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Celso Barbosa de Sant` Anna Filho
Reservossomos de Trypanosoma cruzi:
Caracterização morfológica e análise proteômica
Tese submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ –
visando a obtenção do grau de doutor em Ciências
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2007
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I - Introdução
I. 1 - Trypanosoma cruzi
O gênero Trypanosoma apresenta grande importância dentro da família
Trypanosomatidae, pois contém espécies de parasitas causadores de doenças de
importância médica e econômica em humanos e animais; por esta razão, tal gênero de
protozoários tem sido alvo de vários estudos. Dentre estes, podemos destacar:
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense, agentes causadores da doença do
sono em humanos; Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas em
humanos e parasitas causadores de doenças em animais, como Trypanosoma brucei,
Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma equinum (De Souza, 1999).
A doença de Chagas se apresenta com diferentes formas clínicas, altamente
prevalentes em muitos países da América Latina, tornando o parasita um importante alvo
de pesquisa no campo médico, parasitológico e da biologia celular, sempre em busca do
entendimento das questões que levam seus hospedeiros vertebrado e invertebrado à
infecção pelo parasita. As imagens do parasita obtidas com o uso da microscopia óptica e
eletrônica forneceram importantes informações sobre as estruturas do protozoário. Como
exemplo disso, temos: o núcleo, o flagelo e sua associação com o corpo celular, o
cinetoplasto, que concentra o DNA da mitocôndria única e cuja morfologia difere entre as
formas evolutivas que o T. cruzi apresenta (De Souza, 1999). Além disso, são observadas
estruturas citoplasmáticas típicas dos membros da família, como os glicossomos, que
contêm quase todas as enzimas da via glicolítica (Michels et al., 2005), os reservossomos,
que são organelas onde lipídios e proteínas ingeridos são acumulados (De Souza et al.,
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1978) e os acidocalcissomos, organelas que concentram os íons cálcio e fósforo, além
H
+
-ATPase vacuolar e Ca
2+
-ATPase (Docampo et al., 2005).
Mesmo depois de quase cem anos da descoberta da doença de Chagas, o
tratamento para esta enfermidade ainda não é satisfatório. Os quimioterápicos usados em
seu tratamento são pouco eficazes na fase aguda ou crônica da doença, além de
apresentar muitos efeitos colaterais nos pacientes em tratamento. Por este motivo, existe a
necessidade do desenvolvimento racional de novos fármacos, assim como da busca de
novos alvos para quimioterapia que estejam presentes neste protozoário e ausentes no
hospedeiro vertebrado.
I. 2 - Formas Evolutivas
O T. cruzi é um protozoário heteroxênico, pois alterna o seu ciclo evolutivo entre
um hospedeiro invertebrado e um vertebrado. Durante seu complexo ciclo de vida, o T.
cruzi apresenta três formas evolutivas (figura 1) cuja definição é baseada em três
características: 1) forma geral da célula; 2) posição do cinetoplasto em relação ao núcleo;
3) região da célula de onde emerge o flagelo. Através da análise desses parâmetros, são
distinguidas as diferentes formas evolutivas do parasita: i) os epimastigotas, que são
formas replicativas observadas no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado; ii) os
tripomastigotas, que não possuem capacidade de replicação, porém são capazes infectar
as células hospedeiras e iii) os amastigotas, formas intracelulares no hospedeiro
vertebrado, também capazes de divisão (revisto por De Souza,1999).
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Figura 1 - Aspectos morfológicos gerais das formas epimastigotas (A), tripomastigotas
(B), e amastigotas (C) do Trypanosoma cruzi (De Souza, 1999).
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I. 3 - Ciclo evolutivo do T. cruzi
Em linhas gerais, o ciclo evolutivo do T. cruzi pode iniciar-se quando o
hospedeiro invertebrado, durante o repasto sangüíneo, ingerir o sangue dos hospedeiros
vertebrados infectados. Ao chegar ao estômago, as formas tripomastigotas se diferenciam
em formas epimastigotas. No intestino, ocorre a adesão do flagelo das formas
epimastigotas às células do epitélio intestinal do hospedeiro invertebrado, em seguida dá-
se intensa multiplicação. Na porção final do intestino, ocorre um fenômeno conhecido
como metaciclogênese, onde as formas epimastigotas diferenciam-se em tripomastigotas
metacíclicos. Os tripomastigotas metacíclicos, liberados junto com as fezes do
triatomíneo, são inoculado na pele ou mucosas dos vertebrados. Estas formas infectam as
células do hospedeiro vertebrado através de um reconhecimento inicial. Neste processo,
componentes localizados na superfície do parasita e da célula do hospedeiro
desempenham importantes funções. Após a invasão, os parasitas são observados dentro
do vacúolo parasitóforo, que será destruído pela ação de enzimas do parasita, a TcTox,
liberando os tripomastigotas no citoplasma celular, onde irão diferenciar-se em
amastigotas. Os amastigotas passam por um processo de proliferação, e posteriormente
re-diferenciam-se em tripomastigotas, ocorrendo, em seguida, o rompimento das células
hospedeiras; como conseqüência, dá-se a liberação dos tripomastigotas na corrente
sangüínea, que poderão infectar novas células ou serem capturados pelo inseto vetor
durante o repasto sangüíneo, fechando o ciclo (De Souza, 1999).
O estabelecimento de condições experimentais in vitro para a reprodução das
etapas do ciclo de vida do T. cruzi possibilitou o conhecimento de vários fatores que
estão relacionados ao processo de diferenciação entre as várias formas evolutivas. O
5
processo de melhor entendimento é a metaciclogênese, isto é, a diferenciação de
epimastigotas para tripomastigotas. Atualmente são conhecidos alguns fatores que
disparam este processo, dentre eles temos: a incubação em meio pobre, a exaustão dos
nutrientes (Camargo, 1964; Figueiredo et al, 1994), determinados açúcares e aminoácidos
(Contreras et al., 1985). Recentemente, nosso grupo estabeleceu um protocolo para a
obtenção in vitro do processo reverso da metaciclogênese. Para tal fim, formas
tripomastigotas metacíclicas são incubadas em meio LIT contendo alta concentração de
soro fetal bovino e gradativamente diferenciam-se para epimastigotas (Sant´Anna et al.,
2004).
Figura 2 - Ciclo evolutivo do Trypanosoma cruzi – Tripo – tripomastigotas; Epi –
epimastigotas; Ama – amastigotas (fonte –WHO TDR Welcome Trust
http://www.who.int/tdr/diseases/chagas/lifecycle.htm acessado em 10 de abril de 2007)
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Pelo exposto acima, fica evidente que fatores nutricionais e sua disponibilidade
são importantes no próprio ciclo de vida do T. cruzi. A captação de nutrientes nestes
protozoários, e também em outros membros da família Trypanosomatidae, tem sido alvo
de estudos. Estes estudos apontam para vários mecanismos e moléculas em comum com
células de mamíferos e outros em que os tripanosomatídeos apresentam peculiaridades,
como veremos a seguir.
II - Endocitose em tripanosomatídeos
Endocitose é um processo essencial realizado pela maioria das células
eucarióticas. De forma geral, endocitose é o termo usado para a captação de
macromoléculas presentes no meio extracelular pelas células. Tem sido demonstrado que
as células eucarióticas apresentam distintas formas de captação destes nutrientes, que
podem co-existir nas mesmas células. De acordo com o diâmetro do material endocitado
podemos subdividir a endocitose em dois tipos: i) fagocitose, que é a ingestão de grandes
partículas com diâmetro superior a 250nm (ex. bactérias) e ii) pinocitose, que é a ingestão
de pequenas partículas, tipicamente macromoléculas (Mukherjee et al., 1997). A
atividade endocítica também tem sido demonstrada em protozoários parasitas sugerindo
que moléculas necessárias para este fenômeno são evolutivamente conservadas. Em
tripanosomatídeos, o processo de captação de nutrientes, as organelas que compõem a via
endocítica e as moléculas que governam estes processos vêm sendo extensivamente
descritos (revisto por McConville, 2002). Em termos de endocitose, os
tripanosomatídeos mais bem estudados são a Leishmania, o Trypanosoma cruzi e,
principalmente, o Trypanosoma brucei. Nenhuma atividade endocítica tem sido
demonstrada até então para os tripanosomatídeos monoxênicos.
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II. 1 - Via endocítica em Leishmania
A atividade endocítica em Leishmania tem sido demonstrada em formas
promastigotas e amastigotas. Assim como em T. brucei, a endocitose em Leishmania está
relacionada à nutrição e ao escape do sistema imune. Como promastigotas
invariavelmente ingerem suas macromoléculas de superfície (Weise et al., 2000; Ghedin
et al., 2001) é possível que ocorra a endocitose do complexo macromolécula-anticorpo,
embora este fenômeno não tenha sido descrito até então. Já as formas amastigotas, que
usam o estágio intracelular como escape do sistema imune do hospedeiro, endocitam e
degradam as moléculas de MHC classe II e o seu co-fator em macrófagos infectados,
evitando, assim, a apresentação de antígeno e, conseqüentemente, sua morte (De Souza
Leão et al., 1995; Antoine et al.,1999).
As formas promastigotas captam macromoléculas do meio extracelular através da
bolsa flagelar. Esta invaginação de membrana representa 3% do total da membrana de
superfície e compreende o único sítio de endocitose e exocitose. Proteínas de superfície,
ancoradas por GPI (GP63) ou proteínas transmembrana (fosfatase ácida), acumulam-se
na bolsa flagelar antes de sua ingestão e posterior acúmulo no sistema endo-lisossomal
(Weise et al., 2000; Guedin et al., 2001). Weise e colaboradores (2000) demonstraram
pela primeira vez, por microscopia eletrônica de transmissão, a existência de vesículas
revestidas brotando do Golgi e da bolsa flagelar de formas promastigotas, sugerindo a
existência de um processo endocítico dependente de moléculas de clatrina.
Posteriormente, Denny e colaboradores (2002) demonstraram in silico e por
imunolocalização a presença da cadeia pesada de clatrina (LmCHC), que por sua vez foi
localizada em estruturas vesiculares espalhadas por todo corpo celular, porém
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concentradas na região anterior de promastigotas e amastigotas. A presença de clatrina
sugere a existência de endocitose mediada por receptores a partir da bolsa flagelar de
Leishmania. Poucos receptores transmembrana têm sido identificados em
tripanosomatídeos. Em Leishmania, receptores de transferrina foram identificados em
promastigotas e caracterizados como uma glicoproteína de 70kD distinta dos receptores
de transferrina de células de mamíferos (
Voyiatzaki e Soteriadou, 1992). Recentemente,
Krishnamurthy e colaboradores (2005) estudando a captação de hemoglobina (Hb)
demonstraram que este processo ocorre através de um receptor transmembrana de 46kD
localizado na bolsa flagelar. Vale aqui ressaltar que este foi o primeiro trabalho que
realizou o processo de fusão in vitro entre endossomos de protozoários parasitas.
A partir da bolsa flagelar são observadas três distintas estruturas que compõem a
via endocítica nestas formas: i) corpos multivesiculares, ii) estruturas tubulares e iii)
túbulo multivesicular.
Os corpos multivesiculares são estruturas arredondadas com o diâmetro de 200-
300nm, são envoltos por uma unidade de membrana e se apresentam preenchidos com
várias vesículas de tamanho uniforme (45nm) e se localizam próximo ao Golgi (Weise et
al., 2000).
As estruturas tubulares são um grupo de túbulos regulares localizados próximos
ao Golgi e a bolsa flagelar. Observadas ao microscópio eletrônico de transmissão estas
estruturas são constantemente ligadas a vesículas eletronlucentes. Esta estrutura tubulo-
vesicular é componente da via endocítica, como demonstrado por experimentos de
endocitose de um traçador de fase fluida, a peroxidase. Também foi possível observar
9
que estas estruturas são acessíveis a proteínas transmembrana ou ancoradas por GPI
(Weise et al, 2000).
Um trabalho recente caracterizou o homólogo de Rab5 em Leishmania (LmRab5).
A LmRab5 foi localizada nos endossomos iniciais, que também concentram hemoglobina
endocitada por 5 minutos, tempo necessário para alcançar os endossomos iniciais em
células de mamíferos e estão localizados na região anterior das formas promastigotas
próximos à bolsa flagelar. Estes endossomos iniciais são estruturas dinâmicas e capazes
de realizar fusão homotípica, que é um processo dependente de LmRab5 (Singh et al.,
2003). Os corpos multivesiculares e as estruturas tubulares são os candidatos a
endossomos iniciais, pois, como no trabalho descrito anteriormente, a localização de
LmRab5 foi feita por imunofluorescência, ficando difícil, assim, fazer uma correlação da
estrutura-marcação. A utilização da técnica de imunocitoquímica poderá esclarecer esta
duvida.
Os túbulos multivesiculares (TM) foram primeiramente descritos em Leishmania
mexicana que super-expressavam uma enzima residente de retículo endoplasmático
envolvida na biossíntese de GPI, a dolicol fosfato manose sintase (DPMS) (Ilgoutz et al.,
1999). Neste trabalho os autores erroneamente classificaram os TM como um sub-
compartimento do retículo endoplasmático. Posteriormente, Weise e colaboradores
(2000) fizeram uma exuberante caracterização ultra-estrutural dos TM, a partir de
promastigotas congelados por alta pressão seguido da técnica de substituição a frio. Desta
forma, os TM foram caracterizados como grandes túbulos de 100-200nm de diâmetro
envoltos por membrana, que contêm várias vesículas internas e se estendem da região
anterior até a posterior. Estes túbulos fazem parte da via endocítica da formas
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promastigotas, como mostrado por endocitose de vários marcadores de fase fluida (Weise
et al., 2000; Guedin et al., 2001). Experimento usando Lysotracker, uma base fraca que se
acumula em organelas ácidas, demonstrou o caráter ácido destas estruturas (Guedin et al.,
2001). Sugere-se que estes túbulos sejam a organela final da via endocítica das formas
promastigotas. Em parasitas super-expressando moléculas transmembrana de superfície
ou ancoradas por GPI, foi observado que estas moléculas são encontradas no local
esperado, a superfície, além de acumuladas nos TM. A partir destas observações os
autores sugeriram que a super-expressão de moléculas dirige o seu acúmulo nos TM.
Comparando o tráfego de proteínas transmembrana e ancoradas por GPI, foi possível
observar que as primeiras têm maior acesso aos TM que as últimas. Também, incubando
os parasitas com ceramida foi possível demonstrar que os TM incorporam os
esfingolipídios derivados da ceramida. Interessantemente, Weise e colaboradores
demonstraram a presença de dois microtúbulos distintos que não fazem parte do conjunto
de microtúbulos sub-peliculares (SPMTs) e nem do “quadruplet” presente na bolsa
flagelar, que estão associados aos TM. Como a organização dos TM é perdida quando os
parasitas são tratados com tioridazina (Ghedin et al., 2001), um agente despolimerizador
de microtúbulos, foi sugerido que estes microtúbulos sejam os responsáveis pela sua
organização.
Este conjunto de resultados mostra que os túbulos multivesiculares são o local de
acúmulo de proteínas e lipídios ingeridos pelo parasita e constituem o compartimento
final da via endocítica nas formas promastigotas de Leishmania. Recentemente, foi
demonstrada a presença do túbulo multivesicular em L. chagasi (Alberio et al., 2004).
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Formas amastigotas presentes no vacúolo parasitóforo em macrófagos infectados
são capazes de endocitar macromoléculas que têm acesso a este vacúolo, a partir da bolsa
flagelar (Antoine et al.,1999; De Souza Leão et al., 1995; Borges et al., 1998). Este
processo também pode ser mediado por moléculas de clatrina (Denny et al., 2005).
Posteriormente, o material endocitado é degradado nos megassomos, as organelas finais
da via endocítica de amastigotas. Os megassomos são organelas descritas até bem pouco
tempo somente em Leishmania do complexo Leishmania mexicana. Recentemente,
megassomos também foram descritos em Leishmania chagasi (Alberio et al., 2004). Os
megassomos são grandes organelas citoplasmáticas, eletrondensas, envoltas por uma
unidade de membrana que varia em aspecto, tamanho e número, em alguns casos possui o
diâmetro superior ao núcleo (Pupkis et al., 1986; Ueda-Nakamura et al,. 2001). Devido ao
seu grande diâmetro, eles foram batizados como megassomos. A reconstrução
tridimensional e a morfometria demonstraram que os megassomos de Leishmania
amazonensis ocupam 5% do volume total do parasita, enquanto que os de Leishmania
mexicana ocupam 15% (Coombs et al., 1986). Os megassomos apresentam características
lisossomais, pois são organelas ácidas (Antoine et al., 1988), assim como são alvos de
agentes lisossomotrópicos (Antoine et al., 1989). Estas organelas são ricas nas hidrolases
lisossomais arilsulfatase, beta-glicosidase e cisteína protease, que são reguladas de acordo
com a forma evolutiva, pois possuem maior atividade em amastigotas que em
promastigotas (Pupkis et al., 1986). A cisteína protease, que tem sido relacionada com a
infectividade e sobrevivência do parasita (Pupkis et al., 1986), é considerada o marcador
dos megassomos (Traub-Cseko et al., 1993). A biogênese do megassomos foi descrita a
partir do processo de diferenciação in vitro de promastigotas para amastigotas (Ueda-
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Nakamura et al., 2001; 2002). As formas promastigotas apresentam várias pequenas
vesículas eletronlucentes que acumulam cisteína protease, motivo pelo qual foram
consideradas precursoras de megassomos e durante o processo de diferenciação os
precursores originam os megassomos nos amastigotas (Ueda-Nakamura et al., 2001).
II. 2 - Via endocítica em Trypanosoma brucei
O maior conhecimento sobre as questões que envolvem a via endocítica e seus
marcadores moleculares está relacionado aos tripanosomas africanos, o que foi bastante
facilitado pelo seqüenciamento total do genoma e pela introdução da técnica de
interferência de RNA (RNAi). Por serem parasitas extracelulares, sua sobrevivência no
interior do hospedeiro vertebrado depende da captação de material extracelular e evasão
do sistema imune. A endocitose em T. brucei é regulada de acordo com a forma
evolutiva, pois a forma tripomastigota sanguínea (BSF) possui uma taxa de endocitose
cerca de dez vezes maior que a forma procíclica (PCF) (Morgan et al., 2001),
Paralelamente, na diferenciação entre estas formas, é observada a alteração da expressão
de proteínas envolvidas na via endocítica, como moléculas de clatrina (Morgan et al.,
2001) e a GTPase monomérica TbRab11 (Jeffreis et al., 2001). Esta diferença pode estar
associada ao requerimento diferenciado para a sobrevivência no inseto vetor e no
hospedeiro vertebrado. A via endocítica nestes parasitas é constituída por um sistema de
organelas altamente polarizado, onde todo o aparato das vias endocítica e exocítica está
confinado na região posterior. A endocitose está restrita à bolsa flagelar, uma invaginação
de membrana de onde emerge o flagelo (Landfear, 2001). A área de membrana da bolsa
flagelar é internalizada totalmente a cada 2 minutos (Coppens et al., 1987). Da bolsa
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flagelar brotam vesículas revestidas por moléculas de clatrina que entregam o material
endocitado para um sistema de cisternas e túbulos, os endossomos iniciais. Neste parasita
foi caracterizada a cadeia pesada da molécula de clatrina (TbCLH), assim como a
subunidade ß-adaptina do complexo AP-2. A expressão de TbCLH é cerca de dez vezes
maior na forma sanguínea comparada com a procíclica. Esta diferença na expressão pode
estar relacionada com o maior requerimento nutricional das formas sanguíneas. A
TbCLH foi localizada em estruturas tubulares localizadas na região posterior do parasita,
assim como no TGN (Morgan et al., 2001).
A análise ultra-estrutural de vesículas revestidas por moléculas de clatrina
permitiu a sua subdivisão em vesículas revestidas por moléculas de clatrina de classe I
(CCVs de classe I) e classe II (CCVs de classe II) (Grünfelder et al., 2003). As vesículas
de classe I são grandes vesículas revestidas por moléculas de clatrina, com o diâmetro de
135nm, ricas em moléculas endocitadas a partir da superfície (ex. VSG) e são originadas
a partir das “coated pits”, presentes na membrana da bolsa flagelar e também revestidas
por moléculas de clatrina. É estimado que cerca de 6-7 vesículas de classe I são oriundas
da bolsa flagelar por segundo (Engstler et al., 2003). Posteriormente, estas vesículas se
fundem com as cisternas endossomois (estes endossomos serão abordados em momento
oportuno). Um fato interessante é que vesículas de classe I são ausentes em formas
procíclicas (Hung et al., 2004). As de classe II são pequenas vesículas de 50-60nm que
concentram traçadores de fase fluida, porém excluem VSG (Engstler et al., 2003), isto é,
excluem material destinado a reciclagem. Elas brotam da borda das cisternas
endossomois e dos endossomos de reciclagem e se fundem com os endossomos tardios.
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Vesículas revestidas por clatrina também foram flagradas brotando da região trans do
Golgi.
Experimento de interferência de RNA para moléculas de clatrina mostrou que esta
molécula é essencial para as formas sanguíneas, pois a não expressão de clatrina foi letal
para estas formas (Allen, et al., 2003). Também foi observada uma drástica alteração
morfológica na bolsa flagelar, que se tornou extremamente dilatada, gerando um fenótipo
denominado “BigEye”. Estes parasitas tratados perdem a capacidade de captar nutrientes
do meio externo, que permanecem acumulados na bolsa flagelar. Em contrapartida, o
processo exocítico não é alterado. Desta forma, o fenótipo conhecido como “BigEye”
pode ser gerado pela perda do balanço de membrana entre a endocitose e a exocitose. Em
formas promastigotas, RNAi levou à drástica redução da captação de macromoléculas e
aboliu completamente a sua degradação, assim como inibiu o transporte de moléculas do
retículo endoplasmático para a bolsa flagelar (Hung et al., 2004). Estas observações junto
com a ausência de caveolina no genoma do T. brucei sugerem que a endocitose mediada
por moléculas de clatrina é a principal forma de captação de nutrientes neste parasitas.
Um fato interessante é que o T. brucei apresenta uma proteína única semelhante a
dinamina (TbDLP), e o RNAi foi utilizado para definir a função desta GTPase. Desta
forma, foi possível demonstrar que a TbDLP não participa do processo de fissão de
vesículas revestidas por moléculas de clatrina, portanto, não está relacionada com
processo endocítico. Um trabalho recente, demonstrou que a TbDLP está relacionada
com a regulação do processo de divisão mitocondrial (Morgan et al., 2004).
A VSG é uma glicoproteína variante de superfície ancorada por GPI que forma
um denso revestimento nos tripanosomas africanos e tem sido extensivamente usada para
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acompanhar as vias endocítica e de reciclagem (Overath & Engstler, 2004). A VSG é
endocitada via bolsa flagelar e é concentrada em vesículas revestidas por clatrina de
classe I. Posteriormente, estas vesículas perdem seu revestimento e se fundem com as
cisternas endossomois, que podem também possuir um aspecto circular. Estas cisternas
são os endossomos iniciais, positivos para TbRab5, localizadas próximas ao núcleo,
diferente da localização periférica destas organelas em células de mamíferos.
Experimentos de bloqueio de endocitose de traçadores endocíticos à temperatura de 12ºC
em formas sanguíneas retêm estes traçadores nos endossomos iniciais (Brickman et al.,
1995). O lúmen dos endossomos iniciais é rico em VSG, porém nas extremidades estas
moléculas não são observadas. A partir das extremidades dos endossomos iniciais brotam
vesículas revestidas por clatrina de classe II, porém é observado que estas vesículas
contêm apenas marcadores de fase fluida e a VSG é reciclada para os endossomos de
reciclagem, positivos para TbRab11. Então, as CCVs de classe II entregam seu conteúdo
para os endossomos tardios, um sistema de membranas de formato irregular, positivos
para TbRab7, localizado próximo aos lisossomos e justaposto aos endossomos inicias,
porém distinto deste. Portanto, assim com em células de mamíferos, é nos endossomos
iniciais de T. brucei que ocorre a seleção do material que vai para a via de reciclagem ou
de degradação. As CCVs de classe II também foram observadas brotando a partir dos
endossomos de reciclagem, um grupo de cisternas positivas para TcRab11, e se fundindo
com os endossomos tardios. Destes endossomos ocorre também uma rota distinta e mais
lenta de tráfego para os endossomos de reciclagem. Baseado na positividade para
TcRab11, na semelhança estrutural e na localização é sugerido que os endossomos de
reciclagem dão origem às vesículas carreadoras exocíticas (EXC), que são pequenas
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cisternas espalhadas por toda região posterior do parasita e são ricas em TbRab11 e VSG
para reciclagem. No final, as EXCs fundem com a bolsa flagelar e a VSG retorna para a
superfície do parasita. É importante mencionar que ainda não foi demonstrado o tráfego
dos endossomos tardios para os lisossomos. Proteínas residentes de lisossomos e
materiais endocitados destinados à degradação são transportados aos lisossomos via os
endossomos tardios. Estes endossomos têm sido identificados também em promastigotas
de Leishmania (Weise et al., 2000) e epimastigotas de T. cruzi. No entanto, em
promastigotas de Leishmania os endossomos tardios são claramente multivesiculares,
assim como seus análogos em células de mamíferos. A formação da estrutura
multivesicular pode ter analogia com a formação de corpos multivesiculares em levedura
e células de mamíferos (Lemmon e Traub, 2000). Estes endossomos tardios representam
o ponto de convergência entre a via endocítica e exocítica, já que proteínas residentes de
lisossomos são entregues a eles via TGN. O transporte de traçadores endocíticos de
endossomos iniciais a lisossomos pode ser inibido com a incubação do parasita a baixa
temperatura (Brickman et al., 1995). Um desenho esquemático das vias endocítica e
exocítica de T. brucei pode ser observado na Figura 2 a seguir.
17
Figura 2 – A, B -
Desenhos esquemáticos mostrando a distribuição dos compartimentos das vias
endocítica e exocítica de T. brucei. C – esquema da rota de VSG + traçadores de fase fluida (setas pretas) e
apenas de traçadores de fase fluida (setas vermelhas). FL – flagelo, FAZ – região de adesão flagelar, ER –
retículo endoplasmático, FP – bolsa flagelar, BB – corpúsculo basal, RE – endossomo de reciclagem, EXC
– carreador exocítico, EE – endossomo inicial, LE – endossomo tardio, L – lisossoma, CCV I – vesícula
revestida por molécula de clatrina de classe I, CCV II - vesícula revestida por molécula de clatrina de classe
II, N – núcleo, Mt – mitocôndria, Ax – axonema, G – complexo Golgi, CCV-G - vesícula revestida por
molécula de clatrina oriundas do complexo de Golgi. (retirado de Overath & Engstler, 2004).
18
II. 2. 1 - Proteínas Rab na via endocítica de T. brucei
As proteínas da família das Rab fazem parte da superfamília das GTPases
monoméricas Ras que possuem o peso molecular que varia de 20 a 40kDa e cerca de 60
destas proteínas já foram identificadas em células de mamíferos, embora a função de
muitas delas ainda não tenha sido elucidada. Estas proteínas desempenham um papel
fundamental no tráfego de vesículas, conferindo especificidade à fusão de membranas
entre as organelas que compõem as vias endocítica e secretória (Rodman & Wandinger,
2000; Zerial & Mcbride 2001). Como cada um dos compartimentos que compõem estas
vias possuem suas Rabs específicas, estas proteínas se tornaram uma excelente
ferramenta para identificar e localizar destes compartimentos, sendo extensivamente
usadas para tais fins.
No genoma de T. brucei foram identificados 16 membros da família das Rab,
sendo que 10 delas foram localizadas e tiveram suas funções estabelecidas (revisto por
Field & Carrington, 2004). Vários compartimentos pertencentes ao sistema endossomal
de T. brucei foram descritos baseados na imunolocalização destas GTPases.
TbRab5 e TbRab11 definem diferentes populações de endossomos iniciais e que
provavelmente estão envolvidos no processo de seleção e transporte para lisossomos e na
via de reciclagem para a bolsa flagelar. A TbRab5 está associada com os endossomos
iniciais implicados na seleção de material para endossomos tardios (Field et al., 1998; Pal
et al., 2002). Duas isoformas de TbRab5 (TbRab5A e TbRab5B) foram descritas. Estas
isoformas estão co-localizadas na forma procíclica do parasita, porém na forma sanguínea
elas possuem localização distinta e medeiam o transporte de diferentes materiais (Pal et
al., 2002). TbRab5A está presente em compartimentos positivos para o VSG e receptores
19
de transferrina ancorados por GPI, e negativos para ISG
100
, uma glicoproteína
transmembrana invariante de superfície, demonstrando a participação na via de
reciclagem. No entanto, TbRab5B está presente no mesmo compartimento que ISG
100
mas não apresenta o complexo VSG-anticorpo ou receptores de transferrina (Pal et al.,
2002). Já os traçadores de endocitose de fase fluida tiveram acesso a ambos
compartimentos (Pal et al., 2002). Estas observações sugerem que a endocitose de
proteínas de membrana plasmática segue rotas distintas de acordo com a forma de
associação com a membrana: a internalização de uma proteína transmembrana é
dependente de TbRab5B, enquanto que uma proteína ancorada por GPI depende de
TbRAb5A. Estas rotas são fundamentais para as formas sanguíneas pois a depleção do
RNA destas GTPases foi letal para o parasita (Hall et al., 2004).
TbRab11 está localizada próxima a compartimentos positivos para TbRab5,
porém são compartimentos distintos. A TbRab11 co-localiza com transferrina e VSG
endocitados, sugerindo que este compartimento pode receber material de endossomos
iniciais marcados com TbRab5A, e que TbRab11 está presente em um compartimento
que participa da via de reciclagem de proteínas ancoradas por GPI, VSG e receptores de
transferrina para a superfície celular (Jeffreis et al., 2001).
Enquanto em formas
sanguíneas a TbRab11 está associada ao processo de reciclagem, em formas procíclicas
nenhuma função para esta GTPase foi encontrada. Um trabalho recente fez uma análise
profunda do papel da TbRab11 na via endocítica de T. brucei (Hall et al., 2005). Usando
RNAi os autores demonstraram que a TbRab11 é essencial e possui funções diferentes
em formas sanguíneas e procíclicas. O silenciamento da expressão da TbRAb11 é letal
para as forma sanguíneas e procíclicas, e nesta última, a morte foi mais lenta. Com a
20
RNAi para TbRab11 as formas sanguíneas foram gradativamente arredondando e a bolsa
flagelar encontra-se alargada, já nas formas procíclicas nenhuma alteração morfológica
drástica foi observada. Inesperadamente, em formas sanguíneas, a reciclagem de
transferrina foi reduzida consideravelmente, porém a endocitose não foi alterada. Como é
conhecido, a inibição da reciclagem conduz à inibição da endocitose, porém nas forma
sanguíneas foi observado o aumento compensatório na expressão do receptor de
transferrina. Em contrapartida, em formas procíclicas a endocitose de fase fluida e de
proteínas de membrana foi bastante reduzida. Interessantemente, em formas sanguíneas a
reciclagem de VSG e marcadores de fase fluida não foi inibida. Este fenômeno sugere
que embora TbRAb11 esteja presente no compartimento e em vesículas de reciclagem ela
não é fundamental para este processo (Hall et al., 2005). A TbRab5A e TbRab11 estão
envolvidas na endocitose e reciclagem do complexo VSG-anticorpo, que é a rota de
reciclagem mais rápida observada neste parasito. Logo, esta rota pode representar o
principal mecanismo de evasão do sistema imune.
Em células de mamíferos as mais bem conhecidas vias de reciclagem são
mediadas por Rab11 e Rab4. Em T. brucei, TbRab4 está localizada próxima aos
compartimentos positivos para TbRab5A. Não é possível fazer uma definição ultra-
estrutural destes compartimentos pois eles ainda não foram objeto de tal estudo. Usando
mais uma vez a interferência de RNA, demonstrou-se que a TbRab4 é fundamental para o
parasita, já que seu silenciamento leva à morte. Porém este processo foi bem mais
vagaroso que o observado para os experimentos de RNAi contra as demais proteínas
envolvidas na fase inicial de endocitose (clatrina, actina, TbRab5 e TbRab11). Também
foi demonstrado que esta GTPase não tem efeito sobre o processo de reciclagem, nem
21
sobre o processo de endocitose mediada por receptores. No entanto, o RNAi para TbRab4
levou à inibição na captação de nutrientes via endocitose de fase fluida e o tráfego deste
material para os lisossomas. TbRab4 também está envolvida no processo de
direcionamento de hidrolases lisossomais para os lisossomos (Hall et al., 2004). Outra
proteína que teve a localização estabelecida em T. brucei foi TbRab7. Assim como em
células de mamíferos, TbRab7 é observada nos endossomos tardios, porém nenhum
estudo funcional sobre esta GTPase foi ainda realizado.
II. 3 - Via endocítica em Trypanosoma cruzi
Um aspecto importante para o entendimento da biologia celular do T. cruzi é o
estudo da obtenção de nutrientes por estas células, pois tal processo constitui um dos
principais desafios encontrados por este parasita durante seu complexo ciclo vida, além
de ser necessário à sua diferenciação e desenvolvimento. Pouco se sabe sobre o processo
de captação de nutrientes, a via e tráfego endocítico e os compartimentos que compõem
esta via, assim como as proteínas residentes nestes compartimentos e seus marcadores
moleculares. Tem sido demonstrado que o processo endocítico no T. cruzi está
exclusivamente relacionado às formas epimastigotas, sendo ausentes nas formas
tripomastigotas e amastigotas (Soares et al., 1989). A forma epimastigota apresenta uma
alta capacidade endocítica e é capaz de ingerir macromoléculas presentes no meio
extracelular por endocitose de fase fluida (De Souza et al., 1978), assim como por
endocitose mediada por receptores (Soares & De Souza., 1991). Nestes estudos, foram
utilizados traçadores endocíticos, como peroxidase, proteínas ou lipoproteínas
complexadas a ouro coloidal (albumina, LDL, peroxidase, transferrina) mostrando que o
22
material é endocitado pelo parasita através da bolsa flagelar e citóstoma (Soares & De
Souza., 1991).
II. 3. 1 - Sítios de captação de nutrientes
O processo endocítico em formas epimastigotas é altamente polarizado, havendo
duas regiões especializadas na superfície do parasita para a ingestão dos nutrientes: a
bolsa flagelar e o complexo citóstoma-citofaringe.
A bolsa flagelar é uma invaginação de membrana de onde emerge o único flagelo
presente nestas formas e a membrana desta estrutura é um domínio diferente da
membrana corpo celular e da membrana do flagelo. Trata-se de uma região com ausência
de microtúbulos sub-peliculares, característica esta que permite que esta estrutura seja um
sítio de endocitose e exocitose (Landfear & Ignatushchenko, 2001).
O complexo citóstoma-citofaringe é uma estrutura encontrada somente nos
parasitas do grupo estercorária, isto é, os que são liberados junto às fezes do inseto vetor,
como o T. cruzi e o T. conorhini (Milder & Deane, 1969). Dentre as formas evolutivas do
T. cruzi, o complexo citóstoma-citofaringe é encontrado nas forma epimastigotas e
amastigotas, embora, como mencionado anteriormente, nesta última forma evolutiva
nenhuma atividade endocítica tenha sido demonstrada até então. Um estudo detalhado
por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou que este complexo possui
morfologia em formato de funil e é formado pela abertura presente na superfície do
parasita (o citóstoma) e uma invaginação de membrana, que se aprofunda bastante no
interior do corpo celular alcançando a região perinuclear (citofaringe) e que sempre é
acompanhada por um conjunto de microtúbulos e vesículas, de função ainda não
23
determinada (Milder & Deane, 1969). Em experimentos onde formas epimastigotas
foram incubadas na presença de laranja de acridina, uma base fraca que, quando
protonada, se acumula em compartimentos ácidos, foi observado o acúmulo deste corante
na citofaringe, sugerindo um possível caráter acídico desta organela (Porto-Carreiro et al.,
2000). Recentemente, foi demonstrada a presença de uma próton ATPase do tipo P na
citofaringe de epimastigotas (Vieira et al., 2005), reforçando ainda mais um possível
caráter acídico desta estrutura. Duas metodologias distintas de microscopia eletrônica
foram utilizadas para determinar o diâmetro médio da abertura do citóstoma. Martinez-
Palomo e colaboradores (1976), utilizando a técnica de criofratura, onde as células foram
fixadas por congelamento rápido e depois fraturadas no aparelho de criofratura,
determinaram que o citóstoma apresenta o diâmetro de 300nm. No entanto,
VataruNakamura e colaboradores (2004) utilizando a microscopia de varredura de alta
resolução, onde as células são fixadas quimicamente, desidratadas e secas por ponto
critico, mostraram que o citóstoma possui 150nm de diâmetro. Estes resultados sugerem
que a diferença no diâmetro está relacionada ao tipo de metodologia aplicada para a
determinação desta medida. No entanto, é possível que os dois grupos tenham analisado
parasitos em diferentes condições fisiológicas que levem à variação do diâmetro de
abertura do citóstoma. Também, as análises por criofratura da região do citóstoma
mostraram que esta região não apresenta partículas transmembrana, mas sua superfície
real é rica em glicoconjugados e delimitada por dois feixes de proteínas transmembrana
(Martinez-Palomo et al., 1976). Utilizando as técnicas de contrastação negativa (Okuda et
al., 1999) e rotina em cortes ultrafinos em microscopia eletrônica de transmissão (Porto-
Carreiro et al., 2000) foi sugerido que a membrana que reveste a região do citóstoma é
24
contínua com a membrana da bolsa flagelar. O complexo citóstoma-citofaringe está
exclusivamente relacionado ao processo de captação de nutrientes presentes no meio
externo sendo este complexo o sítio majoritário de ingestão de nutrientes (Porto Carreiro
et al, 2000) e nenhuma atividade exocítica tem sido atribuída a esta estrutura.
Recentemente, nosso grupo vem concentrando esforços para determinar o diâmetro
máximo de uma partícula que pode ser ingerida via o complexo citóstoma-citofaringe.
Para isso, as formas epimastigotas foram incubadas com microesferas fluorescentes de
diferentes diâmetros (100, 200, 300 e 500nm). Estas formas foram capazes de ingerir
somente as microesferas fluorescentes de 100 e 200nm, porém, as de 100nm
apresentaram uma cinética de captação semelhante à de moléculas pequenas como a
transferrina, enquanto que as de 200nm apresentaram um atraso na cinética de captação.
As demais ficaram retidas nos sítios de entrada (manuscrito em preparação).
II. 3. 2 - Via endocítica
A grande maioria das informações sobre a via endocítica no T. cruzi foram
geradas a partir de análises por microscopia óptica e principalmente por microscopia
eletrônica de transmissão. A via endocítica do T. cruzi é mais simples do que a
encontrada em células de mamíferos e em T. brucei. Em T. cruzi, como mencionado
anteriormente, as macromoléculas são acumuladas e internalizadas via bolsa flagelar e
citóstoma (Soares & De Souza.,1991; Porto-Carreiro et al., 2000). A partir da bolsa
flagelar e do fundo da citofaringe brotam vesículas. Até o presente momento, as análises
por rotina em microscopia eletrônica de transmissão mostram que estas vesículas são
lisas, isto é, não apresentam revestimento na porção citoplasmática que sugira a presença
25
de clatrina, ao contrário de outros membros da família, Leishmania (Denny et al., 2005) e
T. brucei (Morgan et al., 2001; Allen et al., 2003). A única descrição de uma vesícula
revestida que pode sugerir a presença de moléculas de clatrina foi encontrada em uma
situação especial, onde formas epimastigotas recém diferenciadas de formas
tripomastigotas metacíclicas apresentaram vesículas brotando do complexo de Golgi
apresentando um revestimento eletrondenso citoplasmático, visto ao microscópio
eletrônico de transmissão (Sant´Anna et al., 2004).
As vesículas que brotam da bolsa flagelar e do complexo citóstoma-citofaringe
entregam o seu material endocitado para o primeiro compartimento da via endocítica das
formas epimastigotas, um sistema túbulo-vesicular que se estende da região perinuclear
até a porção posterior do parasita (Porto-Carreiro et al., 2000). Em epimastigotas tratados
com cloreto de amônio ou cloroquina, bases fracas que elevam o pH de compartimentos
endocíticos, estes túbulos são facilmente observados. A morfologia e distribuição
espacial deste sistema túbulo-vesicular foi bem detalhada a partir da análise em 3D
usando a técnica de reconstrução tridimensional em microscopia eletrônica de
transmissão. Devido ao fato de possuírem um caráter ácido, como demonstrado por
experimento com laranja de acridina, e por ser o primeiro compartimento da via
endocítica, elas foram caracterizadas como endossomos iniciais das formas epimastigotas
(Figura 3), embora falte ainda um marcador molecular para esta organela. Um possível
candidato é a TcRab5, cujo gene foi clonado e seqüenciado e a expressão da proteína foi
demonstrada nas três formas do T. cruzi (Araripe et al., 2005). No entanto, a sua
localização subcelular ainda não foi determinada. Também ainda resta a dúvida se os
endossomos iniciais são resultantes da fusão de vesículas endocíticas ou são
26
compartimentos pré-existentes. No final do processo endocítico, pequenas vesículas que
brotam dos endossomos iniciais fundem-se com as organelas finais da via endocítica de
epimastigotas, os reservossomos (Porto-Carreiro et al., 2000). Um importante fator que
permanece ainda sem explicação é o transporte intracelular das organelas endocíticas dos
seus sítios de entrada (citóstoma e bolsa flagelar) até o destino final (os reservossomos).
Em células de mamíferos o transporte de vesículas endocíticas é mediado por proteínas
motoras (dineína e cinesina) que convertem a energia gerada pela hidrólise de ATP em
movimento. Estas proteínas promovem o transporte unidirecional ao longo de
microtúbulos e microfilamente de actina, sendo fundamentais nos processos de
transporte, organização e função celular (Mallik & Gross, 2004). Em nossas análises por
microscopia eletrônica de transmissão usando um protocolo de acordo com Dallai e
Afzelius (1990) que favorece a visualização de elementos do citoesqueleto, foi possível
observar pequenos filamentos de natureza desconhecida conectando as organelas da via
endocítica e a rede de microtúbulos conhecida como microtúbulos subpeliculares. Este
resultado sugere que o transporte destas organelas nas formas epimastigotas seja mediado
por este conjunto de pequenos filamentos que, assim como proteínas motoras em células
de mamíferos, usariam elementos de citoesqueleto como trilhos no transporte intracelular
(Isabel A. Porto Carreiro, tese de doutorado, 2005).
27
Figura 3 – Desenho esquemático mostrando a
provável distribuição da via endocítica na
forma epimastigota de Trypanosoma cruzi. O
material é endocitado na bolsa flagelar e
majoritariamente no citóstoma (via endocitose
mediada por receptores ou pinocitose de fase
fluida). Vesículas brotariam a partir destas
estruturas, percorreriam a região perinuclear e
posterior, formando estruturas tubulares
(caracterizados como estruturas iniciais da via
endocítica), e posteriormente fundindo-se com
reservossomos (Porto-Carreiro et al, 2000).
28
II. 3. 3 - Reservossomos
Os reservossomos são grandes organelas citoplasmáticas presentes
exclusivamente nos membros do subgênero Schyzotrypanum, assim como o T. cruzi, T.
vespertilionis e T. dionisii. Eles são arredondados com o diâmetro que varia entre 0.4-
0.6µm e estão localizados na porção posterior das formas epimastigotas, não sendo
encontrados nas forma tripomastigotas e amastigotas (Soares & De Souza, 1988). Eles se
apresentam como um sítio de acúmulo de nutrientes endocitados pelos parasitas através
do processo endocítico e, devido a esta característica, receberam o nome de reservossomo
(Soares & De Souza, 1988). Estudos ultraestruturais mostraram que estas organelas são
envolvidas por uma unidade de membrana e apresentam no seu interior uma matriz
eletrondensa, assim como inclusões eletronlucentes. Análises por técnicas citoquímicas
realizadas posteriormente mostraram que a matriz é constituída por proteínas e suas
inclusões correspondem a lipídios (Soares & De Souza, 1988).
Os reservossomos foram primeiramente descritos como estruturas
multivesiculares, pois as observações destas organelas a partir de células fixadas por
congelamento rápido seguido de criofratura sugeriam a presença de vesículas internas
(De Souza et al., 1978). Posteriormente, Soares e colaboradores (1988), por análises de
epimastigotas fixados quimicamente e processados para rotina em microscopia eletrônica
de transmissão negaram a presença de membranas internas nos reservossomos. Portanto,
resultados distintos foram obtidos quando se empregaram metodologias diferentes em
microscopia eletrônica. No entanto, estes resultados ainda necessitam ser melhor
investigados. Os reservossomos foram caracterizados como compartimentos pré-
29
lisossomais através da análise de alguns fatores como: a) não reação para fosfatase ácida,
uma enzima marcadora de lisossomos; b) ausência de glicoproteínas de membrana
lisossomal (LAMP-1, LAMP-2, e lgp 120); e c) a estimativa do pH, feita através da
técnica do DAMP (base fraca que se acumula em compartimentos acídicos), em que as
organelas apresentaram pH 6.0 (Soares et al., 1992). Interessantemente, o pH dos
reservossomos é gerado pela ação da H
+
-ATPases do tipo P (Vieira et al., 2005), como
será discutido em mais detalhes posteriormente. Nos reservossomos é acumulada a
cisteína protease (cruzipaína), a hidrolase lisossomal de maior atividade proteolítica no T.
cruzi (Souto-Padrón et al.,1990; Soares et al., 1992; Engel et al., 1998; 2000) e nesta
organela a enzima se encontra ativa (Cunha-e-Silva et al., 2002). A cisteína protease do
T. cruzi não apresenta resíduos de manose 6-fosfato (Cazzulo et al., 1990), que destina
algumas enzimas provenientes do complexo de Golgi para os endossomos tardios de
células de mamífero. Recentemente, também demonstrou-se a presença de chagasina, um
inibidor natural da cruzipaína, acumulada nos reservossomos, possivelmente fazendo a
modulação da atividade da cruzipaína (Santos et al., 2005). Além disso, foi descrita a
glicoproteína serino carboxipeptidase, uma hidrolase lisossomal que pertence ao grupo C
das serino carboxipeptidases, dentro da família da serino peptidase S10, cuja localização
sugeriu-se que seja nos reservossomos (Parussini et al., 2003). Portanto, os
reservossomos, assim como os lisossomos em células de mamíferos, são um sítio de
acúmulo de hidrolases lisossomais.
Estudos estereológicos demonstraram que os reservossomos ocupam cerca de 6%
do volume total dos epimastigotas e durante o processo de metaciclogênese desaparecem
gradativamente até sua completa ausência nas formas tripomastigotas (Soares et al.,
30
1989). Nesse processo verifica-se primeiramente o desaparecimento das inclusões
lipídicas e, posteriormente, a matriz protéica tornar-se menos densa, sugerindo a
utilização do seu conteúdo na diferenciação da forma epimastigota para a forma
tripomastigota (Soares et al., 1989). Usando a idéia contrária de promover a
metaciclogênese para estudar o desaparecimento dos reservossomos, nosso grupo
estabeleceu um protocolo reprodutível de reverso da metaciclogênese, isto é, a
diferenciação de tripomastigotas (que não apresentam os reservossomos) para formas
epimastigotas (que possuem reservossomos), para ter a rara oportunidade de acompanhar
a biogênese de uma organela endocítica em uma célula eucariótica (Sant´Anna et al.,
2004). Neste estudo foi possível demonstrar que formas intermediárias no processo de
diferenciação já apresentavam estruturas relacionadas com a via endocítica, como o
complexo citóstoma-citofaringe e os reservossomos. Os reservossomos recém produzidos
são ácidos, já acumulam hidrolases e são formados na região anterior do parasita, a partir
da contribuição de conteúdo e membrana das vias endocítica e secretória. Posteriormente,
estes reservossomos seguem uma via que os destina para sua localização típica, a região
posterior.
Até o presente momento não foi determinado um marcador molecular para os
reservossomos, sendo usado então apenas o acúmulo de traçadores endocíticos e análises
morfológicas para a identificação desta estrutura. Um promissor candidato para a função
de marcador molecular do reservossomo era a GTPase monomérica homóloga a Rab7 de
células de mamíferos, que nestes tipos celulares estão localizados nos endossomos
tardios. No entanto, em T. cruzi a TcRab7 foi encontrada concentrada no complexo de
Golgi (Araripe et al., 2004), indicando que esta GTPase em T. cruzi pode estar regulando
31
o tráfego da via secretória. Porém, inesperadamente, a TcRab11, GTPase monomérica
homóloga a Rab11 presente nos endossomos de reciclagem de células de mamíferos, foi
encontrada nos reservossomos (Mendonça et al., 2000), sugerindo um possível papel
destas estruturas nos processos de retorno à superfície do parasita de material endocitado,
receptores e proteínas de membrana.
Os estudos sobre os reservossomos até pouco tempo atrás estavam limitados às
análises por microscopias óptica e eletrônica, isto é, avaliação de pH, cinética endocítica,
análise ultra-estrutural e imunolocalização. Porém pouco se sabia sobre a composição
bioquímica dos reservossomos. Cunha-e-Silva e colaboradores (2002) adicionaram ao
estudo de reservossomos técnicas de fracionamento sub-celular e técnicas bioquímicas. A
partir de uma fração purificada de reservossomos foi feita a caracterização bioquímica
inicial. A análise por SDS-PAGE da composição protéica da fração purificada
demonstrou que os reservossomos contêm proteínas dominantes como um triplete de
bandas com 60-51 kDa e um dublete com 25-23 kDa, que podem representar cisteína
proteinase e TcRab11, já encontradas nos reservossomos por imunocitoquímica (Souto-
Padrón et al, 1990; Mendonça et al, 2000). O gel de substrato revelou que a cisteína
protease está ativa nos reservossomos purificados. O epimastigota acumula lipídeos nos
reservossomos, já que a fração isolada mostra uma relação lipídeo/proteína de 2:1,
enquanto que o epimastigota inteiro apresenta uma relação lipídeo/proteína de 1:1. A
cromatografia de camada fina mostrou que há grande acúmulo de lipídeos neutros, tanto
de provável origem intrínseca, como ergosterol, quanto de origem endocítica, como
colesterol esterificado. Os fosfolipídeos majoritários são fosfatidilcolina e
fosfatidiletanolamina (Cunha-e-Silva et al., 2002).
32
Recentemente, três novas proteína foram caracterizadas no reservossomos: i) um
transportador semelhante a ABCA foi caracterizado e imunolocalizado em T. cruzi
(Torres et al., 2004). Este transportador pertence à família de transportadores ABC e são
responsáveis pelo transporte de vários substratos através da membrana, em um processo
dependente de ATP. Em células de mamíferos eles estão envolvidos no fluxo de
colesterol e fosfolipídios, assim como nas vias endocítica e secretória. No T. cruzi, o
transportador ABCA está codificado por gene de cópia única e está expresso em formas
epimastigotas e amastigotas, sendo ausente nos tripomastigotas. Eles possuem um papel
funcional nas vias endocítica e secretória e estão localizados na membrana plasmática, na
membrana do flagelo e nas organelas da via endocítica, incluindo os reservossomos. Esta
localização nos reservossomos abre uma perspectiva para uma nova função destas
organelas. ii) um homólogo da glicoproteina P: em experimentos de captação de um
análogo fluorescente de heme, a mesoporfirina-paládio, por epimastigotas tratados com
inibidores de transportadores ABC, foi sugerido que o heme é captado através da
membrana plasmática e posteriormente acumulado nos reservossomos, por um segundo
transportador ainda desconhecido (Lara et al., 2007). iii) a tirosina fosfatase, uma
proteína envolvida em várias funções celulares, como metabolismo e ciclo celular, foi
inesperadamente localizada na bolsa flagelar, citóstoma e via endocítica, incluindo os
reservossomos nas formas epimastigotas (Cuevas et al., 2005). No entanto, a função desta
proteína na via endocítica de epimastigotas não foi determinada.
Tais características observadas nos reservossomos mostram a importância da
organela na biologia do T. cruzi, pois ela está intimamente envolvida com dois processos
críticos da célula: a nutrição e a diferenciação celular.
33
III - Material e métodos
III.1 - Parasitas
Formas epimastigotas do clone Dm28c (gentilmente cedidas pelo Dr. Marco
Krieger, TECPAR- FIOCRUZ, Paraná) e da cepa Y (mantida em nosso laboratório há
vários anos e periodicamente reativada por passagem em camundongo suíço) foram
cultivadas em meio LIT (liver infusion tryptose) (Camargo, 1964), suplementado com
10% de soro de fetal bovino (SFB) (Cultilab, Campinas, São Paulo) a 28º C e sub-
cultivadas a cada 4 dias.
Para a obtenção de amastigotas e tripomastigotas de cultura foram usadas como
hospedeiras células da linhagem LLC-MK
2
(ATCC) cultivada em meio RPMI (Gibco),
suplementado com 10% de SFB. As culturas foram mantidas em garrafas de 25cm
3
(TPP), a 37
0
C em atmosfera com 5% de CO
2
. As células foram infectadas com formas
sanguíneas de T. cruzi (cepa Y) na proporção de 10 parasitas por célula, obtidas de
camundongos suíços previamente infectados. De cinco a sete dias após infecção, formas
tripomastigotas foram recolhidas do sobrenadante da cultura e utilizadas para
experimentos.
III. 2 - Imunofluorescência
Epimastigotas de cultivo axênico ou tripomastigotas e amastigotas do
sobrenadante de culturas infectadas foram coletados através de centrifugação, lavados em
PBS (tampão fosfato de sódio 10mM, pH 7,2-7,4, acrescido de cloreto de sódio 150mM)
e fixados em paraformaldeído 4% em PBS por 10 minutos na temperatura ambiente.
34
Posteriormente, os parasitas foram aderidos por 15 minutos a lamínulas previamente
revestidas por poli-L-lisina 0,1% em PBS. As células não aderidas foram retiradas por
lavagem com PBS e as aderidas foram permeabilizadas com Triton X-100 0,5% por 5
min. Então, as amostras foram incubadas em cloreto de amônio 50mM em PBS por 30
minutos, a fim de bloquear os aldeídos livres. Depois disso, foram incubadas em PBS
suplementado com albumina bovina fração V 1.5% e gelatina de peixe 0.5%, pH 7.4
(tampão de bloqueio) por 1 hora na temperatura ambiente. Depois de bloquear os sítios
inespecíficos, as lamínulas foram incubadas com os anticorpos primários utilizados neste
trabalho na concentração específica por 1 hora na temperatura ambiente. Os controles
foram feitos substituindo os anticorpos primários por tampão de bloqueio. Depois de
lavadas em tampão de bloqueio as amostras foram incubadas com anticorpos secundários
conjugados a Alexa 488 (Molecular Probes) (diluídos 1:500) ou Alexa 546 na mesma
diluição, para experimentos de co-localização. Por fim, as amostras foram incubadas com
DAPI 200µg/mL (para corar núcleo e cinetoplasto), lavadas, montadas sobre lâmina
usando n-propil galato (Sigma) 0,2M em PBS-glicerol 9:1 como meio de montagem e
observadas no microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan-1 acoplado a uma câmera
Hamamatsu C5810. As imagens capturadas foram processadas usando o programa Adobe
Photoshop CS2.
III. 3 - Avaliação do pH dos compartimentos
Formas tripomastigotas e amastigotas liberadas da cultura de células epiteliais
LLC-MK
2
foram lavadas duas vezes em meio RPMI e incubadas na presença de
Lysotracker green 1mM (Molecular Probes) em meio RPMI sem soro por 30 minutos a
37°C. Os parasitas foram lavados em PBS e fixados em paraformaldeído 4% por 10
35
minutos a temperatura ambiente. Finalmente, as amostras foram lavadas em PBS e
observadas no microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan acoplado a uma câmera
Hamamatsu C5810.
III. 4 - Microscopia eletrônica de transmissão
Para a microscopia eletrônica de transmissão de rotina, parasitas foram coletados
através de centrifugação, lavados em PBS, pH 7.2, fixados em glutaraldeído tipo I
(Electron Microscopy) 2.5% em tampão fosfato de sódio 0.1 M pH 7.2, pós-fixados em
tetróxido de ósmio (Electron Microscopy) 1%, ferrocianeto de potássio 0.8%, cloreto de
sódio 5mM em tampão cacodilato de sódio 0.1 M, pH 7.2. Após desidratação em série
crescente de acetona (50, 70, 90 e 100%), as amostras foram infiltradas e incluídas em
Epon (Electron Microscopy), que polimerizou após 48h em estufa a 60
o
C. Secções
ultrafinas foram obtidas em ultramicrótomo Reichert, coletadas em grades de cobre e
coradas sucessivamente com acetato de uranila 5% em água por 40 min e citrato chumbo
por 5 min. As amostras foram examinadas e fotografadas ao microscópio eletrônico Zeiss
EM 900 ou JEOL 1200 operando a 80kV. Depois de revelados, os negativos fotográficos
foram digitalizados em scanner Epson com resolução de pelo menos 600 dpi e as imagens
foram processadas usando o programa Adobe Photoshop CS2.
III. 5 - Imunocitoquímica
Os parasitas foram coletados através da centrifugação, lavados em PBS e fixados
em glutaraldeído tipo I 0,2%, paraformaldeído 4% em tampão fosfato de sódio 0.1 M, pH
7.2 em temperatura ambiente por 1 hora. Após a fixação, os parasitas foram lavados em
36
PBS, desidratados em série crescente de etanol a 4º C, transferidos para cápsulas BEEM
(Electron Microscopy) e infiltrados vagarosamente em proporções crescentes de etanol e
resina Unicryl (Pelco) a -20º C durante 36 horas. A polimerização da resina hidrofílica foi
conduzida a -20º C, sob radiação UV, durante 96 horas. Secções ultrafinas de parasitos
incluídos em Unicryl, foram coletadas em grades de níquel e incubadas em 80 mM de
cloreto de amônio em PBS por 30 minutos, a fim de bloquear os aldeídos livres.
Posteriormente, as grades foram transferidas para PBS suplementado com Tween 20
0.01%, albumina bovina 1.5%, gelatina de peixe 0.5%, pH 7.4 (tampão de bloqueio) por
1 hora na temperatura ambiente. Os anticorpos primários utilizados neste trabalho foram
incubados na concentração específica por 1 hora na temperatura ambiente. O controle foi
feito substituindo os anticorpos primários por tampão de bloqueio. Depois de lavadas em
tampão de bloqueio as grades foram incubadas com anticorpos secundários conjugados a
partículas de ouro coloidal de 5 ou 10 nm (diluídos 1:100). As secções ultrafinas foram
lavadas em PBS e água e, então, contrastadas em acetato de uranila e citrato de chumbo
como descrito acima e observadas e fotografadas ao microscópio eletrônico de
transmissão Zeiss EM 900 ou JEOL 1200, operando a 80kV. Depois de revelados, os
negativos fotográficos foram digitalizados e as imagens foram processadas usando o
programa Adobe Photoshop CS2.
III. 6 - Reconstrução tridimensional
Para a reconstrução tridimensional, formas tripomastigotas e amastigotas foram
fixadas e processadas para microscopia eletrônica de transmissão como descrito
anteriormente. Séries de cortes ultrafinos foram obtidas destas amostras, coletadas em
grades de cobre com fenda central e depositadas sobre filme de Formvar. Depois de
37
contrastadas em acetato de uranila e citrato de chumbo foram observadas ao microscópio
eletrônico de transmissão Zeiss EM 900 ou JEOL 1200 operando a 80kV. As células
escolhidas foram fotografadas ao longo da série. Depois de reveladas, as séries de
negativos fotográficos obtidas foram digitalizadas em scanner com resolução de pelo
menos 600 dpi, e impressas em formato 18 X 24 cm. As séries foram alinhadas
estabelecendo-se pontos fiduciais. Em cada plano, os perfis dos compartimentos de
interesse foram traçados utilizando-se uma mesa digitalizadora (Numonics), usando o
software de Young e colaboradores (1987). Os dados foram transferidos para o programa
SYNU (Hessler et al., 1992). O arquivo digitalizado gerou o modelo 3D.
III. 7 - Contrastação negativa
Para contrastação negativa, reservossomos isolados, como será descrito
posteriormente, foram depositados sobre uma grade de cobre previamente revestida com
Fomvar/carbono por 25 min. Posteriormente, as grades foram lavadas em PBS, água
deionizada e contrastadas com polivinil álcool 3% em uranila 2% (9:1, v/v) por 10
minutos. As amostras foram observadas e fotografadas ao microscópio eletrônico de
transmissão Zeiss EM 900 ou JEOL 1200, operando a 80kV. Depois de revelados, os
negativos fotográficos foram digitalizados e as imagens foram processadas usando o
programa Adobe Photoshop CS2.
III. 8 - Citoquímica de lipídeos
Para citoquímica de lipídeos com ósmio-imidazol, as formas epimastigotas foram
coletadas através de centrifugação, lavadas em PBS, pH 7,2, fixadas em glutaraldeído
tipo I (Electron Microscopy) 2,5% em tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7,2. Depois, as
38
amostras foram lavadas em tampão imidazol 0,1M, pH 7,4, incubadas no mesmo tampão
por 10 minutos e pós-fixadas em tetróxido de ósmio (Electron Microscopy) 1% em
tampão imidazol 0,1% , pH 7,4, por 40 minutos. Após a lavagem as amostras foram
processadas e observadas como descrito para microscopia eletrônica de transmissão de
rotina. O controle negativo foi realizado omitindo-se o ósmio na pós-fixação.
III. 9 - Criofratura
Para criofratura, formas epimastigotas foram lavadas em PBS e fixadas em
glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1M pH 7,2 por 1 hora na
temperatura ambiente. Antes do congelamento as amostras foram infiltradas com glicerol
15% e glicerol 30% por 1 hora cada, na temperatura ambiente. O material foi congelado
por imersão em Freon 22 resfriado em nitrogênio líquido e, em seguida, transferido para
o nitrogênio líquido (-196°C). As amostras foram fraturadas em um aparelho Balzers a -
196ºC e metalizadas com platina (45° de inclinação) e carbono (90° de inclinação). A
amostra recoberta pela camada metálica ultrafina foi colocada à temperatura ambiente e
incubada flutuando em solução de hipoclorito de sódio 50% em água por 3 horas para
digestão de todo o material biológico presente sob a réplica. Após este procedimento, as
réplicas foram lavadas em água destilada e recolhidas em grades de níquel para
observação ao microscópio eletrônico Zeiss EM 900 ou JEOL 1200 operando a 80kV.
Depois de revelados, os negativos fotográficos obtidos foram digitalizados as imagens
foram processadas usando o programa Adobe Photoshop CS 8.0. Para contagem do
número médio de partículas transmembranas (IMPs) foram usados 50 reservossomos
escolhidos aleatoriamente.
39
III. 10 - Fracionamento das membranas dos reservossomos
Todo o fracionamento é realizado a 4
o
C ou em banho de gelo. Cerca de 10
11
epimastigotas do clone Dm28c com quatro dias de cultivo foram colhidos por
centrifugação e lavados duas vezes em tampão TMS (Tris-HCl 20 mM pH 7,2, acrescido
de MgCl
2
2 mM e sacarose 250mM). Neste mesmo tampão os parasitos foram rompidos
usando um aparelho de ultra-som de ponteira (Sigma, GEX 600) operando a 10% de
amplitude com 15 ciclos de 2 segundos ligado e 1 segundo desligado, gerando o
homogeneizado total. Este homogeneizado total foi centrifugado a 2.450g por 10
minutos, onde o pellet, contendo células não rompidas, núcleos e cinetoplastos foi
descartado. Volumes iguais deste sobrenadante pós-nuclear e de sacarose 2,3M em TMS
foram misturados, distribuídos em tubos do rotor SW28 (Beckman), cobertos com um
gradiente descontínuo de sacarose 1,2/1,0/0,8M em TMS e centrifugados a 97.000g por 2
horas e 30 minutos. As interfaces 0,8 M/1,0 M (B1), 1,0 M/1,2 M (B2), a camada da
amostra (B3) e o pellet são coletados, diluídos em tampão TMS e centrifugados a
120.000g por 30 minutos. Após a centrifugação o material é ressuspenso em tampão
TMS suplementado com coquetel de inibidores de proteases (Sigma P2714) e estocado
no nitrogênio líquido.
Quando este protocolo para o isolamento e purificação dos reservossomos de
epimastigotas da cepa Y de T. cruzi foi estabelecido por nosso grupo (Cunha e Silva et
al., 2002), consideramos a fração B2 a melhor fração de reservossomos, com base no
rendimento, além dos parâmetros de avaliação do fracionamento (microscopia eletrônica
e dosagem de marcadores enzimáticos). Desde então o rendimento foi melhorado com
ajustes nas etapas de sonicação e recolhimento do gradiente. Por isso passamos a
40
trabalhar com B1, uma fração de reservossomos de menor rendimento do que B2, mas
mais purificada.
III. 11 - Isolamento das membranas dos reservossomos
Para o rompimento dos reservossomos isolados (fração B1), foram feitos 5 ciclos
de congelamento em nitrogênio líquido e aquecimento em banho de 37ºC. Em seguida, as
amostras foram tratadas com carbonato de sódio 200mM pH 11,5 por 16 horas a 4ºC,
pelletada a 120.000g por 2 horas e processadas para a análise proteômica.
III. 12 - Proteoma dos reservossomos e de suas membranas isoladas
III.12. 1 - Digestão das proteínas
Nas frações de reservossomos e de suas membranas isoladas, como descrito
anteirormente, foram adicionados 5μL de ditiotreitol (DTT) 45mM e as fracoes foram
incubados por 15 min a 50
o
C para a redução das pontes de sulfeto. Os resíduos de
cisteína foram alquilados usando 5 μL de iodoacetamida 100mM por 30 min a
temperatura ambiente, protegido da luz. Subseqüentemente, água ultrapura foi adicionada
para obter a concentração de final de uréia a 1M. A digestão com tripsina foi realizada a
uma proporção enzima/proteína de 1/50 (m/m), por 24h a 37
o
C. Para a digestão
tripsina/Glu-C, depois da digestão com tripsina, como descrito anteriormente, foi
adicionada a endoproteinase Glu-C na proporção enzima/proteína de 1/50 (m/m). Depois
da incubação por 24h a 37
o
C, a reação foi parada pela adição de ácido trifluoroacético, na
concentração final de 0.046%.
41
III. 12. 2 - Dessalinização e cromatografia de troca iônica
Após a digestão, os peptídeos foram dessalinizados usando C18 zip tip construída
pela adição de 50uL da resina C
18
100mg/mL (10-15 um, 300Å, Vydac, Hesperia, CA)
em 0,046% isopropanol sobre uma fina camada de lã de vidro, dentro de um tip de pipeta
de 200uL (Axygen). O zip tip foi ativado com metanol, equilibrado com acido
trifluoroacético 0,046% e posteriormente as amostras foram aplicadas. Depois de lavados
com ácido trifluoroacético 0,046%, os peptídeos foram eluídos com 80% de acetonitrila/
ácido trifluoroacético 0,046%.
Após a dessalinização, foi montado o SCX zip tip com 20uL da resina SCX
(POROS HS50, Applied Biosystems, Framingan, MA) como descrito para a coluna C18
zip tip anteriormente. A coluna foi equilibrada com ACN 25%/ AF 0,5% e
posteriormente as amostras foram aplicadas. Os peptídeos foram eluídos com
concentrações crescentes de NaCl (0, 50, 100, 200, 300, 400 e 500mM). Finalmente, as
amostras foram secas em uma centrifuga a vácuo antes da análise no LC-MS.
III. 12. 3 - Cromatografia liquida e espectrometria de massas
Os peptídeos fracionados e previamente secos a vácuo foram ressuspensos em
30uL de ácido fórmico 0,1% e 1uL foi aplicado para a análise por LC-MS. A corrida foi
realizada em um nanoHPLC Ultimate (LC Packings), com um autosampler Famos (LC
Packings). A coluna utilizada foi de PepMap (15 cm x 75 μm, 3μm, LC Packings). O
gradiente utilizado foi de 0-40% solvente B em 100 min (Solvente A - Acetonitrila
(ACN) 5%/AF 0,1%; solvente B - ACN 80%/FA 0,1%). Os peptídeos eluídos da coluna
foram analisados diretamente no espectrômetro de massas (Q-tof 1, Micromass, Waters).
42
Os espectros no modo MS foram coletados a cada 2 segundos, numa faixa de 400-1800
m/z. Cada peptídeo foi submetido à fragmentação (MS/MS) por 3 s, em uma faixa de 50-
2050 m/z.
III. 12. 4 - Identificação de proteína e análise das seqüências
Os espectros MS/MS coletados foram convertidos em uma lista de picos e
analisados no software Mascot (Matrix Science). Para a análise no Mascot, a
carbamidometilação da cisteína foi considerada modificação fixa e a oxidação da
metionina modificação variável, a massa de tolerância foi de 500ppm. Para determinar a
identificação de peptídeos falsos positivos, a análise do Mascot foi realizada com um
banco de dados construído com o TcruziDB v5.0 (www.tcruziDB.org
) e as seqüências de
soro bovino, além do banco de dados TcruziDB v5.0 reverso e 100.000 seqüências
geradas randomicamente, formando um banco de dados de 139.682 seqüências. Os
peptídeos que foram identificados com o TcruziDB v5.0 e as seqüências bovinas foram
consideradas positivos verdadeiros. Os que foram identificados com o TcruziDB reverso
e as seqüências randômicas foram considerados falsos positivos. A proporção de falsos
positivos foi calculada como a proporção entre o número de falsos positivos identificados
sobre o número total de identificados (Nakayasu et al., 2007, submetido).
Todas as seqüências válidas foram comparadas com as seqüências depositadas no
banco de dados GenBank usando a ferramenta Blast
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
). As proteínas identificadas foram submetidas à
predição de peptídeo sinal usando o software SignalP3.0
43
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) e a predição de sítios transmenbrana pelo
TMHMM V.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0).
44
IV - Objetivo geral:
¾ Avançar na caracterização bioquímica e ultra-estrutural dos reservossomos de
epimastigotas de Trypanosoma cruzi.
¾ Iniciar a caracterização bioquímica e ultra-estrutural de organelas relacionadas a
reservossomos em tripomastigotas e amastigotas de Trypanosoma cruzi.
IV.1 - Objetivos específicos:
¾ Analisar morfologicamente os reservossomos usando a maior variedade possível
de preparações em microscopia eletrônica de transmissão;
¾ Determinar a presença de membranas e vesículas internas;
¾ Avaliar a quantidade e a distribuição de proteínas transmembrana nos
reservossomos;
¾ Determinar a localização da serino carboxipeptidase nos três estágios evolutivos
do T. cruzi;
¾ Acumular evidências de que os compartimentos ricos em hidrolases ácidas em
tripomastigotas e amastigotas são organelas relacionadas aos reservossomos;
¾ Estabelecer um protocolo reprodutível de purificação de membranas totais dos
reservossomos de epimastigotas;
¾ Identificar proteínas residentes dos reservossomos, através de análise proteômica
da organela intacta e de suas membranas isoladas.
45
V - Resultados
V. 1 - Morfologia dos reservossomos
A ultra-estrutura dos reservossomos tem sido previamente analisada
principalmente por cortes ultrafinos em microscopia eletrônica de transmissão (De Souza
et al., 1978; Soares et al., 1988; Soares et al., 1992). Desta forma, eles são descritos como
organelas envoltas por uma unidade de membrana, com um conteúdo lumenal proteico
eletrondenso, inclusões lipídicas electronlucentes e sem membranas internas. Neste
trabalho, realizamos uma caracterização fina da ultra-estrutura dos reservossomos por
microscopia eletrônica de transmissão em cortes ultrafinos, citoquímica, contrastação
negativa e criofratura em epimastigotas intactos ou reservossomos isolados.
A análise extensiva em cortes ultrafinos demonstrou a presença de vários
pequenos perfis laminares de membranas internas dispersos pelo lúmen dos
reservossomos (Fig. 1a, cabeças de seta brancas). Estes perfis de membranas internas
possuem a estrutura similar à das membranas que circundam a organela (Fig. 1a, cabeças
de seta pretas). Também, no lúmen de alguns reservossomos foram observadas vesículas
internas envoltas por unidade de membrana (Fig. 2a-c, setas). O número destas vesículas
internas nos reservossomos era bastante reduzido. Em muitos casos foi possível observar
pequenas vesículas externas ao reservossomos justapostos a estas organelas (Fig. 2e,f,
setas). No entanto, com a metodologia empregada não é possível discriminar a natureza
destas vesículas. Em uma abordagem que buscava obter a distribuição espacial das
membranas internas dos reservossomos, realizamos a técnica de contrastação negativa em
reservossomos isolados. Desta forma, foi possível observar que as pequenas membranas
46
observadas em cortes ultrafinos, na verdade são grandes perfis de membrana dispersos ao
logo lúmen da organela (Fig. 1b, cabeças de seta). Outra estrutura bastante marcante na
morfologia dos reservossomos foi à presença de grandes bastões eletronlucentes (Fig. 3a-
c). A grande maioria dos reservossomos apresentou um único bastão (Fig. 3a), porém, em
alguns casos, foi possível observar reservossomos com mais de um bastão (Fig. 3d). A
observação mais detalhada destes bastões intralumenais mostrou que eles são totalmente
envoltos por uma única camada de membrana (Fig. 3a,c, cabeças de setas pretas) que é
diferente da membrana que envolve os reservossomos (Fig. 3a,c, cabeças de setas
brancas). Muitas vezes, em uma das extremidades destes bastões eram encontradas
estruturas elétron-lucentes arredondadas, que não apresentavam envoltório membranar
(Fig. 3b, asteriscos). Estas estruturas arredondadas eram morfologicamente semelhantes
às inclusões lipídicas previamente descritas nos reservossomos (Soares et al., 1988). Para
demonstrar uma possível natureza lipídica dos bastões, foi realizada a citoquímica com
ósmio-imidazol. Desta forma, não encontramos o produto de reação da citoquímica
nestes bastões, porém a monocamada de membrana do seu envoltório foi realçada (Fig.
3c, setas).
Os reservossomos foram também analisados pela técnica de criofratura, que
fornece informações particulares sobre a organização interna da membrana plasmática e
também das membranas das organelas (Fig. 1c,d). Nossos resultados com esta técnica
mostraram que as membranas dos reservossomos apresentam uma distribuição randômica
de partículas intramembranares (IMPs) nas faces E (face externa folheto interno) e que
estas partículas apresentaram heterogeneidade em seu diâmetro (Fig. 1d, cabeças de seta
pretas para as partículas maiores e cabeças de setas pretas para as partículas menores). A
47
contagem das IMPs mostrou que elas estão distribuídas com um numero médio de 1005
IMP/μm
2
na face E da na membrana dos reservossomos, o que corresponde a uma vez e
meia o número das IMPs presentes na face correspondente da membrana plasmática dos
epimastigotas (De Souza et al., 1978). Outro achado bastante interessante, é que foi
possível flagrar algumas vesículas internas contendo partículas intramembranares (Fig.
2d, inset).
V. 2 - Localização da serino carboxipeptidase
A localização da serino carboxipeptidase (SCP) foi realizada usando anticorpos
originados contra esta enzima purificada (Parussini et al., 2003) pelo grupo Dr J. J.
Cazzulo, Argentina. A análise por imunofluorescência de epimastigotas mostrou a
ligação dos anticorpos em estruturas arredondadas localizadas na região posterior do
epimastigota (Fig. 4a, b), uma localização típica dos reservossomos. Em tripomastigotas,
a análise por imunofluorescência mostrou que serino carboxipeptidase estava concentrada
em estruturas confinadas entre o núcleo e o cinetoplasto (Fig. 4c, d). Em amastigotas, as
enzimas estavam concentradas em estruturas localizadas na região posterior (Fig. 4e, f).
A localização reservossomal da serino carboxipeptidase sugere que esta enzima se
acumula em compartimentos ricos em hidrolases lisossomais. Para verificarmos se as
organelas positivas para a SCP em tripomastigotas a amastigotas apresentam esta
característica realizamos experimentos de dupla marcação com cruzipaína (CZP), uma
enzima altamente enriquecida nos reservossomos em epimastigotas (Souto-Padrón et al.,
1990; Soares et al., 1992, Cunha-e-Silva, 2002). As análises por imunoflorescência
demonstram que a SCP e CZP co-localizaram nos reservossomos e no complexo de Golgi
48
em epimastigotas (Fig. 5a, d). A co-localização entre estas enzimas foi observada nos
compartimentos localizados na região posterior de tripomastigotas (Fig. 5e, h) e
amastigotas (Fig. 5i, m). Também, em amastigotas intracelulares o padrão de co-
localização foi encontrado (Fig. 5n, q). No entanto, não foi visualizada marcação das
hidrolases lisossomais na LLCM-K2 (Fig. 5n, q), indicando que não ocorreu reação
cruzadas com as hidrolases lisossomais da célula hospedeira.
A partir da imunolocalização estrutural foi possível confirmar a localização
reservossomal em epimastigotas da serino carboxipeptidase (Fig. 6a, c, setas). Em
tripomastigotas, esta enzima foi observada em organelas distintas distribuídas entre o
núcleo e o cinetoplasto e próximo à bolsa flagelar (Fig. 7a, b, setas). Em amastigotas,
também foi visualizada a marcação da SCP em compartimentos com diferentes formatos
na região posterior (Fig. 7c, d, setas). Em experimentos de dupla marcação usando
anticorpos anti-serino carboxipeptidase e anti-cruzipaína foi possível observar que as
hidrolases ácidas co-localizam e parecem enriquecidas nestas organelas em
tripomastigotas (Fig. 8a, b) e amastigotas (Fig. 8c, d).
V. 3 - Ultra-estrutura dos compartimento ricos em hidrolases lisossomais
A morfologia dos compartimentos intracelulares que acumulam hidrolases
lisossomais em tripomastigotas e amastigotas foi examinada por microscopia eletrônica
de transmissão. Cortes ultrafinos de tripomastigotas mostraram que estes compartimentos
localizados na região posterior são na maioria das vezes arredondados (Fig. 9a-d, setas),
mas também podem apresentar formato alongado (Fig. 7a, b, setas). Em alguns casos,
eles foram observados em posição posterior ao cinetoplasto na extremidade final destas
49
formas. Interessantemente, muitas organelas apresentando morfologia reservossomal
típica também foram observadas (ver Fig. 9d, seta). Estas organelas ricas em hidrolases
reservossomais são envolvidas por uma unidade de membrana e possuem um lúmen
pouco elétron-denso com inclusões eletronlucentes pleiomórficas (Fig. 9c, d, setas).
Também, algumas organelas eram ricas em membranas internas planares, de natureza
ainda desconhecida (Fig. 9a e 9b, setas).
Em amastigotas, a morfologia das organelas localizadas na região posterior foi
extremamente heterogênea (Fig. 10a, setas). Na análise de cortes ultrafinos aleatórios elas
apresentaram uma grande variedade estrutural, tanto em relação ao tamanho quanto ao
aspecto. Quanto à estrutura interna, elas apresentaram uma porção com baixa elétron-
densidade (Fig. 10b, c, asterisco) delimitada por membranas internas (Fig. 10c, cabeças
de seta). Nestas organelas de amastigotas, as inclusões eletronlucentes não foram
observadas; no entanto, grandes bastões electronlucentes de natureza desconhecida foram
observados freqüentemente (Fig. 10b, setas).
A distribuição espacial dos compartimentos que acumulam hidrolases ácidas em
tripomastigotas (Fig. 11a,b) e amastigotas (Fig. 11c, d) foi avaliada por reconstrução 3D
a partir de cortes ultrafinos seriados. Assim, foi possível mostrar que as organelas
presentes no tripomastigotas que estão localizadas na região entre o núcleo e o
cinetoplasto possuem uma pequena variação no tamanho e a morfologia é mais uniforme.
A heterogeneidade das organelas presentes nos amastigotas foi confirmada. A Fig. 11c, d
mostra um modelo 3D de amastigotas apresentando organelas extremamente
pleiomórficas.
50
Para caracterizar os compartimentos ricos em hidrolases ácidas nos baseamos nas
propriedades típicas dos reservossomos, como o caráter ácido e a presença da H
+
-ATPase
do tipo P e da chagasina.
Para estabelecer o caráter ácido destas organelas em tripomastigotas e
amastigotas, estas formas evolutivas foram incubadas com Lysotracker
®
, uma base fraca
que se acumula em compartimentos de caráter ácido. A observação de tripomastigotas
tratados com Lysotraker
®
mostrou organelas concentrando o corante na região posterior,
entre o núcleo e cinetoplasto (Fig. 12a, b). Em amastigotas também foi observado
acúmulo do corante em compartimentos localizados na região posterior (Fig. 12c, d). Esta
localização em ambas formas evolutivas é muito semelhante aos compartimentos
positivos para serino carboxipeptidase e cruzipaína (Fig. 5e-m).
Usando anticorpos gerados contra uma porção conservada entre TcHA1 e TcHA2,
isto é, que não discrimina entre as duas isoformas, realizamos um experimento de dupla
marcação com a H
+
-ATPase do tipo P e serino carboxipeptidase em tripomastigotas (Fig.
13a-d) e amastigotas (Fig. 13e-h). Como previamente demonstrado por Vieira e
colaboradores (2005), a H
+
-ATPase do tipo P está localizada na membrana plasmática e
em compartimentos intracelulares localizados na região posterior, que no presente estudo
também se mostraram positivos para a SCP nestes estágios do T. cruzi (Fig. 13a-h) . A
co-localização entre H
+
-ATPase do tipo P e SCP nos compartimentos intracelulares
demonstrou que as organelas positivas para H
+
-ATPase do tipo P são os mesmos
compartimentos ricos em SCP e CZP. Estes resultados indicam que as organelas dos
tripomastigotas e amastigotas são ácidas e este caráter é possivelmente gerado pela ação
da H
+
-ATPase do tipo P.
51
Também buscamos a localização da chagasina, um inibidor natural da cruzipaína.
Para isso, realizamos um experimento de dupla marcação com anticorpos anti-chagasina
e anti-serino carboxipeptidase. A análise da localização destas proteínas por
imunofluorescência demonstrou que elas co-localizam parcialmente nos compartimentos
localizados na região posterior dos tripomastigotas (Fig. 14a-d) e amastigotas (Fig. 14e-
h). Estes resultados sugerem que esteja ocorrendo a regulação endógena da atividade da
cruzipaína pelo menos em alguns compartimentos.
Este conjunto de resultados está resumido na tabela 1.
Tabela 1 – Características dos reservossomos e dos compartimentos relacionados aos
reservossomos
*
O símbolo +/- significa que nem todas as organelas apresentam a chagasina
V. 4 - Proteômica
Trabalhos anteriores têm demonstrado que as formas epimastigotas de T. cruzi
possuem organelas especiais, conhecidas como reservossomos, que estocam
macromoléculas exógenas captadas do meio extracelular e hidrolases ácidas, como a
Características Reservossomos Compartimentos do
tripomastigota
Compartimentos do
amastigota
Luminal pH ácido ácido ácido
Cruzipaína
+ + +
Chagasina
*
+ +/-
+/-
Serino carboxipeptidase
+ + +
H
+
-ATPases do tipo P
+ + +
Acessibilidade a
trançadores endocíticos
+ - -
52
cruzipaína e a serino carboxipeptidase (Cunha-e-Silva et al., 2006). No entanto, pouco se
sabe sobre a composição protéica desta organela. Portanto, para identificarmos as
proteínas que compõem os reservossomos, fizemos a purificação destas organelas,
segundo Cunha-e-Silva e colaboradores (2002), com a finalidade de obtermos uma fração
de reservossomos intactos (B1). A partir dela, rompendo a organela e fazendo um
tratamento alcalino para liberar seu conteúdo, obtivemos uma fração contendo as
membranas da organela (B1M). A análise das frações B1 e B1M por microscopia
eletrônica de transmissão comprovou a pureza das frações (Fig. 15a-b).
Para obtermos maior cobertura das proteínas identificadas, as amostras foram
digeridas usando 2 estratégias distintas: i) tripsina em um tampão contendo uréia com
agente desnaturante e ii) digestão dupla com tripsina e a endoproteinase Glu-C. Apos a
digestão, as amostras foram fracionadas por cromatografia trocadora de cátions e
submetidas à análise por cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas
(LC-MS). As proteínas foram identificadas através da busca no banco de dados do T.
cruzi e no banco de proteínas do soro bovino, usando o software Mascot como algoritmo.
A proporção de falsos positivos foi determinada pela análise das seqüências no banco de
dados reverso do T. cruzi e das seqüências randômicas. Desta forma, foi possível
identificar e estimar os falsos positivos simultaneamente.
Depois de avaliar a porcentagem de falsos positivos e eliminar os peptídeos
redundantes, foi possível identificar um total de 61 proteínas a partir de 345 peptídeos
com a fidelidade de mais de 99% dos peptídeos identificados, listados na tabela 2 e na
tabela 3. Destas proteínas, 42 foram anotadas como contendo função conhecida ou
predita, onde 10 proteínas apresentaram peptídeo sinal. Outras 17 proteínas possuem
53
domínios transmembrana e destas proteínas que contem porção transmembrana, 10
também apresentam peptídeo sinal. Deste conjunto de proteínas, a cruzipaína (Souto-
Padrón et al., 1990; Soares et al., 1992; Cunha-e-Silva et al., 2002), a serino
carboxipeptidase (Parussini et al., 2003), o transportador ABC (Torres et al., 2004), a
TcHA 1 (Vieira et al., 2005), e a proteína tirosina fosfatase (Cuevas et al., 2005) já foram
previamente descritas como pertencentes aos reservossomos. Na fração B1, foram
identificadas 16 proteínas e destas 6 apresentaram peptídeo sinal e 7 são transmembrana
(2 proteínas também apresentaram peptídeo sinal). Já na fração de membrana dos
reservossomos (B1M), 32 proteínas foram identificadas e destas 8 possuíram peptídeo
sinal e 11 possuem domínios transmembrana (3 proteínas transmembrana apresentam
peptídeo sinal). A análise comparativa (não quantitativa) entre as frações de
reservossomos intactos (B1) e a fração de membrana de reservossomos (B1M),
surpreendentemente, mostrou que a maioria das proteínas identificadas no proteoma (38
proteínas) estava presente na fração de membrana dos reservossomos (B1M) e 11
proteínas foram identificadas exclusivamente na fração B1. Doze proteínas foram
observadas em ambas as frações (B1 e B1M) (Tabela 2 e 3). Também, 8 proteínas de
membrana foram encontradas na fração B1, mas não na fração B1M. Das 40 proteínas
com função conhecida, 48% (19 proteínas) podem ser caracterizadas como não
reservossomais, incluindo chaperonas, proteínas mitocôndrias, glicossomais, de
citoesqueleto ou flagelo, o que sugere uma provável contaminação, que é bastante
comum em fracionamentos sub-celulares, ou processo de reciclagem destas proteínas nos
reservossomos. No entanto, somente uma proteína (5.2%) destes prováveis contaminantes
54
é transmembrana, o que aponta para um nível muito baixo de contaminação com
membranas de outras organelas.
As proteínas com função conhecida foram agrupadas em 10 grupos distintos,
listados na tabela 2. No grupo das proteases, a localização da cruzipaína e da serino
carboxipeptidase (SCP) foi confirmada. Um fato interessante é que foram detectadas 2
isoformas da SCP, uma delas é solúvel enquanto que a outra é uma proteína de membrana
do tipo I. Neste grupo, foi demonstrada a existência de 2 novas hidrolases lisossomais nos
reservossomos, a cisteína peptidase C e a α-manosidase. A presença da uma nova
isoforma de H
+
-ATPase tipo P, a TcHA3 também foi observada no proteôma dos
reservossomos. Duas glicoproteínas de membrana, a p67 e a glicoproteína
Golgi/lisossomo também foram observadas. A primeira, é um conhecido marcador de
lisossomas de T. brucei (Alexander et al. 2002) e a segunda é uma proteína presente na
membrana do complexo de Golgi e dos lisossomas cuja função ainda é desconhecida. Um
achado interessante é a presença da proteína de resistência a multidrogas E, uma
glicoproteína P membro da família de transportadores ABC, que possuem ampla
especificidade para várias substâncias. Também, algumas proteínas transmembrana
típicas de membrana plasmática, como a amastina, o transportador de folato, a proteína
da família de genes dispersos 1 e a redutase férrica foram identificadas no proteoma dos
reservossomos, sugerindo um processo de transporte de membrana da MP para os
reservossomos. Outras proteínas identificadas incluem proteínas de mitocôndria,
glicossomos e citoesqueleto.
As 19 proteínas restantes identificadas no proteoma dos reservossomos e de suas
membranas estão anotadas no genoma do T. cruzi como proteínas de função
55
desconhecidas ou hipotéticas (tabela 3). Para investigar uma possível função ou
localização destas proteínas foi também analisado os hits relevantes no Blast, presença de
peptídeo sinal e porção transmembrana. A grande maioria das proteínas (15 proteínas)
anotadas como hipotéticas estavam presentes na fração de membrana dos reservossomos
(B1M). Do total de 19 proteínas hipotéticas, 12 possuíram porção transmembrana e 6
apresentaram peptídeo sinal. Também, foi possível observar que 10 entre as 19 proteínas
não possuíram domínio determinado, apresentaram como hit relevante proteínas
hipotéticas em outros organismos, como o T. brucei na grande maioria dos casos. Duas
proteínas não apresentaram algum hit significante. No entanto, 9 proteínas apresentaram
um hit relevantes que nos auxiliou na tentativa de identificação das proteínas. Três
proteínas hipotéticas dos reservossomos de T. cruzi
tiveram como hit significante às
proteínas Nonaspanina (Medicago truncatula), uma proteína endossomal integral de
membrana (T. brucei) e PHG1A (Oryza sativa), todas com o domínio EMP70, similar ao
das famílias de proteínas de membrana de multipassagem 9 (TM9SF). Esta família de
proteínas tem sido descrita em plantas, leveduras e humanos, tem sido encontrada em
endossomos em leveduras e está envolvida em fagocitose e adesão celular em
Dictiostelium discoideum. Outras proteínas que apresentaram um hit significante foram: a
Yip1, que é uma proteína transmembrana presente no complexo de Golgi, envolvida no
transporte vesicular dependente de GTPases, a Diacilglicerol lipase beta e a
Hydroximetilglutaril-CoA sintase,
que atuam no metabolismo de lipídeos.
56
VI - Discussão
VI. 1 - Ultra-estrutura dos reservossomos
Inicialmente, os reservossomos foram descritos como estruturas multivesiculares
(De Souza et al., 1978), assim como endossomos tardios em células de mamíferos.
Posteriormente, análises por microscopia eletrônica de transmissão de rotina excluíram a
existência de membranas internas nos reservossomos, mostrando que o lúmen dos
reservossomos é formado exclusivamente por uma matriz elétron-densa protéica e
inclusões lipídicas eletronlucentes (Soares et al., 1988). Neste trabalho, também fazendo
análises da estrutura dos reservossomos, tanto isolado como in sito, usando cortes
ultrafinos mostramos que estas organelas possuem pequenos perfis de membrana interna
em seu lúmen (Fig. 1a). Em trabalhos recentes de nosso grupo já havia sido mencionada a
existência destas membranas (Vieira et al., 2005), em reservossomos isolados (fração B1)
pelo mesmo método usado aqui (Cunha-e-Silva, 2002). Para afastar a possibilidade de
esses perfis vesiculares internos serem conseqüência dos procedimentos do
fracionamento, como a sonicação ou a osmolaridade alta do gradiente, examinamos um
grande número de epimastigotas íntegros tanto do clone Dm28c quanto da cepa Y. Não
temos mais dúvidas de que os reservossomos apresentam membranas internas, no entanto
a ocorrência irregular destes perfis e seus diferentes formatos ainda aguardam novos
experimentos que permitam uma correlação às membranas internas e o estado funcional
da organela.
Usando a técnica de contrastação negativa para obtermos a distribuição espacial
destas membranas, podemos determinar que estes pequenos perfis na verdade eram
57
grandes membranas planares preenchendo todo interior dos reservossomos (Fig. 1b).
Mesmo, com possíveis artefatos gerados pela tensão superficial durante a secagem ao ar
dos reservossomos, a técnica de contrastação negativa foi fundamental como primeira
abordagem da real estrutura e distribuição das membranas internas. Tanto por análises de
cortes ultrafinos quanto por criofratura foi possível observar em alguns reservossomos
discretas vesículas (Fig. 1a-d) também de natureza e função desconhecidas. Em breve
será possível aperfeiçoar o conhecimento sobre a arquitetura interna dos reservossomos
usando tomografia eletrônica.
Outra estrutura bastante marcante na morfologia dos reservossomos são os
grandes bastões eletronlucentes presentes em seu interior (Fig. 3). Nos cortes ultrafinos,
estes bastões apresentam como peculiaridade um envoltório constituído por uma única
camada de membrana. Na tentativa de determinar se a natureza destas estruturas é
lipídica, assim como as inclusões elétronlucentes previamente descritas no lúmen dos
reservossomos (Soares et al., 1988), realizamos uma citoquímica para lipídeos com a pós-
fixação em ósmio em tampão imidazol. Este composto se liga às insaturações dos
lipídeos e forma um produto elétron-denso visto na microscopia eletrônica de
transmissão. A reação negativa nestes bastões demonstrou que eles não são formados por
lipídeos contendo insaturações (Fig. 3c) . Portanto, a natureza e função destas estruturas
peculiares ainda necessita ser esclarecida. Bastões elétronlucentes têm sido caracterizados
principalmente em bactérias do gênero Acinetobacter (Singer et al. 1985). Nestas
bactérias, os bastões são constituídos de cera de éster, uma classe de lipídeo neutro que
serve como uma importante fonte de carbono e estoque de energia. Em tripanosomatídeos
nunca foi demonstrada a presença de cera de éster. Bastões morfologicamente similares
58
também são observados em macrófagos em áreas de formação de placa ateromatosa.
Estes bastões são formados quando macrófagos endocitam agregados de lipoproteínas e
acumulam cristais de colesterol que se formam quando uma massa critica é atingida,
dando origem a estas estruturas particulares (revisto por Bobryshev, 2006).
A ultra-estrutura dos reservossomos tem sido amplamente analisada em cortes
ultrafinos em microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica tem rendido valiosas
informações sobre a organização da organela. Ela não permite, porém, uma avaliação
detalhada da organização de suas membranas e de suas proteínas integrais. Portanto,
neste trabalho utilizamos a técnica de criofratura para analisar a distribuição das proteínas
integrais de membrana (IMP) (Fig. 1c, d). As análises de criofratura mostraram que as
IMPs estão randomicamente distribuídas pela membrana dos reservossomos, assim como
na membrana plasmática de epimastigotas (De Souza et al., 1978), sugerindo que os
reservossomos não apresentam um arranjo especial de partículas, o que é característico
de uma região funcionalmente especializada. A freqüência das IMPs pode estar
relacionada com a atividade funcional da membrana. Nos reservossomos as IMPs
possuem um numero médio de 1005 IMP/μm
2
na face E. Em nossos resultados foram
avaliadas somente as contagens de IMPs na face E, pois o plano das fraturas favoreceu
somente a exposição desta face. Este número de proteínas transmembrana presente na
face E é cerca de uma vez e meia o número de IMPs presentes na membrana plasmática.
Esta diferença pode estar relacionada a uma maior complexidade funcional da membrana
plasmática com relação aos reservossomos ou com a diferença de função entre as
estruturas. As IMPs também apresentaram diâmetro heterogêneo (Fig. 1d), o que pode
refletir a presença de diferentes classes de proteínas presentes na membrana dos
59
reservossomos. A identidade das IMPs é desconhecida, no entanto a análise proteômica
dos reservossomos, descrita anteriormente e discutida mais adiante, poderá contribuir
para identificação e caracterização destas proteínas.
Em resumo, neste estudo morfológico nós ampliamos o conhecimento sobre a
estrutura e organização dos reservossomos através de uma análise detalhada por corte
ultrafino, da membrana da organela por criofratura e pela introdução da contrastação
negativa. Estes novos dados podem ser usados para trabalho futuros de identificação da
organela em ocasiões especiais, como o processo de biogênese ou desaparecimento dos
reservossomos, assim como a possível descrição da organela em outras formas evolutivas
do T. cruzi.
VI. 2 - Organelas relacionadas aos rervossomos
Um trabalho prévio usando a técnica de extração com digitonina em epimastigotas
mostrou que o padrão de extração da serino carboxipeptidase é similar aos observados
para outra hidrolases lisossomais, como a cruzipaína e α-manosidase (Parussini et al.,
2003), sugerindo, conseqüentemente, que a SCP está concentrada em reservossomos.
Neste trabalho, buscamos a localização de serino carboxipeptidase usando um anticorpo
gerado contra a proteína purificada. Desta forma, mostramos que esta enzima está
localizada em grandes organelas presentes na região posterior de epimastigotas (Fig. 4).
A localização reservossomal da SCP foi confirmada com a co-localização com cruzipaína
(Fig. 5a-d). Estes resultados demonstram que não existe segregação entre estas duas
enzimas que seguem a mesma via de biossíntese levando ao acúmulo na mesma organela.
Estes resultados também corroboram a idéia de que reservossomos são o principal sitio
60
de degradação de proteínas exógenas e também um importante sítio de modulação de
proteína endógena.
A SCP foi observada em organelas presentes na região posterior de
tripomastigotas e amastigotas. Em experimentos de dupla marcação usando anticorpos
anti-SCP e CZP (Fig. 5) foi possível observar que, assim como em epimastigotas, estas
enzimas são acumuladas em compartimentos localizados na região posterior.
Comparativamente, estas observações são indicativas que tripomastigotas e amastigotas
possuem organelas especializadas que estocam enzimas digestivas na região posterior,
uma localização similar aos reservossomos. Conseqüentemente, é provável que estes
compartimentos presentes nas formas infectivas estejam envolvidos na modulação de
proteínas endógenas e/ou secreção de hidrolases. Um bom exemplo disso é que a
cruzipaína tem sido considerada como um fator de virulência do T. cruzi fundamental no
processo de invasão do parasita no hospedeiro e sobrevivência intracelular. Trabalhos
prévios demonstraram que tripomastigotas tratados com inibidores seletivos de
cruzipaína permeáveis às membranas inibem o processo de invasão. Além disso, eles
impedem a replicação de amastigotas e diferenciação em tripomastigotas (Meirelles et al.,
1992). Recentemente, foi mostrado que a cruzipaína secretada pelo tripomastigota tem
uma importante função na invasão da célula hospedeira pelo parasita (Aparício et al.,
2004). A função da serino carboxipeptidase neste processo não foi avaliada até o
momento.
A ultra-estrutura dos reservossomos de epimastigotas tem sido bem documentada
em trabalhos prévios (De Souza et al, 1978, Soares & De Souza 1988; 1991; Soares et al.,
1992), ampliados neste estudo. Eles foram caracterizados como uma organela com o
61
diâmetro de cerca de 600nm e que ocupa 5% do volume celular (Soares et al., 1989). Eles
são envolvidos por uma unidade de membrana e seriam ausentes de membranas internas.
O seu lúmen possui uma densa matriz elétron-densa, assim como varias inclusões
elétronlucentes. O primeiro trabalho (De Souza et al., 1978) mostrou que estas inclusões
eléctronlucentes são envolvidas por membranas internas, o que levou a primeira definição
dos reservossomos como estruturas multivesiculares, por analogia aos “corpos
multivesiculares” amplamente caracterizados em células de mamíferos (Piper & Luzio,
2001). Posteriormente, a partir de uma análise de cortes ultrafinos foi sugerida a ausência
das membranas internas (Soares & De Souza, 1998). A análise por citoquímica
demonstrou que a matriz elétron-densa é constituída de proteínas (Soares et al., 1988) e
as inclusões são lipídeos (Soares et al., 1987). Conseqüentemente, o termo “corpos
multivesiculares” foi derrubado e a organela passou a se chamar reservossomos (Soares
& De Souza, 1998).
Em tripomastigotas, organelas envolvidas por uma unidade de membrana com o
conteúdo elétron-denso e com inclusões elétronlucentes foram também observadas (Fig.
9). O aspecto destas organelas, em muitos casos, é bastante similar ao encontrados nos
reservossomos (ver Fig. 9d). Fato interessante é que em algumas organelas, assim como
nos reservossomos (Fig. 1), foram visualizadas membranas internas planares (Fig. 9a, b).
E assim como nos reservossomos, a natureza e a função destas membranas planares ainda
é desconhecida.
Em amastigotas, as organelas que concentram serino carboxipeptidase e
cruzipaína possuem o formato bastante distinto (Fig. 10) daquele descrito para os
reservossomos e das organelas em tripomastigotas. Elas possuem o formato
62
extremamente heterogêneo, que foi confirmado pela observação em 3D destas organelas
(Fig. 11c, d). Esta mudança no aspecto morfológico pode estar relacionada com o
desempenho de uma função específica destas organelas nas formas amastigotas. É sabido
que lisossomos de células de mamíferos possuem aspectos morfológicos diferentes de
acordo com a sua função. Quanto ao conteúdo interno, estes compartimentos de
amastigotas possuem uma matriz que é pouco elétron-densa e é delimitada por uma
unidade de membrana interna (Fig. 10). Outra estrutura peculiar encontrada nestas
organelas foram os grandes bastões eléctronlucentes (Fig. 10b). Estes bastões também
são freqüentemente observados em reservossomos de formas epimastigotas (Fig. 3) e,
assim como nestas organelas os bastões são envolvidos por uma única camada de
membrana. Embora eles sejam uma estrutura bastante marcante nestas formas do T. cruzi
a natureza, composição e função ainda não são conhecidas. Assim como nos
tripomastigotas, não foram observadas vesículas internas nestas organelas.
A alta elétron-densidade encontrada nos reservossomos em epimastigotas está
relacionada à maior concentração de proteínas em seu lúmen. Isto reflete a habilidade dos
reservossomos de concentrar macromoléculas endógenas e exógenas. E como
tripomastigotas e amastigotas não são capazes de captar macromoléculas do meio
externo, a baixa elétron-densidade pode estar relacionada com o acúmulo apenas das
proteínas originadas da via secretória, no mínimo as hidrolases reservossomais e a
degradação das proteínas durante o processo de diferenciação. Portanto, a degradação de
proteínas pode servir como uma fonte endógena de energia para este processo de
diferenciação. Estas similaridades morfológicas dão evidências da existência de organelas
relacionadas a reservossomos nas formas infectivas do T. cruzi.
63
É bem estabelecido que os reservossomos são organelas ácidas pertencentes à via
endocítica de epimastigotas (Soares et al., 1991; 1992). O seu caráter ácido foi
determinado pela incubação de epimastigotas com laranja de acridina (Soares et al.,
1991), uma base fraca que se acumula em compartimentos de caráter ácido.
Posteriormente, usando a técnica do DAMP o pH reservossomal foi terminado com sendo
6.0 (Soares et al., 1992). Neste trabalho, usando o Lysotracker, também uma base fraca,
pudemos demonstrar que o corante se acumulou em compartimentos localizados na
região posterior de tripomastigotas (Fig. 12a, b) e amastigotas (Fig. 12c, d). Esta
localização é consistente com aquela observada para as organelas ricas em hidroláses
ácidas (Fig. 5), demonstrando que estas organelas possuem um caráter ácido.
Em células de mamíferos, o pH ácido dos endossomos é gerado pela ação da H
+
-
ATPase do tipo V (Beyenbach & Wieczorek, 2006). No entanto, o baixo pH dos
reservossomos é gerado pela ação de duas isoformas da H
+
-ATPase do tipo P, a TcHA 1
e TcHA2 (Viera et al., 2005). No referido trabalho, a localização destas isoformas foi
determinada por imunofluorescência e imunocitoquímica. Desta forma, foi demonstrado
que a TcHA1 está localizada na membrana plasmática, assim como na via endocítica,
enquanto que a TcHA2 teve a localização exclusiva nos reservossomos. No mesmo
trabalho, a localização da H
+
-ATPase do tipo P em tripomastigotas e amastigotas foi
visualizada na membrana plasmática, assim como, em compartimentos intracelulares
localizados na região posterior destas formas. Neste trabalho, utilizando os mesmo
anticorpos anti-H
+
-ATPase do tipo P em experimentos de dupla marcação com serino
carboxipeptidase pudemos demonstrar que estas proteínas co-localizam nos mesmos
compartimentos intracelulares localizados na região posterior de tripomastigotas (fig.
64
13a-d) e amastigotas (Fig. 13e-h) descritos por Vieira e colaboradores (2005). Portanto,
estes compartimentos foram identificados como os compartimentos ácidos que acumulam
SCP e CZP localizados na região posterior das formas infectivas do T. cruzi. Este
conjunto de resultados, demonstra que o ambiente ácido destas organelas é gerado pela
ação da mesma bomba de prótons de membrana presente nos reservossomos. Além disso,
estes resultados sugerem que esta bomba é funcional e é a responsável pela geração do
baixo pH nestas organelas. Também, eles são indicativos que a acidificação destas
organelas, assim como nos lisossomos em células de mamíferos (Lee & Marzella, 1994)
e nos reservossomos de epimastigotas, está diretamente relacionada com a degradação de
proteínas. Para dar suporte a esta idéia, é bem estabelecido que hidrolases ácidas, assim
como, CZP (Murta et al., 1992) e SCP (Parussini et al., 2003) possuem atividade ótima
em pH ácido (Hasilik, 1992).
Chagasina, um inibidor natural ta cruzipaína recentemente caracterizado, está
localizado no complexo de Golgi e reservossomos em epimastigotas (Santos et al., 2005).
Portanto, tem sido sugerido que a chagasina atue como um regulador endógeno da
cruzipaína nos reservossomos. Monteiro e colaboradores (2001) usando
imunocitoquímica mostraram que a chagasina está localizada na superfície e bolsa
flagelar de tripomastigotas e amastigotas. Além disso, a chagasina foi observada em
compartimentos intracelulares de tripomastigotas. A localização intracelular em
amastigotas não foi demonstrada. Neste trabalho, a localização de chagasina foi
determinada por imunofluorescência. Usando experimentos de dupla marcação com
anticorpos anti-SCP e chagasina foi possível confirmar que a chagasina está presente na
membrana plasmática de tripomastigotas (Fig. 14a-d) e amastigotas (Fig. 14e-h).
65
Também, foi observado que a chagasina co-localiza parcialmente com as organelas
positivas para serino carboxipeptidase (Fig. 14). Conseqüentemente, como nos
reservossomos, a chagasina pode estar regulando endogenamente a atividade proteolítica
da cruzipaína em tripomastigotas e amastigotas. No entanto, a razão pela qual a regulação
é feita somente em algumas organelas, não foi objeto desta tese e necessita de mais
experimentos para ser elucidado.
Os lisossomos em células de mamíferos dividem propriedades com um grupo de
organelas específicas denominadas como organelas relacionadas aos lisossomos. Estas
organelas são ácidas e possuem proteínas solúveis e de membrana lisossomal. No
entanto, elas diferem dos lisossomos em sua função específica que não está relacionada à
degradação. Este grupo inclui os melanossomos, grânulos líticos, compartimento de
MHC de classe II, grânulos de basófilos, grânulos de azurófilos e pigmentos de drosófilas
(Dell'Angelica et al., 2000). Embora em tripomastigotas e amastigotas jamais tenha sido
demonstrada a captação de lipídeos ou proteínas, neste trabalho nós demonstramos que
estes estágios do T. cruzi possuem organelas intracelulares com características típicas dos
reservossomos. Eles são organelas ácidas que acumulam hidroláses e no mínimo uma
proteína de membrana reservossomal, demonstrando a relação próxima entre estas
organelas. Por outro lado, eles são distintos dos reservossomos com base em sua
definição, que os descreveu como organelas que estocam macromoléculas captadas pelo
parasita (Soares & De Souza, 1988).
Embora a função biológica destes compartimentos necessite ainda ser
estabelecida, uma tentativa de classificação pode ser proposta com base nos nossos
dados, que convergem para sugerir que tripomastigotas e amastigotas possuem uma
66
classe de organelas citoplasmática relacionadas aos reservossomos. A existência de
organelas relacionadas aos reservossomos nas formas infectivas do T. cruzi abre uma
nova possibilidade dos reservossomos agora poderem ser considerados alvos potenciais
para quimioterapia.
V. 3 -Proteoma
Formas epimastigotas de T. cruzi são capazes de captar macromoléculas do meio
externo exclusivamente a partir de duas invaginações da membrana plasmática, a bolsa
flagelar e o citóstoma (Soares e De Souza, 1991; Porto-Carreiro et al., 2000).
Posteriormente, os nutrientes são entregues para os endossomos iniciais e finalmente para
os reservossomos. Os reservossomos são as organelas finais da via endocítica das formas
epimastigotas que concentram os lipídeos e proteínas ingeridas. Também, tem sido
demonstrado que estas organelas são o sitio de acúmulo de hidroláses lisossomais a partir
da via secretória (revisto em Cunha-e-Silva et al., 2006). Embora algumas funções
tenham sido atribuídas aos reservossomos pouco é conhecido sobre a sua composição
lipídica ou protéica. A identificação dos constituintes dos reservossomos foi sempre
realizada por microscopia óptica e eletrônica (Soares et al., 1988; Souto-padrón et al.,
1990, Soares et al., 1991; 1992, Parussini et al., 2003; Torres et al., 2004; Cuevas et al.,
2005, Viera et al., 2005) e mais recentemente por uma análise bioquímica preliminar
(Cunha-e-Silva et al., 2002). Portanto, para obtermos a identidade protéica, entender
função e identificar proteínas residentes que conseqüentemente possam ser tornar um
boas marcadoras moleculares dos reservossomos realizamos o proteoma desta organela
por LC-MS. Para isso, realizamos o fracionamento celular do reservossomos, segundo
67
Cunha-e-Silva e colaboradores 2002 com poucas modificações, para obtermos uma
fração altamente purificada da organela. Após, realizamos o sub-fracionamento para a
obtermos uma preparação de membranas de reservossomos purificada. Para obtermos
maior cobertura dos peptídeos, na análise proteômica utilizamos tanto a fração de
reservossomos intactos como a de suas membranas isoladas, e a combinação de duas
estratégias de digestão e de bancos de dados distintos. Neste ultimo caso, foi possível a
identificação do número de falsos positivos. Para assegurar a qualidade das análises o
falso positivo foi avaliado e as proteínas identificadas foram validadas com menos de 1%
de falso positivo.
A partir da análise do proteoma dos reservossomos e suas membranas foram
identificadas 61 proteínas, das quais 42 possuem função conhecida (tabela 2) e 19 são
anotadas como hipotéticas (tabela 3). Várias destas proteínas foram constituintes
esperados de uma organela ácida, que interage e funde com vesículas oriundas da via
secretória e de invaginações da membrana plasmática e que possivelmente têm sua
localização intracelular estabelecida com auxílio de elementos do citoesqueleto. Usando a
combinação do fracionamento celular e a análise por LC-MS, algumas proteínas
pertencentes a compartimentos endocíticos que não foram previamente relacionadas aos
reservossomos foram identificadas, como a α-manosidase, uma isoforma de serino
carboxipeptidase transmembrana, a cisteina peptidase C, a isoforma TcHA3 da H
+
-
ATPase do tipo P e a glicoproteína de membrana p67. Além destas, as localizações de
proteínas reservossomais foram confirmadas, com a cruzipaína, a isoforma TcHA1 da
H
+
-ATPase do tipo P, a serino carboxipeptidase, o transportador ABC e a proteína
tirosina fosfatase.
68
Surpreendentemente, conhecidos membros do processo de fusão entre
compartimentos da via endocítica, como as Rabs e as SNAREs, não foram detectados em
nossa análise proteômica. Esta aparente ausência das proteínas de fusão em nossas
análises não pode ser explicada facilmente, mas é provável que seja devido à baixa
quantidade ou a modificações nas proteínas que não são detectadas pela análise por LC-
MS. Não podemos afastar a possibilidade de que os procedimentos de preparação das
frações levem à dissociação destas proteínas da organela.
Também foi possível detectar proteínas que não foram previamente associadas a
compartimentos da via endocítica. Estas proteínas são localizadas em outras organelas,
como mitocôndria (proteína de choque térmico 70 kDa, subunidade beta da ATPase,
proteína carreadora ADP/ATP 1, chaperonina HSP60, esterol 24-c-metil transferase),
glicossomos (piruvato fosfato dicinase), flagelo (proteína flagelar ligadora de cálcio).
Proteomas de organelas isoladas têm contribuído muito para o entendimento de
sua função, assim como da função de suas proteínas especificas (Andersen & Mann,
2006). No entanto, em casos onde existe relação entre organelas, por exemplo organelas
da via endocítica, as proteínas freqüentemente apresentam múltipla localização.
Recentemente, um trabalho elegante demonstrou que cerca de 39% das proteínas de uma
organela pode ser detectada em múltiplos compartimentos intracelulares (Foster et al.,
2006). E as possíveis razões para esta observação em mais de uma organela podem ser: i)
proteínas que são realmente encontradas em diferentes compartimentos, ii) contaminantes
e iii) proteínas que são erroneamente identificadas. No caso dos reservossomos, como
várias estruturas estão relacionadas a esta organela, no mínimo a membrana plasmática e
o complexo de Golgi, é possível encontrar o compartilhamento de proteínas entre os
69
reservossomos e uma estrutura relacionada. Conseqüentemente, o perfil protéico dos
reservossomos reflete a dinâmica de tráfego entre estas estruturas, assim como a
localização múltipla de uma proteína pode refletir a sua origem em comum ou sua
natureza transitória e dinâmica. Como bons exemplos deste processo, foi encontrado no
proteoma dos reservossomos uma glicoproteína transmembrana presente no complexo de
Golgi e nos lisossomos (Glicoproteina Golgi/lisossomo) de função ainda desconhecida.
Também, quatro proteínas integrais de membrana típicas de membrana plasmática foram
observadas: o transportador folato/pteridina, a proteína da família de genes dispersos 1
(DGF-1), redutase férrica e a amastina. Um bom exemplo da relação
reservossomos/membrana plasmática é a H
+
-ATPase do tipo P, uma proteína integral de
membrana que é encontrada na membrana plasmática e nos reservossomos em
epimastigotas (Vieira et al., 2005). Não se pode descartar a hipótese destas proteínas ou
algumas delas serem contaminantes. A presença de contaminantes de outras organelas é
uma limitação do processo de fracionamento subcelular e é uma possível explicação da
presença de proteínas de várias origens no proteoma dos reservossomos. É importante
mencionar que análises extensivas por microscopia eletrônica de transmissão associada à
análise bioquímica da fração de reservossomos apontaram para a ausência de
contaminantes de glicossomos, mitocôndria, reticulo endoplasmático e acidocalcissomos
(Cunha-e-Silva, et al., 2002). Baseados nesta caracterização da fração de reservossomos,
podemos considerar que a presença de proteínas específicas de outras organelas em nossa
preparação pode ser uma contaminação quantitativamente desprezível, que é detectada
devido à alta resolução do espectrômetro de massas. É importante mencionar que
somente uma proteína (proteína carreadora ADP/ATP 1) correspondendo a 5,2% das
70
prováveis contaminantes na nossa fração de reservossomos é integral de membrana. Isto
é indicativo de baixo nível de contaminação com membranas de outras organelas.
Experimentos futuros usando anticorpos específicos ou proteínas sintetizadas contendo
um epítopo ou tag GFP (green fluorescent protein) serão necessários para determinar a
verdadeira localização destas proteínas.
A identificação de proteínas específicas dos reservossomos provavelmente
contribuirá para o entendimento da função da organela. Para obtermos uma boa cobertura
de informações sobre as proteínas identificadas, os peptídeos positivos verdadeiros foram
submetidos à predição de peptídeo sinal e porção transmembrana (tabelas 2 e 3). Desta
forma, 29 proteínas (47,5 %) do total de 61 identificadas apresentam porção
transmembrana, enquanto que 16 (26,2%) apresentaram peptídeo sinal.
Considerando que a técnica de criofratura apontou um número médio de 1005
proteínas transmembrana/µm
2
nos reservossomos, ainda não é possível tirar conclusões
sobre o número de cópias de cada proteína em particular. No entanto, a correlação entre
as técnicas de criofratura, fornecendo a contagem das IMPs, e proteômica, fornecendo a
identidade de cada proteína da organela, pode ser uma valiosa ferramenta na necessária
associação entre bioquímica e morfologia.
Dentre as proteínas transmembrana identificadas no proteoma dos reservossomos,
podemos sugerir como prováveis marcadores moleculares, a H
+
-ATPase do tipo P
(TcHA3) e a glicoproteina p67. As H
+
-ATPases do tipo P fazem parte de um grupo de
proteínas transmembrana que transportam ativamente H
+
através da membrana usando a
energia gerada pela hidrólise de ATP, sendo responsáveis pela homeostase do pH
intracelular. Estas bombas vêm sendo descritas exclusivamente na membrana plasmática
71
em leveduras e plantas (Serrano et al., 1992). No T. cruzi, somente a função das
isoformas H
+
-ATPases do tipo P TcHA1 e TcHA2 na homeostase do pH interno (pHi) da
cepa Y de T. cruzi foi descrita (Luo et al., 2002; Vieira et al., 2005). Surpreendentemente,
nesta cepa a acidificação da citofaringe, vesículas endocíticas e dos reservossomos é feita
pela ação destas H
+
-ATPases do tipo P. No entanto, o papel da TcHA3 na homeostase do
pHi no T. cruzi ainda não está estabelecido. Um fato interessante é que nos nossos
resultados de proteoma de reservossomos isolados usando o clone Dm28c a TcHA3 teve
uma boa cobertura o que pode significar grande abundância desta bomba nos
reservossomos. É notável também a ausência da isoforma TcHA2, que na cepa Y
concentra-se em reservossomos. Portanto, é possível que a TcHA3 seja a bomba
majoritária na manutenção do caráter ácido dos reservossomos atuando, desta forma,
como fator determinante para o desempenho das funções desta organela. Devido à
ausência da H
+
-ATPases do tipo P em mamíferos e sua presença em fungos e nos
tripanosomatídeos esta bomba é considerada um potencial alvo quimioterápico.
A proteína p67 é uma glicoproteina transmembrana do tipo I marcadora de
lisossomos em T. brucei. Ela possui uma estrutura geral bastante parecida com as Lamps
(lysosome associated membrane proteins) em células de mamíferos, embora não
apresente homologia de seqüências (Kelley et al., 1999). Por analogia, esta proteína tem
sido relacionada com a formação de um glicocálice protetor contra as hidrolases
lisossomais nos tripanosomas africanos. O destino da p67 para os lisossomos tem sido
atribuído ao domínio citoplasmático da proteína, na formas procíclicas do T. brucei.
Nesta região está localizado o motivo di-leucina similar aos envolvidos no
endereçamento de Lamps em células de mamíferos. Nas formas sanguíneas, porém, este
72
motivo não é o responsável pelo destino da p67 para os lisossomos. Acredita-se que o
possível sinal para o endereçamento lisossomal nas formas sanguíneas esteja localizado
na porção hidrofóbica N-terminal. Fato interessante é que não foi encontrado nenhum
homólogo da p67 em mamíferos. No entanto, os genes desta proteína são encontrados em
vários membros da família dos tripanosomatídeos, incluído o T. cruzi, o que torna esta
proteína um promissor candidato para alvo de quimioterapia. A localização
reservossomal da p67 foi demonstrada no proteoma desta organela. Por analogia, como a
p67 de T. brucei e as Lamps em mamíferos são importantes marcadores moleculares
lisossomais, a p67 de T. cruzi se torna uma excelente candidata para ser um marcador
molecular dos reservossomos. A caracterização molecular e a localização da p67 do T.
cruzi estão sendo realizadas pelo nosso grupo.
Atualmente não é conhecido um peptídeo sinal responsável pelo endereçamento
de proteínas para os reservossomos, embora os dados apresentados no proteoma do
reservossomo possam servir como ponto de partida para a identificação deste peptídeo
sinal. No proteoma dos reservossomos foram identificadas 16 proteínas com peptídeo
sinal e alguns destes podem conter a seqüência de aminoácidos necessária para uma
proteína residente da organela. Em tripanosomas a identificação do sinal de seleção para
endossomos ainda é muito pouco conhecida. Somente dois sinais envolvidos na
endocitose foram caracterizados. Em Leishmania foi demonstrada a presença de um
motivo sinal na região citossólica C-terminal de uma fosfatase ácida (Weise et al., 2005).
Nesta região são encontrados os sinais tirosina e di-leucina, sendo este último encontrado
também nas Lamps, em células de mamíferos, e na p67 de T. brucei. Um segundo sinal
73
envolvido na endocitose é a presença de três resíduos de lisina na porção citoplasmática
de ISG65, uma proteína de superfície de T. brucei (Chung et al., 2004).
No presente estudo foram identificadas hidrolases, entre elas algumas já
conhecidas como residentes dos reservossomos, como a cruzipaína e a serino
carboxipeptidase (SCP). Além da serino carboxipeptidase lumenal outra isoforma de
membrana da SCP que não contém peptídeo sinal também foi identificada. O peptídeo
sinal presente em serino carboxipeptidase de Arabidopsis tem sido relacionado com o
endereçamento para o reticulo endoplasmático (Fraser et al., 2005). Outras hidrolases
lisossomais não previamente descritas como pertencentes aos reservossomos foram
também detectadas. Estes resultados demonstram que os reservossomos são um sitio de
acumulo de hidrolases lisossomais e conseqüentemente, funcionam com um importante
modulador endógeno de proteínas.
Aproximadamente 31% das proteínas identificadas no proteoma dos
reservossomos são proteínas de função desconhecida ou hipotéticas. Estas proteínas
podem constituir uma rica fonte de candidatos para explorar novas funções ou integrar
funções já conhecidas da organela. Portanto, para obtermos um melhor entendimento
destas proteínas e tentar classificá-las foram listados na tabela 2 os seus domínios, assim
como seu hit relevante. Destas podemos destacar a proteína endossomal integral de
membrana de T. brucei, a PHG1A de Oryza sativa, a Nonaspanina de Medicago
truncatula
e a Yipf2 de Monodelphis domestica. As três primeiras proteínas são
membros da família de proteínas transmembrana 9 (TM9SF), que foram primeiramente
identificadas no proteoma de endossomos em leveduras (Singer-kruger et al., 1993).
Estas proteínas apresentam um peptídeo sinal seguido de um grande domínio extracelular
74
e uma região C-terminal hidrofóbica contendo nove domínios transmembrana. Varias
seqüências altamente conservadas da família TM9SF têm sido identificadas em plantas,
leveduras e humanos, sugerindo uma importante função biológica. No entanto, exceto
pelo papel destas proteínas na fagocitose e adesão em D. discoideum, pouco se sabe sobre
a sua função. O domínio da proteína Yipf2 está anotado como uma proteína de membrana
envolvida na fusão entre vesículas num processo dependente de GTP.
A analise proteômica tem sido usada com bastante sucesso em fagossomos, de
células de mamíferos (Garin et al., 2001) e ameba (Okada & Nozaki, 2006), e em
lisossomos de células de mamíferos (Bagshaw et al., 2005). Nos tripanosomatídeos,
podemos destacar o proteoma comparativo entre as três formas evolutivas do T. cruzi
(Paba et al., 2004) e mais recentemente o proteoma dos glicossomos de T. brucei
(Colasante et al., 2006), sendo este o primeiro trabalho de analise proteômica de uma
organela interna em um membro desta família. Estes trabalhos renderam valiosas
informações sobre a localização de proteínas, confirmando a presença de umas e
detectando novas proteínas residentes nestes compartimentos. Portanto, estes dados
conferiram implicações funcionais para estas proteínas e organelas. Aqui neste trabalho,
nós realizamos a analise protéica dos reservossomos, que consistiu no primeiro perfil
proteômico de uma organela endocítica em um membro da família dos
Tripanosomatídeos. Esta análise proteômica pode dar base para a identificação de uma
proteína marcadora para os reservossomos que possibilite o estudo da biogênese e do
desaparecimento dos reservossomos e sua dinâmica de interação com outros
compartimentos do T. cruzi. Marcadores de reservossomos também serão de grande valor
75
para definir a localização de outras proteínas, assim como identificação da própria
organela na demais formas de vidas do protozoário.
76
VI - Conclusões:
9 Os reservossomos apresentam membranas e vesículas internas de natureza e
função ainda desconhecidas;
9 A membrana que envolve os reservossomos apresenta partículas
intramembranares que são distribuídas randomicamente com um número médio
de 1005 IMP/µm
2
; partículas intramembranares também foram observadas nas
vesículas internas dos reservossomos;
9 Os reservossomos possuem grandes bastões elétron-lucentes envoltos por uma
unidade de membrana cuja natureza e função não foram determinadas;
9 A serino carboxipeptidase está localizada nos reservossomos de epimastigotas.
Em tripomastigotas e amastigotas esta enzima foi encontrada em compartimentos
ácidos localizados na região posterior positivos para cruzipaína, H
+
-ATPase do
tipo P e chagasina;
9 Semelhanças morfológicas sugerem fortemente que estes compartimentos de
tripomastigotas e amastigotas são organelas relacionadas aos reservossomos;
9 Foram identificadas 61 proteínas no proteoma dos reservossomos e de suas
membranas. Destas proteínas, 42 apresentam função conhecida e 19 são
hipotéticas.
77
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