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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E TOXICOLOGIA
APLICADA
RISCO OCUPACIONAL EM INDIVÍDUOS EXPOSTOS AO CHUMBO
E A INFLUÊNCIA DOS NÍVEIS DE MICRONUTRIENTES
Tese para obtenção do Título de
Doutor em Genética e Toxicologia
Aplicada
RENATO MINOZZO
Orientador: Drª Juliana da Silva
CANOAS
2009
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Livros Grátis
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida, força e sabedoria, a toda minha família que me
apoiou e acreditou, especialmente minha mãe (in memoriam).
Aos professores Dr. Renato Santos-Mello e Drª
. Juliana da Silva, pela
orientação e pela amizade que enriqueceram meus conhecimentos científicos e
ensinamentos de vida.
Aos professores do Centro Universitário Feevale, Sandrine Comparsi
Wagner, Gustavo Muller Lara, especialmente para o Professor Inácio Borges, pelo
apoio estatístico e pela colaboração no desenvolvimento deste trabalho.
Ao Técnico Luiz Irineu Deiling do Laboratório de Mutagênese da ULBRA,
pelo auxílio na realização das técnicas de Micronúcleo e Ensaio Cometa.
A todos os trabalhadores envolvidos nos grupos de estudo (expostos
ocupacionalmente ao chumbo e aos participantes controles) que colaboraram no
desenvolvimento da pesquisa.
Aos proprietários das microempresas que autorizaram e colaboraram na
realização das coletas de materiais e informações fundamentais para a realização
deste estudo.
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Este trabalho foi realizado nas instalações do
Laboratório de Mutagênese da Universidade Luterana do
Brasil e no Laboratório de Biomedicina do Centro
Universitário Feevale. Inicialmente sob a orientação do prof.
Dr. Renato Santos-Mello (Agosto de 2005 - Março de 2008),
e após sob orientação, revisão e autonomia da Profª. Dra.
Juliana da Silva.
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................ 5
ABSTRACT............................................................................................................ 6
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 7
1.1 Exposição ocupacional ao chumbo .................................................................. 8
1.2 Micronutrientes e estabilidade do genoma ..................................................... 11
1.3 A importância do folato e vitamina B12 na estabilidade do genoma .............. 13
1.4 Fatores não ocupacionais e não nutricionais que podem interferir na
estabilidade do genoma.................................................................................. 17
1.4.1 Idade............................................................................................................ 17
1.4.2 Sexo ............................................................................................................ 18
1.4.3 Fumo ........................................................................................................... 18
1.5 Metodologias no Biomonitoramento ocupacional ........................................... 19
1.5.1 Teste de Micronúcleos................................................................................. 20
1.5.2 Ensaio Cometa ............................................................................................ 24
2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 27
2.1 Objetivo Geral................................................................................................. 27
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 27
3. CAPITULO I – Artigo: Plumbemia em Trabalhadores da Indústria de
Reciclagem de Baterias Automotivas da Grande Porto Alegre, RS ................. 28
4. CAPITULO II – Artigo: Prevalência de anemia em trabalhadores expostos
ocupacionalmente ao chumbo.......................................................................... 35
5. CAPÍTULO III – Artigo: Circulating Concentrations of Folate and Vitamin
B
12
in Relation To Genotoxic Effects in Workers of Battery Manufacturing
and Recycling Companies................................................................................ 40
6. DISCUSSÃO .................................................................................................... 70
7. CONCLUSÕES ................................................................................................ 78
8. PERSPECTIVAS.............................................................................................. 79
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 80
ANEXOS
ANEXO I - Declaração do Pesquisador Responsável ........................................ 90
ANEXO II - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .................................. 91
ANEXO III - Questionário de Saúde Pessoal........................................................ 93
ANEXO IV - Aprovação comitê de ética................................................................ 95
ANEXO V - Artigo Mutation Research de 2004.................................................... 97
RESUMO
O objetivo principal deste estudo foi avaliar não só os riscos a exposição ao
chumbo, mas também a influência do folato e da vitamina B12 sobre a
instabilidade do genoma, utilizando o teste de micronúcleos em linfócitos do
sangue periférico e o Ensaio Cometa. Esta investigação foi realizada em um total
de 53 trabalhadores do sexo masculino expostos ao chumbo e em 53 indivíduos
controle. Estes trabalhadores exercem atividades nas indústrias e nas
recicladoras de baterias automotivas da grande Porto Alegre, RS, Brasil. Foram
também avaliados os níveis de hemoglobina e de chumbo sangüíneo. Pode-se
observar que os indivíduos expostos ocupacionalmente ao chumbo apresentaram
anemia e plumbemia, este último com valores que foram cerca de 20 vezes
maiores que os observados no grupo controle. No teste de Micronúcleos,
encontraram-se diferenças estatisticamente significantes entre o grupo controle e
o exposto em diferentes parâmetros como freqüência de micronúcleos, brotos
nucleares, pontes nucleoplasmáticas, índice de divisão nuclear, apoptose e
necrose. No Ensaio Cometa, foram encontradas diferenças estatisticamente
significantes nos parâmetros freqüência de dano e índice de dano. Nossos dados
mostram que, em geral, tanto no grupo controle como no exposto ao chumbo não
há correlação significativa do folato ou vitamina B12 com os parâmetros
analisados, exceto a correlação positiva encontrada entre folato e idade e folato e
micronúcleos. Encontrou-se ainda correlação entre vitamina B12 e índice de
divisão nuclear. Conclui-se que neste estudo os trabalhadores expostos ao
chumbo apresentaram valores elevados deste metal, que levou a uma anemia e
aumento de danos ao DNA, avaliados pelo Ensaio Cometa e Teste de
Micronúcleos. Além disto, não foi possível demonstrar correlação com os níveis
de folato e vitamina B12, sendo que testes para este grupo de estudo estão
dentro dos valores de referência.
Palavras-chave: Intoxicação por chumbo, Exposição ocupacional, Ensaio
Cometa, Teste de Micronúcleos, folato, vitamina B12.
ABSTRACT
The main aim of this study was to assess lead exposure hazards, and to
investigate the role played by folate and vitamin B12 in genome stability using the
peripheral blood lymphocyte micronucleous test and the comet assay. The study
population was formed by 53 male workers of car battery manufacturing and
recycling companies located in the metropolitan area of Porto Alegre (RS, Brazil).
The control group comprised 53 non-exposed individuals living in the same region.
Lead levels in blood and hemoglobin were also evaluated. Statistically significant
increase was observed for lead concentration in blood and anemia of exposed in
relation to non-exposed. Individuals occupationally exposed to lead present
anemia and plumbism levels; this last one was 20 times as high as that of control
individuals. In the micronucleus test, statistically significant differences were
observed in micronucleus frequency, nuclear buds, nucleoplasmatic bridges,
nuclear division index, apoptosis, and necrosis. The comet assay also revealed
statistically significant differences for damage frequency and damage index. The
data show that in general neither the exposed nor the control groups showed
significant correlation of folate or vitamin B12 levels with the parameters analyzed.
The exceptions are the positive correlation between folate and age, folate and
micronucleus, and vitamin B12 and nuclear division index. Results indicate that
lead causes increased level of this metal in the blood, as seen in the exposed
group, which caused them anemia and chromosome damage as measured by the
micronucleus test and Comet assay. Besides, it was not possible to demosntrate
correlations between the leveles of folate and vitamin B12, given that the results of
such tests were acceptable according to the reference values adopted.
Keywords: Lead intoxication, occupational exposure, comet assay, micronuclei
test, Folate, vitamin B12
1. INTRODUÇÃO
O chumbo é um elemento abundante em toda a crosta terrestre e sua
utilização já ocorria em épocas bem antigas. Ao longo do tempo, seu manuseio
tem aumentado progressivamente. Este metal é muito utilizado em diferentes
setores industriais como, por exemplo, na fabricação de baterias automotivas,
tintas, cerâmicas, cabos, gráfica, munições, inseticidas, porcelana e fabricação de
objetos de adorno. Quando em grandes concentrações, o contato humano com
esse metal pode levar a distúrbios de praticamente todas as partes do organismo
A contaminação humana ocorre pela ingestão e pela via respiratória, e os efeitos
tóxicos podem causar diversos danos, como, problemas reprodutivos,
neurológicos, cardíacos, hematológicos e até mesmo danos ao DNA (Steenland
et al., 1992; Robbins et al., 2001; Henretig, 2002).
Danos genéticos podem acontecer espontaneamente em condições
metabólicas normais e aumentados através da exposição a agentes mutagênicos
e carcinogênicos ambientais e em situações dietéticas deficientes. Nos últimos
anos, vários artigos destacam a importância da nutrição, principalmente de
micronutrientes como folato e vitamina B12, em relação à prevenção da
instabilidade genômica (Fenech et al., 1998; Ames, 1998; 1999; Fenech, 2002-a;
2002-b; 2002-c; 2005). A grande maioria dos estudos, incluindo aqueles sobre
biomonitoramento, considera apenas a interação gene-genotoxinas na prevenção
de danos no DNA (Fracasso et al., 2002; Danadevi et al., 2003; Palus et al., 2003;
Minozzo et al., 2004). No entanto a interação gene-genotoxina-dieta é importante,
não só no estabelecimento de recomendações dietéticas adequadas à
manutenção da estabilidade do genoma, mas também quando são realizados
estudos dos efeitos de exposições ocupacionais a agentes mutagênicos e
carcinogênicos (Fenech, 2002-b; 2002-c; 2005).
Os níveis dietéticos tradicionalmente recomendados para micronutrientes
foram adequadamente definidos levando em consideração a prevenção de
doenças, como o escorbuto para vitamina C e anemia para o ácido fólico. Com o
passar dos anos, poucas alterações nestes níveis foram efetuadas. Apenas na
8
década passada, a necessidade de ácido fólico para prevenção de defeitos no
tubo neural foi revista para mais do que o dobro do RDI (Recommended dietary
intake) original (CDC - MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report, 1992). No
entanto, continua incerto se os níveis aceitos são de fato adequados a minimizar
a taxa de danos cromossômicos e contribuir para a estabilidade do genoma. No
momento, existe uma conscientização crescente de que também é necessário
redefinir as RDI para a prevenção de doenças degenerativas como câncer,
distúrbios cardiovasculares, doença de Alzheimer e morbidade durante a velhice.
Considerando-se que doenças do desenvolvimento, doenças degenerativas e
envelhecimento são, pelo menos parcialmente, causados por danos no DNA
(Holliday, 1995; Ames, 1998), parece lógico focalizar nossa atenção na definição
das necessidades ótimas de minerais e vitaminas para a prevenção de danos no
DNA nuclear e mitocondrial. O conhecimento a respeito dos níveis adequados de
micronutrientes para a estabilidade genômica é escasso e desorganizado
(Fenech, 2002-a). Pouco se encontra na literatura sobre biomonitoramento com
suplementação de micronutrientes (Vaglenov et al., 1998), mas inexistem artigos
nos quais os níveis de folato e vitamina B12 foram considerados.
Aberrações cromossômicas e micronúcleos são biomarcadores úteis de
lesões no DNA e são freqüentemente usados em testes de mutagenicidade e em
biomonitoramento humano. Cada vez mais surgem evidências de que o aumento
na freqüência de aberrações cromossômicas (AC) e micronúcleos (MN) são
indicadores precoces do risco de câncer (Nordic Study Group, 1990; Fenech,
2002-a; Hagmar et al., 2004; Rossner et al., 2005; Bonassi et al., 2007). O
Ensaio Cometa (Single-cell gell electrophoresis assay), embora não seja um teste
de mutagenicidade, também constitui um método muito sensível para medir danos
no DNA (Collins, 2004; Collins et al., 2008).
1.1 Exposição ocupacional ao chumbo
A primeira referência a contaminação por chumbo foi feita pelo físico grego
Discorides, no século II AC. Durante a idade média, a intoxicação foi esquecida,
9
mas no século XVI, Paracelso descreveu a doença dos mineiros. Somente em
1830, Tanquarel realizou um estudo com 1200 casos de intoxicação por chumbo,
trabalho tão completo que pouco foi acrescido aos sinais e sintomas aí descritos
(para revisão ver Nriagu, 1983; Winship, 1989).
A contaminação humana ocorre pela ingestão, através do trato
gastrintestinal, e pela via respiratória, através da inalação de poeiras, névoas e
vapores. A absorção gastrintestinal corresponde de 10% a 15% do total ingerido,
enquanto que, pela via respiratória, chegam aproximadamente 35% a 50 % do
total inalado, dependendo do tamanho da partícula, do volume, taxa respiratória, e
de mecanismos de recuperação muco ciliar e alveolar. Aproximadamente 35% a
45% do chumbo absorvido
entram no sangue, onde o mesmo se liga avidamente
aos eritrócitos e é distribuído para os tecidos como fígado, rins, cérebro e,
principalmente, ossos. Mais de 90% da carga corporal do chumbo encontra-se
depositada no tecido ósseo, na forma de fosfato de chumbo, com meia vida de
cerca de 20 anos. O chumbo pode assumir valência +2 e +4 e é biofisicamente
semelhante ao cálcio (+2), o que explica sua preferência pelo tecido ósseo
(Robbins et al., 2001; Henretig, 2002).
Os efeitos bioquímicos induzidos pelo chumbo podem ser divididos em três
grupos. (1) O primeiro está relacionado à sua ligação com vários doadores de
elétrons, particularmente a grupos sulfídricos. Estas ligações induzem alterações
nas proteínas, principalmente na ação enzimática. (2) O segundo é resultante da
semelhança biofísica com o cálcio, o que permite o acesso a locais críticos da
célula, como as mitocôndrias. (3) Por fim, parece afetar os ácidos nucléicos
através de mecanismo ainda não definido, o que deu origem às especulações
sobre a possível potencialidade do chumbo de induzir danos cromossômicos
(Robbins et al., 2001; Bowler & Cone, 2001).
O chumbo pode provocar toxicidade hematológica, neurológica, renal,
reprodutiva e endócrina. Pode ainda causar danos esqueléticos, cardíacos,
gastrintestinais e até câncer (Winship, 1989). Na toxicidade hematológica, a
indução de anemia é uma das mais proeminentes e a mais estudada ação
toxicológica do chumbo. A anemia é produzida por dois mecanismos: a) inibição
da síntese da heme, mais relacionada à exposição crônica; e b) aceleração da
10
destruição dos eritrócitos, mais comum na exposição aguda (Robbins et al.,
2001; Henretig, 2002). Na toxicidade neurológica, o chumbo pode atravessar a
barreira hemato-encefálica e se manifestar como encefalopatia aguda, podendo
ocasionar sintomas como irritabilidade, mudanças no comportamento, depressão,
ataxia, confusão e delírio. Níveis de exposição acima de 25 µg/dL de chumbo
podem afetar as funções cognitivas do adulto, assim como a inteligência em
crianças (Valciukas, 1978; Stollery, 1991). Mesmo em valores de chumbo no
sangue em humanos, dentro dos valores de referencia, foram encontrados sinais
de comprometimento da memória, humor e coordenação motora fina (Cordeiro et
al., 1996-a; 1996-b). A toxicidade renal caracteriza-se por dois estágios: a)
alterações agudas e reversíveis nas células proximais do túbulo; e b) alterações
crônicas e progressiva destruição das células proximais do túbulo, que resulta em
fibrose intersticial não específica e atrofia tubular (Bernard & Becker, 1988). O
chumbo ainda pode diminuir a capacidade reprodutiva de machos e fêmeas,
provocar aumento de abortos e desenvolvimento cognitivo anormal precoce
(Berlinger, 1987; Assennato, 1991; Rom, 1992). Afeta também o sistema
endócrino como a função da tireóide e adenohipófise. Os principais sintomas
gastrintestinais são dores abdominais, anorexia, vômitos e a “constipação da
cólica do chumbo”. Na toxicidade cardíaca pode induzir hipertensão arterial e
disritmias (Goyer, 1996; Henretig, 2002).
Quanto à genotoxicidade, diferentes estudos demonstraram efeitos
danosos da exposição ocupacional ao chumbo em diferentes níveis. Em estudo
realizado por Minozzo et. al., em 2004 (em anexo), com trabalhadores expostos
ao chumbo, os valores médios do metal foram de 35,40 µg/dL, sendo observado
um aumento na freqüência de micronúcleos e diminuição do IDN (índice de
divisão nuclear). Zhijian et al., (2006) detectaram em trabalhadores expostos
valores similares de chumbo, 32 µg/dL, com aumento na freqüência de
micronúcleo e de índice de dano pelo Ensaio Cometa. Danadevi et al. (2003) e
Wiwanitkit et al. (2008) com uma média de chumbo inferior (24,8 µg/dL e 21,0
µg/dL, respectivamente), encontraram aumento na freqüência de quebras de
cadeia de DNA, assim como de trocas entre cromátides irmãs.
11
1.2 Micronutrientes e estabilidade do genoma
Diferentes estudos demonstram existir uma correlação entre a falta de
micronutrientes e a indução de lesões ocasionadas ao DNA, como por exemplo,
aberrações cromossômicas e micronúcleos, assim como a suplementação
podendo levar a uma minimização destes mesmos danos (Ames 1998; 2004;
Fenech, 1999; 2002-a; 2002-b; 2002-c; 2005). Baseado nestes estudos, Fenech
(1999; 2006) recomenda que em estudos de risco ocupacional, sejam avaliados
os níveis de micronutrientes (dieta). Na Figura 1, podem-se observar as
interações entre a dieta, os agentes genotóxicos e os danos ao DNA. Os danos
ao DNA, se não reparados ou reparados de forma incorreta poderão causar
efeitos como envelhecimento acelerado, altos riscos de iniciar o câncer e
infertilidade, entre outros (Fenech, 2002-a).
Figura 1 - Interações entre gene-dieta e gene-toxina e os possíveis desfechos
causadas pela instabilidade genômica (modificado de Fenech, 2002-a).
A instabilidade genômica é o evento inicial mais provável do processo
carcinogênico (Nordic Study Group, 1990; Hagmar et al., 1998; Fenech, 2002-a;
2002-b; Rossner et al., 2005; Bonassi et al., 2007). Conforme foi citado
Reparo do DNA
Interação
Gene-dieta
Interação
Gene-toxina
Genotoxina
Danos
no DNA
Aumento de
infertilidade?
Alto risco
ao câncer
Envelhecimento
acelerado
Deficiência de
micronutrientes
12
anteriormente, as quantidades recomendadas de micronutrientes e sais minerais
estão baseadas na prevenção de doenças (Domínguez et al., 2005) e não na
manutenção da estabilidade genômica.
Desta forma, há necessidade de reavaliar
os níveis de micronutrientes recomendados nas dietas com vista aos parâmetros
genéticos (Fenech, 1999; 2001-a; 2001-b; 2002-a; 2002-b).
Sabe-se que a ingestão adequada de vitamina B12, ácido fólico, vitamina C
ou E, vitamina B6, ferro ou zinco podem minimizar danos no DNA (Ames, 2004).
A Nutrigenômica, uma importante área emergente da ciência da nutrição trata do
efeito da dieta sobre expressão gênica e a estrutura cromossômica (Fenech,
2005). Estuda também a relação entre diferenças genéticas individuais sobre a
resposta a um determinado padrão dietético (alimento funcional ou suplemento),
em uma condição específica de saúde - buscando a prevenção da instabilidade
genômica, não só das anomalias cromossômicas espontâneas, mas também de
danos induzidos por agentes químicos ou radiações. Estas considerações têm
implicações importantes na estimativa dos riscos relativos à exposição ambiental,
incluindo o risco ocupacional (Fenech, 1999; 2001-a; 2001-b; 2002-b; 2002-c;
2005; Fenech & Fergunson, 2001).
Em outras palavras, deve-se considerar não apenas a interação gene-
genotoxinas, mas integrar esta abordagem com estudos sobre a interação gene-
dieta. No entanto, as concentrações e a reavaliação dos níveis de micronutrientes
recomendados nas dietas com vista à estabilidade genômica devem ser
interpretadas com cuidado. O folato, por exemplo, pode suprimir o
desenvolvimento de tumores intestinais (pólipos no íleo) em ratos ou ter efeito
oposto, dependendo do momento em que é administrado (Song et al., 2000). A
suplementação pode ainda causar diminuição da citotoxicidade das células Killer,
e em alto nível, pode reduzir a resposta antifolato de drogas usadas contra
malária, artrite reumatóide, psoríase e cancer. A combinação de altos níveis de
folato e baixos níveis de vitamina B12 em idosos pode estar associada a um
aumento de danos cognitivos e anemia, já em mulheres grávidas pode levar ao
aumento de resistência a insulina e em crianças pode causar obesidade (Smith,
2007; Smith et al., 2008).
13
1.3 A importância do folato e vitamina B12 na estabilidade do genoma
No grupo folato estão incluídos o ácido fólico o di-hidrofolato (DHF) e várias
formas de tetrahidrofolato (THF) (Mashiyama et al., 2004). São encontrados, em
mais de 90% das vezes, como poliglutamatos, presentes principalmente em
vegetais folhosos verdes como espinafre, couve, brócolis, em vísceras como
fígado e rim, em leguminosas e em algumas frutas frescas. O folato é sintetizado
por microorganismos e plantas superiores, mas não por mamíferos, para os quais
é um nutriente essencial, necessitando ser ingerido através dos alimentos. O
ácido fólico é a forma mais estável dos folatos. Os folatos estão envolvidos em
complexas vias metabólicas e em um grande número de processos bioquímicos
essenciais para a vida, incluindo atuação como co-fator para as enzimas
implicadas na biossíntese de nucleotídeos, timidilato e reações de metilação
(Baluz et al., 2002). Os processos metabólicos dependentes de ácido fólico são
influenciados pela ingestão do folato e de outras vitaminas como Vitamina B12 e
B6, e também por um polimorfismo genético da enzima MTHFR (metil
tetrahidrofolato redutase). O folato e Vitamina B12 funcionam como co-enzimas em
processos de oxi-redução e transferência de radical metila. A principal função das
co-enzimas folato é receber e doar radicais metil em vias metabólicas chaves,
incluindo as envolvidas nas fases de síntese de purinas e pirimidinas,
metabolismo de aminoácidos e na formação do grupamento metil, o S-
adenosilmetionina (SAM) – envolvido em mais de 100 reações de transferências
de grupamento metil (para revisão ver Baluz et al., 2002; Uehara et al., 2005). O
ácido fólico, na sua forma ativa, é denominado ácido tetraidrofólico (THF), forma
esta necessária para síntese de DNA, RNA, metionina, glutamato e serina (para
revisão ver Silbernagl et al., 2003).
Podemos observar na Figura 2 a principal via metabólica do folato e da
homocisteina.
14
Figura 2 - Principal via metabólica do folato e da homocisteina. B12- vitamina
B12; METH- metionina; THF- tetrahidrofolato; TS- timidilato sintetase;
MS- metionina sintetase; MTHFR- metilenetetrahidrofolatoredutase;
SAM- S-adenosilmetionina; SAH- S-adenosil homosisteína (adaptado
de:Fenech, 2001-a).
O folato e a vitamina B12 são importantes para a metilação do DNA e a
conversão de uracila (dUMP-Deoxi-uracil monofosfato) em timidina (dTMP –
deoxi-timidina monofosfato). Desta forma, a deficiência de folato pode romper
com os padrões de metilação do DNA, induzindo uma incorporação excessiva de
uracila (Crott et al., 2001; Fenech, 2001-a; Wang et al., 2004). Existem evidências
consistentes sugerindo que essa incorporação defeituosa de uracila ao DNA não só
ocasiona mutações pontuais, mas resulta na geração de quebras de fita única e
dupla de DNA, quebra cromossômica e formação de micronúcleos (Fenech, 2001-
a). Vitamina B12 e folato também são necessários à síntese de metionina e S-
adenosilmetionina, um doador comum do grupamento metil na manutenção de
padrões de metilação do DNA na determinação da expressão gênica e
conformação do DNA (Fenech, 1999; 2001-a; Wang et al., 2004). Quando as
concentrações de vitamina B12 e metionina são baixas, a síntese de SAM (S-
adenosilmetionina) é reduzida, assim como também a metilação do DNA e a
inibição da MTHFR pela SAM é minimizada resultando em uma conversão
SÍNTESE DA
METIONINA E
METILAÇÃO MEDIADA
DNA METILAÇÃO
HOMOCISTEÍNA
ÁCIDO FÓLICO
DIHIDROFOLATO
THF
5,10 METILENO THF
METH
5
–
METIL THF
SÍNTESE TIMIDILATO
DNA REPARO
DNA SÍNTESE
15
irreversível de 5,10-metiltetrahidrofolato para 5-metiltetrahidrofolato. Essa reação
favorece o aumento de dUMP e, conseqüentemente, a incorporação de uracil no
DNA (Fenech, 2001-a).
A deficiência de folato está relacionada também com aumento ou
desenvolvimento de alguns tipos de câncer, principalmente o coloretal
(Sanjoaquin et al., 2005). Estudo com diferentes concentrações de ácido fólico em
culturas celulares, que foram expostas à radiação, demonstra uma relação entre o
aumento de freqüência de células binucleadas com micronúcleo e de pontes
nucleoplasmáticas com o decréscimo da concentração de ácido fólico. Mostra
também um aumento de aneuploidia do cromossoma 21, apoptose e necrose não
provocada pela radiação iônizante, mas pela deficiência de ácido fólico (Beetstra,
2005). Em outro estudo, Wang et al. (2004) observaram que a deficiência de
folato pode levar à demetilação da heterocromatina, causando efeitos estruturais
no centrômero, que podem induzir danos durante a divisão nuclear. Em 1998,
Titenko-Holland et al., observaram um aumento de micronúcleos em linfócitos
relacionado a diminuição de folato na dieta acompanhado de decréscimos nas
freqüências destes biomarcadores após a reposição do folato. Ainda em relação a
efeitos de redução da concentração de folato, Lindberg et al., (2007) verificaram
um aumento de micronúcleos e brotos nucleares (buds).
A dosagem da concentração de folato mais comumente usada é feita no
soro e nas hemáceas. Vários fatores podem influenciar na concentração de folato
sangüíneo, tais como jejum inadequado, administração de ácido fólico, dieta
vegetariana, transfusão sangüínea, alguns casos de anemia perniciosa. Também
a hemólise ou a deficiência de ferro podem levar a falsa elevação de folato no
soro. Adicionalmente, a diminuição dos seus valores pode estar relacionada à
deficiência nutricional, aumento das necessidades fisiológicas, utilização de
drogas antagonistas ao ácido fólico, doenças hepáticas, deficiências enzimáticas,
dermatite esfoliativa, psoríase, má absorção por doença no intestino delgado ou
idiopático (Baluz et al., 2002; Soares, 2002).
A vitamina B12, também chamada de cobalamina, é sintetizada por
microorganismos, e os animais superiores precisam obtê-la por meio da
alimentação (produtos de origem animal, como fígado, rins, carne, peixe, ovos e
16
leite) (Silbernagl et al., 2003). A vitamina B12 é coenzima de duas enzimas
importantes que participam de processos vitais de transferência de unidades de
um carbono (metilação) à metilmalonil CoA-mutase e à metionina sintase, sendo
esta última responsável pela transformação de homocisteina em metionina. Esta
transformação é um passo fundamental na regeneração do tetrahidrofolato (THF)
a partir de metil-THF (Mahan et al., 2002). Porém, ambas as vitamina B12 e THF
são necessárias para metilação da homocisteina para metionina. Se o folato e a
vitamina B12 são deficientes, ocorre aumento da homocisteina e maior risco de
doenças cardíacas (Ames, 1998).
A influência da nutrição na incidência de câncer está sendo intensamente
investigada, porém a correlação entre níveis alimentares e câncer não está bem
esclarecida. Vaglenov et al. (1998) verificaram que a suplementação de complexo
polivitamínico (composto por 10 diferentes vitaminas e 18 sais minerais) reduziu
drasticamente a frequência de micronúcleos em trabalhadores expostos ao
chumbo. Vários estudos relacionam a deficiência de folato e da vitamina B12 com
a instabilidade cromossômica. Fenech et al. (1997; 1998) avaliaram esta
instabilidade pelo teste de Micronúcleos em indivíduos entre 50 a 70 anos e entre
18 a 32 anos observando uma correlação negativa significante entre
concentração de vitamina B12, níveis de homocisteina e micronúcleos. Fenech
(1999) relata correlação negativa entre micronúcleos em linfócitos com
concentração de vitamina B12 e correlação positiva com homocisteina no plasma.
Ainda constata que a redução ocorre quando os níveis plasmáticos de vitamina
B12 estavam acima de 300 pmol/L (406 pg/mL). Dominguez et al. (2005)
verificaram que o aumento da homocisteína e decréscimo tanto da vitamina B12
quanto do folato estão associados com Alzheimer, problemas vasculares e
diabetes mellitus tipo II, enquanto Sanjoaquin et al. (2005) demonstraram que o
consumo adequado de folato reduziu o risco de câncer coloretal. Em concordância,
estudo realizado por Mezzomo et al. (2008) com grupos de
camundongos que
receberam alimentação deficiente de folato e vitamina B12, bem como com
suplementação
alimentar em doses superiores ao necessário, demonstraram que
estes micronutrientes quando em quantidade superior evitaram formação de
micronúcleos induzidos pelo MMS (metilmetanossulfonato). Porém, Zetterberg et al.
17
(2006) não encontraram diferença na instabilidade cromossômica em indivíduos
sem deficiência de folato, assim como em grupos com ou sem suplementação.
Os valores da RDI baseada na estabilidade genômica e para prevenir
certos tipos de doenças são, para vitamina B12, de 150 ou 203 pg/mL na
prevenção de anemia, e acima de 406 pg/mL na prevenção de quebra
cromossômica e aneuploidia (Fenech, 2001-a). Para folato, os níveis no plasma
devem ser acima de 15 ng/mL e nas hemáceas, acima de 310 ng/mL. Níveis de
vitamina B12 no plasma acima de 406 pg/mL com valores de homocisteina
inferiores a 7,5 µmol/L minimizam a hipometilação do DNA, quebra
cromossômica, incorporação inadequada de uracil e formação de micronúcleos
(Fenech, 2001-b; 2002-a).
1.4 Fatores não ocupacionais e não nutricionais que podem interferir na
estabilidade do genoma
Vários fatores podem causar danos cromossômicos, entre eles estão
idade, sexo e hábito de fumar.
1.4.1 Idade
Alguns trabalhos demonstraram haver uma relação entre idade e
freqüência de micronúcleos (MN) ou dano no DNA em linfócitos (Ganguly, 1993;
Heuser et al., 2007). Testes realizados por Fenech e Morley (1985) demonstraram
uma correlação positiva entre idade e freqüência espontânea de micronúcleos,
em uma amostra com faixa etária variando de 0 a 82 anos - aos 80 anos esta
freqüência de MN é cerca de 4 vezes maior do que a observada em recém
nascidos.
Köteles et al. (1993) avaliaram a freqüência de micronúcleos em cultura
de linfócitos com citocalasina-b em uma amostra de 188 indivíduos moradores da
área urbana industrial, com idade média de 16 anos, observando a existência de
correlação entre idade e freqüência de micronúcleos. Dados semelhantes foram
18
obtidos por Maluf. (2004) em relação a freqüência de micronúcleos. Danos
cromossômicos medidos por translocações de fragmentos acêntricos,
encurtamento do telômero, não disjunção e formação de micronúcleos parecem
estar relacionados com a idade, tanto em homens como em mulheres (Fenech,
1998). O crescimento da freqüência de danos no DNA parece estar relacionado
ao acúmulo de DNA não reparado, associado à redução da capacidade de reparo
do DNA.
1.4.2 Sexo
Em relação ao sexo, a influência é discutível, apresentando uma relação
dependento do tipo de agente de exposição. Existem evidências que demonstram
freqüências de danos mais altas em mulheres (Morgolin e Shelby, 1985). Em
1998, Fenech et al. observaram uma freqüência de micronúcleos 24% maior em
mulheres em relação aos homens. Porém, em outro estudo, não foram
observadas diferenças na freqüência de micronúcleos em relação ao sexo (Dietz
et al., 2000).
1.4.3 Fumo
O fumo pode causar uma série de doenças ao homem, tais como câncer,
enfisema pulmonar e derrame. Estudos realizados demonstram um aumento da
freqüência de micronúcleos
em fumantes (Larramendy & Knuutila, 1991; Cruz et
al., 1994). Bonassi et al. (2003) realizou um estudo com 5710 indivíduos, onde
demonstrou que somente indivíduos que fumavam mais de 30 cigarros por dia
apresentavam aumento de dano genotóxico medido pelo teste de micronúcleos
em linfócitos. Também, cabe ressaltar que o hábito de fumar pode reduzir
significantemente a progressão de divisão nuclear (Bonassi et al., 2003).
19
1.5 Metodologias no Biomonitoramento ocupacional
O biomonitoramento ambiental e ocupacional, largamente usados para
avaliar o risco a que uma determinada população ou o próprio ambiente estão
expostos, induziu a criação de uma ampla bateria de testes destinada a
reconhecer a ação de agentes genotóxicos e citotóxicos. Estes testes permitem a
detecção e monitoração de danos ambientais (Villela et al., 2006; 2007) e
ocupacionais (Minozzo et al., 2004; Bhalli et al., 2006), tanto in vitro como in vivo,
e são realizados em organismos procariotos e eucariotos. Os testes mais usados
envolvendo procariotos são o teste Salmonella/Microssoma ou teste de Ames
(ensaio de mutação gênica reversa com Salmonella typhimurium, Ames et al.,
1975), o Cromoteste SOS (fundamenta-se na avaliação das funções SOS através
dos níveis da enzima β-galactosidase, utilizando uma linhagem de Escherichia
coli) e o teste de indução lisogênica ou Induteste (que se baseia na clivagem do
repressor do profago λ em células de Escherichia coli mediada pela protease
RecA). Outros testes utilizam células de organismos eucariotos, como o teste de
mutagênese e recombinogênese em Saccharomyces cerevisiae e o teste de
detecção de mutação e recombinação somática em Drosophila melanogaster
(SMART, que permite detectar mutações gênicas, aberrações cromossômicas ou
recombinações mitóticas). Ainda em células de eucariotos, destacamos o teste de
trocas entre cromátides irmãs (Sister chromatid exchange – SCE, que analisa as
intertrocas e é um indicador de lesões e reparação de DNA), a análise de
aberrações cromossômicas (que é um teste de mutagenicidade, detecção de
aberrações estruturais e aneuploidia, e pode ser realizado in vivo e in vitro), o
teste de micronúcleos em eritrócitos policromáticos de medula óssea de
camundongos (in vivo) e o teste de micronúcleos em linfócitos do sangue
periférico bloqueado com citocalasina-B (in vitro e in vivo). Nas últimas duas
décadas, vem se destacando o Ensaio Cometa (Collins, 2004; Collins et al.,
2008).
20
1.5.1 Teste de Micronúcleos
Entre as técnicas citogenéticas clássica usada em monitoramento destaca-
se o estudo de cromossomos através da observação e contagem de aberrações
cromossômicas em células em metáfase (Natarajan & Obe, 1982). Esta
abordagem proporciona uma análise detalhada, mas devido a complexidade, o
tempo despendido e a presença de artefatos (como a perda de cromossomos
durante a preparação das lâminas), estimulou o desenvolvimento de metodologia
mais simples destinada a medir danos cromossômicos. Foi então proposta, de
forma independente, por Heddle em 1973 e por Schmid em 1975, uma
abordagem alternativa simples que permitia a avaliação de danos cromossômicos
in vivo, através da análise das freqüências de micronúcleos (corpúsculos de
Howell-Jolly, na hematologia) em populações de eritrócitos da medula óssea de
roedores. Micronúcleos são cromossomos inteiros ou fragmentos cromossômicos
perdidos durante o processo de divisão celular, podendo ser de forma induzida
por algum agente químico, físico ou biológico (Figuras 3 e 4). São formados
durante a anáfase por falhas de ligação ao fuso mitótico (Fenech, 2000; Norppa,
2003; Fenech et al., 2003-a).
Em 1976, foi proposto por Countryman e Heddle o método original para o
estudo de micronúcleos em linfócitos humanos cultivados, que apresentava a
desvantagem de impedir a identificação do número de divisões pelas quais as
células estudadas passavam. Este problema foi solucionado pelo método usado
atualmente, que é baseado no bloqueio pela citocalasina-B da citocinese de
linfócitos do sangue periférico cultivado (Fenech & Morley, 1985; Fenech, 1997,
2006).
21
Figura 3 - Eventos observados no Teste de Micronúcleos: (a) esquema
demonstrando a formação de diferentes anormalidades de divisão
celular; (b) linfócitos humanos mostrando diferentes eventos
observados: (A) Célula mononucleada; (B) Célula binucleada; (C)
Célula multinucleada; (D) Necrose; (E) Apoptose; (F) Célula com
micronúcleo; (G) Célula com ponte nucleoplasmática e micronúcleo;
(H) Célula com brotos nucleares (Fonte: Fenech, 2006).
AGENTE
CITOTÓXICO
GENOTÓXICO
T
este
de
Micronúcleos
APOPTOSE
CROMOSSOMO
DICÊNTRICO
CROMOSSOMO
QUEBRADO E
PERDIDO
AMPLIFICAÇÃO
DO GENE
NECROSE
22
O teste de Micronúcleos fundamenta-se na avaliação da freqüência de
micronúcleos em um determinado tipo celular, como medida de danos
cromossômicos induzidos por agentes clastogênicos e/ou aneugênicos. Os
agentes clastogênicos e/ou aneugênicos podem ser de natureza química,
biológica ou física. No processo mitótico, após a separação dos cromossomos,
dois núcleos são originados, um em cada pólo, e a membrana nuclear é
reconstituída. Entretanto, se um fragmento cromossômico ou um cromossomo
inteiro não se integra a um dos dois novos núcleos, pode constituir um pequeno
núcleo, chamado micronúcleo. Para a formação de micronúcleos, é necessário
que ocorra uma divisão celular após o evento mutagênico (Fenech, 2006).
Micronúcleos também podem ser observados em diferentes tipos de
células, tais como células da mucosa oral, células do trato urinário, células de
peixes, plantas e mamíferos, desde que ocorra uma divisão celular após o evento
mutagênico. A técnica de análise de micronúcleos em linfócitos do sangue
periférico bloqueados pela citocalasina-B, além de fornecer a freqüência de
micronúcleos em células binucleadas, possibilita o estudo e a obtenção de outras
informações importantes como pontes nucleoplasmáticas, brotos nucleares,
índice de divisão nuclear (IDN), necrose e apoptose (Figura 3) (Fenech, 2000;
Fenech & Crott, 2002; Fenech, 2006).
Pontes nucleoplasmáticas podem ser observadas entre núcleos de células
binucleadas. São formadas, provavelmente, por cromossomos dicêntricos nos
quais os centrômeros são arrastados para os pólos opostos da célula. Portanto,
pontes nucleoplásmicas em células binucleadas podem constituir uma medida
adicional e complementar de rearranjos cromossômicos, podendo ser analisadas
juntamente com a contagem de micronúcleos (Fenech & Crott, 2002; Fenech et
al., 2003-a; 2003-b; Fenech, 2006, Lindberg et al., 2007) (Figura 4). Os brotos são
reconhecidos por poder formar micronúcleos. A formação de brotos pode ser a
partir de pontes, considerando que a ligação é frágil (Figura 4).
23
Figura 4 - Pontes Anafásicas e formação de brotos (Adaptado de Lindberg et al.,
2007).
Os Brotos Nucleares (nuclear buds) provavelmente representam DNA
amplificado em excesso que é eliminado do núcleo durante a fase S. O broto
nuclear é semelhante estruturalmente ao micronúcleo, mas enquanto o
micronúcleo é separado do núcleo principal, o broto permanece ligado ao núcleo
principal por uma ponte nucleoplasmática (Figuras 3 e 4) (Fenech & Crott, 2002;
Fenech et al., 2003-a; 2003-b; Fenech, 2006).
Brotos Nucleares
são gerados
simultaneamente ao micronúcleo durante a divisão nuclear ou na fase S, em um
estágio de extrusão do DNA, possivelmente dando base ao micronúcleo. Lindberg
et al. (2007) sugerem diferentes mecanismos de origem para o micronúcleo e
PONTE CROMOSSOMAL
EM ANÁFASE
UMA QUEBRA
NA PONTE
DUAS
QUEBRAS
NA PONTE
OU
FORMAÇÃO DE
BROTOS
NUCLEARES
MICRONUCLEAÇÃO
24
brotos. Micronúcleos derivam inicialmente de fragmentos acêntricos terminais e
cromossomos durante anáfase; fragmentos intersticiais são relativamente raros
em micronúcleos. Brotos originam-se, aparentemente, de fragmentos acêntricos
intersticiais ou terminais. Também verificaram que a deficiência em acido fólico
resulta em aumento na freqüência de micronúcleos e brotos nucleares com
fragmentos acêntricos terminais.
A análise de necrose e apoptose, outras possibilidades de análise no Teste
de Micronúcleos, é importante para a avaliação da sensibilidade celular e
mecanismos de ação de determinado agente químico (Fenech et al., 2003-a;
2003-b; Fenech, 2006; Lindberg et al., 2007).
Outra informação que pode ser obtida desta técnica é a extensão e
progressão da divisão nuclear, pela contagem do número de células com um,
dois, três, quatro ou mais núcleos, em um total de 1000 células por amostra. A
proliferação celular é expressa pelo índice de divisão nuclear (IDN =(M1 + 2M2 +
3M3 + 4M4) / N, onde M1, M2, M3 e M4 indicam o número de células com um,
dois, três, quatro ou mais núcleos, respectivamente, e N o número total de células
analisadas (Eastmond & Turcker, 1989; Fenech et al., 2003-b).
1.5.2 Ensaio Cometa
O Ensaio Cometa, também conhecido pela sigla SCGE (Single Cell Gell
electrophoresis test), detecta danos induzidos no DNA relacionados à quebra de
fita única e fita dupla, danos álcali-lábeis, ligações cruzadas (crosslinks) e sítios
incompletos de reparo por excisão. Pode ser usado em qualquer tipo de célula
eucariota, fornecendo informações sobre genotoxicidade (in vitro e in vivo), e
rotineiramente utilizadas no biomonitoramento humano e ambiental e em estudos
de dano e reparo do DNA (Collins, 2004; Collins et al., 2008).
Ostling e Johanson (1984) foram os primeiros a desenvolver a técnica de
eletroforese por microgel para detectar dano de DNA em células individuais. Eles
embeberam as células em agarose e colocaram em lâmina de microscopia. Após
este procedimento, as células foram rompidas com solução salina e detergentes
25
e, em condições neutras, o DNA é liberado. Singh et al. (1988) introduziram a
técnica com microgel utilizando a eletroforese em meio alcalino (pH 13) para
detecção de dano ao DNA em célula individual, produzindo quebras de cadeia
simples de DNA em sítios álcali-lábeis.
Assim, são dois os métodos do teste mais utilizados: um na versão com o
pH neutro, onde são detectadas danos provocados por quebra de fita dupla de
DNA e crosslinks, e o outro método com pH alcalino (maior que 13), que pode
detectar danos de fita simples e dupla, sítios álcali-lábeis e crosslinks. O teste
consiste numa suspensão de células, as quais são embebidas em gel de agarose
de baixo ponto de fusão, distribuídas sobre uma lâmina e colocadas para lisar. As
lâminas são colocadas em solução alcalina ou neutra para que ocorra o
desenovelamento do DNA e em seguida é feita a eletroforese. Após, as lâminas
são neutralizadas, fixadas e coradas. A leitura é feita por microscopia, onde se
verifica se as células foram lesadas, se o DNA livre migrou do núcleo para o
ânodo, evidenciando uma cauda que lembra a forma de um cometa. Os núcleos
intactos (onde não houve dano ao DNA) apresentam forma arredondada (Tice et
al., 2000; Nadin et al., 2001; Collins, 2004; Collins et al., 2008). Na Figura 5, é
mostrado os tipos de cometas (classes) que podem ser avaliados no Ensaio
Cometa.
26
Figura 5 – Diferentes tipos de cometas observados no Ensaio Cometa. Classes
de Cometa: 0= sem lesão até 4= máximo de lesão.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Dando continuidade aos nossos estudos, publicados em 2004 (Minozzo et
al., 2004), nos propomos a investigar não só os danos genotóxicos em indivíduos
expostos ocupacionalmente ao chumbo, mas principalmente verificar a existência
ou não desta inter-relação entre a ação do agente genotóxico (neste caso a
exposição ao chumbo) com os níveis de micronutrientes (folato e vitamina B12).
Nesta investigação, buscamos verificar os níveis de chumbo no sangue, danos no
DNA através do Ensaio Cometa, análise citogenética em linfócitos cultivados e
bloqueados pela citocalasina-B (Teste de Micronúcleos) e níveis sangüíneos de
micronutrientes (folato e vitamina B12).
2.2 Objetivos Específicos
- Verificar se o nível de plumbemia de trabalhadores expostos ao chumbo
está de acordo com a legislação nacional vigente;
- Determinar a prevalência de anemia nos trabalhadores expostos ao
chumbo;
- Avaliar a importância dos níveis de micronutrientes em relação aos
danos espontâneos que ocorrem no genoma;
- Investigar a genotoxicidade e mutagenicidade relacionada à exposição
ao chumbo;
- Relacionar as respostas individuais dos trabalhadores à sua condição
micronutricional de folato e vitamina B12.
Artigo anexo
Plumbemia em Trabalhadores da Indústria de
Reciclagem de Baterias Automotivas da Grande
Porto Alegre, RS.
Artigo
publicado
no
Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina
Laboratorial v 44, nº6 p. 407-412. Dez. 2008
3. Capitulo I
29
Artigo anexo
30
Artigo anexo
31
Artigo anexo
32
Artigo anexo
33
Artigo anexo
34
Prevalência de anemia em trabalhadores
expostos ocupacionalmente ao chumbo
Artigo publicado
na
Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia
2009 – 31 (2): 94-97
4. Capitulo II
35
Artigo anexo
36
Artigo anexo
37
Artigo anexo
Artigo anexo
39
Circulating Concentrations of Folate and
Vitamin B
12
in Relation To Genotoxic Effects in
Workers of Battery Manufacturing and
Recycling Companies
Artigo a ser encaminh
ado à
MUTATION RESEARCH
5. Capítulo III
40
Circulating Concentrations of Folate and Vitamin B
12
in Relation To
Genotoxic Effects in Workers of Battery Manufacturing and Recycling
Companies
Renato Minozzo
a, b
, Luiz Irineu Deinling
b
, Renato Santos-Mello
b
, Juliana da Silva
b,*
a
Doutorando do Programa de Pós-graduação em Genética e Toxicologia Aplicada
– ULBRA – Canoas - RS
b
Programa de Pós-graduação em Genética e Toxicologia Aplicada Universidade
Luterana do Brasil, ULBRA, Canoas, RS, Brazil.
* Corresponding author,
Juliana da Silva
Av. Farroupilha, 8001 (ULBRA),
Bairro São José, CEP 92425-900,
Canoas/RS
Brazil
Phone: +55 51 3347.92.78.
E-mail address: julian[email protected]
41
ABSTRACT
The aim of this study was to assess lead exposure hazards, and to
investigate the role played by folate and vitamin B12 in genome stability of workers
occupationally exposed using micronucleus test and the comet assay. The study
population was formed by 53 male workers of car battery manufacturing and
recycling companies located in the metropolitan area of Porto Alegre, RS, Brazil.
The control group comprised 53 non-exposed individuals living the same region.
Measures of lead levels in blood were calculated, and blood samples were
collected to carry out micronucleus test, comet assay, and hemoglobin dosage.
The results from this study indicate that the blood from workers directly exposed
contained high levels of lead, compared with the control group, 24 times as high
as that of control individuals, and a significant increase for anemia concentration of
exposed in relation to non-exposed. In the micronucleus test, statistically
significant differences were observed in micronucleus, nuclear buds,
nucleoplasmatic bridges, nuclear division index, apoptosis, and necrosis. The
comet assay also revealed statistically significant differences for damage
frequency and damage index. Folate and vitamin B12 levels observed in the
experiments, considering the reference values adopted did not influence
chromosome damage evaluated in the micronucleus and comet assays, for lead-
exposed and control groups. The data show that in general neither the exposed
nor the control groups showed significant correlation of folate or vitamin B12 levels
with the parameters analyzed. The exceptions are the positive correlation between
folate and age and micronucleus, and vitamin B12 and nuclear division index.
Thus, this study does not provide support for an
association between genotoxic
risk and circulating concentrations
of folate or vitamin B12 in workers of car battery
manufacturing and recycling companies.
Keywords: Lead toxicity; occupational exposure; comet assay; micronuclei test;
folate; vitamin B12
42
INTRODUCTION
Lead (Pb) is an abundant chemical element in nature. In the past, Pb was
used in the manufacture of water pipes, décor objects, as well as containers for
food storage and transport. Today, Pb is employed in a wide array of products
such as batteries, radiators, cables, paint and dyes, ceramics, and is also used in
the production of brass and bronze, ammunition, typography, among other
applications.
The metal has been shown produce hematological, neurological, renal,
reproductive, endocrine toxicities, apart from the effects on the skeletal and
cardiac systems and carcinogenesis. As for hematological toxicity, the induction of
anemia is one of the most prevalent and most studied effects of Pb [1,2]. The
pathway of Pb into the body is the gastrointestinal and respiratory tracts (inhalation
of vapors, dust or powder). Within four to six weeks, Pb distributes along the
tissues that are more richly vascularized such as the liver, the kidneys, the brain,
as well as bones. Over 90% of the total Pb body content is found in the bones as
lead phosphate [3]. Since the human organism is deprived of an active Pb
elimination mechanism, the metal is removed through the biliary and
gastrointestinal tracts, as well as by glomerular filtration in the kidneys [4].
The biochemical effects of Pb may be categorized into three types. The first
relates to the bonds the metal establishes to several electron donors, especially
those of the sulphidric group, which possibly constitutes the main Pb toxicity
source. These bonds induce changes in protein structures and alter enzyme
structures. The second type of effect is due to the biochemical and biophysical
similarity Pb bears with calcium, which provides access to the main cell routes,
such as mitochondria. The third class seems to affect the nucleic acids through a
mechanism not yet fully clarified. This has led to conjectures over the possibility
that Pb may induce chromosome aberrations [5,6,7]. Nevertheless, current data
on the likely genotoxic and carcinogenic action of Pb remain the subject of
controversy [8, 9, 10, 11, 12]. Thus, whilst in bacterial tests lead seems to be
generally non-mutagenic [8], in eukaryotic cells this compound is usually genotoxic
[9] by a mechanism that until now has not been very well characterized and that
43
possibly involves indirect damage to DNA affecting the stabilization of chromatin
[10] or interaction with repair processes [11].
Lead and inorganic lead compounds have been classified by IARC [13] as
possible human carcinogens -Group 2B - on the basis of sufficient evidence for
carcinogenicity in experimental animals, but inadequate evidence for
carcinogenicity in humans. Nevertheless, a recent meta-analysis of published
data, with workers heavily exposed to lead, provides some evidence to support the
hypothesis of an association between stomach and lung cancer and exposure to
lead [14].
Genotoxicity can be modulated by different factors. In particular, it is
accepted that many dietary constituents markedly influence or alter the adverse
effects of genotoxic agents [15, 16, 17]. In recent years, several papers published
have placed emphasis on the importance of nutrition, especially of micronutrients
as folate and vitamin B12, in the prevention of genomic instability [15, 16, 17].
Most studies published so far, if not all, including those conducted from
biomonitoring perspective; consider only the interaction between genes and
genotoxins in predicting DNA damage [12, 18, 19, 20]. Yet, the interaction gene-
genotoxin-diet is important not only in the specification of dietary
recommendations that are appropriate to preserve genomic stability, but also in
the conduction of studies addressing occupational exposure to mutagenic and
carcinogenic agents [21].
Taking this into account, the present work deals with the study of the
genetic damage levels and the influence of micronutrient levels (folate, vitamin
B12) observed in a group of workers exposed to high levels of lead, as
consequence of their work in battery manufacturing and recycling companies. This
genetic damage has been evaluated by using the micronucleus test and comet
assay in peripheral blood cells.
44
MATERIALS AND METHODS
Study population and sample collection
The study was conducted with 53, males aged 18-55 years, employed in
the recycling of automotive batteries in the Greater Porto Alegre Region, RS,
Brazil, for a period of time that ranged from 1 month to 40 years (Table 1). In all
the groups, individuals who smoked more than five cigarettes per day for at least 1
year were considered smokers. The control group consisted of 53 healthy males
aged 18-55 years with no history of exposure to clastogenic and/or aneugenic
agents, and of socioeconomic level similar to that of the subjects exposed to Pb.
At the time of blood collection (10 mL/individual; 5 mL with EDTA and 5 mL with
heparin) all the individuals examined in the study were required to answer a
Portuguese version of a questionnaire utilized by the International Commission for
Protection against Environmental Mutagens and Carcinogens [22] and to take part
in an person-to-person questionnaire which recorded standard demographic data
as well as answers relating to lifestyle, habits such as smoking and alcohol intake,
and factors like medication, recent viral infections, vaccinations, diagnostic tests or
previous occupational exposure to chemicals. Written informed consent was
obtained from each subject. The research procedures used in the present study
were approved by the Ethics Committee of our university.
Lead in blood
Part of the blood collected from each individual was used to determine Pb
concentration by atom absorption spectrophotometer as previously described by
Bosnak et al. [23] using a Perkin-Elmer apparatus, model 4110 ZEEMAN.
Hemoglobin determination
Hemoglobin (Hb) dosage was analyzed in the blood with EDTA by
spectrophotometry (ADVIA 60-CT Automate Hematology System, Bayer
Corporation USA, 2000), at Feevale biomedicine laboratory in Novo Hamburgo
RS, Brazil, according to standard methods [24].
45
Comet assay
The alkaline comet assay was performed as described by Tice et al. [25].
Blood cells with heparin (5 µL) were embedded in 95 µL of 0.75% low-melting
point agarose. Upon agarose solidification, slides were placed in lysis buffer (2.5
M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris; pH 10.0-10.5) containing freshly added 1%
(v/v) Triton X-100 and 10% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) for a minimum of 1 h
and a maximum of 2 weeks. After treatment with lysis buffer, slides were
incubated in freshly-prepared alkaline buffer solution (300 mM NaOH and 1 mM
EDTA; pH >13) for 20 min, and DNA electrophoresis runs were carried out for 20
min at 25 V (0.90 V/cm) and 300 mA. Following electrophoresis, slides were
neutralized in 400 mM Tris (pH 7.5) and fixed (15% w/v trichloroacetic acid, 5%
w/v zinc sulfate, 5% glycerol), washed in distilled water and dried overnight. Next,
gels were re-hydrated for 5 min in distilled water, and then stained for 15 min (37
°C) with a solution containing the following sequence: 34 mL of Solution B (0.2%
w/v ammonium nitrate, 0.2% w/v silver nitrate, 0.5% w/v tungstosilicic acid, 0.15%
v/v formaldehyde, 5% w/v sodium carbonate) and 66 mL of Solution A (5% sodium
carbonate). The staining was stopped with 1% acetic acid and the gels were air-
dried [26]. Images of 100 randomly selected cells (50 cells from each of two
replicate slides) and analyzed under optical microscope. Two parameters were
evaluated: (1) damage index (DI), in which each cell was designated to one of five
classes (from no damage = 0, to maximum damage = 4) according to tail size and
shape. The values obtained for each individuals ranged from 0 (0×100) to 400
(4×100); and (2) damage frequency (DF), calculated as the percentage of
damaged cells [27, 28, 29].
Micronucleus (CBMN) assay
Cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay was conduct according to
the method described by Fenech and Crott [30]. A 0.5-mL aliquot was removed
and cultured in medium consisting of 5 mL RPMI1640 (Gibco) supplemented with
10% inactivated fetal calf serum (Nutricell), 100 units/mL penicillin, 100 µg/mL
streptomycin, and 1% phytohemaglutinin (PHA-Gibco). After incubation at 37 °C
for 44 h, cytochalasin-B (Sigma) was added to all cultures at a final concentration
46
of 3.0 g/mL. After 72h of incubation, each culture was centrifuged at 1,000 rpm for
10 min, underwent hypotonic treatment for 3 min in 0.75M KCl at 37 °C, and was
subsequently fixed using methanol/acetic acid (3:1). Prepared and dried slides
were stained with 10% Giemsa, pH = 6.8, coded and analyzed with a Zeiss
microscope (10×100 with an immersion objective lens). A total of 2,000
binucleated cells per sample with a well-preserved cytoplasm were analyzed for
the determination of micronuclei, nucleoplasmic bridge, buds, necrosis and
apoptosis frequency according to the criteria proposed by Fenech et al. [31]. The
extent and progression of nuclear division were measured by counting the number
of cells with one, two, three and four or more nuclei in a total of 1,000 cells per
sample. Cell proliferation is expressed as nuclear division index (NDI), as follows:
NDI = (M1 +2M2 +3M3 +4M4)/N, where M1, M2, M3 and M4 indicate the number
of cells with one, two, three and four nuclei and N the total number of cells
analyzed [ 32].
Determination of folate and vitamin B12 in blood serum
The determination the folate and vitamin B12 level, were analyzed in serum
by immunoassay chimiolumiluminecence (Beckman Instruments Access
Immunoassay), using like standard value 3.0 µg/mL a 15 µg/mL to folate, and 250
pg/mL to 1100 pg/mL to vitamin B12 [33,34 ].
Statistical analysis
Data were analyzed statistically using the SPSS package (version
16.0). The normality of variables was evaluated by the Kolmogorov–Smirnov test;
χ
2
and t-tests were used to compare the demographic characteristics of study
populations. The statistical analysis of differences in micronucleus test, NDI,
comet assay and laboratory assays was carried out using the nonparametric
Mann–Whitney U test (Critical level for rejection of the null hypothesis was
considered to be a P value of 5%, two tailed). Correlations between different
variables were determined by Kendall rank correlation test (Critical value for
rejection of the null hypothesis of 0.05 %, one tailed).
47
RESULTS
The main demographic characteristics of workers of battery
manufacturing and recycling companies and controls are presented in Table 1. No
significant differences in average age were detected between the groups (t-test).
Few volunteers were considered smokers in either group. No statistical differences
were found in smoking habit (
χ
2
and Mann–Whitney).
Table 1. Evaluation of genetic damage in workers of battery manufacturing and
recycling companies: Main demographic characteristics of the studied
subjects.
GROUPS
PARAMETERS
CONTROL EXPOSED
Number of subjects 53 53
Age
(years; min-max)
33.07 ± 11.68
(18 - 55)
36.00 ± 10.52
(18 - 55)
Time of work
(years; min-max)
-
9.80 ± 11.07
(0.08 - 40)
Smokers
a
7(13.20%)
b
15 (28.30%)
c
Non-smokers 46 (86.80%) 38 (71.70%)
a
Smoking more than 5 cigarettes/day;
b
12.2 cigarettes/day on average;
c
18 cigarettes/day on
average
Table 2 illustrates the results of the comparisons carried out using the
Mann-Whitney test for the several parameters studied in the Pb-exposed and
control groups. The comet assay revealed statistically significant differences as to
the frequency of DNA damage (P<0.001) and DNA damage index (P<0.001).
Significant differences were observed for
micronucleus values (P<0.001), nuclear
buds (P<0.001), nucleoplasmatic bridges (P=0.002), nuclear division index
(P<0.001), apoptosis (P<0.001) and necrosis (P<0.001). In turn, no statistically
48
significant differences were observed when groups were compared for folate
(P=0.820) and vitamin B12 (P=0.907) were compared. Levels of Pb and
hemoglobin in blood for the Pb-exposed and the control groups demonstrates that
exposed group presents increased Pb and reduced hemoglobin levels as
compared to the control group, with statistically significant difference.
Table 2. Mean values (mean±S.D.) obtained by the different parameters analyzed
in terms of control group and workers exposed to lead.
GROUPS
PARAMETERS
CONTROL
(N= 53)
EXPOSED
(N= 53)
Comet assay
Damage frequency
1.75 ± 1.82 14.11 ± 16.21 ***
Damage index
2.57 ± 2.73 21.69 ± 27.85 ***
Micronucleus test
Micronuclei
4.52 ± 2.08 13.94 ± 8.46 ***
Nucleoplasmic bridges
0.89 ± 1.01 1.45 ± 1.05 **
Buds
1.68 ± 1.54 3.05 ± 2.23 ***
Apoptosis
0.40 ± 0.72 2.26 ± 1.78 ***
Necrosis
0.00 ± 0.00 1.85 ± 1.86 ***
Nuclear division index
2.28 ± 0.22
2.02 ± 0.20 ***
Laboratory assays
Lead(µg/dL)
2.44 ± 1.15 59.43 ± 28.34 ***
Hemoglobin (g/dL)
14.51 ± 1.03 13.74 ± 1.42 **
Folate (ng/mL)
6.35 ± 2.51 6.17 ± 2.21
Vitamin B12 (pg/mL)
371.70 ± 148.67
370.33 ± 130.67
***Significant at P < 0.001 level, **Significant at P < 0.01 (Mann-Whitney)
49
When the several parameters studied were compared for Pb-exposed and
control groups in terms of smoking (Table 3), no statistically significant differences
were observed. Thus, smoking was discarded as a variable in the other analyses.
Table 3. Mean values (mean±S.D.) obtained by the different parameters analyzed
in terms of smokers and non-smokers in the controls group and
workers group exposed to lead.
GROUPS
CONTROLS EXPOSED
PARAMETERS
SMOKERS
(N=7)
NON-SMOKERS
(N=46)
SMOKERS
(N=15)
NON-
SMOKERS
(N=38)
Comet assay
Damage frequency
1.07 ± 0.60 1.85 ± 1.92 15.93 ± 13.97 13.39 ± 17.13
Damage index
1.35 ± 1.24 2.75 ± 2.84 26.86 ± 32.38 19.65 ± 26.04
Micronuclei assay
Micronuclei
4.71 ± 1.11 4.50 ± 2.19 10.67 ± 12.11 9.45 ± 10.78
Nucleoplasmic bridges
0.85 ± 0.69 0.89 ± 1.05 1.40 ± 0.91 1.47 ± 1.11
Buds
1.85 ± 1.21 1.65 ± 1.59 3.20 ± 2.39 3.00 ± 2.19
Apoptosis
0.71 ± 1.25 0.34 ± 0.60 3.06 ± 2.25 1.94 ± 1.48
Necrosis
0.00 0.00
1.86 ± 1.59 1.84 ± 1.97
Nuclear division index
2.36 ± 0.14
2.26 ± 0.22
2.10 ± 0.17
1.99 ± 0.20
Laboratory assays
Lead(µg/dL)
2.27 ± 0.81 2.46 ± 1.20 69.04 ± 31.05 55.63 ± 26.68
Hemoglobin (g/dL)
14.37 ± 1.14 14.53 ± 1.01 13.50 ± 1.66 13.84 ± 1.33
Folate (ng/mL)
5.45 ± 1.43 6.49 ± 2.62 5.96 ± 2.02 6.26 ± 2.29
Vitamin B12 (pg/mL)
422.42 ± 196.94
363.97 ± 141.09 386.33 ± 162.41
364.02 ± 117.77
50
Frequency (%) of classes of DNA damage (comet assay) in lead exposed
workers revealing the prevalence of damage classes 1 and 2 (Figure 1).
Control
Exposed
C
l
a
s
s
0
C
l
a
s
s
1
C
l
a
s
s
2
C
l
a
s
s
3
C
l
a
s
s
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Frequency (%)
Figure 1. Frequency of DNA damage classes in the control and the Pb-exposed
groups.
All significant correlations between parameters are illustrates in Table 4.
The other comparisons conducted did not present statistical significance (data not
shown).
51
Table 4. Kendall rank correlation analysis of end-points of lead exposed workers.
WORKERS GROUP
CORRELATIONS
Г VALUES
P
Time of work X Age 0.509 < 0.001
Time of work X Micronuclei 0.252 0.005
Age X Damage frequency 0.176 0.035
Age X Damage index 0.185 0.028
Age X Micronuclei 0.333 < 0.001
Age X Bridge 0.186 0.040
Age X Folate 0.197 0.020
Damage frequency X Damage index 0.865 < 0.001
Damage index X Necrosis 0.196 0.030
Micronuclei X Buds 0.312 0.001
Micronuclei X Folate 0.291 0.001
Nuclear division index X B12 0.159 0.047
Nuclear division index X Hemoglobin - 0.161 0.046
Lead X Hemoglobin - 0.324 < 0.001
Almost all groups presented normal levels of folate (>3 ng/mL; up to 90%)
(Table 5). This table presents a comparison of parameters analyzed for folate
levels (in the reference interval: under 3 ng/mL – equal or above 3 ng/mL; OMS)
between the control group and the group of workers occupationally exposed to Pb.
Statistically significant difference was observed only for the parameter age, in the
control group.
The individuals from this study presented mean levels of folate about 6.35
ng/mL for control group and about 6.17 ng/mL for Pb-exposed group. Table 6
compares the parameters investigated in Pb-exposed and control groups in terms
of the respective mean folate levels of groups from this study (control group: 6.35
ng/mL; Pb-exposed group: 6.17 ng/mL). Statistically significant difference was
observed only for parameter micronuclei, in the Pb-exposed group.
52
Table 5. Parameters analyzed in relation to folate levels (<3ng/mL and >3ng/mL
a
)
in the control and Pb-exposed groups.
FOLATE
GROUPS/PARAMETERS
<3ng/mL ≥3 ng/mL
P
Control
Number of subjects 4 49
Age (Years)
21.75 ± 3.86 34.00 ± 11.63 0.018
Damage frequency 0.87 ± 0.47 1.82 ± 1.87 0.332
Damage Index 1.12 ± 0.62 2.68 ± 2.80 0.255
Micronuclei
3.25 ± 1.89 4.63 ± 2.07 0.179
Nucleoplasmic bridges
0.75 ± 1.50 1.75 ± 1.53 0.152
Buds 1.00 ± 0.81 0.87 ± 1.03 0.562
Apoptosis 0 ± 00 0.42 ± 0.73 0.201
Necrosis 0 ± 00 0 ± 00 1.000
Nuclear division index 2.43 ± 0.10 2.263 ± 0.221 0.117
Vitamin B12 350.50 ± 61.00 373.46 ± 153.85 0.933
Lead (µg/dL)
2.20 ± 1.15 2.46 ± 1.16 0.566
Hemoglobin
14.10 ± 0.70 14.54 ± 1.04 0.252
Exposed
Numbers of subjects 2 51
Age (Years) 38.00 ± 8.48 35.92 ± 10.65 0.709
Time of work (years) 2.08 ± 1.30 10.10 ± 11.17 0.375
Damage frequency 26.25 ± 21.56 13.63 ± 16.05 0.154
Damage Index 49.25 ± 54.09 20.61 ± 26.77 0.224
Micronuclei 21.00 ± 24.04 13.66 ± 7.80 0.981
Nucleoplasmic bridge 3.00 ± 1.41 1.39 ± 1.00 0.073
Buds 2.50 ± 0.70 3.07 ± 2.27 0.925
Apoptosis 1.00 ± 1.41 2.31 ± 1.79 0.284
Necrosis
3.50±2.12 1.78 ± 1.84 0.132
Nuclear division index 2.00 ± 0.67 2.02 ± 0.18 0.963
Vitamin B12 535.00 ± 115.96 363.88 ± 127.91 0.076
Lead (µg/dL)
68.70 ± 8.90 59.06 ± 28.81 0.234
Hemoglobin
13.40 ± 1.97 13.76 ± 1.42 0.455
a
reference value according Beckman Instruments-Folate-2000.
53
Table 6. Mean folate levels for the control (6.35 ng/mL) and Pb-exposed (6.17
ng/mL) groups in relation to parameters analyzed.
GROUPS/PARAMETERS FOLATE
a
P
Control
<6.35 ng/mL
≥6.35 ng/mL
Number of subjects 30 23
Age (Years)
31.16 ± 11.10 35.56 ± 12.19 0.186
Damage frequency 2.01 ± 2.16 1.41 ± 1.20 0.555
Damage Index 2.95 ± 3.25 2.06 ± 1.77 0.619
Micronuclei
4.23 ± 1.94 4.91 ± 2.23 0.293
Nucleoplasmic bridges
0.70 ± 0.91 1.13 ± 1.09 0.111
Buds 1.70 ± 1.53 1.65 ± 1.58 0.832
Apoptosis 0.36 ± 0.76 0.43 ± 0.66 0.447
Necrosis 0 ± 00 0 ± 00 1.000
Nuclear division index 2.28 ± 0.22 2.26 ± 0.21 0.473
Vitamin B12 340.6 ± 88.20 412.26 ± 197.35 0.332
Lead (µg/dL)
2.34 ± 1.23 2.56 ± 1.04 0.169
Hemoglobin
14.75 ± 0.76 14.1 ± 1.23 0.108
Exposed
<6.17 ng/mL
≥6.17 ng/mL
Numbers of subjects 30 23
Age (Years) 33.56 ± 9.60 39.17 ± 11.02 0.060
Time of work (years) 8.50 ± 10.52 11.49 ± 11.76 0.350
Damage frequency 15.33 ± 18.74 12.52 ± 12.37 0.602
Damage Index 25.03 ± 33.84 17.34 ± 17.00 0.647
Micronuclei 12.60 ± 7.47 15.69 ± 9.48 0.017
Nucleoplasmic bridges 1.23 ± 1.10 1.74 ± 0.91 0.065
Buds 2.96 ± 2.18 3.17 ± 2.32 0.771
Apoptosis 2.33 ± 1.74 2.17 ± 1.87 0.647
Necrosis
1.96 ± 1.95 1.69 ± 1.76 0.532
Nuclear division index 1.99 ± 0.24 2.07 ± 0.12 0.342
Vitamin B12 382.56 ± 133.98 354.39 ± 127.37 0.478
Lead (µg/dL)
58.63 ± 28.42 60.46 ± 28.84 0.584
Hemoglobin
13.89 ± 1.48 13.44 ± 1.38 0.219
a
mean values for the individuals from this study
54
Similar to folate, control and workers groups presented about 80% of
individuals with normal levels of B12 (Table 7). Vitamin B12 levels against the 250-
pg/mL reference value [34] in relation to different parameters analyzed are shown
in Table 7. Statistically significant difference was observed only for
nucleoplasmatic bridges, for which an increase occurred in Pb-exposed individuals
and with vitamin B12 levels above the reference value.
Mean values obtained in this study for B12 were 371.70 pg/mg for control
group and 370.33 for Pb-exposed group. The parameters investigated in Pb-
exposed and control groups in terms of the respective mean vitamin B12 levels
(control group: 371.70 pg/mL; Pb-exposed group: 370.33 pg/mL) are
demonstrated in Table 8. Statistically significant differences were observed only
for the parameter time of work (years) in the Pb-exposed group.
Parameters associations with mean values of this study for both folate and
B12 are observed in Table 9. The table compiles results for individuals with folate
and B12 levels above the respective means, folate levels above and vitamin B12
below the means, folate levels below and vitamin B12 above means, and
individuals with levels of both micronutrients above the respective means.
Although we did not find statistically significant differences in any of the
parameters analyzed (ANOVA), a decreased incidence of damage in the comet
assay and in necrosis events was observed when folate and B12 levels are above
the mean.
55
Table 7. Mean vitamin B12 levels for the control and Pb-exposed groups in
relation to parameters analyzed (reference value = 250 pg/mL
a
).
B12
GROUPS/PARAMETERS
<250 pg/mL ≥250 pg/mL
P
Control
Number of subjects 6 47
Age (Years)
39.50 ± 10.09 32.25 ± 11.71 0.084
Damage frequency 2.41 ± 2.78 1.67 ± 1.68 0.650
Damage Index 3.50 ± 4.04 2.25 ± 2.29 0.671
Micronuclei
4.33 ± 2.16 4.55 ± 2.09 0.798
Nucleoplasmic bridges
1.00 ± 1.54 0.87 ± 0.94 0.786
Buds 2.16 ± 1.47 1.61 ± 1.55 0.280
Apoptosis 1.00 ± 1.09 0.31 ± 0.62 0.032
Necrosis 0 ± 00 0 ± 00 1.000
Nuclear division index 2.25 ± 0.30 2.27 ± 0.20 0.955
Folate 6.03 ± 2.13 6.12 ± 2.07 0.877
Lead (µg/dL)
2.36 ± 0.68 2.45 ± 1.20 0.757
Hemoglobin
14.46 ± 0.92 14.51 ± 1.04 0.673
Exposed
Numbers of subjects 12 41
Age (Years) 35.58 ± 11.82 36.12 ± 10.26 0.823
Time of work (years) 12.70 ± 13.74 8.95 ± 10.20 0.233
Damage frequency 17.95 ± 21.59 12.98 ± 14.41 0.443
Damage Index 25.91 ± 30.05 20.46 ± 27.44 0.566
Micronuclei 16.58 ± 12.61 13.17 ± 6.82 0.443
Nucleoplasmic bridges 0.83 ± 0.717 1.63 ± 1.07 0.017
Buds 3.41 ± 2.67 2.95 ± 2.10 0.659
Apoptosis 2.41 ± 2.23 2.21 ± 1.66 0.914
Necrosis
2.66 ± 2.22 1.60 ± 1.70 0.089
Nuclear division index 1.94 ± 0.210 2.04 ± 0.19 0.095
Folate 6.54 ± 2.22 6.07 ± 2.22 0.545
Lead (µg/dL)
52.30 ± 19.99 61.51 ± 30.24 0.573
Hemoglobin
13.24 ± 1.50 13.83 ± 1.42 0.366
a
reference value according Beckman Instruments- Vitamin B12-1998.
56
Table 8. Mean vitamin B12 levels for the control (371.70 pg/mL) and Pb-exposed
(370.33 pg/mL) groups in relation to parameters analyzed.
GROUPS/PARAMETERS B12
a
P
Control < 371.70 pg/mL ≥371.70 pg /mL
Number of subjects 32 21
Age (Years)
32.37 ± 11.55 34.14 ± 12.09 0.439
Damage frequency 1.73 ± 1.80 1.78 ± 1.88 0.963
Damage Index 2.65 ± 2.81 2.42 ± 2.64 0.653
Micronuclei
4.53 ± 2.24 4.52 ± 1.86 0.898
Nucleoplasmic bridges
0.81 ± 0.93 1.00 ± 1.14 0.646
Buds 1.87 ± 1.68 1.38 ± 1.28 0.301
Apoptosis 2.29 ± 0.23 2.24 ± 0.20 0.349
Necrosis 0.31 ± 0.64 0.52 ± 0.81 0.376
Nuclear division index 0 ± 00 0 ± 00 1.000
Folate 6.35 ± 2.52 6.36 ± 2.55 0.942
Lead (µg/dL)
2.43 ± 0.70 2.45 ± 1.63 0.090
Hemoglobin
14.44 ± 1.02 14.62 ± 1.04 0.382
Exposed
<370.33pg /mL
≥370.33pg /mL
Numbers of subjects 29 24
Age (Years) 36.89 ±11.79 34.91 ± 8.88 0.661
Time of work (years) 12.73 ± 12.46 6.26 ± 8.01 0.029
Damage frequency 14.58 ± 17.56 13.54 ± 14.77 0.950
Damage Index 20.10 ± 23.71 23.62 ± 32.59 0.754
Micronuclei 14.31 ± 8.94 13.50 ± 8.01 0.760
Nucleoplasmic bridges 1.34 ± 0.39 1.58 ± 1.21 0.625
Buds 3.34 ± 2.33 2.70 ± 2.09 0.328
Apoptosis 2.38 ± 1.88 2.12 ± 1.70 0.610
Necrosis 2.14 ± 2.17 1.50 ±1.47 0.289
Nuclear division index 1.99 ± 0.18 2.06 ± 0.22 0.155
Folate 6.24 ± 2.29 6.09 ± 2.15 0.950
Lead (µg/dL)
56.23 ± 31.40 63.29 ± 24.23 0.122
Hemoglobin
13.88 ± 1.56 13.47 ± 1.28 0.192
a
mean values for the individuals from this study
57
Table 9. Mean folate and vitamin B12 levels for the Pb-exposed group in relation
to parameters analyzed (mean values
a
).
Folate <6.35 ng/mL Folate ≥6.35 ng/mL
PARAMETERS
B12 <371.69
pg/mL
B12 ≥371.69
pg/mL
B12 <371.69
pg/mL
B12 ≥371.69
pg/mL
Number of subjects 15 15 14 9
Age (Years) 33.33 ± 11.25 33.80 ± 8.02 40.71 ± 11.52 36.77 ± 10.39
Time of work 11.01 ± 12.58 5.99 ± 7.59 14.56 ± 12.52 6.70 ± 9.14
Damage frequency
14.43 ± 19.90 16.23 ± 18.17 14.75 ± 15.40 9.05 ± 3.67
Damage Index
19.66 ± 26.76 30.40 ± 39.93 20.57 ± 20.95 12.33 ± 5.93
Micronuclei
10.80 ± 4.04 14.40 ± 9.62 18.07 ± 11.19 12.00 ± 4.30
Nucleoplasmic bridges
1.20 ± 1.08 1.26 ± 1.16 1.50 ± 0.65 2.11 ± 1.17
Buds
3.26 ± 2.43 2.66 ± 1.95 3.42 ± 2.31 2.77 ± 2.43
Apoptosis
2.46 ± 1.81 2.20 ± 1.74 2.28 ± 2.01 2.00 ± 1.73
Necrosis
2.40 ± 2.23 1.53 ± 1.60 1.85 ± 2.03 1.44 ± 1.33
Nuclear division index
1.96 ± 0.22 2.01 ± 0.26 2.03 ± 0.13 2.12 ± 0.10
Lead (µg/dL)
53.28 ± 30.74 63.99 ± 25.81 59.40 ± 32.94 62.13 ± 22.80
Hemoglobin
14.10 ± 1.49 13.68 ±1.50 13.64 ± 1.66 13.13 ± 0.76
a
mean values for the individuals from this study
58
DISCUSSION
The results of the present study demonstrate that the group of workers
exposed to Pb presents levels of the metal in blood (59.43 ± 28.34 µg/dL) that
significantly exceed those of the control group (2.44 ± 1.15 µg/dL). When the
values detected in the present study are compared to the limits defined in Brazilian
legislation NR7-MT 1988 [35] and that were recently corroborated in Resolution
24/1994, which defines reference values for adults of up to 40.0 µg/dL and
maximum biological level permitted in Brazil (IBMP) of 60 µg/dL, we observed that
11 workers (20.8%) lie in the reference interval, that 19 (35.8%) are above the
reference value and below IBMP, and that 23 workers (43.4%) present levels that
are above IBMP. The Brazilian regulation adopts values that are determined by
the American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGHI), in the
USA, though these values were established in 1972. Currently, the agency
recommends that the biological exposure index be up to 30 µg/dL, as measured in
Pb levels in blood [36].
In turn, the Occupational Safety and Health Administration (OSHA) [37]
defines lead exposure classification criteria and the respective measures to be
taken as: (I) for exposure levels under 10 µg/dL the worker has to be informed
there of, (II) for levels between 10 and 24 µg/dL an investigation has to be
conducted to minimize exposure, (III) for values between 25 and 49 µg/dL the
worker has to be removed from the activity and symptoms have to be investigated,
(IV) for values between 50 and 79 µg/dL the worker has to be removed from the
activity and a careful clinical examination conducted side by side with an
investigation to establish the need for treatment, and (V) values above 80 µg/dL
determine toxicity and define considerable potential for medical treatment. If such
criteria were adopted in the situation observed in the present study, then 96.2% of
the workers examined would have to be removed from their activities and receive
some form of medical care.
Studies conducted by Cordeiro et al. [38,39] in Pb-exposed workers though
with measured levels of the metal within the limits specified in the Brazilian law,
revealed signs of impairment in memory, mood, fine motor skills and in the radial
59
nerve. These and other studies, also conducted by Cordeiro et al., indicate the
need for a lowering in thresholds defined in Brazil, down to 32 µg/dL [40].
Yet another form of damage that Pb may cause in the human organism is of
hematological nature. In the present study, such damage was evaluated through a
hemogram, which measured hemoglobin levels in comparison to reference values
for adult males (13.0 – 17.0 g/dL [24]). Anemia is one of
the problems most
commonly studied, and hemoglobin level is the indicator most often used to reveal
toxicity by Pb [1,2]. We found statistically significant difference between
hemoglobin levels for the control and the Pb-exposed groups. Other authors also
have demonstrated the association between the increase in plasmatic Pb levels
and reduction of hemoglobin levels [41, 42]. In addition there was a negative
correlation between levels of lead and hemoglobin.
Genomic instability, in the present study, was analyzed using the temporary
peripheral blood lymphocyte blocked by cytocalasine B and the comet assay. The
comet assay revealed a statistically significant increase in DNA damage frequency
and in DNA damage index for Pb-exposed individuals. The micronucleus test
revealed statistical significance in higher micronuclei frequency in Pb-exposed
individuals, higher frequency of nuclear buds, higher occurrence of
nucleoplasmatic bridges, of apoptosis and of necrosis, but statistically lower
values for nuclear division index, which indicates that Pb displays potential to
inhibit cell division. These data indicate the capacity Pb has to cause chromosome
damage, as assessed in the micronucleus test, and DNA damage as measured in
the comet assay. This is in accordance with the findings of previous studies that
demonstrated association between lead and micronucleated cells [12, 19, 20] and
DNA damage (comet assay) [18, 43]. Moreover, it is important to say that in the
literature most of the damage is associated to classes 1 and 2. Double strand
breaks are in general associated with class 4 [45]. Thus, our results are in
accordance with those obtained by other authors, who associated metal exposure
to single strand breaks [44,45].
Still, other studies demonstrate an increase in micronuclei frequency in
smokers. Piperakis et al. [49] observed an increase in DNA damage in young and
elderly smokers, though in the present study we did not record statistically
60
significant differences between smokers and non-smokers in micronuclei,
nucleoplasmatic bridges and nuclear buds frequencies, nor in nuclear division
index or in DNA damage using the comet assay. Bonassi et al. [47] studied 5,710
individuals and observed that only the individuals that smoked more than 30
cigarettes a day exhibited a significant increase in genotoxic damage as measured
using the lymphocyte micronuclei test. In the present study, the number of
cigarettes smoked was under 30, which may explain the lack of correlation.
Apart from smoking, several factors may cause an increase in chromosome
damage, among which gender and age. As regard gender, all individuals
investigated in the present study were males. Concerning age, a trend towards
higher numbers of damage events to genetic material has been demonstrated to
affect older individuals, in several studies [48,49,50,51]. Similar to these studies,
positive correlations were observed between age and cytogenetic damages (DNA
damage by comet assay and micronuclei and bridge by micronucleus test).
The specialized literature also lists a considerable number of studies
designed to investigate the influence of micronutrients (such as folate and vitamin
B12) on genomic stability. Vaglenov et al. [12] verified that supplementation with
polyvitamin complexes brought about an expressive decrease in micronuclei
frequency in Pb-exposed workers. Other studies correlated folate and vitamin B12
levels to chromosomal instability. Fenech et al. [52, 53] assessed this instability in
the micronucleus test applies in a population of elderly (50 to 70 years of age) and
of young (18 to 32 years of age) individuals and reported significant negative
correlation between vitamin B12 levels, homocysteine levels and micronuclei
frequency. As for the group of elderly subjects with low levels of the
micronutrients, significant difference was observed between folate and vitamin
B12 and micronuclei frequency. In another study, Fenech [21] reports negative
correlation between micronuclei in lymphocytes and vitamin B12 levels, while
positive correlation was seen with homocysteine in plasma, when folic acid and
vitamin B12 were administered at doses that were 3.5 times the recommended
dietary intake (RDI). The same study also revealed a reduction in the parameters
measured when vitamin B12 levels are above 300 pmol/L (406 pg/mL).
Conversely, studies like the one conducted by Zetterberg et al. [54] did not
61
reveal any difference in chromosomal instability in individuals who did not suffer
from low folate levels, when examining groups of individuals who were given
nutritional supplements or not. In addition, the study of Johansson et al. [55]
did
not provide strong support for an
association between cancer risk and circulating
concentrations
of folate or vitamin B12.
Our data show that neither in the control nor in the Pb-exposed groups was
any significant correlation observed between folate or vitamin B12 levels and the
parameters analyzed, except positive correlation between folate levels and age
(P=0.020), and folate and micronuclei (P<0.001). We also found correlation
between vitamin B12 and nuclear division index (P=0.047), which tallies with other
findings reported in the literature [52, 53, 56, 57].
When the different parameters are compared for folate and vitamin B12 in
subgroups to reference values and the means in the present study, no statistically
significant differences were observed in damage to genetic material, except for the
micronuclei which was high in exposed
individuals with folate values above the
mean (≥6.17 mg/mL) and number of nuclear bridges, which was also high in
individuals exposed to Pb and with vitamin B12 above the reference value (≥250
pmol/L). These results were unexpected, since a large part of the studies
conducted on the subject indicates that the deficiency in micronutrients would be
associated to the increase in lesions in genetic material [52, 53, 56, 57].
When mean values for folate and vitamin B12 are interpreted in terms of
genetic damage, no statistically significant difference was observed between the
groups. Yet, the group of workers with folate and vitamin B12 levels above the
mean presented less DNA lesions as assessed by the comet assay.
Supplementation with folate in different foodstuffs has been intensively discussed
by food toxicologists and also by administrative agencies. The results reported by
Abramsson-Zetterberg et al. [58] show a positive correlation between a high folate
status and high chromosome stability. Although no investigations of folate and
vitamin B12 supplementation were related [59].
The data obtained in the present study afford to conclude that individuals
occupationally exposed to Pb present plumbism levels that are about 24 times that
of non-exposed individuals. It is also possible to say that Pb causes an increase in
62
chromosomal damage as measured by the micronucleus test (frequency of
micronuclei, nucleoplasmatic bridges, nuclear buds, necrosis and apoptosis), as
well as a decrease in the nuclear division index. Also, DNA damage measured by
the comet assay and anemia assessed by hemoglobin dosage were high. The
results show that folate and vitamin B12 levels, when within the reference values
specified (folate: 3 – 15 ng/mL; vitamin B12: 250 – 1100 pg/mL), did not influence
chromosomal damage as assessed by the comet and micronucleus assays in
workers exposed to Pb and in the control group. Further studies with populations
suffering from deficiencies in these micronutrients or with supplementations are
important to verify the actual role they play in genomic stability or toxic thresholds.
63
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6. DISCUSSÃO
Com base nos resultados controversos da literatura a respeito da
genotoxicidade do chumbo e da influência de micronutrientes nos danos
cromossômicos, este estudo foi realizado com trabalhadores da região
metropolitana de Porto Alegre (RS) expostos ocupacionalmente a este metal.
Na presente investigação a média dos valores de chumbo sanguíneo,
encontrados no grupo controle (não exposto ao chumbo), foi de 2,44 ±1,15 µg/dL.
Estes valores estão dentro dos padrões de referência estabelecidos pela
legislação brasileira para indivíduos não expostos, que é de até 20 µg/dL. Estão
também de acordo com os achados anteriores de Minozzo et al. (2004), realizado
com trabalhadores da mesma região de Porto Alegre, que apresentaram em
média 1,95 µg/dL (Anexo V). Outros estudos, realizados em diferentes países,
mostram valores variando entre 2,0 µg/dL e 17,2 µg/dL (Paoliello et al., 2001;
Danadevi et al., 2003; Palus et al., 2003; Zhijian et al., 2006; Yánez et al., 2008).
Esta variação se deve ao fato que alguns destes resultados foram obtidos em
períodos e locais que eram permitido o uso de chumbo na gasolina como
antidetonante.
Já em relação aos valores de chumbo no sangue dos trabalhadores
incluídos no grupo de expostos, os resultados evidenciam valores muito elevados
(59,43 ± 28,34 µg/dL) significativamente maiores do que o encontrado no grupo
controle (2,44 ±1,15 µg/dL). Comparando-se estes valores com a atual legislação
Brasileira (NR7 - Ministério do Trabalho, 1988; mantida pela Portaria nº
24/1994,
que preconiza os valores de referência para adultos expostos de até 40,0 µg/dL e
o IBMP - Índice Biológico Máximo Permitido - de 60 µg/dL) foram encontrados 11
trabalhadores (20,8%) com níveis de chumbo inferiores ao de referência, 19
(35,8%) acima dos valores de referência, mas abaixo do IBMP, e 23 (43,4%)
acima do IBMP (e dos valores de referência). A legislação Brasileira utiliza índices
fixados em 1972 pela American Conference of Governmental Industrial Hygienists
(ACGIH) nos Estados Unidos. Atualmente, este órgão recomenda como índice
70
biológico de exposição valores de até 30 µg/dL para chumbo sangüíneo (Moreira
& Moreira, 2004-a). A OSHA (Occupational Safety and Health Administration,
2008) preconiza a classificação dos trabalhadores expostos ao chumbo e as
respectivas providências que devem ser tomadas da seguinte forma: (I) exposição
inferior a 10 µg/dL, o trabalhador deve ser informado; (II) valores entre 10 a 24
µg/dL, necessitam ser tomadas providências para minimizar a exposição; (III)
valores entre 25 a 49 µg/dL deve ocorrer o afastamento do trabalhador, evitando
futuras exposições, assim como a sintomatologia clínica ; (IV) valores entre 50 a
79 µg/dL, o afastamento da exposição, avaliação clínica criteriosa, verificação da
necessidade de tratamento e, finalmente, (V) quando os valores são superiores a
80 µg/dL, considera-se intoxicação, com grande possibilidade de tratamento
medicamentoso. Utilizando-se estes parâmetros, 96,2% dos trabalhadores
estudados deveriam ser afastados da exposição e receber algum tipo de
atendimento médico.
Os valores de plumbemia encontrados no presente estudo são alarmantes
e podem ser considerados como um problema de saúde pública, já que podem
desencadear uma série de doenças como: anemia, devido a transtornos
enzimáticos; anemia sideroblástica secundária a toxinas; hipotireoidismo,
polinueropatias; encefalopatia tóxica aguda; encefalopatia tóxica crônica;
hipertenção arterial; arritmias cardíacas; cólica do chumbo; gota; nefropatia
túbulo-intersticial; insuficiência renal crônica; e infertilidade masculina (Ministério
da Saúde, 2006). Comparado ao trabalho de Minozzo et al. (2004) com
trabalhadores da mesma região, os valores atuais são cerca de 1,7 vezes
maiores, demonstrando que a exposição ao chumbo está se agravando. Níveis
similarmente elevados de chumbo sanguíneo já foram descritos por Zhijian et al.
(2006) para trabalhadores chineses (32,0 µg/dL); por Danadevi et al. (2003) para
indianos (24,83 µg/dL); por Palus (2003) na Polônia (50,4 µg/dL); e por Yánez et
al. (2008) na Venezuela (70,86 µg/dL).
Estudos realizados por Cordeiro et al. (1996-a; 1996-b) com trabalhadores
expostos ao chumbo, mas com níveis dentro dos limites legais brasileiros,
comparados com pessoas não expostas, mostraram sinais de comprometimento
da memória, humor, coordenação fina e sinais de comprometimento dos nervos
71
radiais. Estas observações associadas a outras obtidas por Cordeiro et al. (1996-
c) indicam a necessidade de redução dos limites legais no Brasil para pelo menos
32 µg/dL.
Comparando os valores de hemoglobina deste estudo com os valores
referenciais para homens adultos (13,0 a 17,0 g/dl), verificou-se que no grupo de
expostos 18 trabalhadores aprensentavam anemia (4%). Observou-se também
que existe uma diferença estatisticamente significante quando comparado o grupo
exposto (13,74 ± 1,42g/dL) com o grupo controle (14,51 ± 1,02g/dL). Estes dados
comprovam a ação do chumbo na indução da anemia e diferentes autores têm
demonstrado associação entre aumento no nível plasmático de chumbo e anemia
(Chuang et al., 1999; Moreira & Moreira, 2004-b). A indução de anemia é uma das
ações mais importantes na exposição ao chumbo, e ela ocorre de forma aguda
(pela destruição dos eritrócitos) e de forma crônica (pela inibição da síntese do
heme) (Robbins et al., 2001; Henretig, 2002).
A instabilidade genômica dos indivíduos expostos ao chumbo e controles
deste estudo foi avaliada pelo teste de cultura de linfócitos temporária de sangue
periférico, bloqueado pela citocalasina -B e pela técnica do cometa. Em relação
ao Ensaio Cometa, foi encontrado aumento estatisticamente significante em
relação à freqüência de dano e índice de dano no DNA nos indivíduos expostos
ao chumbo. No Teste de Micronúcleos foram encontrados
dados estatisticamente
significantes em relação ao grupo exposto quando comparado ao controle, no que
se refere às freqüências de micronúcleos, brotos nucleares, pontes
nucleoplasmáticas, apoptose e necrose. Também se observou para o grupo dos
expostos valores estatisticamente menores relacionados ao IDN (índice de divisão
nuclear) em relação ao não exposto, o que indica que o chumbo possui a
capacidade de inibição da divisão nuclear. Estes dados indicam a capacidade do
chumbo de induzir danos no DNA e nos cromossomos. Alterações na freqüência
de micronúcleos e no índice de divisão nuclear estão de acordo com estudos
anteriores realizados por Minozzo et al. (2004), e outros autores como Vaglenov
et al. (1998), Palus et al. (2003), Danadevi et al. (2003), e Zhijian et al. (2006), que
em estudo com trabalhadores expostos ao chumbo demonstraram aumento de
danos citogenéticos.
72
Lesões induzidas por metais, em geral, são associadas a danos de fita
simples, sendo mais facilmente reparadas do que outros tipos de danos. Neste
estudo foi verificada, através do Ensaio Cometa, a indução de lesões
principalmente de Classes 1 e 2, que, de acordo com os dados da literatura, são
basicamente relacionadas a quebras de cadeia simples de DNA. Estes resultados
concordam com os achados de autores, quando avaliaram as respostas do teste
Cometa em organismos expostos ao chumbo (Hengstler et al., 2002; Villela et al.,
2007). Como foi observado um aumento significativo de micronúcleos, pode-se
sugerir que este aumento se deva a uma relação com falhas do mecanismo de
reparo.
Quanto aos diferentes hábitos, estudos realizados demonstram um
aumento da freqüência de micronúcleos em fumantes. Piperakis et al. (1998)
observaram aumento de danos no DNA em fumantes jovens e velhos. Em nosso
estudo não foi verificada associação entre freqüência de micronúcleos, pontes
nucleoplasmáticas, brotos nucleares, IDN, freqüência de dano no DNA e dano no
DNA com o hábito de fumar. Estes achados estão de acordo com estudos
realizados por Bonassi et al. (2003), num estudo com 5710 indivíduos, onde
verificaram que os danos genotóxicos eram significativos somente quando os
indivíduos fumavam em média mais de 30 cigarros por dia em média. Nos grupos
deste estudo que eram fumantes, a média de cigarros por dia era inferior a este
número de cigarros.
Vários fatores podem causar aumento na incidência de danos
cromossômicos. Além do hábito de fumar, pode-se citar gênero e idade. No item
gênero todos os indivíduos que foram objeto deste estudo, são do sexo
masculino. Quanto à idade, vários trabalhos publicados evidenciam que há uma
tendência de aumento nas frequências de danos com o aumento da idade
(Fenech & Morley, 1985; Ganguly, 1993; Koteles et al., 1993; Maluf, 2004). Similar
a estes estudos encontrou-se correlação entre idade e aumento de danos pelos
diferentes parâmetros citogenéticos (Ensaio Cometa e Teste de Micronúcleos).
Apesar disto não se encontrou relação entre tempo de exposição e com aumento
nos níveis de chumbo. Esta observação se deve, provavelmente, ao fato de que
os níveis de chumbo no sangue não refletem a real exposição dos trabalhadores
73
a longos períodos (Palus et al., 2003; Minozzo et al., 2004; Zhijian et al., 2006), ou
ainda pode estar associada ao tamanho amostral.
Em relação aos micronutrientes, o valor médio de folato encontrado foi de
6,35 ng/mL no grupo controle e de 6,18 ng/mL no grupo exposto, e de vitamina
B12 no grupo controle de 371,69 pg/mL e no exposto de 370,34 pg/mL. Estes
valores não são diferentes entre os grupos.
Muitas vezes existem grandes variações quando se comparam diferentes
regiões de um mesmo país, ou de diferentes países. Vários estudos foram
realizados para verificar a influência de micronutrientes (folato e vitamina B12)
sobre a estabilidade genômica. Vaglenov et al. (1998) verificaram que a
suplementação com complexo polivitamínico reduziu drasticamente a freqüência
de micronúcleos em trabalhadores expostos ao chumbo. Outros estudos
relacionam deficiência de folato e vitamina B12 com a instabilidade
cromossômica. Fenech et al. (1997; 1998) avaliaram esta instabilidade através de
teste de micronúcleos em idosos (50 a 70 anos) e adultos jovens (18 a 32 anos) e
observaram uma correlação negativa e significante entre concentração de
vitamina B12, níveis
de homocisteina e freqüência de micronúcleos. Entre os
idosos deficientes nestas vitaminas, foi encontrada uma diferença significante
entre folato e vitamina B12 e o número de micronúcleos. Fenech (1999) relata
correlação negativa entre micronúcleos em linfócitos e a concentração de
vitamina B12, e correlação positiva com a homocisteina no plasma, em indivíduos
submetidos a uma dieta 3,5 vezes maior do que a DRI (recommended dietary
intake). Constatou ainda que esta redução é observada apenas quando os níveis
plasmáticos de vitamina B12 estão acima de 300 pmol/L (406 pg/mL). Fenech
(2001) também observou que seria necessário elevar a DRI de folato dos atuais
400 µg/dia para 700 µg/dia e de vitamina B12 dos atuais 2,4 µg/dia para 7 µg/dia
para que haja proteção contra a instabilidade genômica. Estudos realizados por
Mezzomo et al. (2008) demostraram que o folato e a vitamina B12 diminuem a
freqüência de micronúcleos em camundongos tratados com os agentes
alquilantes metilmetanosulfonato e cisplatina, submetidos a uma dieta
suplementada com valores 15 e 30 vezes maiores destes micronutrientes. Apesar
disto, estudo como o de Zetterberg et al. (2006) não encontrou diferença na
74
instabilidade cromossômica em indivíduos sem deficiência de folato, e em grupos
com ou sem suplementação.
No entanto, as concentrações e a reavaliação dos níveis de micronutrientes
recomendados nas dietas, com vista à estabilidade genômica, devem ser
interpretadas com cuidado. De fato os dados da literatura indicam que a
suplementação com folato e vitamina B12 diminui os danos cromossômicos, ao
mesmo tempo em que evidenciam a sua ação potencializadora sobre tumores
intestinais (pólipos no íleo) em ratos, dependendo do momento da administração
(Song et al., 2000). Kim (2004) observou que, em gestantes, a suplementação
com ácido fólico tem ação preventiva no que se refere a defeitos do tubo neural
no feto. No entanto, quando esta suplementação é feita em outras
subpopulações, não carentes deste micronutriente, pode atuar nas etapas de
iniciação e progressão de lesões malignas. Smith et al. (2007; 2008) também
consideram que a fortificação indiscriminada de folato pode beneficiar apenas
alguns grupos específicos como gestantes, na prevenção de defeitos no tubo
neural nos neonatos, ou subpopulações carentes. No entanto, em animais, a
dieta rica em folato, pode interferir na metilação das histonas, o que leva a
mudanças fenotípicas. A combinação de altos níveis de folato e baixos níveis de
vitamina B12 pode estar associada a um aumento de danos cognitivos e anemia
em idosos. Já em mulheres grávidas pode levar à resistência à insulina. Embora o
ácido fólico seja considerado não tóxico, é importante que seu potencial como
promotor do câncer seja considerado nos biomonitoramentos populacionais
(Smith et al. 2007; 2008).
Nossos dados mostram que, tanto no grupo controle como no exposto ao
chumbo, não há correlação significativa do folato ou vitamina B12 com os
parâmetros analisados, exceto correlação positiva entre folato e idade, e folato e
micronúcleos. Encontou-se ainda correlação entre vitamina B12 e IDN, tempo de
trabalho e idade demonstrando a correlação entre idade, níveis maiores de folato
no sangue, e tempo de exposição ao chumbo com maior incidência de danos
tanto no DNA como nos cromossomos (micronúcleo, cometa). Tais resultados
estão de acordo com outros achados da literatura (Fenech et al., 1997; Fenech et
al., 1998; Fenech, 2001; Lindberg et al., 2007).
75
No grupo de expostos, comparando-se os diferentes parâmetros por
subgrupos de folato e vitamina B12 em relação aos valores médios deste estudo
(folato de 6,35 ng/mL e vitamina B12 de 371,69 pg/mL) não se verificou
diferenças estatisticamente significativas em nenhum parâmetro estudado.
Avaliando ainda os dois grupos com valores acima e abaixo de 406 pg/mL (300
pmol/L), conforme sugere Fenech (2001), também não se encontrou nenhuma
diferença significante (dados não demonstrados). Estes resultados foram
diferentes daqueles esperados, visto que grande parte dos estudos demonstra
que a deficiência de micronutrientes teria relação com o aumento de lesões ao
material genético (Fenech et al., 1997; Fenech et al., 1998; Fenech, 2001;
Lindberg et al., 2007). Apesar disto, pode-se verificar no grupo dos trabalhadores
expostos, que ocorre um aumento de alguns tipos de lesão, tais como dano no
DNA, avaliados pelo ensaio cometa e, pontes nucleoplasmáticas e células
necróticas, avaliadas pelo teste do micronúcleo.
Quando se associam os resultados referentes aos valores médios dos
indivíduos quanto à folato e B12 em relação aos danos cromossômicos, avaliados
pelo ensaio cometa e teste do micronúcleo, não se verifica diferença entre os
grupos. Apesar disto, pode-se observar que os grupos que apresentaram folato e
B12 acima da média são aqueles que apresentaram menores valores de lesão ao
DNA avaliados pelo Ensaio Cometa, além de menor valor de células necróticas
(Teste de Micronúcleo).
Pelos dados encontrados neste estudo, pode-se concluir que os indivíduos
expostos ocupacionalmente ao chumbo apresentam valores de plumbemia em
torno de 20 vezes superiores aos do grupo controle. Os resultados deste estudo
também indicam que o chumbo causa um aumento nos danos cromossômicos
medidos pelo teste do Micronúcleo (freqüência de micronúcleos, pontes
nucleoplasmáticas, brotos nucleares, necrose e apoptose) e diminuição no índice
de divisão nuclear (IDN), além de aumento de lesões no DNA, medidos pelo
Ensaio Cometa. O chumbo pode ainda causar toxicidade hematológica,
principalmente a indução de anemia (avaliada através da dosagem de
hemoglobina no sangue). Verificou-se ainda que, no grupo de expostos ao
chumbo, quanto mais idade tinham os indivíduos, mais folato no sangue e tempo
76
de exposição ao metal, maior o índice de danos cromossômicos (freqüência de
micronúcleos, medidos pelo teste do micronúcleo e danos ao DNA, medidos pelo
ensaio Cometa). De onde se pode concluir que o Folato e a Vitamina B12, dentro
dos valores referências (folato entre 3 a 15 ug/mL e vitamina B12 entre 250 a
1100 pg/ml), não diminuem os danos cromossômicos e que estes danos
provavelmente sejam provocados pela exposição ocupacional ao chumbo.
Os resultados encontrados na literatura são contraditórios. Enquanto
alguns autores demostram que os níveis deficientes de folato e vitamina B12
causam um aumento de danos cromossômicos e que a suplementação destes
micronutrientes minimiza estes danos, outros estudos indicam que o excesso de
folato pode causar uma série de danos à saúde. Novos estudos demonstraram
uma não influência dos níveis de folato e B12 nos resultados, provavelmente por
estarem dentro dos valores considerados normais para a população. Assim,
outros estudos deverão ser elaborados para definir a real necessidade de
suplementação destes micronutrientes na estabilidade genômica e o limiar tóxico
dos mesmos.
7. CONCLUSÕES
- Através deste estudo realizado com indivíduos expostos
ocupacionalmente ao chumbo, cujo objetivo principal proposto foi o de avaliar a
genotoxicidade causada pelo chumbo e a existência ou não de inter-relação com
os níveis de micronutrientes (folato e vitamina B12), foi verificado que:
- plumbemia 24 vezes maior nos trabalhadores expostos ao chumbo em
relação ao grupo controle. Verificou-se também que 79,2% dos
trabalhadores expostos estão acima dos valores de referência, sendo
que 43,4% estão acima do Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP).
Valores baseados na legislação Brasileira;
- Ocorreu anemia significantemente maior nos trabalhadores expostos ao
chumbo;
- Os indivíduos deste estudo apresentavam níveis normais de
micronutrientes (folato e vitamina B12) em relação aos valores
referenciais;
- A exposição ao chumbo induz efeitos genotóxicos e mutagênicos como
avaliados pelo teste de micronúcleos (frequência de micronucleos,
frequência de pontes nucleopalsmaticas, frequência de brotos, IDN,
necrose e apoptose) e pelo ensaio cometa (frequênca de dano no DNA
e índice de dano no DNA);
- Não existe relação das respostas de danos genéticos individuais dos
trabalhadores à sua condição micronutricional de folato e vitamina B12.
78
8. PERSPECTIVAS
Para se obter mais informações sobre os danos causados pelo chumbo e sua
relação com os micronutrientes, seria de grande importância:
• Avaliar os efeitos do chumbo em um grupo maior de trabalhadores
oriundos de diferentes setores industriais;
• Determinar o efeito da exposição ao chumbo em grupos que recebam
suplementação e em grupos com deficiência destes micronutrientes;
• Verificar o possível papel protetor do folato e da vitamina B12 na
minimização dos efeitos do chumbo;
• Produzir uma cartilha contendo informações básicas sobre os
problemas da exposição ao chumbo para distribuição às empresas
potencialmente expostas;
• Definir através de novos estudos, os valores ideais de folato e vitamina
B12, na redução de danos cromossômicos sem, contudo causar outros
tipos de danos à saúde;
• Sugerir que a legislação seja adequada para que as indústrias
fabricantes de baterias automotivas sejam responsáveis pela recompra
das baterias usadas, e que as mesmas após o uso sejam consideradas
como produto tóxico e recicladas por empresas especializadas.
• Avaliar os efeitos do chumbo em um grupo maior de trabalhadores
oriundos de diferentes setores industriais;
79
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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p.219-226, 2006.
ANEXOS
ANEXO I
Declaração do Pesquisador Responsável
(Resol. 10-196/96, CNS/MS, Cap. VI.2)
Eu, Renato Minozzo, pesquisador responsável pela pesquisa intitulada
“Importância dos níveis de micronutrientes na determinação de danos genotóxicos
em indivíduos expostos ocupacionalmente ao chumbo”, declaro que conheço as
normas vigentes expressas na Resolução 10/196 de outubro de 1996, e na
Resolução 251/97 de agosto de 1997, do Conselho Nacional de Saúde /
Ministério da Saúde, que regulamenta a pesquisa, e suas complementares, e
assumo, neste termo, o compromisso de destinar os dados coletados à
publicação em revista científica de grande circulação (ou congressos, eventos,
etc.) tão logo esta seja concluída e/ou interrompida e seus dados analisados. Pelo
que assino o presente Termo em 2 (duas) vias de igual teor e forma.
Canoas, 30 Dezembro de 2005.
----------------------- ----------------------
Pesquisador Responsável
ANEXO II
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
I – Importância dos níveis de micronutrientes na determinação de
danos genotóxicos em indivíduos expostos ocupacionalmente ao
chumbo.
Nome do paciente: _________________________________________
Idade:_____
II – Justificativas-Objetivos:
A pesquisa tem por objetivo o biomonitoramento de trabalhadores, ou
seja, verificar através de testes laboratoriais os níveis de chumbo, micronutrientes
(folato,B12e vit C) Cometa e micronúcleos em linfócitos , no sangue de
trabalhadores de fábricas ou empresas recicladoras de baterias automotivas.
III - Para os testes serão colhidas 01 (uma) amostra de sangue ( 20
ml) para realização da dosagem de chumbo,vitamina B12,
Folato,vitamina C,teste cometa e teste de micronúcleos.
IV - Fica garantido ao paciente:
a) Direito de anonimato e privacidade;
b) Não será injetado nenhum tipo de medicamento;
c) Serão utilizadas seringas e agulhas descartáveis;
d) A coleta de sangue será feita por profissional qualificado, no local
de trabalho, sem nenhuma despesa;
e) O paciente terá acesso aos resultados dos testes, se assim o
desejar;
f) O paciente poderá sair da pesquisa a qualquer momento, se assim
o desejar.
V - “Acredito ter sido informado suficientemente a respeito das
informações que li ou que foram lidas por mim, descrevendo o
estudo.
Eu discuti com o Pesquisador Renato Minozzo sobre a
minha decisão em participar. Ficaram claros para mim quais são os
propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus
desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de
esclarecimento permanentes.
Ficou claro também que a minha participação é isenta de
despesas. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e
poderei retirar o meu consentimento a qualquer hora, antes ou
durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer
benefício que eu possa ter adquirido. A minha assinatura neste
Consentimento Livre e Esclarecido dará autorização ao patrocinador
do estudo, ao Comitê de Ética da ULBRA, e a organização
governamental de saúde de utilizarem os dados obtidos quando se
fizer necessário, incluindo a divulgação dos mesmos, sempre
preservando minha privacidade.
Canoas, ____, ________________, ________.
Assinatura do paciente: _____________________________________
Assinatura do pesquisador responsável: _______________________
Nome do pesquisador Orientador: Renato Santos-Mello
Pesquisador Doutorando: Renato Minozzo - CRBM 1-4006
_________________________________________________________
Assinatura da testemunha Nome completo
ANEXO III
Questionário de Saúde Pessoal
(questionário foi elaborado levando-se em consideração o modelo recomendado
por: International Commission for Protection against Environmental Mutagens and
Carcinogens (ICPEMC) Mutation Research, 204:379-406, (1988)
Data da Coleta ........./......../......... Código .............
Nome ..........................................................................................................................
Estado Civil............... Idade........................ Sexo....................
Atividade atual...............................................................................
.....................................................................................................
Tempo(Anos)...................................
Atividades anteriores......................................................................
............................................ Tempo(Anos)...................................
Uso Equipamento de Proteção Individual.........................................
Fumante...... Cigarros/dia...............................................................
Uso de Bebida alcoólica..............................Tipo/quantidade/dia.......
Uso de medicamentos/drogas................................Qual...................
Freqüência.....................................................................................
Condições de saúde atual...............................................................
Uso de radiações ionizantes (diagnóstico e/ou Terapêutica)
Doença familiar..............................................................................
Últimas internações..................................Motivo.............................
Hábitos alimentares.............................................Freqüência..........
Observações..................................................................................
Assinatura
ANEXO IV
Aprovação comitê de ética
ANEXO V
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
