075 0,75
50
Tabela 17 - Média da atividade da enzima glutationa redutase das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetida
às concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h, em
µmol/min/mg de proteína
Tempo (h) Controle 0,075 0,750
0 0,586 0,586 0,586
3 0,468 0,538 0,829
6 0,457 0,587 1,282
12 0,463 0,683 0,831
24 0,362 0,751 0,818
36 0,380 0,858 0,636
48 0,361 0,440 0,556
72 0,267 0,273 0,287
96 0,710 0,292 0,635
Tabela 18 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises da atividade
enzimática da glutationa redutase (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 2 0,9776 0,4888 36489,2636**
Tempo 8 1,4538 0,1817 13566,2373**
Conc x Tempo 16 1,6909 0,1057 7889,4887**
Tratamentos 26 4,1222 0,1585
Resíduos 54 0,0007 0,0000
** 1% de significância; CV = 0,6367; DP = 0,5748
51
Tabela 19 - Análise de variância da Tabela 18 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 8 0,4222 0,0528 3940,2525**
0,075 8 0,9328 0,1166 8704,8276**
0,750 8 1,7896 0,2237 16700,1346**
Tabela 20 - Análise de variância da Tabela 18 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 2 0,0000 0,0000 0,0000NS
3 2 0,2199 0,1100 8208,3235**
6 2 1,1793 0,5896 44019,1161**
12 2 0,2057 0,1029 7679,2479**
24 2 0,3637 0,1819 13577,6157**
36 2 0,3438 0,1719 12832,8470**
48 2 0,0574 0,0287 2140,9963**
72 2 0,0006 0,0003 23,5908**
96 2 0,2980 0,1490 11123,4276**
NS = não significativo
52
2.3.5 Atividade de glutationa-S-transferase em espectrofotômetro
A atividade de GST (Figura 10 e Tabela 21) demonstrou diferenças significativas entre
as concentrações e os períodos de exposição, e também a interação entre as concentrações e os
tempos, com relação ao controle (Tabela 22). A atividade do tratamento com 0,075 mM do
metal iniciou-se com queda até às 6h, porém, esta foi aumentando progressivamente até às 36h,
seguindo-se da diminuição da atividade da enzima até às 72h, com outro aumento observado até
às 96h. Para a concentração de 0,750 mM NiCl
2
ocorreu aumento da atividade até às 24h de
exposição, seguindo-se de queda até às 72h e aumento significativo até às 96h.
A maior atividade enzimática foi observada para o controle às 96h, às 36h para a
concentração de 0,075 mM e às 24h para 0,750 mM, sendo que esta concentração possui a maior
média da atividade de GST, neste experimento.
A análise estatística mostra que todas as concentrações apresentaram pelo menos um
valor diferindo da média com relação aos períodos de exposição (Tabela 23). A Tabela 24
mostra que com exceção do tempo 0h, pelo menos um valor de exposição está diferindo da
média com relação as concentrações.
53
Figura 10 - Atividade específica de GST (µmol/min/mg de proteína) em células de Nicotiana tabacum cv BY-2
submetidas às concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48,
72 e 96h
Tabela 21 - Média da atividade da enzima glutationa-S-transferase das células de Nicotiana tabacum cv BY-2
submetida às concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48,
72 e 96h, em µmol/min/mg de proteína
Tempo (h) Controle 0,075 0,750
0 9,386 9,386 9,386
3 8,874 8,638 13,488
6 7,953 8,500 15,001
12 7,154 12,163 17,952
24 7,036 15,323 19,296
36 6,532 20,881 11,957
48 9,092 11,769 10,985
72 7,667 7,939 5,813
96 10,714 9,964 10,292
Tempo de exposição ao metal (h)
Atividade de GST
(µmol/min/mg prote
ína)
5
10
15
20
25
036122436487296
C
0,075
0,75
54
Tabela 22 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises da atividade
enzimática da glutationa-S-transferase (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 2 286,9698 143,4849 8745129,8247**
Tempo 8 301,4547 37,6818 2296635,3523**
Conc x Tempo 16 595,3354 37,2085 2267784,3845**
Tratamentos 26 1183,7599 45,5292
Resíduos 54 0,0009 0,0000
** 1% de significância; CV = 0,0373; DP = 0,0041
Tabela 23 - Análise de variância da Tabela 22 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 8 43,5409 5,4426 331716,8200**
0,075 8 419,1148 52,3893 3193030,1682**
0,750 8 434,4344 54,2668 3307457,1332**
Tabela 24 - Análise de variância da Tabela 22 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 2 0,0000 0,0000 0,0000NS
3 2 44,8672 22,4336 1367284,6321**
6 2 92,2275 46,1137 2810544,0203**
12 2 175,2105 87,6052 5339370,8059**
24 2 234,7941 117,3970 7155124,7878**
36 2 314,9622 157,4811 958170,9413**
48 2 11,3644 5,6822 346320,2235**
72 2 8,0312 4,0156 244742,3837**
96 2 0,8482 0,4241 25847,1061**
NS = não significativo
55
2.3.6 Atividade de guaiacol peroxidase em espectrofotômetro
A atividade da enzima GPX (Figura 11 e Tabela 25) apresentou diferenças significativas
entre os tratamentos e os períodos de exposição ao metal, e interação entre as concentrações e os
períodos de exposição, com relação ao controle(Tabela 26). Na concentração de 0,075 mM
ocorreu queda na atividade até às 6h. Em seguida, ocorreu um aumento significativo até às 72h,
seguido de queda até às 96h. Foi observado para a concentração de 0,750mM queda nas primeiras
3h, seguindo-se de aumento progressivo até às 72h, com queda até às 96h de exposição.
A maior atividade enzimática observada neste experimento foi às 72h para as
concentrações e o controle. Em média, a concentração que provocou o maior aumento da
atividade foi 0,750mM.
A análise estatística mostra que todas as concentrações apresentaram pelo menos um
valor diferindo da média com relação aos períodos de exposição (Tabela 27). A Tabela 28
mostra que com exceção do tempo 0h, pelo menos um valor de exposição está diferindo da
média com relação as concentrações.
56
Figura 11 - Atividade específica de GPX (µmol/min/mg de proteína) em células de Nicotiana tabacum cv BY-2
submetidas às concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48,
72 e 96h
Tabela 25 - Média da atividade da enzima guaiacol peroxidase das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetida
às concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h, em
µmol/min/mg de proteína
Tempo (h) Controle 0,075 0,750
0 0,515 0,515 0,515
3 0,276 0,368 0,448
6 0,209 0,147 0,679
12 0,732 0,165 0,826
24 0,669 0,651 0,939
36 0,837 1,540 1,256
48 1,035 1,876 2,196
72 3,266 2,031 3,922
96 1,096 1,421 1,612
Tempo de exposição ao metal (h)
Atividade de GPX
(µmol/min/mg prote
ína)
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
03 6122436
48
72 96
C
0,075
0,75
57
Tabela 26 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises da atividade
enzimática da guaiacol peroxidase (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 2 3,1419 1,5709 155368,3626**
Tempo 8 55,6257 6,9532 687679,9313**
Conc x Tempo 16 7,2468 0,4529 44795,0302**
Tratamentos 26 66,0144 2,5390
Resíduos 54 0,0005 0,0000
** 1% de significância; CV = 0,2883; DP = 0,0032
Tabela 27 - Análise de variância da Tabela 26 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 8 20,1703 2,5213 249357,9890**
0,075 8 13,4141 1,6768 165833,9093**
0,750 8 29,2881 3,6610 362078,0934**
Tabela 28 - Análise de variância da Tabela 26 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 2 0,0000 0,0000 0,0000NS
3 2 0,0444 0,0222 2197,9780**
6 2 0,5078 0,2539 25109,4066**
12 2 0,8325 0,4163 41168,4725**
24 2 0,1562 0,0781 7722,5934**
36 2 0,7504 0,3752 37108,9780**
48 2 2,1576 1,0788 106694,6044**
72 2 5,5314 2,7657 273532,8462**
96 2 0,4084 0,2042 20193,7253**
NS = não significativo
58
2.3.7 Atividade de ascorbato peroxidase em espectrofotômetro
A atividade da enzima APX (Figura 12 e Tabela 29) também apresentou diferenças
significativas entre as concentrações e os períodos de exposição, e interação entre as
concentrações e os tempos, com relação ao controle (Tabela 30). A atividade da concentração de
0,075 mM iniciou-se com uma queda significativa às 3h, seguida do aumento progressivo, até o
período de 6h, em seguida, ocorreu outra queda até às 96h. Para 0,750 mM, observou-se um
aumento na atividade enzimática ate às 24h, seguido de queda até 72h de exposição ao metal e
aumento às 96h.
Em média, a concentração de 0,750 mM obteve a maior atividade de APX, sendo o pico
desta observado às 24h de exposição. A concentração de 0,075 mM obteve a maior atividade às
6h e o controle às 48h, neste experimento.
A análise estatística mostra que todas as concentrações apresentaram pelo menos um
valor diferindo da média com relação aos períodos de exposição (Tabela 31). A Tabela 32
mostra que com exceção do tempo 0h, pelo menos um valor de exposição está diferindo da
média com relação as concentrações.
59
Figura 12 - Atividade específica de APX (µmol/min/mg de proteína) em células de Nicotiana tabacum cv BY-2
submetidas às concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48,
72 e 96h
Tabela 29 - Média da atividade da enzima ascorbato peroxidase das células de Nicotiana tabacum cv BY-2
submetida às concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48,
72 e 96h, em µmol/min/mg de proteína
Tempo (h) Controle 0,075 0,750
0 0,065 0,065 0,065
3 0,027 0,071 0,092
6 0,022 0,315 0,143
12 0,046 0,134 0,192
24 0,044 0,111 0,371
36 0,039 0,131 0,108
48 0,078 0,099 0,058
72 0,033 0,033 0,013
96 0,031 0,025 0,048
Tempo de exposição ao metal (h)
Atividade de APX
(µmol/min/mg p
roteína)
0
,05
0,1
0
,15
0,2
0
,25
0,3
0
,35
0,4
0 3 6 122436487296
C
0,075
0,75
60
Tabela 30 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises da atividade
enzimática da ascorbato peroxidase (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 2 0,0905 0,0453 495,3957**
Tempo 8 0,2052 0,0256 280,7543**
Conc x Tempo 16 0,2754 0,0172 188,3795**
Tratamentos 26 0,5711 0,0220
Resíduos 54 0,0049 0,0001
** 1% de significância; CV = 10,7601; DP = 0,0096
Tabela 31 - Análise de variância da Tabela 30 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 8 0,0080 0,0010 10,9824**
0,075 8 0,1931 0,0241 264,2476**
0,750 8 0,2794 0,0349 382,2833**
Tabela 32 - Análise de variância da Tabela 30 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 2 0,0000 0,0000 0,0000NS
3 2 0,0066 0,0033 36,1324**
6 2 0,1301 0,0650 711,8876**
12 2 0,0324 0,0162 177,4547**
24 2 0,1790 0,0895 979,7554**
36 2 0,0138 0,0069 75,2749**
48 2 0,0024 0,0012 12,8741**
72 2 0,0008 0,0004 4,3784**
96 2 0,0009 0,0004 4,6739**
NS = não significativo
61
2.3.8 Peroxidação lipídica
2.3.8.1 Quantificação de MDA em espectrofotômetro
A quantificação de MDA (Figura 13 e Tabela 33) possui diferenças significativas entre as
concentrações e os períodos de exposição, e interação entre os fatores, com relação ao controle
(Tabela 34). A quantidade de MDA para a concentração de 0,075 mM diminuiu até às 6h, em
seguida, ocorreu um aumento até às 36h. Entre 12h e 24h, a variação da quantidade não foi
significativa. Às 48h ocorreu diminuição seguida do aumento da quantidade às 72h, seguido de
diminuição até às 96h.
Para a concentração de 0,750 mM observou-se uma diminuição da quantidade de MDA
até às 6h, seguindo-se de um aumento progressivo até às 36h. Às 48h de exposição ao metal
ocorreu uma diminuição da quantidade de MDA, em seguida, às 72h, ocorreu aumento,
finalizando-se com queda às 96h.
A média da quantidade de MDA foi maior para a concentração de 0,750 mM, sendo
observada no período de 72h de exposição. A concentração de 0,075 mM apresentou maior
quantidade às 36h e 72h, não sendo significativa a diferença entre estes dois tempos. O controle
apresentou a maior quantidade nos períodos de 3h, 24h, 48h e 72h, não sendo significativa a
diferença entre estes tempos.
A Tabela 36 mostra que com exceção do tempo 0h, pelo menos um valor de exposição
está diferindo da média com relação às concentrações. A análise estatística mostra que todas as
concentrações apresentaram pelo menos um valor diferindo da média com relação aos períodos
de exposição (Tabela 35).
62
Figura 13 – Quantidade de MDA (mmol/g de tecido) em células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas às
concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h
Tabela 33 - Média da quantidade do ácido malonaldeído das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetida às
concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h, em
mmol/g de tecido
Tempo (h) Controle 0,075 0,750
0 0,0045 0,0045 0,0045
3 0,0055 0,0034 0,0034
6 0,0045 0,0025 0,0029
12 0,0042 0,0033 0,0036
24 0,0051 0,0030 0,0043
36 0,0041 0,0087 0,0077
48 0,0052 0,0063 0,0061
72 0,0051 0,0086 0,0092
96 0,0016 0,0011 0,0019
Tempo de exposição ao metal (h)
Atividade de MDA
(mmol/g tecido)
0
,001
0
,002
0
,003
0
,004
0
,005
0
,006
0
,007
0
,008
0
,009
0,01
0 3 6 122436487296
C
0,075
0,75
63
Tabela 34 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises da quantidade
do ácido malonaldeído (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 2 0,0000 0,0000 32,7600**
Tempo 8 0,0003 0,0000 855,6975**
Conc x Tempo 16 0,0001 0,0000 149,6700**
Tratamentos 26 0,0003 0,0000
Resíduos 54 0,0000 0,0000
** 1% de significância; CV = 4,1636; DP = 0,0002
Tabela 35 - Análise de variância da Tabela 34 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 8 0,0000 0,0000 109,5075**
0,075 8 0,0002 0,0000 587,8575**
0,750 8 0,0001 0,0000 457,6725**
Tabela 36 - Análise de variância da Tabela 34 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 2 0,0000 0,0000 0,0000NS
3 2 0,0000 0,0000 119,0700**
6 2 0,0000 0,0000 90,7200**
12 2 0,0000 0,0000 17,0100**
24 2 0,0000 0,0000 90,9900**
36 2 0,0000 0,0000 474,1200**
48 2 0,0000 0,0000 27,8100**
72 2 0,0000 0,0000 397,1700**
96 2 0,0000 0,0000 13,2300**
NS = não significativo
64
2.3.9 Proteína
2.3.9.1 Quantificação de proteína em espectrofotômetro
Os teores de proteína (Figura 14 e Tabela 37) possuem diferenças significativas entre as
concentrações e os períodos de exposição, e possuem também interação entre os fatores, com
relação ao controle (Tabela 38). A quantidade de proteína para a concentração de 0,075 mM
aumentou até às 6h, em seguida, ocorreu uma diminuição até às 24h, outro aumento foi
observado às 48h, seguido de diminuição às 72h, finalizando com um aumento no teor de
proteína às 96h.
Para a concentração de 0,750 mM observou-se queda da quantidade de proteína até às
24h, seguindo-se de um aumento progressivo até às 48h. Às 72h foi observado uma queda e às
96h novamente um aumento no teor de proteína das células expostas ao metal.
A média do teor de proteína foi maior para o controle, sendo observada no período de
48h de exposição. A concentração de 0,075 mM apresentou maior quantidade de proteína às 6h.
A concentração de 0,750 mM apresentou o maior teor no período 0h, ou seja, quando o metal foi
colocado.
A Tabela 40 mostra que com exceção do tempo 0h, pelo menos um valor de exposição
está diferindo da média com relação as concentrações. A análise estatística mostra que todas as
concentrações apresentaram pelo menos um valor diferindo da média com relação aos períodos
de exposição (Tabela 39).
Em SDS-PAGE (Figura 15) os períodos analisados foram 12h, 36h e 72h de exposição,
seguindo o padrão da análise em espectrofotômetro.
65
Figura 14 - Quantificação de proteínas (mg/mL) em células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas as
concentrações de 0; 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h.
Tabela 37 - Média do teor de proteína das células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetida às concentrações de 0;
0,075 e 0,750 mM de NiCl
2
, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h, em mg/mL
Tempo (h) Controle 0,075 0,750
0 0,767 0,767 0,767
3 0,488 0,888 0,702
6 1,374 1,043 0,547
12 0,801 0,665 0,534
24 1,082 0,424 0,316
36 1,275 0,498 0,547
48 1,570 0,726 0,597
72 0,212 0,188 0,234
96 0,463 0,547 0,682
Tempo de exposição ao metal (h)
0
,
2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
03 612
24
36 48 72 96
C
0,075
0,75
Proteína (mg/mL)
66
2.3.9.2 Proteína em gel SDS-PAGE
Figura 15 - Proteína em gel SDS-PAGE em células de Nicotiana tabacum cv BY-2 submetidas aos tratamentos com
NiCl
2
. Padrão (P) BSA; 1, 2 e 3 representam a concentração de 0 mM nos tempos 12, 36 e 72h; 4, 5 e 6
representam a concentração de 0,075 mM e 7, 8 e 9, a concentração de 0,750mM, para os mesmos
tempos
P 1 2 3 4 5 6 7 8 9
67
Tabela 38 - Análise fatorial com 2 fatores, concentração e tempo, dos dados provenientes das análises da atividade
da peroxidação lipídica (Programa ESTAT)
Variação GL SQ QM F
Concentração 2 1,7280 0,8640 714106,1327**
Tempo 8 3,8632 0,4829 399132,5740**
Conc x Tempo 16 3,5799 0,2237 184930,7449**
Tratamentos 26 9,1711 0,3527
Resíduos 54 0,0001 0,0000
** 1% de significância; CV = 0,1587; DP = 0,011
Tabela 39 - Análise de variância da Tabela 38 com desdobramento do fator concentração
Variação (mM) GL SQ QM F
Controle 8 5,1255 0,6407 529552,5459**
0,075 8 1,5834 0,1979 163586,6633**
0,750 8 0,7342 0,0918 75854,8546**
Tabela 40 - Análise de variância da Tabela 38 com desdobramento do fator tempo
Variação (h) GL SQ QM F
0 2 0,0000 0,0000 0,0000NS
3 2 0,2404 0,1202 99353,4796**
6 2 1,0396 0,5198 429637,3163**
12 2 0,1067 0,0533 44087,5102**
24 2 1,0316 0,5158 426324,7653**
36 2 1,1377 0,5688 470158,9898**
48 2 1,6757 0,8379 692511,1531**
72 2 0,0031 0,0016 1293,8878**
96 2 0,0730 0,0365 30184,9898**
NS = não significativo
68
2.4 Discussão
A cultura de células é o crescimento desorganizado de massas celulares (células
indiferenciadas ou calos) que podem ser mantidas por longos períodos quando repicadas
rotineiramente para novo meio. Apresenta vantagem no estudo com metais pesados devido ao
fácil estabelecimento e a obtenção em elevadas quantidades, reduzindo o volume de solução
contendo o metal, diminuindo os resíduos (NAGATA et al., 1992). Neste estudo foram utilizadas
células não diferenciadas de fumo (Nicotiana tabacum L. cv Bright Yellow-2), para testar o
efeito do metal níquel (Ni) no sistema antioxidante da célula.
O Ni é considerado um micronutriente essencial pois é constitutivo da enzima urease,
participa do complexo enzimático hidrogenase, aumentando a eficiência da fixação do nitrogênio
por leguminosas e participa da síntese de fitoalexinas, aumentando a resistência das plantas às
doenças. Possui alta mobilidade sendo que sua acumulação ocorre de modo diferencial entre os
tecidos e ao longo do ciclo vital da planta, sendo maior nos grãos, nas folhas e nas partes jovens
(DIXON et al., 1975; POLACCO, 1977; KLUCAS et al., 1983; WALKER et al., 1985; BROWN
et al., 1987; MALAN; FARRANT, 1998; PAIVA et al., 2002).
Em altas concentrações pode modificar a absorção e o transporte do nitrato, inibir as
enzimas do Ciclo de Calvin, a biossíntese da clorofila, a glicólise, a assimilação do sulfato e pode
induzir a produção de espécies ativas de oxigênio (EAOs) (VAN ASSCHE; CLIJSTERS, 1990;
FOYER et al., 1997; CHUGH; SAWHNEY, 1999; LEE; LEUSTEK, 1999; PALACIOS;
MATAIX, 1999). Por esses motivos, essencialidade e fitotoxidez, este metal foi escolhido para o
estudo.
As concentrações de NiCl
2
e os períodos de exposição utilizados foram determinados em
análises preliminares onde as células de fumo cv BY-2 foram expostas às concentrações de
0,050; 0,075; 0,100; 0,150; 0,200; 0,500; 0,750; 1,000 e 2,000 mM de NiCl
2
nos períodos de 0,
24, 48, 72 e 96h.
As concentrações de 0,050 até 0,500 mM, apesar de apresentarem diferenças
significativas entre elas, não apresentaram diferenças expressivas com relação ao controle. As
concentrações de 1,000 e 2,000 mM provocaram a morte de elevado número de células, não
sendo interessante o uso destas para o estudo enzimático, pois poderia ocorrer prejuízos na
análise devido a presença reduzida de células viáveis.
69
A concentração de 0,750 mM de NiCl
2
apresentou viabilidade das células em torno de
63%, ou seja, ocorreu a morte celular, porém este valor não diminuiu drasticamente o número de
células viáveis, permitindo que os dados obtidos possuíssem maior credibilidade em se tratando
de garantir que as células a serem analisadas estavam sob efeito significativo do estressor metal.
De forma similar, foi escolhida a concentração de 0,075 mM por ser um valor dez vezes menor e
causar pouco efeito no crescimento das células. Entre as concentrações estudadas, nenhuma
estimulou o crescimento, com relação ao controle.
Em doses elevadas, os metais provocam um efeito deletério sobre o metabolismo celular,
diminuindo a viabilidade e consequentemente o crescimento (BARCELO; POSCHENRIEDER,
1990; PANDOLFINI et al., 1996). Plantas como crotalária (Crotalaria juncea L.), milho (Zea
mays L.) e células de café (Coffea arabica L.) em suspensão, expostas às concentrações de 0,500;
0,250 e 0,500 mM de Ni, respectivamente, tiveram seu crescimento reduzido (MISHRA et al.,
1974; BACCOUCH et al., 1998; CARDOSO et al., 2005; GOMES-JUNIOR et al., 2005). O
mesmo foi observado em células de fumo cv BY-2, em calos de cana-de-açúcar (Saccharum
officinarum L.) e em plântulas de soja (Glycine max (L) Merr), na presença das concentrações de
0,200; 5,0 e 0,500 mM de cádmio (Cd). Na concentração de 0,100 mM e 1,0 mM de Cd porém,
foi observado estímulo do crescimento das células de fumo cv BY-2 e nos calos de cana-de-
açúcar, com relação ao controle, respectivamente (FERREIRA et al., 2002; FORNAZIER et al.,
2002a,b; GRATÃO, 2003). Este efeito foi ainda observado no fungo Aspergillus nidulans, na
concentração de 0,025 mM de Cd, que apesar da sensibilidade ao crescimento na presença do
metal, nesta concentração apresentou estímulo ao mesmo (GUELFI, 2002).
As células das plantas possuem diversos mecanismos contra o estresse provocado por
metais pesados: 1) exclusão celular do metal, 2) adsorsão (fixação) de íons na parede celular, 3)
síntese de enzimas antioxidantes e 4) síntese de fitoquelatinas (PCs), agentes complexantes de
metais. Esses mecanismos podem competir entre si (TURNER; MARSHALL, 1972; COX et al.,
1976; LOLKEMA et al., 1986; RAUSER, 1995; NAKAZAWA et al., 2004).
Como já foi citado, elevadas concentrações de Ni podem induzir a produção de EAOs
(FOYER et al., 1997). As EAOs (radical superóxido (O
2
-
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
),
radical hidroxila (OH
-
) e oxigênio "singlet" (
1
O
2
)) são produtos gerados normalmente pelo
metabolismo dos organismos aeróbios e provocam estresse oxidativo, dependendo da
concentração, devido a ação tóxica e mutagênica sobre as células. Sua produção é estimulada por
70
fatores ambientais de estresse como a exposição a níveis elevados de luminosidade, seca, metais
pesados, concentração de sais, temperatura, radiação ultravioleta (UV), poluição do ar,
herbicidas, estresse físico e como resposta a estresses bióticos, tais como, o ataque de patógenos e
durante as reações fotoquímicas da fotossíntese (BOWLER et al., 1994; ANGELOVA et al.,
2000; MALLICK; MOHN, 2000).
As EAOs, em baixas concentrações, induzem genes de defesa e respostas adaptativas, em
altas concentrações podem dar início a morte celular. São consideradas moléculas sinalizadoras
de estresse e também podem ser sinais intrínsecos regulatórios do crescimento e desenvolvimento
da planta (VRANOVÁ et al., 2002).
As enzimas antioxidantes, que possuem a capacidade de remover, neutralizar ou limpar a
célula das EAOs, são a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), a glutationa redutase
(GR), a glutationa-S-transferase (GST), a guaiacol peroxidase (GPX) e a ascorbato peroxidase
(APX), além de outras que participam das rotas metabólicas as quais estas pertencem. A SOD,
associada ao tilacóide, converte o O
2
-
, produzido pela reação do oxigênio molecular dos
fotossistemas na reação de Meyer, em H
2
O
2
. Este é convertido pela CAT, nos peroxissomos e
pela APX, nos cloroplastos, em água (H
2
O). As moléculas de O
2
-
e H
2
O
2
que não foram
degradadas nos tilacóides, são degradadas no estroma pela SOD e APX. (SCANDALIOS,
1990;1993; FOYER et al., 1994; ALLEN, 1995; FADZILLAH et al., 1996; AZEVEDO et al.,
1998; GRATÃO, 2003).
A SOD caracteriza um grupo de metaloenzimas que catalisam a formação de H
2
O
2
a partir
de O
2
−
, livrando as células da oxidação por esse radical, sendo considerada a primeira enzima de
defesa contra danos provocados por EAOs (BOWLER et al., 1992; ALSCHER et al., 2002). É
classificada em três grupos, de acordo com o componente metálico de seu sítio ativo. O grupo
cobre/zinco (Cu/Zn-SOD), o grupo manganês (Mn-SOD) e o grupo ferro (Fe-SOD) (WINGSLE
et al., 1991; SCANDALIOS, 1993; NIYOGI, 1999; MALLICK; MOHN, 2000).
Neste estudo foi observado o comportamento das células de fumo expostas às
concentrações de 0 (controle), 0,075 e 0,750 mM de NiCl
2,
nos períodos de 12, 36 e 72h em
PAGE não-desnaturante. O ensaio enzimático em espectrofotômetro utilizado para a
determinação da atividade total da SOD foi passível de erro elevado e a repetibilidade desejada
não foi obtida, desta forma adotou-se apenas a análise em PAGE não-desnaturante.
71
A atividade da SOD não foi expressiva entre os três tratamentos, não apresentando um
padrão claro que pudesse sugerir uma ação específica da enzima com relação aos tratamentos
utilizados, seja para a distribuição das isoenzimas ou para a atividade total. Pode-se supor que
outros mecanismos de defesa foram acionados para conter os danos provocados pelo metal
quando em referência a geração do O
2
-
.
Em milho, verificou-se que o Ni foi capaz de inibir a atividade da SOD durante a primeira
hora de estresse, porém, nas raízes da mesma planta, não ocorreu alteração da atividade
(BACCOUCH et al., 1998; 2001). Em guandu (Cajanus cajan L.) ocorreu um aumento da
atividade da SOD, indicando que, provavelmente, a SOD é um importante intermediário no
processo de desintoxicação do Ni (RAO et al., 2000). Em alisso, uma planta hiperacumuladora de
Ni e Cd, foi observado que na espécie Alyssum maritimum L. a atividade de SOD aumentou na
presença dos dois metais, no entanto, em A. argentum ocorreu diminuição desta atividade
(SCHICKLER; CASPI, 1999).
Foram observadas duas isoformas de SOD, as quais foram classificadas como Mn-SOD e
Fe-SOD, em todos os tratamentos. As isoformas da Mn-SOD são encontradas na matriz
mitocôndrial de células eucarióticas e em células procarióticas, embora, a Mn-SOD associada à
membrana, tenha sido observada nos cloroplastos de algumas plantas. A Fe-SOD foi observada
em algumas famílias de plantas e está associada principalmente aos cloroplastos (MALLICK;
MOHN, 2000).
As isoformas de SOD apresentam semelhanças entre as espécies vegetais, porém, o
número e o grupo destas são variáveis. A Mn-SOD tem sido encontrada em praticamente todas as
espécies analisadas, incluindo espécies de distintos grupos vegetais. Na presença de Cd observou-
se a Mn-SOD em soja e crotalária (FERREIRA et al., 2002; PEREIRA et al., 2002). A Fe-SOD é
relativamente rara em plantas quando comparadas a Mn-SOD e Cu/Zn-SOD, sendo encontrada
em arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.), com a função de catalisar a produção de H
2
O
2
formado
durante a β-oxidação de ácidos graxos e nos peroxissomos das folhas, durante a fotorrespiração,
transformando o glicolato em glioxilato (HAVIR; McHALE, 1989; KLIEBENSTEIN et al.,
1998).
Em milho e cana-de-açúcar foram observadas sete isoformas de SOD
(GIANNOPOLITIS; RIES, 1977; FORNAZIER et al., 2002a,b). Células em suspensão de café,
72
na presença de Ni, apresentaram nove isoformas (GOMES-JUNIOR et al., 2005). Na presença de
Cd, células de fumo cv BY-2 apresentaram três isoformas quando expostas à concentração de
0,100 mM e duas isoformas, tanto para o controle quanto para 0,200 mM, indicando
provavelmente uma resposta diferencial para o metal em distintas concentrações (GRATÃO,
2003).
A atividade da enzima SOD e a expressão dos genes que codificam as isoformas têm
mostrado alterações sob diversas condições de estresse. Estas alterações dependem da espécie, da
fase de desenvolvimento da planta, do tecido utilizado para a cultura in vitro e das
particularidades das isoformas (WILLEKENS et al., 1995; AZEVEDO et al., 1998).
A CAT é uma enzima tetramérica, que contém grupos heme e é encontrada em todos os
organismos vivos, possuindo a capacidade de degradar o H
2
O
2
. Foi proposto que a enzima
desempenha papel fundamental nos sistemas que capacitam os organismos a viverem em
ambientes aeróbios (MALLICK; MOHN, 2000).
Existem três tipos de isoformas de CAT, a Cat1, a Cat2 e a Cat3. Em plantas, a Cat1 é
responsável por 80% da atividade total desta enzima e está localizada no interior dos
peroxissomos, sendo responsável pela transformação do H
2
O
2
produzido na fotorrespiração em
H
2
O e O
2
. A Cat2 é encontrada nos tecidos vasculares, enquanto, a Cat3, está localizada no
mesófilo das células (SCANDALIOS, 1990; 1993; WILLEKENS et al., 1995).
Neste estudo a atividade da CAT foi determinada pela atividade total em
espectrofotômetro, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h e em PAGE não-desnaturante,
nos períodos de 12, 36 e 72h. A atividade da enzima para a concentração de 0,075 mM atingiu
maior valor às 48h de exposição ao metal, sendo que em 0,750 mM este valor foi atingido às 36h.
Sendo a CAT diretamente regulada pelos níveis de H
2
O
2
, sugere-se que ocorreu um aumento na
produção do mesmo nestes períodos, ocasionado pela diminuição ou saturação da atividade de
outros mecanismos de defesa. A produção de H
2
O
2
pode ser ativada pela NADH-oxidase ou
pelos níveis elevados de O
2
-
(GROSS et al., 1977).
Às 72h de exposição ocorreu uma queda significativa da atividade enzimática para ambas
as concentrações, o que sugere que outros mecanismos de defesa, até mesmo enzimáticos,
estejam degradando o H
2
O
2
.
73
Em plantas de milho, observou-se aumento da CAT depois de 40h de exposição ao Ni,
sendo que as raízes apresentaram aumento às 24h. Em eucalipto (Leucaena leucocephalla L.) e
feijão-mungo (Vigna radiata L.) foi observado o aumento da atividade da CAT após 24 horas de
exposição ao metal e em células em suspensão de café ocorreu aumento da atividade enzimática
nas primeiras 12h e depois das 48h de exposição ao Ni (BACCOUCH et al., 1998; 2001; ROUT
et al., 1999; SAMANTARY et al., 1999; GOMES-JUNIOR et al., 2005). Células de fumo cv BY-
2 expostas ao Cd mostraram aumento da atividade da CAT nas últimas horas de exposição, o que
pode estar associado a um aumento dos níveis de H
2
O
2
, a diminuição da eficiência do ciclo
glutationa-ascorbato ou a depleção da glutationa reduzida (GSH) para a síntese de fitoquelatinas
(PCs) (GRATÃO, 2003).
Uma isoforma de CAT foi observada em PAGE não-desnaturante, assim com em células
de café em suspensão, na presença de Ni e em células de fumo cv BY-2, em calos de cana-de-
açúcar e em plântulas de soja, na presença de Cd (FERREIRA et al., 2002; FORNAZIER et al.,
2002; GRATÃO; 2003; GOMES-JUNIOR et al., 2005). O fungo Aspergillus nidulans apresentou
duas isoformas de CAT, a CAT A, codificada pelo gene catA, que apresenta sua transcrição
induzida durante a esporulação e em resposta à estresses e a CAT B, codificada pelo gene catB,
presente no micélio e que tem sua expressão induzida pelo H
2
O
2
ou H
2
O
2
−
, não possuindo
controle regulatório pós-transcricional. Estas enzimas constituem mecanismos de defesa
antioxidativa alternativo e específico para os diferentes estágios do ciclo de vida do fungo
(CALERA et al., 2000).
A GR possui importante papel na desintoxicação de metais pesados e xenobióticos e na
proteção contra o estresse oxidativo, mantendo a razão entre os níveis de glutationa reduzida
(GSH) e glutationa oxidada (GSSG) (GALLEGO et al., 1996a,b).
A GSH é essencial na resposta a estresses oxidativos como antioxidante e na síntese de
fitoquelatinas (PCs), podendo controlar a quantidade de Ni e outros metais livres no citossol e
promover a remoção do H
2
O
2
e O
2
-
. Para isto, a GSH deve estar na sua forma reduzida e essa oxi-
redução é catalisada pela GR (CREISSEN et al., 1994).
Neste estudo a atividade da GR foi determinada pela atividade total em espectrofotômetro,
nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h e em PAGE não-desnaturante, nos períodos de
12, 36 e 72h. Foi observado que na concentração de 0,750 mM a atividade da GR aumentou
74
durante as seis primeiras horas de exposição e para 0,075 mM, este aumento se estendeu até às
36h, porém com atividade menor. Este aumento da atividade da GR provavelmente ocorreu para
manter elevado os níveis da GSH, permitindo que esta haja como antioxidante ou na síntese de
PCs, formando complexos com o metal, reduzindo o teor de Ni livre na célula. Para confirmar
qual das hipóteses está correta ou mesmo se ambas ocorrem simultaneamente, a quantificação de
GSH torna-se necessária, pois uma concentração elevada de GSH não significa que PCs estejam
sendo sintetizadas. Para confirmar a presença destas PCs é necessário que ocorra a identificação
destas e de complexos GSH-Ni2+. O GSH pode estar atuando diretamente sobre o H
2
O
2
como
antioxidante (ALSCHER, 1989). Tais análises não foram realizadas neste experimento, mas são
importantes para futuros projetos e melhor compreensão dos resultados aqui obtidos.
Certas espécies de plantas podem de sintetizar PCs na presença de metais pesados
(GRILL et al., 1985), sendo que apenas alguns metais podem formar complexos com PCs (Cd,
Cu, Ni, Zn, Ag, Hg e Pb). Em plantas de feijão (Phaseolus vulgaris L.) submetidas à aplicação de
Cd e Ni, verificou-se que o Cd induziu a síntese de PCs, diferentemente do Ni, onde não foi
observada qualquer resposta (GUO; MARSCHNER, 1995).
O aumento da atividade da enzima GR, na presença de Ni, foi observado em plantas de
guandu, em raízes de trigo (Triticum aestivum L.) juntamente com a síntese de PCs, em plantas
do gênero Alyssum sp e em crotalária. Quando expostas ao Cd, observou-se um aumento da GR
no fungo Aspergillus sp e em plantas de soja e de feijão (PANDOLFINI et al., 1996;
SCHICKER; CASPI, 1999; RAO et al., 2000). Em células de fumo cv BY-2 expostas ao Cd,
observou-se o aumento da atividade na concentração de 0,200 mM, este aumento ocorreu no
início da exposição ao metal com depleção da GSSG. Esta resposta é comum ao Cd, com o
consumo da glutationa para produção de PCs (GRATÃO, 2003).
Duas isoformas de GR foram observadas em PAGE não-desnaturante na concentração de
0,750 mM. Sugere-se que esta segunda isoforma seja específica com relação ao Ni. Em células
em suspensão de café observou-se três isoformas quando na exposição ao Ni (GOMES-JUNIOR
et al., 2005).
Existe uma correlação entre o sistema antioxidante e a atividade mitótica em células de
fumo cv BY-2. O nível de ascorbato e de GR aumentam durante o segundo dia de crescimento da
cultura, quando as células encontram-se em seu máximo índice mitótico. No mesmo período de
75
crescimento da célula, a expressão de dois genes, para a fase M (divisão nuclear) e S (duplicação
do DNA nuclear), também aumenta. Sabe-se ainda que o ascorbato é requerido para a divisão
celular e promove progressão do ciclo celular de células competentes (KERK; FELDMAN, 1995;
KATO; ESAKA, 1999; PINTO et al., 2002).
As GSTs catalisam a adição da GSH para substratos hidrofóbicos eletrofílicos, sendo
induzidas em resposta ao estresse oxidativo, removendo metais pesados, herbicidas e outros
xenobióticos e é responsável pela principal via da eliminação de moléculas endógenas, como
metabólitos secundários (FOYER et al., 1997; DIXON et al., 2002).
Neste estudo a atividade da GST foi determinada pela atividade total em
espectrofotômetro, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48 72 e 96h. Observou-se o aumento da
atividade nas primeiras 24h de exposição para a concentração de 0,750 mM. Para a concentração
de 0,075 mM verificou-se uma diminuição da atividade até as 6h seguida de aumento até 36h.
Essa diminuição da atividade no início da exposição sugere que durante o período analisado a
enzima GR tenha atuado suprindo o mecanismo de defesa. A elevada atividade das enzimas GST
e GR nas primeiras horas de exposição ao metal na concentração maior, sugere que ocorreu um
balanço na utilização da GSH por essas enzimas, que participam do ciclo ascorbato-glutationa.
Em células de fumo cv BY-2 expostas às concentrações de 0,100 e 0,200 mM de CdCl
2
foi observado o aumento da atividade da GST para ambas as concentrações, durante as primeiras
horas de exposição. A concentração de 0,100 mM resultou em maior atividade provavelmente
porque a GSH estava sendo utilizada pela GST. Para 0,200 mM, a GSH provavelmente estava
envolvida na síntese de PCs (GRATÃO, 2003).
Como já mencionado, a GSH é um antioxidante importante na defesa contra EAOs.
Quando é utilizada para sintetizar PCs, ocorre uma diminuição do seu nível, reduzindo a defesa,
podendo por outro lado favorecer o aumento da peroxidação lipídica e diminuir a viabilidade
celular. Plantas tolerantes a determinados metais possuem a capacidade de prevenir o uso
excessivo da GSH antes da síntese de PCs, sendo que além desta síntese, a GSH é utilizada como
substrato para as GSTs na redução do H
2
O
2
(GRATÃO et al., 2005). Desta forma, os níveis de
GSH são aumentados com a produção de H
2
O
2
, tanto em plantas como em cultura de células
submetidas à situação de estresse (SMITH et al., 1985; GALLEGO et al., 1996a,b; JEMAL et al.,
2000).
76
De forma geral, as peroxidases catalisam a oxidação do substrato concomitantemente à
redução do H
2
O
2
, "limpando" a célula e, além disso, participam de processos metabólicos
essenciais, como a lignificação, a regulação do crescimento celular, a oxidação fenólica, a defesa
contra patógenos e a proteção contra estresses (GRISEBACH, 1981; GOLDBERG et al.,1986;
FIELDES; GERHARDT, 1998).
Neste estudo a atividade da GPX foi determinada pela atividade total em
espectrofotômetro, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h. Nas células de fumo cv BY-2
expostas ao Ni observou-se um aumento da atividade da GPX somente às 72h, para o controle e
os tratamentos. Neste mesmo período foi observada a diminuição da atividade das outras
enzimas, CAT, GR, GST e APX. Este resultado pode estar relacionado com o aumento da
disponibilidade do H
2
O
2
no período final da exposição onde a ação da GPX estaria provocando
uma diminuição dos níveis do H
2
O
2
, ou seja, a GPX teria uma ação mais definida na resposta ao
estresse na fase final.
Apesar da variação observada e de já ter sido relatado na literatura respostas claras da
GPX para metais, como por exemplo o Cd em células de fumo cv BY-2 (GRATÃO, 2003), tal
afirmativa apenas explicaria a concentração de 0,750 mM, pois até o controle apresentou
atividade mais elevada do que vinha sendo observada ao longo do ciclo e da própria atividade
observada na concentração mais baixa de Ni. Desta forma, o padrão da atividade enzimática da
GPX não parece necessariamente estar correlacionado ao estresse causado pelo Ni, seja na fase
inicial ou nesta mais tardia do ciclo de crescimento das células, visto não haver uma tendência
clara que explique as variações observadas.
Como mencionado, o aumento da atividade da GPX nos períodos finais do tratamento
pode ser observado em cevada (Hordeum vulgare L.), na presença de cobre (Cu) e manganês
(Mn) e em células de fumo cv BY-2 na presença de Cd (GRATÃO, 2003; DEMIREVSKA-
KEPOVA, et al., 2004). Em plantas de milho tratadas com Ni, em plantas de feijão expostas ao
zinco (Zn), Cd e Ni e em raízes e caules de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) estressados
com Cu, verificou-se o aumento da GPX e números variados de isoformas foram observados em
PAGE não-desnaturante nas diversas concentrações utilizadas dos metais (VAN ASSCHE et al.,
1986; MAZHOUDI et al., 1997; BACCOUCH et al., 1998).
77
O substrato redutor mais importante para a desintoxicação do H
2
O
2
em células vegetais, é
o ascorbato. A APX catalisa a reação em que duas moléculas de ascorbato são oxidadas para
reduzir uma molécula de H
2
O
2
em H
2
O. A reciclagem do ascorbato é realizada pela
monodehidroascorbato redutase (MDAR) e dehidroascorbato redutase (DAR) e que, juntamente
com a GSH que é reciclada pela GR, constituem o ciclo ascorbato-glutationa (NOCTOR;
FOYER, 1998).
Neste estudo a atividade da APX foi determinada pela atividade total em
espectrofotômetro, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h. O padrão de atividade
observado mostrou um aumento nas seis primeiras horas de exposição para a concentração de
0,750 mM e às 24h para 0,075mM. É possível verificar que as enzimas que tiveram um aumento
da atividade nas primeiras horas de contato das células de fumo cv BY-2 com o Ni foram a GR,
a GST e a APX, que participam do ciclo ascorbato-glutationa. Já nos períodos finais de
exposição verificou-se uma elevada atuação das enzimas CAT e GPX.
O aumento da atividade da APX foi observado em células em suspensão de café, em
raízes e plantas de milho e em plantas do gênero Alyssum sp expostas ao Ni, nas plantas de
cevada e feijão expostas ao Cd e Cu, porém diminuiu para girassol (Helianthus annuus L.),
Pinus sp e aveia (Avena sativa L.) expostas ao Cd (GALLEGO et al., 1996a,b; BACCOUCH et
al., 1998; 2001; SCHICKLER; CASPI, 1999; HEGEDUS et al., 2001; SCHÜTZENDÜBEL et
al., 2001; GOMES-JUNIOR et al., 2005).
Neste estudo a quantificação das proteínas foi determinada em espectrofotômetro, nos
períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h e em SDS-PAGE, nos períodos de 12, 36 e 72h. O
controle apresentou quantidade de proteína elevada com relação aos tratamentos. Nos períodos
de 6h e 48h foram observados os maiores valores e às 12h e 72h, os menores. Para a
concentração de 0,075 mM a quantidade de proteína foi maior do que a observada na
concentração de 0,750 mM. Às 72h foi observado o menor valor para ambas as concentrações e
para o controle.
Esta variação na quantidade de proteína provavelmente está relacionada com o estresse
provocado pelo Ni, sendo que a redução da quantidade de proteína pode estar relacionada com a
diminuição do metabolismo da célula, enquanto o aumento desta pode estar relacionado com a
complexação com o metal e outros eventos metabólicos para indução de proteínas do
78
metabolismo celular mesmo que ao nível de SDS-PAGE e coloração com prata não tenham
detectado alterações mais específicas e/ou significativas.
As células de fumo cv BY-2 expostas ao metal e o controle apresentaram, com exceção
da GPX, diminuição significativa da atividade enzimática e da quantidade de proteína às 72h.
Estas células possuem um ciclo de vida em cultura de sete dias, a coleta do material a ser
analisado iniciou-se no terceiro dia, desta forma, às 72h de exposição das células representa o
sexto dia de vida das mesmas. A diminuição da atividade enzimática e da quantidade de proteína
pode estar relacionada com a proximidade da morte natural da célula.
A funcionalidade das proteínas pode ser afetada pelas EAOs através da oxidação das
cadeias laterais dos aminoácidos e/ou por reações secundárias com produtos aldeídicos da
peroxidação lipídica. Em folhas de ervilha (Pisum sativum L.) foi observado que reações
primárias e secundárias, resultantes do estresse, podem introduzir grupos carbonil em proteínas,
modificando sua estrutura e consequentemente sua função (REINHECKEL et al., 1998;
SCANDALIOS et al., 2000). A diminuição dos teores de proteína em situações de estresse foi
observado no fungo Aspergillus sp na presença de 0,050 mM de Cd (GUELFI, 2002).
Kevresan et al. (2001) observaram em plantas de ervilhas, expostas a diferentes
concentrações de Cd, Ni, chumbo (Pb) e molibdênio (Mo), redução da quantidade de proteína,
sendo que esta variou conforme o metal. O metal considerado mais danoso foi o Cd, seguido do
Pb, Ni e Mo. Entretanto, o metal que mais acumulou na planta foi o Pb, seguido do Cd, Ni e Mo.
A peroxidação da membrana celular pode afetar sua funcionalidade através da oxidação
de aminoácidos, podendo resultar em danos irreversíveis às funções celulares. A indução de
danos na membrana esta relacionada com a peroxidação lipídica provocada por radicais livres e
H
2
O
2
que acumulam-se nos tecidos das plantas onde a atividade das enzimas antioxidantes,
como peroxidases, CAT e SOD, esteja suprimida (SCANDALIOS, 1994).
Neste estudo, danos nas membranas das células de fumo cv BY-2 foram estimados
através da quantificação de espécies reativas ao ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), que determina o
malonaldeído (MDA), o maior produto da peroxidação lipídica (HEATH; PACKER, 1968;
BUEGE; AUST, 1978), por espectrofotômetro, nos períodos de 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h.
Observou-se que até às 24h a concentração de MDA no controle foi elevada com relação
aos tratamentos. Neste mesmo período a atividade das enzimas GR, GST e APX encontrava-se
79
elevada, sugerindo que não ocorreu a peroxidação da membrana porque estas degradaram as
EAOs. A partir das 24h ocorreu uma elevação da concentração de MDA nas concentrações, que
manteve-se superior ao controle até às 72h de exposição ao Ni. Nestes períodos, portanto,
ocorreu a peroxidação da membrana. Nestes mesmos períodos as enzimas com elevada atividade
foram a CAT e a GPX, que apresentaram ineficiência contra os danos oxidativos provocados
pelo metal.
Apesar da ocorrência da peroxidação lipídica as células de fumo cv BY-2 continuaram a
crescer, sendo que na concentração de 0,075 mM o crescimento foi semelhante ao demonstrado
pelo controle e na concentração de 0,750 mM o crescimento diminuiu com relação ao controle,
porém as células permaneceram em crescimento, sugerindo que o Ni tenha efeito fitotóxico
secundário.
A peroxidação lipídica foi observada em células em suspensão de café expostas à 0,500
mM de Ni (GOMES-JUNIOR et al., 2005), em raízes de milho em 0,250 mM de Ni, em plantas
de feijão expostas à diferentes concentrações de Cd e Zn e em plantas de soja com deficiência
em cálcio (Ca) (CAKMAK; HORST, 1991; SOMASHEKARAIAH et al., 1992; WECKX;
CLIJSTERS, 1997; BACCOUCH et al., 2001). Em células de fumo cv BY-2 expostas às
concentrações de 0,100 e 0,200 mM de Cd não observou-se a peroxidação, sugerindo que o
sistema enzimático de defesa foi eficiente para estas concentrações e para o referido metal
(GRATÃO, 2003).
80
3 CONCLUSÕES
1 - O mecanismo central envolvido na minimização dos danos causados pelo Ni varia com as
concentrações e com os períodos de exposição das células de fumo cv BY-2;
2 - Do ponto de vista enzimático, foco principal desta dissertação, o estresse oxidativo gerado
pelo Ni resultou em uma resposta inicial pelas enzimas do ciclo ascorbato-glutationa (GR, GST
e APX) para uma resposta tardia das enzimas CAT e GPX;
3 - O estresse causado pelo Ni aparentemente elevou as taxas de peroxidação lipídica
provavelmente devido à ineficiência na etapa final do crescimento celular das enzimas CAT e
GPX.
81
REFERÊNCIAS
ALCSHER, R.G.; ERTURK, N.; HEATH, L.S. Role of superoxide dismutase (SODs) in
controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 53,
n. 372, p. 1331-1341, 2002.
ALLEN, R.D. Dissection of oxidative stress tolerance using trangenic plants. Plant Physiology,
Rockville, v. 107, n. 4, p. 1049-1054, 1995.
ANDERSON, M.D.; PRASAD, T.K.; STEWART, C.R. Changes in isozymes profiles of
catalase, peroxidase and glutatione reductase during aclimation to chilling in mesocotyls of maize
seedlings. Plant Physiology, Rockville, v. 109, n. 4, p. 1247-1257, 1995.
ANDREA, H.; FISCHIT, I.; BACH; T.J. Differencial interation of branch-specific inhibitors of
isoprotenoid biosynthesis with cell-cycle progression in tobacco BY-2 cells. Physiologia
Plantarum, Copenhagen, v. 110, p. 342-349, 2000.
ANGELOVA, M.B.; PASHOVA, S.B.; SLOKOSKA, L.S. Comparison of antioxidant enzyme
biosynthesis by free and immobilized Aspergillus nidulans cells. Enzyme and Microbial
Technology, New York, v. 26, p. 544-549, 2000.
ASADA, K. Ascorbate peroxidase- a hydrogen peroxide scavenging enzyme in plants.
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 85, p. 235-241, 1992.
ASADA, K. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation
of excess photons. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,
Rockville, v. 50, p. 601-639, 1999.
AZEVEDO, R.A.; ALAS, R.M.; SMITH, R.J.; LEA, P.J. Response of antioxidant enzymes to
transfer from elevated carbon dioxide to air and ozone fumigation, in leaves and roots of wild-
type and a catalase-deficient mutant of barley. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 104,
p. 280-292, 1998.
BACCOUCH, S.; CHAOUI, E.L.; EL FERJANI, E. Nickel-induced oxidative damage
antioxidant responses in Zea mays shoots. Plant Physiology, Rockville, v. 36, n. 9, p. 689-694,
1998.
82
BACCOUCH, S.; CHAOUI, E.L.; EL FERJANI, E. Nickel toxicity induces oxidative damage in
Zea mays roots. Journal of Plant Nutrition, New York, v. 24, n. 7, p. 1085-1097, 2001.
BARCELO, J.; POSCHENRIEDER, C. Plant water relation as affected by heavy metal stress: a
review. Journal of Plant Nutrition, New York, v. 13, p. 1-37, 1990.
BEUCHAMP, C.; FRIDOVIC, I. Superoxide dismutase- Improved assays and assay applicable to
acrylamide gels. Analytical Biochemistry, San Diego, v. 44, p. 276-282, 1971.
BOOMINATHAN, R.; DORAN, P.M. Ni-induced oxidative stress in roots of the Ni
hyperaccumulator, Alyssum bertolonii. New Phytology, Rockville, v. 156, p. 205-215, 2002.
BOUSSAMA, N.; OUARITI, O.; GHORBAL, M.H. Changes in growth and nitrogen
assimilation in barley seedlings under cadmium stress. Journal of Plant Nutrition, New York,
v. 22, p. 731-752, 1999a.
BOUSSAMA, N.; OUARITI, O.; SUZUKI, A.; GHORBAL, M.H. Cd-stress on nitrogen
assimilation. Journal of Plant Physiology, Germany, v. 155, p. 310-317, 1999b.
BOWLER, C; VAN MONTAGU, M.; INZÉ, D. Superoxide-dismutase and stress tolerance.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, Rockville, v. 43, p. 83-116,
1992.
BOWLER, C.; VANCAMP, W.; VANMONTAGU, M.; INZE, D. Superoxide-dismutase in
plants. Critical Reviews in Plant Sciences, Clare, v. 13, n. 3, p. 199-218, 1994.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, New York, v. 72,
p. 248-259, 1976.
BROWN, P.H.; WELCH, R.M.; CARY, E.E. Nickel: A micronutrient essential for higher plants.
Plant Physiology, Rockville, v. 85, p. 801-803, 1987.
BUEGE, J.A.; AUST, S.D. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol, San Diego, v. 52,
p. 302-310, 1978.
83
CAKMAK, I.; HORST, W.J. Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide dismutase,
catalase and peroxidase activities in root tips of soybean. Physiology Plantarum, Copenhagen,
v. 83, p. 463-468, 1991.
CALERA, J.A.; SANCHEZ-WEATHERBY, J.; LOPES-MEDRANO, R.; LEAL, F. Distinctive
properties of the catalase B of Aspergillus nidulans. FEBS Letters, Amsterdan, v. 475, p. 117-
120, 2000.
CAMPA, A. Biological roles of plant peroxidases: known and potential function. In: EVERSE;
J.; EVERSE, K.E.; GRISHAM, M.B. Peroxidases in Chemistry and Biology. Boca Raton: CRC
Press, 1991.v. 2, p. 25-50.
CARDOSO, P.F; GRATÃO, P.L.; GOMES-JUNIOR, R.A.; MEDICI, L.O.; AZEVEDO, R.A.
Response of Crotalaria juncea to nickel exposure. Brazilian Journal Plant Physiology,
Campinas, v. 17, n. 2, p. 267-272, 2005.
CHAOUI, A.; GHORBAL, M.H.; EL FERJANI, E. Effects of cadmium-zinc interactions on
hydroponically grown bean (Phaseolus vulgaris L.). Plant Science, Clare, v. 126, p. 21-28,
1997a.
CHAOUI, A. MAZHOUDI, S.; GHORBAL, M.H.; EL FERJANI, E. Cadmium and zinc indution
of lipid peroxidation and effects on antioxidants enzyme activities in bean (Phaseolus vulgaris
L.). Plant Science, Clare, v. 127, p. 139-147, 1997b.
CHEN, J.J.; ZHOU, J.M.; GOLDSBROUGH, P.B. Caracterization of phytochelatin synthase
from tomato. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 101, n. 1, p. 165-172, 1997.
CHEN, S.L.; KAO, C.H. Glutathione reduces the inhibition of rice seedlings root growth caused
by cadmium. Plant Growth Regulation, Netherlands, v. 16/249, p. 252, 1995.
CHUGH, L.K.; SAWHNEY, S.H. Effect of cadmium on activities of some enzymes of glycolysis
and pentose phosphate pathway in pea. Biological Plantarum, Praha, v. 42, p. 401-407, 1999.
COBBETT, C.S. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. Plant Physiology,
Rockville, v. 123, p. 825-832, 2000.
84
CORPAS, F.J.; SANDALIO, L.M.; PALMA, J.M.; LEIDI, E.O.; HERNANDEZ, J.A.;
SEVILLA, F.; DEL RIO, L.A. Subcellular-distribution of superoxide-dismutase in leaves of
ureide-producing leguminous plants. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 82, n. 2, p. 285-
291, 1991.
COX, R.M.; THURMAN, D.A.; BETT, M. Some properties of the soluble acid phosphatases of
roots of zinc-tolerant and non-tolerant clones of Anthoxanthum odoratum. New Phytology,
Rockville, v. 77, p. 547-552, 1976.
COWAN, C.K.; FOX, T.C.; GARVIN, D.F.; KOCHIAN, L.V. The role of iron-deficiency stress
responses in stimulating heavy-metal transport in plants. Plant Physiology, Rockville, v. 116,
p. 1063-1072, 1998.
CREISSEN, G.P.; EDWARDS, E.A.; MULLINEAUX, P.M. Glutathione reductase and ascorbate
peroxidase. In: FOYER, C.H.; MULLINEAUX, P.M. (Eds.). Causes of photoxidative stress
and amelioration of defence systems in plants. Boca Raton: CRC Press, 1994. p. 343-364.
CROOKE, W.M. Effect of soil reaction on uptake of nickel from a serpentine soil. Soil Science,
Israel, v. 81, n. 4, p. 269-276, 1955.
CROOKE, W.M.; INKSON, R.H.E. Relation between nickel toxicity and major nutrient supply.
Plant and Soil, Netherlands, v. 49, n. 1, p. 1-15, 1956.
CUYPERS, A.; VANGRONSVELD, J.; CLIJSTERS, H. The chemical behaviour of heavy metal
plays a prominent role in the induction of oxidative stress. Free Radical Research, Londres,
v. 31, p. S39-S43, 1999.
DE PINTO, M.; TOMMASI, F.; DE GARA, L. Enzymes of the ascorbate biosynthesis and
ascorbate-glutathione cycle in cultured cells of tobacco BY-2. Plant Physiology Biochemistry,
Paris, v. 38, p. 541-550, 2002.
DEMIREVSKA-KEPOVA, K.; SIMOVA-STOILOVA, L.; STOYANOVA, Z.; HOLZER, R.;
FELLER, U. Biochemical changes in barley plants after excessive supply of copper and
manganese. Environmental and Experimental Botany, Oxford, v. 52, n. 3, p. 253-266, 2004.
DIXON, D.P.; LAPTHORN, A.; EDWARDS, R. Plant glutathione transferases. Genome
Biology, Londres, v. 3, p. 1-10, 2002.
85
DIXON, N.E.; GAZZOLA, C.; BLAKELY, R.L.; ZERNER, B. Jack bean urease
(E.C.3.5.1.5.3.). A metalloenzyme. A simple biological role for nickel. Journal of Americam
Chemistry Socity, Washington D.C., v. 97, p. 4131-4133, 1975.
DÖNMEZ, G.; AKSU, Z. The effect of copper (II) ions on the growth and bioaccumulation
properties of some yeasts. Process Biochemistry, Oxon, v. 35, p. 135-142, 1999.
DUCIC, T.; POLLE, A. Transport and detoxification of manganese and copper in plants.
Brazilian Journal of Plant Physiology, Campinas, v. 17, p. 113-112, 2005.
FADZILLAH, N.M.; GILL, V.; FINCH, R.P.; BURDON, R.H. Chilling oxidative stress and
antioxidant responses in shoot cultures of rice. Planta, New York, v. 199, p. 552-556, 1996.
FERREIRA, R.R.; FORNAZIER, R.F.; VITORIA, A.P.; LEA, P.J.; AZEVEDO, R.A. Changes
in antioxidant enzyme activities in soybean under cadmium stress. Journal of Plant Nutrition,
New York, v. 25, n. 2, p. 327-342, 2002.
FIELDES, M.A.; GERHARDT, K.E. Flax guaiacol peroxidases can be used to illustrate the
possibility of misinterpreting the effects of stress on the activity of developmentally regulated
enzymes. Plant Science, Clare, v. 132, p. 89–99, 1998.
FORNAZIER, R.F.; FERREIRA, R.R.; VITÓRIA, A.P.; MOLINA, S.M.G.; LEA, P.J.;
AZEVEDO, R.A. Effects of cadmium on antioxidant enzyme activities in sugar cane. Biologia
Plantarum, Netherlands, v. 45, n. 1, p. 91-97, 2002a.
FORNAZIER, R.F.; FERREIRA, R.R.; PEREIRA, G.J.G.; MOLINA, S.M.G.; SMITH, R.J.;
LEA, P.J.; AZEVEDO, R.A. Cadmium stress in sugar cane callus cultures: Effect on antioxidant
enzymeson. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Netherlands, v. 75, p. 125-131, 2002b.
FOYER, C.H.; LELANDAIS, M.; KUNERT, K.J. Photoxidative stress in plants. Physiologia
Plantarum, Copenhagen, v. 92, p. 696-717, 1994.
FOYER, C.H.; LOPEZ-DELGADO, H.; DAT, J.F.; SCOTT, I.M. Hydrogen peroxide and
glutathione-associated mechanism of acclimatory stress tolerance and signalling. Physiologia
Plantarum, Copenhagen, v. 100, p. 241-254, 1997.
86
FRUGOLI, J.A.; ZONGH, H.H.; NUCCIO, M.L.; McCOURT, P.; McPEEK, M.A.; THOMAS,
T.L.; McCLUNG, C.R. Catalase is encoded by a multigene family in Arabidopsis thaliana (L.)
Heynh. Plant Physiology, Rockville, v. 112, p. 327-336, 1996.
GALLEGO, S.M.; BENAVÍDES, M.P.; TOMARO, M.L. Effect of heavy metal ion excess on
sunflower leaves: evidence for involvement of oxidative stress. Plant Science, Clare, v. 121,
p. 151-159, 1996a.
GALLEGO, S.M.; BENAVIDES, M.P.; TOMARO, M.L. Oxidative damage caused by cadmium
choride in sunflower (Helianthus annuus L.) plants. Phyton-International Journal of
Experimental Botany, Oxford, v. 58, p. 41-52, 1996b.
GALLI, U; SCHUEPP, H; BRUNOLD, C. Thiols in cadmium and copper-treated maize (Zea
mays L.). Planta, New York, v. 198, p. 139-143, 1996.
GEELEN, D.N.; INZÉ, D.G. A bright future for the bright yellow- 2 cell culture. Plant
Physiology, Rockville, v. 127, p. 1375-1379, 2001.
GHOSHROY, S.; FREEDMAN, K.; LARTEY, R.; CITOVSKY, V. Inhibition of plant viral
systemic infection by non-toxic concentrations of cadmium. The Plant Journal, Washington
D.C., v. 13, p. 591-602, 1998.
GIANNOPOLITIS, C.N.; RIES, S.K. Superoxide dismutases ocorrence in higher-plants. Plant
Physiology, Rockville, v. 59, p. 309-314, 1977.
GOLDBERG, R.; IMBEERTY, A.; LIBERMAN, M.; PRAT, R. Relationship between
peroxidase activities and cell wall plasticity. In: GREEPIN, H.; PENEL, C.; GASPER JR, T.
(Ed.). Molecular and Physiological Aspects of Plant Peroxidases. Switzerland: University of
Geneva, 1986. p. 208–220.
GOMES-JUNIOR, R.A.; GRATÃO, P.L.; DELITE, F.S; POMPEU, G.B.; CARDOSO, P.F.;
MOLDES, C.A.; MARQUEZI, M.C.; MAZZAFERA, P.; AZEVEDO, R.A. Análise da resposta
antioxidante de células de café submetidas ao Ni. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE
FISIOLOGIA VEGETAL, 10; CONGRESSO LATINO AMERICANO DE FISIOLOGIA
VEGETAL, 12., 2005, Recife. Anais//Recife, SBFV, SLAFV, 2005. 1 CD-ROM.
87
GRATÃO, P.L. Análise da resposta antioxidativa de células de Nicotiana tabacum cv BY-2
submetidas ao cádmio. 2003. 109 p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de
Plantas) - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo,
Piracicaba, 2003.
GRATÃO, P.L.; POLLE, A.; LEA, P.J.; AZEVEDO, R.A. Making the life of heavy metal-
stressed plants a little easier. Functional Plant Biology, Sidney, v. 32, p. 481-494, 2005.
GRATÃO, P.L.; PRASSAD, M.N.V.; CARDOSO, P.F.; LEA, P.J.; AZEVEDO, R.A.
Phytoremediation: green technology for the clean up toxic metals in the environment. Brazilian
Journal of Plant Physiology, Campinas, v. 17, p. 53-64, 2005.
GRILL, E.; WINNACKER, E.L.; ZENK, M.H. Phytochelatins- the principal heavy metal
complexing peptidies of higher plants. Science, Washington D.C., v. 230, n. 4726, p. 674-676,
1985.
GRISEBACH, H. Lignins. In: COON, E.E. (Ed.). The biochemistry of plants. New York:
Academic Press, 1981. v. 7. p. 457–478.
GROSS, G.C.; JANSE, C.; ELSTNER, E.F. Involvement of malate, monophenols and the
superoxide radical in hidrigen peroxide formation by isolated cell walls from horseradish
(Armoracia lapathifolia Gilib). Planta, New York, v. 136, p. 271-276, 1977.
GUELFI, A. Respostas das enzimas antioxidantes em linhagens do fungo Aspergillus sp. na
presença do metal pesado cádmio. 2002. 60p. Dissertação (Mestrado em Genética e
Melhoramento de Plantas)- Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de
São Paulo, Piracicaba, 2002.
GUO, Y.; MARSCHNER, H. Uptake, distribution, and binding of cadmium and nickel in
different plant species. Journal of Plant Nutrition, New York, v. 18, p. 2691-2706, 1995.
HAVIR, E.A.; McHALE, N.A. Regulation of catalase activity in leaves of Nicotiana sylvestris by
high CO
2
. Plant Physiology, Rockville, v. 89, p. 952-957, 1989.
HAYAKAWA, T.; KANEMATSU, S.; ASADA, K. Occurence of Cu, Zn-superoxide dismutase
in the intrathylakoid space of spinach-chloroplasts. Plant and Cell Physiology, Oxford, v. 25,
p. 883-889, 1984.
88
HEATH, R.L.; PACKER, L. Photoperoxidation in isolated chloplasts. Kinetics and stoichiometry
of fatty acid peroxidation. Arch Biochemistry Biophysic, New York, v. 125, p. 189-198, 1968.
HEGEDUS, A.; ERDEI, S.; HORVATH, G. Comparative studies of H
2
O
2
detoxifying enzymes
in green and greening barley seedlings under cadmium stress. Plant Science, Clare, v. 160,
p. 1085-1093, 2001.
HERNÁNDEZ, J.A.; ESCOBAR, C.; CREISSEN, G.; MULLINEAUX, P. M. Role of hydrogen
peroxide and the redox state of ascorbate in the induction of antioxidant enzymes in pea leaves
under excess light stress. Functional Plant Biology, Sidney, v. 31, p. 359-368, 2004.
HOUT, V.; ETIENNE, P.; PETITOT, A.S.; BARBIER, S.; BLEIN, J.P.; SUTY, L. Hydrogen
peroxide induces cell death features in cultured tobacco BY-2 cells, in a dode-dependent manner.
Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 52, p. 1721-1730, 2001.
HOWDEN, R.; ANDERSEN, C.R.; GOLDSBROUGH, P.B.; COBBET, C.S. A cadmium-
sensitive, glutathione-deficient mutant of Arabidopsis thaliana. Plant Physiology, Rockville,
v. 107, n. 4, p. 1067-1073, 1995.
JEMAL, F.; ZARROUK, M.; GHORBAL, M.H. Effect of cadmium on lipid composition of
pepper. Biochemical Society Transactions, Essex, v. 28, p. 907-910, 2000.
KABATA-PENDIAS, A.; PENDIAS, H. Trace elements in soils and plants. Boca Raton: CRC
Press, 1984. 315 p.
KATO, H.A.; TARHAN, L. Changes in ascorbate oxidase gene expresion and ascorbate levels in
tobacco cells. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 105, p. 321-329, 1999.
KERK, T.; FELDMAN, L.J. A biochemical-model for the initiation and maintenance of the
quiescent center-implications for organization of root-meristems. Development, Oxford, v. 121,
n. 9, p. 2825-2833, 1995.
KEVRESAN, S.; PETROVIC, N.; POPOVIC, M.; KANDRAC, J. Nitrogen and protein
metabolism in young pea plants as affected by different concentrations of nickel, cadmium, lead
and molybdenum. Journal of Plant Nutrition, New York, v. 24, n. 10, p. 1633-1644, 2001.
89
KLIEBENSTEIN, D.J.; MONDE, R.A.; LAST, R.L. Superoxide dismutase in Arabidopsis: An
acletic enzyme family with disparate regulation and protein localization. Plant Physiology,
Rockville, v. 118, p. 637-650, 1998.
KLUCAS, R.V. Nickel, a micronutrient for hydrogen dependent growth of Rhizobium japonicum
and for expression of urease activity in soybean leaves. Proceedings of the National Academy
of Sciences of USA, Washington D.C., v. 80, p. 2253-2257, 1983.
KNÖRZER, O.C.; DURNER, J.; BÖGER, J.P. Alterations in the antioxidative system of
suspension-cultured soybean cells (Glycine max) induced by oxidative stress. Physiologia
Plantarum, Copenhagen, v. 97, p. 388-396, 1996.
KRAUS ,T.E.; McKERSIE, B.D.; FLETCHER, R.A. Paclobutrazol induces tolerance on wheat
leaves to paraquat may involve increased antioxidant enzyme activity. Journal of Plant
Physiology, Germany, v. 145, p. 570-576, 1995.
KUBO, A.; SAJI, H.; TANAKA, K.; KONDO, N. Expression of Arabidopsis cytosolic ascorbate
peroxidase gene in response to ozone or sulfur dioxide. Plant Molecular Biology, Netherlands,
v. 29, p. 479-489, 1995.
KÜPPER, H.; SETLIK, I.; SETLIKOVA, E.; FERIMAZOVA, N.; SPILLER, M.; KÜPPER F.C.
Copper-induced inhibition of photosynthesis: limiting steps of in vivo copper chlorophyll
formation in Scenedesmus quadricauda. Functional Plant Biology, Sidney, v. 30, p. 1187-1196,
2003.
LAGRIFFOUL, A.; MOCQUOT, B.; VANGRONSVELD, J.; MENCH, M. Cadmium toxicity
effects on growth, mineral and chlorophyll contents, and activities of stress related enzymes in
young maize plants (Zea mays L.). Plant and Soil, Netherlands, v. 200, p. 241-250, 1998.
LEE, D.H.; LEE, C.B. Chilling stress-induced changes of antioxidant enzymes in the leaves of
cucumber: in gel enzyme activity assays. Plant Science, Clare, v. 159, p. 75-85, 2000.
LEE, S.M.; LEUSTEK, T. The effect of cadmium on sulphate assimilation enzymes in Brassica
juncea. Plant Science, Clare, v. 141, p. 201-207, 1999.
LESSER, M.P.; STOCHAJ, W.R. Protoadaptation and protection against active forms of oxygen
in the symbiotic prokaryote Prochloron sp and its ascidian host. Applied Environmental
Microbiology, Washington D.C., v. 56, p. 1530-1535, 1990.
90
L’HUILLIER, L.; D'AUZAC, J.; DURAND, M.; MICHAUD-FERRIERE, N. Nickel effects on
two maize (Zea mays) cultivars: growth, structure, Ni concentration and localization. Canadian
Journal of Botany, Ottawa, v. 74, p. 1547-1554, 1996.
LOLKEMA, P.C.; DOORNHOF, M.; ERNEST, W.H.O. Interaction between a copper-tolerant
and a sensitive population of Silene cucubalus. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 67,
p. 654-658, 1986.
LOZANO-RODRIGUEZ, E.; HERNANDEZ, L.E.; BONAY, P.; CARPENA-RUIZ, R.O.
Distribution of cadmium in shoot and root tissues of maize and pea plants: physiological
disturbances. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 48, n. 306, p. 123-128, 1997.
McGRATH, S.P.; SMITH, S. Nickel. In: ALLOWAY; B.J. (Ed.). Heavy metal in soils. New
York: John Wiley, 1990. p. 125-150.
MALAN, H.L.; FARRANT, J.M. Effects of the metal pollutants cadmium and nickel on soybean
seed development. Seed Science Research, Oxon, v. 8, p. 445-453, 1998.
MALAVOLTA, E. Fertilizantes e seu impacto ambiental: micronutrients e metais pesados,
mitos, mistificação e fatos. São Paulo: Produquímica, 1994. 153p.
MALLICK, N.; MOHN, F.H. Reactive oxygen species: response of alga cells. Journal of Plant
Physiology, Germany, v. 157, p. 183-193, 2000.
MANNAZZU, I.; GUERRA, E.; FERRETI, R.; PEDICONI, D.; FATICHENTI, F. Vanadate and
copper induce overlapping oxidative stress responses in the vanadate-tolerant yeast Hansenula
polymorpha. Biochimica et Biophisica Acta, San Diego, v. 1475, p. 151-156, 2000.
MARQUES, T.C.L.L.S.M. Crescimento e absorção mineral de mudas de espécies arbóreas
em material de solo contaminado com metais pesados. Lavras, Universidade Federal de
Lavras, 1996. 116 p. Dissertação (Mestrado em Solos e Nutrição de Plantas)- Universidade
Federal de Lavras, 1996.
MARRS, K.A. The functions and regulation of glutathione S-transferase in plants. Annual
Review of Plant Physiology and Molecular Biology, Rockville, v. 47, p. 127-158, 1996.
91
MARSCHNER, H. Mineral nutrition of higher plants. 2.ed. London: Academic Press, 1995.
v. 1, 889 p.
MATSUNO, H.; URITANI, I. Physiological behavior of peroxidase isozymes in sweet potato
root tissue injured by cutting or with black rot. Plant and Cell Physiology, Oxford, v. 13,
p. 1091-1101, 1972.
MATTIAZZO-PREZOTTO, M. E. Comportamento de cobre, Cd, Cr, Ni e Zn adicionados a
solos de clima tropical em diferentes valores de pH. 1994. 197p. Tese (Livre-Docência)-
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1994.
MAZHOUDI, S.; CHAOUI, A.; GHORBAL, M.H.; EL FERJAM, E. Response of antioxidant
enzymes to excess copper in tomato. Plant Science, Clare, v. 127, p. 129-137, 1997.
MELO, W.J.; MARQUES, M.O.; SILVA, F.C.; BOARETTO, A.E. Uso de Resíduos Sólidos
Urbanos na Agricultura e Impactos Ambientais. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA
DO SOLO, 26, 1997. Anais. Rio de Janeiro: S. Ed., 1997. 28p.
MENCH, M.; MARTIN, E.; SOLTA, P. After effects of metals derived from a highly metal-
polluted sludge on maize (Zea mays L.). Water, Air and Soil Pollution, Dordrecht, v. 75,
p. 277-291, 1994.
MINORSKY, P.V. The hot and the classic. Plant Physiology, Rockville, v. 133, p. 14-15, 2003.
MISHRA, D.; KAR, M. Nickel in plant growth and metabolism. The Botanical Review, v. 40,
n. 4, p. 395-449, 1974.
MITTLER, R.; HERR, E.H.; ORVAR, B.L.; VAN CAMP, W.; WILLENKENS, H.; INZÉ, D.;
ELLIS, B.E. Transgenic tobacco plants with reduced capability to detoxify reactive oxygen
intermediates are hyperresponsive to pathogen infection. Proceedings of the National Academy
of Sciences USA, Washington D.C., v. 96, p. 14165-14170, 1999.
MIYAKE, C.; ASADA, K. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts and
photoreduction of its primary oxidation product the monodehydroascorbate radicals in thylakoids.
Plant and Cell Physiology, Oxford, v. 33, p. 541-553, 1992.
92
MORGUTTI, S.; SACCHI, G.A.; COCUCCI, S.M. Effects of Ni
+2
on proton extrusion, dark CO
2
fixation and malate synthesis in maize roots. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 60, n. 1,
p. 70-74, 1984.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and assays with tobacco
tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p. 473, 1962.
NAGATA, T.; NEMOTOT, Y.; HASEZAWA, S. Tobacco BY- 2 cell line as the "HeLa" cell in
the cell biology of higher plants. International Review of Cytology, San Diego, v. 132, p. 1-30,
1992.
NAKAGAWA, N.; SAKURAI, N. Increase in the amount of cell A protein tobacco BY-2 cells
by a cellulose biosynthesis inhibitor, 2-6 dichlorobenzonitrile. Plant and Cell Physiology,
Oxford, v. 39, p. 779-785, 1998.
NAKANO, Y.; ASSADA, K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascobate specific peroxidase in
spinach cloroplasts. Plant and Cell Physiology, Oxford, v. 22, p.867-880, 1981.
NAKAZAWA, R.; KAMEDA, Y.; ITO, T.; OGITA, Y.; MICHIHATA, R.; TAKENAGA, H.
Selection and characterization of nickel-tolerant tobacco cells. Biologia Plantarum, Praha, v. 48,
n. 4, p. 497-502, 2004.
NIYOGI, K.K. Photoprotection revisited: genetic and molecular approaches. Annual Review of
Plant Physiology and Plant Molecular Biology, Rockville, v. 50, p. 333-359, 1999.
NOCTOR, G.; FOYER, C.H. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control.
Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology, Rockville, v. 49, p. 249-279,
1998.
PAIVA, H.N.; CARVALHO, J.G.; SIQUEIRA, J.O. Teor de nutrientes em mudas de cedro
(Cedrela fissilis Vell.) submetidas a doses crescentes de níquel, em solução nutritiva. Revista
Árvore, Viçosa, v. 26, n. 3, p. 15-25, 2002.
PALACIOS, G.; MATAIX, J. The influence of organic amendment and nickel pollution on
tomato fruit yield and quality. Journal of Environmental Science and Health part b-
pesticides food contaminants and Agricultural Wastes, New York, v. 34, p. 133-150, 1999.
93
PALACIOS, G.; GOMEZ, I.; CARBONELL-BARRACHINA, A.; PEDRENO, J.N.; MATAIX,
J. Effect of nickel concentration on tomato plant nutrition and dry matter yield. Journal of Plant
Nutrition, New York, v. 21, n. 10, p. 2179-2191, 1998.
PAN, S.; YAU, Y. The isozymes of superoxide dismutase in rice. Botanical Bolletin of
Academia Sinica, Sinica, v. 32, p. 253-258, 1991.
PANDA, S.K.; CHOUDHURY, S. Chromium stress in plants. Brazilian Journal of Plant
Physiology, Campinas, v. 17, p. 95-102, 2005.
PANDA, S.K.; CHOUDHURY, I.; KHAN, M.H. Excess heavy metal toxicity induces lipid
peroxidation and affects antioxidants in wheat (Triticum aestivum L.) leaves. Biologia
Plantarum, Praha, v.46, p.289-294, 2003.
PANDOLFIN, T.; GABBRIELLI, R.; CISCATO, N. Nickel toxicity in two durum wheat
cultivars differing in drought sensitivy. Journal of Plant Nutricion, New York, v. 19, n. 12,
p. 1611-1627, 1996.
PAVAN, M.A.; BINGHAM, F.T. Toxidez de metais pesados em plantas: II. Caracterização da
toxidez de níquel em cafeeiros. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Campinas, v. 17, n. 2,
p. 323-328, 1982.
PERALTA-VIDEA, J.R.; GARDEA-TORRESDEY, J.L.; GOMEZ, E.; TIEMANN, K.J.;
PARSONS, J.G.; CARRILO, G. Effect of mixed cadmium, copper, nickel and zinc at different
pHs upon alfafa growth and heavy metal uptake. Environmental Pollution, New York, v. 119,
p. 291-301, 2004.
PEREIRA, G.J.G.; MOLINA, S.M.G.; LEA, P.J.; AZEVEDO, R.A. Activity of antioxidant
enzymes in response to cadmium in Crotalaria juncea. Plant and Soil, Netherlands, v. 239, n. 1,
p. 123-132, 2002.
POLACCO, J.C. Nitrogen metabolism in soybeam tissue culture. Plant Physiology, Rockville,
v. 59, p. 827-830, 1977.
PRASAD, M.N.V. Cadmium toxicity and tolerance in vascular plants. Environmental and
Experimental Botany, Oxford, v. 35, p. 525-545, 1995.
94
RADY, A.A.; EL-SHEEKH, M.M.; MATROVICS, B. Temperature shift-induced changes in the
antioxidant enzyme system of cyanobacterium Synechosystis PCC6803. International Journal
Biochesmistry, Bristol, v. 26, p. 433-435, 1994.
RAO, K.V.M.; SRESTY, T.V.S. Antioxidative parameters in seedling of pige on pea (Cajanus
cajan L.) Millspaugh to Zn and Ni stress. Plant Science, Clare, v. 157, n. 1, p. 113-128, 2000.
RAUSER, W.E. Phytochelatins and related peptidies. Plant Physiology, Rockville, v. 109,
p. 1141-1149, 1995.
REINHECKEL, T.; NOACK, H.; LORENZ, S.; WISWEDEL, I.; AUGUSTIN, W. Comparison
of protein oxidation and aldehyde formation during oxidative stress in isolated mitochondria.
Free Radical Research, Londres, v. 29, n. 4, p. 297-305, 1998.
RICE-EVANS, C.A.; DIPLOCK, A.T.; SYMONS, M.C.R. Techniques in free radical research.
In: BURDON, R.H.; VAN KNIPPENBERG, P.H. (Eds.) Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology. Amsterdam; London; New York; Tokio: Elsevier, 1991.
v. 22, 291 p.
ROUT, G.R.; SAMANTARY, S.; DAS, P. Chromium, nickel and zinc tolerance in Leucaena
leucocephalla (K8). Silvae Genetica, Paris, v. 48, p. 151-157, 1999.
RUIZ, W.F.R. Atividades de superóxido dismutase, catalase e peroxidase durante o
desenvolvimento de micorrizas arbusculares em feijoeiro, sob condições de baixo e alto
nível de fosfato. 1998. 50p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) –
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1998.
SAKAKI, T. Photochemical oxidants: Toxicity. In: DE KOK, L.J.; STULEN, I. (Ed). Responses
of plant metabolism to air pollution and global change. Netherlands: Backhuys Publishers,
1998. p. 117-129.
SALT, D.E.; BLAYLOCK, M.; KUMAR, N.P.B.A.; DUSENKOV, V.; ENSLEY, B.D.; CHET,
I.; RASKIN, I. Mechanisms of cadmium mobility and accumulation in Indian mustard. Plant
Physiology, Rockville, v. 109, p. 1427-1433, 1995.
SAMANTARY, S.; ROUT, G.R.; DAS, P. Chromium and nickel tolerance of Trema orientalis
(Blume) L. in tissue culture. Acta Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 21, n. 1, p. 27-35,
1999.
95
SANTOSH, T.R.; SREEKALA, M.; LALITHA, K. Oxidative stress during selenium deficiency
in seedlings of Trigonella foenum-graecum and mitigation by mimosine-Part II. Glutathione
metabolism. Biological Trace Element Research, Oxford, v. 70, p. 209-222, 1999.
SCANDALIOS, J.G. Response of plant antioxidant defense genes to environmental stress.
Advances in Genetics, San Diego, v. 28, p. 1-41, 1990.
SCANDALIOS, J.G. Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology, Rockville,
v. 101, p. 7-12, 1993.
SCANDALIOS, J.G. Regulation and properties of plant catalases. In: FOYER, C.H.;
MULIUNEAUX, P.M. (Ed.). Causes of photoxidative stress and amelioration of defense
systems in plants. Flórida: CRC Press, 1994, p. 275-315.
SCANDALIOS, J.G.; ACEVEDO, A.; RUZSA, S. Catalase gene expression in response to
chronic high temperature stress in maize. Plant Science, Clare, v. 156, p. 103-110, 2000.
SCHICKLER, H.; CASPI, H. Response of antioxidative enzymes to nickel and cadmium stress in
hyperaccumulator plants of the genus Alyssum. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 105,
p 39-44, 1999.
SCHÜTZENDÜBEL, A.; SCHWANZ, P.; TEICHMANN, T.; GROSS, K.; LANGENFELD-
HEYSER, R.; GODBOLD, D.L.; POLLE, A. Cadmium- induced changes in antioxidant systems,
hydrogen peroxide content and differentiation in scots pine roots. Plant Physiology, Rockville,
v. 127, p. 887-898, 2001.
SEHMER, L.; DIZENGREMEL, P. Contribution to subcellular localization of superoxide
dismutase isoforms of spruce needles and oak leaves. Journal of Plant Physiology, Germany,
v. 53, n. 5/6, p. 545-551, 1998.
SMITH, I.K.; KENDALL, A.C. KEYS, A.J.; TURNER, J.C.; LEA, P.J. The regulation of
biosynthesis of glutathione in leaves of barley. Plant Science, Clare, v. 41, p. 11-17, 1985.
SMITH, I.K.; VIERHELLER, T.L.; THORNE, C.A. Assay of glutathione reductase incrude
tissue-homogenates, using 5.5' Dithiobis (2-nitrobenzoic acid). Annual Biochemistry, San
Diego, v. 125, p. 27-58, 1988.
96
SOMASHEKARAIAH, B.V.; PADMAJA, K.; PRASAD, A.R.K. Phytotoxicity of cadmium ions
on germinating seedlings of mung bean (Phaseoulus vulgaris) involvement of lipid peroxides in
chlorophyll degradation. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 85, p. 85-89, 1992.
STROINSKI, A.; KUBIS, J.; ZIELEZINSKA, M. Effect of cadmium on glutathione reductase in
potato tubers. Acta Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 21, p. 201-207, 1999.
TSUJI, N.; HIRAYANAGI, N.; IWABE, O.; TAKASHI, N.; TAGAWA, M.; MIYAMOTO, S.;
MIYASAKA, H.; MIYAMOTO, K. Regulation of phytochelatin synthesis by zinc and cadmium
in marina green alga, Dunaliella tertiolecta. Phythochemistry, Oxford, v. 62, p. 433-459, 2003.
TUNA, A.L.; BÜRÜN, B.; YOKAS, I.; ÇOBAN, E. The effects of heavy metal on pollen
germination and tube length in the tobacco plant. Turk Journal Biological, Turquia, v. 26,
p. 109-113, 2002.
TURNER, R.G.; MARSHALL, C. The accumulation of zinc by subcellular fractions of roots of
Agrostis tenuis Sibth. In relation to zinc tolerance. New Phitology, Rockville, v. 71, p. 671-676,
1972.
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA. Pólo computacional - Departamento de ciências
exatas. Programa ESTAT. Sistemas para análises estatísiticas (softwares). Jaboticabal: FCAV -
UNESP.
VALLEJOS, C.E. Enzyme activity staining. In: TANKSLEY, S.D.; ORTON, T.J. (Ed.).
Isozymes in plant genetics and breeding -Part A. Amsterdam; Oxford; New York: Elsevier,
1983. p. 469-516.
VAN ASSCHE, F.; PUT, C.; CLIJSTERS, H.M.M. Heavy metals induce specific isoenzyme
patterns of peroxidase in Phaseolus vulgaris L. Physiology Biochemistry, New York, 1986.
v. 94, 60p.
VAN ASSCHE, F.; CLIJSTERS, H. Effects of metals on enzyme activity in plants. Plant Cell
Environmental, Oxon, v. 13, p. 195-206, 1990.
VITORELLO, V.A.; HAUG, A. Short-term aluminum uptake by tobacco cells: Growth
dependence and evidence for internalization in a discrete peripheral region. Physiologia
Plantarum, Copenhagen, v. 97, p. 536-544, 1996.
97
VITORELLO, V.A.; CAPALDI, F.R.; STEFANUTO, V.A. Recent advances in aluminium
toxicity and resistance in higher plants. Brazilian Journal of Plant Physiology, Campinas, v. 17,
p. 129-143, 2005.
VITORIA, A.P.; LEA, P.J.; AZEVEDO, R.A. Antioxidant enzymes responses to cadmium in
radish tissues. Phytochemistry, Oxford, v. 57, p. 701-710, 2001.
VOET, D.; VOET, J.G. Biochemistry. 2ed. New York; Chichester; Brisbane; Toronto;
Singapore: Wiley, 1995. 1361 p.
VRANOVÁ, E.; INZÉ, D.; BREUSEGEM, F.V. Signail transduction during oxidative stress.
Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 53, n. 372, p. 1227-1236, 2002.
WALKER, C. D. Effects of nickel deficiency on some nitrogen metabolites in cowpeas (Vigna
ungiculata L. Walp.). Plant Physiology, Rockville, v. 79, n. 2, p. 474-479, 1985.
WECKX, J.E.J.; CLIJSTERS, H.M.M. Phytotoxicity induces oxidative stress in primary leaves
of Phaseolus vulgaris L. Plant Physiology Biochemistry, Paris, v. 35, n. 5, p. 405-410, 1997.
WILLEKENS, H.; INZE, D.; VANMONTAGU, M.; VANCAMP, W. Catalases in plants.
Molecular Breeding, San Diego, v. 1, p. 207-228, 1995.
WINGSLE, G.; GARDESTRÖM, P.; HALLGREN, J.; KARPINSKI, S. Isolation, purification,
and subcellular localization of isozymes of superoxide dismutase from scots pine (Pinus
sylvestris L.) needles. Plant Physiology, Rockville, v. 95, p. 21-28, 1991.
YAMAMOTO, Y.; KOBAYASHI, Y.; DEVI, S.R.; RIKIISHI, S.; MATSUMOTO, H. Oxidative
stress triggered by aluminium in plant roots. Plant and Soil, Netherlands, v. 255, p. 239-243,
2003.
YAMAMOTO, Y.; MATSUMOTO, K.; RIKIISHI, S.; HACHIYA, A.; YAMAGUCHI, Y.;
MATSUMOTO, H. Aluminum tolerance acquired during phosphate starvation in cultured
tobacco cells. Plant Physiology, Rockville, v. 112, p. 217-227, 1996.
YANG, S.H. Plant tolerance to nickel toxicity: II. Nickel effects on influx and transport of
mineral nutrients in four plant species. Journal of Plant Nutrition, New York, v. 19, n. 2,
p. 265-279, 1996.
98
YANG, S.H.; BERBERICH, T.; SANO, H.; KUSANO, T. Specifc association of transcripts of
tbz F and tbz 17, tobacco genes encoding basic region leucine-zipper type transcriptional
activators, with guard cells of senescing leaves and/or flowers. Plant Physiology, Rockville,
v. 127, p. 23-32, 2001.
ZHU, Y.L.; PILON-SMITS, E.A.H.; JOUANIN, L.; TERRY, N. Over expression of glutathione
synthetase in Indian mustard enhances cadmium accumulation and tolerance oxygen. Plant
Physiology, Rockville, v. 119, p. 73-79, 1999.
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