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I
CARLOMAGNO PACHECO BAHIA
Conexões interhemisféricas do córtex de barris do
rato: análise de neurônios isolados
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS
MORFOLÓGICAS.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Anatomia
Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas
Rio de Janeiro – RJ
2009
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II
Conexões interhemisféricas do córtex de barris do rato:
análise de neurônios isolados.
Carlomagno Pacheco Bahia
Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro
como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas.
Orientador: Professor Doutor Jean Christophe Houzel
Professor Adjunto do Programa de Anatomia, Instituto de Ciências Biomédicas,
UFRJ.
Co-orientador: Professor Doutor Antônio Pereira Jr
Professor Adjunto do Programa de Fisiologia, Instituto de Neurociências,
UFRN.
Rio de Janeiro
2009
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III
Conexões interhemisféricas do córtex de barris de rato:
análise de neurônios isolados.
Carlomagno Pacheco Bahia
Tese submetida ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em Ciências
Morfológicas da Universidade Federal do Rio - UFRJ, como parte do requisito
necessário à obtenção do grau de Doutor.
Aprovado por:
Orientador: Prof. Dr. Jean Christophe Houzel.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Co-orientador: Prof. Dr. Antônio Pereira Jr.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Prof
a
. Dra
.
Ana Maria Blanco Martinez.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Prof
a
. Dra. Claudia Domingues Vargas.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Prof. Dr. Mário Fiorani Junior.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Prof
a
. Dra. Daniela Uziel Rozental.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Prof
a
. Dra. Eliane Volchan.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
2009
IV
Bahia, Carlomagno Pacheco.
Conexões interhemisféricas do córtex de barris do rato: analise de neurônios
isolados/Carlomagno/Pacheco Bahia. Rio de Janeiro: UFRJ/PCM, 2009.
xi, 155f. : 40 il.; 29,7cm
Orientador: Jean Christophe Houzel
Co-orientador: Antonio Pereira Jr.
Tese de doutorado – Universidade Federal do Rio de Janeiro/Programa de Pós-
graduação em Ciências Morfológicas, 2009.
Conexões interhemisféricas 2.Córtex de barris 4.Neurônios isolados 5. Morfometria
–
Tese (Doutorado UFRJ/PCM).
V
Agradecimentos
Ao meu orientador, Jean Christophe Houzel, obrigado pela atenção,
confiança, pelo treinamento no sistema de Neurolúcida, por ter acreditado
neste projeto e, principalmente, pela amizade.
Ao meu co-orientador, Antônio Pereira, um agradecimento especial por
ter me acolhido no Laboratório de Biofísica Celular, pelos dez anos de
convivência recheada de amizade, pela demonstração de simplicidade, por ter
me dado força nos momentos que precisei e pelo incentivo à pesquisa.
À Daniela Uziel Rozental, pela revisão deste manuscrito, pelos
incentivos, pela confiança e pela amizade.
Aos Professores Mário Fiorani, Cláudia Vargas, Ana Martinez e Eliane
Volchan, por aceitarem o convite para participar desta banca!
Ao Roberto Lent, por ter aberto as portas do Laboratório de
Neuroplasticidade, onde desenvolvi grande parte desta tese, pelos
ensinamentos, pela amizade, confiança e pela simplicidade.
Ao João Franca, por ter cedido o set up de eletrofisiologia do Laboratório
de Neurobiologia II para realização de experimentos, pela amizade e pela
convivência.
Ao Cristovam Diniz, pela amizade, pelos conselhos, pelo incentivo à
pesquisa e por sempre me acolher em seu laboratório.
À Renata Anomal, por ter me ajudado nos experimentos de
eletrofisiologia, à Carla Moreira, por ter me ajudado com a coloração de Nissl, à
Lena Dalva e Ludmila Ribeiro, as mulheres de minha tese, e ao Adiel Batista,
por cuidar dos animais. Sem vocês, seria impossível eu desenvolver este
trabalho!
VI
Aos Professores Vivaldo Moura Neto e Cláudia Mermelstein e a Tânia
pela ajuda e atenção na resolução dos problemas.
A todos os Neurolpásticos, em especial Patrícia, Mauren, Noboro, Fred,
Jean Pierre, Carol, Rodrigo, Marisol e Virginia, obrigado pelo alto astral e
convivência fraterna. Muito bom trabalhar com vocês. Adoro a todos!
Aos integrantes do Laboratório de Neurobiologia II, em especial à
Anaelli, Ghyslain, Débora, Glauber e Ruben, pela amizade e carinho. Um
obrigado especial à todos os lucidamaníacos por terem me dado prioridade no
uso do sistema Neurolúcida!
Aos integrantes do Laboratório de Neurorregeneração, em especial ao
Walace, Ivanira, Andreinha e Patrycy, obrigado por todo!.
Aos integrantes do Laboratório de Fronteira em Neurociências, em
especial, Marco e Thelma, obrigado pelo inesgotável otimismo!
Um obrigado especial ao Eliã, Fabiana e Andréia, os irmão que a vida
me deu. Obrigado pela convivência, amizade, carinho e pelo dia-a-dia!
À todos os professores do Programa de Anatomia da UFRJ, que me
adotaram como professor substituto, em especial à Jane Amaral, Sandra
Köning e José Garcia, pelo incentivo e por terem acreditado em meu trabalho.
Jamais os esquecerei!
À Rosinay Tavares, obrigado por tentar me entender, pelos incentivos e
pelos momentos mágicos. Adoro você!
Obrigado à toda a minha família. Meu pai, um exemplo de vida, minha
mãe, que me deu o mundo e é o meu pilar, meus irmãos Cláudio e Marco e a
nova geração da família, Gabriel e Neto. Sem vocês, eu nada seria!
VII
Resumo
Ratos exploram o ambiente usando ativamente as vibrissas em
movimentos bilaterais e rítmicos. Embora as vias ascendentes trigeminais
sejam completamente cruzadas, estímulos em uma única vibrissa podem
exercer influência no córtex de barris ipsolateral, via conexões
interhemisféricas. No córtex de barris de ratos, existem densas conexões
calosas entre as colunas de septo das camadas extragranulares, mas a
precisão dessas conexões a nível neuronal ainda é desconhecida. Neste
estudo, usamos injeções iontoforéticas do neurorrastreador sensível para
analisar a morfologia dendrítica e axonal de células calosas do córtex de barris
de rato. Após induzir o estado anestésico, realizamos registro eletrofisiológico
multiunitário para a seleção do local (barril ou septo) de injeção de dextrana-
amina biotinilada (10%, 3 ou 10 kD). Após sobrevida, os animais foram
perfundidos e os encéfalos cortados (150 μm), seriadamente incubados em
complexo ABC e reagidos com DAB. Os corpos celulares e seus
prolongamentos neuronais marcados foram reconstruídos com o auxilio do
sistema Neurolúcida. Identificamos neurônios calosos nas colunas de septo e
de barris em todas as camadas do PMBSF. Em trinta células calosas (CC)
retrogradamente marcadas e reconstruídas tridimensionalmente, as
arborizações dendríticas das CC localizadas nas camadas supragranulares
foram maiores e ocuparam maior área do que os das CC nas demais camadas.
Adicionalmente, as CC infragranulares das colunas de septo apresentaram
maior e mais complexa arborização dendrítica do que as localizadas nas
colunas de barris da mesma camada. Dez CC marcadas anterogradamente
foram completamente reconstruídas e apresentaram arborização axonal
fracamente ramificada e conectando colunas homotópicas entre os dois
campos de barris. Os terminais axonais das colunas septais restritos às
colunas de septo, porém apresentaram geometria mais complexa e mais
botões sinápticos que os das colunas de barris. Finalmente, os neurônios
calosos do PMBSF de ratos estabeleceram conexões ponto-a-ponto entre
colunas homotópicas do PMBSF, contudo somente os axônios das células
localizadas nas colunas de barris apresentaram a precisão em conectar
exatamente os mesmos pontos dentro do PMBSF.
VIII
Abstract
Rats scan their surroundings through active, rhythmic, bilateral
movements of the whiskers. Although the ascending trigemino-cortical pathway
is fully crossed, stimulation of a single whisker can exert timely precise
influences onto the ipsilateral cortex, via commissural networks. Callosal
connections were shown to be dense between interbarrel septa and
extragranular layers, but their degree of precision at the single neurons level is
unknown. We applied targeted injections of sensitive neuronal tracers to
analyze the morphology of individual callosal cell bodies and axonal arbors in
the rat barrel field. Under ketamine/xylazine anesthesia, extracellular recordings
of neuronal responses to mechanical whisker stimulation were used to target
specific barrel or septal sites, where biotinylated dextran amines (10%, 3 or 10
kDa) were injected iontophoretically. After survival, serial 150μm-thick sections
were incubated in ABC complex and processed DAB reaction. Labeled bodies
and processes were 3D-reconstructed using Neurolucida. Callosal neurons
were identified in septal columns, as well as within barrels and throughout all
layers. Thirty callosal cells were reconstructed. Dendrites of supragranular cells
were significantly longer, and covered a wider cortical area than in other layers.
In addition, infralaminar callosal neurons display more complex dendritic trees
in septal columns than within barrels. Ten anterogradely labeled neurons were
fully reconstructed with their axonal arbor. Individual axons terminate into
weakly ramified and narrow columns homotopic to the cell body, achieving
precise connectivity between restricted, corresponding domains of the opposite
hemisphere. Septal terminals were as spatially restricted in septa as within
barrels, but had more complex geometry and distributed about twice as many
buttons than within barrels. Thus, individual callosal neurons establish sets of
discrete, point-to-point connections between homotopic (barrel or septal)
domains of the rat PMBSF. However, only axons of barrel domains had
symmetrical conections between barrels of same column and arc.
IX
Lista de Abreviaturas
ALBSF: Subcampo AnteroLateral de Barris.
BDA: neurorrastreador Dextrana-Amina Biotinilada.
CC: Células Calosas.
CitOx: Enzima Citocromo Oxidase.
CR: Campo Receptor.
GABA: Ácido γ-Aminobutírico.
M1: Área Motora Primária.
NADPH-d: Enzima NADPH-diaforase.
PMBSF: Subcampo Pósteromedial de Barris.
POm: Porção Rostral do Núcleo Posterior do Tálamo.
PrV: Núcleo Trigeminal Principal.
PV: Área Parietal Ventral.
S1: Área Somestésica Primária.
S2: Área Somestésica Secundária.
SNC: Sistema Nervoso Central.
SpVi: Porção Interpolaris do Núcleo Trigeminal Espinhal.
VB: Complexo Ventrobasal do Tálamo.
VPI: Núcleo Ventral Posterior Inferior do Tálamo.
VPL: Núcleo Ventral Posterior Lateral do Tálamo.
VPM: Núcleo Ventral Posterior Medial do Tálamo.
X
Lista de Figuras
Figura 01: Representação somatotópica da superfície corporal 4
Figura 02: Diagrama esquemático das áreas sensoriais e motoras no cérebro
de rato
5
Figura 03: As diferentes áreas citoarquitetônicas em S1 de humanos 7
Figura 04: A organização colunar é conservada durante a evolução dos
córtices sensoriais de mamíferos
9
Figura 05: A organização laminar do PMBSF de rato 11
Figura 06: Módulos corticais em S1 de ratos 12
Figura 07: As vibrissas mistaciais do rato 18
Figura 08. As vias lemniscal e paralemniscal 21
Figura 09: As vias aferentes e eferentes do PMBSF 22
Figura 10: Circuito do barril versus circuito do septo 26
Figura 11: Padrão de marcação retrógrada para o hemisfério contralateral no
córtex parietal de rato
33
Figura 12: Evidências anatômicas, fisiológicas e funcionais da existência de
conexões calosas fora da representação da linha média
37
Figura 13: Conexões calosas nas representações de partes periféricas do
corpo distantes da linha média
39
Figura 14: Neurônio caloso na representação do córtex visual de rato 42
Figura 15: Resumo do desenho experimental 52
Figura 16: Contornos de pilha de secções seriadas 60
Figura 17: O sistema Neurolúcida 63
Figura 18: Sítios de injeções não utilizados para a reconstrução 3D 67
Figura 19: Injeções iontoforéticas de BDA adequadas para reconstrução 3D 69
Figura 20: Injeção de BDA retrógrado e a marcação no PMBSF do hemisfério
contralateral
71
Figura 21: Marcação, por BDA de transporte anterógrado, no mesmo
hemisfério do sítio de injeção
73
Figura 22: Marcação, por BDA de transporte anterógrado, no hemisfério
contralateral ao sítio de injeção
74
Figura 23: As células calosas do PMBSF marcadas retrogradamente 76
Figura 24: Distribuição das células calosas no PMBSF de rato 78
Figura 25: Neurônio caloso supragranular marcado retrogradamente 80
Figura 26: Neurônio caloso granular marcado retrogradamente 81
Figura 27: Neurônio caloso infragranular marcado retrogradamente 82
Figura 28: Neurônios calosos reconstruídos em 3D 83
Figura 29: Tamanho do corpo celular na distribuição laminar das células
calosas do PMBSF de rato
85
Figura 30: As características morfométricas da arborização dendrítica na
distribuição laminar das células calosas do PMBSF
86
Figura 31: Os neurônios calosos e a organização colunar do córtex de barris 89
Figura 32: Neurônios calosos classificados segundo sua posição laminar e
colunar
90
Figura 33: Características morfométricas das células calosas localizadas nas
colunas de septo e de barris
91
Figura 34: Reconstrução 3D de células calosas do PMBSF 95
Figura 35: Célula calosa supragranular da coluna de barril 96
Figura 36: Célula calosa granular da coluna de barril 97
XI
Figura 37: Neurônios calosos do córtex de barris de rato 99
Figura 38: Célula calosa infragranular septal 100
Figura 39: Quantificação dos dados morfológicos dos axônios calosos do
PMBSF
104
Figura 40: Distribuição dos botões sinápticos 106
1
Sumário
Resumo
Vii
Abstract
Viii
Lista de Abreviaturas
Ix
Lista de Figuras
X
1. Introdução 1
1.1 O Córtex somestésico: representação topográfica, módulos corticais
e conexões interhemisféricas
2
1.1.1 O córtex somestésico 2
1.1.2 A área somestésica primária (S1) 5
1.1.3 Áreas somestésicas secundária e parietal ventral 14
1.1.4 O córtex de barris em roedores 16
1.1.5 Das vibrissas ao córtex de barris: as projeções para o PMBSF 17
1.1.6 Os circuitos locais do córtex de barris 23
1.1.7 As projeções eferentes do córtex de barris 29
1.1.8 As conexões calosas no campo de barris 31
1.2 O corpo caloso e o dogma da "linha média" 35
1.2.1 As conexões calosas fora da representação da linha média 38
1.3 Os neurônios calosos 41
2. Objetivos 44
2.1 Objetivos específicos 44
3. Métodos 45
3.1 Animais experimentais 45
3.1.1 Preparação pré-cirurgica dos animais e anestesia 47
3.1.2 Procedimento cirúrgico 47
3.1.3 Registro eletrofisiológico 48
3.1.4 Injeção de neurorrastreador 50
3.2 Preparação do tecido: perfusão, craniotomia e microtomia 53
3.2.1 Histoquímica para demonstrar a atividade da enzima NADPH-
diaforase
54
3.2.2 Histoquímica para demonstrar a atividade da enzima citocromo
oxidase
55
3.2.3 Revelação do neurorrastreador (BDA) 56
3.3 Lavagem, desidratação e montagem dos cortes 57
3.4 Coloração de Nissl no material sem contra-marcação de NADPH-d
ou CitOx.
58
3.5 Documentação e análise dos dados 59
3.5.1 O sistema Neurolúcida 61
2
3.5.2 Análise estatística 64
4. Resultados 66
4.1 Os sítios das injeções 66
4.2 Análise qualitativa das células calosas do PMBSF de rato 70
4.2.1 A distribuição laminar das células calosas retrogradamente
marcadas
70
4.2.2 A localização laminar e a arborização dendrítica das células
calosas
72
4.2.3 Os axônios calosos do córtex de barris 72
4.3- Análise quantitativa: as características morfométricas das células
calosas do PMBSF de rato
75
4.3.1 Distribuição laminar 75
4.3.2 Distribuição das células calosas na camada IV do PMBSF 79
4.3.3 Características morfométricas do corpo celular e da arborização
dendríticas das CC do PMBSF
79
4.4 Características morfométricas dos axônios calosos do PMBSF de rato 93
5. Discussão 104
5.1 Considerações técnicas 104
5.2 Distribuição laminar, tangencial e morfologia das células calosas no
PMBSF do rato adulto
107
5.2.1 A morfologia dendrítica das células calosas do PMBSF 110
5.3 Distribuição e geometria dos axônios calosos no PMBSF do rato 118
6. Conclusões 124
7. Perspectivas futuras e desdobramentos possíveis 125
8. Bibliografia 126
9. Anexos 153
9.1 Spatiotemporal distribution of proteoglycans in the developing rat’s
barrel field and the effects of early deafferentation.
155
9.2 On the fate of extracellular hemoglobin and heme in brain. 169
1
1 – Introdução
Um dos desafios permanentes das Neurociências é a compreensão dos
mecanismos neurais responsáveis pelas representações mentais que
permitem aos indivíduos perceberem ativamente seu ambiente e interagir
adequadamente com ele. Entretanto, as bases neurais da percepção
sensorial, mais especificamente a integração cortical das informações
sensoriais que permitem a representação coerente do ambiente, ainda não
estão compreendidas.
Devido à organização anatômica das vias sensoriais aferentes do
sistema nervoso central (SNC) de mamíferos, cada hemisfério cerebral só
recebe informações relacionadas à metade oposta do corpo. Entretanto,
somos capazes de perceber nosso ambiente como uma entidade unitária e a
maioria dos comportamentos exploratórios envolve a participação de
receptores localizados nos dois lados do corpo (membros, olhos, ouvidos).
Cabe então às comissuras cerebrais, que conectam os dois hemisférios,
integrar as informações que chegam das metades do corpo. No encéfalo dos
mamíferos, existem várias comissuras desempenhando este papel:
comissura anterior, comissura hipocampal, corpo caloso e a comissura
posterior. O corpo caloso é filogeneticamente mais recente e, em animais
mais encefalizados, assume papel de destaque na integração
interhemisférica.
2
1.1 - O Córtex Somestésico: representação topográfica, módulos
corticais e conexões interhemisféricas
1.1.1 – O córtex somestésico
As funções desempenhadas pelo sistema somestésico podem ser
divididas em três modalidades principais: 1) Exterocepção (sensações de tato
através dos mecanoceptores, temperatura através dos termoceptores e dor
através dos nociceptores); 2) Propriocepção (percepção de posicionamento no
espaço); 3) Enterocepção ou vicerocepção (sensações conscientes, ou
inconsciente, dos órgãos internos) (Burish et al., 2008; Dunckley et al., 2005;
Aziz et al., 2000 Berlucchi & Aglioti, 1997).
Quando um receptor é estimulado na periferia, em seguida ocorre a
ativação de um grupo específico de neurônios na área somestésica primária
do córtex cerebral, que permitirá determinar a (sub)modalidade do estímulo
somestésico assim como sua localização no corpo (Craig, 2002; 2003).
No cérebro, as áreas corticais são definidas a partir de três
características principais: estrutura interna, função e conectividade. Função e
conectividade estão intimamente relacionadas, uma vez que a fisiologia das
áreas do córtex somestésico pode ser inferida a partir de suas conexões,
particularmente das aferências provenientes do complexo ventrobasal (VB) do
tálamo (Jones & Powell, 1969a e b; 1970; Jones, 1970).
Até o presente momento, o isocórtex de todos os mamíferos estudados
apresentou pelo menos duas representações completas e somatotopicamente
organizadas da metade contralateral do corpo: as áreas somestésicas primária
e secundária (S1 e S2, respectivamente) (para revisão, ver Kaas, 1983).
Essas áreas recebem aferências diretas do complexo VB assim como fazem
3
densas conexões recíprocas entre si. S1 corresponde a uma representação
completa da metade contralateral da superfície do corpo do animal, presente
no córtex parietal (Figura 01). S2 localiza-se lateral e caudalmente à S1,
possuindo uma representação topográfica relativamente menos precisa da
superfície cutânea (Beck et al., 1996) (Figura 02).
Uma terceira representação somestésica vizinha à S2, que também
responde a estímulos cutâneos superficiais, foi recentemente identificada no
lobo parietal de alguns mamíferos e denominada de área parietal ventral (PV)
(prototerianos: Krubitzer et al., 1995b; metaterianos: Beck et al., 1996;
euterianos: Krubitzer et al., 1986, 1995a; para uma revisão ver Krubitzer 1995)
(Figura 02).
4
Figura 01: Representação somatotópica da superfície corporal. (A) Em
humanos, os córtices motor e somestésico localizam-se nos giros pré e pós-central
(pontilhados preto e vermelho, respectivamente). (B) A superfície corporal é
ordenadamente representada em M1 e S1. Caricatura representa a proporção de
S1 (C) que é devotada a processar informações de diferentes partes da superfície
corporal e (D) a proporção de M1 devotada a controlar os movimentos de
diferentes partes do corpo. Notar que as representações da face e das mãos são
proporcionalmente maiores que as outras partes do corpo. Adaptado de Bear et al.,
2002. Em Neurociências: desvendando o sistema nervoso, ArtMed, Segunda
Edição.
5
Figura 02: Diagrama esquemático das áreas sensoriais e motoras no
cérebro de rato. S1, o córtex somestésico primário, é subdividido nos
subcampo pósteromedial de barris (PMBSF) e subcampo anterolateral de
barris (ALBSF). PR: área parietal rinal; PM: área parietal medial; PV: área
parietal rinal; A1: área auditiva primária; V1: área visual primária; Agl e Agm:
áreas motoras do rato. Adaptado de Fabri & Burton., 1991; Catania &
Remple, 2002.
1.1.2 - A Área Somestésica Primária (S1)
A área S1 corresponde a uma representação completa da metade
contralateral do corpo do animal disposta ao longo do eixo médio-lateral do
córtex parietal, de tal forma que a representação do membro posterior é
6
encontrada mais medialmente e a da face mais lateralmente, com o membro
anterior e o tronco em posições intermediárias (Figuras 01 e 02). Em
humanos, há quatro áreas fisiologicamente e anatomicamente distintas no
córtex somestésico, originalmente designadas como áreas 3a, 3b, 1 e 2 de
Brodmann (para maiores detalhes ver Kaas, 1983) e cada um das quatro
áreas possui uma representação própria da metade contralateral do corpo
(Figura 03). As áreas 3b e 1 respondem preferencialmente a estímulos
cutâneos superficiais, enquanto as áreas 3a e 2 respondem
preferencialmente a estímulos profundos (transmitidos a partir de receptores
nas articulações e músculos) e todas elas recebem axônios provindos do
complexo VB do tálamo (Kaas, 1983).
A área 3b é a mais densamente inervada pelos axônios do complexo
VB e demonstra uma típica estrutura de área sensorial primária, onde os
axônios provindos do tálamo terminam principalmente na camada IV, mas
também podem fazer sinapses na porção mais profunda da camada III
(Padberg et al., 2009). De fato, fortes evidências apontam que a área 3b de
primatas equivale à área S1 de outros mamíferos (Kaas et al., 1979; Padberg
et al., 2009 ; para revisão ver Kaas, 1983). Uma vez que a informação
somestésica trazida pelos axônios das células tálamo-corticais chega na
camada IV, neurônios dessa camada enviam projeções para as camadas II e
III, cujos neurônios retransmitem as informações para a camada IV de outras
áreas somestésicas/associativas (p. ex. S2) num padrão “feedforward” típico.
Já as células piramidais da camada VI enviam seus axônios para VB,
conectando o córtex somestésico com o tálamo somestésico. Além disso, os
campos receptores dos neurônios da área 3b são pequenos. Sendo assim, a
7
área 3b é a primeira etapa do processamento cortical da informação
somestésica (Kaas, 1983).
Figura 03: As diferentes áreas citoarquitetônicas em S1 de humanos. Em
A, as áreas somatossensoriais de primatas que se localizam no giro pós-
central. Humanos possuem quatro áreas citoarquitetônicamente distintas em
S1 (3a, 3b, 1 e 2) e cada uma delas possui uma representação completa da
superfície contralateral do corpo do animal. Em B, a organização laminar do
córtex descrita por Ramon y Cajal. Adaptado de Martin, 2003. Em
Neuroanatomy: Text and Atlas, McGraw Companies, Third Edition.
8
Devido a área 3a estar localizada entre a área motora (área 4 de
Brodmann) e a área 3b do córtex somestésico e enviar projeções para áreas
motoras, no giro pré-central, e também para a área 2 somestésica, alguns
autores a consideram uma área sensorial com alguma função motora (ver
Jones & Porter, 1980). As áreas 1 e 2 do córtex somestésico apresentam
suas respectivas citoarquiteturas com características de áreas corticais e são
bastante semelhantes entre si; tanto que é difícil discernir, apenas por
critérios anatômicos, onde acaba a área 1 e começa a área 2 (Krubitzer et al.,
2004).
As respostas neuronais para um dado estímulo somestésico ocorre em
células organizadas de maneira colunar em um espaço circunscrito do córtex,
desde a camada mais superficial, logo a baixo da piamater, até as células da
camada VI (Mountcastle at al., 1957; Mountcastle, 1995, 1997; 2003). Essas
colunas corticais são perpassadas por axônios tálamo-corticais, calosos e
intracorticais (para uma revisão, ver Mountcastle, 1997).
Como acontece em outros córtices sensoriais primários, S1 possui
representação magnificada de algumas regiões da periferia sensorial no
córtex cerebral, como por exemplo, as grandes vibrissas mistaciais de alguns
roedores (Krubitzer et al., 1986). Acredita-se que essa magnificação seletiva
esteja relacionada não só com diferenças regionais na densidade de
inervação periférica, mas também com fatores corticais intrínsecos (Welker &
Van der Loos, 1986; Catania, 1995).
A especialização da periferia sensorial possui uma contrapartida na
estrutura da representação cortical. Por exemplo, a representação do bico na
área R do ornitorrinco (Krubitzer, et al., 1995), os apêndices perinasais da
9
toupeira de nariz estrelado (Catania & Kaas, 1995), as grandes vibrissas
mistaciais, que são representadas no campo de barris de S1 de alguns
roedores, lagomorfos e marsupiais (Woolsey et al., 1975) (Figura 04).
Figura 04: A organização colunar é conservada durante a evolução dos
córtices sensoriais de mamíferos. Desde os monotremados até primatas
há clara organização colunar do córtex cerebral e a presença de módulos de
processamento relacionados com os receptores da periferia sensorial. (A1,
A2) O ornitorrinco possui representação dos eletrorreceptores do bico do
animal no córtex cerebral. (B1, B2) No insetívoro topeira de nariz estrelado há
módulos de processamento sensorial que reproduzem, em S1, os apêndices
perinasais usados para tatear o ambiente. (C1, C2) Alguns roedores, como o
camundongo, também possuem módulos corticais em S1 que são chamados
de campo de barris. Em carnívoros, como o gato (D1, D2), e em primatas
como o macaco Rhesus (E1, E2), o sistema visual é organizado em colunas
de dominância ocular, colunas de orientação, além do sistema de blobs nas
espécies que apresentam visão em cores. Adaptado de Lubke & Feldmeyer,
2007.
Em roedores, S1 é subdividido nas áreas citoarquitetônicas Par1, FL e
HL (Wree et al., 1981, 1983, 1990; ver Figura 02). Estas áreas, como é a
característica do isocórtex, possuem seis camadas de células, com a camada
IV sendo chamada de camada de células granulares ou simplesmente
10
camada granular. Quando as camadas corticais de S1 de rato são analisadas
mais cuidadosamente, entretanto, observa-se que a camada IV não é
uniforme ao longo da extensão destas áreas, ocorrendo regiões onde há o
“empacotamento” de células granulares (zona granular) flanqueadas por
regiões onde a densidade de células é menor (zonas disgranulares) (Wree et
al., 1990). A área Par1 contém a representação contralateral da cabeça e da
face, enquanto FL e HL possuem a representação contralateral dos membros
anterior e posterior, respectivamente. Os agregados de células granulares da
camada IV da área Par1 são chamados de barris devido ao seu formato
tridimensional e a região entre barris é chamada de septo (Woolsey & Van
Der Loss, 1970; ver item 1.1.4 e Figuras 05 e 06). As áreas FL e HL também
contêm agregados celulares na camada IV, embora de formato mais irregular
que as dos barris da área Par1 (Figura 06).
11
Figura 05: A organização laminar do PMBSF de rato. Secções coronais de
S1 de rato adulto reagida para a histoquímica das enzimas NADPH-diaforase
(A) e citocromo oxidase (B). As setas brancas apontam para o barril; as setas
pretas apontam para o septo; os asteriscos mostram vasos sanguíneos; I-VI,
camadas corticais; SB, substância branca. Adaptado de Bahia, 2004.
12
Figura 06: Módulos corticais em S1 de ratos. Secções tangenciais do
encéfalo de rato adulto reagidas para a histoquímica da NADPH-diaforase
(A), e para a histoquímica da enzima citocromo oxidase (B). Note que em SI,
há regiões mais reativas às enzimas (barris), flanqueada por regiões menos
reativas (septo). SI: córtex somestésico primário; VI: córtex visual primário; AI:
córtex auditivo primário. Barra de escala 1 mm. Adaptado de Bahia, 2004.
13
Como é característico do córtex cerebral, a camada IV das regiões
granular e disgranular do S1 de rato são os alvos das aferências do tálamo
somestésico. Os principais núcleos aferentes são o núcleo ventral posterior
lateral (VPL), que transmite informação cutânea do tronco e membros e o
núcleo ventral posterior medial (VPM), que transmite informação da face e
cabeça para a região granular. Adicionalmente, S1 recebe aferentes do
núcleo posterior medial tálamo (POm), que se projeta para as regiões
disgranulares (para maiores detalhes ver Kim & Ebner, 1999; Figura 08).
1.1.3 - Áreas Somestésicas secundária e parietal ventral
A área somestésica secundária (S2), assim como S1, recebe aferências
sensoriais talâmicas diretas de VB, além de receber aferências diretas de S1
e, no caso de primatas, também recebe aferências das áreas 3a, 3b, 1 e 2
(Burton & Carson, 1986). Os neurônios de S2, por sua vez, enviam projeções
de volta para S1 e também fazem projeções para o córtex insular, corpo
amidalóide e hipocampo (Pons et al., 1987; 1992), sendo presumivelmente
uma via de retransmissão somestésica para o córtex límbico em mamíferos
(p. ex. primatas; ver Friedman et al., 1986). Seus neurônios respondem
robustamente a estímulos cutâneos superficiais, mesmo se o estímulo for
aplicado com baixa intensidade. Os primeiros estudos eletrofisiológicos
realizados no córtex somestésico do gato, no início da década de 1940, já
identificavam a existência de campos sensoriais distintos entre as áreas S1
área S2, sendo que os campos receptores de S2 são geralmente maiores do
que aqueles encontrados em S1 (ver revisão em Burton & Carlson, 1986).
14
Em termos citoarquitetônicos, S2 possui as mesmas seis camadas de
células que S1, embora não possua a mesma proporção de células
granulares na camada IV. A representação topográfica somestésica em S2
possui um mapa completo da periferia cutânea contralateral, com algumas
regiões do corpo apresentando magnificação preferencial, como a face, em
primatas e roedores (Burton et al., 1982; 1993; 1995). Esta magnificação em
S2, entretanto, não é tão dramática quanto em S1. A disposição topográfica
do mapa somatotópico em S2 é semelhante na maioria dos mamíferos
estudados: a representação da cabeça é localizada mais anterior e
medialmente que a cauda (Burton & Carlson, 1986). A destruição completa de
S2 leva a uma incapacidade permanente de discriminar objetos com base em
sua textura e também ocorre um prejuízo acentuado na discriminação de
objetos com tamanhos diferentes (Murray & Mishkin 1984).
Uma outra área somestésica, a área parietal ventral (PV), também é
ativada pela aplicação de estímulos cutâneos superficiais (Krubitzer et al.,
1986). PV faz limites com a região da face de S1 e a região da face e de
membros anteriores em S2. Semelhante a S2, a camada de células
granulares em PV não é tão desenvolvida quanto em S1. Os aferentes
talâmicos para PV são provenientes de outras subdivisões do tálamo basal,
tal como o núcleo ventral posterior inferior (VPI), em macacos (Qi et al., 2002)
(ver Figura 02).
15
1.1.4 - O córtex de barris em roedores
Alguns animais, como ratos e camundongos, constroem a
representação neuronal do seu ambiente com o auxílio da informação tátil
proveniente das vibrissas mistaciais. As vibrissas são utilizadas para
reconhecer as posições do chão, paredes e obstáculos, especialmente em
condições de baixa luminosidade (Carvell & Simons, 1990; para revisão ver:
Petersen, 2007). Quando as vibrissas tocam num objeto, esses animais
recolhem informações adicionais sobre suas características tais como
tamanho, forma e textura, através de um processo ativo de movimentos
oscilatório das vibrissas para frente e para trás, varrendo os objetos e
normalmente acompanhados de movimentos da cabeça (para uma revisão,
ver: Diamond et al., 2008).
Na área S1 desses animais, mais especificamente na região de
representação da face chamada de Subcampo Pósteromedial de Barris
(PMBSF: acrônimo, em inglês, Posteromedial Barrel Subfield), existem
agregados cilíndricos de células granulares chamados de barris (Woolsey &
Van der Loos, 1970; Welker & Woolsey, 1974; Woolsey et al., 1975). Os
barris maiores representam individualmente cada uma das vibrissas da face
do animal de maneira topograficamente ordenada e o padrão completo pode
ser demonstrado por diversos métodos anatômicos e/ou histoquímicos,
dentre eles a tradicional técnica de Nissl. Outros métodos incluem a
revelação da atividade das enzimas mitocondriais citocromo oxidase,
desidrogenase succínica e da enzima NADPH-diaforase (Wong-Riley & Welt,
1980; Killackey & Belford, 1979, Franca & Volchan, 1995; Pereira et al.,
2000). Apesar dos barris serem mais proeminentes na área citoarquitetônica
16
Par1 do rato, esses módulos de processamento sensorial também estão
presentes nas áreas FL e HL (Wree et al., 1990), que correspondem à
representação da pata anterior e da pata posterior, respectivamente (Dawson
& Killackey, 1987; ver Figuras 02, 05 e 06).
Ratos e camundongos apresentam barris que se distinguem entre si
com relação ao seu tamanho (os barris dos ratos são maiores), forma (mais
elípticos para os ratos e mais arredondados para os camundongos) e pela
estrutura interna, com os barris dos ratos sendo mais homogêneos em cortes
transversais, enquanto os dos camundongos possuem uma região central
com baixa densidade de células granulares (Welker & Woolsey, 1974). Além
de ratos e camundongos, os barris estão presentes em outras espécies de
mamíferos, como o hamster, o rato almiscarado, o porquinho-da-índia (todos
roedores de pequeno porte), em alguns insetívoros e alguns marsupiais
(Woolsey et al., 1975; Rice, 1985; Weller, 1993; Catania, 2002).
Assim como os demais módulos de processamento cortical, uma
questão básica acerca dos barris que permanece ainda não totalmente
esclarecida é sobre a sua função. Porém, uma constatação óbvia é de que
estes módulos podem aumentar a eficiência do processamento cortical ao
agrupar neurônios que lidam com o processamento de áreas sensoriais
adjacentes num mesmo espaço do córtex e assim excluir conexões de origem
topográficas inapropriadas. Esse tipo de organização pode permitir o máximo
de eficiência em conectar múltiplas áreas do encéfalo que processam
diferentes aspectos de informações sensoriais de um mesmo local do corpo
(para revisão ver Catania 2002).
17
1.1.5 – Das vibrissas ao córtex: as projeções para o córtex de barris
Desde os trabalhos pioneiros de Woolsey & Van der Loos, nos anos 70,
neurofisiologistas e neuroanatomistas têm canalizado esforços para entender
as vias neuronais que transmitem a informação desde as vibrissas até o
córtex de barris. Atualmente, o córtex de barris de roedores é um dos
modelos mais estudados nas neurociências, seja em trabalhos que abordem
o desenvolvimento do córtex cerebral, sua conectividade, plasticidade e
regeneração (Schubert et al., 2007; Alloway, 2008).
As grandes vibrissas mistaciais do ratos (também chamadas de
macrovibrissas) são dispostas numa organização espacial composta por
cinco fileiras, designadas de A a E, e vários arcos que são numeradas no
sentido caudo-rostral de modo que uma vibrissa individual possa ser
identificada pela coordenada de sua fileira e arco (como por exemplo, a
vibrissa C3, ver Figura 07). Esta disposição se repete em cada uma das
estações sinápticas na via ascendente, que se inicia nas vibrissas e chega ao
córtex cerebral, passando pelo tronco cerebral e tálamo, com uma clara
relação “uma vibrissa-um barril”. A combinação de métodos fisiológicos e
anatômicos demonstra que estímulos aplicados em uma vibrissa específica
ativa a coluna de neurônios num barril correspondente em S1 (Welker &
Woolsey, 1974; para revisão, ver: Diamond et al., 2008).
18
Figura 07: As vibrissas mistaciais do rato. Em (A), desenho esquemático
da disposição do conjunto de vibrissas. Em cada lado do focinho há cinco
fileiras (identificadas de A a E) e arcos (identificados por números). Em (B),
desenho esquemático do folículo de uma vibrissa cujos mecanorreceptores
conduzem as informações para os núcleos trigeminais que, por sua vez,
fazem projeções para o tálamo. Finalmente, as células talâmicas projetam
seus axônios para o córtex de barris em S1. Adaptado de DIamond et al.,
2008.
19
A estrutura que ancora as vibrissas na pele é chamada de folículo
(Figura 07). Os folículos são inervados pelo nervo trigeminal, cujas
terminações nervosas convertem a energia mecânica em potenciais de ação
(Dörfl, 1985). Uma vez que o estímulo tátil ativa a célula do folículo, esse sinal
viaja pelo ramo periférico do nervo trigeminal até chegar ao corpo das células
localizadas no gânglio trigeminal, no sistema nervoso periférico. A informação
sensorial propaga-se, agora no ramo central do nervo trigeminal, até o tronco
cerebral onde os axônios das células localizadas no gânglio do nervo
trigeminal fazem sinapses com as células dos núcleos do trigeminal. Nos
núcleos do trigeminal, está localizada a primeira estação sináptica das vias
somestésicas da região da cabeça, onde aglomerados de neurônios formam
estruturas chamadas de barriletes, cuja organização espacial assemelha-se à
disposição das vibrissas do focinho do animal (Clarke & Bowsher, 1962;
Veinante et al., 2000a, b). Os neurônios dos núcleos do trigeminal, por sua
vez, retransmitem as informações da vibrissa para o tálamo, através de duas
vias paralelas: a via lemniscal e a via paralemniscal (Deschenes et al.,
2005, ver Figura 08).
No rato, a via lemniscal faz sinapse no núcleo trigeminal principal (PrV).
Os neurônios de PrV projetam seus axônios para o núcleo ventral posterior
do tálamo (Peschanski 1984; Peschanski et al., 1984; Williams et al., 1994;
Veinante et al., 2000). No tálamo, o núcleo ventral posterior medial (VPM) é
considerado a principal via tálamo-cortical para a área de barris em S1. Lá,
um outro aglomerado de células organiza-se de modo semelhante à
disposição das vibrissas e são chamados de barrilóides (Killackey & Ebner,
1973; Pierret et al., 2000). Estudo utilizando injeções do neurorrastreador
20
Phaseolus vulgaris (PHA-L) em VPM de rato (Lu & Li,1993), demonstrou um
sítio denso de marcação anterógrada na camada IV, na camada III, na porção
mais profunda da camada V (também chamada de camada Vb), na camada
VI, em locais que correspondem a barris individuais de S1, e sem marcação
na região de septos (Akers & Killackey, 1978; Jessen & Killackey, 1987). Este
núcleo talâmico também envia aferências para S2 e outros núcleos
subcorticais (Chmielowska et al., 1989; Lu & Lin, 1993; Brecht, 2007; ver
Figuras 08 e 09).
A via paralemniscal tem sua primeira estação sináptica na porção
interpolaris do núcleo trigeminal espinhal (SpVi), cujos neurônios fazem
projeções topograficamente organizadas para a porção rostral do núcleo
posterior do tálamo (POm) (Erzurumlu & Killackey, 1980; Chiaia et al., 1991).
As células de POm, por sua vez, projetam seus axônios principalmente para a
camada IV da região de septos de tal modo que os terminais axonais de POm
localizam-se em regiões complementares àqueles do VPM (Koralek et al.,
1988; Figuras 08 e 09). O núcleo POm faz projeções menos densas para as
camadas supragranulares (camadas I, II e III), para a porção mais superficial
da camada V (também chamada de camada Va) da mesma coluna septal
(Pierret et al., 2000). Adicionalmente, em rato POm também faz aferências
para a área motora primário (M1), para S2, para a ponte, núcleo estriado
(Alloway, 2008; ver Figuras 08 e 09).
21
Figura 08. As vias lemniscal e paralemniscal. Em (A), fotomontagem das
vias periferia-trigeminal-tálamo até o córtex cerebral mostrando a via lemniscal
que vai de uma vibrissa-trigeninal-VPM-barril. A via paralemniscal segue pelo
trigeminal-POm-septo na camada IV de S1. Adaptado de Pettersen, 2001. Em
(B), esquema das aferências para o PMBSF. A via lemniscal, em vermelho, e
a via paralemniscal, em verde. Adaptado de Alloway, 2007.
22
Figura 09: As vias aferentes e eferentes do PMBSF. Diagrama esquemático
das vias trigeminais até o córtex somestésico (A) e das conexões aferentes e
eferentes a partir de S1 (B). Notar que a via lemniscal (em azul) está mais
restrita ao processamento sensorial enquanto a via paralemniscal (em verde)
está tanto relacionada com o processamento sensorial quanto também conduz
a informação sensorial para áreas motoras. Em vermelho, as conexões
calosas. Adaptado de Bahia, 2004; Alloway, 2008.
23
Esse arranjo mantém as vias lemniscal e paralemniscal relativamente
segregadas desde a periferia sensorial até o córtex de barris (Bureau et al.,
2006; para revisão Castro-Alamanco & Connors, 1997; Petersen, 2007; ver
Figura 09).
Outra diferença importante entre as duas vias é que a lemniscal
apresenta campos receptores relativamente pequenos, latência de resposta
curta (Chapin et al., 1987) e conduz exclusivamente informações sensoriais
oriundas das vibrissas (Brecht, 2007) enquanto a via paralemniscal possui
campos receptores relativamente grandes, apresenta uma latência de
resposta longa (Chapin et al., 1987) e conduz informações tanto sensoriais
quanto motoras que surgem durante os movimentos coletivos das vibrissas
quando o animal está exploração o ambiente (Sharp & Evans, 1982; Yu et al.,
2006).
1.1.6 – Circuitos locais no córtex de barris
O arranjo dos circuitos intrínsecos dos córtices sensoriais determina
suas propriedades funcionais, e diferentes estratégias evoluíram para integrar
a atividade que surge a partir das aferências da periferia sensorial para o
córtex cerebral (ver Catania, 2002). Em ratos, as vibrissas são representadas
na camada IV de S1 pelos barris que, por sua vez, são separados entre si por
regiões de septo, com baixa densidade de células granulares. Esses dois
domínios diferentes do córtex de barris recebem aferências de duas vias
distintas a partir da periferia sensorial (Kim & Ebner, 1999).
As projeções intracorticais originadas numa coluna de barril geralmente
são de curto alcance, terminando quase sempre nas bordas das colunas dos
24
barris adjacentes em uma mesma fileira (por exemplo, projeções do barril 3B
alcançam as bordas dos barris 2B e 4B) enquanto as projeções córtico-
corticais podem alcançar S2. Em contraste, as projeções intrínsecas oriundas
dos septos estendem-se por uma distância que corresponde ao tamanho de
dois ou três barris da mesma fileira ao longo de um septo (por exemplo, ao
longo da fileira “B”). Já as projeções córtico-corticais da coluna septal
alcançam a região disgranular anterior à fileira de barris “E” (ver Chapin et al.,
1988), a região do córtex parietal posterior e também os córtices motor
primário (M1) e S2 (para revisão ver, Petersen, 2007; ver Figuras 09 e 10).
Enquanto os barris são praticamente desprovidos de conexões laterais,
os septos apresentam muitas conexões laterais (horizontais) na camada IV,
conectando barris vizinhos (Brecht, 2007; Alloway, 2008). Isto indica que as
duas principais vias subcorticais que partem das vibrissas até chegar à S1
continuam como duas vias parcialmente segregadas no córtex cerebral
(Chepin et al., 1988; Kim & Ebner, 1999).
Os neurônios localizados na camada IV da coluna de barril fazem
projeções para as camadas supragranulares, diretamente acima do barril,
enquanto as células das camadas supragranulares fazem projeções para as
camadas infragranulares, assim como se projetam para outras regiões
corticais (p. ex. S2). Já as camadas infragranulares fazem projeções para
regiões subcorticais, mas também emitem axônios colaterais que chegam a
atingir as camadas supragranulares (Chapin et al., 1988; Kim & Ebner, 1999;
Figura 10).
25
Figura 10: Circuito do barril X circuito do septo. Diagrama esquemático
mostrando o resumo da organização da conectividade a partir da camada IV
da coluna de barril e da coluna de septo. Note que as vias lemniscal e
paralemniscal se mantém segregadas até a camada IV, onde as informações
trazidas pelas duas vias começam a ser juntadas. As setas vermelhas
indicam conexões do circuito de barris e as setas verdes indicam conexões
do circuito do septo (Adaptado de Alloway, 2008).
26
Enquanto o circuito da coluna do barril processa as informações
espaço-temporais dos objetos em contato com as vibrissas, o circuito
relacionado com as colunas de septo codifica a freqüência e outras
características cinéticas dos movimentos ativos das vibrissas (revisto por
Alloway, 2008). Então, de acordo com esta proposta, as aferências das
colunas dos septos modulam as regiões do cérebro que controlam as
vibrissas enquanto que tanto as colunas dos septos quanto as colunas de
barris processam cooperativamente o fluxo das informações para identificar
os estímulos externos encontrados pelas vibrissas (Brecht, 2007; Alloway,
2008). Por sua vez, as colunas de barris e de septo fazem a integração da
informação proveniente do ambiente nas camadas I e Va (Alloway, 2008).
Este padrão de conectividade é ditado, em grande parte, pela
arquitetura da arborização axonal e vários trabalhos mostraram que existem
diferentes classes de neurônios com diversos tipos de propriedades de
disparos de potenciais de ação (Porter et al., 2001; Bruno & Simons 2002;
Petersen et al., 2003; Schubert et al., 2003; Staiger et al. 2004) e os
neurônios do córtex de barris apresentam conexões e interações locais que
variam de acordo com a camada onde seus corpos estão localizados
(Sheperd et al., 2005; Shepherd & Svoboda 2005; Schubert et al., 2006).
Neste contexto, então, cada módulo dos circuitos colunares do córtex de
barris pode assegurar o processamento das informação físicas dos estímulos
táteis adquiridos pelas vibrissas (“o que”) enquanto transfere essas
informações para colunas e áreas vizinhas (“onde”) e a integração desses
circuitos pode permitir a combinação espaço-temporal dos estímulos físicos
(Simons, 1985; Shepherd & Svoboda 2005).
27
Negligenciando as células gliais, buscando a simplificação do circuito,
uma coluna cortical consiste de basicamente dois diferentes tipos de
neurônios: (a) neurônios excitatórios, que usam glutamato como seu principal
neurotransmissor e geralmente são neurônios de projeção e (b)
interneurônios inibitórios, que usam o ácido γ-aminobutírico (GABA) como
principal neurotransmissor e seus axônios ficam predominantemente dentro
da coluna cortical a qual a célula se encontra, ou mesmo dentro da camada
cortical onde está localizado o corpo da célula (Peters, 1984; Fairen et al.,
1998). Dependendo da região cortical, 75-85% dos neurônios são excitatórios
e 15-25% são interneurônios (Ren et al.1992; Beaulieu, 1993). Na camada IV,
podem-se distinguir três principais tipos de neurônios excitatórios: neurônio
piramidal, neurônio piramidal estrelado e o neurônio espinhoso (Jones, 1975;
Feldmeyer et al., 1999; Schubert et al., 2003; Staiger et al., 2004).
Neurônios estrelados são células cujo axônio colateral permanece
confinado à coluna formando uma densa e eficiente rede local que pode
funcionar como amplificador para os sinais provindos do tálamo e ainda
manter claramente segregadas as informações que chegam na camada IV do
córtex de barris (Petersen & Sakmann, 2000; Brecht & Sakmann, 2002;
Staiger et al., 2004). Os outros dois tipos de neurônios excitatórios da
camada IV do córtex de barris apresentam axônios para as outras camadas
de suas respectivas colunas corticais e, na maioria dos casos, fazem claras
aferências transcolunares (Elston et al., 1997; Petersen & Sakmann, 2000;
Stayger et al., 2004; Egger et al., 2007).
Os outros neurônios excitatórios do córtex exibem morfologia
somatodendrítica claramente uniforme, o que dá consistência ao termo
28
células piramidais. Os neurônios das camadas supragranulares (camadas II
e III) predominantemente fazem projeções axonais para áreas associativas,
através das comissuras e apresentam tufos oblíquos em seus dendritos
apicais (Staiger et al., 2004; Shepherd & Svoboda, 2005; Feldmeyer et al.
2006). Nas camadas infragranulares, os neurônios da camada Va exibem
morfologia homogênea e são densamente inervados por axônios intracolunar
e transcolunar de neurônios de sua própria coluna e por neurônios de outras
colunas. Então, estes neurônios podem ser funcionalmente caracterizados
como a primeira interface cortical, ou ponto de convergência, participando da
integração das vias lemniscal e paralemniscal (Feldmayer et al., 2005; Bureau
et al., 2006; Kleinfeld et al., 2006; Frick et al., 2008). Os neurônios piramidais
da camada Vb inervam alvos subcorticais não talâmicos (p. ex. núcleo
estriado, colículo superior e núcleos pontinos) e, em contraste com as células
da camada Va, esses neurônios mostram clara segregação entre as duas
vias tálamo-cortical, mantendo seus axônios confinados à sua coluna e
atravessando as várias camadas (Chagnac-Amitai et al., 1990; Larkman &
Mason, 1990; Mason & Larkman, 1990; Schubert et al., 2001; Molnar &
Cheung, 2006) e seus dendritos apicais atravessam todas as camadas
(Ghazanfar & Nicolelis, 1999; de Kock et al., 2007). Já as piramidais da
camada VI projetam seus axônios quase que exclusivamente para o tálamo
mas também fazem sinapses para outras camadas da mesma coluna (Jones,
1981; Kyllackey & Sherman, 2003; West et al., 2006 ).
Os neurônios das camadas corticais apresentam diferenças em relação
ao tamanho de seus respectivos campos receptores (CRs). Os mecanismos e
a exata conseqüência desse fenômeno ainda não estão esclarecidos.
29
Entretanto, tem-se assumido que quanto maior o campo receptor, maiores as
chances de integração das informações táteis (Armstrong-James & Fox,
1987). Então, neurônios da camada IV, os quais exibem menor campo
receptor, são basicamente limitados a processar as informações que vêm de
uma vibrissa específica. Já os neurônios das camadas supragranulares
exibem CRs maiores e suas células possuem substrato anatômico de
interações transcolunares (Petersen et al., 2003; Feldmeyer et al., 2006).
Finalmente, as piramidais das camadas infragranulares apresentam os
maiores campos receptores, o que pode significar mais integração entre os
diferentes aspectos da informação tátil capturado pelas vibrissas (Ito, 1985;
Simons & Carvell, 1989; Moore & Nelson, 1998; Manns et al., 2004).
Entretanto, alguns autores apontam possíveis correlatos anatômicos para as
diferenças no tamanho dos campos receptores, como a área de
espalhamento do dendrito apical (Larkum et al., 2001; Schubert et al., 2001) e
o tamanho das arborizações dendrítica/axonal (Gottlieb & Keller, 1997;
Staiger et al., 1999).
1.1.7 – As projeções eferentes do córtex de barris
O córtex de barris emite projeções eferentes para várias áreas corticais
como M1, S2, para a região ventral do córtex parietal e para o córtex de barris
contralateral (White & DeAmicis, 1977; Welker et al., 1988; Fabri & Burton,
1991a, b; Hoeflinger et al., 1995; Chakrabarti et al., 2008; ver Figura 09). A
partir do córtex de barris, também partem projeções para regiões motoras
subcorticais, como o núcleo estriado, a ponte e o colículo superior (Mihailoff
et al., 1985; Crandall et al., 1986; Welker et al., 1988; Mercier et al., 1990;
30
Brown et al., 1998; Alloway et al. 1999; Hoffer et al. 2005), assim como para
núcleos talâmicos e também para o tronco cerebral (Hoogland et al., 1987;
Chmielowska et al., 1989; Bourassa et al., 1995; Veinante et al., 2000 a, b;
Killackey & Sherman, 2003). Apesar dos inúmeros estudos, contudo, poucos
examinaram se a origem dessas projeções é a coluna do barril ou a de septo.
Se colunas de barris e de septo representam componentes distintos dos
circuitos que processam aspectos específicos das informações sensoriais
captadas pelas vibrissas, então é provável que as projeções a partir destes
dois domínios do córtex de barris conduzam informações distintas a partir de
S1. De fato, os dados disponíveis na literatura até o presente momento
mostram que há três padrões de projeções a partir do córtex de barris
(Chapin et al., 1987; Kim & Ebner, 1999). Um padrão é caracterizado por
projeções que se originam de neurônios predominantemente alinhados com a
região de septos na camada IV, cujos axônios terminam em regiões do
cérebro que são associadas com o sistema motor (Figuras 09 e 10). O
segundo padrão de projeções a partir do córtex de barris é caracterizado por
se originar em neurônios que estão distribuídos em S1 de rato e não estão
alinhados nem com colunas de septo e nem com colunas de barris e,
finalmente, o terceiro padrão de projeções cujos corpos celulares estão
localizados na coluna de barril (Chapin et al., 1987; Kim & Ebner, 1999;
Staiger et al., 1999; Petersen, 2007; Alloway, 2008).
31
1.1.8 - As conexões calosas no campo de barris.
Uma das principais características do neocórtex é a sua organização
em camadas de células onde cada uma delas possui conexões e funções que
diferem das outras (revisado em Jones & Hendry, 1980; Keller & White, 1989;
DeFelipe et al., 2002). Em mamíferos, o corpo caloso é a maior fonte de
comunicação entre as células dos dois hemisférios cerebrais, principalmente
entre as células das camadas supragranulares (II/III) e infragranulares (V/VI)
e em menor proporção, as células da camada granular (IV) (Ivy et al., 1984;
DeFelipe et al., 2002).
O córtex parietal de rato é subdividido em áreas que recebem densas e
específicas aferências talâmicas, fazem projeções córtico-corticais para áreas
do mesmo hemisfério e áreas que são conectadas através do corpo caloso -
por exemplo o córtex de barris (Wise & Jones, 1976a, b, 1978; Akers &
Killackey, 1978; Ivy et al., 1979, 1984) - cujos neurônios que projetam para o
hemisfério oposto estão distribuídos por todo o córtex de barris (Ivy et al.,
1984; Olavarria et al., 1984). Neurônios excitatórios, com clara morfologia
piramidal, são as principais células que realizam projeções calosas (Bayer &
Altman, 1991; DeFelipe et al., 2002), mas também existem neurônios
claramente com morfologia estrelada espinhosa (Ivy et al., 1984) e também
células GABAérgicas (Fabri & Manzoni, 2004) que mandam seu axônios até o
hemisfério oposto através do corpo caloso (Ramos et al., 2008).
No PMBSF, as células piramidais que conectam esse subcampo de
barris, via corpo caloso, estão localizadas preferencialmente nas camadas II-
III e V (Ivy et al., 1979; Ivy et al., 1984) com os terminais axonais localizados
nas camadas supragranulares das regiões septais contralaterais homólogas
32
(Hayama & Ogawa, 1996; Petreanu et al., 2007, Wang et al., 2007). Este
padrão de organização parece complementar ao padrão de organização das
aferências tálamo-corticais, que por suas vez, chegam preferencialmente no
centro dos barris (Olavarria et al., 1984).
Como descrito para o rato (Wise & Jones, 1976a, 1978) e recentemente
para o camundongo (Mitchell & Macklis, 2005), os corpos celulares dos
neurônios calosos encontram-se em regiões homotópicas ao local em que
seus respectivos axônios chegam no hemisfério oposto. No córtex de barris,
neurônios calosos marcados retrogradamente, a partir de injeções
contralaterais, foram sempre distribuídos em duas bandas horizontais que
correspondem às camadas supragranulares e infragranulares (Hayama &
Ogawa, 1996; Ramos et al., 2008; Figura 11). Apesar de sua morfologia ser
predominantemente piramidal, também houve relatos de neurônios estrelados
fracamente marcados por rastreadores neuronais retrógrados na camada
granular (Ivy et al., 1984).
33
Figura 11: Padrão de marcação retrógrada para o hemisfério
contralateral no córtex parietal de rato. A marcação retrógrada é resultado
de injeção de neurorrastreador em animais com 25 dias de vida pós-natal.
Observe muitos neurônios marcados na camada Va (seta branca) no campo
de barris (delimitado pelas setas pretas). Note também muitas células
marcadas nas camadas supragranulares e somente algumas poucas células
marcadas na camada IV e na camada VI. Adaptado de Ivy & Killackey, 1982.
34
Os neurônios piramidais das camadas supra e infragranulares
aparentemente apresentam morfologia similar, não demonstrando diferir
quanto à complexidade de suas árvores dendríticas, porém o perímetro do
corpo celular entre essas duas populações de neurônios piramidais é
diferente, sendo os das camadas supragranulares maiores do que os das
camadas infragranulares (Ramos et al., 2008). Entretanto, os neurônios
calosos da camada V apresentam arborização do dendrito apical menos
complexa do que os dos neurônios da mesma camada que projetam para
outros alvos (Le Be et al., 2007).
O papel exato da atividade das células calosas na função cortical ainda
é assunto de discussão. No córtex de barris, neurônios calosos
provavelmente são ativados tanto por aferências subcorticais quanto por
aferências intracorticais e sendo assim, é possível que atividade permanente
das células calosas seja uma característica geral do processamento cortical
(Wiest et al., 2005).
Consistente com a proposta acima, estudo recente demonstrou que
após se estimular uma vibrissa, o córtex de barris no hemisfério contralateral
é ativado e, em menos de 20 milisegundos, há atividade cortical do campo de
barris do hemisfério ipsolateral à estimulação periférica (Ferezou et al., 2007).
A inibição da atividade no PMBSF do hemisfério contralateral ao estímulo
também inibe o componente ipsolateral da atividade cortical em região
homotópica (Shuler et al., 2001; 2002), assim como lesões unilaterais em S1
resulta em diminuição acentuada na atividade das células piramidais do
hemisfério oposto, localizadas homotopicamente à região de lesão (Rema &
Ebner, 2003). A atividade cortical provocada pela estimulação das vibrissas
35
mistaciais também tem sua ativação cortical reduzida nas camadas granular,
supragranular e infragranular após lesão no campo de barris do hemisfério
oposto (Rema & Ebner, 2003; Li et al., 2005; Figura 12).
1.2 - O corpo caloso e o “dogma da linha média"
Em várias espécies, as conexões calosas estão principalmente
localizadas na zona de representação da linha média da periferia sensorial.
No córtex somestésico primário, em particular, a maioria dos estudos
anatômicos e funcionais realizados até o momento revelou conexões calosas
concentradas nas zonas de representação das porções medianas do corpo
(rato: Akers & Killackey, 1978; macaco: Karol et al., 1970; Pandya et al.,
1971). No córtex visual primário, as conexões calosas estão principalmente
localizadas na zona de representação da linha média do campo visual
(Innocenti, 1982).
Esses dados indicam que uma provável função do corpo caloso seria
juntar as duas metades dos mapas corticais localizados nas áreas primárias
de cada hemisfério. De fato, estudos eletrofisiológicos demonstraram que a
secção do corpo caloso suprime o componente ipsolateral de campos
receptores que, uma vez estimulados em condições normais, provocam
respostas nos dois hemisférios cerebrais, sejam eles somestésicos ou visuais
(p. ex. ver Shuler et al., 2002). Já que uma organização similar também foi
observada no córtex motor primário, onde cada hemisfério manda sinais para
os motoneurônios que ativam os músculos do lado oposto do corpo, o
conceito da "linha média" tornou-se um verdadeiro dogma, até o ponto em
que a existência de conexões calosas fora das representações da linha
36
média nos córtices primários passou a ser minimizada ou mesmo negada na
literatura.
Entretanto, a periferia sensorial não é representada de maneira
contínua no córtex cerebral, havendo áreas onde a representação é
descontínua (Rocha et al., 2007), outras em que os neurônios apresentam
campos receptores com respostas multimodais (Rizzolatti, et al., 1981) ou
mesmo conexões calosas em regiões do córtex cerebral que não estão
relacionadas com receptores localizados na linha média do corpo (Hayama &
Ogawa, 1997). As conexões calosas nessas áreas claramente violam a regra
da linha média (Figura 12).
37
Figura 12: Evidências anatômicas, fisiológicas e funcionais da existência
de conexões calosas fora de áreas de representação da linha média. Em
(A), injeção de WGA-HRP nos barris da representação das vibrissas do
focinho (A’) e nos barris da representação da pata anterior (A’‘) num
hemisfério e neurônios retrogradamente marcados no hemisfério oposto.
Adaptado de Hayama & Ogawa., 1998. Em (B), registro óptico da região de
S1 (ponto vermelho) e da região de M1 (ponto azul) após a estimulação da
vibrissa C2 da face direita. Adaptado de Ferezou et al., 2007. Em (C), sinal
“BOLD” evocado por deflexão de múltiplas vibrissas mistaciais da face
esquerda do animal numa freqüência de 10 Hz (C’) e a resposta “BOLD” nos
dois hemisférios (L: esquerdo, ipsolateral; R: direito, contralateral). Adaptado
de Alonso et al., 2008.
38
1.2.1 - As conexões calosas fora da representação da linha média.
Nas áreas secundárias ou associativas (visuais ou somestésicas), fibras
calosas conectam regiões de representação periférica - visuais, somestésicas
ou motoras. Entretanto, estudos mais recentes demonstraram que conexões
similares existem também nas áreas primárias, onde elas são realmente mais
escassas que as conexões ao longo das linhas médias (ex.: Koralek &
Killackey, 1990; Koralek et al., 1990; Hayama & Ogawa, 1997; Petreanu et al.,
2007; Wang et al., 2007).
No córtex somestésico primário, conexões calosas nas representações
de partes periféricas do corpo (membros, dedos e vibrissas mistaciais) foram
descritas em algumas espécies: rato (Akers & Killackey, 1979), roedores da
amazônia (Rocha et al., 2007), macaco (Pandya et al., 1971) e homem
(Maldjian et al., 1999a e b). Na década passada, um estudo demonstrou que
injeções de peroxidase de raiz forte (HRP) nas regiões de representação da
mandíbula e do maxilar em S1 do rato marcavam muitos corpos celulares e
terminais nas regiões homotópicas do hemisfério contralateral (Hayama &
Ogawa, 1997). Na região de representação das vibrissas, também houve
marcação de corpos celulares e terminais axonais contralaterais, porém em
menor quantidade. Recentemente, dados de eletrofisiologia (Ferezou et al.,
2007) e ressonância magnética (Karageorgiou et al., 2008) corroboraram
estes resultados (Figura 12).
39
Figura 13: Conexões calosas nas representações de partes periféricas
do corpo distantes da linha média. Desenho tridimensional (A) de terminal
axonal caloso e fotomicrografia (C,D) de um fragmento do axônio caloso tipo
II na área de representação da pata anterior da cutia. Um axônio tipo I (B)
com os detalhes de sua morfologia (E, F). Os boxes de (C) e (E)
correspondem à região ampliada nas fotomicrografias (D) e (F),
respectivamente. Essas conexões calosas estão na representação de partes
periféricas do corpo localizadas longe da linha média. Barra de escala A, B:
50mm; C e E: 20mm; D e F: 10mm. Adaptado de Rocha et al., 2007.
40
Mas, qual seria o papel fisiológico das conexões calosas na região das
vibrissas que, aparentemente, não obedecem ao dogma da linha média?
Recentemente, Shuler et al., (2001, 2002), utilizando métodos
eletrofisiológicos, demonstraram que o comportamento exploratório do rato
depende da integração espacial e temporal bilateral dos estímulos recebidos
nas vibrissas mistaciais. Por outro lado, as conexões calosas não apresentam
uma organização óbvia cujo princípio seja imposto diretamente de acordo
com a organização espacial da periferia sensorial a ainda sofrem influências
de conexões de circuitos locais, de projeções tálamo-corticais e córtico-
corticais (Innocenti, 2009).
Nas últimas três décadas, o uso de moléculas que funcionam como
rastreadores neuronais (p. ex. biocitina) em modelos experimentais, e mesmo
o aperfeiçoamento dos métodos de estudo por imageamento em cérebros
vivos, promoveram uma enorme melhoria na compreensão das conexões
calosas, os locais do córtex cerebral em que elas se encontram, assim como
os morfotipos neuronais que dão origem a elas, a trajetórias dos axônios que
passam pelo corpo caloso e o local onde esses axônios terminam (Carmeli et
al., 2007). Contudo, o papel funcional das conexões calosas permanece
controverso. Atualmente, atribui-se às conexões calosas a função de
sincronizar a atividade de grupos de neurônios nos dois hemisférios que
disparam potenciais de ação conjuntamente facilitando e/ou inibindo
respostas neuronais durante a percepção de estímulos periféricos, execução
de um comando motor ou durante processos cognitivos (Innocenti, 2009).
41
1.3 – Os neurônios calosos
Nos últimos anos, inúmeros trabalhos foram devotados ao
detalhamento anatômico, eletrofisiológico e funcional das conexões calosas,
em espécies não-humanas e também em humanos, e demonstrou-se que a
organização delas entre as áreas sensoriais e motoras é mais elaborada do
que se previa (Houzel, et al., 1999; 2002; Carmeli et al., 2007; Ferezou et al.,
2007; Innocenti, 2009). No caso das áreas sensoriais, as conexões calosas
parecem estar relacionadas ao reconhecimento das características distintas
de um objeto já que essa “construção” requer a interação entre as metades
esquerda e direita do cérebro, como conseqüência das especializações
hemisféricas (Innocenti, 1995; Innocenti et al., 1995).
Aparentemente, não há diferenças na complexidade da arborização
dendríticas das células calosas entre as que estão localizadas nas diferentes
camadas de uma mesma área cortical (Ramos et al., 2008). Já a arborização
axonal apresenta–se com diferentes diâmetros ao longo de seus ramos
(Houzel, et al., 1999) e com geometria radial e tangencial bastante variada
(Houzel et al.,1999; Rocha et al., 2007; ver Figura 13) sugerindo que as
interações entre os dois hemisférios podem usar diferentes canais e isso se
reflete nas diferenças morfológicas dos axônios calosos (Innocenti et al.,
1995).
Esses axônios calosos podem projetar um ramo colateral para a mesma
coluna em que se encontra o corpo celular (Houzel et al., 2002), ramifica-se
na substância cinzenta do hemisfério oposto, em região homotópica ao corpo
celular, não emite ramos colaterais, ramifica-se nas camadas infragranulares
e alcança as supragranulares (Houzel et al.,2002; Figura 14).
42
Figura 14: Neurônio caloso na representação do córtex visual de rato.
Reconstrução tridimensional de um neurônio caloso da parte mais medial de
V1. (A) visão coronal do cérebro do rato indicando, em ambos os lados, a
extensão médio-lateral de V1 (linha espessa preta) e a localização da
representação da linha média vertical (cabeça de setas). (B) ampliação do
desenho 3D do neurônio (cinza: corpo celular e árvore dendrítica; preto:
axônio). (C) vista dorsal do neurônio tridimensionalmente reconstruído obtido
após giro de 90 graus ao longo do eixo médio-lateral. (D) ampliação da vista
coronal mostrando o corpo celular (seta), a arborização dendrítica (cinza) e
do axônio colateral ascendente ipsolateral. Adaptado de Houzel et al. 2002.
43
Apesar das inúmeras informações que são geradas cotidianamente
sobre conexões calosas e o campo de barris em S1 de rato, a originalidade
deste projeto reside na combinação de métodos eletrofisiológicos,
histoquímicos e anatômicos, pela primeira vez utilizando a reconstrução
morfométrica completa de neurônios que realizam projeções calosas entre os
campos de barris de rato,
44
2 - Objetivos
O presente trabalho tem como objetivo reconstruir tridimensionalmente
os neurônios que realizam projeções calosas entre os campos de barris de
rato, abordando especificamente as seguintes questões:
2.1 – Objetivos específicos
(1) Qual a morfologia dos neurônios interhemisféricos em termos de:
• área do corpo celular;
• geometria da árvore dendrítica (comprimento linear dos dendritos,
área dendrítica, volume do campo dendrítico e complexidade
geométrica da árvore dendrítica);
• geometria da árvore axonal (comprimento linear axonal, área
axonal, volume do campo axônico, complexidade geométrica do
axônio e características dos terminais axonais como quantidade
total de botões, quantidade de botões de passagem e botões
terminais).
(2) Qual a topografia das conexões interhemisféricas estabelecidas por
neurônios individuais do PMBSF de rato?
45
3 – Métodos
Este projeto foi realizado nos Laboratórios de Neuroplasticidade,
Neurobiologia II e Fronteiras em Neurociências todos na UFRJ, e nos
Laboratórios de Neuroanatomia Funcional e de Neuroproteção e
Neurorregeneração Experimental na UFPA, sob orientação dos professores
Jean Christophe Houzel (UFRJ) e Antônio Pereira Júnior (UFPA).
Os motivos principais para escolhemos o rato como modelo
experimental são os seguintes: (1) este animal usa ativamente as vibrissas
durante a exploração do ambiente; (2) o córtex somestésico primário desse
animal apresenta módulos de processamento sensorial (barris) bem definidos
que correspondem às grandes vibrissas mistaciais, seguindo uma relação
topográfica precisa; (3) o rato possui um cérebro liso, o que facilita a
sobreposição dos mapas eletrofisiológicos com dados histoquímicos e
anatômicos e, por fim, (4) fácil disponibilidade.
3.1 – Animais experimentais
Neste projeto, utilizamos 84 ratos (Ratus norvegicus) machos da
linhagem Wistar (ver Tabela 01), criados no biotério do Instituto de Ciências
Biomédicas (ICB) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), com
idade entre 90 e 120 dias de vida e pesando entre 350 e 400 g. O uso e os
cuidados na manipulação dos animais seguiram as normas estabelecidas
pela Society for Neuroscience (Handbook for Use of Animals in Neuroscience
Research. Washington, D.C.: SfN, 1991. http://www.sfn.org).
46
Tabela 01
Traçador N
o
de animais
Com
eletrofisiologia
Com
NADPD-d
Com
CitOx
Injeção
Satisfatória
Com
Nissl
BDA 10KD
60
48
36
--
12
3
BDA 3KD
24
--
--
12
6
3
Total
84
48
36
18
18
6
Tabela 01. Resumo dos experimentos realizados.
47
3.1.1 - Preparação pré-cirurgica do animal e anestesia
Vinte e quatro horas antes da cirurgia, os animais foram pré-tratados
com 1,0 mg/Kg (IM) de dexametasona (Decadron, PRODOME), para evitar a
formação de edema no cérebro, durante e após o procedimento cirúrgico, e
1,0mg/Kg de vitamina K (Kanakion, Roche), para evitar sangramento
excessivo durante a cirurgia. No dia da cirurgia, aplicamos novas doses de
1,0 mg/Kg de dexametasona (Decadron, PRODOME) e 1,0mg/Kg de vitamina
K (Kanakion, Roche). Adicionalmente, aplicamos uma dose de 0,1mg/Kg (IM)
de sulfato de atropina (ARISTON) para diminuir a produção de muco nas vias
respiratórias.
Induzimos o estado anestésico com uma dose intramuscular (IM) de
100mg/Kg de cloridrato de cetamina (Ketalar, PARKER) e 1,5mg/Kg de
valium (Diazepan, ROCHE) mais 5mg/Kg (IM) do relaxante muscular
cloridrato de xilazina (Rompun, BAYER). Quando necessário, utilizamos
doses adicionais (1/3 da dose inicial) de cloridrato de cetamina (Ketalar,
PARKER).
3.1.2 - Procedimento cirúrgico
Durante o procedimento cirúrgico, os batimentos cardíacos foram
permanentemente monitorados num eletrocardiógrafo. A temperatura corporal
dos animais foi mantida em 37
o
C com o auxílio de um termômetro retal e um
colchão térmico (Homeothermic Blanket Control, Harvad, USA). Após
completa ausência de reflexos dolorosos, avaliada pelo pinçamento da pata,
os animais tiveram as cabeças fixadas num aparato estereotáxico (Narishig,
JAPÃO) com barras auriculares untados em gel de cloridrato de lidocaína 2%
48
(Xilocaína, ASTRA QUÍMICA FARMACÊUTICA). Após tricotomia da região
craniana, realizamos uma ampla incisão longitudinal na posição mediana do
couro cabeludo, expondo os músculos occiptofrontais e parieto-temporais, os
quais foram desinseridos da crista do osso parietal direito, assim como a
fáscia do músculo occipto-frontal foi desinserido dos osso occipital e frontal,
respectivamente. Com os ossos do crânio dorsal direito expostos,
realizávamos pequena abertura (1,5 a 2,0 mm de diâmetro), utilizando uma
broca odontológica, em local de coordenadas estereotáxicas a seguir: -2,0
mm posterior ao ponto de encontro entre as suturas coronal e sagital e 5,0
mm lateral à linha média (bregma), ou ainda 7,0 mm anterior ao ponto de
encontro entre as suturas sagital e lambdóidea (lambda), e 5,00 mm laterais à
linha média. Essas coordenadas correspondem à localização do PMBSF no
córtex cerebral de ratos Wistar. Para acessar o córtex cerebral do animal,
realizamos uma micro-incisão na duramáter, usando pinça de relojoeiro e
microtesoura íris, auxiliado por um estereomicroscópio cirúrgico (Sm 2001 –
Opto, BRASIL). Para evitar o ressecamento da superfície do córtex cerebral
exposto, utilizamos solução salina a 0,9% sobre o mesmo. Em alguns
animais, a atividade neuronal extracelular multiunitária foi registrada antes da
injeção de neurorrastreador (ver item 3.1.3).
3.1.3 - Registro eletrofisiológico
Em alguns animais (ver Tabela 1), realizamos o registro da atividade
extracelular multiunitária de neurônios usando microeletródios de tungstênio
(FREDERICK HAER Co. Inc., USA) revestidos com verniz, com ponta
exposta de cerca de 10 μm e impedância nominal de 9 a 12M Ohms(MΩ). O
49
eletródio foi posicionado na superfície cortical exposta com o auxílio de um
micromanipulador (Narishig, JAPÃO) e introduzido no parênquima cerebral a
1 mm ortogonalmente à superfície pial. Em cada penetração do eletródio,
registrávamos o sinal elétrico da atividade neuronal a 900 μm, 600 μm e 300
μm a partir da superfície pial. O sinal elétrico derivado dos neurônios e
capturado pelo eletródio foi enviado para um amplificador de alto ganho e alta
impedância (ME 04011 – FHC BRUNSWICK, USA), onde também foi filtrado
(numa banda entre 5 Hz e 50 Hz, para obtermos apenas os potenciais de
campo local e evitarmos artefatos durante o registro das respostas neuronais)
e finalmente enviado para um osciloscópio (1476A – BK PRECISION, USA) e
um monitor de áudio.
Após os procedimentos de craniotomia e de o eletródio estar dentro do
tecido cortical, na área correspondente ao PMBSF, estimulamos levemente a
superfície corporal do animal usando varetas de madeira. Fizemos a deflexão
dos pêlos da face e do corpo do animal, incluindo as vibrissas, e compressão
suave e manipulação dos membros (pata anterior e pata posterior).
Consideramos a ocorrência de resposta somestésica quando havia o
aumento do sinal eletrofisiológico multiunitário no monitor de áudio e o
aumento na freqüência de potenciais de ação observados no osciloscópio
concomitante à estimulação tátil da superfície do corpo do animal.
Os campos receptores foram delimitados de acordo com a presença do
aumento da freqüência das respostas neuronais ao toque da periferia
sensorial. Respostas neuronais relacionadas ao toque numa única vibrissa
sempre resultam em registro do barril correspondente àquela vibrissa.
Quando a atividade neuronal aumentava sua freqüência de disparos de
50
potenciais de ação em respostas ao toque em duas ou mais vibrissas
adjacentes, esse perfil se relacionou sempre ao registro de um ponto da
região de septo, correspondente à área entre as vibrissas estimuladas.
A partir da delimitação dos campos receptores, escolhemos então o
local para a realização da injeção do neurorrastreador dextrana-amina
biotinilada (BDA, Molecular Probes). As injeções do neurorrastreador BDA
foram realizadas iontoforeticamente (ver item a seguir) em três diferentes
profundidades e perpendiculares à superfície pial: 900 μm, 600 μm e 300 μm,
a partir da superfície pial. Entretanto, em alguns animais (ver Tabela 01)
usamos apenas coordenadas estereotáxicas para realizar as injeções do
neurorrastreador. Este procedimento foi adotado com o objetivo de realizar
uma pequena injeção e, conseqüentemente, alcançar o menor número
possível de células marcadas pelo BDA, o que facilita sobre maneira a
reconstrução das células marcadas.
3.1.4 - Injeção de neurorrastreador
Para a marcação neuronal, realizamos injeções iontoforéticas usando
micropipetas de vidro cuja ponta media entre 5-10 μm de diâmetro (as pontas
das pipetas foram medidas e selecionadas com o auxílio do sistema
Neurolúcida). Para preencher as pipetas com a solução de dextrana
biotinilada (BDA 10 %, peso molecular de 3 kD ou 10 kD, em PBS, Molecular
Probes), usamos uma seringa Hamilton de 5 μL. Durante as injeções
iontoforéticas, a passagem de microcorrente elétrica através da solução de
neurorrastreador foi conduzida por um filamento de prata, que ficava em
contato com a solução de BDA 10 % em PBS dentro da pipeta de vidro e que
51
se conectava à fonte geradora de microcorrente elétrica (Stoelting, NIH).
Então, as pipetas de vidro foram posicionadas ortogonalmente à superfície
pial e um micromanipulador introduzia a micropipeta no parênquima cerebral,
em região previamente selecionada (ver item anterior).
A expulsão das moléculas de BDA da micropipeta de vidro em direção
ao tecido cerebral foi realizada através de pulsos de microcorrente elétrica
durante 3 minutos (com pulsos de 3μA de corrente negativa com 7 s on, 7 s
off, para as injeções com grande marcação) ou ainda pulsos de corrente
negativa de 1,5μA durante 1,5 minutos com ciclos de 7 s on, 7 s off (Stoelting,
NIH, USA), para as injeções com pequena marcação, sem registro
eletrofisiológico prévio (ver Fig. 15). Após a injeção, as micropipetas de vidro
permaneceram inseridas no local da injeção por mais 5 minutos antes de
serem lentamente retiradas do parênquima cerebral, para evitar o refluxo do
neurorrastreador.
Ao final, as aberturas nos crânios foram recobertas com gelfoam
(Gelatina Absorvível, PHARMACIA) e vedadas com acrílico (Acrílico Auto-
polimerizante, JET). A pele foi então suturada e untada com pomada
bactericida (Nebacetin, BYK QUÍMICA) e, adicionalmente, aplicamos dose de
0,33 mL de antibiótico de largo espectro (Pentabiótico, ROCHE) para prevenir
infecções. Após recuperação do estado anestésico, devolvemos os animais
para as gaiolas no biotério, onde permaneciam por 10 dias (no caso de
injeção de rastreador retrógrado) ou por 15 dias (no caso de injeções de
rastreador anterógrado).
52
Figura 15: Resumo do desenho experimental. Diagrama esquemático
resumindo os procedimentos experimentais realizados durante o
desenvolvimento desta tese de doutorado: do registro eletrofisiológico à
reconstrução tri-dimensional.
53
3.2 - Preparação do tecido: perfusão, craniotomia e microtomia
Passado o tempo de sobrevida, os animais receberam dose letal de
1000 mg/Kg de cloridrato de cetamina (Ketalar, PARKER) e 15 mg/Kg de
cloridrato de xilazina (Rompun, BAYER) pela via intramuscular (IM). Após
verificar a ausência de respostas à estimulação dolorosa, realizamos uma
ampla abertura torácica. Obliteramos a aorta descendente, usando uma pinça
hemostática, e injetamos intraventricularmente 0,2 mL do anticoagulante
liquemine (Heparina Sódica, ARISTON). Usamos uma cânula ligada a uma
bomba peristáltica (Pump Controller, Chicago, USA) para perfusão, que se
iniciava com 200 mL de tampão fosfato 0,1 M e 0,9 % de NaCl (PBS; pH 7,4),
seguido por 300 mL de paraformaldeído tamponado 4 % (PFA, SIGMA).
Após a perfusão, os encéfalos foram retirados da caixa craniana e
estocados em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2) a 4 ºC. Finalmente, os encéfalos
foram cortados, em plano coronal, a 150 μm de espessura num vibrátomo
(Vibratome Serie 1000 - TED PELLA INC, USA). O plano coronal permitiu-nos
melhor visualizar tanto as camadas como as colunas de barris ou septo em
S1, além de podermos acompanhar os axônios das células anterogradamente
marcadas atravessando o corpo caloso, em direção ao PMBSF do hemisfério
oposto, durante o procedimento de reconstrução 3-D (ver item 3.5.1). Os
cortes foram então recolhidos em solução PB a 0,1 M e pH 7,4.
Antes dos procedimentos histoquímicos, as secções foram lavadas três
vezes em PBS 0,1 M, vinte minutos cada vez, para retirar o excesso de
fixador. Em seguida, os cortes foram incubados em solução para a
histoquímica que demonstra a atividade das enzimas NADPH-diaforase, ou
citocromo oxidase (CitOx), e/ou ainda incubados em solução contendo o
54
complexo avidina-biotina peroxidase (Kit ABC Elite, VECTOR LAB). Para
manter a seqüência correta dos cortes no sentido rostro-caudal, uma vez que
os encéfalos sempre foram cortados no sentido antero-posterior, usamos
cubas de acrílico, com 20 mm de espessura, que possuíam três fileiras de 4
poços, forradas por uma microtela. As cubas de acrílico permitiram deixar
todos os cortes boiando em contato com a mesma solução enquanto lavamos
o tecido e depois o processamos histoquimicamente (ver Figura 15).
3.2.1 - Histoquímica para demonstrar a atividade da enzima NADPH-
diaforase
Com o intuito de visualizar os barris do PBMSF, em alguns animais (ver
Tabela 1) utilizamos a marcação da atividade da enzima NADPH-diaforase
(NADPH-d), usando um protocolo adaptado de estudo anterior (Scherer-
Singler et al., 1983). Brevemente, os cortes foram previamente lavados em
PB 0,1 M durante 20 minutos. Esse procedimento foi realizado três vezes,
para retirar o excesso de fixador.
Em seguida, os cortes foram lavados em tampão TRIS (0,1M; pH 8,0)
durante 5 minutos; este procedimento foi necessário para ajustar o pH das
secções ao pH da solução de NADPH-diaforase. Finalmente, as secções
foram deixadas durante a noite toda em solução contendo 6 mg/mL de ácido
málico (REGEM), 1 mg/mL de β-nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
(β-NADPH, SIGMA), 0,4 mg/mL de cloreto de manganês (REGEM), 0,1
mg/mL de dimetilsulfóxido (DMSO, RIEDELl), 0,3 mg/mL de nitroblue
(SIGMA) e 1% de Triton X-100 (VETEC) sob agitação suave e constante,
protegido da luz e à temperatura ambiente. Quando observamos um padrão
55
bem definido de marcação do neurópilo em S1 (presença dos barris) com o
auxílio de um microscópio (Nikon, JAPÃO ; Zeiss, GERMANY),
interrompemos a reação com duas lavagens em tampão TRIS pH 8,0. Na
presença de β-NADPH , a enzima óxido nítrico sintase (NOS) reduz o
nitroblue tetrazolium à formazam, um sal de coloração azulada (Santer, 1994)
deixando o neurópilo e os neurônios nitridérgicos com coloração azulada.
Esta técnica evidencia os campos de barris em S1 de ratos, entre outras
estruturas.
3.2.2 - Histoquímica para demonstrar a atividade da enzima citocromo
oxidase
Em alguns animais (ver Tabela 1), utilizamos o padrão de marcação da
atividade da enzima citocromo oxidase no PMBSF de rato, segundo o
protocolo adaptado de estudo anterior (Wong-Riley & Welt, 1980).
Os cortes foram lavados durante cinco minutos em tampão fosfato 0,1
M (pH 7,4) para retirar o excesso de fixador e pré-incubados em solução
contendo 0,5 % de cloreto de cobalto (Sigma) durante 20 minutos.
Posteriormente, as secções foram incubadas numa solução contendo 0,05 %
de diaminobenzidina (DAB, Sigma), 0,02 % de catalase (Sigma) e 0,03 % de
citocromo C (Sigma) dissolvidos em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4), sob
agitação suave e constante, protegido da luz e à temperatura ambiente. A
cada 30 minutos, monitorávamos a reação utilizando um microscópio óptico.
Quando observamos um padrão bem definido de marcação do neurópilo em
S1 (presença de barris), interrompemos a reação com uma lavagem de 5
56
minutos em formalina 10%, seguido de uma lavagem de 10 minutos em
tampão fosfato 0,1 M e pH 7,4.
A citocromo C oxidase (CitOx) está localizada na membrana interna das
mitocôndrias de todos os eucariotos e é responsável por catalisar a
transferência de elétrons a partir da ferrocianina C para o oxigênio molecular,
gerando ATP e água (para uma revisão ver Wong-Riley, 1989). Sua estrutura
protéica possui de seis a treze subunidades, onde três grandes subunidades
(as subunidades I, II e III) originam-se do genoma mitocondrial, enquanto que
as demais subunidades são derivadas do genoma nuclear (para uma revisão
ver Wong-Riley, 1989; Di Ricco et al., 1989). Uma vez que o sistema nervoso
não possui reservas energéticas, depende criticamente do metabolismo
oxidativo e da enzima Citocromo C Oxidase em particular. O produto final do
metabolismo aeróbico da glicose, o ATP, é utilizado na síntese de
neurotransmissores e na ativação de bombas de íons que mantém o
potencial de repouso da membrana dos neurônios.
3.2.3 - Revelação do neurorrastreador (BDA)
Após microtomia, os cortes com espessura de 150 μm foram lavados
por 3 vezes (5 mim cada) em tampão fosfato salina (PBS) e pré-incubados
numa solução de tampão fosfato 0,1 M contendo 2 % de triton X100 (SIGMA)
(solução PBT 2%) durante 20 minutos. Esse procedimento ajuda a aumentar
a permeabilização do tecido para as etapas subseqüentes. Em seguida,
realizamos o bloqueio da peroxidase endógena do tecido nervoso lavando as
secções na solução de PBT contendo 2 % de peróxido de hidrogênio (diluição
volume/volume), durante 10 minutos, sob agitação suave e constante. Para
57
finalizar o bloqueio da peroxidase endógena, lavamos as secções novamente
em PBS 0,1M durante 20 minutos. Finalmente, as secções foram incubadas
no complexo avidina-biotina peroxidase (Kit ABC, VECTOR LAB, 1:200), em
PBT, por pelo menos 8 horas, sob temperatura ambiente em agitação suave
e constante.
Revelamos a peroxidase associada ao ABC utilizando o método da
glicose oxidase-diaminobenzidina-níquel (solução GND) proposto por e
adaptado para o protocolo da BDA (Shu et al., 1988), seguindo instrução do
fabricante (MOLECULAR PROBES). Antes de serem submetidos à solução
GND, as secções foram lavadas em tampão acetato 0,1 M (pH 6,0) durante
cinco minutos. A solução GND consiste de 1,25 g de sulfato de níquel
amoniacal (ALDRICH) diluído em 25 mL de tampão acetato 0,2 M pH 6,0
(solução A) e 25 mg de DAB (Diaminobenzidine, SIGMA) diluídos em 25 mL
de água destilada (solução B). Após homogeneização, as soluções A e B
podem ser misturadas, filtradas e acrescentadas de 100 mg β-D-Glucose
(SIGMA) e 20 mg cloreto de amônia (SIGMA). Inicialmente, as secções foram
incubadas em solução GND durante 5 minutos e, então, adicionou-se à
solução pitadas da enzima de glucose oxidase (SIGMA). O tempo de reação
foi controlado visualmente pela intensidade de marcação e interrompida com
lavagem em tampão acetato 0,1 M (pH 6,0), durante 10 minutos, sob agitação
suave e constante.
3.3 - Lavagem, desidratação e montagem
Após histoquímica, as secções foram recolhidas em PBS 0,1 M para
serem montadas seriadamente em lâminas gelatinizadas, deixadas para
58
secar em temperatura ambiente durante oito horas e desidratadas em bateria
de álcool com concentração de 50%, 70%, 80%, 90%, 100% e a 100%, 5
minutos cada, e clareadas por xileno em duas baterias de 5 minutos.
Finalmente, as lâminas foram cobertas com lamínula usando-se como meio
de inclusão entellan (Entellan, MERK).
3.4 - Coloração de Nissl no material sem contra-marcação de NADPH-
diaforase ou citocromo oxidase.
Para os animais cujas secções dos encéfalos não receberam contra-
marcação de NADPH-d ou CitOx, após a reconstrução 3-D das células
marcadas com BDA (ver item a seguir), as lâminas histológicas foram
desmontadas em xilol (SIGMA) durante 48 horas e re-hidratadas em bateria
decrescente de álcool (álcool e clorofórmio [1:1] durante 10 minutos; álcool a
100%, álcool a 95%, álcool a 76% todos durante 3 minutos), foram
brevemente lavadas em água destilada e colocadas em cresil violeta (a
0,25% em água destilada) à 37
0
C durante 3 minutos seguido de lavagem em
água destilada novamente. Após isso, seguiram para álcool 75% (durante 3
minutos), álcool 95% por 10 minutos, álcool 95% mais clorofórmio (1:1)
durante 3 minutos, álcool 95% com algumas gotas de ácido acético durante 3
minutos (para remover o excesso de coloração), álcool 95% por 3 minutos
(para retirar o excesso de clorofórmio e ácido acético), álcool etílico 100%
mais álcool butílico 100% (proporção de 1:1) durante 3 minutos e, finalmente,
clareado com xilol por 5 minutos.
Este procedimento de coloração permitiu-nos visualizar as camadas
corticais e os barris de S1 do rato após a etapa de reconstrução 3-D das
59
células marcadas por BDA e, finalmente, adicionamos os contornos dos barris
e delimitamos as camadas corticais, usando o sistema Neurolúcida (ver item
a seguir) aos arquivos das células reconstruídas previamente e assim
pudemos determinar a exata posição dos corpos celulares e dos terminais
axonais em relação às colunas do PMBSF do rato (ver Figura 15).
3.5 - Documentação e análise dos dados
As lâminas histológicas, contendo as secções seriadamente
organizadas dos encéfalos de rato, após os experimento relatado
anteriormente, foram levadas à um microscópio óptico Axioplan (Zeiss,
GERMANY) para observação, em diferentes aumentos da marcação do
neurorrastreador. As células marcadas pelo BDA no PMBSF com projeções
córtico-corticais através do corpo caloso foram classificadas de acordo com
sua posição nas camadas corticais (supra granular, granular e infragranular)
segundo a marcação da CitOx ou NADPH-d ou ainda a coloração de Nissl.
As células que apresentaram corpos celulares e arborizações dendrítica
e axônica claramente bem preenchidas pelo BDA anterógrado e retrógrado
foram selecionadas para serem reconstruídas em 3D e terem sua
morfometria fina analisadas com o auxílio do sistema Neurolúcida (MBF
Bioscience). Cada uma das secções teve seu contorno externo desenhado,
as camadas corticais, os ventrículos e os vasos sanguíneos de maior calibre
(Figura 16). Este procedimento facilitou o alinhamento correto das secções
adjacentes, uma vez que tanto as células anterogradamente marcadas
quanto as células retrogradamente marcadas pelo BDA localizaram-se
sempre em mais de uma secção.
60
Figura 16: Contornos de pilha de secções seriadas. Em A, visão coronal e
em B, uma visão superior. Note os vasos sanguíneos (vermelhos) que, junto
com outras estruturas anatômicas, ajudaram a alinhar a pilha de seções do
encéfalo de rato.
61
3.5.1 – O Sistema Neurolúcida
Hoje em dia, são raros os casos em que apenas a análise qualitativa é
tão óbvia que possa comprovar, per se, os achados experimentais. Ao invés
disso, há necessidade de mais e mais análises quantitativas para se avaliar
modificações celulares e até subcelulares. No caso específico das
neurociências, torna-se cada vez mais necessária a análise de parâmetros
morfológicos finos dos neurônios tais como a área do corpo celular e do
campo dendrítico (isto é, área de ocupação dos dendritos); complexidade da
arborização dendrítica (como a dimensão fractal); número de varicosidades
dendríticas; viés (bias) dendrítico; área de arborização e complexidade axonal
(outra dimensão fractal); número e densidade de ramificações dos axônios;
ângulo das ramificações axonais; número de botões sinápticos, etc. A análise
desses parâmetros permite caracterizar diferentes populações de neurônios e
detectar até mesmo as mais sutis mudanças nas células nervosas.
Desenvolvido especificamente para as neurociências, o sistema
Neurolúcida (MBF Bioscience Inc, USA) (Figura 17) pode realizar o
mapeamento neuroanatômico, rastreamento de neurônios e reconstrução
seriada de secções do encéfalo e análise da morfometria fina dos neurônios.
Ele é composto pelo programa Neurolúcida, uma câmera digital (ou ainda
minimonitor Lucivid), uma platina motorizada com controlador de foco, mouse
ou tablet, um computador com Windows 2000 (ou versão posterior) e uma
impressora (ver Figura 17).
O sistema controla a platina motorizada, adicionada ao microscópio,
que conduz a navegação durante análise das preparações histológicos nos
62
três eixos (X, Y e Z), permitindo integrar um ilimitado número de secções de
encéfalo seriadamente ordenadas num único arquivo, mantendo cada secção
na posição espacial adequada (3D) para uma completa análise quantitativa,
via o programa de computador Neuroexplorer (MBF Bioscience Inc, USA).
É possível adaptar o sistema Neurolúcida a diferentes desafios ópticos
de imagens e/ou vídeos, como por exemplo em microscópios verticais,
invertidos, eletrônicos e mesmo os confocais. É possível usar qualquer tipo
de iluminação, incluindo campo claro, campo escuros, contraste de fase e
fluorescência. Neste trabalho, usamos microscópio vertical Axioplan (Zeiss,
GREMANY) com luz de transmissão. Características do sistema como a
correção de foco e o reposicionamento no centro do campo de visão quando
se mudam as lentes objetivas são preciosas para se ganhar tempo durante a
análise do material histológico, sejam eles com necessidade de pequeno ou
grande campo de visão.
Neste trabalho, realizamos a reconstrução tridimensional de neurônios
que conectam, via corpo caloso, os campos de barris do PMBSF de ratos
adultos. Para isso, realizamos a reconstrução seriada das secções de
encéfalos de ratos Wistar que receberam injeções iontoforéticas de BDA (de
transporte anterógrado ou retrógrado). As secções foram alinhadas usando
os acidentes anatômicos e os grandes vasos sangüíneos como referências
(ver Figura 16). Em cada secção, desenhamos o contorno externo (superfície
pial), os ventrículos e os grandes vasos sanguíneos. Considerando-se o eixo
antero-posterior, para cada uma das secções fizemos os contornos da porção
mais anterior (sempre em contato com a lamínula) e o contorno da porção
mais caudal da secção (sempre em contato com a lâmina).
63
Figura 17: O Sistema Neurolúcida. Em (A), desenho esquemático de um
sistema Neurolúcida com o minimonitor Lucivid. Em (B), fotografia de um
sistema Neurolúcida com câmera digital de alta resolução. 1: microscópio
vertical; 2A; minimonitor Lucivid acoplado ao microscópio; 2B: câmera digital
acoplada ao microscópio; 3: platina motorizada; 4: controlador da platina
motorizada; 5: joystick; 6, 6B.1 e 6B.2: monitores de vídeo; 7: computador; 8:
mouse.
64
Quando as lâminas estavam posicionadas na platina as imagens foram
enviadas pelo minimonitor Lucivid, que superpõe as imagens da tela do
computador com as imagens que são projetadas nas oculares, ou as imagens
foram enviadas para monitores digitais, com o auxílio de uma câmera digital
de alta resolução acoplada ao microscópio. Desenhamos, então, os axônios
que atravessavam o corpo caloso em direção ao PMBSF contralateral ao
corpo celular. Após desenhar todo o terminal axonal, voltamos a seguir o
axônio a partir do corpo caloso, agora em direção ao corpo celular localizado
próximo ao sítio de injeção. Após a reconstrução do corpo celular, fizemos a
reconstrução tridimensional da arborização dendrítica.
Os neurônios marcados retrogradamente foram desenhados a partir
dos corpos celulares, arborização dendrítica e axônios proximais, até
entrarem na substância branca, no PMBSF do hemisfério oposto ao sítio de
injeção. Em média, os neurônios calosos do PMBSF de ratos tinham seu
corpo celular, arborização dendrítica, axônio e terminais axonais dispostos de
três a seis secções consecutivas do encéfalo. Finalmente, os arquivos
gerados pelo programa Neurolúcida foram abertos no programa
Neuroexplorer, onde extraímos os dados das características morfométricas
das células reconstruídas. Os resultados foram então plotados em planilhas
do programa Biostat (Mamirauá, UFPa) e analisados estatisticamente (ver
Figura 15 para resumo dos métodos) .
3.5.2 – Análise estatística
Os neurônios calosos do PMBSF marcados retrogradamente foram
divididos em três diferentes populações, de acordo com sua localização laminar
65
(supragranular, n=10; granular, n=10; infragranular, n=10) e as características
morfométricas como a área de corpo celular, o comprimento linear dos
dendritos, a área dendrítica, o volume do campo dendrítico e a complexidade
geométrica da arborização dendrítica foram comparadas entre as três
populações usando-se a analisadas variância (ANOVA) com α=5% e pós teste
de Tukey. Para comparar essas mesmas características morfométricas, mas de
acordo com a disposição colunar do PMBSF, os células calosas (CC) foram
subdividas de em: coluna de septo e coluna de barril e usamos o teste t de
Student, com α=0,05.
Para comparar as características morfométricas dos axônios calosos do
PMBSF de rato, 10 células (n=10) marcadas anterogradamente foram
totalmente reconstruídas com o auxílio do sistema Neurolúcida e as mesmas
foram divididas de acordo com a posição colunar do corpo celular no PMBSF:
coluna de septo e coluna de barril. Nessas duas subpopulações, analisamos
o comprimento linear dos axônios, área axonal, o volume do campo axônico,
a complexidade da arborização axonal e a quantidade de botões sinápticos
(de passagem e terminais) utilizando o teste t de Student, com α=0,05, para
comparar as duas subpopulações.
66
4 – Resultados
4.1 – Os sítios de injeção
As injeções iontoforéticas de BDA 3 kD e 10 kD, precedidas de registro
eletrofisiológico extracelular multiunitário, promoveram marcação
predominantemente retrógrada e anterógrada, respectivamente. Entretanto,
dos 84 experimentos realizados neste estudo (ver Tabela 1), usando-se os
mesmos parâmetros nas injeções iontoforéticas (mesmo tempo de pulsos,
polaridade e intensidade da corrente elétrica, mesmo tempo de sobrevida dos
animais e mesma concentração do BDA, ver Métodos), os sítios de injeção
variaram desde sítios muito pequenos, com pouca marcação celular, a sítios de
injeção muito grande que inviabilizaram a reconstrução de células isoladas
(Figura 18).
67
Figura 18: Sítios de injeções não utilizados para a reconstrução 3-D. Em
(A) e (B), injeções que resultaram em sítios grandes e, sendo assim,
inviabilizam a reconstrução 3D devido ao fato de vários dendritos e axônios, de
diferentes células, sobreporem-se uns aos outros. Entretanto, há boa marcação
das conexões córtico-corticais ipsolaterais (setas) a serem analisadas. Em (C),
um sítio de injeção em que BDA não marcou adequadamente, C’ é um
aumento da área C e C” é a ampliação da área em C’.
68
Para a reconstrução em 3D do material histológico no sistema
Neurolúcida, as secções foram primeiramente observadas sob microscopia
óptica e selecionadas de acordo com a presença de corpos celulares,
arborizações dendríticas bem preenchidas (com presença ou não de espinhas)
e arborização axonal com axônios que seguiam em direção ao corpo caloso,
atravessando a linha média em direção ao PMBSF do hemisfério contralateral
e apresentavam terminais axonais bem evidentes, com presença de botões
sinápticos.
As células marcadas pelo BDA retrógrado foram contadas (total de 4160
células), no hemisfério contralateral ao sítio de injeção. Desenhamos os
contornos da superfície pial e dos ventrículos encefálicos e reconstruímos os
neurônios retrogradamente marcados a partir do corpo celular, arborização
dendrítica e parte do axônio que seguia em direção à substância branca. Após
a contagem e a reconstrução dessas células, as lâminas foram desmontadas
em xilol e processadas para a coloração de Nissl. Após serem remontadas,
usamos as lâminas para adicionar os contornos dos barris.
Para a marcação anterógrada, selecionamos os casos em que o sítio de
injeção foi pequeno e que apresentavam células bem preenchidas pelo BDA
com corpos celulares, arborizações dendríticas bem preenchidas (com
presença ou não de espinhas) e arborização axonal com axônios que seguiam
em direção ao corpo caloso, atravessando a linha média em direção ao PMBSF
do hemisfério contralateral e apresentavam terminais axonais bem evidentes,
com presença de botões sinápticos (Figura 19). Após a reconstrução desses
neurônios, as lâminas foram desmontadas em xilol e processadas para a
coloração de Nissl, para visualização dos barris.
69
Figura 19: Injeções iontoforéticas de BDA adequadas para reconstrução
3D. Superior, fotomicrografia de uma secção com injeção iontoforética de
BDA anterógrado. Em (a), os axônios da células marcadas em direção à
substância branca e seguindo em para o corpo caloso, em (b), na substância
branca do hemisfério contralateral ao sítio de injeção, em (c), e os axônios
calosos arborizando em região homotópica do córtex de barril contralateral ao
sítio de injeção, em (d). A barra de escala de a também se aplica em b, c e d.
70
4.2 – Análise qualitativa das células calosas do PMBSF de rato
4.2.1 – A distribuição laminar das células calosas retrogradamente
marcadas
As injeções iontoforéticas de BDA 3 kD resultaram em ampla marcação
retrógrada de corpos celulares em regiões próximas ao sítio de injeção
(PMBSF), em áreas mais laterais à S1, correspondentes à S2 e PV, células
aferentes do núcleo VB do tálamo e também no PMBSF contralateral ao sítio
de injeção (Figura 20).
(1) No hemisfério oposto ao sítio de injeção, as células calosas (CC)
distribuíram-se por todas as camadas do PMBSF, sendo que as camadas
supragranulares apresentam mais células marcadas.
(2) Na camada granular, as células marcadas estavam distribuídas por
todo o plano tangencial, indicando que nessa camada há células que fazem
conexões calosas localizadas tanto na coluna de septo quanto na coluna de
barril.
(3) As camadas infragranulares apresentaram menores quantidades de
células marcadas pelo neurorrastreador e essas células localizaram-se
principalmente na camada V. Algumas poucas células marcadas
retrogradamente localizaram-se na camada VI (ver Figuras 20).
71
Figura 20: Injeção de BDA retrógrado e a marcação no PMBSF do
hemisfério contralateral. Em (A), seções organizadas seriadamente
mostrando o sítio de injeção (hemisfério esquerdo). Em (B), uma secção
superposta com a figura do atlas Paxinos, demonstrando o sítio de injeção na
área correspondente ao PMBSF do córtex somestésico de rato. Em (C),
ampliação do sítio de marcação no hemisfério contralateral em local
homotópico ao sítio de injeção. Em (D), ampliação da área verde, mostrando
neurônios piramidais calosos supragranulares marcados retrogradamente por
BDA.
72
4.2.2 – A localização laminar e a arborização dendrítica das células
calosas
As CC marcadas retrogradamente nas camadas supragranulares
apresentaram arborização dendrítica exuberante, com ramos que alcançaram
até a sexta ordem, espalhamento extenso da árvore dendrítica, dendritos
apicais que alcançaram a camada I (intensamente ramificados) e todas as
células reconstruídas apresentaram espinhas dendríticas.
As CC marcadas retrogradamente na camada granular apresentaram
arborização dendrítica pouco extensas e claramente menor que as CC das
camadas supragranulares e infragranulares, com ramos que alcançaram até
terceira ordem e nenhuma célula apresentou espinhas dendríticas.
As CC marcadas retrogradamente nas camadas infragranulares
apresentaram arborização dendrítica exuberante, com ramos que alcançaram
até a quarta ordem, espalhamento extenso da árvore dendrítica, dendritos
apicais longos que emitiam vários ramos, e células com e sem espinhas
dendríticas.
4.2.3 – Os axônios calosos do córtex de barris
As injeções iontoforéticas de BDA 10 kD promoveram marcação
predominantemente anterógrada. Algumas células marcadas enviavam
axônios para regiões laterais à S1 no mesmo hemisfério (correspondendo à
S2, PV e PR). Nenhuma célula calosa reconstruída fez projeções para outras
áreas ipsolaterais ao corpo celular. Usamos os axônios que se projetaram
para outras áreas ipsolaterais, mas que alcançaram distância semelhante a
73
percorrida pelos axônios calosos, como parâmetro para se determinar o
adequado transporte intracelular do neurorrastreador (Figuras 21 e 22) .
Figura 21: Marcação, por BDA de transporte anterógrado, no mesmo
hemisfério do sítio de injeção. Secção do encéfalo de rato que recebeu
injeção iontoforética de BDA numa coluna de barril (em (A), cabeça de seta) e
as projeções a partir da coluna de barril para o hemisfério ipsolateral. Em (B),
as fibras da coluna de barril penetrando na substância branca, em (C)
terminais axonais que se projetaram para S2, em (D) terminais axonais que
projetaram para PV. Alguns terminais axonais chegando numa área próxima
a fissura rinal (E).
74
Figura 22: Marcação, por BDA de transporte anterógrado, no hemisfério
contralateral ao sítio de injeção. Hemisecção do encéfalo de rato (A’),
contralateral ao sítio de injeção iontoforética de BDA, mostrando as fibras
passando pelo corpo caloso (B’) e terminais axonais chegando ao PMBSF do
hemisfério contralateral ao sítio de injeção (C’).
75
Os terminais axonais calosos no PMBSF oposto inervaram regiões
homotópicas ao corpo celular e foram restritos ou à coluna de septo ou à
coluna de barril. Esses terminais axonais ramificaram-se na camada granular
mas também atingiram as camadas supragranulares, independentemente da
posição laminar do corpo celular, e apresentaram um grande número de botões
sinápticos, com uma clara predominância de botões de passagem em relação
aos botões terminais.
Os terminais das CC dos barris sempre ocupavam a coluna do barril
correspondente à do corpo celular, enquanto os terminais provenientes de
septo inervaram regiões septais no hemisfério contralateral localizadas ao
entorno da linha de barril mais próxima em relação a posição do corpo celular
de origem.
4.3 – Análise quantitativa: as características morfométricas das células
calosas do PMBSF de rato
4.3.1 – Distribuição laminar.
As injeções iontoforéticas de BDA 3 kD no PMBSF de ratos produziram
ampla marcação retrógrada próxima ao sítio de injeção, em regiões ipsolaterais
ao sítio de injeção (S2, PV, PR), no hemisfério contralateral e também no
tálamo, em região correspondente ao núcleo VB (Figura 23).
76
Figura 23: As células calosas do PMBSF marcadas retrogradamente. Em
(A), fotomicrografia de uma secção do PMBSF com células marcadas
retrogradamente. Em (B), fotomontagem dos desenhos no sistema
Neurolúcida e de fotomicrografia da região do PMBSF marcada
retrogradamente. Em (C), montagem de uma pilha de desenhos, com os
barris, e fotomicrografia de parte do sítio de injeção de BDA e marcação
retrógrada no tálamo. Em (D), reconstrução 3D de uma pilha de secções.
Cada ponto colorido corresponde a uma célula marcada. Note que houve
marcação em todas as camadas, sugerindo que há células calosas nas
colunas de septo e de barris.
77
A distribuição laminar das células calosas do PMBSF de rato é a seguinte
(Figuras 24):
• Camadas supragranulares: apresentaram a maior quantidade de células
calosas (850 + 18 células; n=3);
• Camada granular: apresentou quantidade intermediária de células
calosas (411 + 43 células; n=3);
• Camadas infragranulares: apresentaram a menor quantidade de células
calosas (110 + 19 células; n=3).
As médias dos números de CC foram comparadas usando-se análise de
variância (ANOVA) e o resultado aponta que há diferença estatisticamente
significativa entre os valores médios da distribuição laminar das CC no PMBSF
de rato (p<0,05, ANOVA; ver Figuras 24).
78
Figura 24: Distribuição das células calosas no PMBSF de rato. Em (A), a
distribuição laminar das células calosas do PMBSF que se localizaram
principalmente nas camadas supragranulares (850 + 18), seguidas da
camada granular (411 + 43) e, finalmente, nas camadas infragranulares (110
+ 19; ANOVA, p<0,05*). (B) Na camada granular (camada IV), as células
calosas localizaram-se preferencialmente na região septal do que dentro dos
barris (276 + 14, 138 + 12, respectivamente; teste t, p<0,0002***).
79
4.3.2 – Distribuição das células calosas na camada IV do PMBSF.
A distribuição colunar das 4160 CC no PMBSF foi avaliada apenas na
camada IV, em virtude da precisão da transição entre septo e barril:
• Coluna de septo: apresentou maior número de CC marcadas (276 + 14
células; n=3);
• Coluna de barril: apresentou menor número de CC marcadas (138 +
12
células; n=3).
Os valores médios das CC localizadas nas colunas de septos ou nas
colunas de barris foram comparados com o teste t de Student que apontou
diferença estatisticamente significativa entre as duas distribuições na camada
granular (camada IV) do PMBSF (teste t, P<0,0002) (Figura 24B).
Resumindo, no córtex de barris as CC encontram-se localizadas em todas as
camadas do PMBSF, com predominância nas camadas supragranulares,
seguida da camada granular e, em menor quantidade, nas camadas
infragranulares. Na camada granular (camada IV), há predominância de CC
na coluna de septo em relação às colunas de barris.
4.3.3 – Características morfométricas do corpo celular e da arborização
dendríticas das CC do PMBSF
Para análise da morfometria fina das CC, reconstruímos 10 neurônios
de cada camada (sendo cinco células para coluna de septo e cinco para a
coluna de barril) com o auxílio do Sistema Neurolúcida (Figuras 25, 26, 27 e
28).
80
Figura 25: Neurônio caloso supragranular marcado retrogradamente. Em
(A), fotomicrografia mostrando o corpo celular, parte da arborização
dendrítica e o axônio (setas) de um neurônio caloso supragranular. Note a
arborização dendrítica exuberante. Em (B), aumento do boxe em (A),
mostrando parte do dendrito apical com presença de espinhas dendríticas
(cabeças de seta).
81
Figura 26: Neurônio caloso granular marcado retrogradamente. Em (A),
fotomicrografia mostrando o corpo celular, parte da arborização dendrítica e o
axônio (setas) de um neurônio granular caloso. Note a arborização dendrítica
com poucos ramos basais e também no dendrito apical. Essas células não
apresentam espinhas dendrítica. Em (B), maior aumento do boxe em (A),
mostrando o corpo celular e parte proximal dos dendritos basais e do dendrito
apical (cabeças de seta).
82
Figura 27: Neurônio caloso infragranular marcado retrogradamente. Em
(A), fotomicrografia mostrando o corpo celular, parte da arborização
dendrítica e o axônio (seta) de um neurônio infragranular caloso. Note a
arborização dendrítica que é mais exuberante em relação aos neurônios
granulares. Em (B), aumento do boxe em (A), mostrando o corpo celular e
parte dos dendritos basais e do dendrito apical (cabeças de seta).
83
Figura 28: Neurônios calosos reconstruídos em 3D. Um aglomerado de
neurônios calosos marcados retrogradamente por BDA (A) e subdividido por
camadas em (B). Azul corresponde às camadas supragranulares, laranja
corresponde à camada granular e verde às camadas infragranulares. Note a
exuberância das células supragranulares em relação as demais.
84
No total de 30 células reconstruídas e analisadas, as características
morfométricas das CC na distribuição laminar foram as seguintes:
• A área do corpo celular das CC nas camadas supragranulares (151, 4 +
38,36 μm
2
; n=10), granular (151,3 + 28,43 μm
2
; n=10) e infragranulares
(142,2 + 20,16 μm
2
; n=10) foi semelhante entre elas ( ANOVA, p>0,05;
Figura 29);
• O comprimento dendrítico linear foi muito maior nas camadas
supragranulares (2629,0 + 467,1 μm; n=10), menor na camada granular
(142,2 + 6,37 μm; n=10) e de tamanho intermediário nas camadas
infragranulares (217,5 + 37,55 μm; n=10). Houve diferença
estatisticamente significativa para essa característica morfométrica entre
as três subpopulações (ANOVA, p<0,05);
• A área de arborização dendrítica também foi maior nas células das
camadas supragranulares (4149 + 649 μm
2
; n=10), menor nas células
da camada granular (137 + 23 μm
2
; n=10) e de tamanho intermediário
nas células das camadas infragranulares (646 +
132 μm
2
; n=10),
diferindo significativamente entre as três subpopulações de CC (ANOVA,
p<0,05);
• O volume da arborização dendrítica foi maior nas células
supragranulares (3709788 +
201000 μm
3
; n=5), nas células da camada
granular (14625 + 10592 μm
3
; n=10) e infragranulares (1112913 +
126800 μm
3
; n=10), também diferindo significativamente entre as células
das três camadas (ANOVA, p<0,0001);
• E, finalmente, a complexidade geométrica das células das camadas
supragranulares (1,179 + 0,18 k-dim; n=10) foi sempre maior que na
85
camada granular (1,059 + 0,03 k-dim; n=10) e camadas infragranulares
(1,100 + 0,05 k-dim; n=10 e ANOVA, p<0,05; Figura 31).
Figura 29: Tamanho do corpo celular na distribuição laminar das células
calosas do PMBSF de rato. A área de corpo celular foi semelhante entre as
células das camadas supragranular, granular e infragranular (151 +
38; 151 +
28; 142 +
20 μm
2
, respectivamente; ANOVA, p>0,05).
86
Figura 30: Características morfométricas da arborização dendrítica. Em
(A), a soma linear de todos os ramos do dendrito diferiu entre as células das
camadas supragranulares, granular e infragranulares (2629+467, 142+6,
217+37 μm, respectivamente; ANOVA; p<0,0001***; p<0,05*), soma das área
dos segmentos dendríticos em (B) (4149 + 649, 137 + 23, 646 + 132 μm
2
,
respectivamente; ANOVA, p<0,0001***; p<0,05*) o volume que a arborização
dendrítica ocupa no espaço em (C) (3709788+2101000; 14625+10592;
1112913+126800 μm
3
, respectivamente;ANOVA, p<0,0001***; p<0,05*). A
complexidade geométrica da arborização dendrítica diferiu significativamente
apenas entre as células das camadas supragranulares da camada granular,
em (D) (ANOVA, p<0,05*), e não foi diferente entre as células das camadas
supragranulares e infragranulares e entre as células das camadas granula e
infragranulares (1,179 + 0,18, 1,059, 1,100+ 0,05 k-dim, respectivamente;
ANOVA, p<0,05*; p>0,05).
87
Após adicionarmos os contornos dos barris do PMBSF às reconstruções
da série de secções coronais, foi possível então dividir as células marcadas
pelo neurorrastreador retrógrado de acordo com a posição colunar do corpo
células: coluna de septo ou coluna de barril (Figuras 31, 32) e assim analisar as
características morfométricas das CC do PMBSF de rato de acordo com sua
distribuição colunar:
• A área do corpo celular nas colunas de septo e de barril das camadas
supragranulares (131,0 + 19,25 μm
2
e 150,2 + 15,81 μm
2
,
respectivamente; n=10), camada granular (153,4 + 22,03 μm
2
e 148,0 +
19,95 μm
2
, respectivamente; n=10) e camadas infragranulares (168,3 +
16,83 μm
2
e 140,2 + 18,63 μm
2
, n=10; respectivamente) não diferiram
entre as duas colunas (teste t, p>0,05 para todas as comparações);
• O comprimento dendrítico linear das CC nas colunas de septo e de barril
das camadas supragranulares (2791 + 933,5 μm e 2080 + 714,4 μm,
respectivamente; n=10), camada granular (163,6 + 47,30 μm e 200,8 +
46,45 μm, respectivamente; n=10) e camadas infragranulares (829,6 +
294,60 μm e 501,1 + 140,1 μm, n=10; respectivamente) também não
diferiu entre as duas colunas (teste t, p>0,05 para todas as
comparações);
• A área dendrítica foi semelhante entre as CC das colunas de septo e
barril das camadas supragranulares (4402 + 727,24 μm
2
e 4161 +
1019,0 μm
2
, respectivamente; n=10; teste t=0,1969, p=0,4710), camada
granular (142,9 + 25,69 μm
2
e 162,1 + 76,11 μm
2
, respectivamente;
n=10; teste t=0,3389, p=0,3803) e foi maior nas colunas de septo que
nas colunas de barris das camadas infragranulares (1219,0 + 419,9 μm
2
88
e 432,6 + 111,0 μm
2
, respectivamente; n=p; teste t=0,3389, p<0,001)
(Figura 33).
• O volume de arborização dendrítica foi semelhante entre as células
das colunas de septo e barris nas camadas supragranulares (4513000
+ 2845000, 2906000 + 1561000 μm
3
, respectivamente; n=10; teste t,
p>0,05) e camada granular (14579000 + 589000, 14673000 +
5198000 μm
3
, respectivamente; n=10; teste t, p>0,05) e foi maior nas
CC das colunas de septo nas camadas infragranulares barris (septo:
2057000 + 169178 μm
3
; barril: 1468000 + 196873 μm
3
,
respectivamente; , n=10; teste t, P<0,05) (Figura 33).
89
Figura 31: Neurônios calosos e a organização colunar do córtex de barris.
Em (A), o padrão de cores das fileiras de barris usada neste trabalho. Em (B),
contornos das fileiras de barris feitos com o auxílio do sistema Neurolúcida. Em
(C), aglomerado de neurônios calosos reconstruídos em 3D. Note que tanto as
colunas de septo quanto as colunas de barris apresentam neurônios calosos
nas camadas supragranulares (em azul), camada granular (laranja) assim
como as camadas infragranulares (verde) do PMBSF de rato.
90
Figura 32: Neurônios calosos classificados segundo sua posição laminar
e colunar. Em azul, os neurônios calosos das camadas supragranulares, em
laranja, os neurônios calosos da camada granular e em verde os neurônios
calosos das camadas infragranulares. Pontilhado representa barril. Note que,
qualitativamente, a arborização dendrítica dos neurônios calosos
supragranulares é mais exuberante.
91
Figura 33: Características morfométricas das células calosas localizadas
nas colunas de septo e de barris. A linha (A) representa a área de corpo
celular, (B) é a somatória do comprimento total dos dendritos, (C) é a área
dos dendritos e (D) é o volume da arborização dendrítica. A coluna da
esquerda representa as camadas supragranulares (azul), a coluna central
representa a camada granular (laranja) e a coluna da direita representa as
camadas infragranulares (verde). As características morfométricas foram
semelhantes entre as colunas de septo e de barris nas camadas
supragranulares e granular. Nas camadas infragranulares, o volume
dendrítico foi maior nas células calosas das colunas de septo do que nas
barris (septo: 2057000 + 169178 μm
3
; barril: 1468000 + 196873 μm
3
,
respectivamente; n=10; teste t, P<0,05*).
92
Adicionalmente, dividimos qualitativamente as CC das colunas de septos e
de barris de acordo com a presença ou ausência de espinhas dendríticas. Nas
camadas supragranulares, todas as células das colunas de septos e de barris
apresentaram espinhas. Na camada granular, nenhuma célula apresentou
espinha dendrítica. Já nas camadas infragranulares, todas as CC localizadas
nas colunas de septo apresentaram espinhas enquanto nenhuma das CC
localizadas nas colunas de barris apresentou espinhas dendríticas.
Assim, os corpos celulares e as arborizações dendríticas apresentam-se
mais diferenciados entre as camadas do que entre as colunas corticais.
Somente as camadas infragranulares apresentaram variações na morfologia
dendrítica na sua organização colunar. Por exemplo, as células da coluna de
barris das camadas infragranulares não apresentam espinhas dendríticas, o
comprimento linear e a área dendrítica apresentaram tendência de serem
menores nas CC dos barris do que nas septais e o volume dendrítico foi maior
nas CC septais dessas camadas.
Resumindo, nossos resultados demonstram que as CC das camadas
supragranulares apresentam arborização dendrítica maior e mais complexa
que as das outras camadas. As células das camadas granulares não
apresentam espinhas dendríticas. As CC localizadas nas colunas de septo e de
barril nas camadas supragranulares possuem morfologia semelhantes entre si,
assim como as CC localizadas nas colunas de septos e de barris na camada
granular possuem morfologia semelhante entre si. Já as CC septais das
camadas infragranulares apresentam volume dendrítico maior que as CC das
colunas de barris, além disso as CC septais possuem espinhas dendríticas
enquanto que essas estruturas estão ausentes nas CC das colunas de barris.
93
4.4 – Características morfométricas dos axônios calosos do PMBSF de
rato
As injeções de BDA 10 kD que produziram pequenos sítios de marcação
foram selecionadas para a reconstrução 3D total das CC, com o auxílio do
Sistema Neurolúcida. Essas células foram classificadas em CC das colunas de
septos e CC das colunas de barris, de acordo com a posição colunar dos seus
corpos celulares no PMBSF. Nos neurônios reconstruídos, os axônios se
ramificaram pouco na substância cinzenta, próxima ao corpo celular,
navegaram em direção à substância branca, seguiram em direção ao corpo
caloso, cruzaram a linha média e ramificaram seus terminais axonais no
PMBSF do hemisfério contralateral ao sítio de injeção (Figuras 21 e 22).
Além da presença de axônios calosos que alvejaram o PMBSF
contralateral (Figura 22), também observamos axônios de outras células,
entorno do sítio de injeção, projetando-se para inervar outras regiões
somestésicas, além de S1, no hemisfério ipsolateral ao sítio de injeção como
as áreas S2, PV e uma área próxima à fissura rinal, provavelmente a área PR
(Figuras 21). Tanto os axônios que projetaram para o hemisfério oposto quanto
os axônios que projetaram para outras áreas do mesmo hemisfério do sítio de
injeção apresentaram terminais axonais com botões de passagem e botões
terminais. Entretanto, neste trabalho analisamos as características
morfométricas apenas das células que fazem conexões calosas.
94
Nas 10 células totalmente reconstruídas, o corpo celular, os dendritos e
o axônio localizaram-se entre duas a seis secções consecutivas. As CC do
PMBSF completamente reconstruídas tiveram as seguintes características
morfométricas analisadas:
• comprimento linear dos axônios;
• área axonal;
• volume da arborização axonal;
• complexidade geométrica da arborização axonal;
• o número de botões sinápticos,
• o número de botões de passagem versus o número de botões terminais
Apesar de todas as CC do PMBSF fazerem projeções calosas
homotópicas para o PMBSF do hemisfério contralateral, apenas os neurônios
que se encontraram nas colunas de barris, seja nas camadas
supragranulares, camada granular ou camadas infragranulares,
demonstraram precisão em conectar locais correspondentes dentro do
PMBSF, ou seja, o axônio das CC cujo corpos celulares localizam-se no barril
C3, por exemplo, inervaram o barril C3 do hemisfério contralateral,
permanecendo restrito à coluna de barril, ramificando seus terminais axonais
na camada IV, mas também alcançando as camadas supragranulares.
Nenhuma das células reconstruídas apresentou ramificações axonais para
mais de um barril no hemisfério oposto (Figuras 34, 35 e 36).
95
Figura 34: Reconstrução 3-D de células calosas do PMBSF. Neurônios
que conectam os dois PMBSF, enviando seus axônios através do corpo
caloso. Em (A), padrão de cores usadas para identificar as linhas dos barris.
Em (B), visão coronal da posição de alguns dos neurônios reconstruídos. (C,
D), ampliação dos boxes em (B). Contornos coloridos correspondem aos
barris do PMBSF. Os corpos celulares encontram-se no hemisfério esquerdo
e os terminais axonais no hemisfério direito. Em cinza, os contornos da
superfície pial e em azul, os contornos seguindo os ventrículos encefálicos.
96
Figura 35: Neurônio caloso supragranular da coluna de barril. Neurônio
caloso das camadas supragranulares, coluna de barril, completamente
reconstruído com o auxílio do Sistema Neurolúcida. Em (A), visão frontal e o
esquema de cores das fileiras de barris, em (B), visão superior e em (C),
ampliação do corpo celular e do terminal axonal. Note que o terminal axonal
localiza-se preferencialmente no barril, na região homotópica à localização do
corpo celular
97
Figura 36: Célula calosa supragranular da coluna de septo. Neurônio
caloso das camadas supragranulares, coluna de septo, completamente
reconstruído com o auxílio do Sistema Neurolúcida. Em (A), visão frontal e o
“x” indica a posição do corpo celular (esquerda) e do terminal axonal (direita).
Em (B), visão superior e em (C) ampliação da visão frontal com os contornos
dos barris. Note que o terminal axonal localiza-se preferencialmente no septo
que envolve a fileira de barris mais próxima do corpo celular. Barra de escala
1000 mm.
98
Já os neurônios do PMBSF que fazem projeções calosas e cujos corpos
celulares encontram-se nas colunas de septo, projetaram seus respectivos
axônios também para a região de septo do PMBSF no hemisfério contralateral.
Os terminais axonais evitaram as colunas de barris e se ramificaram na
camada granular (camada IV), mas também alcançavam as camadas
supragranulares.
A região septal no PMBSF contralateral inervado pelo axônio caloso,
correspondia às fileiras de septos adjacentes à fileira de barris mais próximas
do corpo celular. Por exemplo, se o corpo celular de uma célula calosa
encontrava-se no septo próximo aos barris da fileira C, seu axônio inervava a
região de septo adjacente à fileira C no PMBSF contralateral. Outra
característica importante é que esses axônio tendem a não invadir as colunas
de barris (Figuras 37 e 38).
99
Figura 37: Neurônios calosos do córtex de barris de ratos. Neurônios
calosos do PMBSF de ratos, reconstruídos tridimensionalmente com o auxïlio
do sistema neurolúcida. Note que, independente da localização
colunar/laminar do corpo celular, os terminais axonais no hemisfério oposto
são sempre pouco exuberante.
100
Figura 38: Célula calosa infragranular septal. Neurônio caloso totalmente
reconstruído com o auxílio do sistema Neurolúcida. Em (A), visão frontal, em
(B), visão superior, em (C) ampliação do corpo celular e dos contornos dos
barris e em (D), ampliação do terminal axonal. Note que o terminal axonal é
pouco ramificado, restrito ás colunas de septo e, neste caso, para na camada
granular. Barras de escala, 500 μm.
101
A seguir, as características morfométricas dos axônios calosos do córtex
de barril:
• O comprimento linear dos axônios: as colunas de septo (10896 + 1370
μm; n=5) e as colunas de barris (11512 + 1029 μm; n=5) apresentaram
comprimento linear dos axônios semelhantes entre si (p=0,5457, teste t);
• A área de arborização axonal: foi levemente maior nos axônios das
colunas de septo (26006 + 5291 μm2; n=5) do que nos axônios das colunas de
barris (21785 + 4061 μm
2
; n=5) e a diferença não foi estatisticamente
significativa (p=0,3311, teste t).
• O volume da arborização axonal (septo: 2.932x10
6
+1.333x10
6
μm
3
;
barril:1.746x10
6
+785x10
6
μm
3
; teste t, P=0,2505) foi maior nos axônios septais,
porém a diferença não foi estatisticamente significativa.
• A complexidade geométrica dos axônios: análise das dimensões
fractais, pelo método da contagem de caixas, mostrou que os axônios das
colunas de septo (51,360 + 25,40 k-dim; n=5) apresentam formas mais
complexas que as dos axônios da coluna de barril (8,023 +
3,131 k-dim; n=5),
com p<0,0001 no teste t de Student (Figura 39).
• O número total de botões sinápticos: os axônios das colunas de septo
(161 + 8 botões; n=5) apresentaram muito mais botões que os axônios das
colunas de barris (48 +
15 botões; n=5) com p<0,001 no teste t de Student.
Botões sinápticos de passagem e botões terminais: tanto os axônios das
colunas de septo (149 + 22 botões de passagem; 17 + 5 botões terminais;
n=5) quando os axônios das colunas de barris (73 + 8 botões de passagem;
14 + 2 botões terminais; n=5) apresentaram muito mais botões de passagem
que botões terminais (Figura 40).
102
Figura 39: Quantificação dos dados morfológicos dos axônios calosos
do PMBSF. Em (A), o comprimento linear médio (septo: 10896+1370 μm;
barril: 11512+
1029 μm; n=10; teste t p=0,7612), em (B), a área dos axônios
(septo: 26006+
5291 μm
2
; barril: 21785+4061 μm
2
; n=10, teste t, p=0,3311) e
em (C), o volume médio dos axônios (septo: 2932x10
6
+1333x10
6
μm
3
;
barril:1.746x10
6
+785x10
6
μm
3
; n=10; teste t, p=0,2505) da coluna de septo
foram maiores que os da coluna de barril, porém a diferença não foi
significativa entre os dois grupos. Em (D), a complexidade geométrica foi
maior nos axônios das coluna de septo do que nos axônios das colunas de
barris (septo: 51+25 k-dim; barril: 8+7 k-dim, respectivamente; n=10; teste t,
p<0,0001).
103
Figura 40: Distribuição dos botões sinápticos dos axônios calosos do
PMBSF. Os axônios calosos do PMBSF de ratos localizados na coluna de
septo apresentaram mais botões sinápticos do que os axônios localizados na
coluna de barril (161+8, 48+15 botões; teste t, p<0,001) em (A). Quando os
botões sinápticos são analisados separadamente entre botões de passagem
e botões terminais, tanto os axônios localizados nas colunas de septo
(149+22 botões de passagem, 17+5 botões terminais; teste t, p<0,0001**)
quanto os localizados nas colunas de barris (73+22 botões de passagem,
14+8 botões terminais; teste t, p<0,0001**) possuem mais botões de
passagem do que botões terminais, em (B).
104
5 – Discussão
5.1 – Considerações técnicas
A dextrana-amina biotinilada (BDA) é um rastreador sensível para
marcar retrogradamente (BDA de 3 kD) ou anterogradamente (BDA de 10 kD)
neurônios (Reiner et al., 2000; Vercelli et al., 2000). A BDA pode ser injetada
por pressão, ou ainda por iontoforese, e visualizada seguindo um protocolo
padrão, o qual consiste em incubação com complexo avidina-biotina
peroxidase (ABC), revelação por oxidação da diaminobenzidina (DAB) com
intensificação por um metal pesado (como o níquel).
As injeções iontoforéticas de BDA 3 kD no PMBSF de ratos adultos
resultaram em marcação detalhada de corpos celulares e de sua arborização
dendrítica em diversas regiões ipsolaterais bem como no PMBSF do hemisfério
contralateral. Foi possível identificar com facilidade os ramos dendríticos mais
finos assim como as espinhas dendríticas. Houve, também, marcação
retrógrada no tálamo, em região que corresponde ao complexo ventrobasal
(VB). Como era esperado, encontramos células retrogradamente marcadas
distribuídas tangencialmente em todas as camadas do córtex de barris
contralateral ao sítio de injeção.
Para as injeções de BDA 10kD, o objetivo foi de injetar a menor
quantidade possível de neurorrastreador, suficiente para marcar
completamente algumas poucas células calosas, sem prejudicar a visualização
dos seus corpos e prolongamentos celulares. Apesar de usarmos sempre
parâmetros semelhantes (diâmetro da micropipeta, tempo e intensidade dos
pulsos de corrente) na realização das injeções iontoforéticas, o tamanho dos
sítios de injeção variou muito, necessitando de um alto número de
experimentos usados neste projeto. Algumas injeções resultaram em sítios
105
grandes e densos, marcando numerosas células e inviabilizando a
reconstrução de neurônios individuais, enquanto que outras resultaram em
marcação insuficiente e/ou não preenchimento correto de toda os
prolongamentos celulares.
Algumas injeções resultaram num numero pequeno de células bem
preenchidas pelo BDA, sendo a situação ideal para a visualização do axônio
caloso com todos seus ramos terminais. Detalhes da morfologia axonal,
inclusive os ramos mais distais e mais finos, e os botões sinápticos, de
passagem e terminais, foram facilmente visualizados. Portanto, todas as
células analisadas com o auxílio do sistema Neurolúcida, foram reconstruídas
com todos os detalhes de suas estruturas dendríticas e axonais.
Os tempos de sobrevida de 10 dias para os animais que receberam
injeções iontoforéticas de BDA 3 kD e de 15 dias para os animais que
receberam injeções iontoforéticas de BDA 10 kD foram ideais para que o
neurorrastreador fosse transportado por todos os prolongamentos das CC e
permitisse a visualização de estruturas como as espinhas dendríticas e os
botões axonais. Como controle interno da marcação neuronal pelo BDA,
sempre nos certificávamos de que as conexões ipsolaterais ao sítio de
injeções, como as para S2, PV e PR, estavam evidentes e com preenchimento
celular completo. Para marcar os axônios que chegavam até a área PR, por
exemplo, o neurorrastreador tinha que ser transportando intracelularmente por
uma distância semelhante à que percorria até alcançar o hemisfério
contralateral.
Durante a execução deste projeto, utilizamos duas configurações
diferentes do sistema Neurolúcida: a primeira (que chamaremos de 01),
106
utilizava o minimonitor Lucivid colocado no tubo da câmera clara do
microscópio. Neste caso, o desenho era feito com o experimentador olhando
nas oculares do microscópio, onde ocorria a sobreposição entre a imagem
óptica da preparação histológica e da saída gráfica produzida pelo programa de
computação (ver Métodos). Na segunda configuração (que chamaremos de
02), a preparação histológica foi digitalizada on-line através de uma câmera
digital de alta resolução e projetada num monitor de vídeo, juntamente com a
saída gráfica do programa de computação. Neste caso, o experimentador
trabalhava diretamente na tela do computado, sem precisar usar
constantemente as oculares do microscópio.
Como a reconstrução de neurônios isolados demanda bastante tempo,
em virtude da necessidade de seguir os ramos dendríticos e axonais de cada
célula calosa do PMBSF através pelo menos três (e até 06) secções coronais
de 150 μm do encéfalo de rato, foi mais confortável usar o sistema 02, uma vez
que a imagem enviada para monitores de vídeo digitais retira a necessidade de
ficarmos com os olhos, por horas ininterruptas, nas oculares do microscópio.
Mas, apesar dessa vantagem, nos maiores aumentos o sistema 02
apresentou problemas ne resolução de imagem e algumas vezes foi
necessário usar as oculares do microscópio para melhor visualizar as
estruturas de menor tamanho. Outra dificuldade foi a perda de profundidade
na imagem projetada no monitor de vídeo. Como no sistema 02 a imagem da
preparação histológica é visualizada de uma única perspectiva (a imagem
capturada pela câmera digital) a noção de profundidade fica prejudicada,
enquanto no sistema 01 o observador beneficia-se da fusão binocular das
imagens projetadas em cada um dos seus olhos, o que produz uma imagem
107
estereoscopica que possui uma aparente profundidade de campo. Em alguns
casos de duvidas, usando-se o sistema 02, como por exemplo na
sobreposição de dois ramos axônicos muito finos que poderiam ser
interpretados de forma errônea como uma bifurcação, o usuário tem sempre
que verificar essas estruturas usando as oculares. Por outro lado, a
possibilidade de capturar imagens com alta resolução no sistema motorizado
02 nos permite realizar microfotomontagens precisas em qualquer aumento.
5.2 – Distribuição laminar, tangencial e morfologia das células calosas
no PMBSF do rato adulto.
Diversos trabalhos usando neurorrastreadores como HRP e WGA-HRP
demonstraram que nas fases precoces do desenvolvimento pós-natal do rato
existem numerosas células calosas espalhadas por toda a extensão do córtex
de barris (Ivy et al., 1979, 1984; Ivy & Killackey, 1982), da mesma forma que
existem inicialmente numerosas células calosas em toda a extensão tangencial
do córtex visual (Innocenti, 1982). Esses resultados clássicos foram
recentemente confirmados por técnicas modernas usando eletroporação
(Mizuno et al., 2007; Wang et al., 2007). Durante as primeiras semanas pós-
natais, muitas dessas células perdem seu ramo axônico caloso e mantém
conexões somente com o córtex ipsolateral, ou com estruturais subcorticais
(Ivy & Killackey, 1982). A partir da terceira semana de vida pós-natal, as células
calosas tornam-se mais esparsas, concentradas principalmente nas camadas
II-III e Va, com poucas células de projeção calosa na região de septo e
ausentes nos barris da camada IV (Ivy et al., 1984; Olavarria et al., 1984;
Hayama & Ogawa, 1997, Mizuno et al., 2007; Wang et al., 2007).
108
Nossos resultados demonstram que, no PMBSF do rato adulto, existem
células calosas tanto nas colunas de septo quanto nas colunas de barris e em
todas as camadas: supragranulares, infragranulares e também na camada IV.
Quantitativamente, as células calosas localizaram-se principalmente nas
camadas supragranulares, depois na camada granular e, em menor
quantidade, nas camadas infragranulares. Na camada granular, as células
calosas foram principalmente localizadas nos septos, embora não forma
ausentes dos barris.
A maior quantidade de células calosas localizadas nas camadas
supragranulares e também a existência de células calosas nas camadas
infragranulares estão de acordo com os resultados de outros estudos (Ivy &
Killackey, 1982). A presença de células calosas na região de septo da camada
granular também (Hayama & Ogawa, 1997). Entretanto, nossos resultados
demonstraram que, na camada IV, existem células calosas dentro dos barris.
Essa discrepância de resultados pode ser atribuída às diferentes sensibilidades
dos neurorrastreadores retrógrados usados.
Enquanto os estudos anteriores usaram neurorrastreadores retrógrados
como o HRP e o WGA-HRP, no presente estudo utilizamos o BDA de baixo
peso molecular (BDA 3 kD), um polissacarídeo hidrofílico caracterizado por sua
boa solubilidade em água, não tóxico e resistente à clivagem de glicosidases
celulares endógenas (ver Vercelli et al., 2000), portanto é um neurorrastreador
mais estável. O BDA marca fibras de passagem que foram rompidas, mas
também marca fibras intactas e tem sido afirmado que é o mais sensível
neurorrastreador para visualização neuronal e seu uso resulta em marcação
detalhada de espinhas dendríticas e de botões sinápticos (Reiner et al., 2000).
109
Neste trabalho também usamos o BDA de alto peso molecular, um
neurorrastreador essencialmente anterógrado (Xue et al., 2004) e obtivemos
marcação de células na camada granular, tanto nas regiões de septo quanto
nas regiões de barris. A reconstrução 3D individual desses neurônios e do seu
axônio, a partir do corpo celular, elimina toda possibilidade que tais células
granulares não sejam, de fato, as de projeções calosas. O fato de tais células
terem passado despercebidas em estudos anteriores pode ser devido a
redução das suas arborizações axonais e dendríticas, em relação às células
calosas das demais camadas, o que limita, respectivamente, tanto a captura do
rastreador retrogrado pelos terminais quanto a acumulação deste nos
dendritos. Embora não tenhamos observado diferenças significativas nas
arborizações das células granulares localizadas nos septos ou no barris,
podemos sugerir que traçadores menos sensíveis não foram adequados para
preencher corretamente tais células com ramificações muito discretas.
Recentes estudos no córtex somestésico (Petreanu et al., 2007, Wang et
al., 2007) e no córtex visual (Mizuno et al., 2007), todos usando técnicas de
eletroporação, demonstraram que as conexões calosas das camadas
supragranulares fazem mais sinapses ipsolaterais e contralaterais com as
camadas V, menos com as camadas II/III e VI e não fazem sinapses com a
camada IV. A manutenção dessas sinapses é dependente de atividade elétrica
durante o desenvolvimento do animal (Togawa et al., 2008). Nossos resultados
também demonstram que as células das camadas supragranulares, tanto nas
colunas de septos quanto nas de barris, possuem axônios calosos que
alcançam as camadas supragranulares do PMBSF contralateral.
Adicionalmente, nossos resultados demonstram que existem botões sinápticos
110
(de passagem e terminal) que se localizam por toda a arborização do terminal
axonal.
Uma vez que as vibrissas desempenham importante papel na
exploração do ambiente pelo animal (Brecht et al., 1997; Brecht 2007), há
diversas evidências fisiológicas apontando para a existência de conexões
entre os campos de barris dos dois hemisférios (Pidoux et al., 1979; Shuler et
al., 2001, 2002; Ferezou et al., 2007; Petersen, 2007) e que existem circuitos
distintos responsáveis por conduzirem as informações desde as vibrissas até o
córtex de barris (ver Alloway, 2008). Essas características podem justificar a
presença das células calosas em todas as camadas e colunas do PMBSF, já
que a segregação laminar e colunar desses circuitos parece ser mantida pelas
conexões interhemisféricas (Alloway, 2008, ver adiante).
Diferentes autores (Ivy et al., 1979; Olavarria et al., 1984) propuseram
que a localização dos terminais calosos seria complementar à das aferências
talâmicas na camada IV do córtex de barris. Além dos nossos resultados
presentes, diversas evidências sugerem uma revisão desse conceito: em
primeiro lugar, não existe uma segregação tão marcante entre as vias
talâmicas e calosas, já que as colunas de septo também recebem aferências
talâmicas na camada Va (Kim & Ebner, 1999). Em segundo lugar, foi
demonstrado que no córtex visual do gato, algumas células calosas
distribuem arborizações terminais na camada IV, embora menos extensas do
que nas demais camadas (Houzel et al., 1994).
111
5.2.1 – Morfologia dendrítica das células calosas do PMBSF
As informações sensoriais são processadas por redes neuronais
conectadas e são fortemente influenciadas pela geometria das células que as
compõem. Neste estudo, analisamos as características morfométricas das
células calosas em relação à sua organização laminar e colunar.
As células calosas supragranulares reconstruídas apresentaram
arborização dendrítica típica de neurônios piramidais supragranulares: corpo
celular de formato piramidal, 2 a 3 dendritos basais espinhosos com densa
ramificações locais e dendrito apical espinhoso, que se ramifica e atinge a
camada I. Tanto o comprimento dendrítico linear quanto a área de arborização
dendrítica das CC supragranulares foram muito maiores do que nas outras
camadas (comprimento: 2629 + 467, 142 + 6, 217 + 37 μm; área: 4149 + 649,
137 + 23, 646 + 132 μm
2
, supragranular, granular e infragranular,
respectivamente). Entretanto o tamanho do corpo celular foi semelhante entre
elas.
Estudos anteriores demonstraram que neurônios piramidais formando
circuito local nas camadas supragranulares possuem comprimento dendrítico
linear médio maior nas célula localizadas nas colunas de septo (L2 barril =
2375 + 162; L3 barril = 6356 + 1143; L2 septo = 7505 + 1409; L3 septo = 8535
+ 2959 μm) (Brecht & Sakmann, 2002; de Kock et al., 2007). As células calosas
das camadas supragranulares do PMBSF apresentaram comprimento
dendrítico linear menor do que as piramidais de circuito local (2629,0 + 467,1
μm). Morfologicamente, as CC das camadas supragranulares do córtex de
barris formam uma subpopulação peculiar de neurônios piramidais no PMBSF
de rato, com arborização dendrítica exuberante, podendo assim receber mais
112
sinapses das células da camada granular e com isso, integrar a informação
sensorial que chegam na camada IV e retransmitir essas informação para o
hemisfério oposto. Entretanto, ainda há a necessidade de se caracterizar
fisiologicamente essas células.
As células estreladas espinhosas da camada IV recebem aferências
talâmicas e/ou aferências excitatórias e inibitórias quase que exclusivamente
de outros neurônios localizados dentro da mesma coluna cortical. Já as células
piramidais estreladas e as piramidais, em contraste, recebem aferências
excitatórias do tálamo, das outras camadas corticais e até mesmo de barris
vizinhos (Shubert et al., 2003). Essas subpopulações apresentam diferentes
dinâmicas de atividade elétrica em respostas a deflexão de uma vibrissa
(Brecht & Sakmann, 2002). Adicionalmente, estudos demonstraram a
existências de conexões monossinápticas entre as células da camada granular
e células das camadas II/III (Feldmayer et al., 2002; Petersen et al., 2003) bem
como da camada V (Feldmayer & Sakmann, 2000; Feldmeyer et al., 2005).
As CC reconstruídas na camada granular apresentaram dendritos lisos
com menor comprimento linear, resultando em arborizações de área restrita
(142,2 + 6,37 μm). Observamos que as células calosas granulares restringem
sua arborização dendrítica na sua coluna de origem (septo ou barril) e não
houve diferença entre as características morfológicas das arborizações
dendríticas das CC localizadas nos septos e nos barris. Esta configuração mais
restrita já era esperada, já que estudos anteriores indicam que as interações
horizontais são fracas e limitadas dentro da camada IV (ver Petersen &
Sakmann, 2000), e essencialmente formada por uma rede local de neurônios,
principalmente excitatórias, capazes de amplificar o sinal trazido pelas
113
aferências talâmicas antes de retransmiti-lo verticalmente para as demais
camadas da mesma coluna (Stratford et al., 1996; Feldmeyer et al., 1999,
2002).
De modo geral, a camada granular de S1 do rato contém pelo menos
três diferentes morfotipos característicos: neurônios estrelados espinhosos,
neurônios piramidais estrelados e neurônios piramidais (Jones, 1975) que
diferem entre si pela presença ou ausência do dendrito apical e de espinhas, o
formato da arborização dendrítica e suas propriedades fisiológicas, embora as
respostas das células espinhosas estreladas e piramidais estreladas da
camada IV sejam semelhantes (Brecht & Sakmann, 2002; Bannister et al.,
2007). Nossos resultados mostraram que os neurônios calosos da camada IV
se aproximam mais dos neurônios estrelados piramidais em virtude da
morfologia do corpo celular, presença de um dendrito apical curto e ausência
de espinhas dendríticas (ver Staiger et al., 2004), mas também há uma CC
granular com dendrito apical longo, que atingiu as camadas II/III.
Diversos estudos demonstraram que as células piramidais de circuito
local das camadas granulares apresentam arborização dendrítica restrita ou à
coluna de septo ou à coluna de barril (Petersen & Sakmann 2000, 2002; Brecht
et al., 2003). Quando os prolongamentos neuronais conectam dois barris
diferentes, eles o fazem preferencialmente em barris localizados na mesma
fileira. Por exemplo, alguns ramos dendríticos de uma célula no barril C3
podem alcançar o barril C4 (mesma fileira) e raramente alcançará o barril B3 ou
D3 (mesmo arco) (Brecht et al., 2003; Pertersen et al., 2003). Fisiologicamente,
as células das colunas de barris apresentam propriedades de respostas
distintas daquelas das células das colunas de septo (Brecht et al., 2003).
114
As CC das camadas infragranulares apresentaram comprimento
dendrítico linear e área de arborização axonal intermediários entre os valores
encontrados nas camadas supragranulares e camada granular. Localizada
principalmente na região mais superficial da camada V, essas células
possuem forma caracteristicamente piramidal, com dendrito apical que se
ramifica alcança as camadas II/III, porém sua arborização dendrítica é restrita à
coluna cortical de origem (septo ou barril). Uma característica importante das
CC infragranulares é que algumas apresentam espinhas dendríticas e outras
não. As que se localizaram nas colunas de septo apresentam espinhas e as
que se localizam nas colunas de barris, não.
As camadas infragranulares recebem aferências das células
supragranulares (Kim & Ebner., 1999) e fazem projeções para as regiões
subcorticais, como para o núcleo estriado, para a ponte e o tálamo (Wise &
Jones, 1977). No córtex de barris de roedores, a camada V, mais
especificamente a camada Va, é o principal alvo das aferências talâmicas da
via paralemniscal (Kim & Ebner, 1999; Alloway, 2008) além de receberem
conexões monossinápticas da camada IV (Feldmeyer & Sakmann, 2000,
Feldmeyer et al., 2003).
As características morfométricas das CC infragranulares também são
compatíveis com as descritas para as piramidais da camada Va como, por
exemplo, o dendrito apical que atinge as camadas II/III e que se ramifica na
própria camada Va, camada IV e nas camadas II/III. Entretanto, também
encontramos algumas poucas CC que se localizaram em posição laminar
corresponde às camadas Vb e VI. As CC infragranulares foram as únicas a
apresentarem diferenças entre a morfologia dendríticas das localizadas nas
115
colunas de septo (1219,0 + 419,9 μm
2
) e as localizadas nas colunas de barris
(432,6 + 111,0 μm
2
). Como as células das camadas infragranulares fazem
projeções para alvos subcorticais e também para o hemisfério contralateral, as
diferenças na morfologia dendrítica parecem manter as vias lemniscal e
paralemniscal segregadas.
A camada VI é a camada que apresenta a maior diversidade morfológica
e funcional dentre todas as camadas do córtex de barris (Chen et al., 2008) e
suas eferências desempenham importante papel, junto com as da camada V,
formando a principal via de saída na comunicação córtico-talâmica e conexões
córtico-corticais ipsolaterais e interhemisféricas (Zhang & Deschenes, 1997,
1998).
Estudos usando o método de impregnação pela prata para análise das
características da morfologia dendrítica descreveram seis grupos morfológicos
na camada VI: neurônios piramidais com dendritos elaborados, neurônios
piramidais com moderado dendrito apical e dendritos basilares padrão,
neurônios piramidais com dendritos curtos, grandes neurônios não piramidais,
neurônios sem dendrito apical e interneurônios complexos (Chen et al., 2009).
Praticamente a metade dos neurônios da camada VI do córtex de barris
de rato faz projeção para o tálamo somestésico e o restante deles projeta-se
para outras áreas corticais ipsolaterais e contralaterais (Zhang & Deschênes,
1997). A diversidade de morfotipos neuronais nas camadas infragranulares
pode justificar as diferenças morfológicas entre as CC das colunas de barris e
das colunas de septo encontradas no presente trabalho.
Nossos resultados demonstraram que as CC das camadas
infragranulares localizam-se principalmente na porção mais superficial dessas
116
camadas e que as colunas de septos e de barris apresentaram as mais
evidentes diferenças quanto a morfometria dos dendritos, uma vez que as CC
das colunas de septo apresentando maior área de arborização dendrítica e
presença de espinhas dendríticas enquanto que as CC das colunas de barris
possuem menor área de arborização dendríticas e não apresentam espinhas.
Na camada V, os neurônios piramidais podem ser classificados em 5
grandes grupos segundo a sua morfologia dendrítica (Tsiola et al., 2003) ou em
2 grandes grupos segundo as características morfológicas da arborização
axonal (Molnar & Cheung, 2006). É possível que essa diversidade morfológica
se reflita nas conexões calosas e tornem as CC dessa camada distintas
morfologicamente entre as que estão localizadas nas colunas de septos e as
que estão localizadas nas colunas de barris. Isso mantém segregada as
informações conduzidas pelas vias lemniscal e paralemniscal nas projeções do
córtex de barris para outras áreas ipsolaterais e para o hemisfério contralateral.
Atualmente, acredita-se que a informação sensorial conduzida pela via
lemniscal e o processamento cortical na coluna de barril estejam relacionados
principalmente com o aspecto sensorial como forma e textura (o quê?),
enquanto a informação conduzida pela via paralemniscal e o processamento
cortical na coluna de septo estejam mais relacionados com a integração de S1
e o controle motor das vibrissas (onde?) (Bureau et al., 2006; Le Be at al.,
2007; para revisão ver Alloway, 2008). Nossos resultados indicam que as CC
localizadas nas camadas supra e granular possuem características
morfológicas semelhantes (tamanho de corpo celular, comprimento dendrítico,
área de arborização dendrítica) nos septos e nos barris. Essas características
morfológicas podem indicar um ponto de convergência das informações de
117
forma e textura dos objetos tocados pela vibrissas (o que) com a localização
dele (onde).
Entretanto, nas camadas infragranulares, observamos uma tendência do
comprimento linear e na área dos dendritos ser maior para as CC localizadas
nos septos em relação as localizadas nos barris. Embora essa tendência não
seja estatisticamente significativa na nossa amostra, é interessante notar que
foi também para este parâmetro que observamos o maior desvio padrão,
sugerindo uma maior variação no comprimento dendrítico das CC
infragranulares.
Corroborando a tendência notada no comprimento dendrítico,
observamos uma diferença significativa no volume da arborização dendrítica,
que foi maior para as CC infragranulares septais em relação as de barris. Ao
contrário das outras camadas, onde tanto as células septais quanto as das
colunas de barris apresentaram (camadas supragranulares) ou não (camada
granular) espinhas dendríticas, as células das camadas infragranulares das
colunas de septo apresentaram espinhas dendríticas enquanto que as das
colunas de barris, não, tornando essas CC morfologicamente distintas.
Uma vez que a camada IV é o principal alvo das aferências talâmicas da
via lemniscal (núcleo VPM do tálamo), a camada Va é o principal alvo das
aferências talâmicas da via paralemniscal (núcleo Pom do tálamo), e a maioria
das CC encontradas nas camadas infragranulares tem características
(localização e morfologia) de células da subcamada Va, podemos sugerir que
estas também estejam envolvidas em circuitos divergentes, relacionados com
as vias lemniscal e paralemniscal.
118
Com base em nossos resultados, propomos que as CC do PMBSF de
ratos apresentam pelo menos quatro morfotipos neuronais distintos, segundo
seu padrão de arborização dendrítica: uma subpopulação com morfologia
dendrítica mais exuberante, característica das camadas supragranulares; uma
subpopulação neuronal com arborização dendrítica discreta, característica da
camada granular; as CC das camadas infragranulares podem ser subdividias
em dois morfotipos distintos: um morfotipo neuronal com arborização dendrítica
que apresenta espinhas, relacionado com as CC das colunas de septo das
camadas infragranulares e relacionadas com a via paralemniscal e outro
morfotipo neuronal que apresenta área de arborização dendrítica menor, não
possui espinhas, estão localizadas nas colunas de barris das camadas
infragranulares e relacionadas com a via lemniscal.
5.3 – Distribuição e geometria dos axônios calosos no PMBSF do rato
Os axônios calosos que conectam os dois PMBSFs de ratos
apresentaram organização homotópica tanto para os axônios das células
localizadas nas colunas de septo quanto para os axônios das células
localizadas nas colunas de barris, onde um axônio cujo corpo celular encontra-
se na coluna de septo projeta-se para a região de septo do PMBSF
contralateral enquanto o axônio cujo corpo celular encontra-se na coluna de
barril projeta-se para coluna de barril correspondente no PMBSF do hemisfério
contralateral.
Entretanto, a precisão topográfica é maior entre os axônios das CC
localizadas nas colunas de barris onde, por exemplo, se o corpo celular
encontra-se localizado na coluna do barril C3 (seja nas camadas
119
supragranulares, camada granular ou camadas infragranulares) o seu axônio
projeta-se para o barril homólogo do hemisfério contralateral, ou seja, para o
barril C3 do PMBSF do hemisfério contralateral.
Por outro lado, os axônios das CC cujos corpos celulares encontram-se
nas colunas de septo projetam-se para a região de septo do córtex de barris
contralateral que envolve a fileira de barril mais próximo do corpo celular, ou
seja, se o corpo celular encontra-se na região de septo próximo a fileira C de
barris, o axônio caloso dessa célula irá localizar-se na região de septo do que
delimita a fileira C de barris do hemisfério contralateral.
Isto significa que os axônios calosos do PMBSF mantêm segregado o
processamento sensorial entre as vias lemniscal e paralemniscal, uma vez que
uma coluna de barril sempre conecta o barril homólogo contralateral e uma
coluna de septo sempre conecta coluna de septo no PMBSF contralateral.
Sendo assim, as vias de processamento sensorial (o quê) e o controle motor
(onde) ainda estão segregadas quando as informação são transferidas entre os
dois hemisférios. A manutenção da segregação das vias é importante para o
animal movimentar uma fileira de vibrissas na mesma direção durante a
exploração do ambiente, pois a modulação do controle motor é feita pela via
paralemniscal. Uma vez que as colunas de barris conectam colunas de barris
correspondentes no hemisfério contralateral e o mesmo acontece com as
colunas de septo, então as vias se mantém segregadas após a transferências
de informações entre os hemisférios.
Nossos resultados permitem-nos assumir que a organização pontual das
conexões interhemisféricas do PMBSF de ratos conectam regiões corticais
semelhantes e assim podem sincronizar os dois hemisférios e permitir uma
120
representação coerente do ambiente enquanto o faz animal o exploração. No
caso de ratos, isso permite ao animal mover as vibrissas das duas faces de
forma assimétrica, aumentando a precisão da periferia sensorial na busca das
informações do ambiente (ver Brecht, 2007).
No córtex visual de gatos, os terminais axonais calosos também
conectam colunas corticais que processam informações com a mesma
seletividade de orientação de movimento e analisam o mesmo ponto na cena
visual (Rochefort et al., 2009). Esses dados demonstraram, em conjunto com
os resultados do presente estudo, que as conexões interhemisféricas estão
organizadas de modo a conectar regiões corticais dos dois hemisférios que
processam os mesmos aspectos da informação sensorial (Ver Innocenti et al.,
1995; Innocenti 1995, 2009).
Tanto os terminais axonais das CC localizadas na coluna de septo
quanto os terminais axonais das CC localizas nas colunas de barris projetaram-
se radialmente, a partir do corpo celular, em direção à substância branca,
apresentaram poucas ramificações no hemisfério ipsolateral ao corpo celular,
defletiram em direção ao corpo caloso e ascenderam na substância cinzenta do
hemisfério contralateral em região homotópica ao corpo celular. Apresentaram-
se com morfologia discreta, pontual, ramificaram-se na camada IV do
hemisfério contralateral, porém atingiram as camadas supragranulares.
O comprimento linear e a área de arborização axonal foram
semelhantes entre axônios provenientes das colunas do septo e dos barris,
porém os axônios das CC das colunas de septo apresentaram-se mais
complexos, segundo os resultados da análise das dimensões fractais, e com
muito mais botões sinápticos do que os axônios das CC das colunas de barris.
121
As diferenças entre a morfologia dos axônios das CC de coluna de septo
e das CC de colunas de barris pode ser explicado em virtude de existirem mais
células calosas nas regiões de septo que nas regiões de barris e isso se reflete
na maior quantidade de botões sinápticos dos axônios das CC das colunas de
septo. Dividindo-se os botões sinápticos em botões de passagem e botões
terminais, tanto as CC das colunas de septos quanto as CC das colunas de
barris apresentaram muito mais botões de passagem que botões terminais. Já
a maior complexidade dos terminais axonais das CC de coluna de septo pode
ser explicado em razão das regiões de septo possuírem áreas contínuas
(linhas e arcos) tanto no sentido antero-posterior quanto no sentido médio-
lateral o que pode permitir o terminal axonal se espalhar mais.
Entretanto, nossos resultados não nos permitem dividir os axônios
calosos do PMBSF de ratos em duas subpopulações distintas, como as que
ocorrem na representação da pata anterior da cutia. Esse animal apresenta um
tipo de axônio claramente mais curto e com maior densidade de botões
enquanto o outro tipo possui maior comprimento linear e menor densidade de
botões de passagem (Rocha et al., 2007). Essa diferença pode ser resultado
dos hábitos diuturnos distintos entre as duas espécies de animais, além de a
cutia apresentar destreza manual que o rato não possui.
Em outras áreas sensoriais, como por exemplo no córtex visual primário
de ratos, o axônio caloso também é homotópico em relação à posição do corpo
celular, porém a arborização axonal é mais exuberante (Houzel et al., 2002).
No PBMSF, a arborização axonal calosa é homotópica em relação à posição
do corpo celular, porém o terminal axonal é discreto e pontual. Em V1 de gatos,
os axônios calosos ramificam-se intensamente na camada granular e atingem
122
as camadas supragranulares, comportamento semelhante ao que observamos
nos terminais axonais calosos do PMBSF (ver Rochefort et al., 2009).
A organização colunar das conexões calosas no córtex visual de gatos e
macacos se assemelha a aglomerados de terminais axonais que se repetem
regularmente ao longo da borda entre as áreas 17 e 18 (Heimer et al., 1967;
Jones et al., 1979; Houzel et al., 1994). Tanto os corpos celulares quanto os
terminais axonais no córtex visual estão localizados nos domínios ricos em
atividade da citocromo C oxidase (Boyd & Matsubara, 1994; Olavarria & Abel,
1996). Essa periodicidade está correlacionada com o padrão de colunas de
dominância ocular do córtex visual (Olavarria, 2001).
Tal organização colunar está presente no PMBSF de ratos, onde uma
coluna de barril conecta especificamente o barril homólogo no hemisfério
contralateral, e a coluna de septo conecta-se à coluna de septo no hemisfério
oposto, segundo o padrão de bandas dos de marcação de domínios ricos
(barris) e pobres (septo) em citocromo C oxidase, e outras enzimas
metabólicas, no PMBSF de ratos (ver Walace, 1987).
Finalmente, nossos resultados demonstram que há mais diferenças
morfológicas entre as populações de CC na organização laminar, onde as
características morfométricas dos dendritos diferem entre as células calosas
das diferentes camadas, do que na organização colunar, onde somente nas
camadas infragranulares as características morfológicas da arborização
dendríticas das CC difere entre as células localizadas nas colunas de septo e
as células localizadas nas colunas de barris.
Os terminais axonais calosos apresentaram morfologia semelhante
entre os que se encontram nas colunas de septo e os que se encontram nas
123
colunas de barris, sendo que os terminais axonais das colunas de septo
apresentam formas mais complexas e com mais botões sinápticos do que nos
terminais axonais das colunas de barris. Isso nos leva a concluir que o
processamento das vias lemniscal e paralemniscal mantêm-se segregados
mesmo após a transferência da informação sensorial de um hemisfério para o
outro. Essas características se reflete no comportamento do animal,
permitindo um controle motor mais elaborado das vibrissas mistaciais que
podem ser movimentadas de forma assimétrica e independente na busca da
informação sensorial enquanto o animal explora o ambiente.
124
6 – Conclusões
• No córtex de barris de rato, as células calosas estão presentes
nas camadas supragranulares, camada granular e camadas
infragranulares e são mais densamente concentradas nas
camadas supragranulares;
• Na camada granular, existem mais células calosas nos septo que
nos barris;
• As células calosas do PMBSF de rato possuem arborização
dendrítica semelhante a dos neurônios que fazem projeção
ipsolateral;
• Nas camadas infragranulares, a morfologia dendrítica das células
calosas do PMBSF de rato é mais exuberante nas colunas de
septos;
• Os axônios das células calosas do PMBSF de ratos apresentam-
se de forma discreta e pontual e conectam colunas corticais
homotópicas do PMBSF nos dois hemisférios cerebrais;
• Nas colunas de barris as conexões são mais precisas,
conectando barris homotópicos;
• Nas colunas de septos, a integração interhemisférica ocorre ao
longo das fileiras;
• Os axônios calosos das colunas de septos apresentam maior
quantidade de botões sinápticos e maior complexidade
geométrica.
• Existem pelo menos dois “canais” interhemisféricos que mantém
a segregação entre as vias lemniscal (barril) e paralemniscal
(septo).
125
7 - Perspectivas futuras e desdobramentos possíveis
Uma vez determinada a topografia das conexões córtico-corticais
interhemisféricas do PMBSF, assim como a morfologia dos dendritos, dos
axônios as terminações dessas células calosas, poderemos utilizar métodos
imunohistoquímicos para:
• Caracterizar a morfologia dos alvos pós-sinápticos;
• Caracterizar o(s) tipo(s) de neurotransmissor(es) que as células
alvos das conexões calosas utilizam;
Podemos também utilizar modelos de animais acalosos para averiguar
se há a formação dos feixes aberrantes (feixe de Probst e feixe sigmóide),
como ocorre em humanos (Tovar Moll at al., 2007) e comparar a morfometria
fina das células que formam esses feixes com a das células que cruzam
normalmente o corpo caloso.
126
8 – Bibliografia
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9 – Anexos
9.1 – Spatiotemporal distribution of proteoglycans in the developing rat’s barrel
field and the effects of early deafferentation.
9.2 – On the fate of extracellular hemoglobin and heme in brain.
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