( PDF ) Caracterização de compostos bioativos em cebola e chlorella

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FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS

CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EM CEBOLA E CHLORELLA

VÂNIA MACHADO RECART

Profª Dr.ª Eliana Badiale Furlong

Orientadora

RIO GRANDE, RS

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FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos

CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EM CEBOLA E CHLORELLA

VÂNIA MACHADO RECART

Bacharel e Licenciada em Química

Dissertação apresentada

para a obtenção do título

de Mestre em Engenharia

e Ciência de Alimentos

Profª. Drª. ELIANA BADIALE-FURLONG

ORIENTADORA

RIO GRANDE – RS

2008

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AGRADECIMENTOS

A Deus por ter iluminado os meus caminhos.

Aos meus amáveis pais, Sidnei e Nelimar pelo amor, carinho e dedicação durante

toda minha vida. Eternamente grata.

Aos meus queridos irmãos Eliane e Wagner pelo carinho, apoio e incentivo ao longo

da caminhada. Amo vocês!

À minha avó Neli, pelo seu carinho, força e otimismo.

Ao adorável Miguel, pelo carinho, apoio e compreensão.

À prof. Dra. Eliana Badiale Furlong pela confiança, dedicação, incentivo e amizade.

Sem a sua ajuda certamente este trabalho não seria possível.

À prof. Dra. Leonor de Sousa Soares, pelo seu apoio, incentivo e amizade.

As minhas amigas e companheiras de laboratório, Michele, Paula, Melissa, Cristina,

Gini, Vivian, Jaqueline, Jesus pelas ajudas prestadas, pelas palavras de conforto nos

momentos difíceis e principalmente pela amizade de vocês. De coração muito obrigada.

À graduanda Eliane Cipolatti, pela sua participação incansável durante o

desenvolvimento do trabalho, pelo seu esforço, dedicação e amizade. Obrigada.

As colegas de laboratório Larine, Sthefani, Helen, Meritaine, pelas ajudas prestadas,

dicas e incentivo para realização deste trabalho.

À Islanda e Gicelda, que estavam sempre prontas para ajudarem.

Aos colegas da Escola Estadual de Ensino Médio Presidente Castelo Branco, pelo

apoio, incentivo e compreensão para que pudesse ser atingida mais uma etapa da minha

formação profissional.

Aos professores do Programa de Pós–Graduação em Engenharia e Ciência de

Alimentos, pelos conhecimentos transmitidos durante o desenvolvimento do Curso de

mestrado.

A EMATER – Rio Grande/RS pela cedência das amostras e informações prestadas

no decorrer do trabalho.

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS............................................................................................................ 6

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ 9

RESUMO............................................................................................................................ 10

ABSTRACT........................................................................................................................ 11

CAPÍTULO I ....................................................................................................................... 12

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 13

2 OBJETIVOS............................................................................................................... 15

2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................... 15

2.2 Objetivo Específico............................................................................................... 15

CAPÍTULO II ...................................................................................................................... 16

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................... 17

3.1 PROCESSOS OXIDATIVOS................................................................................ 17

3.1.1 Caracterização dos Processos Oxidativos...................................................... 17

3.1.2 Causas de Oxidação nos Alimentos............................................................... 18

3.1.3 Mecanismos Naturais de Defesa contra Processos Oxidativos ...................... 20

3.2 COMPOSTOS BIOATIVOS.................................................................................. 21

3.3 PROPRIEDADES FUNCIONAIS.......................................................................... 22

3.4 ANTIOXIDANTES ................................................................................................ 23

3.4.1 Compostos Fenólicos..................................................................................... 25

3.4.2 Métodos para Avaliação da Atividade Antioxidante ........................................ 27

3.5 CEBOLA ............................................................................................................. 29

3.5.1 Características Biológicas e Químicas............................................................ 29

3.5.2 Produção e Consumo..................................................................................... 31

3.5.3 Propriedades Terapêuticas............................................................................. 32

3.6 MICROALGA CHLORELLA ................................................................................. 33

3.6.1 Microalgas e Cianobatérias ............................................................................ 33

3.6.2 Microalga Chlorella......................................................................................... 34

CAPÍTULO III ..................................................................................................................... 36

ARTIGO 1 ..................................................................................................................... 37

OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO DE FENÓIS NA CEBOLA

ATRAVÉS DE PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL...................................................... 38

RESUMO...................................................................................................................... 38

ABSTRACT................................................................................................................... 38

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 39

2 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 40

2.1Procedimentos Experimentais Gerais ................................................................... 40

2.2 Amostras.............................................................................................................. 41

2.3 Planejamento para estudo das condições de extração de fenóis ........................ 41

2.4 Preparação dos extratos nas condições otimizadas ............................................ 41

2.5 Determinação de fenóis totais nos extratos ......................................................... 42

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................. 42

3.1 Indicativos de Mérito para o Método de Folin-Ciocalteau ..................................... 45

4 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 46

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 46

ARTIGO 2 ..................................................................................................................... 48

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE DIFERENTES CLASSES DE CEBOLAS

CULTIVADAS NA REGIÃO SUL DO R.S...................................................................... 49

RESUMO...................................................................................................................... 49

ABSTRACT................................................................................................................... 49

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 50

2 PARTE EXPERIMENTAL .......................................................................................... 52

2.1Procedimentos Experimentais Gerais ................................................................... 52

2.2 Amostras.............................................................................................................. 52

2.3 Determinação da Composição Centesimal........................................................... 52

2.4 Propriedades Eletroquímicas ............................................................................... 52

2.5 Determinação dos Fenóis Totais.......................................................................... 53

2.6 Determinação da Atividade Específica das Enzimas Oxirredutases..................... 53

2.6.1 Catalase ........................................................................................................ 53

2.6.2 Peroxidase e Polifenoloxidase ....................................................................... 54

2.7 Análise Estatística................................................................................................ 54

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................... 55

3.1 Composição Centesimal das Cebolas.................................................................. 55

3.2 Conteúdo de Fenóis Totais .................................................................................. 56

3.3 Atividade Específica de Enzimas Oxirredutases................................................... 57

4 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 60

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 60

ARTIGO 3 ..................................................................................................................... 63

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE COMPOSTOS FENÓLICOS

EXTRAÍDOS DE CEBOLAS COMERCIAIS E DA MICROALGA CHLORELLA ............. 64

RESUMO...................................................................................................................... 64

ABSTRACT................................................................................................................... 64

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 65

2 PARTE EXPERIMENTAL .......................................................................................... 67

2.1 Reagentes............................................................................................................ 67

2.2 Amostras.............................................................................................................. 67

2.3 Determinação do Teor de Fenóis Totais............................................................... 67

2.4 Determinação da Atividade Antioxidante.............................................................. 68

2.4.1 Atividade Seqüestradora do Radical Livre DPPH .......................................... 68

2.4.2 Atividade de Inibição Enzimática Oxidativas................................................... 68

2.4.3 Avaliação da Peroxidação Lipídica................................................................. 69

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................... 70

3.1 Determinação de Fenóis Totais nas Amostras de Cebola e Chlorella .................. 70

3.2 Determinação da Atividade Antioxidante.............................................................. 72

3.2.1 Capacidade de Seqüestrar o Radical Livre DPPH ......................................... 72

3.2.2 Estudo da Inibição de Enzimas Oxidativas pelos Extratos em Estudo............ 75

3.2.3 Avaliação da Peroxidação Lipídica................................................................. 78

4 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 80

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 81

ARTIGO 4 ..................................................................................................................... 83

CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA MICROALGA CHLORELLA...................... 84

RESUMO...................................................................................................................... 84

ABSTRACT................................................................................................................... 84

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 84

2 PARTE EXPERIMENTAL .......................................................................................... 85

2.1Reagentes............................................................................................................. 85

2.2 Amostras.............................................................................................................. 85

2.3 Caracterização da Amostra.................................................................................. 86

2.4 Propriedades Eletroquímicas ............................................................................... 86

2.5 Determinação do Teor de Fenóis Totais............................................................... 86

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................... 87

4 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 87

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 88

CAPÍTULO IV..................................................................................................................... 89

4 CONCLUSÃO GERAL ............................................................................................... 90

CAPÍTULO V...................................................................................................................... 91

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS............................................................. 92

ANEXOS .......................................................................................................................... 100

ANEXO 1 - TABELAS E FIGURAS DO ARTIGO 1 ..................................................... 101

ANEXO 2 - DESCRIÇÃO DOS PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS E TABELAS

ESTATÍSTICAS DO ARTIGO 2................................................................................... 107

ANEXO 3 - DESCRIÇÃO DOS PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS E TABELAS

ESTATÍSTICAS DO ARTIGO 3................................................................................... 122

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO II – Revisão Bibliográfica

Tabela 1: Composição química da cebola em base úmida ................................................. 30

Tabela 2: Classificação comercial da cebola quanto às dimensões do bulbo ..................... 31

CAPÍTULO III – Artigo 2

Tabela 1: Composição centesimal e propriedades eletroquímicas das diferentes classes de

cebolas cultivadas em São José do Norte, R.S................................................................... 55

Tabela 2: Compostos fenólicos totais em diferentes classes de cebola.............................. 56

Tabela 3: Atividade específica da catalase e da peroxidase nas diferentes classes de

cebolas. .............................................................................................................................. 58

CAPÍTULO III – Artigo 3

Tabela 1: Resultados dos fenóis totais presentes nos extratos estudados.......................... 71

Tabela 2: Capacidade de seqüestrar o radical livre DPPH (% de inibição) utilizando-se

diferentes níveis de compostos fenólicos............................................................................ 73

Tabela 3: Conteúdo de fenóis totais, valores de Km, velocidades máximas e % de inibição

das reações de escurecimento enzimático na presença dos extratos analisados............... 76

Tabela 4: Índice de peróxido e concentração de malonaldeído em diferentes condições pró-

oxidantes ............................................................................................................................ 78

Tabela 5: Índice de peróxido, concentração de malonaldeído e % de inibição com adição do

extrato antes do processo oxidativo.................................................................................... 79

ANEXOS – Artigo 1

Tabela 1: Valores de conteúdo de fenóis (µg fenóis/g de cebola) para o planejamento fatorial

e 6 pontos centrais ....................................................................................................... 101

Tabela 2: Efeitos e coeficientes para as variáveis obtidas pelo tratamento estatístico...... 102

Tabela 3: Valores de conteúdo de fenóis (µg fenóis/g de cebola) para o planejamento fatorial

e 3 pontos centrais ....................................................................................................... 102

Tabela 4: Efeitos e coeficientes para as variáveis obtidas pelo tratamento estatístico...... 103

Tabela 5: Coeficiente de regressão para as variáveis significativas obtidas pelo tratamento

estatístico ......................................................................................................................... 103

Tabela 6: Dados de ANOVA para planejamento experimental avaliando rotação, tempo e

interação da rotação com o tempo.................................................................................... 103

Tabela 7: Conteúdo de fenóis totais em cebola nas diferentes classes ............................ 103

Tabela 8: Teste de Tukey entre as variações médias dos fenóis extraídos com metanol nas

diferentes classes de cebola............................................................................................. 104

ANEXOS – Artigo 2

Tabela 1: Procedimento da curva padrão de quercetina................................................... 114

Tabela 2: Procedimento da curva padrão de tirosina........................................................ 115

Tabela 3: Teste de Tukey para umidade nas diferentes classes de cebola....................... 118

Tabela 4: Teste de Tukey para cinzas nas diferentes classes de cebola.......................... 118

Tabela 5: Teste de Tukey para proteínas nas diferentes classes de cebola ..................... 118

Tabela 6: Teste de Tukey para fibra-bruta nas diferentes classes de cebola.................... 119

Tabela 7: Teste de Tukey para pH nas diferentes classes de cebola................................ 119

Tabela 8: Teste de Tukey para acidez nas diferentes classes de cebola.......................... 119

Tabela 9: Teste de Tukey para lipídios nas diferentes classes de cebola ......................... 119

Tabela 10: Teste de Tukey para carboidratos nas diferentes classes de cebola............... 120

Tabela 11: Teste de Tukey para fenóis totais extraídos com metanol para as diferentes

classes de cebola ............................................................................................................. 120

Tabela 12: Teste de Tukey para fenóis totais extraídos com água para as diferentes classes

de cebola.......................................................................................................................... 120

Tabela 13: Teste de Tukey para fenóis totais extraídos com acetato de etila para as

diferentes classes de cebola............................................................................................. 120

Tabela 14: Teste de Tukey para atividade específica da enzima catalase nas diferentes

classes de cebola ............................................................................................................. 121

Tabela 15: Teste de Tukey para atividade específica da enzima peroxidase nas diferentes

classes de cebola ............................................................................................................. 121

ANEXOS – Artigo 3

Tabela 1: Procedimento da curva padrão de quercetina................................................... 123

Tabela 2: Procedimento da curva padrão de tirosina........................................................ 125

Tabela 3: Procedimento da curva padrão de TMP............................................................ 128

Tabela 4: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 100 µL

de extrato em 15 minutos ................................................................................................. 129

Tabela 5: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 100 µL

de extrato em 30 minutos ................................................................................................. 129

Tabela 6: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 100 µL

de extrato em 45 minutos ................................................................................................. 130

Tabela 7: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 100 µL

de extrato em 60 minutos ................................................................................................. 130

Tabela 8: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 200 µL

de extrato em 15 minutos ................................................................................................. 131

Tabela 9: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 200 µL

de extrato em 30 minutos ................................................................................................. 131

Tabela 10: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 200

µL de extrato em 45 minutos............................................................................................. 132

Tabela 11: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 200

µL de extrato em 60 minutos............................................................................................. 132

Tabela 12: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 500

µL de extrato em 15 minutos............................................................................................. 133

Tabela 13: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 500

µL de extrato em 30 minutos............................................................................................. 133

Tabela 14: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 500

µL de extrato em 45 minutos............................................................................................. 134

Tabela 15: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 500

µL de extrato em 60 minutos............................................................................................. 134

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO II – Revisão Bibliográfica

Figura 1: Esquema geral da autoxidação de ácidos graxos poliinsaturados ....................... 19

Figura 2: Estruturas químicas dos antioxidantes sintéticos................................................. 23

Figura 3: Estruturas químicas de compostos fenólicos de ocorrência natural ..................... 25

CAPÍTULO III – Artigo 3

Figura 1: Avaliação da variável tempo em função do percentual de inibição dos extratos .. 75

Figura 2: Inibição da reação de escurecimento enzimático pelos extratos fenólicos de cebola

e chlorella ........................................................................................................................... 77

ANEXOS – Artigo 1

Figura 1: Superfície de resposta (a) e curva de contorno para fenóis (b).......................... 105

Figura 2: Cinética de rendimento de extração de fenóis por tempo................................... 106

RESUMO

O trabalho tem como objetivo determinar propriedades funcionais de tecidos vegetal e

microbiano visando fornecer subsídios para uma dieta saudável. O tecido vegetal escolhido

para este estudo foi a cebola cultivada na região sul do Rio Grande do Sul e a microalga

chlorella, que será avaliada como padrão de funcionalidade. As amostras de cebolas foram

fornecidas e separadas em classes comerciais, conforme o Regulamento Técnico de

Qualidade de Cebola, aprovado em 1995 pelo Ministério da Agricultura, do Abastecimento e

da Reforma Agrária, pelos técnicos da EMATER - Rio Grande. A composição centesimal, pH

e acidez (AOAC, 2000) e os compostos fenólicos da cebola que foram extraídos em três

sistemas solventes sob condições padronizadas (etanólico, aquoso, acetato de etila) e

quantificados colorimétricamente com reagente de Folin-Ciocalteau. Na microalga chlorella

os fenóis foram extraídos em sistema solvente metanólico. O teor de lipídios foi determinado

pelo método de Bligh & Dyer para ambas as matrizes, os açúcares redutores foram

determinados conforme método do 3,5-DNS (MILLER) para as amostras de cebola e na

microalga chlorella foi estimado por diferença. Nas cebolas foi estimada a atividade

específica de catalase, peroxidase e polifenoloxidase. A estimativa do potencial funcional

dos compostos fenólicos foi indicada pela capacidade de seqüestrar o radical livre (DPPH),

inibição da ação de enzimas oxirredutases e inibição de produção de peróxidos e compostos

oxidados em sistemas lipídicos. Nos extratos de cebola a média dos teores de fenóis em

solvente metanol, água e acetato de etila foram respectivamente 2,3; 3 e 0,08 mg/g de

cebola. Os valores para umidade variaram entre 88,3 e 88,6%, lipídios entre 0,16 e 0,19%,

proteínas entre 0,86 e 1,04%, cinzas entre 0,73 e 0,76%, fibras entre 0,6 e 0,7%, açúcares

redutores entre 3,73 e 5,2%, o pH entre 5,08 e 5,23, a acidez entre 0,29 e 0,38%. A

microalga chlorella apresentou 56,9% de proteína, 4,1% de umidade, 6,3% de cinzas, 22,3%

de açúcares redutores, 2,8% de fibra-bruta, 7,6% de lipídios, 0,2% de acidez e pH 5,7. A

atividade específica da catalase nas diferentes classes de cebola variou entre 0,014 e 0,025

mg H

/min/mg proteínas, sendo os maiores valores encontrados nas classes 2 e 3. A

polifenoloxidase não foi detectada nas diferentes classes enquanto que a atividade

específica da peroxidase variou entre 0,003 e 0,031 abs/min/mg proteínas. Todos os

extratos apresentaram atividade seqüestradora do radical livre DPPH, porém o extrato de

cebola extraído com acetato de etila foi o que apresentou maior inibição específica (53%)

em relação aos demais. As velocidades máximas da reação de escurecimento enzimático

diminuíram em presença dos extratos de cebola e chlorella, o que caracteriza o efeito de

inibição da oxidação do guaiacol catalisado pela peroxidase. O extrato mais promissor para

evitar a oxidação ocasionada pela catálise metálica em sistema lipídico foi o extrato de

cebola extraído com acetato de etila com uma inibição percentual de 53% acompanhado

pela menor formação de peróxido (até três vezes menor) e de malonaldeído (1,5 vezes

menor) ao longo do tempo do experimento.

Palavras-chave: antioxidante, enzimas, fenóis.

ABSTRACT

The work has as objective to determine functional properties in vegetal and microbian tissues

aiming at to supply subsidies a healthful diet. The tissue vegetal chosen for this study was

the onion cultivated in the southern region of the Rio Grande do Sul and the microalgae

chlorella, that it will be evaluated as functionality standard. The samples of onions had been

supplied and separate in commercial classrooms, as the Regulation Technician of Quality of

Onion, approved in 1995 for the Ministry of Agriculture, the Supplying and the Agrarian

Reformation, for the technician of the EMATER – Rio Grande. The centesimal composition,

pH and acidity (AOAC, 2000) and the phenolic composites of the onion that had been

extracted in three solvent systems under conditions standardized (ethanolic, watery, acetate

of etila) and quantified colorimetrically with reagent of Folin-Ciocalteau. In the microalgae

chlorella the phenols had been extracted in methanolic solvent system. The content of lipids

was determined by the method of Bligh & Dyer for both the matrices, the reducing sugars

had been determined in agreement method of 3,5-DNS (MILLER) for the samples of onion

and in the microalgae chlorella was esteem by difference. In the onions the specific activity of

catalase was esteem, peroxidase and poliphenoloxidase. The estimate of the functional

potential of phenolic composites was indicated by the capacity to scavenging the radical

(DPPH), inhibition of the enzyme action oxirredutases and inhibition of production of

peroxides and composites oxidated in lipídicos systems free. In onion extracts the average of

phenol texts in solvent methanol, water and acetate of etila had been respectively 2,3; 3 and

0,08 mg/g of onion. The values for humidity had varied between 88,3 and 88,6%, reducing

lipids between 0,16 and 0,19%, proteins between 0,86 and 1,04%, leached ashes between

0,73 and 0,76%, staple fibers between 0,6 and 0,7%, sugars between 3,73 and 5,2%, pH

between 5,08 and 5,23, the acidity between 0,29 and 0,38%. The microalgae chlorella

presented 56.9% of protein, 4.1% of humidity, 6.3% of leached ashes, 22.3% of reducing

sugars, 2.8% of fiber-rude, 7.6% of lipids, 0.2% of acidity and pH 5,7. The specific activity of

catalase in the different classrooms of onion varied between 0,014 and 0,025 mg

/min/mg proteins, being the biggest values found in classrooms 2 and 3.

Poliphenoloxidase w as not detected in the different classrooms while that the specific

activity of peroxidase varied between 0,003 and 0,031 abs/min/mg proteins. All the extracts

had presented scavenging activity of free radical DPPH, however the extract of onion

extracted with acetate of etila was what it presented greater specific inhibition (53%) in

relation to excessively. The maximum speeds of the reaction of enzymatic blackout had

diminished in presence of extracts of onion and chlorella, what it characterizes the effect of

inhibition of the oxidation of guaiacol catalyzed by peroxidase. The extract most promising to

prevent the oxidation caused for the metallic catalysis in lipídico system was the extract of

onion extracted with ethyl acetate with a percentile inhibition of 53% followed by the lesser

peroxide formation (up to three times lesser) and of malonaldeído (1,5 lesser times) to the

long one of the time of the experiment.

Keywords: antioxidants, enzymes, phenols.

CAPÍTULO I

1. INTRODUÇÃO

A literatura apresenta a partir dos anos 90 um aumento no número de estudos

demonstrando a importância do uso de antioxidantes, principalmente aqueles obtidos de

extratos vegetais, microbianos e outros. Eles se mostram capazes de remover os radicais

livres ou modularem a geração destas espécies oxidantes nos organismos ou em sistemas

reacionais geradores destas estruturas.

Os vários estudos com tecidos vegetais e microbianos, que vem sendo realizados

para caracterizar substâncias que apresentem propriedades funcionais em suas estruturas,

são norteados pelo fato que o potencial funcional está diretamente relacionado às

propriedades físico-químicas. Está demonstrado que alimentos ou substâncias possuem

componentes que afetam processos metabólicos, fisiológicos, resultando efeitos benéficos á

saúde, prevenindo ou diminuindo os sintomas de doenças crônicos degenerativas, tais

como, arteriosclerose, hipercolesterolemia, diabetes e outras. Assim a avaliação deste

potencial requer a caracterização físico-química dos constituintes presentes nas matrizes

estudadas, isolamento e elucidação das estruturas moleculares, bem como a avaliação “in

vivo” ou “in vitro” de indicativos dos efeitos benéficos à saúde de humanos e de animais de

criação.

Entre os compostos bioativos, de origem vegetal, são encontradas estruturas

variadas, como os ácidos fenólicos, derivados da cumarina, ligninas, taninos, flavonóides,

alcalóides e terpenóides, sendo todos quimicamente capazes de atuarem como agentes

redutores, seqüestrantes de radicais livres, inativando a reatividade deles por desativação

de seus elétrons desemparelhados.

Considerando que muitos vegetais de consumo disseminado na dieta são ricos em

alguns tipos de compostos funcionais e que variáveis bióticas e abióticas de cultivo, colheita,

armazenamento e preparo influenciam na disponibilidade de funcionais foram escolhidos

para estes estudo a cebola e a microalga chlorella. Entre a grande quantidade de

metabólitos secundários sintetizados pelos tecidos vegetais, que estão ganhando

importância pela suas aplicações biológicas, principalmente no sentido de contribuírem para

melhoria da saúde da população destacam-se os compostos fenólicos. Os fenóis são

compostos orgânicos que contêm um grupo hidróxi (-OH) ligado diretamente num anel

benzeno. Ao contrário dos álcoois normais, os fenóis são ácidos devido à influência dos

anéis aromáticos. Os fenóis participam em grande número de processos metabólicos de

plantas, sendo que 60% da produção em biomassa da planta são compostos fenólicos,

entre os quais, os fenóis monoméricos (ácido cinâmico) e poliméricos (tanino e lignina). A

prevenção de processos oxidativos por estes fitoquímicos decorrente da estrutura

característica pode torná-los adequados para sistemas aquosos ou lipídicos.

A cebola cultivada na região sul do Rio Grande do Sul e em diferentes partes do

mundo é considerada sob o aspecto nutricional como fonte de vitaminas e sais minerais,

além de apresentar propriedades terapêuticas comprovadas, como a proteção contra

algumas infecções do aparelho digestivo, diminuição do nível de glicose no sangue e

proteção contra a arteriosclerose. Pesquisadores demonstraram que a adenosina, presente

na cebola, impede a formação de coágulos, podendo prevenir ataques cardíacos. Estudos

também indicam que a cebola pode proteger contra o entupimento de artérias pelo

colesterol, uma vez que elevam os níveis das lipoproteínas de alta densidade (HDLs)

protetoras. Outras recomendações populares sugerem a ingestão de grandes quantidades

de cebolas para prevenir a hipertensão. Compostos de enxofre responsáveis pelo aroma da

cebola bloqueiam o potencial cancerígeno de alguns compostos químicos. Além disso, a

cebola contém substâncias que possuem um leve efeito antibacteriano.

A cebola (Allium Cepa L.) é uma das plantas cultivadas de mais ampla difusão no

mundo, sendo a segunda hortaliça em importância econômica, com valor da produção

estimado em cerca de US$ 6 bilhões anuais. A produção mundial apresentou aumento de

cerca de 25% na última década, o que coloca a cebola como uma das três hortaliças mais

importantes ao lado do tomate e da batata. Somado a isto, o valor social da cultura de

cebola é inestimável, sendo consumida por quase todos os povos do planeta, independente

da origem étnica e cultural, constituindo-se em um importante elemento de ocupação de

mão-de-obra familiar. Especialmente este aspecto é fundamental para o sul do Rio Grande

do Sul, que tem esta cultura como uma das mais importantes para os pequenos agricultores

da região sul do estado. No entanto, nem sempre o esforço da produção é compensado

comercialmente, pois as condições climáticas, o sistema de armazenamento e transporte

nem sempre propiciam que a cebola in natura atinja colocação satisfatória na classificação

do Ministério da Agricultura.

A microalga chlorella, encontrada espontaneamente em tanques e lagos, foi

descoberta pelos japoneses, tradicionais consumidores de algas, que apreciam e utilizam

normalmente como complemento alimentar. Este povo atribui ao consumo desta alga

sensação de bem estar e aumento de energia após um curto período de uso, associado à

sua alta concentração de vitamina B

que é rapidamente incorporada nos processos

metabólicos.

Esta alga é rica em clorofila, proteínas, vitaminas, sais minerais e aminoácidos, por

isto recomendada como suplemento alimentar, além disto, apresenta algumas propriedades

importantes, como por exemplo, estimulante do sistema imunitário, auxílio nos regimes de

emagrecimento, no tratamento de obesidade, em distúrbios digestivos e cardiovasculares,

na geriatria, e nos níveis de colesterol e triglicerídeos elevados. Atualmente a China e o

Japão são os maiores produtores de chlorella onde é cultivada em escala industrial com

processos biotecnológicos bem definidos e eficientes. Estes também estão sendo estudados

no Laboratório de Engenharia Bioquímica da FURG, visando ampliar escala de cultivo

sustentável como alternativa para os produtores da região, rica em recursos hídricos que

poderiam ser empregados para cultivo de microalgas.

No caso deste trabalho a escolha decorre da similaridade entre os efeitos benéficos

à saúde a ela atribuídos serem similares aos das cebolas. Prevenir a oxidação ou

envelhecimento das células é uma função importante, pois reduz os riscos de inúmeras

doenças crônicos degenerativas e se isto fica demonstrado através dos alimentos pode se

adotar interferências seguras na dieta da população, agregar conhecimento aos saberes

populares, gerar alternativas para a produção de alimentos e emprego de seus resíduos. A

conseqüência disto são benefícios em diferentes níveis tais como sociais, do agronegócio e

saúde pública.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL:

Caracterizar compostos bioativos presentes em tecidos vegetais e microbianos,

visando fornecer subsídios para uma dieta saudável.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Determinar a composição centesimal de cebolas de diferentes classes comerciais e da

microalga chlorella empregada como suplemento alimentar.

 Determinar o conteúdo de fenóis totais em extratos de cebola e chlorella amostradas.

 Medir o potencial antioxidante dos compostos fenólicos das amostras em sistemas

aquosos e lipídicos.

 Avaliar a atividade de enzimas óxido-redutases nas diferentes classes de cebola

produzidas na região sul do Rio Grande do Sul.

CAPÍTULO II

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. PROCESSOS OXIDATIVOS

3.1.1. Caracterização dos Processos Oxidativos

Os organismos vivos interagem com o meio ambiente visando manter um ambiente

interno que favoreça a sobrevivência, o crescimento e a reprodução. O oxigênio molecular

) obtido da atmosfera é vital para organismos aeróbicos, contudo, espécies reativas

formadas intracelularmente a partir do oxigênio ameaçam a integridade celular por meio da

oxidação de biomoléculas, e podem comprometer processos biológicos importantes

(RIBEIRO e et al., 2005).

Os sistemas biológicos oferecem condições favoráveis para ocorrência de reações

de caráter oxidativo, devido à existência de lipídios insaturados nas membranas celulares

(JORDÃO et al., 1998). As espécies reativas de oxigênio (EROs) atacam as cadeias de

ácidos graxos poliinsaturados dos fosfolipídios e do colesterol, abstraindo um hidrogênio do

grupo metileno bis-alílico, iniciando assim o processo de peroxidação lipídica nas

membranas celulares. Os radicais de carbono formados podem reagir com oxigênio

originando radicais peroxila, que por sua vez podem atacar novas cadeias de ácidos graxos

poliinsaturados, propagando a reação. O resultado deste processo é a oxidação de várias

moléculas de ácidos graxos (SOUSA et al 2007; SINGH e RAJINI, 2004; RAMALHO e

JORGE, 2006).

Uma quantidade substancial de evidências tem indicado o papel chave dos radicais

livres e outros oxidantes como grandes responsáveis pelo envelhecimento, e pelas doenças

degenerativas associadas ao envelhecimento, como câncer, doenças cardiovasculares,

catarata, declínio do sistema imune e disfunções cerebrais (GUTTERIDGE, 1993; KEHRER

e SMITH, 1994; HALLIWELL, 2000). Os radicais livres são moléculas instáveis, pelo fato de

seus átomos possuírem um número ímpar de elétrons. Para atingir a estabilidade, estas

moléculas reagem com substâncias que apresentam elétrons desemparelhados (JORDÃO

et al., 1998; HALLIWELL, GUTTERIDGE e CROSS, 1992). Estas estruturas podem ser

formadas no ambiente ou nos seres vivos em presença de luz, temperatura, compostos

metálicos ou como intermediários em reações metabólicas.

Para evitar os danos causados pelas EROs, os organismos desenvolveram vários

mecanismos de defesa, isto é, potenciais de neutralização das ações dos radicais livres,

chamados antioxidantes. Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias que ao

estarem presentes em pequenas concentrações, quando comparadas ao substrato oxidável,

retardam ou previnem significativamente o início ou a propagação da cadeia de reações de

oxidação do mesmo (BIANCHI e ANTUNES, 1999; HALLIWELL et al., 1995). Estes

antioxidantes estão em permanente atividade no organismo, visto que a produção de

energia no organismo é uma das principais causas da formação de radicais, necessitando

estar presentes em quantidades suficientes para neutralização dos efeitos dos radicais livres

normalmente produzidos. Quando esta equivalência não existe, pode-se dizer que está

ocorrendo um estresse oxidativo.

3.1.2. Causas de Oxidação nos Alimentos

Após a colheita de frutas e hortaliças inicia-se uma série de processos degradativos

que aceleram a senescência, causando perdas de grande parte da produção. Diversas

dessas perdas podem ser atribuídas à ação de enzimas durante a pós-colheita (ZANATTA,

ZOTARELLI e CLEMENTE, 2006). A peroxidase e a polifenoloxidase têm sido consideradas

as principais enzimas responsáveis pela deterioração da qualidade em muitas frutas e

vegetais. Estas enzimas podem participar de um grande número de reações oxidativas e de

biodegradação, tais como mudança de cor, degradação da clorofila ou auxinas, oxidação de

fenóis, oxidação do ácido indol acético, biossíntese da lignina, e muitos destes fatores

também podem ser associados com flavour, cor, textura e qualidade nutricional dos

alimentos (VALDERRAMA, MARANGONI, CLEMENTE, 2001; ZANATTA, ZOTARELLI e

CLEMENTE, 2006; CARNEIRO, ROLIM e FERNANDES, 2003).

Os óleos, gorduras e os alimentos que os contêm estão sujeitos a reações químicas

que podem alterar as características do produto final de maneira indesejável, modificando as

qualidades organolépticas, além de efeitos tóxicos causados pela ingestão contínua de

produtos rancificados. Estas reações de degradação dos lipídios, também chamadas de

rancidez ou rancificação, são os processos de deterioração mais importante nesses

produtos e podem ocorrer durante o processamento, estocagem e utilização dos produtos

(BOBBIO e BOBBIO, 1992; ZAMBIAZI, 1999).

Os lipídios podem ser oxidados por diferentes caminhos e usualmente o início são as

reações hidrolíticas catalisadas pelas enzimas lípase ou pela ação de calor e umidade, com

formação de ácidos graxos livres. A oxidação por via enzimática ocorre pela ação das

enzimas lipoxigenases que atuam sobre os ácidos graxos poliinsaturados, catalisando a

adição de oxigênio à cadeia hidrocarbonada poliinsaturada. O resultado é a formação de

peróxidos e hidroperóxidos com duplas ligações conjugadas que podem envolver-se em

diferentes reações degradativas. O mecanismo de fotoxidação de gorduras insaturadas é

promovido essencialmente pela radiação UV em presença de fotossensibilizadores (clorofila,

mioglobina, riboflavina e outros) que absorvem a energia luminosa de comprimento de onda

na faixa do visível e a transferem para o oxigênio triplete (

), gerando o estado singlete

(

). O oxigênio singlete reage diretamente com as ligações duplas por adição formando

hidroperóxidos diferentes dos que se observam na ausência de luz e de sensibilizadores, e

que por degradação posterior originam aldeídos, álcoois e hidrocarbonetos. A autoxidaçao é

o principal mecanismo de oxidação dos óleos e gorduras. A autoxidação dos lipídios está

associada à reação do oxigênio com ácidos graxos insaturados e ocorre em três etapas:

(SILVA, BORGES e FERREIRA, 1999; RAMALHO e JORGE, 2005).

Iniciação: Ocorre a formação dos radicais livres devido à retirada de um hidrogênio

do carbono alílico na molécula do ácido graxo, em condições favorecidas por luz e calor.

Propagação: Os radicais livres são susceptíveis ao ataque do oxigênio atmosférico,

sendo convertidos em outros radicais, gerando produtos primários de oxidação (peróxidos e

hidroperóxidos) cuja estrutura depende da natureza dos ácidos graxos presentes. Os

radicais livres formados atuam como propagadores da reação, resultando em um processo

autocatalítico.

Término: dois radicais se combinam, com a formação de produtos estáveis

(produtos secundários de oxidação) obtidos por cisão e rearranjo dos peróxidos (epóxidos,

compostos voláteis e não voláteis).

O mecanismo da autoxidação dos lipídios, esquematizado na Figura 1, é

tradicionalmente descrito como uma reação em cadeia:

INICIAÇÃO

PROPAGAÇÃO

TERMINAÇÃO

Figura 1: Esquema geral da autoxidação de ácidos graxos poliinsaturados

221

OOORROOROOR

OORROORR

RRRR

OOHRRHROOR

OOROR

HRHR

+→+

→+

−→+

+→+

→+

+→

3.1.3. Mecanismos Naturais de Defesa contra Processos Oxidativos

Para se protegerem contra a oxidação, os organismos contam com mecanismos

químicos e enzimáticos (YU, 1994). O sistema enzimático é formado por diversas enzimas,

destacando-se a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase

(GPx) (RIBEIRO e et al., 2005; YU, 1994).

A superóxido dismutase (SOD) age transformando dois ânions radicais superóxidos

em um peróxido de hidrogênio, a qual é uma reação normal em pH fisiológico porém muito

acelerada através desta enzima. Possui meia vida curta (menos de dez minutos) e não

penetra nas células. A SOD pode ocorrer de três formas, dependendo do metal associado a

mesma (cobre e zinco no citoplasma de eucariontes, manganês na matriz mitocondrial, ferro

em bactérias) (RIBEIRO et al., 2005; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1989; BATELLO, 2002;

YU, 1994).

Outro antioxidante enzimático é a catalase, que possui a capacidade de transformar

peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. Sua localização está nos peroxissomas, tendo

por isto ação diminuída em órgãos como o coração, pulmão e o cérebro que possuem pouco

peroxissomas. Nestes órgãos a ação antioxidante desta enzima ocorre quando os radicais

livres atingem a circulação sanguínea, através da catalase eritrocitária (RIBEIRO et al.,

2005; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1989; BATELLO, 2002; YU, 1994).

Catalase

2 H

----------> 2 H

+ O

O peróxido de hidrogênio também pode ser transformado pela ação da enzima

glutation peroxidase (GPx), localizada no citosol e na matriz mitocondrial. Sua ação ocorre

através da redução do peróxido de hidrogênio e de hidropeptídeos orgânicos através da

utilização da glutation (GSH), um tripeptídeo de ácido α-glutâmico, cisteína e glicina que

atua como co-substrato da glutation peroxidase, com propriedade de doador de elétrons. A

glutation redutase (GR) regenera o glutation com a transferência de hidrogênio do NADPH.

Neste processo são transferidos dois hidrogênios dos grupamentos sulfidrilas para os

peróxidos, transformando-os em álcool e/ou água, resultando em glutation dissulfeto

(GSSG). A glutation peroxidase geralmente ocorre associada ao selênio, mas também pode

ocorrer independente. Os principais locais de ação deste mecanismo são o fígado, os

eritrócitos, o coração, os pulmões e músculos (RIBEIRO et al., 2005; HALLIWELL e

GUTTERIDGE, 1989; BATELLO, 2002; YU, 1994).

GSH-Px (selênio)

2 GSH + H

<----------> GS-SG + 2 H

Glutationa redutase

Outro mecanismo de defesa do organismo é a não-enzimática. Alguns nutrientes

essenciais podem neutralizar diretamente os radicais de oxigênio, como por exemplo, a

vitamina E, vitamina A, carotenóides, ácido ascórbico e uma série de outros antioxidantes

não enzimáticos que participam da defesa contra as espécies reativas do oxigênio nos

sistemas biológicos, tais como, a ubiquinona, a ceruplasmina, o ácido úrico, a taurina, os

flavonóides e outros compostos fenólicos de origem vegetal (HALLIWELL, 1990; CUTLER,

1991; SIES, 1991).

3.2. COMPOSTOS BIOATIVOS

Os processos vitais de biossíntese são responsáveis pela formação, acúmulo e

degradação de inúmeras substâncias orgânicas no interior das células que formam os

diversos tecidos dos organismos animais e vegetais. Muitas dessas substâncias,

especialmente as de origem vegetal, encontram emprego utilitário em diversas áreas

aplicadas à alimentação e à saúde (MATOS, 1997).

Os compostos resultantes desse metabolismo podem ser separados em produtos do

metabolismo primário que são os glicídios, protídios e lipídios, e os do metabolismo

secundário, que são os compostos terpênicos, alcalóides, glicosídios e vários outros. Os

primeiros são estudados, principalmente, no âmbito da bioquímica e os últimos no âmbito do

que se convencionou denominar química de produtos naturais. A fitoquímica tem por

objetivo imediato o esclarecimento e registro dos constituintes resultantes do metabolismo

secundário dos seres vivos, através do seu isolamento e elucidação de suas estruturas

moleculares (MATOS, 1997).

Desde os primórdios da história da humanidade há relatos mostrando que o homem

sempre utilizou plantas na cura de doenças. Entretanto, foi apenas no início do século XIX

que Sertürnerse isolou a morfina do ópio, sendo este considerado o primeiro composto

bioativo (PARTINGTON, 1989). A partir deste fato, cresceu consideravelmente o interesse

no isolamento de novos compostos naturais apresentando bioatividades e, nos últimos anos,

com o advento e a sofisticação de técnicas analíticas como Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE), Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e outras, o isolamento e a

elucidação estrutural de novas substâncias, mesmo complexas, tornou-se trivial

(GIACOMINI et al., 2005).

Dentre as diversas classes de produtos naturais, os compostos fenólicos pertencem

a uma classe que inclui uma grande diversidade de estruturas, simples e complexas

derivados da fenilamina e tirosina (NACZK e SHAHIDI, 2004), cujas estruturas químicas

possuem potencial para atuarem como agentes redutores, seqüestrantes de radicais livres,

inativando a reatividade deles por desativação de seus elétrons desemparelhados.

3.3. PROPRIEDADES FUNCIONAIS

As propriedades funcionais são aquelas que conferem ao sistema em que se

encontram efeitos físicos, químicos ou fisiológicos específicos. Com a evolução da

instrumentação analítica e do conhecimento metabólico o efeito específico destes

compostos passou a ser associado as suas estruturas químicas. A partir disto foram sendo

elucidadas as participações destes compostos nas reações bioquímicas, a exemplo do já

conhecido efeito tecnológico de alguns macronutrientes como as proteínas, carboidratos e

lipídios na década de 70. Para distinguir o termo funcional de caráter tecnológico do

funcional fisiológico alguns países, inclusive o Brasil passaram a legislar sobre as alegações

de funcionalidade em alimentos.

A ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), 1999 definiu alguns termos

visando facilitar o processo de alegação de funcionalidade de alguns alimentos.

“Propriedade funcional é aquela relativa ao papel metabólico ou fisiológico que o nutriente

ou não nutriente tem no crescimento, desenvolvimento, manutenção e outras funções

normais do organismo humano.” “Propriedade de saúde é aquela que afirma, sugere ou

implica a existência da relação entre alimento ou ingrediente com doença ou condição

relacionada à saúde.

Segundo PASTORE (2005) existe diversos grupos químicos aos quais se atribuem

propriedades terapêuticas, ou redutoras de riscos à saúde, que confere esta característica

especial aos alimentos que são denominados funcionais. Como exemplo pode ser citado os

compostos fenólicos do tipo flavonóides, que são antioxidantes encontrados em vegetais de

cores roxa, azul ou violeta (uva, cereja, berinjela). Possuem atividade antiinflamatória,

evitam a aglomeração das plaquetas sanguíneas e a ação de radicais livres no organismo,

protegendo desde o código genético (DNA) aos lipídios, desta forma abortando os

processos carcinogênicos (POKORNY, 1991; WACH, PYRZYNSKA e BIESAGA, 2007). A

quercetina e seus derivados têm recebido atenção especial entre os constituintes da dieta

alimentar, em função de estudos epidemiológicos apontarem estes compostos como

preventivos a doenças cardiovasculares e câncer, tal atividade deve-se a ação antioxidante

exercida pelos mesmos (WACH, PYRZYNSKA e BIESAGA, 2007).

3.4. ANTIOXIDANTES

Os mais abundantes antioxidantes são compostos aromáticos que contém pelo

menos uma hidroxila podendo ser sintéticos ou naturais. Entre os antioxidantes sintéticos

mais utilizados na indústria de alimentos tem-se, o BHA (butil hidroxianisol) e o BHT (butil

hidroxitolueno) apresentando boa resistência a processos de forneamento, embora

inadequadas à fritura. TBHQ (terc-butil hidroquinona) é um sólido de cor bege, mais eficiente

que o BHA e BHT, introduzido como antioxidante na década de 70 é por sua vez

particularmente efetivo na estabilização de óleos altamente insaturados, apresentando-se

bastante eficiente em produtos submetidos à fritura (BANNWART e TOLEDO, 1999). O BHA

é uma mistura de isômeros 3-terc-butil-4-hidroxianisol e 2-terc-butil-4-hidroxianisol

), é um sólido de aspecto ceroso e cor branca ou amarelada e possui fraco odor

aromático característico. O BHT, também, conhecido como 3,5-di-terc-butil-4-hidroxitolueno,

sua fórmula molecular (C

O) e se apresenta como um pó branco.

São usados ainda como antioxidantes sintéticos o galato de propila e o palmitato de

ascorbila. O Galato de propila é um sólido cristalino, pouco solúvel em água, muito solúvel

em compostos orgânicos e pouco solúvel em óleos. É produzido a partir do ácido gálico e

exibe excelente atividade antioxidante em alimentos e óleos vegetais, especialmente em

combinação com o palmitato de ascorbila. O Palmitato de ascorbila é um composto sintético

obtido de dois produtos naturais, ácidos palmítico e ascórbico, é um sólido cristalino branco,

pouco solúvel em água, solúvel em etanol e outros solventes polares. A figura 2 apresenta

as estruturas químicas dos compostos BHA, BHT, TBHQ e Galato de Propila.

Figura 2: Estruturas químicas dos antioxidantes sintéticos

Estudos toxicológicos têm demonstrado a possibilidade destes antioxidantes

apresentarem efeito carcinogênico em experimentos com animais. Em outros estudos, o

BHA mostrou induzir hiperplasia gastrointestinal em roedores por um mecanismo

desconhecido; em humanos, a relevância dessa observação não está clara (RAMALHO e

JORGE, 2006). A redução do nível de hemoglobina e a hiperplasia de células foram

atribuídas ao uso de TBHQ. Por estes motivos, o uso de antioxidantes em alimentos é

limitado.

Tendo em vista dos indícios de problemas que podem ser provocados pelo consumo

de antioxidantes sintéticos, pesquisas têm sido desenvolvidas no sentido de encontrar

produtos naturais com atividade antioxidante, os quais permitirão substituir os sintéticos ou

fazer associações entre eles, com intuito de diminuir sua quantidade em alimentos. Entre os

compostos antioxidantes provenientes de fontes naturais temos os flavonóides, taninos,

cumarinas, xantonas, terpenos, tocoferóis, ácidos fenólicos e outros (IQBAL, BHANGER e

ANWAR, 2007). Eles podem ser encontrados em vários alimentos e plantas, tais como,

frutas, vegetais, sementes, cereais, ervas, especiarias e óleos (IQBAL, BHANGER e

ANWAR, 2007; PAZOS et al., 2007; DIMITRIOS, 2006).

Nos sistemas alimentícios, naturalmente ocorrem antioxidantes, como os tocoferóis e

o ácido ascórbico, e protegem contra a oxidação lipídica pelas reações quelantes de radicais

livres ou varrendo o oxigênio. No entanto, os antioxidantes naturais são freqüentemente

perdidos durante o processo ou estocagem, necessitando da adição de antioxidantes

endógenos que efetivamente retardem o início da oxidação lipídica (AARDT et al., 2004).

Os antioxidantes fenólicos funcionam como seqüestradores de radicais e, algumas

vezes, como quelantes de metais, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação

do processo oxidativo. Os produtos intermediários formados pela ação destes antioxidantes

são relativamente estáveis, devido a ressonância do anel aromático apresentada por essas

substâncias (RAMALHO e JORGE, 2006; PAZOS et al., 2007).

A figura 3 apresenta a estrutura química de alguns compostos fenólicos encontrados

naturalmente em vegetais.

Figura 3: Estruturas químicas de compostos fenólicos de ocorrência natural

O fato de que uma substância ser natural e comumente encontrada em alimentos

não garante que esta não é tóxica. Estes compostos podem possuir menor toxicidade, ou

ser menos carcinogênicos ou mutagênicos. Os antioxidantes sintéticos são constantemente

testados para estes efeitos, mas muitos compostos naturais não foram testados. A indústria

dos alimentos procura a aceitação dos consumidores para os seus produtos, porém é

importante primar pela a utilização de aditivos reconhecidamente seguros, testados antes do

uso.

3.4.1. Compostos Fenólicos

Os compostos fenólicos são compostos orgânicos que contêm um grupo hidróxi (-

OH) ligado diretamente num anel aromático. Ao contrário dos álcoois normais, os fenóis são

ácidos devido à influência do anel aromático, que conferem a estrutura um papel importante

na neutralização ou seqüestro de radicais livres e quelação de metais de transição, agindo

tanto na etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo (HALLIWELL et al.,

1995). A distribuição dos compostos fenólicos nos tecidos e células vegetais varia

consideravelmente de acordo com espécie e tipo de função a exercer, situando-se no

interior de células ou na parede celular (MARTINEZ-VALVERDE; PERIOGO; ROS, 2000).

Os maiores grupos dos agentes fenólicos com propriedades antioxidantes incluem os

fenóis neutros, os ácidos fenólicos, flavonóides, isoflavonas, flavonas, antocianinas,

Ácido Siringico

Ácido 3,4-

dihidrobenzóico

Ácido Sináptico Ácido Caféico

catequinas e outros fenólicos presentes naturalmente em frutas e vegetais (OLIVEIRA,

2005; DIMITRIOS, 2006).

Estes compostos são classificados em três categorias, aqueles pouco distribuídos na

natureza, polímeros e largamente distribuídos na natureza. Na família dos compostos

fenólicos pouco distribuídos na natureza, encontra-se um número bem reduzido, embora

com certa freqüência. Neste grupo estão os fenóis simples, o pirocatecol, a hidroquinona e o

resorcinol. Pertencem ainda a esta família os aldeídos derivados dos ácidos benzóicos, que

são constituintes dos óleos essenciais, como a vanilina (SOARES, 2002). Os polímeros são

fenóis que não se apresentam na forma livre nos tecidos vegetais, esta família engloba os

taninos e as ligninas. Os compostos fenólicos largamente distribuídos na natureza podem se

dividir em flavonóides (antocianinas, flavonóis e seus derivados), ácidos fenólicos (ácidos

benzóico, cinâmico e seus derivados) e cumarinas (KING e YOUNG; 1999)

As estruturas fenólicas são encontradas em frutas cítricas, como o limão, laranja e

tangerina, além de outras frutas a exemplo da cereja, uva, ameixa, pêra, maçã e mamão,

usualmente em maiores quantidades na polpa que no suco da fruta. Pimenta verde, brócolis,

repolho roxo, cebola, alho e tomate também são excelentes fontes destes compostos

(PIMENTEL, FRANCKI e GOLLÜCKE, 2005; DIMITRIOS, 2006).

Diversos pesquisadores têm trabalhado na separação, identificação, quantificação e

aplicação dos compostos fenólicos em alimentos, enfrentando muitos problemas

metodológicos, pois, além de englobarem uma gama enorme de substâncias, são, na

maioria das vezes, de grande polaridade, muito reativos e susceptíveis à ação de enzimas

(AGUIAR et al., 2007; KING e YOUNG; 1999)

A análise de compostos fenólicos é influenciada pela natureza do composto, o

método de extração empregado, o tamanho da amostra, o tempo e as condições de

estocagem, o padrão utilizado e a presença de interferentes tais como ceras, gorduras,

terpenos e clorofilas. Ainda não se desenvolveu um método satisfatório para a extração de

todos ou de uma classe específica presentes nos alimentos. A solubilidade deles varia com

os substituintes das cadeias carbonadas cíclicas, o grau de polimerização e suas interações

com outros constituintes dos tecidos onde se encontram. Os solventes mais utilizados para

a extração são: metanol, etanol, acetona, água, acetato de etila, propanol,

dimetilformaldeído e suas combinações (NACZK e SHAHIDI, 2004).

Outro aspecto importante no desenvolvimento de métodos de quantificação de

compostos fenólicos é a dificuldade de se encontrar um padrão específico e conveniente,

devido à complexidade das substâncias fenólicas presentes nos alimentos e as diferenças

de reatividade entre estas substâncias e os reagentes (ANGELO e JORGE, 2007).

MALACRIDA e MOTTA (2005) quantificaram as concentrações de compostos

fenólicos totais e antocianinas em sucos de uva reconstituídos e simples, de diferentes

marcas, disponíveis no comércio varejista da região metropolitana de Belo Horizonte (Minas

Gerais). O conteúdo de compostos fenólicos totais foi determinado

espectrofotometricamente e os teores encontrados variaram entre 0,3 e 2,4 g/L e as

concentrações de antocianinas de 1,2 a 67 mg/L.

Outro tipo de fonte de compostos fenólicos foi estudado por FUNARI e FERRO

(2006) que realizaram determinações em própolis seguindo a recomendação do Ministério

da Agricultura que recomenda a quantificação dos teores de flavonóides e fenóis totais além

de exame organoléptico, perda por dessecação a 105°C, teores de cinza e de cera, resíduo

insolúvel em metanol e resíduo seco. Os teores de fenóis totais foram quantificados tendo

ácido gálico, tomado como substância de referência e o valor encontrado na amostra

analisada foi de 7,4%, que atende ao requisito mínimo do Ministério da Agricultura, de 5%.

Os resultados permitiram observar que, excetuando-se perda por dessecação a 105°C,

todos os demais parâmetros estiveram dentro dos limites estabelecidos pelo Ministério da

Agricultura.

3.4.2. Métodos para Avaliação da Atividade Antioxidante

A quebra da cadeia reacional da oxidação lipídica pelos antioxidantes não ocorre

segundo um mecanismo simples, e certos aspectos, relativos às interações entre

constituintes de meios complexos, não estão completamente esclarecidos. O emprego de

antioxidantes em formulações é muitas vezes empírico, de tal modo que a garantia da sua

eficácia nem sempre existe. Tendo em vista uma rápida avaliação da capacidade e eficácia

antioxidante de compostos químicos ou extratos vegetais, bem como o estudo dos

mecanismos de ação antioxidante, estão descritos na literatura diversos trabalhos (SILVA,

BORGES e FERREIRA, 1999). Os diversos métodos propostos na literatura variam quanto

ao tipo de radicais livres gerados ao indicador de oxidação escolhido e ao método usado

para a sua detecção e quantificação.

Na maioria dos casos recorre-se à formação de radicais instáveis, pela

decomposição térmica de azo iniciadores (e.g.ABAP, AMVN, AAPH), os quais reagem

rapidamente com o oxigênio originando radicais peróxido. Estes atuam sobre um substrato

lipídico (e.g. ácido linoleíco ou um dos seus ésteres) desencadeando um processo de

lipoperoxidação, em relação ao qual se escolhe um determinado indicador (como o consumo

de oxigênio, desaparecimento do substrato lipídico ou aparecimento de produtos de

oxidação) que é quantificado antes e após a adição de um composto antioxidante (avaliação

da atividade scavenger). Alguns autores propõem outros tipos de testes que não recorrem à

oxidação de substratos lipídicos, mas à redução de radicais livres estáveis gerados in vitro,

como resultado da atividade scavenger de compostos antioxidantes.

Existem diversas maneiras de avaliar a atividade antioxidante, entre elas, a oxidação

forçada de um substrato lipídico, que consiste em colocar num sistema reacional apolar um

ácido linoléico ou linoleato de metila sob aquecimento a 110°C e corrente de oxigênio. A

diminuição da concentração do linoleato de metila é acompanhada por cromatografia

gasosa e a atividade antioxidante é avaliada pelo aumento do tempo de semi-vida do

substrato de oxidação na presença do antioxidante. A utilização deste teste encontra-se

condicionada pela solubilidade e estabilidade térmica dos antioxidantes no meio reacional. A

oxidação do ácido graxo insaturado (ácido linoléico ou linoleato de metila) pode ser

acelerada utilizando um iniciador radicalar ou um pró-oxidante contendo íons Fe

(e.g.hemoglobina), evitando deste modo o aquecimento e oxigenação intensivos (SILVA,

BORGES e FERREIRA, 1999).

A atividade antioxidante utilizando sistema β-caroteno/ácido linoléico, trata-se de um

ensaio espectrofotométrico baseado na descoloração (oxidação) do β-caroteno induzida

pelos produtos da degradação oxidativa de um ácido graxo (e.g. ácido linoleíco). A

determinação é efetuada a 470 nm, na presença e na ausência de um antioxidante (SILVA,

BORGES e FERREIRA, 1999; ALMEIDA et al., 2006).

Um dos métodos mais utilizados para determinar capacidade de um antioxidante de

seqüestrar um radical livre trata-se do método de seqüestro do radical DPPH, que consiste

na redução do radical 2,2’-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH•), que apresenta um máximo de

absorção a 517-520 nm. Ao fixar um H•, abstraído ao antioxidante em estudo, observa-se

uma diminuição da absorvência, o que permite calcular, após o estabelecimento do

equilíbrio da reação, a quantidade de antioxidante gasta para reduzir 50% do DPPH•. Trata-

se de um teste rápido, que não envolve condições drásticas de temperatura e oxigenação

(SOUSA et al., 2007; SILVA, BORGES e FERREIRA, 1999; ALMEIDA et al., 2006).

PASSOTTO, PENTEADO e FILHO (1998) avaliaram a atividade antioxidante da

vitamina A na forma de acetato de retinol e de seu principal precursor, o β-caroteno,

adicionados a um sistema de óleo de soja previamente sensibilizado à oxidação. Os

parâmetros utilizados como grau de atividade oxidativas foram: índice de peróxidos, teores

de malonaldeído durante os intervalos de 24 a 72 horas, e perfil dos ácidos linoléico e

linolênico após 144 horas de oxidação. Os resultados mostraram que o retinol apresentou

atividade antioxidante superior ao β-caroteno. As atividades antioxidantes foram

comparáveis às do butilhidroxitolueno (BHT).

SOUSA et al (2007) determinaram os fenóis totais, pelo método de Folin-Ciocalteau

e avaliaram a atividade antioxidante, pelo ensaio do DPPH, do extrato de cinco plantas

medicinais: Terminalia brasiliensis, Terminalia fagifolia, Cenostigma macrophyllum, Qualea

grandiflora e Copernicia prunifera. Os resultados mostraram que todos os extratos

apresentaram atividade antioxidante, mas o extrato etanólico de cascas de T. brasiliensis,

com maior atividade antioxidante (CE

= 27,6) mostrou-se comparável aos controles

positivos, rutina (CE

= 27,8) e ácido gálico (CE

= 24,3). CE significa a quantidade de

extrato das plantas testadas para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50%.

3.5. CEBOLA

3.5.1. Características Biológicas e Químicas

A cebola (Allium cepa L.) é um bulbo de caule cônico pouco desenvolvido, maciço,

envolto por folhas modificadas, as quais se apresentam como túnicas superpostas. É uma

planta subterrânea, cujas raízes partem da porção inferior deste caule. As folhas, tipo

túnicas ou escamadas, representam à porção comestível que têm como função o

armazenamento de nutrientes para outras porções do vegetal durante o ciclo de vida

(GEMTCHÚJNICOV, 1976; RAVEN, EVERT e EICHHORN, 1996).

As variedades de cebola existentes no mercado são inúmeras e os modos de

classificar seus cultivares são: quanto ao fotoperíodo (de dias curtos, longos ou

intermediários); quanto ao formato do bulbo (periforme, chato, redondo, bojudo, outros);

quanto à coloração das escamas (amarelas, roxas, brancas, verdes); quanto ao sistema de

plantio (sistema de mudas ou semeadura direta); quanto à finalidade (para mesa, conservas,

molhos, outros) (MINAMI, ANDRADE e LIMA, 1980).

Dentre os constituintes da cebola, destaca-se o seu grande conteúdo de água, em

média 90%, sendo o restante constituído basicamente por carboidratos. Observa-se

também, em quantidades menores, a presença de proteínas, de vitamina C e ácidos

orgânicos como são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1: Composição química da cebola em base úmida

Composição bulbo maduro in natura

(100 g de porção comestível)

Valor energético (Kcal) 45

Umidade (%) 85 – 90,5

Carboidratos (%) 6,5 – 11,5

Lipídios (%) 0,1 – 0,2

Compostos nitrogenados (g) 1,5 – 2,0

Fibras (g) 0,5 – 0,6

Cinzas (g) 0,4 – 0,6

Ca (mg) 30

P (mg) 40

Fe (mg) 1,0

Tiamina (mg) 0,04

Riboflavina (mg) 0,03

Niacina (mg) 0,3

Ac. Ascórbico (mg) 10

Ac. Málico (mg) 170

Ac. Cítrico (mg) 20

Fonte: MARTINS (2003)

A cebola apresenta ainda compostos orgânicos sulfurados que conjuntamente com

os carboidratos, conferem gosto acre açucarado. As essências voláteis da cebola são

várias, porém as mais importantes são as sulfuradas. A composição química e as

características sensoriais de cor, aroma e sabor, dependem do cultivar, das condições de

cultivo e do solo. (RANDLE, 1997; HAMILTON, 1998).

3.5.2. Produção e Consumo

A cebola é uma das plantas cultivadas de mais ampla difusão no mundo, sendo a

segunda hortaliça em importância econômica. A produção mundial apresentou aumento de

cerca de 25% na última década, o que coloca a cebola como uma das três hortaliças mais

importantes ao lado do tomate e da batata (EMATER, 2007). Somado a isto, o valor social

da cultura de cebola é inestimável, sendo consumida por quase todos os povos do planeta,

independente da origem étnica e cultural, constituindo-se em um importante elemento de

ocupação de mão-de-obra familiar.

A portaria n° 529, o Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma

Agrária aprovou em 1995 o Regulamento Técnico MERCOSUL de Identidade e Qualidade

da Cebola, o qual apresentou as seguintes normas para o comercio da cebola “in natura”. A

cebola é bulbo pertencente à espécie Allium cepa L, cujos defeitos graves apresentados

neste são o talo grosso, brotado, podridão, mancha negra e mofado. Os defeitos leves são o

colo mal formado ou deformado do bulbo, a falta de revestimento externo, falta de turgência

e os danos mecânicos (EMATER, 2007)

A cebola é classificada de acordo com as dimensões e a qualidade do bulbo. A

Tabela 2 apresenta a classificação comercial dos bulbos em relação ao seu diâmetro

transversal, composta por quatro classes de tamanho.

Tabela 2: Classificação comercial da cebola quanto às dimensões do bulbo

Classes ou calibres Maior diâmetro transversal do bulbo (mm)

2 Maior que 35 até 50

3 Maior que 50 até 70

4 Maior que 70 até 90

5 Maior que 90

Fonte: EMATER (2007)

A cebola que não atender aos requisitos da norma é classificada como “fora do

padrão” e comercializada somente com tal designação na embalagem de comercialização,

no que diz respeito ao comércio em território nacional. São desclassificadas e proibidas para

comercialização toda a cebola que apresentar resíduos de substâncias nocivas a saúde

(acima dos níveis admitidos no âmbito do MERCOSUL) e que apresentar mau estado de

conservação, sabor e odor estranho (EMATER, 2007).

Na FURG já foram realizados alguns estudos com cebola, mas todos voltados para o

estudo do processo de secagem, especialmente no aspecto físico do fenômeno de

transporte.

MARTINS e PINTO (2003) realizaram ensaios de secagem de cebola, visando

estudar as influencias da forma (rodeadas e picadas), do sentido de escoamento de ar

(baixo/cima e cima/baixo) e da carga do material (4 e 6Kg/m

) na caracterização da

secagem. Entre os fatores estudados, a forma foi o que apresentou maior significância

estatística, tanto para primeira como para segunda etapa de secagem. Os maiores valores

para as constantes de secagem da primeira e da segunda etapas foram alcançados com a

carga 4 Kg/m

e direção de escoamento do ar de cima para baixo.

MARTINS, PORTO e PINTO (2004) estudaram a cinética de secagem da cebola em

camada delgada, comparando os valores da difusividade efetiva média baseados nas

espessuras inicial e média das amostras. Analisaram também as propriedades físicas e de

transporte das amostras em função da umidade ao longo da operação. A redução de

espessura do material foi de 80% em relação a da amostra inicial. Os resultados da

difusividade efetiva média de umidade, baseados na espessura média das amostras, foram

semelhantes aos valores médios da difusividade efetiva variável de umidade para a primeira

etapa de secagem.

3.5.3. Propriedades Terapêuticas

A proteção que frutas e outras partes de vegetais conferem contra vários tipos de

doenças, como câncer tem sido atribuída à presença de vários antioxidantes, vitamina C,

vitamina E, α – tocoferol, β – caroteno e compostos fenólicos (MARTINS, 2003).

As plantas do gênero Allium, como cebola e alho, são consumidas freqüentemente

como uma fonte de combinações que inibem atividade de decomposição de gordura nas

artérias do organismo humano, com a meta de diminuir a incidência de doença

cardiovascular. Outras atividades têm sido relatadas: antimutagênica, anticarcinogênica,

antiviral, antifungos, antibacteriológica e antialérgica, inibidor de agregação plaquetária,

inibidor do acréscimo da pressão sangüínea, além de atividades antiúlcera (GOLDMAN, et

al., 1996).

Tal atividade fisiológica destas plantas é em parte determinada por suas

concentrações de compostos bioativos pouco estudados em combinações de substâncias

organossulfuradas. (GOLDMAN, et al., 1996). A cebola tem atividade antioxidante, fato

comprovado pela presença de um flavonóide, a quercetina. Flavonóides são estruturas

polifenólicas de baixo peso molecular encontradas naturalmente nas plantas. Esses

metabólitos secundários são de grande importância na manutenção da saúde de muitos

animais herbívoros, incluindo o homem, pois desempenham uma função muito importante,

que é a remoção dos radicais livres, exercendo um papel citoprotetor em situações de dano

celular.

3.6. MICROALGA CHLORELLA

3.6.1. Microalgas e Cianobactérias

O crescente interesse no estudo de microorganismos como microalgas, alguns

fungos (leveduras, por exemplo) e bactérias deve-se à essencial importância destes nas

diversas cadeias tróficas e na possibilidade da aplicação comercial em distintas áreas como

na nutrição, na saúde humana e animal, no tratamento de águas residuais, na produção de

energia e na obtenção de compostos de interesse das indústrias alimentar, química e

farmacêutica, dentre outras (DERNER et al., 2006). As microalgas formam um grupo

heterogêneo de organismos que engloba todos os microrganismos fotossintetizantes, sejam

eucarióticos ou procarióticos. São geralmente unicelulares, gram-negativos, coloridos devido

à presença dos pigmentos fotossintéticos, e vivem, em sua maioria, em ambientes aquáticos

(OLAIZOLA, 2003).

As microalgas procarióticas recebem o nome de cianobactérias, antigamente

chamadas algas azul-esverdeadas. As estruturas celulares e o mecanismo para a

fotossíntese nestes organismos são semelhantes aqueles dos vegetais (LEHNINGER,

NELSON e COX, 1995). Acredita-se que as cianobactérias surgiram há 3500 milhões de

anos e foram os primeiros organismos fotossintetizantes capazes de produzir oxigênio,

formando a atmosfera terrestre e possibilitando o surgimento de outras formas de vida no

planeta (LEHNINGER, NELSON e COX., 1995; HENRIKSON, 1994).

As culturas comerciais de microalgas em grande escala iniciaram por volta de 1960

no Japão, com a Chlorella, seguida pela cultura de Spirulina e 1970 no México, ambas para

suplemento alimentar; Dunaliella salina para produção de β–caroteno na Austrália em 1986,

Haematococcus pluvialis para produção de caroteno e várias outras espécies para a

aqüicultura. Após, o cultivo de microalgas se espalhou pelo mundo, em países como Israel,

EUA e Índia (BOROWITZKA, 1999). Atualmente as microalgas são utilizadas na

alimentação humana como fontes de suplemento alimentar de alto valor nutricional ou

biocorantes (CHEN e ZHANG, 1997), e na alimentação animal, principalmente de frangos e

animais marinhos (VONSHAK, 1997). Além disso, os cultivos têm sido empregados como

fonte de biocombustíveis e como forma de absorver CO

originado na atividade industrial e

na geração térmica de energia elétrica (ANDRADE, 2005).

3.6.2. Microalga Chlorella

A Chlorella é uma microalga eucariótica unicelular esférica e seu diâmetro varia de 5-

10 µm, dependendo da espécie (ILLMAN, SCRAGG e SHALES, 2000). É encontrada

espontaneamente em tanques e lagos, com grande habilidade de realizar a fotossíntese.

Esta microalga possui 53% de proteínas, 23% de carboidratos, 9% de lipídios e 5% de

minerais (HENRIKSON, 1994). Foi descoberta pelos japoneses, tradicionais consumidores

de algas, que a apreciam e utilizam normalmente como complemento alimentar

(RICHMOND, 1990). Relatam uma sensação de bem estar e aumento de energia após um

curto período de uso, atribuído à elevada concentração de vitamina B

, que tem ação rápida

em processos metabólicos de síntese de hemácias.

É uma alga rica em clorofila, proteínas, vitaminas, sais minerais e aminoácidos

essenciais. As culturas de Chlorella podem apresentar alto conteúdo de lipídios, podendo

chegar a mais de 50%, em base seca, quando cultivada em meio com baixos níveis de

nitrogênio (PIORRECK, BAASCH e POHL, 1984). Em sua composição estão ainda

presentes 18 aminoácidos essenciais importantes na biossíntese das proteínas. A chlorella

também é rica em vitaminas do complexo B, principalmente a B

, vital na formação e

regeneração das células sangüíneas que, juntamente com o ferro, fazem desta alga um

produto indicado no tratamento e prevenção de anemia.

Segundo BOROWITZKA (1999) o primeiro cultivo unialgal foi realizado por

Beijerinchk em 1890 com Chlorella vulgaris. De 1948 a 1950, o cultivo em massa de

microalgas realmente começou a ser um foco de pesquisas em Stanford, na Califórnia, com

a finalidade de utilização da técnica laboratorial para cultivo em escala (RICHMOND, 1990;

BOROWITZKA, 1999). A Chlorella também foi investigada por cientistas alemães durante a

Segunda Guerra Mundial pelo seu potencial em duplicar a biomassa algumas vezes por dia

em culturas iluminadas em laboratório, com fins de estocagem de fontes de alimentos,

principalmente fontes de proteínas. Em 1951 a primeira planta piloto de produção de

Chlorella foi construída e operada em Cambridge, nos Estados Unidos. Outra série de

estudos ocorreu no Japão (RICHMOND, 1990) onde se iniciou o cultivo de microalgas com

fins comerciais nos anos 60 com a cianofícea Chlorella, seguido pelo cultivo de Spirulina nos

anos 70. Nos anos 80 cerca de 46 fábricas na Ásia produziam mais de 1000 Kg de

microalgas por mês e em 1996 cerca de 2000 toneladas de Chlorella foram produzidas

comercialmente somente no Japão (BOROWITZKA ,1999).

A microalga Chlorella, assim como a Spirulina, é de grande interesse comercial, pois

além de rápida velocidade de crescimento, pode ser cultivada em tanques ao ar livre, como

os tanques localizados na estação de Cultivo de Chlorella da Ilha de Ishigaki, Okinawa. Ilha

de recifes de corais de clima subtropical, propício ao cultivo de chlorella de qualidade

superior. A radiação solar durante o ano também estimula os níveis de clorofila.

No laboratório da Engenharia Bioquímica da FURG existem estudos sobre o cultivo

de microalgas, como por exemplo:

COLLA, FURLONG e COSTA (2007) avaliaram o efeito da temperatura de cultivo e

da concentração de nitrogênio no meio de cultivo, sobre o potencial antioxidante da

microalga Spirulina (Arthospira) platensis. E concluiram que quando a microalga foi cultivada

a 35°C e concentração de nitrato de 1,8 g L

-1

ou 2,5g.L

-1

o potencial antioxidante dos

extratos obtidos a partir da biomassa, sobre o escurecimento enzimático causado pela

peroxidase, foi de 29% e 35%, respectivamente, sendo a redução no escurecimento

relacionada com as quantidades de compostos fenólicos presentes nos extratos.

CAPÍTULO III

ARTIGO 1

OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO DE FENÓIS TOTAIS NA

CEBOLA ATRAVÉS DE PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Michele Moraes de Souza; Vânia Machado Recart; Meritaine da Rocha;

Eliana Badiale Furlong

Laboratório de Análise e Bioquímica de Alimentos - Departamento de Química

Fundação Universidade Federal do Rio Grande – Caixa Postal 474

CEP 96201-900 – Rio Grande – RS – Brasil – Tel. (53)3233 8663

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi usar a técnica de planejamento experimental para estabelecer

as melhores condições de extração de compostos fenólicos em cebola (Allium cepa L.). As

variáveis estudadas foram: natureza do solvente, agitação, tempo de extração e tempo com

e sem interrupções de processo. A melhor combinação, que resultou um modelo preditivo,

foi o uso de metanol, agitação de 120 minutos e com rotação de 3,13 G. O maior conteúdo

fenólico em diferentes classes foi 2274,8 µg fenóis/g de cebola, a recuperação foi de 88% e

o limite de quantificação foi 30,7 µg fenóis/g de cebola.

Palavras-chave: cebola, compostos fenólicos, metodologia.

ABSTRACT

The objective of this work was using the experimental planning technique to establish great

phenolic extraction conditions on onions (Allium cepa L.). The studied variables were; solvent

nature, agitation, extraction time and process time with and without interruption. The best

combination, allowed a predicated model, was employing methanol agitated for 120 minutes

in a roll with 3,13 G. The average phenolic content in different classes was 2274,8 µg

phenolic/ g de onion, the recovery was 88% and the detection quantification limit was 30.7 µg

phenolic/ g de onion.

Key words: methodology, phenolic compounds, onion.

1. INTRODUÇÃO

O interesse em identificar compostos químicos que desempenham atividades

funcionais, tem disponibilizado uma série de metodologias para extrair e quantificar

diferentes estruturas químicas em tecidos vegetais. Entre os compostos que poderiam

prevenir danos à saúde destacam-se os fenólicos, tais como os ácidos fenólicos, derivados

do ácido hidroxicinâmico, e os flavonóides, que mesmo presentes em pequenas

quantidades no alimento, poderiam ter efeitos preventivos e/ou curativos de sintomas

patológicos causados por situações oxidativas

(ANTOLOVICH, PRENZLER, RYAN, 2000;

JORGE et al., 1998). A determinação dos níveis de compostos fenólicos totais em tecidos

vegetais é a etapa inicial de qualquer investigação de funcionalidade, avaliação biológica e

estímulo ao consumo, visando à prevenção de doenças crônico-degenerativas (TORRES et

al., 1987).

As substâncias fenólicas podem ocorrer livres ou na forma de glicosídios. A posição

do açúcar na estrutura fenólica influencia na solubilidade e em outras propriedades físico-

químicas. Esta diferença química pode ser usada para separação, quantificação e para

desenvolver estudos sobre suas atividades fisiológicas (ANTOLOVICH, PRENZLER, RYAN,

2000; BADIALE-FURLONG et al., 2003; CHEN et al., 1998).

Para a extração dos compostos fenólicos vêm sendo mencionados sistemas

aquosos, alcoólicos e aceto-etílicos sob diferentes condições de interação, aplicados a

raízes, tubérculos e frutas, tais como feijão mungo; gêneros de Acácia, Terminália,

Copernicia, maçãs, ameixas, peras e outros (IMEH e KHOKBAR, 2002; LIMA et al., 2004;

SOUSA et al., 2007). A quantificação dos compostos fenólicos nos diferentes extratos, em

geral, é feita empregando o reagente de Folin-Ciocalteau. Este consiste numa mistura de

ácidos fosfotungstico e molíbidico, nos quais o molibdênio e o tungstênio no estado de

oxidação 6+, e em presença de redutores, tais como fenóis, passam ao estado de oxidação

variando entre 5 e 6 (forma azul) permitindo a quantificação de substâncias redutoras que

não necessariamente os fenóis (SOUSA et al., 2007). Poucos são os trabalhos que

descrevem adaptações do procedimento básico para matrizes especificas e/ou condições

criticas de preparo de amostra e extração dos compostos fenólicos para a quantificação.

Cabe ressaltar que o processo de extração sob diferentes condições para distintas matrizes

e analitos é fundamental para a estimativa mais exata do potencial de redução decorrente

de compostos fenólicos.

Os estudos sistematizados de alimentos com alegações funcionais vêm sendo

norteados pela cultura popular que atribui efeitos benéficos a estes em diversas regiões do

país. Entre estes esta a cebola (Allium cepa L.), empregada pelo seu papel de conferir

características organolépticas a alimentos, além do seu poder preventivo e curativo de

diversas doenças crônico-degenerativas

(CHEN et al., 1998; JORGE et al., 1998). Apesar do

conhecimento milenar dos benefícios deste vegetal e de diversos estudos sobre seus efeitos

bioativos, algumas regiões produtoras têm dificuldades em comercializar suas safras em

condições satisfatórias para consumo “in natura” ou em formulações industriais, resultando

em descarte de material e desestimulo aos produtores.

Diante desta inconsistência entre a importância sócio-econômica do vegetal e o

estímulo a sua produção é interessante estudar condições que permitam valorizar esta

matéria-prima buscando formas de aproveitar o seu potencial funcional de forma eficiente,

partindo da determinação de seus compostos bioativos como subsídio para sua cultura,

conservação e preparo doméstico e industrial preservando suas qualidades funcionais.

A otimização de metodologia de extração de um analito em especial é fundamental,

visto que pequenos detalhes podem resultar em efeitos que comprometem a confiabilidade

dos resultados. Para atingir esta meta com o mínimo de experimentos, podem ser

empregados planejamentos fatoriais completos. Estes permitem otimizar metodologias

considerando variáveis críticas para alguns tipos de matrizes avaliando seus efeitos e

possíveis interações com outros fatores nas repostas desejadas (NETO, SCARMINIO,

BRUNS, 2003; RODRIGUE e IEMMA, 2005).

Esses aspectos nortearam o trabalho, que objetivou usar a técnica de planejamento

experimental para otimizar uma metodologia de extração para a determinação de compostos

fenólicos totais na cebola (Allium cepa L.).

Para tal, foram avaliadas diferentes variáveis na etapa de extração e os extratos

foram quantificados quanto ao conteúdo fenólico empregando o reagente de Folin-

Ciocalteau (FC). As condições otimizadas também foram avaliadas quanto a sua

performance analítica e aplicabilidade.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Procedimentos experimentais gerais

Todos os solventes e reagentes utilizados durante os testes foram analiticamente

puros. O reagente Folin-Ciocalteau foi adquirido da Polipur (Pró-análise Química e

Diagnostico Ltda) e a quercetina da Sigma Chemical Company (EUA). As medidas de

absorção foram realizadas em espectrofotômetro VARIAN CARY/100 UV-VISIBLE (EL

98033579).

2.2. Amostras

As cebolas foram coletadas no município de São José do Norte, no Rio Grande do

Sul, em março de 2007 e foram cedidas pela EMATER – RS, classificadas segundo

Regulamento Técnico de qualidade da cebola (1995) do Ministério da Agricultura, Pecuária

e Abastecimento (MAPA).

2.3. Planejamento para estudo das condições de extração de fenóis

A partir de condições estudadas por Lima et al

(2004), Baptista et al

(1999), Andrade

et al

(2007), Premzler et al

(2001) e Velioglu et al

(1998) foram avaliados os efeitos das

variáveis: solvente (metanol e acetato de etila), tempo de extração (120, 150 e 180 minutos),

rotação (0,78, 1,76 e 3,13 G) e tempo com e sem interrupções do processo de extração (0,

15 e 30 minutos), através de planejamento fatorial 2

, ou seja, quatro variáveis ou fatores

testados em dois níveis (-1 e +1) e 6 pontos centrais (0) resultando em 22 experimentos

(Tabela 1 - ANEXO 1).

Obtido o solvente que possibilitou a extração mais precisa (Tabela 2 - ANEXO 1),

foram estudados os efeitos do tempo de extração, rotação e tempo com e sem interrupções

de processo, utilizando planejamento fatorial completo 2

, com três variáveis em dois níveis

(-1 e +1) e 3 pontos centrais (0) resultando em 11 experimentos (Tabela 3 - ANEXO 1).

Para análise estatística dos dados foi utilizado o programa Statistica 6.0,

considerando o conteúdo de fenóis totais (µg de fenóis/g de cebola) como resposta das

variáveis em estudo.

2.4. Preparação dos extratos nas condições otimizadas

As cebolas foram secas em estufa com circulação de ar da marca QUIMIS a 60°C,

até atingirem valores de umidade de 13%. Foram pesadas 10g de cebola e adicionados 50

mL de solvente (metanol ou acetato de etila) e agitados em temperatura ambiente em mesa

agitadora orbital TE - 141 da marca TECNAL, o extrato foi filtrado com papel de filtro

Wathman n°1 e clarificado com 10 mL de hidróxido de bário 0,1M e 10 mL de sulfato de

zinco 5%, a solução foi filtrada e transferida quantitativamente para um balão volumétrico de

100 mL, sendo o volume final completado com o solvente utilizado na extração.

2.5. Determinação de fenóis totais nos extratos

A determinação do teor de fenóis totais presentes nos extratos metanólicos e de

acetato de etila da cebola foi realizada por espectrometria utilizando o reagente de Folin-

Ciocalteau, e o procedimento consistiu em tomar alíquotas de 500 µL do extrato agitar com

500 µL de água destilada e 4,5 mL de Na

4% por 1 minuto, colocada em banho-maria a

40°C por 15 minutos. A mistura foi agitada por 30 segundos em banho ultra som com 500 µL

do reagente de Folin-Ciocalteau diluído 1:2 com água destilada. Após 10 minutos, foi

medida a absorbância das soluções a 660 nm. O teor de fenóis totais foi determinado por

interpolação da absorbância das amostras contra uma curva analítica construída com uma

solução padrão de Quercetina contendo 100 µg/mL a partir da qual foram preparadas

diluições variando entre 2 e 16 µg/mL. Os resultados dos conteúdos fenólicos das amostras

foram expressos como µg de fenóis totais/ g de cebola.

Para estudar a performance do método foram determinados o limite de quantificação

e a recuperação de quercetina nas condições otimizadas de extração. O limite de

quantificação foi estimado pela menor concentração absorvida pela curva padrão de

quercetina. A recuperação foi testada em amostras de cebola seca as quais tinham sido

previamente adicionadas soluções metanólicas de quercetina em níveis 1,0; 1,2 e 1,5 mg/ g

de cebola.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As amostras de cebola foram secas para concentrar os sólidos e facilitar o processo

de extração mantendo a proporção de massa seca/solvente, mas sem a necessidade de

grande volume destes. A temperatura de 60ºC minimizou o escurecimento dos tecidos por

ação enzimática ou por caramelização.

Apesar dos inúmeros trabalhos que determinam fenóis em raízes, tubérculos,

cereais, porções distintas de plantas medicinais e frutos, mencionando variação de fenóis

que vão desde 40 µg fenóis/ g de amostra no arroz a 5500 µg fenóis/ g de amostra nas

cascas de limão (IMEH e KHOKBAR, 2002; LIMA et al., 2004; OLIVEIRA, 2005; SOUSA et

al., 2007), quando se trata de cebola estes valores não estão disponíveis. As referências

são unânimes em informar que o principal componente fenólico das diferentes espécies de

cebola é a quercetina que apresentou maior capacidade de reduzir o reagente de Folin-

Ciocalteau em meio alcalino, bem como indicadora de compostos fenólicos em cebola. Este

composto foi escolhido para indicar os fenóis totais em cebolas neste trabalho.

O planejamento experimental foi utilizado para possibilitar a inferência estatística e

fornecer informações sobre o comportamento das respostas entre os níveis das variáveis

em estudo, evidenciando a qualidade da repetibilidade, minimizando custos e tempo ao não

se repetir todos os experimentos, demanda e desgaste de equipamento, menor exposição

do analista e menor volume de descarte

(NETO, SCARMINIO, BRUNS, 2003; RODRIGUES

e IEMMA, 2005).

As variáveis testadas foram aquelas que são mais diversas nos relatos da literatura,

para determinação dos teores de fenóis totais ou para posterior separação das diferentes

famílias de redutores fenólicos presentes em matrizes vegetais. Cabe considerar também

que para a escolha do solvente pode ser levado em consideração a sua toxicidade. A

primeira etapa do estudo do efeito das variáveis solvente de extração, tempo, rotação e

tempo com e sem interrupções de processo, tem seus resultados apresentados na Tabela 1

como conteúdo de fenóis totais expressos em µg de fenóis totais/ g de cebola.

A análise estatística mostrou que os solventes utilizados na extração dos fenóis

apresentaram efeito significativo nos níveis determinados (p = 0,015), como pode ser

observado nos resultados da Tabela 2. O solvente que propiciou a extração de maiores

teores de fenóis foi o metanol, esta resposta pode ser atribuída ao fato de que os compostos

fenólicos solúveis em metanol são mais abundantes em cebola, o que é promissor

considerando-se que os flavonóides podem estar neste conjunto em função da solubilidade.

Nos extratos obtidos com acetato de etila os valores detectados estavam próximos do limite

de quantificação, o que sugere baixas concentrações de fenóis polimerizados, sendo

necessário evaporar o solvente antes da quantificação dos fenóis.

As variáveis tempo de extração, rotação e tempo com e sem interrupções de

processo, foram estudadas em um planejamento completo 2

com três pontos centrais para

obtenção do ponto ótimo de extração dos compostos fenólicos (Tabela 3). O comportamento

verificado permitiu otimizar e construir modelo preditivo dentro da faixa ótima para extração

dos fenóis em função das variáveis estudadas.

A Tabela 4 (ANEXO 1) apresenta os resultados da análise estatística dos efeitos

estudados no planejamento 2

, tendo como resposta o rendimento em fenóis totais na

cebola. A observação dos resultados da Tabela 3 e da Tabela 4, confirmam que ocorrem

diferentes conteúdos de fenóis na cebola em função das associações de condições

avaliadas demonstrada pelos conteúdos obtidos em fenóis totais nos diferentes

experimentos. Lima et al., (2004) também mencionaram estas variações e atribuíram a

formas químicas distintas de fenóis presentes na matriz.

A Tabela 4 mostra que entre as três variáveis estudadas, rotação, tempo de agitação

e a interação da rotação com o tempo de agitação foram estatisticamente significativas ao

nível de confiança de 95%, quando a resposta foi o conteúdo de fenóis totais (µg fenóis/ g

de cebola). A rotação (G) apresentou efeito positivo ao passar do menor valor para a maior,

assim como indicou o aumento na média desta resposta. A variável tempo de agitação teve

efeito contrário, ou seja, o menor tempo resulta em maior conteúdo de fenóis totais. A

interação da variável rotação com o tempo de agitação apresentou efeito negativo

diminuindo a média do conteúdo de fenóis totais em 362 µg fenóis /g de cebola. Os efeitos

das demais variáveis não foram significativos.

Através dos resultados obtidos, foi possível obter os coeficientes de regressão

(Tabela 5 ANEXO 1) de um modelo de terceira ordem para as variáveis e desta maneira

analisar a validade do modelo de conteúdo de fenóis em função das variáveis estudadas por

meio da análise de variância. Estes foram significativos e preditivos para a ação combinada

dos parâmetros tempo de agitação, rotação e a interação da rotação com o tempo de

agitação, no conteúdo de fenóis totais (Tabela 5) originando a Equação 1 e a Figura 1

(ANEXO 1).

Conteúdo de fenóis (µg fenóis/g de cebola) = 2109,9 + 171,9R + 86,6T – 181R . T (1)

Onde: R = rotação (G), T = tempo (minutos)

O teste F, mostrou um F calculado de 31,1, que foi 7 vezes maior do que o F

tabelado, 4,35 (Tabela 6 – ANEXO 1), permitindo que o modelo expresso na Equação 1

fosse utilizado para gerar a superfície de resposta para o rendimento de fenóis (Figura 1).

A Figura 1 mostrou que o rendimento dos fenóis foi maior utilizando rotação de

aproximadamente 3,13G e tempo de agitação de 120 minutos, atingindo valores de 2372,4

µg fenóis/ g de cebola quando a extração e quantificação são realizadas nestas condições

de rotação e tempo de agitação. O que indica que o aumento no tempo de agitação pode

ocasionar uma diminuição no conteúdo de extração dos compostos fenólicos presentes na

cebola. Isto pode ser atribuído à degradação dos fenóis por ação de enzimas óxido

redutases do tecido ou reversão do equilíbrio dos compostos entre as frações sólido-líquido

do sistema.

Em vista deste resultado, menor tempo de extração resultando em maior conteúdo

de fenóis totais, foi avaliada a cinética do processo (Figura 2 - ANEXO 1), diminuindo o

tempo de extração até que este não fosse mais significativo ao nível de confiança de 95%. A

diminuição a partir de 120 minutos não foi significativa no intervalo de confiança

estabelecido, comprovando a adequacidade do tempo estabelecido para a extração dos

compostos.

3.1 Indicativos de Mérito para o Método de Folin Ciocalteau

O procedimento de extração otimizado foi executado para determinar os indicativos

de performance limite de quantificação e recuperação, cujas avaliações foram realizadas em

triplicata.

A Equação da curva de calibração da quercetina foi C = 0,0352A onde C é a

concentração de quercetina, A é a absorbância a 660nm e o coeficiente de correlação R =

0,999 demonstrando a linearidade da relação nas concentrações da curva analítica.

O limite de quantificação determinado foi de 30,7 µg fenóis. O teor médio de

recuperação para o método completo usando a extração otimizada foi de 88% e variou entre

84 e 92 % da menor para a maior concentração testada. As condições de extração resultam

em valores que estão fora dos valores dos pontos críticos para a confiabilidade de

resultados analíticos e neste caso os teores obtidos para limites de quantificação e

recuperação sugerem que o método adaptado é promissor para determinar fenóis em

cebolas, expressando como µg de fenóis (quercetina)/ g de cebola.

O procedimento foi testado quanto à sua aplicabilidade adotando-o para quantificar

fenóis em cebolas cultivadas na região de São José do Norte, na safra de 2007 e

classificadas conforme a legislação do MAPA. A classificação comercial dos bulbos de

cebola adota como critério o diâmetro transversal distribuindo em quatro classes, cujos

tamanhos variam entre 35 a 90 mm. Nesta classificação não estão considerados nenhum

outro aspecto que possa refletir a qualidade do conteúdo do tecido.

Nas cebolas analisadas o teor de fenóis extraídos com metanol variou entre 2244,3 e

2306,4 µg de fenóis totais/ g de cebola (Tabela 7 – ANEXO 1) e o teor de umidade entre

86,8 e 87,4% para as diferentes classes, que ao nível de significância de 95% apresentou

diferença significativa entre as classes no aporte de fenóis na dieta do consumidor (Tabela 8

– ANEXO 1). Considerando o total obtido com o metanol, a classe 4 apresentou o maior

conteúdo de compostos fenólicos. Comparativamente a outros tecidos mencionados pela

literatura como funcionais pelo seu conteúdo fenólico, como banana 310 µg fenóis/ g

amostra, maçã 1000 µg fenóis/ g amostra e batata 990 µg fenóis/ g amostra (equivalente de

tirosina)

(OLIVEIRA, 2005), a cebola parece ser bem promissora quando se investiga

vegetais com maior conteúdo fenólico.

4. CONCLUSÃO

O planejamento experimental é uma ferramenta que melhorou a qualidade da

informação através dos resultados, permitindo otimizar e construir o modelo preditivo dentro

da faixa ótima para a extração de fenóis, representado pela equação obtida para o conteúdo

fenólico.

Empregando duas etapas de planejamento experimental para o rendimento de fenóis

totais, foi possível determinar as condições ótimas de extração de cebola para emprego das

variáveis, tempo de extração, rotação e tempo com e sem interrupções do processo de

extração, com resultados preditivos e significativos para o conteúdo de fenóis. As condições

otimizadas ocorriam quando foi utilizado o tempo de extração de 120 minutos e a rotação de

3,13 G em mesa agitadora orbital. Sendo que a classe 4 foi a melhor para incorporar fenol

na dieta com um conteúdo de 2387,6 µg fenóis/ g de cebola.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ARTIGO 2

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE DIFERENTES CLASSES DE CEBOLAS

CULTIVADAS NA REGIÃO SUL DO R.S.

Vânia Machado Recart; Michele Moraes de Souza, Eliane Cipolatti, Eliana Badiale Furlong

Fundação Universidade Federal do Rio Grande

Laboratório de Análise e Bioquímica de Alimentos

Departamento de Química

Rua: Eng. Alfredo Huch, 475, caixa postal 474 – Centro

Rio Grande – RS – CEP 96201-900, Brasil

RESUMO

A cebola comum (Allium Cepa L.) compreende diversos cultivares que produzem este tipo

de bulbo, estando disponível no mercado diferentes variedades. Visando estimar o aporte de

nutrientes e compostos funcionais destes bulbos o objetivo deste trabalho foi determinar as

características físico-química e a atividade das enzimas oxirredutases em quatro classes de

cebolas comerciais. Foram determinadas a composição centesimal, pH e acidez (AOAC,

2000), compostos fenólicos totais em extratos aquosos, metanólicos e aceto etílicos e

atividade enzimática de catalase, peroxidase e polifenoloxidase. As frações umidade e

cinzas não apresentaram diferença significativa, enquanto as demais frações apresentaram

diferença significativa entre as classes. O extrato que apresentou maior teor de compostos

fenólicos foi o extrato aquoso, valor médio de 2,83 mg de fenóis/g de cebola, não sendo

observada diferença entre as classes. A classe 2 apresentou maior atividade específica para

catalase e peroxidase, 0,025 mg H

decomposta / min / mg de proteína e 0,031 abs / min /

mg de proteínas respectivamente. A enzima polifenoloxidase não foi detectada nas

amostras de cebola.

Palavras chave: cebola, enzimas, fenóis.

ABSTRACT

The common onion (Allium Cepa L.) includes various growing systems which produce this

type of bulb, being available on the market in different varieties. Aiming to estimate the

nutrients and functional composts of such bulbs, the purpose of this study was to

characterize, physically and chemically, and determine the activity of enzymes

oxidoredutases in four classes of commercial onions. It was determinated proximal

composition, pH and acidity, phenolic componends in aquous, methanolic and aceto ethylic

extracts and activity of enzymes of catalase, peroxidase and poliphenoloxidase. The

fractions of humidity and ash did not show any significant difference, while the others showed

significant difference among classes. The extract that showed the greater content of phenolic

composts was the watery extract (average value of 2,83 mg of phenols/g of onion), there was

no occurrence of difference among the classes. Class 2 showed greater specific activity for

catalase and peroxidase enzymes, 0,025 mg H

decomposed/ min / mg of protein and

0,031 abs / min / mg of proteins respectively. The poliphenoloxidase enzyme was not

detected in the samples of onions.

Keywords: onion, enzymes, phenols

1. INTRODUÇÃO

Os processos vitais de biossíntese são responsáveis pela formação, acúmulo e

degradação de inúmeras substâncias orgânicas no interior das células que formam os

diversos tecidos dos organismos animais e vegetais. Muitas dessas substâncias,

especialmente as de origem vegetal, encontram emprego utilitário em diversas áreas

aplicadas à alimentação e à saúde. Os compostos resultantes desse metabolismo podem

ser separados em produtos do metabolismo primário que são os glicídios, protídios e

lipídios, e os do metabolismo secundário, que são os compostos terpênicos, alcalóides,

glicosídios e vários outros (MATOS, 1997).

Entre os metabólitos secundários produzidos pelas células, destacam-se os

compostos fenólicos, que são compostos orgânicos que contêm um grupo hidróxi (-OH)

ligado diretamente num anel aromático (HALLIWELL et al, 1995), estes têm recebido muita

atenção nos últimos anos, sobretudo por inibirem a peroxidação lipídica e a lipooxigenase in

vitro (SOUSA et al., 2007). Várias fontes de compostos fenólicos têm sido estudadas,

visando fornecer subsídios para elaboração de uma dieta saudável à população

A cebola (allium cepa) é uma das plantas cultivadas de mais ampla difusão no

mundo, sendo a segunda hortaliça em importância econômica. A produção mundial

apresentou aumento de cerca de 25% na última década, o que coloca as diferentes

variedades de cebola como uma das três hortaliças mais importantes ao lado do tomate e

da batata (EMATER, 2007). Em função disto o Ministério da Agricultura, do Abastecimento e

da Reforma Agrária aprovou o Regulamento Técnico de Qualidade de Cebola (1995)

portaria n° 529, que descreve o critério de classificação das cebolas baseados nas

dimensões e nas características visuais como indicativo de qualidade, dividindo em quatro

classes variando de 35 a 90 mm de diâmetro transversal (EMATER, 2007). A cebola que

não atender aos requisitos da norma é classificada como “fora do padrão” e comercializada

somente com tal designação na embalagem de comercialização, no que diz respeito ao

comercio em território nacional, a preços pouco atrativos. No entanto, informações

disponíveis sobre as propriedades físico-químicas da cebola não são específicas quanto à

região de cultivo ou a classe e variedade.

A composição de cebola é influenciada pelas condições de cultivo (sistema de

produção, tipo de solo, clima) e por fatores genéticos. Bulbos de cebola para consumo

fresco são pouco calóricos (em torno de 40-50 calorias) e contém de 89 a 95% de água,

além de mono e dissacarídeos (açúcares totais em torno de 6%), proteínas (1,6%), gordura

(0,3%) e sais minerais (0,7%). Possuem também alguns compostos fenólicos, bem como

ácidos málico, cítrico, succínico, fumárico, quínico, biotínicos, nicotínicos, fólicos,

pantotênicos e ascórbico (EMBRAPA, 2007).

Estudos têm demonstrado que após a colheita de frutas e hortaliças iniciam-se uma

série de processos degradativos que aceleram a senescência, causando perdas de grande

parte da produção. Diversas dessas perdas podem ser atribuídas à ação de enzimas

durante a pós-colheita (ZANATTA, ZOTARELLI e CLEMENTE, 2006). A peroxidase e a

polifenoloxidase têm sido consideradas as principais enzimas responsáveis pela

deterioração da qualidade em muitas frutas e vegetais. Estas enzimas podem participar de

um grande número de reações oxidativas, tais como mudança de cor, degradação da

clorofila ou auxinas, oxidação de fenóis, oxidação do ácido indol acético, biossíntese da

lignina, e muitos destes fatores também podem ser associados com flavour, cor, textura e

qualidade nutricional dos alimentos (VALDERRAMA, MARANGONI, CLEMENTE, 2001;

ZANATTA, ZOTARELLI e CLEMENTE, 2006; CARNEIRO, ROLIM e FERNANDES, 2003).

Neste estudo a matriz escolhida foi a cebola cultivada na região sul do Rio Grande

do Sul, por se tratar de um vegetal ao qual se atribuí propriedades funcionais diversas,

determinadas pelos diversos componentes presentes nos seus tecidos. Porém, o retorno

econômico para os produtores não é satisfatório, pois em função de variáveis abióticas na

região as cebolas não atingem as características de classificação para comercialização

compensatória como produto in natura.

Visando estimar o aporte de nutrientes e compostos funcionais destes bulbos o

objetivo deste trabalho foi determinar a composição centesimal, o pH, a acidez, o teor de

compostos fenólicos totais extraídos em três sistemas solventes e a atividade específica das

enzimas catalase, peroxidase e polifenoloxidase em quatro classes de cebolas cultivadas na

região sul do Rio Grande do Sul. Os resultados podem servir para estabelecer processos

industriais ou artesanais que possibilitem a comercialização das cebolas de baixo valor

agregado para a distribuição in natura. Além disso poderão subsidiar os órgãos legisladores

com dados mais consistentes sobre a classificação das cebolas considerando seu aporte

nutricional e funcional.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1. Procedimentos Experimentais Gerais

Os solventes e reagentes empregados foram analiticamente puros (P.A). O reagente

de Folin-Ciocalteau pertencia a marca Polipur, a Quercetina a Sigma, e os substratos

guaiacol e catecol utilizados foram das marcas Merck e Sigma respectivamente.

2.2. Amostras

As cebolas foram coletadas no município de São José do Norte no Rio Grande do

Sul em março de 2007, cedidas pela EMATER – RS, classificadas segundo Regulamento

Técnico de Qualidade da cebola (1995) do Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento (MAPA). As cebolas foram descascadas, lavadas, picadas e secas em estufa

com circulação de ar da marca QUIMIS a 60°C, até atingirem valores médios de umidade de

13%.

2.3. Determinação da Composição Centesimal

Os teores de umidade das diferentes classes de cebolas foram determinados em

estufa com circulação de ar da marca QUIMIS sob temperatura de 60°C. Os percentuais de

cinzas das diferentes classes de cebolas foram determinados pelo método gravimétrico em

mufla 550°C. Os níveis protéicos foram determinados pelo método de micro-Kjeldahl,

empregando como fator de conversão de nitrogênio o valor de 6,25. Todos os

procedimentos seguiram a metodologia da AOAC (2000) com exceção das fibras brutas que

foram determinadas conforme método do INTERLAB VI (CIENTEC, 1991).

A determinação de lipídios foi realizada pelo método de Bligh & Dyer (1959)

adaptando-se as relações solventes extratores ao teor de umidade das amostras. Os

açúcares redutores foram determinados conforme método do 3,5-DNS (MILLER, 1959). Os

métodos estão descritos em detalhes no ANEXO 2.

2.4. Propriedades Eletroquímicas

O pH das diferentes classes de cebolas foi determinado conforme AOAC (2000). O

vegetal foi homogeneizado em água previamente fervida na proporção de 1:9, sob agitação

por 30 minutos. No sobrenadante foi determinado o pH potenciometricamente, utilizando um

pHmetro marca Hanna modelo 200, calibrado com tampão fosfato neutro (pH 7,0).

A acidez foi determinada por titulometria de neutralização com NaOH 0,01N e

expressa como porcentagem de ácido pirúvico. Os métodos estão descritos em detalhes no

ANEXO 2.

2.5. Determinação dos Fenóis Totais

A extração dos compostos fenólicos das cebolas foi realizado a frio com água,

acetato de etila e metanol na proporção de 1:5 de massa seca:solvente, em agitador

horizontal a temperatura ambiente, seguida da partição com hexano, clarificação com

hidróxido de bário 0,1M e sulfato de zinco 5% e filtração. Os extratos provenientes dos três

sistemas solventes foram armazenados em frascos de vidro a 18°C até quantificação e/ou

posterior uso. O conteúdo de fenóis totais, das diferentes classes, foi determinado por

espectrometria de UV/visível após a reação com Folin-Ciocalteau. A estimativa de

concentração de fenóis foi realizada com uma curva de calibração da quercetina, cuja faixa

de concentração variou entre 2 e 16 µg/mL, com linearidade demonstrada pelo R

de 0,99

(BADIALE-FURLONG et al., 2003). O método esta descrito em detalhes no ANEXO 2.

2.6. Determinação da Atividade Específica das Enzimas Oxirredutases

2.6.1. Catalase

O extrato enzimático foi preparado pesando 10g de amostra in natura, seguida de

homogeneização por 20 minutos em blender com 100 mL água destilada e deionizada. Após

homogeneização as amostras foram filtradas com algodão. Os filtrados foram utilizados para

a determinação da atividade enzimática.

A reação enzimática foi realizada a 40°C e pH 7 durante 20 minutos utilizando como

substrato peróxido de hidrogênio 0,005M. O conteúdo de H

residual foi titulado com

permanganato de potássio padrão (0,004M). Os resultados foram expressos como atividade

específica (AE) conforme a equação 1.

proteína

catalase

decompostaOmgH

min

(1)

2.6.2. Peroxidase e Polifenoloxidase

Foram pesadas cerca de 20g de cebola, homogeneizadas em blender com 100 mL

de solução tampão fosfato pH 5,2 por 2 minutos, seguida de filtração. Uma alíquota de 25

mL do sobrenadante foi adicionada a 25 mL de acetona para precipitação das proteínas.

Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido com

solução tampão fosfato pH 5,2.

A reação para medida da atividade enzimática da peroxidase foi realizada a 40°C e

pH 5,5 utilizando o guaiacol como substrato. A reação foi realizada misturando 1,5 mL

solução tampão fosfato de sódio pH 5,5; 1 mL de extrato enzimático; 1,5 mL de água

destilada; 1 mL de peróxido de hidrogênio 0,08% e 1 mL de solução de guaiacol 0,5%. A

absorbância foi medida a 470 nm após 10 minutos de reação. Os resultados foram

expressos em atividade específica definida conforme a equação 2, para as quatro classes

de cebolas comerciais.

proteína

aabsorbânci

peroxidase

iação

min

var

(2)

A medida da atividade enzimática da polifenoloxidase foi realizada a 30°C e pH 6,0

utilizando o catecol como substrato. A reação foi realizada misturando 1 mL de extrato

enzimático; 1,5 mL da solução tampão fosfato de sódio pH 6,0; 2,5 mL de água destilada e

1 mL de solução de catecol 0,05M. A absorbância foi determinada a 425 nm após 10

minutos de reação. Os resultados foram expressos em atividade específica conforme a

Equação 3, para as quatro classes de cebolas comerciais.

proteína

aabsorbânci

xidasepolifenolo

iação

min

var

(3)

2.7. Análise Estatística

Os resultados das determinações das frações centesimais, dos conteúdos de

compostos fenólicos e da atividade enzimática para as classes de cebola foram analisados

utilizando análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey para comparação das médias, ao

nível de significância de 95% entre as diferentes classes de cebola em estudo.

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1. Composição Centesimal das Cebolas

A classificação comercial dos bulbos de cebola adota como critério o diâmetro

transversal distribuindo em quatro classes, cujos tamanhos variam entre 35 a 90 mm. Nesta

classificação não estão considerados outros aspectos que possam refletir a qualidade do

conteúdo do tecido ou mesmo sua relação com safra, local de produção, período de

armazenamento ou qualquer outra variável abiótica. Neste trabalho foram enfatizadas outras

características físico-químicas de cada classe. Na Tabela 1 estão os resultados das médias

das determinações das características físico-químicas nas diferentes classes de cebolas

cultivadas em São José do Norte, Rio Grande do Sul.

Tabela 1: Composição centesimal e propriedade eletroquímicas das diferentes classes

de cebolas cultivadas em São José do Norte, R.S.

Composição/Classes

Classe 2

(35-50 mm)

Classe 3

(50-70 mm)

Classe 4

(70-90 mm)

Classe 5

(> 90 mm)

Umidade (%) 88,5

88,4

88,3

88,6

Cinzas (%) 0,75

0,73

0,76

0,75

Proteínas (%) 0,86

1,04

0,98

0,91

Açúcares redutores (%) 3,73ª 5,27

4,76

4,67

Fibra bruta (%) 0,61

0,62

0,70

0,7

Lipídios (%) 0,17ª 0,18ª 0,19

0,16ª

Acidez (% de ácido pirúvico) 0,31ª 0,38

0,31ª 0,29

pH 5,23ª 5,08

5,2

5,16

Letras iguais indicam que não há diferença significativa pelo teste de Tukey (p < 0,05)

De acordo com o Teste de Tukey entre diferentes classes de cebolas comerciais, as

frações de umidade e cinzas não apresentaram diferença significativa. Nas demais frações

houve diferença significativa entre os níveis encontrados nas classes (Tabela 1),

especialmente para o teor protéico e de carboidratos. Este fato sugere que seria

interessante considerar para critério de classificação não somente as dimensões e as

características visuais, considerando-se a importância do conhecimento do aporte de

nutrientes para o estabelecimento de dietas balanceadas especialmente as restrições ao

consumo de carboidratos necessárias a indivíduos diabéticos ou de restrições alimentares

diversas.

3.2. Conteúdo de Fenóis Totais

Os fenóis constituem uma classe variada de compostos químicos que apresentam

diferentes solubilidades e funções conforme a associação de substituintes na estrutura

fenólica base. Sendo assim foram extraídos empregando três solventes: metanol, água e

acetato de etila. Na Tabela 2 estão os resultados dos teores de compostos fenólicos nos

três solventes determinados nas diferentes classes de cebola.

Tabela 2: Compostos fenólicos totais em diferentes classes de cebola

Classes Metanol (mg fenóis/

g de cebola)

Água (mg fenóis/

g de cebola)

Acet. Etila (mg

fenóis/ g de

cebola

Classe 2 2,26

2,84

0,08ª

Classe 3 2,24

2,89

0,08

Classe 4 2,31

2,78

0,08ª

Classe 5 2,28

2,82

0,08

*Letras iguais indicam que não há diferença significativa pelo teste de Tukey (p < 0,05).

Nas cebolas analisadas o teor de compostos fenólicos extraídos com metanol variou

entre 2,24 e 2,31 mg por grama de cebola (Tabela 2), o que representou diferença

significativa a 95% entre as classes, sendo a classe 4 a de maior potencial para

aproveitamento destes compostos no processo extrativo.

Os teores de compostos extraídos com água e com acetato de etila não

apresentaram diferença significativa entre as classes de cebola, sendo que o último

propiciou rendimentos 35 e 28 vezes menores que a água e o metanol respectivamente. Os

compostos fenólicos solúveis em metanol e água são mais abundantes em cebola, o que é

promissor considerando-se que os flavonóides em função de sua solubilidade podem estar

neste conjunto e que são os fenóis de maior potencial antioxidante, além de outros efeitos

benéficos. Nos extratos obtidos com acetato de etila os valores indicaram que nas classes

analisadas a concentração de fenóis polimerizados em relação aos demais é de

aproximadamente 35 vezes menor, o que é esperado considerando-se que estes são mais

abundantes em tecidos ainda não amadurecidos e que as cebolas apesar de um órgão

subterrâneo possuem paredes celulares pouco desenvolvidas.

Comparativamente a outros tecidos mencionados pela literatura como funcionais

pelo seu conteúdo fenólico, tais como banana 0,31 mg fenóis/ g amostra, maçã 1 mg fenóis/

g amostra e batata 0,99 mg fenóis/ g amostra (equivalente de tirosina), a cebola mostrou-se

promissora quando se considera apenas o conteúdo total de compostos fenólicos,

especialmente no caso de extração aquosa. No entanto, cabe salientar que os efeitos

benéficos dos compostos fenólicos decorrem especialmente da estrutura química, a questão

quantitativa é relevante em termos de que a probabilidade de estarem presentes estruturas

adequadas para a prevenção de processos oxidativos pode ser maior (MELO et al., 2006).

3.3. Atividade Específica das Enzimas Oxirredutases

Os compostos fenólicos desempenhem papéis importantes nos organismos, a ação

destes compostos pode estar comprometida diante da presença de enzimas do tipo

oxirredutases, principalmente as enzimas peroxidase e polifenoloxidase que dependendo de

suas características específicas podem ao atuar causar alterações exatamente nos

compostos biologicamente ativos.

Estas enzimas aparecem em células de diferentes seres vivos e tem por função

oxidar compostos doadores de elétrons. Bioquimicamente a função destas enzimas é de

proteção das células contra danos endógenos e exógenos, e sua atividade se manifesta,

principalmente, em situações de desequilíbrios físico-químicos do sistema tecidual. O

excesso da ação desta enzima pode resultar em danos indesejáveis nas células. No caso de

alimentos as principais alterações são perdas de flavor, cor e de nutrientes (ZANATTA,

ZOTARELLI e CLEMENTE, 2006; VALDERRAMA, MARANGONI, CLEMENTE, 2001). Em

decorrência destes riscos considerou-se interessante, além de conhecer o conteúdo de

compostos fenólicos totais, em suas diferentes formas de associação, estimar o seu

potencial de aproveitamento durante os períodos e situações que antecedem ao consumo

através da determinação da atividade de peroxidase e catalase.

Na Tabela 3 estão as médias das estimativas de atividade específica de catalase e

peroxidase expressas em mg de H

decomposta/ min / mg de proteínas e variação da

absorbância / min / mg de proteína, respectivamente nas diferentes classes de cebolas

estudadas.

Tabela 3: Atividade específica da catalase e da peroxidase nas diferentes classes de

cebola

Classes Atividade Específica Catalase Atividade Específica Peroxidase

Classe 2 0,025

0,031

Classe 3 0,024

0,003

Classe 4 0,014

0,026

Classe 5 0,017

0,025

Letras iguais indicam que não há diferença significativa pelo teste de Tukey (p < 0,05)

A atividade específica da catalase nas amostras de cebolas variou quase em dobro

(0,014 a 0,025), sendo a classe 2 a que apresentou maior atividade específica, mesmo sem

diferença significativa em relação a classe 3. As classes 4 e 5 tiveram atividade enzimática

menores, diferindo significativamente em relação as demais. Possivelmente a maior

atividade desta enzima nas classes 2 e 3, poderão propiciar a estas uma maior função

protetora, visto que esta enzima atua convertendo o peróxido de hidrogênio, que se trata de

uma substância tóxica para as células, numa espécie química que seja inócua e dificulta em

conseqüência a atividade da peroxidase que requer a presença de peróxido de hidrogênio

como doador de oxigênio no processo oxidativo.

A variação da atividade específica da peroxidase entre as classes foi na razão de 10

vezes entre a menor e a maior, sendo a classe 3 a que apresentou menor atividade

específica da enzima peroxidase, diferindo significativamente das demais. Cabe salientar

também que a peroxidase pode causar oxidação em compostos doadores de elétrons

diversos e não apenas os fenólicos (VALDERRAMA, MARANGONI, CLEMENTE, 2001;

ZANATTA, ZOTARELLI e CLEMENTE, 2006; CARNEIRO, ROLIM e FERNANDES, 2003;

MELO e VILAS BOAS, 2006). No caso das cebolas ricas em compostos sulfurados também

podem ser afetados pela ação das peroxidases endógenas.

Em função de seus mecanismos de atuação é esperado que as enzimas catalase e

peroxidase tenham efeito sinergistico antagônico, visto que a catalase decompõem o

peróxido de hidrogênio que é doador de oxigênio para o processo oxidativo catalisado pela

peroxidase. Apenas na classe 2 este comportamento não foi observado, um exemplo é o

caso da classe 3, onde a catalase apresentou atividade específica aproximadamente duas

vezes maior que as demais enquanto a peroxidase mostrou uma atividade dez vezes menor.

Estes dados de estimativa das atividades específicas dessas enzimas nas diferentes

classes de cebolas comerciais são ferramentas importantes, para a adoção de processos

que minimizem danos na composição e na velocidade de degradação dos tecidos e por

conseqüência preservem o potencial de compostos funcionais disponíveis nos tecidos.

No caso de consumidores que buscam em sua dieta não apenas as funções

nutricionais básicas, mas também compostos com efeitos metabólicos e/ou fisiológicos

benéficos à saúde, como é o caso dos compostos fenólicos, a classe 3 seria a mais

recomendada para ser consumida na forma in natura (salada) tendo como base a atividade

estimada para as enzimas oxirredutases. Ao contrário das classes 4 e 5 que apresentaram a

maior atividade específica para a peroxidase, sugerindo que ao serem consumidos os

compostos fenólicos teriam já sofrido alterações na sua estrutura, dependendo das variáveis

abióticas que antecederam o consumo. Neste caso para preservar os fenóis seria

interessante inativar as enzimas, ou seja, processar as cebolas de alguma forma,

especialmente em caso de armazenamento.

A polifenoloxidase é uma enzima intracelular que ocorre em plantas, animais e

fungos. Esta enzima contém cobre no centro ativo e catalisam dois tipos de reações, ambas

envolvendo oxigênio. A primeira reação corresponde à hidroxilação de monofenóis formando

orto-difenóis e a segunda à oxidação de orto-difenóis formando orto-quinonas (GOMES et

al., 2001). Esta enzima não foi detectada nas cebolas analisadas o que sugere também que

as cebolas não estavam ainda afetadas por contaminantes exógenos.

Há muitos estudos sobre a determinação de melhor pH e temperatura para

inativação de enzimas oxirredutases, principalmente peroxidase e polifenoloxidase, em

relação a catalase quase não se encontra estudos a respeito.

Comparando a média da atividade específica da enzima peroxidase encontradas nas

classes de cebola com outras matrizes estudadas por alguns autores, como por exemplo,

VALDERRAMA, ZOTARELLI e CLEMENTE (2006) que avaliaram o comportamento das

atividades enzimáticas da polifenoloxidase e da peroxidase em polpa de goiaba frente ao

tratamento térmico, encontraram atividade específica de 1,2 e 2,9 para peroxidase solúvel

de polpa de goiaba e peroxidase ionicamente ligada a polpa de goiaba respectivamente. Os

valores são expressos como aumento de uma unidade de absorbância por minuto/mL. A

enzima peroxidase apresenta atividade específica superior nas classes de cebolas

analisadas, ou seja, 4,5 aumento de uma unidade de absorbância por min/mg de proteína. A

atividade específica da polifenoloxidase foi de 1,51 na polpa da goiaba. Esta enzima não foi

detectada nas classes de cebola.

Em relação à maçã, as classes de cebolas apresentam atividade específica da

enzima peroxidase inferior, pois segundo VALDERRAMA, MARANGONI e CLEMENTE

(2001) que avaliaram o efeito do tratamento térmico sobre a atividade de peroxidase e

polifenoloxidase em maçã dos cultivares Fuji e Gala. Determinaram 31 e 220 de peroxidase

para polpa e casca da maçã do tipo Gala e 128 e 229 para polpa e casca da maçã Fuji. Os

resultados são expressos como aumento de uma unidade de absorbância por minuto/g de

amostra. Os valores encontrados para a enzima polifenoloxidase foram de 2,4 e 0,96 na

polpa e na casca da amostra de maçã Gala e 5,50 e 12,4 da polpa e da casca da maçã Fuji,

respectivamente. Nenhum dos trabalhos avaliaram a atividade específica da enzima

catalase.

4. CONCLUSÃO

A determinação da composição centesimal das diferentes classes de cebolas

comerciais mostrou que umidade e cinzas não apresentaram diferença significativa entre as

classes, porém ocorre diferença em outras frações de interesse nutricional, como açúcares

redutores e proteínas.

Os extratos da cebola apresentaram ampla faixa de conteúdo fenólico (0,08 e 2,89

fenóis

(bs)

-1

), sendo que os extratos obtidos com água os que se destacaram

significativamente, sendo 1,3 e 35 vezes maiores que os extratos metanólicos e os extraídos

com acetato de etila respectivamente.

As estimativas de atividade específica de catalase e peroxidase sugerem que a

classe 3 seria mais promissora em aporte de compostos fenólicos na dieta, pois seria a

menos susceptível as degradações por ação da peroxidase. A atividade de polifenoloxidase

não foi detectada nas cebolas coletadas.

As diferenças nas características bioquímicas verificadas entre as diferentes classes

de cebola sugerem que seria interessante rever o critério de classificação baseado apenas

no diâmetro transversal para atribuir valor comercial a esta matéria-prima.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ARTIGO 3

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE COMPOSTOS FENÓLICOS

EXTRAÍDOS DE CEBOLAS COMERCIAS E DA MICROALGA CHLORELLA

Vânia Machado Recart; Eliane Cipolatti, Melissa Oliveira, Eliana Badiale Furlong

Fundação Universidade Federal do Rio Grande

Laboratório de Análise e Bioquímica de Alimentos

Departamento de Química

Rua: Eng. Alfredo Huch, 475, caixa postal 474 – Centro

Rio Grande – RS – CEP 96201-900, Brasil

RESUMO

O objetivo do trabalho foi determinar o conteúdo de fenóis totais e avaliar a atividade

antioxidante dos extratos de cebola extraídos em três sistemas solventes (metanol, água e

acetato de etila) e da microalga chlorella em metanol, buscando identificar o emprego mais

adequado para a eficiência na prevenção da atividade antioxidante. Os extratos foram

avaliados frente a três sistemas oxidativos. A capacidade seqüestradora dos radicais livres

(DPPH), inibição da ação de enzimas oxirredutases e inibição de peróxidos e compostos

oxidados em sistemas lipídicos. O extrato com maior teor de compostos fenólicos foi o

aquoso (2,83 mg de fenóis/g de cebola). Todos os extratos apresentaram atividade

antioxidante nos diferentes sistemas empregados, mas o extrato aceto etílico mostrou-se

mais eficiente na ação antioxidante, com 53% de inibição/µg fenóis em DPPH e 53% em

inibição de oxidação e em peroxidase.

Palavras-Chave: cebola, chlorella, fenóis, atividade antioxidante

ABSTRACT

The objective of the work was to determine the total phenolic content and to evaluate the

antioxidants activity of extracts of onion extracted in three solvent systems (methanol, water

and acetate of etila) and of the microalgae chlorella methanol, searching to identify the job

most adequate for efficiency in the prevention of the antioxidants activity. The extracts had

been evaluated front the three oxidativos systems, the capacity of scavenging of the free

radicals (DPPH), inhibition of the enzyme action oxirredutases and inhibition of peroxides

and oxidated compounds lipids in systems. The extract that presented higher concentration

of phenolic composite was the watery extract (2,83 mg of fenóis/g of onion). All the extracts

had presented antioxidants activity in the different used procedure, but the aceto ethylic

shorved the revealed most efficient in the antioxidant action, with 53% of inibição/µg phenols

in DPPH and 53% in inhibition of oxidation and peroxidase.

Keywords: onion, chlorella, phenols, antioxidants activity

1. INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, estudos têm demonstrado que os radicais livres estão entre os

fatores responsáveis pelo envelhecimento e pelas doenças crônicas degenerativas, tais

como, câncer, diabete, doenças cardiovasculares, catarata e etc. Por se tratarem de

moléculas instáveis, ou seja, seus átomos possuem elétrons desemparelhados, estes

atingem as membranas lipídicas das células oxidando-as de forma a dificultar sua atividade

protetora (SOUSA et al 2007; SROKA e CISOWSKI, 2003; IQBAL, BHANGER e ANWAR,

2007)

A produção de radicais livres nos seres vivos pode ser controlada por diversos

compostos antioxidantes, que podem ter origem endógena ou serem provenientes da dieta

alimentar. Os antioxidantes podem ser definidos como um conjunto heterogêneo de

substâncias formadas por vitaminas, minerais, pigmentos naturais e outros compostos

vegetais e, ainda, enzimas, que bloqueiam o efeito danoso dos radicais livres (SINGH e

RAJINI, 2004; SOUSA et al 2007; HALLIWELL et al, 1995). O mecanismo de ação dos

antioxidantes é bem variado e incluem a remoção do oxigênio do meio, seqüestro dos

metais catalisadores da formação de radicais livres, aumento da geração de antioxidante

endógeno, inibição de enzimas oxidativas ou mesmo a interação de mais de um mecanismo.

Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência natural,

destacam-se os compostos fenólicos ou polifenóis que são compostos orgânicos que

contêm um grupo hidróxi (-OH) ligado diretamente num anel aromático, que conferem a

estrutura um papel importante na neutralização ou seqüestro de radicais livres e quelação

de metais de transição, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do

processo oxidativo (HALLIWELL et al, 1995). Os maiores grupos dos agentes fenólicos com

propriedades antioxidantes incluem os fenóis neutros, os ácidos fenólicos, flavonóides,

isoflavonas, flavonas, antocianinas, catequinas e outros presentes naturalmente em frutas e

vegetais (OLIVEIRA e FURLONG, 2008; DIMITRIOS, 2006).

Vários métodos são utilizados para avaliar a atividade antioxidante em extratos e

substâncias isoladas, eles são baseados na estimativa da capacidade seqüestradora de

radicais livres, inibição de enzimas oxirredutases e inibição da peroxidação lipídica.

A atividade seqüestradora do radical livre pode ser determinada com o reagente 1,1-

difenil-2-picril-hidrazila (DPPH), de coloração púrpura que absorve em 515 nm. Por ação de

um antioxidante ou uma espécie radicalar, o DPPH é reduzido formando difenil-picril-

hidrazina, de coloração amarela, com conseqüente desaparecimento da absorção, podendo

a mesma ser monitorada pelo decréscimo da absorbância. A partir da diminuição da

absorbância do DPPH em presença do antioxidante pode ser estimada a porcentagem de

atividade antioxidante ou seqüestradora de radicais livres. Estes dados permitem estimar a

concentração eficiente (CE) ou chamada de concentração inibitória (CI) do extrato, definida

como a quantidade de antioxidante necessária para decrescer a concentração de DPPH em

50% (SOUSA et al., 2007).

Outra forma de estimar atividade antioxidante de extratos é medir a inibição da

reação escurecimento enzimático do guaiacol catalisada pela peroxidase em ausência e

presença do composto em estudo. A outra técnica freqüentemente mencionada na literatura

consiste em avaliar o grau de oxidação do azeite de oliva pré-oxidado, através das medidas

do índice de peróxido e o ácido tiobartitúrico (TBA), usando como inibidor da reação

oxidativa os extratos de cebola e chlorella contendo compostos fenólicos (PASSOTO,

PENTEADO e MANCINI-FILHO, 1998).

Os compostos fenólicos, com atividade antioxidante podem ser obtidos de diferentes

fontes, nesse trabalho a obtenção foi a partir de duas matrizes. A cebola (Allium cepa L.)

que é um bulbo cônico pouco desenvolvido, maciço, envolto por folhas modificadas, as

quais se apresentam como túnicas superpostas. As folhas subterrâneas armazenam

nutrientes para serem utilizadas por outras porções do vegetal durante o ciclo de vida.

(GEMTCHÚJNICOV, 1976; RAVEN et al., 1996). A cebola é considerada como fonte de

vitaminas e sais minerais, além de apresentar propriedades terapêuticas comprovadas,

como a proteção contra algumas infecções do aparelho digestivo, diminuição do nível de

glicose no sangue e proteção contra a arteriosclerose (GOLDMAN et al., 1996).

O segundo tecido estudado foi a Chlorella, uma microalga eucariótica unicelular

esférica e seu diâmetro varia de 5-10µm, dependendo da espécie (ILLMAN, SCRAGG e

SHALES, 2000). É encontrada em tanques e lagos, com grande habilidade de realizar a

fotossíntese. Esta microalga possui 53% de proteínas, 23% de carboidratos, 9% de lipídios e

5% de minerais (HENRIKSON, 1994). Ela contém ainda mais de 2% de clorofila, o que lhe

permite rápido crescimento (VONSHAK, 1997). Esta microalga usada como suplemento

alimentar, rica em compostos funcionais protetores, não apresenta informações sobre o seu

poder antioxidante.

O objetivo deste estudo foi determinar o conteúdo de fenóis totais e avaliar a

atividade antioxidante dos extratos de cebola e da microalga chlorella, buscando identificar o

emprego mais adequado para eficiência da atividade antioxidante.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1. Reagentes

Os solventes e reagentes empregados foram analiticamente puros. Sendo o

reagente Folin-Ciocalteau da marca Polipur, a Quercetina e o 1,1-difenil-2-picril-hidrazila

(DPPH) da Sigma, o ácido gálico da Vetec, e o guaiacol da Merck.

2.2. Amostras

As cebolas cedidas e classificadas pela EMATER, Rio Grande, RS foram coletadas

no município de São José do Norte no Rio Grande do Sul em março de 2007. A

classificação foi realizada segundo Regulamento Técnico de Qualidade da Cebola (1995)

portaria n° 529 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). No

Laboratório de Bioquímica de Alimentos da FURG as cebolas foram descascadas, lavadas,

picadas e secas em estufa com circulação de ar da marca QUIMIS a 60°C, até atingirem

valores de umidade de 13%.

A microalga chlorella foi obtida na forma de pastilhas, em estabelecimento comercial

de lojas especializadas em produtos alimentícios especiais na cidade de Rio Grande – RS.

As pastilhas foram moídas com o auxílio de grau e pistilo até ficarem na forma de pó com

granulometria 0,35 mm

2.3. Extração e Determinação do teor de fenóis totais

A extração dos compostos fenólicos das cebolas foi realizado a frio com água,

acetato de etila e metanol e a microalga chlorella com metanol, na proporção de 1:5 de

massa seca : solvente, em agitador horizontal a temperatura ambiente, seguida da partição

com hexano, clarificação com hidróxido de bário 0,1M e sulfato de zinco 5% e filtração. Os

extratos foram armazenados em freezer até quantificação e/ou posterior uso. O conteúdo de

fenóis totais, das diferentes classes de cebolas e da microalga chlorella foi determinado

através do método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, com uma curva de calibração

da quercetina e tirosina respectivamente, com faixa de concentração variando de 2 e

16µg/mL (BADIALE-FURLONG et al., 2003). O método esta descrito em detalhes no

ANEXO 3.

2.4. Determinação da Atividade Antioxidante

2.4.1. Atividade Seqüestradora do Radical Livre DPPH

A solução estoque de DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazila) foi preparada pesando

0,0100g e transferindo para um balão volumétrico de 50 mL, sendo o volume completado

com metanol. Uma alíquota de 10 mL foi retirada da solução estoque e transferida para um

balão volumétrico de 100 mL, e o volume final foi completado com metanol. Alíquotas de

100 µL, 200 µL e 500 µL dos extratos de cebola e chlorella, com concentração conhecidas

de compostos fenólicos foram colocados em diferentes tubos de ensaio. Em seqüência 3,9

mL, 3,8 mL e 3,5 mL da solução de DPPH em metanol (5x10

-5

M) foram adicionados e, após

agitação manual, os tubos foram deixados em repouso ao abrigo de luz. Ao final de 15, 30,

45 e 60 min a absorbância foi medida a 515 nm e a capacidade de seqüestrar o radical,

expresso como percentual de inibição, calculada de acordo com as equações 1 e 2 (SOUSA

et al., 2007).

Equação 1:

% de Inibição Bruto = (Abs controle – Abs amostra)/ abs controle. 100

Onde absorbância do controle é igual a solução de DPPH sem antioxidante, sendo o volume

completado com metanol

Equação 2:

% de Inibição Específica = (% de inibição bruto/µg de fenóis)

Como padrão de comparação foi utilizado a quercetina para avaliar a capacidade de

seqüestrar o radical DPPH, determinadas nas mesmas condições dos ensaios realizados

com os extratos analisados.

2.4.2. Atividade de Inibição Enzimática Oxidativas

A enzima peroxidase foi extraída de polpa de batata (Solanum Tuberosum L.) da

variedade rosa (20g) com 100 mL de solução tampão fosfato pH 7, sob agitação em blender

por 2 min, seguida de filtração com algodão. Uma alíquota de 10 mL do sobrenadante foi

adicionada a 20 mL de acetona para precipitação da enzima. Após centrifugação, o

sobrenadante foi descartado e a enzima ressuspendida com EDTA 0,25M (OLIVEIRA,

2005).

A reação enzimática foi realizada a 30°C e pH 6,0 utilizando o guaiacol como

substrato em presença de peróxido de hidrogênio 0,08%. A reação foi realizada misturando

1,5 mL de solução tampão fosfato, 1,7 mL de água destilada, 1 mL de peróxido de

hidrogênio 0,08%, 0,5 mL de guaiacol 1%, 1 mL do extrato enzimático e 0,3 mL dos extratos

analisados que continham teores conhecidos de compostos fenólicos. Os extratos foram

adicionados e para avaliar o seu efeito na velocidade da reação no grupo controle o volume

de extrato foi substituído por água destilada. A absorbância foi medida a 470 nm em um

espectrofotômetro VARIAN modelo CARY 100 nos tempos 0, 5, 10, 15, 20 e 25 minutos de

reação. A atividade antioxidante foi expressa como o percentual de inibição da reação de

escurecimento após 10 minutos de reação, em relação ao seu controle. Calculada de acordo

a seguinte equação 3.

Equação 3: (Abs.controle - Abs. Amostra).100/Abs.controle

Estudo do Mecanismo de Inibição de Peroxidase pelos Extratos Fenólicos

Foram utilizadas diferentes concentrações do substrato (guaiacol) e os resultados

foram plotados segundo o método gráfico de Lineweaver e Burk. A reação ocorreu em

solução tampão fosfato pH 6,0, com o extrato enzimático da batata, peróxido de hidrogênio

0,08% e diferentes alíquotas de guaiacol 0,5% como substrato da reação a saber (0, 0,05,

0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8,mL) em cada sistema reator. Além do grupo controle o

procedimento foi repetido em presença dos extratos fenólicos obtidos das amostras de

cebola e microalga chlorella. Para os extratos de cebola extraídos com metanol e com água

foram utilizadas alíquotas de 300 µL e 500 µL e para os extratos de cebola tendo com

solvente o acetato de etila e a microalga chlorella as alíquotas empregadas foram de 500 µL

e 800 µL.

2.4.3. Avaliação da Peroxidação Lipídica

Inicialmente o azeite de oliva foi submetido a diferentes condições pró-oxidantes:

tratamento térmico a 100°C durante 30 minutos, tratamento térmico a 30°C durante 30

minutos, adição de cloreto férrico sob agitação a 25°C e exposição à radiação ultra-violeta

com comprimento de onda de 260 e 354 nm em diferentes tempos (20, 40, 60 minutos).

Para avaliar o efeito dos tratamentos foi determinado o índice de peróxido (IP), que

consistia na reação da amostra com iodeto de potássio, solução de ácido acético-

clorofórmio e água destilada. Com determinação do iodo liberado por titulação com solução

de tiossulfato de sódio padronizada. O método está descrito em detalhes no ANEXO 3.

O índice de peróxido, expresso como meq/Kg de amostra, foi calculado conforme a

equação 4.

Equação 4: I.P. = (V

– V

). N. 1000/ P

= volume de tiossulfato gasto na amostra

= volume de tiossulfato gasto no branco

N = normalidade do tiossulafto de sódio

= peso da amostra em gramas

O teste do ácido tiobartitúrico (TBA) foi realizado segundo metodologia de VYNCKE

(1970) com modificações. O método consiste em determinar os malonaldeídos formados da

reação durante a oxidação lipídica por decomposição de hidroperóxidos com o TBA. A

coloração avermelhada foi determinada espectrofotometricamente a 538 nm após 40

minutos. Os valores das concentrações de malonaldeidos formados foram determinados a

partir de uma curva analítica com padrão TMP (1,1-3,3-tetra metoxipropano) com

concentração variando de 1,01.10

-8

a 10,1.10

-8

. O método esta descrito em detalhes no

ANEXO.

Os testes de índice de peróxido e do ácido tiobartitúrico foram realizados sem a

adição dos extratos (grupo controle) e com a adição dos extratos de cebola e chlorella para

avaliar os efeitos antioxidantes destes.

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1. Determinação de Fenóis Totais nas Amostras de Cebola e Chlorella

A Tabela 1 apresenta a média do conteúdo de compostos fenólicos totais da cebola

extraídos em três sistemas solventes e da microalga chlorella em extrato metanólico.

Tabela 1: Resultados dos fenóis totais presentes nos extratos estudados

Extrato Fenóis Totais (mg

fenóis

/g amostra

Cebola Metanol 2,27

Cebola Água 2,83

Cebola Acetato de Etila 0,08

Chlorellla metanol 0,20

Para determinar o conteúdo de compostos fenólicos nas diferentes classes de

cebolas foi realizado um procedimento de extração otimizado para obtenção dos indicativos

de performance, como limite de quantificação e recuperação, cujas avaliações foram

realizadas em triplicata. O limite de quantificação determinado foi de 30,7 µg fenóis/g

amostra. O teor médio de recuperação para o método completo usando a extração

otimizada foi de 88% e variou entre 84 e 92 % da menor para a maior concentração testada.

As condições de extração resultam em valores que estão fora dos valores dos pontos

críticos para a confiabilidade de resultados analíticos e neste caso os teores obtidos para

limites de quantificação e recuperação sugerem que o método adaptado é promissor para

determinar fenóis.

O conteúdo de fenóis totais variou entre 0,08 mg

fenóis

g amostra na cebola extraída

com acetato de etila e 2,83 mg

fenóis

g amostra na cebola extraída com água. A variabilidade

na distribuição e composição dos compostos fitoquímicos fenólicos é grande para os

diferentes extratos estudados neste trabalho, sendo este mesmo comportamento verificado

por outros autores. Cabe lembrar que isto pode ser determinado pela variedade, espécie,

procedimento de plantio, condições de estocagem e processo ao qual o tecido é submetido

(KIM et al., 2003). Em relação ao extrato da microalga chlorella a média do teor de

compostos fenólicos encontrado foi de 0,20 mg

fenóis

g amostra e não foram encontrados

informes na literatura sobre os níveis destes compostos.

Comparativamente a outros tecidos mencionados pela literatura, como funcionais

pelo seu conteúdo fenólico, como banana 0,31 mg fenóis/ g amostra, maçã 1,0 mg fenóis/ g

amostra e batata 0,99 mg fenóis/ g amostra (equivalente de tirosina), 0,061-0,084 mg fenóis/

g de amostra (ácido ferúlico) (ZHOU et al., 2004), 0,69 e 0,35 mg fenóis/ g de amostra em

bagaço de laranja e polpa de berinjela (BADIALE-FURLONG et al., 2003), a cebola parece

ser bem promissora quando se investiga vegetais com potencial de aporte de compostos

fenólicos na dieta.

Uma vez que os solventes que propiciaram a extração de maiores teores de fenóis

na cebola foram o metanol e a água, esta resposta mostrou que os compostos fenólicos

solúveis em metanol e água são mais abundantes em cebola, o que é promissor

considerando-se que flavonóides podem estar neste conjunto em função da solubilidade.

Nos extratos obtidos com acetato de etila os valores indicam que foram extraídas baixas

concentrações de fenóis que possivelmente se encontravam em estado polimerizado.

3.2. Determinação da Atividade Antioxidante

Vários métodos são utilizados para avaliar a atividade antioxidante em extratos e

substâncias isoladas. Nesse estudo foram realizadas estimativas da atividade em diferentes

sistemas que envolvem oxidação para identificar o tipo de mecanismo de inibição dos

compostos fenólicos presentes nos extratos analisados e a melhor forma de aplicar os

compostos na sua condição de maior eficiência

3.2.1. Capacidade de Seqüestrar o Radical Livre DPPH

A Tabela 2 apresenta os resultados das determinações realizadas para avaliar a

capacidade de seqüestrar o radical livre DPPH, expressa em percentual de inibição, exibida

pelos extratos de cebola e chlorella nas alíquotas de 100 µL, 200 µL e 500 µL com seus

respectivos conteúdos de fenóis totais explicitados.

Tabela 2: Capacidade de seqüestrar o radical livre DPPH (% de inibição) utilizando-se

diferentes níveis de compostos fenólicos

% de Inibição Bruto

Extratos

Compostos

fenólicos

(µg/mL

extrato

)

15 min

30 min

45 min

60 min

Inibição

Específica*

Ceb M-OH 1 3,4 16,7

20,7

22,4

23,7

Ceb M-OH 2 7,4 24,5

29,2

31,5

33,2

Ceb M-OH 3 17 37,9

53,4

Ceb H

O 1 12,6 10

12,4

13,4

Ceb H

O 2 25,2 16,2

17,5

17,8

18,2

0,7

Ceb H

O 3 63,2 18,6

24,2

26,4

28,4

0,4

Ceb Acet 1 0,074 4

4,2

3,7

3,9

Ceb Acet 2 0,15 4,7

5,2

Ceb Acet 3 0,37 7,1

7,7

7,9

8,7

Chlorella 1 0,29 0,3

1,75

2,5

2,7

Chlorella 2 0,57 0,7

3,2

3,7

5,2

5,6

Chlorella 3 1,44 2,7

5,2

7,7

10,2

4,5

Quercetina 1 0,27 10,5

14,5

14,7

15,3

Quercetina 2 0,5 26,6

32,2

Quercetina 3 1,3 65

77,7

80,4

56,5

Letras iguais na coluna indicam que não há diferença significativa pelo teste de Tukey (p< 0,05)

Os números 1, 2 e 3 referem-se a utilização de 100, 200 e 500 µL de extratos.

*Expressos em % de inibição/µg fenóis.

De acordo com os resultados pode se observar que todos os extratos possuem

capacidade de seqüestrar o radical livre DPPH, entretanto este caráter foi diferenciado entre

os extratos analisados, possivelmente em decorrência das diferentes estruturas químicas

extraídas pelos solventes utilizados, além da concentração dos compostos fenólicos nos

extratos.

Quando se observa o percentual de inibição bruto nos tempos de reação avaliados

os extratos de cebola extraído com os solventes metanol e água foram os que apresentaram

maior percentual de inibição respectivamente (Tabela 2). Embora a atividade antioxidante

esteja relacionada com as estruturas químicas envolvidas no processo, a concentração de

compostos fenólicos também é um aspecto importante considerando-se especialmente que

no extrato de cebola metanólico os níveis são até cinqüenta vezes superiores em relação

aos com acetato de etila e doze vezes maior em relação da microalga chlorella. O mesmo

caso foi verificado para o extrato aquoso que apresentou uma concentração de compostos

fenólicos 170 vezes maior que o acetato de etila e 45 vezes maior que a do extrato de

chlorella. Ficou evidente por tanto que estes compostos apresentariam resultados maiores

na inibição bruta, mas quando se levava em consideração a inibição específica, ou seja, o

percentual de inibição em função da concentração dos compostos fenólicos presentes, o

extrato de cebola extraído com acetato de etila foi mais eficiente na capacidade de

seqüestrar o radical livre DPPH apresentando valores de 53; 34; e 21 %inibição/ µg fenóis

respectivamente para cada concentração empregada, e foram os resultados mais próximos

aos do padrão quercetina.

SINGH e RAJINI (2004) investigaram o potencial antioxidante de extratos aquosos

de cascas de batata através de várias técnicas de sistemas in vitro, tais como, peroxidação

lipídica, DPPH, poder de redução e quelação do íon ferro. Os extratos de cascas de batata

demonstraram uma considerável atividade antioxidante de seqüestrar o radical livre DPPH

tal atividade tinha seu efeito aumentado significativamente quando se aumentava a

concentração dos extratos aquosos de cascas de batata. Além de possuir caráter

antioxidante nas demais técnicas desenvolvidas, sendo por tanto considerado eficiente

ingrediente de alimentos funcionais para minimizar o efeito do estresse oxidativo.

MELO et al (2006) avaliaram a capacidade antioxidante de quinze hortaliças

comercializadas na cidade do Recife, PE. Os extratos metanólicos foram testados quanto a

atividade antioxidante em sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico e a habilidade de

seqüestrar o radical estável DPPH. Todas as hortaliças investigadas exibiram propriedades

antioxidantes, entretanto a ação foi diferenciada entre os vegetais. Os extratos metanólicos

da couve (folha), tomate, batata, couve-flor, repolho verde, espinafre e alface crespa, foram

os mais eficazes no seqüestro do radical livre DPPH, com % de inibição superior a 70%. Os

extratos metanólicos da alface lisa, cebola branca e vagem apresentaram ação moderada

(60-70%), enquanto que a cebola roxa, chuchu, pepino e cenoura exibiram a mais fraca

capacidade de sequestrar o radical livre DPPH. No sistema modelo β-caroteno/ácido

linoléico os extratos metanólicos do espinafre e couve-flor exibiram a mais elevada atividade

antioxidante (superior a 70%). As hortaliças testadas, assim como as cebolas estudadas,

podem ser vistas como fontes dietéticas de antioxidantes que podem trazer benefícios à

saúde, portanto o seu consumo deve ser estimulado.

Em função do percentual de inibição do radical livre pelos extratos de cebola e

chlorella foi realizado a avaliação do efeito da variável tempo de reação para melhor

interferir sobre o mecanismo de atuação do antioxidante.

Extrato Cebola Metanol

0 20 40 60 80

Tempo (min)

% inibição

100uL

200uL

500uL

Extrato Cebola Água

0 20 40 60 80

Tempo (min)

% inibição

100uL

200uL

500uL

(a) (b)

Extrato Cebola Acetato

0 20 40 60 80

Tempo (min)

% inibição

100uL

200uL

500uL

Extrato Chlorella

0 20 40 60 80

Tempo (min)

% in ibição

100uL

200uL

500uL

(a) Extrato Cebola Metanólico. (b) Extrato Cebola Aquoso. (c) Extrato Cebola Acetato de

Etila. (d) Extrato Chlorella.

Figura 1: Avaliação da variável tempo em função do percentual de inibição dos extratos

De acordo com a Figura 1 pode-se observar que todos os extratos tiveram o mesmo

tipo de comportamento, ou seja, com o passar do tempo e com o aumento da concentração

de extrato utilizado, houve um maior percentual de inibição que tendia a se estabilizar após

20 minutos de interação com o radical livre DPPH.

3.2.2. Estudo da Inibição de Enzimas Oxidativas pelos Extratos em Estudo

O mecanismo de inibição de oxidação dos extratos em um sistema enzimático

aquoso de peroxidase extraída da batata foi avaliado para compreensão e identificação da

melhor forma para um possível emprego dos compostos extraídos.

A Tabela 3 apresenta a concentração de compostos fenólicos contida nos extratos

utilizados em cada experimento, os valores de Kms e velocidades máximas obtidos a partir

das equações das retas dos gráficos de Lineweaver e Burke e o percentual de inibição,

causada pela presença dos extratos de cebola e chlorella no meio reacional.

Tabela 3: Conteúdo de Fenóis Totais, Valores de Km, Velocidades Máximas e % de

Inibição das Reações de Escurecimento Enzimático pelos Compostos Fenólicos dos

Extratos em estudo

Extrato

Fenóis

(mg

fenóis

/mL)

controle

extrato

Vmáx.

controle

Vmáx.

extrato

% de

Inibição

da reação

Ceb.Metanol 1 2,14 0,12 0,12 0,18 0,15 17

Ceb. Metanol 2 1,29 0,17 0,45 0,26 0,19 27

Ceb. Água 1 4,54 0,21 0,38 0,16 0,12 25

Ceb. Água 2 2,73 0,17 0,36 0,26 0,18 31

Ceb. Acetato 1’ 0,005 0,07 0,065 0,15 0,105 30

Ceb. Acetato 2’ 0,008 0,07 0,068 0,15 0,07 53

Chlorella 1’ 0,019 0,07 0,044 0,15 0,08 47

Chlorella 2’ 0,030 0,07 0,05 0,15 0,05 67

1 e 2: níveis de fenóis decrescentes

1’ e 2’: níveis de fenóis crescentes

De acordo com a Tabela 3 não foi observada relação linear crescente entre os teores

de fenóis e a inibição do escurecimento avaliada pela velocidade máxima relativa ao

controle (ausência de extrato). Este efeito reforça o esperado em relação ao efeito da

estrutura química dos componentes ativos dos extratos, tais como a posição e o número de

hidroxilas presentes na molécula dos polifenóis são fatores relevantes para esta atividade

(MELO et al., 2006).

As velocidades máximas da reação de escurecimento enzimático diminuíram em

presença dos extratos de cebola e chlorella, o que caracterizaria o efeito de inibição da

oxidação do guaiacol catalisado pelas peroxidases extraídas da batata. Os valores de Km

das reações em presença de alguns extratos fenólicos, como por exemplo, o extrato de

cebola extraído com acetato de etila e o extrato da microalga chlorella, diminuíram em

relação à reação controle. Este comportamento não ocorreu com os extratos de cebola

metanólico (300 µL) e com os extratos aquosos que tiveram valores de Km aumentados em

relação ao controle. O extrato de cebola metanólico (500 µL) teve valor de Km igual ao do

controle. Os valores de Km diferenciados em relação ao controle deve-se aos diferentes

tipos de inibição ou ativação provocada pelos extratos analisados. No menor nível do

extrato metanólico e dos aquosos foi observado o mesmo tipo de inibição, a inibição

competitiva, ou seja, o inibidor se combina com a enzima livre de tal maneira que ele

compete com o substrato normal pela ligação ao sítio ativo. E os extratos de cebola

extraídos com acetato de etila e o extrato da microalga chlorella apresentaram o mesmo tipo

de inibição, que é a inibição não-competitiva, a qual o inibidor pode combinar-se com a

enzima livre ou com o complexo enzima-substrato, interferindo na ação de ambos.

A Figura 2 ilustra o comportamento da reação de escurecimento enzimático do

guaiacol catalisada pela peroxidase em ausência e presença de extratos fenólicos ao longo

de 25 minutos.

Reação de Escurecimento na Presença ou não do Inibidor

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30

Tempo (min)

abs

branco

ceb met

ceb agua

ceb acet

chlorella

Branco = reação sem adição de extrato fenólico; ceb met = extrato fenólico de cebola

extraído com metanol; ceb água = extrato fenólico de cebola extraído com água; ceb acet =

extrato fenólico de cebola extraído com acetato de etila; chlorella = extrato fenólico de

chlorella extraído com metanol.

Figura 2: Inibição da Reação de Escurecimento Enzimático pelos Extratos Fenólicos de

Cebola e Chlorella

De acordo com a Figura 2 pode ser observado que houve diminuição da velocidade

de escurecimento ao longo do tempo quando se empregava os extratos das diferentes

fontes, sugerindo que a reação de escurecimento enzimático foi inibida, destacando-se os

extratos de cebola aquoso e metanólico. Nestes casos as atividades inibitórias coincidem

com os maiores teores de compostos fenólicos determinados.

3.2.3. Avaliação da Peroxidação Lipídica

Inicialmente foram estudadas diferentes condições para oxidar o azeite de oliva,

visando escolher a melhor condição que seria empregada para avaliar o efeito antioxidante.

A condição foi escolhida baseada nos valores de Índice de peróxido e concentrações de

malonaldeído. A Tabela 4 apresenta as condições empregadas para oxidação do azeite de

oliva, monitorado pela determinação do índice de peróxido e concentrações de

malonaldeído que antecederam o estudo.

Tabela 4: Índice de Peróxido e Concentração de Malonaldeído em diferentes

Condições Pró-Oxidantes

Condição Pró-Oxidante Índice de

Peróxido∗

[malonaldeído]∗∗

Tratamento Térmico (100ºC/30min) Não detectado 1,15. 10

-8

Tratamento Térmico (30°C/30min) 0,98 0,69. 10

-8

Tratamento Metal (FeCl

agitação/25°C) 22,4 2,27. 10

-8

UV (20, 40, 60 min) Não detectado Não detectado

NaCl (50ºC/30min)

Não detectado 0,93. 10

-8

∗ Expressos em mEq peróxido/kg amostra; ∗∗ Expresso em molaridade (M).

De acordo com a Tabela 4, a condição que melhor permitiria o acompanhamento do

processo oxidativo para estudo in vitro do processo, foi aquela em que tanto os teores de

peróxido como os de malonaldeídos formado variaram dentro do mesmo intervalo do

experimento , ou seja, quando o processo oxidativo foi catalisado pelo cloreto férrico sob

agitação a 25°C.

Nos primeiros experimentos os extratos de cebola e chlorella e o cloreto férrico foram

colocados ao mesmo tempo no sistema lipídico, ocasionando uma pequena variação no

índice de peróxido comparada a não adição dos antioxidantes, ou seja, sem a adição do

extrato o índice de peróxido foi igual a 20,3 mEq peróxido/Kg amostra e com a adição dos

extratos de cebola metanólico, aquoso, acetato de etila e da microalga chlorella o índice de

peróxido encontrado foi 19, 18, 17 e 20 mEq peróxido/Kg amostra respectivamente. Este

comportamento mostrou que uma vez iniciado o processo oxidativo ele não era interrompido

pela adição dos extratos com a eficiência necessária para proteger o sistema lipídico do

dano. Portanto as análises foram realizadas se adicionando os extratos estudados antes do

início da oxidação. A Tabela 5 apresenta o índice de peróxido, a concentração de

malonaldeídos e % de inibição causados pelos extratos estudados antes do início do

processo oxidativo.

Tabela 5: Índice de Peróxido, Concentração de Malonaldeído e % de Inibição com

Adição do Extrato antes do Processo Oxidativo

Extrato

Compostos

Fenólicos nos

Extratos∗

Índice de

Peróxido∗∗

Concentração de

Malonaldeído∗∗∗

% de

Inibição

Ceb. M-OH

9,1 12 1,82. 10

-8

Ceb. H

O 14,6 16,9 1,16. 10

-8

Ceb. Acet.

0,012 6,6 1,08. 10

-8

Chlorella 0,53 17,0 1,87. 10

-8

∗ Expressos em µg fenóis/mL extrato; ∗∗ Expressos em mEq peróxido/kg amostra; ∗∗∗

Expresso em molaridade (M).

De acordo com a Tabela 5 o extrato de cebola mais promissor para evitar a oxidação

ocasionada pela catálise metálica em sistema lipídico foi o extraído com acetato de etila com

uma inibição percentual de 53% acompanhado pela menor formação de peróxido (até três

vezes menor) e de malonaldeído (1,5 vezes menor) ao longo do tempo do experimento.

Estudos têm sido realizados visando oferecer alguma contribuição para a

estabilização de alimentos lipídicos, por exemplo, PASSOTO, PENTEADO e MANCINI-

FILHO (1998) avaliaram a atividade antioxidante da vitamina A na forma de acetato de

retinol e de seu principal precursor o β-caroteno, adicionados a um sistema de óleo de soja

previamente sensibilizado à oxidação. Os parâmetros utilizados como grau de atividade

oxidativa como neste estudo foram o índice de peróxido (I.P.) e teores de malonaldeído. As

determinações das atividades antioxidantes foram comparadas à do butilihidroxitolueno

(BHT). E foi verificado que o óleo de soja adicionado de β-caroteno apresentou os I.P.

reduzidos (131,3 meq/Kg) em relação ao controle (151,3 meq/Kg), portanto de menor

magnitude em relação ao deste trabalho. Quanto aos teores de malonaldeído, não houve

diferença significativa em relação ao controle. No caso do acetato de retinol o índice de

peróxido reduziu em aproximadamente quatro vezes em relação ao do controle.

Comparando os resultados obtidos com este que utilizada a o β-caroteno e o acetato

de retinol como antioxidantes, o extrato aceto etílico foi mais eficiente contra a oxidação dos

ácidos graxos, pois o percentual de inibição obtido por eles após 72 horas foi de 54,5% em

relação a concentração de malonaldeído ao extrato controle, este percentual foi

aproximadamente o encontrado para o extrato de cebola mencionado.

4. CONCLUSÃO

Os extratos de cebolas extraídos com diferentes solventes apresentaram uma ampla

faixa de compostos fenólicos (0,08 e 2,83 mg

fenóis

g amostra), sendo que o extrato aquoso

foi o que extraiu maior conteúdo de compostos fenólicos. No extrato da microalga chlorella a

média do teor de fenóis encontrado foi de 0,20 mg

fenóis

g amostra.

Todos os extratos apresentaram capacidade de seqüestrar o radical livre DPPH, mas

o extrato aceto etilíco foi mais eficiente quanto a capacidade de seqüestrar o radical livre

DPPH apresentando valores de inibição específica de 53; 34 e 21 %inibição/µg fenóis

respectivamente para cada concentração empregada, e foram os resultados mais próximos

aos do padrão quercetina.

As velocidades máximas da reação de escurecimento enzimático diminuíram em

presença dos extratos de cebola e chlorella, o que caracteriza o efeito de inibição da

oxidação do guaiacol catalisado pela peroxidase. Os aceto etílicos de cebola e os de

chlorella ocasionaram inibição não-competitiva, o extrato metanólico e os extratos aquosos

apresentaram inibição competitiva.

O extrato de cebola mais promissor para evitar a oxidação ocasionada pela catálise

metálica em sistema lipídico foi o obtido com acetato de etila com uma inibição percentual

de 53% acompanhado pela menor formação de peróxido (até três vezes menor) e de

malonaldeído (1,5 vezes menor) ao longo do tempo do experimento.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ARTIGO 4

CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA MICROALGA CHLORELLA

Vânia Machado Recart; Eliana Badiale Furlong

Fundação Universidade Federal do Rio Grande

Laboratório de Análise e Bioquímica de Alimentos

Departamento de Química

Rua: Eng. Alfredo Huch, 475, caixa postal 474 – Centro

Rio Grande – RS – CEP 96201-900, Brasil

RESUMO

Alguns tipos de microalgas são comercializadas como alimento natural ou suplemento

alimentar e são encontradas formulações em pó, tabletes, cápsulas ou extratos. O objetivo

do trabalho foi determinar a composição centesimal, o pH, a acidez e o teor de compostos

fenólicos da microalga chlorella extraído comercializada como pastilha. As médias dos

valores encontrados foram 4,1% de umidade; 6,3% de cinzas; 22,3% de carboidratos; 2,8%

de fibra-bruta; 56,9% de proteína; 7,6 de lipídios; 0,2% de acidez; pH 5,7 e 0,20

fenóis

(bs)

de compostos fenólicos.

ABSTRACT

The microalgaes is commercialized as natural food or alimentary supplement and is found

formularizations in dust, tablets, capsules or extracts. The objective of the work was to

determine the centesimal composition, pH, the acidity and phenolic composite the text of the

microalgaes chlorella extracted with methanol. The averages of the joined values had been

4.1% of humidity; 6,3% of leached ashes; 22,3% of carboidratos; 2,8% of fiber-rude; 56,9%

of protein; 7,6 of lipídios; 0,2% of acidity; pH 5,7 and 0,20 mgfenóis.g(bs)

of phenolic

composites.

1. INTRODUÇÃO

Muitos estudos vêm sendo realizados com relação às aplicações das microalgas e

dos produtos extraídos destas na indústria de alimentos tais como: no tratamento de águas

residuais de inúmeros processos industriais, para a detoxificação biológica e remoção de

metais pesados, como bioindicadores, na detecção de nutrientes e substâncias tóxicas. As

microalgas podem produzir uma gama de moléculas bioativas com propriedades

antibióticas, anticâncer, antiinflamatórias, antivirais, redutoras do colesterol, enzimáticas e

com outras propriedades farmacêuticas. O conteúdo lipídico confere potencial para seu

emprego na produção de biocombustíveis (biodisel, por exemplo) (DERNER et al., 2006).

As microalgas são comercializadas como alimento natural ou suplemento alimentar e

são encontradas formulações em pó, tabletes, cápsulas ou extratos. São também

incorporadas em massas, petiscos, doces, bebidas, etc, tanto como suplemento alimentar

quanto como corantes naturais, no entanto sua atividade como conservante não vem sendo

explorada sendo usualmente enfatizada a qualidade de proteínas e ácidos graxos

essenciais (COLLA et al., 2004; PULZ & GROSS, 2004).

A Chlorella é uma microalga eucariótica unicelular esférica e seu diâmetro varia de 5-

10 µm, dependendo da espécie (ILLMAN, SCRAGG e SHALES, 2000). Aparece

espontaneamente em tanques e lagos, com grande habilidade de realizar a fotossíntese,

caracteriza-se por ser rica em clorofila, proteínas, vitaminas, sais minerais, aminoácidos

essenciais. Além de alto conteúdo de lipídios, podendo chegar a mais de 50%, em base

seca, quando cultivada em meio com baixos níveis de nitrogênio (PIORRECK, BAASCH e

POHL, 1984). Em sua composição estão ainda presentes 18 aminoácidos essenciais

importantes na biossíntese das proteínas. A chlorella também é rica em vitaminas do

complexo B, principalmente a B

, vital na formação e regeneração das células sangüíneas

que, juntamente com o ferro, fazem desta alga um produto indicado no tratamento e

prevenção de anemia.

Visando estimar o aporte de compostos funcionais, especialmente antioxidantes em

suplemento alimentar disponível comercialmente, o objetivo deste trabalho foi determinar a

composição centesimal, o pH, a acidez e o teor de compostos fenólicos da microalga

chlorella extraído com metanol.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1. Reagentes

Os solventes e reagentes empregados foram analiticamente puros (P.A). O reagente

de Folin-Ciocalteau pertencia a Polipur e a Tirosina a marca Sigma.

2.2. Amostra

A microalga chlorella foi obtida na forma de pastilhas, em estabelecimento comercial

de lojas especializadas em produtos alimentícios especiais na cidade de Rio Grande – RS.

As pastilhas foram moídas com o auxílio de grau e pistilo até ficarem na forma de pó com

granulometria 0,35 mm.

2.3. Caracterização da Amostra

Os teores de umidade da microalga chlorella foram determinados em estufa com

circulação de ar da marca QUIMIS sob temperatura de 105°C. Os percentuais de cinzas

foram determinados pelo método gravimétrico em mufla 550°C. Os níveis protéicos foram

determinados pelo método de micro-kjeldahl, empregando como fator de conversão de

nitrogênio o valor de 6,25, para a microalga chlorella. Todos os métodos seguiram a

metodologia da AOAC (2000), com exceção de fibras brutas determinadas conforme o

método do INTERLAB VI (CIENTEC, 1991).

A determinação de lipídios foi realizada pelo método de Bligh & Dyer (1959),

adaptado para os teores de umidade da microalga. Os açúcares redutores da microalga

chlorella foram determinados por diferença. Os métodos estão descritos em detalhes no

ANEXO 2.

2.4. Propriedades Eletroquímicas

O pH da microalga chlorella foi determinado conforme AOAC (2000). Esta foi

homogeneizada em água previamente fervida na proporção de 1:9, sob agitação por 30

minutos. No sobrenadante foi determinado o pH potenciometricamente, utilizando um

pHmetro marca Hanna modelo 200, calibrado com tampão fosfato neutro (pH 7,0).

A acidez foi determinada por titulometria de neutralização com NaOH 0,01N. Os

métodos estão descritos em detalhes no ANEXO 2.

2.5. Determinação do teor de fenóis totais

A extração dos compostos fenólicos da microalga chlorella foi realizado a frio com

metanol, na proporção de 1:5 de massa seca:solvente, em agitador horizontal a temperatura

ambiente, seguida da partição com hexano, clarificação com hidróxido de bário 0,1M e

sulfato de zinco 5% e filtração. Os extratos foram armazenados em freezer até quantificação

e/ou posterior uso. O conteúdo de fenóis totais da microalga chlorella foi determinado

através do método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, com uma curva de calibração

de tirosina, com faixa de concentração variando de 2 a 16µg/mL (BADIALE-FURLONG et

al., 2003). O método esta descrito em detalhes no ANEXO.

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

No comércio estavam disponíveis várias marcas de chlorella com preço variável em

uma ampla faixa de valores. Considerando que o material para a produção de pastilhas é

importado e que não são muito difundidos os cultivos desta espécie foi escolhido a marca de

maior valor comercial para a amostragem.

As determinações de componentes físico-químicos da microalga chlorella foram

todas realizadas em triplicatas, e os resultados das médias foram os seguintes: 4,1% de

umidade; 6,3% de cinzas; 22,3% de carboidratos; 2,8% de fibra-bruta; 56,9% de proteína;

7,6 de lipídios; 0,2% de acidez e pH 5,7. Os valores encontrados para a microalga chlorella

são condizentes com a literatura levando-se em conta as diferentes condições de

apresentação (pastilhas, pó, cápsulas e etc) (HENRIKSON, 1994). A média do conteúdo de

compostos fenólicos do extrato da microalga chlorella encontrado foi de 0,20 mg

fenóis

(bs)

Comparativamente a outros tecidos mencionados pela literatura, como funcionais

pelo seu conteúdo fenólico, como banana 0,31 mg fenóis/ g amostra, maçã 1,0 mg fenóis/ g

amostra e batata 0,99 mg fenóis/ g amostra (equivalente de tirosina), 0,061-0,084 mg fenóis/

g de amostra (ácido ferúlico) (ZHOU et al., 2004), 0,69 e 0,35 mg fenóis/ g de amostra em

bagaço de laranja e polpa de berinjela (BADIALE-FURLONG et al., 2003), a microalga

chlorella apresenta menor conteúdo fenólico.

4. CONCLUSÃO

As médias dos valores encontrados foram 4,1% de umidade; 6,3% de cinzas; 22,3%

de carboidratos; 2,8% de fibra-bruta; 56,9% de proteína; 7,6 de lipídios; 0,2% de acidez e

pH 5,7. Os valores encontrados para a microalga chlorella são condizentes com a literatura.

A média do conteúdo de compostos fenólicos do extrato da microalga chlorella encontrado

foi de 0,20 mg

fenóis

(bs)

, valor inferior a alguns tecidos mencionados na literatura.

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CAPÍTULO IV

4. CONCLUSÃO GERAL

As condições ótimas de extração de compostos fenólicos totais empregando duas

etapas de planejamento experimental para emprego das variáveis, solvente, tempo de

extração, rotação e tempo com e sem interrupções do processo de extração, apresentou

resultados preditivos e significativos para o conteúdo de fenóis totais. As condições

otimizadas ocorriam quando foi utilizado o metanol, tempo de extração de 120 minutos e a

rotação de 3,13 G em mesa agitadora orbital. Sendo que a classe 4 foi a melhor para

incorporar fenol na dieta com um conteúdo de 2387,6 µg fenóis/ g de cebola.

As diferentes classes de cebola apresentaram diferença significativa ao nível de

confiança de 95%, entre todas as frações dos macrocomponentes estudadas, com exceção

da umidade e dos teores de cinzas.

Os extratos da cebola obtidos com os diferentes solventes continham uma faixa

ampla de compostos fenólicos totais variando entre 0,08 no extrato aceto-etílico e 2,83 mg

fenóis

/g amostra no extrato aquoso. Nos extratos de chlorella a média do conteúdo de

compostos fenólicos encontrados foi de 0,20 mg

fenóis

/g amostra.

Todos os extratos apresentaram atividade seqüestradora do radical livre DPPH,

porém o extrato aceto etílico de cebola foi o que apresentou maior inibição específica (53%

inibição/µg fenóis) em relação aos demais.

As velocidades máximas da reação de escurecimento enzimático diminuíram em

presença dos extratos de cebola e chlorella, o que caracteriza o efeito de inibição da

oxidação do guaiacol catalisado pelas peroxidases extraídas da batata. Os aceto etílicos de

cebola e os de chlorella ocasionaram inibição não-competitiva, os extratos metanólicos e os

aquosos apresentaram inibição competitiva.

O extrato mais promissor para evitar a oxidação ocasionada pela catálise metálica

em sistema lipídico foi o extrato de cebola extraído com acetato de etila com uma inibição

percentual de 53% acompanhado pela menor formação de peróxido (até três vezes menor)

e de malonaldeído (1,5 vezes menor) ao longo do tempo do experimento.

CAPÍTULO V

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS

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100

ANEXOS

101

ANEXO 1 - Tabelas e figuras do artigo 1

Tabela 1: Valores de conteúdo de fenóis (µg fenóis/g de cebola) para o planejamento fatorial

e 6 pontos centrais.

Ensaios

Solvente

Intervalo descanso(min)

Rotação(G)

Tempo(min)

Fenóis(µgfenois/g cebola)

1 Metanol

0(-1) 0,78(-1) 120(-1) 1556,6

2 Metanol

30(+1) 0,78(-1) 120(-1) 1767,6

3 Metanol

0(-1) 3,13(+1) 120(-1) 2363,6

4 Metanol

30(+1) 3,13(+1) 120(-1) 2372,4

5 Metanol

0(-1) 0,78(-1) 180(+1) 2263,2

6 Metanol

30(+1) 0,78(-1) 180(+1) 2131,4

7 Metanol

0(-1) 3,13(+1) 180(+1) 2119,6

8 Metanol

30(+1) 3,13(+1) 180(+1) 2238,5

9 Acet etl

0(-1) 0,78(-1) 120(-1) 97,1

10 Acet etl

30(+1) 0,78(-1) 120(-1) 63,1

11 Acet etl

0(-1) 3,13(+1) 120(-1) 95,1

12 Acet etl

30(+1) 3,13(+1) 120(-1) 85,3

13 Acet etl

0(-1) 0,78(-1) 180(+1) 88,9

14 Acet etl

30(+1) 0,78(-1) 180(+1) 82,4

15 Acet etl

0(-1) 3,13(+1) 180(+1) 45,9

16 Acet etl

30(+1) 3,13(+1) 180(+1) 49,3

17 Metanol

15(0) 1,76(0) 150(0) 2160,9

18 Metanol

15(0) 1,76(0) 150(0) 2101,5

19 Metanol

15(0) 1,76(0) 150(0) 2134,3

20 Acet etl

15(0) 1,76(0) 150(0) 81,6

21 Acet etl

15(0) 1,76(0) 150(0) 80,4

22 Acet etl

15(0) 1,76(0) 150(0) 81,8

102

Tabela 2: Efeitos e coeficientes para as variáveis obtidas pelo tratamento estatístico.

Efeito Desvio padrão

Média/interação

1093,66

239,5349 0,006025

(1)Solvente (L)

-2025,73

561,7592 0,015445

(2)Intervalo (L)

20,00 561,7592 0,972977

(3)Rotação (L) 164,93 561,7592 0,780870

(4)Tempo(L) 77,30 561,7592 0,895923

1L com 2L -31,73 561,7592 0,957151

1L com 3L -178,90

561,7592 0,763006

1Lcom 4L -95,82 561,7592 0,871242

2L com 3L 10,32 561,7592 0,986047

2L com 4L -24,00 561,7592 0,967576

3L com 4L -193,07

561,7592 0,745055

Tabela 3: Valores de conteúdo de fenóis (µg fenóis/g de cebola) para o planejamento fatorial

e 3 pontos centrais.

Ensaios

Intervalo descanso(min)

Rotação(G)

Tempo(min)

Fenóis(µgfenóis/g de cebola)

1 0(-1) 0,78(-1) 120(-1) 1556,6

2 30(+1) 0,78(-1) 120(-1) 1767,6

3 0(-1) 3,13(+1) 120(-1) 2363,6

4 30(+1) 3,13(+1) 120(-1) 2372,4

5 0(-1) 0,78(-1) 180(+1) 2263,2

6 30(+1) 0,78(-1) 180(+1) 2131,4

7 0(-1) 3,13(+1) 180(+1) 2119,6

8 30(+1) 3,13(+1) 180(+1) 2238,5

9 15(0) 1,76(0) 150(0) 2160,9

10 15(0) 1,76(0) 150(0) 2101,5

11 15(0) 1,76(0) 150(0) 2134,3

103

Tabela 4: Efeitos e coeficientes para as variáveis obtidas pelo tratamento estatístico

Efeito

Desvio

padrão

Média/Interação 2109,964

8,97113 0,000018

(1)INTERVALO(L)

51,725 21,03917

0,133181

(2)ROTAÇÃO (L) 343,825 21,03917

0,003724

(3)TEMPO(L) 173,125 21,03917

0,014449

1L com 2L 12,125 21,03917

0,622622

1L com 3L -58,175 21,03917

0,109689

2L com 3L -362,075 21,03917

0,003359

Tabela 5: Coeficiente de regressão para as variáveis significativas obtidas pelo tratamento

estatístico

Coef.

regressão

Desvio

padrão

Média/interação

2109,964 8,97113 0,000018

(2)Rotação(L) 171,913 10,51958

0,003724

(3)Tempo (L) 86,563 10,51958

0,014449

2L com 3L -181,037 10,51958

0,003359

Tabela 6: Dados de ANOVA para planejamento experimental avaliando rotação, tempo e

interação da rotação com o tempo

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Grau

Liberdade

Média

quadrática

Teste F F

tab (95%)

Fcalc/Ftab

Regressão 558572,4 3 186190,8 31,1 4,35 7,15

Resíduo 41869,8 7 5981,4

Falta de ajuste

40099,2

Erro puro 1770,6

Total 600442,2 10

Tabela 7: Conteúdo de fenóis totais em cebola nas diferentes classes

Classes Conteúdo (µg fenóis/ g de cebola)

Classe 2 2265,9

Classe 3 2244,3

Classe 4 2306,4

Classe 5 2282,9

Letras iguais indicam que não há diferença significativa pelo teste de Tukey (p < 0,05)

104

Tabela 8: Teste de Tukey entre as variações médias dos fenóis extraídos com metanol nas

diferentes classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 2265,9 2244,3 2306,4 2282,9

Classe 2 {1} 0,001492 0,000242 0,010301

Classe 3 {2} 0,001492 0,000231 0,000242

Classe 4 {3} 0,000242 0,000231 0,001480

Classe 5 {4} 0,010301 0,000242 0,001480

105

Superfície de resposta e condições de contorno para os fenóis

1300

1200

1100

1000

(a)

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Rotação (rpm)

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Tempo (min)

(b)

Figura 1: Superfície de resposta (a) e curva de contorno para fenóis (b)

106

80 100 120 140 160 180

2100

2150

2200

2250

2300

2350

2400

2450

Conteudo de Fenois(µg/g de cebola)

Tempo de extração (min)

Figura 2: Cinética de rendimento de extração de fenóis por tempo

107

ANEXO 2 - Descrição dos Procedimentos Analíticos e Tabelas Estatísticas do Artigo 2

Determinação de Umidade

- Colocar as cápsulas de alumínio em estufa de circulação de ar da marca QUIMIS a 60°C

durante 1 hora;

- Após colocar num dessecador e pesar no momento do uso;

- Pesar 5 gramas de cebola;

- Colocar estas em estufa de circulação de ar da marca QUIMIS a 60°C durante 6 horas;

- Colocar as amostras num dessecador até atingir a temperatura ambiente;

- Pesar as cápsulas novamente.

Determinação de Cinzas

- Tarar os cadinhos de porcelana;

- Colocar 3 gramas da amostra seca ou com teor de umidade inferior a 30%;

- Efetuar a calcinação da amostra em capela;

- Transferir o cadinho de porcelana para uma mufla a 550°C e deixar até que as cinzas

estejam brancas;

- Desligar a mufla e quando estiver 250°C retirar os cadinhos e colocar num dessecador

para o sue resfriamento;

- Pesar o conjunto amostra + cadinho até atingir peso constante;

- Calcular a relação percentual entre a massa final e a massa inicial da amostra.

Determinação de Proteínas em Tecidos Vegetais, segundo Método de Kjeldahl

Preparo dos reagentes:

a) Padronização do HCl

- Colocar 2 gramas de Na

para secar em estufa a 300°C por 1 hora;

- Pesar 0,15 gramas e adicionar 25 mL de água (fazer quadruplicata deste procedimento);

- Adicionar 4 gotas de indicador misto;

OBS: o indicador misto é mistura das soluções alcoólicas de vermelho de metila 0,1% e

vermelho de bromocresol 0,1%, proporção 1:1.

- Titular com HCl 0,1N

108

Cálculo do fator de correção:

Fator = Pc x 1000 Pc = peso do carbonato

V x 5,2995 V = volume gasto de HCl

b) Ácido bórico 4%

- Pesar 40 gramas de ácido bórico e levar a um balão de 1000 mL completando o volume

com água destilada.

c) Hidróxido de Sódio 40%

- Pesar 400 gramas de hidróxido de sódio e diluir em um béquer aos poucos com água

destilada (em banho de gelo), transferir para um balão volumétrico de 1L e completar o

volume com água destilada.

Procedimento de digestão e destilação:

Em um tubo de digestão colocar 0,2 gramas de amostra embrulhada em papel de

seda ou filtro, juntar 0,7 gramas de catalisador (3 gramas de sulfato de potássio e 0,03

gramas de selênio em pó). Adicionar 3 mL de peróxido de hidrogênio e 7 mL de ácido

sulfúrico (adicionar o ácido aos poucos). Colocar os tubos em um bloco digestor e efetuar a

digestão a quente até a solução se tornar clara. Após esta etapa, esfriar a solução a

temperatura ambiente.

Destilar em um destilador de arraste a vapor todo o conteúdo do digerido passando

para o recipiente coletor do destilador. Adicionar 50 mL de NaOH 40%, para conferir a

neutralidade do meio adicionar 3 gotas de indicador de fenolftaleína na mistura. Recolher o

destilado em um erlenmeyer contendo 10 mL de acido bórico 4% (adicionado de 4 gotas de

indicador misto), coletar 125 mL e titular com HCL 0,1N padronizado até viragem do

indicador.

Determinação de Fibra Bruta

- Pesar 2 gramas de amostra conforme o teor de fibra bruta estimada em relação a amostra

analisada (consultar a literatura ou pelos teores dos componentes maiores);

- Adicionar 200 mL de ácido sulfúrico 1,25% em ebulição (sistema de refluxo) e algumas

gotas de solução anti-espumante (álcool amílico/ isoamílico – 5 gotas).

- Deixar em refluxo por exatamente 30 minutos;

- Filtrar quantitativamente sob vácuo em funil de Buchner provido de tela de náilon, ou

poliéster, ou aço inox, ou cadinho de vidro sintetizado em sistema automático de filtração;

- Lavar o resíduo com água fervente até completa neutralização;

109

- Passar o resíduo quantitativamente para o erlenmeyer já usado, lavando a tela ou o

recipiente filtrante com 200 mL de NaOH 1,25N em ebulição, adicionar algumas gotas de

solução anti-espumante;

- Deixar em refluxo por exatamente 30 minutos;

- Filtrar diretamente em cadinho de vidro sintetizado ou no sistema filtrante adotado

utilizando água destilada para a transferência;

- Lavar com aproximadamente 20 mL de álcool etílico ou acetona e 20 mL de acetona ou

éter de petróleo;

- Colocar em estufa a 105°C até peso constante (4 a 6 horas), retirar, deixar em dessecador

até temperatura ambiente e pesar;

- Queimar em mufla a 560°C por 3 horas (colocar o cadinho na mufla ainda fria e então

iniciar o aquecimento);

- Desligar a mufla e quando estiver a 250°C retirar o cadinho, colocar em dessecador, deixar

esfriar até temperatura ambiente e pesar;

Determinação de pH

- Pesar 10 gramas de amostra;

- Homogeneizar em água destilada previamente fervida na proporção 1:9, sob agitação por

30 minutos;

- Determinar no sobrenadante o pH potenciometricamente, utilizando um pHmetro marca

Hanna modelo 200.

Determinação de Acidez

- Pesar 5 gramas de amostra e diluir com água destilada na proporção de 1:10,

- Agitar em mesa agitadora orbital TE - 141 da marca TECNAL por 30 minutos e repousar

por 10 minutos;

- Filtrar e retirar uma alíquota de 10 mL;

-Transferir a alíquota para um erlenmeyer e adicionar 10 mL de água destilada e

previamente fervida.

- Homogeneizar a amostra e adicionar 0,5 mL de fenolftaleína como indicador;

- Titular com uma solução padrão de NaOH até mudança de coloração.

110

Determinação de Lipídios em Cebola e Chlorella - Método de Bligh & Dyer (1959)

adaptado.

- Pesar 10 gramas da amostra (até 10% de umidade);

- Colocar a amostra em um erlenmeyer de 250 mL e adicionar 50 mL de metanol, 25 mL de

clorofórmio e 30 mL de água;

- Tampar o erlenmeyer e colocá-lo sob agitação rigorosa em mesa agitadora por 20 minutos;

- Em seguida, adicionar mais 25 mL de clorofórmio e 25 mL de solução de sulfato de sódio

1,5%;

- Agitar a mistura por mais 4 minutos;

- Filtrar;

- Transferir o filtrado para um funil de separação, onde ocorrerá a formação do sistema

bifásico;

- Agitar e deixar em repouso por 5 minutos;

- Remover a camada inferior (que contém os lipídios) para um erlenmeyer de 125 mL;

- Medir o volume da camada inferior, Valor:___________

- Retirar uma alíquota de 6 mL e transferir para uma balão de fundo chato para a

quantificação dos lipídios totais,

- Evaporar o solvente em rotaevaporador e colocar o balão em estufa com circulação de ar a

50°C por 1hora e 30 minutos;

- Retirar da estufa e colocar o balão em dessecador para resfriar por 20 minutos;

- Pesar o balão com a amostra em balança analítica;

- Estimar o conteúdo de lipídios em percentual relativo massa inicial da amostra e/ou volume

de clorofórmio obtido.

Determinação de açúcares em cebolas (Allium cepa L.) utilizando a propriedade

redutora através do método de redução do ácido 3,5 dinitrossalicílico (DNS).

Esta análise foi efetuada baseada no método de MILLER (1959), conforme as

seguintes etapas:

111

1ª etapa) Preparo da amostra:

- Pesar 10 gramas de cebola (seca)

-Colocar a cebola seca (10g) em béquer e adicionar 40 mL de água destilada, levando-se a

banho-maria por 30 minutos a 50°C.

- Passar a solução do béquer para balão volumétrico de 100 mL, adicionar 10 mL da

solução de Carrez I e 10 mL da solução de Carrez II, completando a seguir o volume do

balão (até 100 mL) com água destilada.

- Centrifugar a solução obtida (suspensão turva e floculada) até se obter a perfeita

separação das fases lípida (sobrenadnate) e a suspensão turva e floculada (precipitado).

- Recolher o sobrenadante em proveta e tomar nota do volume obtido, o qual é o volume da

amostra preparada para os ensaios de hidrólise ácida (VOLUME DA AMOSTRA

PREPARADA).

2ª etapa) Determinação da curva padrão de glicose:

- Preparar uma solução estoque de 0,5 mg/mL de glicose padrão seca (levada a estufa e

dessecador).

- Num conjunto de 10 tubos de ensaio, transferir 0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL, 0,4 mL, 0,5 mL, 0,6

mL, 0,7 mL, 0,8 mL, 0,9 mL e 1 mL para cada tubo e, em seguida, adicionar água destilada

elevando o volume a 1 mL. Na seqüência, adicionar 1 mL da solução do ácido 3,5

dinitrossalicílico a estes, como também ao branco da análise. Colocar os tubos de ensaio

em banho-maria a 100°C por 5 minutos. Finalizado o período, retirar os tubos de ensaio e

adicionar 8 mL de água destilada em cada tubo.

- Deixar as alíquotas esfriar e em seguida fazer as leituras das suas respectivas

absorbâncias em espectrofotômetro a 546 nm.

3ª etapa) Hidrólise ácida dos açúcares contidos na amostra preparada:

Num conjunto de 6 tubos de ensaio transferir 1 mL da solução obtida na primeira

etapa, adicionar 1 mL de HCl 2N, como também ao branco, e colocar em banho-maria por

40 minutos. Logo em seguida, adicionar 1 mL de NaOH 2N a todos os tubos.

4ª etapa) Determinação dos açucares da amostra:

Após a hidrólise ácida se aplica o mesmo tratamento dado as alíquotas da solução

de glicose preparadas para a determinação da curva padrão, ou seja, adicionar 1 mL da

solução do ácido 3,5 dinitrossalicílico a estes, como também ao branco da análise. Colocar

os tubos de ensaio em banho-maria a 100°C por 5 minutos. Finalizado o período, retirar os

tubos de ensaio e adicionar 6 mL de água destilada em cada tubo. Deixar as alíquotas

112

esfriar e logo em seguida se faz a leitura das suas respectivas absorbâncias em

espectrofotômetro a 546 nm.

Preparo dos reagentes:

a) Reagente de 3,5 dinitrossalicílico:

Preparar as seguintes soluções:

- Solução A: 13,5 g de NaOH em 300 mL de água destilada.

- Solução B: 8,8 g de DNS, 255 g de tartarato de sódio e potássio em 800 mL de água

destilada (dissolver o reagente de 3,5 DNS em 400 mL de água e depois adicionar aos

poucos a solução de tartarato).

- Solução C: mistura das soluções A e B.

b) Soluções de Carrez I e II:

- Carrez I: 150 g de K

Fe(CN)

, completando o volume em balão volumétrico de 1 L.

- Carrez II: 300 g de ZnSO

completando o volume em balão volumétrico de 1 L.

Preparação dos Extratos de Cebola e Chlorella

Extrato de Cebola

- Secar as cebolas em estufa de circulação de ar da marca QUIMIS a 60°C durante duas

horas;

- Pesar 10 gramas de cebola

- Adicionar 50 mL de solvente (metanol, ou acetato de etila ou água)

- Agitar durante 2 horas consecutivas a temperatura ambiente em mesa agitadora orbital TE

141 da marca Tecnal;

- Filtrar o extrato com papel filtro n° 1

- Clarificar com 10 mL de hidróxido de bário 0,1M e 10 mL de sulfato de zinco 5%;

- Filtrar a solução novamente e transferir quantitativamente para um balão volumétrico de

100 mL;

- Completar o volume final com o solvente utilizado na extração.

Extrato de Chlorella

- Pesar 5 gramas da microalga chlorella;

- Adicionar 30 mL de metanol;

113

- Agitar a temperatura ambiente em mesa agitadora orbital TE – 141 da marca TECNAL

durante uma hora;

- Interromper a agitação por 15 minutos;

- Reiniciar após a adição de 20 mL de metanol, durante uma hora.

- Filtrar o extrato;

- Colocar o extrato num funil de separação e lavar cinco vezes com 10 mL de hexano;

- Transferir o extrato para balão de fundo chato e evaporar o solvente;

- Ressuspender os resíduos do balão com 40 mL de água;

- Clarificar o extrato com 10 mL de hidróxido de bário 0,1M e 10 mL de sulfato de zinco 5%;

- Deixar em repouso durante 20 minutos;

- Filtrar para um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com o solvente utilizado

na extração.

Metodologia para Determinação de Fenóis Totais na Cebola

Reagentes:

- Solução Alcalina: mistura das soluções Na

4%, CuSO

2% e Tartarato duplo de sódio

e potássio 4% nas proporções 100:1:1, respectivamente. Filtrar a solução de carbonato de

sódio 4% em papel Whatman n°1 antes de adicionar o tartarato duplo de sódio e potássio

4% e o sulfato de cobre 2%.

Curva Padrão de Quercetina

A partir de uma solução padrão de Quercetina 100 µg.mL-1, seguir o procedimento

da Tabela 1.

114

Tabela 1: Procedimento da curva padrão de quercetina

Tubo Quercetina (mL) Água (mL) Solução Alcalina (mL)

1 0 1,0 4,5

2 0,1 0,9

4,5

3 0,2 0,8

4,5

4 0,3 0,7

4,5

5 0,4 0,6

4,5

6 0,5 0,5 4,5

7 0,6 0,4

4,5

8 0,7 0,3 4,5

9 0,8 0,2 4,5

10 0,9 0,1 4,5

11 1,0 0 4,5

- Colocar os tubos em banho-maria a 40°C por 15 minutos;

- Adicionar 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocaleau diluído 1:2 (em água);

- Fazer a leitura da absorbância após 30 minutos utilizando comprimento de onda a 750 nm

Quantificação dos Fenóis Totais na Cebola

- Tomar quatro tubos de ensaio e colocar nestes 0,0; 0,3; 0,5; 0,8 e 1,0 mL de extrato;

- Completar o volume com 1 mL de água;

- Adicionar 4,5 mL da solução alcalina (Tabela 1);

- Deixar 15 minutos em banho-maria a 40°C;

- Adicionar a cada tubo 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau diluído 1:2 (água);

- Deixar em repouso durante 10 minutos a temperatura ambiente;

- Realizar a leitura da amostra em espectrofotômetro a 750 nm;

- Fazer triplicatas para todas as leituras.

115

Metodologia para determinação de fenóis totais na microalga chlorella

Reagentes:

- Solução Alcalina: mistura das soluções Na

4%, CuSO

2% e Tartarato duplo de sódio

e potássio 4% nas proporções 100:1:1, respectivamente. Filtrar a solução de carbonato de

sódio 4% em papel Whatman n°1 antes de adicionar o tartarato duplo de sódio e potássio

4% e o sulfato de cobre 2%.

Curva Padrão de Tirosina

A partir de uma solução padrão de tirosina 100 µg.mL

-1

, seguir o procedimento da

Tabela 2.

Tabela 2: Procedimento da curva padrão de tirosina

Tubo Tirosina (mL) Água (mL) Solução Alcalina (mL)

1 0 1,0 4,5

2 0,1 0,9

4,5

3 0,2 0,8

4,5

4 0,3 0,7

4,5

5 0,4 0,6 4,5

6 0,5 0,5

4,5

7 0,6 0,4 4,5

8 0,7 0,3

4,5

9 0,8 0,2

4,5

10 0,9 0,1

4,5

11 1,0 0

4,5

- Colocar os tubos em banho-maria a 40°C por 15 minutos;

- Adicionar 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocaleau diluído 1:2 (em água);

- Fazer a leitura da absorbância após 30 minutos utilizando comprimento de onda a 660 nm.

116

Quantificação dos Fenóis Totais na Microalga Chlorella

- Tomar quatro tubos de ensaio e colocar nestes 0,0; 0,3; 0,5; 0,8 e 1,0 mL de extrato;

- Completar o volume com 1 mL de água;

- Adicionar 4,5 mL da solução alcalina (Tabela 1);

- Deixar 15 minutos em banho-maria a 40°C;

- Adicionar a cada tubo 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau diluído 1:2 (água);

- Deixar em repouso durante 10 minutos a temperatura ambiente;

- Realizar a leitura da amostra em espectrofotômetro a 660 nm;

- Fazer triplicatas para todas as leituras.

Determinação da Atividade Específica da Catalase

Preparação do Extrato Enzimático

- Pesar 10 gramas de cebola;

- Homogeneizar em blender com 100 mL água destilada;

- Filtrar a amostra com algodão.

Atividade Enzimática da Catalase

- Adicionar uma alíquota de 4 mL do extrato enzimático a 2 mL de tampão fosfato pH 7 e

peróxido de hidrogênio 0,005M previamente padronizado com permanganato de potássio

0,01N;

- Colocar a solução obtida em banho-maria a 40°C durante 20 minutos;

- Interromper a reação pela adição de 5 mL de ácido sulfúrico 10%;

- Passar os conteúdos dos tubos para erlenmeyers e titular com permanganato de potássio

até a viragem do indicador;

- Expressar os resultados em atividade específica (mg de H

decomposta/min/mg

proteínas) para as quatro classes de cebolas comerciais.

Determinação do extrato enzimático da peroxidase e polifenoloxidase

- Pesar cerca de 20 gramas de cebola;

- Homogeneizar a amostra em blender com 100 mL de solução tampão fosfato 5,2mM, pH

5,2 durante 2 minutos;

- Filtrar a amostra com algodão;

117

- Retirar do sobrenadante uma alíquota de 25 mL e adicionar 25 mL de acetona para serem

agitados em mesa agitadora orbital TE 141 da marca Tecnal.;

- Interromper a agitação e adicionar mais 25 mL de acetona e agitar novamente por mais 5

minutos;

- Realizar este mesmo procedimento mais uma vez;

- Centrifugar por 8 minutos.

- Ressuspender o resíduo da centrifugação utilizando 25 mL de solução tampão fosfato

5mM, pH 5,2.

Determinação da Atividade Enzimática da Peroxidase

- Misturar 1 mL do extrato enzimático com 1,5 mL de solução tampão fosfato de sódio pH

5,5 e 1,5 mL de água destilada;

- Colocar a solução em banho-maria a 40°C durante 5 minutos para uniformizar a

temperatura;

- Acrescentar 1 mL de água oxigenada 0,08% e 1 mL de guaiacol 0,5%.

- Aguardar 10 minutos para realização das leituras;

- Realizar as leituras em espectrofotômetro UV-Visível Cary 100 Conc da Varian a 470 nm.

- Expressar os resultados em atividade específica (Abs/ min/mg proteínas) para as quatro

classes de cebolas comerciais.

Para o tempo zero adicionar a enzima, o tampão, a água destilada e ferver por 5 minutos

para inativar a enzima. Logo após deve-se adicionar o guaiacol e a água oxigenada.

Determinação da Atividade Enzimática da Polifenoloxidase

- Misturar 1 mL do extrato enzimático com 1,5 mL de solução tampão fosfato de sódio pH

6,0 e 2,5 mL de água destilada;

- Colocar a solução em banho-maria a 30°C durante 5 minutos para uniformizar a

temperatura;

- Acrescentar 1 mL de catecol 0,05M;

- Aguardar 10 minutos para realização das leituras;

- Realizar as leituras em espectrofotômetro UV-Visível Cary 100 Conc da Varian a 425 nm.

- Expressar os resultados em atividade específica (Abs/ min/mg proteínas) para as quatro

classes de cebolas comerciais.

118

Para o tempo zero adicionar a enzima, o tampão, a água destilada e ferver por 5 minutos

para inativar a enzima. Logo após deve-se adicionar o catecol.

TABELAS ESTATÍSTICAS UTILIZADAS NO ARTIGO 2:

Tabela 3: Teste de Tukey para umidade nas diferentes classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 88,5 88,4 88,3 88,6

Classe 2 {1} 0,742886 0,414172 0,975579

Classe 3 {2} 0,742886 0,925364 0,517532

Classe 4 {3} 0,414172 0,925364 0,250366

Classe 5 {4} 0,975579 0,517532 0,250366

Tabela 4: Teste de Tukey para cinzas nas diferentes classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 0,75 0,73 0,76 0,75

Classe 2 {1} 0,805738 0,929411 0,998739

Classe 3 {2} 0,805738 0,480690 0,727349

Classe 4 {3} 0,929411 0,480690 0,967898

Classe 5 {4} 0,998739 0,727349 0,967898

Tabela 5: Teste de Tukey para proteína nas diferentes classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 0,86 1,04 0,98 0,91

Classe 2 {1} 0,000247 0,001148 0,066115

Classe 3 {2} 0,000247 0,024712 0,000659

Classe 4 {3} 0,001148 0,024712 0,040262

Classe 5 {4} 0,066115 0,000659 0,040262

119

Tabela 6: Teste de Tukey para fibra bruta nas diferentes classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 0,61 0,62 0,70 0,70

Classe 2 {1} 0,768002 0,000265 0,000299

Classe 3 {2} 0,768002 0,000334 0,000428

Classe 4 {3} 0,000265 0,000334 0,913114

Classe 5 {4} 0,000299 0,000428 0,913114

Tabela 7: Teste de Tukey para pH nas diferentes classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 5,23 5,08 5,2 5,16

Classe 2 {1} 0,008279 0,800907 0,257290

Classe 3 {2} 0,008279 0,27407 0,129869

Classe 4 {3} 0,027407 0,800907 0,693342

Classe 5 {4} 0,129869 0,257290 0,693342

Tabela 8: Teste de Tukey para acidez nas diferentes classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 0,31 0,38 0,31 0,29

Classe 2 {1} ,001550 1,000000 ,037275

Classe 3 {2} ,001550 ,001550 ,000263

Classe 4 {3} ,001550 1,000000 ,037275

Classe 5 {4} ,000263 ,037275 ,037275

Tabela 9: Teste de Tukey para lipídios nas diferentes classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 0,17 0,18 0,19 0,16

Classe 2 {1} ,656793 ,164718 ,445340

Classe 3 {2} ,656793 ,656793 ,095337

Classe 4 {3} ,656793 ,164718 ,018608

Classe 5 {4} ,095337 ,445340 ,018608

120

Tabela 10: Teste de Tukey para açúcares redutores nas diferentes classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 3,73 5,27 4,76 4,67

Classe 2 {1} ,000230 ,000230 ,000231

Classe 3 {2} ,000230 ,000518 ,000300

Classe 4 {3} ,000518 ,000230 ,585017

Classe 5 {4} ,000300 ,000231 ,585017

Tabela 11: Teste de Tukey para fenóis totais extraídos com metanol para as diferentes

classes de cebolas

{1} {2} {3} {4}

Média 2265,9 2244,3 2306,4 2282,9

Classe 2 {1} 0,001492 0,000242 0,010301

Classe 3 {2} 0,001492 0,000231 0,000242

Classe 4 {3} 0,000242 0,000231 0,001480

Classe 5 {4} 0,010301 0,000242 0,001480

Tabela 12: Teste de Tukey para fenóis totais extraídos com água para as diferentes classes

de cebolas

{1} {2} {3} {4}

Média 2840,3 2889,3 2784,6 2818,2

Classe 2 {1} 0,627639 0,534733 0,942531

Classe 3 {2} 0,627639 0,112888 0,346452

Classe 4 {3} 0,534733 0,112888 0,833747

Classe 5 {4} 0,942531 0,346452 0,833747

Tabela 13: Teste de Tukey para fenóis totais extraídos com acetato de etila para as

diferentes classes de cebolas

{1} {2} {3} {4}

Média 76,8 77,0 78,4 77,7

Classe 2 {1}

0,998690 0,649567 0,880894

Classe 3 {2} 0,998690

0,733657 0,934768

Classe 4 {3} 0,649567 0,733657

0,966713

Classe 5 {4} 0,880894 0,934768 0,966713

121

Tabela 14: Teste de Tukey para atividade específica da enzima catalase nas diferentes

classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 0,0256667 0,0240000 0,0146667 0,0176667

Classe 2 {1} 0,163900 0,000230 0,000235

Classe 3 {2} 0,163900 0,000231 0,000286

Classe 4 {3} 0,000230 0,000231 0,012195

Classe 5 {4} 0,000235 0,000286 0,012195

Tabela 15: Teste de Tukey para atividade específica da enzima peroxidase nas diferentes

classes de cebola

{1} {2} {3} {4}

Média 0,0306667 0,0033333 0,0263333 0,0250000

Classe 2 {1} 0,000230 0,160242 0,057545

Classe 3 {2} 0,000230 0,000231 0,000233

Classe 4 {3} 0,160242 0,000231 0,882395

Classe 5 {4} 0,57545 0,000233 0,882395

122

ANEXO 3 - Descrição dos Procedimentos Analíticos e Tabelas Estatísticas do Artigo 3

Preparação dos Extratos de Cebola e Chlorella

Extrato de Cebola

- Secar as cebolas em estufa de circulação de ar da marca QUIMIS a 60°C durante duas

horas;

- Pesar 10 gramas de cebola

- Adicionar 50 mL de solvente (metanol, ou acetato de etila ou água)

- Agitar durante 2 horas consecutivas a temperatura ambiente em mesa agitadora orbital TE

141 da marca Tecnal;

- Filtrar o extrato com papel filtro n° 1

- Clarificar com 10 mL de hidróxido de bário 0,1M e 10 mL de sulfato de zinco 5%;

- Filtrar a solução novamente e transferir quantitativamente para um balão volumétrico de

100 mL;

- Completar o volume final com o solvente utilizado na extração.

Extrato de Chlorella

- Pesar 5 gramas da microalga chlorella;

- Adicionar 30 mL de metanol;

- Agitar a temperatura ambiente em mesa agitadora orbital TE – 141 da marca TECNAL

durante uma hora;

- Interromper a agitação por 15 minutos;

- Reiniciar após a adição de 20 mL de metanol, durante uma hora.

- Filtrar o extrato;

- Colocar o extrato num funil de separação e lavar cinco vezes com 10 mL de hexano;

- Transferir o extrato para balão de fundo chato e evaporar o solvente;

- Ressuspender os resíduos do balão com 40 mL de água;

- Clarificar o extrato com 10 mL de hidróxido de bário 0,1M e 10 mL de sulfato de zinco 5%;

- Deixar em repouso durante 20 minutos;

- Filtrar para um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com o solvente utilizado

na extração.

123

Metodologia para Determinação de Fenóis Totais na Cebola

Reagentes:

- Solução Alcalina: mistura das soluções Na

4%, CuSO

2% e Tartarato duplo de sódio

e potássio 4% nas proporções 100:1:1, respectivamente. Filtrar a solução de carbonato de

sódio 4% em papel Whatman n°1 antes de adicionar o tartarato duplo de sódio e potássio

4% e o sulfato de cobre 2%.

Curva Padrão de Quercetina

A partir de uma solução padrão de Quercetina 100 µg.mL-1, seguir o procedimento

da Tabela 1.

Tabela 1: Procedimento da curva padrão de quercetina

Tubo Quercetina (mL) Água (mL) Solução Alcalina (mL)

1 0 1,0 4,5

2 0,1 0,9

4,5

3 0,2 0,8

4,5

4 0,3 0,7

4,5

5 0,4 0,6

4,5

6 0,5 0,5

4,5

7 0,6 0,4

4,5

8 0,7 0,3 4,5

9 0,8 0,2

4,5

10 0,9 0,1 4,5

11 1,0 0

4,5

- Colocar os tubos em banho-maria a 40°C por 15 minutos;

- Adicionar 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau diluído 1:2 (em água);

- Fazer a leitura da absorbância após 30 minutos utilizando comprimento de onda a 750 nm.

124

Quantificação dos Fenóis Totais na Cebola

- Tomar quatro tubos de ensaio e colocar nestes 0,0; 0,3; 0,5; 0,8 e 1,0 mL de extrato;

- Completar o volume com 1 mL de água;

- Adicionar 4,5 mL da solução alcalina (Tabela 1);

- Deixar 15 minutos em banho-maria a 40°C;

- Adicionar a cada tubo 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau diluído 1:2 (água);

- Deixar em repouso durante 10 minutos a temperatura ambiente;

- Realizar a leitura da amostra em espectrofotômetro a 750 nm;

- Fazer triplicatas para todas as leituras.

Metodologia para determinação de fenóis totais na microalga chlorella

Reagentes:

- Solução Alcalina: mistura das soluções Na

4%, CuSO

2% e Tartarato duplo de sódio

e potássio 4% nas proporções 100:1:1, respectivamente. Filtrar a solução de carbonato de

sódio 4% em papel Whatman n°1 antes de adicionar o tartarato duplo de sódio e potássio

4% e o sulfato de cobre 2%.

Curva Padrão de Tirosina

A partir de uma solução padrão de tirosina 100 µg.mL

-1

, seguir o procedimento da

Tabela 2.

125

Tabela 2: Procedimento da curva padrão de tirosina

Tubo Tirosina (mL) Água (mL) Solução Alcalina (mL)

1 0 1,0 4,5

2 0,1 0,9

4,5

3 0,2 0,8

4,5

4 0,3 0,7

4,5

5 0,4 0,6

4,5

6 0,5 0,5 4,5

7 0,6 0,4

4,5

8 0,7 0,3 4,5

9 0,8 0,2

4,5

10 0,9 0,1

4,5

11 1,0 0

4,5

- Colocar os tubos em banho-maria a 40°C por 15 minutos;

- Adicionar 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau diluído 1:2 (em água);

- Fazer a leitura da absorbância após 30 minutos utilizando comprimento de onda a 660 nm.

Quantificação dos Fenóis Totais na Microalga Chlorella

- Tomar quatro tubos de ensaio e colocar nestes 0,0; 0,3; 0,5; 0,8 e 1,0 mL de extrato;

- Completar o volume com 1 mL de água;

- Adicionar 4,5 mL da solução alcalina (Tabela 1);

- Deixar 15 minutos em banho-maria a 40°C;

- Adicionar a cada tubo 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau diluído 1:2 (água);

- Deixar em repouso durante 10 minutos a temperatura ambiente;

- Realizar a leitura da amostra em espectrofotômetro a 660 nm;

- Fazer triplicatas para todas as leituras.

126

Índice de Peróxido

Reagentes:

- Solução ácido acético-clorofórmio (3:2);

- Solução saturada de KI (tem que ser preparada na hora): colocar 144g KI e completar com

100 mL de água;

- Solução Tiossulfato de sódio 0,1N (padronizado com K

CrO

);

- Solução de amido 1% (tem que ser preparada na hora): 1g de amido (indicador) em 100

mL de água.

Padronização de tiossulfato de potássio com dicromato de potássio:

- Pesar 0,14-0,16 gramas de dicromato de potássio;

- Colocar em erlenmeyer de 250 mL;

- Colocar 50 mL de água (previamente fervida) – temperatura ambiente;

- Agitar;

- 2 gramas de iodeto de potássio;

- 8 mL de ácido clorídrico concentrado;

- Titular – bureta 50 mL com solução padrão de tiossulfato, ao observar mudança de

coloração (castanho → amarelo), adicionar 2 mL de solução de amido (indicador) e continua

titulação (azul → verde).

Método:

- Pesar 5 gramas de amostra em erlenmeyer de 250 mL;

- Adicionar 30 mL da solução ácido acético-clorofórmio;

- Agitar para dissolução da amostra;

- Adicionar 0,5 mL da solução de KI saturada e agitar

- Deixar em repouso por 1 minuto no escuro;

- Adicionar 30 mL de água destilada previamente fervida e fria e agitar;

- Adicionar 0,5 mL de solução de amido;

- Titular com solução de tiossulfato de sódio 0,1N até o desaparecimento da cor azul.

127

Método Ácido Tiobarbitúrico

- Pesar a amostra em balança analítica;

- Adicionar 30 mL de TCA 7,5% (homogeneizar primeiramente com uma parte desse

volume, e a seguir adicionar o restante);

- Filtrar, descartar o precipitado, reservando o filtrado, do filtrado coletar alíquota de 5 mL e

transferir para tubos de ensaio (em triplicata);

- Adicionar 5 mL de TBA (0,02M) aos tubos de ensaio;

- Branco: em tubos de ensaio adicionar 5 mL de TBA e 5 mL de TCA 7,5%

- Levar todos os tubos para banho a 100°C, por 40 minutos, a seguir resfriar em banho de

água. Ler em espectrofotômetro a 538 nm.

Curva padrão de TMP:

Reagentes e soluções:

- Solução aquosa de TCA 7,5%

- Solução aquosa de TBA 0,02M

- Reagente TMP (1,1- 3,3 – tetra metoxipropano) padrão

- Solução estoque de TMP: pesar 0,1659g de TMP e transferir para balão de 100 mL com

TCA 7,5% e completar o volume;

- Solução diluída de TMP: volume de 0,1mL da solução estoque e completar o volume para

50 mL com TCA 7,5.

Adicionar a cada tubo as alíquotas a seguir, fechar tubos.

128

Tabela 3: Procedimento da curva padrão de TMP

Tubos TMP (mL) [TMP] (M) TCA (mL)

Branco 0,0 0 5,0

1 0,5 1,01x 10

-8

4,5

2 1,0 2,02x 10

-8

4,0

3 1,5 3,03x 10

-8

3,5

4 2,0 4,04x 10

-8

3,0

5 2,5 5,05x 10

-8

2,5

6 3,0 6,06x 10

-8

2,0

7 3,5 7,07x 10

-8

1,5

8 4,0 8,08x 10

-8

1,0

9 4,5 9,09x 10

-8

0,5

10 5,0 10,10x 10

-8

0,0

- Adicionar a cada tubo, 5 mL da solução TBA

- Fechar a tampa e aquecer em banho de água fervente por 40 minutos (colocar os tubos

somente quando a água estiver fervendo, e marcar o tempo).

- Após completar o tempo, imediatamente resfriar, sob água corrente (10 minutos são

suficientes)

- Fazer a leitura a 538 nm

129

TABELAS ESTATÍSTICAS UTILIZADAS NO ARTIGO 3:

Tabela 4: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 100 µL

de extrato em 15 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 16,733 9,8667 4,0667 ,17000 10,567

Ceb. metanol

0,000187 0,000176 0,000176 0,000219

Ceb. água 0,000187 0,000260 0,000176 0,877752

Ceb. Acetato 0,000176 0,000260 0,002992 0,000199

Chlorella 0,000176 0,000176 0,002992 0,000176

Quercetina 0,000219 0,877752 0,000176 0,000176

Tabela 5: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 100 µL

de extrato em 30 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 20,733 12,400 4,1667 1,7533 14,500

Ceb. metanol

0,000180 0,000176 0,000176 0,000304

Ceb. água 0,000180 0,000180 0,000176 0,166359

Ceb. Acetato 0,000176 0,000180 0,095223 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,095223 0,000176

Quercetina 0,000304 0,166359 0,000176 0,000176

130

Tabela 6: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 100 µL

de extrato em 45 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 22,300 13,423 3,6000 2,5000 14,733

Ceb. metanol

0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. água 0,000176 0,000176 0,000176 0,024773

Ceb. Acetato 0,000176 0,000176 0,062707 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,062707 0,000176

Quercetina 0,000176 0,024773 0,000176 0,000176

Tabela 7: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 100 µL

de extrato em 60 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 23,700 13,367 3,9167 2,6667 15,333

Ceb. metanol

0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. água 0,000176 0,000176 0,000176 0,034723

Ceb. Acetato 0,000176 0,000176 0,240212 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,240212 0,000176

Quercetina 0,000176 0,034723 0,000176 0,000176

131

Tabela 8: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 200 µL

de extrato em 15 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 24,400 16,200 4,6967 ,71000 26,600

Ceb. metanol

0,000179 0,000176 0,000176 0,126432

Ceb. água 0,000179 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. Acetato 0,000176 0,000176 0,004694 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,004694 0,000176

Quercetina 0,126432 0,000176 0,000176 0,000176

Tabela 9: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 200 µL

de extrato em 30 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 29,197 17,477 5,0067 3,2000 29,000

Ceb. metanol

0,000176 0,000176 0,000176 0,980426

Ceb. água 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. Acetato 0,000176 0,000176 0,003957 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,003957 0,000176

Quercetina 0,980426 0,000176 0,000176 0,000176

132

Tabela 10: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 200

µL de extrato em 45 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 31,597 17,767 5,0333 3,6833 32,000

Ceb. metanol

0,000176 0,000176 0,000176 0,993705

Ceb. água 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. Acetato 0,000176 0,000176 0,673492 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,673492 0,000176

Quercetina 0,993705 0,000176 0,000176 0,000176

Tabela 11: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 200

µL de extrato em 60 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 33,167 18,133 5,2000 5,1333 32,167

Ceb. metanol

0,000176 0,000176 0,000176 0,202866

Ceb. água 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. Acetato 0,000176 0,000176 0,999843 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,999843 0,000176

Quercetina 0,202866 0,000176 0,000176 0,000176

133

Tabela 12: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 500

µL de extrato em 15 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 37,907 18,633 7,1000 2,7633 65,000

Ceb. metanol

0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. água 0,000176 0,000177 0,000176 0,000176

Ceb. Acetato 0,000176 0,000177 0,017340 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,017340 0,000176

Quercetina 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Tabela 13: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 500

µL de extrato em 30 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 45,027 24,200 7,7000 5,4600 71,033

Ceb. metanol

0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. água 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. Acetato 0,000176 0,000176 0,099286 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,099286 0,000176

Quercetina 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

134

Tabela 14: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 500

µL de extrato em 45 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 50,090 26,400 7,9000 7,6800 77,733

Ceb. metanol

0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. água 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. Acetato 0,000176 0,000176 0,998377 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,998377 0,000176

Quercetina 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Tabela 15: Teste de Tukey para avaliar a capacidade de seqüestrar o DPPH utilizando 500

µL de extrato em 60 minutos

{1} {2} {3} {4} {5}

Média 53,400 28,367 8,7667 10,267 80,433

Ceb. metanol

0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. água 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

Ceb. Acetato 0,000176 0,000176 0,162428 0,000176

Chlorella 0,000176 0,000176 0,162428 0,000176

Quercetina 0,000176 0,000176 0,000176 0,000176

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