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Centro de Ciências Biológicas
Departamento de Microbiologia
Programa de Pós-graduação em Microbiologia
Luciana Ruano de Oliveira
Análise da expressão dos genes nodC e nodG de
Rhizobium tropici sob indução com flavonóides pela
técnica de PCR quantitativo
Londrina
2009
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ii
Luciana Ruano de Oliveira
Análise da expressão dos genes nodC e nodG de
Rhizobium tropici sob indução com flavonóides pela
técnica de PCR quantitativo
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Microbiologia da Universidade
Estadual de Londrina como parte
dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Microbiologia.
Orientadora: Profª Drª Mariangela
Hungria
Co-orientadora: Drª Francismar
Corrêa Marcelino
Londrina
2009
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iii
Luciana Ruano de Oliveira
Análise da expressão dos genes
nodC e
nodG
de
Rhizobium tropici sob indução com flavonóides pela
técnica de PCR quantitativo
Dissertação apresentada ao Curso
de Pós-Graduação em Microbiologia
da Universidade Estadual de
Londrina como parte dos requisitos
para a obtenção do título de Mestre
em Microbiologia.
Comissão Examinadora
Profª Drª Mariangela Hungria da Cunha
Orientadora – Embrapa Soja/UEL
Drª Francismar Corrêa Marcelino
Embrapa Soja
Drª Elisete Pains Rodrigues
Embrapa Soja
Londrina, 29 de junho de 2009
iv
Aos meus pais
Aos meus irmãos
Aos meus sobrinhos
Ao meu amor, Yudi
com amor
DEDICO
v
“ Todo o bem que eu puder fazer,
toda a ternura que eu puder demonstrar a qualquer ser humano,
que eu os faça agora, que não os adie ou esqueça, pois não passarei duas vezes
pelo mesmo caminho.”
(
James Greene)
vi
Agradecimentos
Nada na vida conquistamos sozinhos. Sempre precisamos de outras
pessoas para alcançar os nossos objetivos e muitas vezes, um simples gesto
pode mudar a nossa vida e contribuir para o nosso sucesso.
De uma maneira geral gostaria de agradecer a todas as pessoas que
de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho. Acredito que
qualquer trabalho científico só se realiza com a dedicação de um grupo de
pessoas, e este não foi diferente.
À Deus por ter me concedido a vida, a oportunidade de estudar e a
força para vencer todos os obstáculos.
Agradeço de coração a todos os meus familiares, em especial meus
queridos pais José Adelino e Maria Aparecida, meus queridos irmãos José
Adelino, Silvia (minha irmã gêmea) e Marilice, minha cunhada Juliana e meus
lindos sobrinhos Isabela e Diogo. Obrigada por compreenderem todos os
momentos de ausência e por todo o apoio que sempre me deram.
Meus queridos pais eu gostaria de agradecer de uma maneira especial
pelo exemplo de vida que sempre me deram, me mostrando que mesmo com
todo o sofrimento que passaram nesta vida continuaram lutando e enfrentando
todas as dificuldades com esforço, muito esforço, trabalho, paciência,
dedicação, fé, coragem, amor, não desistindo nunca quando os obstáculos
surgiam. Que desde sempre incutiram-me os valores, princípios éticos e morais
dos quais jamais me afastei. Pela motivação, compreensão e força, com que
sempre me acompanharam. Por sempre acreditarem e me fazerem acreditar
que sou capaz. Pelo amor incondicional. Vocês são tudo na minha vida. Meu
amor e eterno agradecimento.
Com um carinho muito especial eu agradeço ao meu namorado Yudi,
pelo apoio, carinho, amor, amizade, paciência, dedicação. Obrigado por me
ouvir nos meus desabafos, compreender os momentos de ausência e pelas
palavras de incentivo, sempre.
À minha orientadora, Drª Mariangela Hungria, pela oportunidade.
Mesmo sem me conhecer, ter me aceitado orientar; pela confiança e
profissionalismo demonstrados. Por não medir esforços para ajudar seus
alunos, mesmo na correria do seu dia a dia.
vii
À Drª Francismar Corrêa Marcelino, pela co-orientação neste trabalho,
tendo paciência em dirimir minhas dúvidas; pela amizade, além de orientadora.
Ao Drº Marco Antônio Nogueira, membro da banca de defesa de
projeto e ao Drº Fernando Gomes Barcellos, membro da banca de defesa de
projeto e qualificação. Obrigado pelas críticas e sugestões.
À Lígia, técnica do Laboratório de Biotecnologia dos Solos da Embrapa
Soja, pelos ensinamentos e incentivos.
Aos amigos do Laboratório de Biotecnologia dos Solos da Embrapa, e
mesmo aqueles que não estão mais no laboratório: Maria, Adalgisa, Glaciela,
Odair, Pâmela, Susan, Jesiane, Adriana, Simone, Fabinho, Renan Ribeiro,
Renan Oliveira, Nágila, Leny, Letícia, Renata, Ilmara, Aline, André, Gesiele,
Rinaldo, Dona Rosa, Sueli. Pela amizade, carinho e ajuda. Àqueles que me
deram forças nos momentos mais difíceis e estiveram sempre à disposição, em
todos os momentos. Vou guardar pra sempre em meu coração. Todos os
momentos de descontração foram fundamentais para que as minhas forças
fossem restabelecidas.
Aos técnicos do Laboratório de Biotecnologia Vegetal da Embrapa
Soja, em especial à Silvana e ao César, pela ajuda, por terem permitido com
que eu utilizasse o nanodrop
, além de me fornecerem vários reagentes para
que eu conseguisse concluir meus experimentos. Muito obrigado.
À Drª Elisete Pains Rodrigues, pelo exemplo de profissional, sempre
disposta a ajudar os colegas, pelas ótimas sugestões, dicas, orientações. Pela
amizade, por ter sempre me incentivado e ajudado. Muito obrigado.
Às minhas amigas Joyce, Rafaela e Bianca, pelos momentos de
descontração e amizade.
Aos membros da banca examinadora: Drª Francismar Corrêa Marcelino
e Drª Elisete Pains Rodrigues pela disponibilidade em participar da banca de
defesa desta dissertação e pelas valiosas contribuições durante o
desenvolvimento e a conclusão deste trabalho.
Aos professores e funcionários do curso de Pós-Graduação em
Microbiologia da UEL, pelo conhecimento transmitido e ao apoio concedido.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudos.
viii
À EMBRAPA Soja, pela oportunidade de estágio e bolsa de estudos
durante o primeiro ano de estágio, pela estrutura que me foi concedida para a
realização dos experimentos.
Enfim, agradeço a todas as pessoas que, direta ou indiretamente
contribuíram para a realização deste trabalho. Meu muito obrigado!
ix
SUMÁRIO
Lista de figuras
...................................................................................xi
Lista de tabelas
.................................................................................xiii
Resumo..............................................................................................xiv
Abstract
..............................................................................................xvi
1. Revisão de literatura
......................................................................1
1.1. Introdução...................................................................................1
1.2. A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)..............................3
1.3. A importância da fixação biológica do nitrogênio........................5
1.4. Simbiose rizóbio-leguminosa e os processos de infecção e
nodulação das raízes de feijoeiro................................................7
1.5. Genes rizobianos responsáveis pelo controle dos processos de
infecção, nodulação e especificidade hospedeira.......................9
1.6. Genes envolvidos na biossíntese do fator Nod.........................14
1.7. Sinais moleculares liberados em exsudatos de plantas
hospedeiras...............................................................................17
1.8. Sinais indutores dos genes de nodulação do rizóbio................18
1.9. Análise da expressão gênica.....................................................24
2. Objetivo
..........................................................................................27
3. Material e métodos
........................................................................27
3.1. Estirpe bacteriana......................................................................27
3.2. Condições de crescimento.........................................................27
3.2.1. Indução dos genes de nodulação (nod).....................................28
3.2.2. Experimento 1:...........................................................................28
3.2.3. Experimento 2:...........................................................................28
3.3. Preparo do flavonóide e do exsudato de sementes de feijão....29
3.4. Extração e quantificação de RNA total......................................29
3.5. Desenho dos Primers para RT-qPCR........................................31
3.6. PCR quantitativo em tempo real................................................31
3.7. Análise estatística......................................................................32
4. Resultados
.....................................................................................34
x
4.1. Avaliação da expressão dos genes nodC e nodG em Rhizobium
tropici PRF 81 durante a indução por naringenina e exsudatos de
sementes de feijão................................................................................34
5. Discussões.....................................................................................42
6. Conclusões
.....................................................................................48
7. Referências Bibliográficas
............................................................49
8. Anexos
............................................................................................61
xi
Lista de figuras
Figura 1:
Genes de nodulação (nod) de (a) R. leguminosarum bv.
viciae (plasmídeo pRLIJI) e (b) R. leguminosarum bv. trifolii (plasmídeo pRtr
ABU841). Os genes são representados por setas que apontam a direção da
sua transcrição. Os genes nod “comuns” estão representados pelas setas
pretas e os específicos dos hospedeiros (hsn) pelas setas hachuradas (alguns
autores, como Long, 1992, e Phillips, 1992, não consideram os genes nodI e
nodJ como “comuns”). As setas brancas representam os genes regulatórios
nodD e os triângulos indicam a posição das caixas “nod” (Dénarié et al., 1992;
Schlaman et al., 1992b; Spaink, 1992). (Fonte: Hungria, 1994)........................12
Figura 2:
Rota biossintética para formação da estrutura básica de um
fator de nodulação. (Fonte: Downie, 1998)........................................................17
Figura 3:
Níveis de expressão dos genes nodC e nodG, obtidos por
RT-qPCR, em Rhizobium tropici PRF 81, submetidos ao tratamento de indução
com naringenina e exsudato de sementes de feijão durante 48 h de indução,
comparados com os respectivos controles (metanol e água; utilizados como
calibradores na RT-qPCR). Os valores foram normalizados pela expressão do
gene referência 16S. Os traços verticais sobre as barras correspondem ao
desvio padrão
.
....................................................................................................37
Figura 4:
Níveis de expressão do gene nodC, obtidos por RT-qPCR,
em Rhizobium tropici PRF 81, submetido ao tratamento de indução com
exsudato de sementes de feijão nos tempos de: 5 min, 15 min, 1 h, 4 h e 8 h,
comparados com o controle, água, utilizado como calibrador na RT-qPCR. Os
valores foram normalizados pela expressão do gene referência 16S. Os traços
verticais sobre as barras correspondem ao desvio padrão...............................39
Figura 5:
Níveis de expressão do gene nodG, obtidos por RT-qPCR,
em Rhizobium tropici PRF 81, submetido ao tratamento de indução com
exsudato de sementes de feijão nos tempos de: 5 min, 15 min, 1 h, 4 h e 8 h,
comparados com o controle, água, utilizado como calibrador na RT-qPCR. Os
valores foram normalizados pela expressão do gene referência 16S. Os traços
verticais sobre as barras correspondem ao desvio padrão...............................39
Figura 6:
Níveis de expressão do gene nodC, obtidos por RT-qPCR,
em Rhizobium tropici PRF 81, submetido ao tratamento de indução com
naringenina (1,5 µM) nos tempos de: 5 min, 15 min, 1 h, 4 h e 8h , comparados
com o controle, metanol, utilizado como calibrador na RT-qPCR . Os valores
foram normalizados pela expressão do gene referência 16S. Os traços verticais
sobre as barras correspondem ao desvio padrão.............................................41
xii
Figura 7: Níveis de expressão do gene nodG, obtidos por RT-qPCR,
em Rhizobium tropici PRF 81, submetido ao tratamento de indução com
naringenina (1,5 µM) nos tempos de: 5 min, 15 min, 1 h, 4 h e 8h , comparados
com o controle, metanol, utilizado como calibrador na RT-qPCR. Os valores
foram normalizados pela expressão do gene referência 16S. Os traços verticais
sobre as barras correspondem ao desvio padrão.............................................41
xiii
Lista de tabelas
Tabela 1:
Genes de nodulação cujas principais funções são
conhecidas (Fonte: Hungria, 1994)....................................................................13
Tabela 2:
Indutores dos genes nod isolados de leguminosas. (Fonte:
Dakora & Phillips, 2002; Hungria & Stacey, 1997)............................................23
Tabela 3: Seqüências dos primers utilizados para RT-qPCR..............31
Tabela 4:
Estatística descritiva baseada nos níveis de expressão dos
genes nodC e nodG tratados com exsudato de sementes de feijão em todos os
tempos de indução. Cada amostra foi amplificada em triplicata à partir de 3
repetições biológicas independentes.................................................................35
Tabela 5: Estatística descritiva baseada nos níveis de expressão dos
genes nodC e nodG tratados com naringenina (1,5 µM) em todos os tempos de
indução. Cada amostra foi amplificada em triplicata à partir de 3 repetições
biológicas independentes..................................................................................36
Tabela 6:
Análise estatística dos resultados de expressão relativa, pelo
programa REST 2008 (versão 2.0.7), dos genes nodC e nodG submetidos ao
tratamento com exsudato de sementes de feijão e narigenina, em todos os
tempos de tratamento, normalizados pelo gene referência rRNA 16S..............40
xiv
OLIVEIRA, LUCIANA RUANO DE. Análise da expressão dos genes nodC e
nodG de Rhizobium tropici sob indução com flavonóides pela técnica de PCR
quantitativo. 2009. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Universidade
Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brasil.
RESUMO
O estabelecimento da simbiose rizóbio-leguminosa inicia-se com a excreção,
pela planta hospedeira, de compostos de ação quimiotática sobre o rizóbio,
facilitando a colonização rizosférica e estimulando o crescimento da bactéria.
Geralmente, estes compostos excretados são açúcares, aminoácidos e ácidos
dicarboxílicos, que promovem a adesão dos rizóbios aos pelos radiculares das
plantas. Simultaneamente a esta adesão, tem início uma troca de sinais
moleculares entre o microssimbionte e a planta hospedeira, que libera
compostos fenólicos, principalmente flavonóides, responsáveis pela indução da
transcrição de genes bacterianos essenciais à nodulação (genes nod, nol e
noe). Os rizóbios produzem, então, por meio dos genes de nodulação, os
fatores de nodulação (fatores Nod), que são oligossacarídeos lipoquitínicos
(LCOs) que induzem modificações radiculares no estágio de pré-infecção,
essenciais à infecção do rizóbio para a formação do nódulo e posterior fixação
do nitrogênio (N
2
). O gene nodC é responsável pela biossíntese da estrutura
básica do fator Nod, mais especificamente, é responsável pelo controle da
etapa de elongação da cadeia principal oligossacarídica. Já o gene nodG é um
gene específico do hospedeiro (hsn), responsável pela modificação no
esqueleto oligossacarídico do fator Nod. Neste estudo foi relatada a resposta
transcricional dos genes nodC e nodG na estirpe PRF 81 de Rhizobium tropici,
após indução com naringenina e exsudato de sementes de feijão, pela técnica
de PCR quantitativo (RT-qPCR). Deste modo, diferentes tratamentos de
indução dos genes nod foram realizados. No primeiro experimento, os genes
nodC e nodG foram induzidos com naringenina ou exsudato de sementes de
feijão por um período de 48 h. Já no segundo experimento, após as células
bacterianas atingirem a fase exponencial de crescimento, foi realizado o
processo de indução dos genes nod, sendo aplicados os seguintes tempos: 5
min, 15 min, 1 h, 4 h e 8 h. Em seguida, procedeu-se à extração do RNA total
xv
de todas as culturas. Os níveis de expressão gênica diferencial foram
calculados aplicando-se o método 2
-∆∆Ct
(Livak and Schmittgen, 2001) e a
análise dos dados foi feita por estatística descritiva, onde a reprodutibilidade e
precisão dos valores de RQ obtidos foram estimados pelos desvios padrão
(SD) e coeficiente de variação (CV%) em cada corrida e entre as corridas.
Também foi utilizado o programa REST 2008 (Relative Expression Software
Tool), versão 2.0.7 (Pfaffl et al., 2002; http://www.gene-quantification.info), o
qual testa as diferenças para significância através de um teste randômico,
baseado em iterações. Em todas as reações foi utilizado o gene ribossômico
16S como normalizador. Os resultados da quantificação relativa mostraram
que, após 5 min de incubação, ambos os genes foram significativamente
induzidos pelo exsudato, com valores 121,97 e 14,86 superiores ao controle,
respectivamente. Níveis de expressão inferiores foram observados na presença
de naringenina, além disso, a expressão máxima na presença desse indutor foi
verificada somente após 8 h de incubação. Esses resultados sugerem que o
exsudato de sementes de feijão revelam maior potencial para uma imediata
indução dos genes nod em R. tropici PRF 81.
Palavras-chave: genes de nodulação; expressão gênica; fixação biológica do
nitrogênio; Phaseolus vulgaris; Rhizobium tropici; RT-qPCR; simbiose.
xvi
OLIVEIRA, LUCIANA RUANO DE. Analysis of the expression of nodC and
nodG genes of Rhizobium tropici after induction with flavonoids by the
quantitative PCR technique (RT-qPCR). 2009. Dissertação (Mestrado em
Microbiologia) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brasil.
ABSTRACT
The establishment of rhizobia-legume symbiosis begins with the excretion by
the host plant of compounds with chemotatic activity to the rhizobia, facilitating
the rhizospheric colonization and stimulating bacterial growth. In general these
excreted compounds are sugars, amino acids and dicarboxylic acids that
promote the attachment of the rhizobia to the plant root hairs. Simultaneously to
this attachment, an exchange of molecular signals between the microsymbiont
and the host plant starts, with the plant releasing phenolic compounds, mainly
flavonoids, responsible for the induction of the transcription of bacterial
nodulation genes (nod, nol and noe genes). Following, rhizobia releases the
nodulation factors (Nod factors) that are lipochitin oligosaccharides (LCOs)
responsible for the changes in the early stages of the root infection, facilitating
the infection of rhizobia that will lead to nodule formation and nitrogen fixation.
The nodC gene is responsible for the biosynthesis of the basic structure of the
Nod factor, more especifically, it is responsible for controlling the elongation of
the oligosaccharides backbone. The nodG gene is a host-specific gene (hsn),
responsible for modification in the oligosaccharide backbone of the Nod factor.
This study reports the transcriptional response of nodC and nodG genes of
strain PRF 81 of Rhizobium tropici, after induction with naringenin and common
bean exudate, evaluated by the quantitative PCR technique (RT-qPCR).
Different gene induction treatments were applied. In the first experiment, nodC
and nodG genes were induced with naringenin or seed exudates by 48 h. In
the second experiment, after bacterial cells reached the exponential phase of
growth, induction was achieved by the incubation with naringenin or seed
exudates in different periods of time: 5 min, 15 min, 1 h, 4 h e 8 h. Following,
total RNA was extracted from all cultures. The levels of differential gene
expression were estimated by the method of 2
-∆∆Ct
(Livak and Schmittgen,
2001) and the analyses of the data was performed by using descriptional
xvii
statistics, with the reproducibility and precision of the RQ values being
estimated by the standard deviation (SD) and the coefficient of variatio (CV%)
obtained in each assay and among the asssays. The REST 2008 (Relative
Expression Software Tool), versão 2.0.7 (Pfaffl et al., 2002; http://www.gene-
quantification.info) was also used, to test the statistical significance by means of
a random test base on interactions. In all reactions the 16S rRNA gene was
used as a normalizer. The results of relative quantification have shown that,
after 5 min of incubation, both genes were significantly induced by the
exudates, with values of 121,97- and 14,86-fold higher than the control,
respectively. Lower levels of expression were observed in the presence of
naringenin; furthermore, maximum expression in the presence of this inducer
was verified only after 8 h of incubation. These results suggest that common
bean seed exudates have a higher potential for a prompt induction of nod gene
in R. tropici strain PRF 81.
Key-words:
biological nitrogen fixation;
gene expression; nodulation genes;
Phaseolus vulgaris; Rhizobium tropici; RT-qPCR; symbiosis.
1
1. Revisão de Literatura
1.1. Introdução
O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é a leguminosa mais importante para
a nutrição humana no Brasil, tendo em vista que o feijão é um dos alimentos
mais tradicionais na dieta alimentar do brasileiro. É fonte de proteína vegetal e,
também, de aminoácidos essenciais, representando uma das principais fontes
de proteínas da dieta de populações menos favorecidas (Costa & Vieira,
2000b). O Brasil é, atualmente, o maior produtor e consumidor de feijão
(Phaseolus vulgaris L.) do mundo.
Em condições limitadas de nitrogênio, bactérias pertencentes a
diversos gêneros, como Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium (= Ensifer),
Azorhizobium, Mesorhizobium, Burkholderia, Methylobacterium, Cupriavidus,
coletivamente denominadas como rizóbios, são capazes de estabelecer
simbiose com espécies de plantas pertencentes à família Leguminosae,
formando estruturas altamente especializadas, denominadas de nódulos, em
cujo interior, posteriormente, irá ocorrer a fixação biológica do nitrogênio (FBN)
(Rhijn & Vanderleyden, 1995; Hungria & Stacey, 1997; Brencic & Winans, 2005;
Stacey et al., 2006). O processo da nodulação radicular inicia-se com a
excreção, pela planta hospedeira, de compostos que agem como substâncias
quimiotáticas e estimulam a multiplicação das bactérias na rizosfera (Hungria,
1994). Geralmente, estes compostos excretados são açúcares, aminoácidos e
ácidos dicarboxílicos, que promovem a adesão dos rizóbios aos pelos
radiculares das plantas, um processo relativamente estável e irreversível.
Simultaneamente a essa adesão, ocorre uma troca de sinais moleculares entre
o microssimbionte e a planta hospedeira, que libera compostos fenólicos,
especialmente flavonóides, além de outras moléculas, como as betaínas (não
pertencentes à família dos flavonóides), que induzem a transcrição dos genes
de nodulação (nod, nol e noe) nas bactérias (Hungria et al., 1997; Brencic &
Winans, 2005; Pinto, 2007). A seguir, ocorre a síntese e a liberação, pelo
rizóbio, de pequenas moléculas que são percebidas pela planta e que, por
conseguinte, ativam o processo de formação do nódulo. Essas moléculas são
chamadas de fatores Nod, também conhecidos como lipo-quito-
oligossacarídeos (LCOs) (Brencic & Winans, 2005) e são responsáveis pelas
2
modificações radiculares na planta no pré-estágio de infecção, culminando com
a formação dos nódulos fixadores de nitrogênio (N
2
).
Uma imediata indução dos genes nod é considerada essencial para o
início do processo de infecção pelo rizóbio. Os flavonóides exsudados por
sementes e raízes de uma determinada leguminosa consistem de uma mistura
de indutores dos genes nod fracos e fortes, além de compostos inibidores e
ineficazes (Mulligan & Long, 1985; Firmin et al., 1986; Peters et al., 1986;
Redmond et al., 1986; Hartwig et al., 1989, 1990; Hungria et al., 1992). No caso
do feijoeiro, o principal grupo de compostos indutores liberados pelas sementes
foi identificado como antocianidinas (delfinidina, petunidina e malvidina) e
flavonóis (miricetina, quercetina e canferol) (Hungria et al., 1991a). Nos
exsudatos radiculares foram identificados eriodictiol, naringenina e genisteína
como os principais indutores (Hungria et al., 1991b). Bolanõs-Vásquez &
Werner (1997) identificaram outros compostos flavonóides indutores dos genes
nod em exsudatos radiculares de feijoeiro, a chalcona isoliquiritigenina, e a
correspondente flavanona liquiritigenina.
Não existem estudos de expressão gênica da estirpe PRF 81 de
Rhizobium tropici, portanto, torna-se necessário verificar se o flavonóide
naringenina e exsudato de sementes de feijão são capazes de induzir a
expressão dos genes nod.
Além disso, a maioria dos estudos de expressão dos genes nod,
baseados na indução desses genes pelos flavonóides indutores, reportados na
literatura, são obtidos através das construções de “plasmídeos repórteres”, as
quais permitem monitorar a expressão dos genes nod através da atividade da
enzima
β
-galactosidase (Innes et al., 1985; Mulligan & Long, 1985; Rossen et
al., 1985; Zaat et al., 1987b). Existem poucos estudos utilizando a técnica de
PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) para verificar a expressão de
genes de nodulação (nod) em rizóbios. Dentro deste contexto, investigou-se o
potencial indutor do flavonóide naringenina e de exsudato de sementes de
feijão na expressão dos genes nodC e nodG de R. tropici PRF81, através da
técnica de RT-qPCR.
Estes estudos podem fornecer informações valiosas para a
compreensão dos mecanismos envolvidos na simbiose entre o feijoeiro
(Phaseolus vulgaris) e seu microssimbionte R. tropici, e consequentemente
3
permitir o desenvolvimento de estratégias que possam elevar a FBN nessa
leguminosa e aumentar os rendimentos.
1.2. A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)
O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é a leguminosa mais importante para
a nutrição humana, tendo em vista que o feijão é um dos alimentos mais
tradicionais na dieta alimentar do brasileiro. É fonte de proteína vegetal e,
também, de aminoácidos essenciais, representando uma das principais fontes
de proteína da dieta de populações menos favorecidas (Costa & Vieira, 2000b).
Graças às suas comprovadas propriedades nutritivas e terapêuticas, o
feijão é altamente desejável como componente em dietas de combate à fome e
à desnutrição. Além do seu conteúdo proteico, o elevado teor de fibra
alimentar, com seus reconhecidos efeitos hipocolesterolêmico e hipoglicêmico,
aliado às vitaminas (especialmente do complexo B) e aos carboidratos, tornam
o seu consumo altamente vantajoso como alimento funcional, representando
uma fonte importante de nutrientes, de energia e atuando na prevenção de
distúrbios cardiovasculares e certos tipos de câncer (Costa & Vieira, 2000b;
Embrapa, 2007a).
O feijoeiro é originário das Américas, com dois centros de
diversificação genética: o Mesoamericano ou grupo norte (do México à região
norte da América do Sul) e o Andino ou grupo sul, que abrange o sul do Peru
até o norte da Argentina. Além desses centros primários, um terceiro centro
menor de domesticação pode existir na Colômbia (Gepts, 1990; Kami et al.,
1995).
Entre as espécies cultivadas do gênero Phaseolus (P. vulgaris, P.
coccineus, P. acutifolius, P. lunatus), o P. vulgaris é a mais plantada, sendo
responsável por cerca de 95% da produção mundial de Phaseolus (Costa &
Vieira, 2000a).
O Brasil é, atualmente, o maior produtor e consumidor de feijão
(Phaseolus vulgaris L.) do mundo. Conforme publicação do quinto
levantamento da safra 2008/09, realizada em fevereiro de 2009 pela
Companhia Nacional de Abastecimento - Conab, a área plantada de feijão
aumentou de 3.993,4 mil hectares (ha), em 2007/08, para 4.141,4 mil ha, em
4
2008/09. A análise dos dados de produção, referentes ao mesmo período,
mostra um aumento mínimo de 3.521,9 mil toneladas, em 2007/08, para
3.588,2 mil toneladas em 2008/09. A produtividade aponta um decréscimo de
882 kg ha
-1
para 866 kg ha
-1
. Esses dados referem-se às três safras que
compõem o ciclo da cultura ao longo do ano (CONAB, 2009).
O cultivo dessa leguminosa é bastante difundido em todo território
nacional e, dependendo da região, o plantio de feijão no Brasil é feito ao longo
do ano, em três épocas. A primeira, também conhecida como safra das
“águas”, ocorre entre agosto e dezembro e concentra-se mais nos estados da
Região Sul; a segunda safra, ou da “seca”, abrange todos os estados
brasileiros e ocorre entre janeiro e abril; a terceira safra, ou de “inverno”,
concentrada nas Regiões Sudeste, Sul, Centro-Oeste e no Estado da Bahia, é
realizada de maio até julho ou agosto, dependendo do estado. Dessa forma,
durante todo o ano, em alguma região do país sempre haverá produção de
feijão (Costa & Vieira, 2000a). É reconhecida como cultura de subsistência,
uma vez que grande parte da produção está ligada a pequenas e médias
propriedades, geralmente utilizando baixo nível tecnológico, apresentando
importância destacada nos sistemas produtivos vinculados à agricultura familiar
(Embrapa, 2007b).
O baixo nível de tecnologia e o cultivo em solos marginais,
especialmente com baixo teor de nitrogênio (N), contribuem para a baixa
produtividade do feijoeiro, representando um dos fatores limitantes à obtenção
de maiores rendimentos nacionais (Hungria et al., 1997; 2003; Pinto, 2007).
Nesse contexto, o suprimento adequado de N pela simbiose com bactérias
diazotróficas, de modo eficaz, representa uma alternativa para aumentar os
rendimentos nacionais a um baixo custo, contribuindo para a manutenção da
fertilidade do solo, além de evitar a contaminação dos recursos hídricos pelo
nitrato e de diminuir a emissão dos gases com efeito estufa (Hungria et al.,
1997, 2003; Embrapa, 2007c). De fato, já foi constatado que, com a utilização
de cultivares e estirpes mais adequadas, aliada à condições ambientais
favoráveis, o feijoeiro pode obter N proveniente da FBN em quantidades
comparáveis às das plantas recebendo fertilizante nitrogenado (Hungria et al.,
2000; 2003).
5
1.3. A importância da fixação biológica do nitrogênio
O N é o quarto elemento mais abundante nas plantas, sendo superado
apenas pelo carbono (C), pelo oxigênio (O
2
) e pelo hidrogênio (H
2
). É
constituinte essencial de aminoácidos, proteínas, bases nitrogenadas, ácidos
nucléicos, hormônios e da clorofila (Morgante, 2003), estando presente na
natureza como nitrogênio molecular (N
2
), íons de nitrato (NO
3
-
), amônia (NH
3
)
ou incorporado em compostos orgânicos nitrogenados (Drozdowicz, 1997;
Pinto, 2007).
Apesar de sua abundância na atmosfera na forma de N
2
, constituindo
aproximadamente 80% dos gases atmosféricos, nenhum animal ou planta é
capaz de utilizá-lo diretamente como nutriente, devido à ausência do aparato
enzimático responsável em quebrar a tripla ligação existente entre os dois
átomos de N, que é uma das mais fortes de que se tem conhecimento na
natureza (Araújo & Carvalho, 2006; Hungria et al., 2007; Pinto, 2007).
As principais fontes para fornecimento de N para as plantas são: 1) o
solo, principalmente pela decomposição da matéria orgânica; 2) a fixação não-
biológica; 3) os fertilizantes nitrogenados; e 4) o processo de FBN doN
2
.
Em relação ao N do solo, o reservatório desse nutriente presente na
matéria orgânica é limitado, podendo ser esgotado, rapidamente, após alguns
cultivos.
A fixação não-biológica, isto é, independente da ação de organismos
vivos, resulta de processos naturais, como a reação de descargas elétricas
com o N
2
, a combustão e o vulcanismo. Essa fonte, porém, contribui com
apenas cerca de 10% da entrada anual de N na terra.
Os fertilizantes nitrogenados representam a forma assimilada com
maior rapidez e com menor custo energético pelas plantas, porém, com custos
econômico e ambiental elevados. O processo industrial que transforma o N
2
em
amônia (NH
3
) requer: hidrogênio (derivado de gás de petróleo); catalisador
contendo ferro; altas temperaturas (300° a 600°); e altas pressões (200 a 800
atm). Desse modo, o gasto equivalente de fontes energéticas por tonelada de
amônia sintetizada é de, aproximadamente, seis barris de petróleo. Um
agravante na utilização dos fertilizantes nitrogenados reside na baixa eficiência
de sua utilização pelas plantas, raramente ultrapassando 50%. Deve-se
6
considerar, ainda, que os fertilizantes nitrogenados estão altamente
relacionados à poluição ambiental, pois a lixiviação do N e o escorrimento
desse nutriente pela superfície do solo resultam em acúmulo de formas
nitrogenadas, particularmente nitrato, nas águas dos rios, lagos e lençóis
subterrâneos, podendo atingir níveis tóxicos aos peixes e ao homem. Em
termos globais, estima-se que a produção industrial da amônia contribua com,
aproximadamente, 25% das entradas de N na terra.
A terceira fonte de N para as plantas é representada pela FBN, a qual
representa a principal via de incorporação do N à biosfera (Hungria et al., 2001,
2007; Pinto, 2007). Na FBN há redução do N
2
em NH
3
, a mesma forma obtida
pelo processo indusrial, que será, posteriormente, utilizada para a síntese de
compostos orgânicos nitrogenados. Esse processo é realizado pelas bactérias
fixadoras de N, também denominadas como diazotróficas, as quais adquiriram,
durante sua evolução, a capacidade de sintetizar a nitrogenase, uma enzima
capaz de romper a tripla ligação do N
2
(Drozdowicz, 1997).
A maior contribuição do processo de FBN ocorre pela associação
simbiótica de plantas da família Leguminosae com bactérias pertencentes a
diversos gêneros, como Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium (= Ensifer),
Azorhizobium, Mesorhizobium, Burkholderia, Methylobacterium, Cupriavidus,
coletivamente denominadas como rizóbios (Hungria et al., 2007).
A FBN representa um componente essencial para a sustentabilidade
da agricultura (Dixon & Kahn, 2004; Pinto, 2007), tanto que inoculantes
rizobianos têm sido aplicados, freqüentemente, como biofertilizantes. Os
inoculantes são produtos desenvolvidos a partir de bactérias do solo capazes
de estabelecer uma associação com as plantas e possibilitar o fornecimento de
N a elas. São compostos de um veículo esterilizado, geralmente turfa (um tipo
de solo orgânico) ou outro material semelhante, e grande quantidade de
bactérias específicas para cada espécie de leguminosa, sendo misturado às
sementes no momento da semeadura (Embrapa, 2007d). A tendência moderna
no cultivo de leguminosas é o uso cada vez mais intenso do inoculante, por ser
um produto natural, de alta eficiência e com uma relação custo/benefício muito
favorável para o lado do benefício.
7
Estima-se que o processo biológico contribua com cerca de 65% de
todas as entradas de N, sendo o maior provedor desse nutriente para a
manutenção da vida na terra (Hungria et al., 2001).
Os teores de N nos solos brasileiros são baixos, de modo que, para
garantir o rendimento da cultura do feijoeiro, é necessário fornecer esse
nutriente, seja através do uso de fertilizantes ou pelo processo de FBN. A
contribuição do processo de FBN representa, portanto, uma alternativa de
baixo custo, protetora do meio ambiente e com uma grande contribuição para o
tipo de manejo que hoje é buscado mundialmente, o de uma agricultura
sustentável (Pinto, 2007).
1.4. Simbiose rizóbio-leguminosa e os processos de infecção e nodulação
das raízes de feijoeiro
Em condições limitadas de N, os rizóbios são capazes de estabelecer
simbiose com espécies de plantas pertencentes à família Leguminosae,
formando estruturas altamente especializadas, denominadas de nódulos, em
cujo interior, posteriormente, irá ocorrer a FBN (Rhijn & Vanderleyden, 1995;
Hungria & Stacey, 1997; Brencic & Winans, 2005; Stacey et al., 2006). Essa
associação planta-bactéria é tida como simbiótica, uma vez que o N fixado
pelos microrganismos é assimilado pelas plantas, enquanto estas fornecem
fontes de C para o simbionte (Straliotto & Teixeira, 2000); Essa interação é, de
um modo geral, específica para cada leguminosa hospedeira (Hungria, 1994;
Stacey et al., 2006).
A formação dos nódulos é um processo complexo que ocorre em várias
etapas, envolvendo mudanças fisiológicas e morfológicas, tanto na planta
hospedeira, como na bactéria. As alterações na bactéria visam, especialmente,
o recebimento de fontes de C da planta hospedeira, para prover ATP e poder
redutor, necessários para o processo de FBN, enquanto que as mudanças na
planta hospedeira visam assimilar a amônia produzida pelas bactérias. O
processo da nodulação radicular inicia-se com a excreção, pela planta
hospedeira, de compostos que agem como substâncias quimiotáticas e
estimulam a multiplicação das bactérias na rizosfera (Hungria, 1994).
Geralmente, estes compostos são açúcares, aminoácidos e ácidos
8
dicarboxílicos, que promovem a adesão dos rizóbios aos pelos radiculares das
plantas, um processo relativamente estável e irreversível. Esse processo
ocorre em duas etapas: na primeira, as bactérias isoladas aderem à superfície
radicular e, em seguida, outras bactérias aderem às que estão presas aos
pelos radiculares. Simultaneamente a essa adesão, ocorre uma troca de sinais
moleculares entre o microssimbionte e a planta hospedeira, que libera
compostos fenólicos, especialmente flavonóides, além de outras moléculas,
como as betaínas (não pertencentes à família dos flavonóides), que induzem a
transcrição dos genes de nodulação (nod, nol e noe) nas bactérias (Hungria et
al., 1997; Brencic & Winans, 2005; Pinto, 2007). Na segunda etapa da
sinalização molecular, ocorre a síntese e a liberação, pelo rizóbio, de pequenas
moléculas que são percebidas pela planta e que, por conseguinte, ativam o
processo de formação do nódulo. Essas moléculas são chamadas de fatores
Nod, também conhecidos como lipo-quito-oligossacarídeos (LCOs) (Brencic &
Winans, 2005) e são responsáveis pelas modificações radiculares no pré-
estágio de infecção, como: formação de raízes curtas e grossas, deformação,
encurvamento e aumento no número de pelos radiculares, seguidos por
invaginação da parede celular e formação de um cordão de infecção no interior
do pelo radicular, que cresce da extremidade do pelo radicular encurvado em
direção ao córtex, conduzindo o rizóbio para as células interiores (Pinto, 2007).
Em associação à infecção ocorrem os processos de divisão das células do
córtex e formação do primórdio do nódulo (Hungria, 1994; Hadri et al., 1998;
Stacey et al., 2006). Os cordões de infecção entram nas células desse
primórdio, em cujo citoplasma as bactérias são liberadas e envoltas em uma
membrana. Em seguida, os primórdios diferenciam-se em nódulos – autênticos
órgãos de especialização celular - dentro dos quais as bactérias se
diferenciarão em bacteróides, formas capazes de fixar o N
2
(Hungria, 1994;
Stacey et al., 2006; Pinto, 2007). Nos bacteróides ocorre a síntese das enzimas
relacionadas com a quebra da tripla ligação do N
2
e com a assimilação do N
fixado, dando início ao processo de FBN (Hungria, 1994).
Atualmente, existem seis espécies de Rhizobium descritas capazes de
nodular e fixar N
2
em feijoeiro: Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli (Jordan,
1984), R. tropici (Martínez-Romero et al., 1991), R. etli (Segovia et al., 1993),
9
R. gallicum, R. giardinii (Amarger et al., 1997) e R. lusitanum (Valverde et al.,
2006).
Através de um programa de seleção de estirpes baseado na
diversidade de rizóbios nativos, realizado pela Embrapa Soja e pelo IAPAR, foi
possível a identificação da estirpe PRF 81 (= SEMIA 4080) de R. tropici, com
alta eficiência de FBN, competitiva e estável geneticamente, além de ser
tolerante às condições de altas temperaturas e acidez do solo. Por essas
características, a estirpe vem sendo utilizada em inoculantes comerciais desde
1998, uma vez que se comprovou, em diversos ensaios a campo, a capacidade
de aumentar o rendimento da cultura em até 906 kg ha
-1
(Hungria et al., 2000).
1.5. Genes rizobianos responsáveis pelo controle dos processos de
infecção, nodulação e especificidade hospedeira
Os genes bacterianos essenciais à infecção e nodulação podem ser
divididos em duas classes.
Uma classe inclui os genes envolvidos na formação
da superfície celular bacteriana, tais como os genes determinantes da síntese
de exopolissacarídeos (genes exo), lipopolissacarídeos (genes lps),
polissacarídeos capsular ou antígeno K, e 1,2-
β
-glucanos (genes ndv),
relacionados ao desenvolvimento nodular. Mutações nesses genes podem
afetar o processo de infecção em vários graus, como, por exemplo,
incapacitando a formação dos cordões de infecção, o que resulta na formação
de nódulos vazios não fixadores de N
2
(fenótipo Nod
+
Fix
-
). Um possível
envolvimento dos genes exo e lps na determinação da especificidade
hospedeira tem sido sugerido, porém, nenhuma evidência mais clara mostrou,
ainda, que os componentes da superfície celular do rizóbio são os
determinantes principais da especificidade hospedeira (Rhijn & Vanderleyden,
1995; Mercante et al., 2002).
A segunda classe consiste dos genes de nodulação (nod, nol e noe)
(Tabela 1). Esta classe de genes divide-se em duas categorias, os genes nod
comuns (nodABC) e os genes nod específicos do hospedeiro (hsn). A
inativação dos genes desta classe pode resultar em vários fenótipos na planta,
como ausência de nodulação (Nod
-
), nodulação tardia, porém efetiva (Nod
d
10
Fix
+
), ou uma mudança na especificidade do hospedeiro (Rhijn &
Vanderleyden, 1995).
Até recentemente, os genes comuns nodABC estavam presentes em
todos os rizóbios estudados. Após quase duas décadas de estudos dos genes
nodABC, porém, surgiu a revelação de que podem existir espécies de rizóbios
capazes de nodular e fixar N
2
sem esses genes, conforme demonstrado pelo
genoma completo da estirpe BTAi1 de Bradyrhizobium sp. (Giraud et al., 2007).
Os genes nodABC não são expressos constitutivamente, sendo necessária a
presença de um indutor para que haja sua expressão. Estes genes são
estruturalmente conservados e funcionalmente transferíveis entre as espécies
de rizóbios, sem alteração do reconhecimento do hospedeiro original (Rhijn &
Vanderleyden, 1995; Hungria & Stacey, 1997; Mercante et al., 2002), ou seja,
possuem a capacidade de restituir funções de nodulação quando transferidos
entre espécies diferentes de rizóbios (Valarine, 1998).
A transcrição destes genes é essencial para a síntese da estrutura
básica do fator Nod, o qual conduz às principais alterações na raiz da planta,
necessárias à entrada do rizóbio no hospedeiro (Kondorosi et al., 1989). Em
muitas espécies, os genes nodA, nodB e nodC localizam-se no mesmo operon
(nodABC) (Figura 1). Entretanto, em R. etli, o gene nodA encontra-se separado
dos genes nodBC por 20 Kb (Girard et al., 1991; Rhijn & Vanderleyden, 1995).
Schlaman et al. (1992) classificam os genes nodIJ como nod comuns,
já Phillips (1992), como genes específicos do hospedeiro (hsn). A proteína NodI
apresenta sequência homóloga a uma família de ATPases de transporte
possivelmente envolvidas na secreção de lipooligossacarídeos, como foi
também demonstrado para a proteína NodJ (Spaink et al., 1995).
Dentre outros genes de nodulação comuns à maioria dos rizóbios,
podem-se citar os genes nodMN, descritos pela primeira vez por Baev et al.
(1992), sendo requeridos para a otimização da nodulação em alfafa.
Os genes hsn constituem a maioria dos genes de nodulação descritos,
sendo responsáveis pelas modificações no esqueleto oligossacarídico do fator
Nod (Pinto, 2007). São necessários para a nodulação específica de cada planta
hospedeira, não apresentando homologia genética e/ou funcional entre as
espécies de rizóbio (Kondorosi et al., 1989). A maioria das mutações nesses
11
genes resulta em alterações na nodulação ou modificações na faixa de
especificidade hospedeira (Rhijn & Vanderleyden, 1995).
Na maioria das espécies de Rhizobium, os genes que controlam a
nodulação, a especificidade hospedeira e a fixação de N
2
estão localizados em
um plasmídio chamado plasmídio simbiótico (pSym), como em R. tropici (Pinto,
2007).
Ao contrário, em Bradyrhizobium e Mesorhizobium, esses genes estão
em uma “ilha” simbiótica localizada no cromossomo bacteriano (Sadowsky et
al., 1991; Kaneko et al., 2000).
Em outra categoria dos genes nod, estão incluídos os genes
classificados como “regulatórios”, como o nodD, que codifica proteínas
conhecidas como NodD (elemento trans, o qual é um fator de transcrição sítio-
específico). Essa proteína NodD se liga a seqüências de DNA altamente
conservadas de 55 pares de bases (pb) encontradas nas regiões promotoras
dos genes de nodulação, denominadas de “caixas nod” (Peck et al., 2006), ou
elementos cis. A ligação dessas proteínas às “caixas nod” ocorre tanto na
presença, como na ausência de flavonóides, porém, somente a presença do
indutor é capaz de converter a proteína NodD em sua forma ativa,
desencadeando a expressão dos genes de nodulação (Brencic & Winans,
2005). As proteínas NodD pertencem à família “LysR-type” de ativadores
transcricionais e apresentam diferentes especificidades pelos flavonóides e
outros compostos derivados, dependendo da espécie em estudo; além disso,
estão presentes em todas as estirpes de rizóbio investigadas até o momento,
havendo uma variação entre as espécies quanto ao número de cópias
presentes (Rhijn & Vanderleyden, 1995; Mercante et al., 2002; Grange, 2005).
R. leguminosarum bv. viciae e bv. trifolii apresentam apenas uma cópia do
gene nodD. Rhizobium sp. NGR234, R. meliloti (= Ensifer meliloti), e R. tropici
possuem duas a cinco cópias (Broughton et al., 2000). Bradyrhizobium
japonicum, duas cópias (Loh & Stacey, 2003). O significado dessas cópias
múltiplas de nodD e a interação entre as mesmas e os flavonóides não está
totalmente elucidado; foi sugerido, entre outros, que poderia haver uma
correlação com a especificidade a diferentes hospedeiros (Hungria & Stacey,
1997).
Em E. meliloti, a proteína NodD localiza-se no citoplasma e migra em
direção à membrana citoplasmática quando o flavonóide é adicionado,
12
sustentando a hipótese de que o sítio de interação entre o NodD e o flavonóide
está localizado na membrana interna (Rhijn & Vanderleyden, 1995).
Figura 1.
Genes de nodulação (nod) de (a) R. leguminosarum bv. viciae (plasmídeo pRLIJI) e
(b) R. leguminosarum bv. trifolii (plasmídeo pRtr ABU841). Os genes são representados por
setas que apontam a direção da sua transcrição. Os genes nod “comuns” estão representados
pelas setas pretas e os específicos dos hospedeiros (hsn) pelas setas hachuradas (alguns
autores, como Long, 1992, e Phillips, 1992, não consideram os genes nodI e nodJ como
“comuns”). As setas brancas representam os genes regulatórios nodD e os triângulos indicam a
posição das caixas “nod” (Dénarié et al., 1992; Schlaman et al., 1992; Spaink, 1992). (Fonte:
Hungria, 1994).
13
Tabela 1. Genes de nodulação cujas principais funções são conhecidas (Fonte:
Hungria, 1994).
14
Tabela 1. Genes de nodulação cujas principais funções são conhecidas (Fonte:
Hungria, 1994).
(1) Rl: R. leguminosarum; Rt: R. trifolii; Rm: R. meliloti; Bj: Bradyrhizobium japonicum; Bp:
B. sp. (Parasponia); NGR234, R. sp. NGR234; Rf: R. fredii.
(2) Hsn, host specific gene.
1.6. Genes envolvidos na biossíntese do fator Nod
O fator de nodulação (fator Nod) representa a chave para os sinais
moleculares envolvidos no início do desenvolvimento nodular e na invasão
bacteriana (Broughton et al., 2000). Os fatores Nod são sintetizados e
exportados da bactéria pelos produtos dos genes nod (Brencic & Winans,
2005).
O gene nodM, descrito em E. meliloti e em R. leguminosarum bv.
viciae, codifica uma glucosamina-sintetase e apresenta elevada homologia com
o gene glmS de Escherichia coli, com capacidade para codificar a proteína que
catalisa a formação da 6-P-glucosamina a partir da 6-P-frutose e da glutamina,
representando o processo inicial e essencial para a síntese dos fatores Nod
(Baev et al., 1992). Mutantes nodLMN não apresentam o fenótipo Nod
-
, mas
apenas algumas alterações, como anormalidades no encurvamento dos pelos
radiculares (Djordjevic et al., 1985; Débellé et al., 1986). Baev et. al (1992)
verificaram que em mutantes nodM de E. meliloti a produção de fator Nod é
severamente reduzida, porém, não existem diferenças na estrutura química dos
15
fatores produzidos pela estirpe selvagem e pelo respectivo mutante. Mutantes
nodM reduziram em até 20 vezes a quantidade de fatores Nod em E. meliloti e
em três vezes em R. leguminosarum (López-Lara & Geiger, 2001). Mutantes
nodM e nodN induziram um atraso significativo na nodulação em Medicago
sativa, além de diminuição no número de pelos radiculares formados (Baev et
al., 1991). Além disso, os bacteróides derivados da mutação no gene nodM em
R. tropici apresentam um desenvolvimento incompleto e alterações fisiológicas,
afetando a fixação do N
2
e o peso seco de plantas de feijoeiro (Manyani et al.,
2001).
As moléculas de N-acetilglucosamina (GlcNAc) sintetizadas pelas
proteínas NodM, ou por outras proteínas homólogas envolvidas no
metabolismo natural das bactérias são polimerizadas em tri-, tetra- e
pentassacarídeos mediante a atividade da N-acetilglucosamina transferase
produzida pela proteína NodC (Barny & Downie, 1993) (Figura 2). A proteína
NodA promove a transferência de um grupo acil ao grupo amina livre da
extremidade não redutora, enquanto a proteína NodB age na desacetilação do
resíduo de N-acetilglucosamina da extremidade não redutora do fator Nod
(Rhijn & Vanderleyden, 1995; Broughton et al., 2000; Pinto, 2007).
Posteriormente, a estrutura básica do fator Nod pode ser modificada,
mediante a ação de várias proteínas codificadas pelos genes de nodulação
específicos de cada rizóbio, as quais conferem uma variedade de substituições,
por exemplo, com fucosil, arabinosil, sulfato, carbamil, acetil ou glicerol
(Hungria & Stacey, 1997; Rasmussen et al., 2004; Grange, 2005; Pinto, 2007),
resultando nas diversas estruturas de fatores Nod liberados por diferentes
espécies de rizóbios, desempenhando importante função na especificidade
hospedeira (Brencic & Winans, 2005; Pinto, 2007). R. tropici sintetiza uma
combinação de fatores de nodulação sulfatados e não-sulfatados. Ambos
estimulam o processo de divisão das células corticais externas de P. vulgaris,
porém os compostos sulfatados são, em grande parte, mais ativos (Rhijn &
Vanderleyden, 1995). Acredita-se que essa habilidade em produzir os dois
tipos de compostos representa uma função importante na ampla capacidade de
nodular vários hospedeiros que esta espécie de rizóbio possui (Poupot et al.,
1995b). Em concentrações da ordem de picomolares e nanomolares, estas
moléculas provocam deformação dos pelos radiculares, rápida despolarização
16
da membrana, expressão de nodulinas iniciais, e mitose no córtex da raiz, os
quais, de certa forma, conduzem à organogênese do nódulo (Poupot et al.,
1995a).
O gene nodG é um gene hsn, sendo responsável pela modificação no
esqueleto oligossacarídico do fator Nod (Pinto, 2007). O gene nodG foi descrito
em quatro rizóbios, E. meliloti 1021, que nodula Medicago sativa (Swanson et
al., 1987), Rhizobium sp. N33 que nodula Astragalus cicer e Onobrychis
viciifolia (Cloutier et al., 1997), Mesorhizobium sp. 7653R que nodula
Astragalus sinicus (Zhang et al., 2000), e mais recentemente em R. tropici PRF
81, que nodula Phaseolus vulgaris (Pinto et al., 2009). Este gene está
localizado no mesmo operon e imediatamente abaixo de nodFE nos três
primeiros rizóbios descritos (López-Lara & Geiger, 2001). López-Lara & Geiger
(2001) verificaram que a proteína NodG possui a mesma função bioquímica
que FabG, uma proteína de nodulação com atividade enzimática 3-oxoacyl-
ACP redutase (3-oxoacyl-acyl-carrier protein reductase), codificada pelo gene
fabG de R. leguminosarum. Esta enzima catalisa a primeira etapa de
elongação da cadeia de ácido graxo. A similaridade elevada da proteína NodG
com a 3-oxoacyl-ACP redutase, relatada anteriormente, somada ao fato de que
mutações no gene nodG de E. meliloti não resultarem em qualquer alteração
na estrutura de ácido graxo do fator Nod, sugerem a presença de uma
duplicação do gene, ou de um equivalente cromossomal que possa substituir a
proteína NodG. No entanto, estudos fenotípicos da simbiose de rizóbios
carregando uma mutação no gene nodG, indicaram que a função dessa
proteína, em alguns casos, não pode ser totalmente complementada pelo
equivalente cromossomal (López-Lara & Geiger, 2001). Em alguns casos,
mutantes nodG de E. meliloti inoculados na alfafa não apresentaram qualquer
falha na nodulação, enquanto em outros causaram apenas um leve atraso na
nodulação (Horvath et al., 1986; Swanson et al., 1987). Mutantes nodG de
Rhizobium sp. N33 tiveram leve falha na nodulação e formaram um número
reduzido de nódulos na planta hospedeira Astragalus cicer; além disso, os
nódulos formados em Onobrychis viciifolia são menores (Cloutier et al., 1997).
Também, foi mostrado que mutantes de E. meliloti RCR2011 deficientes em
nodG ou nodE formaram nódulos menores em Sesbania macrocarpa em
relação à estirpe parental (Krishan & Pueppke, 1998).
17
Figura 2. Rota biossintética da estrutura básica de um fator de nodulação. (Fonte: Downie,
1998)
1.7. Sinais moleculares liberados em exsudatos de plantas hospedeiras
As estirpes de rizóbios podem sobreviver no solo por vários anos, sem
estarem associadas às plantas hospedeiras. O pré-requisito para que o rizóbio
esteja associado como um microssimbionte, no entanto, é o de que a planta
seja capaz de se comunicar com ele (Mercante et al., 2002).
As plantas exsudam elevados níveis de nutrientes, frequentemente
mais de 20% de todo o C fixado. Aminoácidos, ácidos orgânicos, açúcares,
compostos aromáticos, dentre outros metabólitos secundários compreendem a
maioria dos exsudatos de baixo peso molecular da raiz, enquanto exsudatos de
18
alto peso molecular incluem, principalmente, polissacarídeos e proteínas
(Brencic & Winans, 2005). Tais compostos servem não apenas como fonte de
C para o crescimento microbiano, mas também estão envolvidos na
quimiotaxia desses microrganismos na rizosfera, além de controlar o
fornecimento de N para as leguminosas simbióticas (Dakora & Phillips, 2002).
A existência de sinais enviados da planta para a bactéria e vice-versa
foi deduzida a partir de um experimento realizado por van Brussel et al. (1986),
em que plantas de Vicia sativa subsp. nigra foram cultivadas sob condições
estéreis em meio líquido e, após sete dias, foram inoculadas com R.
leguminosarum bv. viciae. O sobrenadante desta cultura foi, então, esterilizado
por filtragem e utilizado como substrato para V. sativa, também em condições
estéreis. Após sete dias de crescimento, as raízes mostraram respostas
positivas quanto à deformação dos pelos radiculares (fenótipo “Had” – h
air
d
eformation) e formação de raízes mais curtas e grossas (fenótipo “Tsr” – thick
and s
hort root). Esses fenótipos radiculares foram utilizados para avaliar a
resposta do hospedeiro ao microssimbionte específico (Canter-Cremers et al.,
1986; van Brussel et al., 1986; Zaat et al., 1987a). Os controles que incluíam
plantas crescendo em sobrenadantes de bactérias, que não haviam sido
expostas aos exsudatos das plantas, e em exsudatos de plantas que não
haviam sido inoculadas com bactérias, foram negativos para os fenótipos “Had”
e “Tsr”. Foi constatado, ainda, que “Tsr” e “Had” estavam necessariamente
ligados à presença do plasmídeo simbiótico (pSym) e dos genes nodABC da
bactéria (van Brussel et al.,1986). Resultados semelhantes foram obtidos com
R. leguminosarum bv. trifolii e plantas de Trifolium repens (Canter-Cremers et
al., 1986).
1.8. Sinais indutores dos genes de nodulação do rizóbio
Inicialmente, os estudos dos sinais liberados pelas plantas baseavam-
se na indução dos fenótipos Had e Tsr, referentes à deformação dos pelos
radiculares e à formação de raízes mais curtas e grossas, respectivamente
(van Brussel et al., 1986). Posteriormente, estas análises foram substituídas
por outra mais específica e direta, baseada na indução dos genes nod pelos
sinais da planta presentes nos seus exsudatos. Dessa forma, a identificação
19
dos indutores destes genes passou a ser obtida com a construção de
“plasmídeos repórteres”, ou seja, fragmentos de DNA da região nod são
unidos, por um processo denominado de “fusão de genes”, ao gene estrutural
lacZ (sem promotor), de E. coli. Com estas construções genéticas, a expressão
dos genes nod pode ser monitorada pela atividade da enzima
β
-galactosidase
(Innes et al., 1985; Mulligan & Long, 1985; Rossen et al., 1985; Zaat et al.,
1987b). A expressão dos operons nod induzíveis está sob o controle do
produto do gene nodD, que, na forma ativada por exsudatos liberados pelas
plantas, inicia a transcrição destes operons (Mulligan & Long, 1985; Innes et
al., 1985; Rossen et al., 1985; Zaat et al., 1987a).
As fusões entre o gene lacZ de E. coli e os genes nod de rizóbio têm
sido usadas para monitorar a atividade indutora de vários exsudatos e extratos
de plantas, uma vez que a expressão do gene nod está diretamente
relacionada à produção da enzima
β
-galactosidase, que pode ser medida
facilmente por métodos colorimétricos (Mulligan & Long, 1985; Boivin et al.,
1990; Lam et al., 1990). Assim, a expressão dos genes nod na presença de um
sinal da planta (flavonóide ou outros sinais) induz à produção da enzima β-
galactosidase, por exemplo, desenvolvendo uma coloração azul na presença
de “X-gal” (5-bromo-4-cloro-3-indolil-
β
-D-galactosida), que é substrato da
enzima (Drahos et al, 1986).
O primeiro indutor estudado foi isolado de extratos de sementes de
alfafa e identificado como um composto fenólico, uma flavona, “luteolina”,
derivada do metabolismo dos fenilpropanóides (Peters et al., 1986). Após a
identificação desse flavonóide, outros indutores presentes nas sementes e
raízes de outras leguminosas hospedeiras começaram a ser identificados
(Tabela 2). A grande maioria dos compostos investigados posteriormente foram
identificados como flavonóides, que induziram a transcrição dos genes nodABC
em estirpes de E. meliloti (Maxwell et al., 1989; Hartwing et al., 1990),
Bradyrhizobium japonicum (Kosslak et al., 1987), Ensifer fredii (Kape et al.,
1992), R. leguminosarum bv. viceae (Firmin et al., 1986; Zaat et al., 1989), R.
leguminosarum bv. phaseoli (Hungria et al., 1991a, b).
Os flavonóides pertencem a uma ampla classe de metabólitos
secundários derivados do metabolismo dos fenilpropanóides, sendo
20
distribuídos por todo o reino vegetal e sintetizados tanto na parte aérea, quanto
nas raízes. Modificações específicas na estrutura básica desses indutores
produzem diferentes classes de flavonóides incluindo chalconas, flavanonas,
flavonas, flavonóis, isoflavonas e antocianidinas (Brencic & Winans, 2005;
Hungria et al., 1991b), que são liberados pelas plantas hospedeiras. Contudo, o
espectro de flavonóides é dependente da espécie e do estágio de
desenvolvimento da planta (Brencic & Winans, 2005). Os flavonóides
exsudados por sementes e raízes de uma determinada leguminosa consistem
de uma mistura de indutores dos genes nod fracos e fortes, além de compostos
inibidores e ineficazes (Mulligan & Long, 1985; Firmin et al., 1986; Peters et al.,
1986; Redmond et al., 1986; Hartwig et al., 1989, 1990; Hungria et al., 1992).
Além disso, a exsudação radicular não é uniformemente distribuída ao longo do
eixo radicular. Os flavonóides são liberados em maior quantidade próximos às
extremidades radiculares, e concentrações ótimas ocorrem nas proximidades
da zona de emergência dos pelos radiculares, correspondente à região mais
susceptível à infecção e nodulação (Brencic & Winans, 2005). Além dos
flavonóides, alguns compostos não pertencentes à família dos flavonóides,
como estaquidrina (N-metilprolina) e trigonelina (ácido nicotínico N-
metilbetaína), foram identificados em exsudatos de sementes de alfafa como
indutores dos genes nod em E. meliloti (Phillips et al., 1992). Essas moléculas
são classificadas como compostos quaternários de amônio, sendo
coletivamente conhecidas como betaínas. Ambas, trigonelina e estaquidrina,
foram encontradas em sementes, raízes e exsudatos de raizes de várias
leguminosas, e uma concentração maior que a dos flavonóides é necessária
para indução dos genes nod (Brencic & Winans, 2005).
No caso do feijoeiro, o principal grupo de compostos indutores
liberados pelas sementes foi identificado como antocianidinas (delfinidina,
petunidina e malvidina) e flavonóis (miricetina, quercetina e canferol) (Hungria
et al., 1991a). Nos exsudatos radiculares foram identificados eriodictiol,
naringenina e genisteína como os principais indutores (Hungria et al., 1991b).
Bolanõs-Vásquez & Werner (1997) identificaram outros compostos flavonóides
indutores dos genes nod em exsudatos radiculares de feijoeiro, a chalcona
isoliquiritigenina, e a correspondente flavanona liquiritigenina.
21
Os efeitos indutores podem ser aditivos ou sinergísticos, mas os
indutores fracos em quantidade modestas podem reduzir o efeito de indutores
fortes (Hartwig et al., 1989). Os indutores potentes podem atuar em
concentrações menores que 1 mM (Göttfert, 1993). Segundo Hartwig et al.
(1989), a presença de concentrações sub-ótimas de diferentes indutores pode
resultar em um aumento sinergístico na expressão do gene. Os resultados
experimentais obtidos por estes autores demonstraram que a leguminosa
parece se beneficiar do efeito sinergístico entre indutores da semente e
indutores da raiz, criando uma zona altamente propícia à nodulação na coroa
da raiz. Do mesmo modo, foi observado um aumento na transcrição dos genes
nod de R. leguminosarum bv. phaseoli pela ação sinergística entre a malvidina,
principal indutor das sementes de feijão, e a genisteína, indutor mais potente
das raízes (Hungria et al., 1992).
Também foi observado que alguns flavonóides podem atuar como
repressores da indução do gene nod (Firmin et al., 1986; Djordjevic et al., 1987;
Peters & Long, 1988; Kosslak et al., 1990). A daidzeína e a genisteína, por
exemplo, que são fortes indutores em B. japonicum, são potentes inibidores da
expressão do gene nod em E. meliloti (Györgypal et al., 1991). Diversos
estudos mostram, ainda, que a transcrição dos genes pode ser inibida por uma
interação complexa entre os próprios indutores liberados pela planta. Djordjevic
et al. (1987), por exemplo, verificaram que um indutor forte poderia ser
atenuado por um indutor fraco do mesmo hospedeiro inoculado com R.
leguminosarum bv. trifolii. Do mesmo modo, a ação do principal indutor (metoxi-
chalcona) exsudado pelas raízes de alfafa foi diminuída por dois indutores
fracos (hidroxi-flavona e hidroxi-flavanona) liberados pelas raízes do mesmo
hospedeiro, inoculado com E. meliloti (Hartwig et al., 1989).
De uma maneira geral, a síntese e a liberação de flavonóides são
controladas, principalmente, pela planta. Contudo, as bactérias presentes na
rizosfera são capazes de influenciar a síntese e/ou exsudação de flavonóides
indutores do gene de nodulação, alterando o metabolismo da planta. Foi
demonstrado que R. leguminosarum bv. viciae (van Brussel et al., 1990), B.
japonicum (Cho & Harper, 1991) e R. leguminosarum bv. phaseoli (Dakora et
al., 1993), assim como fatores Nod purificados (Spaink et al., 1991),
aumentaram a produção de flavonóides indutores nas plantas hospedeiras.
22
Assim, tem sido sugerido que a exsudação destes indutores em resposta aos
fatores Nod poderia representar um terceiro passo da comunicação molecular
entre planta e o microrganismo (Hungria, 1994).
Resultados experimentais mostram a possibilidade de se obter
incrementos na nodulação, por exemplo, pelo fornecimento suplementar de
sinais (flavonóides), que poderiam ser adicionados aos inoculantes. Hungria &
Phillips (1993), por exemplo, observaram que entre duas linhagens de feijão
(uma parental e uma mutante isogênica para a síntese dos principais indutores
dos genes nod), a nodulação da mutante isogênica estava limitada pelo baixo
teor de indutores, recuperando a nodulação quando os flavonóides foram
adicionados às sementes. Em outro estudo, foi constatado que a adição de
flavonóides indutores às raízes de alfafa inoculada aumentou a nodulação,
mostrando que, naquelas condições, os flavonóides eram os fatores limitantes
(Kapulnik et al., 1987).
Enfim, diversos benefícios agronômicos, como o aumento significativo
da nodulação de leguminosas e da capacidade competitiva das estirpes de
rizóbio, podem ser alcançados pelo aumento quantitativo e/ou qualitativo dos
indutores exsudados pelo hospedeiro. Contudo, torna-se necessário um melhor
entendimento da troca de sinais nas interações planta-microrganismos para
otimizar a aplicação desse conhecimento; além de identificar as melhores
substâncias que podem ser utilizadas como indutoras para cada tipo de rizóbio.
23
Tabela 2. Indutores dos genes nod isolados de leguminosas. (Fonte: Hungria &
Stacey, 1997; Dakora & Phillips, 2002).
Leguminosa Flavonóide
Alfafa (Medicago sativa) 4,4'-di-hidroxi-2'-metoxichalcona
4'-7-di-hidroxiflavona
liquiritigenina
Caupi (Vigna unguiculata) daidzeína
genisteína
coumestrol
Feijoeiro (Phaseolus vulgaris) genisteína
genisteína-3'-O-glucosídeo
eriodictiol
naringenina
daidzeína
coumestrol
antocianina
Macrotilona (Macrotyloma geocarpum L.)
daidzeína
genisteína
coumestrol
Soja (Glycine max) isoliquiritigenina
genisteína
genisteína-7-O-glucosídeo
genisteína-7-O-(6''-O-malonilglucosídeo)
daidzeína
daidzeína-7-O-(6''-O-malonilglucosídeo)
Ervilhaca (Vicia sativa) 3,5,7,3'-tetra-hidroxi-4'-metoxiflavanona
7,3'-di-hidroxi-4'-metoxiflavanona
2',4',4-tri-hidroxichalcona
4',4-di-hidroxi-2'-metoxichalcona
naringenina
liquiritigenina
7,4'-di-hidroxi-3'-metoxiflavanona
5,7,4'-tri-hidroxi-3'-metoxiflavanona
5,7,3'-tri-hidroxi-4'-metoxiflavanona
Trevo branco (Trifolium repens L.) 7,4'-di-hidroxiflavona
umbelliferona
a
formononetina
a
Amendoim (Arachis hypogaea L) daidzeína
genisteína
coumestrol
Sesbânia (Sesbania rostrata) liquiritigenina
Lupinus (Lupinus albus) ácido eritrônico
ácido tetrônico
a
inibidores dos genes nod
24
1.9. Análise da expressão gênica
Durante as décadas de 80 e 90, foi investido muito tempo e esforço no
sequenciamento do genoma de diversos organismos, com o intuito de se
elucidar completamente o mecanismo de funcionamento celular a nível
molecular (Villas-Bôas & Gombert, 2006). Esta rápida e crescente
disponibilização de dados genômicos despertou grande interesse científico,
porém, o conhecimento acumulado com os sequenciamentos de genomas de
diferentes organismos demonstra que é preciso caminhar mais adiante. Na era
pós-genômica ou era pós-sequenciamento, ficou evidente que o conhecimento
das sequências completas de todos os genes de um organismo não é
suficiente para se elucidar todos os mecanismos moleculares de uma célula.
Os projetos genoma envolvem o sequenciamento dos conjuntos de genes de
um organismo inteiro ou de parte dele, não revelando, porém, dados sobre a
expressão destes genes, a quantidade expressa e o funcionamento dos seus
produtos. O fato de as células de um organismo terem o mesmo genoma, mas
apresentarem as mais variadas funções e morfologias, resultado de diferentes
composições de proteínas expressas, ilustra a importância de estudar não só a
sequência dos genes, mas também a sua expressão para podermos
compreender as suas funções biológicas. Para este tipo de estudo foram
desenvolvidas as abordagens de avaliação do genoma funcional, como a
transcriptômica e a proteômica.
A transcriptômica se baseia no estudo da expressão dos genes.
Transcriptoma é o termo dado ao conjunto de RNAs mensageiros (RNAm) que
codificam as informações que a célula precisa em um determinado momento
(Nakanishi & Nureki, 2005). Neste caso, podem-se obter informações precisas
sobre a regulação da transcrição. Porém, devido a mecanismos de regulação
pós-traducionais, a quantidade de proteína expressa não é necessariamente
proporcional à quantidade de seu RNAm correspondente (Calsa Junior et al.,
2004).
Já a proteômica é definida como a caracterização em larga escala do
conjunto de proteínas expressas por um organismo ou tecido em um
determinado momento e sob uma condição específica (James, 1997; Rocha et
al., 2005; Wilkins et al., 1997).
25
Técnicas para análise diferencial da expressão de genes utilizam como
alvo de estudo, principalmente os transcritos (moléculas de RNAm), que são
sintetizados pelo indivíduo durante determinado tratamento, em comparação
com aqueles produzidos na ausência do mesmo (Pereira, 2008).
Apesar de analisar a expressão de centenas de genes
simultaneamente, técnicas de análise da expressão gênica em larga escala
como os microarranjos de DNA, apresentam baixa sensibilidade comparativa.
Atualmente a técnica de PCR em tempo real ou PCR quantitativo (RT-qPCR)
apresenta-se como a metodologia mais precisa para quantificar níveis de
expressão de um determinado gene, oferecendo ainda dados rápidos e
reprodutíveis (Ginzinger, 2002). Em contraste com quantificações nos ciclos
finais da PCR (end points), a PCR em tempo real monitora a reação ciclo a
ciclo, associando a amplificação do alvo em cada ciclo com a emissão de uma
determinada quantidade de fluorescência. A intensidade da fluorescência
emitida é proporcional à quantidade de DNA alvo amplificado e aumenta
exponencialmente em cada ciclo de amplificação. Desse modo, é possível
monitorar a quantidade de produto gerada em cada ciclo, e durante a fase
exponencial da reação, onde a quantidade de fragmento gerado é proporcional
à quantidade inicial.
Durante a fase exponencial de amplificação é possível determinar um
valor de intensidade de fluorescência, na qual todas as amostras podem ser
comparadas. Este valor é denominado Limiar ou threshold e é calculado em
função da quantidade de fluorescência basal (background). Neste ponto, o sinal
de fluorescência gerado pela amostra é significativamente maior que a
fluorescência basal. A quantidade de ciclos de PCR requerida para que cada
amostra emita fluorescência sufuciente para alcançar este ponto é definido
cycle threshold ou Ct. O Ct é específico para cada amostra e é inversamente
proporcional à quantidade inicial do alvo presente na reação. Este valor é a
base para a quantificação baseada em PCR quantitativo (Marcelino, 2006).
A maioria dos estudos de expressão dos genes nod reportados na
literatura, os quais baseiam-se na indução desses genes pelos sinais da planta
presentes nos seus exsudatos, são obtidos através das construções de
“plasmídeos repórteres”. Essas construções genéticas permitem monitorar a
expressão dos genes nod através da atividade da enzima β-galactosidase
26
(Innes et al., 1985; Mulligan & Long, 1985; Rossen et al., 1985; Zaat et al.,
1987b).
Várias técnicas desenvolvidas nos últimos anos, na área de biologia
molecular, têm permitido a análise da expressão gênica de vários organismos
em nível global e/ou pontual, contudo, existem poucos estudos utilizando a
técnica de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) para verificar a
expressão de genes de nodulação (nod) em rizóbios. Wei et al. (2008)
verificaram o perfil de expressão global de Bradyrhizobium japonicum USDA
110 em resposta a exsudatos de sementes de soja (Glycine max) e genisteína,
através de macroarranjos de DNA. Posteriormente, doze genes
diferencialmente expressos foram, de fato, validados por RT-qPCR. Estes
estudos podem fornecer informações valiosas para a compreensão dos
mecanismos envolvidos na simbiose entre o feijoeiro comum (Phaseolus
vulgaris) e seu microssimbionte Rhizobium tropici.
27
2. Objetivo
Verificar a expressão, por RT- qPCR, dos genes de nodulação nodC e
nodG de Rhizobium tropici, estirpe PRF 81, após a indução por flavonóide
naringenina (4’,5,7-trihydroxyflavanone) e por exsudato de sementes de feijão.
3. Material e Métodos
3.1. Estirpe bacteriana
Foi utilizada a estirpe PRF 81 (= SEMIA 4080) de R. tropici,
microssimbionte do feijoeiro. A estirpe consta do banco de germoplasma de
rizóbios da Embrapa Soja (Londrina, Paraná, Brasil), onde vem sendo
estudada há vários anos. A estirpe é utilizada em inoculantes comerciais e não
oferece risco para o meio ambiente e saúde humana, encaixando-se nos
padrões de biossegurança (NB-1).
3.2. Condições de crescimento
A estirpe foi retirada do estoque a –80°C, repicada em meio de cultura
YM sólido (Vincent, 1970), com corante vermelho congo (0,025%), e crescida a
28°C por 48 h. Após, a estirpe foi inoculada em 10 mL de meio de cultura TY
líquido (Beringer, 1974), e a cultura (pré-inóculo) foi mantida sob agitação a
28°C, por aproximadamente 24 horas, até atingir a densidade óptica de 0,9 (λ =
600 nm). Posteriormente, 1 mL do pré-inóculo foi adicionado em 200 mL de
meio de cultura TY líquido, onde foi aplicado os diferentes tratamentos de
indução dos genes de nodulação (nod).
28
3.2.1. Indução dos genes de nodulação (
nod
)
3.2.2. Experimento 1:
O experimento seguiu um delineamento em blocos ao acaso com três
réplicas como blocos, sendo testados dois tipos de indutores dos genes de
nodulação (nod): o flavonóide naringenina (4’,5,7-trihydroxyflavanone, Sigma)
na concentração final de 1,5 µM, e exsudato de sementes de feijão, preparado
conforme descrito por Hungria et al., (1991b), também na concentração final de
1,5 µM dos flavonóides presentes, preparado conforme descrito no item 3.3.
Cada tratamento foi comparado com seu respectivo controle, metanol ou água,
que foram utilizados como calibradores nas análises de expressão gênica.
Neste experimento, a naringenina ou metanol e exsudato ou água
foram adicionados simultaneamente ao pré-inoculo no meio de cultura,
permanecendo por 48 h sob agitação, a 28°C. A seguir, procedeu-se à
extração de RNA. Os ensaios foram realizados em triplicata.
3.2.3. Experimento 2
:
O experimento seguiu um delineamento em blocos ao acaso com três
réplicas como blocos, em uma estrutura fatorial, com dois fatores: tipo de
indutor dos genes nod [o flavonóide naringenina (4’,5,7-trihydroxyflavanone,
Sigma) ou exsudato de sementes de feijão, preparado conforme descrito por
Hungria et al. (1991b), ambos na concentração final de 1,5
µ
M)], e tempos de
indução [T
5
(5 min), T
15
(15 min), T
1
(1 h), T
4
(4 h) e T
8
(8 h)].
Neste experimento, o processo de indução dos genes de nodulação
(nod) ocorreu após as células bacterianas atingirem a fase exponencial de
crescimento (após atingirem uma OD
600
de 0,4 – 0,6). Em seguida, procedeu-
se a extração de RNA. Cada tratamento foi comparado com seu respectivo
controle, metanol ou água, que foram utilizados como calibradores nas análises
de expressão gênica. Todos os ensaios foram realizados em triplicata, com
exceção para os tratamentos de 15 min e 1 h de indução, os quais foram
conduzidos apenas uma repetição biológica, e em duplicata na placa.
29
3.3. Preparo do flavonóide e do exsudato de sementes de feijão:
Foi preparado uma solução estoque de naringenina à 1000 µM (em
metanol), sendo utilizado um volume de 300 µL desse estoque nos ensaios
acima citados (para 200 mL de meio de cultura TY líquido), logo a
concentração final de 1,5 µM. O mesmo volume de metanol foi utilizado no
meio como controle para o tratamento com naringenina.
O exsudato de sementes de feijão foi preparado conforme descrito por
Hungria et al. (1991b). A concentração do flavonóide foi determinada
espectrofotometricamente, no comprimento de onda 289 nm e usando o
coeficiente de extinção molar (log ∈) 4.23 (Hungria et al., (1991b). Um volume
de 160 µL de exsudato de sementes de feijão foi, então, utilizado nos ensaios
acima citados (para 200 mL de meio de cultura TY líquido), logo a
concentração final de 1,5 µM. O mesmo volume de água foi utilizado no meio
como controle para o tratamento com exsudato.
3.4. Extração e quantificação de RNA total
O RNA total das bactérias foi extraído pelo método descrito por Farrel
(1998), com algumas modificações. Após o período de crescimento, procedeu-
se à centrifugação das culturas a 10,000 g por 10 min e a 4°C e à
ressuspensão do precipitado celular em 3 mL de tampão de lise NP-40
(solução de sacarose 250 mM; 20 mM EDTA; 0,75% de NP-40 Nonidet P40,
detergente não-iônico) e 4 mL de tampão de acetato de potássio ( 3 M KCH
3
O
2
pH 5,5; 10 g de tiocianato de guanidina). A suspensão celular foi, então,
incubada no gelo por 10 min e após esse período, centrifugada a 10,000 g por
10 min a 4°C. O sobrenadante foi transferido cuidadosamente para um tubo
estéril, com o cuidado de não transferir nenhum precipitado sólido, e incubado
no gelo por 15 min, sendo centrifugado novamente, em seguida, a 10,000 g por
10 min a 4°C. Novamente, o sobrenadante foi transferido para outro tubo estéril
e a este foi adicionado um volume igual de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1),
sendo homogeneizado gentilmente. A seguir, a mistura foi, então, centrifugada
por 3 min a 10,000 g a 4°C. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e
30
adicionou-se 0,6 do volume de isopropanol gelado. Após gentil
homogeneização, a mistura foi incubada a –20°C por 1 hora. Após esse
período, o RNA foi coletado por centrifugação a 10,000 g por 10 min a 4°C. O
isopropanol foi removido e o pellet de RNA foi lavado duas vezes com etanol
70%, seguido por centrifugação a 10,000 g por 5 min a 4°C. O etanol 70% foi,
então, removido e o RNA, seco em estufa a 37°C. O RNA foi ressuspenso em
200 µL de água livre de RNAse tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) e
estocado a –80°C.
O RNA extraído foi quantificado usando micro-espectrofotômetro
(Nanodrop
Spectrophotometer ND-1000, Unisciense), com leituras nos
comprimentos de onda de 260 e 280 nm, utilizando água DEPC como controle
(branco). O DNA foi removido com a DNAse [RNAse free DNAse Set (50),
Qiagen], conforme as recomendações do fabricante, no qual 2 U de DNAse
foram utilizadas para cada 1000 ng de RNA. A reação foi incubada a 37°C por
10 min, sendo interrompida por choque térmico a 60°C por 5 min. O RNA foi
quantificado novamente, sendo utilizado, para a síntese da primeira fita de
cDNA, aquele com relação à 260/280 entre 1,9 - 2,0, o que garante, juntamente
com o perfil do gráfico, RNA íntegro e de boa qualidade.
Para cada reação de síntese da primeira fita de cDNA foi utilizado 1,0
µg de RNA utilizando o kit TaqMan
Reverse Transcription Reagents (Applied
Biossystems), de acordo com as especificações do fabricante (Sybr
Green
PCR Master Mix and RT-PCR Protocol, Applied Biossystems). A cada reação
foram, então, adicionados: 10
µ
L de TaqMan RT Buffer 10x; 22
µ
L de MgCl
2
(25 mM); 20
µ
L de dNTP’s (2,5 mM); 5
µ
L de primer randômico (50
µ
M); 2
µ
L
de inibidor da RNAse (20 U/L); 2,5 µL de enzima transcriptase reversa (50
U/µL) e água livre de RNAse suficiente para um volume final de 100 µL de
reação. As reações foram incubadas em termociclador por 10 min a 25°C,
seguidos por 30 min a 48°C e 5 min a 95°C. O cDNA foi armazenado a – 80°C.
31
3.5. Desenho dos Primers para RT-qPCR
Os primers para amplificação dos genes foram desenhados com base
no genoma parcial de R. tropici PRF 81 (Pinto et al., 2009), utilizando o
software Primer Express versão 3.0 (Applied Biossystems, Foster, CA, USA).
Foram obtidos amplicons de tamanhos entre 50 e 150 pares de bases para os
genes alvos nodC e nodG, e o gene que codifica para a sub-unidade 16S, que
foi utilizado como normalizador. As sequências dos pares de primers
desenhados para cada gene são mostradas na Tabela 3.
Tabela 3.
Sequências dos primers utilizados para RT-qPCR
Gene Sequência do primer Amplicon
F 5' CAAGCTGCGCCCTTATCTG 3’
nodC
R 5' CAAGCAACGTGTCACGGAAA 3’
68 bp
F 5' GAGCTGACCCATCCGATGA 3’
nodG
R 5' CGACGACCGAGGTGATGTT 3’
64 bp
F 5' CAAGGCGACGATCCATAGCT 3’
16S
R 5' AGGAGTTTGGGCCGTGTCT 3’
72 bp
3.6. PCR quantitativo em tempo real
Para as reações de RT-qPCR foi utilizado o kit SYBR
Green PCR
Master Mix (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), conforme recomendações
do fabricante. As reações foram realizadas
no termociclador ABI PRISM
7500
Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA).
Curvas de eficiência de amplificação para cada par de primers dos
genes estudados e para o par de primers do gene normalizador foram
realizadas a partir de uma série de diluições do cDNA (de 10 a 10
-10
), sendo
testadas diferentes concentrações de primers. Os valores de Ct (cycle
threshold) obtidos em cada diluição foram plotados em função do logaritmo das
diluições, e o índice de inclinação da reta foi utilizado para calcular a eficiência
de cada sistema, de acordo com a fórmula E=[10
-1/slope
]-1. Os parâmetros de
ciclagem utilizados para as reações foram: 50°C por 2 min, 95°C por 10 min,
seguidos de 45 ciclos de 95°C por 15 seg, 62°C por 1 min, sendo os dados
coletados neste último passo.
32
A concentração de primer com melhor desempenho na curva de
eficiência foi escolhida para ser utilizada na etapa de quantificação relativa. As
reações de PCR foram realizadas em triplicatas, constituindo-se de 12,5 µL de
SYBR Green PCR Master Mix 2x (AmpliTaqGold
DNA polimerase; dNTPs
com dUTP; referência passiva ROX; fluoróforo Syber Green); 2,0 µL de cDNA;
1,0 µL ( 0,4 µM) de cada primer F e R para o gene normalizador 16S; 0,8 µL
(0,32 µM) de cada primer F e R para os genes alvo nodC e nodG, sendo
completado com água livre de RNAse para um volume final de 25 µL. Os
parâmetros de ciclagem para as reações de amplificação foram 50°C por 2 min;
95°C por 10 min; seguidos de 45 ciclos de 95°C por 2 min, 62°C por 1 min,
sendo os dados coletados na última etapa. Após o término da quantificação
relativa, a fim de verificar a formação de dímeros de primers, amplificações
inespecíficas e contaminações, realizou-se a curva de dissociação.
3.7. Análise estatística
O nível de expressão gênica diferencial (RQ) foi calculado aplicando-se
o método 2
-∆∆Ct
(Livak and Schmittgen, 2001). Os valores médios de Ct dos
genes alvos e da referência endógena (normalizador) foram calculados.
Posteriormente, através da subtração do Ct do gene alvo com o Ct do
normalizador foi obtido o ∆Ct. Este valor de ∆Ct do gene alvo é subtraído do
valor de ∆Ct da amostra controle (calibrador – controle não tratado), resultando
num valor de ∆∆Ct. O valor de RQ foi determinado pela fórmula 1,95
-
∆∆
Ct
,
ajustada pelas eficiências obtidas entre o gene alvo e normalizador.
A partir dos valores de RQ obtidos em cada corrida foram calculados
os valores de RQ geral, desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV %).
Cada amostra biológica (3 repetições biológicas) foi quantificada em
triplicata dentro da placa, totalizando 9 pontos de coleta de dados para cada
gene e tratamento em estudo, exceto para os tempos de 15 min e 1h, para os
quais foi obtida apenas uma amostra biológica.
A análise dos dados foi feita por estatística descritiva. A
reprodutibilidade e precisão dos valores de RQ obtidos foram estimados pelos
desvios padrão (SD) e coeficiente de variação (CV %) em cada corrida e entre
33
as corridas. Também foi utilizado o programa REST 2008 (Relative Expression
Software Tool), versão 2.0.7 (Pfaffl et al., 2002; http://www.gene-
quantification.info), o qual compara dois grupos, com até 16 dados (valores) de
Ct por grupo (gene alvo, versus o grupo controle) normalizados pelo gene
referência. O programa testa as diferenças para significância através de um
teste de randomização (no mínimo 2000 randomizações), baseado em
iterações. São apresentados se os genes, em comparação com os respectivos
controles, são super (UP) ou “pouco” (DOWN) expressos (regulados), quando a
diferença entre os níveis de expressão entre o tratamento e o controle é
significativa. A hipótese H
0
correponde a todos os possíveis contrastantes entre
médias serem estatisticamente nulos, ao nível de 5% de probabilidade.
O objetivo do REST, portanto, é determinar se existe diferença
significativa entre amostras e controles, normalizados pelo gene referência.
P(H1) representa a probabilidade da hipótese que a diferença entre a amostra
e o controle seja devido ao acaso.
34
4. Resultados
4.1. Avaliação da expressão dos genes
nodC
e
nodG
em
Rhizobium
tropici PRF 81 durante a indução por naringenina e exsudato de sementes
de feijão
A expressão dos genes nodC e nodG de R. tropici PRF 81, induzidos
com exsudatos de sementes de feijão e naringenina, foi monitorada em
diferentes tempos de indução; após 48 h de crescimento desde a adição do
pré-inóculo e flavonóides ao meio de cultura, bem como à partir da fase log nos
tempos de 5 min, 15 min, 1 h, 4 h e 8 h de indução.
Os resultados médios de quantificação relativa (RQ) dos genes nodC e
nodG, tratados com exsudato de sementes de feijão e naringenina, em todos
os tempos de tratamento de indução, podem ser visualizados nas tabelas 4 e 5.
Os desvios dos valores de ∆Ct, dentro de cada corrida, não superaram
2,9, demostrando alta precisão da quantificação. Entre as diferentes corridas os
maiores valores de SD e CV (%) foram observados nos tratamentos onde
foram obtidos os menores valores de RQ. Os menores valores de RQ são
determinados em função de valores de Cts obtidos em ciclos finais da reação,
de modo que tal variação é esperada.
Os maiores níveis de expressão gênica foram observados nos tempos
de 5 min de indução com o tratamento exsudato de sementes de feijão, para
ambos os genes avaliados.
35
Tabela 4: Estatística descritiva baseada nos níveis de expressão dos genes
nodC e nodG tratados com exsudato de sementes de feijão em todos os
tempos de indução. Cada amostra foi amplificada em triplicata à partir de 3
repetições biológicas independentes.
Gene / Tratamento
Tempo Indução
Repetição Biológica
delta Ct
1
SD delta Ct
2
RQ
3
RQ Geral
4
SD Geral
5
CV (%)
6
1 10,744 0,537 159,8615596
2 * 13,168 0,357 13,6117899
5 min
3 12,069 0,093 84,0770193
121,97 53,59 43,94
1 21,246 1,998 0,246074876
2 - - -
15 min
3 - - -
-
-
-
1 18,743 0,509 0,687525513
2 - - -
1 hora
3 - - -
-
-
-
1 23,402 1,399 1,41035319
2 24,495 0,384 1,78983002
4 horas
3 * 23,723 0,921 4,50011208
1,60 0,27 16,77
1 23,661 1,609 0,34842064
2 -
-
dados perdidos
8 horas
3 25,277 2,702 0,267616778
0,31 0,06 18,55
1 17,606 0,443 1,89876668
2 17,653 0,374 1,71172280
3 17,601 0,185 1,61247159
nodC / exsudato
48 horas
4 ** 7,177 0,272 2,29529924
1,88 0,30 16,04
1 * 8,346 0,603 49,30130460
2 11,428 0,487 13,33261599
5 min
3 10,439 0,253 16,38066473
14,86 2,16 14,51
1 18,117 0,118 0,360660679
2 - - -
15 min
3 - - -
-
-
-
1 16,994 0,147 1,150849447
2 - - -
1 hora
3 - - -
-
-
-
1 18,280 0,164 0,28793819
2 18,029 0,338 0,40158970
4 horas
3 19,966 0,073 0,90435814
0,53 0,33 61,74
1 16,962 0,103 1,20832357
2 19,676 0,540 1,16336896
8 horas
3 10,529 0,264 0,89933814
1,09 0,17 15,31
1 14,942 0,219 1,43131610
2 17,304 0,156 1,58963709
nodG / exsudato
48 horas
3 19,254 0,136 1,19363803
1,40 0,20 14,19
1
delta Ct, Ct do gene alvo subtraído do Ct do normalizador;
2
SD delta Ct, desvio padrão dos valores de delta Ct;
3
RQ,
quantificação relativa;
4
RQ Geral, média da quantificação relativa das repetições biológicas;
5
SD Geral, desvio padrão
dos RQs entre as repetições e
6
CV (%), coeficiente de variação. * Amostras excluídas de modo a diminuir os SD e CV
(%). ** Repetição em placa. - dados não avaliados.
36
Tabela 5: Estatística descritiva baseada nos níveis de expressão dos genes
nodC e nodG tratados com naringenina (1,5
µ
M) em todos os tempos de
indução. Cada amostra foi amplificada em triplicata à partir de 3 repetições
biológicas independentes.
Gene / Tratamento
Tempo Indução
Repetição Biológica
delta Ct
1
SD delta Ct
2
RQ
3
RQ Geral
4
SD Geral
5
CV (%)
6
1 15,580 0,061 0,59661291
2 17,142 0,426 0,37347262
5 min
3 17,948 0,053 0,47169908
0,48 0,11 23,27
1 20,984 0,305 0,96107557
2 - - -
15 min
3 - - -
-
-
-
1 20,728 1,563 0,20551806
2 - - -
1 hora
3 - - -
-
-
-
1 11,504 0,890 0,25506424
2 27,614 0,149 0,27378295
4 horas
3 25,774 2,531 0,34028428
0,29 0,04 15,46
1 22,345 1,337 1,76448392
2 24,962 2,905 2,18842105
8 horas
3 10,519 0,294 1,72709757
1,89 0,26 13,53
1 18,092 1,142 1,04017531
2 16,829 0,154 0,68894867
3 16,581 0,164 0,79000999
nodC / naringenina
48 horas
4 ** 6,954 0,048 0,82483165
0,84 0,15 17,68
1 12,758 0,121 0,54777955
2 7,910 0,192 1,31163739
5 min
3 15,791 0,239 1,97783376
1,64 0,47 28,64
1 18,184 0,381 1,24976588
2 - - -
15 min
3 - - -
-
-
-
1 17,532 0,323 0,45315102
2 -
-
-
1 hora
3 -
-
-
-
-
-
1 16,381 0,201 0,77106156
2 19,273 0,236 0,50074440
3 19,458 0,156 1,38786558
4 horas
4 ** 9,413 0,091 0,57451919
0,81 0,40 49,81
1 16,782 0,159 0,85914989
2 18,389 0,193 2,81292656
3 19,944 0,125 1,16933982
8 horas
4 ** 9,305 0,162 1,41324098
1,56 0,86 55,20
1 15,284 0,137 1,75081039
2 17,311 0,186 0,85430444
3 18,395 0,069 1,56362659
nodG / naringenina
48 horas
4 ** 8,797 0,329 1,65281757
1,46 0,47 32,49
1
delta Ct, Ct do gene alvo subtraído do Ct do normalizador;
2
SD delta Ct, desvio padrão dos valores de delta Ct;
3
RQ,
quantificação relativa;
4
RQ Geral, média da quantificação relativa das repetições biológicas;
5
SD Geral, desvio padrão
dos RQs entre as repetições e
6
CV (%), coeficiente de variação. ** Repetição em placa. - dados não avaliados.
37
De acordo com os resultados, os genes nodC e nodG, induzidos
durante 48 h na presença de exsudato de sementes de feijão apresentaram
níveis de expressão gênica superiores ao controle, água (Figura 3), porém, de
acordo com os resultados do programa REST, não houve expressão gênica
diferencial desses genes, neste tratamento, comparados com o respectivo
controle (p>0,05) (Tabela 6). Quando submetidos ao tratamento com
naringenina, apenas o gene nodG apresentou nível de expressão gênica
superior ao controle, metanol (Figura 3). Do mesmo modo, após análise REST,
nenhum nível de expressão gênica diferencial foi detectado para esse gene,
neste tratamento, em relação ao controle metanol (p>0,05) (Tabela 6).
Figura 3:
Níveis de expressão dos genes nodC e nodG, obtidos por RT-qPCR, em Rhizobium
tropici PRF 81, submetidos ao tratamento de indução com naringenina e exsudato de sementes
de feijão durante 48 h de indução, comparados com os respectivos controles (metanol e água;
utilizados como calibradores na RT-qPCR). Os valores foram normalizados pela expressão do
gene referência 16S. Os traços verticais sobre as barras correspondem ao desvio padrão.
38
De acordo com a análise estatística, foi possível constatar expressão
gênica diferencial do gene nodC, quando tratado com exsudato de sementes
de feijão, apenas no tempo de 5 min. Pela análise REST verificou-se que o
gene nodC foi super (UP) expresso 130,122 vezes na presença do exsudato
em comparação com o controle água (p=0,001). O gene nodG apresentou um
perfil de expressão similar ao nodC na presença do exsudato, sendo
diferencialmente expresso após 5 min de indução, pela análise REST. Em 5
min de indução, o gene nodG atingiu níveis de expressão 16,785 vezes
superior ao controle (p=0,001) (Tabela 6). Após 5 min foi possível observar
uma queda brusca nos níveis de expressão de ambos os genes, nodC e nodG,
sendo que o tempo avaliado imediatamente após o pico de indução foi onde se
observaram os menores níveis de expressão desses genes para o tratamento
com exsudato. Contudo, após essa queda os níveis de expressão do gene
nodC permaneceram similares ao controle (não diferencialmente expresso) em
todos os demais tempos avaliados. Já o gene nodG voltou a apresentar um
aumento no nível de expressão após 1 h de indução, retornando, após esse
tempo, a níveis similares ao controle (Figuras 4 e 5). Após 1 h de indução, o
gene nodG atingiu um nível de 1,156 vezes superior ao controle (p=0,000)
(Tabela 6).
Quando tratado com naringenina, o gene nodC apresentou expressão
gênica superior ao controle (metanol) apenas no tratamento de 8 h de indução
(Figura 6), contudo, de acordo com os resultados do REST, não houve
expressão gênica diferencial do gene nodC em relação ao controle neste
tratamento e tempo (Tabela 6).
Já o gene nodG, quando tratado com naringenina apresentou
expressão gênica superior ao controle nos tempos de 5 min, 15 min e 8 h
(Figura 7), embora, também de acordo com os resultados do REST, o gene
nodG também não apresentou expressão gênica diferencial em relação ao
controle neste tratamento, em nenhum dos tempos de indução (Tabela 6).
Em ambos os genes foi detectado, pela análise estatística, diferença
significativa de inibição da expressão (DOWN) nos tempos de 15 min para o
nodG tratado com exsudato e, 5 min e 1 h para o nodC tratado com
naringenina (Tabela 6 ).
39
nodC
induzido com exsudato
1,00
0,25
0,69 1,60
0,31
121,97
0
50
100
150
200
controle 5 min 15 min 1 h 4 h 8 h
Figura 4:
Níveis de expressão do gene nodC, obtidos por RT-qPCR, em Rhizobium tropici PRF
81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de sementes de feijão nos tempos de: 5
min, 15 min, 1 h, 4 h e 8 h, comparados com o controle, água, utilizado como calibrador na RT-
qPCR. Os valores foram normalizados pela expressão do gene referência 16S. Os traços
verticais sobre as barras correspondem ao desvio padrão.
nodG
induzido com exsudato
1,00
0,36
1,15
0,53
1,09
14,86
0
5
10
15
20
controle 5 min 15 min 1 h 4 h 8 h
Figura 5:
Níveis de expressão do gene nodG, obtidos por RT-qPCR, em Rhizobium tropici PRF
81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de sementes de feijão nos tempos de: 5
min, 15 min, 1 h, 4 h e 8 h, comparados com o controle, água, utilizado como calibrador na RT-
qPCR. Os valores foram normalizados pela expressão do gene referência 16S. Os traços
verticais sobre as barras correspondem ao desvio padrão.
40
Tabela 6.
Análise estatística dos resultados de expressão relativa, pelo programa REST 2008 (versão 2.0.7), dos genes nodC e nodG submetidos ao
tratamento com exsudato de sementes de feijão e naringenina, em todos os tempos de tratamento, normalizados pelo gene referência rRNA 16S.
Tratamento Gene Tempo Eficiência da reação Expressão Erro padrão I.C 95% P(H1) Resultado
16S 1,0 1,000
5 min 0,95 130,122 72,024 - 238,501 62,416 - 543,404 0,001 UP
15 min 0,95
0,237 0,062 - 0,945 0,052 - 1,096 0,494
1 h 0,95
0,689 0,526 - 0,966 0,417 - 1,163 0,352
4 h 0,95
1,535 0,428 - 4,893 0,176 - 13,893 0,429
8 h 0,95
0,305 0,049 - 1,536 0,011 - 3,914 0,146
nodC
48 h 0,95
1,836 0,537-8,634 0,001-3.392,584 0,589
5 min 0,95
16,785 8,179 - 29,436 6,383 - 42,084 0,001
UP
15 min 0,95
0,350 0,318 - 0,387 0,301 - 0,407 0,000
DOWN
1 h 0,95
1,156 1,068 - 1,251 1,062 - 1,258 0,000
UP
4 h 0,95
0,462 0,109 - 2,821 0,076 - 3,869 0,118
8 h 0,95
1,102 0,011 - 99,274 0,001 - 705,894 0,887
Exsudato
nodG
48 h 0,95
1,397 0,253 - 8,104 0,065 - 28,519 0,561
16S 1,0 1,000
5 min 0,95
0,454 0,139 - 1,273 0,056 - 2,560 0,044 DOWN
15 min 0,95
0,962 0,770 - 1,213 0,707 - 1,312 0,834
1 h 0,95
0,204 0,071 - 0,611 0,060 - 0,700 0,000 DOWN
4 h 0,95
0,288 0,000-2.224,787 0,000-25.679,304 0,619
8 h 0,95
1,900 0,001-3.040,340 0,000-123.731,160 0,745
nodC
48 h 0,95
0,829 0,126 - 7,949 0,000 - 1.478,306 0,802
5 min 0,95
1,120 0,043 - 23,345 0,006 - 663,596 0,899
15 min 0,95
1,248 0,923 - 1,769 0,760 - 2,076 0,344
1 h 0,95
0,451 0,383 - 0,538 0,348 - 0,586 0,317
4 h 0,95
0,752 0,062-14,908 0,001-1.448,987 0,799
8 h 0,95
1,429 0,077 - 13,686 0,001 - 1.867,791 0,735
Naringenina
nodG
48 h 0,95
1,386 0,176 - 13,883 0,002 - 984,681 0,716
41
nodC
induzido com naringenina
1,00
1,89
0,29
0,21
0,96
0,48
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
controle 5 min 15 min 1 h 4 h 8 h
Figura 6:
Níveis de expressão do gene nodC, obtidos por RT-qPCR, em Rhizobium tropici PRF
81, submetido ao tratamento de indução com naringenina (1,5
µ
M) nos tempos de: 5 min, 15
min, 1 h, 4 h e 8h , comparados com o controle, metanol, utilizado como calibrador na RT-
qPCR . Os valores foram normalizados pela expressão do gene referência 16S. Os traços
verticais sobre as barras correspondem ao desvio padrão.
nodG
induzido com naringenina
1,00
1,56
0,81
0,45
1,64
1,25
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
controle 5 min 15 min 1 h 4 h 8 h
Figura 7: Níveis de expressão do gene nodG, obtidos por RT-qPCR, em Rhizobium tropici PRF
81, submetido ao tratamento de indução com naringenina (1,5 µM) nos tempos de: 5 min, 15
min, 1 h, 4 h e 8h , comparados com o controle, metanol, utilizado como calibrador na RT-
qPCR. Os valores foram normalizados pela expressão do gene referência 16S. Os traços
verticais sobre as barras correspondem ao desvio padrão.
42
5. Discussões
A etapa inicial da simbiose rizóbio-leguminosa envolve a secreção de
compostos fenólicos pela planta, especialmente flavonóides que irão conduzir à
expressão dos genes nod no rizóbio e, por conseguinte, a síntese dos fatores
Nod, os quais especificamente engatilham várias respostas na planta para a
formação dos nódulos fixadores de N
2
(Brencic & Winans, 2005; Hungria et al.,
1997; Lang et al., 2008).
Os fatores Nod produzidos pelos rizóbios, em resposta a compostos
exsudados pela planta hospedeira, são moléculas chave no estabelecimento
da simbiose e, embora o feijoeiro seja considerado uma planta promíscua, por
ser capaz de reconhecer uma ampla gama de fatores Nod, existe uma
hierarquia de preferência, onde a acetil-fucose no extremo redutor é preferida
sobre as demais modificações (Laeremans & Vanderleyden, 1998). A função
dos genes nod ainda não está bem estabelecida em R. tropici PRF 81,
necessitando de mais estudos. Porém, se esses genes estão sendo expressos,
eles podem ter sim algum papel importante na nodulação do feijoeiro.
O gene nodC, presente na maioria dos rizóbios estudados até o
presente momento, é responsável pela biossíntese da estrutura básica do fator
Nod; além disso, ele não é expresso constitutivamente, sendo necessária a
indução (Angelini et al., 2003; Mulligan & Long, 1985). Mais especificamente, o
gene nodC é responsável pelo controle da etapa de elongação da cadeia
principal oligossacarídica dos fatores Nod (Kamst et al., 1997). Já o gene nodG
é um gene envolvido na nodulação de um hospedeiro específico (hsn), sendo
responsável pela modificação no esqueleto oligossacarídico do fator Nod
(López-Lara & Geiger, 2001). Não existem estudos sobre a expressão desse
gene “in vivo”, ou seja, no próprio rizóbio, mas sabe-se que a proteína
produzida por tal possui homologia com proteínas carregadoras do grupo acil
(López-Lara & Geiger, 2001). Este estudo apresenta, portanto, pela primeira
vez, a resposta “in vivo” de R. tropici a flavonóides de sua planta hospedeira,
através da técnica de RT-qPCR.
Mulligan & Long (1985), utilizando plasmídeos repórteres verificaram a
expressão do gene nodC de Ensifer meliloti 1021 em resposta aos exsudatos
de sua planta hospedeira Medicago sativa. A exposição do nodC-lacZ aos
43
exsudatos resultou em uma indução de 30 vezes da atividade da β-
galactosidase. Wei et al. (2008) verificaram a expressão da ilha simbiótica de
Bradyrhizobium japonicum USDA 110 em resposta a exsudatos de semente de
soja (Glycine max) e genisteína (o principal indutor liberado por sementes de
soja para a indução dos genes nod de B. japonicum). Contudo, os níveis de
expressão obtidos foram muito mais intensos para o tratamento com o
exsudato. De modo similar, neste trabalho foi possível reportar aumento da
expressão em até 130,122 e 16,78 vezes dos genes nodC e nodG,
respectivamente, após a indução com exsudato de sementes de feijão,
confirmando mecanismos de indução similares em R. tropici.
Devido à elevada sensibilidade da metodologia e dos vários fatores que
podem interferir nos valores de Ct obtidos, relacionados à eficiência de
amplificação, esperam-se valores elevados de SD e CV (%) para as análises
de RT-qPCR. No caso de análise de quantificação de organismos
geneticamente modificados (OGMs), por exemplo, valores de CV (%) variando
de 20% a 35% são descritos com alta freqüência (Taverniers et al., 2004).
Deste modo, embora tenham-se observado valores de SD e CV (%) elevados
para os valores de RQ dos genes nodC e nodG, no tempo de 5 min no
tratamento com exsudato, em todas as repetições biológicas, os valores de RQ
na presença do indutor sempre foram superiores ao calibrador (água),
confirmando a ativação dos mesmos pelo tratamento.
Angelini et al. (2003) também verificaram expressão do gene nodC na
presença dos seguintes flavonóides: apigenina, crisina, daidzeína, genisteína,
luteolina e naringenina. Cada flavonóide foi utilizado na concentração final de
3,7 µM, um valor elevado em relação à concentração da naringenina utilizada
neste trabalho (1,5 µM). Já em outro estudo, naringenina na concentração de
0,5 µM foi utilizada como indutor dos genes nodABC em Rhizobium
leguminosarum bv. viciae estirpe D923, microssimbionte de ervilha (Pisum
sativum L. cv. Bohatyr), avaliação essa que também foi conduzida utilizando
plasmídeos repórteres, com base na atividade da β-galactosidase (Tsvetkova
et al., 2006). Através de construções “in vitro”, com o uso de vetores de
expressão e os genes fabG de R. leguminosarum LPR5045 e nodG de
Rhizobium sp. N33, López-Lara & Geiger (2001) induziram a expressão das
44
proteínas, FabG e NodG com naringenina na concentração final de 1,5 µM.
Contudo, não foi possível constatar expressão gênica diferencial dos genes
nodC e nodG, neste trabalho, mediante o tratamento com naringenina.
Considerando a elevada sensibilidade da técnica de RT-qPCR, uma explicação
para o fato de não ter sido detectado alteração nos níveis de expressão dos
genes nod em R. tropici PRF 81, na presença de tal flavonóide, pode ser a
concentração utilizada. Até o momento não há nenhum trabalho reportando tal
efeito da dose do flavonóide na expressão dos genes nod nesta bactéria.
Ensaios futuros com doses superiores de naringenina, bem como outros
flavonóides, devem ser testados, pois a concentração de indutor necessária
para que ocorra a indução dos genes nod em cada rizóbio é variável. Além
disso, Begum et al. (2001) verificaram, também com base na atividade da β-
galactosidase, que a combinação de naringenina 3 µM e hesperetina 7 µM
resultou em melhor indução dos genes nod de R. leguminosarum
(microssimbionte de ervilha, Pisum sativum L. e lentilha, Lens culinaris L.),
comparado com naringenina e hesperetina sozinhos. Efeitos semelhantes na
indução dos genes nod de R. leguminosarum bv. phaseoli foram descritas para
os flavonóides eriodictiol e naringenina em combinação com genisteína
(Hungria et al., 1992). Neste estudo, ficou evidente que o tratamento com
naringenina a 1,5 µM não foi suficiente na indução dos genes nodC e nodG de
R. tropici PRF 81 em nenhum dos tempos aplicados, baseado na análise
estatística. Contudo, vale ressaltar que níveis de expressão máxima foram
observados na presença desse flavonóide somente após 8 h de incubação
para os dois genes. Apesar de não possuírem expressão estatisticamente
diferentes em relação aos controles, biologicamente podem sim estarem
desempenhando papel significativo. Talvez uma combinação com outro
flavonóide tornasse mais eficiente o processo de indução ou, então, um
aumento na concentração da naringenina poderia ser suficiente para alcançar
um nível de expressão satisfatório. Também, em decorrência da concentração
utilizada, um tempo maior de indução poderia ser conveniente para verificar tal
processo, não avaliados neste trabalho. Contudo, uma imediata indução dos
genes nod é considerada essencial para o início do processo de infecção pelo
rizóbio.
45
No presente trabalho, foi comprovado que os genes nodC e nodG são
funcionais em R. tropici PRF 81, sendo expressos na presença do indutor.
Porém, tal expressão foi detectada como diferencial apenas com exsudato de
sementes de feijão, no tratamento de 5 min de indução e o perfil de expressão
de ambos genes foi muito semelhante. O fato de ter sido detectado apenas no
tempo de 5 min pode ser explicado em decorrência de que em procariotos,
mRNAs são transcritos e traduzidos em um único compartimento celular, e os
dois processos estão estreitamente ligados, ocorrendo quase que
simultaneamente. Além disso, mRNAs procarióticos são moléculas muito
instáveis, possuem uma meia-vida de somente poucos minutos (em média,
aproximadamente dois minutos), sendo traduzidos em proteínas antes mesmo
que o processo de transcrição termine (Zaha et al., 2003; Lewin, 2004); e o
processo de degradação do mRNA é iniciado tão logo termina a sua tradução.
Desse modo, portanto, o rizóbio, ao entrar em contato com o exsudato,
rapidamente sintetiza as proteínas envolvidas na síntese do fator Nod.
Ademais, a queda brusca observada nos níveis após o pico máximo de
expressão é coerente caso esteja ocorrendo um feedback negativo na síntese
de tais fatores. Após atingir elevados níveis e suprir a quantidade suficiente das
proteínas relacionadas à síntese do fator Nod, espera-se um controle para
cessar a síntese de mRNA, uma vez que tal molécula começa a ser traduzida
nas diferentes proteínas antes mesmo do processo de transcrição terminar
(Zaha, 2003; Lewin, 2004). No entanto, tal resultado de feedback negativo não
foi reportado até o momento na literatura, uma vez que os flavonóides são tidos
como indutores da nodulação. Vale ressaltar que, os exsudatos são compostos
por uma combinação de indutores fortes e fracos (Mulligan & Long, 1985;
Firmin et al., 1986; Peters et al., 1986; Redmond et al., 1986; Hartwig et al.,
1989, 1990; Hungria et al., 1992), os quais podem estar atuando de maneira
sinérgica ativando com maior intensidade a expressão dos genes nod após 5
min de indução; além disso, como os níveis alcançaram um pico bastante
elevado é coerente observar tal feedback negativo para a interrupção da
síntese das proteínas de nodulação após esse tempo, sendo evidenciado pela
inibição da expressão (DOWN) para o gene nodG no tempo de 15 min, o qual
retoma a um nível basal de expressão nos demais tempos avaliados. Segundo
Hartwig et al. (1989), a presença de concentrações sub-ótimas de diferentes
46
indutores podem resultar em um aumento sinergístico na expressão do gene.
Embora, existam relatos de que a transcrição dos genes nod pode ser inibida
por uma interação complexa entre os próprios indutores liberados pela planta
(Mercante et al., 2002), nesse estudo foi evidenciado uma forte indução dos
genes quando tratados com exsudatos de sementes de feijão. Vale ressaltar,
também, que a composição dos flavonóides exsudados pela raiz difere
daqueles exsudados pelas sementes, o que pode indicar que os genes nodC e
nodG respondem mais rapidamente quando em contato com os indutores da
semente. Análises cromatográficas por HPLC (cromatografia líquida de alta
eficiência) demonstraram que a maioria dos exsudatos de raizes e sementes
de leguminosas contêm um número variável de indutores, por exemplo, no
caso dos exsudatos de raiz de ervilhaca (Vicia sativa), nove indutores são
encontrados (Zaat et al., 1989). No caso do feijoeiro, o número de indutores é
surpreendente. As antocianidinas (delfinidina, petunidina e malvidina) e os
flavonóis (miricetina, quercetina e canferol) são o principal grupo de compostos
indutores liberados pelas sementes. Já nos exsudatos radiculares, eriodictiol,
naringenina e genisteína são os principais indutores encontrados (Hungria et
al., 1991a,b), além da chalcona isoliquiritigenina e a correspondente flavanona
liquiritigenina (Bolanõs-Vásquez & Werner, 1997). Contudo, nos estudos
realizados por Hungria et al. (1991a,b) e por Bolanõs-Vásquez & Werner
(1997), a atividade biológica de todos os indutores identificados foi
demonstrada pela indução da atividade da
β
-galactosidase em R.
leguminosarum bv. phaseoli. Por isso, a importância em estudar a resposta dos
genes nod de R. tropici PRF 81 a esses compostos pela metodologia
apresentada neste trabalho.
Já a inibição da expressão (DOWN) do gene nodC nos tempos de 5
min e 1 h na presença da naringenina pode ter acontecido devido ao metanol
presente na solução estoque desse flavonóide. Contudo, é reportado seu uso
como solvente para os flavonóides nos estudos de indução dos genes nod em
rizóbios (Lang et al., 2008). Ademais, a concentração utilizada nesse estudo,
como citado anteriormente, pode ter sido baixa, incapaz de induzir os genes
nodC e nodG de R. tropici PRF 81. Porém, não foi observado perfil semelhante
de inibição para o gene nodG tratado com naringenina.
47
R. tropici é uma bactéria isolada de feijoeiro cultivado em regiões
tropicais. No caso da estirpe PRF 81, ela apresenta alta eficiência de FBN, é
competitiva e estável geneticamente, além de ser tolerante às condições de
altas temperaturas e acidez do solo. A estirpe vem sendo utilizada em
inoculantes comerciais no Brasil desde 1998, uma vez que se comprovou, em
diversos ensaios a campo, a capacidade de aumentar, consistentemente, o
rendimento da cultura (Hungria et al., 2000, 2005).
Em um estudo inicial do genoma da estirpe PRF 81, foi identificado que
este é formado por um cromossomo de 5.305 kb (67,6 %) e, com base na
análise do perfil plasmidial desta estirpe (Pinto et al., 2009), foram identificados
4 plasmídeos com tamanhos em torno de 1700, 510, 185 e 150 kb (2.545 kb),
correspondendo a 32,4 % do genoma. Vários genes de nodulação foram
identificados por Pinto et al. (2009) na estirpe PRF 81, dentre eles os genes
nodC e nodG. O gene nodC apresentou similaridade elevada com a estirpe tipo
de R. tropici CIAT 899; já o gene nodG, com R. leguminosarum. Foram
encontrados homólogos desses genes na maioria dos rizóbios sequenciados,
sendo que nodC foi encontrado em M. loti, B. japonicum, E. meliloti, R. etli, R.
leguminosarum e NGR234; enquanto o nodG foi identificado em M. loti, E.
meliloti, R. etli e R. leguminosarum.
Contudo, embora presentes no genoma (Pinto et al., 2009), esses
genes poderiam não ser funcionais e este estudo apresenta fortes indicações
de que os genes nodC e nodG da estirpe PRF 81 de R. tropici são funcionais e
devem estar relacionados à nodulação do feijoeiro.
48
6. Conclusões
- Os genes nodC e nodG da estirpe PRF 81 de Rhizobium tropici são
funcionais e apresentaram níveis de expressão gênica diferencial em presença
de exsudato de sementes de sua respectiva leguminosa hospedeira, o feijoeiro
(Phaseolus vulgaris L.).
- A maior expressão ocorreu aos 5 minutos de contato com o exsudato,
indicando uma resposta imediata ao indutor.
- O exsudato de sementes de feijão foi identificado como melhor indutor
dos genes nod quando comparado com naringenina, nos tempos avaliados
neste trabalho.
- Na dose de 1,5 µM, o flavonóide naringenina não foi capaz de induzir
a expressão dos genes nodC e nodG, essenciais para o processo de
nodulação, nos diferentes tempos avaliados neste trabalho.
49
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8. Anexos
Tabelas de análise da expressão gênica por RT-qPCR dos genes nodC e nodG.
Tabela A.
Expressão gênica relativa do gene nodC de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com naringenina por
5 min, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodC
Média Ct nodC
SD nodC
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Narigenina 35,1048
35,052 0,05 19,3909 19,472 0,072 15,580
0,061 0,770 0,061 0,59661291
0,57267544 0,48059487
0,11183581
23,27028805
35,0106
19,5256
1 35,0405
19,5008 0,62155094
Metanol 33,5902
34,558 0,93 19,892 19,749 0,142 14,809
0,664 0 0,664 1,00000000
34,6448
19,7465
35,4399
19,6082
Narigenina 35,6017
35,838 0,58 18,8333 18,696 0,152 17,142
0,426 1,469 0,426 0,37347262
0,28059729
35,4088
18,7206
2 36,502 18,5327 0,49708889
Metanol 37,1753
36,928 0,87 21,4997 21,254 0,223 15,673
0,633 0 0,633 1,00000000
35,9632
21,2003
37,6442
21,0626
Narigenina 34,5107
34,696 0,17 16,8016 16,748 0,075 17,948
0,128 1,120 0,128 0,47169908
0,43282378
34,8281
16,7792
3 34,7489
16,6622 0,51406607
Metanol 35,698 35,733 0,27 19,0245 18,905 0,127 16,828
0,213 0 0,213 1,00000000
36,0217
18,918
35,478
18,7718
62
Tabela B.
Expressão gênica relativa do gene nodC de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de
sementes de feijão por 5 min, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodC
Média Ct nodC
SD nodC
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRN
A 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral SD Geral
CV%
Exsudato 32,8468
33,494 0,70 22,7546 22,750 0,285 10,744
0,537 -7,566 0,537 159,86155961
111,52688212
121,96928947
53,58776234
43,93545504
34,2429
22,4622
1 33,3921
23,0327 229,14402121
Água 36,2694
36,241 0,02 17,9661 17,931 0,040 18,310
0,033 0 0,033 1,00000000
36,2241
17,9396
36,2307
17,8873
Exsudato 37,1407
37,251 0,49 24,224 24,083 0,123 13,168
0,357 -3,893 0,357 13,61178991
10,71458294 excluí
36,8261
24,0063
2 37,7864
24,0175 17,29239724
Água 34,9824
35,671 0,60 18,5611 18,609 0,048 17,062
0,424 0 0,424 1,00000000
36,0519
18,6579
35,9788
18,6092
Exsudato 38,3292
38,378 0,09 26,2743 26,309 0,096 12,069
0,093 -6,608 0,093 84,07701933
79,00341412
38,4811
26,2355
3 38,32343
26,4179 89,47645186
Água 38,5602
39,108 0,95 20,4116 20,431 0,103 18,677
0,674 0 0,674 1,00000000
40,2023
20,5416
38,5602
20,339
63
Tabela C.
Expressão gênica relativa do gene nodG de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com naringenina por
5 min, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amo
stra/Trat
Ct nodG
Média Ct nodG
SD nodG
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Narigenina 32,3615
32,230 0,15 19,3909 19,472 0,072 12,758
0,121 0,897 0,121 0,54777955
0,50525064 1,64473558
0,471071972
28,64119795
32,0599
19,5256 0,59388829
1 32,2698
19,5008
Metanol 31,2018
31,609 0,36 19,892 19,749 0,142 11,861
0,276 0 0,276 1,00000000
0,83099864
31,9007
19,7465 1,20337141
31,7257
19,6082
Narigenina 31,9533
32,118 0,14 24,4741 24,208 0,231 7,910 0,192 -0,404 0,192 1,31163739
1,15284323
32,1839
24,0904 1,49230407
2 32,218 24,0597
Metanol 32,0144
31,664 0,32 23,6105 23,349 0,229 8,315 0,279 0 0,279 1,00000000
0,82954183
31,3844
23,2498 1,20548472
31,5927
23,1867
Narigenina 33,9205
33,667 0,33 17,963 17,876 0,077 15,791
0,239 -1,017 0,239 1,97783376
1,68495319
33,7859
17,8517 2,32162318
3 33,2954
17,8145
Metanol 36,7735
35,708 1,32 19,1382 18,900 0,359 16,808
0,966 0 0,966 1,00000000
0,52319776
36,116 19,075 1,91132316
34,2341
18,487
64
Tabela D.
Expressão gênica relativa do gene nodG de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de
sementes de feijão por 5 min, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodG
Média Ct nodG
SD nodG
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta C
t
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Exsudato 30,191 31,096 0,80 22,7546 22,750 0,285 8,346 0,603 -5,812 0,603 49,30130460
32,89704767 14,85664036
2,155295932
14,5072902
31,3702
22,4622 excluir 73,88561612
1 31,7274
23,0327
Água 32,0723
32,090 0,02 17,9661 17,931 0,040 14,159
0,031 0 0,031 1,00000000
0,97940649
32,0886
17,9396 1,02102652
32,1079
17,8873
Exsudato 33,6603
33,022 0,59 21,7665 21,595 0,351 11,428
0,487 -3,862 0,487 13,33261599
9,61899245
32,9177
21,1916 18,47996556
2 32,4892
21,8265
Água 31,4851
31,812 0,53 16,3428 16,522 0,168 15,290
0,395 0 0,395 1,00000000
0,76703955
32,4276
16,6752 1,30371375
31,5231
16,5484
Exsudato 36,8555
36,748 0,34 26,2743 26,309 0,096 10,439
0,253 -4,169 0,253 16,38066473
13,82250191
36,3627
26,2355 19,41227274
3 37,0272
26,4179
Água 35,0402
35,039 0,05 20,4116 20,431 0,103 14,609
0,081 0 0,081 1,00000000
0,94736245
35,0884
20,5416 1,05556220
34,9891
20,339
65
Tabela E.
Expressão gênica relativa do gene nodC de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com naringenina por
4 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodC
Média Ct nodC
SD nodC
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Narigenina 35,3917
36,281 1,26 24,7319 24,777 0,064 11,504
0,890 2,037 0,890 0,25506424
0,14039724 0,28971049
0,044787
15,45924006
37,1699
24,8222
1 0,46338351
Metanol 35,5877
35,394 0,27 26,0015 25,928 0,668 9,467 0,510 0 0,510 1,00000000
35,2012
25,8543
Narigenina 42,9504
42,928 0,15 15,4803 15,314 0,149 27,614
0,149 1,932 0,149 0,27378295
0,24767477
44,4653
15,2701
2 41,3685
15,1912 0,30264327
Metanol 41,9261
42,347 0,19 16,7992 16,664 0,186 25,683
0,186 0 0,186 1,00000000
41,9261
16,742
43,1885
16,4517
Narigenina 44,5459
40,417 3,58 14,8126 14,644 0,152 25,774
2,531 1,607 2,531 0,34028428
0,06234568
38,353 14,6011
3 38,353 14,5176 1,85728014
Metanol 40,31 38,536 1,55 14,4429 14,370 0,070 24,166
1,098 0 1,098 1,00000000
37,8619
14,3642
37,4373
14,3036
66
Tabela F.
Expressão gênica relativa do gene nodC de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de
sementes de feijão por 4 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodC
Média Ct nodC
SD nodC
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta del
ta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Exsudato 38,0364
39,712 1,98 16,3826 16,310 0,064 23,402
1,399 -0,513 1,399 1,41035319
0,55171624 1,60009160
0,2683306
16,76970498
39,2048
16,2852
1 41,894 16,2612 3,60528832
Água 43,8407
42,162 1,45 18,2952 18,248 0,041 23,915
1,028 0 1,028 1,00000000
41,3358
18,2265
41,3108
18,2213
Exsudato 41,8605
41,510 0,50 17,2491 17,016 0,209 24,495
0,384 -0,868 0,384 1,78983002
1,38329268
41,7348
16,952
2 40,9357
16,8464 2,31584504
Água 42,4988
43,016 0,90 17,3105 17,653 0,305 25,363
0,669 0 0,669 1,00000000
42,4988
17,8953
44,0499
17,7542
Exsudato 39,3245
37,977 1,30 14,3467 14,254 0,081 23,723
0,921 -2,243 0,921 4,50011208
2,42667770 excluí
37,8744
14,2208
3 36,731 14,1946 8,34515798
Água 40,1083
40,284 3,29 14,3764 14,319 0,063 25,965
2,327 0 2,327 1,00000000
37,0854
14,3277
43,6581
14,2516
67
Tabela G.
Expressão gênica relativa do gene nodG de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com naringenina por
4 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodG
Média Ct nodG
SD nodG
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Narigenina 34,5437
34,769 0,27 18,4964 18,388 0,097 16,381
0,201 0,388 0,201 0,77106156
0,67392277 0,88655718
0,45469817
51,28808167
34,6995
18,3595
1 35,0635
18,3082 0,88220187
Metanol 34,6474
34,776 0,29 18,637 18,783 0,318 15,993
0,302 0 0,302 1,00000000
35,1036
18,5643
34,5781
19,1482
Narigenina 34,7956
34,587 0,30 15,4803 15,314 0,149 19,273
0,236 1,031 0,236 0,50074440
0,42734192
34,7203
15,2701
2 34,2442
15,1912 0,58675488
Metanol 35,1781
34,906 0,24 16,7992 16,664 0,186 18,242
0,213 0 0,213 1,00000000
34,7877
16,742
34,7516
16,4517
Narigenina 34,0096
34,102 0,16 14,8126 14,644 0,152 19,458
0,156 -0,489 0,156 1,38786558
1,24988173
34,0095
14,6011
3 34,2869
14,5176 1,54108251
Metanol 34,3922
34,317 0,17 14,4429 14,370 0,070 19,947
0,132 0 0,132 1,00000000
34,4401
14,3642
34,1193
14,3036
Naringenina
33,6898
33,659 0,04 24,1602 24,245 0,12 9,413 0,091 0,826 0,091 0,57451919
0,57451919
33,6273
24,3304 1,00000000
Metanol 34,0244
33,910 0,16 25,3805 25,323 0,08 8,587 0,128 0 0,128 1,00000000
Repetição em placa
33,7958
25,266
68
Tabela H.
Expressão gênica relativa do gene nodG de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de
sementes de feijão por 4 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodG
Média Ct nodG
SD nodG
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Exsudato 34,3611
34,590 0,22 16,3826 16,310 0,064 18,280
0,164 1,856 0,164 0,28793819
0,25793345 0,53129535
0,328041238
61,7436686
34,8066
16,2852 0,32143331
1 34,601 16,2612
Água 34,4987
34,671 0,25 18,2952 18,248 0,041 16,423
0,177 0 0,177 1,00000000
0,88809123
34,9539
18,2265 1,12601044
34,5608
18,2213
Exsudato 35,5402
35,045 0,43 17,2491 17,016 0,209 18,029
0,338 1,360 0,338 0,40158970
0,32015247
34,8221
16,952 0,50374215
2 34,7717
16,8464
Água 34,3057
34,322 0,24 17,3105 17,65333333 0,305 16,668
0,273 0 0,273 1,00000000
0,83260765
34,5663
17,8953 1,20104589
34,0934
17,7542
Exsudato 34,1522
34,220 0,06 14,3467 14,254 0,081 19,966
0,073 0,150 0,073 0,90435814
0,86130066
34,2768
14,2208 0,94956812
3 34,2308
14,1946
Água 34,1669
34,135 0,03 14,3764 14,319 0,063 19,816
0,050 0 0,050 1,00000000
0,96722140
34,1325
14,3277 1,03388945
34,1043
14,2516
69
Tabela I.
Expressão gênica relativa do gene nodC de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com naringenina por 8
h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodC
Média Ct nodC
SD nodC
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Narigenina 41,5613
40,304 1,88 18,1475 17,958 0,201 22,345
1,337 -0,847 1,337 1,76448392
0,71966665 1,97645248
0,299768816
15,16701354
41,2075
17,9801
1 38,1418
17,7473 4,32617449
Metanol 42,5876
41,236 1,19 18,1127 18,044 0,070 23,192
0,841 0 0,841 1,00000000
40,759 18,0458
40,3605
17,9727
Narigenina 38,0735
39,556 4,11 14,6955 14,594 0,123 24,962
2,905 -1,168 2,905 2,18842105
0,31200138
44,197 14,6304
2 36,3971
14,4569 1,00000000
Metanol 43,5061
40,453 2,77 14,3834 14,323 0,057 26,129
1,960 0 1,960 1,00000000
39,7545
14,3172
38,0978
14,2696
Naringenina
34,79 34,980 0,27 24,6858 24,461 0,32 10,519
0,294 -0,815 0,294 1,72709757
1,41756579
3 35,1706
24,2363 2,10421698
Metanol 35,3463
35,831 0,69 24,4691 24,497 0,04 11,334
0,486 0 0,486 1,00000000
36,3159
24,525
70
Tabela J.
Expressão gênica relativa do gene nodC de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de
sementes de feijão por 8 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodC
Média Ct nodC
SD nodC
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Exsudato 40,6218
41,091 2,28 17,3926 17,430 0,035 23,661
1,609 1,572 1,609 0,34842064
0,11840496 0,30801871
0,057136958
18,54983363
39,0866
17,4627
1 43,5648
17,4353 1,02526906
Água 39,0612
39,597 0,52 17,5342 17,508 0,027 22,089
0,369 0 0,369 1,00000000
39,6276
17,5087
40,1013
17,481
Exsudato 40,784 40,784 #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0!
#DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0!
dados perdidos
2
Água 43,1627
43,163 0,00 14,9486 14,894 0,060 28,268
0,042 0 0,042 1,00000000
43,1627
14,9046
43,1627
14,83
Exsudato 37,8962
39,883 3,75 14,2529 14,606 0,743 25,277
2,702 1,966 2,702 0,26761678
0,04369571
37,5456
14,1047
3 44,2068
15,4594 1,63903355
Água 37,161 38,295 1,02 14,9433 14,983 0,153 23,312
0,727 0 0,727 1,00000000
38,5976
15,1519
39,1257
14,8542
71
Tabela K.
Expressão gênica relativa do gene nodG de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com naringenina por
8 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amos
tra/Trat
Ct nodG
Média Ct nodG
SD nodG
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Narigenina 34,6741
34,741 0,10 18,1475 17,958 0,201 16,782
0,159 0,226 0,159 0,85914989
0,77238154 1,61380542
1,049987176
65,06281119
34,6922
17,9801
1 34,8557
17,7473 0,95566568
Metanol 34,5452
34,600 0,41 18,1127 18,044 0,070 16,556
0,297 0 0,297 1,00000000
35,0391
18,0458
34,2149
17,9727
Narigenina 35,0688
34,891 0,19 16,2959 16,502 0,192 18,389
0,193 -1,542 0,193 2,81292656
2,47123275
34,6844
16,6769
2 34,92 16,533 3,20186587
Metanol 34,6612
35,010 0,31 15,1608 15,079 0,108 19,931
0,229 0 0,229 1,00000000
35,1337
15,1183
35,2345
14,9565
Narigenina 34,6661
34,538 0,13 14,6955 14,594 0,123 19,944
0,125 -0,233 0,125 1,16933982
1,07532044
34,4129
14,6304
3 34,5364
14,4569 1,27157968
Metanol 34,716 34,501 0,29 14,3834 14,323 0,057 20,177
0,211 0 0,211 1,00000000
34,6202
14,3172
34,1664
14,2696
Naringenina
33,6005
33,463 0,20 24,0723 24,157 0,12 9,305 0,162 -0,516 0,162 1,41324098
1,41324098
33,3245
24,2423 1,00000000
Metanol 33,5856
33,744 0,22 23,9082 23,923 0,02 9,821 0,159 0 0,159 1,00000000
Repetiçao na placa
33,9027
23,9382
72
Tabela L.
Expressão gênica relativa do gene nodG de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de
sementes de feijão por 8 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodG
Média Ct nodG
SD nodG
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Exsudato 34,3631
34,392 0,14 17,3926 17,430 0,035 16,962 0,103 -0,282 0,103 1,20832357
1,12765283 1,09034356
0,16693571
15,31037704
34,5462
17,4627
1 34,2681
17,4353 1,29476539
Água 34,7059
34,752 0,06 17,5342 17,508 0,027 17,244 0,047 0 0,047 1,00000000
34,7302
17,5087
34,8211
17,481
Exsudato 34,1329
34,282 0,17 14,2529 14,606 0,743 19,676 0,540 -0,226 0,540 1,16336896
0,81006432
34,2388
14,1047
2 34,4739
15,4594 1,67076528
Água 34,5699
34,885 0,28 14,9433 14,983 0,153 19,902 0,223 0 0,223 1,00000000
35,0876
15,1519
34,9974
14,8542
Exsudato 33,8286
34,00225 0,245578185
23,2742 23,4733 0,28156992 10,52895
0,264187684
0,1582 0,264187684 0,899338142
0,753314425
3 34,1759
23,6724 1,073667339
Água 33,7276
33,7138 0,019516147
23,3837 23,34305 0,057487781
10,37075
0,042928574
0 0,042928574 1,0000000
33,7 23,3024
73
Tabela M.
Expressão gênica relativa do gene nodC de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com naringenina por
48 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodC
Média Ct nodC
SD nodC
Ct rRNA 16
S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Narigenina 38,3994
37,861 1,61 19,9069 19,769 0,120 18,092
1,142 -0,059 1,142 1,04017531
0,48366750 0,83599141
0,147819108
17,68189326
39,1333
19,7125
1 36,0506
19,6884 2,23700102
Metanol 37,0368
37,445 1,28 19,3539 19,295 0,053 18,151
0,905 0 0,905 1,00000000
38,8783
19,2788
36,4208
19,2515
Narigenina 34,4797
34,363 0,18 17,5198 17,534 0,122 16,829
0,154 0,556 0,154 0,68894867
0,62139204
34,1554
17,6622
2 34,4549
17,4203 0,76384993
Metanol 33,7982
33,694 0,16 17,4717 17,421 0,059 16,274
0,118 0 0,118 1,00000000
33,5148
17,4342
33,7701
17,3562
Narigenina 33,5671
33,614 0,22 17,1125 17,032 0,073 16,581
0,164 0,351 0,164 0,79000999
0,70758097
33,4203
17,0143
3 33,8542
16,9705 0,88204151
Metanol 33,2641
33,235 0,03 17,0286 17,005 0,020 16,230
0,023 0 0,023 1,00000000
33,213 16,9970
33,229 16,9906
Naringenina
32,9008
32,853 0,07 25,8987 25,899 0,000 6,954 0,048 0,287 0,048 0,82483165
0,798836235
32,8053
25,8987 0,851672997
Metanol 32,7558
33,061 0,43 26,6872 26,394 0,415 6,667 0,423 0 0,423 1,00000000
Repetição na placa
33,3662
26,1004
74
Tabela N.
Expressão gênica relativa do gene nodC de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de
sementes de feijão por 48 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodC
Média Ct nodC
SD nodC
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delt
a Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Exsudato 37,2799
37,431 0,62 19,8351 19,824 0,080 17,606
0,443 -0,956 0,443 1,89876668
1,41090142 1,87956508
0,301503765
16,04114533
36,8986
19,8990
1 38,1130
19,7391 2,55532729
Água 40,0303
38,056 1,72 19,5031 19,494 0,015 18,562
1,214 0 1,214 1,00000000
37,2249
19,4769
36,9135
19,5021
Exsudato 34,3249
34,696 0,52 17,1267 17,043 0,101 17,653
0,374 -0,801 0,374 1,71172280
1,33178916
35,2901
16,9313
2 34,474 17,0706 2,20004414
Água 35,2193
35,406 0,30 16,9271 16,951 0,071 18,455
0,218 0 0,218 1,00000000
35,7511
17,0308
35,2461
16,8938
Exsudato 34,0658
34,021 0,26 16,4280 16,420 0,048 17,601
0,185 -0,712 0,185 1,61247159
1,42451063
34,2518
16,4624
3 33,7439
16,3681 1,82523357
Água 34,4441
34,823 0,54 16,5552 16,510 0,048 18,313
0,384 0 0,384 1,00000000
35,4424
16,4597
34,5834
16,5148
Exsudato 33,2616
33,265 0,00 26,3604 26,088 0,39 7,177 0,272 -1,239 0,272 2,29529924
2,02774313
33,2679
25,8159 1,82523357
Metanol 33,4766
33,425 0,07 25,041 25,010 0,04 8,416 0,060 0 0,060 1,00000000
Repetição na placa
33,3739
24,9785
75
Tabela O.
Expressão gênica relativa do gene nodG de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com naringenina por
48 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodG
Média Ct no
dG
SD nodG
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Narigenina 35,2255
35,053 0,15 19,9069 19,769 0,120 15,284
0,137 -0,835 0,137 1,75081039
1,59749850 1,45538975
0,472916235
32,4941299
34,9399
19,7125 1,91883561
1 34,9944
19,6884
Metanol 35,2226
35,414 0,17 19,3539 19,295 0,053 16,119
0,123 0 0,123 1,00000000
0,92082184
35,5124
19,2788 1,08598641
35,5066
19,2515
Narigenina 34,61 34,845 0,23 17,5198 17,534 0,122 17,311
0,186 0,235 0,186 0,85430444
0,75406537
34,8489
17,6622 0,96786844
2 35,0768
17,4203
Metanol 34,6083
34,497 0,20 17,4717 17,421 0,059 17,076
0,145 0 0,145 1,00000000
0,90706618
34,2695
17,4342 1,10245539
34,6133
17,3562
Narigenina 35,4991
35,428 0,06 17,1125 17,032 0,073 18,395
0,069 -0,667 0,069 1,56362659
1,49322161
35,3742
17,0143 1,63735114
3 35,4092
16,9705
Metanol 36,1732
36,067 0,09 17,0286 17,005 0,020 19,062
0,067 0 0,067 1,00000000
0,95631325
36,0134
16,9970 1,04568247
36,0144
16,9906
Naringenina
33,5772
33,906 0,47 25,1136 25,109 0,01 8,797 0,329 -0,749 0,329 1,65281757
1,58061135
34,2352
25,1049 1,04568247
Metanol 33,7975
34,619 1,16 24,9619 25,073 0,16 9,546 0,829 0 0,829 1,00000000
1,00000000
Repetição na placa
35,4413
25,1845 1,00000000
76
Tabela P.
Expressão gênica relativa do gene nodG de R. tropici PRF81, submetido ao tratamento de indução com exsudato de
sementes de feijão por 48 h, utilizando a técnica de RT-qPCR.
Rep. Biológica
Amostra/Trat
Ct nodG
Média Ct nodG
SD nodG
Ct rRNA 16S
Média Ct rRNA 16S
SD rRNA 16S
delta Ct
SD delta Ct
delta delta Ct
SD delta delta Ct
RQ RQmín/RQmáx
RQ Geral
SD Geral
CV%
Exsudato 34,4648
34,766 0,30 19,8351 19,824 0,080 14,942
0,219 -0,535 0,219 1,43131610
1,23555509 1,40486374
0,19932037
14,18787916
35,0638
19,8990 1,65809343
1 34,7694
19,7391
Água 35,3142
34,970 0,31 19,5031 19,494 0,015 15,476
0,222 0 0,222 1,00000000
0,86161928
34,6997
19,4769 1,16060541
34,8971
19,5021
Exsudato 34,4909
34,347 0,20 17,1267 17,043 0,101 17,304
0,156 -0,691 0,156 1,58963709
1,43138897
34,1227
16,9313 1,76538044
2 34,4278
17,0706
Água 34,959 34,946 0,21 16,9271 16,951 0,071 17,995
0,160 0 0,160 1,00000000
0,89831367
35,1537
17,0308 1,11319691
34,7252
16,8938
Exsudato 35,8881
35,673 0,19 16,4280 16,420 0,048 19,254
0,136 -0,264 0,136 1,19363803
1,08965138
35,5554
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