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Rosana Aparecida Gabriel Adamowicz
Estrutura, desenvolvimento,
histoquímica e atividade
antioxidante dos órgãos vegetativos
de Mart &
Zucc. (Nymphaeaceae) procedente
do Pantanal/ MS, Brasil.
Nymphaea amazonum
Campo Grande
2007
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Rosana Aparecida Gabriel Adamowicz
Estrutura, desenvolvimento, histoquímica e atividade antioxidante
dos órgãos vegetativos de
Nymphaea amazonum
Mart & Zucc.
(Nymphaeaceae) procedente do Pantanal/ MS, Brasil
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Vegetal da
Universidade Federal de Mato Grosso do
Sul como um dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em Biologia
Vegetal junto ao Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde.
Orientadora: Dra. Edna Scremin Dias
Campo Grande
2007
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Ficha Catalográfica
_________________________________________________________________________
i
Adamowicz, Rosana Aparecida Gabriel
Estrutura, desenvolvimento, histoquímica e atividade
antioxidante dos órgãos vegetativos de
Nymphaea amazonum
Mart & Zucc. (Nymphaeaceae) procedente do Pantanal/ MS,
Brasil. 62p
Dissertação (Mestrado) – Laboratório de Botânica –
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul.
1.
Nymphaea
2. Anatomia 3. Histoquímica I.
Laboratório de Botânica – Universidade Federal de Mato
Grosso do Sul.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________
Prof. Dr. Luiz Antônio de Souza
Universidade Estadual de Maringá - UEM
___________________________________
Prof. Dr. Rosani do Carmo de Oliveira Arruda
Universidade Federal do Estado do Rio de
Janeiro -
_____________________________________
Profa. Dra. Edna Scremin-Dias (Orientadora)
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul – UFMS
ii
Ao Márcio, meu companheiro de todas as horas.
Por tudo que representa na minha vida.
Obrigada pelo apoio, compreensão e carinho que foram
fundamentais para a conclusão dessa etapa.
Com amor, dedico.
iii
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, João Maria e Tereza, por terem dedicado suas vidas em prol da minha
educação, por todo o incentivo e apoio, que mesmo à distância, foi fundamental nos
momentos difíceis.
Às minhas irmãs Rosângela e Lucélia pela torcida e incentivo, acrescentando força e
energia a este desafio.
À Professora Edna pela acolhida, motivação, pelo exemplo de ética e competência, pela
amizade e por todo o carinho que sempre recebi, “You are the best”.
À amiga Kasinha pelo apoio técnico, pela amizade e por todos os momentos divertidos que
passamos juntas.
À Ana Lúcia pelo auxílio nas análises histoquímicas e por todos os momentos agradáveis e
divertidos que tivemos durante a minha passagem pelo laboratório, adorei conhecer você.
À Seloi por todo o “socorro” prestado nos momentos que eu não sabia mais o que fazer,
pela motivação e conselhos sábios.
À querida Joelma pelo carinho sempre que eu precisei de ajuda e pelas sugestões que muito
colaboraram para o fechamento desse trabalho.
À Zildamara por sua alegria, entusiasmo e pela ajuda nas coletas.
À Cris Kalife pela tradução dos resumos, por sua amizade e por nossas ricas conversas nos
momentos de descontração no laboratório.
Ao técnico Fábio pelo auxílio na edição das fotos e por todos os momentos que
prontamente ajudou a resolver problemas com o computador.
À Joicy Lugnani pelas sugestões e auxilio na revisão do texto.
iv
Aos estagiários do Laboratório de Botânica, em especial à Silvana, Tamires, Mariana, Jane
pelo apoio técnico e pela amizade firmada durante o tempo que convivemos, valeu meninas
vocês moram no meu coração.
Ao Thales pela correção das referências bibliográficas.
Ao Fernando Belan pelo auxílio nas dúvidas nas análises anatômicas.
Ao técnico João do Laboratório de Farmacognosia pelo auxílio na preparação de soluções
para as análises histoquímicas.
Ao Laboratório de Pesquisa do Departamento de Química pelo apoio nas análises
fitoquímicas em especial à Professora Neli pela orientação e atenção dedicada.
Ao Laboratório de Pesticidas Naturais, em especial à Vanderléia e ao Euclésio pelo auxílio
nas análises de atividade antioxidante.
A FUNDECT pela bolsa de Mestrado concedida e recursos financeiros para a pesquisa.
A Rede de Sementes do Pantanal pelo empréstimo da caminhonete para as viagens de
coleta.
Aos amigos do mestrado pelo incentivo e amizade.
A todos os citados e aqueles que, direta ou indiretamente colaboraram de alguma forma
com a conclusão deste trabalho, MUITO OBRIGADA!!!
v
SUMÁRIO
RESUMO-----------------------------------------------------------------------------------------------1
ABSTRACT--------------------------------------------------------------------------------------------2
INTRODUÇÃO GERAL---------------------------------------------------------------------------- 4
OBJETIVOS--------------------------------------------------------------------------------------8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS--------------------------------------------------------9
FIGURAS--------------------------------------------------------------------------------------- 12
CAPÍTULO I – Estrutura, histoquímica e atividade antioxidante da folha e do caule
de Nymphaea amazonum Mart & Zucc. (Nymphaeaceae) procedente do Pantanal/ Ms,
Brasil. --------------------------------------------------------------------------------------------------14
INSTRUÇÕES AOS AUTORES – Acta Botanica Brasilica.----------------------------15
RESUMO----------------------------------------------------------------------------------------18
ABSTRACT-------------------------------------------------------------------------------------18
INTRODUÇÃO-------------------------------------------------------------------------------- 19
MATERIAL E MÉTODOS-------------------------------------------------------------------21
RESULTADOS E DISCUSSÃO-------------------------------------------------------------23
Caule-----------------------------------------------------------------------------------------23
Limbo foliar e pecíolo---------------------------------------------------------------------25
Análises histoquímicas e fitoquímicas--------------------------------------------------28
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS-------------------------------------------------------30
FIGURAS E LEGENDAS-------------------------------------------------------------------- 34
CAPÍTULO II – Estrutura, desenvolvimento e histoquímica da raiz de Nymphaea
amazonum Mart & Zucc. (Nymphaeaceae)---------------------------------------------------- 46
INSTRUÇÕES AOS AUTORES – Brazilian Archives of Biology and Technology--47
vi
ABSTRACT-------------------------------------------------------------------------------------49
INTRODUÇÃO--------------------------------------------------------------------------------49
MATERIAL E MÉTODOS-------------------------------------------------------------------50
RESULTADOS E DISCUSSÃO-------------------------------------------------------------52
RESUMO----------------------------------------------------------------------------------------59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS-------------------------------------------------------59
CONSIDERAÇÕES FINAIS----------------------------------------------------------------------61
Resumo Geral
__________________________________________________________
1
O Pantanal é um dos biomas brasileiros mundialmente conhecido por sua beleza cênica,
representada principalmente pela diversidade de macrófitas aquáticas, as quais têm grande
importância ecológica e econômica. Nymphaea amazonum Mart & Zucc. (Nymphaeaceae)
amplamente distribuída no Pantanal Matogrossense, pode ser encontrada em lagoas e
cursos d’água com baixa correnteza. Além da sua importância ecológica pelo fato de ser
utilizada por vários animais como alimento, abrigo e local de desova, também tem sido
utilizada como planta medicinal pela população ribeirinha. O Capítulo I desta dissertação
apresenta dados sobre a anatomia, histoquímica e atividade antioxidante do caule e das
folhas, com o intuito de evidenciar as características adaptativas ao ambiente aquático bem
como sua composição química geral. No capítulo II são descritos aspectos estruturais,
ontogenéticos e histoquímicos das raízes evidenciando características que permitem seu
desenvolvimento em solos com baixa quantidade de oxigênio em decorrência do
permanente alagamento. Este trabalho apresenta contribuições importantes para o
entendimento da biologia de N. amazonum, bem como descreve a potencialidade
antioxidante desta espécie, indicando-a como foco para estudos mais aprimorados em
fitoquímica e filogenia.
Palavras-chave: Nymphaea amazonum, anatomia, histoquímica, atividade antioxidante.
Abstract
__________________________________________________________
2
Pantanal is one of the Brazilian biomes worldly known by its scenic beauty, represented
mainly by the diversity of aquatic macrophytes, that have great ecological and economic
importance. Nymphaea amazonum Mart & Zucc. (Nymphaeaceae) widely distributed in
Pantanal Matogrossense, can be found in lakes and watercourses of slow flow. Besides its
ecological importance as food, shelter and spawning place to many animals, it has been
used as medicinal plant to riverine people. The chapter I of this dissertation presents data
about anatomy, histochemistry and antioxidant activity of steam and leaves, with the aim of
evidencing the adaptive characteristics to aquatic environment as well as its general
chemical composition. In chapter II structural, ontogenetic and histochemical aspects of the
roots are described, evidencing characteristics that allow their development in soils with
low oxygen supply due to permanent flooding. This work presents important contributions
to the understanding of the biology of N. amazonum, as well as describes the antioxidant
potentiality of these species, indicating it as a focus to deeper studies in phytochemistry and
phylogeny.
Key-words: Nymphaea amazonum, anatomy, histochemistry, antioxidant activity.
_________________________________________________________________________
INTRODUÇÃO GERAL
Introdução Geral
__________________________________________________________
4
O Brasil abriga em seu território cerca de 50-56 mil (20-22%) das 250 mil espécies
de Angiospermas existentes na superfície terrestre, sendo considerado o país com a maior
diversidade vegetal do planeta (Peixoto & Thomas 2005). Abrange seis biomas
continentais, representados pela Amazônia, Cerrado, Caatinga, Mata Atlântica, Pantanal e
Pampa. De acordo com pesquisa realizada pelo IBGE (2006) o Pantanal é o bioma com
menor área territorial, no entanto, apresenta uma das maiores concentrações de vida
silvestre no planeta (Consevation International do Brasil 2006), e tem sua importância
reconhecida internacionalmente, sendo considerado Patrimônio da Humanidade e Reserva
Nacional da Biosfera. Este bioma abriga diversas unidades de paisagens, diferenciadas pela
intensidade e regularidade do pulso de inundação a que estão submetidas (Pozer &
Nogueira 2004). Sofre influências de outros Biomas como Cerrado, Amazônia, Mata
Atlântica e o Chaco paraguaio (Lange & Freitas 2004), formando um mosaico de paisagens
(GEF 2004). Possui dois terços de sua área no estado de Mato Grosso do Sul, e um terço
em Mato Grosso, sendo dividido em 11 sub-regiões (Figura 1).
A influência da Amazônia no Pantanal é exercida principalmente em matas ciliares
do rio Paraguai (Prance & Schaller 1982; Adámoli 1987) e seus tributários servem como
rota de migração dessa flora (Pennington et al. 2000; Spichiger et al. 2004), fato que pode
ser verificado pela presença de elementos da vegetação amazônica no Pantanal, tais como
as macrófitas aquáticas Victoria amazônica (Poepp.) Sowerby e Nymphaea amazonum
Mart. & Zucc. (Adámoli 1987; Pott 1998).
Segundo Pott & Pott (1994), ocorrem no Pantanal pelo menos 1700 espécies de
vegetais superiores (fanerógamas), representando a maior planície inundável do mundo,
Introdução Geral
__________________________________________________________
5
com aproximadamente 150.355 km² (IBGE 2006), tendo sido indicado como um dos quatro
centros de diversidade de macrófitas aquáticas do Brasil (Pedralli 1992). O termo
macrófitas aquáticas foi primeiramente mencionado por Weaner & Clements (1938)
definindo-as como plantas herbáceas que crescem na água, em solos cobertos por água ou
em solos saturados por esta. Irgang& Gastal Jr. (1996) adotaram conceito mais amplo,
descrevendo-as como “vegetais visíveis a olho nu, cujas partes fotossintetizantes ativas
estão permanentemente por diversos meses ou todos os anos, total ou parcialmente
submersas em água doce ou salobra, ou ainda, flutuantes na mesma”.
Em ecossistemas aquáticos, as macrófitas aquáticas são consideradas importantes
componentes estruturais por fornecerem a base da cadeia alimentar desses ambientes. Elas
fazem da produção primária, que entra na cadeia trófica, servindo de alimento para peixes e
outros organismos aquáticos. Muitas plantas aquáticas despertam interesse econômico
sendo utilizadas como apícola, ornamental, têxtil, alimentar, forrageiro, medicinal,
despoluidoras entre outros. Além disso, está comprovado que essas plantas também são
capazes de descontaminar a água de microorganismos patogênicos os quais poderiam
causar doenças em peixes ou mesmo no homem (Pott & Pott 2000a; Marquina et al. 2005).
O conhecimento das relações entre as plantas aquáticas e os tipos de ambientes é
importante para o manejo e a conservação desses recursos naturais, bem como para várias
áreas de conhecimento como pecuária, ictiologia, limnologia e ecologia (Pott & Pott 2000a;
Pompêo & Mosquini 2003).
As atuais plantas aquáticas desenvolveram, ao longo do curso evolutivo, várias
características anatômicas que minimizam os efeitos dos diversos fatores ambientais aos
quais estão submetidas, sendo o sucesso da colonização destas espécies no ambiente,
Introdução Geral
__________________________________________________________
6
determinado por estas características (Sculthorpe 1967; Scremin-Dias et al. 1999; Cronk &
Fennessy 2001).
Além das adaptações morfológicas e anatômicas, a interação do ambiente com os
mecanismos fisiológicos das plantas resulta no estímulo da síntese de metabólitos especiais,
denominados metabólitos secundários. Esses compostos são componentes importantes para
a sobrevivência e reprodução dos vegetais, podendo estar relacionados tanto com respostas
aos fatores bióticos como abióticos, sendo que alguns deles podem ser expressos
constitutivamente e outros, como as fitoalexinas, sintetizados em resposta ao ataque de
herbívoros ou patógenos (Castro et al. 2004; Santarém 2006). Dessa forma, estudos
detalhados que caracterizem a morfologia, anatomia e a composição química, permitem um
melhor entendimento das adaptações dessas plantas ao ambiente aquático.
A família Nymphaeaceae é constituída por herbáceas aquáticas de distribuição
cosmopolita, incluindo seis gêneros e cerca de 60 espécies (Lorenzi & Souza 2005), sendo
descrito para o Pantanal a ocorrência de sete espécies de Nymphaea e uma espécie de
Victoria. (Pott 1998; Pott & Pott 2000a). Esta família está enquadrada dentro do complexo
“paleoervas” pelo fato de seus representantes possuírem sistema vascular difuso, ausência
de câmbio vascular, sistema de raízes adventícias e ausência de óleos etéreos (Judd et al.
1999). Segundo este autor, dados moleculares e morfológicos suportam sua posição como
grupo parafilético dentro da divisão das angiospermas. Contudo, sua posição taxonômica
ainda não está bem definida, o que tem despertado maior interesse sobre o estudo de
representantes dessa família nas últimas décadas (Marquina et al., 2005).
Dentre as espécies de Nymphaeaceae que ocorrem no Pantanal, ressalta-se
Nymphaea amazonum que possui ampla distribuição na América tropical, do México e
Guianas ao Paraná e também no Pantanal Matogrossense (Pott & Pott 2000a). É conhecida
Introdução Geral
__________________________________________________________
7
popularmente como lírio d’água, camalote da meia-noite, dama da noite, batata-d’água
(Pott 1998; Crispim 2002) e, além de ser utilizada por vários animais como alimento,
abrigo e local de desova, também tem sido utilizada como planta medicinal pela população
ribeirinha, que usa suas folhas como cicatrizantes de feridas e úlceras e o suco da raiz é
usado em banho, cataplasma e emplasto para hemorróidas (Balbach 1969; Pott & Pott
2000b).
N. amazonum caracteriza-se como planta herbácea aquática, flutuante fixa, com
folhas levemente peltadas com limbo simples, inteiro, geralmente com manchas
avermelhadas, nervuras radiais salientes (Figura 2 e 3) e um anel de pêlos no ápice do
pecíolo (Pott, 1998). É típica de lagoas permanentes (Figura 4) sendo perene enquanto
houver água suficiente, pois é restritamente aquática (Pott & Pott 2000a). Suas folhas têm a
superfície encerada para repelência de água com a função de proteger os estômatos contra o
filme de água que pode se formar diminuindo a capacidade de absorção de CO
2
pelos
mesmos (Barthlott & Neinhuis 1997; Pott & Pott 2000a). Além disso, estruturas de
repelência de água presentes na superfície de folhas, principalmente em plantas aquáticas,
facilitam a remoção de partículas de pó, esporos e conídios de fungos por gotículas de água
da chuva ou orvalho, sendo esse processo conhecido como “efeito Lótus” (Barthlott &
Neinhuis 1997).
As flores são solitárias, bissexuadas com um longo pedicelo e usualmente
flutuantes, abrem e fecham-se diariamente durante a noite (Judd et al.1999). Estas exalam
odor parecido com acetona ou éter atraindo besouros polinizadores (Figura 6) que ficam
presos durante o dia comendo os apêndices carpelares, ricos em amido (Pott & Pott 2000a).
Atualmente, investigações que caracterizem a morfologia e a composição química,
bem como a anatomia das estruturas secretoras presentes nos órgãos vegetativos por meio
Introdução Geral
__________________________________________________________
8
da histoquímica, são escassas para a maioria das espécies brasileiras e, principalmente em
macrófitas aquáticas. E mesmo com o crescente interesse em Nymphaeaceae, são raros
estudos com N. amazonum, sendo inexistentes trabalhos sobre anatomia, morfologia,
histoquímica ou fitoquímica para todo o corpo vegetativo da planta.
Neste sentido, o presente trabalho caracteriza a anatomia, a histoquímica e a
atividade antioxidante dos órgãos vegetativos, bem como descreve a presença de algumas
classes de metabólitos secundários nestes, por meio da fitoquímica. Também são
apresentados aspectos ontogenéticos do caule e da raiz de N. amazonum evidenciando as
adaptações que permitem seu perfeito estabelecimento em solos permanentemente alagados
sob condições de baixa concentração de oxigênio.
As informações estruturais obtidas nesse estudo podem contribuir para o
conhecimento dos locais de síntese e acúmulo das substâncias produzidas por N. amazonum
distribuída na região do Pantanal de Miranda e Abobral, além de subsidiar trabalhos futuros
que visam à exploração econômica desta espécie, bem como contribuir com informações
para a conservação da mesma no Pantanal.
Objetivos
• Descrever a constituição anatômica de Nymphaea amazonum e relacioná-la com
adaptações da espécie ao ambiente;
• Caracterizar alguns aspectos da ontogênese dos tecidos da raiz e do caule desta
espécie;
• Realizar testes histoquímicos nos órgãos vegetativos para evidenciar in situ os
principais grupos de metabólitos secundários produzidos;
Introdução Geral
__________________________________________________________
9
• Contribuir com informações sobre as potencialidades da espécie estudada visando
sua conservação e exploração econômica.
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Figura 1. Mapa evidenciando as diferentes sub-regiões do Pantanal.
12
2
3
4
6
Figura 2-5 2 e 3
45.
6.
. Mart & Zucc. . Detalhe de evidenciando o hábito e a morfologia.
.Lagoa mostrando ampla distribuição em águas paradas. Detalhe do cormo com raízes contráteis
(setas). Flor sendo visitada por polinizadores durante a noite.
Nymphaea amazonum
13
5
_______________________________________________________________________
CAPITULO I
Estrutura, histoquímica e atividade antioxidante da folha e do caule
de
Nymphaea amazonum
Mart & zucc. (Nymphaeaceae) procedente
do Pantanal/MS, Brasil.
15
NORMAS GERAIS PARA
PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS NA
ACTA BOTANICA BRASILICA
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Botânica, básica ou aplicada, em
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2. Os artigos devem ser concisos, em
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todos os autores poderão fornecer e-mail.
6. A estrutura do trabalho deve, sempre
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seqüência:
-RESUMO e ABSTRACT (em caixa
alta e negrito) – texto corrido, sem
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parágrafo e com cerca de 200 palavras.
Deve ser precedido pelo título do artigo
em Português, entre parênteses. Ao final
do resumo, citar até cinco palavras-chave
à escolha do autor, em ordem de
importância. A mesma regra se aplica ao
Abstract em Inglês ou Resumen em
Espanhol.
-Introdução (em caixa alta e baixa,
negrito, deslocado para a esquerda): deve
conter uma visão clara e concisa de: a)
conhecimentos atuais no campo
específico do assunto tratado; b)
problemas científicos que levou(aram)
o(s) autor(es) a desenvolver o trabalho; c)
objetivos.
-Material e métodos (em caixa alta e
baixa, negrito, deslocado para a
esquerda): deve conter descrições breves,
suficientes à repetição do trabalho;
técnicas já publicadas devem ser apenas
citadas e não descritas. Indicar o nome
da(s) espécie(s) completo, inclusive com
o autor. Mapas - podem ser incluídos se
forem de extrema relevância e devem
apresentar qualidade adequada para
impressão. Todo e qualquer comentário
de um procedimento utilizado para a
análise de dados em Resultados deve,
obrigatoriamente, estar descrito no item
Material e métodos.
-Resultados e discussão (em caixa alta e
baixa, negrito, deslocado para a
esquerda): podem conter tabelas e figuras
(gráficos, fotografias, desenhos, mapas e
16
pranchas) estritamente necessárias à
compreensão do texto. Dependendo da
estrutura do trabalho, resultados e
discussão poderão ser apresentados em
um mesmo item ou em itens separados.
As figuras devem ser todas numeradas
seqüencialmente, com algarismos
arábicos, colocados no lado inferior
direito; as escalas, sempre que possível,
devem se situar à esquerda da figura. As
tabelas devem ser seqüencialmente
numeradas, em arábico com numeração
independente das figuras.
Tanto as figuras como as tabelas devem
ser apresentadas em folhas separadas
(uma para cada figura e/ou tabela) ao
final do texto (originais e 3 cópias). Para
garantir a boa qualidade de impressão, as
figuras não devem ultrapassar duas vezes
a área útil da revista que é de 17,5´23,5
cm. Tabelas - Nomes das espécies dos
táxons devem ser mencionados
acompanhados dos respectivos autores.
Devem constar na legenda informações
da área de estudo ou do grupo
taxonômico. Itens da tabela, que estejam
abreviados, devem ter suas explicações na
legenda.
As ilustrações devem respeitar a área útil
da revista, devendo ser inseridas em
coluna simples ou dupla, sem prejuízo da
qualidade gráfica. Devem ser
apresentadas em tinta nanquim, sobre
papel vegetal ou cartolina ou em versão
eletrônica,
gravadas em .TIF, com resolução de pelo
menos 300 dpi (ideal em 600 dpi). Para
pranchas ou fotografias - usar números
arábicos, do lado direito das figuras ou
fotos. Para gráficos - usar letras
maiúsculas do lado direito.
As fotografias devem estar em papel
brilhante e em branco e preto.
Fotografias coloridas poderão ser
aceitas a critério da Comissão
Editorial, que deverá ser previamente
consultada, e
se o(s) autor(es) arcar(em) com os
custos de impressão.
As figuras e as tabelas devem ser
referidas no texto em caixa alta e baixa,
de forma abreviada e sem plural (Fig. e
Tab.). Todas as figuras e tabelas
apresentadas devem, obrigatoriamente, ter
chamada no texto. Legendas de pranchas
necessitam conter nomes dos táxons com
respectivos autores. Todos os nomes dos
gêneros precisam estar por extenso nas
figuras e tabelas. Gráficos - enviar os
arquivos em Excel. Se não estiverem em
Excel, enviar cópia em papel, com boa
qualidade, para reprodução.
As siglas e abreviaturas, quando
utilizadas pela primeira vez, devem ser
precedidas do seu significado por
extenso. Ex.: Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE); Microscopia
Eletrônica de Varredura (MEV). Usar
unidades de medida de modo abreviado
(Ex.: 11 cm; 2,4 µm), o número separado
da unidade, com exceção de percentagem
(Ex.: 90%). Escrever por extenso os
números de um a dez (não os maiores),
a menos que seja medida. Ex.: quatro
árvores; 6,0 mm; 1,0-4,0 mm;125
exsicatas. Em trabalhos taxonômicos o
material botânico examinado deve ser
selecionado de maneira a citarem-se
apenas aqueles representativos do táxon
em questão e na seguinte ordem: PAÍS.
Estado: Município, data, fenologia,
coletor(es) n úmero do(s) coletor(es)
(sigla do Herbário). Ex.: BRASIL. São
Paulo: Santo André, 3/XI/1997, fl. fr.,
Milanez 435 (SP). No caso de mais de
três coletores, citar o primeiro seguido de
et al. Ex.: Silva et al. (atentar para o que
deve ser grafado em CAIXA ALTA,
Caixa Alta e Baixa, caixa baixa, negrito,
itálico). Chaves de identificação devem
ser, preferencialmente, indentadas.
Nomes de autores de táxons não devem
aparecer.
17
Os táxons da chave, se tratados no texto,
devem ser numerados seguindo a ordem
alfabética. Ex.:
1. Plantas terrestres
2. Folhas orbiculares, mais de 10 cm
diâm.................................2. S. orbicularis
2. Folhas sagitadas, menos de 8 cm
compr................................. 4. S. sagittalis
1. Plantas aquáticas
3. Flores brancas .............1. S. albicans
3.Flores vermelhas.........3. S. purpurea
O tratamento taxonômico no texto deve
reservar o itálico e o negrito simultâneos
apenas para os nomes de táxons válidos.
Basiônimo e sinonímia aparecem apenas
em itálico. Autores de nomes científicos
devem ser citados de forma abreviada, de
acordo com índice taxonômico do grupo
em pauta (Brummit & Powell 1992 para
Fanerógamas). Ex.:
1. Sepulveda albicans L., Sp. pl. 2: 25.
1753.
Pertencia albicans Sw., Fl. bras. 4: 37,
t. 23, f. 5. 1870.
Fig. 1-12
Subdivisões dentro de Material e métodos
ou de Resultados e/ou discussão devem
ser escritas em caixa alta e baixa, seguida
de um traço e o texto segue a mesma
linha. Ex.: Área de estudo - localiza-se ...
Resultados e discussão devem estar
incluídos em conclusões.
-Agradecimentos (em caixa alta e baixa,
negrito, deslocado para a esquerda):
devem ser sucintos; nomes de pessoas e
Instituições devem ser por extenso,
explicitando o porquê dos
agradecimentos.
-Referências bibliográficas
- Ao longo do texto: seguir esquema
autor, data. Ex.:
Silva (1997), Silva & Santos (1997),
Silva et al. (1997) ou Silva (1993; 1995),
Santos (1995; 1997) ou (Silva 1975;
Santos 1996;
Oliveira 1997).
- Ao final do artigo: em caixa alta e baixa,
deslocado para a esquerda; seguir ordem
alfabética e cronológica de autor(es);
nomes dos periódicos e títulos de livros
devem ser grafados por extenso e em
negrito. Exemplos:
Santos, J. 1995. Estudos anatômicos em
Juncaceae. Pp. 5-22. In: Anais do
XXVIII Congresso Nacional de
Botânica. Aracaju 1992. São Paulo,
HUCITEC Ed. v.I.
Santos, J.; Silva, A. & Oliveira, B. 1995.
Notas palinológicas. Amaranthaceae.
Hoehnea 33(2): 38-45.
Silva, A. & Santos, J. 1997. Rubiaceae.
Pp. 27-55. In: F.C. Hoehne (ed.). Flora
Brasilica. São Paulo, Secretaria da
Agricultura do Estado de São Paulo.
Para maiores detalhes consulte os
últimos fascículos rescentes da Revista,
ou os links da mesma na internet:
www.botanica.org.br. ou ainda artigos
on line por intermédio de
www.scielo.br/abb.
Não serão aceitas Referências
bibliográficas de monografias de
conclusão de curso de graduação, de
citações resumos simples de Congressos,
Simpósios, Workshops e assemelhados.
Citações de Dissertações e Teses devem
ser evitadas ao máximo; se necessário,
citar no corpo do texto. Ex.:
J. Santos, dados não publicados ou J.
Santos, comunicação pessoal.
18
________________________________________________________________________________________
1
Parte da Dissertação de Mestrado da primeira Autora
2
Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul/ Bolsista Fundect
3
Docente Orientadora, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Departamento de Biologia C. Postal 549, CEP 79070-
900 Campo Grande, MS, Brasil
4
Docente Colaboradora, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Departamento de Química
2, 3
Autores para correspondência: [email protected]
Estrutura, histoquímica e atividade antioxidante da folha e do
caule de Nymphaea amazonum Mart. & Zucc. procedente do
Pantanal/MS, Brasil
1
Rosana Aparecida Gabriel Adamowicz
2
, Edna Scremin Dias
3
e Neli K. Honda
4
RESUMO - (Estrutura, histoquímica e atividade antioxidante da folha e do caule de Nymphaea amazonum Mart. & Zucc.
procedente do Pantanal/MS, Brasil) A estrutura, histoquímica e atividade antioxidante de folhas e do cormo de Nymphaea
amazonum são descritas, evidenciando adaptações ao solo alagado sob condições de déficit de oxigênio. O ápice meristemático
situa-se na porção superior do cormo. Na base dos pecíolos, dispostos em espiral, ocorrem numerosos tricomas tectores. O
revestimento do cormo desenvolvido é multiestratificado, contém suberina, compostos fenólicos gerais e taninos. O sistema
vascular é difuso com longas traqueídes e com floema bem densevolvido. O córtex, com espaços intercelulares evidentes, é
rico em amiloplastos. As folhas são flutuantes fixas e apresentam cloroplastos e estômatos na epiderme da face adaxial,
hidropótios na epiderme da face abaxial do limbo e no pecíolo. O mesofilo é dorsiventral, com várias camadas de parênquima
paliçádico e parênquima esponjoso com lacunas aeríferas e astroesclereídes. Compostos fenólicos gerais foram encontrados na
epiderme do limbo e do pecíolo, no parênquima paliçádico, na região da nervura mediana e no parênquima do pecíolo.Taninos
ocorrem na epiderme do limbo, nas células do parênquima do pecíolo, próximo aos feixes vasculares centrais. Lignina foi
observada apenas nas esclereídes e nas traqueídes. Testes fitoquímicos revelaram taninos em maior concentração, e
esteróis/triterpenos em menor concentração tanto nas folhas quanto no cormo, além de alta atividade antioxidante.
Palavras –Chave: Pantanal, anatomia, histoquímica, atividade antioxidante, macrófitas aquáticas.
ABSTRACT –
(Structure, histochemistry and antioxidant activity of the leaf and stem of Nymphaea amazonum Mart. &
Succ. proceeding from Pantanal/MS, Brazil). Structure, histochemistry and antioxidant activity of leaves and rhizome of
Nymphaea amazonum are described, making evident the adaptations to flooded soil under conditions of oxygen deficiency.
The meristematic apex is located in the superior portion of the circular corm. Plentiful trichomes occur at the insertion of
petioles disposed in a spiral. The revetment of developed corm is multistratified, has suberin, general fenolic compounds and
tannins. The vascular system is diffused with long tracheids and a well developed phloem. The cortex, with evident
intercellular spaces is rich in amyloplasts. The leaves are floating and fixed and present chloroplasts in adaxial face of
epidermis, and hydropotes in abaxial face of epidermis of leaf blade and petiole. The mesophyll is dorsiventral, with several
layers of palisade parenchyma and spongy parenchyma with air lacunae and astrosclereids. General fenolic compounds were
found in the epidermis of blade and petiole, in palisade parenchyma, in the region of mean vein and in the parenchyma of
petiole, near to central vascular bundles. Lignin was observed only in sclereids and tracheids. Phytochemical tests showed
higher concentration of tannins, and sterols/triterpens in lower concentration either in leaves as in corm, besides the high
antioxidant activity.
Key-words: Pantanal, anatomy, histochemistry, antioxidant activity, aquatic macrophytes.
; screm[email protected]
19
Introdução
A conquista do ambiente terrestre pelas plantas vasculares foi um grande avanço em termos
evolutivos. A adaptação dos órgãos vegetativos ao ambiente seco e, principalmente, a possibilidade de
realizar a fertilização sem depender da água, propiciaram a vasta dispersão das plantas vasculares,
principalmente das angiospermas predominantes na atualidade. Contudo, algumas poucas briófitas,
pteridófitas e angiospermas, principalmente as herbáceas, retornaram ao ambiente aquático. Na água elas
passaram a viver e se reproduzir, estando em parte ou totalmente submersas. No retorno ao ambiente
primitivo, as atuais plantas aquáticas desenvolveram, ao longo do curso evolutivo, várias características
anatômicas que minimizam os efeitos dos diversos fatores ambientais aos quais estão submetidas. O
sucesso da colonização destas espécies no ambiente aquático é determinado por estas características
(Scremin-Dias et al., 1999; Sculthorpe, 1967; Cronk & Fennessy, 2001).
Células epidérmicas com cutícula delgada e brilhante, hidropótios (estruturas epidérmicas que
realizam absorção de água e sais), redução dos tecidos de condução e sustentação, presença de
parênquima aerífero bem desenvolvido distribuído nas raízes, caules e folhas, as quais permitem a
flutuação e o armazenamento de oxigênio, são algumas características relacionadas a evitar os efeitos dos
fatores extremos que o ambiente aquático impõe as macrófitas aquáticas (Scremin-Dias et al., 1999).
Publicações clássicas relacionam uma série de estruturas e/ou mecanismos que as plantas aquáticas
possuem e que estão associados a sua adaptação e sobrevivência no ambiente aquático (Sculthorpe,
1967). Dentre essas características ressalta-se o alongamento dos pecíolos logo após a subida do nível da
água (Scremin-Dias, 2000) e desenvolvimento de caules com numerosas raízes adventícias, com a função
de ancorar a planta ao solo alagado (Sculthorpe, 1967; Scremin-Dias et al., 1999).
A interação do ambiente com os mecanismos fisiológicos das plantas promove o estímulo da síntese
de compostos especiais, os metabólitos secundários. Estes são componentes importantes para a
sobrevivência e reprodução dos vegetais, podendo estar relacionados tanto com respostas aos fatores
bióticos como abióticos. Tais compostos podem ser sintetizados em resposta ao ataque de herbívoros ou
patógenos, como as fitoalexinas, ou serem expressos constitutivamente (Castro et al, 2004; Santarém,
2006).
Segundo Visser et al. (2003) a baixa concentração de oxigênio e a re-oxigenação que ocorre com a
retirada de água do solo alagado no período de seca, juntos, promovem a geração de espécies de oxigênio
reativo (ROS), os quais são possíveis fitotoxinas que afetam os tecidos de plantas de áreas alagáveis.
Mecanismos de proteção contra ROS envolvendo produção de compostos com atividade antioxidante, são
características essenciais para plantas tolerantes ao alagamento, ajudando a proteger os lipídios e
macromoléculas contra os efeitos dos danos oxidativos (Visser et al., 2003).
20
Os radicais livres, presentes também no organismo humano, são gerados por diversas reações
biológicas, capazes de danificar biomoléculas vitais que mantém a integridade celular, podendo acelerar o
desenvolvimento de patologias como câncer, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. (Fan et al.,
2006; Nabasree, 2006). Estudos recentes revelam que compostos presentes em vegetais como ácido
ascórbico, vitamina E, flavonóides, taninos e outros compostos fenólicos, apresentam potencial
antioxidante. Estes têm despertado grande interesse na área médica, devido à habilidade de estabilizar as
moléculas dos radicais livres, reduzindo os danos associados às doenças acima citadas (Gil et al., 2005;
Nabasree, 2006; Siddhuraju & Becker, 2006). De acordo com pesquisa realizada por Gil et al. (2005),
plantas que se desenvolvem em áreas alagadas, solos arenosos e elevada incidência luminosa, como é o
caso do Pantanal, apresentam características geralmente associadas à produção de fitoantioxidantes.
A família Nymphaeaceae destaca-se no Pantanal por sua ampla distribuição e é representada por
espécies de hábito flutuante fixo, com folhas flutuantes conectadas ao órgão submerso por longos
pecíolos (Cronk & Fennessy, 2001). As espécies com órgãos flutuantes, como as folhas de N. amazonum,
exibem características morfológicas e anatômicas que permitem grande estabilidade e resistência contra
dilaceração provocada pelo movimento da água e imersão causada pelo vento e pela chuva. Isso é
decorrente da presença de folha peltada, circular com a margem inteira e superfície repelente à água, além
do pecíolo flexível (Sculthorpe, 1967).
Nymphaea amazonum Mart. & Zucc., de distribuição neotropical, conhecida popularmente como
lírio d’água, camalote-da-meia-noite, dama da noite, batata-d’ água, é herbácea aquática, flutuante fixa,
com folhas levemente peltadas, geralmente com manchas avermelhadas, nervuras radiais salientes e com
anel de pêlos no ápice do pecíolo (Pott, 1998).
Além de ser utilizada por vários animais como alimento, abrigo e local de desova, também tem sido
utilizada como planta medicinal pela população ribeirinha (Pott & Pott, 2000). As folhas de N. amazonum
são utilizadas como cicatrizantes de feridas e úlceras, o suco da raiz é usado em banho, cataplasma e
emplasto para hemorróidas (Balbach, 1969; Pott & Pott, 2000).
Marquina et al. (2005) ressaltam que o interesse sobre o estudo de representantes da família
Nymphaeaceae aumentou nas últimas décadas devido ao fato da sua posição taxonômica não estar bem
definida. Segundo Judd et al. (1999), esta família está enquadrada dentro do grupo das “paleohervas” e,
análises cladísticas baseadas em dados moleculares e morfológicos suportam sua posição como grupo
parafilético dentro da divisão das angiospermas.
Investigações que caracterizam a morfologia e a composição química, assim como a anatomia dos
tecidos e demais estruturas secretoras presentes nos órgãos vegetativos por meio da histoquímica, são
escassas para a maioria das espécies brasileiras e, principalmente, em macrófitas aquáticas.
21
Conhecimentos em diferentes escalas, abordagens e ecossistemas permitem ampliar a visão da
função das macrófitas aquáticas, de sua biologia e ecologia, demonstrando seu potencial de uso em
sistemas naturais, contribuindo para o manejo e conservação desses ambientes (Pott & Pott, 2000;
Pompêo & Moschini-Carlos, 2003).
O presente trabalho descreve os aspectos estruturais e histoquímicos das folhas e cormo de
Nymphaea amazonum Mart. & Zucc., seu potencial antioxidante e evidencia as adaptações que permitem
seu perfeito estabelecimento em solos permanentemente alagados sob condições de baixa concentração de
oxigênio.
Material e métodos
Folhas e cormos completamente desenvolvidos de N. amazonum foram coletados no Pantanal nas
áreas de influência dos rios Miranda e Abobral, em lagoas e caixas de empréstimo ao longo da Estrada
Parque Pantanal e nas adjacências da Base de Estudos do Pantanal (BEP) da Universidade Federal do
Mato Grosso do Sul (S19°25’30.8” W57°02’50.2”), nos meses de maio e junho do ano de 2005 e em abril
e junho de 2006. Nos períodos de maio e abril o nível da água apresentou-se mais elevado e, em
detrimento a isso, observou-se maior abundância na distribuição de N. amazonum. Nos meses de junho de
2005 e 2006 houve diminuição do nível da água em decorrência do escoamento que ocorre anualmente
nesse período na região, acarretando em menor quantidade de indivíduos da espécie em estudo. Segundo
informações descritas por Cardoso et al. (2000), o Pantanal possui clima tropical subúmido (Aw), com
médias anuais de chuva em torno de 1.100 mm, sendo a estação chuvosa de outubro a março e
relativamente seca de abril a setembro, podendo variar anualmente. A temperatura média anual é de
25,5°C, oscilando entre 20,7°C e 28,0°C, onde a média anual da temperatura máxima é de 31,5°C, sendo
que as máximas absolutas no período de setembro a janeiro ultrapassam 40°C (Soriano et al., 1997).
O material coletado foi fixado em formalina neutra tamponada (Kraus & Arduin, 1997) por 24
horas, lavado abundantemente em água corrente e posteriormente conservados em álcool 70%.
Para a confecção de lâminas permanentes, o cormo foi desidratado em série alcoólica ascendente,
mantido em bomba á vácuo e, posteriormente, emblocado em parafina e cera de abelha a 6%, de acordo
com técnicas usuais. Secções transversais e longitudinais do material emblocado foram feitas em
micrótomo rotatório e, posteriormente, afixadas em lâmina com gelatina glicerinada de Bissing. Após
desparafinização e desidratação em série alcoólica, o material passou por dupla coloração com azul de
astra e safranina, sendo montadas lâminas com resina Entellan (Kraus & Arduin, 1997). O bordo, a região
mediana e o pecíolo foram emblocados em historesina e as lâminas, montadas a partir de secções
transversais feitas em micrótomo rotatório, foram posteriormente coradas com azul de toluidina.
22
Para os cortes à mão livre, após diafanização em solução de hipoclorito de sódio a 20% e dupla
coloração (azul de astra e safranina), as lâminas foram montadas em glicerina e lutadas com esmalte de
unha incolor.
Os testes histoquímicos foram realizados a partir das folhas e cormo recém coletados, seguindo as
seguintes técnicas:
1. Lactonas sesquiterpênicas: Os cortes foram diretamente montados em ácido sulfúrico (Geissmen
& Griffin, 1971).
2. Terpenóides com grupos carbonila: Os cortes foram colocados em solução saturada de 2,4
dinitrofenilhidrazina em HCl (Ganter & Jollés, 1970).
3. Compostos fenólicos: foi aplicado nas amostras Cloreto de Ferro III a 10% (Johansen, 1940).
4. Alcalóides: foi aplicado às amostras o reagente de Wagner (Furr & Mahlber, 1981).
5. Taninos: os cortes foram tratados com vanilina a 0,5% em ácido clorídrico a 9% (Mace &
Howell, 1974).
6. Lignina: foi aplicado às amostras, floroglucinol em ácido clorídrico a 20% ( Johansen, 1940).
7. Suberina: as amostras foram tratadas com Sudam III em etanol 80% durante 25 minutos ( Kraus
& Arduin, 1997).
A análise e ilustração do material foram realizadas em microscópio Leica – DM LB acoplado ao
sistema de captura de imagens e fotografia, sendo projetadas as escalas micrometradas correspondentes.
Além dos testes histoquímicos foi realizada também triagem fitoquímica e cromatográfica, segundo
técnicas descritas por Matos (1988), como análise complementar dos dados microquímicos. Para tal, as
folhas e caule de N. amazonum foram coletados e desidratados à temperatura ambiente. Após a secagem,
foram triturados e moídos em processador Walita. A extração foi feita a partir de 40 gramas do pó, sob
refluxo, com etanol, por duas horas e filtrado em papel de filtro. O volume foi acertado para 200 mL. Os
compostos pesquisados foram:
a) Esteróides/triterpenóides: o teste foi realizado por reação de Liebermann-Buchard.
b) Alcalóides: os testes foram realizados com os reativos de Mayer, Dragendorff e Bouchardat.
c) Taninos: sua presença foi pesquisada por meio de reações com solução de cloreto de ferro III a
2% em água, e com solução de gelatina a 0,5%.
d) Saponinas: a pesquisa foi feita por meio da observação da formação e persistência de espuma,
após agitação.
O extrato bruto foi cromatografado em placa de sílica gel eluída com acetato de etila: n-propanol :
H
2
O (80:18:2 v/v). A revelação foi realizada com solução de metanol contendo 10% de ácido sulfúrico.
Após o aparecimento das manchas foi aplicado sobre a placa solução sulfúrica de p-anisaldeído (Stahl,
1969).
23
A atividade seqüestradora de radical livre para os extratos etanólicos foi determinada utilizando o
teste com o radical livre DPPH (difenilpicrilhidrazina), em uma série de diluições, misturando-se 5ml de
solução de DPPH (0,004 % em etanol) com quantidades apropriadas do extrato bruto de N. amazonum
(concentrações variando entre 0,3mg/ml – 10mg/ml). Após 30 minutos, a quantidade dos radicais de
DPPH foi registrada em UV visível no comprimento de onda 517mm. Foi utilizado como padrão o
antioxidante sintético BHA (hidroxibutilanisol) com IC
50
de 0,17mg/ml). A eficiência antiradicalar foi
estabelecida utilizando a análise de regressão linear obtido por meio do programa Exell. Os resultados
foram expressos pelo valor da IC
50
(Concentração Inibitória de 50%) que representa a concentração da
amostra necessária para seqüestrar 50% dos radicais de DPPH (Silva et al., 2006).
Resultados e discussão
Caule: o caule de N. amazonum é um cormo na forma circular, tendo na porção superior, ao nível da
superfície do solo, o ápice meristemático e, ao redor deste, a inserção de pecíolos dispostos em espiral
(Fig.1). O comprimento dos pecíolos varia no mesmo indivíduo e entre indivíduos diferentes, tendo sido
observados variações entre 30cm a 2,15m de comprimento, dependendo do nível da lâmina da água.
Grande parte da circunferência do cormo é ocupada pelas bases dos pecíolos e escapos florais. Na base do
pecíolo há grande quantidade de tricomas tectores pluricelulares e unisseriados. Weidlich (1976),
estudando espécies de três subgêneros de Nymphaea, observou características anatômicas semelhantes ao
caule de N. amazonum que, aparentemente, é padrão para as espécies. .
Em indivíduos adultos, pode ocorrer o desenvolvimento de gema axilar que origina um estolho (Fig.
1). Este é desprovido de tricomas e possui crescimento limitado – aproximadamente 10 cm. Não há
articulação de nós e entrenós e a nova planta é emitida no ápice do estolho, permanecendo por algum
tempo, ainda conectada ao cormo da planta mãe (Fig. 1). A propagação vegetativa por meio de estolhos,
pode ocorrer a partir de cormos velhos – sem a presença de folhas -, ou de cormos jovens ainda em
atividade. Weidlich (1976) denominou esta estrutura de “tubérculos horizontais” presente em espécies do
gênero Nymphaea, cuja origem está relacionada com a dormência em decorrência da sazonalidade –
diminuição do nível da água ou período de seca. A gema apical está disposta na região superior do cormo,
totalmente protegida pelas bases dos pecíolos e pelos tricomas unisseriados multicelulares, visíveis a olho
nu. Numerosas raízes adventícias estão dispostas ao longo de todo o perímetro do cormo, inclusive entre
os pecíolos, sendo algumas contráteis, o que mantém o caule em um nível constante no substrato (Fig. 1).
O cormo da planta adulta possui coloração castanho-escura com sistema de revestimento de superfície
áspera recoberto por tricomas tectores longos e persistentes (Fig 1).
24
Envolvendo o meristema apical em formato de domo, há uma região plana e rica em tricomas
(Fig. 2). As iniciais meristemáticas são em número restrito, não sendo possível visualizar a organização
da túnica e corpo no promeristema. Esta organização do meristema apical introduzida por Schimidt em
1924, é descrita com sendo comum para maioria das angiospermas. No entanto, a organização do
meristema apical de angiospermas pode variar dependendo da fase ontogenética da planta, diferir entre
meristemas apicais e laterais em uma mesma planta, ou ainda em decorrência das alterações que as
flutuações sazonais causam no crescimento da planta (Martin & Tucker 1985; Hara 1962). Logo abaixo
das células iniciais meristemáticas podem ser distintas as derivadas imediatas, que sofrem divisões
predominantemente anticlinais, (Fig. 2). Bem próximo ao promeristema já são distintos os cordões
procambiais envoltos por meristema fundamental, cuja vacuolização é bem evidente (Fig. 2). Esta espécie
apresenta quatro cordões de procâmbio os quais, ao se desenvolverem, se anastomosam e ramificam
dando origem aos traços foliares e do escapo floral, além de se direcionarem para as raízes adventícias.
As unidades vasculares posicionadas no centro do cormo (Fig. 3) são predominantemente anficrivais (Fig.
4), podendo ocorrer unidades vasculares colaterais ao longo do órgão.
No cormo completamente desenvolvido, o sistema vascular é complexo, tendo unidades vasculares
distribuídas de forma concêntrica na região central do caule e envoltas por parênquima medular (Fig. 3).
Elementos do xilema constituídos por traqueídes com espessamento helicoidal (Fig. 5), em geral são
margeadas por floema com elementos de tubo crivado de lume amplo com placas crivadas evidentes e
transversas (Fig. 6). As observações do sistema vascular desta espécie foram feitas por meio de
microscopia óptica, a qual apresenta certas limitações na visualização de detalhes das estruturas. Ressalta-
se aqui a necessidade do estudo de ultraestrutura dos elementos traqueáreos do xilema, tanto no caule
como na folha, para a obtenção de dados mais consistentes sobre a organização da estrutura destes.
Weidlich (1976) apresentou amplo estudo sobre a organização do sistema vascular de três subgêneros de
Nymphaea elucidando a complexa rede formada pelas unidades vasculares do caule, bem como sua
constituição nos traços de folha, escapo floral e raízes. Este autor denomina os feixes procambiais centrais
de feixes axiais, que são envoltos por feixes satélites colaterais. No presente trabalho, elaborado com N.
amazonum, não foi empregada a mesma técnica utilizada por Weidlich (1976), no entanto, com base neste
autor, acredita-se que os feixes colaterais observados correspondem aos feixes satélites citados.
O caule adulto é inicialmente recoberto por epiderme com numerosos tricomas tectores
pluricelulares unisseriados e visíveis a olho nu (Fig. 2 e 7). Bem próximo do meristema apical notam-se
divisões periclinais, aparentemente de derivadas imediatas da protoderme (Fig. 7) formando, no cormo
adulto, a parte mais externa do sistema de revestimento, a qual é persistente (Fig. 8 e 9). Concomitante às
divisões das células epidérmicas, a camada subjacente, caracterizada pela parte mais externa do córtex,
também sofre divisões periclinais, originando várias camadas de células que são suberizadas quando
25
diferenciadas, além de numerosas esclereídes no limite entre o que constitui o sistema de revestimento
adulto e as células corticais ( Fig. 8 e 9), formando assim, o que Raven et al. (2001) definem como
epiderme multiestratificada. Nessa espécie a origem do sistema de revestimento pode ser considerada
mista, não sendo possível distinguir um felogênio típico. Segundo Metcalf & Chalk (1979) é difícil obter
a distinção entre epiderme multiestratificada de uma hipoderme ontogeneticamente formada por divisões
das camadas subepidérmicas.
Cutter (1987) cita que algumas Monocotiledôneas apresentam súber estratificado que não é
originado pelo felogênio e sim por divisões periclinais das células superficiais do parênquima, formando
fileiras radiais de células suberizadas, semelhante ao que ocorre com Nymphaea que não forma felogênio
típico, tendo o sistema de revestimento do caule adulto pluriestratificado.
O córtex externo consiste de parênquima com células estreladas com braços curtos presentes nas
regiões de onde partem as bases dos pecíolos. As células parenquimáticas da medula e do córtex interno
apresentam paredes finas com espaços intercelulares bem evidentes e grandes quantidades de
amiloplastos (Fig. 7 e 8).
Secções transversais do estolho demonstram numerosas lacunas aeríferas onde se observa a
presença de astroesclereídes, principalmente nas células próximas aos feixes vasculares O estolho possui
de 4 - 5 feixes vasculares colaterais (Fig. 10), entre os quais um deles possui maior quantidade de floema
que os demais (Fig. 11) e cada feixe é envolvido por endoderme com estrias de Caspary (Fig. 13),
caracterizando um monostelo. Albiero et al (2005) citam que a presença de monostelos é comum em
Piperaceae e também em monocotiledôneas.
Limbo foliar e pecíolo - a epiderme do limbo foliar de N. amazonum é unisseriada com raros
cloroplastos (Fig. 14), células de altura regular e contorno variando de retangular à quadrangular em
secção transversal (Fig. 14). As paredes anticlinais são sinuosas nas regiões internervurais e retas sobre as
nervuras, quando observadas em secção paradérmica (Fig. 15). A cutícula delgada é conspícua na
superfície adaxial (Fig. 14) quando comparada com a abaxial. As células da epiderme do pecíolo
apresentam paredes retas e são mais longas que largas em secção paradérmica (Fig. 16). Em secção
transversal seguem o mesmo padrão descrito para a epiderme do limbo. A presença de cutícula
ligeiramente espessa e brilhante na face adaxial auxilia na repelência da água em folhas flutuantes
(Gonzalez, 2002) e, segundo Fahn (1990), a epiderme recoberta por cutícula fina, não desempenha a
função de proteção contra a transpiração em plantas aquáticas, mas sim facilita a absorção de nutrientes –
face abaxial -, e trocas gasosas, visto que essas plantas não sofrem com o problema da dessecação.
Hidropótios, distribuídos aleatoriamente, ocorrem na epiderme do pecíolo e na face abaxial do
limbo, sendo constituídos por três células – uma basal ao nível das demais células epidérmicas, uma
mediana cuja parede periclinal interna é mais espessada, e a apical cuja extremidade é arredondada. Esta
26
célula e a célula mediana produzem mucilagem quando jovem (Fig. 17, 18) e, a célula basal possui
maior número de cloroplastos, quando comparada com as demais células epidérmicas. Geralmente em
material preparado de folhas adultas, a célula apical é eliminada tanto nas folhas como nos pecíolos,
restando somente a célula basal e a célula mediana, que possui formato côncavo e espessamento
acentuado da parede periclinal interna (Fig. 17, 18).
Solereder (1908) já havia descrito a presença de pêlos mucilaginosos na epiderme das folhas de
espécies deste gênero, utilizando como exemplo, ilustrações de tricomas que se assemelham aos
hidropótios observados em N. amazonum e Gonzalez (2002) descreve a constituição dos hidropótios de N.
amazonum com três células concordando com o descrito neste trabalho. Também Metcalfe & Chalk
(1979) ao conceituar hidropótios ilustram estas estruturas em espécies de Nymphaea como tendo três
células, no hidropótio adulto. Ressalta-se aqui a necessidade do estudo da ultraestrutura dos hidropótios,
tanto em folhas jovens quanto adultas, para obtenção de dados conclusivos para saber se a abscisão da
célula apical torna o hidropótio não funcional, haja vista que a mínima manipulação das folhas,
principalmente as adultas, promove a separação da célula apical das demais constituintes dos hidropótios
(Fig. 17).
Os hidropótios têm sido citados por vários autores como estruturas que facilitam o transporte de
água e íons para dentro da planta, os quais são translocados por meio do sistema vascular no mesofilo
(Sculthorpe, 1967; Fahn, 1990; Greulich et al., 2001; Lavid et al., 2001a).
Tricomas tectores unisseriados, pluricelulares, robustos, de tamanhos variados, são bem evidentes
tanto na base do limbo quanto na base do pecíolo (Fig. 19 e 20). As células que compõem estes tricomas
têm contorno retangular e evidentemente são mais alongadas na base dos pecíolos quando comparadas
com as da região da junção do limbo com o pecíolo (Fig. 19 e 20). O anel de tricomas muito alongados na
base do limbo e visível a olho nu é importante caráter para a identificação da espécie estudada (Pott
1998).
Estômatos anomocíticos, dispostos ao nível das células epidérmicas, estão presentes apenas na face
adaxial das folhas (Fig. 15), corroborando com a descrição de Mauseth (1988) e Gonzalez (2002) para o
gênero, e Solereder (1908) para a família Nymphaeaceae. A parede periclinal externa das células
oclusoras se projeta acima da superfície epidérmica formando crista estomática. A câmara subestomática
interrompe uma ou mais camadas de células do parênquima paliçádico (Fig. 21). A presença de estômatos
na superfície adaxial das folhas flutuantes de plantas aquáticas permite a perda de vapor de água, além de
facilitar a absorção de oxigênio e dióxido de carbono (Sculthorpe, 1967). A manutenção do fluxo hídrico
em plantas aquáticas, proporcionada pela alta densidade de estômatos que se mantêm abertos
constantemente, é muito importante para a absorção de nutrientes que se encontram dissolvidos no solo
alagado (Sculthorpe, 1967).
27
O mesofilo dorsiventral possui parênquima paliçádico com três a quatro estratos de células
alongadas de tamanhos variados (Fig. 21, 22 e 23) e ricas em cloroplastos, corroborando o descrito por
Gonzalez (2002) para esta espécie. Pode-se observar a presença de células coletoras entre as células do
parênquima paliçádico e esponjoso, cujo formato é bem variado (Fig. 22).
O aerênquima de amplas lacunas se estende ao longo do pecíolo e do limbo formando uma rede
poligonal de células volumosas (Fig. 23 e 24), que no limbo constitui o parênquima esponjoso, formando
uma malha de grandes canais de ar. No pecíolo, as maiores lacunas aeríferas estão distribuídas no centro e
diminuem à medida que se aproximam da periferia do órgão (Fig. 24). Diafragmas interrompendo as
lacunas têm distribuição restrita, sendo observados somente na região da junção do pecíolo com o limbo
foliar (Fig. 25). A presença de diafragma nas folhas de N. amazonum é descrição inédita para esta espécie,
e consiste em importante característica adaptativa das plantas que habitam ambiente aquático. Sculthorpe
(1967) relata que o número e tamanho das lacunas aeríferas variam de acordo com a idade, a natureza do
órgão e a espécie. Conard (1905) descreve que o padrão das lacunas para o gênero Nymphaea é variável
nas diversas espécies. Dalla Vecchia et al. (1999) e Coan et al. (2002) descrevem que a presença de
tecido aerenquimatoso altamente compartimentado em plantas aquáticas é uma adaptação importante,
pois dessa forma, elas conseguem estocar um mínimo de oxigênio requerido nesse tipo de ambiente e o
transportam das folhas até a raiz.
O bordo foliar é agudo, onde se observa nítida redução do número de células do parênquima
paliçádico em direção a este, possui duas camadas de parênquima regular, sem parênquima esponjoso e
tecido de sustentação (Fig. 26), seguindo o padrão descrito por Esau (1976) e Fahn (1990) para as plantas
aquáticas em geral, e para N. amazonum por Gonzales (2002).
Esclereídes no formato de astroesclereídes ocorrem principalmente entre as células que limitam
longitudinalmente as lacunas aeríferas do limbo e pecíolo. No parênquima paliçádico as esclereídes
possuem formato laminar e algumas delas se ramificam para dentro da lacuna aerífera (Fig. 27 e 28). Sua
origem ocorre tardiamente por meio da diferenciação de uma célula do meristema fundamental, quando as
lacunas aeríferas já estão desenvolvidas. Estas características já foram descritas por Gonzalez (2002) para
esta espécie e, Gaudet (1960), estudando a ontogênese de esclereídes em folhas de Nymphaea odorata
Aiton, observou desenvolvimento semelhante ao encontrado N. amazonum. Segundo Sculthorpe (1967),
essas células especializadas dão suporte mecânico e aparecem em uma ontogenia tardia dos órgãos
quando os tecidos aumentam de volume.
Ao final da diferenciação, as esclereídes possuem paredes fortemente lignificadas com cristais de
oxalato de cálcio (Fig. 27). Incrustações de oxalato de cálcio foram citadas por Fahn (1990) como sendo
comuns às esclereídes de espécies de Nymphaea. Para este autor, a localização, tipo e aparência dos
cristais de oxalato de cálcio, comuns em células vegetais, são importantes na delimitação das espécies.
28
Gaudet (1960) descreve que cristais aparecem entre a parede primária e secundária, durante a fase final
do processo de maturação das esclereídes de folhas de N. odorata.
Os três feixes vasculares que ocorrem na região da nervura mediana do limbo, dispostos
paralelamente à maior superfície foliar, possuem tamanhos distintos sendo o maior localizado próximo à
face abaxial, enquanto o de menor porte, está próximo à face adaxial (Fig. 29). Todas as unidades
vasculares do limbo são colaterais, ocorrendo maior número de células de floema, quando comparado
com o xilema (Fig. 30). Algumas unidades vasculares menores possuem somente floema e as lacunas de
protoxilema são menores quando comparadas com aquelas do pecíolo.
A nervura mediana e as laterais de maior porte são bem proeminentes e possuem toda a sua
extensão preenchida por aerênquima, tendo na face abaxial colênquima angular típico (Fig 31). Na face
adaxial o parênquima paliçádico é interrompido por poucas células de parênquima (Fig. 29). As unidades
vasculares do mesofilo distribuem-se na interface parênquima paliçádico e parênquima esponjoso, sendo
os feixes internervurais menores que aqueles da nervura central com feixes colaterais abertos (Fig. 23 e
30).
No pecíolo as unidades vasculares são caracterizadas por possuírem grande lacuna de protoxilema.
Estas se originam por processo esquizógeno, são circundadas por células de parênquima, cujas paredes
periclinais internas são mais espessas e revestidas por substâncias de caráter lipídico (Fig. 32). O pecíolo
possui dois feixes vasculares maiores, que podem ser bicolaterais ou colaterais abertos (Fig. 33 e 34),
dispostos abaixo do parênquima cortical, na região mediana e em posição oposta um a outro (Fig.24).
Estes possuem uma grande lacuna de protoxilema central, tendo elementos de tubo crivado com lume
muito amplo. Entre estas unidades vasculares, e posicionados no centro do pecíolo, ocorrem dois feixes
colaterais menores, cujo xilema é constituído somente pela lacuna de protoxilema, ou ainda só possuir
somente cordões de floema (Fig. 24 e 35). As demais unidades vasculares (15-17) estão distribuídas na
periferia do pecíolo, sempre ocorrendo unidades maiores e menores intercaladas. Na maioria das unidades
menores não ocorre lacuna de protoxilema e sim o elemento traqueal persistente, semelhante ao que
ocorre nas unidades vasculares do limbo (Fig.30). O córtex do pecíolo possui 2 a 3 camadas de células de
colênquima posicionadas logo abaixo da epiderme seguidas pelo parênquima regular e, ao centro, as
amplas lacunas de ar, concordando com o descrito por Gonzalez (2002) para esta espécie.
De acordo com Sculthorpe (1967) e Goremykin et al. (2004), vasos são ausentes em muitos gêneros
de Nymphaeaceae, e os elementos condutores são longas traqueídes com espessamento anelar ou
espiralado, alguns ou todos eventualmente desorganizados, partindo de um xilema lacunar e um cordão de
floema em cada feixe.
Análises histoquímicas e fitoquímicas: os testes histoquímicos realizados na folha de N. amazonum
revelaram a presença de compostos fenólicos gerais na epiderme, no parênquima paliçádico e na região
29
da nervura mediana. No pecíolo estes compostos foram observados na epiderme, em algumas células
parenquimáticas que limitam as lacunas aeríferas e nas células parenquimáticas próximas aos feixes
vasculares (Fig. 34). No caule os compostos fenólicos foram observados no sistema de revestimento e em
algumas células do córtex. Taninos foram observados na epiderme do limbo, nas células do parênquima
do pecíolo, principalmente próximo aos feixes vasculares centrais (Fig 36) e nas células do sistema de
revestimento do caule.
Os fenóis pertencem a uma classe de compostos que possuem pelo menos um anel aromático, no
qual, ao menos, um hidrogênio é substituído por uma hidroxila, sendo amplamente distribuídos no reino
vegetal (Simões et al, 1999). Segundo esses autores, os compostos fenólicos abrangem metabólicos
secundários como taninos, ligninas, alcalóides e terpenóides, além de fazerem parte de moléculas
estruturais como as proteínas. Vários autores descrevem que muitos derivados de fenóis apresentam
atividade cicatrizante, antisséptica, desinfetante, anestésica, na inibição de síntese de melanina
(hidroquinona) e que a presença desses compostos em plantas, na maioria dos estudos, está relacionada
com estresse metabólico, composição da parede celular e exsudados de raízes e sementes. Eles agem
também na proteção do vegetal contra pragas, doenças e como compostos alelopáticos. (Castro et al.,
2004; Simões et al., 1999). Lignina foi detectada, como era de se esperar, somente nas esclereídes e
traqueídes. Suberina foi observada nas paredes das células do sistema de revestimento do caule.
A reação dos tecidos submetidos ao ácido sulfúrico concentrado para a detecção de lactonas
sesquiterpênicas nas folhas foi considerada não conclusiva. Houve a desintegração da maior parte dos
tecidos, mas na região da epiderme as células apresentaram seqüência de coloração similar esperada para
tais compostos. O teste para evidenciar terpenóides também foi considerado não conclusivo, talvez pela
baixa concentração destes compostos nessa espécie. Não foi detectada a presença de alcalóides em N.
amazonum.
Os estudos fitoquímicos direcionados para três principais metabólitos secundários, revelaram a
presença de taninos, em maior concentração, e esteróis/triterpenos em menor concentração nas folhas de
N. amazonum. Os testes para detectar a presença de saponinas e alcalóides nesta espécie foram negativos.
Fahn (1990) cita que os taninos são um grupo heterogêneo derivado dos compostos fenólicos que,
em secções microscópicas, usualmente aparecem como massas granulares ou corpos coloridos amarelos,
vermelhos ou marrons, podendo ser encontrados no citoplasma, no vacúolo ou na forma de gotículas, e
algumas vezes penetram na parede celular. Segundo esse autor, podem ocorrer em diferentes partes da
planta, especialmente em folha, periderme, no tecido vascular, em frutos verdes, em cascas de sementes,
em tecidos produzidos pela ação de patógenos e têm a função de proteger a planta contra desidratação,
apodrecimento e danos causados por animais.Taninos são usados comercialmente, especialmente em
indústrias de curtume de couro (Castro et al., 2004).
30
Lavid et al. (2001b) relaciona a alta concentração de taninos na folha, a presença de esclereídes e
a sua co-existência com fenol-oxidases para o gênero Nymphaea, com a habilidade de ligação com metais
pesados. Segundo esses autores isso ocorre provavelmente nas mesmas rotas metabólicas que envolvem a
produção de taninos, que também conduzem ao desenvolvimento de esclereídes.
A atividade antiradicalar do extrato etanólico de N. amazonum teve valor de 1,8mg/ml (1800 µg),
considerada bem significativa quando comparado com o padrão (BHA com IC
50
.= 0,17 mg/ml). Esse
resultado pode estar relacionado com a presença de compostos fenólicos em todos os órgãos vegetativos
desta espécie, pois estudos recentes revelam que estes compostos apresentam grande potencial
antioxidante (Nabasree, 2006).
Os resultados da análise química aqui apresentados apontam para a necessidade da realização de
testes farmacológicos para esta espécie, haja vista a utilização terapêutica desta espécie com base em
conhecimento empírico dos ribeirinhos pantaneiros (Pott & Pott, 2000).
A análise do cormo desta espécie é bem peculiar, principalmente quanto ao sistema vascular e de
revestimento. Apesar de Weidlich (1976) apresentar ampla revisão e um trabalho de ontogênese e
organização tridimensional do sistema vascular de três espécies de Nymphaea, trabalhos de ontogênese
com outras espécies do gênero e demais gêneros da família Nymphaeaceae seriam importantes para
entender a filogenia do grupo. Estes estudos, aliados aos filogenéticos, poderiam auxiliar no entendimento
da origem e evolução das Angiospermas.
Agradecimentos
Agradecimento especial à Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia
do Estado de Mato Grosso do Sul (FUNDECT), pela concessão da bolsa de Mestrado à primeira autora e
pelo financiamento do projeto. Aos estagiários do Laboratório de Botânica, em especial à Jane Rodrigues
Silva, Mariana Carolina Souza, Silvana C. H. de Medeiros e Tamires Soares Yule. Ao Laboratório de
Pesquisa do Departamento de Química (UFMS) pelo apoio nas análises fitoquímicas e ao Laboratório de
Pesticidas Naturais (UFMS) pelo auxílio nas análises de atividade antioxidante.
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34
Figura 1- Detalhe do cormo desenvolvido de Nymphaea amazonum Mart. & Zucc., evidenciando o estolho
(Es), os numerosos tricomas (Tr), a organização dos pecíolos (Pe) e as raízes adventícias (Ra). (Barra= 3
cm).
35
36
Figuras 2 - 13. Caule de Nymphaea amazonum Mart. & Zucc. 2. Secção longitudinal do meristema apical
do cormo evidenciado sua organização e a presença de numerosos tricomas (Tr). 3. Secção transversal do
cormo jovem indicando as unidades vasculares difusas e os feixes procambiais centrais (setas). 4. Detalhe do
feixe anficrival central da foto anterior. 5. Traqueídes helicoidais do feixe vascular adulto (setas). 6.
Elemento de tubo crivado curto com lume amplo (Ec), placa crivada (setas) e células do parênquima
associado ao feixe vascular (Pa). 7. Fase inicial da ontogênese do sistema de revestimento e do córtex
aerenquimatoso (Ct), observar a protoderme em divisão (seta). 8 e 9 . Secções transversais do sistema de
revestimento do cormo jovem (8), com seqüência de células provenientes de divisões da protoderme e córtex
externo rico em amiloplastos (seta); em 9 o sistema de revestimento do cormo adulto indicando a presença de
tricoma (Tr) e a camada limitante do sistema de revestimento (Sr) com esclereídes (Es). 10. Secção
transversal do estolho com os feixes vasculares (setas). 11 e 12. Detalhes evidenciando os feixes vasculares
do estolho. 13. Feixe colateral com estrias de Caspary (Ec) na endoderme. (Cp = cordões procambiais, Fl=
floema, Lpx = lacuna de protoxilema, Mf = meristema fundamental, Mx = metaxilema, Px = protoxilema).
(Barras figuras: 4, 5, 6 = 30 µm; 2,11,12,13= 50 µm; 7;8, 9 = 100 µm; 3, 10 = 200 µm).
Lpx
Fl
Fl
11
4
Px
Mx
Fl
Fl
Fl
12
Fl
3
Es
Sr
Tr
9
8
13
Fl
Lpx
Cp
MF
Mf
2
Tr
Mf
Tr
Ec
6
Ct
7
10
37
5
Pa
38
Figuras 14-20. Nymphaea amazonum Mart. & Zucc. 14. Secção transversal da face adaxial do limbo
evidenciando a cutícula (Ct). 15. Secção paradérmica do limbo mostrando a organização dos estômatos e das
demais células epidérmicas. 16. Secção paradérmica do pecíolo com hidropótios (setas). 17. Detalhe do
hidropótio no limbo. 18. Secção longitudinal da folha jovem mostrando hidropótio com mucilagem (seta).
19. Tricomas tectores da região da junção do pecíolo com o limbo. 20. Detalhe do tricoma da foto anterior.
(Ca = célula apical, Cb = célula basal, Cm = célula mediana, Ep = epiderme, Es = esclereíde, Fv = feixe
vascular, In = região internervura, La = lacuna aerífera, N = região sobre as nervuras, Pp = parênquima
paliçádico). (Barra figuras: 14, 16, 17, 18, 20 = 30 µm; 15 = 50 µm; 19 = 100 µm).
15
N
In
16
La
Fv
Es
Ca
Cb
Cm
17
18
19
20
39
14
Ep
Pp
Ct
40
Figuras 21-26. Limbo e pecíolo de Nymphaea amazonum Mart. & Zucc. 21. Secção transversal do limbo
indicando estômato na face adaxial, crista estomática (Ce) e câmara subestomática (Cs). Notar a variação no
tamanho das células do parênquima paliçádico (Pp). 22. Secção transversal do limbo evidenciando a presença
de célula coletora (Cc). 23. Organização dorsiventral da folha onde se observa a presença de hidropótios
(setas) na face abaxial. 24. Secção transversal do pecíolo. 25. Detalhe do diafragma encontrado na base do
limbo. 26. Secção transversal do bordo, notar hidropótios. (Ep = epiderme). (Barra figuras = 21,25 = 30 µm;
22 = 50 µm; 23,26 = 100 µm; 24 = 200 µm).
21
Ce
Cs
Pp
Ep
22
Cc
23
Pp
La
Fv
Fv
Fv
25
24
26
Es
Fv
Fv
41
42
Figuras 27-32. Secções transversais do limbo de Nymphaea amazonum Mart. & Zucc. 27 e 28.
Astroesclerídes com cristais de oxalato de cálcio (Cr) entre as células do parênquima paliçádico. 29. Nervura
mediana do limbo, notar a distribuição dos feixes vasculares colaterais, a interrupção do parênquima
paliçádico por células de parênquima regular, e os hidropótios (setas). 30. Feixe vascular colateral de menor
calibre. 31. Detalhe do feixe vascular da nervura mediana. 32. Secção transversal do pecíolo mostrando a
ampla lacuna de protoxilema, revestidas por substâncias de natureza lipídica nas paredes internas das células
parenquimáticas e a bainha do feixe. (Bf). (Col = colênquima, Tr = traqueíde). (Barra figuras: 27 = 30 µm;
28,30,32 = 50 µm; 29,31 = 100 µm).
30
Tr
32
Bf
Lpx
31
Bf
Col
Col
29
La
Pp
Fv
Fv
Fv
27
Cr
28
43
44
Figuras 33-36.Secções transversais do pecíolo de Nymphaea amazonum Mart. & Zucc. 33. Feixe vascular
bicolateral aberto evidenciando a ampla lacuna de protoxilema (Lpx) e os elementos de tubo crivado (setas).
34. Feixe vascular colateral e riqueza de amiloplastos (seta) na bainha e idioblasto (Id) nas células do
aerênquima com compostos fenólicos. 35. Detalhe de um feixe colateral menor com um amplo elemento de
tubo crivado (Ec) e ausência de lacuna de protoxilema. 36. Tecido parenquimático evidenciando idioblasto
taninífero (seta). (La = lacuna aerífera). (Barra figuras: 35, 36 = 50 µm; 33, 34 = 100 µm).
36
35
Ec
33
La
La
La
Lpx
34
Id
45
CAPITULO II:
Estrutura, desenvolvimento e histoquímica da raiz de
Nymphaea
amazonum
Mart & Zucc. (Nymphaeaceae).
47
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
Submission of papers
Brazilian Archives of Biology and
Technology publishes original research papers,
Short notes and Review articles in English in
the interdisciplinary areas of biological sciences
and engineering/technology. Submission of
paper implies that it has not been published or
being considered for publication elsewhere.
Care should be taken to prepare a compact
manuscript with precision in presentation,
which will help authors in its acceptance. All
the papers are subjected to review by referees.
Manuscript
Three copies of the single-spaced typed
manuscript (maximum 12 pages for original
and review articles and 2-4 pages for short
notes) on a high grade A-4 size paper (210x297
mm), with margins (left 25, right 20, superior
and inferior 30 mm) should be prepared. This
should be divided under the following
headings: ABSTRACT, INTRODUCTION,
MATERIALS AND METHODS, RESULTS,
DISCUSSION, ACKNOWLEDGEMENTS,
RESUMO, REFERENCES. These headings
should be typed in bold upper case (12 font).
For review articles, authors should make their
own headings along with Abstract and
Introduction.
Title
The title (18 font, bold) of the paper
should clearly reflect its contents. It should be
followed by the name(s) of author(s) with
expanded initials (12 font, bold) and the
address(s) (italic, 10 font) of the institution(s)
where the work has been carried out.
ABSTRACT
Each paper should be provided with an
abstract (italic) of 100-150 words, describing
briefly on the purpose and results of the study.
It should be prepared as concisely as possible.
Key words
Authors should provide three to six key
words that will be used in indexing their paper.
INTRODUCTION
This should describe the background
and relevant information about the work. It
should also state the objective of the work.
MATERIALS AND METHODS
Authors must take care in providing
sufficient details so that others can repeat the
work. Standard procedures need not be
described in detail.
RESULTS AND DISCUSSION
Results and Discussion may be
presented separately or in combined form
(authors may decide easier way for them).
Preliminary work or less relevant results are not
to be described. The reproducibility of the
results, including the number of times the
experiment was conducted and the number of
replicate samples should be stated clearly.
RESUMO
An abstract of the paper should also be
prepared in Portuguese and placed before the
list of References. Authors from other than
Latin American countries can seek the help of
Editor's office to prepare Portuguese resumo of
their papers.
REFERENCES
References in the text should be cited at
the appropriate point by the name(s) of the
author(s) and year (e.g. Raimbault & Roussos,
1996; Raimbault et al., 1997). A list of
references, in the alphabetic order (10 font),
should appear at the end of the manuscript. All
references in the list should be indicated at
some point in the text and vice versa.
Unpublished results should not be included in
the list. Examples of references are given
below.
In journals
48
Pandey, A. (1992), Recent
developments in solid state fermentation.
Process Biochem., 27, 109-117 Thesis: Chang,
C. W. (1975), Effect of fluoride pollution on
plants and cattle. PhD Thesis, Banaras Hindu
University, Varanasi, India
In books:
Tengerdy, R. P. (1998), Solid substrate
fermentation for enzyme production. In-
Advances in Biotechno-logy, ed. A. Pandey.
Educational Publishers & Distributors, New
Delhi, pp. 13-16 Pandey, A. (1998),
Threads of Life. National Institute of Science
Communication, New Delhi
In conferences:
Davison, A. W. (1982), Uptake,
transport and accumulation of soil and airborne
fluorides by vegetation. Paper presented at 6th
International Fluoride Symposium, 1-3 May,
Logan, Utah
Tables and Figures
Tables and figures, numbered
consecutively with Arabic numerals must be
inserted at appropriate place in the text. These
should be used to present only those data,
which can not be described in the text.
Units and Abbreviations
The SI system should be used for all
experimental data. In case other units are used,
these should be added in parentheses. Only
standard abbreviations for the units should be
used. Full stop should not be included in the
abbreviation (e.g. m, not m. or rpm, not r.p.m.).
Authors should use '%' and '/' in place of 'per
cent' and 'per'.
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
Manuscript lay-out
It is suggested that authors consult a recent
issue of the journal for the style and layout.
Except the title, abstract and key words, entire
text should
49
Estrutura, desenvolvimento e histoquímica da raiz de
Nymphaea amazonum Mart. & Zucc. (Nymphaeaceae)
1
Rosana Ap. Gabriel Adamowicz¹, Edna Scremin-Dias² e Neli K. Honda
3
2. Programa de Pó –Graduação em Biologia Vegetal do Departamento de Biologia da Universidade Federal do
Mato Grosso do Sul. Av. Costa e Silva, S/N, Campo Grande, MS, CEP 79070-900. E-mail:
[email protected]
3. Professora adjunta do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul. Av. Costa e
Silva, S/N, Campo Grande, MS, CEP 79070-900. E-mail: [email protected]
4. Professora do Departamento de Química da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Av. Filinto Muller,
1555, Campo Grande, MS, CEP 79074-460. E-mail:
nkhonda@nin.ufms.br
ABSTRACT
Structure, ontogenesis and histochemistry of roots of Nymphaea amazonum Mart. & Zucc. are described. They were
collected in Pantanal Sulmatogrossense, and showed adaptations that allow their establishment in flooded soil and
medicinal potential. Apical meristem has open organization, protoderm
and exodermis have their origin in the same meristematic initial cells, similar to monocotyledons. The cortex is
formed by an honeycomb-shaped aerenchyma, with astrosclereids. Air lacunae extend from exodermis to
endodermis being interrupted by diaphragms. In developed root, uniseriate epidermis has rare root hairs and they
were observed at 5 cm from the apex. Vascular system is polyarch, with protoxylem elements interrupting the
uniseriate pericycle. Similar to monocotyledons, the formation of vascular cambium does not occur in this species.
Lateral roots arise at 300 µm from the root apex. It was verified the presence of lignin and suberin in Casparian
strips of endodermis. Tannins and terpens were found in low concentration.
KEY-WORDS: Nymphaeaceae, Nymphaea amazonum, anatomy, histochemistry
INTRODUÇÃO
Nymphaea amazonum Mart. & Zucc.,
pertencente à família Nymphaeaceae,
conhecida popularmente como lírio d’água,
camalote-da-meia-noite, dama da noite,
batata-d’ água, possui ampla distribuição no
Pantanal Matogrossense. É uma planta
herbácea aquática, flutuante fixa, com folhas
levemente peltadas, conectadas ao cormo por
meio de longos pecíolos (Pott, 1998).
Apresenta numerosas raízes adventícias as
quais fixam fortemente a planta ao solo
alagado. A formação de raízes adventícias em
plantas herbáceas está geralmente associada à
ambientes com baixa quantidade de oxigênio
em solos alagados (Bonna & Morretes, 2003).
Além de N. amazonum ser utilizada por vários
animais como alimento, abrigo e local de
desova, também tem sido utilizada como
planta medicinal pela população ribeirinha
(Pott & Pott, 2000).
Nymphaeaceae atualmente é enquadrada
como “paleoherva” (Judd et al., 1999) e
possui várias características semelhantes às
Monocotiledôneas. Esta proximidade com as
Monocotiledôneas é evidenciada pela presença
de meristema aberto nas raízes, e epiderme
originada de iniciais meristemáticas comuns
àquelas do córtex em várias espécies de
Nymphaeaceae (Clowes, 2000).
Em ambientes alagáveis o
desenvolvimento e a sobrevivência da flora
depende da sua capacidade de responder
fisiológica ou morfologicamente ao estresse
determinado pelas variações ambientais
(Scremin-Dias, 2000a), sendo o déficit de
oxigênio nos solos alagados o principal fator
ambiental limitante imposto às plantas
aquáticas ou de áreas úmidas. A baixa
concentração de oxigênio nesse tipo de solo
surge do desequilíbrio entre a lenta difusão de
gases na água, comparada com o ambiente
aéreo, o consumo do estoque de oxigênio por
1 Parte da Dissertação de Mestrado da primeira autora
Autor para correspondência: rosanagabriel@terra.com.br
, [email protected]
50
microrganismos e pela respiração celular dos
tecidos das raízes das plantas. As respostas
para reduzir os efeitos causados por esse tipo
de rstrição, muitas vezes, podem ser
encontradas atuando em conjunto, como por
exemplo, modificações morfológicas e
bioquímicas, as quais podem ser encontradas
naturalmente na planta ou induzidas pelo
evento do alagamento (Visser et al., 2003).
As raízes são órgãos essencialmente
aeróbicos e a baixa quantidade de oxigênio
disponível em solos alagados pode ser fatal
para tecidos aeróbicos, pois quando cessa a
respiração aeróbica, ocorre um declínio na
captura e transporte de íons (Visser et al.,
2003). Além do déficit de oxigênio, o
alagamento do solo reduz a concentração de
nutrientes como nitrato e fosfato, por diluição.
A restrição de oxigênio nas raízes estimula a
produção de etileno que, devido à inundação
das raízes, deixa de ser eliminado radialmente
ficando acumulado no órgão (Armstrong &
Jackson, 1999). Numerosas plantas aquáticas
toleram a influência desses fatores restritivos
por meio de adaptações estruturais (Soukup et
al., 2002; Scremin-Dias, 2000a). Essas
adaptações envolvem o estabelecimento de
contínuo sistema de lacunas de ar, o qual cria
uma rede de baixa resistência para o transporte
de oxigênio que é difundido das folhas para o
caule e raízes (Scremin-Dias, 2000b; Visser et
al., 2000). As lacunas permitem também a
flutuação das partes aéreas e oferece
resistência mecânica para as partes submersas
das plantas (Scremin-Dias, 2000b).
Além das adaptações morfológicas e
anatômicas, a interação do ambiente com os
mecanismos fisiológicos das plantas resulta no
estímulo da síntese de metabólitos especiais,
denominados metabólitos secundários. Esses
compostos são componentes importantes para
a sobrevivência e reprodução dos vegetais,
podendo estar relacionados tanto com
respostas aos fatores bióticos como abióticos,
sendo que alguns deles podem ser expressos
constitutivamente e outros, como as
fitoalexinas, sintetizados em resposta ao
ataque de herbívoros ou patógenos (Santarém,
2006; Castro et al, 2004).
Investigações que caracterizem a
morfologia e a composição química, assim
como a anatomia das estruturas secretoras
presentes nos órgãos vegetativos por meio da
histoquímica, são escassas para a maioria das
espécies brasileiras e, principalmente, em
macrófitas aquáticas.
Neste trabalho são apresentados os
aspectos estruturais, ontogenéticos e
histoquímicos das raízes de Nymphaea
amazonum Mart. & Zucc. evidenciando as
adaptações que permitem seu perfeito
estabelecimento em solos permanentemente
alagados sob condições de baixa concentração
de oxigênio.
MATERIAL E MÉTODOS
Ápices meristemáticos e raízes
completamente desenvolvidas (a partir de 4cm
do ápice) de N. amazonum foram coletadas no
Pantanal, nas áreas de influência dos rios
Miranda e Abobral, nas adjacências da Base
de Estudos do Pantanal (BEP) da
Universidade Federal do Mato Grosso do Sul
(S19°25’30.8” W57°02’50.2”). O material
coletado foi fixado em formalina neutra
tamponada (Kraus & Arduin, 1997) por 24
horas, lavado abundantemente em água
corrente e posteriormente conservados em
álcool 70%.
Para a confecção de lâminas
permanentes as raízes foram desidratadas em
série alcoólica ascendente, mantidas em
bomba a vácuo e, posteriormente, emblocadas
em parafina e cera de abelha a 6% e em
historesina, de acordo com técnicas usuais. As
secções transversais e longitudinais do
material emblocado em parafina e em
historesina foram feitas em micrótomo
rotatório e, posteriormente, afixadas em
lâmina com gelatina glicerinada de Bissing.
Após desparafinização e desidratação em série
alcoólica, o material passou por dupla
coloração com azul de astra e safranina, sendo
montadas lâminas com resina Entellan (Kraus
51
& Arduin, 1997). As lâminas confeccionadas
em historesina foram coradas com azul de
toluidina.
Para os cortes à mão livre, após
diafanização em solução de hipoclorito de
sódio a 20% e dupla coloração (azul de astra e
safranina), as lâminas foram montadas em
glicerina e lutadas com esmalte de unha
incolor.
Os testes histoquímicos foram realizados
a partir da raiz recém coletada, seguindo as
seguintes técnicas:
1. Lactonas sesquiterpênicas: Os cortes
foram diretamente montados em ácido
sulfúrico e observados imediatamente
(Geissmen & Griffin, 1971).
2. Terpenóides com grupos carbonila: Os
cortes foram colocados em solução
saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina
em HCl 2N por 10 minutos. A seguir
os cortes foram lavados e montados em
água (Ganter & Jollés, 1970).
3. Compostos fenólicos: foi aplicado nas
amostras cloreto de ferro III a 10%
durante 15 a 30 minutos e,
posteriormente, os cortes foram
lavados e montados em água. Os
compostos fenólicos coram-se de verde
intenso, púrpura, azul ou negro. Outra
técnica utilizada para o mesmo fim foi
a aplicação de dicromato de potássio
10% durante 10 a 30 minutos, sendo os
cortes lavados em água (Johansen,
1940).
4. Alcalóides: foi aplicado às amostras o
reagente de Wagner (iodeto de
potássio, iodo e água) durante cinco a
10 minutos, lavado e, posteriormente,
montado em água (Furr & Mahlber,
1981).
5. Taninos: os cortes foram tratados com
vanilina a 0,5% em ácido clorídrico a
9% durante 10 minutos (Mace &
Howell, 1974).
6. Lignina: foi aplicado às amostras,
floroglucinol em ácido clorídrico a
20% durante 1 a 2 minutos ( Johansen,
1940).
7. Suberina: as amostras foram tratadas
com Sudam III em etanol 80% durante
25 minutos ( Kraus & Arduin, 1997).
As análises e ilustrações do material
foram realizadas em microscópio Leica – DM
LB acoplado ao sistema de captura de imagens
e fotografia, sendo projetadas as escalas
micrometradas correspondentes.
Além dos testes histoquímicos foi
realizada também triagem fitoquímica e
cromatografia, segundo técnicas descritas por
Matos (1988). Para tal, as raízes de N.
amazonum foram coletadas e desidratadas à
temperatura ambiente. Após a secagem, foram
trituradas e moídas em processador Walita. A
extração foi feita a partir de 40 gramas do pó,
sob refluxo, com etanol, por duas horas e
filtrado em papel de filtro. O volume foi
acertado para 200 mL. Os compostos
pesquisados foram:
a) Esteróides/triterpenóides: o teste foi
realizado por reação de Liebermann-
Buchard, onde 20 mL do extrato
alcoólico foi evaporado sob pressão
reduzida. O resíduo foi dissolvido em
clorofórmio e filtrado. Foi adicionado
1,0 mL de anidrido acético e 2 a 3
gotas de ácido sulfúrico concentrado à
2,0 mL do extrato clorofórmico. O
teste é considerado positivo pelo
aparecimento da coloração verde
azulada.
b) Alcalóides: os testes foram realizados
com os reativos de Mayer, Dragendorff
e Bouchardat, onde 2,0 mL do extrato
etanólico foi evaporado sob pressão
reduzida. O resíduo foi alcalinizado
com 15 gotas de solução de hidróxido
de sódio a 1% e acrescentado a este,
5,0 mL de água. A solução foi
transferida para um tubo de ensaio
sendo adicionado 5,0 mL de
clorofórmio para extração. A fração
aquosa foi desprezada e, na fração
clorofórmica restante, adicionadas 15
gotas de ácido clorídrico a 1%. Após a
adição de 5,0 mL de água, a fração
clorofórmica foi desprezada e foram
52
realizados os testes com a fração
aquosa ácida, após filtração.
Posteriormente foi adicionado 1,0 mL
da fração aquosa ácida em três tubos
de ensaio acrescentando 3 a 4 gotas do
reativo de Mayer, de Dragendorff e de
Bouchardat. O teste é considerado
positivo quando ocorrer turvação da
solução ou formação de precipitado.
c) Taninos: a presença dessa classe de
substâncias foi pesquisada por meio de
reações com solução de cloreto de
ferro III a 2% em água, e com solução
de gelatina a 0,5%. Cerca de 100 mL
do extrato etanólico foi evaporado em
pressão reduzida, o resíduo foi
dissolvido em 10 mL de água e filtrado
em papel. Foi adicionado a 2,0 mL
desta solução 3 gotas da de cloreto de
ferro III a 2%. O teste é considerado
positivo com desenvolvimento de uma
coloração esverdeada. O teste com
gelatina a 0,5% foi realizado pela
adição de 2,0 mL desta solução à 3,0
mL da solução filtrada. Esse teste é
considerado positivo com a formação
de precipitado ou turvação branca.
d) Saponinas: a presença dessas
substâncias foi pesquisada por meio da
observação da formação e persistência
de espuma, após agitação. O teste de
formação de espuma foi efetuado em
forte agitação de 1,0 mL da solução
aquosa, por trinta segundos. Esse teste
é considerado positivo com o
surgimento de espuma persistente por,
pelo menos, meia hora.
O extrato bruto foi cromatografado em
placa de sílica gel eluída com acetato de etila:
n-propanol : H
2
O (80:18:2 v/v). A revelação
foi realizada com solução de metanol
contendo 10% de ácido sulfúrico seguido de
aquecimento em chapa elétrica. Após o
aparecimento das manchas foi aplicado sobre
a placa solução sulfúrica de p-anisaldeído e
novamente aquecido (Stahl, 1969).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O meristema apical da raiz de N.
amazonum tem organização aberta, com as
iniciais meristemáticas posicionadas a 500µm
da porção mais externa da coifa (Figura 1 A),
corroborando o descrito por Seago et al.
(2000) para outras espécies do gênero. Em
meristemas abertos a protoderme, meristema
fundamental e o procâmbio se originam das
mesmas iniciais meristemáticas que são
difíceis de serem visualizadas (Appezzato-da-
Glória & Hayashi, 2006). A maioria dos
estudos considera que há uma célula inicial
comum para as células da coifa, córtex e
estelo, isto é, um promeristema transverso
(Clowes, 1981). Este pesquisador afirma que
há um pólo no meristema apical, em alguns
grupos de plantas, separando as células
centrais da coifa que estão ativamente se
dividindo daquelas que originarão o estelo e o
córtex. Para N. amazonum esta separação não
está evidente, e optou-se por chamar de região
central do meristema apical, o local onde se
localizam as iniciais dos histógenos –
protoderme, meristema fundamental e
procâmbio -, devido à dificuldade de
individualizá-las, característica que corrobora
o descrito por diversos autores para os
meristemas abertos (Esau, 1976; Fahn, 1990).
Lateralmente à região central do
meristema apical, distinguem-se as iniciais dos
histógenos. As células do meristema
fundamental já apresentam espaços
intercelulares evidentes bem próximo desta
região e o procâmbio pode ser visualizado na
região central da raiz (Figuras 1 e 2). Não há
diferenciação nítida do caliptrógeno,
característica descrita por Clowes (2000)
como comum para espécies com meristemas
abertos, havendo dissolução da lamela média
entre as células da coifa e as protodérmicas,
formando amplo espaço intercelular (Figuras 1
e 2). A protoderme e a camada
53
2
Pc
Pd
Pc
Ei
1A
1B
Mf
La
Im
Co
Pd
Pc
3
Pd
Ex
4
Ep
Ex
La
Ei
Figuras 1-4. Nymphaea amazonum Mart & Zucc. (1A). 100 µm: Secção longitudinal do ápice meristemático
indicando a posição das iniciais meristemáticas e histógenos; (1B). 50 µm: Detalhe da coifa evidenciando os
amiloplastos (setas); (2). 100 µm: Secção transversal do ápice meristemático nota-se o espaço intercelular entre a
caliptra e a protoderme; (3). 30µm: Detalhe da foto anterior indicando a protoderme e a exoderme já diferenciadas;
(4). 30µm: Secção transversal de raiz jovem evidenciando a epiderme e a exoderme. (Co= Coifa, Ei= espaço
intercelular, Ep = epiderme, Ex= exoderme, Im= iniciais meristemáticas, La = lacuna aerífera, Mf = meristema
fundamental, Pc = procâmbio, Pd = protoderme)
mais externa do meristema fundamental têm
origem das mesmas iniciais meristemáticas em
N. amazonum, corroborando o descrito por
Clowes (2000) para outros gêneros de
Nymphaeaceae. Esse autor discute o fato
dessa característica ser bastante comum em
Monocotiledôneas, evidenciando a
semelhança de alguns caracteres do grupo à
família Nymphaeaceae.
A protoderme, visualizada lateralmente
ao centro meristemático, pode ser distinta das
demais células meristemáticas por possuir
células de contorno pentagonal, núcleo grande
e citoplasma denso, característica comum
deste histógeno (Figura 3). Em secção
transversal observa-se que, à medida que se
distancia das iniciais meristemáticas, as
células protodérmicas tornam-se mais altas
que largas e parede periclinal externa mais
espessada que a parede periclinal interna,
predominantemente em formato de “V”
(Figura 3). Nessa região a formação dos
vacúolos já está evidente e o núcleo é
proporcionalmente pequeno em relação ao
tamanho da célula. As células da epiderme da
raiz jovem são mais altas que largas, seguidas
de exoderme com suberina (Figura 4).
A camada mais externa da coifa possui
células robustas, com paredes periclinais
externas espessadas e vacúolos evidentes
54
(Figura 1B). A coifa se mantém unida ao ápice
radicular somente ao nível das iniciais
meristemáticas e no limite basal desta
estrutura, formando uma bolsa de ar entre as
suas células as da protoderme (Figura 5). Nas
células da coifa próximas à região
meristemática, observa-se a presença de
estatólitos (Figura 1B), os quais Mauseth
(1988) descreve como sendo tipos especiais de
amiloplastos que estão provavelmente
envolvidos com o geotropismo positivo da
raiz.
As lacunas aeríferas se formam pela
dissolução da lamela mediana entre as células
derivadas corticais e, também, pelo
rompimento de algumas destas, caracterizando
a formação da lacuna pelo processo liso-
esquizógeno (Figura 6), descrito por Justin &
Armstrong (1987) para outros representantes
dessa família. Alguns trabalhos citam que os
dois processos podem ocorrer na mesma
planta, como observado em N. amazonum,
onde o desenvolvimento lisógeno ocorre
primeiro seguido pelo esquizógeno, no mesmo
órgão (Armstrong & Jackson,1999; Drew &
Lewis, 1996).
O desenvolvimento das lacunas
aeríferas em raízes de plantas aquáticas ou de
áreas úmidas pode ocorrer constitutivamente
ou, em resposta à pobre aeração do solo
alagado, como é o caso de plantas anfíbias ou
terrestres (Armastrong & Jackson, 1999). De
acordo com estudos feitos por Waisel et al.
(1996), sob condições anaeróbicas, o
aerênquima se desenvolve como resultado da
morte seletiva de certas células corticais.
Aquelas que permanecem ativas formarão
faixas estreitas de tecido que separam os
grandes canais de ar e promovem o suporte
mecânico, ligando a superfície da hipoderme
(exoderme mais epiderme) ao cilindro
vascular. Esse pesquisador comenta que o
mecanismo da seleção e regulação desse
processo ainda não é bem conhecido, mas
teoricamente, pode ser aleatório, estar
relacionado à proximidade das células
corticais dos pólos de protoxilema ou à
genética .
Nos vértices das lacunas ocorrem
células que, em secção transversal, possuem
formato hexagonal e, conectadas a estas,
células menores retangulares (Figura 7). A
ampliação da lacuna é acompanhada pela
expansão das paredes das células hexagonais e
retangulares. Característica similar à descrita
para N. amazonum foi observada por Seago et
al. (2000) em Nymphaea odorata onde o
aerênquima é formado a partir de uma única
série de células com divisões oblíquas das
facetas anticlinais das células hexagonais do
meristema fundamental, produzindo séries de
células laterais que limitam as lacunas. A
expansão lateral das células corticais amplia as
dimensões da lacuna e da própria raiz. No
aerênquima totalmente formado, as lacunas
aeríferas são amplas e interrompidas por
diafragmas, cujas células possuem pequenos
espaços intercelulares, o que confere
porosidade ao tecido (Conard, 1905; Scremin-
Dias, 2000a; Seago et al., 2000).
O termo diafragma foi primeiramente
empregado por Snow (1914) que o definiu
como “uma estrutura perfurada, formada por
uma ou mais camadas celulares delgadas, que
atravessam, em intervalos, os espaços
aeríferos da plantas” (Mani, 1962). O
surgimento da célula inicial do diafragma em
N. amazonum, bem como sua proliferação
(Adamowicz & Scremin-Dias, 2006), segue o
padrão já descrito para o gênero por Seago et
al. (2000), cujas iniciais podem ser
reconhecidas na zona de diferenciação celular
(Figura 8), pelas divisões anticlinais das
células que delimitam as lacunas. Estas células
projetam-se para o interior da lacuna (Figura
8), dividindo-se sucessivas vezes, sempre na
face conectada às células laterais ou
hexagonais, de maneira a formar uma lâmina
celular unisseriada, o diafragma (Figuras 8-
17). No ângulo das células do diafragma, bem
como em suas áreas medianas, há dissolução
da lamela média, originando pequenos espaços
intercelulares. Ao final da diferenciação do
meristema fundamental o córtex é
55
Figuras 5-19. Nymphaea amazonum Mart & Zucc. (5). 200 µm: Secção longitudinal da região apical da raiz. Notar
o meristema aberto; (6). 50 µm: Secção transversal do ápice da raiz mostrando o início do desenvolvimento do
aerênquima. Notar restos celulares formados pelo processo lisógeno (seta); (7). 20 µm: Secção transversal da raiz
próximo ás inicias corticais.evidenciando células hexagonais e retangulares (setas); (8 e 9). 55 µm: Estágio inicial da
formação do diafragma com célula inicial, projetando-se para dentro da lacuna; (10 a 13). 55 µm: Secção transversal
mostrando as lacunas e vários estágios do diafragma em desenvolvimento; (14 a 17). 50 µm: Secção longitudinal do
ápice da raiz próximo das iniciais corticais mostrando o desenvolvimento do diafragma a partir da formação de uma
célula retangular até o completo fechamento da lacuna; (18). 475 µm: Secção transversal da raiz desenvolvida
mostrando o aerênquima com diafragma interrompendo a lacuna (seta); (19). 50 µm: Detalhe da foto anterior
evidenciando diafragma já desenvolvido, com formato celular estrelado das células braciformes. (Ch = células
hexagonais, Co = coifa, Im = iniciais meristemáticas, La = lacunas aeríferas, Pc = procâmbio)
56
20
21
22
23A
23B
La
La
Es
Es
20
21
22
23A
23B
20
21
22
23A
23B
La
La
Es
Es
Figuras 20-23. Secções transversais de raiz jovem de Nymphaea amazonum Mart & Zucc.. (20 a 23). 30 µm:
Formação e desenvolvimento das esclereides a partir de células das lacunas aeríferas; (23A). 50 µm: Esclereíde
completamente desenvolvida; (23B). 30 µm: Detalhe da foto anterior. (Es= esclereide)
basicamente constituído por aerênquima, com
lacunas aeríferas estendendo-se desde a
camada subjacente à exododerme, até a
endoderme, assumindo, na raiz completamente
diferenciada, formato de favo de mel
conforme descrito por Conard (1905). As
lacunas aeríferas próximas à endoderme
apresentam diâmetro menor aumentando de
tamanho em direção à exoderme (Figura 18).
Ao final da ontogênese do córtex, o diafragma
apresenta células estreladas tipicamente
braciformes (Figuras 18 e 19). As células
estreladas são resultantes do crescimento, sob
pressão, do tecido parenquimático,
desempenhando diversas funções e são
constantemente associadas com a passagem de
feixes vasculares que atravessam as lacunas
em caules e folhas (Mani, 1962). O formato e
a distribuição dos diafragmas nos aerênquimas
dos órgãos de plantas aquáticas é variável,
sendo mais comumente encontrados em
caules, raízes, pecíolos e limbos foliares
(Sculthorpe, 1967). Eles são especialmente
característicos em Nymphaeaceae e
Monocotiledôneas aquáticas, mas
inexplicavelmente ausentes em folhas
flutuantes e submersas de algumas espécies
(Sculthorpe, 1967).
O exato motivo da formação dos
diafragmas ainda não está bem claro, mas
importantes propriedades funcionais têm sido
relacionadas a eles, tais como proteção
mecânica, nutrição, armazenamento, condução
e sustentação do lume aerífero (Armstrong,
2000). Eles representam reforço para a
integridade do sistema de lacunas de ar
quando ocorre algum tipo de dano nas partes
submersas da planta, bloqueando a difusão
rápida da água pelos espaços de ar devido a
sua natureza hidrofóbica (Armstrong, 2000;
Scremin-Dias et al., 1999). Registros desse
tipo de função já haviam sido citados para
Nymphaeaceae em 1870, sendo destacada
recentemente a característica de resposta
rápida à invasão de água nas lacunas aeríferas
de órgãos submersos, quando danificados por
insetos (Armstrong, 2000).
Esclereídes na forma de
astroesclereídes surgem por diferenciação de
células hexagonais (Figura 20 - 22)
distribuídas aleatoriamente por todo o córtex.
Estas células produzem ramos ou braços que
atravessam as lacunas aeríferas e o diafragma.
No final da diferenciação apresentam paredes
fortemente lignificadas e cristais de oxalato de
cálcio (Figura 23A e 23 B).
Segundo Sculthorpe (1967) essas
células especializadas dão suporte mecânico e
aparecem em estágio ontogênico tardio
quando os tecidos aumentam de volume. A
diferenciação destas células em N. amazonum
inicia-se a cerca de 5 cm do meristema apical,
quando as demais células corticais já estão em
estágio avançado de diferenciação.
A
exoderme sofre somente divisões anticlinais
resultando em camada unisseriada com células
de tamanhos variados, não apresentando
estrias de Caspary.
57
24
28
2726
Px
Px
Px
En
Fl
Fl
25
La
Ex
Figuras 24-28. Secções transversais de raiz completamente desenvolvida de Nymphaea amazonum Mart & Zucc.
(24). 30 µm: Endoderme com Estrias de Caspary (seta); (25). 50 µm: Detalhe evidenciando a perda da epiderme
restando apenas a exoderme; (26). 50 µm: Observar a presença de pêlo absorvente (seta); (27). 50 µm: Detalhe
mostrando o cilindro vascular; (28). 50 µm: Detalhe da foto anterior evidenciando a placa crivada do floema. (En =
endoderme; Fl = floema)
Barnabas (1996) afirma que nem todas
as plantas aquáticas de água doce apresentam
exoderme com estrias de Caspary, pois a
exclusão de certos solutos como cloreto de
sódio dos tecidos das raízes pode não ser
necessário em angiospermas de água doce,
diferentemente do que ocorre com as
angiospermas marinhas. Isso pode justificar
exoderme sem estias de Caspary em raízes de
algumas plantas de água doce.
Estrias de Caspary foram evidenciadas
na endoderme de N. amazonum (Figura 24),
que é considerada por vários autores,
juntamente com o aerênquima, como
importantes barreiras para restringir o
movimento de água e de íons entre o córtex e
o estelo, por meio simplasto, nas células da
raiz de várias angiospermas (Peterson, 1992).
Isso faz com que o oxigênio necessário para
atender a demanda do meristema apical seja
conservado, inibindo a perda radial desse gás
para o solo circundante que apresenta
deficiência nessa molécula (Visser et al.,
2003; Drew & Lewis, 1996). As células da
endoderme podem conter grandes quantidades
de substâncias fenólicas que, em conjunto com
a presença de suberina na parede celular,
detêm a invasão de bactérias, fungos e
invertebrados parasitas (Peterson, 1992).
Na raiz completamente desenvolvida o
sistema de revestimento é constituído por
epiderme unisseriada, com células mais largas
que altas, que podem romper em raízes adultas
(Figura 25). Nesse caso a exoderme, que pode
apresentar até duas camadas em alguns pontos
da raiz, torna-se o sistema de revestimento.
58
Pêlos absorventes são raros (Figura 26) e
observados a 5cm do ápice. Mauseth (1988) e
Fahn (1990) já afirmavam que pêlos radicais
podem ser escassos ou ausentes em plantas
aquáticas.
O desenvolvimento do sistema
vascular é caracterizado pela diferenciação
acrópta do procâmbio, onde o protofloema é o
primeiro se distinto no cilindro vascular.
A camada mais externa do cilindro
vascular é representada por periciclo
unisseriado, com células de paredes delgadas e
tamanhos variados (Figuras 24 e 27), com os
elementos do protoxilema interrompendo estas
células (Figura 27). Semelhante às
Monocotiledôneas, não ocorre a formação de
câmbio vascular nesta espécie. O sistema
vascular é do tipo poliarco, com 6-8 pólos de
protoxilema intercalados por dois amplos
elementos do floema e medula parenquimática
(Figuras 27 e 28).
O surgimento de raízes laterais ocorre
a 300µm do ápice da raiz, sendo que, no
sistema radical de N. amazonum, existem
raízes extremamente ramificadas e outras com
nenhuma ou raras raízes laterais.
Os estudos fitoquímicos direcionados
para três principais grupos de compostos do
metabolismo secundário revelaram a presença
de esteteróis/triterpenos e taninos, indicando
baixa concentração dessas substâncias na raiz.
Não foi detectada a presença de alcalóides e
saponinas nesta espécie.
Na caracterização histoquímica,
verificou-se a presença de lignina e suberina
nas estrias de Caspary na endoderme e
suberina na exoderme. Os testes foram
negativos para alcalóides, lactonas
sesquiterpênicas, compostos fenólicos gerais,
taninos e terpenos, estes detectados em baixa
concentração no extrato bruto, fato que
provavelmente justifique a não observação
desses compostos quando submetidos ao teste
histoquímico com vanilina clorídrica e 2,4
dinitrofenilhidazina, respectivamente, nos
cortes da raiz a fresco.
Monteiro et al. (2005) cita que diversos
estudos sobre taninos têm abordado a
interação ecológica entre vegetais e
herbívoros, sugerindo que os teores desses
compostos podem diminuir a taxa de predação
por tornar a planta impalatável, afastando seus
predadores naturais. Pesquisas recentes sobre
atividade biológica dos taninos evidenciaram
importante ação contra determinados
microorganismos, como agentes
anticarcinogênicos, antiinflamatórios,
cicatrizantes e como inibidores da
transcriptase reversa do vírus HIV (Monteiro
et al., 2005). Os esteróis e triterpenos fazem
parte de uma gama de compostos que formam
os óleos essenciais das plantas e
desempenham várias funções ecológicas como
inibidores da germinação, proteção contra
predadores, na atração de polinizadores, na
proteção contra perda de água e aumento da
temperatura, entre outras. Também são
atribuídas atividades biológicas como
antiinflamatória, anti-séptica contra várias
bactérias e fungos e estimulantes do sistema
nervoso central (Durigan & Almeida, 1993;
Simões et al.,1999). A presença destes
compostos, mesmo em baixa quantidade na
raiz, pode explicar a excelente adaptabilidade
desta planta ao ambiente aquático. A despeito
de numerosas larvas e animais aquáticos, raras
foram as raízes analisadas que apresentaram
qualquer sinal de injúria. Isto pode refletir a
eficiência destes compostos na defesa do
sistema radical desta planta.
AGRADECIMENTOS
Agradecimento especial à Fundação de
Apoio ao Desenvolvimento do Ensino,
Ciência e Tecnologia do Estado de Mato
Grosso do Sul (FUNDECT), pela concessão
da bolsa de mestrado à primeira autora e pelo
financiamento de projeto. Aos estagiários do
Laboratório de Botânica, em especial à
Mariana C. Souza, Jane Rodrigues Silva,
Silvana C. H. de Medeiros e Tamires Soares
Yule, pelo auxilio técnico. Ao Laboratório de
Pesquisa do Departamento de Química
(UFMS) a pelo apoio nas análises
fitoquímicas.
59
RESUMO
São descritos estrutura, ontogênese e
histoquímica das raízes de Nymphaea
amazonum Mart. & Zucc., coletadas no
Pantanal Sulmatogrossense, evidenciando
adaptações que permitem seu estabelecimento
em solo alagado e potencial medicinal. O
meristema apical tem organização aberta, a
protoderme e a exoderme têm origem das
mesmas iniciais meristemáticas, semelhantes
às monocotiledôneas. O córtex é constituído
por aerênquima em formato de favo de mel,
com astroesclereides. Lacunas aeríferas
estendem-se da exoderme até a endoderme
sendo interrompidas por diafragmas. Na raiz
desenvolvida, a epiderme unisseriada possui
raros pêlos absorventes e estes foram
observados a 5cm do ápice. O sistema
vascular é do tipo poliarco, com elementos do
proxilema interrompendo o periciclo
unisseriado. Semelhante às monocotiledôneas,
não ocorre formação de câmbio vascular nesta
espécie. Raízes laterais surgem a 300µm do
ápice da raiz. Verificou-se a presença de
lignina e suberina nas estrias de Caspary na
endoderme. Taninos e terpenos foram
detectados em baixa concentração.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
62
Considerações Finais
_________________________________________________________
Os resultados apontaram para a importância de aprimorar estudos fitoquímicos em
Nymphaea amazonum Mart & Zucc. devido ao seu potencial antioxidante, haja vista o
crescente interesse da indústria farmacêutica e de alimentos em buscar compostos naturais
visando diminuir os efeitos tóxicos dos antioxidantes sintéticos comumente utilizados.
Os estudos ontogenéticos, tanto do caule quanto da raiz, são inéditos para essa
espécie e merecem maior atenção, por apresentar características peculiares quanto à
estrutura do sistema vascular e de revestimento, sendo importantes para entender a
filogenia dos grupos correlacionados.
A morfo-anatomia evidencia o grau de especialização e adaptação desta espécie ao
ambiente em que vive. O trabalho acrescenta conhecimento científico, em especial ao grupo
de macrófitas aquáticas do Pantanal, cujos estudos ainda são escassos, necessitando ampliar
informações principalmente visando a conservação do bioma.
Neste sentido, o trabalho além de contribuir com a descrição morfo-anatômica da
espécie, relaciona características anteriormente desconhecidas, podendo subsidiar novas
pesquisas e incentivar o desenvolvimento de estudos nessa linha.
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