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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
SELEÇÃO DE Lotus corniculatus L. TOLERANTE AO ALUMÍNIO
ALINE JANKE
Engenheira Agrônoma (UFRGS)
Dissertação apresentada como um dos requisitos à obtenção do Grau de
Mestre em Zootecnia
Área de Concentração Plantas Forrageiras
Porto Alegre (RS), Brasil
Maio, 2009
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iii
“Tantas vezes pensamos ter chegado,
Tantas vezes é preciso ir além.”
Fernando Pessoa
Aos meus pais, NAIR e RUBERT, pelo amor incondicional.
A minha irmã, AMANDA, pelo amor e incentivo.
Sem vocês eu nada seria...
DEDICO
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iv
AGRADEÇO...
Ao Pai do Céu pela minha vida e por sempre estar ao meu lado!
A minha família pelo amor, carinho, incentivo e educação! Família é
a base de tudo!
Ao meu Amor, Clebersom, pelo seu amor, amizade, carinho e
compreensão, tornando assim minha vida mais bela!
Aos professores da Pós-graduação pelo aprendizado e
principalmente ao meu orientador Miguel Dall’Agnol, pela sua confiança,
amizade e sobretudo pelos seus ensinamentos de vida!
Aos meus colegas e amigos da pós-graduação, que tornaram esta
caminhada repleta de aprendizados... Foi bom ter convivido com vocês!
A CAPES pela concessão da bolsa e a todos os brasileiros, que
graças aos seus esforços patrocinaram os meus estudos.
Enfim, a todas as pessoas que de alguma maneira contribuíram para
a realização deste sonho,
Muito obrigada!
v
SELEÇÃO DE Lotus corniculatus L. TOLERANTE AO ALUMÍNIO
1
Autora: Aline Janke
Orientador: Miguel Dall’Agnol
RESUMO
A utilização de pastagens capazes de tolerar o alumínio em níveis
elevados apresenta-se como uma alternativa viável para contornar um dos
principais problemas existentes em áreas de cultivo com solos ácidos. Entre as
leguminosas forrageiras, o cornichão (Lotus corniculatus L.) destaca-se pela
sua qualidade nutricional e versatilidade de adaptação. Em função disso, esse
trabalho foi desenvolvido com o objetivo de selecionar plantas de L.
corniculatus tolerantes ao alumínio, bem como analisar a diversidade genética
existente entre estes materiais com o auxílio de marcadores moleculares do
tipo microssatélites. Foram utilizados três genótipos de cornichão (Draco, São
Gabriel e UFRGS) em solução nutritiva, contendo 200 mol/L de cálcio
(CaCl
2
.2H
2
O), 100 mol/L de alumínio (AlCl
3
) e pH controlado em uma faixa de
4,1 - 4,3. Realizaram-se dois ciclos de seleção, sendo as plântulas
selecionadas pelo comprimento final das radículas. Posteriormente, testou-se o
progresso alcançado pelos ciclos de seleção através de um experimento em
solução nutritiva, semelhante ao utilizado nas seleções, com as populações
originais e melhoradas, em quatro concentrações de alumínio (0, 50, 100 e 150
mol/L) (AlCl
3
). Foram avaliados o comprimento inicial, final e o crescimento
das radículas. Após o término do segundo ciclo de seleção, realizou-se a
análise da diversidade genética existente entre os genótipos de cornichão
estudados. Foram utilizados 18 pares de primers desenvolvidos para Lotus
japonicus (Regel) Larsen e Trifolium repens L. As similaridades genéticas, com
base no coeficiente de Jaccard, foram utilizadas para fazer o agrupamento dos
genótipos pelo método UPGMA, através do programa NTSYS pc 2.1. O
número de alelos e o conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) também
foram calculados para cada loco. A seleção em solução nutritiva mostra-se
eficiente na seleção de plântulas de cornichão tolerantes ao alumínio. Os
materiais analisados apresentam diferenças em relação a esta característica,
destacando-se como o genótipo mais tolerante UFRGS F2, proveniente de dois
ciclos de seleção. Os marcadores microssatélites revelam-se adequados para
acessar a variabilidade genética entre os genótipos de L. corniculatus.
1
Dissertação de Mestrado em Zootecnia – Plantas Forrageiras, Faculdade de Agronomia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil. (93p.). Maio, 2009.
vi
SELECTION OF Lotus corniculatus L. TOLERANT TO ALUMINUM
2
1
Author: Aline Janke
Adviser: Miguel Dall’Agnol
ABSTRACT
The use of grasslands capable to tolerate high levels of aluminum is
a viable alternative to bypass one of the main problems existing in cultivated
areas with acid soils. Among the forage legumes, the birdsfoot trefoil (Lotus
corniculatus L.) stands out for its nutritional quality and versatility of adaptation.
Given the importance, this work was carried out to select plants of L.
corniculatus tolerant to aluminum, and analyze the genetic diversity between
these materials with the aid of microsatellite molecular markers. Three
genotypes of birdsfoot trefoil were used (Draco, São Gabriel and UFRGS) in
nutrient solution containing 200 mol/L of calcium (CaCl
2
.2H
2
O), 100 mol/L of
aluminum (AlCl
3
) and controlled in a pH range of 4.1 - 4.3. Two selection cycles
were made, where the seedlings were selected by the root length.
Subsequently, the progress achieved by cycles of selection was tested in an
experiment in nutrient solution, similar to that used in the selections, with the
original and improved populations, in four concentrations of aluminum (0, 50,
100 and 150 mol/L) (AlCl
3
). The initial, final and the growth of the radicle were
evaluated. After the end of the second cycle of selection it was carried out the
analysis of genetic diversity among genotypes of birdsfoot trefoil studied.
Eighteen pairs of primers developed for Lotus japonicus (Regel) Larsen and
Trifolium repens L. were used. The genetic similarities based on Jaccard
coefficient was used to make the grouping of genotypes by the UPGMA
method, using the program NTSYS pc 2.1. The number of alleles and the
polymorphism information content (PIC) were calculated for each locus. The
selection in nutrient solution was efficient in the selection of seedlings of
birdsfoot trefoil tolerant to aluminum. The materials analyzed differ for this
characteristic, with the genotype UFRGS F2, being the most tolerant. The
microsatellite markers are suitable for accessing the genetic variability among
genotypes of L. corniculatus.
1
Master of Science Dissertation in Forage Science, Faculdade de Agronomia, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (93p.). May, 2009.
vii
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................ 4
2.1 Considerações gerais sobre a toxidez por alumínio..................... 4
2.1.1 Solos ácidos......................................................................... 4
2.1.2 Toxidez por alumínio............................................................ 6
2.1.3 Mecanismos de tolerância ao alumínio................................ 9
2.1.4 Controle genético................................................................. 12
2.1.5 Métodos de seleção............................................................. 13
2.1.6 Fixação simbiótica................................................................
17
2.2 Microssatélites...............................................................................
19
2.3 Lotus corniculatus L., uma boa espécie forrageira........................
24
2.3.1 Origem e biologia..................................................................
24
2.3.2 Características agronômicas................................................
27
2.3.3 Melhoramento.......................................................................
30
3. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................
33
3.1 Seleção em solução nutritiva.........................................................
33
3.1.1 Avaliação da tolerância ao alumínio.....................................
37
3.2 Análise molecular...........................................................................
38
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................
44
4.1. Avaliação da tolerância ao alumínio.............................................
44
4.2. Análise molecular..........................................................................
54
5. CONCLUSÕES....................................................................................
61
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................
62
7. APÊNDICES........................................................................................
73
8. VITA.....................................................................................................
93
viii
RELAÇÃO DE TABELAS
Página
1. Primers de microssatélites utilizados na amplificação de seis
genótipos de Lotus conriculatus L.......................................................
41
2. Comprimento radicular inicial (cm) dos genótipos de cornichão
(Lotus corniculatus L.) e alfafa crioula (Medicago sativa L.)
utilizados na implantação do experimento de avaliação da
tolerância ao alumínio em solução nutritiva........................................
45
3. Comprimento radicular final (cm) dos genótipos de cornichão (Lotus
corniculatus L.) e alfafa crioula (Medicago sativa L.) aos 14 dias em
solução nutritiva contendo 200 mol/L de cálcio (CaCl
2
.2H
2
O
) em
quatro concentrações de alumínio (0, 50, 100, 150 mol/L)
(AlCl
3
)..................................................................................................
46
4. Crescimento radicular (cm) dos genótipos de cornichão (Lotus
corniculatus L.) e alfafa crioula (Medicago sativa L.) aos 14 dias em
solução nutritiva contendo 200 mol/L de cálcio (CaCl
2
.2H
2
O)
em
quatro concentrações de alumínio (0, 50, 100 e 150 mol/L)
(AlCl
3
)..................................................................................................
48
5. Tamanho alélico (pb), número de alelos (A) e conteúdo de
informação de polimorfismo (PIC), de cada um dos 18 marcadores
de microssatélites analisados na caracterização de seis genótipos
de cornichão (Lotus corniculatus L.)..................................................
55
6. Matriz de similaridade genética de seis genótipos de Lotus
corniculatus L. analisados através da técnica de microssatélites......
56
ix
RELAÇÃO DE FIGURAS
Página
1. Seleção de genótipos de Lotus corniculatus L. tolerantes ao
alumínio, em solução nutritiva contendo 200 mol/L
de cálcio
(CaCl
2
.2H
2
O) e 100 mol/L
de alumínio (AlCl
3
)..................................
34
2. Polinização de Lotus corniculatus L. (A) inflorescência; (B) retirada
da quilha; (C) polinização; (D) formação das vagens.........................
36
3. Gel de agarose com bandas de DNA das populações de Lotus
corniculatus L. em análise do primer de microssatélite
TM0817...............................................................................................
42
4. Crescimento radicular médio (cm) de alfafa crioula (Medicago sativa
L.) e de três populações originais e melhoradas de cornichão (Lotus
corniculatus L.) após 14 dias em solução nutritiva contendo 200
mol/L de cálcio (CaCl
2
.2H
2
O) em quatro concentrações de
alumínio (0, 50, 100 e 150 mol/L) (AlCl
3
)...........................................
50
5. Efeitos da toxidez por alumínio em plântulas de Lotus corniculatus L.
51
6. Avaliação da tolerância ao alumínio de nove populações de
cornichão (Lotus corniculatus L.) em relação ao crescimento
radicular médio das plântulas submetidas a diferentes
concentrações de alumínio (0, 50, 100 e 150 mol/L) (AlCl
3
).............
52
7. Dendrograma obtido com base na similaridade genética de seis
genótipos de Lotus corniculatus L., utilizando-se 18 marcadores
microssatélites....................................................................................
58
x
RELAÇÃO DE ABREVIATURAS
A................. número de alelos por loco
Al
3+
..............
Alumínio
ALF.............
Alfafa
CF...............
comprimento radicular final
CI................
comprimento radicular inicial
CIMMYT..... Centro Internacional de Melhoramento de Trigo e Milho
CR.............. crescimento radicular
cv................
Cultivar
DIVMO........
digestibilidade in vitro da matéria orgânica
DPFA..........
Departamento de Plantas Forrageiras e Agrometeorologia
DR..............
genótipo de Lotus corniculatus L. INIA Draco
DR-F1.........
genótipo de L. corniculatus INIA Draco após um ciclo de seleção
DR-F2.........
Genótipo de L. corniculatus INIA Draco após dois ciclos de seleção
FDA............ Fibra em Detergente Ácido
FDN............ Fibra em Detergente Neutro
IAC............. Instituto Agronômico de Campinas
MS.............. Matéria seca
pb............... par de base
PIC............. conteúdo de informação de polimorfismo
QTL............
Quantitative Trait Loci
rpm............. rotações por minuto
RS.............. Rio Grande do Sul
SG..............
genótipo de L. corniculatus São Gabriel
SG-F1.........
Genótipo de L. corniculatus São Gabriel após um ciclo de seleção
SG-F2.........
Genótipo de L. corniculatus São Gabriel após dois ciclos de seleção
SSR............ Microssatélite
UF...............
Genótipo de L. corniculatus UFRGS
UF-F1.........
Genótipo de L. corniculatus UFRGS após um ciclo de seleção
UF-F2.........
Genótipo de L. corniculatus UFRGS após dois ciclos de seleção
UFC............ Unidade Formadora de Colônia
USDA.........
United States Department of Agriculture
1. INTRODUÇÃO
Os solos ácidos compreendem grande parte do mundo,
principalmente as regiões tropicais e subtropicais úmidas, onde o volume
considerável de chuvas e as temperaturas elevadas acabam acelerando a ação
do intemperismo. Nesses solos, o principal fator limitante é a presença de
alumínio tóxico (Al
3+
) em elevadas concentrações, resultando em uma redução
no crescimento e na produtividade das plantas (Delhaize & Ryan, 1995).
A redução na quantidade do Al
3+
pode ser realizada através de
práticas de calagem, pois este elemento é totalmente neutralizado quando o pH
do solo é superior a 5,5. Por outro lado, o uso de corretivos representa um
acréscimo nos custos de produção. Além do mais, o alumínio não ocorre
apenas na camada arável do solo, mas também em maiores profundidades,
tornando difícil a realização desta operação.
Outra maneira de superar as dificuldades relativas à presença do
Al
3+
no solo é através da utilização de cultivares tolerantes (Foy et al., 1978),
obtidas por meio da exploração do potencial genético de cada espécie. O uso
destes materiais pode diminuir os custos de implantação e manutenção da
cultura e, também, permitir um melhor desenvolvimento em situações de
estresse hídrico, pois as plantas tolerantes apresentam um melhor
desenvolvimento do sistema radicular.
2
Pesquisas vêm sendo realizadas através de diversos métodos de
seleção, dentre os quais se destaca a seleção em solução nutritiva, por ser
uma técnica relativamente fácil e rápida, além de apresentar baixos custos.
Outro fator que deve ser ressaltado em relação a este método é a escolha dos
materiais pela visualização das raízes, já que o principal sintoma de toxidez por
alumínio nas plantas é a redução do crescimento radicular.
A utilização de técnicas moleculares concomitantes ao programa de
melhoramento permite uma melhor elucidação do comportamento genético dos
materiais analisados, não estando restrito apenas a características
morfológicas e agronômicas. Os microssatélites ou SSR são marcadores que
possuem expressão co-dominante, são somaticamente estáveis, multialélicos e
altamente reprodutíveis. Esses marcadores possuem um elevado conteúdo de
informação de polimorfismo, sendo ideais para serem utilizados na
identificação e discriminação de genótipos (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
O cornichão (Lotus corniculatus L.) apresenta-se como uma espécie
promissora em programas de melhoramento, encontrando-se amplamente
distribuído no mundo, destacando-se pelo seu alto valor nutritivo,
palatabilidade, capacidade de desenvolvimento em diversos ambientes e por
não provocar timpanismo (Beuselinck, 1999).
Nas consorciações, L. corniculatus apresenta um bom
comportamento, contribuindo de maneira efetiva para o aumento da
produtividade da pastagem, fixando nitrogênio atmosférico através de simbiose
e adicionando proteína à dieta animal. Por ser uma leguminosa hibernal,
também permite a distribuição da forragem de maneira adequada ao longo do
3
ano, principalmente quando utilizada no melhoramento do campo nativo do Rio
Grande do Sul, visto que este possui em sua maioria espécies estivais.
O cornichão também é capaz de tolerar a acidez e a baixa fertilidade
do solo, situações essas pouco toleráveis por outras leguminosas de
importante valor forrageiro. Apesar disso, em função dos elevados teores de
Al
3+
encontrados nos solos do Sul do Brasil, ainda há a necessidade de
melhorar esta característica.
Em razão desses fatores, o trabalho foi desenvolvido visando à
obtenção de populações com maior tolerância ao alumínio, de três genótipos
de L. corniculatus, através de seleção em solução nutritiva. O estudo também
objetivou a caracterização genética de genótipos de cornichão, com o auxílio
de marcadores moleculares do tipo SSR.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Considerações gerais sobre a toxidez por alumínio
2.1.1 Solos ácidos
Os solos ácidos são freqüentes nas regiões tropicais e subtropicais,
ocupando aproximadamente 3,95 bilhões de hectares, correspondendo a 30%
da área cultivável no mundo (von Uexküll & Mutert, 1995). No Rio Grande do
Sul (RS), um levantamento realizado por Rheinheimer et al. (2001) indicou que
44% dos solos do estado apresentavam pH em água inferior a 5,5.
Nas regiões de clima árido e semi-árido, os solos são geralmente
alcalinos, pois a precipitação pluviométrica não é suficiente para percolar os
cátions básicos do solo. Por outro lado, nas regiões tropicais e subtropicais, o
processo de acidificação do solo é intenso. Devido à elevada precipitação
pluviométrica, ocorre à lixiviação de cátions (Na
+
, K
+
, Ca
2+
e Mg
2+
) e ânions
(cloreto, nitrato e sulfato) de menor valência, associada à retenção de cátions
de maior valência (Al
3+
e Mn
2+
), nos sítios de troca da argila e da matéria
orgânica. Havendo uma remoção de cátions básicos maior do que a taxa de
liberação pelo intemperismo, o pH do solo diminui (Bohnen et al., 2006).
A solubilização da rocha ocorre porque a água da chuva que entra
em contato com a mesma é levemente ácida (pH 5,5 a 6,5), em decorrência da
dissolução parcial do gás carbônico do ar na água. Os íons hidrogênio (H
+
)
5
formados a partir desta reação irão reagir com a rocha, e assim serão liberados
cátions e ânions que servirão de nutrientes para os organismos que começarão
a se estabelecer sobre a rocha matriz (Tedesco & Bissani, 2004; Bohnen et al.,
2006).
Os minerais primários das rochas passam pelos processos de
hidratação e hidrólise. A hidratação consiste na associação de moléculas de
água nos minerais, sem causar alteração direta nos mesmos. Todavia, na
hidrólise, ocorre uma substituição dos cátions básicos e do íon alumínio (Al
3+
)
por íons H
+
, podendo resultar em uma diminuição do pH do solo. O alumínio
liberado poderá ocupar os sítios de troca ou passar pelo processo de hidrólise,
liberando assim mais íons H
+
, favorecendo dessa maneira a dissolução da
rocha (Wiethölter, 2000).
A decomposição dos resíduos vegetais pelos microrganismos, a
utilização de fertilizantes e a própria absorção dos nutrientes pelas plantas
também contribuem para a acidificação do solo. A mineralização da matéria
orgânica ocasiona a liberação de H
+
e nitrato (NO
3
-
). Quando ocorre a
percolação do NO
3
-
no perfil do solo, há obrigatoriamente o arraste de um
cátion (K
+
, Ca
2+
, Mg
2+
) para manter a eletroneutralidade da solução. Em
decorrência da percolação desses cátions, os sítios de troca são ocupados
gradativamente pelos íons Al
3+
e Mn
2+
(Bohnen et al., 2006).
Quando as plantas absorvem um cátion (
+
) ou um ânion (
-
) acabam
liberando na rizosfera, respectivamente, íons H
+
ou OH
-
para a manutenção da
eletroneutralidade. As leguminosas absorvem mais cátions, tornando esse
processo mais intenso em relação às gramíneas. Além disso, as leguminosas
6
não absorvem grandes quantidades de nitrato devido à fixação simbiótica,
resultando em maior liberação de íons H
+
para o solo, contribuindo dessa
maneira para sua acidificação (Bohnen et al., 2006).
Entretanto, a concentração de íons H
+
na solução do solo, mesmo com
um valor elevado de 0,1 mmol/L correspondente ao pH 4,0, não é considerada
um fator limitante ao crescimento normal das plantas, desde que haja
suprimento adequado de todos os nutrientes essenciais e ausência de
elementos em concentrações tóxicas. Esta situação não acontece naturalmente
no solo, pois, em condições ácidas, podem ocorrer íons em concentrações
tóxicas para as plantas, como o Al
3+
e o Mn
2+
. Além do mais, pode ocorrer
menor disponibilidade de alguns nutrientes, por exemplo, o fósforo, bem como
a interferência na atividade dos microrganismos do solo (Tedesco & Bissani,
2004; Sousa et al., 2007).
2.1.2 Toxidez por alumínio
O alumínio é o metal mais abundante e o terceiro elemento mais
comum da crosta terrestre após o oxigênio e o silício (Haug & Foy, 1984).
Destaca-se como o principal fator limitante em solos com pH abaixo de 5,5,
tornando-se mais fitotóxico em pH inferior a 5,0 (Foy et al., 1978). Além disso,
apresenta-se como um dos principais problemas agronômicos relacionados a
limitações abióticas, sendo superado apenas pelo estresse hídrico (von Uexküll
& Mutert, 1995).
O alumínio pode estar presente em diferentes formas no solo. Em
condições ácidas (pH<5,0), o alumínio se hidrolisa em solução, predominando
7
a forma Al(H
2
O)
6
3+
, chamado convencionalmente por Al
3+
. Conforme o aumento
do pH, o Al(H
2
O)
6
3+
sofre sucessivas desprotonações para formar Al(OH)
2+
e
Al(OH)
2
+
. Nos solos com pH próximos da neutralidade, ocorre a forma sólida
Al(OH)
3
, enquanto que em solos alcalinos predomina Al(OH)
4
-
(Kochian, 1995).
O Al
3+
forma complexos de baixo peso molecular quando se une a
ligantes orgânicos e inorgânicos, como por exemplo, PO
4
3-
, SO
4
2-
, F
-
, ácidos
orgânicos, proteínas e lipídios (Delhaize & Ryan; Kochian, 1995). Uma forma
de alumínio polinuclear, Al
13
, também pode se formar quando soluções de
alumínio são parcialmente neutralizadas com uma base forte (Parker &
Bertsch, 1992), entretanto sua ocorrência natural e a contribuição para a
toxidez no solo ainda não estão claros (Delhaize & Ryan; Kochian, 1995).
O alumínio interfere em vários processos fisiológicos e celulares,
podendo ser a toxicidade o resultado de interações complexas do Al
3+
com o
apoplasto (parede celular), membrana plasmática e com alvos simplásticos
(citosol) (Kochian et al., 2005). O alumínio atua no ápice da raiz, mais
precisamente na parte distal da zona de transição, afetando o alongamento e a
divisão celular (Sivaguru & Horst, 1998).
A inibição do crescimento radicular é o sintoma primário de toxidez
por alumínio nas plantas. Ocorrem mudanças morfológicas nas raízes, tais
como crescimento reduzido, intumescimento do ápice, formação de pouca ou
nenhuma ramificação, coloração castanha devido à necrose dos tecidos, além
de tornarem-se quebradiças (Foy et al., 1978; Kochian, 1995). Os danos
podem levar à deficiência mineral e ao estresse hídrico (Degenhardt et al.,
1998).
8
Por outro lado, a redução do crescimento da parte aérea é um
sintoma secundário, onde as plantas apresentam sinais de deficiência de
fósforo (crescimento anormal das folhas; coloração púrpura das folhas, colmos
e nervuras; amarelecimento e morte das folhas da extremidade da planta) ou
de cálcio (enrolamento das folhas jovens e morte das gemas apicais), e
parecem ser uma consequência dos danos que ocorrem no sistema radicular
(Foy et al., 1978).
Os efeitos da toxidez por alumínio são muito variáveis, dependendo
da concentração de Al
3+
, do tempo de exposição e principalmente do nível de
tolerância ou sensibilidade da espécie utilizada (Čiamporová, 2002). Algumas
espécies são capazes de apresentar sintomas detectáveis em poucos minutos
após a exposição ao alumínio, entretanto, outras são apenas visíveis após um
maior período de exposição (Ma et al., 2001).
A redução na quantidade de alumínio tóxico presente na solução do
solo pode ser realizada através da elevação do pH, utilizando práticas de
calagem, pois o Al
3+
é totalmente neutralizado quando o pH do solo é superior
a 5,5 (Bohnen et al., 2006). Entretanto, o uso de corretivos representa um
acréscimo nos custos de produção, podendo ser, em determinadas situações,
economicamente inviável. Ainda assim, o alumínio não ocorre apenas na
camada arável do solo (0 – 30 cm), mas também em maiores profundidades.
Devido a isso, o sistema radicular irá se desenvolver apenas nas camadas
superficiais, o que é prejudicial ao crescimento das plantas, pois estas não
conseguem absorver água e nutrientes nas regiões mais profundas do solo
(Sousa et al., 2007).
9
Uma das alternativas para solucionar este problema seria a
utilização de cultivares tolerantes ao alumínio (Foy et al., 1978), obtidas através
de um estudo do potencial genético das espécies de interesse, selecionando
ou melhorando aquelas plantas que apresentam resistência ao alumínio.
2.1.3 Mecanismos de tolerância ao alumínio
Algumas espécies desenvolveram mecanismos que possibilitam o
desenvolvimento das mesmas em solos ácidos onde concentrações de
alumínio tóxicas podem limitar o crescimento das plantas (Ma et al., 2001).
Os mecanismos de tolerância podem ser divididos naqueles que
atuam no sentido de excluir o Al
3+
depois de absorvido ou de impedir sua
entrada pela raiz (mecanismos de exclusão) e naqueles que permitem a planta
acumular o alumínio em locais específicos, tolerando-o dentro da célula
(mecanismos de tolerância) (Kochian, 1995; Hartwig et al., 2007).
Dentre os mecanismos, o mais comum é o de exclusão. A
detoxicação ocorre principalmente pela exudação de ácidos orgânicos, os
quais são liberados na rizosfera, atuando como quelantes do Al
3+
(Hoekenga et
al., 2003). Os principais ácidos orgânicos secretados pelas raízes são o ácido
cítrico, ácido oxálico e ácido málico, sendo que o ácido cítrico forma complexos
mais estáveis com o alumínio, além de ser o mais comum entre as espécies
estudadas (Barceló & Poschenrieder, 2002).
Existem dois padrões de secreção de ácidos orgânicos em resposta
ao alumínio. No padrão I, a liberação de ácidos orgânicos ocorre logo após a
exposição ao alumínio, enquanto no padrão II a secreção ocorre após várias
10
horas de exposição. A resposta rápida do padrão I sugere que o Al
3+
ative um
mecanismo pré-existente e a indução de novas proteínas não seja necessária.
Por outro lado, o atraso observado no padrão II indica a necessidade de
indução de novas proteínas (Ma et al., 2001).
As cultivares tolerantes de cevada (Hordeum vulgare L.) exudam
citrato em ambos os padrões; as de arroz (Oryza sativa L.) e triticale (Triticale
ssp.) exudam citrato e malato no padrão II; as de trigo (Triticum aestivum L.)
liberam malato e as de trigo mourisco (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.)
oxalato no padrão I (Ma & Furukawa, 2003).
Santos et al. (2008a) observaram um aumento na secreção de ácido
oxálico em genótipos de cornichão, quando submetidos a um tratamento com
alumínio (200 mol/L), indicando ser um mecanismo de tolerância ativado pela
presença do elemento tóxico.
Apesar dos ácidos orgânicos exercerem um papel relevante na
detoxicação do Al
3+
, este não é o único mecanismo de exclusão existente. Um
experimento realizado com um mutante de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
(alr-104) resistente ao alumínio, comprovou que há um aumento no pH da
rizosfera destes indivíduos quando expostos a níveis tóxicos de Al
3+
,
acarretando em uma redução da solubilidade deste elemento (Degenhardt et
al., 1998).
Ainda pode ocorrer a liberação de compostos fenólicos, que atuam
na complexação do alumínio. No experimento realizado por Kidd et al. (2001),
com uma variedade tolerante (Sikuani) de milho (Zea mays L.), observou-se a
exudação dos flavonóides catequina e quercetina após quatro horas de
11
exposição das plântulas a 50 mol de Al
3+
, resultando em uma recuperação do
crescimento radicular.
A secreção de mucilagem também pode atuar como uma barreira de
entrada ao Al
3+
nas células. Entretanto, uma avaliação precisa destas
rizodeposições é complicada, pois a sua produção é fortemente influenciada
pela composição e resistência física do substrato (Barceló & Poschenrieder,
2002).
Os mecanismos de tolerância permitem o acúmulo de alumínio em
altas concentrações, sendo baseados na complexação e detoxicação do
alumínio após sua entrada no citoplasma (Kochian et al., 2005). A eliminação
do elemento tóxico pode estar relacionada à quelação do Al
3+
por ácidos
orgânicos, proteínas ou outros ligantes orgânicos; compartimentação do Al
3+
nos vacúolos; síntese de proteínas tolerantes ao Al
3+
e elevação da atividade
enzimática (Kochian, 1995).
A planta ornamental Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. é capaz
de acumular mais de 3.000 mg de Al
3+
por quilo de matéria seca (MS) em suas
folhas. A cor das suas sépalas pode variar do vermelho ao azul, conforme a
acidificação do solo. A mudança para a cor azul é devida ao acúmulo de Al
3+
nas sépalas, resultando na formação de um complexo de alumínio com dois
componentes, delfinidina-3-glucosídeo e ácido 3-cafeoilquínico (Ma et al.,
1997a).
As variedades tolerantes de trigo mourisco, além de exudarem
oxalato de suas raízes, também conseguem acumular Al
3+
em grande
quantidade (até 15 mg/kg MS) nas suas folhas quando expostas em um meio
12
ácido. O alumínio é armazenado nos vacúolos na forma de um complexo
alumínio-oxalato (Zheng et al., 1998; Ma et al., 2001).
2.1.4 Controle genético
A tolerância ao alumínio é uma característica herdável, que pode ser
controlada por um ou mais genes dominantes ou por diversos genes recessivos
(Kochian, 1995), existindo uma grande variação genética tanto entre quanto
dentro das espécies (Delhaize & Ryan, 1995).
Larsen et al. (1998) demonstraram, através de um estudo em
mutantes de A. thaliana, que a resistência ao Al
3+
é semidominante. Também
identificaram dois loci que conferem resistência a este caráter, o alr-108,
localizado no cromossomo um, atuando na liberação de ácidos orgânicos e, o
alr-104, localizado no cromossomo quatro, atuando na alcalinização da
rizosfera.
Existe uma controvérsia em relação ao número de loci que possam
estar relacionados à tolerância ao Al
3+
no trigo. Alguns trabalhos sugerem que
a resistência é atribuída a um único locus dominante (Alt
BH
) que está localizado
no cromossomo 4D (Delhaize et al., 1993; Riede & Anderson, 1996; Rodriguez-
Milla & Gustafson, 2001), enquanto outros, realizados em linhas ditelossômicas
da variedade Chinese Spring, sugerem estar relacionada a diversos loci (Aniol,
1990; Papernik et al., 2001).
Magalhães et al. (2004) mapearam em sorgo (Sorghum bicolor (L.)
Moench) o maior locus para tolerância ao alumínio, Alt
SB
, na região terminal do
cromossomo três. A cevada apresenta um locus maior para tolerância ao Al
3+
,
13
Alp, localizado no braço longo do cromossomo quatro. Essa espécie é
extremamente sensível e demonstra tolerância apenas em níveis muito baixos
de Al
3+
(Minella & Sorrells, 1992).
No arroz, a herança é oligogênica, determinada por alelos
dominantes, sendo controlada por pelo menos dois loci independentes, Alt1,
localizado no cromossomo 6RS e, Alt3, no cromossomo 4R (Gallego et al.,
1998). A resistência ao Al
3+
em milho é uma característica quantitativa, tendo
sido identificados pelo menos dois loci, Alm1 e Alm2, localizados no braço curto
dos cromossomos 10 e seis, respectivamente. O locus Alm1 mostra um efeito
sobre o fenótipo três vezes mais intenso do que o Alm2 (Sibov et al., 1999).
2.1.5 Métodos de seleção
Várias técnicas estão sendo utilizadas para identificar plantas
capazes de tolerar o Al
3+
, dentre as quais se pode destacar os métodos de
seleção em solo e solução nutritiva.
A seleção em solo consiste na avaliação do crescimento das plantas
em um solo com alta saturação de alumínio, podendo ser realizado a campo ou
em ambiente controlado, onde são escolhidas aquelas que se apresentarem
mais tolerantes (Echart & Cavalli-Molina, 2001).
A seleção realizada a campo permite a seleção de germoplasma em
condições climáticas e de solo naturais, além de possibilitar a visualização do
estresse causado pelo Al
3+
na planta durante um ciclo de crescimento. As
desvantagens do método estão no custo elevado, na vulnerabilidade do
material em relação às condições ambientais, na complexidade das interações
14
planta-ambiente, além de ser necessário um maior período de tempo,
geralmente um ciclo de crescimento completo (Echart & Cavalli-Molina, 2001).
Na seleção realizada com solo em ambiente controlado, os
principais problemas estão na obtenção de solos adequados, pois a toxicidade
do alumínio não é o único fator limitante e, na observação das raízes, já que o
efeito primário do alumínio é a inibição do crescimento. Devido às dificuldades
mencionadas acima, trabalhos realizados utilizando estas metodologias estão
diminuindo consideravelmente (Samac & Tesfaye, 2003).
Um método capaz de avaliar e selecionar plântulas de espécies que
possuam sementes pequenas, em relação à acidez do solo, foi desenvolvido
por Voigt et al. (1997), com trevo branco, utilizando uma fina camada de solo
ácido sobre ágar, durante um período aproximado de 10 dias. Nesse sistema, a
avaliação da tolerância é dada pela rapidez com que as raízes atravessam a
camada de solo e penetram no ágar. Essa técnica foi testada com sucesso em
28 cultivares pertencentes a 15 espécies de forrageiras leguminosas, dentre
elas Lotus corniculatus L., Trifolium repens L., Trifolium pratense L. e Trifolium
subterraneum L., visando à avaliação dos materiais quanto à tolerância ao Al
3+
(Voigt & Mosjidis, 2002).
O método de seleção em solução nutritiva vem sendo muito utilizado
para selecionar, bem como, testar diversas espécies em relação ao caráter
tolerância ao Al
3+
, dentre as quais estão a alfafa (Medicago sativa L.) (Caetano,
1998; Martins et al., 2007; Rocha et al., 2007a), a braquiária (Brachiaria
decumbens Stapf.) (Wenzl et al., 2006), o cornichão (L. corniculatus) (Santos et
al., 2007), a cevada (Ma et al., 1997b; Echart et al., 2002), o milho (Martins et
15
al., 1999; Paterniani & Furlani, 2002), a soja (Glycine max (L.) Merrill.)
(Menosso et al., 2000; Souza, 2001), o trigo (Camargo & Oliveira, 1981; Mistro
et al., 2001), entre outras.
Nessa metodologia as plântulas são mantidas, geralmente, em uma
solução ácida contendo Al
3+
, sendo o crescimento radicular medido após
alguns dias. A tolerância é avaliada pela comparação do crescimento radicular
das plântulas que foram tratadas com Al
3+
em relação aquelas que não
receberam o elemento tóxico (controle). A principal vantagem está na rapidez
do método e na manutenção da integridade das raízes, além de permitir o
controle rigoroso sobre a disponibilidade dos nutrientes e do pH e apresentar
custo baixo. Por outro lado, não se recomenda o método em plantas que
exprimam a tolerância ao alumínio apenas na fase adulta ou naquelas que
apresentam propagação vegetativa (Samac & Tesfaye, 2003).
Menosso et al. (2000) realizaram ensaios com diferentes níveis de
Al
3+
e Ca, em solução nutritiva, com o objetivo de identificar a melhor
concentração destes elementos, bem como o tempo necessário para a
diferenciação de plântulas de soja em relação à tolerância ao Al
3+
. Os níveis
estabelecidos foram de 0,2 mg/L de alumínio e 50 mg/L de cálcio. A avaliação
das raízes nove dias após o transplante das plântulas para a solução nutritiva
permitiu a separação de genótipos tolerantes e sensíveis.
A tolerância ao Al
3+
de 38 genótipos de trigo provenientes do Centro
Internacional de Melhoramento de Trigo e Milho (CIMMYT), no México e de um
programa de melhoramento do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), foi
avaliada em solução nutritiva, com seis concentrações de alumínio (0, 2, 4, 6, 8
16
10 mg/L). A tolerância foi medida pela capacidade de crescimento das raízes
primárias após serem mantidas por um período de 48 horas na solução
contendo alumínio. Os genótipos provenientes do CIMMYT demonstraram
maior sensibilidade, ocorrendo uma paralisação do crescimento radicular, em
grande parte dos materiais, nas baixas concentrações de Al
3+
(2 e 4 mg/L). Por
outro lado, os genótipos do IAC demonstraram maior tolerância, com
crescimento radicular satisfatório até mesmo na dose mais elevada de Al
3+
(Mistro et al., 2001).
Wenzl et al. (2006) analisaram a resistência ao Al
3+
de 41 genótipos
de braquiária. A avaliação foi feita através da comparação do comprimento e
do diâmetro das radículas submetidas a duas soluções nutritivas. Uma
contendo 200 mol/L de CaCl
2
e, a outra, 200 mol/L de CaCl
2
e 200 mol/L de
AlCl
3
, ambas com pH 4,2. Os materiais sensíveis foram caracterizados por uma
redução no comprimento radicular e por um aumento no diâmetro das
radículas. Por outro lado, os genótipos tolerantes apresentaram maior
comprimento e menor diâmetro das radículas.
Utilizando três métodos, Caetano (1998) selecionou genótipos de
alfafa tolerantes ao Al
3+
, em solução nutritiva, solo e solo seguido de solução
(cruzada). As plântulas foram mantidas por 12 dias na solução contendo 0,62
mmol/L de cálcio, 3,7 mol/L de alumínio e pH controlado a 4,5. O solo utilizado
foi do tipo argiloso, onde se adotou o nível de saturação de alumínio de 2,5%,
sendo os materiais mantidos por um período de seis semanas. Na seleção
cruzada utilizaram-se plantas previamente selecionadas em solo e
posteriormente em solução. Todos os métodos mostraram-se eficientes.
17
Posteriormente, Santos et al. (2008b) avaliaram o crescimento
radicular dos genótipos selecionados por Caetano (1998) em solução nutritiva
com 200 µmol/L de cálcio e cinco níveis de alumínio (0, 6, 12, 24 e 48 µmol/L),
por um período de 15 dias. Utilizou-se a alfafa crioula como testemunha e pH
ajustado para 4,2. Em todas as concentrações de alumínio, foi observado um
aumento de 20 e 40% no comprimento radicular das populações cruzada e,
solo e solução, respectivamente, em relação à testemunha. Os resultados
indicaram a possibilidade de distinguir genótipos de alfafa, com diferentes
graus de tolerância ao alumínio, em curto prazo, utilizando solução nutritiva.
Além disso, comprovou-se que o progresso obtido na população selecionada
em solução nutritiva foi tão eficiente quanto à realizada em solo.
Santos et al. (2007) determinaram a concentração de alumínio capaz
de discriminar, em solução nutritiva, genótipos de L. corniculatus em relação a
sensibilidade ao alumínio. Avaliaram-se dois materiais contrastantes (Draco e
UFRGS) em relação à resposta ao Al
3+
, em solução com 200 µmol/L de Ca,
quatro níveis de alumínio (0, 50, 100 e 200 µmol/L) e pH controlado a 4,2. As
plântulas foram mantidas nas soluções por um período de 13 dias. A avaliação
do comprimento radicular demonstrou que a dose 100 µmol/L de alumínio foi
eficiente na discriminação de genótipos tolerantes e sensíveis ao Al
3+
.
2.1.6 Fixação simbiótica
As plantas da família Leguminosae possuem a capacidade de fixar
nitrogênio atmosférico através de associações endosimbióticas com bactérias
pertencentes, principalmente, aos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium. A
18
interação entre estes organismos é altamente específica, podendo ocorrer em
nível de espécie ou até mesmo de cultivares (Freire, 1992). Uma pesquisa
realizada no Uruguai identificou dois rizóbios altamente específicos para o
cornichão, Rhizobium loti e Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, além da
existência de variabilidade entre os isolados (Baraibar et al., 1999).
A eficácia desta relação pode ser afetada em solos ácidos, pois o
Al
3+
se liga as células do rizóbio interferindo na síntese de DNA dessas
bactérias, levando a uma redução na colonização do solo (Johnson & Wood,
1990). O número de rizóbios em solos corrigidos chega a 10
5
unidades
formadoras de colônia (UFC)/g, enquanto que em solos ácidos esse valor não
ultrapassa 10
2
UFC/g (Brockwell et al., 1991). Alguns trabalhos revelam que o
alumínio em altas concentrações e o baixo pH afetam com maior severidade a
formação dos nódulos e a fixação simbiótica de nitrogênio, quando comparado
ao crescimento radicular das plantas hospedeiras (Jo et al., 1980).
Watkin et al. (2000) analisaram a tolerância a solos ácidos de seis
estirpes de Rhizobium leguminosarum bv. trifolli em trevo subterrâneo (T.
subterraneum). Uma delas foi identificada como tolerante, apresentando maior
capacidade de colonização e persistência, além de fixar uma maior quantidade
de nitrogênio nas plantas em relação às demais estirpes estudadas. Brose
(1992) relatou resultados semelhantes em cornichão quando avaliou estirpes
de Rhizobium loti em relação à acidez do solo. As estirpes tolerantes ao Al
3+
mostraram-se tão produtivas e eficientes na fixação de nitrogênio quanto às
recomendadas para a espécie, sendo que as menos tolerantes apresentaram
menor eficiência simbiótica.
19
Entretanto, nem sempre as estirpes que apresentam maior
tolerância ao Al
3+
são as mais produtivas, indicando a dificuldade de selecionar
rizóbios tolerantes e ao mesmo tempo eficientes. Papa et al. (1999)
classificaram uma coleção de rizóbios de alfafa, coletados em solos
moderadamente ácidos da Argentina e do Uruguai, de acordo com a tolerância
a acidez. O grupo formado por Sinorhizobium meliloti demonstrou crescimento
restrito em solos com baixo pH, e o outro, constituído por um rizóbio
semelhante geneticamente ao Rhizobium sp. Or191, capaz de se desenvolver
em solos ácidos, manifestou maior tolerância ao Al
3+
. Porém, os rizóbios com
menor sensibilidade ao Al
3+
mostraram-se ineficientes na fixação de nitrogênio.
Devido à importância da associação benéfica entre as bactérias
fixadoras de nitrogênio e as leguminosas, bem como a existência de diferenças
entre as estirpes em relação à resposta ao Al
3+
, programas de melhoramento
de leguminosas tolerantes a solos ácidos devem estar associados a programas
de seleção de rizóbios tolerantes ao Al
3+
.
2.2 Microssatélites
O avanço da genética e da biologia molecular permitiu o
desenvolvimento de marcadores genéticos valiosos na identificação,
caracterização e avaliação do germoplasma vegetal. O princípio da utilização
destes marcadores é baseado na pressuposição de que diferenças genéticas
significam, geralmente, diferenças fenotípicas (Faleiro, 2007). Entende-se por
marcadores moleculares aquelas características herdáveis do DNA capazes de
diferenciar dois ou mais indivíduos geneticamente (Millach, 1999). Entre as
20
vantagens dos marcadores moleculares pode-se destacar a identificação direta
do genótipo sem influência ambiental, a detecção de polimorfismos em
qualquer estádio de desenvolvimento da planta, além da obtenção de um
número elevado de polimorfismos genéticos (Faleiro, 2007).
Os principais marcadores moleculares podem ser classificados de
acordo com a metodologia utilizada para identificá-los. O método da
hibridização utiliza enzimas de restrição que fragmentam o DNA, os quais são
hibridizados com sequências homólogas de DNA. Entre os marcadores
identificados por esta técnica estão o RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) e os Minissatélites ou loci VNTR (Variable Number of Tandem
Repeats). No outro método, PCR (Polymerase Chain Reaction), que consiste
na amplificação de fragmentos de DNA, estão incluídos os marcadores do tipo
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism), SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) e
os Microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats) (Ferreria & Grattapagia,
1998; Millach, 1999).
A escolha do marcador a ser utilizado deve ser baseada no objetivo
do trabalho. Na maioria das vezes, marcadores moleculares multilocos
utilizados em DNA fingerprinting, como por exemplo, RAPD, AFLP e
Microssatélites, são mais apropriados para estudos de identidade genética,
testes de paternidade e estudos de variabilidade dentro da mesma espécie.
Marcadores baseados em comprimentos de fragmentos de restrição como os
RFLPs obtidos de DNA mitocondrial (mtDNA), DNA cloroplasmático (cpDNA) e
DNA ribossomal (rDNA) são mais apropriados para estudos de diversidade
21
genética de espécies fortemente relacionadas. Por outro lado, marcadores
baseados em análises de sequências, por exemplo, o PCR sequencig, são
apropriados para análises de espécies com alto nível de divergência
evolucionária, embora possam ser utilizados para análises de espécies ou
acessos com qualquer nível de divergência (Faleiro, 2007).
Os microssatélites são pequenas sequências de um a seis
nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem ao longo da molécula de
DNA, estando presente no genoma de eucariotos e procariotos (Tóth et al.,
2000). Essas sequências estão sujeitas a elevadas taxas de mutação, sendo
manifestadas principalmente através de alterações no número de repetições
das sequências motivo dos SSR. As mutações ocorrem principalmente devido
ao escorregamento da fita de DNA durante a replicação (slippage) e na
recombinação (crossing-over) (Li et al., 2002).
A distribuição genômica dos SSR não é aleatória, sendo encontrada
em maior quantidade nas regiões não codificantes do DNA e em menor
quantidade nas regiões codificantes. Essa diferença é atribuída à seleção
negativa contra mutações estruturais nas regiões codificantes (Metzgar et al.,
2000). Apesar disso, 14% de todas as proteínas contêm sequências repetidas.
Dessa maneira, a seleção pode estar atuando contra a contração ou expansão
aleatória de pelo menos parte dos loci de SSR, visto que esses atuam na
organização da cromatina, regulação da atividade gênica, recombinação,
replicação do DNA, ciclo celular, sistema de reparo, entre outros (Li et al.,
2002).
Nos vegetais ocorre em maior frequência uma sequência motivo de
22
SSR perfeita, ou seja, aquela onde nenhuma interrupção é observada entre as
sequências repetidas e, o elemento repetido que aparece com maior
assiduidade é o di-nucleotídeo AT (Morgante & Olivieri, 1993).
Os SSR possuem expressão co-dominante, são somaticamente
estáveis, multialélicos e altamente reprodutíveis. A elevada variabilidade entre
os organismos relacionados faz com que estes marcadores sejam altamente
informativos, possuindo o mais elevado conteúdo de informação de
polimorfismo (PIC, Polymorphism Information Content) e sejam ideais para
serem utilizados no mapeamento genético e físico de genomas, identificação e
discriminação de genótipos, testes de paternidade e seleção assistida por
marcadores (Faleiro, 2007).
Por outro lado, a limitação desta técnica está na necessidade da
utilização de sequências de nucleotídeos que flanqueiam os SSR (primer),
específicas para cada espécie. O desenvolvimento dos primers é muito
laborioso, pois requer a construção de bibliotecas genômicas, seleção e
seqüenciamento dos clones positivos e o desenho dos primers (Ferreira &
Grattapaglia, 1998; Faleiro, 2007). Entretanto, primers de espécies
geneticamente relacionadas também são capazes de fornecer bons
marcadores em algumas situações. Wang et al. (2006) utilizaram com sucesso
primers desenvolvidos para trigo, milho e sorgo em Paspalum vaginatum
Swartz, obtendo uma taxa de transferência média de SSR de 61% entre as
espécies.
A capacidade do emprego de microssatélites em estudos de
diversidade genética pode ser confirmada em diversos trabalhos. Sawasato et
23
al. (2008) utilizando sete pares de primers heterólogos, discriminaram 64
acessos de Paspalum urvillei Steudel, os quais foram agrupados em sete
grupos, de acordo com a região da coleta do material. Dias et al. (2008)
observaram a existência de uma elevada diversidade genética entre 56
acessos da coleção básica de trevo vermelho (T. pratense) do Departamento
de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), utilizando sete marcadores de
SSR. Sardaro et al. (2008) avaliaram a diversidade genética presente em 11
populações italianas de cornichão com SSR e AFLP. Ambos marcadores
apresentaram medidas similares de variabilidade entre os indivíduos,
entretanto, os SSR permitiram uma melhor diferenciação genética entre as
populações.
A construção de mapas de ligação é muito importante, pois fornece
informações a respeito da organização do genoma, podendo ser utilizado em
estudos genéticos e programas de melhoramento. Röder et al. (1998) e Barret
et al. (2004) construíram mapas de ligação para trigo e trevo branco
(T. repens), respectivamente, baseados exclusivamente em SSR. Outra
aplicação importante dos SSR é na identificação de marcadores que estejam
ligados a genes que confiram características importantes em programas de
melhoramento. Genes que conferem tolerância ao alumínio já foram
identificados em trigo e sorgo. Sasaki et al. (2004) identificaram no trigo o gene
ALTM1 que atua na exudação de malato e, Magalhães et al. (2007)
descobriram o gene SbMATE, que libera ácido cítrico quando as plantas estão
em contato com Al
3+
.
Ma et al. (2005) identificaram dois marcadores SSR (Xwmc331 e
24
Xgdm125) flanqueados a um dos principais QTLs responsáveis pela tolerância
ao alumínio, no cromossomo 4DL, da cultivar tolerante de trigo Atlas 66. Em
um estudo realizado com cevada, foram identificados quatro marcadores SSR
(Bmac310, Bmag353, HVM68 e HVMCABG) fortemente ligados ao gene Alt
responsável pela tolerância ao alumínio nesta espécie. O marcador Bmag353
detectou grande variação alélica permitindo sua implementação em programas
de seleção assistida por marcadores (Raman et al., 2002).
A utilização de SSR como uma ferramenta auxiliar em programas
tradicionais de melhoramento apresenta grande relevância, pois conforme o
mencionado, a técnica permite diferenciar indivíduos muito próximos, além de
atuar na identificação de genes associados a características importantes.
Dessa maneira, a escolha de progenitores pode ser realizada através de
características fenotípicas e genotípicas.
2.3 Lotus corniculatus, uma boa espécie forrageira
2.3.1 Origem e biologia
O gênero Lotus compreende aproximadamente 125 - 180 espécies,
perenes e anuais, exibe uma grande diversidade de formas e adapta-se a
vários ambientes. O L. corniculatus se destaca como uma das principais
espécies agronômicas deste gênero, devido principalmente ao seu elevado
valor forrageiro (Sokoloff & Lock, 2005).
O cornichão é uma leguminosa perene, hibernal, de origem européia
e mediterrânea, amplamente distribuída no mundo, ausente apenas em regiões
muito frias, tendo sido naturalizado nas regiões temperadas da América do Sul
25
e do Norte, Austrália e Nova Zelândia. A capacidade de adaptação a vários
ambientes deve-se à alta variabilidade genética encontrada nessa espécie,
tendo como maior centro de diversidade a região do Mediterrâneo (Steiner,
1999).
No Brasil, o único cultivar (cv) comercialmente disponível é o São
Gabriel. O material foi desenvolvido pela Estação Experimental Agronômica da
Secretaria de Agricultura de São Gabriel, RS, a partir de pesquisas realizadas
entre os anos de 1955 e 1965. O cultivar é caracterizado pela boa
produtividade e elevada qualidade de forragem, tendo sido difundido em outros
estados e também em países vizinhos, como o Uruguai e a Argentina (Paim,
1988).
O cornichão é uma espécie tetraplóide (2n=4X=24), embora tenha
sido descoberta uma forma diplóide (2n=2x=12) rizomatosa no Marrocos,
semelhante à forma rizomatosa tetraplóide. O achado sugere a possibilidade
da existência de diplóides ou até mesmo que estes sejam os progenitores
diretos do tetraplóide (Steiner, 1999).
Ainda não existe um consenso em relação à origem do cornichão.
Os primeiros trabalhos sugeriam que o mesmo tivesse surgido como um
autotetraplóide de espécies diplóides relacionadas - Lotus glaber Mill. (2n=12)
ou Lotus alpinus (DC.) Ramond (2n=12) (Steiner, 1999). Um estudo posterior
avaliou características fisiológicas e bioquímicas, e sugeriu que L. corniculatus
fosse um alotetraplóide segmentar, originado a partir da hibridização de L.
glaber ou L. alpinus como parentais maternos e Lotus uliginosus Schk. (2n=12)
como parental paterno, seguido por uma duplicação cromossômica do híbrido
26
(Ross & Jones, 1985). Por outro lado, um estudo realizado com o marcador
RFLP indicou um modelo de herança tetrassômica, suportando a hipótese de
L. corniculatus ser uma espécie autotetraplóide (Fjellstrom et al., 2001).
Steiner & Garcia de Los Santos (2001) caracterizaram
morfologicamente 28 genótipos de L. corniculatus coletados no Velho Mundo.
Foram observadas variações entre os caracteres, principalmente em relação à
inflorescência, hábito de crescimento, formato e tamanho da folha. As
diferenças visualizadas foram correlacionadas com o local de origem do
material, como por exemplo, as plantas decumbentes sendo provenientes de
locais de elevada altitude e, as prostradas, de menores altitudes.
Soster et al. (2004) também encontraram variação fenotípica no
cornichão quando avaliaram oito populações do cv São Gabriel. As maiores
diferenças foram em relação ao hábito de crescimento (ereto, ascendente e
decumbente) e ao diâmetro da coroa. Acredita-se que os diferentes fenótipos
existentes no cornichão sejam o resultado da adaptação aos diversos
ambientes no qual é encontrado e, também, devido às contínuas hibridizações
interespecíficas (Steiner, 1999).
De uma forma geral, L. corniculatus apresenta-se como uma planta
herbácea, glabra ou pouco pilosa, com hábito de crescimento variável de
decumbente a ereto. A raiz é pivotante com ramificações laterais, sendo que
alguns genótipos possuem rizoma. As hastes principais se desenvolvem a
partir de gemas situadas na coroa da planta; as ramificações secundárias e
terciárias surgem das axilas das folhas, formando multirramificações. As folhas
são trifolioladas e possuem um par de estípulas grandes. A inflorescência é do
27
tipo umbela, geralmente com quatro a seis flores amarelas, apresentando
polinização cruzada. Os estames são diadelfos, com filetes engrossados no
ápice; ovário reto, estilete longo e estigma capitado. O fruto é um legume,
linear e elasticamente deiscente (Izaguirre & Beyhaut, 1998; Kirkbride Junior,
1999).
O cornichão é classificado como uma planta de dia longo,
necessitando de pelo menos 16 horas de luz por dia para obtenção de um
florescimento abundante. Com um menor fotoperíodo, as plantas produzem
poucas inflorescências e mais flores estéreis, quando comparado as plantas
que crescem sob um fotoperíodo longo (Jones & Turkington, 1986).
2.3.2 Características agronômicas
O cornichão destaca-se pela capacidade de se manter em solos
relativamente ácidos e pouco férteis, onde outras leguminosas de importante
valor agronômico geralmente não se estabelecem ou apresentam pouca
persistência. A forragem possui ainda boa qualidade e alta palatabilidade, além
de poder ser utilizada diretamente como pastagem ou feno (Blumenthal &
McGraw, 1999).
Os valores de proteína bruta (PB) do cornichão são consideráveis.
Scheffer-Basso et al. (2001) encontraram valores de PB nas folhas que
variaram de 22% no estádio de florescimento pleno a 30% no estádio
vegetativo. No caule, os valores variaram de 8 a 14% de PB nos estádios de
florescimento pleno e vegetativo, respectivamente.
A digestibilidade in vitro da matéria orgânica (DIVMO) no cornichão é
28
elevada, estando associada aos baixos níveis de lignina. No trabalho realizado
por Scheffer-Basso et al. (2001), o valor de DIVMO foi de 75% nas folhas e, no
caule, houve uma variação de 50 a 61% nos estádios de florescimento pleno e
vegetativo, respectivamente.
Outros fatores que determinam a qualidade de uma forragem são os
teores de fibra em detergente ácido (FDA) e fibra em detergente neutro (FDN),
onde os mesmos não devem ultrapassar a 30 e 60%, respectivamente
(Paterson et al., 1994). Soster et al. (2004) encontraram valores de FDA em
média de 24% e de FDN de 57%.
A espécie apresenta baixa concentração de taninos condensados
(30 g/kg MS), os quais são benéficos na dieta dos ruminantes quando
encontrados em quantidades que variam de 20 a 40 g/kg MS. Nessas
concentrações, os taninos condensados atuam na prevenção do timpanismo,
reduzem a degradação da proteína no rúmen e aumentam a absorção de
aminoácidos essenciais da dieta (Waghorn & Shelton, 1997; Barry & McNabb,
1999).
O manejo, em relação à altura e a frequência dos cortes, influencia a
produção de MS das plantas (Araújo & Jacques, 1974). Flaresso & Saibro
(1992) observaram maiores rendimentos de MS de L. corniculatus em cortes
menos frequentes, com intervalos de seis e nove semanas, realizados a 5 cm.
Os cortes realizados em intervalos de nove semanas a uma altura de 5 cm,
também permitiram uma maior ressemeadura natural.
Araújo e Jacques (1974) avaliaram a produção de MS do cv São
Gabriel em relação à altura de corte (3 e 6 cm) e ao estádio fenológico
29
(vegetativo, pré-florescimento e florescimento). A produção de MS do cornichão
foi favorecida nos cortes realizados em estádios avançados de crescimento
(pré-florescimento e florescimento) a uma altura de 6 cm. O corte mais alto
preservou em maior quantidade as gemas e hastes axilares e as hastes da
coroa, acarretando em um aumento do vigor na rebrota e na produção de MS.
Bosworth et al. (2003) recomendam que no ano de estabelecimento
da pastagem, o primeiro corte deve ser realizado no estádio de florescimento
pleno. Nos estandes já estabelecidos, o primeiro corte deve ser feito no início
do florescimento, com um intervalo entre os cortes de seis semanas. Rocha et
al. (2007b) relataram a produção de 6.627 kg/ha MS do cv São Gabriel, com o
primeiro corte realizado no estádio de florescimento pleno, na Depressão
Central do RS.
O cornichão pode ser utilizado em misturas com outras espécies
hibernais, como por exemplo, o azevém (Lolium multiflorum Lam) e o trevo
branco (Paim, 1988). Da mesma maneira, a planta também pode ser
empregada no melhoramento do campo nativo, aumentando o rendimento de
MS e permitindo uma melhor distribuição da forragem ao longo do ano,
diminuindo o efeito negativo da sazonalidade da pastagem natural (Prestes,
1995).
Scheffer-Basso et al. (2002) obtiveram 13.663 kg/ha MS de uma
mistura de cornichão, festuca (Festuca arundinaceae Schreb.) e azevém, no
Planalto Médio do RS, em 475 dias de experimento. O cornichão contribuiu
com 80% da mistura na primavera-verão, com 3.500 kg/ha MS. A mistura
destacou-se também por apresentar baixa incidência de espécies invasoras no
30
verão e no outono do segundo ano. Isso demonstra que o crescimento do
cornichão é favorecido durante a estação primaveril, tornando-se efetivo na
competição com as espécies indesejadas.
2.3.3 Melhoramento
Existe uma grande variabilidade genética entre as espécies do
gênero Lotus que poderia ser utilizada em programas de melhoramento,
visando à obtenção de cultivares modernas e com maior potencial produtivo
(Steiner, 1999).
Garcia de Los Santos et al. (2001) estudaram a habilidade de
cruzamento entre diferentes fontes de germoplasma de cornichão, indicando a
possibilidade de transferência de características desejáveis através de técnicas
convencionais de melhoramento. Esse resultado sugere a possibilidade de
sucesso naqueles programas que não possuem muitos recursos.
Um dos principais problemas relacionados à produção do cornichão
é a falta de persistência dos materiais, sendo acentuada nas regiões com clima
quente no verão. Geralmente, a limitada persistência é atribuída à interação de
fatores bióticos e abióticos, incluindo estresses edáficos e climáticos, pragas e
doenças e práticas de manejo inadequadas (Blumenthal & McGraw, 1999).
Beuselinck et al. (1984) relataram uma redução de 90% na densidade das
plantas, durante um período de dois anos, devido a doenças na coroa e nas
raízes, causadas por fungos dos gêneros Colletotrichum, Fusarium e
Rhizoctonia em um experimento no Missouri (EUA).
A seleção para resistência a doenças tem sido um dos objetivos nos
31
programas de melhoramento, visando o aumento da persistência nesta
espécie. Entretanto, a condução destas pesquisas é difícil e laboriosa, pois as
doenças afetam a sobrevivência das plantas, inclusive das plântulas. O
Colletotrichum acutatum, por exemplo, infecta as estruturas reprodutivas,
reduzindo o florescimento e a produção de sementes (English, 1999).
Altier et al. (2000) selecionaram genótipos de L. corniculatus
resistentes à podridão da raiz, causada por Fusarium oxysporum, através de
seleção recorrente. Em adição a tolerância, houve também um aumento no
tamanho da coroa e na quantidade de raízes laterais.
A descoberta de acessos rizomatosos de cornichão no Marrocos
permitiu a transferência desta característica para cultivares adaptados,
representando outra maneira de aumentar a persistência nesta espécie. Os
híbridos F1, derivados destes cruzamentos apresentaram-se férteis e
vigorosos. A seleção resultou no lançamento da primeira cultivar rizomatosa,
ARS-2620 (Beuselinck & Steiner, 1996).
Outro fator importante, a ser considerado em programas de
melhoramento, é a tolerância ao pastejo. Perez (2003) avaliou e selecionou
genótipos de cornichão a campo e em casa de vegetação, resultando na
obtenção de uma população com boa produção de forragem e tolerância ao
pastejo. Além disso, identificou um marcador morfológico (altura do primeiro
nó) nas plântulas, capaz de separar precocemente os genótipos contrastantes
quanto à aptidão ao pastejo.
Trabalhos relacionados ao melhoramento de cornichão para solos
ácidos são escassos, entretanto, a tolerância natural inerente a espécie deve
32
ser explorada, visto que outras forrageiras leguminosas de importante valor
forrageiro não são capazes de se adaptar a essas condições.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção em solução nutritiva
O experimento foi conduzido em casa de vegetação, no
Departamento de Plantas Forrageiras e Agrometeorologia (DPFA) da
Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(UFRGS), localizada no município de Porto Alegre - RS, no período de 11 de
junho de 2007 a 19 de dezembro de 2008.
A metodologia utilizada, assim como os detalhes e a escolha das
concentrações de cálcio e alumínio, para a seleção das plantas em solução
nutritiva, descritas a seguir, foram baseadas em um experimento realizado com
L. corniculatus por Santos et al. (2007).
Três genótipos de L. corniculatus foram utilizados como populações
originais: INIA Draco (DR), material uruguaio, selecionado para persistência em
condições de campo; São Gabriel (SG), material brasileiro, selecionado para
produção de forragem; e, UFRGS (UF), material selecionado pelo DPFA da
Faculdade de Agronomia da UFRGS para persistência ao pastejo.
Foram utilizadas cerca de 0,60 g de sementes de cada genótipo,
tendo sido previamente tratadas com hipoclorito de sódio a 1% e escarificadas
manualmente com lixa nº 100. As sementes foram semeadas em caixas
plásticas sobre papel filtro, onde foram umedecidas desde o primeiro dia da
34
semeadura com uma solução de 200 mol/L
de cálcio (CaCl
2
.2H
2
O) e 100
mol/L de alumínio (AlCl
3
), permanecendo em temperatura ambiente durante
todo esse período.
Após sete dias, quando as radículas dos três genótipos atingiram
cerca de 10 mm de comprimento, as plântulas que apresentaram uniformidade
e normalidade das radículas foram transplantadas para telas plásticas com
malha de 1,5 mm de diâmetro coladas sob lâminas de isopor, com um cm de
espessura, visando à sustentação das plântulas sobre a solução nutritiva.
Foram utilizadas quatro bandejas, cada uma contendo os três
genótipos de L. corniculatus a serem selecionados. Em cada bandeja foram
transplantadas cerca de 100 plântulas de cada genótipo, constituindo um total
de 300 plântulas por bandeja. As bandejas plásticas apresentavam capacidade
nominal de oito litros e dimensões 25 x 40 x 8 cm (Figura 1).
FIGURA 1. Seleção de genótipos de Lotus corniculatus L. tolerantes ao
alumínio, em solução nutritiva contendo 200 mol/L
de cálcio
(CaCl
2
.2H
2
O) e 100 mol/L
de alumínio (AlCl
3
). UFRGS, Porto
Alegre, RS, 2007 -2008.
A solução nutritiva era composta por 200 mol/L
de cálcio
(CaCl
2
.2H
2
O) e 100 mol/L
de alumínio (AlCl
3
). O pH da solução foi ajustado
35
para uma faixa de 4,1 – 4,3 com ácido clorídrico (HCl), sendo verificado
diariamente e ajustado quando necessário. A troca total da solução ocorria a
cada três dias, tendo por objetivo evitar o acúmulo de exsudados e a alteração
das concentrações de cálcio e alumínio. Cada bandeja possuía um volume final
de solução de cinco litros que foi aerada constantemente com compressores
para aquário.
Após as plântulas serem mantidas por 14 dias em solução foi
realizada a seleção das populações originais, levando-se em consideração o
maior comprimento radicular, sendo imposta uma pressão de seleção de 10%.
Portanto, foram selecionadas cerca de 40 plântulas por genótipo, que foram
transplantadas para vasos com substrato comercial, composto por farinha de
ossos, cal, esterco de galinha, casca de pinus e arroz carbonizado. As plantas
foram conduzidas até a polinização, sendo cada genótipo cruzado
manualmente, por um período aproximado de 60 dias (Figura 2 A-D).
Durante todo o período experimental, a casa de vegetação recebeu
iluminação artificial com o objetivo de estimular e manter o florescimento das
plantas. O sistema de iluminação foi realizado com lâmpadas halógenas
brancas de 150 W de potência, que permaneciam ligadas das 6 às 22 horas.
Os legumes produzidos de cada genótipo foram colhidos e
acondicionados em sacos de papel, os quais foram levados à estufa de
ventilação forçada, com temperatura entre 28 e 30ºC, por um período de 96
horas. Após a secagem, os legumes foram trilhados e as sementes foram
submetidas a um processo de limpeza em peneiras manuais e passadas por
soprador visando à eliminação de sementes chochas. A produção de sementes
36
foi determinada, e as mesmas separadas por genótipo e acondicionadas em
sacos de papel, sendo mantidas em refrigerador (4ºC) até a sua utilização.
FIGURA 2. Polinização de Lotus corniculatus L. (A) inflorescência; (B) retirada
da quilha; (C) polinização; (D) formação das vagens. UFRGS,
Porto Alegre, RS, 2007-2008.
As sementes obtidas através dos cruzamentos realizados nas
populações originais constituíram as populações Draco F1 (DR-F1), São
Gabriel F1 (SG-F1) e UFRGS F1 (UF-F1), as quais passaram pelo segundo
ciclo de seleção, através da mesma metodologia utilizada anteriormente,
visando aumentar a tolerância ao alumínio. As sementes obtidas do novo ciclo
formaram as populações Draco F2 (DR-F2), São Gabriel F2 (SG-F2) e UFRGS
F2 (UF-F2).
Eventualmente, as plantas mantidas nos vasos receberam
tratamento contra fungos e insetos, com Difenoconazol (25% m/v) e
Deltametrina (25% m/v), respectivamente.
A
B
C
D
A
B
C
D
37
3.1.1 Avaliação da tolerância ao alumínio
Após a coleta das sementes das populações F2, as populações
selecionadas (F1 e F2) foram testadas em relação ao progresso alcançado,
tendo as mesmas sido comparadas com as populações originais em diferentes
concentrações de alumínio.
O ensaio foi realizado no período de 29 de dezembro de 2008 a 19
de janeiro de 2009, em casa de vegetação, no DPFA da faculdade de
agronomia da UFRGS, localizada no município de porto alegre - RS.
Utilizaram-se cerca de 0,10 g de sementes de cada genótipo de L.
corniculatus (DR, SG, UF; DR-F1, SG-F1, UF-F1; DR-F2, SG-F2 e UF-F2) além
de 0,20 g de sementes de alfafa crioula, utilizada como testemunha por ser
considerada uma espécie sensível ao alumínio. As sementes foram tratadas
com hipoclorito de sódio a 1%, escarificadas manualmente com lixa nº 100 e
semeadas em caixas plásticas sobre papel filtro, onde foram umedecidas com
água bidestilada até o transplante para as bandejas.
Sete dias após a semeadura, as plântulas foram transplantadas para
telas plásticas com malha de 1,5 mm de diâmetro colocadas sob lâminas de
isopor de um cm de espessura. Foram preparadas quatro soluções nutritivas,
novamente baseadas em Santos et al. (2007), contendo 200 mol/L
de cálcio
(CaCl
2
.2H
2
O) e quatro concentrações de alumínio: 0, 50, 100 e 150 mol/L
de
alumínio (AlCl
3
), sendo o nível zero considerado como controle. A solução foi
aerada constantemente com compressores para aquário e o pH foi ajustado
diariamente para uma faixa de 4,1 – 4,3 com HCl.
Ao todo, utilizaram-se oito bandejas plásticas contendo cinco litros
38
de solução, sendo utilizadas duas para cada nível de alumínio e seis plântulas
de cada genótipo por bandeja, totalizando 12 plântulas de cada genótipo por
tratamento. As plântulas foram conduzidas nas bandejas por um período de 14
dias, sendo que a solução nutritiva era trocada a cada três dias e o pH era
verificado diariamente e ajustado quando necessário.
Avaliou-se o comprimento radicular inicial (CI, sete dias após a
germinação) e final (CF, 14 dias após o transplante das plântulas para as
bandejas) e o crescimento radicular (CR, comprimento final – comprimento
inicial).
Os dados foram submetidos à análise estatística com o auxílio do
software SAS, versão 8.0, pelo procedimento “Factorial ANOVA”, constituindo-
se em uma análise de variância fatorial (genótipos x doses de alumínio) para
CI, CF e CR, tendo suas médias comparadas pelo teste de Duncan com 5% de
probabilidade, quando houve significância para o teste F.
3.2 Análise molecular
A extração do DNA genômico e a análise molecular foram realizadas
no Laboratório de Análise Genética do DPFA da Faculdade de Agronomia da
UFRGS, no período de 15 de janeiro a 20 de fevereiro de 2009.
A caracterização molecular foi feita nas populações selecionadas
(DR-F2, SG-F2 e UF-F2), bem como nas populações originais (DR, SG e UF)
de L. corniculatus, com o auxílio de marcadores microssatélites (SSR).
A extração do DNA foi realizada segundo a metodologia descrita por
Ferreira & Grattapaglia (1998), com modificações. Cada amostra foi constituída
39
pela mistura (bulk) de uma folha jovem e sadia de 20 plantas de cada
população. Logo após a coleta do material, o mesmo foi depositado em tubos
eppendorf de 1,5 mL e macerado em nitrogênio líquido. Ao material macerado,
foi adicionado 650 L de tampão de extração CTAB (2% de CTAB, 1,4 mol de
NaCl, 20 mmol EDTA e 10 mmol de Tris base pH 8,0) previamente aquecido a
65º C, 14 L de -mercaptoetanol, 10 L de proteinase K e 1% de PVP. O
material macerado foi suspenso no tampão de extração com o auxílio do
aparelho vortex. As amostras permaneceram em banho-maria a 65º C por 30
minutos, sendo levemente agitadas a cada 10 minutos. Após a retirada do
banho, as amostras foram resfriadas no agitador por 30 minutos. Logo depois,
foram adicionados 650 L de clorofórmio isoamílico (24 clorofórmio:1 álcool
isoamílico), sendo as amostras agitadas por 30 minutos. A suspensão foi
centrifugada por 15 minutos a 13.000 rotações por minuto (rpm). O
sobrenadante foi retirado e transferido para um novo eppendorf, sendo
adicionado ao mesmo volume de DNA o volume de isopropanol gelado. Os
tubos foram invertidos gentilmente a fim de observar a precipitação do DNA. A
solução foi mantida a 4º C durante uma noite. No dia seguinte, os tubos foram
retirados da geladeira e centrifugados a 13.000 rpm por 10 minutos, sendo
descartado o sobrenadante. Feito isso, foram acrescentados 500 L da solução
de lavagem (76% de etanol e 10 mmol de acetato de amônio) por 10 minutos,
sendo posteriormente centrifugado por cinco minutos a 13.000 rpm. O
sobrenadante foi descartado e os tubos foram mantidos invertidos até a
secagem do pellet. Os pellets de DNA foram ressuspensos em 100 L de TE
pH 7,4 (10 mmol de Tris base pH 8,0 e 1 mmol de EDTA), sendo as amostras
40
mantidas em banho-maria a 65º C por cinco minutos. Após a retirada do banho,
o DNA foi reprecipitado com 50 L de 7,5 mol de acetato de amônio e 375 L
de etanol absoluto. As amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 13.000
rpm. O sobrenadante foi descartado e os tubos foram mantidos invertidos até a
completa secagem do pellet. Posteriormente o DNA foi ressuspenso em 50 L
de TE pH 7,4. Os tubos foram mantidos por 24 horas a 4º C e depois
armazenados a -18º C.
O DNA das amostras foi quantificado através de eletroforese (100 V
por uma hora) em gel de agarose 1% corado com 0,04 L/mL de brometo de
etídio (10 mg/mL) para visualização das bandas e comparação com os padrões
de concentração conhecida (100, 500 e 1000 ng de DNA) e submerso em
tampão TBE 0,5X. Posteriormente, uma alíquota de cada amostra foi diluída
em TE pH 7,4 a uma concentração de 20 ng/L.
As reações da polimerase em cadeia (PCR) foram realizadas em um
volume final de 10 L por reação, compostos por 3 L da solução de trabalho
de DNA (20 ng/L), 1 L de tampão PCR 10X, 0,3 L de MgCl
2
(50 mmol),
0,2 L de dNTP mix (10 mmol) contendo 2,5 mmol de cada um dos quatro
nucleotídeos, 0,6 L do primer forward (10 mol), 0,6 L do primer reverse
(10 mol), 0,1 L de Taq DNA Polimerase Qiagen (5 U/L) e água MiliQ
esterilizada para completar o volume. Utilizaram-se 14 primers de
microssatélites desenvolvidos para Lotus japonicus (Regel) Larsen e cinco
primers de microssatélites desenvolvidos para Trifolium Repens L. (Tabela 1).
41
TABELA 1. Primers de microssatélites utilizados na amplificação de seis
genótipos de Lotus corniculatus L. UFRGS, Porto Alegre, RS,
2009.
Primer
Sequência F (5’ – 3’)
Sequência R (3’ – 5’)
Motivo/
classe
*
TM0021 GGTCATCTTTGTGATAGTAAGTAA (CT)
16
CTGTTGTATCAAGCCACAAG
Perfeito
*
TM0029 CCTATATAACCTTATTCAAATTGG (CT)
15
ACGAAAACAAAACCCTGCTG
Perfeito
*
TM0046 ATCTAACCAAAACGTGCTTC (CT)
16
TTCTTGCCCTTTCTCTGTGG
Perfeito
*
TM0072 TTATGGTGCTGTATGAGTATG (AT)
9
CTTATGAAACTTAAGCCCTG
Perfeito
*
TM0080 AACAAAATACTAAACTATAGCAAAG (AT)
14
CGTCCCACAACTCTCTTTAC
Perfeito
*
TM0133 CTTTGAAATAACTCATCAAAC (CT)
24
TACTGACACATTCCCCTTGC
Perfeito
*
TM0151 CTATCTAATCAAATATGGTGGC (AT)
25
ACGCTTAAACTTGTAAAGGC
Perfeito
*
TM0208 TGGCTAGGAATGATGTTGTG (AAT)
15
TACAATCATGTTTATAAATGTGG
Perfeito
*
TM0212 CTTCCTTCCTCACCACTTAG (CT)
13
TAAACGAAAATGAAGCAGAG
Perfeito
*
TM0256 GAAATTCTTTCCATTCATTG (AAAT)
7
AGAGAGATAGGGTTGCTCAC
Perfeito
*
TM0314 TGTGATTAGTGATTAGAAAGTGAG (CT)
14
TTTGACCAAACTTCCTTCAC
Perfeito
*
TM0756 GCACCTACCAAATAAACAGC (AAG)
6
CTCCCATTGAACGCCTTGAC
Perfeito
*
TM0817 TTGCTCATGTGAGAAAGAAC (AAT)
19
GCTTTAAAATGACGTCCTAATC
Perfeito
*
TM1491 TCAAAAGTCTGATTTGGAGG (AAG)
6
TTGTAAAGTGAAAGCAATGG
Perfeito
**
ATS070 GTCATTGGTGATGGTGTTCT (CA)
N
TTTCGTCAGTGGCGGTGCTC
Perfeito
**
ATS226 CATCTACTCACCACCACCTA (ATG)
N
CAGCAGCAGCAGCAGCGATA
Perfeito
**
PRS582 CCGGTTCGATTCAACAAGTT (TTC)
N
CTGCAGATCCAGTAATGATTTCC
Perfeito
**
PRS612 TTGAACTAGTCGTTGGATGGG (ATG)
N
GAGAGGGTTTCAGGAACATACG
Perfeito
**
TRSSRAXX31 TCTGTTTTGTTGGCCATGC (GT)
7
TTGCAAAGTGTTTGGAAGGA
Perfeito
*
primer desenvolvido para Lotus japonicus (Regel) Larsen.;
**
primer desenvolvido para Trifolium repens L.
42
As condições de amplificação de SSR foram baseadas em Bortolini
(2008), com modificações, as quais consistiam de uma desnaturação inicial de
94º C por 5 minutos, seguidos por sete ciclos de 1 minuto a 94º C, 1 minuto a
61º C, 1 minuto a 72º C, com uma redução na temperatura de anelamento de
1º C por ciclo, seguido de 25 ciclos de 1 minuto a 94º C, 1 minuto a 55º C e 1
minuto a 72º C e, seis ciclos de 45 segundos a 94º C, 45 segundos a 54º C e
45 segundos a 72º C, e por fim, extensão a 72º C por 8 minutos e estoque a
7º C. Após a amplificação foram acrescentados 4 L de tampão de amostra
(4g/mL de sacarose, 2,5 mg/mL de azul de bromofenol e TE pH 7,4) em cada
amostra.
Os fragmentos amplificados foram visualizados em gel de agarose
de alta resolução (Agarose 1000) 4% corado com 0,08 L/mL de brometo de
etídio (10 mg/mL), submerso em tampão TBE 1X, a uma corrente de 100 V por
duas horas (Figura 3). Após a eletroforese, o gel era visualizado em um
transiluminador de luz ultravioleta (comprimento de onda de 260 nm) e
fotografado, para que os fragmentos das amostras fossem determinados por
comparação a um padrão de 100 pares de bases (pb), através do programa
Kodak EDAS 290 (Electrophoresis Documentation and Analysis System).
FIGURA 3. Gel de agarose com bandas de DNA das populações de Lotus
corniculatus L. em análise do primer de microssatélite TM0817.
UFRGS, Porto Alegre, RS, 2009.
43
Por fim, foi construída uma matriz binária dos dados, onde foi
atribuído o valor um para a presença e zero para a ausência de bandas. A
partir dessa matriz, com o auxílio do programa “Numerical Taxonomy and
Multivariate Analysis System” NTSYSpc versão 2.1 (Rohlf, 2000) e utilizando o
coeficiente de Jaccard, foi gerada uma matriz de similaridade comparando
todos os genótipos.
Uma análise de agrupamento foi realizada utilizando o módulo
SAHN do NTSYS e o método da média das distâncias (UPGMA, Unweighted
Pair-Group Method Using an Arithmetic Average) e assim, construído um
dendrograma de similaridade genética entre os genótipos.
Foi calculado o número total de alelos por loco (A), as frequências
genotípicas e alélicas e o conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) para
cada loco (PIC = 1 - pi
2
, onde pi é a freqüência do alelo i). O PIC fornece uma
estimativa do poder discriminativo do marcador, variando de zero, para perfis
monomórficos, até um, para perfis altamente polimórficos.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação da tolerância ao alumínio
Os comprimentos radiculares iniciais (CI) das plântulas
apresentaram diferenças significativas (P<0,05) em relação aos genótipos no
momento da implantação do experimento. Por outro lado, não houve variação
significativa (P>0,05) entre o CI e às concentrações de alumínio (Tabela 2).
Os maiores comprimentos radiculares foram observados em alfafa
(ALF), UF-F1 e UF-F2 e, o menor, em DR. A alfafa apresentou um crescimento
médio 13% superior ao dos genótipos das populações originais de cornichão
(DR, SG e UF), e 7% maior em relação às populações melhoradas. Houve uma
tendência das populações selecionadas de L. corniculatus apresentarem maior
CI do que as populações originais.
O tamanho das sementes pode estar associado ao CI observado,
visto que a existência de plântulas vigorosas está positivamente relacionada às
sementes maiores (Leishman et al., 2000). As sementes de cornichão são
pequenas quando comparadas às demais espécies de forrageiras leguminosas
(Blumenthal & McGraw, 1999), principalmente quando confrontadas com as de
alfafa. Por exemplo, um grama de sementes de alfafa corresponde a 500
sementes, enquanto no cornichão, esse valor equivale a 815 (Brasil, 1992).
Além disso, o baixo vigor das plântulas de L. corniculatus, na maioria das
45
vezes, está associado ao tamanho reduzido de suas sementes (Blumenthal &
McGraw, 1999).
TABELA 2. Comprimento radicular inicial (cm) dos genótipos de cornichão
(Lotus corniculatus L.) e alfafa crioula (Medicago sativa L.)
utilizados na implantação do experimento de avaliação da
tolerância ao alumínio em solução nutritiva. UFRGS, Porto Alegre,
RS, 2009.
*Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna, não diferem pelo teste de Duncan a 5%.
**Médias seguidas de mesma letra minúscula na linha, não diferem pelo teste de Duncan a 5%.
Por outro lado, a seleção parece ter contribuído para o aumento do
vigor das sementes de cornichão, tendo como consequência um maior
comprimento radicular nas populações melhoradas. O peso de mil sementes
das populações selecionadas foi, em média, de 1,5 g, representando um
aumento médio de 23% em relação ao das populações originais (1,2 g).
Caetano (1998), do mesmo modo, verificou um aumento no comprimento
radicular nos materiais selecionados em relação aos originais, quando
selecionou plântulas de alfafa para solos ácidos.
Até o momento do transplante para as bandejas, todos os genótipos
Concentrações de alumínio (mol/L)
Genótipos
0
50
100
150
Média
ALF
2,38
2,34
2,38
2,28
2,35
A*
DR
1,99
1,89
2,08
2,12
2,02
C
DR-F1
2,04
2,13
2,17
2,12
2,11
BC
DR-F2
2,05
2,22
2,15
2,14
2,14
BC
SG
2,11
1,98
2,13
2,19
2,10
BC
SG-F1
2,15
2,14
2,21
2,22
2,18
B
SG-F2
2,11
2,28
2,25
2,16
2,20
B
UF
2,15
2,12
2,09
2,13
2,12
BC
UF-F1
2,30
2,32
2,37
2,38
2,34
A
UF-F2
2,28
2,36
2,38
2,33
2,33
A
Média
2,16
a**
2,18
a
2,22
a
2,20
a
46
foram tratados apenas com água bidestilada, não havendo a interferência do
alumínio neste estádio. Somente após o transplante, as plântulas de cada um
dos genótipos foram submetidas a quatro diferentes concentrações de Al
3+
.
Isso pode explicar a semelhança entre as médias dos comprimentos
radiculares iniciais, nos diferentes tratamentos.
A análise de variância, do comprimento radicular final (CF), não
apresentou interação significativa (P>0,05) entre os genótipos e as
concentrações de alumínio. A significância (P<0,05) foi observada apenas nos
efeitos principais (Tabela 3).
TABELA 3. Comprimento radicular final (cm) dos genótipos de cornichão (Lotus
corniculatus L.) e alfafa crioula (Medicago sativa L.) aos 14 dias em
solução nutritiva contendo 200 mol/L de cálcio (CaCl
2
.2H
2
O) em
quatro concentrações de alumínio (0, 50, 100, 150 mol/L) (AlCl
3
).
UFRGS, Porto Alegre, RS, 2009.
Concentrações de alumínio (mol/L)
Genótipos
0
50
100
150
Média
ALF
2,88
2,55
2,54
2,39
2,59
AB*
DR
2,29
2,11
2,27
2,24
2,23
D
DR-F1
2,33
2,38
2,38
2,24
2,33
CD
DR-F2
2,33
2,47
2,36
2,28
2,36
CD
SG
2,43
2,28
2,33
2,34
2,34
CD
SG-F1
2,47
2,46
2,48
2,38
2,45
BC
SG-F2
2,45
2,59
2,53
2,34
2,48
ABC
UF
2,50
2,41
2,33
2,28
2,38
CD
UF-F1
2,62
2,62
2,65
2,54
2.61
AB
UF-F2
2,63
2,70
2,67
2,53
2,63
A
Média
2,49
a**
2,46
ab
2,45
ab
2,36
b
*Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna, não diferem pelo teste de Duncan a 5%.
**Médias seguidas de mesma letra minúscula na linha, não diferem pelo teste de Duncan a 5%.
Os menores comprimentos radiculares finais foram vistos em todas
as populações originais (DR, SG e UF) e nas melhoradas DR-F1 e DR-F2,
47
diferenciando-se significativamente (P<0,05) dos demais materiais analisados.
Por outro lado, destacou-se (P<0,05) a população UF-F2, possuindo o maior
CF. Numericamente, todas as populações selecionadas apresentaram CF
superior ao das populações originais, mantendo a tendência observada no CI.
O vigor inicial das sementes pode ter influenciado o comportamento
das plântulas em relação ao CF. A alfafa, considerada uma das espécies de
leguminosas forrageiras de maior vigor (Formoso, 2000), teve um dos maiores
CF, assim como as plântulas das populações melhoradas de SG e UF.
O comportamento do genótipo DR, frente a diferentes concentrações
de alumínio, foi avaliado por Santos et al. (2007). Os autores observaram a
sensibilidade deste material a partir de doses elevadas de alumínio
(100 mol/L), corroborando os resultados obtidos neste experimento.
Quanto às diferenças existentes entre as concentrações de alumínio,
estas foram significativas (P<0,05) apenas entre os níveis zero e 150 mol/L.
Estes resultados poderiam sugerir que todos os materiais analisados são
tolerantes a concentrações elevadas de Al
3+
, entretanto, trabalhos anteriores
demonstraram a sensibilidade de alguns genótipos de Lotus (Santos et al.,
2008c) e de alfafa crioula (Santos et al., 2008b) em relação ao alumínio. Dessa
maneira, o CF não é uma forma adequada para diferenciar genótipos de
cornichão em relação à tolerância ao alumínio.
Entre as avaliações realizadas neste trabalho, o crescimento
radicular (CR) foi o que melhor caracterizou a tolerância ao alumínio. A
avaliação permitiu que as diferenças existentes entre as radículas das
plântulas, na implantação do experimento, fossem suprimidas, considerando-se
48
apenas o crescimento radicular líquido (CF – CI). A análise de variância,
referente ao CR, indicou uma interação significativa (P<0,05) entre os
genótipos testados e as concentrações de alumínio utilizadas (Tabela 4).
TABELA 4. Crescimento radicular (cm) dos genótipos de cornichão (Lotus
corniculatus L.) e alfafa crioula (Medicago sativa L.) após 14 dias
em solução nutritiva contendo 200 mol/L de cálcio (CaCl
2
.2H
2
O)
em quatro concentrações de alumínio (0, 50, 100, 150 mol/L)
(AlCl
3
). UFRGS, Porto Alegre, RS, 2009.
Concentrações de alumínio (mol/L)
Genótipos
0
50
100
150
ALF 0,50
A*a**
0,21
C b
0,16
D bc
0,11
C c
DR 0,30
B a
0,22
C b
0,19
DC b
0,12
C c
DR-F1 0,29
B a
0,25
BC ab
0,21
BCD b
0,12
C c
DR-F2 0,28
B a
0,25
BC ab
0,21
BCD b
0,14
BC c
SG 0,32
B a
0,29
AB a
0,20
BCD b
0,15
ABC b
SG-F1 0,32
B a
0,32
AB a
0,27
AB a
0,16
ABC b
SG-F2 0,34
B a
0,31
AB ab
0,28
AB b
0,18
AB c
UF 0,35
B a
0,29
AB ab
0,24
ABC b
0,15
ABC c
UF-F1 0,32
B a
0,30
AB a
0,28
A a
0,16
ABC b
UF-F2 0,35
B a
0,34
A a
0,29
A a
0,20
A b
*Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna, não diferem pelo teste de Duncan a 5%.
**Médias seguidas de mesma letra minúscula na linha, não diferem pelo teste de Duncan a 5%.
No tratamento zero, todos os genótipos de cornichão tiveram o CR
semelhante, porém inferiores ao da alfafa. Entretanto, o inverso ocorreu nos
tratamentos com alumínio, havendo uma redução acentuada no CR da alfafa,
desde a concentração 50 mol/L, indicando maior sensibilidade ao Al
3+
nesta
espécie.
Entre os genótipos de cornichão, o CR foi semelhante entre as
doses zero e 50 mol/L, com exceção do DR, o qual apresentou maior redução
quando comparado as demais populações de L. corniculatus, e comportamento
parecido com o da alfafa.
49
Nas concentrações elevadas de alumínio, as populações
melhoradas de SG e UF destacaram-se das originais, sendo que os materiais
UF-F1 e UF-F2 mantiveram seus CR satisfatórios até a concentração de 100
mol/L. No nível 150 mol/L, os materiais SG-F2 e UF-F2 apresentaram,
numericamente, os maiores CR. Em contrapartida, os menores CR foram vistos
em ALF e DR.
O comportamento exibido pelos materiais de L. corniculatus, nos
diferentes níveis de alumínio, permitiu caracterizar o genótipo DR como um
material sensível ao Al
3+
, enquanto SG e UF mostraram-se mais tolerantes.
Santos et al. (2007) já haviam caracterizado DR e UF em relação à resposta ao
Al, indicando que os mesmos são sensíveis e tolerantes, respectivamente.
As diferenças encontradas entre os genótipos, referentes à
tolerância ao Al
3+
, podem ser explicadas pela grande variabilidade genética
existente no germoplasma de L. corniculatus (Steiner, 1999). Essa variabilidade
deve ser explorada em programas de melhoramento, visando à obtenção de
materiais que possam ser utilizados como parentais, de acordo com as
características desejáveis.
A alfafa mostrou-se sensível ao alumínio, sofrendo uma inibição
média, no CR, de 68% nas diferentes concentrações de Al
3+
testadas. Por
outro lado, os genótipos de cornichão demonstraram maior tolerância, sendo
que as populações originais apresentaram uma redução média no CR de 36%,
enquanto que nas populações melhoradas (F2) essa diminuição foi de 24%
(Figura 4). A utilização das populações melhoradas de cornichão, nas áreas de
pastagem que possuam solos ácidos, acarretaria em uma redução na
50
quantidade de calcário a ser utilizada, bem como uma diminuição nos custos
de implantação e manutenção da pastagem, sem prejuízos na produção e na
persistência.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0
50
100
150
Crescimento radicular (cm)
Concentrações de alumínio
Alfafa
Cornichão pop original
Cornichão pop melhorada
FIGURA 4. Crescimento radicular médio (cm) de alfafa crioula (Medicago sativa
L.) e de três populações originais e melhoradas de cornichão (Lotus
corniculatus L.) após 14 dias em solução nutritiva contendo 200
mol/L de cálcio (CaCl
2
.2H
2
O) em quatro concentrações de
alumínio (0, 50, 100 e 150 mol/L) (AlCl
3
). UFRGS, Porto Alegre,
RS, 2009.
Ao contrário da alfafa, que teve seu CR acentuadamente reduzido
quando exposta às diferentes concentrações de alumínio, as populações
melhoradas de cornichão mantiveram certa estabilidade até mesmo em níveis
elevados (100 mol/L), apresentando uma diminuição média de 6% entre os
níveis zero e 50 mol/L e 19% entre zero e 100 mol/L.
Os efeitos da toxidez (Figura 5) foram percebidos de maneira
proporcional ao aumento das concentrações de Al
3+
, ocorrendo uma diminuição
considerável no CR dos genótipos estudados, nas doses elevadas. Estes
resultados estão de acordo com trabalhos previamente publicados, os quais
(
mol.L
-
1
)
51
afirmam ser a inibição do crescimento radicular, o sintoma primário de toxidez
por alumínio nas plantas (Foy et al., 1978; Delhaize & Ryan, 1995; Kochian,
1995).
FIGURA 5. Efeitos da toxidez por alumínio em plântulas de Lotus corniculatus
L. UFRGS, Porto Alegre, RS, 2009.
A avaliação do CR mostrou que a concentração de 100 mol/L foi
eficiente na discriminação dos genótipos estudados em relação à sensibilidade
ao Al
3+
, confirmando o resultado obtido por Santos et al. (2007).
Nos ensaios realizados, as populações melhoradas apresentaram
maior CR em relação às populações originais, indicando que a seleção para
tolerância ao alumínio, em solução nutritiva simples, contendo 100 mol/L de
Al
3+
e 200 mol/L de Ca, foi eficiente nos materiais estudados (Figura 6).
Após o primeiro ciclo de seleção, os aumentos percentuais médios
relativos ao CR nas populações F1 foram de 5, 10 e 5% e, após o segundo
ciclo, foram de 6, 14 e 16% referentes às populações originais DR, SG e UF,
respectivamente. A redução nos ganhos percentuais relacionados ao CR,
observados após o primeiro ciclo de seleção nas populações melhoradas de
52
DR e SG, pode ser explicada pela maior variabilidade existente nas populações
originais (Carvalho et al., 2008). Ao longo das etapas de seleção, a
variabilidade vai sendo reduzida e, dessa maneira, tornando-se mais difícil de
ser explorada.
0,00
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
0,24
0,27
0,30
0,33
1 2 3
Crescimento radicular (cm)
Pop. original
F1
F2
FIGURA 6. Avaliação da tolerância ao alumínio de nove populações de
cornichão (Lotus corniculatus L.) em relação ao crescimento
radicular médio das plântulas submetidas a diferentes
concentrações de alumínio (0, 50, 100 e 150 mol/L) (AlCl
3
).
UFRGS, Porto Alegre, RS, 2009.
Entretanto, pelo fato da espécie L. corniculatus ser tetraplóide,
alógama e por ter sido realizado somente dois ciclos de seleção, existe ainda
variabilidade genética para a tolerância ao Al
3+
, dentro e entre as populações
selecionadas. Além do mais, esta variabilidade permite a obtenção de maiores
ganhos para esta característica, podendo ser fixada em uma população futura,
bem como combinada com outros atributos relevantes para a espécie.
A tolerância ao alumínio é uma característica herdável,
apresentando diferenças entre as espécies em relação ao seu controle,
DRACO SÃO GABRIEL UFRGS
53
podendo a mesma ser regulada por um ou mais genes dominantes ou por
vários genes de efeitos aditivos atuantes em diferentes rotas bioquímicas
(Kochian, 1995). Ainda não foram divulgados trabalhos capazes de revelar
como ocorre o controle genético dessa característica no cornichão, apenas em
relação ao mecanismo de tolerância (Santos et al., 2008a), o que auxiliaria na
escolha do método mais apropriado para a seleção. Assim mesmo, a seleção
recorrente empregada neste trabalho mostrou-se eficiente na escolha de
plântulas tolerantes ao alumínio.
A variabilidade genética existente em L. corniculatus, bem como a
capacidade natural de adaptação a solos pobres e relativamente ácidos
(Blumenthal & McGraw, 1999), deve ser explorada em programas de
melhoramento. A busca por materiais tolerantes ao alumínio ocorre em outras
culturas de importante valor agronômico, como por exemplo, na alfafa
(Caetano, 1998), no sorgo (Caniato et al., 2007), no trevo branco (Voigt &
Staley, 2004) e na soja (Menosso, 2000).
A utilização de cultivares capazes de se desenvolverem e se
manterem em solos ácidos, com um mínimo necessário de calcário, apresenta-
se como uma alternativa ambientalmente e economicamente sustentável. O
maior comprimento radicular manifestado nas plantas tolerantes ao alumínio
permite a possibilidade de absorção dos nutrientes além da camada arável e,
também, o acesso à água nas camadas mais profundas, durante períodos de
déficit hídrico. Ainda torna possível a redução dos gastos relacionados à
correção do solo, durante a implantação e/ou manutenção da pastagem.
Entretanto, os materiais selecionados ainda devem ser testados sob
54
condições de campo, visando um conhecimento mais aprofundado do
comportamento das populações tolerantes em condições reais de utilização.
4.2. Análise molecular
Na análise molecular, testaram-se 19 pares de primers de SSR, dos
quais 14 foram desenvolvidos para L. japonicus e, cinco, para T. repens. Todos
os primers testados foram utilizados nas análises, com exceção de um
(prs582), desenvolvido para T. repens, por não ter produzido bandas evidentes
e ter apresentado falhas na amplificação dos genótipos.
Os 18 marcadores analisados detectaram ao todo 51 alelos nos seis
genótipos de L. corniculatus estudados (DR, UF, SG, DR-F2, SG-F2 e UF-F2).
O número de alelos por loco variou de um (TM0212 e TM1491) a cinco
(TM0133), com uma média de 2,8 alelos por loco. Os tamanhos alélicos
variaram de 112 a 460 pares de bases (pb) (Tabela 5).
Sardaro et al. (2008) analisando onze populações selvagens de
cornichão, com o auxílio de cinco marcadores SSR, detectaram a presença, em
média, de 13,6 alelos por loco. A grande variação observada entre o número de
alelos existentes em populações selvagens e cultivares, deve-se
principalmente à estreita base genética utilizada em programas de
melhoramento (Tanksley & McCouch, 1997).
O conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) variou de zero a
0,75, com uma média de 0,52. Dez pares de primers foram polimórficos
(TM0021, TM0029, TM0072, TM0133, TM0151, TM0208, TM0314, TM0756,
prs612 e TRSSRAXX31) e oito foram monomórficos (TM0046, TM0080,
55
TM0212, TM0256, TM0817 e TM1491, ats070, ats226). Os locos monomórficos
apresentaram os menores valores de PIC, enquanto que, valores elevados
foram encontrados nos locos com maior número de alelos. Todos os locos
foram capazes de detectar pelo menos um alelo em cada um dos genótipos de
cornichão analisados. Esse fato pode estar relacionado à heterozigose dos
materiais, visto que o modo de reprodução dos mesmos é o de fecundação
cruzada.
TABELA 5. Tamanho alélico (pb), número de alelos (A) e conteúdo de
informação de polimorfismo (PIC), de cada um dos 18
marcadores de microssatélites analisados na caracterização de
seis genótipos de cornichão (Lotus corniculatus L.). UFRGS,
Porto Alegre, RS, 2009.
*primer desenvolvido para Lotus japonicus (Regel) Larsen;
**primer desenvolvido para Trifolium repens L.
A partir da matriz de similaridade genética (Tabela 6), obtida pelo
Primer
Tamanho alélico (pb) A PIC
*
TM0021 160 – 189 4 0,63
*
TM0029 153 – 170 3 0,58
*
TM0046 148 – 162 2 0,50
*
TM0072 135 – 172 4 0,73
*
TM0080 129 – 167 2
0,50
*
TM0133 160 – 195 5 0,71
*
TM0151 112 – 128 3
0,57
*
TM0208 143 – 246 3 0,64
*
TM0212 160 – 000 1 0,00
*
TM0256 169 – 183 2 0,50
*
TM0314 148 – 160 2
0,48
*
TM0756 134 – 168 3
0,58
*
TM0817 124 – 162 2 0,50
*
TM1491 148 – 000 1
0,00
**
ats070 193 – 455 4 0,75
**
ats226 142 – 372 4 0,75
**
prs612 130 – 266 3 0,62
**
TRSSRAXX31 317 – 460 3 0,41
Total 51
Média 2,8
0,52
Min – Max 112 – 460 1 - 5
0 – 0,75
56
índice de Jaccard, foi gerado um dendrograma (Figura 7), o qual apresentou
um coeficiente de correlação cofenético elevado (r = 0,93), indicando a
representatividade do mesmo em relação à matriz de similaridade genética. A
similaridade média entre os genótipos analisados foi alta (0,79), variando de
0,73 a 0,92. A utilização da similaridade média como ponto de corte permitiu a
formação de três grupos. Um grupo maior, composto por quatro genótipos; e
dois grupos, com apenas um genótipo cada.
TABELA 6. Matriz de similaridade genética de seis genótipos de Lotus
corniculatus L. analisados através da técnica de microssatélites.
UFRGS, Porto Alegre, RS, 2009.
DR SG UF DR-F2
SG-F2
UF-F2
DR ---
SG 0,80 ---
UF 0,79 0,84 ---
DR-F2
0,78 0,83 0,79 ---
SG-F2
0,76 0,83
0,92
0,81 ---
UF-F2 0,78
0,74 0,73
0,78 0,75 ---
A elevada similaridade existente entre os genótipos estudados pode
ser o resultado da base genética semelhante utilizada no desenvolvimento de
novas cultivares, principalmente quando o programa de melhoramento é
desenvolvido a partir de cultivares previamente lançadas através de seleção
massal ou recorrente. As espécies de Lotus apresentam uma grande
variabilidade genética, tanto intra quanto interespecífica, que deve ser melhor
compreendida e utilizada em programas de melhoramento, na tentativa de
evitar os gargalos genéticos (Steiner, 1999).
O maior índice de similaridade observado em relação aos materiais
analisados foi de 0,92 entre SG-F2 e UF. Os menores índices foram de 0,73 e
57
0,74 entre UF e UF-F2 e, SG e UF-F2, respectivamente. A maior e a menor
similaridade encontradas entre as populações SG e UF podem ter ocorrido em
decorrência do genótipo UF ter sido originado do SG a partir de um programa
de melhoramento anterior (Perez, 2003). Após o genótipo UF ter sofrido dois
ciclos de seleção, passando a ser chamado de UF-F2, ocorreu um maior
distanciamento do seu ancestral SG. Ao contrário, quando o SG foi melhorado,
(SG-F2), este se assemelhou a sua progênie melhorada, o genótipo UF.
Foram percebidas alterações discretas na similaridade entre os
genótipos após o melhoramento. Antes da seleção, DR apresentava-se 80 e
79% similar aos genótipos SG e UF, respectivamente. Após dois ciclos, estes
valores passaram a ser de 76% entre SG-F2 e, 78% entre UF-F2. Por outro
lado, a similaridade inicial entre UF e SG era de 84%, passando a ser de 92%
entre UF e SG-F2. Essas mudanças indicam a ocorrência de alterações a nível
gênico nas populações, ao longo do programa de melhoramento.
A similaridade entre os genótipos das populações originais e
melhoradas foi de 0,78 entre DR e DR-F2; 0,83 entre SG e SG-F2; e 0,73 entre
UF e UF-F2. Não foram observadas diferenças em relação ao número de alelos
entre as populações originais e melhoradas.
O acompanhamento do número e da frequência alélica dos
indivíduos que fazem parte de um programa de melhoramento, pode ser
realizado com o auxílio de marcadores moleculares, através da comparação
genética com os seus progenitores. Dessa maneira, pode-se determinar se
houve um aumento ou uma diminuição, ou até mesmo o desaparecimento de
um alelo na população. Através da análise desses dados, o melhorista pode
58
decidir o momento mais adequado para a introdução de novas fontes de
variabilidade à população (Brondani et al., 2004).
FIGURA 7. Dendrograma obtido com base na similaridade genética de seis
genótipos de Lotus corniculatus L., utilizando-se 18 marcadores
microssatélites. A linha tracejada indica a distância média e o
ponto de corte no dendrograma. UFRGS, Porto Alegre, RS, 2009.
Os agrupamentos podem ter sido gerados em decorrência do
programa de melhoramento para solos ácidos, no qual os genótipos haviam
sido previamente submetidos. Através da análise dos resultados obtidos do
experimento anterior, o material DR apresentou-se como o mais sensível ao
alumínio entre os demais. Por outro lado, o material UF-F2 destacou-se como o
mais tolerante. Ambos formaram grupos únicos, a partir do corte realizado no
dendrograma. Os genótipos que constituíram o grupo maior (SG, UF, DR-F2 e
SG-F2) apresentaram um nível de tolerância intermediário, exceto o SG-F2.
Provavelmente, este material permaneceu neste grupo pelo fato do genótipo
UF ter sido originado do SG, como visto anteriormente.
DR
SG
UF
SG-F2
DR
-
F2
UF-F2
59
Os marcadores utilizados neste trabalho foram desenhados para
outras espécies, e mesmo assim mostraram-se eficientes na diferenciação dos
genótipos de L. corniculatus analisados, corroborando os demais trabalhos que
também utilizaram primers heterólogos. Sawasato et al. (2008) analisaram a
diversidade genética entre 64 acessos de Paspalum urvillei Steudel utilizando
marcadores desenvolvidos para Lolium multiflorum L. e Trifolium repens L.
Sardaro et al. (2008) acessaram a variabilidade genética existente entre 11
populações selvagens de L. corniculatus com o auxílio de cinco pares de
primers desenvolvidos para L. japonicus.
A maior limitação na utilização dos SSR está no elevado custo
requerido para o desenvolvimento de primers específicos, quando os mesmos
não estão disponíveis para a espécie a ser estudada. Entretanto, nas situações
onde ocorre a conservação de sítios de microssatélites entre as espécies
relacionadas, a transferência dos marcadores é possível utilizando-se primers
heterólogos (Faleiro, 2007).
Diversos trabalhos relacionados ao estudo da diversidade genética
em populações naturais já foram realizados com a técnica de microssatélites.
Contudo, existem poucos trabalhos referentes a diferenças genéticas entre
cultivares ou populações. Em alfafa, Flajoulout et al. (2005) investigaram
satisfatoriamente o nível de diferenciação entre sete cultivares originadas de
um programa de melhoramento, e entre estas cultivares e o material que lhes
originaram, com oito marcadores SSR desenvolvidos para Medicago truncatula
L. Sete cultivares de Lolium perenne L. apresentaram diferenças inter- e
intraespecíficas através de 22 marcadores SSR (Kubik et al., 2001).
60
O sucesso no desenvolvimento de novas cultivares depende da
escolha dos genitores e do planejamento dos cruzamentos que devem ser
realizados ao longo do programa (Borém, 2005). Os marcadores moleculares
atuam como uma ferramenta eficiente na análise da variabilidade genética dos
potenciais genitores, identificando diferenças entre os materiais em nível de
DNA. As técnicas moleculares fornecem aos pesquisadores uma nova fonte de
informações, que utilizadas em conjunto com os dados morfológicos e
agronômicos acabam contribuindo para o aumento da eficácia do programa
(Faleiro, 2007).
5. CONCLUSÕES
1. A seleção de plântulas de Lotus corniculatus L. em solução nutritiva
contendo 100 mol/L de alumínio e 200 mol/L de cálcio, mostra-se eficiente
na obtenção de materiais com maior tolerância ao alumínio.
2. O crescimento radicular líquido é o parâmetro que avalia com maior precisão
os materiais analisados em relação à tolerância ao alumínio.
3. Os genótipos analisados de cornichão mostram-se mais tolerantes ao
alumínio do que a alfafa crioula, principalmente o material UF-F2.
4. Os marcadores moleculares microssatélites são capazes de diferenciar
geneticamente os genótipos de L. corniculatus analisados.
5. Os primers desenvolvidos para Lotus japonicus (Regel) Larsen e Trifolium
repens L. conseguem acessar os locos SSR existentes nos genótipos de
cornichão estudados.
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7. APÊNDICES
74
Apêndice 1. Valores obtidos nas variáveis observadas durante a avaliação da
tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão (Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
ALF 0 1 2,2 2,7 0,5
ALF 0 2 2,4 2,9 0,5
ALF 0 3 2,2 2,6 0,4
ALF 0 4
ALF 0 5 3 3,5 0,5
ALF 0 6 2 2,4 0,4
ALF 0 7 2,4 3 0,6
ALF 0 8 2,5 3 0,5
ALF 0 9 2,1 2,5 0,4
ALF 0 10 3 3,5 0,5
ALF 0 11 2,3 2,9 0,6
ALF 0 12 2,1 2,7 0,6
ALF
50 mol/L
1 3,2 3,5 0,3
ALF
50 mol/L
2 2,3 2,5 0,2
ALF
50 mol/L
3 2,4 2,6 0,2
ALF
50 mol/L
4 1,9 2 0,1
ALF
50 mol/L
5 2,2 2,4 0,2
ALF
50 mol/L
6 3 3,3 0,3
ALF
50 mol/L
7 2,5 2,7 0,2
ALF
50 mol/L
8 2,7 3 0,3
ALF 50 mol/L 9 1,8 2 0,2
ALF
50 mol/L
10 1,7 1,8 0,1
ALF
50 mol/L
11 2,3 2,5 0,2
ALF
50 mol/L
12 2,1 2,3 0,2
ALF
100 mol/L
1 2 2,2 0,2
ALF
100 mol/L
2
ALF
100 mol/L
3
ALF
100 mol/L
4 2,1 2,2 0,1
ALF
100 mol/L
5 2,1 2,3 0,2
ALF
100 mol/L
6 2,2 2,3 0,1
ALF
100 mol/L
7 1,8 1,9 0,1
ALF
100 mol/L
8 2,7 2,9 0,2
75
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L AlCl
3
)
REP CI CF CR
ALF
100 mol/L
9 3,4 3,6 0,2
ALF
100 mol/L
10 2,3 2,5 0,2
ALF
100 mol/L
11 2,4 2,5 0,1
ALF
100 mol/L
12 2,8 3 0,2
ALF 150 mol/L 1
ALF
150 mol/L
2 2,1 2,2 0,1
ALF
150 mol/L
3 2,4 2,5 0,1
ALF
150 mol/L
4 2,2 2,3 0,1
ALF
150 mol/L
5 2,3 2,4 0,1
ALF
150 mol/L
6 2,3 2,4 0,1
ALF
150 mol/L
7
ALF
150 mol/L
8 2,2 2,3 0,1
ALF
150 mol/L
9 2,1 2,2 0,1
ALF
150 mol/L
10 2,5 2,7 0,2
ALF
150 mol/L
11 2 2,1 0,1
ALF
150 mol/L
12 2,7 2,8 0,1
DR 0 1 1,8 2 0,2
DR 0 2 2 2,4 0,4
DR 0 3 2,2 2,5 0,3
DR 0 4 1,9 2,2 0,3
DR 0 5
DR 0 6 2 2,3 0,3
DR 0 7 2,3 2,7 0,4
DR 0 8 2 2,3 0,3
DR 0 9 1,9 2,1 0,2
DR 0 10 2,1 2,5 0,4
DR 0 11 2 2,3 0,3
DR 0 12 1,7 1,9 0,2
DR
50 mol/L
1 1,7 1,9 0,2
DR
50 mol/L
2 2,2 2,5 0,3
DR
50 mol/L
3 1,8 2 0,2
76
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L AlCl
3
)
REP CI CF CR
DR
50 mol/L
4 1,9 2,2 0,3
DR
50 mol/L
5 2,1 2,3 0,2
DR
50 mol/L
6 2 2,2 0,2
DR
50 mol/L
7 1,7 1,9 0,2
DR
50 mol/L
8 1,3 1,5 0,2
DR
50 mol/L
9 2,1 2,3 0,2
DR
50 mol/L
10 1,7 1,9 0,2
DR
50 mol/L
11 2 2,2 0,2
DR
50 mol/L
12 2,2 2,4 0,2
DR
100 mol/L
1 2,1 2,3 0,2
DR 100 mol/L 2 1,9 2,1 0,2
DR
100 mol/L
3 1,8 1,9 0,1
DR
100 mol/L
4 2,2 2,4 0,2
DR
100 mol/L
5 1,8 2 0,2
DR
100 mol/L
6 2,2 2,4 0,2
DR
100 mol/L
7 1,9 2,1 0,2
DR
100 mol/L
8 2,7 2,9 0,2
DR
100 mol/L
9 2,2 2,4 0,2
DR
100 mol/L
10 2 2,1 0,1
DR 100 mol/L 11 1,7 1,9 0,2
DR
100 mol/L
12 2,4 2,7 0,3
DR
150 mol/L
1 1,8 1,9 0,1
DR
150 mol/L
2 2 2,1 0,1
DR
150 mol/L
3 2,3 2,5 0,2
DR
150 mol/L
4 2,1 2,3 0,2
DR
150 mol/L
5 2,2 2,3 0,1
DR
150 mol/L
6 1,7 1,8 0,1
DR
150 mol/L
7 2,4 2,6 0,2
DR
150 mol/L
8 2,4 2,5 0,1
DR
150 mol/L
9 2,3 2,4 0,1
DR 150 mol/L 10 1,9 2 0,1
77
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
DR
150 mol/L
11 2,2 2,3 0,1
DR
150 mol/L
12 2,1 2,2 0,1
DR-F1 0 1 2,4 2,8 0,4
DR-F1 0 2 2,2 2,5 0,3
DR-F1 0 3 1,9 2,1 0,2
DR-F1 0 4 2,1 2,4 0,3
DR-F1 0 5 2,1 2,4 0,3
DR-F1 0 6 2 2,3 0,3
DR-F1 0 7 1,9 2,2 0,3
DR-F1 0 8 2,3 2,6 0,3
DR-F1 0 9 1,9 2,2 0,3
DR-F1 0 10 1,9 2,1 0,2
DR-F1 0 11 2,1 2,4 0,3
DR-F1 0 12 1,7 2 0,3
DR-F1
50 mol/L
1 2,2 2,5 0,3
DR-F1
50 mol/L
2 2,3 2,5 0,2
DR-F1
50 mol/L
3 2,3 2,5 0,2
DR-F1
50 mol/L
4 1,9 2,2 0,3
DR-F1
50 mol/L
5 2,3 2,6 0,3
DR-F1 50 mol/L 6 1,4 1,5 0,1
DR-F1
50 mol/L
7 3,1 3,5 0,4
DR-F1
50 mol/L
8 2,2 2,5 0,3
DR-F1
50 mol/L
9 2,2 2,4 0,2
DR-F1
50 mol/L
10 2 2,2 0,2
DR-F1
50 mol/L
11 1,8 2,1 0,3
DR-F1
50 mol/L
12 1,8 2 0,2
DR-F1
100 mol/L
1 1,9 2,1 0,2
DR-F1
100 mol/L
2 1,9 2 0,1
DR-F1
100 mol/L
3 2,2 2,4 0,2
DR-F1
100 mol/L
4 2 2,1 0,1
DR-F1 100 mol/L 5 1,9 2,1 0,2
78
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
DR-F1
100 mol/L
6 2,3 2,6 0,3
DR-F1
100 mol/L
7 2,5 2,7 0,2
DR-F1
100 mol/L
8 2 2,2 0,2
DR-F1
100 mol/L
9 2 2,2 0,2
DR-F1
100 mol/L
10 2,2 2,5 0,3
DR-F1
100 mol/L
11
DR-F1
100 mol/L
12 3 3,3 0,3
DR-F1
150 mol/L
1 2 2,1 0,1
DR-F1
150 mol/L
2 2 2,1 0,1
DR-F1
150 mol/L
3 1,7 1,8 0,1
DR-F1 150 mol/L 4 1,9 2 0,1
DR-F1
150 mol/L
5 2,3 2,4 0,1
DR-F1
150 mol/L
6 2 2,1 0,1
DR-F1
150 mol/L
7 2,4 2,6 0,2
DR-F1
150 mol/L
8 2,2 2,3 0,1
DR-F1
150 mol/L
9 2,5 2,6 0,1
DR-F1
150 mol/L
10 2,1 2,3 0,2
DR-F1
150 mol/L
11 2,3 2,5 0,2
DR-F1
150 mol/L
12 2 2,1 0,1
DR-F2 0 1 1,9 2,1 0,2
DR-F2 0 2 2,8 3,2 0,4
DR-F2 0 3 2,5 2,9 0,4
DR-F2 0 4 2 2,2 0,2
DR-F2 0 5 2 2,2 0,2
DR-F2 0 6 1,6 1,8 0,2
DR-F2 0 7 1,9 2,1 0,2
DR-F2 0 8 2,3 2,7 0,4
DR-F2 0 9 1,8 2,1 0,3
DR-F2 0 10 2,1 2,5 0,4
DR-F2 0 11 1,7 1,9 0,2
DR-F2 0 12 2 2,3 0,3
79
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
DR-F2
50 mol/L
1 2,4 2,7 0,3
DR-F2
50 mol/L
2 1,8 2 0,2
DR-F2
50 mol/L
3 1,9 2,1 0,2
DR-F2
50 mol/L
4 3 3,2 0,2
DR-F2
50 mol/L
5 1,8 1,9 0,1
DR-F2
50 mol/L
6 2 2,2 0,2
DR-F2
50 mol/L
7 2,2 2,5 0,3
DR-F2
50 mol/L
8 2,4 2,7 0,3
DR-F2
50 mol/L
9 2,1 2,4 0,3
DR-F2
50 mol/L
10 2,4 2,8 0,4
DR-F2 50 mol/L 11 2,2 2,4 0,2
DR-F2
50 mol/L
12 2,4 2,7 0,3
DR-F2
100 mol/L
1
DR-F2
100 mol/L
2 1,9 2,1 0,2
DR-F2
100 mol/L
3 2 2,2 0,2
DR-F2
100 mol/L
4 1,8 1,9 0,1
DR-F2
100 mol/L
5 2,2 2,4 0,2
DR-F2
100 mol/L
6 2 2,3 0,3
DR-F2
100 mol/L
7 2 2,2 0,2
DR-F2 100 mol/L 8 2,7 2,9 0,2
DR-F2
100 mol/L
9 1,9 2,1 0,2
DR-F2
100 mol/L
10 2,1 2,3 0,2
DR-F2
100 mol/L
11 2,5 2,7 0,2
DR-F2
100 mol/L
12 2,6 2,9 0,3
DR-F2
150 mol/L
1 1,8 1,9 0,1
DR-F2
150 mol/L
2 2 2,1 0,1
DR-F2
150 mol/L
3 2 2,2 0,2
DR-F2
150 mol/L
4 1,7 1,8 0,1
DR-F2
150 mol/L
5 2,4 2,6 0,2
DR-F2
150 mol/L
6 2 2,1 0,1
DR-F2 150 mol/L 7 2,4 2,5 0,1
80
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
DR-F2
150 mol/L
8 3 3,2 0,2
DR-F2
150 mol/L
9 2,3 2,4 0,1
DR-F2
150 mol/L
10 2,5 2,7 0,2
DR-F2
150 mol/L
11 1,8 1,9 0,1
DR-F2
150 mol/L
12 1,8 2 0,2
SG 0 1 2 2,3 0,3
SG 0 2 2,1 2,4 0,3
SG 0 3 1,9 2,1 0,2
SG 0 4 1,9 2,2 0,3
SG 0 5 2,3 2,7 0,4
SG 0 6 1,8 2,1 0,3
SG 0 7 2 2,3 0,3
SG 0 8 2,4 2,8 0,4
SG 0 9 2,6 3 0,4
SG 0 10 2 2,3 0,3
SG 0 11 2,3 2,7 0,4
SG 0 12 2 2,3 0,3
SG
50 mol/L
1 2,3 2,7 0,4
SG
50 mol/L
2 1,8 2 0,2
SG 50 mol/L 3 1,8 2,1 0,3
SG
50 mol/L
4 2,4 2,7 0,3
SG
50 mol/L
5 2,3 2,6 0,3
SG
50 mol/L
6 2,6 2,9 0,3
SG
50 mol/L
7 1,3 1,5 0,2
SG
50 mol/L
8 1,7 1,9 0,2
SG
50 mol/L
9 1,9 2,4 0,5
SG
50 mol/L
10 2 2,2 0,2
SG
50 mol/L
11 1,9 2,3 0,4
SG
50 mol/L
12 1,8 2 0,2
SG
100 mol/L
1 2,2 2,4 0,2
SG 100 mol/L 2 2 2,2 0,2
81
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
SG
100 mol/L
3 1,7 1,9 0,2
SG
100 mol/L
4 2,1 2,4 0,3
SG
100 mol/L
5 2,1 2,4 0,3
SG
100 mol/L
6 2 2,2 0,2
SG
100 mol/L
7 1,6 1,7 0,1
SG
100 mol/L
8 1,9 2 0,1
SG
100 mol/L
9 2,7 2,9 0,2
SG
100 mol/L
10 2,7 3 0,3
SG
100 mol/L
11 2,5 2,7 0,2
SG
100 mol/L
12 2 2,2 0,2
SG 150 mol/L 1 2 2,1 0,1
SG
150 mol/L
2 2,1 2,3 0,2
SG
150 mol/L
3 2,4 2,5 0,1
SG
150 mol/L
4
SG
150 mol/L
5 2,1 2,2 0,1
SG
150 mol/L
6 1,9 2 0,1
SG
150 mol/L
7 2,2 2,3 0,1
SG
150 mol/L
8 2,4 2,6 0,2
SG
150 mol/L
9 2,2 2,5 0,3
SG 150 mol/L 10 2 2,1 0,1
SG
150 mol/L
11 2,3 2,4 0,1
SG
150 mol/L
12 2,5 2,7 0,2
SG-F1 0 1 2 2,2 0,2
SG-F1 0 2 2 2,2 0,2
SG-F1 0 3 2,4 2,7 0,3
SG-F1 0 4 2,5 3 0,5
SG-F1 0 5 2,1 2,4 0,3
SG-F1 0 6 1,7 1,8 0,1
SG-F1 0 7 2,7 3,1 0,4
SG-F1 0 8 2,2 2,5 0,3
SG-F1 0 9 2 2,4 0,4
82
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L AlCl
3
)
REP CI CF CR
SG-F1 0 10 2,4 2,9 0,5
SG-F1 0 11 2 2,4 0,4
SG-F1 0 12 1,8 2 0,2
SG-F1
50 mol/L
1 2 2,4 0,4
SG-F1
50 mol/L
2 2,4 2,7 0,3
SG-F1
50 mol/L
3 2,2 2,6 0,4
SG-F1
50 mol/L
4 2,1 2,3 0,2
SG-F1
50 mol/L
5 2,3 2,7 0,4
SG-F1
50 mol/L
6 2 2,2 0,2
SG-F1
50 mol/L
7 2,4 2,7 0,3
SG-F1 50 mol/L 8 2,1 2,5 0,4
SG-F1
50 mol/L
9 1,9 2,1 0,2
SG-F1
50 mol/L
10 1,7 2 0,3
SG-F1
50 mol/L
11 2,1 2,5 0,4
SG-F1
50 mol/L
12 2,5 2,8 0,3
SG-F1
100 mol/L
1 1,9 2,1 0,2
SG-F1
100 mol/L
2 2,3 2,5 0,2
SG-F1
100 mol/L
3 2 2,2 0,2
SG-F1
100 mol/L
4 2,4 2,8 0,4
SG-F1 100 mol/L 5 2,5 2,7 0,2
SG-F1
100 mol/L
6 2,6 2,9 0,3
SG-F1
100 mol/L
7 2,7 3,1 0,4
SG-F1
100 mol/L
8 2,1 2,4 0,3
SG-F1
100 mol/L
9 2,1 2,3 0,2
SG-F1
100 mol/L
10 1,8 2,1 0,3
SG-F1
100 mol/L
11 2 2,2 0,2
SG-F1
100 mol/L
12 2,1 2,4 0,3
SG-F1
150 mol/L
1 2,2 2,4 0,2
SG-F1
150 mol/L
2 2,1 2,3 0,2
SG-F1
150 mol/L
3 2,2 2,4 0,2
SG-F1 150 mol/L 4 2,5 2,8 0,3
83
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L AlCl
3
)
REP CI CF CR
SG-F1
150 mol/L
5 2,2 2,3 0,1
SG-F1
150 mol/L
6 2 2,2 0,2
SG-F1
150 mol/L
7 2,4 2,5 0,1
SG-F1
150 mol/L
8 1,8 1,9 0,1
SG-F1
150 mol/L
9 2,3 2,5 0,2
SG-F1
150 mol/L
10 2,2 2,3 0,1
SG-F1
150 mol/L
11 2,3 2,4 0,1
SG-F1
150 mol/L
12 2,4 2,6 0,2
SG-F2 0 1 1,5 1,7 0,2
SG-F2 0 2 2,6 3 0,4
SG-F2 0 3 2 2,3 0,3
SG-F2 0 4 1,7 2 0,3
SG-F2 0 5 2,2 2,5 0,3
SG-F2 0 6 1,5 1,8 0,3
SG-F2 0 7 1,8 2,1 0,3
SG-F2 0 8 3 3,4 0,4
SG-F2 0 9 2,1 2,4 0,3
SG-F2 0 10 2,8 3,2 0,4
SG-F2 0 11 1,6 2 0,4
SG-F2 0 12 2,5 3 0,5
SG-F2
50 mol/L
1 2,4 2,8 0,4
SG-F2
50 mol/L
2 2,4 2,7 0,3
SG-F2
50 mol/L
3 1,8 2,1 0,3
SG-F2
50 mol/L
4 2,2 2,5 0,3
SG-F2
50 mol/L
5 2,9 3,2 0,3
SG-F2
50 mol/L
6 2,2 2,5 0,3
SG-F2
50 mol/L
7 2,2 2,5 0,3
SG-F2
50 mol/L
8 2,3 2,6 0,3
SG-F2
50 mol/L
9 2,7 3 0,3
SG-F2
50 mol/L
10 2,2 2,5 0,3
SG-F2 50 mol/L 11 1,8 2,1 0,3
84
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
SG-F2
50 mol/L
12 2,3 2,6 0,3
SG-F2
100 mol/L
1 2,5 2,9 0,4
SG-F2
100 mol/L
2 1,8 2 0,2
SG-F2
100 mol/L
3 2,1 2,3 0,2
SG-F2
100 mol/L
4 2 2,2 0,2
SG-F2
100 mol/L
5 2,2 2,5 0,3
SG-F2
100 mol/L
6 1,9 2,1 0,2
SG-F2
100 mol/L
7 2,8 3,2 0,4
SG-F2
100 mol/L
8 2,7 3 0,3
SG-F2
100 mol/L
9 2,3 2,6 0,3
SG-F2 100 mol/L 10 2,3 2,5 0,2
SG-F2
100 mol/L
11 2,1 2,4 0,3
SG-F2
100 mol/L
12 2,3 2,6 0,3
SG-F2
150 mol/L
1 2,3 2,6 0,3
SG-F2
150 mol/L
2 2 2,1 0,1
SG-F2
150 mol/L
3 1,8 2 0,2
SG-F2
150 mol/L
4 2 2,1 0,1
SG-F2
150 mol/L
5 2,6 2,9 0,3
SG-F2
150 mol/L
6 2 2,1 0,1
SG-F2 150 mol/L 7 2,3 2,5 0,2
SG-F2
150 mol/L
8 2,5 2,7 0,2
SG-F2
150 mol/L
9 2 2,1 0,1
SG-F2
150 mol/L
10 2,2 2,4 0,2
SG-F2
150 mol/L
11 2,2 2,4 0,2
SG-F2
150 mol/L
12 2 2,2 0,2
UF 0 1 2,2 2,6 0,4
UF 0 2
UF 0 3 2 2,3 0,3
UF 0 4 2,5 3,1 0,6
UF 0 5 2,1 2,3 0,2
UF 0 6 2,2 2,6 0,4
85
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
UF 0 7 1,8 2 0,2
UF 0 8 2,1 2,4 0,3
UF 0 9 2,1 2,4 0,3
UF 0 10 2,2 2,6 0,4
UF 0 11 2,4 2,8 0,4
UF 0 12 2,1 2,4 0,3
UF
50 mol/L
1 1,8 2,1 0,3
UF
50 mol/L
2 2,6 3 0,4
UF
50 mol/L
3 2,6 2,9 0,3
UF
50 mol/L
4 2 2,3 0,3
UF 50 mol/L 5 2,6 3 0,4
UF
50 mol/L
6 2 2,2 0,2
UF
50 mol/L
7 1,8 2,1 0,3
UF
50 mol/L
8 1,6 1,8 0,2
UF
50 mol/L
9 2,1 2,3 0,2
UF
50 mol/L
10 1,9 2,2 0,3
UF
50 mol/L
11 2,1 2,3 0,2
UF
50 mol/L
12 2,3 2,7 0,4
UF
100 mol/L
1 2,1 2,3 0,2
UF 100 mol/L 2 2 2,2 0,2
UF
100 mol/L
3 2 2,2 0,2
UF
100 mol/L
4 1,9 2,1 0,2
UF
100 mol/L
5 2,3 2,5 0,2
UF
100 mol/L
6 2,1 2,4 0,3
UF
100 mol/L
7 2,1 2,3 0,2
UF
100 mol/L
8 2,1 2,5 0,4
UF
100 mol/L
9 1,9 2,1 0,2
UF
100 mol/L
10 2 2,3 0,3
UF
100 mol/L
11 2,2 2,4 0,2
UF
100 mol/L
12 2,4 2,7 0,3
UF 150 mol/L 1 2,2 2,3 0,1
86
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
UF
150 mol/L
2 2 2,1 0,1
UF
150 mol/L
3 2,2 2,4 0,2
UF
150 mol/L
4 2 2,1 0,1
UF
150 mol/L
5 2,2 2,4 0,2
UF
150 mol/L
6 1,9 2 0,1
UF
150 mol/L
7 2 2,1 0,1
UF
150 mol/L
8 2,3 2,5 0,2
UF
150 mol/L
9 2 2,1 0,1
UF
150 mol/L
10 2,3 2,4 0,1
UF
150 mol/L
11 2,4 2,7 0,3
UF 150 mol/L 12 2,1 2,3 0,2
UF-F1 0 1 2 2,4 0,4
UF-F1 0 2 2,4 2,8 0,4
UF-F1 0 3 2,6 3 0,4
UF-F1 0 4 3,1 3,6 0,5
UF-F1 0 5 2,9 3,2 0,3
UF-F1 0 6 2,1 2,3 0,2
UF-F1 0 7 2,8 3,3 0,5
UF-F1 0 8 1,8 2 0,2
UF-F1 0 9 2,3 2,5 0,2
UF-F1 0 10 1,8 2 0,2
UF-F1 0 11 1,6 1,8 0,2
UF-F1 0 12 2,2 2,5 0,3
UF-F1
50 mol/L
1 2,2 2,7 0,5
UF-F1
50 mol/L
2 2,8 3,1 0,3
UF-F1
50 mol/L
3 2,7 3 0,3
UF-F1
50 mol/L
4 2,4 2,9 0,5
UF-F1
50 mol/L
5 2,2 2,4 0,2
UF-F1
50 mol/L
6 2 2,2 0,2
UF-F1
50 mol/L
7 1,8 1,9 0,1
UF-F1 50 mol/L 8 2,6 3 0,4
87
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
UF-F1
50 mol/L
9 2,4 2,8 0,4
UF-F1
50 mol/L
10 1,8 2 0,2
UF-F1
50 mol/L
11 2,7 2,9 0,2
UF-F1
50 mol/L
12 2,2 2,5 0,3
UF-F1
100 mol/L
1 2,3 2,5 0,2
UF-F1
100 mol/L
2 2,3 2,6 0,3
UF-F1
100 mol/L
3 1,8 2 0,2
UF-F1
100 mol/L
4 2,1 2,4 0,3
UF-F1
100 mol/L
5 1,7 1,9 0,2
UF-F1
100 mol/L
6 2,7 2,9 0,2
UF-F1 100 mol/L 7 2,2 2,4 0,2
UF-F1
100 mol/L
8 2,5 3 0,5
UF-F1
100 mol/L
9 3 3,3 0,3
UF-F1
100 mol/L
10 2,7 3 0,3
UF-F1
100 mol/L
11 3,1 3,5 0,4
UF-F1
100 mol/L
12 2 2,3 0,3
UF-F1
150 mol/L
1 2 2,1 0,1
UF-F1
150 mol/L
2 2,2 2,3 0,1
UF-F1
150 mol/L
3 2,6 2,8 0,2
UF-F1 150 mol/L 4 2,2 2,4 0,2
UF-F1
150 mol/L
5 2,6 2,7 0,1
UF-F1
150 mol/L
6 2 2,1 0,1
UF-F1
150 mol/L
7 2,2 2,4 0,2
UF-F1
150 mol/L
8 2,8 3 0,2
UF-F1
150 mol/L
9 2,7 2,9 0,2
UF-F1
150 mol/L
10 2,8 3,1 0,3
UF-F1
150 mol/L
11 2,6 2,8 0,2
UF-F1
150 mol/L
12 1,8 1,9 0,1
UF-F2 0 1 2,3 2,6 0,3
UF-F2 0 2 1,6 1,9 0,3
UF-F2 0 3 2,1 2,4 0,3
88
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
UF-F2 0 4 1,8 2 0,2
UF-F2 0 5 2,7 3,3 0,6
UF-F2 0 6 2,3 2,7 0,4
UF-F2 0 7 2,2 2,5 0,3
UF-F2 0 8 2,8 3,2 0,4
UF-F2 0 9 2,5 2,9 0,4
UF-F2 0 10 2,3 2,7 0,4
UF-F2 0 11 1,7 2 0,3
UF-F2 0 12 3 3,4 0,4
UF-F2
50 mol/L
1 2,3 2,6 0,3
UF-F2 50 mol/L 2 2,9 3,2 0,3
UF-F2
50 mol/L
3 2,1 2,5 0,4
UF-F2
50 mol/L
4 2,7 3,1 0,4
UF-F2
50 mol/L
5 2,2 2,5 0,3
UF-F2
50 mol/L
6 2,9 3,4 0,5
UF-F2
50 mol/L
7 2,9 3,2 0,3
UF-F2
50 mol/L
8 2,1 2,5 0,4
UF-F2
50 mol/L
9 2,1 2,4 0,3
UF-F2
50 mol/L
10 2 2,2 0,2
UF-F2 50 mol/L 11 2 2,3 0,3
UF-F2
50 mol/L
12 2,1 2,5 0,4
UF-F2
100 mol/L
1 2,1 2,3 0,2
UF-F2
100 mol/L
2 2,4 2,6 0,2
UF-F2
100 mol/L
3 2,5 2,9 0,4
UF-F2
100 mol/L
4 1,9 2,2 0,3
UF-F2
100 mol/L
5 2,7 3 0,3
UF-F2
100 mol/L
6 2 2,3 0,3
UF-F2
100 mol/L
7 2,3 2,5 0,2
UF-F2
100 mol/L
8 2,3 2,5 0,2
UF-F2
100 mol/L
9 2,7 3 0,3
UF-F2 100 mol/L 10 2,8 3,3 0,5
89
Apêndice 1. Continuação... Valores obtidos nas variáveis observadas durante a
avaliação da tolerância ao alumínio dos genótipos de cornichão
(Janeiro/2009).
GENÓTIPO
TRAT (mol/L
AlCl
3
)
REP CI CF CR
UF-F2
100 mol/L
11 2,2 2,5 0,3
UF-F2
100 mol/L
12 2,6 2,9 0,3
UF-F2
150 mol/L
1 2,2 2,5 0,3
UF-F2
150 mol/L
2 2,2 2,4 0,2
UF-F2
150 mol/L
3 2 2,2 0,2
UF-F2
150 mol/L
4 2,1 2,2 0,1
UF-F2
150 mol/L
5 2,6 2,9 0,3
UF-F2
150 mol/L
6 1,9 2 0,1
UF-F2
150 mol/L
7 3,3 3,6 0,3
UF-F2
150 mol/L
8 2 2,1 0,1
UF-F2 150 mol/L 9 2,8 3 0,2
UF-F2
150 mol/L
10 2,5 2,7 0,2
UF-F2
150 mol/L
11 2,3 2,5 0,2
UF-F2
150 mol/L
12 2 2,2 0,2
90
Apêndice 2. Resumo da análise de variância referente ao comprimento
radicular inicial dos genótipos de cornichão.
Variável dependente: comprimento radicular inicial (CI)
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 39 6.87232495 0.17621346 1.66 0.0091
Error 430 45.63790909 0.10613467
Corrected Total 469 52.51023404
R-Square Coeff Var Root MSE CI Mean
0.130876 14.88462 0.325783 2.188723
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
Genótipo 9 5.44166167 0.60462907 5.70 <.0001 **
Nível 3 0.28424715 0.09474905 0.89 0.4448
Genótipo*Nível 27 1.09595526 0.04059094 0.38 0.9982
Tests of Hypotheses Using the Type III MS for Genótipo*Nível as an Error Term
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
Genótipo 9 5.44166167 0.60462907 14.90 <.0001
Nível 3 0.28424715 0.09474905 2.33 0.0963
Duncan's Multiple Range Test for CI
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 430
Error Mean Square 0.106135
Harmonic Mean of Cell Sizes 46.9545
Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Critical Range .1322 .1391 .1438 .1472 .1499 .1521 .1539 .1555 .1569
Duncan Grouping Mean N Genótipo
A 2.34651 43 ALF
A 2.33958 48 UF-F1
A 2.33333 48 UF-F2
B 2.20000 48 SG-F2
B 2.17917 48 SG-F1
C B 2.14043 47 DR-F2
C B 2.12340 47 UF
C B 2.11277 47 DR-F1
C B 2.10000 47 SG
C 2.01915 47 DR
Duncan's Multiple Range Test for CI
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 430
Error Mean Square 0.106135
Harmonic Mean of Cell Sizes 117.4811
Number of Means 2 3 4
Critical Range .08355 .08796 .09090
Duncan Grouping Mean N Nível
A 2.21810 116 100
A 2.20427 117 150
A 2.17750 120 50
A 2.15556 117 0
91
Apêndice 3. Resumo da análise de variância referente ao comprimento
radicular final dos genótipos de cornichão.
Variável dependente: comprimento radicular final (CF)
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 39 10.99024790 0.28180123 2.04 0.0004
Error 430 59.45156061 0.13825944
Corrected Total 469 70.44180851
R-Square Coeff Var Root MSE CF Mean
0.156019 15.24303 0.371833 2.439362
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
Genótipo 9 7.66423664 0.85158185 6.16 <.0001**
Nível 3 1.19519929 0.39839976 2.88 0.0356*
Genótipo*Nível 27 2.05876557 0.07625058 0.55 0.9686
Tests of Hypotheses Using the Type III MS for Genótipo*Nível as an Error Term
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
Genótipo 9 7.66423664 0.85158185 11.17 <.0001
Nível 3 1.19519929 0.39839976 5.22 0.0056
Duncan's Multiple Range Test for CF
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 430
Error Mean Square 0.138259
Harmonic Mean of Cell Sizes 46.9545
Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Critical Range .1508 .1588 .1641 .1680 .1711 .1736 .1757 .1775 .1790
Duncan Grouping Mean N Genotipo
A 2.63125 48 UF-F2
B A 2.60625 48 UF-F1
B A 2.59535 43 ALF
B A C 2.47708 48 SG-F2
B C 2.44583 48 SG-F1
D C 2.37872 47 UF
D C 2.36170 47 DR-F2
D C 2.34468 47 SG
D C 2.33191 47 DR-F1
D 2.22553 47 DR
Duncan's Multiple Range Test for CF
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 430
Error Mean Square 0.138259
Harmonic Mean of Cell Sizes 117.4811
Number of Means 2 3 4
Critical Range .0954 .1004 .1038
Duncan Grouping Mean N Nível
A 2.49231 117 0
B A 2.45500 120 50
B A 2.45345 116 100
B 2.35641 117 150
92
Apêndice 4. Resumo da análise de variância referente ao crescimento radicular
dos genótipos de cornichão.
Variável dependente: crescimento radicular (CR)
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 39 2.96234598 0.07595759 12.15 <.0001
Error 431 2.69489394 0.00625265
Corrected Total 470 5.65723992
R-Square Coeff Var Root MSE CR Mean
0.523638 31.53575 0.079074 0.250743
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
Genótipo 9 0.36163594 0.04018177 6.43 <.0001
Nível 3 2.13175313 0.71058438 113.65 <.0001
Genótipo*Nível 7 0.48273229 0.01787897 2.86 <.0001**
Tests of Hypotheses Using the Type III MS for Genótipo*Nível as an Error Term
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
Genótipo 9 0.36163594 0.04018177 2.25 0.0502
Nível 3 2.13175313 0.71058438 39.74 <.0001
Duncan's Multiple Range Test for CR
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 431
Error Mean Square 0.006253
Harmonic Mean of Cell Sizes 47.07132
Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Critical Range .03204 .03373 .03486 .03569 .03634 .03688 .03732 .03770 .03803
Duncan Grouping Mean N Genotipo
A 0.29792 48 UF-
F2
B A 0.27708 48 SG-
F2
B A 0.26667 48 UF-
F1
B A 0.26667 48 SG-F1
B C 0.25532 47 UF
B C 0.25455 44 ALF
B C D 0.24468 47 SG
E C D 0.22128 47 DR-
F2
E D 0.21915 47 DR-
F1
E 0.20213 47 DR
Duncan's Multiple Range Test for DC
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 431
Error Mean Square 0.006253
Harmonic Mean of Cell Sizes 117.7315
Number of Means 2 3 4
Critical Range .02026 .02133 .02204
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N Nível
A 0.33644 118 0
B 0.27750 120 50
C 0.23534 116 100
D 0.15214 117 150
8. VITA
Aline Janke, filha de Rubert Janke e Nair Janke, nasceu em dois de
abril de 1982 no município de Esteio – RS. Concluiu o ensino fundamental na
Escola Municipal Arthur Pereira de Vargas e o ensino médio no Centro
Educacional La Salle, ambos em Canoas – RS.
Ingressou na Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul em 2001, graduando-se como Engenheira Agrônoma em
2006. Neste período, atuou como bolsista de iniciação científica nas áreas de
fitotecnia, agrometeorologia e produção e tecnologia de sementes.
Em março de 2007, iniciou o Mestrado em Zootecnia, Área de
Concentração Plantas Forrageiras, no Programa de Pós-graduação da
Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
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