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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E TOXICOLOGIA APLICADA
ANÁLISE DA PREVALÊNCIA DA DOENÇA DO RIM POLICÍSTICO (PKD) EM
FELINOS DA RAÇA PERSA E ASSEMELHADOS NO SUL DO BRASIL
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Genética e Toxicologia Aplicada
Márcio Aurélio da Costa Teixeira
Orientador: Dr. Daniel Thompsen Passos
CANOAS
2007
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AGRADECIMENTOS
Aos proprietários que forneceram seus animais para que fosse possível realizar este
trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Biotecnologia, do Hospital Veterinário da ULBRA,
principalmente ao Diego e Fábio, que foram fundamentais para a execução deste projeto.
Agradecimento à Dr
ª
Tania de Azevedo Weimer, pela colaboração na análise
estatística e todo o apoio técnico oferecido.
Ao Prof. Dr. Daniel Thompsen Passos, meu orientador, que viabilizou este trabalho.
Obrigado.
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SUMÁRIO
1. Introdução......................................................................................................................10
1.1 Base Genética da PKD................................................................................................12
1.2 Possível Mecanismo de Formação do Cisto...............................................................15
1.3 Diagnóstico da PKD no Gato.......................................................................................16
1.3.1 Diagnóstico Ultra-Sonográfico..................................................................................17
1.3.2 Diagnóstico Molecular..............................................................................................20
2. Justificativa e Objetivos.................................................................................................22
3. Materiais e Métodos......................................................................................................26
3.1 Amostras ....................................................................................................................26
3.2 Exame Ultra-Sonográfico............................................................................................26
3.3 Extração de DNA.........................................................................................................27
3.4 Amplificação do Fragmento.........................................................................................27
3.5 Análise dos RFLPs......................................................................................................28
3.6 Análise Estatística.......................................................................................................28
4. Resultados e Discussão................................................................................................30
4.1 Análise Ultra-Sonográfica............................................................................................30
4.2 Análise Molecular.........................................................................................................33
4.3 Análise Comparativa entre PCR-RFLP e U.S..............................................................34
5. Conclusões.....................................................................................................................40
6. Referências Bibliográficas..............................................................................................41
Anexo.................................................................................................................................47
4
LISTA DE ABREVIATURAS
ADPKD – Autosomal Dominante Policystic Kidney Disease (Doença Renal Policística
Autossômica Dominante)
EDTA – Ácido Etilenodiaminotetracético
kD - Quilodaltons
Kpb - Mil Pares de Bases
Pb - Pares de Bases
PCR - Reação em Cadeia de Polimerase
PKD - Policistic Kidney Disease (Doença do Rim Policístico)
SNP - Polimorfismo de Um Único Nucleotídeo
RFLP - Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição
U.S. - Ultra-Som
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -Representação esquemática das proteínas policistina 1 e 2...............................14
Figura 2 -Ilustração da cistogênese.....................................................................................15
Figura 3 -Fotografia ilustrativa de Raio-X abdominal demonstrando renomegalia..............17
Figura 4 -Fotografia ilustrativa de Ultra-Sonografia de rim normal......................................18
Figura 5 -Fotografia ilustrativa de Ultra-Sonografia demonstrando cisto na cortical renal..18
Figura 6 -Fotografia de Ultra-Sonografia demonstrando destruição do parênquima renal..19
Figura 7 -Representação da seqüência do éxon 29 do gene da PKD1...............................27
Figura 8 -Fotografia do experimento demonstrando múltiplos cistos..................................31
Figura 9 -Fotografia do experimento demonstrando formação cística única.......................31
Figura 10 -Fotografia de Ultra-Som do parênquima renal alterado.....................................31
Figura 11 -Eletroforese em gel de poliacrilamida, identificando os produtos da amplificação
e clivagem pela PCR – RFLP.............................................................................................33
6
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -Resultado dos exames Ultra-Sonográficos.........................................................30
Tabela 2 -Freqüência de heterozigotos para PKD, distribuídos por sexo e freqüência
alélica................................................................................................................................34
Tabela 3 - Resultados comparativos entre o U.S. e a PCR................................................35
7
RESUMO
A doença do rim policístico (PKD) é uma anomalia renal progressiva que causa
insuficiência renal crônica, devido à compressão parenquimal e à nefrite intersticial,
sendo considerada uma importante causa de insuficiência renal nos gatos. A PKD,
também conhecida como ADPKD (doença renal policística autossômica dominante), é
a doença genética mais prevalente em gatos Persas e seus derivados e é
caracterizada pelo desenvolvimento de cistos renais, com substituição de porções
significativas do parênquima renal por múltiplos cistos. Até recentemente, o único
método prático, não invasivo e disponível para o diagnóstico era a ultra-sonografia
(U.S.). Com a identificação da mutação genética responsável pela ADPKD, é agora
possível o uso de técnicas moleculares para o diagnóstico da doença. No Brasil,
exames realizados utilizando U.S. detectaram uma taxa de prevalência semelhante à
encontrada em outros países, porém os dados são escassos. Este trabalho avaliou a
prevalência da PKD e comparou os resultados com aqueles obtidos através de ultra-
sonografia renal, em uma amostra de gatos Persa do Sul do Brasil. Um total de 116
animais, com idades e sexos distintos, foram examinados através de imagem ultra-
sonográfica e teste molecular (PCR-RFLP). Os resultados indicaram uma prevalência
de 26% de indivíduos portadores da mutação, valor um pouco mais baixo que os
índices de outros países, situados entre 30% e 40%. Nenhum homozigoto foi
observado, embora dois fossem esperados de acordo com a freqüência alélica
observada (0,13), o que confirma a hipótese de que homozigotos para PKD seriam
letais embrionários. Somente 50% dos portadores da mutação foram diagnosticados
através do U.S., o que salienta a ocorrência de falsos negativos. Vinte e dois por cento
dos animais apresentaram alterações inconclusivas na análise por U.S., 23% dos quais
foram heterozigotos para a mutação. Adicionalmente, 5% dos animais com resultado
positivo por U.S. não apresentaram a mutação PKD, indicando a ocorrência de outras
causas para o cisto renal. O diagnóstico molecular possibilitou a estimativa da
prevalência real da PKD em gatos Persas, permitiu o diagnóstico precoce da PKD e a
elaboração de um programa de seleção da raça para a eliminação da mutação
genética responsável pela doença.
8
ABSTRACT
Polycystic kidney disease (PKD) is a progressive renal disorder that causes chronic
renal failure, due to the compression of adjacent parenchyma and interstitial nephritis,
being considered an important cause of renal failure in cats. PKD, also known as
autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), is the most prevalent inherited
disease of cats, particularly affecting Persians and its relatives. It is characterized by the
development of renal cysts and displacement of significant portions of renal parenchyma by
multiple cysts. Until recently, the disease has been diagnosed only by renal
ultrasonography (U.S.), the only practical and non-invasive method available. With the
identification of the genetic mutation responsible for PKD it is now possible to use
molecular techniques to screen for the disease. In Brazil, the estimated prevalence by U.S.
seems to be similar to that of other countries, but the data are scarce. This work was
performed to establish the prevalence of PKD in a sample of Persian cats and its relatives,
from South Brazil. A total of 116 cats, from different ages and sexes were examined
through U.S. image and a molecular method (PCR-RFLP). Twenty six percent of the
animals were heterozygous for the PKD mutation, values somewhat low in comparison with
the data of other countries (30% to 40%). No homozygous was verified, although two were
expected according to the observed PKD allele frequency (0.13), confirming the hypothesis
that PKD homozygous would be lethal in the embryonic phase. Only 50% of the PKD
heterozygous were identified through by U.S., indicating the occurrence of untrue negative
results. Twenty two percent of the animals had unconcluded results through U.S., 23% of
them being heterozygous for PKD mutation. Additionally, 5% of the animals with positive
U.S. results did not present the mutation, indicating the occurrence of other reasons for the
renal cysts. The molecular method allows obtaining the real prevalence of PKD in Persian
cats from South Brazil, performing the early diagnosis of the susceptible animals as well as
developing a breed improvement program to eliminate the disease in this cat population.
9
INTRODUÇÃO
10
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos assistimos a um aumento progressivo na população de gatos
domésticos, relacionado com a verticalidade das cidades, bem como com a mudança no
estilo de vida das populações humanas. O gato, por ser um animal de menor porte e de
maior independência, tornou-se mais adequado às necessidades de certos grupos sociais.
Dentre as raças que mais ganharam espaço no Brasil, destacam-se persas, himalaios,
híbridos de persa e siameses.
A doença do rim policístico (Polycystic Kidney Disease - PKD) é uma doença
progressiva que causa insuficiência renal crônica, devido à compressão parenquimal e à
nefrite intersticial sendo considerada uma importante patologia nos gatos (GONZALEZ e
FROES, 2003; FERRANTE, 2004; RAH et al. 2006).
A PKD, também conhecida como ADPKD (Doença Renal Policística Autossômica
Dominante), é uma doença hereditária dos gatos persas e raças aparentadas (PODDEL et
al., 1992; MILLER et al., 1999; BILLER, 2003). É uma doença autossômica dominante,
caracterizada pela substituição de porções significativas do parênquima renal por múltiplos
cistos (LULICH et al., 1994; CARAKUSCHANSKY, 2001; FISCHER, 2004).
Esta enfermidade é muito semelhante a ADPKD que acomete os humanos, sendo o
gato um ótimo modelo experimental (GONZALEZ e FROES, 2003). Tanto a PKD humana
quanto a felina normalmente são acompanhadas de falha renal em idades tardias e
apresentam intensa variação no curso clínico da doença (BILLER et al., 1996; IGARASHI e
SOMLO, 2002; MCMILLAN et al., 2004).
Para LULICH et al. (1994), oito entre 10 gatos com rins policísticos bilaterais,
avaliados nas Universidades de Minessota e Carolina do Sul (EUA), apresentavam pêlo
longo, o que sugere uma tendência genética nesta raça. HARKIN et al. (2003)
complementaram que essa classificação foi feita com base em estudos de nascimentos de
afetados e análises de pedigree.
BECK e LAVELLE (1999) realizaram um estudo de prevalência da PKD na
Universidade de Melbourne (EUA), obtendo como resultado uma prevalência de 45% nos
gatos persas e 50% nos gatos exóticos. A prevalência encontrada nos Estados Unidos
(EUA) no ano de 2001 foi de 45% para persas e 42% para exóticos (raça semelhante a
11
persa). Em 2003, a França revelou um índice de 41,8% para persas e 39,1% para exóticos
(BARTHEZ et al., 2003).
No Brasil, parece haver uma prevalência semelhante à encontrada em outros
países, porém os dados são escassos. Sobre o assunto, ALVES et al. (2006) realizaram
um estudo de prevalência de PKD, através de avaliação ecográfica em gatis de Porto
Alegre-RS, obtendo como resultado uma prevalência de 44,6% de animais afetados. Para
BILLER (2003) e CHEW et al. (2004) não se trata de uma doença nova, pois tem sido
relatada, esporadicamente, há cerca de 30 anos.
Nos últimos 10 anos, foi caracterizada como uma doença hereditária, irreversível e
de progressão lenta, ocorrendo uma alta incidência de gatos assintomáticos (FERRANTE,
2004).
O tamanho dos cistos pode variar desde um milímetro até mais de um centímetro
(FIGUEIREDO et al., 1998; NORSWOTHY, 2004). Embora esses autores afirmem que os
cistos possam formar-se em decorrência de obstrução extra ou intra-luminal dos túbulos
renais, a principal causa é de origem genética (FOWLER, et al., 2000).
O desenvolvimento e o crescimento de estruturas císticas em ambos os rins e,
freqüentemente, no fígado são características da PKD (GONZALEZ e FROES, 2003).
EATON et al. (1997) citam ainda que os cistos podem aparecer também no pâncreas e
segundo GREEN (1996), a ocorrência concomitante no fígado foi relatada em gatos.
Os cistos múltiplos estão presentes bilateralmente, após o nascimento e aumentam
lentamente de tamanho ao longo da vida, causando hipertrofia, o que leva a uma redução
progressiva do parênquima renal (BILLER, 2003). Para FISCHER (2004), a doença é
progressiva e na maioria dos gatos, a compressão parenquimal e a conseqüente nefrite
intersticial resultam em insuficiência renal.
BILLER (2003) afirmou que em razão da evolução lenta da doença, nem todos os
gatos que sofrem de PKD irão desenvolver a sintomatologia clínica. O ritmo de
crescimento dos cistos renais é muito variável, variando de tamanho de um rim para o
outro em um mesmo gato, entre os pais e os descendentes atingidos e entre as linhagens
genéticas. Gatos afetados apresentam-se clinicamente normais por quase toda a vida e a
falha renal ocorre tardiamente, acima dos sete anos de idade (EATON et al., 1997).
Segundo FIGUEIREDO et al. (1998), fatores ambientais podem estar envolvidos
com infecções renais como medicamentos e substâncias químicas que favorecem a
12
hipertrofia e hiperplasia do epitélio tubular, promovendo obstrução e dilatações císticas.
Cistos renais podem, assim, se desenvolver em pacientes que não carregam o gene para
PKD.
Vários agentes (drogas, endotoxinas e hormônios) têm sido associados com o
desenvolvimento de cistos renais em animais (ROSS et al.,1982; LULICH et al., 1994).
Segundo LULICH et al. (1995), a ingestão de drogas como difeniltiazole, ácido
nordihidroguaiarético, difenilamina e corticosteróides causam formação de cistos em rins
normais. Cistos renais adquiridos têm sido identificados em cães e gatos com displasia
renal, neoplasias, infecções e nefrite túbulo-intersticial (LULICH et al., 1995). Para GREEN
(1996) a formação dos cistos pode se dar secundariamente à inflamação ou obstrução dos
túbulos renais, que resulta em cistos cheios de urina. Os cistos congênitos, podem surgir
de qualquer parte do néfron, são muito variáveis em número e, inicialmente, muito
pequenos, mas tendem a crescer em tamanho com a idade (CANNON et al., 2001).
Segundo GONZALEZ e FROES (2003), o fluido acumulado no interior do cisto é
derivado da filtração glomerular e/ou da secreção de fluidos dos eletrólitos a partir das
células epiteliais da membrana dos cistos. Além disso, a redução da concentração da
glicose no fluido cístico comparada ao soro é compatível com a reabsorção tubular de
glicose; e a alta taxa da creatinina no fluido cístico comparado ao soro é compatível com a
modificação tubular do filtrado glomerular.
1.1 Base Genética da PKD
A PKD é a doença genética mais prevalente em gatos. Até recentemente, o único
método prático, não invasivo e disponível para o diagnóstico era a ultra-sonografia. Em
2004, a mutação genética responsável pela PKD foi identificada em um grupo de gatos
persa nos Estados Unidos. Com a base genética elucidada, tornou-se possível o
diagnóstico através de métodos moleculares, tais como a Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR), PCR em tempo real (Real-Time PCR) e PCR-RFLP (Polimorfismo de
Tamanho de Fragmentos de Restrição) (HELPS et al., 2007).
A mutação no gene PKD1, localizado no cromossomo E3 de gatos, é polimorfismo
de um único nucleotídeo (SNP), devido à transversão de uma citosina por uma adenosina
(C/A). Esta alteração ocorre no éxon 29 do gene PKD1, causando uma anormalidade na
13
tradução da proteína com a troca do aminoácido cisteína (UGC), para um códon de
terminação (UGA), tornando a proteína truncada a aproximadamente 33% do seu término.
(MURPHY, 2000; IGARASHI e SOMLO, 2002; LYONS et al., 2004; HELPS et al., 2007).
A mutação é identificada em estado de heterozigose em todos os gatos afetados
analisados e nenhum homozigoto foi identificado, sugerindo que a mutação em
homozigose seja letal na fase embrionária (LYONS et al., 2004; HELPS et al., 2007).
Em humanos, esta desordem apresenta uma freqüência de 1 entre 1000 indivíduos;
85% dos casos da mutação humana ocorrem no gene PKD1, localizado no cromossomo
16 e 15% são causados por mutação no gene PKD2, localizado no cromossomo 4,
responsáveis por glicoproteínas de membrana chamadas policistina 1 e policistina 2,
respectivamente (TORRES e HARRIS, 2007).
As informações sobre estrutura e funcionamento dos genes PKD1 e PKD2, referem-
se a humanos, pois estes dados não estão disponíveis em felinos.
A policistina está envolvida em vários processos biológicos, como fertilização e
translocação de íons. Ela está localizada em vários tecidos, incluindo os rins, cérebro,
ossos e músculos. No rim, está localizada na membrana plasmática da célula epitelial
tubular, especialmente no néfron distal e ductos coletores (IGARASHI e SOMLO, 2002).
Estes autores, ainda descrevem que o gene PKD1 humano (responsável pela
policistina 1) é muito grande, e consiste de 46 éxons distribuídos em mais de 52 Kpb do
DNA genômico. O gene codifica um RNAm de 14,1 kpb, que é traduzido em uma proteína
composta de 4302 aminoácidos e peso molecular de 500 kD. De forma interessante, a
região do gene que se estende do éxon 1 até o éxon 33 é duplicado em seis outros locais
no cromossomo 16p.
O gene PKD1 fica próximo de outro gene que também está relacionado com lesões
de esclerose nos túbulos renais o TSC 2, que produz sintomas semelhantes quando
comparados com a doença do rim policístico. Mutações concomitantes no gene TSC2 e
PKD1, também apresentarão como conseqüência a formação do rim policístico.
A explicação molecular para este fenômeno, está no fato de que o produto do gene
TSC 2 (tuberina) é um importante co-fator para a translocação da policistina 1 do aparelho
de Golgi para a membrana plasmática (GALLAGHER et al., 2002).
A policistina 1 apresenta três porções ou domínios: um extracelular com terminação
amino (NH
2
) ligado a outros aminoácidos e imunoglobulinas, que provavelmente
14
funcionam como receptor para algum ligante; outra porção transmembrana e a última
porção situada no citoplasma, apresenta um grupamento carboxil (COOH) que participa de
interações entre outras proteínas por fosforilação (Figura 1). Um recente estudo mostrou
que a policistina, através dos seus segmentos, funciona como uma proteína G, isto é, é
responsável pela transdução de sinais (processo pelo qual um impulso é conduzido e
amplificado para gerar uma resposta adequada). A super expressão de policistina 1 em
células de ratos inibiu a proliferação celular e suprimiu a formação de cisto (GALLAGHER
et al., 2002, IGARASHI e SOLMO, 2002).
O gene PKD2, codifica a proteína policistina 2 (Figura 1) que é composta por 968
aminoácidos, não apresenta segmento extracelular e a porção transmembrana é 50% igual
à policistina 1. A policistina 2 está intimamente relacionada com a policistina 1, o que
explica porque mutações de PKD1 ou PKD2 produzem doenças com manifestações
clínicas idênticas. A policistina 2 é expressa em muitos tecidos, tais como: coração, ovário,
testículo, músculo liso vascular e intestino delgado. Já no rim, a policistina 2 é expressa,
assim como a policistina 1, em todos os segmentos do néfron (IGARASHI e SOLMO,
2002).
Figura 1: Estrutura da Policistina 1 e 2 humana (IGARASHI, 2002)
15
1.2 Possível Mecanismo de Formação do Cisto
Os cistos renais originam-se nos epitélios dos néfrons e sistemas coletores, que
estão forrados por uma única camada de células que apresentam altas taxas de
proliferação celular sendo a taxa de mutação somática, das células epiteliais do rim, de
aproximadamente 2 x 10
-
4
(IGARASHI e SOLMO, 2002).
As estruturas tubulares do rim originam-se de dois tecidos: dos néfrons que são
derivados do mesênquima metanefrogênico e dos túbulos coletores que originam de
brotos uretéricos. A diferenciação do mesênquima metanefrogênico é especial, porque
uma célula mesenquimal tem que se transformar em uma estrutura epitelial com lúmen.
Para este processo deve haver um sinal que ative a formação do lúmen e outro para que o
processo cesse, quando a formação do lúmen já estiver estabelecida, a expansão dos
túbulos é finalizada e as células circunvizinhas são degradadas. A cistogênese (Figura 2),
pode ser considerada como um processo de falha no sinal de parada de formação do
lúmen. Este sinal é determinado pela policistina 1 e policistina 2; na presença da mutação
não há sinal de parada e o processo não é interrompido, formando o cisto (GALLAGHER
et al., 2002).
Figura 2: Cistogênese em humanos (GALLAGHER et al., 2002)
Formação do lúmen controlado (tubulogênese)
Alta expressão
de policistina
Formação do lúmen descontrolada (cistogênese)
Ausência de
policistina
16
Embora todas as células no néfron carreguem a mesma mutação na sua linha
germinativa, somente alguns cistos surgem, por néfron. Muitos néfrons aparecem
completamente normais, definindo a doença policística como focal. Uma explicação para
isto, está no fato é que um gene danificado é herdado de um genitor e outro gene
selvagem (sem a mutação) é herdado do outro. Durante a vida do indivíduo, o gene
selvagem sofre uma mutação somática e torna-se inativado, o gene mutante, então,
começa a se manifestar. Estudos mostraram que cistos renais em pacientes, exibem perda
de heterozigozidade devido à perda do alelo selvagem. Assim, enquanto o padrão da
herança é dominante, a doença acontece por mecanismos moleculares recessivos
(IGARASHI e SOLMO, 2002).
1.2 Diagnóstico da PKD no gato
Atualmente, nenhum exame clínico nem análises laboratoriais, são capazes de
confirmar ou excluir um diagnóstico de PKD, já que nenhuma alteração sangüínea ou
urinária é específica para essa doença. O diagnóstico baseia-se no exame diferencial das
afecções que levam à nefromegalia e à insuficiência renal (CARVALHO, 2004).
As técnicas de diagnóstico por imagem são imprescindíveis para descartar outras
causas de nefromegalia, como linfoma renal, nefrite granulomatosa por peritonite
infecciosa felina, hidronefrose e pseudocisto renal. A radiografia não é um exame de rotina
para o diagnóstico de PKD porque não fornece muitas informações e muitas vezes os rins
de animais afetados têm aspecto normal nas radiografias abdominais. Os cistos são
visualizados como pontos não uniformes de maior radiopacidade que devem ser
diferenciados de neoplasias, abscessos, artefato e hidronefrose. A imagem mais sugestiva
de doença cística na radiografia é a renomegalia (Figura 3), que consiste no aumento da
silhueta renal (KELLY, 2005).
17
Figura 3: Renomegalia bilateral (a) rim direito, (b) rim esquerdo (KELLY, 2005)
1.3.1 Diagnóstico Ultra-Sonográfico (U.S.)
O ultra-som é um dos primeiros exames realizados para avaliação renal, pois
importantes informações anatômicas são obtidas, como dimensões, forma, contorno e
arquitetura interna, independentemente de sua função. Os rins são órgãos
retroperitoneais, circundados por tecido adiposo. Na avaliação longitudinal, através do
ultra-som, podemos identificar a cápsula renal que produz um fino eco brilhante quando a
onda sonora incide perpendicularmente. A região cortical é mais ecogênica que a região
medular porque é formada pelos glomérulos, possuindo uma quantidade maior de células
que a região medular, esta última é composta pela maioria dos túbulos do sistema coletor,
possuindo uma maior quantidade de fluido, o que a torna hipoecogênica, como observado
na Figura 4 (CARVALHO, 2004).
a
b
18
Figura 4: Rim normal, (M) medular, (C) cortical, (setas) cápsula (NYLAND, 2005)
As características ecográficas dos cistos renais compreendem um perfil esférico,
paredes lisas com margens nitidamente delimitadas, nenhum eco interno e presença de
uma transmissão transversal que consiste em um enriquecimento acústico posterior,
correspondente ao tamanho da lesão (BILLER, 2003). Para CARVALHO (2004) as
características sonográficas dos cistos são, contorno arredondado ou ovalado, paredes
finas e bem delimitadas, conteúdo anecogênico, presença de reforço acústico posterior e
uma região anecogênica nas laterais do cisto estendendo-se distalmente (esse artefato é
chamado de sombreamento das margens e resulta da refração do feixe sonoro quando
passa pelas bordas arredondadas), com destruição do parênquima (Figura 5 e 6).
Figura 5: (seta) Cisto na cortical (NYLAND, 2005)
C
C
C
C
19
Figura 6: Destruição do parênquima (seta) (NYLAND, 2005)
Segundo GREEN (1996) e BECK e LAVELLE (2001), o padrão ultra-sonográfico de
múltiplas cavidades anecóicas, com reforço distal é altamente específica de PKD.
O ultra-som detecta com segurança o cisto, entretanto sua precisão e
confiabilidade, dependem da experiência dos operadores que realizam e interpretam o
exame (BILLER, 2003; FISCHER, 2004).
O diagnóstico pode ser complicado, pois o tamanho dos cistos é imperceptível na
fase precoce e seu crescimento é variável, os grandes podem alterar o contorno do rim.
Em seres humanos e em gatos com um grande número de cistos muito pequenos, tem-se
observado um padrão sonográfico hiperecogênico ou complexo, graças à presença de
múltiplas interfaces refletoras. Este padrão pode ser confundido com outras lesões renais.
O U.S. oferece 95% de confiabilidade quando realizado em gatos com pelo menos 10
meses de idade (CARVALHO, 2004; PRATS, 2005).
Recomenda-se empregar um transdutor de alta freqüência, com pelo menos
7,5MHz e aparelhos com boa resolução de imagem (GONZALEZ e FROES, 2003). Os rins
afetados apresentam junção córtico-medular indistinta, o que está associado com a
degeneração crônica e inflamação. A sombra distal hiperecóica é devida a áreas de
mineralização, o que é confirmado pela histopatologia (REICHLE et al., 2002).
Os testes genéticos apresentam mais especificidade para o diagnóstico de PKD,
entretanto, isto não significa o fim da exploração diagnóstica por ultra-som, pois ele ainda
vai ser utilizado para o monitoramento da lesão, para avaliação da severidade nos animais
20
positivos para PKD e detecção de outras causas para a formação do cisto renal (HELPS,
2007).
1.3.2 Diagnóstico Molecular
LYONS (2004) identificou a mutação genética responsável pela PKD nos gatos
persas e raças relacionadas, utilizando técnica de ultra-som e o método de PCR-RFLP,
nos EUA. Foram utilizados 81 animais, destes 48 apresentavam cistos no exame ultra-
sonográfico e 33 eram considerados normais. A análise pela PCR -RFLP foi realizada pela
amplificação de um fragmento de 559 pb, correspondendo à uma porção da seqüência do
gene onde ocorre a mutação, no éxon 29. A clivagem do amplicon com a enzima de
restrição Mly I, produz dois fragmentos de 316 e 243 bp (pares de bases).
Todos os 48 animais que apresentaram cistos no exame de U.S. apresentaram a
mutação, porém nove animais dos 33 considerados normais, apresentaram também a
mutação, sendo, portanto, potencialmente afetados.
HELPS et al. (2007) realizaram a identificação do SNP causador da PKD em gatos
persa do Reino Unido, utilizando a análise pela Real-Time PCR. O objetivo do trabalho foi
comparar a técnica da Real-Time PCR, PCR-RFLP e Ultra-sonografia. Para o estudo
foram utilizados 72 gatos da raça persa e exótico. Foram identificados alelos do tipo
selvagem, sem a mutação (43 animais) e o alelo responsável pela PKD (29 animais). Os
métodos moleculares detectaram 100% dos animais positivos para a mutação. A análise
ultra-sonográfica indicou dois animais positivos no grupo de animais selvagens,
demonstrando a presença de cisto por outro motivo, não relacionado com o gene da PKD.
Recente estudo realizado por HELPS et al. (2007), utilizou 506 gatos persa e raças
relacionadas, destes 149 gatos foram identificados como positivos para PKD, sendo todos
heterozigotos, apoiando a hipótese que filhotes homozigotos apresentariam morte
embrionária.
O uso da raça persa no desenvolvimento de outras raças pode ter introduzido o
gene mutado nas mesmas, porém tem sido demonstrado que o gene para PKD não
segrega com os genes responsáveis por produzir pêlos longos ou aspecto braquicefálico
(CANNON et al., 2001).
21
A realização de pesquisas mais extensas, para avaliar a presença da mutação em
gatos de diferentes regiões do mundo deveria ser uma preocupação. Investigações das
causas da PKD serão valiosas para a saúde felina e também para as perspectivas da
doença em humanos. Os humanos, assim como os gatos apresentam diferentes
características na progressão e severidade da doença, que podem ser relacionados com
outros fatores genéticos e ambientais. Embora, os criadores sejam aconselhados a não
procriar animais positivos para PKD, a criação é feita indiscriminadamente, já que os sinais
clínicos nem sempre estão presentes, além de falta de informação do criador e
indisponibilidade do exame e/ou custo elevado (LYONS, 2004).
22
JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
23
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
A PKD é uma doença hereditária dos gatos persas e raças aparentadas. Há cerca
de 30 anos tem sido objeto de relatos esporádicos na literatura veterinária. Nos últimos
anos tem recebido uma maior importância no meio científico, em virtude do aumento da
incidência e prevalência na população dos gatos (BILLER et al., 1996).
Vários trabalhos têm sido publicados com objetivo de definir a prevalência da PKD
em vários países, utilizando principalmente o diagnóstico ultra-sonográfico (BILLER et al.,
1996, BECK e LAVELLE, 1999, CANNON et al., 2001, BARTHEZ et al., 2003).
Atualmente, tem sido utilizado o exame ultra-sonográfico e o diagnóstico molecular para
identificar os gatos portadores de cistos e da mutação, respectivamente, definindo a
prevalência da doença e do alelo mutante na população (LYONS et al., 2004, e HELPS et
al., 2007). Os estudos estão demonstrando diferentes resultados, entre as técnicas de
diagnóstico.
No Brasil, ALVES et al. (2006), identificaram através do ultra-som, uma prevalência
semelhante à encontrada em outros países. Na região sul o exame ultra-sonográfico é a
técnica de diagnóstico mais utilizada para pesquisa de PKD pelos criadores de gatos.
Exames moleculares são realizados, porém a dificuldade e o custo, já que
atualmente, o material para o diagnóstico molecular é enviado principalmente para
laboratórios na Austrália, impede uma maior utilização deste meio para detectar a real taxa
de prevalência do alelo mutante na população de gatos.
Dentro deste contexto, este trabalho teve como:
2.1 Objetivo geral:
Estabelecer a prevalência da doença do rim policístico em felinos da raça persa e
assemelhados no sul do Brasil, utilizando técnicas de ultra-sonografia e PCR-RLFP
.
24
2. 2 Objetivos específicos:
1) Verificar as freqüências genotípicas e alélicas para o polimorfismo de um único
nucleotídeo (SNP) do gene PKD1 em animais da raça persa ou assemelhados;
2) Comparar os genótipos verificados e as imagens ultra-sonográficas dos animais;
3) Elaborar um programa de melhoria genética, através da manutenção do exame
da PCR-RLFP, para os criadores de gatos das raças afetadas.
25
MATERIAIS e MÉTODOS
26
3. MATERIAIS e MÉTODOS
3.1 Amostras
Amostras de sangue foram obtidas de gatis de Porto Alegre e região metropolitana,
totalizando 116 animais, entre fêmeas e machos, com idades distintas, variando de 2
meses a 10 anos, clinicamente sadios. Todos os animais foram examinados por ultra-
sonografia no momento da coleta de sangue.
O tamanho da amostra foi estimado, através do programa do Laboratório de
Epidemiologia e Estatística Vinculado à Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo, prevendo de prevalência 35% e fixando o nível de significância entre 1 e 5%.
(http://lee.dante.br/cgi-bin/uncgi/calculo_amostra).
3.2 Exame Ultra-sonográfico (Ecografia)
Os exames ultra-sonográficos foram realizados no Hospital Veterinário da
Universidade Luterana do Brasil (HV-ULBRA), localizado em Canoas, e no Hospital de
Clínicas Veterinárias do Rio Grande do Sul, localizado na rua Dr. Murtinho 324, bairro Bom
Jesus, em Porto Alegre.
Para realização dos exames ultra-sonográficos, foram utilizados dois aparelhos: um
equipamento modelo GPS 5000, equipado com transdutor de 7,5 MHz e outro modelo
ALOKA 500 equipado com transdutor de 7,5 MHz.
Os rins foram examinados nos planos longitudinal, sagital e transverso, através de
abordagem lateral e ventral.
Foram estabelecidos três critérios de diagnóstico ultra-sonográfico, que foram
tabulados da seguinte forma:
a) animais positivos para a PKD: receberam um sinal de ( ++ )
b) animais negativos: sinal de ( - )
27
c) animais duvidosos: um sinal positivo ( + ). Foram considerados duvidosos, os
animais que apresentaram alterações parenquimatosas como: cortical heterogênea, pobre
definição córtico-medular e hidronefrose.
3.3 Extração do DNA
Amostras de DNA foram obtidas a partir da retirada de sangue periférico, através de
seringas de 3 ml com agulhas 25 x 7, armazenados em tubos contendo anticoagulante
(EDTA); após a coleta o sangue era refrigerado e encaminhado para o Laboratório de
Biotecnologia da ULBRA, no Hospital Veterinário. A extração foi realizada através do
método de extração descrito por MILLER et al. (1988).
3.4 Amplificação do Fragmento
A PCR foi realizada utilizando os oligonucleotídeos iniciadores descrito por HELPS
et al. (2007).
PKD1 F (5’ – GACAAGCATCTCTGGCTCTCC – 3’ )
PKD1 R (5’ – ACGACCCCGTACCACACAG – 3’ )
O programa de amplificação teve uma desnaturação inicial de 94°C por 3 min.
Seguidos de 35 ciclos a 94°C por 30 seg., 62°C por 30 seg., 72°C por 30 seg e uma
extensão final a 72°C por 10 min. O fragmento amplificado foi de 131 pares de bases,
representado uma porção do gene da PKD1, como demonstrado na Figura 7.
Figura 7: Seqüência do éxon 29 do gene da PKD1
5´GCTGTCGGTGGAGACTGAGGCCAATGGCGGCCTCGTGGAGAAGGAGG
TGCTGGCAGCAAGTAAGGGCCTGGGCCCGTCCCTGCCCGGGCTGGCCGA
GGGGTGGCCTGTGCCACTGGCCTCCTGAAGCCAGCTGTGCCCTTTCTGC
AGGCGACGCGGCTGTGCGGCGGTTCCGGCGCCTCCTGGTGGCCGAGCTG
CAGCGTGGCTTTTTTGACAAGCATCTCTGGCTCTCCCTCTGGGACCGGC
CTCCTCGGAGCCGCTTCACCCGCGTCCAGCGGGCCACCTGTTGAGTCCT
CCTCGTCTGCCTCTTCCTGGGCGCCAATGCTGTGTGGTACGGGGTCGTG
GGAGACGCCGCCTACAGGTGGGTGCCCGAGGGGGGCCCGATGATCTCCT
CCTGCCCGACCCCTCCTACCCCCCACAGCCTCTCCCAGCCCGGGTCTCT
CTCCTCTCCTGCCACACAGCGCGGGGCCCGTGTCCGGTCTGATCCCGCT
Sítio de Clivagem
para a enzima.
Mly
I.
Seqüência do Primer
PKD1 F
Seqüência complementar do
Primer PKD1 R
Mutação
C/A
28
3.5 Análise dos RFLPs
O produto da PCR foi clivado com a enzima de restrição Mly I. Os fragmentos
obtidos foram de 86 pb e 45 pb, no alelo mutante (A), enquanto que no alelo normal (C), o
fragmento de 131pb não sofre clivagem (Figura 11).
Os produtos da amplificação da PCR foram analisados por eletroforese em gel de
agarose 1,5% corado com brometo de etídeo, exposto à luz ultravioleta e os produtos de
clivagem foram analisados em gel vertical de poliacrilamida 10,5%, não desnaturante, com
tampão de TBE (pH 8,3). Após a coloração com nitrato de prata, os fragmentos foram
identificados por comparação com marcadores de peso molecular (SAMBROOK e
RUSSEL, 2001).
3.6 Análises Estatísticas
As freqüências alélicas e genotípicas foram computadas por contagem direta. As
comparações entre grupos (sexo, idade e tipo de diagnóstico) foram realizadas pelo teste
do χ
2
, através do pacote estatístico SPSS
para Windows
.
29
RESULTADOS e DISCUSSÃO
30
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análise Ultra-Sonográfica
A Tabela 1 apresenta a prevalência de PKD, por avaliação ultra-sonográfica, nos
animais examinados. Dos 116 animais (59% fêmeas), 61,21% foram negativos, 16,38%
foram positivos para presença de cisto e 22,41% apresentaram parênquima alterado, sem
visualização do cisto. Não foram verificadas diferenças entre os sexos (dados não
tabulados).
Tabela 1: Resultado dos exames Ultra-Sonográficos
Exame Ultra-sonográfico
N
º
Negativo 71 (61,21%)
Positivo (presença de cisto) 19 (16,38%)
Parênquima alterado 26 (22,41%)
Total 116 (100%)
As Figuras 8 e 9, representam imagens de rins com a presença de cistos. Foram
observadas formações anecóicas, encapsuladas, distribuídas através do parênquima
renal, com graus variados de destruição parenquimatosa. A Figura 10, representa os
casos indefinidos, caracterizados pela alteração parenquimatosa, sem a visualização do
cisto.
31
As principais alterações ecográficas são: pobre definição córtico-medular, dilatação
da pelve e aumento da ecogenecidade cortical.
Figura 8: Múltiplos cistos Figura 9: Cisto isolado
Figura 10: Perda da relação córtico-medular
A interpretação das imagens ecográficas, como cistos, seguiu o mesmo padrão
ultra-sonográfico, descrito por NYLAND e MATTOON (2005), contorno circular a ovóide,
conteúdo sem eco, paredes finas, lisas e nitidamente demarcadas com uma parede
distinta e um forte reforço de eco distal. Ao contrário de massas sólidas de aparência
similar, os cistos permanecem anecóicos, apesar do aumento dos padrões encontrados na
varredura. A parede proximal do cisto não aparece lisa. De acordo com CARVALHO
(2004), isto se deve à sobreposição dos artefatos de reverberação.
32
Foi possível observar a deformidade do contorno renal, em alguns rins que
apresentavam cistos grandes (2 cm). Para NYLAND (2005), cistos grandes podem
deformar o contorno renal, sendo mais proeminente a alteração quando múltiplos cistos
são identificados no mesmo rim. O autor também descreve que pode ocorrer
deslocamento, distorção e dilatação do sistema coletor, devido à obstrução parcial.
O número de cistos encontrados foi variado, desde um até múltiplos cistos (4-5) no
mesmo parênquima e com característica uni e bilateral. BILLER (2003) descreve que a
variação do tamanho dos cistos é algo freqüente e muito importante para definir a
gravidade da lesão no parênquima renal. Mais tarde, com o desenvolvimento da doença,
os ecos do sino renal central podem ser deformados por cistos maiores. Para BARRS et
al. (2001), BARTHEZ et al. (2003) e FERRANTE (2004) os rins policísticos são
caracterizados pelo número variável de cistos presentes no parênquima renal, variando em
tamanho e consistência. Ambos os rins estão invariavelmente comprometidos.
As alterações parenquimatosas encontradas foram: heterogenecidade da cortical,
identificando-se áreas de hipoecogenecidade e áreas de hiperecogenecidade sem
limitação evidente, pouca definição córtico-medular e graus de hidronefrose. Para
CANNON et al. (2001), dependendo da localização e tamanho, os cistos podem não ser
visualizados. Cistos dentro da córtex renal são mais facilmente identificados, devido ao
aumento de contraste entre o fluido anecóico do cisto e a relativa ecogenecidade do
cortical. Cistos medulares são mais difíceis de identificar, devido à sua característica
hipoecóica. Estes autores descrevem que a junção córtico-medular pode demonstrar
numerosas áreas de hipoecogenecidade e hiperecogenecidade dificultando a identificação
do verdadeiro cisto renal. Nesse estudo, um animal de dois anos de idade foi examinado
através da ultra-sonografia e considerado afetado, devido ao padrão encontrado (múltiplas
áreas de hipoecogenecidade na cortical). Entretanto, cinco meses após, este gato foi
eutanasiado sem relato de doença renal. No exame pós-mortem não foi identificada
formação de cisto renal. A origem das múltiplas regiões de hipoecogenecidade dentro da
cortical não foi esclarecida.
33
4.2 Análise Molecular
A Figura 11 representa a eletroforese em gel de poliacrilamida demonstrando
alguns produtos da PCR–RFLP. As canaletas 1 a 6 e 8 a 12, representam a identificação
do fragmento de 131pb, indicando o genótipo selvagem, sem a mutação. A canaleta n
º
7
representa o heterozigoto mutante com a presença dos fragmentos de 86 pb e 45 pb, além
daquele de 131pb.
Figura 11: Eletroforese em gel de poliacrilamida, identificando os produtos da amplificação
e clivagem pela PCR–RFLP. Canaleta 5: marcador de peso molecular de 25 pb
Foram verificados 26% de animais heterozigotos para a mutação do gene PKD, não
ocorrendo diferenças significativas entre machos e fêmeas (Tabela 2), como esperado, já
que trata de uma herança autossômica. Esta freqüência foi similar à descrita por HELPS et
al. (2007) que obtiveram uma taxa de 27,5%.
45
pb
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
131pb
86 pb
1
300 pb
275 pb
Marcador de
peso molecular
25 pb
34
Tabela 2: Freqüência de heterozigotos para PKD, distribuídos por sexo e freqüência
alélica na amostra total, detectados pela técnica da PCR-RFLP
Amostras Heterozigotos %
Machos 13 27%
48
Fêmeas 17
25%
68
Total 30 26%
Freqüência alélica 0,129
116
4.3 Análise comparativa entre PCR-RFLP e U.S.
A comparação entre os resultados da PCR-RFLP e os do ultra-som (Tabela 3),
indica que, dos animais negativos no ultra-som, 30% foram positivos do exame molecular e
5% dos positivos no ultra-som foram negativos na PCR-RFLP. CARVALHO (2004)
descreve que o diagnóstico ultra-sonográfico pode ser complicado, pois o tamanho dos
cistos é imperceptível na fase precoce e seu crescimento é variável. O U.S. oferece 95% de
confiabilidade quando realizado em gatos com mais de 10 meses de idade, mas não
descarta a possibilidade de aparecimento tardio do cisto.
Outro dado importante foi que, dos exames indefinidos no ultra-som, 23% dos
animais foram identificados como portadores por PCR-RFLP, indicando que a grande
maioria dos indivíduos em U.S. alterado tinham outra causa para as alterações
observadas. Assim, 50% do total de indivíduos portadores da mutação apresentaram, no
N
°
°°
°
35
U.S., resultados falsos negativos ou alteração inespecífica do parênquima demonstrando a
inespecificidade do exame ultra-sonográfico, quando comparado com o molecular.
Tabela 3: Resultados comparativos entre U.S. e PCR
Exames
Ultra-som
Positivo Negativo Alterado Total
PCR
Mutante
(CA)
15 (50%) 9 (30%) 6 (20%) 30
Selvagem (
CC)
4 (5%) 62 (72%) 20 (23%) 86
Total 19 71 26 116
X² = 34,58. 2D.F. P>0,001.
Dos animais positivos no exame de ultra-som 4 (5%) não apresentaram a mutação,
indicando outra causa para a formação do cisto. ROSS et al. (1982) e LULICH et al. (1994)
relacionaram vários agentes (drogas, endotoxinas e hormônios) como causadoras do
desenvolvimento de cistos renais, em animais. Por exemplo, a ingestão das drogas
difeniltiazole, ácido nordihidroguaiarético, difenilamina e corticosteróides causam formação
de cistos em rins normais. Os autores também afirmam que cistos renais adquiridos têm
sido identificados em cães e gatos com displasia renal, neoplasias, infecções e nefrite
túbulo-intersticial. Segundo GREEN (1996) e BECK e LAVELLE (2001), o padrão ultra-
sonográfico de múltiplas cavidades anecóicas, com reforço distal é altamente específica
para o diagnóstico do cisto renal, mas não específica para diagnóstico de PKD.
Para LYONS et al. (2004) e HELPS et al. (2007) o teste genético além de ser
altamente específico para detectar a mutação da PKD, gera outras vantagens em relação
ao ultra-som, como a comodidade de não necessitar da presença do animal e
36
principalmente o fato de o resultado independer da idade. Isto no entanto, não significa o
fim da exploração diagnóstica por ultra-som, que ainda necessitará ser utilizada para o
monitoramento da lesão, para avaliação da severidade da doença nos animais positivos
para PKD e para identificação de cisto renal de outra origem.
Em humanos, TORRES e HARRIS (2007) afirmaram que 15% dos cistos são
causados por mutação no gene PKD2, localizado no cromossomo 4, responsáveis pela
tradução da policistina 2. Assim é possível que, também em gatos, outras causas
genéticas, diferentes da AD-PKD, expliquem a ocorrência de cistos. Desta forma, não se
pode excluir que os indivíduos positivos por U.S., mas negativos por PCR-RFLP, tenham
de fato PKD, mas por mutações em outro gene. Vale salientar que, até o presente, o gene
PKD2, não foi descrito em felinos.
Nenhum animal do estudo apresentou homozigose para a mutação, embora com a
freqüência observada do alelo PKD + (13%), esperar-se-iam encontrar 2 homozigotos,
neste tamanho amostral; este dado reforça a hipótese de que animais homozigotos não
completam o desenvolvimento (LYONS et al., 2004 e HELPS et al., 2007).
Prevalência no Rio Grande do Sul x Prevalências Mundiais
As freqüências observadas neste trabalho diferem das encontradas por outros
pesquisadores, mesmo considerando que a maioria dos trabalhos tenham estimado as
prevalências apenas por exame ultra-sonográfico.
BARRS et al (2001) encontraram uma prevalência de 45% de PKD em gatos em
Sydney, Austrália.
Em estudo realizado no Reino Unido, CANNON et al. (2001) encontraram uma
prevalência de 49,2% de PKD em 146 animais, entre 6 meses e 15 anos, incluindo animais
sadios e doentes e também exames pós-mortem.
BARTHEZ et al. (2003) determinaram uma prevalência de 39,1% de PKD nos
animais examinados. Nesse estudo, foram excluídos animais com sinais clínicos ou
37
histórico de falha renal. O estudo evidenciou a similaridade da prevalência da PKD entre
vários países como: Austrália, Reino Unido, Estados Unidos e Alemanha.
Em recente estudo realizado por BONAZZI et al. (2007) a prevalência da PKD
encontrada foi de 41%. Os animais foram divididos em grupos, conforme a idade, menos
de 9 meses e mais de nove meses. Foram considerados positivos para PKD, animais que
apresentavam pelo menos um cisto, em um dos rins, no exame ultra-sonográfico. Também
foram considerados outros sinais ecográficos como sinal medular; foi comparada a
imagem encontrada na zona medular quando havia ou não presença de cisto,
determinando uma alteração no parênquima renal. Os resultados obtidos não
evidenciaram diferença significativa entre os grupos de idades diferentes e nem nos
resultados dos parênquimas alterados com sinais medulares.
No entanto, conforme outros pesquisadores, a idade do animal é um fator
importante para a identificação dos cistos, havendo maior dificuldade na identificação do
cisto, por U.S., em gatos com até 10 meses de idade (GRENN, 1996, BECK e LAVELLE,
2001, PRATES, 2005). BARRS et al. (2001), em um estudo da prevalência da doença na
Austrália, reafirmaram que a sensibilidade do exame ultra-sonográfico aumenta com a
idade, devido ao aumento progressivo do tamanho cisto. O cisto pode ser identificado em
filhotes de seis ou sete semanas, mas a ausência de cisto, nesta idade, não pode ser
definitiva, pois a visualização do cisto pode ocorrer mais tardiamente.
Em estudo realizado por BILLER (2003), foi obtida uma sensibilidade de 75% na
identificação de cisto renal em filhotes de quatro meses e de 91% em filhotes com 9 meses
de idade. Devido a estes resultados foi recomendado que para ser considerado negativo,
através do ultra-som a gato deverá ter no mínimo 10 meses. Entretanto, este autor define
que esta idade mínima é muito frustrante para os criadores, já que estes precisam decidir
quais dos filhotes ficarão para reprodução e quais serão comercializados.
Os valores mais baixos de PKD encontrados neste estudo (16% por U.S. e 26% por
PCR-RFLP), podem estar evidenciando a melhoria genética dos animais criados no Rio
Grande do Sul. Os criadores estão demonstrando uma constante preocupação com a
PKD; há pelo menos 8 anos, estão sendo realizados cruzamentos entre animais que não
apresentam o problema, identificados através de exames ultra-sonográficos e/ou por
diagnósticos genéticos realizados no exterior para a detecção da mutação PKD.
38
Este trabalho, além de permitir conhecer a prevalência real da PKD em gatos persa
e seus híbridos, possibilitou o estabelecimento de um programa de melhoramento genético
da raça, através da disponibilização do exame molecular, para os criadores de gatos das
raças afetadas. Os exames serão realizados, através do credenciamento do veterinário
responsável pela solicitação do exame, conforme Anexo 1. Esta estratégia permitirá a
eliminação da doença em nosso Estado, pois de acordo com HELPS et al. (2007) um
programa bem elaborado de teste genético e acasalamentos direcionados podem erradicar
a mutação da população felina.
39
CONCLUSÕES
40
5. CONCLUSÕES
A análise da prevalência de PKD em 116 gatos assintomáticos do Rio Grande do
Sul por duas metodologias (ultra-sonografia e diagnóstico molecular) permitiu as seguintes
conclusões:
● A taxa de prevalência encontrada nos animais neste estudo, foi de 26% para PCR-RFLP
e 16% para o U.S. Independente da metodologia, esta prevalência foi menor do que a
relatada em outros países, o que, provavelmente, reflete o cuidado que vem sendo tomado
por criadores de gatos da raça persa do Rio Grande do Sul, que, há pelo menos 8 anos,
estão realizando cruzamentos entre animais sem o problema.
● O método molecular foi mais eficiente para a detecção da PKD, pois somente 50% dos
animais portadores do alelo mutante, foram diagnosticados através do exame de ultra-
som.
● O U.S. é um método eficiente para detectar o cisto renal, porém ele não define a causa
da formação cística;
● O exame ultra-sonográfico não descarta a possibilidade de desenvolvimento de cisto
renal mais tardiamente;
● Apesar do ultra-som não poder definir a origem da formação do cisto, ele é
extremamente útil para monitorar a severidade da lesão parenquimatosa;
● A possibilidade da realização do exame molecular para a comunidade de criadores, que
não necessitará mais enviar amostras para o exame, no exterior, facilitará o controle e a
tentativa de erradicação da doença.
41
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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46
Anexo
47
CREDENCIAMENTO DE MÉDICO VETERINÁRIO
PARA REALIZAÇÃO DE EXAMES DE PCR-RLFP PARA PESQUISA DE PKD
HOSPITAL VETERINÁRIO DA ULBRA - LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA
Atribuições do Médico Veterinário credenciado:
a) Realizar a coleta do material ( anexo instrução de coleta )
b) Identificar o animal ( resenha, nº de registro, proprietário,anexo modelo )
c) Enviar material com requisição específica para o exame ao hospital veterinário da ULBRA.
d) Caso seja de seu interesse o proprietário poderá conduzir o animal ao HV-ULBRA, para
coleta de sangue, com requisição específica para o exame, emitida pelo veterinário
credenciado, cujo os dados serão de responsabilidade do mesmo.
Atribuições do Laboratório de Biologia Molecular do HV-ULBRA
a) Realização do Exame, desde que, a qualidade do material o permita.
b) Elaboração do laudo conforme os dados constantes na requisição
c) Envio do laudo ao endereço constante na requisição
d) O prazo de entrega do laudo será de cinco a vinte dias úteis , dependendo da rotina
laboratorial.
Instrução de coleta de material:
a) Sangue com anticoagulante ( EDTA ou Citrato de sódio ), sem heparina.
Volume de sangue: mínimo 1 ml.
b) Conservação : refrigerado
c) Tempo da coleta até a chegada no laboratório: 12 horas
d) Identificação do animal no frasco de coleta
Modelo de Requisição:
Solicito realização de PCR- RLFP, para pesquisa de PKD do animal abaixo identificado:
Nome: Idade: Raça: Sexo:
N° de registro: Pelagem:
Proprietário/ Criador:
Endereço completo para envio do laudo:
Data da solicitação e assinatura do veterinário credenciado.
Eu,_________________________________,médico veterinário,CRMV______. Estou de acordo
com as normas estabelecidas acima.
Canoas____ de _________ de 200__
_________________________________________ _________________________
Resp. Laboratório de Biotecnologia do HV- ULBRA Méd. Veterinário credenciado
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