( PDF ) Resinas vegetais coletadas por Scaptotrigona (Hymenoptera, Apidae): composição química e atividade antimicrobiana

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

Resinas vegetais coletadas por Scaptotrigona (Hymenoptera, Apidae): composição

química e atividade antimicrobiana

Ivan Paulo Akatsu

Tese apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e

Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das

exigências para a obtenção do título de Doutor em

Ciências, Área: Entomologia.

RIBEIRÃO PRETO – SP

2009

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

Resinas vegetais coletadas por Scaptotrigona (Hymenoptera, Apidae):

composição química e atividade antimicrobiana

Ivan Paulo Akatsu

Tese apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e

Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das

exigências para a obtenção do título de Doutor em

Ciências, Área: Entomologia.

Orientador: Prof. Dr. Ademilson Espencer Egea Soares

RIBEIRÃO PRETO – SP

2009

a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, meio convencional ou

eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Akatsu, Ivan Paulo

Resinas vegetais coletadas por Scaptotrigona (Hymenoptera, Apidae):

composição química e atividade antimicrobiana, Ribeirão Preto, 2009.

115f; il.

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras

de Ribeirão Preto, USP – Departamento de Biologia.

Orientador: Ademilson Espencer Egea Soares

1. Scaptotrigona. 2. Resinas vegetais. 3. Atividade antimicrobiana..

RESUMO

Neste trabalho foram abordados quatro objetivos. Primeiro: Averiguar indícios da

origem vegetal e composição química das resinas da própolis de colméias com

Scaptotrigona sp (Barra do Corda, MA) e Scaptotrigona aff. depilis (Estação

Experimental de Luis Antônio, SP). Segundo: Apurar a existência de atividade

antimicrobiana da resina da própolis de Scaptotrigona sp. e S. aff. depilis contra

microorganismos de interesse clínico. Terceiro, verificar a atividade antimicrobiana

das resinas da própolis de Scaptotrigona sp. e S. aff. depilis, contra microorganismos

isolados das próprias colméias. Averiguar a composição química de resina vegetal

após a manipulação destas por Scaptotrigona aff. depilis. Através de “ESI-(-)

fingerprints” indicou-se que as resinas coletadas por Scaptotrigona sp. originaram-se

em parte de Schinus terebenthifolius e contém terpenos com grupos ácidos. Já a

resina coletada por S. aff. depilis veio em parte de conífera, provavelmente de Pinus

sp. e possui os ácidos E/Z comúnico, agatálico e agático. As resinas das própolis de

Scaptotrigona sp. e S. aff. depilis não apresentaram atividade contra

microorganismos de interesse clínico. As resinas das própolis de S. aff. depilis

inibiram todos os microoganismos testados e as de Scaptotrigona sp. um fungo

filamentoso. Acessoriamente se testou a atividade de mel, alimento larval e pólen

fermentado de cada Scaptotrigona contra os microorganismos anteriores. O alimento

larval de Scaptotrigona sp. mostrou atividade contra todos os microorganismos e o

alimento de S. aff. depilis apenas foi ineficaz contra um fungo filamentoso. Através

de caracterização por cromatografia de fase gasosa acoplada à espectrometria de

massas (CG-EM) verificou-se que de Hymenaea courbaril (jatobá), provavelmente

manipulada em própolis por Scaptotrigona aff. depilis continha triterpenos. Também

verificou-se que a resina de jatobá apresentou diterpenos e um sesquiterperno.

Apesar destas resinas das própolis terem se mostrado clinicamente ineficazes, as

investigações com própolis de meliponíneos devem continuar. Todos os elementos

analisados mostraram atividade alguma contra os microorganismos associados à

colônia. Destacam-se na contribuição da sanidade do ninho o alimento larval,

independente de abelha, da própolis de Scaptotrigona aff. depilis, que contém

provavelmente resina de Pinus sp, que atesta os registros anteriores de atividade

antimicrobiana desta resina. A verificação das diferenças entre a resina de jatobá e a

provável própolis originada dela merecem maiores investigações.

ABSTRACT

In the present study, we aimed at four objectives. First: Inquiring indications of the

plant origin and chemical composition of the propolis resin of Scaptotrigona sp hives

from Barra do Corda, MA, Brazil and of Scaptotrigona aff. depilis hives placed at

Estação Experimental de Luis Antonio, SP, Brazil. Second: Investigating the

existence of antimicrobial activity of Scaptotrigona sp’s and Scaptotrigona aff. depilis’

propolis resins against microorganisms of clinical interest. Third: Verifying the

antimicrobial activity of Scaptotrigona sp’s and Scaptotrigona aff. depilis’ propolis

resins against microorganisms isolated from the proper hives. Fourth: Ascertaining

the chemical composition of the plant resins after their manipulation by

Scaptotrigona aff. depilis. Through ESI-(-) fingerprints we indicated that resins

collected by Scaptotrigona sp are partially originated from Schinus terebenthifolius

and present terpenes with acid groups. The resins collected by S. aff. depilis, come

from, partially, a conifer, probably Pinus sp and have E/Z communic acids, agathalic

acid and agathic acid. Scaptotrigona sp’s and S.aff. depilis’ propolis resins have not

showed activity against microorganisms of clinical interest. S. aff. depilis’ propolis

resins inhibited all of the tested microorganisms and Scaptotrigona sp.’s propolis

resins inhibited a filamentous fungus. Besides we tested the activity of honey, larval

food and fermented pollen of each Scaptotrigona against the microorganisms.

Scaptotrigona sp.’s larval food presented activity against all microorganisms and S.

aff. depilis' larval food was just ineffective against a filamentous fungus. Through

characterization by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) we

verified that Hymenaea courbaril (jatobá)

resins, probably manipulated at propolis by

Scaptotrigona aff. depilis had triterpenes. We also could verify that the resin of

Hymenaea courbaril presented diterpenes and a sesquiterpene. Although these

propolis resins had showed to be clinically ineffective, investigations with stingless

bees’ propolis must go on. All of the elements analysed showed some activity against

the microorganisms associated to the colony. It was possible to observe that the

main elements which contribute to the health of the nest are the larval food,

independent of the bee specie, and the Scaptotrigona aff. depilis ‘ propolis which

has, probably, Pinus sp resins, testifying previous registers of the antimicrobial

activity of this resin. The existence of differences between the resin of Hymenaea

courbaril and its probable originated propolis must be better investigated.

SUMÁRIO

RESUMO................................................................................................................

03

ABSTRACT............................................................................................................. 05

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 10

1.1 OBJETIVOS...................................................................................................... 11

1.1.1 Composição química das resinas da própolis das vedações........................ 11

1.1.2 Atividade antimicrobiana das resinas das própolis das vedações................. 11

1.1.3 Resinas das vedações e sanidade do ninho.................................................. 12

1.1.4 Manipulação das resinas e sua composição química.................................... 12

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................ 13

2.1 O GÊNERO Scaptotrigona Moure, 1942, E MELIPONICULTURA................... 13

2.2 RESINAS VEGETAIS........................................................................................ 16

2.3 PRÓPOLIS........................................................................................................ 26

2.4 INSETOS EUSSOCIAIS E SANIDADE DOS NINHOS..................................... 28

3 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................... 30

3.1 LOCAL............................................................................................................... 30

3.2 METODOLOGIA................................................................................................

31

3.2.1 Composição química das resinas da própolis das vedações........................ 31

3.2.1.1 Obtenção das amostras de própolis........................................................... 31

3.2.1.2 Avaliação da composição química das resinas das própolis...................... 31

3.2.1.3 Informações adicionais: massa das própolis, proporção de resina na

própolis, realocação da própolis............................................................................. 33

3.2.2 Atividade antimicrobiana das resinas da própolis das vedações................... 34

3.2.2.1 Obtenção da própolis e extração de resinas............................................... 34

3.2.2.2 Ensaios para avalição da atividade das resinas contra microorganismos

de interesse clínico.................................................................................................. 35

3.2.3 Resinas das vedações e sanidade da colônia............................................... 41

3.2.3.1 Isolamento de fungos filamentosos............................................................. 41

3.2.3.2 Avaliação da atividade das resinas contra os fungos isolados................... 42

3.2.3.3 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento

larval, mel e pólen contra fungos isolados.............................................................. 47

3.2.3.4 Isolamento de bactérias.............................................................................. 48

3.2.3.5 Avaliação da atividade das resinas contra bactérias isoladas.................... 50

3.2.3.6 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento

larval, mel e pólen contra bactérias isoladas.......................................................... 51

3.2.4 Manipulação das resinas e sua composição química.................................... 54

4 RESULTADOS..................................................................................................... 56

4.1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS RESINAS DA PRÓPOLIS DAS VEDAÇÕES..

56

4.1.1 Composição química das resinas das própolis.............................................. 56

4.1.2 Informações adicionais: massa da própolis, proporção de resina na

própolis, realocação da própolis............................................................................. 56

4.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS RESINAS DA PRÓPOLIS DAS

VEDAÇÕES............................................................................................................ 59

4.2.1 Ensaios para avaliação da atividade das resinas contra microorganismos

de`interesse clínico................................................................................................. 59

4.3. RESINAS DAS VEDAÇÕES E SANIDADE DA COLÔNIA.............................. 60

4.3.1 Avaliação da atividade das resinas contra os fungos isolados...................... 60

4.3.2 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento

larval, mel e pólen contra fungos isolados.............................................................. 60

4.3.3 Avaliação da atividade das resinas contra as bactérias isoladas.................. 67

4.3.4 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento

larval, mel e pólen contra as bactérias isoladas..................................................... 67

4.4 MANIPULAÇÃO DAS RESINAS E COMPOSIÇÃO QUÍMICA........................... 72

5 DISCUSSÃO........................................................................................................ 78

5.1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS RESINAS DA PRÓPOLIS DAS VEDAÇÕES. 78

5.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS RESINAS DA PRÓPOLIS DAS

VEDAÇÕES............................................................................................................ 80

5.2.1 Ensaios para avaliação da atividade das resinas contra microorganismos

de interesse clínico.................................................................................................. 80

5.3 RESINAS DAS VEDAÇÕES E SANIDADE DA COLÔNIA............................... 83

5.3.1 Avaliação da atividade das resinas contra os fungos isolados...................... 83

5.3.2 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento

larval, mel e pólen contra os fungos isolados......................................................... 84

5.3.3 Avaliação da atividade das resinas contra as bactérias isoladas................... 85

5.3.4 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento

larval, mel e pólen contra as bactérias isoladas..................................................... 86

5.3.5 Considerações gerais.................................................................................... 87

5.4 MANIPULAÇÃO E MUDANÇA DO PERFIL QUÍMICO DAS

RESINAS................................................................................................................. 89

6 CONCLUSÃO....................................................................................................... 91

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 92

APÊNDICES............................................................................................................ 108

ANEXOS.................................................................................................................. 110

10

INTRODUÇÃO

Dentre as abelhas sem ferrão encontra-se o gênero Scaptotrigona

(Hymenoptera, Apidae), que é amplamente distribuído pela região Neotropical. Os

meliponíneos, bem como outros grupos de abelha utilizam resinas vegetais para a

construção de seus ninhos. Os meliponíneos utilizam as resinas misturadas em

diferentes quantidades de cera. Comumente denomina-se de própolis as porções de

resina encontradas nos ninhos de meliponíneos puras ou misturadas a uma

quantidade de cera menor que no cerume. A própolis dos meliponíneos encontra-se

nas calafetações do ninho (MICHENER, 1974; ROUBIK, 1989; NOGUEIRA-NETO,

1997). A utilização do termo própolis relacionado a meliponíneos, provavelmente

ocorreu por analogia com Apis mellifera com a qual o termo própolis é

historicamente associado (GARY, 1975) A própolis de A. mellifera já possui um

considerável número de estudos em relação a várias atividades biológicas bem

como de caracterização da composição química (BANKOVA, DE CASTRO,

MARCUCCI, 2000; FARRÉ, FRASQUET e SANCHEZ, 2004)). No caso da própolis

dos meliponíneos estes tipos de estudos começam a ganhar volume nos últimos

anos (BANKOVA e POPOVA, 2007). As resinas vegetais tem a função primária de

defesa das plantas contra herbívoros e patógenos. Por isso acredita-se que estes

sejam variáveis importantes no processo seletivo, conduzindo as resinas a

características químicas que lhes conferem, por exemplo, atividade antimicrobiana

(LANGENHEIM, 2003). Esta capacidade antimicrobiana poderia continuar a ocorrer

nas própolis encontradas nos ninhos de meliponíneos, auxiliando na manutenção da

sua sanidade. Existem indícios que isto ocorra em ninhos de (CHRISTE, et al.,

2003). Ainda não existem muitas informações sobre as particularidades que

envolvem a manipulação das resinas pelos meliponíneos.

11

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 Composição química das resinas da própolis das vedações

BANKOVA et al. (1998a) encontraram variações sazonais na composição

química de amostras de própolis utilizadas por Apis mellifera, oriundas da mesma

região do Brasil. Isto pode ocorrer porque as resinas estão sujeitas a variações

temporais na sua produção (LANGENHEIM, 2003). Assim sendo, a disponibilidade

de resinas para as abelhas sem ferrão também pode variar temporalmente

(HOWARD, 1985). E ainda BANKOVA, de CASTRO e MARCUCCI (2000) apontam

que a origem vegetal de resinas utilizadas por abelhas pode ser inferida através de

diferenças apontadas por análises químicas. Portanto, justifica-se aventar o seguinte

objetivo de trabalho:

- Averiguar indícios da origem vegetal e composição química das resinas da

própolis que compõem as vedações de colméias com Scaptotrigona sp. e

Scaptotrigona aff. depilis, instaladas em duas localidade, a partir de amostras

coletadas durante um ano.

1.1.2 Atividade antimicrobiana das resinas das da própolis das vedações

Existem indicações que apontam atividade da própolis produzida por abelhas

sem ferrão, contra microorganismos de interesse clínico (KUJUMGIEV et al., 1999;

VELIKOVA et al., 2000; FERNANDES Jr. et al, 2001). Já existem projetos de

desenvolvimento comunitário baseados em produtos de abelhas sem ferrão. Logo, a

indicação de novas possibilidades de uso dos produtos das abelhas sem ferrão,

pode colaborar no desenvolvimento de comunidades tradicionais e rurais como já

ocorre em relação ao mel (VILLAS-BÔAS e MALASPINA, 2005; PIRES,

DRUMMOND e LACERDA, 2006). Por conseguinte, propõe-se o seguinte objetivo

de trabalho:

- Apurar a existência de atividade antimicrobiana da resina da própolis de

vedações de colméias de Scaptotrigona sp. e Scaptotrigona aff. depilis,

instaladas em duas localidades do Brasil, contra microorganismos de interesse

clínico.

12

1.1.3. Resinas das vedações e sanidade do ninho

No interior dos ninhos de insetos eussociais, como por exemplo, formigas

muitas vezes encontra-se uma grande concentração de indivíduos, além de

condições ambientais ótimas para o desenvolvimento de patôgenos (WHEELER,

1910; HÖLLDOBLER e WILSON, 1990). Porém, entre os insetos eussociais existem

estratégias para manter a sanidade dos ninhos. Entre elas observa-se a retirada de

mecônios do ninho, comportamento que é visto em abelhas sem ferrão (ROUBIK,

1989; DUNCAN e HART, 2009). Bem como se verificou que formigas retiram ou

isolam cadáveres e afastam material em decomposição do ninho (HÖLLDOBLER e

WILSON, 1990). Há também indícios que existe comunicação sobre a existência de

patógenos entre cupins da espécie Zootermopsis gusticollis (ROSENGAUS et al.,

1998). Segundo CHRISTE et al. (2003) formigas Formica paralugubris utilizam

resinas vegetais para diminuir a quantidade de microorganismos em seus ninhos.

Por isso, se torna plausível estabelecer o seguinte objetivo de trabalho:

- Inquirir se a atividade antimicrobiana, das resinas extraídas da própolis dos

ninhos de Scaptotrigona, auxilia na manutenção da sanidade dos mesmos,

através da verificação da atividade das resinas contra microorganismos

isolados de seus próprios ninhos.

1.1.4 Manipulação das resinas e sua composição química

Foi observado que operárias de Plebeia emerina que manipulam própolis

possuem glândulas salivares e intramandibulares ativas (SANTOS, 2007). A autora

propõe que as secreções das glândulas intramandibulares mantenham a

viscosidade da própolis facilitando a manipulação destas pelas operárias. A autora

também propõe que as glândulas intramandibulares também teriam alguma função

associada à manipulação de própolis/resinas. Assim, para averiguar maiores

detalhes da manipulação de resinas por Scaptotrigona aff. depilis propõe-se:

- Averiguar a composição química de resinas após a manipulação destas por

Scaptotrigona aff. depilis e comparar com a composição da resina antes da

manipulação.

13

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 O GÊNERO Scaptotrigona Moure, 1942, E MELIPONICULTURA

O grupo de espécies sob o gênero Scaptotrigona, pertence ao grupo de

abelhas eussociais (MICHENER, 1974) comumente denominado de “abelhas

indígenas sem ferrão” (NOGUEIRA-NETO, 1953). MOURE (1942) propôs o

estabelecimento de Scaptotrigona como sendo este um novo subgênero de Trigona

(Meliponidae). O autor apresenta os caracteres que justificariam a separação deste

do subgênero Trigona (Nannotrigona) (SCHWARZ, 1938). O autor também descreve

a nova espécie Trigona (Scaptotrigona) depilis, a qual se reuniria a T. postica e a T.

tubiba sob o novo subgênero. MOURE (1951) dispôs as abelhas sem ferrão na

subfamília Meliponinae (Apidae), diferente de MICHENER (1944) que as propôs

como tribo Meliponini (Apidae, Apinae) e SCHWARZ (1948) que as considerou como

família (Meliponidae). MOURE (1951) também considerou como havendo doze

gêneros na subfamília para região neotropical, alguns dos quais apresentados como

subgênero por SCHWARZ (1948). Assim sendo Nannotrigona torna-se gênero,

sendo Scaptotrigona considerado subgênero deste. MOURE (1961) propôs

Meliponinae com duas tribos (Meliponini e Trigonini) e Scaptotrigona ainda continua

como subgênero de Nannotrigona. CAMARGO E MOURE (1988) reforçam a posição

em favor da elevação de subgêneros de Trigonini da região neotropical para gênero.

Em SILVEIRA, MELO e ALMEIDA (2002) o gênero Scaptotrigona, e as demais

abelhas sem ferrão, foram classificados na tribo Apini e subtribo Meliponina (Apidae,

Apinae). Na proposta de rearranjo da classificação das abelhas defendida por MELO

e GONÇALVES (2005), todas as abelhas são reunidas em uma única família

(Apidae) e as famílias tradicionalmente reconhecidas são rebaixadas a subfamília.

Nesta proposta a subtribo Meliponina mantém seu status. MICHENER (2007)

mantém as abelhas sem ferrão na tribo Meliponini (Apidae, Apinae). O autor também

expressa sua hesitação em manter Scaptotrigona como gênero. Pois, crê que

Scaptotrigona deveria ser classificado como subgênero de Nannotrigona.

ROUBIK, SEGURA e CAMARGO (1997) utilizando informações morfológicas

propõem que Scaptotrigona é grupo irmão de Meliwillea, um novo gênero descrito

pelos autores. Isto é confirmado pela filogenia de abelhas sem ferrão inferida por

COSTA et al. (2003), a partir de seqüências de DNA mitocondrial. Em ambas as

14

filogenias Nannotrigona não é grupo-irmão de Scaptotrigona+Meliwillea. Isto pode

implicar em revisão das propostas de relação entre Scaptotrigona e Nannotrigona,

apresentadas em SCHWARZ (1938), MOURE (1961) e MICHENER (2007).

Scaptotrigona possui distribuição através da região Neotropical, do centro-sul

do México ao norte da Argentina (SCHWARZ, 1948; MOURE, URBAN e MELO,

2007). MOURE, URBAN e MELO (2007) apresentam 21 espécies bem definidas sob

o gênero Scaptotrigona. MICHENER (2007) indica que o gênero apresentaria por

volta de 24 espécies. Segundo MOURE, URBAN e MELO (2007), as espécies que

ocorrem no Brasil são: S. affabra, S. bipunctata (nomes comuns: “canudo”,

“tapesuá”, “tubuna”), S. depilis (“canudo”, “mandaguari”, “tapezuá”, “tombuna”,

“tubiba”), S. fulvicutis, S.polystica (“bui-kaiaki”, “imerê-ti”, “mijui”, “bijui”), S. postica,

S. tubiba (“tubi”, “tapissuá”, “tubi bravo”, “tuibá”) e S. xantotricha (“abelha fedente”,

“mandaguari amarelo”, “trompeta”, “tujumirim”, “mandagoari”). SILVEIRA, MELO e

ALMEIDA (2002) pontuam que existem em todo o Brasil diversas espécies ainda não

descritas muitas delas sendo de complexos de difícil separação.

Scaptotrigona é encontrada nidificando em cavidades pré-existentes, em

árvores e em construções humanas (CAMARGO, 1970; WILLIE e MICHENER, 1973;

ROUBIK, 1979; ROUBIK, 1983, FREITAS, 2001). A entrada do ninho é constituída

por um tubo no qual algumas operárias se posicionam ao longo da borda para

defesa do ninho. Na parte interna, os ninhos estão estruturados com favos de cria

em posição horizontal, os quais estão envolvidos em um invólucro. Ao redor dessas

estruturas estão dispostos os potes de mel e pólen. As estruturas antes descritas

são construídas com cerume (cera mais resinas vegetais). Os ninhos ainda possuem

revestimentos e vedações associados a resinas vegetais (SCHWARZ, 1948; WILLIE

e MICHENER, 1974; ROUBIK, 1979; WILLIE, 1983; NOGUEIRA-NETO, 1997;

ROUBIK, 2006). Muitas espécies de Scaptotrigona podem ser consideradas

agressivas, a se deduzir pelo seu nome comum, “enredapelos”, em países de língua

espanhola (MOURE, URBAN e MELO, 2007). Bem como pelas descrições de

agressividade apresentadas por CAMARGO (1970), MICHENER (1974); ROUBIK

(1979); CAMARGO e POSEY (1990). Os ninhos de Scaptotrigona podem atingir

dimensões consideráveis e conter grande número de indivíduos. Como, por

exemplo, S. pectoralis (20 favos e 5201 indivíduos), S. tubiba (25 e 1764 indivíduos)

e S. barrocoloradensis (28 favos e 7827 indivíduos) (ROUBIK, 1979; ROUBIK,

1983).

15

No México, desde a época pré-hispânica, a meliponicultura é praticada pelos

Maias e outras etnias, como os Nautls. Observou-se S. pectoralis, S. mexicana e S.

helwegeri entre as espécies criadas, além de Melipona beccheii e Nannotrigona

perilampoides (SCHWARZ, 1948; ACERETO e FREITAS, 2005; CORTOPASSI-

LAURINO et al., 2006). No Brasil os povos indígenas, ao que parece, praticavam,

comumente, o extrativismo dos elementos produzidos pelos meliponíneos, dada a

indicação de MAACK (1968) em relação aos Guarani-Carijós. Segundo KEER,

CARVALHO e NASCIMENTO (1996) M. compressipes, no Maranhão, e M.

scutellaris em outros estados da região Nordeste foram criadas por diversas etnias.

CAMARGO e POSEY (1990) listaram as espécies de abelhas sem ferrão

exploradas, em geral, de forma extrativista, pelos Kayapós, ainda que por vezes

fossem criadas. Neste trabalho citam os conhecimentos dos Kayapós a respeito de

ecologia, biologia e morfologia e taxonomia destas abelhas bem como aspectos

culturais influenciados pelos meliponíneos e outros insetos sociais. Entre as abelhas

utilizadas estavam S. polystica (imerê-ti) e S. nigrohirta (nomina nuda segundo

MOURE, URBAN e MELO, 2007) (imerê-nhy-kamrek) das quais os Kayapós

consomem o mel, pólen, larvas e pupas, além de utilizar o cerume na confecção de

utensílios. Tendo em vista a verificação da possibilidade de manejo de S. aff. depilis

YAMAMOTO (2007) levantou informações a respeito da produção de mel em S. aff.

depilis. Isto porque CORTOPASSI-LAURINO et al. (2006) apontam que

Scaptotrigona ao lado de Melipona, Cephalotrigona e Tetragona são os gêneros

neotropicais que possuem considerável produção de mel. YAMAMOTO (2007)

também averiguou as propriedades físico-químicas e parâmetros microbiológicos os

quais se mostraram positivos. Adicionalmente, autora levantou indícios de boa

aceitação do sabor do mel.

16

2.2 RESINAS VEGETAIS

LANGENHEIM (2003) define, segundo a própria autora de forma funcional,

resinas vegetais como sendo “...uma mistura lipossolúvel de compostos fenólicos ou

terpenóides secundários que são (1) usualmente secretados por estruturas

especializadas localizadas tanto internamente quanto na superfície da planta e (2)

de potencial significado em interações ecológicas”. Os terpenóides, os quais

compõem também resinas vegetais, constituem-se na categoria mais abundante e

diversa de metabólitos secundários das plantas (McGARVEY e CROTEAU, 1995;

1991; DUDAREVA, PICHERSKI e GERSHENZON, 2004). Os terpenóides (ou

isoprenóides) são reunidos em um mesmo grupo por possuírem como elemento

estrutural o isopreno (C

5

H

8

), que é unido através de uma via de síntese comum

(LANGENHEIM, 2003) A síntese dos terpenóides que compõem as resinas, e os

terpenóides em geral, pode ocorrer através de duas vias (fig.1). A primeira é a via do

mevalonato (MVA) a partir da acetil-CoA (NEWMAN e CHAPPELL, 1999;

DUDAREVA, PICHERSKI e GERSHENZON, 2004). A segunda é a via do

metileritritol fosfato (MEP) a partir do piruvato e gliceraldeídeo–3-fosfato (ROMHER,

1999; DUDAREVA, PICHERSKI e GERSHENZON, 2004). Na via do mevalonato três

moléculas de acetil-CoA são ligadas, (piro)fosforiladas, descarboxiladas e

desidratadas para produzir isopentenil difosfato (IPP) (LANGENHEIM, 2003). O IPP

é a unidade básica C

5

dos terpenóides (OGURA e KOYAMA, 1998). O dimetilalil

difosfato (DMAPP), que é isômero do IPP, ao qual as unidades de IPP podem ser

adicionadas em passos seqüenciais de alongamento da cadeia (fig.1). Estas

reações são mediadas por enzimas chamadas de preniltransferases (OGURA e

KOYAMA, 1998). Assim, uma unidade de DMAPP se combina com uma de IPP para

formar o geranil difosfato (GPP) que é o precursor C

10

de todos os monoterpenos.

Caso haja a adição de duas moléculas de IPP ao DMAPP, se obtém o farnesil

difosfato (FPP) que se constitui no precursor C

15

de todas os sesquiterpenos.

Similarmente, uma tripla adição de IPP ao DMAPP, resulta no precursor C

20

dos

diterpenos, o geranil-geranil difosfato (GGPP). A ligação de duas moléculas

(dimerização) de FPP resulta em compostos C

30

, os triterpenos. Existem ainda os

tetraterpernos (C

40

) e os politerpenos (C

n>40

), sobre os quais não existem indicações

que sejam constituintes de resinas (LANGENHEIM, 2003). Ocorre uma

17

compartimentalização das vias do MVA e MEP, bem como a produção dos

diferentes tipos de terpenóides (fig.1). Dentro do retículo endoplasmático e no

citoplasma (citosol) ocorre a via do MVA, cujos IPP(s) originarão FPP e a partir deste

sesquiterpenos e triterpenos (fig.1). Já no interior dos plastídios se desenvolve a via

do MEP, cujos IPP(s) formarão GPP e partir deste monoterpenos e diterpenos (fig.1)

(NEWMAN e CHAPPELL, 1999; LANGENHEIM, 2003; DUDAREVA, PICHERSKI e

GERSHENZON, 2004; CHENG et al., 2007).

2X

Plastídeo

Citosol

–

Retículo endoplas

mático (RE)

2 IPP

(C

20

)

GGPP

Diterpenos

Triterpenos

Via do MEP

Via do MVA

IPP

DMAPP (C

5

)

Citosol - RE & Plastídeo

IPP

2 IPP

FPP

(C

15

)

(C

10

)

GPP

Monoterpenos

Sesquiterpenos

Figura 1 - Biossíntese de terpenóides representada de acordo com a

compartimentalização das duas vias. Os terpenos presentes nas resinas estão nas

caixas (tracejadas terpenos voláteis; linha sólida não voláteis). DMAPP – dimetilalil

difostato; MAV – via do ácido mevalônico; MEP – via metileritritol fosfato; FPP – farnesil

difosfato; GPP – geranil difostato; GGPP – geranil-geranil difostato; IPP – isopentenil

difosfato. Baseado em LANGENHEIM (2003).

18

Os fenólicos compõem um grupo de compostos que possuem um anel

aromático ao qual pode estar ligado grupos substituintes hidroxila, carboxilia ou

metoxila e muitas vezes outros anéis não aromáticos (SALISBURY e ROSS, 1992).

Um esquema das vias de síntese de fenólicos em plantas e que também vão compor

as resinas é apresentado na figura 2 (LANGENHEIM, 2003). A via do ácido

chiquímico produz aminoácidos com anel aromático, como a fenilalanína (fig. 2). A

fenilalanína é convertida em ácido cinâmico, que é composto por um anel aromático

no qual se liga um radical de três carbonos (propil). Esta conversão é um processo

que leva a formação de vários componentes das resinas fenólicas e é catalizada

pela enzima fenilalanina amônia liase. Assim, ocorre a formação de fenilpropanóides

derivados do ácido cinâmico, que também são as unidades básicas para a formação

de outros fenólicos, na via dos fenilpropanóides (fig. 2). Os fenilpropanóides podem

apresentar formas diméricas. Outra categoria de fenólicos encontrados nas resinas

são os flavonóides. Estes são baseados em uma estrutura de dois anéis benzênicos

conectados por uma cadeia C

3

. Um dos anéis vem da via do ácido chiquímico e o

outro é produzido através de unidades de acetato geradas na via do ácido malônico

(fig. 2). Muitas vezes a cadeia C

3

cicla com uma hidroxila adjacente, formando um

anel heterocíclico. Uma subclasse de de flavonóides que ocorre nas resinas são as

flavonas, que se caracterizam pela falta de um açúcar (aglicona) substuinte. Os

fenólicos podem apresentar terpenos (prenil) ligados a sua estrutura, desta forma

são chamados prenilados fenólicos. Os terpenóides em geral estão ligados

diretamente ao anel aromático, mas podem estar ligados ao grupo fenólico (HELDT,

2005). WOLLENWEBER e DIETZ (1981), observaram que flavonóides ocorrem junto

a sesquiterpenos e triterpenos. Esta observação pode ser somada à proposição de

que enzimas que participam da síntese de fenilpropanóides e flavonóides se

agrupariam no retículo endoplasmático (HRAZDINA e JENSEN, 1984; WINKEL-

SHIRLEY, 1999). Desta forma é possível propor que flavonóides e terpenóides são

sintetizados em locais próximos nas células vegetais. Em relação aos tecidos das

plantas, as resinas podem ser armazenadas em estruturas secretoras internas

(dutos), isto comumente ocorre em coníferas e angiospermas tropicais. Nestes

grupos, as estruturas secretoras estão revestidas por células parenquimáticas

chamadas de células epiteliais, nas quais os componentes das resinas são

sintetizados (LANGENHEIM et al. 1978). Estes dutos ganham a denominação de

canais se forem alongados e de bolsas ou cistos se forem arredondados

19

(DICKINSON, 2000; LANGENHEIM, 2003). As resinas terpênicas produzidas em

estruturas secretoras internas podem ser distinguidas em relação a sua produção

em constitutivas (pré-formadas e armazenadas) ou induzidas (reação a trauma)

(LEVIN, 1976; LEWINSOHN, GIJZEN e CROTEAU, 1990). Na superfície das plantas

as estruturas secretoras de resinas são representadas por tricomas glandulares e

células epidérmicas (DICKINSON, 2000; LANGENHEIM, 2003). Estas estruturas são

encontradas apenas em angiospermas, em geral de hábito arbustivo

(LANGENHEIM, 2003).

Figura 2 – Esquema geral da biossíntese dos maiores grupos de fenólicos

presentes nas resinas

. Baseado em LANGENHEIM (2003).

Via do ácido

chiquímico

Fenilalanina

Fenilalanina amônia

-

liase

(PAL)

Ácido cinâmico

Fenilpropanóides

Flavonóides lipofílicos

Via dos fenilpropanóides

Via do ácido

mevalônico

Acetil CoA

Componentes fenólicos das resinas

20

Comumente se propõe que a função primária desempenhada pelas resinas,

nas plantas que as produzem, seja de defesa contra herbívoros e patógenos

(LANGENHEIM, 1969; LEVIN, 1976; AMBRUSTER et al., 1997). A defesa pode ter

natureza mecânica, como ocorre com as resinas constitutivas de coníferas. Estas

resinas são as primeiras a serem liberadas, podendo deslocar e sepultar insetos

herbívoros e selar injúrias á entrada de microorganismos. Isto ocorre porque logo

que liberadas, estas resinas são viscosas e à medida que mono e sesquiterpenos,

que são voláteis, evaporam a fração de diterpenos se solidifica (NORIN, 1972;

PHILLIPS e CROTEAU, 1999;

．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．

TRAPP e CROTEAU, 2001; LANGENHEIM, 2003). A

defesa pode exibir ação química, como a resina das folhas de Hymenaea que é

composta por sesquiterpenos, alguns dos quais inibem o consumo das folhas

(LANGENHEIM, FOSTER e McGINLEY, 1980).

Em LANGENHEIM (2003) é possível distinguir três exemplos de sistemas de

relações entre planta-herbívoro/patógeno mediadas por resinas. O primeiro exemplo

apresenta Pinus ponderosa (Pinaceae), uma conífera da América do Norte. Existem

evidências da ação de insetos herbívoros no Triássico Superior, há 220 milhões de

anos (SCOTT, ANDERSON e ANDERSON, 2004; KEELING e BOHLMANN, 2006).

Bem como há evidências que a produção de resina por coníferas remonta ao

Cretáceo Inferior, há 120-135 milhões de anos (ALONSO et al., 2000). Dentro deste

período de tempo, é plausível o desenvolvimento de diferentes cenários na relação

coníferas-herbívoros/patôgenos, como os observados em Pinus ponderosa.

STURGEON (1979) observou no estado da Califórnia (EUA) variações na

quantidade de monoterpenos da resina constitutiva em P. ponderosa. Os

monoterpenos são os principais componentes da fração volátil das resinas de

coníferas (TRAPP e CROTEAU, 2001). STURGEON (1979) propôs que estas

variações são provocadas pela pressão dos hábitos alimentares do besouro

brocador Dendroctonus brevicomis (Scolytidae). Os adultos de besouros brocadores,

Scolytidae, constroem galerias no tronco de árvores onde se acasalam, a seguir,

suas larvas constroem túneis menores nos quais se alimentam, por exemplo, de

seiva (HILL, 1997). STURGEON (1979) verificou que populações de pinheiros que

passaram por ataques grandes de D. brevicomis, apresentam concentrações

maiores de limoneno. Este tem baixa concentração em populações nas quais não

houve ataque pesado. Isto porque se sabe que limoneno repele D. brevicornis.

Porém, também se observou que dentro das populações mais atacadas, a

21

quantidade de α-pineno varia mais que nas populações menos atacadas. Como α-

pineno é precursor de feromônio para os besouros STURGEON (1979) propôs que

D. brevicomis tenderia a se alimentar em árvores com baixas concentrações de

limoneno e altas de α-pineno, que é o fenótipo mais comum antes do ataque. Dessa

forma, num primeiro momento a seleção seria direcional no sentido de fenótipos com

alta concentração limoneno e baixa de α-pineno. Assim, a seguir, indivíduos com

alta concentração de limoneno vão se tornando comuns. Isto aumenta as chances

de surgirem árvores com fenótipo com concentrações altas de limoneno e α-pineno,

caracterizando seleção dependente de freqüência. Um estudo similar foi realizado

por STURGEON e MITTON (1986) no estado do Colorado. Porém não se constatou

diferenças entre a composição de monoterpenos da resina de populações de P.

ponderosa var. scopulorum (LANGENHEIM, 2003) atacadas por Dendroctonus

ponderosae e a composição de árvores tomadas ao acaso de áreas adjacentes. Os

autores também verificaram que a variação na composição das resinas de

populações atacadas na Califórnia (STURGEON, 1979) é três vezes maior que a do

Colorado. Bem como se observou que D. ponderosae pode atacar igualmente P.

contorta var. latifolia (LANGENHEIM, 2003) e P. flexilis, o que não ocorria na

Califórnia, porque existe apenas P. ponderosa. Adicionalmente sabe-se que a

capacidade de digestão de terpenos por D. brevicomis e D. ponderosae é similar.

Pelas inferências anteriores STURGEON e MITTON (1986) aventaram que a

pressão exercida por D. ponderosae resulte numa variação entre as espécies de

Pinus, mas não dentro da população de uma determinada espécie. Fora o dano

direto, os besouros brocadores (Scolytidae) podem ser vetores de fungos

patogénicos (Ophiostomataceae), que aumentam os danos às coníferas (PHILLIPS

e CROTEAU, 1999). Os terpenos das resinas também podem inibir o crescimento de

alguns destes fungos (BRIDGES, 1987). O esquilo Sciurus aberti também parece

gerar pressões seletivas sobre as resinas defensivas de P. ponderosa. S. aberti se

alimenta de tecidos abaixo da casca de ramos superiores de P. ponderosa

(SNYDER, 1992). O autor verificou que árvores atacadas por esquilos têm fluxo de

resina menor que árvores não atacadas. Igualmente notou-se que as concentrações

de dois monoterpenos (β-pineno e β-felandreno) são menores nas árvores atacadas.

O autor em experimento com iscas embebidas e não embebidas em β-pineno e β-

felandreno, observou que esquilos preferem as não embebidas. Estas evidências

somadas ao fato de que árvores atacadas produzem menos estruturas reprodutivas

22

e sementes, além de crescerem menos (SNYDER, 1993), apontam que S. aberti

produz seleção direcional que pode aumentar a freqüência de fenótipos de árvores

com maior fluxo de resina com concentrações maiores de β-pineno e β-felandreno.

O segundo exemplo apresentado por LANGENHEIM (2003) trata do gênero

Hymenaea (Leguminosae: Caesalpinioideae). O gênero Hymenaea inclui as árvores

denominadas popularmente de “jatobá”. Vestígios de âmbar indicam que o gênero

está presente ao menos desde a metade do Terciário (LANGENHEIM, 1969;

LANGENHEIM, 2003). O gênero distribui-se por áreas tropicais da região

Neotropical e leste da África (LANGENHEIM e LEE, 1974). As resinas de Hymenaea

são compostas de sesquiterpenos na fração volátil e de diterpenos na não volátil

(LANGENHEIM, 2003). LANGENHEIM et al. (1978) analisaram indivíduos de

diferentes populações do de Hymenaea courbaril no Brasil, Costa Rica e México.

Observou-se que os jatobás apresentaram resinas constitutivas com diferentes

composições ao longo de tecidos e órgãos. Os autores propuseram que isto ocorre

devido a pressões de diferentes herbívoros e patógenos sobre as diferentes partes

da planta. Assim, previram que as resinas mais viscosas do tronco que são ricas em

diterpenos que podem deslocar os herbívoros, como as resinas de coníferas. Bem

como os diterpenos labdenos presentes e que se polimerizam rapidamente selariam

os ferimentos no tronco (LANGENHEIM, 2003). Esta previsão apóia-se em JANZEN

(1975) que verificou uma maior quantidade de resinas nas vagens indeiscentes de

H. courbaril na Costa Rica do que nas vagens de árvores em Porto Rico. Esta

seleção direcional para uma maior quantidade de resinas, seria decorrente do

ataque de besouros do gênero Rhinochenus, que não existem em Porto Rico.

LANGENHEIM et al. (1978) ressaltam que as resinas das vagens são

predominantemente diterpenos labdenos. Os autores também notaram que no limbo,

no pecíolo das folhas e nos tecidos primários do caule de H. courbaril, a composição

é restrita a sesquiterpenos. Esta observação associada a outras, são argumentos

para a previsão de que composições diferentes de resina em diferentes partes da

árvore são geradas por pressões de herbívoros e patógenos específicos destas

partes. LANGENHEIM, FOSTER e McGINLEY (1980) indicaram que o sesquiterpeno

cariofileno encontrado em folhas de Hymenaea, tem ação contra Spodoptera exigua

(Lepdoptera), que é usado como herbívoro-modelo em experimentos (LANGENHEIM

et al., 1982). Além disso, LANGENHEIM, FOSTER e McGINLEY (1980) constataram

que as diferenças nas concentrações do cariofileno, que caracterizam três

23

populações de Hymenaea (Brasil, Costa Rica e Venezuela), têm ações diferentes

sobre S. exigua. Isto seria evidência de seleção, uma vez que a variação na ação de

herbívoros em cada local desencadeia uma pressão seletiva diferenciada. Além de

defesa contra insetos herbívoros o óxido de cariofileno (ao invés do cariofileno) é

ativo contra o fungo foliar Pestalotiopsis que ocorre em Hymenaea (ARRHENIUS e

LANGENHEIM, 1983; ARRHENIUS e LANGENHEIM, 1986). O terceiro exemplo

evidenciado por LANGENHEIM (2003) é o do arbusto do gênero Larrea

(Zygophyllaceae) que ocorre em áreas desérticas das América do Sul e do Norte

(HUNZIKER et al., 1972). As resinas em Larrea são produzidas em tricomas de

folhas jovens. Em Larrea tridentata tricomas se colapsam e liberando a resina

através de poros até a superfície das folhas. Aparentemente tricomas de folhas

velhas não liberam resinas já que estão todos colapsados (THOMSON, PLATT-

ALOIA, KOLLER, 1979). A resina que cobre as folhas de Larrea é composta

majoritariamente por fenólicos. Em L. tridentata e L. divaricata são flavonóides,

agliconas (flavonas e flavonóis), um dihidroflavonol e duas lignanas (entre elas o

ácido nordihidroguaiarético) (SAKAKIBARA et al., 1975). RHOADES (1977) teoriza

que as folhas mais jovens são alvo de ataque de herbívoros porque têm presença

mais constante ao longo do tempo, ou seja a planta sempre está produzindo folhas

jovens. RHOADES (1977) em experimentos verificou que um gafanhoto Cibolacris

parviceps (Acrididae), que é um herbívoro generalista, passa a se alimentar mais de

folhas jovens de L. tridentata quando estas tem suas resinas retiradas por éter. Já

um herbívoro especialista, a larva da mariposa Semiothisa colorata (Geometridae),

se alimenta mais em folhas novas nas quais se retira parte da resina, mas não toda.

O autor aventa a possibilidade da baixa concentração de resinas servir de pista para

alimentação das larvas. RHOADES (1977) também indica que a ação inibidora das

resinas de Larrea é igual a do tanino (inibição da digestão de proteínas). RHOADES

(1977) também demonstrou através de experimentos a resina de Larrea pode agir

como antidessecante e fotoprotetora contra UV.

Além de funções defensivas resinas existem alguns casos de mutualismo com

insetos involvendo as resinas. Um dos casos ocorre com as plantas do gêneros

Dalechampia (Euphobiaceae) e Clusia (Guttiferae/Clusiaceae) que oferecem resinas

como recompensa floral para polinizadores. Em Dalechampia as resinas são

secretadas por um complexo de brácteas modificadas que ficam abaixo das flores

estaminadas. Em Clusia as flores estaminadas possuem grupos de estaminóides

24

que secretam resina, já nas flores pistiladas os estaminóides formam anéis. No caso

dos dois gêneros, abelhas que coletam resina são os polinizadores

(AMBRUSTER,1984). Outro caso é de Roridulas gorgonias cujos tricomas

glandulares das folhas produzem resinas. Estas resinas viscosas prendem insetos

que acabam por ser sugados por Pamerida roridulae (Hemiptera, Meridae). Durante

a sua alimentação P. roridulae libera excretas cujo nitrogênio é absorvido por R.

gorgonias (ELLIS e MIDGLEY, 1996). Observações e medições de VOIGT e GORB

(2008) apontam que P. roridulae não fica aderido à secreção resinosa de R.

gorgonias devido a uma camada lipídica espessa sobre a cutícula que produz um

mecanismo que impede a adesão.

Insetos podem utilizar resinas com várias finalidades. Observa-se que larvas

de Neodiprion sertifer (Hymenoptera, Diprionidae), se alimentam de folhas de

pinheiro escocês e acumulam as resinas no intestino anterior. Quando agredidas as

larvas de N. sertifer regurgitam a resina (EISNER, JOHNESSEE e CARREL, 1974).

POINAR Jr (1992) descreve a presença em âmbar de indivíduos de Apiomerinae

(Hemiptera, Reduviidae). Estes hemípteros cobrem suas pernas anteriores com

resina para auxiliar na fixação de presas. Através do fóssil, o autor indica que esse

uso de resina vem ocorrendo há 25 milhões anos.. As abelhas usam resinas,

principalmente, para a construção de ninhos ou estruturas destes. Isto foi notado em

espécies da família Megachilidae, que pode utilizar resina associada a fragmentos

de folhas e solo (GRIGARICK e STANGE, 1968; CANE, 1996; ARMBRUST, 2004).

Na família Apidae, observou-se o uso de resinas por Epicharis (ROUBIK e

MICHENER, 1980) e euglossíneos

(ZUCCHI, SAKAGAMI e CAMARGO, 1969). Os

fósseis em âmbar contendo centenas de operárias de Proplebeia indicam que este

gênero extinto de meliponíneo coletava resinas de Hymenaea entre 15 a 20 milhões

de anos atrás (Mioceno). Acredita-se a resina coletada seja de Hymenaea porque o

âmbar dominicano no qual se encontram as abelhas fossilizadas é formado por

resinas de Hymenaea (CAMARGO, GRIMALDI e PEDRO, 2000). Os meliponíneos

também empregam resinas para confecção de estruturas de seus ninhos. Nos favos

de cria, invólucro e potes de alimento as resinas encontram-se misturadas à cera

formando o cerume. Nos batumes, que são elementos de isolamento e vedação, as

resinas podem estar misturadas a terra cera ou encontrarem-se puras. Existem

ainda, depósitos de resina pura, que podem ser encontradas ao longo da estrutura

do ninho, como em Tetragonisca angustula e Plebeia spp. A resina pura ou

25

combinada com cera pode ser denominada própolis e quando mesclada à terra é

designada de geoprópolis. Os batumes de geoprópolis são característicos do gênero

Melipona. Além de material de construção, algumas espécies de meliponíneos

podem untar resina em seus agressores, para imobilizá-los, como faz Friesiomellita

varia. Esta espécie ainda utiliza resinas para cobrir todo o entorno da entrada do

ninho (KERR et al., 1967; ROUBIK, 1989; MICHENER, 1974; WILLIE e MICHENER,

1973; NOGUEIRA-NETO, 1997). MICHENER (1974) cita que os meliponíneos

manipulam as resinas vegetais basicamente com as mandíbulas. dos SANTOS

(2007) apontou que as glândulas salivares cefálicas apresentam-se ativas nas

operárias de Plebeia emerina de faixa etária (20-30 dias) correspondente a função

de manipulação de depósitos de própolis. Assim, as secreções destas glândulas

manteriam a viscosidade dos depósitos. A autora também propõe que as glândulas

intramandibulares que estão presentes em todas as idades de P. emerina, também

teriam alguma função associada à manipulação de própolis/resinas. Isto porque nas

operárias de 20-30 dias e campeiras o epitélio secretor destas glândulas encontra-se

hipertrofiado.

26

2.3 PRÓPOLIS

Tradicionalmente o termo própolis é ligado a Apis mellifera, tanto que GARY

(1975) cita que desde os tempos de Aristóteles se sabia de sua existência nas

colméias destas abelhas. WITHERELL (1975), VAN TOL FILHO (1952) e BARROS

(1962), por exemplo, denominam por própolis os exsudados coletados por Apis

mellifera nas plantas. Sendo que estes vão servir de material para a vedação de

aberturas, na fixação de favos e para mumificar intrusos.

Provavelmente, o termo própolis passou a ser utilizado na meliponicultura, por

analogia com A. mellifera. Ainda que ROUBIK (1989), entenda que própolis seja um

elemento ligado apenas a A. mellifera. NOGUEIRA-NETO (1997) define própolis

como sendo resinas vegetais de plantas lenhosas que são coletadas pelos

meliponíneos e levadas ao ninho. Após a manipulação a resina pode receber adição

de um pouco de cera, podendo existir assim, depósitos de própolis puro ou misto.

O uso medicinal da própolis de A. mellifera é tradicional e KRELL (1996)

reporta sua utilização com essa finalidade desde o tempo clássico de romanos e

gregos. Assim sendo, já existem extensas revisões, como por exemplo, FARRÉ,

FRASQUET e SANCHEZ (2004), a respeito do potencial da própolis de A. mellifera.

No Brasil, a ênfase em seu uso popular e produção (BREYER, 1980) bem como

estudos sobre sua atividade (SZEWCZAK, GODOY e CHOCIAI, 1986) ocorrem a

partir dos anos 80. Posteriormente, inicia-se a caracterização de compostos, por

exemplo com RIBEIRO (1994).

Durante os anos 90 iniciam-se os trabalhos com própolis de abelhas sem

ferrão de forma análoga aos de própolis de A. mellifera. Tanto assim que TOMÁS-

BARBERÁN et al. (1993) analisaram através de cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) as própolis de Melipona favosa, M. compressipes, Scaptotrigona

depilis e Frieseomelitta varia, na Venezuela. Os autores indicaram que estas própolis

continham fenólicos (benzofenonas polipreniladas) e que Clusia, que fora analisada

conjuntamente, era a fonte da resina. KUJUMGIEV et al. (1998) realizaram análises

de atividade antimicrobiana de própolis de M. compressipes e M. quadrifasciata

anthidioides em conjunto com amostras de A. mellifera. Nesta análise através de

métodos de difusão e cultura em células os autores verificaram das própolis de

Melipona atividade considerável contra Staphylococcus aureus, Candida albicans e

um vírus de gripe aviária (H7N7). Por outro lado, BANKOVA et al.(1999) testaram,

27

através de método de difusão, a própolis de M. quadrifasciata anthidiodes, M.

compressipes e Tetragona clavipes. Notou-se uma atividade discreta contra S.

aureus e ausência de atividade contra E. coli. Neste trabalho através de

cromatografia cromatografia de fase gasosa acoplada à espectrometria de massas

(CG-EM) foi indicada a presença de ácidos, ésteres, álcoois, fenóis, aldeídos,

monoterpenos, sesquiterpenos, hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos nas

amostras. FERNANDES Jr. et al. (2001) averiguaram a concentração mínina

inibitória da atividade antibacteriana de própolis de oito espécies de meliponíneos. A

atividade foi signficativa para as própolis de Melipona sp. M. scutellaris e Partamona

sp contra S. aureus. Os autores não verificaram atividade significativa por parte de

nenhuma amostra contra E. coli. VELIKOVA et al. (2000) através de método de

difusão, mostraram uma atividade moderada contra S. aureus e E. coli do ácido

caurenóico, o qual isolaram da própolis de M. quadrifascita anthidioides. Em relação

à identificação de compostos na própolis de meliponíneos, PATRICIO et al. (2002)

retiraram amostras de própolis das tíbias de Frieseomelitta varia, F. languida e F.

silvestrii e analisaram em CG-EM e encontraram monoterpenos, sesquiterpenos e

diterpenos. PERREIRA, BICALHO e AQUINO NETO (2003), utilizaram

cromatrografia gasosa de alta resolução e alta temperatura (CGAR–AT) e

cromatografia gasosa de alta resolução e alta temperatura acoplada a

espectrometria de massas (CGAR–AT-EM) e caracterizaram triterpenos em uma

amostra de própolis de Tetragonisca angustula. Neste trabalho através de

bioautografia verificou-se indícios de atividade contra S. aureus. SAWAYA et al.

(2006) utilizando espectometria de massas por ionização eletrospray no modo

negativo, ESI-MS (-), indicaram através da comparação de íons característicos que a

fonte de resina para Tetragonisca angustula, no Brasil, é Schinus terebenthifolius

(aroeira mansa). Isto apesar das amostras serem de regiões diferentes. Os autores

também apontam que alguns dos compostos destas amostras são triterpenos com

grupos ácidos. SAWAYA et al. (2009), analisaram a variação da atividade

antioxidante de amostras mensais de própolis recolhidas durante um ano de

colméias de três espécies de Scaptotrigona. A atividade das amostras apresentaram

atividade menor que a registrada para própolis de A. mellifera.

28

2.4 INSETOS EUSSOCAIS E SANIDADE DOS NINHOS

No interior dos ninhos de insetos sociais muitas vezes encontra-se uma

grande agregação de indivíduos, bem como uma concentração de reservas de

alimentos e condições de temperatura e umidade ótimas para o desenvolvimento de

microorganismos (HÖLLDOBLER e WILSON, 1990). Por isso, já WHEELER (1910),

baseado em observações com formigas já supunha teoricamente que este cenário

aumentaria a probabilidade de proliferação de microorganismos e logo de doenças

nos ninhos. CREMER, ARMITAGE e SCHIMD-HEMPEL (2007), em sua revisão,

denominam de imunidade social os mecanismos, observados em insetos sociais,

que dependem da cooperação de membros do grupo, e que resultam em prevenção,

controle e eliminação de infecções parasitárias (2007). Os autores fazem uma

categorização desses mecanismos de acordo com o local onde eles ocorrem ou

direção de transmissão dos agentes patogênicos (horizontal ou vertical). Uma

dessas categorias engloba os mecanismos para reduzir a probabilidade de

estabelecimento dos agentes patogênicos no interior do ninho. Entre os mecanismos

encontram-se aqueles que são desencadeados pelo patógeno ou são medidas

profiláticas. Entre os mecanismos profiláticos no ninho interior do ninho é possível

citar que formigas retiram ou isolam cadáveres bem como afastam material em

decomposição do ninho (HÖLLDOBLER e WILSON, 1990). Meliponíneos

transportam detritos (exúvias de pupas e fezes) para fora dos ninhos (ROUBIK,

1989). Há indícios que cupins Zootermopsis gusticollis produzem sinais vibratórios

quando na presença de esporos de fungos patogénicos, fazendo com que os

indivíduos da colônia se afastem da área contaminada (ROSENGAUS et al., 1999).

As fezes (mecônio) também são retiradas do ninho por espécies de vespas adultas

da tribo Ropalidiini as quais algumas auxiliam a larva a ejetar o mecônio. Em outras

espécies as larvas ejetam o mecônio sozinhas para que os adultos os retirem

(KOJIMA, 1996). A coleta de materiais e sua deposição no ninho também é um

mecanismo profilático que controla o crescimento microbiano, como é o caso de

Formica paralugubris que coleta resina vegetal e deposita em seu ninho (CHRISTE

et al., 2003). A própolis de Apis mellifera pode ter uma ação semelhante, já que

possuem resinas em sua composição, e testes in vitro apontaram que a própolis

inibe o crescimento de Paenebacillus larvae, uma bactéria patogênica para A.

mellifera (BASTOS et al., 2008). Um outro aspecto das condições sanitárias do ninho

29

é a conservação das reservas de alimento. Os experimentos de CURRIE et al.

(1999) demonstraram que o actinomiceto Streptomyces simbionte é capaz de inibir o

fungo parasita Escovopis que é nocivo ao fungo do qual as formigas cortadeiras

cultivam se alimentam. BIJLSMA et al. (2006), pontuam a respeito da concentração

de água no mel de meliponíneos, que é mais alta que no mel de A. mellifera, o que

poderia desencadear sua deterioração mais rápida, sendo que em geral não se

observa isto. Os autores citam que o mel de Trigona nigra e Melipona favosa pode

manter-se por um ano sem aparentemente alterar suas características. Os autores

aventam a possibilidade das abelhas sem ferrão adicionarem enzimas outras

substâncias que conferem capacidade antibiótica ao mel.

30

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 LOCAL

As amostras de própolis das vedações utilizadas nos procedimentos dos

subitens 3.2.1, 3.2.2 e 3.2.3 foram recolhidas em duas localidades distintas. As

amostras de Scaptotrigona sp., localmente conhecida por “tubi”, procederam de um

meliponário instalado no município de Barra do Corda, Maranhão. O centro

geográfico do município está situado a 5º 5' S e 42º 25' W (IBGE, 2006a). O clima é

quente, semi-úmido com quatro ou cinco meses secos. A maior parte do município

abrange áreas de cerrado (IBGE, 2006b). Já as amostras de própolis de

Scaptotrigona aff. depilis foram obtidas de um meliponário instalado na Estação

Experimental de Luiz Antônio (EELA), no município de Luiz Antônio, São Paulo. O

meliponário localiza-se a 21º 35’ 16,7” S e 47º 44’ 31,0” W. A Estação Experimental

encontra-se em uma área que se caracteriza por dois períodos climáticos distintos,

sendo um com precipitação e temperaturas altas (novembro a abril) e outro com

precipitação e temperaturas baixas (maio a outubro), (UFSCAR, 2000). A maior

parte da área que circunda as colméias está ocupada por plantações de Pinus sp. e

Eucaliptus sp. (UFSCAR, 2000). As colônias de Scaptotrigona sp. do meliponário de

Barra do Corda são nativas da região. As colônias de S. aff. depilis dos meliponários

da Estação Experimental, foram obtidas a partir de transferências de ninhos

procedentes do campus USP RP. Os ninhos se encontravam em árvores caídas ou

cortadas pela Divisão de Parques e Jardins do campus.

Os procedimentos do subitem 4.2.4 utilizaram S. aff. depilis. Estas colônias

estavam instaladas no meliponário do Departamento de Genética FMRP, campus

USP Ribeirão Preto. As colônias deste meliponário procedem também de

transferências de ninhos naturais do campus. O campus situa-se a 21º 15' S e 47º

55' W. O local tem altitude máxima de 653 m e está sob domínio de clima subtropical

úmido temperado (FREITAS, 2001).

31

3.2 METODOLOGIA

Foi considerado como própolis o material que compunha as vedações das

colméias de Scaptotrigona.

Foram consideradas como sendo resinas vegetais as frações separadas da

própolis, segundo os procedimentos descritos a seguir. Ou então, os exsudatos

vegetais retirados de espécies vegetais reconhecidas em LANGENHEIM (2003)

como produtoras de resina.

3.2.1 Composição química das resinas da própolis das vedações

3.2.1.1 Obtenção das amostras de própolis

As amostras de própolis procedentes de Barra do Corda foram coletadas

mensalmente durante o período de maio de 2006 a abril de 2007. As amostras

foram retiradas de dez colônias de Scaptotrigona sp. As colônias estavam

acondicionadas em colméias racionais modelo Portugal-Araújo, modificada por Kerr

e Venturieri (VENTURIERI, 2003) (fig.3). Utilizando-se espátula, as amostras de

própolis foram retiradas das vedações construídas entre a tampa e módulo e entre

os módulos das colméias. Em seguida, as amostras foram enviadas até a

Universidade de São Paulo, campus Ribeirão Preto, pelo correio via SEDEX. As

amostras oriundas da EELA foram coletadas mensalmente no intervalo entre

setembro de 2006 a outubro de 2007. As amostras foram recolhidas de cinco

colônias de S. aff. depilis. Estas colônias estavam abrigadas em colméias racionais

modelo Walmir Pedro Züge (fig. 3). As amostras foram coletadas das colméias da

mesma forma que em Barra do Corda. Posteriormente, tão rápido quanto possível,

as amostras de própolis das duas localidades foram armazenadas a

aproximadamente -16 ºC.

32

3.2.1.2 Avaliação da composição química das resinas das própolis

As análises de avaliação da composição química foram realizadas no

Laboratório Thomson de Espectrometria de Massas do Instituto de Química da

UNICAMP.

As amostras foram analisadas pela técnica de espectometria de massas por

ionização eletrospray no modo negativo, ESI-MS (-). Esta análise também fez parte

dos procedimentos que originaram o trabalho de SAWAYA et al. (2009). Portanto, a

metodologia e os resultados apresentados aqui constam também neste trabalho.

As resinas contidas nas própolis foram extraídas através da adição de 10 mL

de etanol (Merck) para cada 3,0 g de amostra de própolis individualmente. As

amostras permanecem sete dias junto ao solvente sob agitação a 100 rpm. A

seguir, filtrou-se a parte insolúvel e o filtrado foi posto a -16 ºC “overnight” para

congelamento da cera e novamente sofreu filtração a – 16 ºC (SAWAYA et al.,

2006). Isto foi realizado para diminuir a quantidade de ceras junto á resina. O

filtrado obtido teve o etanol evaporado a 50

o

C para obtenção dos extratos secos de

resina.

Este extrato seco foi dissolvido em uma solução de 70% de metanol (v/v)

grau cromatográfico (Tedia), 30% água deionizada (v/v), 0,5% hidróxido de amônio.

Em seguida, injetou-se diretamente as soluções de resina a um fluxo de 10µL . m

-1

na fonte de ESI, através de um injetor (Harvard Apparatus). Os espectros de massa

(fingerprint) ESI(-)-MS foram obtidos em um espectômetro de massa Q-TOF de

Figura 3

–

A

- Colméia racional modelo Portugal-

Araújo

modificada por Kerr e Venturieri. B -

Colméia racional modelo

Walmir Pedro Züge.

A

B

33

micromassa híbrido sob as seguintes condições: capilar -3000 V; cone - 40 V;

temperatura de dessolvatação 100 ºC. Os “fingerprint” foram obtidos na faixa de m/z

100 a 1000. Posteriormente, para caracterizar as amostras foi efetuada uma análise

de componentes principais (PCA) através do programa Pirouette 2.60 (Infometrix).

Os espectros de massa foram expressos como as intensidades de íons individuais

[M – H

-

]. Os íons com intensidades acima de 30% no “fingerprint” foram utilizados

como variáveis na PCA. Também foram incluídas nas análises as concentrações

nas quais as amostras reduziam a absorbância em 50% em teste de atividade

antioxidante (ED

50

) (SAWAYA et al., 2009). Os valores foram pré-processados

através de auto-escala antes da realização da análise de componentes principais.

3.2.1.3 Informações adicionais: massa da própolis, proporção de resina na própolis,

realocação da própolis

Para aumentar os subsídios para a discussão a respeito dos resultados

obtidos pelo procedimento anterior foram realizados mais três procedimentos.

O primeiro foi o de medir a massa de cada amostra mensal, em balança

mecânica (amostras de Scaptotrigona sp Barra do Corda) e em balança digital

(amostras de S. aff. depilis EELA). Os valores obtidos para as amostras de

Scaptotrigona sp dos seis primeiros meses de extração de própolis foram

comparados com os valores dos seis últimos. Já para dos valores de S. aff. depilis,

descontou-se um dos seis primeiros e um dos seis últimos, pois nestes meses o

coletor não foi o mesmo das demais coletas, o que fez com que os valores se

mostrassem enviesados. As massas de S. aff. depilis foram comparadas através do

teste U de Mann-Whitney. Já as massas de Scaptotrigona sp foram comparadas

com teste t para duas amostras independentes.

No segundo procedimento, extraíram-se as resinas das amostras mensais

de própolis das duas abelhas de acordo com o subitem 3.2.2.1. A seguir obteve-se

a proporção de resina através da divisão da massa desta pela massa da amostra

de própolis correspondente. Os valores de proporção de resina dos seis primeiros

meses de coleta com os valores dos seis últimos foram comparados através de do

teste U de Mann-Whitney. As análises estatísticas destes experimentos e de todos

os outros deste trabalho foram realizadas no programa Statistica 6.0.

34

No terceiro procedimento, tomou-se uma colméia racional do meliponário do

Depto. de Genética, USP-RP, contendo S. aff. depilis e procurou-se retirar toda a

própolis que vedava a tampa e a melgueira junto a esta. Nas melgueiras inferiores e

na região dos favos espalhou-se purpurina prateada nas áreas onde havia própolis

depositada. Após três dias foi verificado se houve realocação da própolis de outros

locais do ninho na melgueira para as áreas que tiveram a própolis retirada.

3.2.2 Atividade antimicrobiana das resinas da própolis das vedações

3.2.2.1 Obtenção da própolis e extração de resinas

As amostras mensais de própolis de Scaptotrigona sp. (Barra do Corda) e de

S. aff. depilis (EELA), são as mesmas obtidas nas condições apresentadas no

subitem 3.2.1.1. A extração de resina das amostras foi realizada através de

maceração. Para tanto, colocava-se a proporção de 4 mL de etanol (Merck) junto a

1 g de própolis (ADELMANN, 2005). A extração ocorreu sob agitação de 60 rpm a

30 ºC por 14 dias (Bastos, 2006, comunicação verbal)

1

. Após esse período o extrato

foi mantido por no mínimo 12 horas a -16 ºC, em seguida realizou-se a filtração da

porção insolúvel também a -16 ºC (modificação de SAWAYA et al., 2006). Após a

filtração, o etanol foi evaporado em estufa a 35 ºC. Decidiu-se fazer uma mescla

(“pool”) para o grupo de resinas provenientes de cada localidade. Isto porque as

amostras mensais de Barra do Corda mostraram certa identidade umas com as

outras, bem como as amostras da EELA entre si (subitens 4.1.1 e 5.1). Os “pools”

também foram feitos para se obter um material que refletisse as tendências de

coleta durante o ano. Para se obter a mescla de cada localidade, tomaram-se as

amostras mensais de resinas já extraídas e procedeu-se uma nova suspensão de

cada uma delas. Estas suspensões foram produzidas diluindo-se as resinas

extraídas na proporção 1g de resina para 3mL de etanol (Merck). Então, foram

misturados 2mL de cada suspensão formando os “pool”, que em seguida tiveram o

etanol evaporado em estufa a 35ºC. Em todos os procedimentos anteriores

procurou-se manter as amostras abrigadas da luz.

1

Informação fornecida por Bastos, Ribeirão Preto, julho de 2006.

35

3.2.2.2 Ensaios para avaliação da atividade das resinas contra microorganismos de

interesse clínico

Avaliações prévias de atividade antimicrobiana dos “pools” de resinas das

duas abelhas foram realizadas na Fundação Ezequiel Dias - FUNED (Belo

Horizonte, MG).

As avaliações foram realizadas através de ensaios de métodos de difusão

em placa para atividade antibacteriana e atividade antifúngica, cujos protocolos

foram estabelecidos para própolis de A. mellifera em FUNED (2008a) e FUNED

(2008b). Os procedimentos utilizados encontram-se no APÊNDICE 1.

Nos testes prévios de difusão em placa para atividade antibacteriana (fig. 4)

ambos os “pools” de resina não apresentaram atividade contra Escherichia coli.

(diâmetro halo de inbição = 0). O disco de gentamicina que serviu de controle de

atividade apresentou halo com 28mm de diâmetro. O controle para toxicidade do

etanol não apresentou halo. Já contra Staphylococcus aureus o “pool” de

Scaptotrigona sp. não apresentou atividade (halo = 0), enquanto que o “pool” de

Scaptotrigona. aff. depilis mostrou uma atividade razoável. Os dos halos tinham

12mm, 12mm e 13mm de diâmetro (média de 12,33mm). O disco de vancomicina

produziu um halo de 21mm e o etanol não produziu halo. Considera-se como ideal,

na metodologia utilizada, o halos de inibição ≥ 13mm.

No ensaio de atividade antifúngica contra Candida albicans (fig. 4) as placas

com o “pool” da EELA apresentaram respectivamente 136; 352; 208 colônias,

(média=232 colônias). Nas placas com “pool” de Barra do Corda surgiram 1116;

744; 840 colônias (média= 898 colônias). Já nas placas de controle da toxicidade

do DMSO apresentaram 717; 708; 735 colônias (média= 720 colônias). A placa de

controle de viabilidade de C. albicans com apenas PDA apresentou 1120 colônias.

A comparação desta última placa com as demais indicou como que nenhum “pool”

foi efetivo contra C. albicans.

Como considerou-se apenas representativa a atividade do “pool” de

Scaptotrigona. aff. depilis contra Staphylococcus aureus. Foi realizado ensaio de

microdiluição em placa de 96 poços para caracterizar melhor a atividade do “pool”

contra S. aureus. Os procedimentos foram realizados no laboratório de

Farmacognosia do departamento de Ciências Farmacêuticas da FCFRP-USP.

Procurou-se observar os protocolos do NCCLS (2003). Inicialmente, tubos de

36

ensaios com 5mL de caldo de soja tríptica (TSB - Himedia) foram inoculados com

S. aureus (ATCC 25923) e incubados de 18h a 24h, a 37

o

C. A seguir, as bactérias

do caldo foram inoculadas em tubo com ágar de soja tríptica (TSA – Himedia), que

foi incubado por 18h a 24h, a 37

o

C. A partir desta cultura as bactérias foram

transferidas para tubos com 6000µL de salina 0,85% até que a suspensão atingisse

turbidez igual à de uma solução padrão de Mc Farland de 0,5 de BaSO

4

(10

8

UFC/mL). Em seguida, 1000µL da suspensão foram diluídos em 9000µL de caldo

Mueller-Hinton, resultando no inóculo com 10

7

UFC/mL. Do inóculo foram

transferidos 10µL para cada poço que necessitava (fig.5a), resultando em 5 x 10

4

UFC/poço, já que cada poço continha o volume final de 200µL. A seguir, preparou-

se uma solução de resina da EELA em dimetilsulfóxido (DMSO - Merck) com

concentração 400mg/mL. A partir desta solução foram feitas seis diluições

sucessivas 1:2 em caldo Mueller-Hinton (Difco), produzindo ao final uma solução de

trabalho com concentração final de 6250µg/mL, com 1,6% (v/v) de DMSO. O

esquema de aplicação da solução de trabalho e as concentrações finais de resina

nos poços encontram-se nas figuras 5a e 5b. Também para verificar se a própolis

(resina+cera) mostraria diferença na atividade, foi preparado um “pool” das

amostras destas como se fizera para as resinas (subitem 3.2.2.1). Assim, também

se preparou uma solução de trabalho do “pool” de própolis como descrito

anteriormente para o “pool” de resina. A aplicação da solução de trabalho do “pool”

de própolis e as concentrações na placa também foram similares ao do “pool” de

resina (fig.5a e 5b). A penicilina G (Sigma) foi utilizada como controle de atividade

antibacteriana. A preparação do antibiótico foi iniciada com a diluição da penicilina

G em tampão fosfato de potássio a 1% (pH 6,0), produzindo uma solução de

1000µg/mL. Então, se diluiu 1mL desta solução em 9mL de caldo Mueller-Hinton.

Da solução anterior tomou-se 1mL que foi diluído em 5mL de caldo Mueller-Hinton

resultando em uma solução de penicilina G a 20µg/mL. A partir desta solução foram

feitas diluições 1:2 seqüenciais na placa conforme figura 5a. As concentrações de

penicilina nos poços estão na figura 5b. Para obter o controle da toxicidade do

DMSO preparou-se uma solução diluindo-se 32µL de DMSO em 1968µL de caldo

Mueller-Hinton, obtendo-se uma solução com 1,6% (v/v) de DMSO. A aplicação

deste controle é demonstrada na figura 5a. Também foram feitos controles de

esterilidade do caldo Mueller-Hinton, da resina e da própolis, bem como controle da

viabilidade de S. aureus (fig.5a). Ao final da aplicação das soluções o volume nos

37

poços era de 200µL e os ensaios e controles se apresentam em triplicata (fig.5a).

Após a finalização da aplicação das soluções a placa foi selada com filme plástico e

incubada por 16h-20h a 37

o

C. Após a incubação foi adicionado em todos os poços

20µL de uma solução reveladora de cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio (CTT)

(Vetech). Este sal é incolor, mas em contato com bactérias este é reduzido a trifenil

formazan tornando-se vermelho (SIMONS e WILLIANS, 1967). A placa, então, foi

incubada novamente por 30 min, 37

o

C, após esse período a placa foi levada até um

“scanner” digital para captura da imagem do fundo da placa. A imagem dos poços

foi analisada através do programa Flicker - V0.87.1-beta que foi criado para analisar

a densitometria de imagem (LEMKIN, THORNWALL e EVANS, 2005). Os valores

de densitometria do programa são interpretações da densidade de cor dos “pixels”

da imagem digitalizada. O método de análise do crescimento bacteriano em placas

de 96 poços, através de imagens digitalizadas via “scanner” foi proposto por

GABRIELSON et al. (2002). Os valores de densitometria dos poços com

781,25µg/mL e 200µg/mL de ambos “pools” foram submetidos à análise de

variância (ANOVA) e posteriormente teste de Tukey.

38

Figura 4

-

Testes de avaliação prévia de atividade antimicrobiana e antifúngica.

A1 a A3- placas com E. coli.

B1 a B3- placas com S. aureus.

Abreviaturas:

EE – “Pool” Estação Experimental; BC- “Pool” Barra do Corda; AL-

Etanol; G- Gentamicina; V- Vancomicina

C1 a C3- placas com C. albicans + “Pool” de resina de Barra do Corda, MA

C4 a C6 placas com C. albicans + DMSO

C7 a C8 placas com C. albicans

+ “Pool” de resina da Estação Experimental de

Luiz Antônio, SP.

D – C. albicans em ágar batata dextrose

A1

A2

A3

B1

B2

B3

C4

C5

C6

C7

C8

C9

C1

C2

C3

D

EE

E

EE

BC

AL

G

V

39

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

C 90 µL

ST R 100 µL

IN 10 µL

C 140 µL

ST R 50 µL

IN 10 µL

C 165 µL

ST R 25 µL

IN 10 µL

C 184 µL

ST R 6 µL

IN 10 µL

C 200

µL

C 200

µL

C 200

µL

B

IDEM

µL

C 100

µL

ST R 100

µL

C 100

µL

ST R 100

µL

C 100

µL

C

IDEM

µL

C 100

µL

SST P 100

µL

C 100

µL

SST P 100

µL

C 100

µL

D

DMSO 1

00

µL

C 190

µL

IN 10

µL

DMSO 100

µL

C 190

µL

IN 10

µL

DMSO 100

µL

C 190

µL

IN 10

µL

E

C 90 µL

ST R 100 µL

IN 10 µL

C 140 µL

ST R 50 µL

IN 10 µL

C 165 µL

ST R 25 µL

IN 10 µL

C 184 µL

ST R 6 µL

IN 10 µL

C 190

µL

IN 10

µL

C 190

µL

IN 10

µL

C 190

µL

IN 10

µL

F

IDEM

C 90 µL

IN 10 µL

C 100 µL

P 7 µL

C 90 µL

IN 10 µL

C 100 µL

P8 100 µL

C90

IN 10

P9 100 µL

Descarte

2 3 4 5 6 7 8 9 10

µL

C 140µL

ST R 50µL

IN 10µL

C 165µL

ST R 25µL

IN 10µL

C 184µL

ST R 6µL

IN 10µL

C 200 µL C 200 µL C 200 µL

IDEM

C 100µL

ST R 100µL

C 100µ

ST R 100µL

C C

100µL

IDEM

C 100 µL

ST P 100 µL

C 100 µL

ST P 100 µL

C 100 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

µL

C 140µL

ST P 50µL

IN 10µL

C 165µL

ST P 25µL

IN 10µL

C 184µL

ST P 6µL

IN 10µL

C 190 µL

IN 10 µL

C 190 µL

IN 10 µL

C 190 µL

IN 10 µL

IDEM

90 µL

IN 10 µL

C 100

P7 100µL

C 90 µL

IN 10 µL

C 100

P8 100µL

C 90 µL

N 10 µL

P9 100µL

Descarte

IDEM

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle

Solução trabalho resina

Controle

Caldo Mueller

Controle esteri

Solução trabalho próp olis

Controle toxicidade

DMSO

Controle

Inóculo

.

IDEM

Antibiótico

Figura 5a

-

Diagrama de aplicação de soluções utilizadas em ensaio da atividade de “pool” de resinas e própolis de Scaptotrigona aff. depilis (EELA)

contra Staphylococcus aureus – Método de microdiluição em placa de 96 poços. A ordem de cima para baixo das abreviaturas representa a ordem de

aplicação das soluções. Os valores a frente das abreviaturas indicam os volumes aplicados. Abreviaturas: C – Caldo Mueller-Hinton; ST R – Soluções

de trabalho de “pool” resina ; ST P – Solução de trabalho de “pool”de própolis ; IN – Inóculo de S. aureus; DMSO – Solução de dimetilsulfóxido; P –

Solução de Peniciliana G; P7; P8; P9 – Solução de Penicilina G vinda do poço 8,9,9.

ENSAIO

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle de esterilidade

Solução trabalho resina

Controle de esterilidade

Solução trabalho própolis

Controle de esterilidade

Caldo Mueller-Hinton

Controle de toxicidade

DMSO

Controle de viabilidade

Inóculo

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

POOL

RESINA

3125

µg/mL

POOL

RESINA

1562,5

µg/mL

POOL

RESINA

781,25

µg/mL

POOL

RESINA

200

µg/mL

- - -

B

IDEM

RESINA

3125

µg/mL

POOL

RESINA

3125

µg/mL

POOL

RESINA

3125

µg/mL

C

IDEM

PRÓPOLIS

3125

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

3125

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

3125

µg/mL

D

DMSO

1% (v/v)

DMSO

1% (v/v)

DMSO

1% (v/v)

E

POOL

PRÓPOLIS

3125

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

1562,5

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

781,25

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

200

µg/mL

- -

-

F

IDEM

G

10 µg/mL

PENICILINA

G

5 µg/mL

PENICILINA

G

2,5 µg/mL

2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

µL

C 140µL

ST R 50µL

IN 10µL

C 165µL

ST R 25µL

IN 10µL

C 184µL

ST R 6µL

IN 10µL

C 200 µL C 200 µL C 200 µL

IDEM

C 100µL

ST R 100µL

C 100µ

ST R 100µL

C C

100µL

IDEM

C 100 µL

ST P 100 µL

C 100 µL

ST P 100 µL

C 100 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

µL

C 140µL

ST P 50µL

IN 10µL

C 165µL

ST P 25µL

IN 10µL

C 184µL

ST P 6µL

IN 10µL

C 190 µL

IN 10 µL

C 190 µL

IN 10 µL

C 190 µL

IN 10 µL

IDEM

90 µL

IN 10 µL

C 100

P7 100µL

C 90 µL

IN 10 µL

C 100

P8 100µL

C 90 µL

N 10 µL

P9 100µL

Descarte

IDEM

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle

Solução trabalho resina

Controle

Caldo Mueller

Controle esteri

Solução trabalho próp olis

Controle toxicidade

DMSO

Controle

Inóculo

.

IDEM

Diagrama de concentrações de substâncias utilizadas em ensaio da atividade de “pool” de resinas e própolis de Scaptotrigona aff. depilis

(EELA) contra contra Staphylococcus aureus – Método de microdiluição em placa de 96 poços. A concentração de S. aureus

nos poços onde se

aplicou o inoculo foi de 5 x 10

4

UFC/poço.

ENSAIO

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle de esterilidade

Solução trabalho resina

Controle de esterilidade

Solução trabalho propólis

Controle de toxicidade

DMSO

Controle de atividade

Antibiótico

41

3.2.3 Resinas das vedações e sanidade da colônia

3.2.3.1 Isolamento de fungos filamentosos

Os procedimentos para isolamento de fungos foram feitos no laboratório de

Microbiologia e Biologia Celular do departamento de Biologia da FFCLRP USP.

Durante o isolamento de fungos filamentosos das colônias de S. aff. depilis do

meliponário da EELA foram testados três métodos de coleta, que foram executados

nas cinco colônias. No primeiro, foram retiradas com espátulas estéreis amostras de

própolis das vedações do módulo da colméia correspondente à área dos favos de

cria. Estas amostras foram postas em frascos estéreis. No segundo, colocou-se uma

placa de Petri pequena estéril dentro de cada colônia, no módulo de melgueira mais

próximo à área de cria. As placas permaneceram por dez dias nas colméias, até

serem fechadas e recolhidas. No terceiro, uma placa de Petri aberta contendo meio

de aveia (ágar 2g : farinha de aveia 4g : água 100mL) estéril, foi posta em cada

colméia no módulo de melgueira mais próximo da área de cria. As placas foram

deixadas por cerca de 20 minutos nas colméias. Em seguida, as placas foram

lacradas e recolhidas. O material coletado pelo primeiro método (própolis) em cada

colônia foi transferido para placas de Petri individualizadas com meio de aveia. Em

seguida, as placas foram incubadas em estufa a 30 ºC. As placas de Petri utilizadas

no segundo método foram colocadas abertas em placas de Petri maiores contendo

meio de aveia. Após isto, as placas foram postas em estufa a 30 ºC. As placas de

Petri com meio de aveia, usadas no terceiro método, logo após a chegada ao

laboratório, também foram incubadas a 30ºC. O primeiro método apresentou o

crescimento de um número maior de morfotipos diferentes de fungos (cinco). Assim,

a partir destas placas iniciou-se o isolamento dos morfotipos. Fungos cinza e

marrom não foram isolados para evitar possível contaminação ao laboratório. O

isolamento foi realizado através de raspagem com alça de platina flambada dos

fungos selecionados. Em seguida, foi feita a inoculação dos fungos em novas placas

com meio de aveia acrescido de composto antibacteriano Pentabiótico

®

Fort Dodge

a 50µg/mL. Estas placas foram levadas à estufa a 30 ºC. O processo de isolamento

foi repetido até que nas placas houvesse apenas o crescimento de um morfotipo por

placa. Obtiveram-se três morfotipos que foram enviados para identificação na

Micoteca URM (University Recife Mycologia), Departamento de Micologia UFPE. Os

42

fungos foram identificados como Aspergillus niger, Van Tieghem (agregado com

outro Aspergillus), Paecilomyces variotii Bainier e Aspergillus flavus, Link. O

isolamento de fungos das colônias de Scaptotrigona sp. de Barra do Corda foi

iniciado com o recolhimento de fragmentos de própolis de cinco colméias. A coleta

foi feita com o mesmo procedimento do primeiro método utilizado na EELA. Este

procedimento foi escolhido porque através dele se obteve um número maior de

morfotipos vindos da EELA. As amostras foram mantidas resfriadas até serem

colocadas em placas de Petri com meio de aveia, as quais foram incubadas à 30ºC.

Após o crescimento dos fungos foi realizado o isolamento destes através dos

mesmos procedimentos utilizados para as amostras da EELA. Os nove morfotipos

isolados foram enviados para identificação na Micoteca URM, Departamento de

Micologia UFPE. Foi possível identificar Aspergillus niger, Van Tieghen, Curvularia

lunata var. aeria (Bat., J.A. Lima & C.T. Vasconc.) M.B. Ellis e Aspergillus japonicus

(agregado a Aspergillus niger). Isto porque o alto nível agregação nos demais

morfotipos não permitiu o isolamento para identificação.

3.2.3.2 Avaliação da atividade das resinas contra os fungos isolados

Os procedimentos para avaliação da atividade das resinas contra os fungos

coletados foram realizados no laboratório de Microbiologia e Biologia Celular do

departamento de Biologia da FFCLRP USP.

Nos ensaios foram testados os “pools” de resinas (subitem 3.2.2.1) de uma

localidade contra os fungos isolados das colméias daquela localidade. Também

foram usados “pools” de própolis das duas localidades como no subitem 3.2.2.1. Nos

ensaios foram utilizados Aspergillus niger + Aspergillus sp. e Paecilomyces variotti,

(EELA) e A. niger e A. japonicus + A. niger (Barra do Corda). A. niger e A. japonicus

foram escolhidos porque podem produzir, respectivamente, ocratoxina A (ROMERO

et al., 2005) e esterigmatocistina (BEGUN e SAMAJPATI, 2000). Estas substâncias

têm potencial entomopatogénico (PATERSON, SIMMONDS e BLANEY, 1987;

OBANA et al., 1994). Para Paecilomyces variotti não foi encontrada referência a

respeito de ação entomopatogênica. Porém há indicações a respeito de

enfermidades em humanos provocadas por este fungo (GUTIÉRREZ, 2005 et al.).

Assim, para aproveitamento do material isolado decidiu-se pela sua utilização. A.

43

flavus apesar de ser bem caracterizado como entomopatogênico, inclusive com

relatos para abelhas solitárias (BATRA e BOHART, 1969) teve sua utilização

descartada. Isto se deveu ao seu também conhecido potencial patogênico para

humanos (HADAYATI et al., 2007). O método utilizado foi o de microdiluição em

placa de 96 poços, procurando-se observar os princípios do NCCLS (2002).

Primeiramente, preparou-se soluções de trabalho dos “pools” de resina e própolis a

100mg/mL em DMSO (Merck). A seguir, em um tubo de ensaio, dilui-se 90µL destas

soluções em 4410µL de caldo RPMI 1640 (GIBCO

®

Invitrogen) finalizando assim, as

soluções de trabalho com 2000µg/mL de resina. Os esquemas de aplicação das

soluções de trabalho bem como as concentrações resultantes por poço estão nas

figuras 6a e 6b, respectivamente. Para a preparação dos inóculos, os fungos foram

cultivados de 5 a 7 dias, 30

o

C, em garrafas de boca larga (400mL) providas de 50mL

de BDA (ágar dextrose batata - Biobras). Com auxílio de pipeta de vidro adicionou-

se junto aos fungos cultivados 10mL de salina 0,85% e utilizando-se a mesma

pipeta, fez-se uma raspagem dos fungos em meio. Em seguida, filtraram-se em funil

com gaze as soluções iniciais de esporos que foram recolhidas em Erlenmeyer. Em

seguida, as concentrações de esporos nas soluções iniciais foram determinadas

através de câmara de Neubauer. As soluções continham aproximadamente de 10

9

esporos/mL a 10

11

esporos/mL. A partir destas soluções iniciais, foram feitas

diluições na razão de 1:10 (1mL de solução de esporos em 9mL de salina 0,85%),

até que atingissem 10

7

esporos/mL. Desta solução transferia-se 500µL para um tubo

tipo Eppendorf com 500µL de salina que resultava em soluções com 5 x 10

6

esporos/mL. Foram tomados 72µL de cada uma destas soluções que foram diluídos

em 3528µL de caldo RPMI, resultando para cada um dos fungos soluções de inóculo

com 10

5

esporos/mL. Foram aplicados 100µL das soluções de inóculo em cada um

dos poços nos quais eram necessários, desta forma a concentração nestes poços foi

de cerca de 5 x 10

4

esporos/mL (fig. 6a). Os ensaios incluíram ainda controles de

esterilidade do caldo RPMI, controles de esterilidade das soluções de trabalho de

resina e própolis, e controle de toxicidade do DMSO. A aplicação das soluções para

preparação destes controles, bem como as concentrações dos poços de controle de

atividade antifúngica (anfotericina B) estão nas figuras 6a e 6b. Para a preparação

do controle de atividade antifúngica preparou-se uma solução de 5000µg/mL de

anfotericina B (Fungizon

®

Bristol-Myers-Squibb) em água destilada. Então, tomou-se

13,6µL desta solução e adicionou-se a 3386,4µL de caldo RPMI, que produziu uma

44

solução de antibiótico a 20µg/mL. A partir desta solução foram feitas diluições 1:2

seqüenciais na placa conforme figura 6a. As concentrações de anfotericina B nos

poços estão na figura 6b. Foram feitos controles com anfotericina para se avaliar a

resistência dos fungos. Todos os ensaios e controles foram feitos em triplicata. As

placas foram incubadas a 30ºC por 48h ou até haver crescimento. Os poços

utilizados foram fotografados individualmente através de sistema de captura de

imagem ligado a estereomicroscópio. A leitura do resultado foi feita através de

comparação do crescimento no poço de controle de viabiliadade com os demais

poços. A exceção da categoria “>25%”, que foi estipulada para caracterizar melhor a

atividade, as demais seguiram a categorização de crescimento de NCCLS (2002), as

quais são: Crescimento (igual) ao controle de viabilidade = 4

75% do crescimento do controle de controle de viabilidade = 3

50% do crescimento do controle de controle de viabilidade = 2

25% do crescimento do controle de controle de viabilidade = 1

> 25% do crescimento do controle de controle de viabilidade = 0-1

Nenhum crescimento= 0

45

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

ST R 100 µL

IN 100 µL

RPMI 50 µL

ST R 50

µL

IN 100 µL

RPMI 80 µL

ST R 20 µL

IN 100 µL

RPMI

200

µL

RPMI

200

µL

RPMI

200

µL

B

IDEM

µL

RPMI

100

µL

ST R100

µL

RPMI

100

µL

ST R100

µL

RPMI

100

µL

C

IDEM

µL

RPMI

100

µL

ST P100

µL

RPMI

100

µL

ST P100

µL

RPMI

100

µL

D

RPMI

98

µL

DMSO 2

µL

IN 100

µL

RPMI

98

µL

DMSO 2

µL

IN 100

µL

RPMI

98

µL

DMSO 2

µL

IN 100

µL

E

ST P 100 µL

IN 100 µL

RPMI 50 µL

ST P 50 µL

IN 100 µL

RPMI 80 µL

ST P 20 µL

IN 100 µL

RPMI

100

µL

IN 100

µL

RPMI

100

µL

IN 100

RPMI

100

µL

IN 100

F

IDEM

IN 100µL

RPMI

100

µL

A6 100 µL

IN 100 µL

RPMI

100

µL

A7 100 µL

IN 100 µL

A8 100 µL

descarte

G

IDEM

Solução de trabalho resina

Figura 6a

Diagrama de aplicação de soluções utilizadas em ensaio da atividade de “pool” de resinas e própolis de Scaptotrigona

(Estação

Experimental de Luiz Antônio, SP e Barra do Corda, MA) contra fungos filamentosos isolados nas colméias –

Método de microdiluição em placa de 96

poços. A ordem de cima para baixo das abr

eviaturas representa a ordem de aplicação das soluções. Os valores a frente das abreviaturas indicam os

volumes aplicados. Abreviaturas: ST R – Soluções de trabalho de resina; ST P- Soluções de trabalho de própolis; IN – Inóculo de fungo; RPMI –

Caldo

RPMI

1640;

DMSO

–

Dimetilsulfóxido;

A6; A7; A8

–

Solução de anfotericina B vinda do poço 6,7,8.

ENSAIO

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle de esterilidade

Caldo RPMI

Controle de esterilidade

Solução de trabalho própolis

Controle de toxicidade

DMSO

Controle de viabilidade

Inóculo

Controle de atividade

Antibiótico

46

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

POOL

RESINA

1000

µg/mL

POOL

RESINA

500

µg/mL

POOL

RESINA

200

µg/mL

- - -

B

IDEM

RESINA

1000

µg/mL

POOL

RESINA

1000

µg/mL

POOL

RESINA

1000

µg/mL

C

IDEM

PRÓPOLIS

1000

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

1000

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

1000

µg/mL

D

DMSO

1% (v/v)

DMSO

1% (v/v)

DMSO

1% (v/v)

E

POOL

PRÓPOLIS

1000

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

500

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

200

µg/mL

- - -

F

IDEM

10 µg/mL

Anfotericina B

5 µg/mL

Anfotericina B

2,5 µg/mL

G

IDEM

H

IDEM

-

Diagrama de concentração de substâncias utilizadas em ensaio da atividade de “pool” de resinas e própolis de Scaptotrigona

(Estação

Experimental de Luiz Antônio, SP e Barra do Corda, MA) contra fungos filamentosos isolados nas colméias –

Método de microdiluição em placa de 96

poços. A concentração dos inóculos nos poços nos quais foram aplicados foi de 5 x 10

4

esporos/mL.

ENSAIO

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle de atividade

Antibiótico

Controle de esterilidade

Solução trabalho resina

Controle de esterilidade

Solução trabalho própolis

Controle de toxicidade

DMSO

47

3.2.3.3 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do

alimento larval, mel e pólen contra fungos isolados

Para aumentar os subsídios para a discussão a respeito dos

resultados obtidos pelo procedimento anterior foi averiguada a atividade de

mel alimento, larval e pólen de Scaptotrigona contra os fungos antes

escolhidos. A atividade foi verificada através de método de difusão em placa

adaptado de FUNED (2008a). O mel dos ninhos de Scaptotrigona nas duas

localidades foi recolhido com seringas descartáveis estéreis. Já os favos de

cria e potes de pólen fermentado do ninho foram destacados do ninho.Em

fluxo laminar estes tiveram seus conteúdos recolhidos em tubos tipo Falcon.

Procurou-se retirar somente alimento larval das células mais externas do favo

através do uso de pipetador automático, já o pólen foi recolhido com espátula

estéril. No início dos ensaios incubou-se os fungos A. niger + Aspergillus sp.,

Paecilomyces variotti, (EELA) e A. niger, A. japonicus + A. niger (Barra do

Corda) em BDA por 5 a 7 dias, 30

o

C, em garrafas de boca larga. Com os

mesmos procedimentos do subitem 3.2.3.2 produziu-se soluções de esporos

em salina. Igualmente ao subitem 3.2.3.2, verificou-se a concentração de

esporos nas soluções e realizou-se diluições seqüenciais até se obter

soluções 10

6

esporos/mL. Desta última solução foram transferidos 100µL

para placa de Petri (15cm) preparada com 20mL de ágar Mueller-Hinton

enriquecido com glicose, método baseado em ESPINEL-INGROFF et

al.(2007). O ágar Muller-Hinton foi preparado diluindo-se 2,1g caldo Mueller-

Hinton (Himedia); 2g ágar (Synth); 1,5g de dextrose (Merck) para cada

100mL de água destilada. As soluções de esporos foram espalhadas pelo

ágar com alça de Drigalski, até que o ágar não apresentasse excesso de

umidade. A seguir, procedeu-se a feitura de três orifícios no ágar com o uso

de ponteira de 200µL e em seguida colocou-se discos de papel filtro (6mm x

3mm) nestes orifícios (APÊNDICE 1). Em seguida foi colocado em um

primeiro orifício 40µL de mel, em um segundo 40µL de alimento larval e no

terceiro com espátula procurou-se preencher o orifício com o pólen. Como

controles foram utilizados discos de papel (3mm) com 12µg de anfotericina B.

Estes foram preparados embebendo-se discos estéreis com 12µL de solução

de anfotericina B a 1000µg/mL e secando-os em fluxo laminar. Finalizada a

48

montagem dos ensaios, em triplicata para cada fungo, dos ensaios, as placas

foram incubadas a 30ºC e foram observadas após 24h. Os halos presentes

foram medidos com régua. Os diâmetros dos halos de inibição dos elementos

testados foram comparados com os halos de anfotericina B através de teste

U de Mann-Whitney.

3.2.3.4 Isolamento de bactérias

Os procedimentos para isolamento de bactérias foram realizados no

laboratório de Farmacognosia do departamento de Ciências Farmacêuticas

da FCFRP-USP, Ribeirão Preto.

A partir de cinco colônias de Scaptotrigona das duas localidades

retirou-se, com agulhas estéreis, amostras de cerume do invólucro da área

de cria que foram colocadas em tubos estéreis. Escolheu-se o invólucro

como fonte de amostra, porque este é manipulado pelas abelhas, além de

possuir resina. As amostras de Barra do Corda foram mantidas

moderadamente refrigeradas até o fim do transporte ao laboratório. Logo em

seguida, amostras de invólucro foram transferidas para tubos de ensaio nos

quais foram acrescidos peptona 0,1% (pH 7) na proporção de 5mL para cada

1mg de amostra. Os tubos foram incubados por 24h, e a partir do caldo de

peptona incubado procedeu-se quatro diluições seqüenciais na razão 1:10

em peptona (1mL caldo com bactérias: 9mL de peptona). Então, baseado no

crescimento das bactérias (turbidez) da solução de peptona escolheu-se dois

tubos com diferentes concentrações para cada amostra vinda de cada

colônia. De cada tubo retirou-se 100µL que foram transferidos para placas de

Petri de 15cm com ágar de soja tríptica (TSA, Himedia) acrescidas de

cicloheximida (Sigma-Aldrich) a 50µg/mL. O inóculo foi espalhado nas placas

com alça de Drigalski, até o esgotamento do excesso de umidade. As placas

foram repetidas em duplicatas e incubadas a 30ºC por 48h. A seguir,

procedeu-se a contagem dos morfotipos de colônias, para se definir os

morfotipos mais comuns e isola-los. Padronizou-se o período de incubação

em 48h devido ao crescimento lento de algumas bactérias, bem como para

permitir que um crescimento maior para que certas colônias definissem

49

melhor o seu morfotipo em relação a outros. Logo em seguida, com de alça

de platina recolheu-se o material das bactérias escolhidas. Foi tomado

material de colônias totalmente individualizadas de cada morfotipo escolhido

por placa. Cada material foi inoculado em duplicata em tubos de ensaio de

TSA. Os tubos foram incubados a 30ºC até que as bactérias cobrissem a

maior área possível do meio, depois os tubos foram conservados em

geladeira. A identificação das bactérias foi realizada na Embrapa Meio-

Ambiente, Jaguariúna, SP. A identificação foi realizada através de

cromatografia de fase gasosa acoplada à espectrometria de massas de

ácidos graxos das paredes das células bacterianas e análise do resultado

através de comparação com o banco de dados através do programa Sherlock

MIS 4.0 (MIDI - Microbial Identification Inc.). Foram considerados

identificados apenas os isolados que atingiram índices de similaridade acima

de 0,5 em escala de 0 a 1 (MIDI, 2008). Porém as identificações ainda assim

não foram consideradas boas porque, na maioria dos casos, a diferença

entre os índices da primeira espécie sugerida com o da segunda espécie,

não foi ≥ 0,1 (MIDI, 2008). Para uso nos ensaios, foram escolhidas as 3

espécies com maiores índices de similaridades e com maior número de

unidades formadoras de colônia na fase de isolamento. Assim, das bactérias

isoladas nas colônias de S. aff. depilis (EELA) utilizou-se: Tetragenococcus

halophilus, Salmonella bongori e Kluyvera cryocrescens. Daquelas originadas

de Scaptotrigona sp. (Barra do Corda) foram usadas: Enterobacter cloacae,

Enterobacter aerogenes GC subgrupo A e Salmonella-choleraesuis-

choleraesuis-GC subgrupo B. As bactérias dos gêneros Salmonella,

Enterobacter e Kluyvera pertencem a família de bactérias gram-negativas

Enterobacteriaceae (SMITH, 1984; NHUNG et al., 2007). Esta família

caracteriza-se por abrigar bactérias causadoras de patogenias humanas e

por causar fermentação ácida de glicose. Sendo assim, isto pode deteriorar o

mel e inviabilizar seu consumo por Scaptotrigona. Assim como a bactéria

gram-positiva T. halophilus também se relaciona a degradação de açúcares

com a produção de ácido láctico (JUSTÉ et al., 2008).

50

3.2.3.5 Avaliação da atividade das resinas contra as bactérias isoladas

Os procedimentos para avaliação de atividade contra as bactérias

foram realizados no laboratório de Farmacognosia do departamento de

Ciências Farmacêuticas da FCFRP-USP, Ribeirão Preto.

Foram utilizados os mesmos procedimentos do método de

microdilulição em placa de 96 poços dos ensaios sobre a atividade dos

“pools” de resina e própolis contra Staphylococcus aureus (subitem 3.2.2.2).

Assim, foram preparados “pools” de resina e própolis das duas abelhas, para

serem usados nos ensaios contra as bactérias isoladas de seus respectivos

ninhos. Bem como as soluções, inclusive dos controles, também foram

preparadas da mesma maneira que no ensaio de S. aureus. As aplicações

das soluções também foram similares, produzindo as mesmas concentrações

descritas no subitem 3.2.2.2 (figuras 5a , 5b e 7a, 7b). Porém, para as

enterobacteriáceas, que são gram-negativas, foi utilizada estreptomicina

(Sigma) como controle de atividade. Assim, preparou-se uma solução de

estrepitomicina a 1000µg/mL em tampão fosfato de potássio a 1% (pH 6,0). A

seguir, se diluiu 1mL desta solução em 9mL de caldo Mueller-Hinton. Da

solução anterior tomou-se 1mL que foi diluído em 5mL de caldo Mueller-

Hinton resultando em uma solução final de estreptomicina a 20µg/mL. Foram

feitos controles com antibióticos para se avaliar a resistência das bactérias. A

imagem dos poços foi analisada através do programa Flicker - V0.87.1-beta

(LEMKIN, THORNWALL e EVANS, 2005). Os valores densitométricos dos

poços dos “pools” de resinas e própolis de Scaptotrigona aff. depilis foram

comparados com os poços do controle de viabilidade de Kluyvera

cryocrescens através de ANOVA e teste de Tukey. Os valores

densitométricos dos poços de controle de viabilidade das bactérias de Barra

do Corda foram comparados com os valores dos poços com “pools” de

resinas de Scaptotrigona sp. nas concentrações de 200µg/mL até 1562,5 µg/

mL através teste de Kruskall-Wallis.

51

3.2.3.6 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do

alimento larval, mel e pólen contra bactérias isoladas

Para aumentar os subsídios para a discussão a respeito dos

resultados obtidos pelo procedimento anterior foi averiguada a atividade de

mel alimento, larval e pólen de Scaptotrigona contra as bactérias antes

escolhidas. A verificação foi feita através de método de difusão em placa

adaptado de FUNED (2008a).

Da mesma forma como no subitem 3.2.3.2 coletou-se alimento larval,

pólen fermentado e mel das duas localidades. E da mesma forma os

procedimentos de avaliação foram adaptados de FUNED (2008a). As

bactérias (subitem 4.2.3.4) foram inoculadas em tubos de ensaio com TSA e

cultivadas a 30ºC por 24h. Após esse período, adicionaram-se as bactérias

em tubos com 6000µL de salina 0,85% até se obter uma suspensão similar à

escala Mc Farland de 0,5 (10

8

UFC/mL). Em seguida, diluiu-se duas vezes,

1:10 as suspensões, adicionando 500µL destas em 4500µL de salina, até se

obter inóculos com 10

6

UFC/mL. E seguida, foi adicionado 150µL do inóculo,

de cada espécie de bactéria em placas de Petri de 15cm com 20mL de ágar

Mueller-Hinton (Difico). O inóculo foi espalhado no meio com suabe em três

direções, até a redução de umidade no meio. Então, procedeu-se da mesma

forma como no subitem 3.2.3.2, ou seja, em cada placa foram feitos orifícios,

que receberam discos de papel filtro e 40µL de cada elemento testado no

ensaio. Diferentemente, do subitem 3.2.3.2, o pólen foi solubilizado em água

na proporção de 1g para 1,3mL, isto porque no ensaio com fungos, a

colocação do pólen seco mostrou-se problemática. Como controle de

atividade antibacteriana, a cada placa foi adicionado um disco de gentamicina

(10µg Sensifar, Cefar, Diagnóstica). O ensaio contra cada bactéria foi

realizado em triplicata. As placas foram incubadas a 30ºC por 24h, e após

esse período, os halos de inibição presentes foram medidos com régua. Os

diâmetros de halo de inibição da gentamicina foram comparados como os

halos dos elementos testados através de teste de t para duas amostras

independentes ou pelo teste U de Mann-Whithey.

52

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

C 90 µL

SM R 100 µL

IN 10 µL

C 140 µL

SM R 50 µL

IN 10 µL

C 165 µL

SM R 25 µL

IN 10 µL

C 184 µL

SM R 6 µL

IN 10 µL

C 200

µL

C 200

µL

C 200

µL

B

IDEM

µL

C 100

µL

SM R 100

µL

C 100

µL

SM R 100

µL

C 100

µL

C

IDEM

µL

C 100

µL

SSM P 100

µL

C 100

µL

SSM P 100

µL

C 100

µL

D

DMSO 100

µL

C 190

µL

IN 10

µL

DMSO 100

µL

C 190

µL

IN 10

µL

DMSO 100

µL

C 190

µL

IN 10

µL

E

C 90 µL

SM R 100 µL

IN 10 µL

C 140 µL

SM R 50 µL

IN 10 µL

C 165 µL

SM R 25 µL

IN 10 µL

C 184 µL

SM R 6 µL

IN 10 µL

C 190

µL

IN 10

µL

C 190

µL

IN 10

µL

C 190

µL

IN 10

µL

F

IDEM

C 90 µL

IN 10 µL

C 100 µL

A 7 µL

C 90 µL

IN 10 µL

C 100 µL

A8 100 µL

C90

IN 10

A9 100 µL

Descarte

2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

µL

C 140µL

ST R 50µL

IN 10µL

C 165µL

ST R 25µL

IN 10µL

C 184µL

ST R 6µL

IN 10µL

C 20 0 µL C 200 µL C 200 µL

IDEM

C 100µL

ST R 100µL

C 100µ

ST R 100µL

C C

100µL

IDEM

C 100 µL

ST P 100 µL

C 100 µL

ST P 100 µL

C 100 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

µL

C 140µL

ST P 50µL

IN 10µL

C 165µL

ST P 25µL

IN 10µL

C 184µL

ST P 6µL

IN 10µL

C 190 µL

IN 10 µL

C 190 µL

IN 10 µL

C 190 µL

IN 10 µL

IDEM

90 µL

IN 10 µL

C 100

P7 100µL

C 90 µL

IN 10 µL

C 100

P8 100µL

C 90 µL

N 10 µL

P9 100µL

Descarte

IDEM

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle

Solução trabalho resina

Controle

Caldo Mueller

Controle esteri

Solução trabalho próp olis

Controle toxicidade

DMSO

Controle

Inóculo

.

IDEM

Antibiótico

Figura 7a

-

Diagrama de aplicação de substâncias utilizadas em ensaio da atividade de “pool” de resinas e própolis de Scaptotrigona (EELA, SP e

Barra do Corda, MA) contra bactérias isoladas nas colméias – Método de microdiluição em placa de 96 poços. A ordem de cima para baixo das

abreviaturas representa a ordem de aplicação das soluções. Os valores a frente das abreviaturas indicam os volumes aplicados. Abreviaturas: C –

Caldo Mueller-Hinton; ST R – Soluções de trabalho de “pool” resina ; SR P – Solução de trabalho de “pool”de própolis ; IN – Inóculo de bactéria; DMSO

– Solução de dimetilsulfóxido; A – Solução de antibiótico (g+ - penicilina G, g- - estreptomicina); A7; A8; A9 – Solução de antibiótico vinda do poço

8,9,9.

ENSAIO

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle esterilidade

Solução trabalho resina

Controle esterilidade

Solução trabalho propólis

Controle esterilidade

Caldo Mueller-Hinton

Controle toxicidade

DMSO

Controle viabilidade

Inóculo

53

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

POOL

RESINA

3125

µg/mL

POOL

RESINA

1562,5

µg/mL

POOL

RESINA

781,25

µg/mL

POOL

RESINA

200

µg/mL

- - -

B

IDEM

RESINA

3125

µg/mL

POOL

RESINA

3125

µg/mL

POOL

RESINA

3125

µg/mL

C

IDEM

PRÓPOLIS

3125

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

3125

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

3125

µg/mL

D

DMSO

1% (v/v)

DMSO

1% (v/v)

DMSO

1% (v/v)

E

POOL

PRÓPOLIS

3125

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

1562,5

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

781,25

µg/mL

POOL

PRÓPOLIS

200

µg/mL

- -

-

F

IDEM

G

10 µg/mL

PENICILINA

G

5 µg/mL

PENICILINA

G

2,5 µg/mL

2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

µL

C 140µL

ST R 50µL

IN 10µL

C 165µL

ST R 25µL

IN 10µL

C 184µL

ST R 6µL

IN 10µL

C 20 0 µL C 200 µL C 200 µL

IDEM

C 100µL

ST R 100µL

C 100µ

ST R 100µL

C C

100µL

IDEM

C 100 µL

ST P 100 µL

C 100 µL

ST P 100 µL

C 100 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

DMSO100µL

C 190µL

IN 10 µL

µL

C 140µL

ST P 50µL

IN 10µL

C 165µL

ST P 25µL

IN 10µL

C 184µL

ST P 6µL

IN 10µL

C 190 µL

IN 10 µL

C 190 µL

IN 10 µL

C 190 µL

IN 10 µL

IDEM

90 µL

IN 10 µL

C 100

P7 100µL

C 90 µL

IN 10 µL

C 100

P8 100µL

C 90 µL

N 10 µL

P9 100µL

Descarte

IDEM

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle

Solução trabalho resina

Controle

Caldo Mueller

Controle esteri

Solução trabalho próp olis

Controle toxicidade

DMSO

Controle

Inóculo

.

IDEM

Diagrama de concentrações de substâncias utilizadas em ensaio da atividade de “pool” de resinas e própolis de Scaptotrigona

(EELA, SP e

Barra do Corda, MA) contra bactérias isoladas nas colméias – Método de microdiluição em placa de 96 poços. A concentração de bactérias

nos poços

onde se aplicou o inóculo foi de 5 x 10

4

UFC/poço.

ENSAIO

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle esterilidade

Solução trabalho resina

Controle esterilidade

Solução trabalho propólis

Controle toxicidade

DMSO

Controle viabilidade

Inóculo

54

3.2.4 Manipulação das resinas e sua composição química

Uma colônia de S. aff. depilis do meliponário do Departamento de Genética,

FMRP-USP foi transferida de sua colméia para uma nova colméia. Esta nova

colméia não estava pintada e foram transferidos apenas os favos de cria com

invólucro e as abelhas. O mel foi colocado em copos plásticos pequenos e o pólen

em potes de cera de Apis mellifera vedados. Procurou-se manter a colônia sempre

abastecida de alimento (xarope de açúcar e água 50% v/v). Também foram

colocados pedaços de cera de A. mellifera, para que as abelhas utilizassem como

material para organização do ninho. Logo após a transferência a colméia foi

transportada para uma casa de vegetação (estufa vedada) no campus USP-RP. A

colônia foi mantida por sete dias na casa de vegetação. Diariamente foi oferecida

pela manhã resina de jatobá (Hymenaea courbaril) (fig. 8). Esta resina foi escolhida

porque LANGERHEIM (2003) cita que os meliponíneos coletam-na e também

porque previamente havia sido observado que S. aff. depilis coleta esta resina,

quando ela é oferecida às abelhas. Como a resina de jatobá encontrava-se

solidificada esta era amolecida com um pouco de álcool PA (Merck), sendo o

excesso de álcool evaporado em estufa, só então, oferecia-se a resina. Após o

sétimo dia retirou-se amostras das própolis depositadas para vedar a colméia.. A

seguir ambas as amostras foram analisadas no laboratório de Química Orgância,

FCFRP. As amostras de resina de jatobá foram solubilizadas em hexano. As

amostras de própolis foram solubilizadas em clorofórmio. Isto porque estas se

mostraram de difícil solubilização. As análises das amostras foram realizadas por

cromatografia de fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM).

Utilizou-se um cromatógrafo de fase gasosa Shimadzu – QP 2010 equipado com

injetor automático AOC – 20Si operando no modo “split” (1:50), acoplado com um

detector seletivo de massas. A aquisição dos resultados foi realizada com o auxílio

do sistema de dados Shimadzu e biblioteca de espectro de massas Wiley 7.0. Para

estas análises foi utilizada uma coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m x 0,25

mm x 0,25 µm). O hidrogênio foi usado como gás de arraste e os espectros de

massas foram obtidos no modo impacto eletrônico a 70 eV, com escala de massas

variando entre 40-500 m/z. A temperatura do injetor foi de 250ºC e a programação

de temperatura, que foi utilizada para o forno, foi determinada da seguinte forma:

iniciou-se com escala de 120-260ºC elevando-se a temperatura com proporção de

55

20°C/min até atingir a temperatura de 260ºC, que foi mantida por 5 min. Na

seqüência foi estabelecida uma rampa de 260-280°C elevando-se 2°C/min,

mantendo-se 280°C por 9 minutos. Em seguida, esta foi de 280-290°C com 2°C/min,

assegurando-se 290°C por 20 minutos e finalizando-se a análise com o tempo de 45

minutos. As caracterizações químicas das amostras de própolis e resina de jatobá

foram realizadas pelo estudo comparativo dos espectros de massas obtidos para

cada amostra em relação àqueles disponíveis na biblioteca Wiley do sistema

Shimadzu. O 5- α-colestano, com tempo de retenção em 14,2 min, foi adicionado na

amostra de própolis para servir como padrão interno, o qual possibilita o cálculo da

retenção relativa dos compostos de interesse o que aumenta a confiabilidade da

metodologia de caracterização.

Figura 8

–

Oferta de resina de jatobá (

Hymenea

courbaril

) para

Scaptotrigona aff. depilis.

56

4 RESULTADOS

4.1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS RESINAS DA PRÓPOLIS DAS VEDAÇÕES

4.1.1 Composição química das resinas das própolis

A análise de componentes principais dos “fingerprint” caracterizou as

amostras de resinas de Scaptotrigona sp. (Barra do Corda) e S. aff. depilis (EELA),

dividindo-as em grupos distintos (fig 7). As amostras de Barra do Corda foram

agrupadas pelos íons de m/z 153, 157, 209, 215, 217, 225, 371, 373, 401 e 471 que

se mostraram mais intensos. Já as amostras da EELA foram agrupadas pelos íons

de m/z 299, 301, 313, 315, 317, 331,333, 335, 349 e 351. Os “fingerprints” de cada

grupo ao longo dos meses encontram-se no ANEXO 1.

4.1.2 Informações adicionais: massa da própolis, proporção de resina na própolis,

realocação da própolis

No primeiro procedimento a média da massa de própolis recolhida na EELA

nos cinco primeiros foi de 132g e a média dos cinco últimos meses foi de 103g. Foi

indicado que os dois grupos não diferem entre si (α = 0,34 - U de Mann-Whitney.). A

média da massa de própolis obtida nos seis primeiros meses de coleta em Barra do

Corda foi de 608,33g e para os seis últimos foi de 855,83g. Também não houve

indicação de diferença entre os dois grupos (α = 0,061 – teste t duas amostras).

No segundo experimento, verificou-se uma média de 49,22% de resina nas

amostras de própolis obtidas na EELA nos seis primeiros meses de coleta. Para os

seis últimos anotou-se 46,29% de média de resinas. Foi apontado que as médias

amostras não apresentam diferenças (α = 0,43 - U de Mann-Whitney.). Para as

amostras de própolis de Barra do Corda a média de resina nos seis primeiros meses

foi de 34,83% e para os seis últimos foi 37,39%. Estas amostras também foram

consideradas semelhantes (α = 0,34 - Mann-Whitney.).

No terceiro experimento, notou-se após o terceiro dia o surgimento de

purpurina na melgueira da qual se retirou a própolis (fig. 8).

57

Figura 7

-

A

-

Escores da análise dos “fingerprint” ESI(-)-

MS das amostras mensais de

resinas de Scaptotrigona sp (Ss), Barra do Corda e S. aff. depilis (Sd

), EELA. Após as

abreviaturas seguem mês e ano de coleta. Sb (Scaptotrigona bipunctata

) foi

desconsiderada neste trabalho. B – As variáveis utilizadas foram m/z

dos íons e atividade

antioxidante, valores de ED

50

, (aa). Figura retirada de SAWAYA et al. (2009).

58

A

B

C

Figura 8 –

Realocação de própolis.

A

-

1º

dia retirada da própolis da vedação de melgueira superior.

B

–

1º di

a purpurina prateada depositada em depósito de própolis (círculos laranja) na área de cria abaixo

da melgueira. C –

3º dia melgueira superior com purpurina na própolis (pontos brilhantes no detalhe

aumentado à direita).

59

4.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS RESINAS DA PRÓPOLIS DAS

VEDAÇÕES

4.2.1 Ensaios para avaliação da atividade das resinas contra microorganismos de

interesse clínico

Observou-se, para os “pools” de resina e própolis, a inibição de S. aureus nas

concentrações de 3125µg/mL e 1562,5µg/mL (fig. 5b; fig.9). Isto é inferido através da

cor vermelha do CTT. Este sal cora a atividade biológica, sendo que quanto maior o

crescimento bacteriano maior é a intensidade da cor. Os controles indicam

esterilidade das soluções utilizadas, bem como toxicidade desprezível do DMSO e

viabilidade satisfatória do inóculo. Houve crescimento de S. aureus no poço F7

(10µg/mL), provocado, possivelmente, por algum erro nos procedimentos.

Considerou-se que a estreptomicina inibiu S. aureus em todas as concentrações (fig.

5b). Isto porque, o crescimento no poço F7 foi pequeno e nas outras repetições

deste poço bem como nas demais concentrações isto não ocorreu.

Segundo a ANOVA e o teste de Tukey, dos valores densitométricos para os

poços com concentrações 781,25µg/mL dos “pools” de resina Scaptotrigona aff.

depilis são maiores que os do “pool” (α<0,001). O mesmo ocorrendo com os valores

desses os “pools” a 200µg/mL (α<0,001).

Figura 9 - Ensaio de microdiluição

em placa de 96 poços dos “pools” de

resina e própolis de

Scaptotrigona

aff.

depilis

(EELA) contra

Staphylococcus aureus.

60

4.3 RESINAS DAS VEDAÇÕES E SANIDADE DA COLÔNIA

4.3.1 Avaliação da atividade das resinas contra os fungos isolados

Os resultados dos ensaios de microdiluição do “pool” de S. aff. depilis (EELA)

contra A. niger + Aspergillus e Paecilomyces variotti encontram-se na figura 10a e

10b respectivamente. Já os resultados do ensaio do “pool’ de Scaptotrigona sp.

(Barra do Corda) contra A. niger e A. japonicus + A. niger estão nas figuras 11a e

11b. No ensaio do “pool” de resina verificou-se atividade. Houve redução no

crescimento de A. niger+Aspergillus sp e Paecilomyces variotti (EELA) em todas as

concentrações de “pools” de resina e própolis. O mesmo se verifica para A. niger

(Barra do Corda) nos poços com “pool” de resina de Scaptotrigona sp. (11a). Como

o controle de esterilidade da própolis apresentou-se contaminado, talvez por

bactéria, o ensaio do “pool” de própolis contra A. niger foi descartado, pois é possível

que o contaminante afete os resultados. A placa com A. japonicus+A. niger, foi

integralmente desconsiderada. Como o controle de viabilidade do inóculo

apresentou falhas no crescimento, em um poço que aparentasse atividade, existia a

possibilidade que isso se desse por problemas no inóculo e não pela ação de

qualquer substância. Bem como, houve sinais de contaminação no controle de

esterilidade do “pool’ própolis.

4.3.2 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento larval,

mel e pólen contra fungos isolados

Os diâmetros dos halos de inibição verificados nas placas com alimento

larval, mel e pólen de Scaptotrigona sp e S. aff. depilis contra os fungos estão

encontram-se na TABELA 1.

Nas placas com Aspergillus niger + Aspergillus sp. nenhum elemento

apresentou halo.

Para as placas com Paecilomyces variotti a média de diâmetro médio de halo

de inibição para o alimento larval foi 13,33mm e a média de halo para os discos de

anfotericina B foi, 9,67mm. Estas médias foram consideradas iguais (α=0,126 – teste

U Mann-Whitney).

61

Nas placas com Aspergillus niger a média de halo para alimento larval foi

9mm e a média de halo para anfotericina B foi 19,33mm (α=0,049). Já nas placas

com A. japonicus + A. niger a média de halo para alimento larval foi 8,67mm e a

média de anfotericina B foi 15,67mm. Nestes dois útimos casos os diâmetros médios

de alimento larval foram considerados menores que os diâmetros médios dos discos

de anfotericina (α ≤ 0,05 – teste U Mann-Whitney).

Pólen e mel em nenhum dos casos apresentaram halos de inibição.

62

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

1/0 1/0 1/0 0 0 0 0

B

1/0 1/0 1

0 0 0

C

1/0 1/0 1

0 0 0

D

3 3 3

E

1/0 1/0

1

4 4 4

F

1/0 1/0

1

0 4 3

G

1/0 1/0 1

1/0 3 3

H

0 3 3

ENSAIO

RESINA

Figura 10a

Esquema dos resultados apresentados pela placa do ensaio de microdiluição dos “pools”, resinas e própolis, de

Scaptotrigona aff.

depilis,

EELA, contra

Aspergillus niger

+

Aspergilus sp.

. Os valores indicam o crescimento do fungo nos poços e baseiam-

se na comparação entre

o crescimento ocorrido nos poços com o do controle de viabilidade do inóculo (subitem 4.2.3.2).

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle esterilidade

do RPMI

Controle da esterilidade

Solução trabalho resina

Controle da toxicidade

do DMSO

Controle da viabilidade

do inóculo

Controle

Atividade antifúngica

Controle da esterilidade

Solução trabalho própolis

63

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

1/0 1/0 1/0 0 0 0

B

1/0 1/0 1

0 0 0

C

1/0 1/0 1

0 0 0

D

4 4 3

E

1/0 2 1

4 4 3

F 1/0 1/0 1

3 3 3

G

1/0 1/0 1/0

3 3 3

H

2 2 3

Figura 10b

Esquema dos resultados apresentados pela placa do ensaio de microdiluição dos “pools”, resinas e própolis de

Scaptotrigona aff.

depilis,

EELA, contra

Paecilomyces variotti

. Os valores indicam o crescimento do fungo nos poços e baseiam-

se na comparação entre o crescimento

ocorrido nos poços c

om o do controle de viabilidade do inóculo (subitem 4.2.3.2).

Controle esterilidade

do RPMI

Controle da esterilidade

Solução trabalho resina

Controle da toxicidade

do DMSO

Controle da viabilidade

do inóculo

Controle

Atividade antifúngica

Controle da esterilidade

Solução trabalho própolis

ENSAIO

RESINA

ENSAIO

PRÓPOLIS

64

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

0 1/0 1/0 0 0 0

1/0 1/0 1/0

0 0 0

C

1/0 1/0 1/0

CONT CONT CONT

D

3 3 3

E

CONT 0 2

4 4 4

F

MÉDIO CONT MÉDIO

0 0 0

G

MÉDIO MÉDIO MÉDIO

0 0 0

H

0 0 0

ENSAIO

RESINA

Figura 11a

Esquema dos resultados apresentados pela placa do ensaio de microdiluição dos “pools”, resinas e própolis, de

Scaptotrigona sp.,

Barra do Corda contra

Aspergillus niger

. Os valores indicam o crescimento do fungo nos poços e baseiam-

se na comparação entre o crescimento

ocorrido nos poços com o do controle de viabilidade do inóculo (subitem 4.2.3.2).

CONT

–

Contaminado.

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle esterilidade

do RPMI

Controle

da esterilidade

Solução trabalho resina

Controle da toxicidade

do DMSO

Controle da viabilidade

do inóculo

Controle

Atividade antifúngica

Controle da esterilidade

Solução trabalho própolis

65

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

1/0 1/0 0

0 0 0

B

1/0 1/0 0

0 0 0

C

0 0 1/0

0 0 CONT

D

0 4 4

E

0 3 CONT

4 1/0 0

F

1 3 2

0

G

0

CONT 0

0

H

0

ENSAIO

RESINA

Figura 11b

Esquema dos resultados apresentados pela placa do ensaio de microdiluição dos “pools”, resinas e própolis, de

Scaptotrigona sp.,

Barra do Corda contra

Aspergillus japonicus + A.niger

. Os valores indicam o crescimento do fungo nos poços e baseiam-

se na comparação entre o

crescimento ocorrido nos poços com o do controle de viabili

dade do inóculo (subitem 4.2.3.2).

CONT

–

Contaminado.

ENSAIO

PRÓPOLIS

Controle esterilidade

do RPMI

Controle da esterilidade

Solução trabalho resina

Controle da toxicidade

do DMSO

Controle da viabilidade

do inóculo

Controle

Atividade antifúng

ica

Controle da esterilidade

Solução trabalho própolis

66

Barra do Corda (Scaptotrigona sp)

Fungo

Alimento

larval

halo diâmetro

(mm)

Pólen

halo diâmetro

(mm)

Mel

halo diâmetro

(mm)

Anfotericina B

halo diâmetro

(mm)

9 - - 19

9 - - 20

Aspegillus niger

9 - - 19

9 - - 18

9 - - 15

Aspegillus

japonicus

(agregado

a

A.

niger)

8 - - 14

TABELA

1 –

Ensaio de difusão em placa para atividade de alimento larval, pólen

fermentado e mel de colônias de Scaptotrigona

contra fungos isolados destas

colônias

EELA (Scaptotrigona aff. depilis)

Fungo

Alimento

larval

halo diâmetro

(mm)

Pólen

halo diâmetro

(mm)

Mel

halo diâmetro

(mm)

Anfotericina B

halo diâmetro

(mm)

- - - 13

- - 14

Aspegillus niger

(agregado

Aspergillus sp.

)

- - - 12

13 - - 10

13 - - 12

Paecilomyces

variotti

11 - - 7

67

4.3.3 Avaliação da atividade das resinas contra as bactérias isoladas

O “pool” de resinas de S. aff. depilis (EELA), inibiu Tetragenococcus

halophilus nas concentrações de 3125µg/mL e 1562,5µg/mL. Já pool de “própolis”

não inibiu apenas em 200µg/mL. (fig. 12a). O “pool” de resina de S. aff. depilis inibiu

Salmonella bongori em todas concentrações exceto em 200µg/mL. Já seu “pool” de

própolis inibiu a bactéria em todas as concentrações. (fig. 12b). Os dois “pools” de S.

aff. depilis não evitaram o crescimento de Kluyvera cryocrescens em nenhuma

concentração (fig. 12c). Através de ANOVA e teste de Tukey, os valores

densitométricos do ensaio do “pool” de resina foram comparados aos do controle de

viabilidade. Indicou-se que o crescimento bacteriano foi menor em todas as

concentrações (α<0,001) menos em 200µg/mL (α=0,076). Já o ensaio de “pool” de

própolis apresentou valores menores em todas as concentrações em relação ao

controle de viabilidade (α<0,001).

Todos os controles de esterilidade apontam para contaminação do “pool” de

própolis de Scaptotrigona sp. (Barra do Corda) em todas as placas (fig.13a, fig.13b,

fig.13c).. Assim como no subitem 4.3.1, excluiu-se das análises esse “pool”. Como

os “pools” de resinas não se apresentaram contaminados estes foram submetidos à

análise. O “pool” de resina de Scaptotrigona sp. (Barra do Corda), não inibiu

nenhuma das três bactérias em nenhuma concentração (fig.13a, fig.13b, fig.13c).

Nas comparações dos poços com “pool” de resina a 200µg/mL, 781,25 µg/mL e

1562,5 µg/mL com os poços do controle de viabilidade, através do teste de Kruskal-

Wallis, em todos os casos foram considerados semelhantes (α>0,05). Na placa com

Enterobacter aerogenes considera-se que o poço F8 (controle estreptomicina) indica

inibição, apesar de avermelhado. Isto porque o poço F8 foi atingido por vazamento

de solução de um poço vizinho durante o transporte até o scanner.

4.3.4 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento larval,

mel e pólen contra as bactérias isoladas

Os diâmetros dos halos de inibição verificados nas placas com alimento

larval, mel e pólen de Scaptotrigona sp e S. aff. depilis encontram-se na TABELA 2.

68

Para as placas com Tetragenococcus halophilus, a média de diâmetro de halo

de inibição de alimento larval foi 13mm, a média de halo de pólen foi 7,67mm e

média de halo para os discos de gentamicina foi 16,67mm. Já para as placas com

Salmonella bongori a média de halo para o alimento larval foi 29,67mm, a média

para halo de pólen foi 20,33mm e a média para halo de gentamicina foi 35mm. Para

as placas com Kluyvera cryocrescens a média de halo para o alimento larval foi

11mm, a média de halo para o pólen foi 9mm e a média de halo de gentamicina foi

20,67mm. Em todas as placas o mel não apresentou halo. Em todos os casos

comparando-se os halos dos alimentos (pólen e alimento larval) com os da

gentamicina das mesmas placas, os halos dos alimentos foram considerados

menores (α ≤ 0,05 – U Mann-Whitney).

Para as placas com Enterobacter cloacae a média de halo de alimento larval

foi 13mm, a média de halo de mel foi 8,67mm e a média para gentamicina foi

19,67mm. Já para as placas com Enterobacter aerogenes a média de halo de

alimento larval foi 13,33mm, a média de halo de mel foi 9,33mm e a média de halo

de gentamicina foi 21,33mm. Para as placas com Salmonella choleraesuis

choleraesuis a média de halo de alimento larval foi 11mm, a média de halo de mel

foi 9mm e a média de halo de gentamicina foi 20,67mm. Em todos os casos os pólen

não apresentou halo. Em todos os casos comparando-se os halos dos alimentos

(mel e alimento larval) com os da gentamicina das mesmas placas, os halos dos

alimentos foram considerados menores (α ≤ 0,05 – U Mann-Whitney).

69

Figura 12b

-

Ensaio de microdiluição em placa

de 96 poços dos “pools” de resina e própolis de

Scaptotrigona aff. depilis,

EELA, contra

Salmonella bongori.

Tons vermelhos indicam

crescimento bacteriano.

Figura 12c- Ensaio

de microdiluição em placa

de 96 poços dos “pools” de resina e própolis de

Scaptotrigona aff. depilis,

EELA, contra

Kluyvera

cryocrescens.

Tons vermelhos indicam

crescimento bacteriano.

Figura 12a-

Ensaio de microdiluição em placa de

96 poços dos “pools” de resina e própolis de

Scaptotrigona aff. depilis,

EELA, contra

Tetragenococcus halophilus.

Tons vermelh

os

indicam crescimento bacteriano.

70

Figura 13b-

Ensaio de microdiluição em placa de

96 poços dos “pools” de resina e própolis de

Scaptotrigona sp.

, Barra

do Corda, contra

Enterobacter aerogenes.

Tons vermelhos

indicam crescimento bacteriano.

Figura 13a

-

Ensaio de microdiluição em placa de

96 poços dos “pools”

de resina e própolis de

Scaptotrigona sp.

, Barra do Corda, contra

Enterobacter cloacae.

Tons vermelhos indicam

crescimento bacteriano.

Figura 13c-

Ensaio de microdiluição em placa de

96 poços dos “pools” de resina e própolis de

Scaptotrigona sp.

, Barra do Corda, contra

Salmonella choleraesuis choleraesuis.

Tons

vermelhos indicam crescimento bacteriano.

71

TABELA 2 –

Atividade antibacteriana de alimento larval, pólen fermentado e mel de

ninhos de Scaptotrigona contra bactérias isoladas a partir destes ninhos.

EELA (Scaptotrigona aff. depilis)

Bactéria

Alimento

larval

halo diâmetro

(mm)

Pólen

halo diâmetro

(mm)

Mel

halo diâmetro

(mm)

Gentamicina

halo diâmetro

(mm)

13 8 - 16

13 8 - 18

Tetragenococcus

halophilus

13 7 - 16

28 19 - 35

33 23 - 35

Salmonella

bongori

28 19 - 35

20 12 - 26

18 11 - 28

Kluyvera

cryocrescens

16 13 - 26

Barra do Corda (Scaptotrigona sp)

Bactéria

Alimento

larval

halo diâmetro

(mm)

Pólen

halo diâmetro

(mm)

Mel

halo diâmetro

(mm)

Gentamicina

halo diâmetro

(mm)

13 - 6 19

13 - 10 20

Enterobacter

cloacae

13 - 10 20

13 - 9 21

12 - 10 21

Enterobacter

aerogenes

15 - 9 22

12 - 9 20

11 -

9

21

Salmonella

choleraesuis

10 -

9

21

72

4.4 MANIPULAÇÃO DAS RESINAS E COMPOSIÇÃO QUÍMICA

Com relação à amostra de resina de jatobá, a comparação entre os espectros

de massas envolvendo os picos de interesse, detectou a presença de sesquiterpeno

e diterpenos, pois tais espectros apresentaram índices de similaridade superiores a

90%. A figura 14 mostra o perfil cromatográfico desta amostra e as figuras 15, 16, 17

e 18 apresentam os dados que permitiram identificar os seguintes compostos: óxido

de cariofileno, caureno, caurenol e ácido caruenóico, respectivamente. Na figura 19

são apresentadas as estruturas químicas destes sesquiterpeno e diterpenos.

Figura 14 - Perfil cromatográfico por CG/EM de amostra de resina de

jatobá (

Hymenaea courbaril

).

73

Figura 15

-

Espectros de massas do óxido de cariofileno apresentando tempo de retenção em 4,6

min. A - Óxido de cariofileno detectado na amostra. B -

Espectro deste sesquiterpeno disponível na

biblioteca Wiley.

B

A

a

B

Figura 16 - Espectros de massas do caur

eno apresentando tempo de retenção em

7,2 min. A - Caureno detectado na amostra. B -

Espectro deste diterpeno

disponível na biblioteca Wiley.

A

B

74

A

B

A

B

Figura 17 -

Espectros de massas do caurenol apresentando tempo de retenção

em 10,3 min. A - Caurenol detectado na amostra. B -

Espectro deste diterpeno

disponível na biblioteca Wiley.

Figura 18 - Espectros de massas do ácido caurenóico apresentando

tempo de retenção em 11,6 min. A – Ácido caurenóico detectado na

amostra. B - Espectro deste diterpeno disponível na biblioteca Wiley.

75

.

Considerando a amostra de própolis de S. aff. depilis os espectros de massas

apresentaram índice de similaridade em torno de 85%. Por isso, com o uso de

padrão interno (5-α-colestano) e adição de padrões autênticos de α-amirina e lupeol,

foi possível calcular a retenção relativa dos compostos de interesse. Este

procedimento envolvendo a adição de padrões foi realizado para aumentar a

confiabilidade da caracterização química desta amostra. Neste caso, α-amirina e

lupeol, os quais foram detectados na amostra apresentaram retenção relativa de

2,37 e 2,39, respectivamente. Já os padrões autênticos destes triterpenos

apresentaram retenção relativa de 2,36 e 2,38, respectivamente. Portanto, com base

no estudo comparativo envolvendo espectros e retenção relativa, a qual apresentou

dados bastante similares, os compostos detectados na amostra de própolis de S. aff.

depilis são os triterpenos α-amirina e lupeol. A figura 20 apresenta o perfil

Figura 19

– Estrutura química dos terpenos caracterizados na amostra de

resina de jatobá. (1) Óxido de cariofileno, (2) Caureno, (3) Caurenol e (4)

Ácido caurenóico.

76

cromatográfico da amostra de própolis. As figuras 21 e 22 apresentam os espectros

da α-amirina e lupeol, repectivamente. Na figura 23 são apresentadas as estruturas

químicas destes triterpenos.

.

A

B

Figura 20

– Perfil cromatográfico por CG/EM de amostra de própolis

de colméia de Scaptotrigona aff. depilis.

Figura 21 - Espectros de massas da α-

amirina apresentando tempo de

retenção em 33,6 min. A - α-amirina detectada na amostra. B -

Espectro

da α-amirina disponível na biblioteca Wiley.

77

A

B

Figura 22

- Espectros de massas do lupeol apresentando tempo de

retenção em 33,9 min. A - Lupeol detectado na amostra. B - Espectro do

lupeol disponível na biblioteca Wiley.

Figura 23 – Estrutura química dos triterpenos caracterizados na amostra de

própolis de S. aff. depilis. (1) α-amerina; (2) Lupeol.

78

5 DISCUSSÃO

5.1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS RESINAS DA PRÓPOLIS DAS VEDAÇÕES

Ocorreram variações ao longo do período de coleta das amostras (ANEXO 1).

Porém, observa-se pela da figura 7 que as amostras mensais de Barra do Corda

(Scaptotrigona sp.) e da EELA (S. aff. depilis) podem ser divididas em dois grupos

principais.

As amostras de Barra do Corda (Scaptotrigona sp.) foram caracterizadas

pelos íons m/z 371, 373, 401 e 471 (ANEXO 1). SAWAYA et al. (2006) indicou que

estes íons também encontrados em própolis de Tetragonisca angustula, ocorrem em

Schinus terebenthifolius, popularmente conhecida como aroeira mansa. SAWAYA et

al. (2009), apud. SAWAYA, et al. (2006) propuseram que o ESI(-)MS/MS destes íons

indica que estes podem ser relacionados com terpenos ligados a grupos ácidos.

As amostras da EELA (S. aff. depilis) apresentaram tipicamente os íons m/z

301, 315, 317 e 333 (ANEXO 1) que foram descritos como marcadores de resinas

de coníferas. Estes íons estão relacionados segundo SAWAYA (2006) ao ácido E/Z

comúnico (m/z 301), ao ácido agatálico (m/z 317) e ao ácido agático (m/z 333).

As indicações de origem vegetal não são contraditórias com o ambiente no

qual se encontram instaladas as colméias. As colméias com Scaptotrigona sp. estão

instaladas em uma área urbana e sabe-se que S. terebenthifolius, que além de ser

amplamente distribuída é recomendada para a arborização urbana (CARMELLO-

GUERREIRO e PAOLI, 1999; GUZZO e CARNEIRO, 2008). O local onde se

encontram o meliponário com S. aff. depilis é cercado por plantações de Pinus sp.

(UFSCAR, 2000). Estas árvores são frequentemente cortadas provocando liberação

de resina (NORIN, 1972; PHILLIPS e CROTEAU, 1999;

．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．

TRAPP e CROTEAU, 2001).

Foram observados ainda em alguns talhões árvores que possuiam sinais de manejo

para extração de resina. Assim pode-se propor que, apesar da diferença latitudinal

das localidades, ao menos algumas fontes de resina tem indícios que foram

determinadas por ação humana e não pela vegetação nativa.

A constância de oferta ao longo do ano das fontes de resina é deduzida pela

não diferenciação entre as massas de própolis obtidas no início e no fim do período

de coletas. A proposição sobre a constância das fontes, também é apoiada pela

verificação de que a proporção de resinas nas amostras do inicio da coleta e do fim

79

não apresentou diferenças. Portanto, pode-se inferir que as abelhas não

adicionaram mais cera para compensar a falta de resina. Ressalva-se apenas que

como o experimento de realocação de própolis indicou transporte desta entre partes

do ninho, é possível que este comportamento possa enviesar conclusões, através de

análise de composição química, sobre a constância de oferta de resina por parte de

uma fonte, ao longo do tempo.

80

5.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS RESINAS DA PRÓPOLIS DAS

VEDAÇÕES

5.2.1 Ensaios para avaliação da atividade das resinas contra microorganismos de

interesse clínico

As avaliações iniciais de atividade antimicrobiana dos “pools” de resinas

foram realizadas através de princípio de difusão em placa. A falta de atividade de

ambos os “pools” contra E. coli (fig.4), bem como a ausência de atividade do “pool”

de Scaptotrigona sp (Barra do Corda) contra S. aureus (fig.4) poderiam ser

distorções. Isto ocorreria devido à dificuldade dos “pools” de se difundirem pelo meio

(RÍOS e RECIO (2005)). Acredita-se que este não seja o caso para o “pool” de

Scaptotrigona aff. depilis, pois esse apresentou atividade nas placas com S. aureus.

No caso do “pool” Scaptotrigona sp. ensaios anteriores de microdiluição em placa de

96 poços já apontavam a ausência de atividade destas resinas contra

Staphylococcus aureus e E. coli (fig.24). Isto torna verossímil os resultados dos

ensaios de difusão. Já nos ensaios contra C.albicans dificuldades com difusão foram

em parte contornados porque os “pools” foram incorporados ao meio.

A

B

C

D

Figura 24 – Ensaios prévios de micro

diluição em placa de 96 poços de “pool” de

resina de

Scaptotrigona sp.

(Barra do Corda) poços 1A até B8. A-B -

Duplicata

de ensaio contra

Staphylococcus aureus.

C-D -

Duplicata de ensaio contra

Escherichia coli..

81

Em relação aos ensaios prévios do “pool” de Scaptotriona sp. seria plausível

esperar alguma atividade contra E. coli e Staphylococcus aureus. Isto porque como

existe a indicação que pelo menos parte desta própolis vem de Schinus

terebenthifolius (subitem 5.1) e que MARTINEZ et al. (1996) relataram atividade de

Schinus terebenthifolius contra estas bactérias e também a falta de atividade para C.

albicans. Porém, a ausência de atividade de Schinus terebenthifolius contra E. coli

foi reportada por DEGÁSPARI; WASZCZYNSKJ e PRADO (2005), bem como

também reportaram uma atividade baixa contra S. aureus e nenhuma atividade

contra C. albicans. Um adendo que pode ser feito em relação aos dois trabalhos

anteriormente citados. O primeiro foi realizado com plantas de Cuba e o segundo

com uma planta do Paraná. Isto pode estar refletindo diferenças dadas por

processos regionais. Já em relação aos ensaios prévios com o “pool” de

Scaptotrigona aff. depilis de forma semelhante poderia se prever atividades

relevantes contra E. coli, e C. albicans. Isto baseando-se na indicação de que ao

menos parte da fonte de resina é Pinus sp. (subitem 5.1) e nos relatos de KIZIL et al.

(2002) sobre a ação de resinas de Pinus brutia sobre estes microorganismos. A falta

de atividade de ambos os “pools” contra E. coli poderia indicar um paralelo com a

própolis de A. mellifera que não é eficaz contra bactérias gram-negativas SEIDEL et

al. (2008). Poderia se aventar que a falta de atividade, contra os microorganismos,

também pode ter sido gerada por uma baixa concentração de compostos com

atividade antimicrobiana nos dois “pools”. Embora existam, relatos de atividade das

plantas (Schinus terebenthifolius e Pinus sp.) que contribuíram para a formação da

própolis, o método que indicou os íons característicos destas plantas não é

quantitativo.

Através do ensaio de microdiluição considerou-se que a atividade dos “pool”

(resina e própolis) de Scaptotrigona aff. depilis contra Staphylococcus aureus foi

baixa em termos clínicos, pois, a atividade ocorreu a partir de 1562,5µg/mL e RÍOS e

RECIO (2005) recomendam que atividades de extratos vegetais acima de

1000µg/mL sejam desconsideradas. SALOMÃO et al. (2007) verificaram que a

própolis produzida por A. mellifera, a partir da resina de outra conífera (Araucaria)

inibiu S. aureus a 0,4µg/mL. É interessante continuar a investigar aspectos que

aumentem as opções de produtos oriundos da meliponicultura (CORTOPASSI-

LAURINO et al., 2006) já que isto pode servir como auxilio à manutenção de projetos

sociais ligados a ela (PIRES, DRUMMOND e LACERDA, 2006). As própolis dos

82

meliponíneos devem ser investigadas, pois a região Neotropical abriga a maior

riqueza de meliponíneos. (CAMARGO e PEDRO, 1992) os quais podem estar

associados a vários tipos de plantas produtoras de resina. Por exemplo,

meliponíneos foram observados coletando em uma espécie de Clusia

(GONÇALVES-ALVIM, 2001). E Clusia é um gênero que apresenta uma resina com

atividade antimicrobiana inclusive contra E. coli (SUFFREDINI et al., 2006). Bem

como a atenção às interações inseto-planta podem gerar inferências a respeito das

resinas coletadas pelos meliponíneos. Como é o caso das interações do jatobá cuja

resina já foi vista sendo coletada por abellhas sem ferrão (JANZEN, 1975;

LANGENHEIM, 2003).

Merece atenção também o fato de que os valores densitométricos nos poços

com concentrações 781,25µg/mL do “pool” de resinas são maiores que os do “pool”

de própolis (α<0,001). O mesmo ocorrendo com os valores desses “pools” a

200µg/mL (α<0,001). Esperava-se que a atividade dos “pools” de resina fosse maior

que a da própolis em concentrações iguais. Já que a própolis conteria cerca de 48%

de cera (subitem 4.1.2). Isto indicaria, talvez, que compostos com atividade nesta

própolis tivessem afinidade por cera e após a maceração e filtração ficaram retidos

nela.

83

5.3 RESINAS DAS VEDAÇÕES E SANIDADE DA COLÔNIA

5.3.1 Avaliação da atividade das resinas contra os fungos isolados

Estima-se que as colméias com Scaptotrigona aff. depilis (EELA)

apresentaram uma concentração média de 3248,65µg/mL de própolis por volume de

colméia/mês. Obteve-se esse valor baseando-se na média mensal de própolis obtida

(117g) pelo volume dos módulos (6cm x 24,5cm x 24,5cm x 2 módulos x 5 colméias).

Esta concentração na colméia está provavelmente subestimada. Pois, como as

colônias também estavam sendo utilizadas para a produção de mel. Assim, não se

retirava a própolis integralmente para não sobrecarregar a colônia. Como houve

redução de crescimento de Aspergillus niger + Aspergillus sp. e Paecilomyces

variotti em todas concentrações dos “pools” de própolis e resinas, que eram abaixo

do valor suposto de concentração de própolis para as colméias. Assim é possível

indicar que a resina coletada por S. aff. depilis e contida na própolis contribui para

controlar o crescimento de fungos no ninho. Aqui se nota efeito similar ao subitem

5.2.1, pois, em concentrações iguais resina e própolis tiveram atividades

semelhantes. Quanto se esperaria um efeito maior do “pool” de resina, já este teria

menos cera que a própolis.

O “pool” de resina de Scaptotrigona sp. apresentou atividade contra A. niger

(Barra do Corda) em todas as concentrações. Assim, infere-se que as resinas

contidas na própolis auxiliam na redução do crescimento de fungos, ao menos A.

niger, nas colônias de Scaptotrigona sp. Deduz-se isso porque a concentração

média estimada de própolis para as colméias desta abelha é de 3755,41µg/mL, dada

a média de própolis coletada (732,08g) e o volume das colméias (8cm x 28,5cm x

28,5cm x 3 módulos x 10 colméias). Considerando que a própolis contenha 50% de

resina e 50% cera (suposição de valor maior que o aferido, subitem 4.1.2) haveria

em média nas colméias uma concentração de 1877,5 µg/mL de resina por

colônia/mês. Assim considerando o poço mais concentrado do ensaio de resina

(1000µg/mL), verifica-se que as concentrações mensais deduzidas de resinas

(1877,5 µg/mL), são compatíveis com uma média de 1000µg/mL (α=0,49, teste-t

para uma média).

Pode-se também inferir que a atividade das resinas é fungistática já que os

fungos testados foram obtidos de própolis. E a própolis foi o material que originou a

84

maior quantidade de morfotipos de fungos (cinco) no caso, das colméias de

Scaptotrigona aff. depilis. Das amostras de própolis de Scaptotrigona sp. foram

obtidos nove morfotipos. No caso das própolis de S. aff. depilis dada a indicação que

parte das resinas vem de conífera (subitem 5.1), poder-se-ia associar os resultados

verificados com BRIDGES (1977). Este observou que uma redução no crescimento

do fungo Ceratocystis minor, provocado por β-pineno um monoterpeno, presente na

resina de coníferas. Porém, CHRISTE et al. (2003), testaram resinas que as

formigas Formica paralugubris coletaram de uma conífera (Picea abies) contra

fungos isolados dos ninhos das próprias formigas e não encontraram atividade. Bem

como NERG et al. (2004) não encontraram relação entre a resistência de grupos de

Pinus sylvestris ao fungo Conyophora puteana com a quantidade de monoterpenos

das plantas. PRASHANTH KUMAR et al. (2006) não relatam atividade de extratos

de várias partes de Pinus gerardiana contra A. niger. Em relação à própolis de

Scaptotriogona sp. parte das resinas que a compõe vem de Schinus terebenthifolius

(subitem 5.1). Assim poderia se relacionar à redução de crescimento de A. niger com

esta planta. Contudo DEGÁSPARI; WASZCZYNSKJ e PRADO (2005) não

observaram atividade do extrato de Schinus terebenthifolius contra este fungo.

5.3.2 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento larval,

mel e pólen contra os fungos isolados

Outro aspecto relevante da sanidade de uma colônia de insetos eussociais

seria a preservação das reservas de alimentos, pois é razoável pensar que a

deterioração de alimento é negativo para a colônia. Assim seria plausível verificar se

os próprios alimentos puderiam demonstrar resistência aos microoganismos.

Percebe-se que o alimento larval apresenta halo de inibição contra Paecilomyces

variotti igual a anfotericina B. Em duas placas com valores que podem ser

considerados como clinicamente como ativos (TABELA 2) (ESPINEL-INGROFF,

2007). Os demais halos do alimento larval em Aspergillus niger, A. japonicus + A.

niger foram considerados menores que aos da anfotericina B. Porém, dado que

estes não são testes clínicos pode-se inferir que em todos os halos são indicativos

de atividade do alimento larval contra os fungos. A atividade do alimento larval

possivelmente seja devido ao baixo pH do alimento larval.

85

5.3.3 Avaliação da atividade das resinas contra as bactérias isoladas

Pode-se indicar que a resina coletada, e contida na própolis, por S. aff. depilis

na EELA contribui para a manutenção da condições sanitárias em seus ninhos. Isto

porque nota-se atividade tanto do “pool” de própolis quanto do “pool” de resina

contra Tetragenococcus halophilus. Houve inibição do “pool” de própolis a partir de

781,25µg/mL que é um valor abaixo da estimativa de concentração de própolis por

volume de colméia, 3248,65µg/mL (subitem 6.3.1). Apesar de verificar inibição no

ensaio do “pool” de resina a partir de 1562,5µg/mL, os poços de concentração

781,25µg/mL, mostraram que possuem valores densitométricos menores que os

dos poços de controle de viabilidade (U de Mann-Whitney, α=0,049). Isto indica

redução de crescimento de T. halophilus. Também nota-se que o “pool” de própolis

inibiu Salmonela bongori em todas as concentrações e o “pool” de resina inibiu até

781,25µg/mL. Verifica-se também que os valores densitométricos dos poços a

200µg/mL, do ensaio do “pool”de resina são menores que os valores do controle de

viabilidade (teste t uma média, α<0,0001) indicando redução no crescimento.

Percebe-se que o antibiótico não inibiu S. bongori nem na concentração mais alta.

Não se vê inibição em nenhuma concentração nos ensaios contra Kluyvera

cryocrescens. Apesar disso, a ANOVA e teste de Tukey, indicaram que os valores

densitormétricos dos poços de todas as concentrações do ensaio de própolis são

menores que aos valores do controle de viabilidade (α<0,001). Também

comparando-se, por ANOVA e Tukey os poços do ensaio de resina como os do

controle verifica-se que apenas o poço a 200µg/mL é similar ao controle (α=0,076).

Um fato que de novo se destaca é que nos três ensaios o “pool” de própolis de

Scaptotrigona aff. depilis teve atividade maior que o “pool” de resinas, como ocorreu

contra Staphylococcus aureus (subitem 5.2.1). Principalmente, para os casos de T.

halophilus (gram-positiva) e S. bongori (gram-negativa) a atividade concorda com

KIZIL et al. (2002). Isto porque os autores encontraram atividade da resina de Pinus

brutia contra bactérias gram-negativas e positivas. Há, ainda, a indicação que a

resina utilizada por S. aff. depilis tenha como uma das fontes Pinus sp.. O fato das

bactérias terem sido isoladas de cerume poderia indicar que a atividade da resina é

bacteriostática.

Observa-se que houve crescimento bacteriano em todas as concentrações do

ensaio do “pool” de resina de Scaptotrigona sp. Então, os valores densitométricos

86

dos poços a 200µg/mL, 781,25µg/mL e 1562,5 µg/mL em todas as placas foram

comparados com os valores dos poços de seus respectivos controles de viabilidade,

através do teste de Kruskal-Wallis. Nesta comparação considerou-se estas

concentrações, pois estas representariam presumivelmente as quantidades de

resina abaixo ou similares das própolis de Scaptotrigona sp (teste t uma média para

concentração 1562,5 µg/mL, α=0,095) - subitem 5.3.1. Em todos os casos foi

indicado que os poços de todas as placas foram semelhantes aos poços do controle

de viabilidade (α>0,05). Isto é indicativo de que a resina coletada por Scaptotrigona

sp. não contribui na manutenção da sanidade do ninho. A resina pode não ser ativa

por se expressar semelhante às própolis de A. mellifera que tendem a não serem

ativas contra bactérias gram-negativas SEIDEL et al. (2008), já que todas as

bactérias testadas eram enterobacteriáceas. É possível, ainda aventar que como as

bactérias foram isoladas de cerume (que possui resinas) estas bactérias já seriam

resistentes as resinas coletadas por Scaptotrigona sp. em Barra do Corda. A

indicação que parte da resina coletada vem de Schinus terebenthifolius, não

esclarece a previsão de atividade contra gram-negativas, já que existem relatos de

atividade desta planta contra E.coli (gram-negativa) (MARTINEZ et al. ,1996). Bem

como existe relato de falta de atividade (DEGÁSPARI; WASZCZYNSKJ e PRADO,

2005).

5.3.4 Obtenção de informações adicionais: avaliação da atividade do alimento larval,

mel e pólen contra as bactérias isoladas

As médias dos halos de inibição de alimento larval e pólen de Scaptotrigona

aff. depilis foram menores que as médias dos halos de gentamicina. Apesar disto é

possível considerar que houve atividade relevante para a sanidade da colônia, haja

vista que CRISTHE et al. (2003) consideram como relevantes halos de 3,2mm a

5,6mm obtidos de fragmentos de resina em ninhos de Formica paralugubris. Um

adendo a ser feito é que em relação aos halos de gentamicina em Salmonela e

Shigella devem ser desconsiderados, pois apesar da aparência elas são resistentes

a gentamicina e a outros amiloglicosídeos (CLSI/NCCLS, 2005). A inibição

demonstrada pelo alimento larval possivelmente é dada pela sua acidez. Já o pólen

produziria os halos devido à ação de metabólitos de bactérias que acabam por

87

dominar a microbiota do pólen ao final do processo de fermentação, como ocorre

com o pólen de Melipona quadrifascita (MACHADO, 1973),

Os halos de inibição de alimento larval e mel de Scaptotrigona sp. também

foram considerandos menores que de gentamicina. Porém, novamente seriam

relevantes na dinâmica da salubridade dos ninhos sendo maiores que os valores

obtidos por CRISTHE et al. (2003). Mais um adendo a se fazer é que o antibiótico

apenas é um parâmetro para avaliar o nível resistência das bactérias isoladas e

servir de referência para a capacidade antibacteriana dos elementos estudados.

GRAJALES-CONESA et al. (2003) relatam a atividade antibacteriana de mel de

Scaptotrigona mexicana contra Staphylococcus aureus. Devido aos procedimentos

utilizados no trabalho, os autores indicam que a atividade não ocorre devido ao pH

baixo ou osmolaridade, aventando que a atividade seja dada pela origem floral.

5.3.5 Considerações gerais

Crê-se que a constância da atividade antimicrobiana de um elemento seria

um fator a se considerar quando da indicação do nível de participação deste

elemento na manutenção das condições sanitárias de um ninho de insetos

eussociais. Enquanto as resinas coletadas por S. aff. depilis reduziram o

crescimento de todos os microorganismos, a resinas coletadas por Scaptotrigona sp.

reduziram apenas o crescimento de fungo. A contaminação do controle de

esterilidade da própolis, tanto nos ensaios contra fungos quanto no ensaio contra

bactérias poderia indicar uma tendência de baixa atividade antimicrobiana por parte

da própolis de Scaptotrigona sp.. Sendo que as condições de coleta e

armazenamento foram iguais para as amostras de Scaptotrigona aff. depilis e

Scaptotrigona sp.. Isto ocorreria plausivelmente por causa da origem vegetal variável

das resinas (SAWAYA et al., 2009). Ou talvez por variações populacionais na

composição das resinas como ocorre com Hymenaea (LANGENHEIM, FOSTER e

McGINLEY, 1980). E isto poderia ser responsável por sua atividade antimicrobiana

variável como registrado para Schinus terebenthifolius (MARTINEZ et al. ,1996;

DEGASPARI; WASZCZYNSKJ e PRADO, 2005). Destaca-se a atividade das resinas

de coletadas por Scaptotrigona aff. depilis que são efetivas até contra bactérias

gram-negativas e que podem causar fermentação do mel, o que inviabilizaria o

88

consumo do mel pelas próprias abelhas (NOGUEIRA-NETO, 1997). Esta atividade

na colônia de Scaptotrigona aff. depilis, pode ser mais ou menos constante. Haja

vista que, Pinus sp que parece ser uma das fontes de coleta e disponibiliza

freqüentemente resina. Sendo que esta pode ter potencial antibacteriano (KIZIL et

al. (2002). O mel que apresentou também alguma atividade. Mas como as resinas, o

mel pode apresentar variações na atividade de acordo com sua origem geográfica

(diferentes fitofisionomias), como observado para o mel de Tetragonisca angustula

na Costa Rica (DEMERA e ANGERT, 2004). Se espera que o pólen fermentado

apresentasse mais atividade devido ao seu pH, em torno de 5,0 como visto para

Melipona quadrifasciata (MACHADO, 1973). Dentre os elementos analisados todos

possivelmente podem contribuir na sanidade na manutenção da sanidade

controlando o crescimento de microorganismos. Mas sua apenas o alimento larval

apresentou constância na atividade a despeito do tipo de abelha e diferenças

geográficas. Isto indicaria que o alimento larval tem capacidade de resistir a ação de

microorganismos, o que garantiria suas condições de consumo para as larvas. Em

abelhas solitárias o alimento deteriorado por microorganismos pode levar as larvas

à morte (BATRA; BATRA e BOHART, 1973).

89

5.4 MANIPULAÇÃO E MUDANÇA DO PERFIL QUÍMICO DAS RESINAS

Os perfis cromatográficos de resina de jatobá (Hymenaea courbaril) (fig.14) e

da própolis de Scaptotrigona aff. depilis (fig.20), mostraram-se diferentes. Os

espectros da resina indicaram três diterpenos e um sesquiterpenos (fig.15, fig.16,

fig.17 e fig.18). Como a resina utilizada vinha do tronco/raiz os resultados

concordam com as indicações que as resinas do tronco bem como das vagens são

ricas em diterpenos (LANGENHEIM et al. 1978, LANGENHEIM, 2003).

LANGENHEIM e LEE (1974) já haviam demonstrado que as resinas de jatobá

possuem cariofileno, cujo óxido foi o sesquiterpeno caracterizado nos resultados. Já

os espectros indicam da própolis de S. aff. depilis apontam apenas para triterpenos

(fig.21, fig.22) ). Porém as resinas de jatobá e outras árvores do gênero Hymenaea

são conhecidas por serem ricas em diterpenos (CUNNINGHAM, MARTIN e

LANGENHEIM, 1973; LANGENHEIM, 2003). Pressupõe-se que a única fonte de

resina disponível para as abelhas foram as resinas de jatobá. Sendo que inclusive

observou-se operárias manipulando a resina no tubo de entrada onde esta era

oferecida. Uma vez que operárias de Plebeia emerina estão com, principalmente, as

salivares glândulas ativadas no período quando desenvolvem tarefa de manipulação

dos depósitos de resina que se mantém viscosos (SANTOS, 2007). A aqui se faz a

proposição de manter as averiguações para verificar se os resultados dos espectros

são artefatos. Ou se ocorreu uma mudança na composição química. Esta última

hipótese parece ser a menos parcimoniosa, pois, acredita-se que é mais simples as

abelhas coletarem a resina, misturem à cera e a depositarem simplesmente. Nota-

se, porém que CRUZ LANDIM (1967) indica que as glândulas salivares de

meliponineos produzem uma substância que amolece cera. Ela hipotetiza, que isto é

similar ao que ocorre com A. mellifera, que produz secreções para manipular a cera.

Porém, entende-se que possa ter havido problemas durante a solubilização das

amostras. Pois a amostra de resina de jatobá solubilizou bem em hexano, o que não

ocorreu com a própolis. Por isso optou-se pelo clorofórmio, mesmo assim

continuaram as dificuldades. Acabou por se injetar apenas um lavado da própolis. O

que pode não ter levado todos os constituintes nela contidos. Bem como não se

pode ter certeza que as abelhas também se utilizaram do cerume que estava no

invólucro que teve que ser mantido. Bem como os se os fragmentos de cera,

90

colocados para vedar o pólen fermentado introduzido na colméia, de A. mellifera

contribuíram com algum artefato (triterpeno)..

91

6 CONCLUSÃO

Através dos resultados obtidos conclui-se que:

- Alguma conífera é uma das fontes de resina para para Scaptotrigona aff.

depilis instalada na Estação Experimental de Luiz Antônio, SP. Possivelmente a

fonte é Pinus sp. uma vez que as colméias são cercadas por plantações desta

árvore. Prováveis componentes das resinas coletadas por S. aff. depilis são os

ácidos E/Z comúnico, agatálico e agático. Já para Scaptotrigona sp. instalada em

Barra do Corda, MA, uma das fontes foi Schinus terebenthifolius. Sendo que dentre

os componentes provavelmente haja terpenos com grupos ácidos.

- As resinas de Scaptotrigona aff. depilis e Scaptotrigona sp. não

apresentaram atividade relevante contra microorganismos de interesse clínico.

Apesar disso é interessante que existam mais investigações a respeito da própolis

dos meliponíneos, pois existem muitas espécies dessas abelhas na região

Neotropical que podem estar coletando em diversas espécies de plantas produtoras

de resina.

- As resinas de Scaptotrigona aff. depilis indicou ser mais efetiva para

manutenção da sanidade do ninho, reduzindo o crescimento todos os

microorganismos isolados dos ninhos destas abelhas. Scaptotrigona sp. reduziu o

crescimento apenas de fungos encontrados em seus ninhos. Ressalta-se também a

atividade do alimento larval que independente de espécie de abelha e local quase

sempre apresentou atividade. Isto pode indicar sua capacidade de manter-se em

condições de consumo para as larvas, contribuindo com a sanidade do ninho.

- Constataram-se diferenças na composição química da resina oferecida à

Scaptotrigona aff. depilis e na composição da própolis, a qual se presume foi

elaborada com a mesma resina oferecida. Haja vista várias lacunas são necessárias

maiores averiguações antes de se apontar que S. aff. depilis modifique a

composição química das resinas.

92

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APÊNDICE 1- METODOLOGIA PARA AVALIAÇÃO PRÉVIA DE ATIVIDADE

ANTIBACTERINA E ANTIFÚNGICA DE PRÓPOLIS DE Scaptotrigona BASEADO

EM FUNED (2008a ;2008b )

A verificação de atividade antibacteriana, do “pool” de própolis de

Scaptotrigona sp. e S. aff. depilis foi através de ensaio de difusão em placa realizado

em triplicata. Utilizou-se culturas de Escherichia coli (ATCC 25922) e

Staphylococcus aureus (ATCC 25923) que foram cultivadas em estufa por 24 horas

a 37ºC em tubo de ensaio com caldo Mueller-Hinton (Difco). A partir destas culturas

foram preparadas suspensões bacterianas padrão. Para tanto, adicionou-se as

bactérias cultivadas em tubos com 3000µL de salina 0,85% até que as suspensões

atingissem turbidez igual à de uma solução de BaSO

4

, equivalente a escala Mc

Farland de 0,5, que corresponde a 10

8

UFC/mL (unidades formadoras de colônias

por mililitro) de bactérias. Em seguida, diluiu-se dez vezes as suspensões padrões

adicionando 300µL destas em 2700µL de salina 0,85%. Estas novas suspensões

foram novamente diluídas 1:10 da mesma forma, obtendo-se as suspensões de

trabalho com 10

6

UFC/mL. Então, foi adicionado 100µL das suspensões de trabalho,

de S. aureus, em cada uma de três placas de Petri de 15cm com 20mL de ágar

Mueller-Hinton (Acumedia). Procedeu-se da mesma forma com E. coli, em outras

três placas semelhantes. As suspensões de trabalho foram espalhadas pela

superfície do meio em três direções diferentes com auxílio de suab até a eliminar o

excesso de líquido. Logo após, foram feitos dois orifícios na superfície do ágar

Mueller-Hinton em cada uma das placas. Para tanto, utilizando-se ponteiras de

200µL invertidas. Em cada placa, no interior de um orifício foi adicionado 40µL de

solução etanólica (500mg/mL) do “pool” de resina de Barra do Corda e em outro o

mesmo volume na mesma concentração, do “pool” da EELA. Como controle uma

das placas recebeu um orifício extra no qual se adicionou 40µL de etanol (controle).

Também como controle e parâmetro de comparação, uma placa com E. coli recebeu

um disco de gentamicina 10µg (Sensifar, Cefar, Diagnóstica). Enquanto uma placa

com S. aureus recebeu um disco de vancomicina 30µg (Sensifar, Cefar,

Diagnóstica). As placas foram incubadas em estufa a 37ºC, e avaliadas após 24h

através da mensuração do halo de inibição, com régua.

Para avaliar a atividade antifúngica, efetuou-se um ensaio em triplicata. Para

tal, primeiramente, prepararam-se placas de Petri de 15cm para o ensaio. Para a

109

preparação das placas, tomou-se 600µL de soluções de cada resina feitas em

dimetilsulfóxido (DMSO - Calbiochem) a 500mg/mL. Cada uma das soluções foi

incorporada sob agitação a 60mL (em recipientes distintos) de ágar batata dextrose

(BDA) (Himedia) ainda fundido. Em seguida, 20mL de meio com cada tipo de “pool”

foi vertido em cada uma de três placas. Concomitantemente, culturas de Candida

albicans (ATCC 18804) foram cultivadas por 24h a 37ºC. A partir desta cultura

preparou-se em um tubo com 3000µL de salina 0,85% uma suspensão padrão com

turbidez igual de uma solução de BaSO

4

, equivalente a escala Mc Farland de 0,5,

que representa 10

6

UFC/mL de C. albicans. Então, diluiu-se a solução padrão em

dez vezes, tomando-se 300µL desta e adicionando-se a 2700µL de salina. A nova

solução foi diluída 1:10 da mesma forma como anteriormente, produzindo a solução

de trabalho (10

4

UFC/mL). A seguir, foi adicionado 100µL da solução de trabalho em

cada uma das seis placas com resina incorporada ao meio. A solução foi espalhada

pela superfície com auxílio de suab até a eliminação do excesso de líquido. Para

servir como controles do nível de toxicidade do DMSO, foram preparadas três placas

com 20mL de BDA a cada qual foi incorporada 2µL de DMSO. Estas três placas

foram inoculadas como as placas contendo resina. Como controle de crescimento de

C. albicans, foi preparada uma placa com 20mL de BDA a qual foi inoculada como

as placas com resina. As placas foram incubadas a 37ºC por 48h. Após a incubação

foi feita a contagem das colônias que cresceram. A avaliação do nível de atividade

foi feita através da comparação entre as placas da quantidade de colônias que

surgiram.

110

ANEXO 1 – “ESI(-)-MS FINGERPRINTS” DAS AMOSTRAS DE PRÓPOLIS

DE Scaptotrigona sp. (BARRA DO CORDA, MA) E Scaptotrigona aff. depilis

(ESTAÇÃO EXPERIMENTAL DE LUIZ ANTÔNIO, SP)

Ss = Scaptotrigona sp.; Sd = Scaptotrigona aff. depilis

Ss05/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

225.1

215.1

187.1

451.2

275.1

239.1

245.1

421.1

377.1

347.1

295.1

317.1

373.3

405.1

389.2

435.2

452.2

469.4

601.4

533.3

487.4

503.3

593.4

563.4

637.4

603.4

649.4

Ss06/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

373.3

371.3

195.1

191.1

167.1

215.1

225.1

369.3

347.3

313.1

297.1

227.1

279.1

401.4

387.3

471.4

421.1

435.3

563.4

505.4

495.4

551.4

593.4

651.5

603.4

667.4

Ss07/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

373.3

371.3

225.1

211.1

164.1

347.3

239.1

275.1

251.1

299.3

313.2

401.3

374.3

387.3

471.4

469.4

421.1

467.4

435.3

515.4

503.4

591.4

516.4

589.4

601.4

635.4

649.4

Ss 08/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700

m/z

0

100

%

157.1

215.1

191.1

159.1

179.1

195.1

217.1

371.1

313.1

297.1

271.2

255.3

347.3

327.3

471.4

375.1

395.1

439.2

561.5

501.4

515.3

547.4

593.4

603.4

623.4 651.4

111

Ss09/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

471.3

373.3

371.3

297.2

165.1

279.2

347.3

401.3

387.3

455.4

402.3

421.1

472.3

487.3

Ss 10/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700

m/z

0

100

%

373.3

371.3

347.3

345.3

157.0

195.1

225.1

297.3

348.3

401.4

375.3

387.3

471.4

402.3

455.4

403.3

453.4

511.4

502.4

497.4

517.4

561.4

518.4

593.4

651.5

603.5

Ss11/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700

m/z

0

100

%

373.3

371.3

195.1

157.1

369.3347.3

345.3

217.1

285.1

227.1

271.1

297.3

401.4

375.3

387.3

471.4

469.4

402.4

467.4

417.3

513.4

472.4

601.4

561.4

553.4

591.4

651.5602.4

Ss12/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

217.1

195.1

187.1

295.1

265.1

245.1

377.1

309.1

353.1

311.1

401.3

471.4

467.4

431.1

563.4

493.3

509.3

547.3

593.4

635.4

649.4

675.5

Ss01/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700

m/z

0

100

%

471.4

469.4

421.1

373.3

173.1

195.1

371.3

209.1

285.1

217.1

271.1

347.3

317.1

401.3

377.1

455.4

422.1

472.4

485.4

501.4

517.3

112

Ss02/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700

m/z

0

100

%

471.4

469.4

373.3

371.3

191.1

297.3

209.1

271.1

215.1

265.1

347.3

341.1

421.1

401.3

374.3

455.4

453.4

472.4

487.4

511.4

563.2

593.2

601.4

Ss03/07

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

450

475

500

525

550

575

600

625

650

675

700

m/z

0

100

%

157.0

471.4

209.1

173.1

181.1

373.3

371.3

215.1

237.1

347.3

291.1

275.1

303.1

335.1

401.3

374.3

421.1

455.4

453.4

472.4

505.3

503.3

593.4

513.4

577.4

525.4

594.4

635.4

651.4

Ss04/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700

m/z

0

100

%

209.1

157.0

181.1

373.3

237.1

225.1

371.3

275.1

251.1

347.3

333.1

291.1

401.3

374.3

471.4

421.1

467.4

422.1

472.4

591.4

505.3

511.4

577.4

623.4

Sd09/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

301.2

299.2

187.1

291.2

275.2

195.1

255.1

315.2

317.2

334.2

349.2

363.2

439.3

423.3

379.2

455.2

471.3

635.4

525.3

619.5

603.5

559.3

649.4

667.5

Sd10/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

301.2

299.2

195.1

179.1

271.2

265.2

239.1

315.2

525.3

334.2

471.4

347.3

365.2

366.2

457.3

423.3

394.2

472.4

499.3

526.3

559.3

619.4

603.5

635.4

691.4

113

Sd11/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

301.2

299.2

265.2

191.1

179.1

239.1

192.1

297.2

317.2

333.2

471.4

334.2

349.2

423.3

363.2

379.2

437.3

489.4

507.2

635.4

615.4587.4

569.4

651.5

677.4

Sd12/06

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

301.2

299.2

191.1

179.1

265.2

227.1

275.2

315.2

333.2

347.3

361.2

366.2

471.4

393.3

423.3

437.3

489.4

635.4

617.4

511.3

601.4

653.4

Sd01/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

333.2

315.2

301.2

299.2

291.2

275.2

191.1

265.1

349.2

471.4

365.2

459.3

411.1

381.2

489.4

507.2

Sd02/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

333.2

315.2

299.2

291.2

275.2

349.2

365.2

381.2

Sd03/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

315.2

301.2

291.2

275.2

333.2

349.2

365.2

381.2

114

Sd04/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

333.2

315.2

299.2

291.2

275.2

271.1

349.2

365.2

Sd05/07

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

450

475

500

525

550

575

600

625

650

675

m/z

0

100

%

333.2

315.2

301.2

299.2

195.1

275.2

255.1

233.1

211.1

349.2

365.2

667.5

651.4

367.2

383.2

635.4

455.3

423.3

513.3

471.3

609.4

683.5

Sd06/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

333.2

315.2

299.2

291.2

273.2

349.2

351.2

365.2

381.2

Sd07/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

333.2

315.2

301.2

291.2

275.2

255.1

349.2

351.2

365.2

381.2

115

Sd08/07

175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675

m/z

0

100

%

333.2

315.2

301.2

291.2

275.2

255.1

349.2

351.2

365.2

471.4

381.2

489.3

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