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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO - UFRJ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS - ICB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
MORFOLÓGICAS
ANDERSON DELANO SANTOS ARAÚJO
DEGENERAÇÃO GORDUROSA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO
DO MANGUITO ROTATOR DE OVELHAS: UM ESTUDO
EXPERIMENTAL
SALVADOR
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2008
ANDERSON DELANO SANTOS ARAÚJO
DEGENERAÇÃO GORDUROSA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO
DO MANGUITO ROTATOR DE OVELHAS: UM ESTUDO
EXPERIMENTAL.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências Morfológicas do
Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
realizado em parceria com o Instituto de
Ciências da Saúde da UFBA, como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Morfológicas.
Orientador: Prof. Dr. Radovan Borojevic
Co-orientador: Prof. Dr. Gildásio Cerqueira
Daltro
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SALVADOR
2008
Araújo, Anderson Delano Santos
DEGENERAÇÃO GORDUROSA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO DO MANGUITO ROTATOR DE
OVELHAS: UM ESTUDO EXPERIMENTAL/ Anderson Delano Santos Araújo
42 f.; 30 cm; il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciências
Biomédicas e Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde, 2008.
Orientador: Prof. Radovan Borojevic. Co-orientador: Prof. Gildásio Daltro
1. Degeneração gordurosa 2. Músculo esquelético 3. Modelo experimental 4. Manguito
rotador.
TERMO DE APROVAÇÃO
ANDERSON DELANO SANTOS ARAÚJO
DEGENERAÇÃO GORDUROSA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO DO MANGUITO ROTATOR
DE OVELHAS: UM ESTUDO EXPERIMENTAL.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ realizado em parceria
com o Instituto de Ciências da Saúde da UFBA, como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.
Prof. Dr. Maria Isabel Doria Rossi
Professor da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
_______________________________________________
Prof. Dr. Luciana Maria Pedreira Ramalho
Professora da Universidade Federal da Bahia (UFBA)
________________________________________________
Prof. Dr. Vitor Antonio Fortuna
Professor da Universidade Federal da Bahia(UFBA)
__________________________________________________
Prof. Dr. Márcia Cury El-Cheikh
Revisor e Suplente, Universidade Federal do Rio de Janeiro
__________________________________________________
Radovan Borojevic
Orientador, Professor Titular da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
___________________________________________________
Gildásio de Cerqueira Daltro
Co-Orientador, Professor Adjunto da Universidade Federal da Bahia
___________________________________________________
Anderson Delano Santos Araújo
Mestrando
___________________________________________________
Salvador ____ de _____________ de 2008
RESUMO
O presente estudo teve como objetivo avaliar a degeneração muscular do
manguito rotador em ovelhas, visando estabelecer um modelo experimental em
animais de médio porte para o desenvolvimento de pesquisa da manipulação
de células-tronco autólogas, como uma opção de tratamento. Foram utilizadas
ovelhas adultas da raça Santa Inês, fêmeas, de 2 a 4 anos, com 25 a 35 kg,
clinicamente saudáveis. Os Ovinos foram anestesiados e foi realizada a
tenotomia do tendão do músculo infra-espinal. Para que o tendão lesionado
não se recuperasse, um dreno “Penrose” que foi suturado à porção final do
tendão. Foram coletadas biópsias musculares com 21, 35 e 65 dias pós-lesão.
As amostras foram processadas pelo método de rotina histopatológica. Os
procedimentos deste trabalho foram avaliados e aprovados pela Comissão de
Bioética. Nas amostras de 21 dias pós-lesão apresentaram alguns pontos
poucos adipócitos entre os fascículos (perimísio) e poucos adipócitos entres as
fibras musculares (endomísio). Com 35 dias pós-lesão foi observada maior
infiltração de adipócitos no perimísio e no endomísio, do que com 21dias. Nas
amostras de 65 dias pós-lesão foi observada uma acentuada infiltração de
tecido adiposo e havia diminuição do tamanho das fibras musculares e
desarranjo estrutural; e formação de tecido de granulação próximo a região
onde foi colocado o dreno, apresentando infiltrado de células mononucleares,
proliferação de tecido conjuntivo e neovascularização. Este modelo
experimental mostrou-se adequado para o estudo da infiltração gordurosa do
tecido muscular do manguito rotator.
Palavras chave: Degeneração gordurosa, músculo esquelético, modelo
experimental, manguito rotador.
ABSTRACT
This study aimed to evaluate the muscle degeneration of the rotator cuff in
sheep, to establish an experimental model of animal midsize search for the
development of the manipulation of autologous stem-cells, as an option to
treatment. Take used the adult sheep Santa Inez race, female, from 2 to 4
years, with 25 to 35 kg, clinically healthy. The sheep were anesthetized and
was held to tenotomy infraespinal. For the injured tendon is not recover, a drain
"Penrose" that was sutured to the final portion of the collected tendão. Take
used muscle biopsies with 21, 35 and 65 days post-injury. The samples were
processed by means of routine histopathology. The procedures of this work
were reviewed and approved by the Commission on Bioethics. In samples of 21
days post-injury showed some few points between the issues adipocytes
(perimysion) and few adipocytes between the muscle fibers (internal
perimysium). With 35 days post-injury was observed in greater infiltration of
adipocytes perimysion and internal perimysion, than with 21days. In samples of
65 days post-injury was observed a marked infiltration of fat and there was
reduction in the size of muscle fibers and structural breakdown and formation of
granulation tissue near the region where the drain was placed, giving infiltrate of
mononuclear cells, proliferation connective tissue and neovascularization. This
experimental model proved to be suitable for the study of fat infiltration of the
muscle tissue of rotator cuff.
Key words: fatty degeneration, skeletal muscle, experimental model, rotator
cuff.
DEDICATÓRIA
À todos as pessoas que contribuíram para a minha formação,
científica ou pessoal e que sempre acreditaram na palavra de um homem.
AGRADECIMENTO
Á Deus, que sempre guiou a minha vida e sempre mostrou-me isso ao longo da
minha caminhada.
Aos Meus Pais e Minhas Irmãs pelo amor, pela dedicação incansável, pelos
exemplos e por serem o meu combustível.
À Denise, simples assim!
Aos Meus Avós pelos exemplos e pelo amor e à Minha Mamãe Norma pelo
amor incondicional.
Aos Meus familiares (Tios e Primos) pelo apoio de sempre.
Aos Meus Pais, Irmãos e Avós paulistas que me acolheram e sempre me
ofertam um amor verdadeiro. Incondicional.
Ao Meu Professor Radovan Borojevic por ter me acolhido, ajudado, acreditado
em mim e por sempre me ensinar a ser Professor.
Ao Meu Professor Gildásio Daltro pela acolhida e pelos ensinamentos na
Ortopedia do Hospital Universitário Professor Edgard Santos.
À Minha Professora Maria Eugênia pelo carinho, atenção e incentivo.
Ao amigo Paulo Itamar Ferraz Lessa pela amizade e pelo incentivo.
À toda equipe do Laboratório de Histologia da UFRJ e à equipe de Medicina
Veterinária da UFF e em especial à Minha Professora Ana Maria Ferreira.
À equipe da Ortopedia e Traumatologia do HUPES pelos ensinamentos e pela
amizade.
À Minha Amiga Gorete (Laboratório da UFRJ) pelo carinho e atenção de
sempre.
Ao Meu Amigo Bruno Adelmo pela amizade, pelas risadas e pelo apoio na
informática.
À Daniela Heine pelo amor e amizade constantes.
Aos Meus alunos pela confiança e carinho devotados.
Aos Meus Amigos Marcelo Rios e Jaqueline pela amizade e confiança.
Ao Meus Amigos Fábio Luciano e Janice pela amizade e pelo incentivo.
Ao Meu C.R. do Flamengo pelo sorriso que sempre coloca no meu rosto e por
sempre me ensinar, seja nas vitórias, seja nas derrotas.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
E JUSTIFICATIVA
11
2
REVISÃO DE LITERATUR
A
1
4
2.1 DESENVOLVIMENTO DO MÚSCULO ESQUELÉTICO
14
2.2 ESTRUTURA DO MÚSCULO ESQUELÉTICO 16
2.3 CARACTERÍSTICAS DO MÚSCULO ESQUELÉTICO ADULTO 18
2.4 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DA REGENERAÇÃO DO
TECIDO ESQUELÉTICO.
19
2.5 O MANGUITO ROTADOR E A INFILTRAÇÃO ADIPOSA
22
3 OBJETIVOS
25
3.1 OBJETIVO GERAL
25
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 25
4
MATERIAIS E MÉTODOS
2
6
4.1 ANIMAIS 26
4.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO 26
4.2.1 PROCEDIMENTO PRÉ-ANESTÉSICO 26
4.2.2 INDUÇÃO ANESTÉSICA 26
4.3 CIRURGIA 26
4.4 COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL 27
4.5 ANÁLISE HISTOLÓGICA DA BIÓPSIA MUSCULAR 27
4.6 PROTOCOLO PARA A DETECÇÃO DOS CARBOIDRATOS
REATIVOS COMA A LECTINA DA GRIFFONIA SIMPLICIFORA
28
4.7 HISTOMORFOMETRIA
29
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA 29
5
RESULTADOS
30
4.1 ASPECTOS CLÍNICOS E MACROCÓPICOS 30
4.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA 30
5
DISCUSSÃO
32
6
CONCLUSÕES
3
6
ANEXOS
3
7
REFERÊNCIAS
39
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
ATP - Adenosia tri fostato
BS-I - Lectina Griffonia simplicifora
CK - Creatina quinase
CCR2 - Receptor proteína
DM - Dermomiotomo
E - Ectoderma
LP - Placa lateral
MCP-1 - Monocyte chemotactic protein 1
MCK - Creatina quinase muscular
MHC - Miosina de cadeia pesada
MRF - Fator regulatorio miogenico
MyoD - Proteína de regulação da diferenciação muscular
Myf5 - Fator miogenico 5
MT - Miotomo
NC - Notocorda
NT - Tubo neural
NCAM - Moléculas de adesão neuronal
PAS - Ácido periódico reativo de Schiff
SC - Esclerotomo
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A degeneração e ruptura do tendão são causas freqüentes de incapacidade
funcional dolorosa no homem. A forma usual de tratamento consiste na
reparação cirúrgica e re-inserção dos tendões rompidos. Tanto a reparação
espontânea quanto o tratamento conservador com a cicatrização do tendão em
posição retraída freqüentemente levam a uma função não satisfatória devido à
retração músculo-tendinosa, atrofia e infiltração adiposa nos músculos
esqueléticos. O tecido adiposo pode, eventualmente, substituir a maioria das
fibras musculares no fascículo muscular (Goutallier et al, 1994). Após algumas
semanas, as alterações retrácteis se tornam irreversíveis (Matsumoto et al,
2002), representando a principal causa da perda de função permanente,
apesar do sucesso do ponto de vista técnico, no reparo do tendão (Goutallier et
al, 1995). A lesão muscular associada é hoje, considerada como um processo
degenerativo não específico (Tomanek & Cooper, 1972; Baker & Hall-Craggs,
1980; Bjorkenheim, 1989; Josza et al, 1990).
Experimentalmente já foi verificado que a liberação do tendão leva a
profundas alterações estruturais e funcionais no músculo esquelético
(Bjorkenheim, 1989). Os músculos se tornam atróficos, sendo que as fibras de
contração lenta (fibras do tipo I) são mais afetadas que as fibras de contração
rápida (tipo II). O tecido conjuntivo intramuscular aumenta enquanto que o
número de capilares diminui (Josza et al, 1990). O músculo esquelético encurta
e perde parcialmente sua capacidade de criar tensão (Crawford, 1977). Após
um tempo relativamente curto as alterações se tornam irreversíveis (Jozsa et
al, 1990).
Na prática médica são observadas alterações musculares semelhantes
após a lesão por ruptura dos tendões dos músculos do manguito rotador. A
atrofia muscular é freqüentemente pronunciada e parece depender do tamanho
da ruptura e do tempo pós-lesão (Nakagaki et al, 1996; Gerber et al, 2000).
Imagens obtidas por tomografia computadorizada e ressonância magnética
demonstram a progressiva infiltração ou substituição dos músculos do
manguito rotador pelo tecido adiposo, processo denominado de degeneração
adiposa muscular (
Goutallier et al, 1989; Goutallier et al, 1994; Nakagaki et al,
1996; Fuchs et al, 1999). Estas alterações musculares têm uma grande
relevância clínica uma vez que a degeneração adiposa pode predizer a
possibilidade de reparação das rupturas do tendão do manguito rotador
(Thomazeau et al, 1997; Goutallier et al, 1999) e influenciar de forma
substancial o prognóstico da reparação do manguito rotador (Goutallier et al,
1999; Pfirrmann et al, 1999; Gerber et al, 2000) ou da artroplastia total do
ombro (Edwards et al, 2002). A recuperação parcial da lesão pode ocorrer
quando há presença de atrofia muscular (Thomazeau et al, 1997; Gerber et al,
2000). Por outro lado, quando há presença de degeneração adiposa, a lesão
no ombro humano parece ser irreversível (Goutallier et al, 1999; Gerber et al.
2000). Além disso, a degeneração gordurosa muscular pode aumentar após a
reparação mesmo quando se obtém a reparação do tendão para o osso
(Gerber et al, 2000).
A degeneração gordurosa no músculo esquelético é observada em uma
variedade de doenças neuromusculares incluindo a distrofia muscular de
Duchene (Goutallier et al, 1994), miopatia mitocondrial (Goutallier et al, 1995),
miopatia nemalínica (Matsumoto et al, 2002), e esclerose lateral amiotrófica
(Baker e Hall-Craggs, 1980), em lesões tóxicas musculares (Bjorkenheim,
1989), lesão isquêmica (Tomanek e Cooper, 1972) e após denervação (Josza
et al, 1990; Crawford, 1977).
A degeneração gordurosa tem como conseqüência importante a perda da
função muscular e de amplitude de movimento, ocasionando uma mudança
funcional e estrutural nos músculos esqueléticos(Goutallier et al, 1995).
Baseado nestas informações e sabendo-se que a atrofia muscular e o infiltrado
de células de gordura são importantes fatores prognósticos é necessário o
entendimento dos mecanismos celulares e moleculares que disparam e
mantém a degeneração adiposa no músculo esquelético durante a reparação
da lesão tendinosa.
Na última década, as terapias celulares abriram novas perspectivas em
tratamento de doenças degenerativas. O aporte de células progenitoras
mostrou-se capaz de restaurar a estrutura e função dos tecidos atrofiados ou
degenerados, inclusive de músculo esquelético (Decary,1997). No caso da
atrofia e degeneração gordurosa a questão de terapia celular permanece
aberta. O aporte de novas células pode promover a regeneração do músculo,
mas pode também trazer novos progenitores de células adiposas. A
diferenciação adiposa é a via de diferenciação espontânea defaut de células-
tronco mesenquimais, quer fazem parte de maioria dos protocolos de terapias
celulares de tecidos de origem mesodérmica. O aporte desse tipo de
progenitores pode, portanto, tornar-se deletério na terapia de degeneração
associada com hipertrofia de tecido adiposo ectópico.
Com objetivo de esclarecer a possibilidade de uma nova proposta de
terapias para a degeneração gordurosa do músculo, estamos propondo um
estudo da lesão muscular provocada pela ruptura do tendão do músculo infra-
espinhal em ovelhas para futuramente propor protocolos de terapia celular
visando a reversão deste processo de degeneração.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Desenvolvimento do músculo esquelético
Todos os músculos esqueléticos, exceto os músculos da cabeça são
derivados de células precursoras mesodérmicas que se originam nos somitos.
Durante o desenvolvimento embrionário a especificação das células
precursoras mesodérmicas para a linhagem miogênica é regulada por sinais
positivos e negativos originários dos tecidos circunjacentes (FIGURA 1A)
A especificação para a linhagem miogênica requer um aumento da
expressão de MyoD e Myf5, ativadores transcripcionais da família do fator
regulatório miogênico (MRF). Células miogênicas proliferativas positivas para
MyoD e/ou Myf5 são denominadas mioblastos. A partir do momento em que
elas saem do ciclo celular se tornam miócitos terminalmente diferenciadas que
expressam as MRFs tardias, a miogenina e a MRF4 e subseqüentemente os
genes músculo-específicos tais como a miosina de cadeia pesada (MHC) e a
creatina quinase muscular (MCK) (FIGURA 1B).
FIGURA 1A. Sinalização e eventos celulares na formação do músculo
esquelético embrionário. Células mesodérmicas dos somitos localizadas na
porção dorsal do somito (dermomiotomo – DM) recebem sinais dos tecidos
circunjacentes que induzem Wnts, sonic hedgehog (Shh) e Noggin ou inibem
(BMP 4) a expressão de MRFs primárias (Myf 5 e MyoD) e o comprometimento
para a linhagem miogênica. Mioblastos comprometidos migram lateralmente e
formam o miótomo (MT), o qual, eventualmente forma a musculatura
esquelética. Pax 3 promove a miogênese no miótomo lateral. . E, ectoderma;
LP, placa lateral; SC, esclerotomo; NC, notocorda; NT, tubo neural. (Retirado
de Chargé & Rudnicki, 2004).
FIGURA 1B. A expressão de Pax 3 nas células precursoras contribui para a
expansão das células miogênicas. Após a indução de Myf5 e/ou MyoD, as
células mesodérmicas do somito são comprometidas para a linhagem
miogênica (mioblastos). Posteriormente a upregulation de MRFs secundárias
(miogenica e MRF4) induz a diferenciação terminal de mioblastos para
miócitos. Finalmente a fusão de miócitos dá origem a miofibras multinucleadas
(retirado de Chargé & Rudnicki, 2004).
Por fim, os miócitos mononucleados se fundem formando um sincício
multinucleado o qual eventualmente se torna uma fibra muscular madura
contráctil (FIGURA 1B). Durante o desenvolvimento muscular uma
subpopulação de mioblastos não se diferencia permanecendo associada à
superfície das miofibras em desenvolvimento como células musculares
satélites, quiescentes (FIGURA 1B). Após a maturidade sexual o músculo
esquelético se torna um tecido estável caracterizado pela presença de fibras
musculares pós-mitóticas multinucleadas (Revisto por Chargé & Rudnicki,
2004)
2.2 Estrutura do Músculo esquelético
O tecido muscular é constituído por células alongadas, que contem
grande quantidade de filamentos citoplasmáticos de proteínas contráteis
geradoras de forças necessárias para a contração desse tecido utilizando a
energia contida nas moléculas de ATP. A célula muscular tem origem no
mesoderma e sua diferenciação ocorre pela síntese de proteínas filamentosas
concomitante com o alongamento das células. De acordo com as
características morfológicas e funcionais, distinguem-se três tipos de tecido
muscular; o músculo estriado esquelético, o músculo estriado cardíaco e o
músculo liso (Junqueira. 2004).
O músculo esquelético tem sido objeto de estudo em pesquisas nos
variados campos do conhecimento. O tecido muscular é capaz de exercer um
trabalho dinâmico, que permite a movimentação articular e um trabalho estático
que permite a estabilização articular (McComas, 1996). Afecções de diversas
origens podem acometer a musculatura e vem despertando um crescente
interesse por sua organização estrutural e funcional.
O músculo estriado esquelético é formado por feixes de células
cilíndricas muito longas e multinucleadas que apresentam estriações
transversais. Essas células ou fibras têm contração rápida e vigorosa e estão
sujeitas ao controle voluntário. Alguns componentes das células musculares
receberam nomes especiais como: sarcolema (membrana celular),
sarcoplasma (citossol) e o retículo sarcoplásmatico (retículo endoplasmático
liso) (Junqueira, 2004).
No músculo-esquelético os numerosos núcleos se localizam na periferia
das fibras, nas proximidades do sarcolema, fato este que ajuda a distinguir este
do músculo cardíaco, já que ambos possuem estriações transversais, porém no
músculo cardíaco os núcleos são centrais. As fibras musculares estão
organizadas em grupos de feixes envolvidos por uma camada de tecido
conjuntivo chamada epimísio que recobre o músculo inteiro. Do epimísio
partem finos septos de tecido conjuntivo que se dirigem para o interior do
músculo separando os feixes, com estes septos constituindo o perimísio
envolvendo os feixes de fibras. Cada fibra muscular, individualmente, é
envolvida pelo endomísio que é formado pela lâmina basal da fibra muscular,
associada às fibras reticulares. O endomísio apresenta escassa população
celular constituída por algumas células do conjuntivo, principalmente
fibroblastos (Junqueira, 2004). A unidade estrutural contrátil do músculo
esquelético é a fibra muscular esquelética ou miônio, célula cilíndrica - com 1 a
30 cm de comprimento e diâmetro de 10 a 100 µm - em que os vários núcleos
se dispõem em posição subsarcolêmica e com numerosas miofibrilas no
citoplasma (McComas, 1996).
Um segundo tipo celular da linhagem miogênica é a célula satélite,
mononucleada, sem miofibrilas, que se apóia na membrana basal do miônio.
Essas células persistem na fase G0 do ciclo celular, mas, em resposta a
determinados estímulos, podem entrar no ciclo mitótico, proliferar e se fundir ao
miônio. Desse modo, contribuem para o crescimento, reparo e hipertrofia pós-
natal do músculo-esquelético. Quando em mitose, as células satélites
expressam, temporariamente, moléculas específicas como os fatores de
transcrição da família MyoD, as isoformas da cadeia pesada da miosina e a
desmina (proteína de filamento intermediário), tanto in vitro quanto in vivo.
O MyoD é um membro da família de proteínas cuja expressão ectópica
pode induzir células não-miogênicas a se submeterem à diferenciação
miogênica. A família MyoD compreende MyoD, miogenina e Myf-5. Todas
possuem um domínio protéico conservado, o motivo bHLH e podem ativar a
expressão de genes musculares específicos. Cada membro da família pode
regular um estágio diferente do desenvolvimento muscular. Myf-5 e MyoD
parecem agir no estágio inicial da diferenciação dos mioblastos e a miogenina
no estágio mais tardio do mesmo (Koishi et al, 1994; Fuchtbauer et al, 1992).
As células satélites também expressam as moléculas de adesão NCAM
e M-caderina, no estado quiescente. A M-caderina está presente em células
satélites de músculos normais, desnervados ou em regeneração (Kuschel et
al., 1999). Os miônios apresentam no citoplasma miofibrilas cilíndricas de 1 a 2
µm de diâmetro que, freqüentemente, são tão longas quanto à própria célula
muscular. Estas miofibrilas consistem de pequenas unidades contráteis
repetidas, em série – sarcômeros - cada um com comprimento de 2,2 µm, que
conferem à miofibrila esquelética sua aparência estriada (Alberts et al., 2004).
Cada sarcômero é formado por filamentos finos e espessos. Os primeiros são
compostos de actina e proteínas associadas, sendo ligados por uma de suas
extremidades à linha Z, em cada extremidade do sarcômero. As extremidades
livres dos filamentos finos se estendem em direção ao centro do sarcômero,
onde se sobrepõem aos filamentos espessos. Estes, por sua vez, são
formados a partir de isoformas de miosina II específicas de músculo (Alberts et
al., 2004). As proteínas do disco Z estão em troca dinâmica com um pool
citoplasmático – incluindo até mesmo as proteínas previamente caracterizadas
como componentes estruturais estáticos do disco Z, como a -actinina e a
miotilina (LANGE et al., 2006).
2.3 Características do Músculo Esquelético Adulto
As fibras musculares são circundadas individualmente por tecido
conjuntivo e agrupadas em feixes que formam o músculo esquelético. São
altamente vascularizados para prover os nutrientes essenciais para a função
muscular. A fibra muscular madura está em contato com um neurônio motor
único e expressa moléculas características para a contração muscular,
principalmente as isoformas de miosina de cadeia pesada e enzimas
metabólicas. A especificação para as propriedades contráteis do músculo
esquelético é dada tanto pelo neurônio motor quanto a origem do mioblasto
muito embora os mecanismos precisos ainda não estejam clarificados
(Wigmore & Evans, 2002). Os músculos esqueléticos adultos são compostos
por uma mistura de miofibras com diferentes propriedades fisiológicas, desde
um tipo de contração lenta, resistente à fadiga a um tipo de contração rápida,
não resistente à fadiga. A proporção de cada tipo de fibra dentro do músculo
determina sua capacidade contrátil global. Apesar destas diferenças
fisiológicas, o mecanismo básico da contração muscular é semelhante em
todas as miofibras e é o resultado do mecanismo de escorregamento dos
filamentos espessos ricos em miosina sobre os filamentos finos ricos em
actina, após ativação neuronal (Huxley, 2000). A rede de tecido conjuntivo no
músculo esquelético transforma as contrações das miofibras em uma unidade
funcional onde a contração das miofibras é transformada em movimento via as
junções miotendíneas nas extremidades onde as miofibras se ligam ao
esqueleto através dos tendões. Portanto, as propriedades funcionais do
músculo esquelético dependem da manutenção de uma rede complexa de
miofibras, neurônios motores, vasos sanguíneos e matriz extracelular.
2.4 Características morfológicas da regeneração do tecido esquelético.
O músculo esquelético de adulto é um tecido estável com baixo turnover
(Decary et al, 1997; Schmalbruch & Lewis, 2000). Lesões pouco extensas
suscitam somente um baixo turnover muscular. Estima-se que no músculo
esquelético adulto de rato não mais que 1 – 2% das células sejam substituídas
cada semana (Schmalbruch & Lewis, 2000). Entretanto, o músculo esquelético
de mamíferos tem uma capacidade rápida e extensa de resposta frente a uma
lesão grave.
Quando ocorre uma lesão muscular causada por trauma direto (como
uma atividade física extensa e mais especificamente um treino de resistência)
ou por defeitos inatos genéticos, a regeneração muscular é caracterizada por
duas fases: uma fase degenerativa e uma fase regenerativa. O evento inicial da
degeneração muscular é a necrose das células musculares. Este evento é
geralmente iniciado pela ruptura do sarcolema da miofibra resultando em
permeabilidade da miofibra. A ruptura da integridade da miofibra é indicada
pelo aumento dos níveis séricos das proteínas musculares tais como a creatina
quinase - CK que usualmente está restrita ao citosol da miofibra. Em humanos
e em modelos animais, o aumento sérico de CK também é observado em
doenças musculares degenerativas como nas distrofias musculares. A ruptura
da integridade da membrana sarcolemal resulta em aumento do influxo de
cálcio resultando em perda da homeostasia de cálcio e aumento da proteólise
dependente do aumento do influxo deste íon (Belcastro et al, 1997; Alderton &
Steinhardt, 2000). Implica-se as calpaínas, que são proteases ativadas pelo
cálcio, capazes de clivar as proteínas miofibrilares e do citoesqueleto, no
processo inicial de degeneração miofibrilar (Belcastro et al, 1997).
A fase inicial da lesão muscular está geralmente acompanhada pelo
recrutamento de células inflamatórias e miogênicas. Fatores liberados pelo
músculo lesado ativam as células inflamatórias residentes no músculo que
liberam sinais quimiotáticos para a circulação. Granulócitos neutrófilos são as
células que inicialmente invadem o músculo lesado, sendo vistas nas primeiras
6 horas após a lesão. Após 48 horas, os macrófagos se tornam as células
predominantes no infiltrado inflamatório (Tidball, 1995). Além de seu papel na
degradação da área lesada e fagocitose dos debris celulares tem sido
verificado seu importante papel na regulação dos eventos essenciais na
regeneração do músculo esquelético (Lescaudron et al, 1999; Merly et al,
1999). Diferentes subpopulações macrofágicas estão presentes tanto no
músculo lesado quanto no músculo em regeneração de ratos (McLENNAN,
1996). Tanto a proteína MCP-1 e seu receptor CCR2 estão expressas no
músculo esquelético lesado (Summan et al, 2006; Warren et al, 2004). Além
disso, a imunoexpressão de CCR2 foi vista em macrófagos e em células
precursoras musculares miogenina-positivas (Warren et al, 2005). O papel do
eixo MCP-1 – CCR2 na regeneração muscular foi evidenciado utilizando
animais nocautes para CCR2. Os animais nocautes apresentaram defeito na
regeneração muscular com aumento da adipogênese e fibrose intramuscular
(Warren et al, 2004).
A degeneração muscular é seguida de ativação do processo
regenerativo. A reparação e a manutenção do sincício são feitas por um pool
de células miogênicas precursoras, indiferenciadas, denominadas células
satélites que se localizam abaixo da lamina basal que circunda a miofibra.
Durante o desenvolvimento pós-natal, as células satélites se dividem para
formar novos núcleos para as fibras musculares em crescimento (Moss and
Leblond, 1971), antes de se tornarem quiescentes enquanto as miofibras se
tornam maduras (Schultz et al, 1978). Entretanto as células satélites retém sua
capacidade de proliferar e se diferenciar em resposta a necessidades para o
turnover do núcleo e hipertrofia da miofibra (Snow, 1977,1978; Bischoff, 1986;
Schmalbruch & Lewis, 2000).
A ativação e proliferação das células satélites é provavelmente a
responsável pela enorme capacidade e eficiência de regeneração do músculo
esquelético lesado, com geração de grande número de novos miotubos nos
primeiros 3 dias após uma lesão aguda grave (Whalen et al, 1990). A taxa e
grau deste reparo é enorme considerando-se a escassez de células satélites
associadas com cada miofibra implicando em uma rápida ativação e expansão
dos precursores para a restauração da fibra muscular (Zammit et al, 2002).
A ativação das células satélites ou, seja, sua passagem do estado
quiescente para as etapas subseqüentes ao longo da linhagem miogênica
miogênese é controlada por vários fatores de transcrição, principalmente os
fatores regulatórios miogênicos (MRFs), o Myf5,MyoD, miogenina, and MRF4
(revisto por Zammit & Beauchamp, 2001). Os fatores Myf5 and MyoD
determinam a linhagem miogênica (Rudnicki et al, 1993; Tajbakhsh et al, 1996)
enquanto que a miogenina é essencial para a diferenciação muscular (Hasty et
al., 1993). No músculo adulto, o locus do Myf5 está ativo nas células satélites
quiescentes com Myo D aparecendo durante a ativação e a miogenina assim
que se inicia a diferenciação muscular (Fuchtbauer & Westphal, 1992;
Grounds et al, 1992; Yablonka-Reuveni & Rivera, 1994; Cooper et al, 1999;
Beauchamp et al, 2000).
Histologicamente, as fibras neoformadas são reconhecidas em cortes
longitudinais e em fibras isoladas como fibras contendo núcleos centrais
presentes por vezes ao longo de toda a extensão da fibra regenerada, o que
sugere que a fusão celular não ocorre de forma difusa durante a regeneração
mas, de forma focal no sítio da lesão (Blaveri et al, 1999). As fibras
neoformadas são geralmente basofílicas o que reflete a alta taxa de síntese
protéica e expressam formas embrionárias de miosina de cadeia pesada (Hall-
Craggs & Seyan, 1975; Whalen et al, 1990). Quando a fusão miocitária se
completa, as novas miofibras formadas aumentam em tamanho e o núcleo se
move para a periferia da fibra muscular.
2.5 O Manguito Rotador e a Infiltração Adiposa
O manguito rotador consiste de quatro músculos: o subescapular, o
supraespinal, o infraespinal e o redondo menor. Todos eles se originam na
escápula e inserem-se nas tuberosidades da cabeça umeral que possui três
funções essenciais: estabilidade, mobilidade e nutrição da articulação gleno-
umeral. Os músculos do manguito rotador terminam em tendões largos e
achatados, contínuos com a cápsula articular para formar o manguito
músculotendíneo. O músculo subescapular origina-se da porção anterior da
escápula e insere-se na pequena tuberosidade. O supraespinal origina-se na
fossa supra-espinhal, passa sob o acrômio e insere-se no topo da grande
tuberosidade. Já o infraespinal origina-se na fossa infra-espinhal e insere-se na
grande tuberosidade, atrás do músculo supraespinal e o redondo menor
origina-se da porção látero-inferior da escápula e insere-se na porção posterior
da grande tuberosidade (Sobotta, 2000)
A anatomia vascular do manguito rotador constitui um dos fatores
etiológicos do desenvolvimento das lesões do manguito, com o supraespinal
recebendo sua irrigação sanguínea da massa muscular. A chamada “área
crítica de Codman”, localizada próxima à inserção do supraespinal, é o local
onde a patologia degenerativa do manguito se inicia. Esta área é
hipovascularizada, pois se encontra continuamente comprimida entre o acrômio
e a grande tuberosidade. Sabe-se ainda que há mais abundância de vasos
sanguíneos na porção superior do que na porção inferior. A patogênese das
lesões do manguito rotador é muito controversa tendo no trauma, atrito
(degeneração), hipovascularização e impacto subacromial são os fatores mais
frequentemente citados (Sizinio, 2003).
Charles Neer (1972) descreveu as três fases evolutivas da síndrome
compressiva do manguito rotador. Na fase I ocorrem edema e hemorragias
reversíveis e tem relação direta com o uso excessivo do membro superior. A
fase II é marcada por fibrose e tendinite do manguito rotador e ocorrem de
maneira crônica e intermitente. Já na fase III ocorre a ruptura completa do
manguito com alterações ósseas, cistos subcondrais e formação de osteófitos.
A ruptura dos tendões dos músculos do ombro pode ser responsável pela
degeneração muscular e esta é caracterizada pela infiltração de células
gordurosas no tecido muscular, fato este já confirmado por estudos histológicos
(Goutallier et al, 1994). A infiltração gordurosa e a atrofia são consideradas
como sendo conseqüentes do desuso e da degeneração ou denervação do
músculo, sendo que essa última depende da espessura do tendão e do tempo
ocorrido após a lesão, ainda que a degeneração não tenha relação com o
envelhecimento, somente ocorrendo com o músculo lesionado (Ryan et al.
2002). Ocorre um aumento da densidade do tecido conjuntivo intramuscular e
uma diminuição do número de capilares e os músculos encurtados e
parcialmente lesados perdem a capacidade de desenvolver tensão. Após um
período relativamente curto, estas mudanças tornam-se irreversíveis,
ocasionando uma mudança funcional e estrutural nos músculos esqueléticos
(Gerber et al, 2004).
A degeneração do músculo supra-espinal é global, porém geralmente
leve já a do infra-espinal é global e se mais de meio tendão estiver
despedaçado, pode ser muito severa (Goutallier et al, 1994). O subescapular
também pode ser acometido de forma severa, mas envolve somente a parte do
músculo que está com o tendão rompido e o infra-espinal pode estar com
degeneração se existir uma ruptura larga e ântero-superior envolvendo o
supra-espinal e o subescapular (Goutallier et al, 1994; Gerber et al, 2004;
Meyer et al, 2005). A degeneração gordurosa é um importante fator de
prognóstico para as cirurgias do manguito rotador. Esta é progressiva com o
tempo e é acompanhada por uma debilidade da função muscular, embora
diminua após o reparo, sendo um fator que prediz a reparabilidade do tendão e
influencia substancialmente no resultado clínico da intervenção cirúrgica
(Goutallier et al, 1994; Gerber et al, 2004; Meyer et al, 2005).
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Desenvolver e caracterizar um modelo de lesão muscular em ovelhas pela
ruptura do tendão do músculo infra-espinal que se assemelhe à lesão do
manguito rotator.
3.2 Específicos
3.2.1. Descrever as alterações degenerativas e reparadoras no músculo infra-
espinhal após 21, 35 e 60 dias da ruptura do tendão provocada
experimentalmente.
3.2.2. Quantificar, através de estudo morfométrico, a densidade volumétrica da
infiltração / degeneração gordurosa no músculo infra-espinhal após 35 e 60
dias da ruptura do tendão provocada experimentalmente.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as
recomendações éticas e legais especificadas para a experimentação animal do
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (1991).
Vários estudos experimentais tem demonstrado que os ombros das ovelhas
são modelos adequados para o estudo de desordens do manguito rotador em
humanos. Com base nessas informações foram selecionadas oito ovelhas
fêmeas, jovens, com idade entre 18 e 24 meses e com pesos entre 20 e 30 kg.
4.2 Procedimento cirúrgico
4.2.1 Procedimento pré-anestésico
Foram administrados, por via intravenosa, 0,1 mg/kg de Maleato de
Acepromazina 0,2% (Acepromazina, Syntec) e 0,2 mg/kg de Midazolam
(Induson, Cellofarm Farmacêutica). Além disso, foi administrado 0,4 mg/kg de
morfina, injetada via intramuscular.
4.2.2 Indução anestésica
Para a indução anestésica foram injetados por via intravenosa, 5 mg/kg
de Cloridrato de Cetamina 10% (Cetamin, Syntec) e 0,1 mg/kg de Midazolam
(Induson, Cellofarm Farmacêutica). Para manutenção da narcose anestésica
foi administrado por via inalatória Isoflurano (Isoforine, Cristália).
4.3 Cirurgia
Todos os procedimentos foram realizados em campo cirúrgico estéril, no
Hospital Veterinário da Universidade Federal Fluminense, segundo a técnica
descrita por Gerber e colaboradores (2004). Foi realizada uma incisão
cirúrgica curva, de 15 cm, na região posterolateral da articulação do ombro
direito. A incisão foi aprofundada e a origem acromial do músculo deltóide foi
identificada. O músculo foi elevado na sua porção cranial para a exposição da
inserção tendinosa do músculo infra-espinhal e sua inserção na porção
proximal do úmero. O tendão infra-espinhoso foi liberado de sua inserção da
unidade músculotendínea, na porção proximal do úmero, de forma a mimetizar
uma lesão crônica do manguito rotador. O ombro contralateral serviu como
controle. Relatos prévios mostraram que os tendões do infraespinal das
ovelhas se reparam espontaneamente após uma tenotomia. Para impedir esse
reparo espontâneo, a extremidade do tendão foi coberta com um tubo de
silicone de 5 cm (tubo de dreno de silicone com diâmetro de 12 milímetros,
instrumento médico da Fortuna, Taipei, Formosa) que foi fechada com sutura
na extremidade distal, técnica descrita por Gerber e colaboradores (2004).
4.4 Coleta e processamento do material
Foi realizada a dissecação e biopsias dos músculos infraespinhais, nos
tempos pós-cirúrgicos de 21, 35 e 60 dias, com cerca de 0,5 cm por 0,5 cm,
sendo fixadas imediatamente após a retirada cirúrgica em formaldeído 10%
tamponado. O material foi posteriormente submetido à técnica de rotina para
inclusão em parafina. Resumidamente, os fragmentos foram submetidos à
desidratação em soluções crescentes de álcool etílico, clarificados em xileno e
embebidos em parafina. Cortes de 3 µm de espessura foram obtidos em
micrótomo rotatório e corados com hematoxilina-eosina (técnica histológica
para estudo topográfico), tricrômico de Masson, PAS (ácido periódico-reativo
de Schiff) e Picro-Sirius para colágeno.
4.5 Análise histológica da biópsia muscular:
A organização geral de tecidos foi avaliada assim como as alterações
distróficas (degeneração / regeneração) existentes no tecido. Foi utilizada uma
escala histológica de 4 pontos, modificada de Hack e colaboradores (1999),
considerando-se o percentual da secção histológica apresentando os seguintes
parâmetros: fibrose, infiltração adiposa e degeneração e inflamação.
0 – nenhuma alteração;
1 – 5 -10% da superfície apresentando lesão;
2 - >10–25% da superfície apresentando lesão;
3 - > 25% - 50% da superfície apresentando lesão;
4 - > 50% da superfície apresentando lesão.
4.6 Protocolo para a detecção dos carboidratos reativos coma a lectina da
Griffonia simplicifora
A lectina Griffonia simplicifora (BS-I) se liga especificamente a resíduos
galactosil, cora o endotélio vascular de várias espécies animais inclusive o de
rato (Alroy et al, 1987). Portanto, utilizamos a lectina Griffonia simplicifora
biotinilada (B-1105, Vector Laboratories, USA) para a detecção do endotélio,
sendo utilizada para a quantificação dos capilares.
Em resumo, os cortes histológicos foram desparafinados e hidratados,
seguindo-se então a inibição da peroxidase endógena em solução de H
2
O
2
a
3% em metanol por 15 minutos, lavagem em tampão fosfato salina (PBS) pH
7,4 após o bloqueio das ligações inespecíficas com solução de PBS-BSA 5%.
Os cortes histológicos foram então incubados com a lectina biotinilada na
diluição de 1: 100, em solução tampão contendo sais de metais (Kiernan,
1990), por 16 horas, na geladeira, em câmara úmida. Posteriormente, as
lâminas foram submetidas a lavagens com solução de PBS e incubadas com a
estreptavidina conjugada à peroxidase (Sigma, USA) na diluição de 1:50, em
PBS. Para a visualização da peroxidase foi utilizado o substrato cromógeno
DAB (Liquid DAB, DAKOCYTOMATON), seguindo-se lavagens com PBS e
água destilada, e contracoloração pela hematoxilina.
4.7 Histomorfometria
O estudo morfométrico foi realizado através de um sistema de captura
de imagens, constituído de câmara fotográfica digital EVOLUTION (Media
Cybernetics, USA) acoplada a microscópio de luz E 500 NIKON (Japan) e a um
computador contendo o programa de análise de imagens MAGEPRO–PLUS
5.0 (Media Cybernetics, USA). Imagens digitalizadas de alta qualidade (2048 x
1536 pixels buffer) obtidas das lâminas coradas pela HE e Griffonia simplicifora
utilizando a lente objetiva de 20x foram utilizadas para a quantificação da
densidade capilar (número de secções transversais de capilares / µm
2
).
4.8. Análise estatística
Todos os dados foram submetidos a análise estatística com auxílio do
programa Microsoft Excel® e SigmaStat®.
Os resultados da análise histomorfométrica dos grupos foram expressos
sob a forma de média ± desvio padrão. Na comparação de mais que duas
médias em uma única variável categórica independente (fator), aplicou-se o
teste de Análise de Variância (ANOVA) e o pós-teste Student-Newman-Keuls.
Um p<0,05 foi considerado como significativo.
5. RESULTADOS
5.1 Aspectos clínicos e macroscópicos
Os animais apresentaram–se após o procedimento cirúrgico
aparentemente bem, levantando-se imediatamente e andando. Nas
observações realizadas 21, 35 e 60 dias pós-lesão os animais apenas
apresentaram no galope uma claudicação leve, com redução da fase de apoio
na marcha, embora as patas dianteiras dos ovinos sejam de utilização para
propulsão.
No procedimento da biópsia aos 60 dias, foi feita uma incisão também
no local onde foi realizada a incisão do tendão. Foi observado que
macroscopicamente o tendão parecia ter se regenerado, apresentando aspecto
semelhante ao tendão original, apesar da presença de um tubo protetor que foi
envolvido pelo tecido conjuntivo.
5.2 Análise Histopatológica
O músculo infra-espinhal dos animais com 21 dias de lesão exibiu uma
organização relativamente pouco distorcida, com feixes musculares paralelos.
Algumas fibras estavam degeneradas (Escore=2, Anexo A), células em
regeneração caracterizadas pela presença de núcleos centrais enfileirados
(Escore=1, Anexo A) e processo inflamatório do tipo mononuclear com raros
granulócitos polimorfonucleares (Escore 3, Anexo A). Notava-se presença de
muito raras e pequenas células adiposas em meio às fibras musculares
fasciculares (Escore=1, Anexo A) e em maior numero no espaço interfascicular
(Escore=1, Anexo A). Todos os adipócitos, incluindo os menores no início da
diferenciação, eram tipicamente uniloculares. Nos espaços interfasciculares os
focos nascentes eram associados aos vasos sanguíneos de pequeno e médio
calibre, com rico tecido adventicial. Os pequenos adipócitos eram
freqüentemente próximos ao lado abluminal dos vasos. Com diferenciação
plena e aumento do volume do lóculo gorduroso, formavam-se cachos
preenchendo os espaços interfasciculares adjacentes. O infiltrado inflamatório
não era mais pronunciado nos focos interfasciculares de adipogênese, sendo
freqüentemente mais intenso nas interfaces interfasciculares ao longo dos
perimísios.
Após 35 dias de lesão notou-se a presença ainda de algumas células
degeneradas (Escore=2, Anexo A), raras células em regeneração (Escore=0,
menos de 5% da superfície examinada, Anexo A) e inflamação constituída por
células mononucleares presentes tanto em regiões inter- quanto
intrafasciculares (Escore=2, Anexo A). Infiltração gordurosa também foi vista
nas duas regiões, sendo mais abundantes em região interfascicular (Escore=2,
Anexo A). Ela se tornou dissecante, separando totalmente os feixes
musculares pela infiltração contínua ao longo dos perimísios.
Progressivamente, grupos de adipócitos invadiam também os feixes
musculares, separando os grupos cada vez menores. Deposição de fibras
colágenas foi vista em torno de células adiposas em áreas interfasciculares
(Escore=1, Anexo A) e entre fibras musculares (Escore=1, Anexo A; Figuras 1,
Anexo B).
Após 60 dias verificamos raras células degeneradas (Escore=1),
diminuição da inflamação em relação ao ponto 21 e 35 (Escore=1) e aumento
da infiltração gordurosa, tanto entre as fibras musculares, dentro do fascículo
muscular (Escore=2), quanto nas regiões interfasciculares (Escore=2). Fibras
colágenas também se mostraram mais abundantes dentro dos fascículos
musculares, em menor quantidade em regiões interfasciculares (Anexo B,
figuras 1-8).
6. DISCUSSÃO
Este estudo foi feito com objetivo de caracterizar descritivamente, do
ponto de vista histológico, as mudanças estruturais que ocorrem no músculo
esquelético após a desinserção da unidade músculo-tendínea do manguito
rotador de ovelhas. Nesta situação cria-se a inatividade do manguito rotador. O
protocolo cirúrgico utilizado para a desinserção do manguito rotador das
ovelhas foi o de Gerber e colaboradores (2004). A vantagem deste protocolo,
onde o tendão liberado é colocado e fixado dentro de um tubo de silicone, é a
criação de um modelo de lesão onde há o aparecimento de alterações no
músculo esquelético, devido a inatividade muscular, como a degeneração
adiposa e a atrofia muscular (Eccles, 1948; Björkenheim, 1989; Josza et al
1990), sem evidências de reparação muscular espontânea (Gerber et al, 2004).
Foi verificado que, a ruptura tendínea induzida, do músculo supraespinal de
coelhos seguida da inserção de uma membrana de polivinilidina (Durapore 7
SVLP, Millipore), para prevenir a reinserção espontânea, de forma semelhante
ao do tubo de silicone, ocasionou uma atrofia muscular, infiltração adiposa e
retardo da regeneração muscular (Matsumoto et al, 2002). Em humanos, o
retardo do tratamento cirúrgico também agrava as lesões no músculo, tanto a
infiltração adiposa quanto a atrofia muscular, sendo que após o reparo cirúrgico
com a re-inserção do tendão não levou a melhora do quadro nem reversão das
lesões (Nakagaki et al, 1996; Matsumoto et al, 2002; Gladstone et al, 2007),
aspecto também visto em coelhos (Rubino et al, 2007).
É bem conhecido que a desinserção do tendão leva a retração músculo-
tendínea provocando mudanças estruturais e arquiteturais profundas no
músculo esquelético (Hans et al, 2003; Meyer et al, 2004). O músculo sofre
atrofia sendo que as fibras lentas do tipo I são mais afetadas que as rápidas do
tipo II (Josza et al, 1990) e perda do volume muscular (Matsumoto et al, 2002;
Gerber et al, 2004; Meyer et al, 2004). Ocorre um encurtamento da fibra
muscular provavelmente devido a diminuição dos sarcômeros (Baker & Hall-
Craggs, 1978) e infiltração adiposa substancial nos espaços criados pela
modificação arquitetural muscular, porém sem evidências de um processo
degenerativo da unidade músculo-tendínea (Meyer et al, 2004). O tecido
adiposo e também o tecido fibroso invadem o músculo. Alguns autores
consideram que este processo visa preencher o espaço criado pela atrofia
muscular (Uhthoff et al, 2003). Há tanto uma infiltração adiposa intrafascicular
quanto extrafascicular (Matsumoto et al, 2002; Gerber et al, 2004), muito
embora o mecanismo que inicia o processo da infiltração adiposa ainda não
seja esclarecido. A implantação de estruturas tubulares, independente do tipo
de material, dentro do tecido muscular, provoca o aparecimento de lipoblastos
no tecido de granulação formado (Xaymardan et al, 2002).
No presente estudo, não pudemos realizar um estudo morfométrico
comparativo no sentido de inferirmos uma diminuição da área das fibras
musculares (atrofia) e/ou aumento da área de tecido adiposo. Por esta razão foi
realizado um estudo semi-quantitativo com a utilização de escores para
determinados parâmetros morfológicos. Diversos estudos em patologia
muscular tem utilizado este tipo de análise semi-quantitativa (Hack et al, 1999;
Fanin et al, 2007). Verificamos que tanto após 35 dias quanto 60 dias da
realização da desinserção tendínea há mínima evidencia de um processo
regenerativo dentro do músculo, o que corrobora o modelo proposto por Gerber
e colaboradores (2004). Além disso, pudemos evidenciar tanto o acúmulo de
tecido adiposo intrafascicular e interfascicular assim como aumento do tecido
conjuntivo extrafascicular e intrafascicular semelhante ao já descrito em
coelhos e em ovelhas (Björkenheim et al, 1989; Gerber et al, 2004; Meyer et al,
2004; Rubino et al, 2007; Coleman et al, 2008). Além disso, pudemos verificar
que o processo angiogênico já se encontra em fase de remodelamento, tendo
sido possível demonstrar a diminuição do número de capilares no tempo 60
dias. O uso da lectina GS permitiu evidenciar a célula endotelial, permitindo
desta forma, aferir o número de capilares existentes no músculo.
Gerber e colaboradores (2004) detectaram em exames de ressonância
magnética (RNM) que nem todas as partes do supra-espinal sofrem o mesmo
grau de atrofia. Nas atrofias conseqüentes a lesões nervosas, o infiltrado de
tecido gorduroso ocorre nas áreas desnervadas e nas atrofias por lesões
completas do tendão, o acúmulo de tecido adiposo é mais homogênea. A parte
mais superficial do músculo que se origina da fáscia reage diferentemente à
lesão e à retração do tendão do que a parte profunda que se origina da
escapula. A parte mais próxima à fáscia contribui mais para a atrofia muscular
do que a parte próxima à inserção muscular que por sua vez sofre mais com o
infiltrado de tecido gorduroso.
A origem dos adipócitos presentes no músculo em regeneração ainda
não é conhecida. Há evidências de que elas possam ser derivadas de células
precursoras mesenquimais presentes no tecido muscular. No tecido adiposo
subcutâneo, células estromais vasculares do tecido muscular podem ser a
fonte dos pré-adipócitos, que geram novos adipócitos. O processo semelhante
pode ocorrer na degeneração gordurosa intramuscular (Hausman &
Eichardson, 1998; Hausman & Poulos, 2005).
Sabe-se atualmente que os pericitos perivasculares têm características
pluripotenciais e estão presentes em todos os tecido adultos inclusive no tecido
muscular (Diaz-Flores et al, 1991; 1992; Brighton et al, 1992; Doherty et al,
1998; Shi & Gronthos, 2003; Brachvogel et al, 2005; Meirelles et al, 2007). Seu
potencial adipogênico, em cultura, já foi demonstrado (Farrington-Rock et al,
2004). Outra possibilidade para a origem dos adipócitos na lesão é a partir da
célula satélite muscular. Ela é uma célula multipotencial, capaz de exibir
diferenciação miogênica, osteogênica e adipogênica (Asakura et al, 2001) e
que, as condições de hiperóxia, também pode ser induzida em linhagem
adipogênica (Csete et al, 2001). Finalmente, o infiltrado inflamatório
mononuclear pode conter os progenitores pluripotentes de origem medular, que
são mobilizados da medula óssea para os tecidos em processo de inflamação
e regeneração, assim como monócitos que podem conter uma subpopulação
com características de progenitores pluripotentes (Zhao et al. 2003).
As vias de indução ectópica da diferenciação adipocítica no músculo em
degeneração não são conhecidas. A sinalização via MCP1 e seu receptor
CCR2 está expressa no músculo esquelético lesado (Summan et al, 2006;
Warren et al, 2004). A mesma via é responsável da mobilização de macrófagos
em tecido adiposo na síndrome metabólica e diabete (Kanda et al, 2006). A
mobilização de macrófagos e o intenso infiltrado mononuclear no interior de
feixes musculares representam aparentemente uma resposta à mesma
sinalização, que simultaneamente atrai e ativa a linhagem mono-macrofágica.
Em conseqüência da ativação, os macrófagos secretam grande quantidade de
TNFα cujo alvo, entre outros, é a via de sinalização do PPARγ
Este gene é o
gene-master de diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos, e a sua
ativação pode ser suficiente para converter os progenitores mesenquimais
perivasculares em adipócitos. Semelhante ao tecido adiposo em diabete, os
adipócitos ectópicos podem por sua vez ativar a mesma sinalização, gerando
um circulo auto-sustentado de hipertrofia adiposa. Este quadro se reflete na
dificuldade de reversão da atrofia muscular gordurosa, mesmo depois do
restabelecimento da ligação teno-muscular e solução da sua causa inicial.
As hipóteses citadas devem ser verificadas em estudos futuros, assim
como a viabilidade da proposta de uma terapia celular, que poderia, por vias
parácrinas, reverter o quadro de hipertrofia de adipócitos. Alternativamente, o
aporte de novos progenitores mesenquimais poderá aumentar a diferenciação
de novos adipócitos, e este perigo deve ser adequadamente avaliado.
7. CONCLUSÕES
O modelo de lesão muscular em ovelhas pela ruptura do tendão do
músculo infra-espinal que se assemelhe à lesão do manguito rotator se
mostrou representativo das lesões degenerativas e atrofia gordurosa de
músculo em humanos.
A infiltração progressiva de adipócitos envolveu seqüencialmente
perimísio e endomísio, com evidências morfológicas de atrofia das fibras
musculares em estágios avançado.
O início de diferenciação adipocítica envolveu as regiões perivasculares,
sugerindo a origem de novos adipócitos a partir de pericitos perivasculares.
Os achados sugerem cautela em propostas de terapia celular que
contemple a introdução de células mesenquimais nas regiões em degeneração
gordurosa, pois elas podem exacerbar a proliferação e diferenciação de
progenitores adipocíticos in situ.
FIGURA 1A. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo
feixes musculares separados por células adiposas (seta) e infiltrado
inflamatório ( ponta de seta ). Coloração: HE. Aumento original: 100X
FIGURA 1B. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo
espaço interfascicular com infiltração adiposa (seta). Em meio ao
fascículo muscular, fibras musculares em degeneração circundadas
por infiltrado inflamatório (ponta de seta). Coloração: HE. Aumento
original: 200X.
FIGURA 1C. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo
detalhe do infiltrado inflamatório em meio as fibras musculares
esqueléticas (seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X
FIGURA 1D. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares corados intensamente pelo PAS. Nota-se entre
fibras musculares presença de células adiposas (seta). Aumento
original: 100X
FIGURA 2A. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares separados por tecido adiposo ( ∗ ). Coloração:
HE. Aumento original: 100X
FIGURA 2B. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares separados por tecido adiposo e raros adipócitos
presentes em meio ao fascículo muscular. Coloração: HE. Aumento
original: 200X.
FIGURA 2C. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares em corte transversal, tendo em área, em torno
de célula em degeneração, infiltrado inflamatório mononuclear (seta).
Coloração: HE. Aumento original: 400X.
FIGURA 2D. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares em corte longitudinal. Nota-se em uma fibra
muscular núcleos enfileirados, centrais, indicativo de célula em
regeneração (seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X
FIGURA 3A. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares separados por tecido adiposo ( ∗
∗∗
∗ ) e fibras
musculares heterogêneas em relação ao conteúdo de glicogênio (
seta ). PAS. Aumento original: 100X
FIGURA 3B. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares separados por tecido adiposo e fibras
musculares com ausência quase total de glicogênio (seta). PAS.
Aumento original: 100X.
FIGURA 3C. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares em corte longitudinal exibindo traves fibrosas
entre os fascículos musculares (seta). Picro-Sirius. Aumento original:
100X.
FIGURA 3D. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares em corte longitudinal. Traves fibrosas
interfasciculares e mínima deposição de colágeno intrafascicular
demonstradas pelo Picro-Sirius. Aumento original: 200X
FIGURA 4A. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares separados por tecido adiposo ( ∗ ). Coloração:
HE. Aumento original: 100X
FIGURA 4B. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares separados por tecido adiposo e adipócitos
presentes em meio ao fascículo muscular. Coloração: HE. Aumento
original: 200X.
FIGURA 4C. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares em corte transversal, tendo em área, em torno
de célula em degeneração, infiltrado inflamatório mononuclear (seta).
Coloração: HE. Aumento original: 400X.
FIGURA 4D. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares em corte longitudinal com alguns adipócitos
intrafasciculares ( ∗ ). Nota-se em uma fibra muscular núcleos
enfileirados, centrais, indicativo de célula em regeneração (seta).
Coloração: HE. Aumento original: 400X
FIGURA 5A. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares separados por tecido adiposo ( ∗
∗∗
∗ ) e fibras
musculares com ausência quase completa do conteúdo de glicogênio
(seta). Coloração: PAS. Aumento original: 100X
FIGURA 5B. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares separados por tecido adiposo e fibras
musculares com ausência total de glicogênio (seta). Coloração: PAS.
Aumento original: 200X.
FIGURA 5C. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares em corte longitudinal exibindo intensa
degeneração adiposa e traves fibrosas entre os fascículos musculares
(seta). Coloração: Picro-Sirius. Aumento original: 100X.
FIGURA 5D. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículos musculares em corte longitudinal. Traves fibrosas
interfasciculares e mínima deposição de colágeno intrafascicular
demonstradas pelo Picro-Sirius. Aumento original: 200X
FIGURA 6A. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo
vasos capilares corados pela Griffonia simplicifora isolectina I
(GS-I) biotinilada e revelada pela estreptavidina-peroxidase,
utilizando a diaminobenzidina como substrato cromógeno.
Contracoloração: hematoxilina. Aumento original: 100X.
FIGURA 6B. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo a
reatividade da lectina (GS-I) em vasos. Reação histoquímica para
lectina. Contracoloração: hematoxilina Aumento original: 100X.
10
20
30
*
***
*
***
mero de Vasos
FIGURA 6C. Representação gráfica da densidade capilar no músculo
esquelético de ovelhas após a desinserção do tendão do músculo
infraespinhal. Houve diferença significativa da densidade vascular no
músculo infraespinhal animais.
Dados representados pela média e desvio padrão da densidade capilar após 35 e 60
dias da lesão.
∗∗∗ ; ∗ : grupos diferentes entre si, com significância estatística (p<0,05).
FIGURA 7A. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo
fascículo muscular tendo no espaço interfascicular algumas células
adiposas, algumas delas em íntimo contacto com a parede da vênula
(seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X.
FIGURA 7B. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo o
mesmo aspecto anterior. Coloração: HE. Aumento original: 400X.
FIGURA 7C. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo
infiltração adiposa em espaço interfascicular. Notar a parede venular
em contato com adipócitos (seta). Coloração: HE. Aumento original:
400X.
FIGURA 7D. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo
espaço inerfascicular com infiltração adiposa e células inflamatórias
(seta). Coloração: HE. Aumento original: 200X
FIGURA 8A. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia de corte
histológica de músculo infra-espinhal lesado corado pela técnica
imunohistoquímica para a detecção da isoforma alfa de músculo liso
revelada pela técnica da avidina-biotina-peroxidase. A cor marrom da
diaminobenzidina identifica a actina alfa de músculo liso existente em
pericitos, em torno de capilares (seta). Notar a íntima relação da
parede capilar com o adipócito. Aumento original: 400X.
FIGURA 8B e 8C. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia de
músculo infra-espinhal lesado corado pela técnica imunohistoquímica
para a detecção da isoforma alfa de músculo liso revelada pela
técnica da avidina-biotina-peroxidase. A cor marrom da
diaminobenzidina identifica a actina alfa de músculo liso existente em
pericitos, em torno de capilares (seta). Células adiposas presentes
em íntima relação com a parede de capilares e/ou vasos de pequeno
calibre. Aumento original: 400X.
FIGURA 8D. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia de tecido
muscular lesado corado para a detecção da isoforma alfa de músculo
liso e revelada pela técnica da avidina-biotina-peroxidase.
Reatividade para pericitos e camada muscular de vasos evidente no
espaço interfascicular (seta). Células adiposas presentes em íntima
relação com a parede de capilares e/ou vasos de pequeno calibre.
Aumento original: 200X.
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