ads:
UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E TOXICOLOGIA
APLICADA
ESTUDO DA TOXICIDADE GENÉTICA ASSOCIADA A COMPOSTOS
UTILIZADOS PARA O TRATAMENTO DA HIPERPLASIA PROSTÁTICA
BENIGNA: FINASTERIDA, DOXAZOSINA E SAW PALMETO
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Genética e Toxicologia
Aplicada – Ênfase em Farmacologia e
Toxicologia.
Katiane Cella Gabriel
Orientadora: Dra. Heloísa Helena Rodrigues de Andrade
CANOAS
Maio/2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
Este trabalho foi desenvolvido no
Laboratório de Toxicidade Genética
(TOXIGEN) do Programa de Pós-
Graduação em Genética e Toxicologia
Aplicada da Universidade Luterana do
Brasil, subvencionado pela Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio
Grande do Sul (FAPERGS), Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq) e Universidade
Luterana do Brasil (ULBRA).
ads:
3
AGRADECIMENTOS
À professora Heloísa, a Helô, pela confiança, pelo incentivo nos
momentos difíceis e pelo imenso conhecimento transmitido.
A todo pessoal do laboratório Toxigen da Ulbra, pela ajuda em tudo e
companheirismo em todas as horas.
Aos queridos amigos Rafael e Viviane, pela paciência e
disponibilidade de explicar tudo de novo.
A todos os colegas do Programa de Pós Graduação em Genética e
Toxicologia Aplicada, juntos nas horas boas e força nas horas difíceis.
À Fernanda, secretária do Programa. Amiga nos momentos difíceis e
decisivos.
Às minhas cunhadas, cunhados e sobrinhos pela força e incentivo
inesgotáveis.
Ao meu irmão Willyans, pelo exemplo de vida, persistência e luta
pelos ideais.
Aos meus pais, Luizinho e Leodete, meu porto seguro. Apoio
incondicional nas minhas decisões.
Ao meu marido, Dinis, pela compreensão em todas as vezes que
ouvia “Agora não posso, preciso estudar”. Se isto foi possível é porque
sempre esteve ao meu lado incentivando, mesmo em silêncio.
À minha filha, Elisa, minha princesinha. Mesmo pequena entendendo
que a mamãe precisava viajar para estudar, mas que voltaria logo.
A todos os meus amigos, principalmente às meninas, entendendo
que um dia terminaria as longas horas de estudo e os encontros voltariam
ao normal.
À toda minha família pelo incentivo e as boas horas de distração.
À Deus, pela benção diária, pela força divina, pelo dom da vida.
4
ÍNDICE
RESUMO .........................................................................................06
ABSTRACT.......................................................................................08
1. INTRODUÇÃO...............................................................................10
1.1 ALFA BLOQUEADORES ADRENÉRGICOS .....................................12
1.2 INIBIDORES DA 5α REDUTASE .................................................13
1.3 FITOTERÁPICOS ( SAW PALMETO)... .........................................15
1.4 TOXICIDADE GENÉTICA ...........................................................17
2. OBJETIVOS ..................................................................................19
3. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................20
3.1 AGENTES QUÍMICOS ...............................................................20
3.2 TESTE SMART.........................................................................20
3.2.1 LINHAGENS UTILIZADAS.................................................21
3.2.2 CRUZAMENTOS ..............................................................22
3.2.3 TRATAMENTOS...............................................................22
3.2.4 ANÁLISE MICROSCÓPICA ................................................23
3.2.5 BASES GENÉTICAS .........................................................23
3.2.5.1 ADULTOS TRANS- HETEROZIGOTOS ......................23
3.2.5.2 ADULTOS HETEROZIGOTOS TM3 ...........................24
3.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA....................................................25
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................26
5
4.1 CONTROLES ...........................................................................26
4.2 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE GENÉTICA.....................................27
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................35
6
RESUMO
A hiperplasia prostática benigna (HPB) é o tumor mais comum entre
os homens com idade superior aos 40 anos, caracterizando-se por
sintomas como polaciúria, tenesmo, noctúria, pressão e sensação de
esvaziamento incompleto da bexiga. A terapia medicamentosa da HPB
utiliza alfa bloqueadores adrenérgicos (doxazosina mesilato), inibidores da
5α redutase (finasterida), assim como fitoterápicos como o saw palmeto –
sendo uma alternativa ao procedimento cirúrgico, já que garante a
melhoria da qualidade de vida dos pacientes.
A pouca informação sobre a ação tóxico genética destes
medicamentos nos levou a avaliá-los como indutores de diferentes tipos de
lesões no material genético - utilizando o Teste para Detecção de Mutação
e Recombinação em Células Somáticas de Drosophila melanogaster
(SMART). As drogas foram testadas em pelo menos três diferentes
concentrações, que apresentaram, em teste piloto, mortalidade inferior a
50%: finasteride ( 1,0, 2,0 e 4,0 mg/ml); doxazosina mesilato (1,0, 2,0 e
4,0 mg/ml) e saw palmeto (20,0, 40,0, 80,0 e 160,0 mg/ml).
A finasterida não induziu lesões do tipo mutação gênica,
cromossômica, bem como eventos relacionados à recombinação mitótica –
podendo ser considerada como uma substância destituída de ação
genotóxica, nas condições experimentais empregadas. Por outro lado, a
doxazosina e o saw palmeto induzem aumentos significativos no total de
manchas nas moscas trans-heterozigotas. Para estabelecer a real
contribuição de recombinação mitótica e da mutação para a ação
genotóxica total foram analisados os imagos heterozigotos TM3 - sendo
obtidas respostas não estatisticamente significativas, para ambas as
drogas.
7
Os nossos dados sugerem que ambos os medicamentos induzem
especificamente recombinação homóloga em células proliferativas de
Drosophila. Apontam também para o risco da sua utilização, uma vez que
a recombinação homóloga está diretamente vinculada a perda do estado
heterozigoto ou à indução de rearranjos genéticos, responsáveis pela
gênese de inúmeras doenças genéticas, incluindo o câncer.
8
ABSTRACT
Benign prostatic hyperplasia (BPH) is the most common tumor in
men over 40 years of age. Pollakuria, tenesmus, nocturia and the
sensation of uncompleted bladder discharge are typical symptoms of BPH.
Drug therapy includes the use of adrenergic alpha-blockers (doxazosin
mesylate), 5-reductase inhibitors (finasteride), as well as of
phytoterapeutic compounds such as saw palmetto. Alternatively, surgical
intervention is also considered, as the treatment approach guarantees
quality of life to patients.
The paucity of information available about the genotoxic action of
these drugs led us to assess their activity as inducers of different types of
lesions in the genetic material using the Somatic Mutation and
Recombination Test in Drosophila melanogaster (SMART). The drugs were
tested in at least three concentrations that led to mortality results below
50% in a pilot assay: finasteride (1.0, 2.0, and 4.0 mg/ml); doxazosin
mesylate (1.0, 2.0, and 4.0 mg/ml); and saw palmetto (20.0, 40.0, 80.0
and 160.0 mg/ml).
Finasteride did not induce mutagenic lesions, chromosomal mutation
lesions, or mitotic recombination lesions, and may be considered without
genotoxic action in the experimental conditions chosen. On the other
hand, doxazosin mesylate and saw palmetto induced significant increases
in spot frequencies in trans-heterozygous flies. In order to establish the
actual role played by mitotic recombination and by mutation in total
genotoxic action, TM3 heterozygous imagoes were analyzed, though
without statistically significant results for both drugs.
Our data indicate that doxazosin mesylate and saw palmetto are
specific inducers of homologous recombination in Drosophilla somatic cells.
The results obtained in the present study also point to the risk in using the
9
drugs, as homologous recombination is directly linked to loss of
heterozygosity or to the induction of genetic rearrangements, which are
events held responsible for numerous genetic diseases, including cancer.
10
1. INTRODUÇÃO
A hiperplasia prostática benigna (HPB) é o tumor benigno mais
comum no homem, com manifestação próxima aos 40 anos. Cerca de
90% dos pacientes com idade acima dos 65 anos é acometido por esta
hiperplasia, embora apenas 50% destes desenvolvam sintomas do trato
urinário - que não são obrigatoriamente específicos da HPB ou do sexo
masculino. Os principais sinais de obstrução da HPB são hesitação para
começar o jato urinário, jato fraco ou intermitente e gotejamento terminal
da urina. Cerca de 80% dos pacientes também apresentam sintomas
irritantes, como polaciúria, tenesmo, noctúria, pressão e sensação de
esvaziamento incompleto da bexiga (Manes et al., 2001; Schulz et al.,
2002).
O mecanismo fisiopatológico da HPB é atribuído a dois fatores:
mecânico (anatômico) e dinâmico (funcional). O fator mecânico está
relacionado à ampliação da massa prostática adenomatosa, principalmente
na área peri-uretral. Já o dinâmico deve-se ao aumento do tônus da
musculatura lisa, por ampliação da intensidade da ação simpática na
cápsula prostática e no colo vesical - locais ricos em receptores α-
adrenérgicos (Manes et al., 2001). A obstrução do fluxo urinário
decorrente da hiperplasia prostática benigna pode acarretar manifestações
clínicas relacionadas ao crescimento progressivo da próstata. Tais
sintomas se expressam como obstrução associada ao estreitamento da
uretra prostática e irritação durante a micção, que é decorrente da
instabilidade do detrusor vesical. Sua história natural transcorre com fases
de melhora e de exacerbação, não havendo constância das manifestações
clínicas (Arap e Góes, 2000).
11
A etiologia e a patogênese da HPB não foram completamente
compreendidas, embora seja geralmente considerada como um distúrbio
endócrino de homens mais velhos, causado por alterações do equilíbrio
hormonal associado ao envelhecimento. A hipótese mais largamente
apoiada relaciona-se ao aumento da síntese prostática de
diidrotestosterona, acompanhado por níveis maiores de estrógeno. Outra
possibilidade seria a associação entre a transformação do tecido prostático
e a perda da habilidade de ligação da globulina ao hormônio sexual
(GLHS). Entretanto, deve ser levado em consideração que o
envelhecimento causa aumento da GLHS , sendo também comum em
pacientes idosos que não manifestam sintomas de HPB. Há ainda a
alternativa de que níveis elevados de mediadores inflamatórios
(prostaglandinas e leucotrienos) possam ser parcialmente responsáveis
pelo desenvolvimento da HPB (Schulz et al., 2002).
A glândula prostática adulta pesa aproximadamente 20 ± 6 gramas
(Figura 1.a), enquanto a com hiperplasia pode variar de 40 a 400 gramas
(Figura 1.b). A exata fisiopatologia da HPB é pouco clara. A primeira
alteração histológica está relacionada as células do estroma, reguladas
pelo sistema nervoso adrenérgico . De fato, no tecido muscular prostático,
o receptor prevalente é o do subtipo α1-adrenérgico (Chagas et al., 2001;
Logan e Belgeri, 2005).
O tratamento da HPB é indicado para pacientes sintomáticos, cujo
prostatismo tenha impacto sobre a qualidade de vida. Estima-se que em
torno de 80% dos pacientes portadores de HPB prefiram o tratamento
medicamentoso à cirurgia (Diaz, 2003). A abordagem terapêutica
medicamentosa da HPB inclui fármacos que reduzem o tônus da
musculatura lisa prostática ou as dimensões da próstata (Arap e Góes,
2000). Agentes farmacológicos - incluindo bloqueadores α-adrenérgicos
12
(α-bloqueadores), inibidores da 5α redutase (terapia hormonal) e
fitoterápicos (Saw palmeto) - são as drogas de escolha mais comuns
(Logan e Belgeri, 2005).
1.a) PRÓSTATA NORMAL 1.b) PRÓSTATA COM HPB
FIGURA 1: FIGURA ILUSTRATIVA DE UMA PRÓSTATA NORMAL E PRÓSTATA COM
HPB ( http://www.uro.com.br/hpb.htm) .
1.1 ALFA BLOQUEADORES ADRENÉRGICOS
Medicamentos que atuam por bloqueio de receptores α-adrenérgicos
diminuem a obstrução da uretra por relaxamento da musculatura
prostática. Atualmente, sabe-se que 30 a 70% dos homens com HPB
evoluem para remissão dos sintomas durante o curso da doença, mesmo
sem qualquer tratamento. No entanto, a chance de melhora varia de 59%
a 86% quando do uso de α-bloqueadores adrenérgicos - já que estes
atenuam a obstrução da via de saída vesical, diminuindo o tônus muscular
do colo vesical e da cápsula prostática (Manes et al., 2001).
13
A doxazosina mesilato (Figura 2) é um α-bloqueador adrenérgico do
subtipo 1
A,
, que reduz a resistência vascular prostática. De fato, de todos
os subtipos presentes na próstata, 70% são do subtipo 1
A
(Arencibia et al.,
2005), o que justifica a sua ampla utilização no tratamento da HPB.
Apresenta boa absorção por via oral (~95%), assim como
biodisponibilidade plasmática em até duas horas. Tem alto poder de
ligação protéica, com meia-vida plasmática em torno de 22 horas, o que
permite o regime de dose única diária. É metabolizada pelo fígado,
originando metabólitos farmacologicamente inativos, que são excretados
pelas fezes. Embora esta droga não induza efeitos teratogênicos, observa-
se morte fetal em animais expostos a altas doses – equivalentes a 300
vezes a dose máxima recomendada em humanos (Lapa et al., 2004).
Figura 2: ESTRUTURA MOLECULAR DA DOXAZOSINA
(http://www.neurosci.pharm.utoledo.edu/MBC3320/images/Doxazosin.gif.) .
1.2 INIBIDORES DA 5α
αα
α REDUTASE
O principal androgênio com ação prostática é a dihidrotestosterona
(DHT), obtida pela conversão da testosterona - via 5α redutase presente
nas células prostáticas. A finasterida (Figura 3) é um inibidor competitivo e
específico desta enzima, que não possui afinidade pelo receptor
androgênico - e, conseqüentemente não tem efeito androgenético,
14
antiandrogenético, estrogênico, antiestrogênico ou progestacional. A
finasterida inibe a ação da 5α redutase, o que impede a conversão
periférica da testosterona em dihidrotestosterona e leva a diminuição do
tamanho da próstata, a partir das primeiras 24 horas do início do
tratamento (Rhoden et al., 2000; Logan e Belgeri, 2005).
Figura 3: ESTRUTURA MOLECULAR DA FINASTERIDA (http://www.chem-
online.org/.../finasteride.htm).
A finasterida é bem absorvida por via oral (~ 63%) atingindo
biodisponibilidade plasmática em 2 horas e efeito máximo por volta de 8
horas após a ingestão, com meia vida de até 30 dias. Possui taxa de
ligação proteica em torno de 90%, sendo metabolizada pelo fígado e
eliminada por excreção intestinal (Rhoden et al., 2000). Estudos clínicos
de longo prazo, em pacientes tratados com 5 mg/dia de finasterida,
demonstraram que a supressão da DHT foi associada à acentuada
regressão do volume prostático, aumento no fluxo urinário máximo e
melhora dos sintomas gerais e obstrutivos.
Ratos tratados por 24 meses, com doses de finasterida 3.200 vezes
maiores que as recomendadas para o homem, não apresentaram
desenvolvimento de tumores malignos, ainda que estudo semelhante com
15
camundongos tenha evidenciado aumento estatisticamente significativo
na incidência de adenoma de célula testicular de Leydig. A finasterida não
foi capaz de induzir mutações pontuais em bactérias, assim como
mutações cromossômicas em culturas de células de mamíferos. Ao
mesmo tempo evidências experimentais apontam para a incapacidade
deste composto induzir aberração cromossômica em camundongos –
mesmo quando foram usadas doses 2.500 vezes superiores a
recomendada para o homem
(http://www.merck.com.br/index.php?link=consumidores_genericos_finasterida_5mg.ph
p).
1.3 FITOTERÁPICO (SAW PALMETO)
O extrato lipido-esterólico de uma pequena palmeira em leque
[Serenoa repens ( Arecaceae)], conhecida como saw palmeto ou sabal
vem sendo utilizado desde o início do século XX, em função das suas
propriedades antiedematosa em animais e estrogênica em humanos. Este
extrato é capaz de agir sobre o metabolismo das prostaglandinas, em
cultura de células prostáticas, modulando a ação da 5α redutase humana
(Arap e Góes, 2000). Em seu extrato etanólico foram detectados ácidos
graxos como: cáprico, caprílico, láurico e mirístico. Estão também
presentes os ácidos palmítico, esteárico, oleico, linoleico e linolênico, além
de esteróis - campesterol, stigmasterol, β-sitosterol e cicloartenol. Esta
mistura complexa também contém álcoois alifáticos- com estrutura
composta por 26 a 30 carbonos - flavonóides, glicose, galactose,
arabinose, ácido urônico e alguns polissacarídeos. Os fitoesteróis, em
particular o β-sitosterol e o stigmasterol, parecem inibir a atividade da
enzima 5α redutase, apresentando afinidade pelo receptores androgênicos
16
citossólicos da DHT – o que resulta na diminuição da exposição das células
prostáticas à estimulação hormonal. Adicionalmente o extrato
lipoesterólico da S. repens pode influenciar a síntese dos metabólitos
inflamatórios do ácido araquidônico, através da inibição dose-dependente
das atividades da ciclooxigenase(COX) e lipoxigenase. Este extrato possui
também compostos antagonistas de α-adrenoreceptores e bloqueadores
de cálcio, o que poderia explicar seu efeito benéfico sobre o trato urinário
e a redução dos sintomas urológicos (Yunes et al. 2001). As preparações
comerciais contêm apenas extratos lipofílicos, obtidos por extração com
hexano ou dióxido de carbono líquido, que atuam como inibidores da 5α
redutase (Nemecz, 2004).
Figura 4: PLANTA ADULTA DE SAW PALMETO
(http://www.pharmacy.utas.edu.au/.../sawpalmetto.htm).
Cerca de 92% dos pacientes portadores de HPB, tratados com o
extrato lipido-esterólico de Serenoa repens – 160mg administrado duas
vezes ao dia - mostraram melhora significativa na sintomatologia, sem
efeitos colaterais importantes (Arap e Góes, 2000).
17
1.4. TOXICIDADE GENÉTICA
Apesar do grande avanço tanto no conhecimento do processo
carcinogênico quanto no desenvolvimento de novas terapias para o seu
combate, a mortalidade associada ao câncer é ainda muito alta (Jemal et
al., 2002). Dentre os inúmeros fatores envolvidos na etiologia do câncer
destacam-se a predisposição genética, a exposição a mutágenos e
carcinógenos - que incluem agentes naturais, químicos, radiação e tipos
específicos de vírus – assim como o estilo de vida e os hábitos
alimentares. O papel crucial da alimentação sobre o surgimento desta
doença é comprovado por dados epidemiológicos, mostrando que 80% dos
casos de câncer de cólon estão associados a uma alimentação incorreta.
Esta associação é computada também para os cânceres em geral,
mostrando valores próximos a 35% - podendo chegar a 60%, quando
somados ao consumo de cigarro e álcool. Ainda dentro deste panorama
destaca-se a contribuição da predisposição genética, representada por
20%, assim como os carcinógenos ambientais apontados como os mais
potentes agentes envolvidos na etiologia desta enfermidade (Reddy et al.,
2003).
Em nível molecular, os agentes mutagênicos interagem com o DNA
das células somáticas, causando lesões que podem alterar as células ou os
tecidos, contribuindo de maneira significativa para o aparecimento de uma
série de doenças genéticas (Bridges et al., 1990; Karsten e Krypsin-
Sorensen, 1988; Kirkwood, 1989; Fearon e Vogelstein, 1990). Desta
forma, mutações e/ou alterações genômicas somáticas acabam por
interferir sobre a variabilidade genética das populações, por alterarem
parâmetros relacionados tanto com o sucesso reprodutivo, como com a
18
taxa de mortalidade das espécies. Podem também promover mudanças
nas freqüências alélicas, não apenas por seleção de um loco que confere
resistência a ambientes poluídos, mas também pela fixação, em pequenas
populações, de alelos deletérios (Richard, 1994).
Na verdade, a grande maioria dos estudos epidemiológicos,
realizados até o final dos anos 80, mostrava uma alta correlação entre
presença de lesões mutagênicas e/ou clastogênicas e carcinogênese.
Entretanto, na última década descobriu-se que muitos agentes que
participam das etapas de iniciação ou promoção de tumores malignos, não
induzem tais tipos de danos (Richard, 1994). Estes achados impulsionaram
a criação de ensaios genéticos específicos, visando detectar um outro
parâmetro genético: a recombinação. De fato, a partir deste novo
enfoque, foi possível demonstrar que muitos compostos capazes de lesar o
DNA agem como promotores de eventos recombinacionais mitóticos. Estas
observações salientam a relevância da utilização de bioensaios específicos,
capazes de detectar a indução de permuta mitótica, ao invés de assumir
que testes de mutagenicidade podem fazê-lo de maneira adequada – como
é o caso de Teste para Detecção de Mutação e Recombinação Mitótica
(SMART) em Drosophila melanogaster.
2. OBJETIVOS
O principal objetivo do tratamento do paciente com HPB é à
melhora da qualidade de vida, realizada através de uma abordagem
19
terapêutica que pode incluir - drogas que atuam como bloqueadoras
adrenérgicas (doxazosina), inibidoras da 5α redutase (finasterida) - ou
ainda fitoterápicos, como é o caso do saw palmeto. A investigação da
presença de agentes tóxicos para o material genético é uma realidade que
deve ser considerada devido à relação existente entre fatores etiológicos
externos ao organismo e o desenvolvimento do câncer, baseado no caráter
de risco genético no desenvolvimento de neoplasias malignas. Para tanto,
a identificação e a implementação de medidas de controle que visam
reduzir a exposição humana a estes compostos é imprescindível.
A quase ausência de informações referentes a ação tóxico genética
destes medicamentos nos levou a avaliá-los como indutores de diferentes
tipos de lesões no material genético - utilizando o Teste para Detecção de
Mutação e Recombinação em Células Somáticas de Drosophila
melanogaster (SMART).
Dentro deste contexto pretende-se obter resultados:
• qualitativos da ação mutagênica, clastogênica e/ou
recombinogênica dos produtos em estudo;
• quantitativa da contribuição da recombinação mitótica e da
mutação – gênica e/ou cromossômica – para a genotoxicidade
total.
20
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 AGENTES QUÍMICOS
Foram avaliados três medicamentos utilizados no tratamento
da HPB: doxazosina mesilato (CAS 77883-43-3) Galena Química e
Farmacêutica, Campinas – SP; finasterida (CAS 98319-26-7) e saw
palmeto (extrato seco), DEG Importação de Produtos Químicos, São Paulo-
SP. Durante os testes, os medicamentos foram diluídos em solução de
Tween 80 a 5% para obtenção das diferentes concentrações empregadas.
Para cada composto testado foram realizados dois experimentos
independentes, que incluíram os respectivos controles negativos (Tween
80 a 5%).
3.2 TESTE PARA DETECÇÃO DE MUTAÇÃO E RECOMBINAÇÃO EM
CÉLULAS SOMÁTICAS DE DROSOPHILA MELANOGASTER (SMART)
Neste ensaio genético, a amostra a ser analisada entra em contato
com as células dos discos imaginais presentes na larva, que proliferam até
se diferenciarem, durante a metamorfose, em estruturas das asas da mosca
adulta. A análise dos possíveis danos causados é feita pela observação de
grupos celulares (manchas) com fenótipo marcador específico (flr
3
e/ou
mwh), que se manifestam visualmente na forma de tricomas mutantes.
Estes fenótipos expressam-se devido à perda da heterozigose, induzida
pelos diferentes tipos de eventos genotóxicos abaixo citados. Enquanto o
número de manchas fornece resultados quantitativos sobre os danos
induzidos, os tipos de manchas dão informações sobre a natureza da lesão
21
que as originou. Manchas simples – que expressam apenas um dos
fenótipos mutantes - flr
3
ou mwh – indicam a ocorrência de mutação gênica
e/ou cromossômica, bem como de eventos recombinogênicos. Por outro
lado, manchas gêmeas – formadas por clones flr
3
e mwh adjacentes – são
originadas exclusivamente por recombinação somática (Graf et al., 1984).
3.2.1 LINHAGENS UTILIZADAS
Para o desenvolvimento desta abordagem experimental
foram utilizadas duas linhagens de Drosophila melanogaster, denominadas
flr
3
e mwh. Estas linhagens são portadoras de uma série de genes
marcadores específicos, localizados no braço esquerdo do cromossomo 3,
que permitem monitorar eventos relacionados com mutação gênica,
aberração cromossômica e recombinação mitótica – cujos genótipos estão
representadas abaixo:
• flr
3
- flr
3
/In(3LR)TM3,ri p
p
sep l(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
• mwh - mwh/mwh
Os genes de interesse para a detecção de genotoxicidade são flr
3
e
mwh, que alteram a forma dos pêlos presentes nas asas dos adultos. Os
demais marcadores não têm importância para a detecção da atividade
tóxico genética, mas são característicos das inversões (In), presentes no
braço direito do cromossomo 3 (3LR). Esta inversão tem como objetivo
eliminar os produtos de recombinação mitótica que ocorrerem no genótipo
heterozigoto TM3.
Para maiores esclarecimentos a respeito dos marcadores genéticos,
acima apresentados, ver Lindsley e Zimm (1992). Todas os estoques de
22
Drosophila melanogaster, assim como os cruzamentos, foram mantidos a
25
o
C ±1
o
C e a umidade de 60-70%.
3.2.2. CRUZAMENTOS
Nesta abordagem experimental foi empregado o cruzamento padrão,
no qual fêmeas virgens flr
3
foram cruzadas com machos mwh, originando
larvas com duas constituições genotípicas, no que se refere aos genes
marcadores localizados no cromossomo 3:
• larvas mwh +/ + flr
3
- que são trans-heterozigotas para os
marcadores recessivos mwh e flr
3
.
• larvas mwh +/TM3,Bd
S
- heterozigotas para o cromossomo TM3. Os
adultos heterozigotos para o cromossomo TM3 apresentam recortes
nas asas - determinados pelo gene marcador Bd
S
- o que permite
diferenciá-los dos imagos trans-heterozigotos que apresentam asas
com formato normal.
3.2.3. TRATAMENTOS
Os cruzamentos foram realizados em massa (80 fêmeas : 40
machos), durante 3 dias, em vidros contendo meio de cultura padrão.
Após este período, os casais foram transferidos para tubos de ¼l contendo
meio de ovoposição, onde permaneceram por 8 h, sendo então
descartados. Depois de 72 ± 4h do início do período de ovoposição, foram
coletadas larvas de terceiro estágio por flotação em água corrente. Estas
larvas foram, então, submetidas a tratamento crônico em meio sintético
(Fórmula 4-24, Carolina Biological Supply Company, Burlington, North
23
Carolina) contendo o diluente (Tween 80 a 5%) ou as diferentes
concentrações das drogas, até completarem o seu desenvolvimento larval
(aproximadamente 48 h).
Todos os adultos que nasceram 10-12 dias após a postura dos ovos
foram conservados em etanol 70% . Posteriormente, as asas dos
indivíduos trans-heterozigotos e heterozigotos TM3 foram submetidas à
montagem em lâminas de vidro. As lâminas contendo 10 asas de fêmeas e
10 asas de machos foram analisadas em microscópio óptico com aumento
de 400X.
3.2.4. ANÁLISE MICROSCÓPICA
Foram analisadas as asas de pelo menos 30 indivíduos de cada sexo,
por ponto de tratamento, observando-se os fenótipos dos tricomas ou
pêlos existentes nas superfícies dorsal e ventral das asas dos indivíduos
trans-heterozigotos. Quando, nestes imagos, foram obtidos resultados
estatisticamente significantes procedeu-se a análise das asas dos
heterozigotos para o cromossomo TM3.
3.2.5. BASES GENÉTICAS
3.2.5.1. Adultos trans-heterozigotos
Através da análise dos pêlos presentes nas asas dos adultos trans-
heterozigotos são detectadas manchas simples (pequenas e grandes) e/ou
gêmeas, que refletem a ocorrência de eventos genéticos específicos.
Assim, as manchas simples, com os fenótipos pêlos múltiplos ou pêlos com
a base alargada, podem se originar por: (i) alteração do conteúdo
informacional dos genes selvagens mwh
+
ou flr
3+
e (ii) deleção de um
fragmento cromossômico ou de um cromossomo inteiro, contendo os
24
marcadores selvagens mwh
+
ou flr
3+
. Adicionalmente, a ocorrência de: (i)
uma recombinação simples entre os locos mwh e flr
3
leva ao aparecimento
de manchas simples com o fenótipo pêlos múltiplos; (ii) uma
recombinação simples entre flr
3
e o centrômero, seguido de uma segunda
recombinação simples entre mwh e flr
3
origina pêlos com a base alargada.
Desta forma, as manchas simples podem originar-se tanto por eventos
mutacionais, incluindo mutações pontuais e aberrações cromossômicas,
como por recombinação mitótica. Por outro lado, as manchas gêmeas, que
expressam simultaneamente os fenótipos com a base alargada e pêlos
múltiplos, originam-se exclusivamente de uma recombinação simples
entre flr
3
e o centrômero, com posterior segregação de um cromossomo
recombinado e um parental.
Desta forma, a análise das manchas de clones mutantes, efetuada
nas asas dos adultos trans-heterozigotos, não permite quantificar a real
contribuição da atividade recombinacional para a indução de clones de
células mutantes - uma vez que as manchas simples, pequenas e grandes,
podem não só ter se originado por eventos mutagênicos e/ou
clastogênicos, como também por recombinação mitótica.
3.2.5.2. Adultos heterozigotos TM3
Os imagos heterozigotos para o cromossomo balanceador TM3
expressam apenas manchas simples do tipo mwh - uma vez que estes
indivíduos são hemizigotos para o gene selvagem flr
3+
. Adicionalmente o
cromossomo TM3 apresenta múltiplas inversões, o que inviabiliza a
manutenção de células que tenham sofrido recombinação mitótica. Como
conseqüência, as moscas portadoras deste genótipo expressam somente
eventos relacionados com mutação pontual, clastogênese e aneugênese.
25
3.2.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a avaliação da genotoxicidade, as séries tratadas foram
comparadas com seus respectivos controles negativos. A análise
estatística foi feita através de um programa de computador que emprega o
teste de Kastenbaum-Bowman e segue o procedimento de decisão múltipla
de acordo com Selby e Olson (1981) e Frei e Würgler (1988),
possibilitando a caracterização dos resultados como positivos, fraco-
positivos, negativos ou inconclusivos. Na aplicação prática do método de
decisão, além da hipótese nula, elabora-se uma hipótese alternativa
específica, que requer uma freqüência de mutação no tratado m vezes
maior que a obtida no controle. Para avaliar os resultados negativos, dois
fatores de multiplicação (m) foram originalmente introduzidos no teste:
m= 2 para manchas simples pequenas e o total de manchas, devido às
suas altas freqüências espontâneas; m= 5 para manchas simples grandes
e manchas gêmeas, que raramente surgem de forma espontânea (Andrade
e Lehmann, 2003).
Quatro diferentes diagnósticos estatísticos são possíveis quando
testamos a hipótese nula (Ho) e a hipótese alternativa (Ha): se Ho é
aceita e Ha é rejeitada – negativo; se Ho e Ha são aceitas – inconclusivo;
se Ho é rejeitada e Ha é aceita – positivo; se Ho e Ha são rejeitadas –
fraco positivo. Isto significa que o tratamento induziu uma resposta
genotóxica fraca, com uma freqüência de danos que é significativamente
menor que m vezes a freqüência obtida no controle negativo (Andrade e
Lehmann, 2003).
O diagnóstico da positividade, obtida através do teste de
Kastenbaum-Bowman, foi somente confirmada quando acompanhada pela
positividade do teste U (Mann-Whitney).
26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente trabalho avaliou, através do teste SMART de asa em
Drosophila melanogaster, o potencial tóxico-genético de três
medicamentos empregados no tratamento da HPB. Para todos os produtos
foram realizados dois experimentos independentes, que não mostraram
diferenças estatisticamente significantes quando comparados por χ
2
. Em
função destes achados, os dados dos experimentos individuais foram
somados e encontram-se representados na Tabela I. A análise
microscópica referente à identificação de manchas mutantes concentrou-se
nas respostas obtidas nos imagos portadoras do genótipo trans-
heterozigoto, oriundos do cruzamento padrão. Quando foram obtidas
respostas estatisticamente significantes procedeu-se à análise das asas
das moscas portadores do genótipo heterozigoto TM3.
4.1. CONTROLES
As freqüências de mutações espontâneas - referentes ao total de
manchas por indivíduo no genótipo trans-heterozigoto - observadas no
controle negativo (Tween 80 a 5%) foram: (i) 0,70 para doxazosina,
finasterida e saw palmeto. Nos adultos heterozigotos TM3, a freqüência de
mutações espontâneas foi: 0,50 para doxazosina e 0,57 para Saw
palmeto. A comparação destes valores com os controles históricos do
laboratório, bem como com os controles da literatura, revelam que as
taxas de mutação espontâneas obtidas no presente estudo encontram-se
dentro dos valores de normalidade esperados (Frei e Würgler, 1996,
Lehmann et al., 2003).
27
4.2. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE GENÉTICA
Na Tabela I, é apresentado o somatório dos resultados obtidos
através do SMART de asa, considerando as respostas das moscas adultas
portadores dos genótipos trans-heterozigoto e TM3. Foram avaliadas pelo
menos três diferentes diluições de cada uma da drogas- uma vez que
doses mais elevadas causaram um índice de mortalidade superior a 50%.
Como se pode observar, nenhuma das diluições da finasterida,
apresentou efeito genotóxico nos imagos trans-heterozigotos, uma vez
que as freqüências das diferentes categorias de manchas não foram
significativamente superiores àquelas observadas nos respectivos
controles negativos. Como o total de manchas é o parâmetro indicativo da
genotoxicidade dos compostos testados e como não foram observados
aumentos estatisticamente significantes neste parâmetro, pode-se inferir
que, nas condições experimentais empregadas, a finasterida não induziu
lesões do tipo mutação gênica, cromossômica, bem como eventos
relacionados à recombinação mitótica. De fato, informações sobre a ação
tóxico genética da finasterida restringem-se as contidas na bula deste
medicamento, uma vez que não achamos registro de qualquer tipo de
artigo científico voltado para a análise da sua genotoxicidade. Dentro deste
contexto, pode-se referir que não foram observadas evidências de
mutagênese in vitro quando foi aplicado o teste de Ames. O mesmo é
verdadeiro para bioensaios, também in vitro, que utilizaram cultura de
células de mamíferos, avaliadas por eluição alcalina. No que se refere a
mutações cromossômicas há o relato de aumento na incidência deste tipo
de evento, porém este acréscimo não foi estatisticamente significativo em
células de ovário de hamster chinês tratadas com altas doses de
28
finasterida - tais concentrações correspondem a 4.000-5.000 vezes os
picos dos níveis plasmáticos observados em pacientes tratados com doses
diárias de 5 mg. Também não foram observadas alterações cromossômicas
em camundongos tratados com doses de finasterida 2.500 vezes maiores
que a recomendada para o homem (250 mg/kg/dia- dose máxima
tolerada). Tais achados corroboram os nossos resultados, quanto a
inabilidade da finasteride induzir tanto mutações pontuais quanto
cromossômicas. Ao mesmo tempo, em função das particularidades do
SMART, podemos também caracterizá-la como uma droga que não induz
recombinação, quando avaliada em células somáticas de D. melanogaster.
O cruzamento com alta bioativação enzimática não foi testado devido à
finasterida sofrer metabolização hepática gerando metabólitos inativos,
sem atividade farmacológica ou toxicológica.
Por outro lado, como pode ser observado na Tabela I a doxazosina e
o saw palmeto induzem aumentos significativos no total de manchas,
quando são consideradas as respostas dos imagos trans-heterozigotos. De
fato, para a doxazosina a positividade é confirmada nas duas maiores
doses utilizadas, enquanto que para o saw palmeto observam-se
acréscimos significativos apenas na maior concentração utilizada. Estes
achados indicam que ambas as drogas apresentam genotoxicidade quando
avaliadas pelo teste SMART, porém não permitem estabelecer se os
acréscimos observados devem-se a mutação e/ou recombinação – já que
neste genótipo ambos os eventos podem contribuir para a indução de
manchas mutantes. Para poder aferir a real contribuição dos eventos
relacionados à recombinação mitótica, no que tange o potencial genotóxico
destas substâncias, foram analisados os imagos heterozigotos para o
cromossomo TM3 - nas diluições que apresentaram resposta positiva nas
moscas trans-heterozigotas. No genótipo TM3, não foram obtidas
29
respostas estatisticamente significativas, tanto para a doxazosina quanto
para o saw palmeto (Tabela I) - o que indica que a ação genotóxica
observada está restrita a eventos relacionados com recombinação
mitótica, pelo menos em células proliferativas de D. melanogaster.
Ainda que a doxazosina venha sendo utilizada no tratamento da HPB
a longo tempo, a sua aplicação vem crescendo gradativamente, e como
conseqüência, o interesse em determinar seus possíveis efeitos adversos.
As potencialidades desta droga em interagir com o conteúdo informacional
da célula foram investigadas previamente a sua liberação para uso em
humanos, não tendo sido observadas alterações em nível cromossômico
que pudessem ser atribuídas ao fármaco ou aos seus metabólitos após
metabolização hepática. Por outro lado, por mais que tenhamos
pesquisado não encontramos nenhuma referência bibliográfica que
apresente dados voltados para a pesquisa da genotoxicidade do Saw
palmeto.
Os dados aqui apresentados parecem ser os primeiros a atribuir a
estas duas substâncias - doxazosina e ao saw palmeto - a característica de
aumentar a incidência de recombinação mitótica. Considerando que o
SMART detecta preferencialmente permuta mitótica, os nossos dados
sugerem que ambos os medicamentos induzem especificamente
recombinação homóloga em células proliferativas de Drosophila. O papel
fundamental da recombinação homóloga – visualizada como mecanismo
errante de reparo de DNA que pode levar a perda do estado heterozigoto
ou a rearranjos genéticos – na gênese de inúmeras doenças genéticas,
incluindo o câncer, é por si própria nociva. No que diz respeito a esta
última enfermidade, é um fato bem estabelecido que uma variedade de
supressores tumorais expressam-se com um padrão recessivo. Logo, em
indivíduos heterozigotos, a ocorrência de mutação, permuta mitótica e/ou
30
deleção podem levar a homo ou hemizigose destes genes e desencadear o
desenvolvimento de tumores malignos (Cavanee et al., 1983, 1986;
Knudson, 1986). Além disto, eventos recombinogênicos também estão
envolvidos com duplicação gênica e, conseqüentemente, com a
amplificação de proto-oncogenes – o que leva a superexpressão destes
genes. Neste último caso, a tumorigênese não está relacionada com a
indução de lesões específicas no DNA, mas com o excesso de produto
gênico – que vai interferir em etapas posteriores à iniciação (Bishop e
Schiestl, 2003; Weinberg, 1985).
Pelo menos três diferentes argumentos reforçam o papel
preponderante da recombinação homóloga (RH) na indução de tumores
malignos. O primeiro, fundamenta-se na comprovação de que uma série
de doenças, que aumentam a propensão para o desenvolvimento do
câncer, estão associadas com alta instabilidade genética, assim como com
um elevado nível de recombinação homóloga. O segundo, relacionado com
a demonstração de que RH ocorre mais freqüentemente em células
proliferativas. O terceiro, associado com a recente descoberta de que a
recombinação homóloga está diretamente envolvida na manutenção dos
telômeros (Bishop e Schiestl, 2003).
Outro ponto relevante relaciona-se ao fato de que o teste SMART de
asa utiliza um organismo experimental eucarioto, com alta similaridade
genética e bioquímica quando comparado aos mamíferos (St. John e Xu,
1997). Embora a Drosophila apresente apenas ~13.000 genes,
comparados aos ~30.000 de humanos, a maioria destes são duplicações e
elaborações de seus equivalentes encontrados nesta mosca (Miklos e
Rubin, 1996). Conseqüentemente existe uma alta conservação entre rotas
bioquímicas e funções regulatórias entre as duas espécies (Artavanis-
Tsakonas et al., 1995; St. John e Xu, 1997). Adicionalmente, um número
31
significante de genes estudados na mosca da fruta provaram ser
homólogos de genes supressores de tumor e oncogenes humanos (Miklos
e Rubin, 1996). Em função destas similaridades, a Drosophila é
considerada como um excelente modelo para estudar a genotoxicidade e
seus mecanismos moleculares, podendo fornecer respostas relevantes,
que podem ser extrapoladas para humanos com um índice de acerto de
92%.
A evidência de que o efeito da doxazosina e do saw palmeto está
centrado no aumento da freqüência de eventos relacionados à RH,
associado a nossa exposição diária a agentes genotóxicos endógenos e
exógenos, que também causam incrementos em RH apontam para o risco
associado ao seu uso terapêutico.
Tabela 1: Diagnóstico estatístico da toxicidade genética associada a Finasterida, Doxazosina e Saw palmeto no teste SMART
em D. melanogaster
Manchas por indivíduo (no. de
manchas)/diagnóstico estatístico
a
Genótipos
Concen
tração
( mg )
No. de
indiv.
(N)
Manchas
Simples
Pequenas
(1-2cells)
b
(m = 2)
Manchas
Simples
Grandes
(>2 cells)
b
(m = 5)
Manchas
Gêmeas
(m = 5)
Total de
manchas
(m = 2)
Total de
manchas
mwh (n)
Tamanho
médio de
manchas
mwh
c,d
Freqüência
de indução
de manchas
(por 10
5
células por
divisão
celular)
e
(n/NC)
d,f
Recombi
nação
(%)
e
Doxazosina
mwh / flr
3
CN 30 0,60 (18) 0,07 (2) 0,03 (1) 0,70 (21) 20 1,70 1,37
1,0 30 0,90 (27) i 0,23 (7) i 0,03 (1) i 1,17 (35) + 34 2,26 {3,07} 2,32 {0,96} ~100
2,0 30 1,00 (30) i 0,20 (6) i 0,03 (1) i 1,23 (37) +
h
37 2,03 {2,41} 2,53 {1,16} ~100
4,0
30 1,07 (32) + 0,13 (4) i 0,07 (2) i 1,27 (38) +
h
38 1,68 {1,67} 2,60 {1,23} ~100
mwh / TM3 CN 40 0,45 (18) 0,05 (2)
g
0,50 (20) 20 1,45 1,02
33
1,0 40 0,33 (13) - 0,03 (1) i 0,35 (14) - 14 1,50 {1,33} 0,72 –{0,31}
2,0 40 0,43 (17) - 0,03 (1) i 0,45 (18) - 18 1,39 {2,00} 0,92 –{0,10}
4,0 40 0,43 (17) - 0,03 (1) i 0,45 (18) - 18 1,28 {3,00} 0,92 –{0,10}
Saw Palmeto
mwh / flr3 CN 30 0,60 (18) 0,07 (2) 0,03 (1) 0,70 (21) 20 1,70 1,37
20 30 0,67 (20) i 0,13 (4) i 0,03 (1) i 0,83 (25) - 25 1,80 {2,20} 1,71 {0,34}
40 30 1,10 (33) + 0,07 (2) i 0,07 (2) i 1,23 (37) + 37 1,68 {1,65} 2,53 {1,16} ~100
80 30 0,93 (28) i 0,07 (2) i 0,03 (1) i 1,03 (31) i 31 1,52 {1,18} 2,12 {0,75}
160
30 1,07 (32) + 0,10 (3) i 0,03 (1) i 1,20 (36) +
h
36 1,72 {1,75} 2,46 {1,09} ~100
mwh / TM3
CN 30 0,50 (15) 0,07 (2)
g
0,57 (17) 17 1,41 1,16
40 30 0,50 (15) - 0,00 (0) i 0,50 (15) - 15 1,33 {2,00} 1,02 –{0,14}
160 30 0,30 (9) - 0,07 (2) i 0,37 (11) - 11 1,36 {1,50} 0,75 –{0,41}
34
Finasteride
mwh / flr3 CN 30 0,60 (18) 0,07 (2) 0,03 (1) 0,70 (21) 20 1,70 1,37
1,0 30 0,87 (26) i 0,07 (2) i 0,03 (1) i 0,97 (29) i 29 1,81 {4,00} 1,43 {0,07}
2,0 30 0,53 (16) - 0,13 (4) i 0,07 (2) i 0,73 (22) - 21 1,71 {2,00} 1,43 {0,07}
4,0 30 0,73 (22) i 0,03 (1) i 0,03 (1) i 0,80 (24) - 24 1,38 -{0,25} 1,64 {0,27}
a
Diagnóstico estatístico de acordo com Frei e Würgler (1988): +, positivo; -, negativo; i, inconclusivo; m
: fator de multiplicação; níveis de
significância α = β = 0.05;
b
incluindo manchas simples flr
3
raras;
c
considerando os clones mwh para as manchas simples mwh
e para as manchas
gêmeas;
d
números entre colchetes são as freqüências de indução corrigidas em relação a incidência espontânea estimada do controle negativo;
e
para
os cálculos ver Andrade et al., (2003);
f
C=48.800, i.e., número aproximado de células examinadas por indivíduo;
g
apenas manchas simples mwh
podem ser observadas nos indivíduos heterozigotos mwh/TM3, já que o cromossomo balanceador TM3 não contém o gene mutante flr
3
;
h
diagnóstico
positivo confirmado pelo teste U: P ≤ 0.05.
35
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Andrade, H.H.R.; Lehmann, M. 2003. Teste para detecção de mutação e
recombinação somática (SMART) em Drosophila melanogaster.
Mutagênese Ambiental. 281-307.
Arap, S.; Góes, P.M. 2000. Open-ended, non-comparative study to
evaluate the efficacy and tolerability of Serenoa repens extract in
patients with benign prostatic hiperplasia. Brazilian Journal of Urology
V.26 (1) 32-37.
Arencibia, J.M.; Del Rio, M.; Bonnin, A.; Lopes, R.; Lemoine, N.R.;
Barahona, M.L. 2005. Doxazosin induces apoptosis in LNCaP prostate
cancer cell line through DNA binding and DNA-dependent protein kinase
down-regulation. International Journal of Oncology. V. 27 1617-1623.
Artavanis – Tsakonas,S; Matsumoto, K; Fortini, M.E. 1995. Genotoxic
activity of different chromium coumpounds in larval cells of Drosophila
melanogaster, as measured in the wing spot test. Environ. Mol.
Mutagen., 34: 47-51.
Bishop, A.J.R.; Schiestl, R.H. 2003. Role of homologous recombination
in carcinogenesis. Exp Mol Pathol 74:94-105.
Bridges, B.A.; Penn, A.; Hansen, E.S.; Wakabayashi, K. 1990. The
possible involvement of somatic mutations in the development of
arteriosclerotic plaques. Mutat. Res., 239:143-188.
36
Cavanee, W.; Dryza, T.P.; Phillips, R.A.; Benedict, W.F.; Godbout, R.;
Gallie,L.; Murphree, A.L.; Strong, L.C.; White, R.L. 1983. Expression of
recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma.
Nature, 305:779-784.
Cavanee, W.; Koufos, A.; Hansen, M.F. 1986. Recessive mutant genes
predisposing to human cancer. Mutat. Res., 168:3-14.
Chagas, M.A.; Babinski, M.A.; Costa, W.S.; Damião, R.; Sampaio, F.J.B.
2001. Stereological analysis of histologic components in transition zone
of norml and hyperplastic human prostates. Brazilian Journal of Urology
V.27 26-31.
Dapkus,J.; Merell,D.J. 1977. Chromosomal analysis of DDT-resistence in
a long- term selected population of Drosophila melanogaster. Genetics,
87, 685-697.
Diaz, F. 2003. Hiperplasia prostática benigna (HPB).
http://www.santalucia.com.br Hospital Santa Lúcia Brasília-DF. Acesso
em 11/12/2006.
Fearon, E.R.; Vogelstein, B. 1990. A genetic model for colorectal
tumorogenesis. Cell 61:759-767.
Frei, H.; Würgler, F.E. 1988. Statical methods to decide whether
mutagenicity test data from Drosophila assays indicate positive,
negative or inconclusive result. Mutat. Res., 203: 297-308.
37
Frei, H.; Würgler, F. E. 1995. Optimal experimental design and sample
size for the statistical evaluation of data from somatic mutation and
recombination tests (SMART) in Drosophila. Mutatation Res., 334, 247-
258.
Frei, H.; Würgler, F.E. 1996. Induction of somatic mutation and
recombination by four inhibitors of eukaryotic topoisomerases assayed in
the wing spot test of Drosophila melanogaster. Mutagenesis, 11: 315-325.
Frölich,A.; Würgler, F.E. 1989. New tester strains with improved
bioactivation capacity for the Drosophila wing-spot test. Mutat. Res.,
216, 179-187.
Garcia-Bellido,A.; Dapena,J. 1974. Induction, deletion and
characterization of cell diferentiation mutants in Drosophila melanogaster.
Mol. Gen. Genet., 128, 117-130.
Graf,U.; Würgler, F.E.; Katz, A. J.; Frei, H.; Juon, H.; Hall, C. B.; Kale, P.
G. 1984. Somatic mutation and recombination test in Drosophila
melanogaster. Environ. Mutagen., 6, 153-188.
Hällstron,I.; Blanck, A. 1985. Genetic regulation of the cytochrome P-
450 system in Drosophila melanogaster. I Chromosomal determination
of some cytochrome P-450 dependent reactions. Chem-Biol Interact,
.56: 157-171.
http://www.uro.com.br/hpb.htm
.
Acesso em 11/12/2006.
38
http://www.neurosci.pharm.utoledo.edu/MBC3320/images/Doxazosin.gi
f. Acesso em 11/12/2006.
http://www.chem-online.org/…/finasteride.htm.
Acesso em 11/12/2006.
http://www.merck.com.br/index.php?link=consumidores_genericos_fina
sterida_5mg.php
.
Acesso em 11/12/2006.
http://www.pharmacy.utas.edu.au/…/sawpalmetto.htm.
Acesso em
11/12/2006.
Jemal A, Thomas A, Murray T and Thun M . 2002. Cancer statistics. CA
Cancer J Clin. V 52:23-47.
Karsten, W.; Krypsin-Sorensen, I. 1988. Penetrance and low
concordance in monozygotic twins in disease: are they the result of
alterations in somatic genomes? Molec. Reprod. Dev., 1:63-75.
Kirkwood, T.B.L. 1989. DNA, mutants and ageing. Mutat. Res., 219:1-8.
Knudson, J.R.A.G. 1986. Genetics of human cancer. Ann. Rev. Genet.,
20:231-251.
Lapa, A.J.; Soucar, C.; Lima-Landman, M.T.R.; Godinho,R.O.; Nogueira
T.C.M.L. 2004. Farmacologia e toxicologia de produtos naturais.
Farmacognosia da planta ao medicamento, 11:248-262.
39
Lehmann, M.; Franco, A.; Vilar, K. S. P.; Reguly, M. L.; Andrade, H. H.
R. 2003. Doxorubicin and two of its analogues are preferential inducers
of homologous recombination compared with mutational events in
somatic cells of Drosophila melanogaster. Mutation Research, V. 539:
167-175.
Lindsley, D.L.; ZIMM, G.G. 1992. The Genome of Drosophila
melanogaster. Academic Press, Inc., San Diego, 1113 p.
Logan, Y.T.; Belgeri, M.T. 2005. Monotherapy versus combination drug
therapy for the tratament of benign prostatic hyperplasia. The American
Journal of Geriatic Pharmacotherapy V.3 (2) 103-114.
Manes, C.H.S; Cavalcanti, A .G.; Canalini, A .F.; Javorandi, V.; Rachid
Fº, D.; Souto, J.B. 2001 Sonographic-Urodynamic evaluation of
patientes with benign prostatic hiperplasia treated with alpha-blocker.
Brazilian Journal of Urology V.27 (1): 55-59.
Miklos, G.L.G.; Rubin, G.M. 1996. The role of the genome project in
determining gene function: insights from model organisms. Cell, 86:
521-529.
Nemecz, G. 2004. Saw palmetto, in U.S. Pharmacist, Vol.23.
Reddy, L.; Odhav,B.; Bhoola. K.D. 2003. Natural products for cancer
prevention: a global perspective, Pharmacol. Ther. 99 1-13.
40
Rhoden, E.L.; Riedner, C.E.; Chammas Jr, M.F. 2000. Fármacos usados
no tratamento da hiperplasia prostática benigna in Farmacologia Clínica
Cap.71 919-922.
Richard, A.M. 1994. Application of SAR methods to non-congeneric data
bases associated with carcinogenicity and mutagenicity: Issues and
approaches. Mutat. Res., 305: 73-97.
Schulz; Hänsel; Tyler. 2002. Hiperplasia Prostática Benigna in
Fitoterapia Racional 4ed. 273-278.
Selby,P.B.; Olson,W.H. 1981. Methods and criteria for deciding whether
specific-locus mutation-rate data in mice indicate a positive, negative, or
inconclusive result. Mutation Research, 83: 403 - 418.
St. John, M.A.R.; Xu, T. 1997. Insights from model systems.
Understanding human cancer a fly? Am. J. Hum. Genet., 61: 1006-
1010.
Yunes, R.A.; Pedrosa, R.C.; Cechinel Filho, V. 2001. Fármacos e
Fitoterápicos: A Necessidade do Desenvolvimento da Indústria de
Fitoterápicos e Fitofármacos no Brasil, in Química Nova, Vol.24, Nº 1,
147-152.
Weinberg, R.A. 1985. The action of oncogenes in the cytoplasm and
nucleus. Science, 230:770-776.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
