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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
TOXICOLOGIA APLICADA
AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE E ESTRESSE
OXIDATIVO EM AGRICULTORES QUE TRABALHAM NA
FUMICULTURA
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Genética e Toxicologia
Aplicada
JODÉL ALVES
Orientador: Prof. Dr. João Antônio Pêgas Henriques
Co-orientadora: Profa. Dra. Juliana da Silva
CANOAS
2008
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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E TOXICOLOGIA
APLICADA
AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE E ESTRESSE
OXIDATIVO EM AGRICULTORES QUE TRABALHAM NA
FUMICULTURA
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Genética e Toxicologia
Aplicada
JODEL DA SILVA ALVES
Orientador: Prof. Dr. JOÃO ANTONIO PEGAS HENRIQUES
Co-orientadora: Profa. Dra. JULIANA DA SILVA
CANOAS
2008
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Este trabalho foi realizado nas instalações do Laboratório de
Genética Toxicológica da Central de Laboratórios da
Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), sendo financiado
pelo Programa de Mestrado em Genética e Toxicologia Aplicada
e pelos Autores.
4
Para Luciane e Leonardo.
5
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador João Antônio Pegas Henriques, pela amizade, confiança e pelos
ensinamentos que me foram passados durante o desenvolvimento do mestrado;
A minha co-orientadora Juliana da Silva pela amizade, pela atenção, pelos
ensinamentos, estímulo e compreensão;
A Fernanda Rabaioli da Silva, pela amizade, companheirismo e auxílio inestimável
nas atividades de coleta e laboratório;
A todos aqueles que, de uma forma ou de outra, tornaram possível a realização
deste trabalho.
6
SUMÁRIO
RESUMO ------------------------------------------------------------------------------------------------ 7
ABSTRACT --------------------------------------------------------------------------------------------- 8
I INTRODUÇÃO--------------------------------------------------------------------------------------- 9
I .1 O fumo no Rio Grande do Sul e Saúde -------------------------------------------------------------------------
11
1.2 Agrotóxicos, seus efeitos e os Radicais Livres ------------------------------------------------------------------
13
I.3 Testes de Genotoxicidade------------------------------------------------------------------------16
II OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------------------------------19
II.1 Objetivo Geral -------------------------------------------------------------------------------------------------------
19
II.2 Objetivos Específicos -----------------------------------------------------------------------------------------------
19
III ARTIGO: EVALUATION OF GENOTOXICITY AND OXIDATIVE STRESS IN
TOBACCO FARMERS------------------------------------------------------------------------------20
IV DISCUSSÃO ---------------------------------------------------------------------------------------48
V CONCLUSÕES -------------------------------------------------------------------------------------52
VI PERSPECTIVAS----------------------------------------------------------------------------------53
VII REFERENCIAS----------------------------------------------------------------------------------54
VIII ANEXOS----------------------------------------------------------------------------------------- 58
7
RESUMO
A exposição aos agrotóxicos pode representar um risco em potencial para os
agricultores e tem sido demonstrado em alguns estudos ser prejudicial à saúde. É
necessário para a sociedade o estabelecimento de regras e controle destes agentes
potencialmente perigosos. Atualmente o Brasil é o segundo produtor mundial de tabaco.
Com o objetivo de detectar alterações genéticas causadas pela exposição aos agrotóxicos
usados na cultura do fumo, foi realizado biomonitoramento com fumicultores em Santa
Cruz do Sul-RS, em período pré-exposição e pós-exposição aos agrotóxicos, utilizando o
Ensaio Cometa, em leucócitos do sangue periférico, e o Teste de Micronúcleos, em
esfregaço de mucosa oral. Os níveis de estresse oxidativo foram determinados pelo ensaio
da enzima Superóxido Dismutase (SOD). As coletas de amostras foram realizadas entre os
meses de Maio e Dezembro de 2007, quando cerca de 22 fumicultores foram avaliados
antes e após a exposição aos pesticidas. O Grupo exposto (19 agricultores) apresentou
valores de Freqüência de Danos, Índice de Danos, Micronúcleos e SOD maiores do que o
grupo controle (22 agricultores), formado pelo mesmo grupo de agricultores, em período de
mínima ou nenhuma exposição a agrotóxicos. Assim, é possível que quando os
fumicultores não estão expostos aos agrotóxicos as alterações possam ser reparadas,
voltando a valores considerados normais. Em questionário aplicado a ambos os grupos,
todos os agricultores informaram que não utilizam nenhum equipamento de proteção
individual. É importante enfatizar que medidas de proteção são essenciais para evitar riscos
à saúde. Nossos resultados indicam que o uso de compostos químicos na produção de
tabaco tem aumentado os níveis de lesão de DNA em células somáticas, sugerindo um risco
à saúde dos fumicultores, e este achado pode estar relacionado com o não uso de
equipamentos de proteção.
8
ABSTRACT
Pesticide exposure is a potential risk to agricultural workers and some studies
demonstrated their harmful effects on human health. It is necessary to society the
establishment of rules and control of these potentially harmful agents. Nowadays, Brazil is
the second producer of tobacco in the world. With the objective to detect genetic alterations
caused by exposition to pesticides used at tobacco’s crop, was realized biomonitoring with
tobacco farmers in Santa Cruz do Sul-RS, Brazil. The evaluation of DNA damage was
realized through Comet assay, in peripheral blood leukocytes, Micronucleus Test in
exfoliated buccal cells, and levels of oxidative stress through products of reaction with
Superoxide dismutase (SOD) in unexposed and exposed to pesticides. The sampling was
realized between May and December 2007, about 22 agricultural workers were evaluated
before (unexposed) and after the exposition (exposed). Exposed group showed values of
Damage Frequency, Damage Index, micronucleus and SOD higher than unexposed. In the
low exposure period, when the pesticides almost are not used, these values came back to
normal level, indicating that these alterations should be repaired. However, is important to
emphasize that protective measures are essentials to avoid potential risks to human health.
Our findings indicate that the use of chemical compounds in the production of tobacco
have increased levels of DNA damage in somatic cells, suggesting a potential health risk
for the workers, and this finding can be related with the non-use of personal protective
equipment.
Keywords: Pesticides, Comet assay, Micronucleus Test, Oxidative Stress.
9
I INTRODUÇÃO
A contaminação do meio ambiente com produtos químicos é uma questão de grande
importância nos dias atuais, considerando-se o elevado número de substâncias que são
produzidas e utilizadas a cada ano. Um grande número destes compostos químicos é
utilizado na agricultura sob a forma de agrotóxicos, constituindo-se em poluentes
ambientais em potencial. Neste contexto, tem relevância o conhecimento sobre os efeitos
deletérios à saúde humana, associados à ampla utilização dos agrotóxicos (JOCKSIC et al,
1997). O interesse da comunidade científica pelo conhecimento, detecção e controle dos
agentes ambientais responsáveis por danos à saúde humana tem se intensificado com os
relatos sobre os danos na camada de ozônio, mudanças climáticas globais, liberação dos
dejetos e gases radioativos industriais, aumento do nível de nitrogênio no ambiente, etc
(BICKHAM et al., 2000).
Os toxicologistas buscam conhecer os mecanismos de toxicidade e a dosagem dos
níveis de contaminantes nos tecidos dos organismos e em amostras ambientais. A
comunidade científica admite hoje que a saúde humana depende da saúde ambiental, e que
a contaminação do meio ambiente ameaça a qualidade de vida. Os impactos causados por
agentes tóxicos no ambiente e na saúde humana muitas vezes não podem ser observados e
medidos diariamente. A informação obtida nas análises de risco nos permite estimar e
comparar esses impactos. Análises de risco são estudos que obtêm dados, medidas e
promovem a comparação entre diferentes formas de danos e seus efeitos na população. O
gerenciamento destes é baseado em técnicas utilizadas para diminuir os possíveis impactos
(ELESPURE, 1996).
A determinação do risco inclui quatro pontos fundamentais: identificação da
substância (agente tóxico) que pode provocar efeitos adversos à saúde humana; cenários
(ambientes) de exposição aos agentes tóxicos; caracterização dos efeitos na saúde humana;
e, estimativa da probabilidade (risco) de ocorrência dos efeitos adversos (CAMARA E
TAMBELLINI, 2003).
Efeitos adversos na saúde humana são algumas vezes difíceis de identificar e
determinar. Mesmo quando é observado algum efeito, ainda é difícil reconhecer quais os
elementos do ambiente que estão associados a ele. A análise de risco denomina estes
componentes de ‘fatores de risco’. Em geral, para que substâncias possam ser consideradas
fatores de risco devem apresentar alguns aspectos característicos (CAMARA E
TAMBELLINI, 2003), tais como: a exposição ao fator de risco precede o aparecimento dos
10
efeitos adversos; o fator de risco e o efeito adverso devem estar estreitamente associados,
isto é, o efeito adverso não é comumente observado na ausência do fator de risco; quanto
maior a quantidade ou intensidade do fator de risco, maior é o efeito observado, embora a
relação entre eles não precise ser linear; a ocorrência ou magnitude do efeito adverso é
maior na presença do fator de risco do que na ausência dele e esta diferença deve ser
estatisticamente significativa.
É mister o estabelecimento de normas de uso e controle de agentes químicos
potencialmente danosos. Normalmente isto é realizado com base em estudos capazes de
identificar substâncias que possuem potencialidades mutagênicas, carcinogênicas e/ou
teratogênicas. A função primária dos testes de toxicologia genética é investigar, usando
células ou organismos, o potencial dos agentes químicos de induzirem mutações nas células
somáticas, ou que possam ser transmitidas às gerações futuras por gametas. A
determinação dos efeitos citogenéticos em indivíduos expostos a agentes químicos pode
servir como um indicador precoce do aumento do risco de câncer (BULL et al., 2006). Os
dados científicos disponíveis comprovam que a lesão do DNA em células somáticas é um
evento crítico na gênese do câncer. Em alguns estudos epidemiológicos realizados em
agricultores, ficou comprovado que a exposição ocupacional a agrotóxicos contribui para
aumentar a incidência de vários tipos de câncer em sítios específicos (GOFF et al., 2005).
Portanto, os testes de mutagenicidade também servem para identificar as substâncias de
potencial carcinogênico, levando em consideração, entretanto, que determinados
carcinógenos não são mutagênicos (SILVA, 2003).
Para que sejam eficientes, as normas de uso e controle de agentes potencialmente
danosos devem acompanhar o desenvolvimento científico e ser freqüentemente revisadas e
atualizadas. Atualmente têm sido utilizados e determinados diversos tipos de testes de
toxicologia genética, sendo alguns mais empregados que outros. Os mais empregados são
aqueles que detectam eventos mutagênicos como alterações moleculares, deleções,
recombinações mitóticas ou alterações cromossômicas, decorrentes de lesões no DNA e
subseqüente ação dos mecanismos de reparação (SILVA, 2003). Os estudos
epidemiológicos apresentam uma variação de resultados, atribuível a fatores como
características do estudo, número de indivíduos estudados, natureza da exposição, tempo de
exposição, tipos de compostos químicos utilizados, etc (GOFF et al., 2005).
A legislação brasileira e internacional exige que produtos industrializados como
pesticidas, fármacos e fitoterápicos, entre outros, sejam produzidos ou colocados no
11
mercado somente após a avaliação rigorosa de suas características. Os órgãos de
regulamentação exigem que o produto em estudo passe por uma extensa bateria de testes,
para determinar suas propriedades físico-químicas, atividade tóxica e neurotoxicidade em
animais, e ainda seu potencial mutagênico, embrio-fetotóxico e carcinogênico (BRASIL,
2004).
I .1 O fumo no Rio Grande do Sul e Saúde
No Brasil o fumo já era conhecido antes mesmo do descobrimento, quando os
indígenas o utilizavam para fins medicinais e em rituais mágicos. No século XVIII o
Marquês de Pombal regulamentou o plantio e a comercialização do tabaco e no Século XIX
já havia uma produção de fumos negros para atender à demanda interna e a exportação à
Europa (AFUBRA, 2008). Posteriormente coube a Rui Barbosa, como o primeiro Ministro
da Fazenda do período republicano, transformar o fumo em uma das principais fontes
tributárias do Estado, ao instituir as bases do então Imposto sobre Consumo – o futuro
Imposto sobre Produtos Industrializados (IPI).
Em 1903 teve início a industrialização de cigarros no Rio de Janeiro. A partir daí,
com o crescimento da demanda interna, houve a necessidade de organizar o sistema
produtivo brasileiro. Em 1918 houve a implantação do Sistema Integrado de Produção de
Fumo na região Sul do Brasil, mais precisamente no Estado do Rio Grande do Sul,
estendendo-se posteriormente aos estados de Santa Catarina e Paraná. A partir de 1950 teve
início a produção dos fumos claros tipo “Virgínia” (curados com fonte de calor) e Burley
(curados naturalmente) no Sul. Nos anos 70 a fumicultura teve um aumento significativo na
região Sul do Brasil, com a ampliação do parque industrial e o incremento da produção e
exportação. Atualmente, o sul do Brasil produz mais de 758.000 toneladas de fumo por ano
e é o maior exportador mundial. O faturamento do setor fumageiro em 2006 superou os 14
bilhões de reais, sendo 10 bilhões em consumo doméstico e quase 4 bilhões em
exportações. Na safra 2006/2007 a fumicultura empregou cerca de 2.400.000 pessoas, com
960.000 empregos diretos e 1.440.000 empregos indiretos (AFUBRA, 2008).
A fumicultura no Rio Grande do Sul apresenta números igualmente imponentes: na
safra 2001/2002 o número de produtores foi de 77.570, com 79.590 estufas, uma área
plantada de 152.680 hectares, produção de 330.360 toneladas de fumo, média de 2.164
Kg/ha; na safra 2002/2003 eram 86.370 produtores, 86.980 estufas, 182.790 hectares de
área plantada, 296.720 toneladas de fumo produzidas, média de 1.623 Kg/ha; na safra
2003/2004 o número de produtores subiu para 96.180, com 100.060 estufas, área plantada
12
de 207.090 hectares, produção de 445.990 toneladas de fumo, média de 2.154 Kg/ha; na
safra 2004/2005 foram 97.740 produtores, 109.840 estufas, 218.260 hectares de área
plantada, 422.960 toneladas produzidas, média de 1.938 Kg/ha; na safra 2005/2006 o
número de produtores foi de 96.790, com 109.510 estufas, 204.030 hectares de área
plantada, produção de 396.050 toneladas de fumo, média de 1.941 Kg/ha; na safra
2006/2007 o número de famílias produtoras foi de 182.650, 360.910 hectares plantados,
produção de 758.660 toneladas (AFUBRA, 2008), evidenciando um aumento significativo
na produção de fumo.
Há 776 municípios produtores de fumo no sul do país, com 144.620 propriedades
produtoras, envolvendo 182.650 famílias. Mais de 38 mil famílias (21%) não são
proprietários rurais e trabalham em regime de parceria. A área média das propriedades dos
fumicultores é de 16,5 hectares (AFUBRA, 2008).
Estimativas indicam que a exposição ocupacional é a causa de 4% de todos os casos
de câncer em humanos. Trabalhadores de diferentes áreas ocupacionais estão
potencialmente expostos a substâncias genotóxicas que podem causar alterações genéticas
tanto em células somáticas quanto em células germinativas. A exposição pode ocorrer pela
inalação, absorção pela pele ou por ingestão. Dependendo da atividade dos trabalhadores,
estes estão expostos a misturas de agentes químicos ou de agentes químicos e físicos juntos
(ERDTMANN & MALUF, 2003).
Os agentes químicos relacionados com a exposição ocupacional podem ser
classificados em três tipos: orgânicos, inorgânicos e grupos específicos. Em alguns setores,
o trabalhador está exposto a um grupo específico de agentes químicos, como, por exemplo,
os agricultores expostos a agrotóxicos. Dentre os agrotóxicos mais utilizados na
fumicultura estão os organofosforados, carbamatos, piretróides e neonicotinóides. A
exposição a esses agentes químicos ocorre durante a fabricação e processamento dos
produtos, bem como durante sua utilização. Além disso, a exposição em agricultores
também ocorre pelo contato da pele com resíduos destes compostos que permanecem nas
plantas (KVITKO, 2003).
Como as regiões onde se cultiva o fumo em geral são quentes, os agricultores
muitas vezes trabalham sem camisa, colhem as folhas e as prendem sob as axilas, para
depois formar rolos. Os níveis de absorção dos pesticidas pela pele são altos e provocam
mal estar, vômitos e dor de cabeça (ONUKI et al., 2003). Esse mal é conhecido como
Síndrome da Folha Verde, ou Green Tobacco Sickness – GTS. Os sintomas de GTS
incluem náuseas, vômitos, tonturas, cefalalgia, cólicas intestinais, diarréia, fraqueza,
inapetência, prostração. Em casos mais severos ocorre desidratação importante e
13
necessidade de tratamento médico (QUANDT et al., 2003). Na região pesquisada os
agrotóxicos são aplicados duas a três vezes por semana e a colheita se inicia cerca de seis
meses após o plantio.
1.2 Agrotóxicos, seus efeitos e os Radicais Livres
O termo “agrotóxicos” envolve um grupo de compostos químicos que são usados
para a eliminação ou controle de pragas. Agrotóxicos são compostos químicos
especialmente desenvolvidos e produzidos para o uso no controle de pragas na agricultura e
na saúde pública, e para facilitar modernos métodos de agricultura. São geralmente
classificados de acordo com o tipo de praga (fungicidas, inseticidas, herbicidas,
nematicidas, molusquicidas) a que se destinam (STENERSEN, 2004). Os agrotóxicos
apresentam benefícios econômicos e para a saúde pública, e têm sido usados através dos
anos para o controle de vetores de doenças como a malária e febre das montanhas rochosas,
para a melhoria da produção agrícola em vários países e para o controle de pragas
domésticas (BRITT, 2003).
O uso de substâncias químicas orgânicas e inorgânicas na agricultura não é
uma prática atual, mas remonta à antiguidade clássica. Escritos gregos e romanos
mencionavam o uso de produtos como o arsênico e o enxofre para o controle de insetos. A
partir do século XVI o emprego de substâncias orgânicas extraídas de plantas foi
comumente utilizado na Europa e nos Estados Unidos da América para o controle de
insetos (OPAS, 1997).
No início do século XX iniciaram-se estudos sistemáticos buscando o emprego de
substâncias inorgânicas para a proteção de plantas. Produtos à base de cobre, chumbo,
mercúrio, cádmio, etc, foram desenvolvidos comercialmente e empregados contra uma
grande variedade de pragas. Novas tecnologias, muitas delas baseadas no uso extensivo de
agentes químicos, foram disponibilizadas para o controle de doenças, aumento da
produtividade e proteção contra insetos e outras pragas. Entretanto, essas novas facilidades
não foram acompanhadas pela implementação de programas de qualificação da força de
trabalho, sobretudo nos países em desenvolvimento, expondo as comunidades ambientais a
um conjunto de riscos ainda desconhecidos. Os termos praguicidas, defensivos, pesticidas e
agrotóxicos são expressões utilizadas para se referir aos produtos químicos xenobióticos,
ou seja, substâncias estranhas aos seres vivos, e também a alguns compostos de origem
14
animal ou vegetal utilizados no controle de pragas ou vetores de doenças (TARGA e
RABELO-GAY, 1983). Os agrotóxicos inorgânicos são produtos constituídos por
elementos tóxicos como arsênico, cobre, chumbo e mercúrio, não degradam facilmente e
podem persistir por muito tempo no ambiente. Os agrotóxicos orgânicos são de diversas
origens, sendo classificados como: (1) orgânicos naturais, extraídos de diversas plantas,
p.ex. nicotina, (2) orgânicos metálicos sintéticos, p.ex. mercuriais, (3) fenólicos, p.ex.
pentaclorofenol, (4) hidrocarbonetos clorados, p.ex dicloro-difenil-tricloroetano, (5)
orgânicos fosforados, (6) carbamatos, (7) triazinas, (8) piretróides (FREEDMAN, 1995).
Entre os agrotóxicos mais utilizados na fumicultura estão: Mancozeb (fungicida
ditiocarbamato, classe toxicológica II), Acefato (inseticida organofosforado, classe
toxicológica III), Imidacloprid (inseticida neonicotinóide, classe toxicológica III),
Clomazone (herbicida isoxazolidinona, classe toxicológica III), Sethoxydin (herbicida pós-
emergente, classe toxicológica II), Glifosato (herbicida glicina, classe toxicológica II),
Flumetralin (regulador de crescimento, dinitroanilina, classe toxicológica IV). Os
agrotóxicos são capazes de gerar radicais livres (RL), espécies químicas (átomo ou
molécula) que possuem um elétron não pareado na última camada eletrônica e que é
responsável por sua grande reatividade (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000).
O transporte de elétrons ao longo da cadeia respiratória é conhecido como uma das
principais fontes de radicais livres geradas durante o metabolismo oxidativo normal. Estes
radicais, quando não inativados, são capazes de oxidar diferentes biomoléculas, tais como
proteínas, lipídios, carboidratos e ácidos nucléicos, comprometendo, desta forma, a
integridade celular. Quando há um desbalanço entre pró-oxidantes e antioxidantes em favor
dos primeiros, há a formação do estresse oxidativo, que pode afetar os mais diferentes
órgãos. Estudos demonstram que os radicais livres participam no mecanismo de instalação
de várias doenças, entre elas: doença de Parkinson, esclerose múltipla, distrofia muscular,
cataratas, retinopatias, ateroesclerose, infarto do miocárdio, enfisema pulmonar, cirrose
hepática e vários tipos de câncer (BECKMAN & AMES, 1998; PAWLAK et al.., 1998).
Também nos estados inflamatórios, nos transplantes de órgãos, nos processos de
envelhecimento e nas doenças decorrentes da radiação, do fumo e da poluição, os radicais
livres desempenham um significativo papel (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000).
As defesas antioxidantes, que protegem os sistemas biológicos de danos provocados
por radicais livres, podem ser definidas como “qualquer substância que, quando presente
em baixa concentração com relação à de um substrato oxidável retarda, significativamente,
ou previne a oxidação deste substrato”. Os antioxidantes podem ser divididos, de acordo
15
com o seu mecanismo de ação, nos seguintes grupos: (1) enzimas antioxidantes, (2)
quelantes e proteínas, (3) substâncias não enzimáticas (ABDALLA & FAINE, 2008).
Entre as principais enzimas antioxidantes destaca-se a Superóxido Dismutase. As
SOD são metalo-enzimas abundantes em células aeróbicas, e que agem sobre o radical O
2
-
,
dismutando-o a H
2
O
2
. Em células eucarióticas há várias isoenzimas do tipo SOD,
geralmente responsáveis por compartimentos celulares distintos, podendo conter cobre,
zinco ou manganês nos seus sítios ativos (CuZn-SOD, Mn-SOD). A SOD contendo ferro
(Fe-SOD) só é encontrada em procariotos. A SOD distribui-se em diversos órgãos na
seguinte ordem de atividade específica: fígado > cérebro > testículos > rins > coração >
estômago > pulmão > pâncreas (ABDALLA & FAINE, 2008).
Outros antioxidantes não enzimáticos como o ascorbato, tocoferóis (vitamina E),
carotenóides, licopenos e flavonóides em geral, presentes em dietas ricas em frutas e
verduras, constituem-se em importantes defesas contra os radicais livres, diminuindo as
chances de desenvolvimento de patologias degenerativas (FENECH, 2005; WONG et al.,
2005).
Atualmente a única técnica disponível para avaliar diretamente a formação de
radicais livres é através de “Eletron Spin Ressonance” (ESR), onde são medidas as
mudanças de energia que ocorrem no alinhamento de elétrons em resposta a um campo
magnético externo. Entretanto, em sistemas biológicos esta técnica não pode ser utilizada,
uma vez que a meia vida dos radicais livres é muito curta (da ordem de mili-segundos) e
estes não se acumulam em quantidade suficiente para serem detectados. A técnica de “Spin
Trapping”, na qual o radical livre reage com um composto, a fim de formar um produto
mais estável (que é então medido por ESR), também não tem sido bem sucedida em
sistemas biológicos. Além disso, a exigência de aparelhagem sofisticada faz com que estas
metodologias sejam de alcance limitado e muito onerosas (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 2000). Desta forma, as técnicas que vêm sendo mais utilizadas na
detecção dos radicais livres baseiam-se, fundamentalmente, na detecção de produtos ou
alterações fisiológicas provocadas pelo estresse oxidativo.
Doses subcrônicas de agrotóxicos organoclorados como Dicloro-Difenil-
Tricloroetano (DDT) e Lindane geram aumento dose-dependente na concentração
plasmática da enzima superóxido dismutase, sem no entanto alterar as concentrações de
glutationa reduzida (VIDELA et al., 2003). Estes dados indicam um possível envolvimento
dos radicais livres na toxicidade dos agrotóxicos organoclorados.
Além dos testes de estresse oxidativo, Videla et al. (2003) afirma que devido à
similaridade do código genético e da síntese de proteínas entre os organismos, o uso de
16
testes de mutagenicidade de curta duração pode servir na obtenção de informação sobre um
agente mutagênico. Assim, os testes de curta duração, principalmente se forem aliados a
biomarcadores de exposição (Ensaio Cometa) e a outros biomarcadores de efeito (Teste de
Micronúcleos), serão importantes ferramentas para traçar os riscos de exposição à
xenobióticos.
I.3 Testes de Genotoxicidade
Um número crescente de países tem procurado estabelecer “limites de tolerância”
em relação à exposição ocupacional a agentes danosos, segundo as recomendações
internacionais, como a Organização Mundial da Saúde (OMS), a Organização Internacional
do Trabalho (OIT) e a Comissão Permanente da Associação Internacional de Saúde
Ocupacional, compilando dados publicados em países como Estados Unidos da América,
Alemanha e França.
O estabelecimento dos limites de tolerância às substâncias e a sua aplicação de
forma adequada têm, como finalidade principal, diminuir a incidência de efeitos adversos
destes agentes, procurando manter o bem estar físico, mental e social de todos os
indivíduos ocupacionalmente expostos.
O aparecimento de efeitos adversos como conseqüência da exposição aos agentes
indica que os níveis destes contaminantes estão acima dos recomendáveis ou que não são
seguros. Desta forma, devem ser tomadas medidas preventivas de proteção ou, nos casos
extremos, afastamento do manipulador do ambiente de trabalho.
A exposição a agentes genotóxicos em nosso ambiente pode causar uma variedade
de efeitos sobre a saúde humana. Alguns deles se expressam imediatamente, enquanto
outros levam anos para se manifestarem. Efeitos tardios bem conhecidos incluem a indução
de câncer, doenças genéticas nas gerações seguintes, desordens de desenvolvimento, entre
outros (ERDTMANN, 2003).
Exposições baixas, ocorridas durante várias semanas ou meses, podem produzir
efeitos subagudos a curto prazo, assim como exposições sucessivas a baixas doses podem
resultar em efeitos crônicos a longo prazo, difíceis de serem diagnosticados. Alguns
exemplos incluem a intoxicação crônica por mercúrio, problemas respiratórios crônicos
devido às substâncias irritantes, como o metanol, e câncer decorrente da exposição a
agentes carcinogênicos.
17
A avaliação do potencial genotóxico (ou mutagênico) de um agente químico isolado
é realizada utilizando estudos que abrangem organismos procarióticos e eucaróticos, com
testes in vitro e in vivo. Os primeiros estudos devem ser, preferencialmente, estudos
realizados in vitro, e conforme os resultados obtidos, são então recomendados ensaios mais
específicos in vitro e in vivo (BRUSICK, 1988; WEISBURGER, 1999).
Os métodos que são mais amplamente empregados para detecção de mutações
gênicas são aqueles que utilizam as bactérias (Salmonella typhimurium e Escherichia coli).
Estes são relativamente simples, reproduzíveis e dão resultados confiáveis de
interação do produto com o DNA. Contudo, as bactérias são organismos simples, e os
resultados obtidos nem sempre são válidos para células animais ou outros eucariontes. Para
se obter dados sobre mutação gênica em eucariotos há testes em leveduras (Saccharomyces
cerevisiae), em células de culturas de mamíferos, em Drosophila, ou mesmo mutações
somáticas em mamíferos pelo teste de HGPRT (gene de hipoxantina-guanina
phosphoribosil-transferase, ligado ao cromossomo X dos mamíferos), ou o “mouse spot
test” (alteração da cor do pelo em camundongos tratados durante a embriogênese). Para
detecção de mutações cromossômicas os testes mais utilizados incluem as aberrações
cromossômicas e micronúcleos, sendo que estes testes exigem que as células estejam em
estado proliferativo. O estudo de aberrações cromossômicas possibilita a identificação de
quase todas as alterações na estrutura do cariótipo, escapando apenas as bem pequenas, não
visíveis ao microscópio. Mas, hoje em dia, por haver técnicas para detecção de mutações
cromossômicas mais rápidas e simples, como o Teste de Micronúcleos, o estudo de
aberrações cromossômicas é apenas utilizado em situações recomendadas, como dirimir
dúvidas, definir os tipos de mutação, validar outras metodologias, etc. Estes testes têm um
sistema de validação internacional, e podem ser desenvolvidos tanto in vitro como in vivo,
desde que se conheça adequadamente a biologia do organismo-teste. Recentemente, o teste
alcalino eletroforético de célula-única ou Ensaio Cometa (EC), que detecta quebras no
DNA, tem sido recomendado para o biomonitoramento ambiental, sendo um teste realizado
em células individuais não proliferativas (SILVA; HEUSER; ANDRADE, 2003). A
facilidade de avaliação e o fato de que qualquer tecido de qualquer organismo eucariótico
pode ser analisado tem favorecido o uso do Ensaio Cometa (MOLLER, 2006).
O micronúcleo é o resultado da perda de fragmento ou fragmentos de um ou mais
cromossomos, podendo ser induzida por agentes que afetam o fuso mitótico. Os fragmentos
ou cromossomos inteiros, que não se orientam para os núcleos filhos de uma célula em
divisão, ficam perdidos no citoplasma e formam sua própria membrana nuclear, originando
os micronúcleos, que são detectados em células interfásicas como pequenos corpúsculos
18
arredondados de cromatina, separados do núcleo principal (FENECH et al., 2006;
MATEUCA et al., 2006). Nos últimos anos o Teste de Micronúcleos tem se tornado uma
ferramenta atrativa para os testes de genotoxicidade, por sua simplicidade e por sua
aplicabilidade em diferentes tipos de células (DECORDIER & KIRSCH-VOLDERS,
2006).
A técnica do Ensaio Cometa consiste em obter, a partir de células individualizadas,
colocadas em agarose, lisadas, submetidas à eletroforese e coradas, uma matriz com um
halo fluorescente, formado por DNA não danificado e que não migrou. Células com DNA
danificado formam um cometa, consistindo de uma cabeça (matriz nuclear) e uma cauda
(DNA quebrado). A extensão do DNA que migrou está correlacionada com o dano
ocorrido (GONTIJO, 2003; BRENDLER-SCHWAAB et al., 2005).
O ensaio cometa combina a simplicidade da técnica bioquímica de detecção de
quebras no DNA com a utilização de poucas células e corresponde a um ensaio
citogenético. As vantagens dessa técnica incluem a sensibilidade na detecção de dano no
DNA: a coleta de dados a nível de célula individual; o uso de um número pequeno de
células para a análise e a possibilidade de aplicação em qualquer população de células
eucarióticas (DUSINSKA et al., 2008).
19
II OBJETIVOS
II.1 Objetivo Geral
Pretendeu-se avaliar os riscos à saúde dos agricultores do município de Santa Cruz
do Sul que trabalham na fumicultura, com um conjunto de análises que permitissem
identificar os danos causados pela exposição aos agrotóxicos.
II.2 Objetivos Específicos
1. Avaliar possíveis efeitos genotóxicos da exposição dos trabalhadores aos
agrotóxicos, pelo Ensaio Cometa, em leucócitos do sangue periférico, e do
Teste de Micronúcleos, em esfregaço de mucosa oral.
2. Medir o grau de estresse oxidativo em células do sangue periférico, pela
análise da enzima SOD (superóxido dismutase), nos trabalhadores expostos
aos agrotóxicos.
3. Correlacionar na medida do possível os resultados obtidos.
20
III ARTIGO:
EVALUATION OF GENOTOXICITY AND OXIDATIVE STRESS
IN TOBACCO FARMERS
A ser submetido a revista: Journal of Occupational Environmental Medicine
21
EVALUATION OF GENOTOXICITY AND OXIDATIVE STRESS IN TOBACCO
FARMERS
ALVES, J. S.
1,
, DA SILVA, J.
1,*
,
SILVA, F. R.
3
, SALVADOR, M
4
, HENRIQUES, J. A.
P.
1,2,3
1
Laboratório de Genética Toxicológica, PPGGTA, Universidade Luterana do Brasil
(ULBRA), Canoas-RS, Brazil.
2
Departamento de Biofísica, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e
Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre-RS, Brazil.
3
Departamento de Genética, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre-RS, Brazil.
4
Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul (UCS), Caxias do Sul-RS,
Brazil.
*Corresponding author:[email protected]
22
Abstract
Pesticide exposure is a potential risk and some studies demonstrated their harmful
effects on human health. It is necessary to society the establishment of rules and control of
these potentially harmful agents. Nowadays, Brazil is the second producer of tobacco in the
world. With the objective to detect genetic alterations caused by exposition to pesticides
used at tobacco’s crop, was realized biomonitoring with tobacco farmers in Santa Cruz do
Sul-RS, Brazil. The evaluation of DNA damage was realized through Comet assay, in
peripheral blood leukocytes, Micronucleus Test in exfoliated buccal cells, and levels of
oxidative stress through products of reaction with Superoxide dismutase (SOD) in
agricultural workers before and after exposition to pesticides. The sampling was realized
between May and December/2007, about 22 agricultural workers were evaluated before
(unexposed) and after the exposition (exposed). Exposed group showed values of Damage
Frequency, Damage Index, micronucleus and SOD higher than unexposed. In the low
exposure period, when the pesticides almost are not used, these values came back to normal
level, indicating that these alterations should be repaired. However, is important to
emphasize that protective measures are essentials to avoid potential risks to human health.
Our findings indicate that the use of chemical compounds in the production of tobacco
have increased levels of DNA damage in somatic cells, suggesting a potential health risk
for the workers, and this finding can be related with the non-use of personal protective
equipment.
Keywords: Pesticides, Comet assay, Micronucleus Test, Oxidative Stress.
Grant sponsor: ULBRA
23
1. Introduction
Located in southern Brazil, the municipality of Santa Cruz do Sul (Rio Grande do
Sul- RS) is an important producer of tobacco leaves (Nicotiana tabacum), with more than
390,000 tons annually and employing over 96,000 farmers (1).
The health risks associated with smoking tobacco and exposure to secondhand smoke
are well known. However, the health effects of handling wet tobacco leaves are less
studied. Green Tobacco Sickness (GTS) is a form of nicotine poisoning that affects
workers that have direct contact with tobacco plants during cultivation and harvesting. GTS
symptoms are similar to those induced by pesticide exposure or heat stroke, and nicotine
intoxication experienced by novice smokers. GTS is characterized by nausea, pallor, chills,
vomiting, headache, difficult breathing, abdominal pain, diarrhea, appetite loss, runny eyes,
blurred vision, weakness, prostration and dizziness, and occasionally by blood pressure or
heart rate fluctuation (2). Although GTS has not been associated with mortality or long-
term morbidity, it causes significant discomfort and productivity loss among tobacco
workers.
Pesticides residues on foliage can be absorbed mainly through the skin of the hands
and the forearms (3). Many of these compounds are classified by International Agency for
Research on Cancer (IARC) as carcinogenic. Therefore, it is important to evaluate the
occupational exposure to these products. People involved in preparing and spraying
pesticide mixes are the most commonly exposed group of farmers (3). Tobacco farmers in
Brazil usually apply several pesticides (insecticides, herbicides, fungicides and plant
growth regulators) in tobacco plants to improve crop characteristics and yield. The list of
pesticides used in tobacco ranges from carbamates to nitroanilines with relatively benign to
extremely toxic properties.
24
Pesticides are among the most widely used chemicals throughout the world. They
include a large variety of substances, with different composition and properties with the
purpose to kill, destroy and repel undesirable living organisms. Pesticides are responsible
for several adverse effects on human health other than acute intoxications. Effects on
immune, nervous, endocrine and reproductive systems have been reported in many studies,
and DNA damage has also been related to pesticide exposure. These compounds can
interact with DNA leading to abortions, degenerative diseases and ultimately to cancer, in
the absence of reparation processes. Many reports on chromosomal aberrations (CA) (4, 5),
sister chromatid exchange (SCE) (6, 7), micronuclei (MN) (8, 9) and Comet cells (6, 10)
found significant increases in these biomarkers when there is exposure to pesticides,
providing suggestive evidence of genotoxic effects induced by these chemicals. However,
conclusions of genotoxic damage studies are conflicting. Some indicate a significant
increase in MN, SCE, and CA frequencies (11, 12), while others did not find significant
differences (13, 14, 15). The response mainly depends on the type of pesticide, period of
exposure, and the use of personal protective equipment.
Occupational exposure together with environmental factors (tobacco smoke,
contaminants in air, water and food, radiations, dietary components and infectious agents)
are key contributors to human cancer (80-90% of cases). Human biological monitoring is a
tool of great interest in cancer risk assessment as it allows estimating the genetic risk
deriving from environmental exposure to chemicals. Biomarkers such as MN, SCE, and
CA provide information on DNA damage. Although it is difficult to establish a connection
between pesticide exposure and cancer prevalence, especially because of the high number
of involved compounds, some authors observed higher prevalence of certain types of
cancer in pesticide-exposed populations. According to Buckley et al. (16) and Meinert et
al. (17), the incidence of leukemia and non-Hodgkin lymphomas is higher in individuals
exposed to pesticides. A meta-analysis showed that farmers were at risk of specific tumors
25
including leukemia and multiple myeloma (3). Possible pesticide abuse or misuse can lead
to significant exposure levels, particularly among those occupationally exposed. It has been
suggested that the assessment of cytogenetic effects in exposed subjects can serve as an
early indicator of increased risk of cancer, although the evidence is somewhat contradictory
(18).
In the present study, tobacco workers from Santa Cruz do Sul (Brazil) exposed to
pesticides were evaluated using Micronucleus test in exfoliated buccal cells, Comet assay
in peripheral leukocytes and oxidative stress, in order to assess if prolonged exposure to
complex mixtures of pesticides could lead to an increase in cytogenetic damage.
26
2. Materials and methods
2.1. Study population and sample collection
The study involved a total number of 28 individuals (sprayers, 18 males and 10
females), between 18 and 63 years of age, from Santa Cruz do Sul (in the central region of
the State of Rio Grande do Sul, southern Brazil). This is a region of tobacco production.
The characteristics of the groups are presented in Table I. Nineteen individuals were
agricultural workers directly exposed to pesticides (mean age: 42.89 ±12.55; exposed since
childhood). The control group consisted of the same exposed individuals, when they were
not spraying pesticides or directly exposed to them. None of these was recently exposure to
pesticides or other suspected genotoxic agents. The control group consisted of 22 subjects
(13 males and 9 females), between 22 and 63 years of age (mean 40.18 ± 13.38), with very
similar social-economic and nutritional status. In both groups, individuals who had smoked
more than five cigarettes/day for at least one year were considered smokers (control
smokers= 9 males; agricultural workers= 8 males). All agricultural workers were regularly
exposed, about twice or three times per week, to complex mixtures of pesticides, which
were different according to the weather. The list of used pesticides is shown in Table II.
Agricultural workers worked mainly in open fields, and the main crop was tobacco.
Pesticide application was usually carried out over the worker´s head and about three times
a week. All (100%) pesticide-exposed workers reported not using any kind of protection
during pesticide preparation and application (gloves, breathing masks, protective goggles,
impermeable boots, etc.). All these individuals had been exposed to pesticides 1-3 days
before the interview and sample collection. Only in a weekend in December 2007, 20
people (16 males and 4 females) presented symptoms related with pesticides, such as
headache, abdominal pain, nausea, and vomits.
27
Although the factor gender was initially considered, it was not statistically
significant. The selected population was approached by communitarian health agents to
make an appointment with the general practitioner, when a medical interview performed
and their occupational history was collected. Clinical data were collected and evaluated by
medical personnel. Pesticide applicators also completed an occupational questionnaire
which included work activity, pesticides application duration, pesticide type, and protective
measures used. All individuals gave their informed and written consent.
The individuals examined in the study were asked to complete a Portuguese version
of a questionnaire of the International Commission for Protection against Environmental
Mutagens and Carcinogens (19), and to participate in a face-to-face interview, which
included standard demographic data (age, gender, etc.), as well as questions related to
medical issues (exposure to X-rays, vaccinations, medication, etc.), life style (smoking,
coffee and alcohol consumption, diet, etc.), and occupation (number of working hours per
day, time exposed to organic solvents, use of protective measures, etc.).
This study was approved by the Brazilian National Committee on Research Ethics
(Comissão Nacional de Ética em Pesquisa – CONEP), and informed written consent was
obtained from every individual before the study started
Blood samples were obtained by venopuncture using heparinized vacutainers at two
different times: when pesticide application peaks (high exposure period, in December
2007) and at the end oh the season, regarded as baseline exposure (low exposure period, in
May 2007).
All blood samples were processed as quickly as possible in order to prevent damage
associated with storage; blood-cell samples were transported to the laboratories at or below
8◦C, and processed within 8 h of collection.
28
2.2. Genotoxicity evaluations
2.2.1 Micronucleus Test: MN in exfoliated buccal cells (EBCMN)
Exfoliated buccal cells (EBC) were collected by swabbing the inner cheek of the
individuals, on both sides, with a moistened wooden tongue depressor, at the same time
that was collected the Comet Assay. The sample was directly placed on a slide, and then
was spread as a smear. Prepared slides were air-dried and stained for 7 min with a mixture
of 10 ml Giemsa and 90 ml phosphate buffer (pH 5.8).
The criteria used for micronuclei analysis were those of Tolbert et al. (20) and
Titenko-Holland et al. (21). Only cells that were not clumped or overlapped at smearing
and that contained intact nuclei were included in the analysis. Cells that underwent
degenerative processes producing anomalies that are difficult to distinguish from
micronuclei (binucleated cells, condensed chromatin, ‘broken egg’, pycnosis, karyorrhexis
and karyolysis) were excluded from the micronucleus analysis.
All slides were coded to allow blind analysis. The quality of the slides was
determined at 200X magnification using a bright-field Zeiss microscope. Micronuclei
frequency was estimated based on the number of normal EBC counted using bright-field
optical microscopy at 1000X magnification. For each volunteer, 2000 buccal cells (i.e.
1000 from each of the duplicate slides) were scored.
2.2.2 Comet assay
The alkaline Comet assay was performed as described by Singh et al. (13) with the
modifications suggested by Tice et al. (14), Collins et al. (22), Lovell and Omori (23).
Blood cells (5 µl) were embedded in 95 µl of 0.75% low-melting point agarose, and after
agarose solidified, slides were placed in lysis buffer (2.5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM
Tris; pH 10.0-10.5) containing freshly added 1% (v/v) Triton X-100 and 10% (v/v)
29
dimethyl sulfoxide (DMSO) for a minimum of 1 hour and a maximum of two weeks. After
treatment with lysis buffer, slides were incubated in a freshly-prepared alkaline buffer
solution (300 mM NaOH and 1 mM EDTA; pH >13) for 20 min, and DNA was submitted
to electrophoresis for 20 min at 25 volts (0.90 V/cm) and 300 mA. Following
electrophoresis, slides were neutralized in 400mM Tris (pH 7.5), fixed (15% w/v
trichloroacetic acid, 5% w/v zinc sulfate, 5% glycerol), washed in distilled water, and dried
overnight. Gels were re-hydrated for 5 min in distilled water, and then stained for 15 min
(37˚C) with a solution containing the following sequence: 34 mL of Solution B (0.2% w/v
ammonium nitrate, 0.2% w/v silver nitrate, 0.5% w/v tungstosilicic acid, 0.15% v/v
formaldehyde, 5% w/v sodium carbonate) and 66 mL of Solution A (5% sodium
carbonate). The staining was stopped with 1% acetic acid and the gels were air-dried (24).
Images of 100 randomly selected cells (50 cells from each of two replicate slides) were
analyzed for each individual using a fluorescence microscope equipped with a 12 nm
BP546 excitation filter and a 590 nm barrier filter. Two parameters were evaluated: (1)
damage index (DI), in which each cell was designated to one of five classes (from no
damage = 0, to maximum damage = 4) according to tail size and shape [see figures in
Heuser et al., (15)] - values obtained for each individuals ranged from 0 (0×200) to 400
(4×100); and (2) damage frequency (DF), calculated as the percentage of damaged cells.
International guidelines and recommendations for the Comet assay consider that visual
scoring of comets is a well-validated evaluation method. Although the DI parameter is
subjective, it is highly correlated with computer-based image analysis (14, 25).
2.3 Enzymatic activity: Superoxide dismutase (SOD)
Superoxide dismutase activity was spectrophotometrically determined in serum
samples by measuring the inhibition of auto-catalytic adrenochrome formation rate at
480nm in a reaction medium containing a final concentration of 1mmol/l adrenaline (pH
30
2.0) and 50 mmol/l glycine (pH 10.2) (6), both from E. Merck, with a final pH of 10.0. This
reaction was conducted at a constant temperature of 30ºC for 3 minutes. The enzymatic
activity is expressed as superoxide dismutase units per g of protein. One unit is defined as
the amount of enzyme that inhibits in 50% the rate of adrenochrome formation.
2.4 Hematological evaluations
The hematological evaluation was carried out in a commercial laboratory
(ENZILAB Laboratory, Santa Cruz do Sul-RS, Brazil), according to standard methods.
2.5 Statistical Analysis
The normality of the variables was evaluated using the Kolmogorov-Smirnov test.
χ
2
and t-test were used to compare the basic characteristic of study populations. The
ANOVA- Dunnet was used to compare the parameters analyzed for the groups. The critical
level for rejection of the null hypothesis was considered to be a P value of 5%.
31
3. Results
The main characteristics of the studied groups, exposed and unexposed, are presented
in Table I. The subjects were classified by gender, smokers or non-smokers, and age. Mean
age was not significantly different between groups, and about 40% of agricultural workers
in each group were smokers and none females were smokers.
The main pesticides used by the exposed group are showed in Table II.
The analyzed cytogenetic parameters are presented in Table III and Figures 1, 2, and
3. Figure 1 and 2 show no difference between males and females in the pesticide
unexposed or exposed groups, both in Comet assay and Micronucleus test. Therefore,
samples were shared only between exposed and unexposed workers.
Comet assay analysis showed a significant increase in Damage Index and Damage
Frequency in the exposed group as compared to the unexposed group (~ 5.5 x) (Table III).
The exposed group also presented an increase in the number of BNLMN in exfoliated
buccal cells as compared to the control group (~ 122.2 x). No difference was observed
between smokers and non-smokers.
The Damage Classes in the exposed group are shown in Figure 3. Mainly class 1 was
found.
The variation in Superoxide dismutase activity is shown in Figure 4; the data present
the variation in Sod activity before and after the exposure of the subjects to pesticides.
There was an important increase of activity of this enzyme as compared to the control
group.
Mean hematological parameter values of unexposed and exposed groups, and
reference values are presented in Table IV. In this analysis, the obtained values were
within the normal limits. In the first sample (unexposed group), the number of eosinophils
of two females and one male was higher than the reference values; in the second sample
32
(exposed group), with exception of one subject, all volunteers presented normal eosinophils
values. Nevertheless, significant differences were observed in band neutrophils, monocytes,
mean corpuscular hemoglobin, and mean corpuscular hemoglobin concentration between
the exposed and the unexposed group (P<0.05; t-Student test).
33
4. Discussion
Pesticides are a heterogeneous category of chemicals especially designed to control
pests, weeds, or plant diseases. Pesticide abuse or misuse can lead to significant levels of
exposure, particularly among those occupationally exposed, and the possible cytogenetic
damage caused by these compounds has been investigated by researchers in several
countries. Literature reviews on this subject (3, 18) report that most studies found an
increase in genotoxicity biomonitoring end points in pesticide appliers or users. Working
environment, personal protective equipment, time of exposure and exposure conditions are
described in the literature as factors that may affect cytogenetic damage levels (3).
Pesticide sprayers are the most frequently exposed group of agricultural workers, with
positive findings obtained in 18 of 27 studies, presenting 1.12-7.67 higher exposure rates
(3, 26) than other workers. Our results demonstrated that cytogenetic damage in pesticide-
exposed individuals was about 5-fold higher than in the unexposed group. The agricultural
workers included in this study were exposed to a large number of pesticides, some of which
are classified as hazardous by World Health Organization, such as glyphosate, sethoxydim,
chlorpyrifos, etc. (Table II). All pesticides used by exposed group were previous described
as harmful to DNA (32). No difference between males and females was observed in the
unexposed and exposed groups, as detected both by Comet assay and Micronucleus test.
Costa et al. (28) did not find any significant differences between males and females in CA
and SCE in a recent study.
In a recent review, Bull et al. (18) discussed genotoxicity in pesticide appliers, and
highlighted the importance of using personal protective equipment. In our study, none of
the agricultural workers reported using any protective measures; the Comet Assay and
Micronucleus Test results show significant higher values for the exposed group as
compared to the control group.
34
In addition, results observed in the Comet assay in this study detected recent
repairable lesions, such as breaks and alkali-labile sites , while the observed micronuclei
detected non- repairable damage, such as clastogenic and aneugenic lesions (14, 25, 29).
However, we observed mainly damage classes related to simple strand break [classes 1, 2
and 3; (30)], some reminiscent lesions or incorrect rejoining of the DNA molecules which
could lead to MN formation (31, 29). There is evidence that metal ions present in some
pesticides may interfere with distinct steps of different DNA repair systems and to produce
the reactive oxygen species, leading to DNA oxidative damage (31). However, about 5
months after non-exposure to pesticides, both DNA damage and micronucleus returned to
normal values (Table III).
We also noticed an important increase in the activity of the enzyme Superoxide
dismutase (Figure 4) in the agricultural workers exposed to pesticides. Shadnia et al. (32)
demonstrated that chronic exposure to pesticides was associated with increased SOD
activity. Previous studies have reported that exposure to different categories of pesticides
(organophosphates, carbamates, pyrethroids, etc) leads to oxidative stress in pesticide
sprayers (33).
In conclusion, our study demonstrates the presence of genotoxic effects in blood
cells and exfoliated buccal cells of agricultural workers exposed to pesticides. These
findings appeared during the high exposure period, when pesticide application is more
frequent, sometimes daily. During the low exposure period, when the pesticides are almost
never used, the values detected by Comet assay, Micronucleus test, and Superoxide
dismutase return to values considered as normal. However, it is important to emphasize that
protective measures are essential to avoid potential risks to human health. Our findings
indicate that agricultural workers have higher levels of DNA damage in somatic cells,
suggesting a potential health risk for these workers. Risk assessment of pesticide users is
35
crucial to prevent long-term health hazards leading to the development of cancer and other
degenerative diseases.
5. Acknowledgements
The authors express their gratitude to all the individuals who were volunteered to
participate in this study. This study was only possible with the help of ENZILAB
Laboratory Santa Cruz do Sul (RS, Brazil), Silvane de Melllo e Clarice Maria de Araújo
Hochscheid (Communitary Health Agents). This work was financially supported by
ULBRA – Canoas and by the Authors.
36
Table I. Characteristics of study population.
Unexposed group Exposed group
No. of subjects 22 19
Age (in years) [mean±SD;
(range)]
39.22±13.38; (17-62)
42.89±12.55; (24-63)
Gender 13 males, 9 females 13 males, 6 females
Smokers
a
(%)
13 (59.09%) 11 (57.89%)
Non-smokers (%)
9 (40.90%) 8 (42.10%)
S.D.= standard deviation;
a
smoking 5 or more cigarettes per day.
37
Table II. List of pesticides used by exposed group.
Pesticides Compounds Chemical class
Fungicides
Mancozeb Dithiocarbamate
Propinebe Carbamate
Iprodione Dicarboximide
Insecticides
O,S- Dimethyl
acethylphosphoramidothiate
Organophosphorate
Chlorpyrifos Organophosphorate
Imidachlopride Neonicotinoid
Carbofuran Carbamate
Deltamethrin Pyrethoid
Herbicides
Glyphosate Organophosphorate
Sethoxydim Organophosphorate
Clomazone Isoxazolidinone
Pendimethalin Dinitroaniline
38
Table III. Mean values (mean ± S.D.) obtained in the cytogenetic analysis in unexposed and exposed groups.
Group Comet assay (100 leukocytes/subject)
Damage Index (n) Damage Frequency (n)
MN in Exfoliated buccal cells
(2000 cell/subject) (n)
Unexposed
9.40 ± 8.39(22) 5.86 ± 4.82 (22) 0.04±0.21(22)
Smokers
11.55 ± 10.01 (9) 7.35 ± 5.37 (9) 0 ± 0 (9)
Non-smokers
7.92 ± 7.11 (13) 5.15 ± 4.48 (13) 0.08 ± 0.3 (13)
Exposed
50.82 ± 20.83* (19) 33.78 ± 9.35* (19) 4.89 ± 4.24(19)*
Smokers
42.37 ± 24.57 (8) 29.62 ± 10.75 (8) 2.75 ± 2.18 (8)
Non-smokers
55.54 ± 19.20 (11) 35.81 ± 9.14 (11) 6.45 ± 4.76 (11)
*Significant difference as compared to the control group (unexposed) at P < 0.001 (ANOVA, Dunnet).
39
Table IV. Mean values of hematological parameters (± S.D.) analyzes of unexposed and exposed groups to pesticides.
Parameters
Unexposed group Exposed group
Reference values
Hematocrit
44.17±3.50 42.71±3.95
12.80-17.80 %
Hemoglobin
14.22±1.18 14.51±1.43
39.0-53.0 g/dl
White blood cells
6872.72±1794.74 6621.05±1780.94
3.600-11.500/mm
3
Band neutrophils
2.68±1.08 1.78±1.31*
0-5%
Segmented neutrophils
62.7±6.57 60.57±7.52
45-70%
Eosinophils
5.40±11.40 2.94±3.36
1-7%
Basophils
0.00±0.00 0.05±0.22
0-3%
Lymphocytes 30.22±6.61 29.84±6.90
20-50%
Monocytes
1.31±0.64 4.78±1.35*
2-10%
Red blood cells
4.87±0.31 4.74±0.32
4.50-6.10 million/mm
3
Mean Corpuscular Volume
90.51±3.22 89.81±3.15 80.00-98.00µ
3
Red cell Distribution Width
12.65±0.52 12.70±0.51
Max. 15.00%
Platelets
206,545.5±47,336.41 233,894.7±50,094.24
150,000-450,000/mm
3
S.D.= standard deviation. *Significant difference as compared to the control group (unexposed) at P < 0.05 (t-test).
40
Female Male Female Male
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Damage Index (0-400)
Unexposed
Exposed
*
*
(A)
Female Male Female Male
0
10
20
30
40
50
Damage Frequency (%)
Unexposed
Exposed
*
*
(B)
Figure 1. Mean and standard deviation of Damage Index (A) and Damage Frequency
(B) in peripheral leukocytes of unexposed and exposed groups to pesticides, both males
and females. *Significant difference as compared to the respective gender (unexposed)
at P < 0.001 (ANOVA, Dunnet).
41
42
Female Male Female Male
0
1
2
3
4
5
6
7
Micronucleus/Exfoliated buccal cells
Unexposed
Exposed
*
*
Figure 2. Mean and standard deviation of micronucleus in exfoliated buccal cells of
unexposed and exposed groups to pesticides, both males and females. *Significant
difference as compared to the respective gender (unexposed) at P < 0.001 (ANOVA,
Dunnet).
.
43
0 1 2 3 4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Damage Classes
Frequency (%)
Figure 3. Mean and standard deviation of damage classes in blood cells to exposed
group.
44
Unexposed Exposed
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
*
Groups
Sod (Usod/g protein)
Figure 4. Results of oxidative stress markers analyzed in the unexposed and exposed
groups (before and after exposition to pesticides). * Significant at P<0.01 in relation to
control (unexposed group); t-Student Test.
45
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49
IV DISCUSSÃO
O Brasil vem utilizando agrotóxicos em escala crescente. Apesar do uso
extensivo o conhecimento de seus riscos para a saúde associada à exposição prolongada
é relativamente pobre, e incertezas ainda existem. Diferentes estudos indicam que vários
destes compostos induzem mutações, alterações cromossômicas e/ou dano ao DNA
(BOLOGNESI, 2003).
Seu uso em excesso e/ou utilização inadequada pode levar a níveis significativos
de exposição, particularmente entre os indivíduos ocupacionalmente expostos, sem
proteção adequada, e o dano citogenético desencadeado por estas substâncias tem
recebido a atenção de pesquisadores de vários países. Os efeitos sobre a saúde humana
decorrentes da exposição a agentes genotóxicos podem ser imediatos ou tardios,
desencadeando mutações e/ou câncer. A revisão da literatura sobre este assunto mostra
que vários estudos encontraram um aumento dos biomarcadores de genotoxicidade em
aplicadores de agrotóxicos (BOLOGNESI, 2003; BULL et al., 2006). Biomarcadores
são definidos como uma resposta biológica a um ou vários compostos químicos que
fornecem dados sobre a exposição e, algumas vezes também, sobre efeitos tóxicos em
nível de suborganismos ou organismos (GUARANTINI et al, 2008). O ambiente de
trabalho, o uso ou não de equipamentos de proteção individual, o tipo de agrotóxico, o
tempo e as condições de exposição são descritos na literatura como fatores capazes de
afetar os níveis de dano citogenético (BOLOGNESI, 2003). Outras variáveis que
influenciam na resposta aos agrotóxicos são idade, tabagismo, consumo de bebidas
alcoólicas, uso de medicamentos, suscetibilidade individual, etc. Como as alterações
genotóxicas induzidas por estas substâncias não afetam apenas um indivíduo, sua
detecção precoce reveste-se de importância. Os aplicadores de agrotóxicos constituem o
50
grupo de agricultores mais frequentemente exposto, com resultados positivos obtidos
em 18 de 27 estudos, apresentando níveis de exposição 1,12-7,67 vezes maior
(BOLOGNESI, 2003; JOCSIK et al., 1997). O biomonitoramento através dos testes de
genotoxicidade constitui uma valiosa ferramenta de avaliação e controle dos danos
citogenéticos derivados de uma exposição a uma complexa mistura de produtos
químicos. Nossos resultados demonstraram cerca de cinco vezes mais danos para o
grupo exposto do que para o grupo controle, no Ensaio Cometa. Os agricultores
incluídos neste estudo estiveram expostos a um grande número de pesticidas, alguns dos
quais classificados como perigosos pela Organização Mundial da Saúde, como por
exemplo glifosato, setoxidin, clorpirifós, acefato, etc. Todos os pesticidas usados pelo
grupo exposto foram previamente descritos como prejudiciais ao DNA (MARONI et al.,
2000). Não foram encontradas diferenças significativas entre homens e mulheres nos
grupos exposto e controle, no Ensaio Cometa e no Teste de Micronúcleos. Costa et al.
(2006) não encontraram diferenças entre homens e mulheres em aberrações
cromossômicas e troca de cromátides irmãs em um estudo recente.
Em uma revisão recente, Bull et al. (2006) estudaram a genotoxicidade em
aplicadores de pesticidas e evidenciaram a importância do uso de equipamentos de
proteção individual. Em nosso estudo, nenhum dos agricultores referiu usar medidas de
proteção. Nossos resultados do ensaio Cometa e do Teste de Micronúcleos apresentam
valores para o grupo exposto que são significativamente maiores do que os valores do
grupo pré-exposição.
Os resultados observados para o Ensaio Cometa neste estudo detectaram lesões
recentes que podem ser reparadas, como quebras e sítios álcali-labeis, enquanto que os
micronúcleos detectaram lesões não reparadas, com as clastogênicas e aneugênicas
(TICE et al., 2000; COLLINS et al., 2008; IARMARCOVAI et al., 2008). Entretanto,
51
nós observamos principalmente classes de danos relacionadas com quebras simples
(classes 1, 2 e 3), algumas lesões remanescentes ou reparos incorretos do DNA que
podem levar à formação de micronúcleos (IARMARCOVAI et al., 2008).
Há evidências de que íons metálicos, presentes em alguns pesticidas, poderiam
interferir em etapas distintas dos diversos sistemas de reparo do DNA e produzir
Espécies Reativas de Oxigênio (ERO), levando ao dano oxidativo do DNA (VIDELA et
al., 2003). Apesar disso, no período de baixa exposição, quando os pesticidas quase não
são usados, ambos os valores de lesões no DNA e os micronúcleos voltam aos níveis
normais, indicando que estas alterações poderiam ser reparadas (Tabela III). Os
resultados referentes à hematologia não demonstraram alterações significativas. Foi
observado um aumento na hemoglobina corpuscular média (MCH) e na concentração de
hemoglobina corpuscular média (MCHC) em alguns indivíduos do grupo exposto,
porém estas alterações não têm significado clínico. Dois indivíduos de cada grupo
apresentaram elevação nos valores de eosinófilos; estes achados podem ser encontrados
em reações alérgicas e parasitoses intestinais e não tiveram significância neste estudo
(FAILLACE, 2003).
Observamos também um importante aumento na atividade da enzima
Superóxido dismutase (Figura 4), em agricultores expostos aos agrotóxicos. A
Superóxido dismutase é uma enzima antioxidante presente em todos os organismos
aeróbicos e catalisa a dismutação do radical superóxido. Antioxidantes podem ser
definidos como substâncias químicas que inibem o processo de oxidação ou diminuem
significativamente a oxidação de um substrato (ABDALLA & FAINE, 2008). Shadnia
et al., (2005) demonstraram que a exposição crônica aos agrotóxicos estava associada
com o aumento da atividade da SOD. Estudos prévios têm relatado que a exposição
ocupacional a diferentes categorias de agrotóxicos, bem como à combinação de mais de
52
um tipo de composto químico, (organofosforados, carbamatos, piretróides, etc) leva ao
estresse oxidativo em agricultores que fazem a aplicação destes (PRAKASAM et al.,
2001).
Nosso estudo demonstrou a presença de efeitos genotóxicos em células do
sangue periférico e em esfregaço de mucosa oral em agricultores expostos aos
agrotóxicos. Estes resultados acontecem no período de maior exposição, quando a
aplicação de agrotóxicos é mais freqüente, muitas vezes diária. No período de menor
exposição (entressafra), quando os agrotóxicos quase não são usados, os valores
detectados pelo Ensaio Cometa, teste de Micronúcleos e Superóxido dismutase voltam a
valores que podem ser considerados normais. Entretanto, é necessário enfatizar que
medidas de proteção são essenciais para evitar riscos à saúde humana. Nossos achados
indicam que os agricultores têm aumento dos níveis de lesões de DNA em células
somáticas, sugerindo que a exposição ocupacional aos agrotóxicos é um importante
fator de risco à saúde dos trabalhadores na fumicultura. O reconhecimento dos riscos do
manuseio e do excesso de exposição aos agrotóxicos, sem proteção adequada, é muito
importante para prevenir e/ou evitar riscos à saúde, pois as alterações genotóxicas e o
estresse oxidativo podem levar ao desenvolvimento de câncer ou outras doenças
degenerativas.
53
V CONCLUSÕES
A avaliação dos efeitos genotóxicos e mutagênicos dos pesticidas utilizados na
fumicultura é um importante instrumento para determinar os riscos biológicos a que
estão expostos os agricultores. Nosso estudo permitiu concluir que:
a) foi verificado nos agricultores em período de maior exposição genotoxicidade através
do Ensaio Cometa e mutagenicidade através do Teste de Micronúcleos no sangue
periférico;
b) houve um importante aumento da atividade da enzima Superóxido dismutase no
grupo exposto aos agrotóxicos, demonstrando estresse oxidativo;
c) não foram observadas diferenças significativas para os diferentes testes entre homens
e mulheres expostos;
d) em períodos em que não há aplicação de agrotóxicos os resultados dos testes de
genotoxicidade e de estresse oxidativo retornam a valores dentro dos limites da
normalidade. Isto permite sugerir que os mecanismos de reparo conseguem corrigir os
efeitos deletérios dos agrotóxicos utilizados pelos agricultores deste estudo;
e) nenhum agricultor referiu utilizar equipamentos de proteção individual (EPIs), como
luvas, máscara, óculos ou roupas adequadas a essa atividade, o que deve ter contribuído
para as respostas observadas;
f) não foram encontradas alterações significativas nos parâmetros hematológicos
estudados.
54
VI PERSPECTIVAS
Para se obter mais informações sobre os danos causados pela exposição aos
agrotóxicos em fumicultores, seria de grande importância:
• avaliar os efeitos dos agrotóxicos em diferentes períodos de utilização, antes,
durante e após a aplicação destes, correlacionando com genes de
suscetibilidade em metabolização e reparação do DNA;
• elaborar uma estratégia de divulgação científica junto aos agricultores de
Santa Cruz do Sul, buscando uma conscientização destes quanto a
importância do uso dos equipamentos de proteção individual.
55
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