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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
RESPOSTA SOROLÓGICA DE BOVINOS VACINADOS
CONTRA O CLOSTRIDIUM CHAUVOEI AVALIADA PELOS
TESTES DE AGLUTINAÇÃO EM PLACA E ELISA
Rafael Ferreira de Araujo
Médico Veterinário
Jaboticabal - São Paulo - Brasil
Fevereiro - 2009
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
RESPOSTA SOROLÓGICA DE BOVINOS VACINADOS
CONTRA O CLOSTRIDIUM CHAUVOEI AVALIADA PELOS
TESTES DE AGLUTINAÇÃO EM PLACA E ELISA
Rafael Ferreira de Araujo
Orientador: Prof. Dr. Iveraldo dos Santos Dutra
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias - Unesp,
Câmpus de Jaboticabal, como parte das
exigências para obtenção do título de Mestre
em Medicina Veterinária (Medicina
Veterinária Preventiva).
Jaboticabal - São Paulo - Brasil
Fevereiro - 2009
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Araujo, Rafael Ferreira
A663r Resposta sorológica de bovinos vacinados contra o Clostridium
chauvoei avaliada pelos testes de aglutinação em placa e Elisa /
Rafael Ferreira de Araujo. – Jaboticabal, 2009
xvii, 58 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2009
Orientador: Iveraldo dos Santos Dutra
Banca examinadora: Samir Issa Samara, Vera Cláudia Lorenzetti
Magalhães Curci
Bibliografia
1. Carbúnculo sintomático. 2. Bovinos. 3. Resposta sorológica. I.
Título. II. Jaboticabal - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:614.4:636.2
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
RAFAEL FERREIRA DE ARAUJO – nascido no Rio de Janeiro, RJ, em 13 de
dezembro de 1979. Filho de Paulo Sergio Simões de Araujo e Regina Lucia Ferreira de
Araujo. Médico Veterinário graduado em 2005 pela Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro (UFRRJ). Em 2006 obteve o título de Especialista em Sanidade de
Ruminantes pela Universidade do Grande Rio. Iniciou o curso de Mestrado em 2007, na
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista
(UNESP), Campus de Jaboticabal, no programa de pós-graduação de Medicina
Veterinária, na área de Medicina Veterinária Preventiva.
iii
“O dia que o Homem compreender os sentimentos dos animais saberá que
quando cometer um crime contra um animal estará cometendo um crime
contra a Humanidade.”
Autor desconhecido
iv
Aos meus pais, Paulo e Regina, pelo apoio, confiança e
incentivo à minha formação.
Com eterna gratidão,
OFEREÇO este trabalho.
À minha namorada Sheila
e à minha grande amiga de todos os momentos (Rahya),
pelo apoio, incentivo, companheirismo
e principalmente compreensão nos momentos de ausência
DEDICO
v
HOMENAGEM
À minha família,
e em especial ao avô Jaime (
in memoriam
)
pelo carinho compartilhado
vi
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Iveraldo dos Santos Dutra, pela confiança, amizade e pelos
ensinamentos na elaboração deste trabalho.
À Rosa Maria Morais Ferreira, pela paciência, amizade, ensinamentos e pelo
constante apoio profissional.
À Profa. Dra. Tereza Cristina Cardoso da Silva, pelas sugestões e pela
colaboração na realização do teste de Elisa e análise Bayesiana.
À Profa. Dra. Cáris Maroni Nunes, pelas sugestões e pela colaboração na
realização da produção e dosagem de proteínas dos antígenos.
À Profa. Dra. Sílvia Helena Venturolli Perri, pela realização das análises
estatísticas e sugestões.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação da FCAV - Unesp
(Jaboticabal), da Área de Medicina Veterinária Preventiva, pela receptividade e pelos
ensinamentos.
Aos colegas da Pós-Graduação de Jaboticabal e Araçatuba pelos momentos
compartilhados.
Aos técnicos Adão, Pedro, Gilmara, Alessandra e Alexandre, pelo auxílio na
realização do trabalho.
À CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela
bolsa concedida.
viii
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS............................................................................................. x
LISTA DE FIGURAS............................................................................................. xii
RESUMO............................................................................................................... xiv
ABSTRACT........................................................................................................... xvi
1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 3
3 OBJETIVOS....................................................................................................... 16
3.1 Objetivo geral…………………………………………………………………….. 16
3.2 Objetivos específicos……………………………………………………………. 16
4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 17
4.1 Locais de realização do trabalho................................................................. 17
4.2 Vacinas comerciais ..................................................................................... 17
4.3 Grupos experimentais…………………………………………………………... 18
4.3.1 Experimento 1: Resposta sorológica em bezerros induzida por vacina
comercial polivalente contra clostridioses............................................................. 18
4.3.2 Experimento 2: Anticorpos de origem colostral em bezerros................. 18
4.3.3 Experimento 3: Resposta sorológica em vacas multíparas com idade
superior a 4 anos ................................................................................................. 19
4.4 Coleta e armazenamento do soro................................................................ 19
4.5 Soros controles……………………............................................................... 19
4.6 Cepas de Clostridium chauvoei................................................................... 20
4.7 Teste de Aglutinação em Placa................................................................... 20
4.7.1 Produção do antígeno de Clostridium chauvoei.................................... 20
4.7.2 Procedimento do teste........................................................................... 21
4.8 Teste de Elisa.............................................................................................. 23
4.8.1 Produção do antígeno de Clostridium chauvoei.................................... 23
4.8.2 Procedimento do teste........................................................................... 23
ix
4.9 Análise Estatística........................................................................................ 25
4.9.1 Análise estatística convencional............................................................ 25
4.9.2 Análise estatística Bayesiana................................................................ 25
5 RESULTADOS................................................................................................... 28
5.1 Teste de Aglutinação em Placa................................................................... 28
5.1.1 Experimento 1: Resposta sorológica em bezerros induzida por vacina
comercial polivalente contra clostridioses............................................................. 28
5.1.2 Experimento 2: Anticorpos de origem colostral em bezerros................. 29
5.1.3 Experimento 3: Resposta sorológica em vacas multíparas com idade
superior a 4 anos.................................................................................................. 32
5.2 Teste de Elisa.............................................................................................. 32
5.2.1 Experimento 1: Resposta sorológica em bezerros induzida por vacina
comercial polivalente contra clostridioses............................................................. 32
5.2.2 Experimento 2: Anticorpos de origem colostral em bezerros................. 35
5.2.3 Experimento 3: Resposta sorológica em vacas multíparas com idade
superior a 4 anos.................................................................................................. 38
5.3 Análise Bayesiana........................................................................................ 39
6 DISCUSSÃO...................................................................................................... 42
7 CONCLUSÕES.................................................................................................. 48
8 REFERÊNCIAS.................................................................................................. 50
9 ANEXOS............................................................................................................ 56
9.1 Teste de Aglutinação em Placa................................................................... 56
9.1.1 Anexo I - Meio de cultura....................................................................... 56
9.1.2 Anexo II - Solução salina tamponada.................................................... 56
9.2 Teste de Elisa.............................................................................................. 57
9.2.1 Anexo III - Soluções utilizadas na produção do antígeno de
Clostridium chauvoei............................................................................................. 57
9.2.2 Anexo IV - Soluções utilizadas na padronização e no procedimento
do teste................................................................................................................. 57
x
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Quantidade da mistura antígeno-soro para o teste de aglutinação
em placa...............................................................................................................
22
Tabela 2. Procedimento de diluição do soro para o teste de aglutinação em
placa.....................................................................................................................
22
Tabela 3. Interpretação do título para o teste de aglutinação em placa..............
22
Tabela 4. Média geométrica dos títulos da resposta sorológica contra o
Clostridium chauvoei de bezerros induzidos com uma vacina comercial
polivalente (V1) contra clostridioses, avaliados pelo teste de aglutinação em
placa.....................................................................................................................
29
Tabela 5. Média geométrica dos títulos da resposta sorológica passiva contra
o Clostridium chauvoei de bezerros cujas mães foram induzidas com duas
vacinas comerciais polivalentes (V2 e V3) contra clostridioses, avaliados pelo
teste de aglutinação em placa.............................................................................
30
Tabela 6. Coeficiente de correlação linear entre os dias de vacinação das
mães e de nascimento dos bezerros para o teste de aglutinação em placa e
as cepas de referência (MT) e de campo (SP)....................................................
30
Tabela 7. Valores médios e desvio padrão da resposta sorológica (DO) contra
o Clostridium chauvoei de bezerros induzidos com uma vacina comercial
polivalente (V1) contra clostridioses, avaliados pelo teste de Elisa..................... 33
xi
Tabela 8. Valores médios e desvio padrão da resposta sorológica passiva
(DO) contra o Clostridium chauvoei de bezerros cujas mães foram induzidas
com duas vacinas comerciais polivalentes (V2 e V3) contra clostridioses,
avaliados pelo teste de Elisa...............................................................................
35
Tabela 9. Coeficiente de correlação linear entre os dias de vacinação das
mães e de nascimento dos bezerros para o teste de Elisa e as cepas de
referência (MT) e de campo (SP).........................................................................
37
Tabela 10. Parâmetros obtidos pela interferência Bayesiana após 9.500
interações com os valores de sensibilidade (se), especificidade (sp) e
prevalência (pi) calculados para o teste de aglutinação em placa......................
39
Tabela 11. Parâmetros obtidos pela interferência Bayesiana após 9.500
interações com os valores de sensibilidade (se), especificidade (sp) e
prevalência (pi) calculados para o teste de Elisa indireto....................................
40
xii
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Diagrama de dispersão dos títulos de anticorpos passivos maternos
avaliados pelo teste de aglutinação em placa para a cepa de referência (MT)
de Clostridium chauvoei, em função do dia de nascimento dos bezerros após
a vacinação das mães..........................................................................................
31
Figura 2. Diagrama de dispersão dos títulos de anticorpos passivos maternos
avaliados pelo teste de aglutinação em placa para a cepa de campo (SP) de
Clostridium chauvoei, em função do dia de nascimento dos bezerros após a
vacinação das mães............................................................................................
31
Figura 3. Resposta sorológica (DO) para a cepa de referência (MT) de
Clostridium chauvoei em bovinos, induzida por uma vacina comercial
polivalente (V1) contra clostridioses em três protocolos distintos de vacinação
(G1, G2 e G3), e avaliados pelo teste de Elisa em diferentes momentos...........
34
Figura 4. Resposta sorológica (DO) para a cepa de campo (SP) de Clostridium
chauvoei em bovinos, induzida por uma vacina comercial polivalente (V1)
contra clostridioses em três protocolos distintos de vacinação (G1, G2 e G3), e
avaliados pelo teste de Elisa em diferentes momentos.......................................
34
Figura 5. Imunidade natural passiva para a cepa de referência (MT) de
Clostridium chauvoei em bezerros até 90 dias de idade, avaliada pelo teste de
Elisa.....................................................................................................................
36
Figura 6. Imunidade natural passiva para a cepa de campo (SP) de
Clostridium chauvoei em bezerros até 90 dias de idade, avaliada pelo teste de
xiii
Elisa.....................................................................................................................
36
Figura 7. Diagrama de dispersão dos valores de anticorpos maternos (DO)
pelo teste de Elisa para a cepa de referência (MT) de Clostridium chauvoei,
em função do dia de nascimento dos bezerros após a vacinação das mães,
com a representação da reta ajustada e coeficiente de determinação (R2).......
37
Figura 8. Diagrama de dispersão dos valores de anticorpos maternos (DO)
pelo teste de Elisa para a cepa de campo (SP) de Clostridium chauvoei, em
função do dia de nascimento dos bezerros após a vacinação das mães, com a
representação da reta ajustada e coeficiente de determinação (R2)..................
38
Figura 9. Distribuição dos valores de sensibilidade (se), especificidade (sp) e
Prevalência (pi) após 9.500 interações com distribuição unimodal para o teste
de aglutinação em placa (valores x = percentagem; y = densidades).................
40
Figura 10. Distribuição dos valores de sensibilidade (se), especificidade (sp) e
prevalência (pi) após 9.500 interações com distribuição unimodal para o teste
de Elisa indireto (valores x = percentagem; y = densidades)..............................
41
xiv
RESPOSTA SOROLÓGICA DE BOVINOS VACINADOS CONTRA O CLOSTRIDIUM
CHAUVOEI AVALIADA PELOS TESTES DE AGLUTINAÇÃO EM PLACA E ELISA
RESUMO – O carbúnculo sintomático é um problema sanitário mundial,
responsável por elevados coeficientes de mortalidade em bovinos e ovinos. A
imunização dos animais jovens, seguida de reforço anual até 2,5 anos de idade, é a
principal medida profilática. Foram realizados três experimentos distintos com intuito de
avaliar as respostas sorológicas de bovinos vacinados contra o carbúnculo sintomático,
pelos testes de aglutinação em placa e Elisa, empregando-se como antígenos a cepa
de referência (MT) e uma cepa de campo (SP). No primeiro experimento, os bezerros
foram organizados em três grupos (G1, G2 e G3) e submetidos a três protocolos
distintos de vacinação empregando-se uma vacina comercial polivalente contra
clostridioses. O G1 foi primovacinado aos 4 meses de idade e recebeu o reforço na
desmama (8 meses). O G2 recebeu a primeira dose na desmama e reforço 30 dias
após. O G3 foi vacinado somente na desmama. As coletas de soro foram realizas aos
4, 8, 9 e 10 meses de idade dos bezerros. O G1 apresentou a melhor resposta
sorológica em comparação aos outros dois protocolos. Quando a avaliação dos grupos
foi realizada aos 10 meses de idade, independente do protocolo empregado, a resposta
sorológica foi similar. No segundo experimento, foi avaliada a imunidade natural passiva
de bezerros, filhos de vacas vacinadas até 30 dias antes do parto (2ª dose),
empregando-se duas vacinas comercias polivalente contra clostridioses. As coletas de
soro foram realizadas aos (±)7, 45 e 90 dias de idade dos bezerros. Independente das
vacinas empregadas na imunização ativa das mães, a resposta sorológica passiva dos
bezerros avaliados foi similar até os 3 meses de idade. Houve uma correlação linear da
resposta sorológica passiva dos bezerros com a data de vacinação das mães e o dia do
parto quando empregado o teste de Elisa. No terceiro experimento, as 30 vacas Nelore
com idade superior a 4 anos e sem histórico de vacinação contra o carbúnculo
sintomático havia pelo menos 2 anos apresentaram resposta sorológica contra o
Clostridium chauvoei. A resposta sorológica dos bovinos foi significativamente inferior
quando empregada a cepa de campo (SP) como antígeno em dois momentos da
xv
avaliação no G3 do primeiro experimento, em dois no V2 do segundo experimento e no
terceiro experimento do teste de aglutinação em placa. Quando empregado o teste de
Elisa, tal situação foi constatada em dois momentos no G1, um no G3 e três no controle
do primeiro experimento, e um no controle do segundo experimento. A resposta
sorológica dos bovinos foi significativamente inferior quando empregada a cepa de
referência (MT) como antígeno em um momento da avaliação no G1 e outro no G2 do
primeiro experimento, e no terceiro experimento do teste de Elisa. De acordo com a
análise Bayesiana, independente dos testes empregados na mensuração da resposta
sorológica dos bovinos, os valores de sensibilidade e prevalência de anticorpos foram
similares e a análise de concordância foi superior a 90%.
Palavras-Chave: carbúnculo sintomático, Clostridium chauvoei, bovinos, resposta
sorológica, vacina, teste de aglutinação em placa, teste de Elisa, análise Bayesiana.
xvi
SEROLOGICAL RESPONSE FROM VACCINATED BOVINES AGAINST
CLOSTRIDIUM CHAUVOEI BY THE USE OF AGGLUTINATION AND ELISA
METHODS
ABSTRACT – Black leg disease is one of the most important sanitary problem,
responsible for high levels of mortality observed in bovines and ovines herds. The
vaccination of young animals, followed by annual booter until 2,5 years-old, is the major
preventive measure against outbreaks. Three distinct experiments were conducted to
measure the vaccinal response from bovines. The vaccinal strains used were the
reference MT and field Clostridium chauvoei isolated. Sera from vaccinated animals
were tested by agglutination and Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Elisa), both
standardized for the present study. First experiment, calves were divided into three
groups (G1, G2 and G3); and submitted to three vaccination schedule with a polyvalent
vaccine. The G1 received first vaccine at 4 months of age and a subsequent booster
after calving (8 month-old). The G2 received first vaccine dose after calving and booster
at 30 days after. The G3 received only one vaccine dose at 8 months. The sera were
colleted at 4, 8, 9 and 10 months for all groups studied. The G1 group showed the best
serological response at 10 months of age in comparison to G2 e G3 and control.
Moreover, at 10 months of age all groups presented similar levels of serological
response. The second experiment, the natural immunity of calves, separated from their
mothers vaccinated 30 days before calving with two polyvalent vaccines. The respective
serum was colleted at (±) 7, 45 and 90 days of age. All calves presented similar
serological response at 3 months of age, independent of vaccinal strain used. The third
experiment, 30 heifers, Nelore race, aged above 4 years-old, without vaccination against
black leg, were vaccinated with two Clostridium strains. When the SP strain was used
the serological response was considered good in G3 (first experiment), second and third
experiment for agglutination assay. To compare both techniques, agglutination and
Elisa, inference Bayesian was performed, resulting in agreement of 90% in the results
tested.
xvii
Key words: Black leg, Clostridium chauvoei, bovines, serological response, vaccine,
agglutination test, Elisa assay, Bayesian test.
1
1 INTRODUÇÃO
O carbúnculo sintomático é uma enfermidade não contagiosa causada pela
ativação de esporos latentes do Clostridium chauvoei na musculatura dos animais. É
uma clostridiose que acomete principalmente ruminantes como bovinos, ovinos e
caprinos em menor proporção, e esporadicamente eqüinos e suínos. A enfermidade
apresenta curso clínico agudo ou superagudo, geralmente fatal, caracterizando-se por
uma miosite necrosante associada com celulite gangrenosa localizada. Nos bovinos e
ovinos, o termo comumente empregado é manqueira, e trata-se de infecção endógena
pelo Clostridium chauvoei. Nas demais espécies, é denominada de gangrena gasosa e
ocorre como conseqüência de uma infecção de ferimentos pelo microrganismo.
Esta clostridiose é um problema sanitário universal dos bovinos e ovinos, sendo
reconhecida como doença distinta em 1790 por Chabert e denominada pelo mesmo de
carbúnculo sintomático. Um aspecto epidemiológico relevante sobre a enfermidade é a
ocorrência em animais jovens, com idade variando entre 9 meses e 2,5 anos, sendo
raramente observada em outras categorias.
A imunização contra o carbúnculo sintomático é uma medida profilática das mais
importantes na bovinocultura e ovinocultura. Essa prática é executada desde o século
XX; no Brasil, segundo dados atuais fornecidos pelo Sindicato Nacional da Indústria de
Produtos para Saúde Animal (SINDAN), são comercializadas anualmente cerca de 150
milhões de doses de vacinas apresentadas nas formulações monovalentes ou
polivalentes. Cabe ressaltar que a vacinação é voluntária, indicando o reconhecimento
sobre a importância e necessidade desta medida preventiva nos sistemas de produção
da bovinocultura e ovinocultura nacional. O Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA), segundo a Portaria Nº 49, realiza o controle das partidas de
vacinas comercializadas quanto à valência do Clostridium chauvoei. No entanto os
critérios visam basicamente verificar a inocuidade, a esterilidade e se as vacinas
atendem aos requisitos do teste de eficiência em cobaias, utilizando-se no desafio uma
cepa oficial denominada MT (Manguinhos e Teixeira).
2
Os laboratórios produtores de vacinas contra clostridioses têm desenvolvido
produtos biológicos direcionados à quantidade numérica de antígenos e problemas
específicos de características regionais ou esporádicos. Contudo o Laboratório de
Enfermidades Infecciosas dos Animais da Unesp, Campus de Araçatuba, tem registros
relacionados à ocorrência de surtos de carbúnculo sintomático em rebanhos
sabidamente vacinados. Em diversas ocasiões têm sido registrados surtos da
enfermidade, com diagnóstico etiológico, após alguns meses da vacinação de reforço
em animais primovacinados. Essa situação indica uma eventual possibilidade de
variações antigênicas entre as cepas vacinais e as de campo ou, ainda, um problema
relacionado com a eficiência das vacinas frente a desafios naturais. Além disso, não
existem testes sorológicos capazes de mensurar a resposta imunológica necessária
para garantir uma proteção adequada dos animais frente ao desafio natural. O fato de a
enfermidade não ser de notificação obrigatória, aliado a pouca abrangência da
vigilância epidemiológica do país, contribui para a ausência de discussões sobre a
problemática.
A escassez de estudos sistemáticos relacionados à mensuração da resposta
sorológica bovina contra o Clostridium chauvoei estimulada pela vacinação, o aumento
progressivo na produção e no consumo das vacinas, e a importância econômica e
sanitária da manqueira motivaram o presente estudo, que se propôs a avaliar a
resposta sorológica de bovinos vacinados contra o Clostridium chauvoei pelos testes de
aglutinação em placa e Elisa, empregando-se como antígeno uma cepa de referência
(MT) e uma cepa de campo (SP).
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
O gênero Clostridium pertence ao grupo de bactérias anaeróbias estritas, Gram-
positivas, em forma de bacilo, geralmente encontradas isoladas, ocasionalmente aos
pares ou pequenas cadeias; também são formadoras de esporos, móveis e flageladas.
Habitam o trato digestivo do homem e dos animais e podem ser isoladas de vísceras de
animais sadios. Os esporos são encontrados em pastagem, solo, água e alimentos de
origem animal e vegetal (KRIEK & ODENDAAL, 2004).
O carbúnculo sintomático é uma enfermidade infecciosa causada pelo
Clostridium chauvoei, acometendo principalmente bovinos e ovinos, ocasionalmente
caprinos, e esporadicamente suínos, eqüinos, camelos e cervos (STERNE, 1981). Os
surtos da doença em bovinos ocorrem principalmente de forma sazonal, após as
chuvas nos períodos de outono e verão, apresentando uma distribuição regional e em
blocos, podendo uma mesma região apresentar localidades com ocorrência da infecção
clínica e outras sem sinais clínicos (BAGADI, 1978).
A diferenciação do Clostridium chauvoei de outras espécies de clostrídios por
meio de cultivo em meios sólidos é extremamente difícil, pois este apresenta variadas
formas de crescimento, e a fermentação de carboidratos é inespecífica, sendo
necessárias outras provas complementares (LIMA, 1992).
A imunofluorescência é um método rápido e eficiente para identificação, quando
se tem disponível comercialmente fluoresceína conjugada ao anticorpo específico para
C. chauvoei, C. septicum, C. novyi, C. sordelli, com a vantagem de não propiciar reação
cruzada (BISPING & AMTSBERG, 1988; QUINN et al., 1994).
No entanto, a identificação do Clostridium chauvoei pela reação de cadeia da
polimerase (PCR) demonstra um resultado superior quando comparado ao da
imunofluorescência (KUHNERT et al., 1997).
Os antígenos de Clostridium chauvoei são divididos em dois grupos distintos:
antígenos celulares e antígenos solúveis. Os antígenos celulares são classificados em
antígenos somáticos (O) termoestáveis, comuns a todas as cepas, e antígenos
4
flagelares (H) termolábeis, sendo dois distintos (MOUSSA, 1959). Os antígenos
somáticos incluem antígeno aglutinogênico, antígeno O termoestável, antígeno não
aglutinogênico, e o antígeno termolábil que não apresenta os antígenos O e H
(CRICHTON et al., 1990).
A estrutura antigênica de cepas bovinas e ovinas de Clostridium chauvoei tem
sido estudada por reações de aglutinação, absorção de aglutininas O e H. Sabe-se que
o componente O é comum a cepas isoladas tanto de ovinos quanto de bovinos, mas o
componente H é específico para cada tipo, bovino ou ovino (ROBERTS, 1931). As
cepas de Clostridium chauvoei possuem um antígeno somático comum e dois
antígenos flagelares distintos (ROBERTS, 1931; HENDERSON, 1932). O segundo
antígeno flagelar é restrito a cepas isoladas de ovinos (HENDERSON, 1932).
O Clostridium chauvoei produz pelo menos cinco antígenos solúveis (enzimas) e
mais uma enzima necrótica: hemolisina oxigênio-estável (alfa); desoxirribonuclease
(beta); hialuronidase (gama); hemolisina oxigênio-lábil (delta); e uma neuraminidase.
Outros produtos solúveis identificados em sobrenadantes de culturas incluem um fator
produtor de edema e um componente imunizante (CRICHTON et al., 1990). Relatos de
TILLERAY e KNIGHT (1986) sugeriram que culturas filtradas contêm uma ordem
marcadamente heterogênea de proteínas. Enquanto a função biológica de antígenos
solúveis de Clostridium chauvoei não tem sido estabelecida, há evidências de estudos
de outros gêneros de bactérias para suportar a visão de que, coletivamente, essas
moléculas funcionam como fatores de virulência. Os antígenos solúveis aumentam a
habilidade das cepas virulentas de invadirem e se multiplicarem nos tecidos de seus
hospedeiros suscetíveis (CRICHTON et al., 1990).
Os antígenos solúveis de Clostridium chauvoei são menos tóxicos que os
antígenos solúveis de outras espécies de clostrídios causadores de gangrena gasosa
(CRICHTON et al., 1990). De acordo com KERRY (1967), as toxinas poderiam ser
imunologicamente importantes.
O modo de infecção pelo Clostridium chauvoei não está totalmente estabelecido.
Acredita-se que ocorra infecção após a ingestão de esporos do solo ou da água
contaminados concomitante a época de erupção dentária. Os esporos ingeridos
5
atravessariam o lúmen intestinal, atingiriam o sistema circulatório e linfático, para então
serem distribuídos aos tecidos e órgãos de todo o corpo, inclusive na musculatura,
onde permaneceriam latentes por longo período (KERRY, 1964; SMITH & WILLIAMS,
1984). Trata-se, portanto, de uma infecção endógena, em que os esporos permanecem
quiescentes na musculatura por longos períodos.
A principal fonte de infecção parece ser carcaça de animais mortos pelo
carbúnculo e a subseqüente contaminação da pastagem, bebedouros, currais e
galpões. Uma determinada área, quando contaminada, permanece assim durante anos.
A transmissão direta de animal para animal não ocorre. Os animais com idade variando
entre 9 meses e 2,5 anos, submetidos ao sistema de confinamento, apresentam uma
alta suscetibilidade à infecção. Bovinos de crescimento rápido e alto padrão alimentar
são mais suscetíveis que animais subnutridos (SMITH & WILLIAMS, 1984).
A patogenia do Clostridium chauvoei é desconhecida. Acredita-se que um
processo traumático na musculatura resulte em áreas de baixo potencial de oxi-
redução, favorecendo a germinação e a multiplicação dos esporos latentes. As células
vegetativas crescem, fermentam o glicogênio, digerem proteínas e produzem
exotoxinas e gases (STEPHEN & PIETROWSKI, 1986), e matam os animais devido ao
choque tóxico.
Em alguns casos, podem ocorrer lesões no miocárdio em função da mudança
causada pelo alto nível de cortisol e catecolaminas em resposta ao estresse, fazendo
com que os esporos latentes no músculo cardíaco germinem e se multipliquem,
produzindo as lesões (GLASTONBURY et al., 1988).
Os sinais clínicos iniciais da doença são de difícil observação, pois seu curso é
muito rápido, portanto a maioria dos bovinos morre e uma pequena parcela de ovinos
se recupera (HENNING, 1956; SIPPEL, 1972; STERNE, 1981).
Os sinais, quando observados, compreendem hipertermia, depressão, anorexia,
estase ruminal, rigidez muscular seguida de claudicação. Os grupos musculares mais
afetados são os músculos dos membros posteriores, músculos da paleta e musculatura
lombar. Caso os músculos afetados sejam superficiais, há um inchaço subcutâneo e
uma crepitação local devido à produção de gás. Este inchaço tende a aumentar de
6
tamanho, sendo inicialmente quente e dolorido, passando a frio e indolor numa fase
posterior. Quando os animais deitam, há ocorrência de dispnéia e pulso acelerado
(STERNE, 1981).
Em casos de sítios de lesões por aplicação de produtos contaminados por
Clostridium chauvoei, há formação de edema e crepitação, que se estende
rapidamente, causando exsudação de líquido sero-sanguinolento através da pele, com
odor rançoso. Nestes casos, a morte ocorre até 18 horas após a injeção com agulha
contaminada (STERNE, 1981).
Alterações clínico-patológicas variam desde aumento de enzimas associadas à
lesão muscular, como a creatina-quinase, até um hemograma indicando choque tóxico
(PEMBERTON et al., 1974).
Animais mortos pela doença entram em rápida putrefação e são encontrados
normalmente inchados e com extravasamento de líquidos sanguinolentos pelas
cavidades naturais. Quando é possível realizar a necropsia, o tecido subcutâneo, o
tecido intermuscular e outros próximos ao local afetado apresentam-se distendidos por
um fluido edematoso amarelo, parcialmente hemorrágico e com bolhas de gás (miosite
hemorrágica). Ao corte, há exsudação de líquido avermelhado e de odor rançoso. Os
músculos acometidos são ressecados no centro da lesão e há comprometimento dos
linfonodos regionais, que ficam hiperêmicos e edemaciados. Um fluido seroso
avermelhado é encontrado freqüentemente nas cavidades torácica e abdominal, e os
pulmões estão geralmente edemaciados e hiperêmicos. Quando o miocárdio está
lesado, ocorre pericardite fibrinosa a fibrino-hemorrágica e trombos murais nas câmaras
cardíacas (HENNING, 1956).
Histologicamente encontra-se extensa área de necrose proveniente das toxinas
bacterianas e do envolvimento vascular. Hemorragias, bolhas de gás, diversos
organismos clostridiais e ausência de resposta inflamatória são características do
carbúnculo (HULLAND, 1993). As lesões de gangrena gasosa em ovinos e eqüinos são
semelhantes às lesões dos bovinos que morrem de carbúnculo (GLASTONBURY et al.,
1988; HAGEMOSER et al., 1980).
7
A imunidade protetora contra Clostridium chauvoei é geralmente considerada
antibacteriana, em menor proporção antitóxica. (CHANDLER & GULASEKHARAM,
1970; CRICHTON et al., 1990).
Durante o cultivo do Clostridium chauvoei, a concentração de toxinas protéicas e
outros antígenos indutores de proteção produzidos variaram de acordo com a cepa
utilizada. As bactérias e o filtrado de meio fluido no qual elas cresceram foram
imunogênicos (CLAUS & MACHEAK, 1972a; STEVENSON & STONGER, 1980). A
imunização com culturas totais formolizadas produziram altos níveis de imunidade
protetora, provavelmente estimulada pelo antígeno protetor termolábil, presente na
parede celular do microrganismo (CHANDLER & GULASEKHARAM, 1970; CHANDLER
& HAMILTON, 1975).
A antigenicidade da cepa CH3 de Clostridium chauvoei foi estimulada pelos
antígenos termolábeis, pH sensível e antígeno somático não aglutinogênico, não houve
a participação do antígeno flagelar termolábil (CHANDLER & GULASEKHARAM, 1974).
A imunidade contra infecções por Clostridium chauvoei foi derivada de frações
antigênicas de células purificadas (somáticas e flagelares) e frações antigênicas
solúveis. Vacinas formuladas com componentes purificados demonstraram ser tão
efetivas quanto às vacinas celulares. Vacinas de Clostridium chauvoei compostas por
um coquetel heterogêneo de antígenos solúveis e celulares estimulou uma resposta
sorológica heterogênea em um animal imunizado por esse tipo de vacina. Assim, a
resposta sorológica a um antígeno individual não deveria ser empregada para mensurar
a potência das vacinas (CRICHTON et al., 1990).
Estudos laboratoriais indicaram que vacinações com culturas completas de
Clostridium chauvoei apresentaram uma melhor imunogenicidade em cobaias que a
vacinação com lavado de células bacterianas, em ambas as preparações contendo o
mesmo número de células (CLAUS & MACHEAK, 1972a).
As células bacterianas e as culturas filtradas (contendo antígenos celulares e
toxinas) possuíram propriedades antigênicas. Conseqüentemente, as vacinas deveriam
ser preparadas com culturas formolizadas de Clostridium chauvoei (STEVENSON &
STONGER, 1980).
8
A extração ácida de células bacterianas de Clostridium chauvoei acompanhada
de purificação seletiva do flagelo bacteriano possibilitou a preparação do antígeno de
extrato ácido, cuja capacidade foi induzir uma melhor imunidade nas cobaias
(STEVENSON & STONGER, 1980).
A antigenicidade do Clostridium chauvoei não sofreu influência da temperatura
durante o cultivo da bactéria. Entretanto o fornecimento parcial e fracionado de glicose
associado ao pH controlado afetaram negativamente a capacidade de indução de
imunidade do extrato celular. Dessa forma, a limitação na fonte de carbono influenciou
a antigenicidade das células bacterianas. Para obtenção de antígenos com
propriedades imunogênicas tornaram-se importantes as seguintes medidas:
temperatura de 37ºC; fornecimento parcial de glicose (5 g) uma única vez; e não houve
necessidade de um pH controlado (CORTIÑAS et al., 1994).
A imunogenicidade do flagelo pôde ser comprovada pelo aumento da resposta
sorológica de camundongos submetidos à vacinação, empregando-se o flagelo como
antígeno. Conseqüentemente, o flagelo também teria a capacidade de elevar a
virulência da cepa durante o processo infeccioso em camundongos (TAMURA et al.,
1995).
O flagelo de Clostridium chauvoei teve um papel importante na indução da
imunidade em camundongos, mas o antígeno somático foi mais imunogênico que o
flagelo. O extrato celular apresentou 100% de proteção, e quando foi diluído em 1:500
pôde ser utilizado sozinho ou misturado em vacinas comercias (MICALIZZI & GUZMÁN,
1997a).
A suspensão flagelar de Clostridium chauvoei estimulou uma resposta sorológica
em camundongos demonstrada por títulos de anticorpos no teste de aglutinação,
contudo apresentou uma proteção média (75%) quando empregado o teste de desafio
com suspensão de esporo contendo 10DL
50/camundongo
. As suspensões de extrato celular
ou cultura celular formolizada apresentaram uma proteção excelente (100%). Tal
situação ressaltou importância da imunogenicidade do antígeno somático (MICALIZZI &
GUZMÁN, 1997a).
9
A suspensão de extrato celular foi um bom antígeno com capacidade de
desenvolver uma imunidade protetora contra o Clostridium chauvoei quando comparada
às vacinas comerciais disponíveis na Argentina. Desta forma, a suspensão deveria ser
adicionada às vacinas comerciais (MICALIZZI & GUZMÁN, 1997b).
Estudos antigênicos em camundongos demonstraram que proteínas celulares de
Clostridium chauvoei sonicadas apresentaram uma imunogenicidade superior quando
comparada às células formolizadas (MATTAR et al., 2002).
A fase estacionária da cultura de Clostridium chauvoei foi a mais adequada para
obtenção de imunidade protetora, com a presença de antígenos indutores de maiores
títulos de IgG. Dependendo da cepa, a capacidade antigênica diminuiu ou desapareceu
nas fases de crescimento ou estacionária tardia. A exposição das células ao pH final
baixo, metabólitos de fermentação final ou diminuição da glicose afetou negativamente
a imunogenicidade das células bacterianas após 24 horas de incubação,
correspondendo à fase de crescimento tardio (MATTAR et al., 2002).
Problemas ocorreram durante o desenvolvimento de um teste de potência de
bacterinas contendo Clostridium chauvoei. Dentre eles, destacaram-se a diferença entre
testes empregando-se cobaias e bovinos, pois o nível de potência das vacinas foi
superior quando se utilizaram cobaias nos testes e foi menor quando bovinos foram
empregados (CLAUS & MACHEAK, 1972b).
Houve uma relação entre títulos de aglutinação e imunogenicidade em bovinos
vacinados empregando-se vacinas experimentais e comerciais contendo bacterinas de
Clostridium chauvoei. A imunidade protetora foi considerada satisfatória quando se
tornou necessário 0,5 µL de soro bovino para realizar a completa aglutinação de 50 µL
do antígeno padrão composto por Clostridium chauvoei (MACHEAK et al., 1972).
Quando cobaias e bovinos foram submetidos ao teste de potência de vacinas
contra o Clostridium chauvoei, MACHEAK et al. (1972) verificaram uma proteção igual
ou maior em bovinos, comprovando que cobaias foram mais sensível à infecção pelo
Clostridium chauvoei. Tal situação permitiria o emprego de cobaias nos testes de
potência.
10
O significado das culturas filtradas no desenvolvimento da imunidade deveria ser
avaliado no estabelecimento de um teste de potência confiável e aceitável para
bacterinas contendo Clostridium chauvoei (CLAUS & MACHEAK, 1972a).
Testes de aglutinação não seriam adequados para estimar o nível de anticorpos
protetores no soro de animais vacinados e não deveriam ser empregados para o teste
de controle de qualidade de vacinas contra carbúnculo sintomático. Bovinos infectados
por cepas altamente virulentas de Clostidium chauvoei foram efetivamente protegidos
somente por vacinas contendo células com antígeno protetor termolábil e antígeno
termoestável. Essas cepas altamente virulentas poderiam ser encontradas no campo,
sendo necessário assim selecioná-las para o teste de desafio em animais vacinados
para o controle de qualidade das vacinas contra carbúnculo sintomático. Dessa forma,
um centro internacional deveria ser responsável pela escolha e distribuição dessas
cepas (CHANDLER, 1976).
O teste de Elisa como método de avaliação da potência das vacinas contendo
antígenos de Clostridium chauvoei apresentou duas vantagens: redução significativa do
número de cobaias utilizadas e a estimativa de forma quantitativa da potência das
vacinas, quando comparado ao teste desafio (CRICHTON et al., 1990).
O teste de Elisa indireto foi desenvolvido com o intuito de quantificar anticorpos
específicos para antígeno flagelar altamente purificado de Clostridium chauvoei em soro
de coelho. O teste compara a densidade óptica de um soro desconhecido a um soro
padrão de várias diluições, utilizando linhas paralelas para computar a potência relativa.
O soro proveniente de coelhos vacinados contra C. tetani, C. sordelli, C. perfrigens tipo
C e D, C. septicum, C. haemolyticum, C. novyi foi avaliado no teste e demonstrou uma
reação cruzada mínima. A potência relativa foi resultado de testes sorológicos
empregando-se vacinas de diversas potências, e as comparando favoravelmente aos
resultados do teste de desafio das cobaias (HAUER et al., 1996).
Nos Estados Unidos, a vacinação contra Clostridium chauvoei tem sido praticada
por mais de 60 anos. Durante várias décadas, a vacinação contra Clostridium chauvoei
e Clostridium septicum (Edema Maligno) tem sido considerada a operação mínima
requerida para bovinos (ROGERS & SWECKER, 1997).
11
Um estudo sobre a prática da vacinação em bovinos realizado pelo “National
Animal Health Monitoring System” (NAHMS) nos Estados Unidos indicou que mais de
60% dos produtores vacinaram seus animais. Dados relatados pelo NAHMS, em 1994,
indicaram que 34,4% dos confinamentos de até 1.000 animais e 91% dos
confinamentos com mais de 1.000 animais vacinaram contra um ou mais agentes
clostridiais. Esses dados indicaram que a administração de vacinas clostridiais foi uma
rotina, sendo o principal componente de um programa básico de saúde animal
(ROGERS & SWECKER, 1997).
No Brasil, segundo dados fornecidos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA), são comercializadas aproximadamente 100 milhões de doses
de vacinas por ano (BRASIL, 2003). Entretanto, segundo dados atuais fornecidos pelo
Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Saúde Animal (SINDAN), são
comercializadas anualmente cerca de 150 milhões de doses de vacinas apresentadas
nas formulações monovalentes ou polivalentes. Essa medida preventiva adotada pelos
sistemas de produção animal voltados à criação de ovinos e bovinos de corte e leite é
de extrema importância e reconhecida pelos produtores, mesmo sendo de aplicação
voluntária.
A vacinação contra doenças clostridiais foi responsável por uma significante
redução na taxa de mortalidade dos animais e conseqüentemente aumento no lucro
dos produtores (KNOTT et al., 1985).
A aplicação da vacina por via subcutânea diminuiu as lesões musculares no local
de aplicação, minimizando os danos teciduais causados pela reação inflamatória local
proveniente do adjuvante contido na vacina e conseqüentemente as perdas
econômicas dos produtores na comercialização dos bovinos destinados ao abate. Para
reduzir a reação inflamatória local recomenda-se a substituição dos adjuvantes oleosos
pelo hidróxido de alumínio no processo de fabricação das vacinas (McFARLANE et al.,
1996).
O desenvolvimento de lesões no local de aplicação da vacina contra clostridioses
aumentou a resposta imunológica dos animais, expressada pelo título de anticorpos nos
testes sorológicos (TROXEL et al., 2001).
12
Os bovinos devem ser imunizados entre 3 e 6 meses de idade, sendo realizadas
duas inoculações em um intervalo de 28 dias. Posteriormente, a vacinação deve ser
anual até o animal completar 3 anos de idade. A partir dessa idade, adquire proteção
natural por repetidos contatos com a bactéria (KRIEK & ODENDAAL, 2004).
Em locais de alta prevalência da enfermidade o intervalo de vacinação deve ser
a cada 9 meses e durante surtos de carbúnculo, a imunização deve ser realizada com
agulhas individuais e estéreis, com o intuito de evitar a transmissão da bactéria
(ERASMUS et al., 1990).
A imunidade passiva colostral de bezerros nascidos de mães imunes durou
aproximadamente 3 meses, podendo interferir com a imunização ativa (SCHIPPER et
al., 1978).
Os títulos de anticorpos aglutinantes para clostridioses em bezerros entre os dias
50 e 53 após o nascimento poderiam ser incrementados se as mães forem vacinadas
aproximadamente 4 meses antes da parição. Dessa forma, recomendou-se a vacinação
dos bezerros com 60 dias de idade e reforço vacinal com 90 dias, antecedendo a
desmama (TROXEL et al., 1997).
Não houve diferença significativa até 4 meses de idade entre os títulos de
bezerros vacinados no terceiro dia de idade com uma vacina comercial polivalente
contra clostridioses e de bezerros não vacinados, filhos de vacas vacinadas com a
mesma vacina próximo ao parto. Dessa forma, a importância e a duração da imunidade
passiva foram ressaltadas (TROXEL et al., 2001).
As vacinas comerciais foram avaliadas em diversas combinações de antígenos
clostridiais (BROWN et al., 1976; CAMERON et al., 1986; KNOTT et al., 1985; STERNE
et al., 1962). Esses imunógenos tiveram em sua composição um ou mais antígenos,
dentre eles: C. chauvoei, C. botulinum, C. tetani, C. sordellii, C. novyi, C. septicum, C.
perfrings tipo C e D. Um bom grau de imunidade foi obtido após simples injeção de
vacinas polivalentes, entretanto foi necessário um reforço para elevar o tempo de
imunidade (STERNE et al., 1962).
Uma vacina comercial polivalente composta por bacterina-toxóide de C.
chauvoei, C. septicum, C. sordellii e C. novyi protegeu 100% das cobaias quando
13
desafiadas com esporos virulentos. Quando bovinos e ovinos foram submetidos ao
teste de desafio, empregando-se o mesmo antígeno na diluição de 1:15, houve uma
proteção de 100% contra C. chauvoei, C. septicum e C. sordellii, e também uma
proteção de 50% contra C. novyi (BROWN et al., 1976).
Cobaias e bovinos imunizados com uma dose reduzida de vacina contendo
Clostridium chauvoei e produzida em meio semi-sintético, obtiveram excelentes
resultados. Duas injeções de 2mL protegeram os bovinos contra o desafio com duas
doses letais mínimas de uma cultura virulenta, após mais de 12 meses de vacinação
(CAMERON et al., 1986).
Houve uma diferença significativa entre as vacinas comerciais polivalentes contra
clostridioses e as suas respectivas respostas sorológicas em ovinos e caprinos. A
reação inflamatória local foi semelhante tanto em ovinos quanto em caprinos e a
resposta sorológica foi maior nos ovinos, caracterizando uma melhor imunidade
protetora quando comparada aos caprinos (GREEN et al., 1987).
Países desenvolvidos estão interessados na produção de vacinas combinadas
em medicina veterinária, devido à redução dos custos durante os processos de
fabricação e ao aumento na eficiência dos programas profiláticos a campo. Essas
vacinas baseiam-se na compatibilidade biológica dos imunógenos e a interação de
vários componentes quando misturados ou liofilizados. No entanto, alguns cuidados
devem ser rigorosamente verificados e deve haver transparência dos laboratórios na
fabricação das vacinas, pois as mesmas devem conter todos os antígenos que
propõem e em quantidades suficientes para conferir boa imunidade aos animais
(PROVOST & PERREAU, 1978).
Vacinas contendo células com antígenos protetores termolábeis e termoestáveis
comuns a todas as células de Clostridium chauvoei, protegeram efetivamente contra
algumas cepas altamente virulentas (CHANDLER, 1976).
A vacinação utilizando cepas vacinais homólogas às cepas do meio ambiente
induziu uma proteção maior nos animais (SCHIPPER et al., 1978).
Determinadas cepas isoladas de Clostridium chauvoei podem diferir em suas
habilidades para conferir proteção em cobaias, camundongos e ovelhas, assim como
14
para conferir imunidade contra outras cepas (KERRY, 1967). Estudos da imunidade
protetora demonstraram diferenças entre cepas em suas habilidades para proteger
contra um desafio heterólogo padrão (CHANDLER & GULASEKHARAM, 1970).
KERRY (1967), empregando um desafio de letalidade conhecida, constatou que
as diferenças na virulência das cepas são desprezíveis e que a vacinação com cepas
individuais tem um melhor resultado de proteção contra desafio homólogo em
comparação ao desafio heterólogo, pois algumas cepas produzem vacinas que tem um
espectro de proteção maior que outras.
Os antígenos produzidos por algumas cepas de Clostridium chauvoei poderiam
ser modificados ou até mesmo ser perdidos depois de repetidas subculturas em
laboratório. Devido a isso, uma cepa recém-isolada demonstraria ter uma capacidade
altamente virulenta (KERRY, 1967).
A importância prática de um espectro protetor distinto entre cepas poderia não
ser significativa se um animal fosse desafiado enquanto solidamente imune. Entretanto,
torna-se relevante quando a imunidade estivesse diminuída ou em fase de
desenvolvimento, especialmente se estimulada por uma vacina composta por uma cepa
simples. Para estimular uma imunidade protetora nos animais que vivem sob condições
de campo, torna-se importante a inclusão de cepas de campo na composição da
vacina. Um soro hiperimune, produzido particularmente por uma mistura de cepas
antigênicas, deveria em função do número de injeções necessárias para hiperimunizar
o animal doador, conter uma quantidade suficiente de anticorpos inespecíficos de
Clostridium chauvoei com o intuito de proteger o animal receptor contra um desafio
frente a cepas de campo (KERRY, 1967).
As variações entre cepas devem ser avaliadas quando a potência das vacinas é
testada, pois quando comparações são feitas entre vacinas, resultados equivocados
podem ser obtidos se o desafio é realizado com uma cepa simples. A vacina homóloga
parecerá mais imunogênica. Para trabalhos comparativos e para testes corretos de
vacinas individuais é melhor o uso de uma mistura de cepas, ou várias cepas
individuais diferentes, em seqüência para obter um resultado significante (KERRY,
1967).
15
A ocorrência de mortes de bovinos por carbúnculo sintomático na Austrália, entre
abril de 1976 e abril de 1977, conduz questionamentos quanto à eficácia das vacinas
clostridiais. Para tal fato foram consideradas três possibilidades: vacina com potência
reduzida, desafio anormal e cepa de campo ausente na vacina (REED & REYNOLDS,
1977).
Algumas cepas de campo têm a capacidade de vencer a imunidade dos animais
vacinados pela cepa padrão. Essa situação ocorre devido à ausência de conhecimento
dos antígenos capazes de induzir uma imunidade protetora. Para reduzir as falhas
vacinais, as indústrias têm desenvolvido vacinas clostridiais polivalentes, porém as
mesmas têm sido questionadas em função da falta de transparência durante o processo
de fabricação das vacinas (WOOLCOCK & FROST, 1977).
Há uma grande carência de um sistema que previna e relate precocemente
surtos da enfermidade e de informações referentes a cepas de campo de Clostridium
chauvoei (DODSON, 1978).
Cobaias vacinadas por diferentes produtos comerciais contra o carbúnculo
sintomático e submetidas ao desafio com a cepa de referência (MT) no teste de
potência das vacinas, seguindo a metodologia empregada pelo MAPA, apresentaram
uma imunidade protetora em 95,46% das vacinas testadas. Por outro lado, quando
utilizada a cepa de campo (SP) para o desafio, apenas 36,36% das vacinas foram
aprovadas. Nessa condição, grande parte dos imunógenos comercializados no Brasil
(63,64%) não protegeu as cobaias no desafio da cepa de campo (SP) (SANTOS, 2003).
16
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
• Avaliar a resposta sorológica de bovinos vacinados contra o Clostridium chauvoei
pelos testes de aglutinação em placa e Elisa.
3.2 Objetivos Específicos
• Avaliar a resposta sorológica de bezerros induzida por vacina comercial
polivalente contra clostridiose em três protocolos distintos de vacinação.
• Avaliar a presença de anticorpos de origem colostral em bezerros contra o
Clostridium chauvoei aos 7 (±2), 45 e 90 dias após o nascimento.
• Avaliar a resposta sorológica contra o Clostridium chauvoei em vacas Nelore
multíparas com idade superior a 4 anos.
• Comparar os valores de sensibilidade e de especificidade entre os testes de
aglutinação em placa e Elisa, empregando-se a análise Bayesiana.
17
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Locais de Realização do Trabalho
As atividades de campo foram executadas em três experimentos. O experimento
referente aos três protocolos distintos de vacinação foi realizado na Agropecuária
Estrela do Céu, Fazenda Santa Paula, Município de Lavínia, SP. O experimento da
imunidade passiva foi desenvolvido no Pólo Regional de Desenvolvimento Tecnológico
dos Agronegócios (PRDTA) do Extremo Oeste, Andradina, SP. As vacas multíparas
com idade acima de quatro anos cujos anticorpos séricos foram avaliados pertenciam à
Fazenda Córrego Azul, localizada em Brasilândia, MS.
As atividades laboratoriais foram executadas no Laboratório de Enfermidades
Infecciosas dos Animais e no Laboratório de Virologia Animal, do Departamento de
Apoio, Produção e Saúde Animal, Unesp, Campus de Araçatuba, SP.
4.2 Vacinas Comerciais
As três vacinas comerciais polivalentes distintas, contendo Clostridium chauvoei,
foram adquiridas em lojas comerciais, com a observação dos prazos de validade e de
conservação. Após a aquisição, os produtos foram identificados por uma numeração de
1 a 3.
18
4.3 Grupos Experimentais
4.3.1 Experimento 1: Resposta sorológica em bezerros induzida por vacina
comercial polivalente contra clostridioses
Foram avaliados 60 bezerros mestiços (Nelore, Aberdeen Angus, Brahman e
Red Angus), cujas mães multíparas haviam sido submetidas ao manejo sanitário da
propriedade, constando de duas vacinações anuais contra o carbúnculo sintomático
(maio e novembro). Os bezerros foram divididos em três grupos (n=15 cada),
submetidos aos diferentes esquemas de vacinação, com o emprego de uma vacina
comercial polivalente (V1) contra clostridioses. A vacinação foi realizada por via
subcutânea segundo a dose recomendada pelo fabricante. O Grupo 1 foi vacinado aos
4 meses e na desmama (8 meses). O Grupo 2 foi primovacinado na desmama e
recebeu reforço 30 dias após. O Grupo 3 recebeu uma única dose da vacina na
desmama. Como controle (n=15), foi avaliado sorologicamente bezerros não vacinados
e pertencentes ao mesmo lote de animais. As coletas do soro foram realizadas aos 4, 8,
9 e 10 meses após o nascimento, aproximadamente.
4.3.2 Experimento 2: Anticorpos de origem colostral em bezerros
Foram avaliados sorologicamente 36 bezerros recém-nascidos da raça Nelore,
cujas mães foram vacinadas contra o carbúnculo sintomático pelo menos 2 meses
antes da parição e receberam um reforço 42 dias após, com duas vacinas comerciais
polivalentes (V2, n=12 e V3, n=12). Como controle (n=12), foram avaliados
sorologicamente bezerros filhos de vacas não vacinadas. As coletas do soro foram
realizadas nos dias 7 (±2), 45 e 90 após o nascimento.
19
4.3.3 Experimento 3: Resposta sorológica em vacas multíparas com idade
superior a 4 anos
Foram avaliadas 30 vacas cuja faixa etária era superior a 4 anos, da raça Nelore,
sem o histórico de vacinação contra o carbúnculo sintomático havia pelo menos dois
anos.
4.4 Coleta e Armazenamento do Soro
As amostras de sangue foram coletadas dos bezerros e das vacas através de
punção da veia jugular externa, com auxílio de tubos Vacuntainer
®
. As amostras de
sangue foram mantidas a temperatura ambiente até a retração completa do coágulo.
Posteriormente, foram centrifugadas para obtenção do soro. Este permaneceu
congelado (-20ºC) até o momento de sua utilização nos testes sorológicos.
4.5 Soros Controles
Os soros positivos utilizados na padronização dos testes de aglutinação em
placa e Elisa foram obtidos de dois bovinos de 18 meses de idade submetidos a três
doses de uma vacina comercial polivalente contra clostridiose, sendo o intervalo entre
as vacinações de 15 dias.
O soro negativo utilizado na padronização dos testes de aglutinação em placa e
Elisa foram obtidos de um bezerro recém-nascido, antes da ingestão do colostro.
20
4.6 Cepas de Clostridium chauvoei
Para os testes de aglutinação em placa e Elisa foram empregadas como
antígenos duas cepas distintas de Clostridium chauvoei, denominadas MT (cepa oficial)
e SP (cepa de campo). A cepa MT de referência foi fornecida pelo MAPA. A cepa SP foi
isolada de surto natural, devidamente identificada pelo método de reação em cadeia de
polimerase (PCR) e mantida na bacterioteca do Laboratório de Enfermidades
Infecciosas dos Animais, no Departamento de Apoio Produção e Saúde Animal, Unesp,
Campus de Araçatuba.
4.7 Teste de Aglutinação em Placa
4.7.1 Produção do Antígeno de Clostridium chauvoei
As cepas de Clostridium chauvoei de referência (MT) e de campo (SP) foram
cultivadas em meio modificado de cultura (Anexo I) descrito por CLAUS & MACHEAK
(1972b).
O meio modificado foi ajustado para um pH 7,2 e autoclavado a 121°C por 15
minutos em tubos de 20 mL e dois balões volumétricos de 500 mL. Logo após, o meio
foi resfriado a 37°C e posteriormente identificado e armazenado a 4°C. Para o repique
das cepas MT e SP, 1 mL de cada cultura de Clostridium chauvoei em atividade
crescente foi adicionado aos tubos de 20 mL e incubados por 12 horas a 37°C em
jarras de anaerobiose (Oxoid
®
) juntamente com o Anaerogen
®
. A verificação do
crescimento satisfatório tornou-se possível pelo aspecto turvo e pela formação de
bolhas de gás. Esfregaços corados pelo Gram foram realizados para verificar as
características morfo-tintoriais e monitorar o crescimento bacteriano.
A inoculação da cultura de Clostridium chauvoei das cepas MT e SP em balões
volumétricos de 500 mL ocorreu durante o crescimento ótimo, quando 10 mL da cultura
do tubo foram semeadas nos mesmos. Os balões volumétricos foram colocados em
21
jarras de anaerobiose (Oxoid
®
) contendo Anaerogen
®
, em conjunto com alguns tubos
de 20 mL para observação dos respectivos crescimentos. Foram incubados a 37°C por
48 horas, quando observadas a formação de bolhas e a turvação do meio.
Formalina foi adicionada na concentração de 1% do volume final e levemente
misturada pelo agitador magnético. A cultura formolizada foi incubada por 18 horas a
37°C. Depois, a cultura foi centrifugada (Eppendorf Centrifuge 5810R
®
) a 3.000 rpm
durante 20 minutos a 4°C. As células precipitadas (pellet) foram ressuspensas em
solução salina tamponada (Anexo II) contendo 0,1% de formalina.
O antígeno foi mantido a 4°C em tubo cônico de plástico e padronizado na
concentração de 4 x 10
8
bactérias/ml empregando-se o teste de turbidez segundo a
escala de Mac Farland (BIER,1980).
4.7.2 Procedimento do Teste
O teste de aglutinação foi conduzido em placa e caixa de Huddleson, segundo a
metodologia de CLAUS & MACHEAK (1972b). Foram adicionados 40 µL do antígeno de
cada cepa as quantidades de 40 µL, 20 µL, 10 µL, 5 µL e suas respectivas diluições
1:10 e 1:100 dos soros bovinos a serem avaliados (Tabelas 1 e 2). Os soros foram
diluídos em solução fisiológica (0,85% NaCl). A mistura foi realizada manualmente, com
auxílio de espátulas descartáveis, seguida de 15 movimentos circulares.
Posteriormente, a placa permaneceu na caixa escura de Huddleson por 10 minutos.
Depois, foram realizados mais 30 movimentos circulares com a placa. A leitura das
reações foi efetuada com iluminação indireta da caixa de Huddleson, onde a mistura
antígeno-soro pode ser examinada macroscopicamente, seguindo o mesmo
procedimento de leitura do teste de brucelose.
22
Tabela 1. Quantidade da mistura antígeno-soro para o teste de aglutinação em placa.
Antígeno
40 µL 40 µL 40 µL 40 µL
+ + + +
Soro
40 µL 20 µL 10 µL 5 µL
Tabela 2. Procedimento de diluição do soro para o teste de aglutinação em placa.
Diluição do soro
Volume (µL) de soro
Não Diluído 40 20 10 5
1/10 4 2 1 0,5
1/100 0,4 0,2 0,1 0,05
Quando um soro de alto título é testado, a aglutinação deve ocorrer ao redor da
periferia da mistura antígeno-soro. Em soro de baixo título, a aglutinação deve produzir
grânulos vistos inteiramente na mistura.
As reações foram consideradas positivas quando houve uma aglutinação
periférica e central da mistura antígeno-soro. A aglutinação apenas central da mistura
foi considerada como reação negativa, sendo atribuída à reação de auto-aglutinação
desenvolvida pela bactéria. As interpretações dos títulos dos soros bovinos individuais
seguiram o mesmo protocolo de diluição da brucelose (Tabela 3).
Tabela 3. Interpretação do título para o teste de aglutinação em placa.
Diluição / Volume de Soro
40 µL 20 µL 10 µL 5 µL
Não Diluído 25 50 100 200
1/10 250 500 1.000 2.000
1/100 2.500 5.000 10.000 20.000
23
4.8 Teste de Elisa
4.8.1 Produção do Antígeno de Clostridium chauvoei
As cepas de Clostridium chauvoei de referência (MT) e de campo (SP) foram
cultivadas em Meio Reforçado de Clostrídio (Oxoid
®
) conforme recomendado por
CRICHTON et al. (1990).
As culturas foram incubadas em balões volumétricos de 500 mL por 24 horas a
37ºC em jarras de anaerobiose (Oxoid
®
) contendo Anaerogen
®
. As células bacterianas
foram centrifugadas (Eppendorf Centrifuge 5810R
®
) a 3.000 RPM durante 20 minutos a
4ºC. As células precipitadas (pellet) retornaram em 50% ao seu volume original em
meio tampão DPBS (Anexo III), e depois foram centrifugadas novamente. Após duas
lavagens, as células foram suspensas em 25 mL de solução tamponada de fosfato de
sódio (Anexo III).
A suspensão celular foi sonicada por 10 minutos em tubo cônico de plástico
contendo um volume de 10 a 15 mL. Depois, a suspensão celular foi misturada e
mantida congelada em tubos de criopreservação (Nunc
®
) de 1 mL a -70ºC. Os
antígenos tiveram suas concentrações protéicas dosadas pelo método calorimétrico do
ácido bicinconinico (BCA), atingindo as seguintes concentrações: 2,72 mg/mL para a
cepa MT e 2,50 mg/mL para a cepa SP.
4.8.2 Procedimento do Teste
Os antígenos e os soros controles positivos e negativos sofreram uma série de
diluições, enquanto o conjugado foi mantido na diluição de 1:10.000.
Os antígenos MT e SP foram submetidos às diluições 1:50, 1:100, 1:200, 1:400,
1:800 e 1:1.600 em duplicata utilizando placas individuais para cada antígeno.
Os soros controles, positivo e negativo, foram diluídos a 1:50, 1:100, 1:200,
1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400, 1:12.800, 1:25.600, 1:51.200 e 1:102.400 em
24
quadruplicata nas placas, exceto as diluições 1:51.200 e 1:102.400 do soro controle
negativo, que foram em duplicata. Quatro orifícios da placa foram utilizados como
controle da mesma (branco).
Verificou-se nas diluições 1:50 dos antígenos MT e SP e 1:100 dos soros
controles positivo e negativo uma diferença acentuada dos valores de absorbância
entre bovinos que apresentam uma resposta sorológica considerada satisfatória para a
presença de anticorpos contra o Clostridium chauvoei de bovinos sem a ingestão de
colostro, ou seja, ausência total de anticorpos.
Placas de microtitulação de 96 orifícios (Nunc
®
) foram sensibilizadas com 100
µL/poço de antígeno diluído em tampão carbonato-bicarbonato (TCB) (Anexo IV) cuja
diluição foi 1:50, em câmara úmida por 12 horas a 4ºC. Depois, as placas foram
submetidas a um ciclo de três lavagens com PBS Tween 0,05% (PBS-T) (Anexo IV) em
uma lavadora automática de placas.
O bloqueio foi realizado com 200 µL de leite em pó desnatado (LPD - Molico
®
)
10% diluído em TCB por orifício. As placas foram incubadas em câmara úmida a 37ºC
durante 45 minutos, e em seguida foram realizadas as lavagens conforme descrito
anteriormente.
Na seqüência, foram adicionados 100 µL dos soros testes e controles diluídos
em PBS (Anexo IV) + 10% LPD, cuja diluição foi 1:100. Dois orifícios da placa não
receberam soro, somente o tampão, e foram utilizados como o controle da placa
(branco). As placas foram incubadas a 37ºC por 60 minutos. Nova seqüência de
lavagens com PBS-T foi realizada.
Posteriormente, cada orifício da placa recebeu 100 µL de conjugado
imunoenzimático comercial (SIGMA
®
), correspondente a soro de coelho anti Ig G bovina
conjugado com peroxidase na diluição de 1:10.000 em PBS + 10% LPD, sendo as
placas incubadas novamente a 37ºC por 90 minutos. Mais uma seqüência de lavagem
com PBS-T foi realizada.
A seguir, foram adicionados 50 µL por orifício da solução de substrato orto-
fenileno-diamina (OPD), diluída em tampão citrato-fosfato (Anexo IV). A reação foi
interrompida após 15 minutos com solução de HCl 2 M (50 µL/orifício). A leitura foi
25
realizada em um espectrofotômetro (Labsystem - Multiskan EX
®
) para microplacas, em
filtro de 492 nm.
4.9 Análise Estatística
4.9.1 Análise Estatística Convencional
Os dados dos testes de aglutinação em placa e Elisa foram transformados em
log (x+1) e submetidos à análise de variância com medidas repetidas e análise dos
resíduos para verificar a normalidade e homogeneidade de variâncias, pré-requisitos
necessários para a análise de variância. Entretanto, os dados do primeiro teste foram
apresentados em médias geométricas. As médias foram comparadas pelo teste de
Tukey, e os dados foram considerados significativos quando p<0,05.
O mesmo teste foi empregado para analisar a imunidade passiva em bezerros
até os três meses de idade, além de análise de correlação e regressão dos valores de
anticorpos maternos (títulos do teste de aglutinação em placa e densidade óptica)
contra as cepas de referência (MT) e de campo (SP) de Clostridium chauvoei, em
função do dia do nascimento dos bezerros após a vacinação das mães.
As análises estatísticas foram efetuadas empregando-se o programa SAS
(Statistical Analysis System - 1999).
4.9.2 Análise Estatística Bayesiana
A análise Bayesiana consiste na obtenção de medidas, resumos ou densidades
a “posteriori” para os parâmetros de interesse nos modelos em estudo. Estas medidas
ou densidades são obtidas combinando as informações a “priori” sobre os parâmetros
de interesse e informações contidas nos dados da amostra. No entanto, nem sempre a
função de verossimilhança e as distribuições a “priori” são analiticamente tratáveis. No
26
presente estudo, os valores analisados foram selecionados a “priori” e definidos como:
animais (n=15) com vacinação aos 4 meses e reforço aos 8 meses pertencentes ao
grupo 1 (G1) do experimento 1 (resposta sorológica em bezerros induzidos com vacina
comercial polivalente contra clostridioses); como antígeno empregou-se o resultado da
cepa de referência (MT). Nesse sentido, foram comparadas em modelos individuais as
técnicas sorológicas calculando a sensibilidade (se), a especificidade (sp) e a
prevalência de anticorpos, com intuito de observar qual a metodologia sorológica se
aplica à determinação do melhor momento para a revacinação. Os dados foram
tratados utilizando o software gratuito da Universidade de Davis, Califórnia, USA
(http://www.epi.ucdavis.edu/diagnostictests/). Os valores modais foram transformados
pelo sistema de beta distribuição com o programa computacional BETABUSTER 1.0
free software. Para a condicional independente, o modelo Bayesiano gerado foi 1
população, 2 testes e a ausência de um “gold test” ou teste padrão. A sensibilidade e a
especificidade de cada teste, o módulo, a prevalência e os valores de beta (α,β) foram
submetidos à análise de inferência Bayesiana ilustrada a seguir:
TESTE DE AGLUTINAÇÃO EM PLACA
model
{
Tpos ~ dbin(p, n)
p <- pi*Se + (1-pi)*(1-Sp)
Z ~ dbern(tau0)
Se ~ dbeta(88.28,1.89) ## Mode=0.99, 95% sure Se > 0.95
Sp ~ dbeta(20.63, 1.19) ## Mode=0.99, 95% sure Sp > 0.85
pistar ~ dbeta(130.70, 15.41 ) ## Mode=0.9, 95% sure pistar > 0.85
pi <- Z*pistar
piequal0 <- equals(pi,0)
}
list(n=15, Tpos=15, tau0=0.95)
list(pistar=0.9, Se=0.99, Sp=0.99, Z=0)
27
TESTE DE ELISA INDIRETO
model
{
Tpos ~ dbin(p, n)
p <- pi*Se + (1-pi)*(1-Sp)
Z ~ dbern(tau0)
Se ~ dbeta(88.27, 1.88) ## Mode=0.99, 95% sure Se > 0.95
Sp ~ dbeta(12.92, 1.12) ## Mode=0.99, 95% sure Sp > 0.78
pistar ~ dbeta(130.70, 15.41) ## Mode=0.9, 95% sure pistar > 0.85
pi <- Z*pistar
piequal0 <- equals(pi,0)
}
list(n=15, Tpos=15, tau0=0.95)
list(pistar=0.9, Se=0.99, Sp=0.99, Z=0)
28
5 RESULTADOS
5.1 Teste de Aglutinação em Placa
5.1.1 Experimento 1: Resposta sorológica em bezerros induzida por vacina
comercial polivalente contra clostridioses
Nos três esquemas de vacinação avaliados houve um aumento significativo
(p<0,05) nos títulos médios de anticorpos aglutinantes séricos após a vacinação ou
reforço. Os bezerros primovacinados aos 4 meses de idade (G1) apresentaram títulos
de anticorpos aglutinantes quando avaliados aos 8 meses e não diferiram dos outros
dois esquemas de vacinação (G2 e G3) quando avaliados aos 10 meses de idade. Os
títulos de anticorpos aglutinantes dos primovacinados aos 8 meses de idade e reforço
vacinal 30 dias após (G2) não diferiram dos outros dois esquemas (G1 e G3). Os
bezerros primovacinados na desmama (G3) apresentaram um aumento significativo nos
títulos médios de anticorpos quando avaliados 30 dias após, no entanto aos 10 meses
não diferiram dos outros grupos avaliados. Quando a aglutinação foi realizada com a
cepa de campo (SP), os títulos de anticorpos foram significativamente inferiores aos 4
meses e aos 9 meses de idade na avaliação do G3 (Tabela 4).
29
Tabela 4. Média geométrica dos títulos da resposta sorológica contra o Clostridium
chauvoei de bezerros induzidos com uma vacina comercial polivalente (V1)
contra clostridioses, avaliados pelo teste de aglutinação em placa.
Meses
Cepa Grupo
4 8 9 10
G1 120,30 aC 757,85 aB 1.906,66 aA 1.447,26 aA
G2 138,19 aB 109,68 bB 1.823,44 aA 1.741,10 aA
G3 151,57
aB* 95,48 bC 1.096,82 bA* 1.319,50 aA
MT
Controle 65,97
bB 52,36 cBC 47,74 cC 182,34 bA
G1 120,30
aC 793,70 aB 1.561,49 aA 1.259,92 aA
G2 114,87 aB 100,00 bB 1.587,40 aA 1.662,47 aA
G3 114,87
aC 95,48 bC 793,70 bB 1.319,50 aA
SP
Controle 65,97
bB 52,36 cBC 50,00 cC 182,34 bA
Médias seguidas de letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem entre si pelo
teste de Tukey (P < 0,05).
* Diferença significativa em relação à cepa SP (P < 0,05).
G1 = vacinados aos 4 e 8 meses; G2 = vacinados aos 8 e 9 meses; G3 = vacinados 8 meses; Controle =
não vacinados.
5.1.2 Experimento 2: Anticorpos de origem colostral em bezerros
Houve uma redução significativa (p<0,05) dos títulos de anticorpos passivos dos
bezerros, quando avaliados aos 45 e 90 dias após o nascimento. Não houve diferença
entre as duas vacinas polivalentes avaliadas. A resposta sorológica passiva dos
animais foi significativamente inferior (p<0,05) quando o antígeno empregado no teste
de aglutinação em placa foi elaborado com a cepa de campo (SP) (Tabela 5).
Na análise dos títulos obtidos pelos grupos aos 7 dias de vida, não foi verificada
uma correlação linear entre os dias de vacinação das mães antes do parto e o
nascimento dos bezerros. À medida que transcorreu mais tempo da vacinação das
mães até o parto, não foi detectada uma redução do título de anticorpos maternos nos
30
bezerros (Tabela 6). A representação gráfica da correlação linear entre o dia da
vacinação das mães e o dia do parto está registrada nas Figuras 1 e 2.
Tabela 5. Média geométrica dos títulos da resposta sorológica passiva contra o
Clostridium chauvoei de bezerros cujas mães foram induzidas com duas
vacinas comerciais polivalentes (V2 e V3) contra clostridioses, avaliados pelo
teste de aglutinação em placa.
Idade (dias aproximados)
Cepa Grupo
7 45 90
V2 4.372,59 aA* 219,49 aB* 59,50 aC
V3 2.562,13 bA 203,38 aB 59,52 aC
MT
Controle 59,54
cA 39,74 bB 0 bC
V2 3.041,03
aA 203,75 aB 47,21 aC
V3 1.811,97 aA 188,79 aB 56,26 aC
SP
Controle 63,09
bA 39,74 bB 0 bC
Médias seguidas de letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem entre si pelo
teste de Tukey (P < 0,05).
* Diferença significativa em relação à cepa SP (P < 0,05).
Tabela 6. Coeficiente de correlação linear entre os dias de vacinação das mães e de
nascimento dos bezerros para o teste de aglutinação em placa e as cepas de
referência (MT) e de campo (SP).
Cepa Coeficiente de correlação (R)
Referência (MT) - 0,295
Campo (SP) -0,327
31
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 20 40 60 80 100 120 140
Dias do nascimento após a vacinação das mães
Títulos do Teste de Aglutinação
em Placa (Cepa MT)
Figura 1. Diagrama de dispersão dos títulos de anticorpos passivos maternos avaliados
pelo teste de aglutinação em placa para a cepa de referência (MT) de
Clostridium chauvoei, em função do dia de nascimento dos bezerros após a
vacinação das mães.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 20 40 60 80 100 120 140
Dias do nascimento após a vacinação das mães
Títulos do Teste de Aglutinação
em Placa (Cepa SP)
Figura 2. Diagrama de dispersão dos títulos de anticorpos passivos maternos avaliados
pelo teste de aglutinação em placa para a cepa de campo (SP) de Clostridium
chauvoei, em função do dia de nascimento dos bezerros após a vacinação das
mães.
32
5.1.3 Experimento 3: Resposta sorológica em vacas multíparas com idade
superior a 4 anos
As 30 vacas avaliadas sorologicamente apresentaram títulos de anticorpos
aglutinantes séricos. Esses títulos oscilaram de valores entre 200 e 500 para ambas as
cepas. Houve uma diferença significativa (p<0,05) dos títulos quando o antígeno
empregado no teste de aglutinação em placa foi elaborado com a cepa de campo (SP).
A cepa de referência (MT) apresentou uma média geométrica do título de 236,11
enquanto a cepa de campo (SP) obteve 215,61.
5.2 Teste de Elisa
5.2.1 Experimento 1: Resposta sorológica em bezerros induzida por vacina
comercial polivalente contra clostridioses
Nos três esquemas de vacinação avaliados houve um aumento significativo
(p<0,05) nos valores médios de anticorpos séricos após a vacinação ou o reforço
(Tabela 7 e Figuras 3 e 4).
Os bezerros do G1, primovacinados aos 4 meses, apresentaram uma redução
dos títulos de anticorpos quando avaliados aos 8 meses. Após o reforço aos 8 meses
de idade houve um aumento significativo dos valores, gerando uma diferença em
relação aos outros dois esquemas de vacinação (G2 e G3) aos 9 meses, mas não
diferiu do G2 quando avaliado aos 10 meses de idade. Os valores de anticorpos dos
primovacinados aos 8 meses de idade e reforço vacinal 30 dias após (G2) não diferiram
do G3 aos 9 meses (Tabela 7 e Figuras 3 e 4).
Os bezerros primovacinados na desmama (G3) apresentaram um aumento
significativo dos valores de anticorpos quando avaliados 30 dias após, no entanto aos
10 meses diferiram dos outros grupos avaliados (G1 e G2), mas não do controle.
Quando o teste de Elisa foi realizado com a cepa de campo (SP), os valores de
33
anticorpos foram significativamente inferiores em dois momentos da avaliação no G1,
um no G3 e três no Controle. Quando se empregou a cepa de referência (MT), os
valores foram significativamente inferiores em um momento da avaliação no G1 e outro
no G2 (Tabela 7 e Figuras 3 e 4).
Tabela 7. Valores médios e desvio padrão da resposta sorológica (DO) contra o
Clostridium chauvoei de bezerros induzidos com uma vacina comercial
polivalente (V1) contra clostridioses, avaliados pelo teste de Elisa.
Meses
Cepa Grupo
4 8 9 10
G1 0,424 ± 0,227 aB 0,256 ± 0,133 abB* 1,045 ±0,336 aA* 0,830 ±0,275 aA*
G2 0,289 ± 0,161 abC 0,101 ± 0,060 bD* 0,504 ±0,183 bB 0,986 ±0,310 aA
G3 0,299 ± 0,156 abAB 0,240 ± 0,193 abB* 0,447 ±0,231 bA 0,325 ±0,169 bAB
MT
Controle
0,178 ± 0,082 bB 0,386 ± 0,325 aA* 0,203 ±0,132 cB* 0,266 ±0,125 bAB*
G1 0,401 ± 0,237 aB 0,356 ± 0,146 aB 0,865 ±0,307 aA 0,772 ±0,254 aA
G2 0,282 ± 0,141 abC 0,140 ± 0,088 bC 0,497 ±0,193 bB 0,970 ±0,296 aA
G3 0,314 ± 0,141 abA 0,171 ± 0,141 bB 0,427 ±0,210 bA 0,318 ±0,126 bA
SP
Controle
0,192 ± 0,068 bA 0,230 ± 0,185 abA 0,179 ±0,139 cA 0,231 ±0,112 bA
Médias seguidas de letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem entre si pelo
teste de Tukey (P < 0,05).
* Diferença significativa em relação à cepa SP (P < 0,05).
G1 = vacinados aos 4 e 8 meses; G2 = vacinados aos 8 e 9 meses; G3 = vacinados 8 meses; Controle =
não vacinados.
34
Figura 3. Resposta sorológica (DO) para a cepa de referência (MT) de Clostridium
chauvoei em bovinos, induzida por uma vacina comercial polivalente (V1)
contra clostridioses em três protocolos distintos de vacinação (G1, G2 e G3), e
avaliados pelo teste de Elisa em diferentes momentos.
Figura 4. Resposta sorológica (DO) para a cepa de campo (SP) de Clostridium chauvoei
em bovinos induzida por uma vacina comercial polivalente (V1) contra
clostridioses em três protocolos distintos de vacinação (G1, G2 e G3), e
avaliados pelo teste de Elisa em diferentes momentos.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Meses
DO Cepa MT
G1 G2 G3 Controle
4 8 9 10
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Meses
DO Cepa SP
G1 G2 G3 Controle
4 8 9 10
35
5.2.2 Experimento 2: Anticorpos de origem colostral em bezerros
Houve uma redução significativa (p<0,05) dos valores de anticorpos passivos
dos bezerros, quando avaliados aos 45 e 90 dias após o nascimento. Não houve
diferença entre as duas vacinas polivalentes avaliadas. A resposta sorológica passiva
do grupo controle apresentou-se significativamente inferior (p<0,05) quando o antígeno
empregado no teste de Elisa foi elaborado com a cepa de campo (SP) (Tabela 8 e
Figuras 5 e 6).
Na análise dos valores obtidos pelos grupos aos 7 dias de vida, foi verificada
uma correlação linear entre os dias de vacinação das mães antes do parto e o
nascimento dos bezerros. À medida que transcorreu mais tempo da vacinação das
mães até o parto, menores foram os valores de anticorpos de origem materna
detectados nos bezerros (Tabela 9). A representação gráfica da correlação linear entre
o dia da vacinação das mães e a época do parto está registrada nas Figuras 7 e 8.
Tabela 8. Valores médios e desvio padrão da resposta sorológica passiva (DO) contra o
Clostridium chauvoei de bezerros cujas mães foram induzidas com duas
vacinas comerciais polivalentes (V2 e V3) contra clostridioses, avaliados pelo
teste de Elisa.
Dias
Cepa Grupo
7 45 90
V2
1,098 ±0,188
aA 0,603 ±0,150 aB 0,305 ±0,122 aC
V3
1,164 ±0,106
aA 0,551 ±0,171 aB 0,355 ±0,160 aC
MT
Controle
0,651 ±0,237
bA 0,348 ±0,162 bB* 0,124 ±0,085 bC
V2
1,117 ±0,193
aA 0,607 ±0,162 aB 0,311 ±0,134 aC
V3
1,147 ±0,078
aA 0,553 ±0,177 aB 0,359 ±0,164 aC
SP
Controle
0,633 ±0,231
bA 0,332 ±0,161 bB 0,121 ±0,086 bC
Médias seguidas de letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem entre si pelo
teste de Tukey (P < 0,05).
* Diferença significativa em relação à cepa SP (P < 0,05).
V2 = Vacina polivalente 2; V3 = Vacina polivalente 3; Controle = não vacinados.
36
Figura 5. Imunidade natural passiva para a cepa de referência (MT) de Clostridium
chauvoei em bezerros até 90 dias de idade, avaliada pelo teste de Elisa.
Figura 6. Imunidade natural passiva para a cepa de campo (SP) de Clostridium
chauvoei em bezerros até 90 dias de idade, avaliada pelo teste de Elisa.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Dias após o nascimento
DO Cepa MT
G3 G4 Controle
7 45 90
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Dias após o nascimento
DO Cepa SP
G3 G4 Controle
7 45 90
37
Tabela 9. Coeficiente de correlação linear entre os dias de vacinação das mães e de
nascimento dos bezerros para o teste de Elisa e as cepas de referência (MT) e
de campo (SP).
Cepa Coeficiente de Correlação (R)
Referência (MT) -0,528*
Campo (SP) -0,497*
* Diferença significativa (P < 0,05).
y = -0,0042x + 1,4913
R
2
= 0,2784
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
0 20 40 60 80 100 120 140
Dias do nascimento após a vacinação das mães
Densidade Óptica (DO) do Teste
de Elisa (Cepa MT)
Figura 7. Diagrama de dispersão dos valores de anticorpos maternos (DO) pelo teste de
Elisa para a cepa de referência (MT) de Clostridium chauvoei, em função do
dia de nascimento dos bezerros após a vacinação das mães, com a
representação da reta ajustada e coeficiente de determinação (R
2
).
38
y = -0,0037x + 1,4537
R
2
= 0,2467
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
0 20 40 60 80 100 120 140
Dias do nascimento após a vacinação das mães
Densidade Óptica (DO) do Teste
de Elisa (Cepa SP)
Figura 8. Diagrama de dispersão dos valores de anticorpos maternos (DO) pelo teste de
Elisa para a cepa de campo (SP) de Clostridium chauvoei, em função do dia de
nascimento dos bezerros após a vacinação das mães, com a representação da
reta ajustada e coeficiente de determinação (R
2
).
5.2.3 Experimento 3: Resposta sorológica em vacas multíparas com idade
superior a 4 anos
As 30 vacas avaliadas apresentaram respostas sorológicas com valores (DO)
oscilando entre 0,303 e 1,551 para a cepa de referência (MT) e 0,278 e 1,437 para a
cepa de campo (SP). Houve uma redução significativa (p<0,05) da resposta sorológica
quando o antígeno empregado no teste de Elisa foi elaborado com a cepa de referência
(MT). A cepa de referência (MT) apresentou uma média e desvio padrão (DO) de 0,788
± 0,332 enquanto a da cepa de campo (SP) foi 0,833 ± 0,327.
39
5.3. Análise Bayesiana
Como resultados da inferência Bayesiana, os valores de sensibilidade (se),
especificidade (sp) e prevalência (pi) calculados para cada teste estão expressos nas
Tabelas 10 e 11, levando-se em consideração intervalo de confiança de 2,5 - 97,5%
com 9.500 interações. Os resultados foram semelhantes entre si, com valores próximos
de sensibilidade, especificidade e prevalência na detecção de anticorpos vacinais. Por
meio desta análise, foram validados os resultados obtidos pelo teste de Elisa indireto
sem a presença de um “gold test” ou teste padrão, o que seria impossível em uma
análise estatística convencional. As Figuras 9 e 10 ilustram a freqüência das interações,
revelando um padrão unimodal para sensibilidade, especificidade e prevalência de
ambos as técnicas analisadas. Dos valores obtidos, o teste de aglutinação em placas
apresentou 98,21%, 94,23% e 90,37% de sensibilidade, especificidade e prevalência,
respectivamente. Os valores de sensibilidade e prevalência foram semelhantes para o
teste de Elisa indireto, enquanto a especificidade foi inferior na análise Bayesiana,
revelando 91,4%, entretanto dentro de valores considerados altos nas análises
sorológicas. A análise de concordância apresentou-se acima de 90%, caracterizando
um resultado desejável entre os dois testes.
Tabela 10. Parâmetros obtidos pela interferência Bayesiana após 9.500 interações com
os valores de sensibilidade (se), especificidade (sp) e prevalência (pi)
calculados para o teste de aglutinação em placa.
Média Média Intervalo
confiança (IC)
Desvio padrão (dp) interações
Se 0,9821 0,9850
±0,010
9.500
Sp 0,9423 0,9560
±0,020
9.500
Pi 0,9037 0,9051
±0,050
9.500
40
Tabela 11. Parâmetros obtidos pela interferência Bayesiana após 9500 interações com
os valores de sensibilidade (se), especificidade (sp) e prevalência (pi)
calculados para o teste de Elisa indireto.
Média Média Intervalo
confiança (IC)
Desvio padrão (dp) interações
Se 0,9820 0,9849
±0,012
9.500
Sp 0,9140 0,9346
±0,023
9.500
Pi 0,9030 0,9048
±0,051
9.500
A B
Se sample: 9500
0.9 0.925 0.975 1.0
0.0
20.0
40.0
60.0
Sp sample: 9500
0.4 0.6 0.8 1.0
0.0
5.0
10.0
15.0
pi sample: 9500
0.7 0.8 0.9
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
Figura 9. Distribuição dos valores de sensibilidade (se), especificidade (sp) e
prevalência (pi) após 9.500 interações com distribuição unimodal para o teste
de aglutinação em placa (valores x = percentagem; y = densidades).
C
41
A B
Se sample: 9500
0.85 0.9 0.95 1.0
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
Sp sample: 9500
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
pi sample: 9500
0.75 0.8 0.85 0.9 0.95
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
Figura 10. Distribuição dos valores de sensibilidade (se), especificidade (sp) e
prevalência (pi) após 9.500 interações com distribuição unimodal para o teste
de Elisa indireto (valores x = percentagem; y = densidades).
C
42
6 DISCUSSÃO
A vacinação contra o carbúnculo sintomático é uma medida de grande
importância na bovinocultura e na ovinocultura, visto que a enfermidade é causa
freqüente de mortalidade (ROGERS & SWECKER, 1997). Dessa forma, é necessário
que a vacina confira alto grau de imunidade, principalmente em regiões com incidência
de surtos da enfermidade.
A vacinação é a principal medida profilática para minimizar a ocorrência da
doença nos rebanhos, no entanto, verifica-se que mesmo em rebanhos vacinados há
surtos da enfermidade (ROGERS & SWECKER, 1997), embora muitas vezes esses
episódios não sejam diagnosticados de maneira correta. A imunização dos animais
pode ser realizada a partir dos 4 meses de idade, com reforço 30 dias após a
primovacinação, seguida de vacinação anual até 3 anos de idade; após esse período o
animal adquiriria imunidade natural (KRIEK & ODENDAAL, 2004).
O MAPA testa os produtos biológicos comercializados no país e utiliza como
normativa a Portaria N° 49 (BRASIL, 1997), que avalia a eficiência da bacterina de
Clostridium chauvoei presente na vacina frente ao teste de desafio em cobaias
vacinadas, empregando-se como antígeno uma cepa de referência (oficial) denominada
MT.
Quando submetidos ao teste de desafio, os bovinos apresentam uma proteção
igual ou maior contra o Clostridium chauvoei em comparação às cobaias, demonstrando
que as cobaias são mais sensíveis à infecção causada pelo agente (CLAUS &
MACHEAK, 1972b; MACHEAK et al., 1972). Dessa forma, torna-se admissível o
emprego de cobaias no teste de controle de qualidade das vacinas contendo bacterinas
de Clostridium chauvoei.
Os bezerros vacinados com um produto comercial polivalente contra clostridioses
apresentaram um aumento significativo da resposta sorológica após a primovacinação e reforço
vacinal. Assim, o “booster” vacinal estimulou a produção de anticorpos contra o carbúnculo
sintomático.
43
Os bezerros primovacinados aos 4 meses de idade apresentaram títulos de anticorpos
aglutinantes quando avaliados aos 8 meses, ocasião em que receberam o reforço vacinal
(Tabela 4). Embora não se saiba o valor mínimo necessário para proteger os animais frente aos
desafios naturais do agente etiológico, nessa condição a vacinação dos bezerros já aos 4
meses de idade, seguida do reforço 4 meses após, elevou significativamente os anticorpos.
Aos 10 meses de idade, os três grupos vacinados não apresentaram diferenças
significativas (p<0,05) entre si nos títulos de anticorpos aglutinantes (Tabela 4). Entretanto, os
valores de anticorpos foram similares entre G1 e G2, e diferiram significativamente (p>0,05) de
G3 quando avaliados pelo teste de Elisa (Tabela 7).
Possivelmente esses valores encontrados são suficientes para a garantia de uma boa
imunidade ao rebanho nesse período. Contudo, torna-se necessário reavaliar a duração dessa
imunidade e o protocolo de vacinação a partir dos 10 meses de idade, o que não foi objeto
deste estudo.
Considera-se que a imunidade natural passiva é de importância para a profilaxia
do carbúnculo sintomático, visto que animais com idade inferior a 8 meses raramente
desenvolvem o quadro clínico da enfermidade (KRIEK & ODENDAAL, 2004).
A avaliação da resposta sorológica passiva dos bezerros, filhos de vacas
vacinadas contra o Clostridium chauvoei pelo menos 30 dias antes do parto, revelou
valores significativamente superiores aos bezerros cujas vacas não receberam a
vacinação (Tabelas 5 e 8). Os títulos de anticorpos aglutinantes para clostridioses entre
os dias 50 e 53 após o nascimento em bezerros foram incrementados quando suas
respectivas mães receberam uma dose da vacina comercial aproximadamente 4 meses
antes da parição (TROXEL et al., 1997).
Entretanto, esses anticorpos colostrais diminuem significativamente no
transcorrer de 3 a 4 meses (SCHIPPER et al., 1978; TROXEL et al., 2001). De fato, a
estratégia da imunização natural passiva pelo colostro deve ser viabilizada
operacionalmente em nível de rebanho, pois existe uma variação do tempo gestacional
das vacas em sistema extensivo de pecuária de corte. Em tal situação deve-se
considerar ainda a possibilidade de interferência entre a imunização ativa aos 3 meses
de idade e os anticorpos de origem colostral.
44
Houve uma correlação linear da resposta sorológica passiva dos bezerros com a época
de vacinação das mães e o dia do parto. Assim, a imunização das mães deve ser executada o
mais próximo ao parto, com o intuito de elevar os valores de anticorpos passivos detectados
nos bezerros. Sob esse aspecto, torna-se relevante a vacinação das fêmeas reprodutoras pelo
menos 30 dias antes da parição (2ª dose).
A correlação linear pode ser observada somente quando se empregou o teste de Elisa,
cujo antígeno foi preparado a partir de cultivo sonicado de Clostridium chauvoei (Tabela 9).
Entretanto, quando a avaliação sorológica foi pelo teste de aglutinação em placa, utilizando a
bactéria formolizada como antígeno, não houve correlação linear (Tabela 6); isso se deve
provavelmente às propriedades distintas dos antígenos empregados em cada técnica, o que
teria influenciado na avaliação das respostas sorológicas dos bezerros avaliados.
A ocorrência de anticorpos contra o Clostridium chauvoei, com títulos no teste de
aglutinação em placa oscilando de 200 a 500, indica que animais adultos não vacinados
havia pelo menos 2 anos ainda apresentavam títulos aglutinantes. Acredita-se que a
condição imune considerada perpétua de animais adultos estaria relacionada às
infecções repetidas causadas pela constante ingestão de esporos da bactéria presentes
no solo (KRIEK & ODENDAAL, 2004). No entanto, ainda são escassos os estudos a
respeito dessa imunidade natural adquirida pelos animais e ocasionalmente bovinos
com idade superior a 3 anos podem contrair a enfermidade.
A inexistência de ações de vigilância epidemiológica para o carbúnculo
sintomático, de uma rede laboratorial de diagnóstico veterinário, do hábito dos
profissionais em realizarem necropsia e coleta de material, e o pouco controle
zootécnico e sanitário nas propriedades rurais, associados ao fato de o teste oficial do
MAPA empregar apenas uma única cepa bacteriana (MT) para o desafio em cobaias
criam grandes fragilidades que impossibilitam a avaliação da eficácia dos programas de
vacinação no país. A isso, acrescenta-se o fato de que dezenas de laboratórios
comercializam produtos polivalentes contra clostridioses no mercado nacional,
empregando na produção de imunógenos cepas de Clostridium chauvoei de diferentes
origens. Com base nestas considerações, é possível deduzir que as vacinas
comercializadas protegeriam satisfatoriamente os rebanhos contra desafios homólogos,
ou ainda contra a cepa de referência (MT).
45
A ocorrência de episódio de alta mortalidade bovina na Austrália na década de
1970, decorrente provavelmente de falha vacinal, obrigou as autoridades sanitárias
daquele país a exigirem a inclusão de cepas de campo representativas nos produtos
comerciais (REED & REYNOLDS, 1977).
O emprego de uma cepa de campo no presente trabalho, para avaliação
sorológica, decorreu do fato de que em testes anteriores houve diferenças no grau de
proteção de cobaias vacinadas com diferentes produtos comerciais desafiados com as
cepas de referência (MT) e a cepa de campo (SANTOS, 2003).
A existência de diferenças significativas nas respostas sorológicas dos animais,
quando avaliados com uma cepa de campo (Tabelas 4, 5, 7 e 8), traz indicadores
importantes para os laboratórios produtores de vacinas e para os órgãos oficiais
envolvidos no controle dos produtos comercializados no país.
A falta de conhecimentos técnico-científicos quanto à presença do antígeno O
somático termoestável e do antígeno H flagelar termolábil na composição estrutural das
cepas de Clostridium chauvoei dificulta a fabricação de vacinas mais potentes e
capazes de imunizar os animais de forma satisfatória quando desafiados pelas cepas
de campo, pois acredita-se que esses antígenos são responsáveis pela
imunogenicidade das cepas (MOUSSA, 1959). Outro fator referente à estrutura
antigênica do Clostridium chauvoei ainda pouco estudado é a composição do
componente H, que é específico para cada espécie, tanto bovina quanto ovina
(ROBERTS, 1931), embora não se saiba exatamente a sua diferença entre as
espécies.
A imunidade protetora contra o Clostridium chauvoei é mais antibacteriana que
antitóxica, entretanto não se sabe a proporção com que o microrganismo confere um ou
outro tipo de imunidade (CHANDLER & GULASEKHARAM, 1974).
Imunologicamente ignora-se qual o fator que realmente confere melhor proteção
frente a desafios heterólogos de grande escala e se há possibilidade desses fatores
antigênicos serem utilizados como imunógenos, sem causar enfermidade nos animais.
De fato, as vacinas contra o carbúnculo sintomático são bacterinas e contém os
antígenos da cultura total do microrganismo.
46
Dentre todos os fatores relevantes na produção de imunidade contra o
Clostridium chauvoei, o mais importante é a diferença de proteção que é estimulada
pelas vacinas compostas por cepas homólogas às do ambiente e pelas vacinas
compostas por cepas heterólogas às encontradas no campo (SCHIPPER et al., 1978).
A vacinação empregando-se cepas homólogas protege melhor contra o desafio
homólogo do que contra o desafio heterólogo, pois algumas cepas induzem imunidade
com maior espectro de proteção que outras (KERRY, 1967). Deve-se relatar ainda, o
fato de algumas cepas parecerem altamente virulentas, devendo-se isso provavelmente
ao fato de que vacinas produzidas com cepas laboratoriais, que foram submetidas à
repetidas subculturas, perdem seus antígenos e assim modificam-se substancialmente,
não conferindo mais a proteção adequada (KERRY, 1967).
Assim, presume-se que o ideal seria a introdução de cepas de campo regionais
na fabricação dos produtos comerciais e a melhoria da vigilância epidemiológica, como
propõe CHANDLER (1976). Esta dedução pode ser parcialmente consubstanciada
pelas diferenças nos resultados da sorologia com o emprego da cepa de campo na
avaliação pelos testes de aglutinação em placa e Elisa.
A inexistência de um “gold test”, a dificuldade de um teste de desafio a campo e
a ausência de testes sorológicos padronizados para detecção de anticorpos contra o
Clostridium chauvoei dificultam a avaliação mais consistente dos protocolos vacinais e
da eficácia dos produtos. Nesse sentido, o emprego da análise Bayesiana possibilitou
melhor entendimento dos testes de aglutinação em placa e Elisa na avaliação
sorológica de animais vacinados. Embora os valores de sensibilidade e prevalência de
anticorpos tenham sido semelhantes e a análise de concordância entre os dois testes
foi superior a 90%, possibilitando assim o emprego de ambos na mensuração da
resposta sorológica de bovinos contra o Clostridium chauvoei, a especificidade foi
superior no teste de aglutinação em placa.
O teste de Elisa como método de avaliação da potência das vacinas contendo
antígenos de Clostridium chauvoei apresenta duas vantagens: redução significativa do
número de cobaias utilizadas e a estimativa de forma quantitativa da potência das
vacinas, quando comparado ao teste desafio em cobaia (CRICHTON et al., 1990).
47
Há uma relação entre títulos de aglutinação e imunogenicidade em bovinos
vacinados empregando-se vacinas experimentais e comerciais contendo bacterinas de
Clostridium chauvoei e desafiados experimentalmente. A imunidade protetora é
considerada satisfatória quando se torna necessário 0,5 µL de soro bovino para realizar
a completa aglutinação de 50 µL do antígeno padrão composto por Clostridium
chauvoei (MACHEAK et al., 1972).
Os resultados do presente trabalho revelaram alguns aspectos inéditos na
literatura e certamente de valor para os programas de saúde animal, com aplicação
prática e de importância na prevenção da doença, apresentando assim subsídios para a
execução de programas de vacinação contra o carbúnculo sintomático e para a
fabricação de produtos biológicos de qualidade assegurada.
48
7. CONCLUSÕES
Os resultados da resposta sorológica dos bovinos contra o Clostridium chauvoei,
empregando-se a cepa de referência (MT) e uma cepa de campo (SP) como antígenos,
avaliados pelo teste de aglutinação em placa e Elisa, permitiram concluir que:
a) independente dos protocolos empregados na vacinação de bezerros contra o
carbúnculo sintomático, a resposta sorológica foi similar aos 10 meses de idade.
b) a primovacinação dos bezerros aos 4 meses de idade e reforço na desmama (8
meses) apresentou a melhor resposta sorológica quando comparado com outros
protocolos.
c) independente das vacinas empregadas na imunização ativa das mães, a
resposta sorológica passiva dos bezerros foi similar até os 3 meses de idade.
d) houve uma correlação linear da resposta sorológica passiva dos bezerros com a
data de vacinação das mães e o dia do parto, quando empregado o teste de
Elisa.
e) todas as vacas com idade superior a 4 anos avaliadas apresentaram resposta
sorológica contra o Clostridium chauvoei.
f) a resposta sorológica dos bovinos foi significativamente inferior quando
empregou-se a cepa de campo (SP) como antígeno em dois momentos da
avaliação no G3 do primeiro experimento, em dois no V2 do segundo
experimento e no terceiro experimento do teste de aglutinação em placa.
Quando empregado o teste de Elisa, tal situação foi constatada em dois
momentos no G1, um no G3 e três no controle do primeiro experimento, e um no
controle do segundo experimento.
g) a resposta sorológica dos bovinos foi significativamente inferior quando
empregou-se a cepa de referência (MT) como antígeno em um momento da
avaliação no G1 e outro no G2 do primeiro experimento, e no terceiro
experimento do teste de Elisa.
49
h) independente dos testes empregados na mensuração da resposta sorológica dos
bovinos, os valores de sensibilidade e prevalência de anticorpos foram similares
e a análise de concordância foi superior a 90%.
50
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56
9 ANEXOS
9.1 Teste de Aglutinação em Placa
9.1.1 Anexo I - Meio de Cultura
Preparação Meio de Cultura para Clostridium chauvoei
Extrato de Carne……………………………………………………………………. 20,0 g
Peptona…………………………………………………………………………….... 10,0 g
Amido Solúvel……………………………………………………………………….. 1,0 g
Glicose……………………………………………………………………………….. 1,0 g
Cloreto de Sódio (NaCl)……………………………………………………………. 5,0 g
Cloridrato de L-cysteína (Cysteina HCL).......................................................... 0,3 g
Água Destilada…………………………………………………………………….... 1.000 mL
* Ajustar o pH a 7,2.
* Esterilização: Autoclave a 121°C por 15 minutos.
9.1.2 Anexo II - Solução Salina Tamponada (pH 7,0)
Cloreto de Sódio (NaCl)……………………………………………………………. 8,5 g
Solução de Fosfato Bibásico de Sódio (Na
2
HPO
4
) (molaridade/15)................ 30 mL
Solução de Fosfato Monobásico de Potássio (KH
2
PO
4
) (molaridade/15)........ 20 mL
Formalina 0,1%................................................................................................ 0,1 mL
Água Destilada…………………………………………………………………….... 1.000 mL
57
9.2 Teste de Elisa
9.2.1 Anexo III - Soluções utilizadas na Produção do Antígeno de Clostridium
chauvoei.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline - DPBS (pH 7,3)
Cloreto de Sódio (NaCl)……………………………………………………………. 8,0 g
Cloreto de Potássio (KCl)………………………………………………………….. 0,2 g
Cloreto de Cálcio Bi-hidratado (CaCl
2
.2H
2
O)................................................... 0,13 g
Cloreto de Magnésio Hexa-hidratado (MgCl
2
.6H
2
O)........................................ 0,1 g
Fosfato Bibásico de Sódio Bi-hidratado (Na
2
HPO
4
.2H
2
O)................................ 1,15 g
Fosfato Monobásico de Potássio (KH
2
PO
4
)...................................................... 0,2 g
Água Destilada…………………………………………………………………........ 1.000 mL
Solução Tamponada de Fosfato de Sódio (pH 8,9)
Fosfato Bibásico de Sódio Bi-hidratado (Na
2
HPO
4
.2H
2
O)................................ 7,2 g
Água Destilada………………………………………………………….................. 1.000 mL
9.2.2 Anexo IV - Soluções utilizadas na Padronização e no Procedimento do Teste.
Tampão Carbonato-Bicarbonato - TCB (0,05 M e pH 9,6)
Carbonato de Sódio (Na
2
CO
3
).......................................................................... 1,6958 g
Bicarbonato de Sódio (NaHCO
3
)...................................................................... 2,8563 g
Água Destilada.................................................................................................. 1.000 mL
58
Phosphate Buffered Saline - PBS (pH 7,0 a 7,4)
Cloreto de Sódio (NaCl)…………………………………………………………..... 15,74 g
Fosfato Bibásico de Sódio (Na
2
HPO
4
).............................................................. 1,419 g
Fosfato Monobásico de Sódio (NaH
2
PO
4
)........................................................ 1,379 g
Água Destilada…………………………………………………………………........ 1.000 mL
Phosphate Buffered Saline Tween (PBS-T) 0,05%
Cloreto de Sódio (NaCl)…………………………………………………………..... 15,74 g
Fosfato Bibásico de Sódio (Na
2
HPO
4
).............................................................. 1,419 g
Fosfato Monobásico de Sódio (NaH
2
PO
4
)........................................................ 1,379 g
Tween 80…………………………………………………………………………….. 0,5 ml
Água Destilada…………………………………………………………………….... 1.000 mL
Tampão Citrato Fosfato (pH 4,9 a 5,2)
* Solução A
Fosfato Bibásico de Sódio (Na
2
HPO
4
).............................................................. 11,9 g
Água Destilada…………………………………………………………………….... 1.000 mL
* Solução B
Ácido Cítrico…………………………………………………………………………. 7,0 g
Água Destilada…………………………………………………………………….... 1.000 mL
* 5,5 ml da Solução A + 7,0 ml da Solução B + 50 µl H
2
O
2
3% + 5 mg OPD (orto-
fenileno-diamina) → Solução Cromógeno do teste (1 placa).
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