( PDF ) Alterações morfológicas, apoptose e expressão de metaloproteinases no tecido laminar de eqüinos submetidos a obstrução intestinal experimental. Efeitos da hidrocortisona

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS, APOPTOSE E

EXPRESSÃO DE METALOPROTEINASES NO TECIDO

LAMINAR DE EQUINOS SUBMETIDOS À OBSTRUÇÃO

INTESTINAL EXPERIMENTAL. EFEITOS DA

HIDROCORTISONA

Luciane Maria Laskoski

Médica Veterinária

JABOTICABAL- SP

2009

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS, APOPTOSE E

EXPRESSÃO DE METALOPROTEINASES NO TECIDO

LAMINAR DE EQUINOS SUBMETIDOS À OBSTRUÇÃO

INTESTINAL EXPERIMENTAL. EFEITOS DA

HIDROCORTISONA

Luciane Maria Laskoski

Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Araújo Valadão

Co-orientadora: Profa. Dra. Rosemeri de Oliveira Vasconcelos

JABOTICABAL- SP

2009

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias – Unesp, Campus de

Jaboticabal, como parte das exigências para a

obtenção do título de Mestre em Cirurgia Veterinária

junto ao programa de Pós-graduação em Cirurgia

Veterinária.

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DADOS CURRICULARES DO AUTOR

LUCIANE MARIA LASKOSKI – nasceu na cidade de Curitiba, PR, no dia

18 de abril de 1981, filha de João Laskoski e Leonor Madalena Laskoski. Em

janeiro de 2005, graduou-se em Medicina Veterinária pela Universidade Federal

do Paraná, Campus de Curitiba. Participou como aprimoranda do Programa de

Aprimoramento (Residência) em Medicina Veterinária na área de Clínica Médica

de Grandes Animais, nos anos de 2005 e 2006, na Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista Júlio de

Mesquita Filho, Unesp, câmpus de Jaboticabal, e, em março de 2007, ingressou

no Programa de Pós-graduação em Cirurgia Veterinária, no curso de Mestrado.

"Existem apenas duas maneiras de ver a vida. Uma é pensar que não

existem milagres e a outra é pensar que tudo é um milagre."

Albert Einstein

iii

A todos os eqüinos que já passaram pela minha vida, sobretudo os animais

utilizados neste estudo.

Ao meu irmãozinho Tiago (in memorian), que sempre cultivou o verdadeiro

amor aos cavalos. Agradeço a Deus, por todos os anos, meses e horas que viveu

conosco. Todas as minhas conquistas são também suas conquistas.

Dedico

Aos meus tesouros

Meu pai, João Laskoski, exemplo extraordinário de ser humano, dotado de

imensa capacidade de amar ao próximo, em quem procuro me espelhar todos os

dias. Agradeço a Deus por todos os momentos que me permite desfrutar de sua

presença!

À minha mãe, Leonor Madalena Laskoski, que sempre se dedicou a todos

com muito amor e carinho. E mesmo em meio a obstáculos, por vezes tão

dolorosos, não se deixou abater, sendo a rocha sólida que une a nossa família.

Às minhas queridas irmãzinhas, Renata e Lorena, que muito mais que

irmãs, são minhas melhores amigas, a quem tudo confio. Não são apenas os

laços de sangue que nos unem...somos irmãs de alma!

Ofereço

AGRADECIMENTOS

À Deus, que sempre esteve ao meu lado, não permitindo que eu duvidasse

um segundo sequer sobre sua existência, mesmo nos momentos mais difíceis e

dolorosos dessa caminhada, chamada vida.

Ao prof. Dr. Carlos Augusto Araújo Valadão, profissional a quem já

admirava antes de conhecer, por ter me aceitado como sua orientada, propiciando

conhecimento ímpar durante o mestrado. Com o senhor aprendi que os sonhos

são importantes para guiar nossos passos em direção ao futuro, mas que não se

deve desprezar as várias etapas, e concluí-las da melhor forma possível. E agora,

como não haveria de ser, pelo senhor sinto um profundo respeito e carinho, por

tudo o que tem feito em relação a mim.

À prof

Rosemeri de Oliveira Vasconcelos, pela co-orientação de grande

importância durante a realização deste trabalho, me inserindo no mundo

“tenebroso” da imunohistoquimica. Co-orientação esta que me possibilitou

conviver com a pessoa querida Rosemeri, sempre disposta a ajudar a todos que

lhe procuram com extrema amabilidade.

Ao pessoal do Laboratório de Imunologia Aplicada da Prof

. Dagmar

Machado, da UNICAMP, especialmente à Juliete e Danilo, pela pronta solicitação

que foi fundamental para os resultados finais deste estudo.

Aos funcionários do Departamento de Patologia Veterinária, Téo, Edgar,

Lia, Francisca e Ronaldo, que foram de extrema importância para a execução

experimental, auxiliando nas coletas do material, preparação das lâminas e

armazenagem das amostras A dedicação, boa vontade e amizade de todos vocês

foi muito importante para o desenrolar deste estudo.

À Adriana Helena de Souza, que me orientou, com muita propriedade, a dar

os passos iniciais na pesquisa com laminite.

À Nathalia dos Santos Costa, e também a seu orientador Prof. José

Jurandir Fagliari, pelo trabalho em parceria que possibilitou a execução deste

trabalho.

Ao prof. Dr. Antônio Carlos Alessi, pela utilização de seu laboratório e

contribuições inteligentes e construtivas sobre este trabalho. Saiba que lhe admiro

e estimo pela pessoa diferenciada que é, como profissional ético e dotado de

conhecimento, e pessoa querida e agradável. Poder trabalhar junto ao senhor foi

uma oportunidade única que este trabalho me proporcionou.

Ao prof. Dr. José Corrêa de Lacerda Neto, pelas valorosas contribuições a

esse trabalho. Aproveito para destacar, que agradeço não apenas pelo momento

atual, mas principalmente por todo o aprendizado que tive graças aos seus

ensinamentos durante a residência, e mesmo durante o mestrado. Pelo senhor

tenho, além de admiração, um carinho sincero.

Ao colega Alexandre Pinto Ribeiro, pela boa vontade em cooperar, sendo

de fundamental importância para que as análises zimográficas pudessem ser

realizadas

À funcionária da reprodução, Roberta, pela boa vontade em me ajudar com

o congelamento das amostras.

vii

À Ana Carolina Trompieri, pela pronta colaboração com a técnica de

imunohistoquímica e amizade durante todo o tempo de realização da IHQ.

À Geórgia Mode, por toda a doçura e boa vontade em me ajudar com a

leitura das lâminas.

Ao prof. Dr. Rafael Resende Faleiros, pelas valiosas trocas de informações

que resultaram neste trabalho. Profissional a quem admiro, pelo imenso

conhecimento e simplicidade.

À prof

Renee Laufer Amorim, da Faculdade de Medicina Veterinária e

Zootecnia, Unesp – Botucatu, por toda a ajuda durante a padronização da

imunohistoquímica para caspase 3.

Ao amigo Marsel de Carvalho, pela fundamental ajuda na colheita de

material no abatedouro de eqüinos, e por todo o companheirismo durante o tempo

de mestrado.

À querida amiga Andréa Uribe, grande companheira nestes dois anos de

mestrado. Pude contar com sua ajuda durante a coleta de casco dos animais

controle e inúmeras outras atividades, de boa vontade e entusiasmo. Obrigada por

todo o carinho e palavras sempre ditas no momento exato. Você é muito especial

para mim.

Ao Dr. Philip Johnson, contribuindo com conhecimento ímpar a respeito de

diversos aspectos nesse trabalho, sempre com extrema amabilidade e atenção.

viii

À Rodrigo Norberto Pereira, pelo companheirismo durante o período

experimental, muito importante para superar todas as dificuldades que se

apresentaram

Ao funcionário Cláudio, responsável pelo transporte da Unesp, pela boa

vontade em ajudar com todas as atividades que dependiam de sua colaboração.

À Fapesp, pelo apoio financeiro com a bolsa de mestrado e auxílio

pesquisa, sem os quais seria impossível desenvolver este estudo.

Aos professores José Jurandir Fagliari, Mario Roberto Hatayde, Luis Carlos

Marques e Luis Fernando O. S. Carvalho pelo período de grandes ensinamentos

durante a residência. Agradeço também aos professores José Wanderley

Cattelan, Delphim da Graça Macoris, José Antônio Marques e Júlio Carlos Canola

pelas contribuições importantes no mesmo período.

Às funcionárias da Pós-graduação, em especial a Karina, Márcia e Bel por

toda a ajuda e boa vontade em colaborar com os trâmites burocráticos.

Aos funcionários do HV, Edson, Zé Buzoli, Carlão, José, Bertanha, Carlos,

Arildo, Arnildo e Laerte por toda a ajuda e amizade durante a residência e em

vários momentos durante o mestrado. Agradeço muito também as queridas

funcionárias da diretoria, Sirlene e Dalva, pela boa vontade em me ajudar em tudo

o que pudessem. À Shizuko e Aléscio, por todos os auxílios burocráticos

prestados. Agradeço aos demais, Ana, Izilda, Márcia, Luiza, Flávia, Lígia, Miguel,

Lidiane, pelo convívio tranqüilo e prazeroso durante todo esse tempo. E, de modo

especial, ao Eugênio, pela paciência e disposição para fotografar os cortes

histológicos.

Às queridas amigas que fiz em Jaboticabal: Fernanda Perez Medeiros,

Thaís Gomes Rocha e Larissa Gabriela Ávila, que durante um ano de intensa

convivência tornaram minha vida em Jaboticabal muito mais leve e feliz. À Dunia

Trujillo, minha amiga colombiana, companheira dos meses finais do mestrado. À

Julia Eumira, que mesmo encontrando poucas vezes, compartilhamos uma

amizade rara. À Sabrina Santos Costa, amiga desde os tempos de estágio, de

coragem e determinação contagiantes. Todas mulheres guerreiras, honestas e

verdadeiras, vocês são os meus presentes de Deus em Jaboticabal.

À amiga Marina Mendes, pela amizade espontânea. O seu jeito de ser,

determinado, e seu amor aos animais, me servem de exemplo.

Às minhas amigas, Camila Gomes, Márcia Albuquerque e Anabella Mira,

amizades que o tempo não apaga e a distância não diminui. Sempre presentes em

todos os grandes momentos da minha vida, sejam eles alegres ou tristes.

Deixo aqui também registradas, algumas palavras que a emoção não

permitiu dizer pessoalmente...o agradecimento especial à meus pais e minhas

irmãs. À vocês, que foram a rocha forte que sustentou toda a minha caminhada

em busca de meus sonhos, com a certeza, como vocês mesmos falaram, que se

algo desse errado estariam sempre esperando por mim. Por vocês levanto a cada

tropeço da vida, e é para vocês que ofereço todas as conquistas de meu esforço.

Tenho muito orgulho de nossa origem e nossa história. Nesta família aprendi o

sentido da palavra amor.

E a todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a

realização deste trabalho.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................. xii

LISTA DE TABELAS.............................................................................. xiii

LISTA DE FIGURAS.............................................................................. xiv

RESUMO................................................................................................

xvi

ABSTRACT............................................................................................ xvii

1. INTRODUÇÃO .................................................................................. 1

2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................. 2

3. OBJETIVOS....................................................................................... 11

4. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................

4.1 Animais......................................................................................... 11

4.1.1 Animais Controle Normais (Gc)............................................ 11

4.1.2 Animais Submetidos a Procedimento Cirúrgico (Gi, Gt e

Gnt).........................................................................................

4.2 Delineamento Experimental.......................................................... 12

4.2.1 Distribuição dos grupos........................................................ 13

4.2.2 Extração do tecido laminar................................................. 14

4.3 Análise em Microscopia de Luz.................................................... 14

4.4 Análise Imunohistoquímica (IHQ) para Detecção de Caspase 3

e 4 e Metaloproteinases (MMPs) 2 e 9................................................

4.5 Análise Zimográfica das MMPs 2 e 9............................................

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................... 18

6. RESULTADOS................................................................................... 18

6.1 Presença de Lesões Histológicas no Córium laminar...................

6.2 Imunomarcação para Caspase 3 e 14.......................................... 23

6.3 Intensidade de Imunomarcação para MMP-2............................... 26

6.4 Intensidade de Imunomarcação para MMP-9............................... 28

6.5 Relação de Dependência entre os Escores de Alteração

Morfológica e Intensidade de Imunomarcação para MMP-2 e MMP-

9....................................................................................................

6.6 Expressão de MMPs 2 e 9 por Meio da Técnica de Zimografia... 31

7. DISCUSSÃO...................................................................................... 34

8. CONCLUSÕES.................................................................................. 43

9. REFERÊNCIAS..................................................................................

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

BSA: soro albumina bovino

CaCl:cloreto de cálcio

CB: célula basal

DAB: diaminobenzidina

DNA: ácido desoxirribonucléico

Gc: grupo controle

Gi: grupo instrumentado

Gnt: grupo não tratado

Gt: grupo tratado

HE: hematoxilina e eosina

HCl: ácido clorídrico

IHQ: imunohistoquímica

kDa: kilodaltons

LDP: lâmina dérmica primária

LDS:lâmina dérmica secundária

LEP: lâmina epidérmica primária

LES: lâmina epidérmica secundária

Log: logarítmo

MB: membrana basal

mmHg: milímetros de mercúrio

mM: milimols

MMPs: metaloproteinases

MMP-2: metaloproteinase 2

MMP-2 L+I: metaloproteinase 2 latente mais intermediária

MMP-9: metaloproteinase 9

NaCl: cloreto de sódio

NGAL: lipocalina associada a gelatinase de neutrófilos

PAS: ácido periódico de Schiff

PBS: solução tampão de fosfato

ROS: espécies reativas de oxigênio

SOD: superóxido dismutase

TIMP: inibidor tecidual de metaloproteinase

TNF-α: fator de necrose tumoral α

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela

Página

Distribuição dos grupos de acordo com o procedimento

realizado.....................................................................................

Escores de alterações morfológicas do córium laminar dos

eqüinos dos grupos experimentais (baseado em POLLITT,

1996)..........................................................................................

Anticorpos utilizados para imunomarcação no tecido

laminar........................................................................................

Medianas dos escores de alterações do tecido laminar

observados nos grupos controle e experimentais (Gi, Gt e

Gnt), com intervalos interquartis entre parêntesis. Colunas

marcadas pela mesma letra não diferem entre si......................

Médias e desvios padrão do número de células apoptóticas

entre os grupos controle e experimentais (Gi, Gt e Gnt).

Colunas marcadas pela mesma letra não diferem entre

si.................................................................................................

Medianas da intensidade de imunomarcação para MMP- 2

entre os grupos controle e experimentais (Gi, Gt e Gnt), com

intervalos interquartis entre parêntesis. Colunas marcadas

pela mesma letra não diferem entre si.......................................

Medianas da intensidade de imunomarcação para MMP- 9

entre os grupos controle e experimentais (Gi, Gt e Gnt), com

intervalos interquartis entre parêntesis. Colunas marcadas

pela mesma letra não diferem entre si.......................................

Valor de significância estatística entre os escores de alteração

morfológica, MMP-2 e MMP-9, por meio do teste de Fisher......

Médias e coeficiente de variabilidade das enzimas MMP-2 e

MMP-9 entre os grupos experimentais (p<0,05), em 10

pixels..........................................................................................

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura

Página

Fotomicrografias do tecido laminar eqüino. Características

morfológicas dos escores zero e 1...............................................

Fotomicrografias de tecido laminar eqüino. Características

morfológicas dos escores 1 e 1,5.................................................

Fotomicrografias do tecido laminar eqüino. Características

morfológicas da MB nos escores zero e 1,5.................................

Medianas e intervalos interquartis dos escores das alterações

morfológicas do tecido laminar observadas nos grupos controle

e experimentais (Gi, Gt e Gnt).Colunas marcadas pela mesma

letra não diferem entre si...............................................................

Imunohistoquímica para caspase 3 e 14. Fotomicrografias do

tecido laminar equino (A, C, D, F); fotomicrografia de linfonodo

equino (B) e fotomicrografia de pele eqüina

(E)..................................................................................................

Médias e desvios padrão do número de células apoptóticas dos

grupos controle e experimentais (Gi, Gt e Gnt). Colunas

marcadas pela mesma letra não diferem entre si.........................

Imunohistoquímica para MMP-2. Fotomicrografia do tecido

laminar equino (A, B, C, D e F). Fotomicrografia de tecido

mamário de cadela

(E)..................................................................................................

Medianas e intervalos interquartis dos escores para a

Intensidade de imunomarcação para MMP-2 dos grupos

controle e experimentais (Gi, Gt e Gnt). Colunas marcadas pela

mesma letra não diferem entre

si....................................................................................................

Imunohistoquímica para MMP-9. Fotomicrografia do tecido

laminar equino (A, B, C) e fotomicrografia de tecido mamário de

cadela (E)......................................................................................

Medianas e intervalos interquartis das Intensidade de

imunomarcação para MMP-9 dos grupos controle e

experimentais (Gi, Gt e Gnt). Colunas marcadas pela mesma

letra não diferem entre si...............................................................

Ilustração fotográfica da atividade enzimática das MMPs,

registrada em gel de poliacrilamida. Nota-se que a apenas os

grupos Gi, Gnt e Gt possuem a banda formada pela substância

MMP-9 conjugada ao NGAL (C_MM)-9/NAGL)...........................

Densitometria de bandas para a enzima MMP-2,nas formas

ativa (MMP-2A) e latente +intermediária (MMP-2L+I), entre os

grupos controle e experimentais, e respectivo desvio padrão.

Colunas marcadas pela mesma letra não diferem entre si...........

Densitometria de bandas para a enzima MMP-9, nas formas

ativa (MMP-9A) e latente (MMP-9L), entre os grupos controle e

experimentais, e respectivo desvio padrão. Colunas marcadas

pela mesma letra não diferem entre si..........................................

Densitometria de bandas para o complexo MMP-9/NGAL

(C_MMP-9/NGAL) entre os grupos controle e experimentais, e

respectivo desvio padrão. Colunas marcadas pela mesma letra

não diferem entre si.......................................................................

xvi

ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS, APOPTOSE E EXPRESSÃO DE

METALOPROTEINASES NO TECIDO LAMINAR DE EQÜINOS SUBMETIDOS A

OBSTRUÇÃO INTESTINAL EXPERIMENTAL. EFEITOS DA HIDROCORTISONA

RESUMO: A laminite está associada a ativação inflamatória sistêmica, a qual

ocorre em diversas afecções, principalmente as gastrointestinais. Sua patogenia

está relacionada a ativação de metaloproteinases e degradação do colágeno e/ou

hemidesmossomos. O objetivo deste estudo foi analisar alterações morfológicas,

apoptose, metaloproteinases (MMP) 2 e 9 e infiltração leucocitária, pela pesquisa

da lipocalina liberada por neutrófilos (NGAL), no tecido laminar de eqüinos

submetidos a obstrução intestinal experimental. Os animais foram distribuídos nos

grupos: controle (Gc); instrumentado (Gi), com procedimento de enterotomia sem

obstrução; obstruído tratado com hidrocortisona (Gt) e obstruído não tratado (Gnt).

O tecido laminar foi analisado pelas técnicas de microscopia em luz,

imunohistoquímica e zimografia. Os animais dos grupos experimentais (Gi, Gt e

Gnt) demonstraram alterações morfológicas, MMPs e substância formada pela

MMP-9 e NGAL superiores aos resultados do Gc. A presença de apoptose não foi

evidenciada pelo procedimento cirúrgico. O Gc não foi diferente quanto às

alterações morfológicas quando comparado ao Gi, e também não diferiu do Gt em

relação à MMP-9, principalmente associada a neutrófilos. Com estes resultados,

conclui-se que: o modelo experimental pode causar alterações morfológicas

associadas a laminite; a apoptose não participa da fase inicial de alterações

laminares no córium laminar; a hidrocortisona pode ser utilizada para coibir os

efeitos deletérios da ativação inflamatória associada a diversas doenças, sem

comprometer o córium laminar.

xvii

Palavras-chave: eqüino, laminite, metaloproteinases, apoptose, obstrução

intestinal, infiltração leucocitária

MORPHOLOGIC ALTERATION, APOPTOSIS AND EXPRESSION MATRIX

METALLOPROTEINASES IN LAMINAR TISSUE OF HORSES SUBJECTED TO

INTESTINAL OBSTRUCCION EXPERIMENTAL. EFFECTS OF

HYDROCORTISONE

SUMMARY: The laminitis is associated to systemic inflammatory activation that

occur in several diseases, mainly gastrointestinal. The pathogeny of the laminitis is

related to matrix metalloproteinases (MMPs) activation with collagen or

hemidesmossomos degradation. The aim of this study is evaluated of the

morphologic alterations, apoptosis, MMPs 2 and 9 and leukocyte infiltration, for

research of MMP-9 related to neutrophil gelatinase associated to lipocalin (NGAL)

in laminar corium of horses subjected to intestinal obstruction experimental. The

animals were divided in groups: control (Gc); instrumented (Gi), with enterotomy

without obstruction; obstruction treated by hydrocortisone (Gt) and without

treatment (Gnt). The laminar tissue was analyzed by optical microscopy,

immunohistochemistry and zymography. The animals showed morphologic

alterations, MMPs expression and MMP-9 associated to NGAL greater the Gc. The

presence of apoptosis was not evidend by cirurgical procedure. However, the Gc

was not different to Gi about morphologic alterations, and too Gt, about MMP-9,

mainly the form conjugated to NGAL. The results indicate that the experimental

model can cause morphologic alterations associated with laminitis. The apoptosis

is not prerequisite for laminar lesion. The hydrocortisone can be administrated to

reduce the deleterious effects of inflammatory activation in several diseases,

without to affect the laminar corium.

Key words: horse, laminitis, matrix metalloproteinases, apoptosis, intestinal

obstruction, leukocyte infiltration

xviii

1. INTRODUÇÃO

A laminite é uma das mais devastadoras condições mórbidas que afeta os

equídeos. Ela está associada às doenças que desencadeam comprometimento

inflamatório sistêmico podendo, também, estar associada às alterações

metabólicas como a obesidade.

A definição de laminite, segundo o termo, é inflamação das lâminas do

casco. No entanto, essa denominação caiu em desuso pelos estudiosos da área,

pela ausência de processo inflamatório típico. Muitos pesquisadores preferem

utilizar a definição “degeneração laminar”, em virtude dos achados de

desestruturação morfológica observados no tecido laminar de animais acometidos

pela doença podal. No entanto, achados de pesquisas recentes possam remeter a

adoção do antigo termo, pelas evidências de envolvimento de diversos

mediadores inflamatórios descritos na fase prodrômica da laminite, inclusive

infiltrado leucocitário.

Como a patogênese da doença permanece desconhecida, raras medidas

terapêuticas apresentam resultados práticos, sendo mais efetivas na fase de

desenvolvimento da laminite, quando os sinais clínicos ainda são incipientes.

Pouco se pode fazer para efetivamente melhorar a condição precária a que os

animais são submetidos quando a doença já se manifestou, principalmente se já

houver ocorrido a rotação da falange distal, prenúncio da fase crônica.

Desta forma, a busca pelos fatores envolvidos na patogêne da laminite se

faz necessária principalmente para guiar o tratamento preventivo e terapêutico.

2. REVISÃO DE LITERATURA

A laminite é uma doença podal grave que acomete os equídeos, sendo

responsável por sofrimento intenso. Ela é observada comumente como sequela de

distúrbios gastrintestinais, respiratórios e reprodutivos que deflagram quadro

inflamatório sistêmico (EADES et al., 2002; PARSONS et al., 2007), afetando

também animais com alterações endócrinas (EADES et al., 2002; JOHNSON et

al., 2002).

Esta enfermidade é base de muitos estudos no mundo todo, realizados com

a intenção de conhecer o mecanismo de desenvolvimento da doença. O quadro

de laminite é, em geral, induzido experimentalmente em equinos, por meio de

administração de carboidratos, extrato de nogueira preta ou oligofrutose

(GARNER et al., 1975; POLLITT & VAN EPS, 2002). No entanto, pouco se tem

avançado no que diz respeito às alterações do tecido laminar em equinos com

enfermidades gastrintestinais (RIO TINTO et al., 2004).

A fisiopatogenia da laminite está relacionada à degradação da membrana

basal (MB) e/ou perda dos hemidesmossomos, os quais fazem a união entre a

lâmina densa da membrana basal e as células epidérmicas (POLLITT &

DARADKA, 1998; FRENCH & POLLITT, 2004). A membrana basal se localiza

entre as lâminas dérmicas e epidérmicas, sendo que estas estruturas formam

interdigitações que são responsáveis pela fixação da falange distal à parede do

casco. A falência desta estrutura pode resultar em rotação e/ou afundamento da

falange distal (POLLITT, 1996). A MB é composta por laminina (glicoproteína) e

colágeno tipos IV e VII (POLLITT, 1994). Existem inibidores teciduais e

sanguíneos para prevenir a degradação laminar excessiva, como exemplo, o

inibidor tecidual de metaloproteinases (TIMP) nos tecidos, e a α

-macroglobulina

no sangue (POLLITT, 1996; POLLITT, 2003).

A patogenia da laminite pode estar associada à degradação do colágeno

devido a superativação das metaloproteinases presentes no tecido laminar

(POLLITT, 1994), produzidas pelas células basais para o controle do crescimento

normal do casco, constituindo a base da teoria enzimática. A concentração de

metaloproteinases aumenta de maneira considerável 48 horas após a indução de

laminite por administração de carboidratos (KYAW-TANNER & POLLITT, 2004). A

ativação destas enzimas ainda é pouco conhecida, sugerindo-se o envolvimento

de toxinas bacterianas, absorvidas do trato gastrintestinal, e de citocinas

inflamatórias deflagradas nos quadros de ativação inflamatória sistêmica, como o

fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (POLLITT, 1999, HAN et al., 2000; HAN et

al., 2001). Dentre as toxinas bacterianas que ativam as MMPs, as exotoxinas de

espécies de Streptococos, especialmente Streptococcus bovis assumem grande

importância (POLLITT, 1999; MUNGALL et al., 2001; MILINOVICH et al., 2007).

As MMPs podem, ainda, ser liberadas por leucócitos que migraram para os

tecidos laminares (BELKNAP & BLACK, 2005).

Acredita-se que exista envolvimento direto de fatores presentes no lúmen

intestinal que, direta ou indiretamente, possam ativar as MMPs e iniciar a

degradação descontrolada do colágeno. Estes fatores estão presentes no tecido

laminar em menos de 24 horas após o início do processo primário (LOFTUS et al.,

2007; NOURIAN et al., 2007). A acidose cecal parece estar estritamente

relacionada ao aumento destas substâncias desencadeadoras da laminite, pois a

administração de solução tamponante mostrou-se efetiva na redução da

quantidade de MMPs no tecido laminar (SOUZA et al., 2006).

Existem duas gelatinases distintas da família das MMPs, encontradas

também como pró-enzimas. O aumento de ambas nem sempre ocorre (JOHNSON

et al.,1998). A MMP-9 tem sido associada a processos inflamatórios por ser

ativada por citocinas pró-inflamatórias e liberada por leucócitos, possuindo

distribuição limitada entre os tecidos quando comparada à MMP-2, a qual é

observada de maneira constitutiva no tecido laminar (KYAW-TANNER & POLLITT,

2004).

A anatomopatologia do casco afetado pela laminite é analisada com base

nas alterações características da laminite; sendo macroscopicamente visualizadas

pela deformação do casco e rotação da falange distal na fase crônica, e

microscopicamente, pelas mudanças morfológicas do tecido laminar. A

classificação utilizada atualmente (POLLITT, 1996) considera, principalmente, as

alterações presentes nas células basais (CB), o formato da lâmina epidérmica

secundária (LES) e o contorno da membrana basal (MB) (POLLITT, 1996).

CROSER & POLLITT (2006) demonstraram, através de biópsia seriada do tecido

laminar em equinos com indução da doença, que os eventos morfológicos iniciais

como arredondamento do núcleo das células basais, que se tornam

progressivamente mais próximos da membrana basal e afilamento da extremidade

das LES, com redução do espaço ocupado pelas lâminas dérmicas secundárias

(LDS). A degradação da membrana basal ocorre entre 36 e 48 horas.

Como a etiopatogenia da laminite permanece desconhecida, existem

teorias, além da enzimática, para tentar explica-la. Dentre elas se destacam a

vascular, trombogênica, metabólica (HOOD, 1999; JOHNSON, 2002) e, a que foi

recentemente levantada, a teoria inflamatória, de envolvimento sistêmico (MOORE

& BELKNAP, 2008). As teorias muitas vezes se relacionam, o que classifica a

enfermidade como multifatorial.

A teoria vascular postula que as lesões do tecido laminar são causadas por

vasoconstrição digital e/ou abertura de anastomoses arteriovenosas no tecido

laminar, levando a estase sanguínea e, consequentemente, edema tecidual e

necrose (HOOD et al., 1978; ALLEN et al., 1990; KEEN et al., 2008; NOSCHKA et

al., 2008). Exames de cintilografia, demonstraram redução da perfusão sanguínea

no período prodrômico da laminite (GALEY et al., 1990). Atualmente, evidências

do envolvimento inflamatório sistêmico demonstram que os mediadores

inflamatórios, principalmente citocinas, podem agir causando vasoconstrição

digital, que está associada à fase prodrômica da laminite (NOSCHKA et al., 2008).

Estudos demonstraram que ocorre maior contratilidade nas veias laminares do

que nas artérias laminares, quando estas são sensibilizadas com vasoconstritores

agonistas, sendo essa resposta o oposto da encontrada nos vasos digitais, em

que as artérias sofrem maior contratilidade que as veias (PERONI et al., 2005;

PERONI et al., 2006). A endotelina-1 (ET-1), secretada pelo endotélio, causa

vasoconstrição três vezes maior em veias do que em artérias. Sua secreção é

regulada pelo óxido nítrico, vasodilatador também produzido pelo endotélio, e

existindo evidências de desequilíbrio dessas duas substâncias na laminite aguda

(VENUGOPAL et al., 2001). No entanto, achados experimentais contestam a

vasoconstrição como evento primordial para o aparecimento da laminite, como a

ausência da xantina oxidase, enzima liberada durante a isquemia tecidual

(LOFTUS et al., 2007). Existem evidências da vasodilatação, presente no início de

desenvolvimento da doença, a qual está associada ao aumento da temperatura e

fluxo sanguíneo no tecido laminar (POLLITT & DAVIES, 1998; POLLITT, 1999,

POLLITT, 2003). POLLITT & DAVIES (1998) sugerem que, após a sobrecarga de

carboidratos, ocorra um período de 12 a 40 horas de vasodilatação sublaminar,

precedendo os sinais clínicos da laminite

A teoria trombogênica afirma que a patogenia da laminite está relacionada a

agregação e adesão plaquetária sobre o endotélio integro, evento frequentemente

associado a animais com abdômen agudo (REININGER et al., 1998; DIVERS,

2003). WEISS et al. (1995) observaram a formação de microtrombos na parede de

vasos localizados na lâmina dérmica e, por meio de arteriografia, redução do fluxo

sanguíneo para o membro. Semelhantemente ao que ocorre na síndrome

metabólica no homem, que é caracterizada por eventos inflamatórios e pró-

trombóticos (ODROWAZ-SYPNIEWSKA, 2007), é possível que o mesmo

mecanismo possa acontecer nos equinos, predispondo à doença por afluxo

sanguíneo insuficiente (ROBERTSON et al. 2008). No entanto, a administração de

heparina, após 24 horas da indução de laminite, não apresenta efeito benéfico no

desenvolvimento das lesões características de laminite (MARTINS FILHO et al.,

2008), talvez pela administração em período posterior à formação dos trombos no

tecido laminar.

A teoria metabólica está pautada na observação de laminite em animais

com síndrome de Cushing, administração prolongada e em altas doses de

glicocorticóides e a intolerância à insulina, observada em animais obesos

(JOHNSON et al., 2002). A relação da laminite com estas alterações endócrinas

foi mais bem observada por meio da indução da doença com infusão contínua de

insulina em pôneis normais (ASPLIN et al., 2007). Da mesma forma, existe relação

da laminite com resposta inflamatória sistêmica, que neste particular, parece ser

despertada pelas próprias alterações metabólicas. Sabe-se que a obesidade

causa aumento de citocinas inflamatórias, provavelmente pela produção destas

por adipócitos (HUTLEY & PRINS, 2005; VICK et al., 2007). A hiperglicemia e

resistência à insulina parecem estar implicadas no desenvolvimento de um “estado

inflamatório”, com inflamação sistêmica subaguda crônica (SHOELSON et al.,

2006; GEOR & FRANK, 2008), o que tornaria os animais com estas alterações

menos tolerantes aos efeitos deletérios da resposta inflamatória que ocorre na

sepse (VAN EPS & POLLITT, 2006; EADES et al., 2007), semelhante ao que

ocorre no homem (SINGER & GRANGER, 2007).

Os achados de vários estudos realizados no período de desenvolvimento

da laminite induzida experimentalmente fornecem fundamentos sobre o

envolvimento da ativação inflamatória sistêmica na patogenia da laminite, como a

presença de citocinas inflamatórias circulantes (LOFTUS et al., 2007; NOSCHKA

et al., 2009), espécies reativas de oxigênio (HURLEY et al., 2006) e infiltração

leucocitária tecidual, a qual pôde ser observada graças a implementação de

técnicas laboratoriais específicas (BLACK et al., 2006; HURLEY et al., 2006;

LOFTUS et al., 2006; FALEIROS et al., 2009). A explicação para a ativação

inflamatória sistêmica pode ser de origem infecciosa, como por endotoxinas, que

foram detectadas no início da doença (BAILEY et al., 2008), ou injúria tecidual,

observada no quadro de abdômen agudo (EADES et al., 2002; RIO TINTO et al.,

2004).

A administração de endotoxina, segundo HUNT et al. (1990), não promove

sinais clínicos de laminite em cavalos, mas não foi encontrado nenhum relato de

alterações morfológicas após esta prática nesta espécie, apenas em bovinos, nos

quais houve alterações do tecido laminar (BOOSMAN et al., 1991) sem a

presença de sinais clínicos da afecção podal. Deve-se considerar que este modelo

experimental, por gerar ativação inflamatória maciça, porém transitória

(BENJAMIN, 2001), pode não desencadear alterações morfológicas laminares

consistentes com o aparecimento de sinais clínicos de laminite. Portanto, modelos

que provavelmente levam a liberação contínua de endotoxinas, como a injúria

intestinal, promovem a ativação inflamatória sustentada (BENJAMIN, 2001) para

que seja possível associar as alterações morfológicas no tecido laminar com os

sinais clínicos da doença (POLLITT, 2007). Embasando ainda mais essa hipótese,

Duncan et al. (1985) demonstraram que a infusão contínua de endotoxina causou

redução da temperatura do casco e que os equinos apresentaram visível

desconforto podal.

A ativação inflamatória sistêmica pode ser deflagrada pela injúria de

isquemia-reperfusão observada em afecções gastrintestinais (BONE et al., 1996;

EADES et al., 2002; RIO TINTO et al., 2004; BIANCO-BLATLLES et al., 2008),

promovendo a liberação de diversos mediadores inflamatórios e, principalmente,

espécies reativas de oxigênio as quais podem modificar a estrutura de proteínas e

carboidratos, representando o quadro de estresse oxidativo (HALLIWELL, 1989;

CAMPOS & YOSHIDA, 2004).

Estas evidências de envolvimento inflamatório na fase de desenvolvimento

da laminite permitem associar a doença com a falência orgânica no homem, onde

a resposta inflamatória sistêmica leva à injúria de locais distantes ao sítio da

afecção (BELKNAP et al.; 2009). Neste contexto, a infiltração leucocitária,

observada nos períodos iniciais de desenvolvimento da laminite (BLACK et al.,

2006; HURLEY et al., 2006) tem papel fundamental na patogenia da laminite pela

liberação de substâncias lesivas aos tecidos, como as MMPs (STETLER-

STEVENSON, 1990), mieloperoxidase, espécies reativas de oxigênio (BELKNAP

& BLACK, 2005; HURLEY et al., 2006; RIGGS et al., 2007).

A lipocalina associada a gelatinase de neutrófilos – NGAL, é uma proteína

liberada pelos neutrófilos (BORREGAARD & COWLAND, 1997), produzida nos

precursores de polimorfonucleares na medula óssea e estocada até que a célula

seja ativada (FLOWER, 1996). Esta proteína tem sido encontrada em tecidos

sobre estresse em associação com à MMP-9 (GUPTA et al., 2007; LORENCINI et

al., 2009) provavelmente com a função de proteger a MMP-9 contra sua

autodegradação, contribuindo para um período enzimático proteolítico ativo mais

longo desta protease (GUPTA et al., 2007). Muitos estudos sugerem que o NGAL

possa ser marcador de lesões e da infiltração neutrofílica em diversos órgãos, (BU

et al., 2006; HEMDAHL et al., 2006; GUPTA et al., 2007; SMITH et al., 2008),

predizendo, inclusive, o agravamento do quadro clínico (BOLIGNANO et al.,

2009). SHAPIRO et al. (2009) observaram que sua apresentação como

biomarcador mostrou-se confiável para sepse, choque septico e morte nos

pacientes com comprometimento sistêmico.

A possível explicação para a injúria à distância, que é provocada pela

resposta inflamatória sistêmica, comprometendo o tecido laminar nos equinos e

não outros órgãos, pode ser a insuficiente quantidade da enzima superóxido

dismutase (SOD) no tecido laminar quando comparada à outros órgãos (LOFTUS

et al., 2007). A SOD possui importante atividade antioxidante, reduzindo os efeitos

teciduais deletérios das espécies reativas de oxigênio pela dismutação destas

substâncias (ANDRADE JÚNIOR et al., 2005, MADESH et al., 2005). Esta

particularidade do tecido laminar deve ser considerada face aos achados de

aumento de espécies reativas de oxigênio em equinos com laminite induzida, tanto

em concentrações séricas (HURLEY et al., 2006), como locais, no tecido laminar

(YIN et al., 2008). Adicional a isso, alterações do tecido laminar puderam ser

observadas no estudo de STEWART et al. (2008), os quais demonstraram

concentrações de mediadores inflamatórios neste tecido superiores aos de outros

órgãos, como fígado e pulmão, durante a indução da laminite.

Evidências experimentais apontam a ocorrência de apoptose, em condições

normais nas lâminas dérmicas e epidérmicas, e estando aumentada após o

aparecimento dos sinais clínicos da laminite (FALEIROS et al., 2004, SOUZA,

2007). A apoptose é uma forma fisiológica de morte celular oposta à mitose, de

ocorrência normal para regulação da homeostase e crescimento tecidual

(TARNAWSKI & SZABO, 2001; DENMEADE & ISAACS, 2005). Difere da

necrose em virtude das células apoptóticas serem reconhecidas por macrófagos e

ingeridas antes que se desintegrem, evitando o derrame do conteúdo celular e,

assim, não deflagrando inflamação e lesão tecidual (MEAGHER et al., 1992;

COHEN, 1993). Sua ativação pode ocorrer por processos mórbidos, como na

síndrome da imunodeficiência adquirida, desordens degenerativas e sepse

(HASLETT & SAVILL, 2001).

A morte celular não seguida de autólise ou apoptose acontece pela ativação

de proteases, chamadas caspases, que são encontradas sob a forma de pró-

enzimas no citosol celular. Existem diversas caspases, que são ativadas em

cascata, por duas vias principais. A via extrínseca, à qual pertence a caspase 8, é

ativada por ligantes, como o TNF-α, que se acoplam a receptores (HERMAN et al.,

2005; HOTCHKISS & NICHOLSON, 2006). A via intrínseca ou mitocondrial, que

abrange a caspase 9, é ativada por diversos estímulos, como espécies reativas de

oxigênio, radiação e agentes quimioterápicos. As duas vias ativam caspases

efetoras, normalmente a caspase 3, que é crucial ao final da cadeia da morte

celular programada (HOTCHKISS & NICHOLSON, 2006), causando destruição do

DNA, por ativação de DNAase no núcleo celular, e desorganização da estrutura

normal do citoesqueleto da célula (NICHOLSON, 1999; CREAGH et al., 2003;

BOCCELLINO et al., 2004). Existem também caspases relacionadas à

diferenciação celular normal como a caspase 14, que é expressa principalmente

no epitélio e mucosa oral, clivando proteínas estruturais ou ativando enzimas

encontradas na camada granular que participam da formação do extrato córneo

(ECKHART et al., 2000; KUECHLE et al., 2001; HATHAWAY & KUECHLE, 2002).

Existem inúmeras medidas indicadas para a prevenção e tratamento da

laminite, sendo muitos empíricos e controversos pelo conhecimento incompleto da

patogenia da doença (EADES et al., 2002). A crioterapia aplicada aos cascos é

uma medida de boa eficácia preventiva (VAN EPS & POLLITT, 2004), por causar

redução da atividade metabólica e enzimática de leucócitos, diminuindo a

liberação de mediadores inflamatórios (SWENSON et al., 1996; WORSTER et al.,

2001).

Pelo mesmo raciocínio, a administração de anti-inflamatórios poderia

impedir o desenvolvimento da laminite, face a presença significativa de

mediadores inflamatórios na fase prodrômica da doença atenuando, assim, seus

efeitos adversos (CAMPEBELL et al., 2007). A utilização de corticóides tem sido

inicialmente desestimulada, pois muitas vezes o desenvolvimento de laminite é

observado em animais que necessitam de doses altas e/ou repetidas desses

medicamentos (POLLITT, 1999; JOHNSON et al., 2003, RYU et al., 2004). A

administração diária de corticóides causa resistência à insulina, a qual também

apresenta ligação com o desenvolvimento de laminite (BAILEY et al., 2007; TILEY

et al., 2007). Todavia, achados de BRASIL et al. (1999) e ANNANE & CAVAILLO

(2003) demonstraram que a utilização de corticosteróides inibe a liberação de

citocinas inflamatórias como o TNF-α, reduzindo a proliferação e infiltração

leucocitária, o que torna seu uso em modelos de sepse benéfico.

Por todo o exposto, entender os mecanismos que levam ao

desenvolvimento das lesões no tecido laminar de animais com abdômen agudo é

essencial para a compreensão da patogenia da laminite, facilitando a adoção de

medidas preventivas que possam reduzir a gravidade do quadro, uma vez

instalado.

3. OBJETIVOS

 Avaliar o modelo de injúria intestinal como indutor de alterações laminares

 Determinar o efeito da administração de hidrocortisona sobre as alterações

do tecido laminar

 Contribuir, de modo geral, para o entendimento da fisiopatogenia da

laminite

Estes objetivos foram pautados no estudo das alterações morfológicas,

apoptose, expressão de MMPs 2 e 9 e atividade da MMP-9 conjugada a NGAL, no

tecido laminar de animais com obstrução intestinal.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizadas amostras do tecido laminar provenientes de vinte

equinos adultos, sendo sete animais isentos de quaisquer procedimentos

experimentais, representando o grupo controle e de outros treze após a obstrução

intestinal experimental, distribuídos em três grupos: instrumentado, obstruído não

tratado e obstruído tratado.

4.1.1 Animais controle (Gc)

Foram utilizadas amostras de tecido laminar de sete equinos, de sexo e

idade desconhecida, peso médio de 300±50, os quais foram considerados hígidos

após inspeção sanitária. O material foi colhido de animais abatidos em

estabelecimento

comercial de abate de equinos. O fragmento laminar foi colhido

da mesma forma em todos os animais, segundo a descrição contida no item 4.2.2.

4.1.2 Animais submetidos a procedimentos cirúrgicos

(Gi, Gt e Gnt)

Foram utilizados treze equinos

, sendo sete machos e seis fêmeas, sem

raça definida e com idade variando de dois a quinze anos, com peso de 300±63kg,

considerados hígidos e sem alterações de deambulação. Os animais

permaneceram em piquete coletivo, recebendo feno de Coast-cross (Cynodon

dactylon) e água à vontade, recebendo vermífugo quinze dias antes do início do

experimento. Os equinos foram distribuídos aleatoriamente em três grupos

experimentais. O grupo instrumentado (Gi) constituído de cinco animais, enquanto

os grupos obstruídos não tratado (Gnt) e tratado (Gt) de quatro cavalos cada.

4.2 Delineamento Experimental

Os animais dos grupos Gi, Gt e Gnt foram submetidos a jejum alimentar de

dezoito horas e restrição hídrica de quatro horas. Posteriormente foram sedados

com cloridrato de xilazina 10%

(0,5 mg/kg, via intravenosa) e butorfanol

(0,1mg/kg, via intramuscular). A anestesia local foi realizada com cloridrato de

lidocaína 2%

sem vasoconstritor, por meio da técnica de “L” invertido, como

utilizado por FALEIROS (2003).

Abatedouro e frigorífico Pomar SA, Araguari – MG , Brasil

Material obtido do estudo “Obstrução experimental de jejuno de equinos tratados ou não com

hidrocortisona: aspectos clínicos, hematológicos, bioquímicos e anatomopatológicos”, aprovado pela

Comissão de Ética e Bem Estar Animal, protocolo número 013598-06

Sedazine – Fort Dodge, Overland Park – KS, Estados Unidos da América

Torbugesic – Fort Dodge, Overland Park – KS , Estados Unidos da América

Xilestesin 2% sem vasoconstritor – Cristália Hospitalar, Butantã – SP, Brasil

O terço médio do jejuno foi exposto pela realização de laparotomia pela

fossa paracostal esquerda e submetido à compressão intramural da parede

intestinal, mediante a implantação de um balão de látex vazio no lúmen,

subseqüentemente ao procedimento de enterotomia, conforme protocolo utilizado

por FALEIROS et al. (2002). O balão foi inflado até obter a pressão de 12 mmHg,

sendo esta registrada e monitorada por meio de manômetro durante todo o

período da obstrução, para que a pressão permanecesse a mesma mesma. Ao

término de quatro horas, o balão foi retirado e decorrido o intervalo de dezoito

horas os animais foram submetidos à eutanásia.

4.2.1 Distribuição dos grupos

Os animais, com exceção do grupo controle, foram distribuídos

casualmente nos grupos experimentais que constam na Tabela 1.

Tabela 1 – Distribuição dos grupos de acordo com o procedimento realizado

GRUPO PROCEDIMENTO

ontrole

(Gc)

Os equinos não foram submetidos a procedimentos cirúrgicos

nstrumentado

(Gi)

Os equinos foram submetidos a todas as manobras e métodos aplicados

aos demais grupos, exceto a distensão do balão para provocar a

obstrução intestinal.

Tratado

(Gt)

Os animais foram submetidos à isquemia do jejuno por meio da obstrução

pelo balão inflado durante quatro horas, e receberam tratamento com

hidrocortisona

, na dose de 4mg/kg, uma hora antes da desobstrução.

Não tratado

(Gnt)

Os animais foram submetidos à isquemia de jejuno durante quatro horas,

sem receber tratamento.

4.2.2 Extração do tecido laminar

Solu-Cortef, Rhodia Farma Ltda, São Paulo – SP, Brasil

Os animais dos grupos Gi, Gnt e Gt foram submetidos à eutanásia por meio

de superdosagem de anestésico (tiopental sódico IV e administração intra-tecal de

lidocaína a 2%) e os animais do grupo controle por concussão cerebral por meio

de pistola pneumática (dessensibilização central) e sangria da veia jugular e

artéria carótida, segundo o protocolo adotado pelo frigorífico. As extremidades dos

membros dos animais foram retiradas por meio de desarticulação metacarpo-

falangeana. Os cascos foram seccionados com a utilização de serra, de acordo

com protocolo descrito previamente por POLLITT (1996). Os fragmentos obtidos

pela retirada do tecido laminar, com auxílio de lâmina de bisturi nº 21, contendo a

interface entre as lâminas dérmicas e epidérmicas. As amostras foram

armazenadas de duas formas: fixadas em solução de formol a 10%, por período

de 24 horas, desidratadas em álcool e incluídas em parafina; e pelo

congelamento, imediatamente imersas em nitrogênio líquido e posterior

acondicionamento em freezer a menos 70˚C.

4.3 Análise em Microscopia de Luz

Os fragmentos de tecido laminar foram cortados a 5µm de espessura e

corados com os métodos histoquímicos hematoxilina e eosina (HE) e ácido

periódico de Schiff (PAS), e, posteriormente, submetidos à microscopia de luz. O

corante PAS foi utilizado para a análise das alterações na membrana basal do

tecido laminar.

A avaliação das lesões do tecido laminar baseou-se nos graus descritos

por POLLITT (1996), estabelecendo-se escores intermediários para melhor

classificar as lesões (Tabela 2). A classificação das alterações foi feita por análise

cega, pelo mesmo observador.

Tabela 2 – Escores de alterações morfológicas do tecido laminar, presentes na maior parte do

corte histológico, dos equinos dos grupos experimentais (adaptado de POLLITT, 1996)

ESCORE MORFOLOGIA OBSERVADA

0 LES com extremidade arredondada, LEP retilínia e com extremidade

arredondada, núcleos das CB ovalados e apicais, MB com contorno bem definido.

0,5* Presença de núcleos de CB arredondados, mas com localização ainda apical em

alguns segmentos, e de algumas LES com extremidade levemente afilada.

1,0 LES afiladas com redução do espaço pertencente a LDS, núcleos de CB

arredondados e próximos à MB, LEP com extremidade levemente ondulada.

1,5* LES marcadamente afiladas e alongadas, com redução da LDS entre as LES,

núcleos de CB arredondados e próximos à MB, LEP com extremidade afilada e

ondulada, entretanto, a MB se encontra com distância normal da LEP (espaço

compreendido por 2 CB). MB contorno irregular e borrado.

2,0 Todas as alterações anteriores, com aumento significativo da distância entre o

eixo queratinizado das LEP e MB, e esta se encontra serrilhada e ausente em

vários segmentos na coloração de PAS.

3,0 Intensa destruição da arquitetura laminar, ausência marcante de MB, extremidade

das LES sensivelmente afiladas e alongadas, formando uma massa amorfa de

tecido entre LEP e LDP, causado também pelo descolamento das LES do eixo da

LEP.

LES – lâmina epidérmica secundária; LEP – lâmina epidérmica primária; CB – célula basal; LDP –

lâmina dérmica primária; MB – membrana basal. PAS – coloração de ácido periódico de Schiff.

*valores intermediários utilizados neste estudo para classificação das lesões.

4.4 Análise Imunohistoquímica (IHQ) para Detecção de Caspase 3 e 14

e Metaloproteinases (MMPs) 2 e 9

Este procedimento foi realizado no Laboratório de Neuropatologia, sob

responsabilidade do Prof. Dr. Antônio Carlos Alessi e co-orientação da Prof

Rosemeri de Oliveira Vasconcelos, do Departamento de Patologia Veterinária, da

FCAV-UNESP, Jaboticabal, SP, com o intuito de identificar células em apoptose,

por meio da imunomarcação da caspase 3, células em diferenciação celular, pela

imunomarcação de caspase 14 e a presença de MMPs 2 e 9 no tecido laminar. O

protocolo básico foi o mesmo para todos os anticorpos, variando o tipo de

anticorpo, diluição e tempo de incubação, sendo estes apresentados na tabela 3.

Os cortes do tecido laminar para a análise imunohistoquímica foram processados

em tecido incluído em parafina, cortados a 3µm de espessura e fixados em

lâminas previamente preparadas com Poly-L-Lisina

. A desparafinização dos

cortes foi feita em estufa à 60ºC, durante 30 minutos. Posteriormente os cortes

foram hidratados em soluções de xilol I e II por 20 minutos cada, e após passagem

rápida em álcool absoluto (duas vezes), álcool 95%, álcool 80% e álcool 50%. A

seguir foram lavadas em água destilada por dez vezes. A recuperação antigênica

foi feita com solução tampão de citrato de sódio a 10mM, com pH 6,0, pelo vapor

por vinte minutos. O bloqueio de proteínas inespecíficas foi realizado com leite em

pó a 5% diluído em solução tampão de fosfato pH 6,0 (PBS), por vinte minutos.

Para o bloqueio da peroxidase endógena utilizou-se um bloqueador comercial

por dez minutos. Foi realizada a incubação com o anticorpo (Tabela 3). Os

controles negativos foram incubados apenas com a solução diluidora

anticorpos. Logo após incubou-se com o complexo estreptavidina-biotina

, com

anticorpo secundário biotinilado universal por 30 minutos, seguido pela

streptavidina também por 30 minutos. A revelação da reação foi feita com o

cromógeno diaminobenzidina

(DAB), por três minutos, seguido de lavagem em

água destilada. A contra-coloração dos cortes foi feita com hematoxilina de Harris

e a montagem das lâminas com bálsamo do Canadá

, para posterior observação

em microscópio óptico. Como controle positivo, utilizou-se linfonodo de equino

para a caspase 3, para a caspase 14 um corte de pele de equino, e para as

ambas as MMPs 2 e 9, tecido mamário de cadela. Para o controle negativo, como

descrito acima, omitiu-se o anticorpo primário nos cortes de tecido laminar,

incubando-se apenas o diluente

do anticorpo.

P-7886 Sigma Chemical Corporation, Saint Louis – MO, Estados Unidos da América

Steam Cuisine, T-Fall, New Jersey , Estados Unidos da América

TA-060-HP. Hydrogen Peroxidase Block, Lab Vision, Fremont – CA, Estados Unidos da América

S3022, Dako Corporation, Carpinteria – CA, Estados Unidos da América

LSAB, K0690, Dako Corporation, Carpinteria – CA, Estados Unidos da América

K3468, Dako Corporation, Carpinteria – CA, Estados Unidos da América

Labsynth, Diadema – SP, Brasil

Tabela 3 – Anticorpos utilizados para imunomarcação no tecido laminar

ANTICORPOS PRIMÁRIOS ORIGEM DILUIÇÃO INCUBAÇÃO

Anti--caspase 3

coelho 1:700 15 horas (overnight)

Anti- caspase 14

coelho 1:3000 30 minutos

Anti-MMP-2

camundongo 1:100 1 hora

Anti-MMP-9

cabra 1:200 1 hora

4.5 Análise zimográfica das MMPs 2 e 9

A técnica de zimografia foi realizada no Laboratório de Imunologia

Aplicada, do Departamento de Imunologia, sob responsabilidade da Prof

. Dr

Dagmar Machado, na Unicamp, Campinas, SP.

Para o processamento desta técnica, foram coletados fragmentos de

tecido laminar e imediatamente congelados em nitrogênio líquido, armazenados

posteriormente em freezer a menos 70º C até a realização da técnica.

Os fragmentos do tecido laminar foram triturados e a extração das

proteínas realizada em tampão contendo 50 mM Tris-HCl pH 7,4; 0,2M NaCl; 0,1%

Triton; 10mM CaCl

e 1% protease inhibitor cocktail

, com o auxílio de um

triturador. A quantificação protéica foi realizada de acordo com BRADFORD

(1976), utilizando uma curva padrão de soro albumina bovino (BSA). A zimografia

para análise da atividade das MMPs-2 e 9 foi realizada em gel de poliacrilamida

10% contendo gelatina 0,1%. Aproximadamente 20µg de proteína por amostra

foram aplicadas no gel. Após eletroforese, o gel foi lavado à temperatura ambiente

com 2,5% Triton X-100, incubado overnight (15 horas aproximadamente) em

tampão 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 contendo 0,1 M NaCl e 0,03% azida sódica, a

ASP 175, Cell Signaling, Trask Lane – Danvers, Estados Unidos da América

ab1653, Abcam, Cambridge – UK, Estados Unidos da América

Ab-19 (clone CA-4001), Lab Vision, Fremont – CA, Estados Unidos da América

sc-6840, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz – CA, Estados Unidos da América

Sigma Chemical Company, Sant Louis – MO, Estados Unidos da América

37°C. O gel foi corado com Coomassie brilliant blue. As bandas correspondentes à

atividade gelatinolítica puderam ser observadas após lavagem com solução

contendo metanol (30%) e ácido acético (10%). Os géis foram avaliados pela

densitometria das bandas por meio do programa Scion Image.

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

O método estatístico empregado para avaliar a existência de alterações

morfológicas, células apoptóticas e imunomarcação para MMP-2 e MMP-9 foi o

teste de Kruskal Wallis (não paramétrico, amostras independentes, comparações

múltiplas) e para determinar a diferença, o teste de comparação múltipla de Dunn.

Adotou-se o nível de significância de 5% (p<0,05). A relação entre o grau de lesão

histológica e intensidade de imunomarcação para MMP-2 e MMP-9 foi analisada

por meio de tabela de contingência 4x3, considerando frequência de escores nos

grupos experimentais, avaliada pelo teste exato de Fisher. As enzimas obtidas

pelo método de zimografia, MMP-2 e MMP-9 foram avaliadas pela análise de

variância de delineamento inteiramente casualizado, sendo a diferença detectada

pelo teste de Tukey (p<0,05). A comparação dos dados entre os grupos foi feita

pela média dos resultados obtidos nos membros torácicos direito e esquerdo.

6. RESULTADOS

Os animais submetidos ao procedimento cirúrgicos dos grupos

instrumentado, tratado e não tratado permaneceram em posição quadrupedal

após o procedimento cirúrgico, sem a presença de claudicação evidente durante a

deambulação.

6.1 Presença de Lesões Histológicas no Tecido Laminar

A classificação das alterações morfológicas foi realizada por meio de

escores pelo predomínio das mesmas no corte histológico.

As alterações observadas foram: células basais (CB) com núcleos

arredondados, afilamento da extremidade da lâmina epidérmica secundária (LES),

separação entre LES pouco distinta, com redução da lâmina dérmica secundária

(LDS) entre elas, lâmina epidérmica primária (LEP) com extremidade afilada, e

apresentando ondulações no seu eixo queratinizado, contorno da membrana basal

(MB) indefinido, apresentando aspecto serrilhado e borrado em alguns segmentos

(Figuras 1 a 3).

O grupo Gc não apresentou alterações histológicas marcantes do tecido

laminar. Alguns animais apresentaram afilamento da extremidade das LES em

pequena proporção e presença de células basais com núcleos arredondados, o

que permitiu classifica-los como escore 0,5 (Figura 1).

Não foram observadas alterações na derme laminar dos equinos dos

grupos controle e submetidos à cirurgia, exceto pela presença de poucas células

inflamatórias demonstrando inflamação localizada em determinado ponto no tecido

laminar de um animal (animal 6, Gi)

Figura 1 – Fotomicrografias do tecido laminar equino.Características morfológicas dos escores 0

e 1. (A) Presença de núcleos de células basais (CB) ovalados e apicais (setas),

lâminas epidérmicas secundárias (LES) de extremidade arredondada (Gc, escore

zero HE, obj. 40x). (B) Afilamento de algumas LES (setas pretas pontilhadas) LES com

extremidade arredondada (setas brancas pontilhadas),. presença de núcleo de CB

esféricos (setas pretas contínuas) e núcleos ovalados (setas brancas contínuas) (Gi,

escore 0,5 HE, obj. 20x)

Figura 2 – Fotomicrografias de tecido laminar equino. Características morfológicas dos escores 1 e

1,5. (A) Núcleos esféricos de CB próximos a MB (setas pretas), afilamento das

extremidades das LES e redução do espaço entre elas (seta branca) (Gt, escore 1 HE,

obj. 40x). (B) Núcleos esféricos das CB (setas) e afilamento pronunciado da extremidade

das LES (Gnt, escore 1,5 HE obj. 40x).

Figura 3 – Fotomicrografias do tecido laminar equino. Características morfológicas da MB nos

escores zero e 1,5. (A) Membrana basal (MB) íntegra (setas) (Gc, escore zer PAS,

aproximado de obj 40x). (B) MB de contorno irregular e borrado (setas) em alguns

segmentos da LES (Gt, escore 1 PAS, obj. 40x).

A gravidade das lesões histológicas foi maior nos animais dos grupos

obstruídos (Gt e Gnt) quando comparados ao Gc. As lesões observadas no Gi não

diferiram dos outros grupos, Gc, Gt e Gnt (Tabela 4 e Figura 4).

Tabela 4 – Medianas dos escores de alterações do tecido laminar observados nos grupos controle

e experimentais (Gi, Gnt e Gt), com intervalos interquartis entre parêntesis. Colunas

marcadas pela mesma letra não diferem entre si.

GRUPOS Gc Gi Gnt Gt

MEDIANA

DOS ESCORES

zero (0 – 0,25)

0,5 (0,25 – 1,25)

1,25 (1,12 – 1,5)

1,25 (1,12 – 1,25)

Gc Gi Gnt Gt

Grupos

Alterações morfológicas (escore)

Figura 4 – Medianas e intervalos interquartis dos escores das alterações morfológicas do

tecido laminar observadas nos grupos controle e experimentais (Gi, Gnt e

Gt).Colunas marcadas pela mesma letra não diferem entre si.

6.2 Imunomarcação para Caspase 3 e 14

A imunomarcação para detecção de apoptose foi positiva para o anticorpo

anti-caspase 3, com marcação nuclear nas células basais, presentes na lâmina

epidérmica secundária. O anticorpo anti-caspase 14 não apresentou

imunomarcação no tecido laminar (Figura 5). Foi feita contagem das células

imunomarcadas pela caspase 3 por área de corte histológico (células/mm

Não foram observadas diferenças entre os grupos experimentais com

respeito a contagem de células imunomarcadas para caspase 3, o que demonstra

a presença de apoptose (Tabela 5 e Figura 6).

Figura 5 – Imunohistoquímica para caspase 3 e 14. Fotomicrografias do tecido laminar equino (A,

C, D, F); fotomicrografia de linfonodo equino (B) e fotomicrografia de pele equina (E). (A)

Imunomarcação para Caspase 3 nos núcleos das células basais (CB) (setas, Gnt). (B)

Controle positivo para caspase 3 (setas). (C) Controle negativo da reação

imunohistoquímica para caspase 3 (Gt). (D) Imunomarcação negativa para caspase 14

(Gt). (E) Controle positivo para caspase 14 (seta). (F) Controle negativo da reação de

imunohistoquímica para caspase 14 (Gt). Método Imunohistoquímico Estreptavidina-

Biotina (LSAB Kit, cromógeno DAB, obj. 40x).

Tabela 5 – Médias e desvios padrão do número de células apoptóticas entre os grupos controle e

experimentais (Gi, Gnt e Gt). Colunas marcadas pela mesma letra não diferem entre si.

GRUPOS Gc Gi Gnt Gt

MEDIA ± DESVIO PADRÃO

(mm

)

1,8 ± 2

0,4 ± 0,6

1,9 ± 1,6

0,7 ± 1

Gc Gi Gnt Gt

Grupos

Celulas

apoptóticas (n

)

Figura 6 – Médias e desvios padrão do número de células apoptóticas dos grupos controle e

experimentais (Gi, Gnt e Gt). Colunas marcadas pela mesma letra não diferem entre si.

6.3 Intensidade de Imunomarcação para MMP-2

Todos os cortes de tecido laminar dos animais dos grupos experimentais

apresentaram imunomarcação citoplasmática nas CB, abrangendo toda a LES,

demonstrando como variação apenas a intensidade de marcação (Figura 7). A

marcação foi classificada com escores de intensidade, variando de 0 (atenuada), 1

(leve), 2 (moderada) e 3 (intensa).

Houve aumento na intensidade de expressão de MMP-2 nos animais dos

grupos obstruídos (Gt e Gnt) em relação ao Gc, e o Gi apresentou não diferiu dos

demais (Tabela 6 e Figura 8).

Figura 7 – Imunohistoquímica para MMP-2. Fotomicrografia do tecido laminar equino (A, B, C,

D e F). Fotomicrografia de tecido mamário de cadela (E.) (A) Escore 0 (Gc, obj 40x).

(B) Escore 1 (Gi, obj 40x). (C) Escore 2 (Gt, obj. 40x). (D) Escore 3 (Gt, obj. 40x). (E)

Controle positivo (obj 40x). (F) Controle negativo (Gnt, obj. 20X). Método

Estreptavidina-Biotina (LSAB Kit, cromógeno DAB).

Tabela 6 – Medianas da intensidade de imunomarcação para MMP-2 entre os grupos controle e

experimentais (Gi, Gnt e Gt), com intervalos interquartis entre parêntesis. Colunas

marcadas pela mesma letra não diferem entre si.

GRUPOS Gc Gi Gnt Gt

MEDIANA DOS

ESCORES

zero (0 –

1,0 (0,75 – 1,5

)

2,0 (2,0 – 2,0)

2,0 (1,75 – 2,25)

Gc Gi Gnt Gt

0.5

1.5

2.5

Grupos

Intensidade de imunomarcação

para MMP-2 (mediana)

Figura 8 – Medianas e intervalos interquartis dos escores para a intensidade de imunomarcação

para MMP-2 dos grupos controle e experimentais (Gi, Gnt e Gt). Colunas marcadas

pela mesma letra não diferem entre si.

6.4 Intensidade de Imumomarcação para MMP-9

Todos os cortes de tecido laminar dos animais dos grupos submetidos a

procedimento cirúrgico (Gi, Gt e Gnt) apresentaram imunomarcação

citoplasmática nas células basais da LES (Figura 9). A classificação também foi

realizada pela intensidade de marcação observada, variando de escore 0

(atenuada), 1 (discreta), 2 (moderada) e 3 (intensa).

Os grupos Gi e Gnt apresentaram aumento da expressão da MMP-9

quando comparado ao Gc. A intensidade de imunomarcação para MMP-9 no

grupo tratado pela hidrocortisona (Gt) não diferiu dos demais (Tabela 7 e Figura

10).

Tabela 7 – Medianas da intensidade de imunomarcação para MMP- 9 entre os grupos controle e

experimentais (Gi, Gnt e Gt), com intervalos interquartis entre parêntesis. Colunas

marcadas pela mesma letra não diferem entre si.

GRUPOS Gc Gi Gnt Gt

MEDIANA DOS

ESCORES

1,0 (1,0 – 1

,0)

2,0 (1,75 – 2,75

)

2,25 (1,75 – 2,5

)

1,75 (1,5 – 2,25)

Figura 9 – Imunohistoquímica para MMP-9. Fotomicrogr

afia do tecido laminar equino (A, B, C) e

fotomicrografia de tecido mamário de cadela (E). (A) Escore 1 (Gc, obj. 40x). (B) Escor

2 (Gt, obj. 40x). (C) Escore 3 (Gnt, obj. 40x) (D) Controle positivo (obj. 40x). Método

Estreptavidina-Biotina (LSAB Kit, cromógeno DAB).

Gc Gi Gnt Gt

0.5

1.5

2.5

Grupos

Intensidade de imunomarcação

para MMP-9 (mediana)

Figura 10 – Medianas e intervalos interquartis da intensidade de imunomarcação para MMP-9 dos

grupos controle e experimentais (Gi, Gnt e Gt). Colunas marcadas pela mesma letra

não diferem entre si.

6.5 Relação de Dependência entre os Escores de Alteração

Morfológica e a Intensidade de Imunomarcação para MMP-2 e MMP-9

Foi pesquisada a possível relação entre as alterações morfológicas,

intensidade de imunomarcação para MMP-2 e intensidade de imunomarcação

para MMP-9, considerando o papel destas enzimas na patogenia da laminite.

Houve relação entre os escores de lesão histológica e a imunomarcação

para MMP-2 (Tabela 8).

Não existiu relação entre os escores de lesão tecidual e imunomarcação

para MMP-9 (Tabela 8)

As expressões de MMP-2 e MMP-9 apresentaram interdependência (Tabela

8).

Tabela 8 – Valor de significância estatística entre os escores de alteração morfológica, MMP-2 e

MMP-9, por meio do teste de Fisher

Variáveis

MMP

Alter

ação morfológica

p = 5,89x10

* p = 0,0738

MMP

- p = 0,0014*

*significativo a 5% (p≤0,05), p<0,01 significativo a 1%, p>0,05 não significativo

6.6 Expressão de MMPs 2 e 9 por Meio da Técnica de zimografia

A densitometria da atividade da MMP-2 apresentou três isoformas, latente

(pró-enzima), intermediária e ativa, sendo que não foi possível separar as bandas

latente e intermediária (MMP-2L+I) para quantificação como amostras

diferenciadas, e a MMP-2 ativa (densitometria de 62 kDa). A atividade da MMP-9

foi observada com as formas latente (92 kDa) e ativa (82 kDa). Foi possível

observar, nos animais submetidos ao procedimento cirúrgico dos grupos

instrumentado, tratado e não tratado, a substância formada pela conjugação da

MMP-9 e lipocalina associada a gelatinase de neutrófilos (NGAL), representada

aqui como C_MMP-9/NGAL, com densitometria de 135 kDa (Figura 11).

Os valores da média e desvio de cada grupo experimental em razão da

variável analisada estão apresentados na Tabela 9, em 10

pixels.

Houve aumento significativo da atividade enzimática nos grupos com

procedimento experimental (Gi, Gt e Gnt) para as variáveis MMP-2A, MMP-2L+I e

MMP-9A (Figuras 12 e 13).

A enzima MMP-9L não apresentou diferença entre os grupos experimentais

(Figura 13).

O C_MMP-9/NGAL não apresentou diferenças entre os grupos Gc e Gt. Na

comparação com os demais grupos, não houve diferença entre os grupos com

procedimento cirúrgico (Gi, Gt e Gnt). Os grupos Gi e Gnt diferiram do Gc (Figura

14).

Figura 11 – Ilustração fotográfica da atividade enzimática das MMPs, registrada em gel de

poliacrilamida. Nota-se que a apenas os grupos Gi, Gnt e Gt possuem a banda

formada pela substância MMP-9 conjugada ao NGAL (C_MM)-9?NAGL)

Tabela 9 – Médias e coeficiente de variabilidade das enzimas MMP-2 e MMP-9 entre os grupos

experimentais (p<0,05), em 10

pixels.

VARIAÇÃO Gc

Gnt

C. V.

MMP-2ª* 13 ± 3

141 ± 85

89 ± 45

98 ± 34

MMP-2L+I* 77 ± 9

635 ± 164

515 ± 147

601 ± 99

MMP-9A* 10 ± 3

67 ± 41

62 ± 20

61 ± 17

MMP-9L* 13 ± 7

71 ± 62

63 ± 51

80 ± 55

C_MMP-9/NGAL* zero

30 ± 24

16 ± 19

31 ± 16

* Valores transformados em log(observação+1);

Valores não transformados. Médias seguidas pelas mesmas letras nas colunas não diferem entre

si pelo teste de Tukey (p<0,05)

Padrão Gc Gi Gnt Gt

150

300

450

600

750

900

Gc Gi Gnt Gt

Densitometria de Banda (x10

pixels)

MMP2 Latente + Intermediária MMP2 Ativa

Figura 12 – Médias e desvio padrão da densitometria de bandas para a enzima MMP-2 nas formas

ativa (MMP-2A) e latente + intermediária (MMP-2L+I), entre os grupos controle e

experimentais, e respectivo desvio padrão. Colunas marcadas pela mesma letra não

diferem entre si.

100

150

200

Gc Gi Gnt Gt

Densitometria de Banda (x10

pixels)

MMP9 Latente MMP9 Ativa

Figura 13 – Médias e desvio padrão da densitometria de bandas para a enzima MMP-9, nas formas

ativa (MMP-9A) e latente (MMP-9L), entre os grupos controle e experimentais, e

respectivo desvio padrão. Colunas marcadas pela mesma letra não diferem entre si.

Gc Gi Gnt Gt

Densitometria de Banda (x103 pixels)

C_MMP9/NGAL

Figura 14 – Médias e desvio padrão da densitometria de bandas para o complexo MMP-9/NGAL

(C_MMP-9/NGAL) entre os grupos controle e experimentais, e respectivo desvio padrão.

Colunas marcadas pela mesma letra não diferem entre si.

7. DISCUSSÃO

As principais alterações morfológicas observadas no tecido laminar foram,

principalmente, a presença de núcleos esféricos, afilamentos das LES e redução

do espaço entre as LES, alterações estas que caracterizam os eventos iniciais da

laminite, segundo CROSER & POLLITT (2006). Estas alterações foram mais

acentuadas nos animais dos grupos submetidos aos procedimentos cirúrgicos (Gi,

Gt e Gnt), os quais apresentaram escore variando de 0 a 1,5. Os animais com

escore 1,5 apresentaram as características próximas às descritas por POLLITT

(1996) para o escore 2, no entanto não foi notado aumento significativo da

distância entre a MB e o eixo queratinizado da LEP. Face ao exposto, foram

classificadas seguindo uma nova proposta, como escore 1,5 (Figura 3). Alguns

cortes histológicos demonstraram membrana basal com aspecto irregular e

borrado, de contorno indefinido em alguns segmentos. Esta característica pode

estar relaciona à degradação da MB, na fase inicial, provavelmente por MMPs, e

que leva à falência da união entre as lâminas dérmicas e epidérmicas (POLLITT,

1996; POLLITT & DARADKA, 1998; CROSER & POLLITT, 2006).

Todos os animais dos grupos submetidos aos procedimentos cirúrgicos (Gi,

Gt e Gnt) apresentaram alterações morfológicas, sendo que a diferença de

intensidade observada entre as alterações dos grupos obstruídos (Gt e Gnt) e do

Gc indicam que o dano provocado pela isquemia intestinal pode lesar o tecido

laminar, predispondo à laminite.

Os dados obtidos por meio da obstrução luminal dos equinos trazem

evidências passíveis de serem associadas com a fase de desenvolvimento da

laminite. Existem diversos achados experimentais demonstrando a participação da

resposta inflamatória sistêmica na fase inicial da laminite, como aumento de

citocinas inflamatórias (LOFTUS et al., 2007; NOSCHKA et al., 2009), infiltração

leucocitária (BLACK et al., 2006; HURLEY et al., 2006; LOFTUS et al., 2006) e

espécies reativas de oxigênio (HURLEY et al., 2006), e o desenvolvimento desta

afecção podal pode ser visto como consequência deste processo inflamatório

afetando locais distantes, semelhante a falência orgânica no homem (BELKNAP et

al., 2009). O modelo de injuria intestinal vem sendo utilizado, em outras espécies,

como indutor de sepse, a qual está intrinsecamente relacionada à inflamação

sistêmica (BENJAMIN, 2001), e pode, ainda, ocorrer pelas lesões de isquemia-

reperfusão intestinal (BIANCO-BLATLLES et al., 2008), que provavelmente

ocorreram durante a obstrução luminal dos animais deste experimento. FALEIROS

et al., (2006) relataram, em quadro semelhante, que a distensão do cólon menor

induz acúmulo pulmonar de neutrófilos.

As espécies reativas de oxigênio, liberadas por meio da injúria de isquemia-

reperfusão são moléculas instáveis, desestruturando proteínas e carboidratos

(HALLIWELL, 1989; CAMPOS & YOSHIDA, 2004), além de ativar as

metaloproteinases (JOHNSON, 2004). Além disso, o estresse oxidativo gerado

pode causar injúria à membrana mitocondrial, causando alteração da respiração

celular e, também, a ativação da apoptose (NATHAN & SINGER, 1999). Como

existe um aumento desta substância em animais no período de desenvolvimento

da laminite tanto em concentrações sistêmicas (HURLEY et al., 2006) como local,

no tecido laminar (YIN et al., 2008), provavelmente exista relação da mesma com

a laminite.

As lesões teciduais encontradas nos tecidos laminares destes equinos

foram mais intensas do que as relatadas por RIO TINTO et al. (2004),

possivelmente em função do período de 12 horas de reperfusão intestinal

utilizadas por estes autores, o qual foi inferior às 18 horas aqui empregadas.

Esses dados indicam que a gravidade das lesões laminares estão relacionadas ao

tempo de ocorrência de injúria intestinal.

A ausência de diferença entre as lesões encontradas nos cavalos

submetidos ao procedimento cirúrgico, porém sem obstrução (Gi), com aquelas

dos grupos obstruídos (Gt e Gnt) demonstra que a realização da enterotomia pode

deflagrar alterações do tecido laminar, ainda que menos intensas que as anotadas

nos grupos obstruídos, uma vez que não houve diferenças entre as lesões do Gi

com o grupo controle (Gc). Sabe-se que a laparotomia leva a redução da

motilidade intestinal, provavelmente pela manipulação das alças durante a

manobra cirúrgica, associada à liberação de prostaciclinas (GOTTLIEB et al.,

1989; FUKUDA et al., 2005), e predisposição à translocação bacteriana intestinal

(REDDY et al., 2006), os quais estariam relacionados ao desenvolvimento da

resposta inflamatória sistêmica, fato que justificaria as alterações laminares

encontradas nos animais submetidos a enterotomia. HIKI et al. (2006)

demonstraram que ocorre aumento significativo de citocinas inflamatórias e

concentrações sistêmicas de endotoxinas em suínos submetidos à gastrectomia

com o método tradicional, com manipulação intestinal quando comparado à

animais submetidos à gastrectomia por laparoscopia e animais com laparotomia

sem manipulação de alças. Diferente do que ocorre na medicina humana, foi

constatado que na extremidade dos membros de equinos ocorre vasoconstrição

digital, mediada pela prostaciclina, descrito por MENZIES-GOW et al. (2008),

sendo, talvez, uma também explicação plausível para as alterações morfológicas

observadas.

Segundo POLLITT (1996), as alterações do tecido laminar classificadas

com escore superior a 1 induzem sinais clínicos de laminite, e alterações como

esta foram observadas em vinte e sete por cento dos equinos dos grupos

experimentais, Gi, Gt e Gnt (escore 1,5). Considerando que a evolução da laminite

secundária ao quadro de abdômen agudo transcorre entre 24 a 48 horas (WHITE,

1990), caso estes animais não fossem sacrificados no período de tempo de 18

horas de reperfusão intestinal, poderiam desenvolver alterações posturais e

locomotoras características da enfermidade. No entanto é impossível afirmar que

o quadro seria de laminite com sintomatologia clínica, e talvez estas alterações

seriam sub-clínicas, pois apenas 25% dos animais com afecções gastrintestinais

desenvolvem sinais clínicos de laminite (COHEN et al., 1994).

As alterações sutis (escore 0,5) observadas em alguns animais do grupo

controle (15%) podem ser consideradas passíveis de ocorrer em animais normais,

induzidas por processo inflamatório sistêmico de pequena gravidade.

A caspase 14 é uma enzima não apoptótica que participa da diferenciação

celular dos queratinócitos, formando o extrato córneo da pele (HATHAWAY &

KUECHLE, 2002). O tecido laminar tem origem epidérmica, e possivelmente

poderia expressar esta caspase. Todavia, não houve imunomarcação para a

caspase 14 nos cortes histológicos, corroborando com os achados de FALEIROS

et al. (2004) e SOUZA (2007), o que confirma sua inexistência no tecido laminar.

A fragmentação do núcleo formando os corpos apoptóticos caracteriza a

apoptose, e ocorre pela ativação da DNAase nuclear por meio da caspase 3

(McILROY et al., 1999). A imunomarcação para a caspase 3, denotando a

presença de apoptose, foi observada nos cortes histológicos dos animais deste

estudo, no entanto, o número de células imunomarcadas apresentou grande

variabilidade até dentro do mesmo grupo. Este fato demonstra que durante a fase

inicial da lesão laminar não ocorre ativação excessiva das caspases, uma vez que

os dados dos grupos submetidos aos procedimentos cirúrgicos (Gi, Gt e Gnt) não

diferiram do grupo controle. A apoptose está presente nos tecidos normais de

maneira fisiológica, como observado neste estudo e também nos achados de

FALEIROS et al., (2004) e SOUZA (2007), provavelmente promovendo a

renovação celular. FALEIROS et al. (2004) relataram aumento da taxa de

apoptose em cavalos com laminite naturalmente adquirida, com até uma semana

de evolução, quando comparados a animais no período prodrômico ou com

laminite crônica. SOUZA (2007) observou aumento de células apoptóticas em

equinos após 48 horas de indução da laminite. Desta forma, a ocorrência da

apoptose deve estar associada à gravidade das lesões encontradas na laminite,

evidentes no período mais tardio ao início do desenvolvimento da doença, quando

já houve manifestação da sintomatologia clínica.

Em humanos, a apoptose apresenta ligação com lesões de isquemia, sendo

detectada mais frequentemente durante o período de reperfusão (OLIVETTI et al.,

1997). Acredita-se que as espécies reativas de oxigênio e as MMPs, estimuladas

pela injúria de isquemia e reperfusão, possam ativar a cascata de apoptose

(CHEUNG et al., 2000).

O tecido laminar não exibe a presença de edema e necrose, segundo

POLLITT (2004), e como a apoptose é uma forma de morte celular que não

desencadeia reação inflamatória local (MEAGHER et al., 1992; COHEN, 1993),

seu aumento no tecido laminar de animais com sinais clínicos da doença, como

observado por FALEIROS et al. (2004), explicaria a falência das CB que ocorre na

fase prodrômica da laminite. Porém, tal fato não ocorreu neste trabalho.

Embora não se tenha elementos que suportem esta hipótese, poder-se-ia

pensar que a ativação da cascata apoptótica possa estar relacionada a

regeneração e renovação tecidual na laminite, como tentativa de se restabelecer a

integridade estrutural do tecido laminar, considerando que as lesões teciduais

foram deflagradas sem sua participação e que esse evento ocorre no tecido

normal, provavelmente com esta mesma função.

A maioria dos estudos tanto da medicina humana como veterinária utiliza

técnicas de imunohistoquímica e zimografia para detecção de MMP-2 e 9 nos

tecidos. O estudo imunohistoquímico apresenta a localização tecidual de cada

MMP. Entretanto pode, às vezes, resultar em falso positivo baseado em reações

cruzadas não específicas. Já a zimografia demonstra a ação proteolítica mais do

que a antigenicidade e assim fornece medidas semi-quantitativas, além de

distinguir as formas ativa e latente (pró-enzima) das MMPs (PEREIRA et al.,

2006).

A imunomarcação foi específica para as MMPs. A marcação foi difusa na

LES, corando o citoplasma das CB. Desta forma, a classificação foi baseada em

MORALES et al (2007), estabelecendo escores para a intensidade de

imunomarcação.

A expressão local das MMPs por meio da classificação empregada

mostrou-se satisfatória para este fim, uma vez que houve aumento da intensidade

de imunomarcação nos animais dos grupos com procedimento cirúrgico (Gi, Gt e

Gnt) que era esperado devido às alterações morfológicas encontradas nestes

animais. E estes achados foram respaldados pela resposta semelhante

encontrada para a atividade enzimática destas proteases obtida pela técnica de

zimografia.

Houve aumento da imunomarcação e atividade das formas latente e ativa

da MMP-2 nos animais dos grupos Gt e Gnt, os quais apresentaram lesões

laminares superiores aos animais normais do grupo controle. O grupo

instrumentado apresentou valores intermediários de MMP-2 imumarcada,

relacionada, desta forma, às alterações morfológicas observada nestes animais,

com intensidade igualmente intermediária comparada aos demais grupos. Esse

resultado foi semelhante aos resultados de KYAW-TANNER & POLLITT (2004) no

tecido lesado pela indução experimental de laminite. Em estudo utilizando gelo

para prevenir a laminite, observou-se também relação da MMP-2 com as

alterações, sendo que o casco que não desenvolveu a enfermidade não

apresentou aumento da protease (VAN EPS & POLLITT, 2004). As MMPs estão

associadas ao desenvolvimento da laminite pela degradação excessiva do

colágeno na MB (POLLITT, 1994; MUNGALL et al., 2001). Os resultados da MMP-

2 aqui vistos indicam que existe relação de dependência entre a intensidade das

lesões laminares e o aumento da protease. Todavia, nem sempre se observa o

aumento na fase prodrômica da laminite induzida (MUNGALL & POLLITT, 1999;

LOFTUS et al., 2006; LOFTUS et al., 2007) ou na laminite naturalmente adquirida

(LOFTUS et al., 2008), o que questiona sua real participação na patogenia da

doença. Lesões musculares demonstram durante a fase inicial de inflamação

aumento de ambas as MMPs, enquanto na fase de regeneração há redução da

MMP-9 e concentrações permanentemente elevadas de MMP-2 (ZIMOWSKA, et

al., 2008). Portanto, o aumento da MMP-2 em lesões teciduais pode estar

relacionado, devido a sua expressão constitutiva, com a regeneração e renovação

tecidual (COCHRANE et al., 1995; SEIFERT et al., 1996).

Equinos na fase prodrômica da laminite, induzida ou de ocorrência natural,

possuem aumento de MMP-9 (MUNGALL & POLLITT, 1999; LOFTUS et al., 2006;

LOFTUS et al., 2007). Os animais deste estudo também exibiram essa resposta,

com elevação da MMP-9 nos grupos com injúria intestinal, tanto por meio da IHQ

como da zimografia. Certos estudos encontraram aumento da forma latente, ou

pró-enzima, da MMP-9 durante a fase de desenvolvimento da laminite (MUNGALL

& POLLITT, 1999; LOFTUS et al., 2006; LOFTUS et al., 2008), no entanto, não foi

observada diferença em relação à MMP-9 latente neste modelo, provavelmente

pelo grande desvio padrão entre as amostras.

A MMP-9 tem sido associada ao desenvolvimento da injúria tecidual em

vários órgãos, principalmente pela sua forte associação com a infiltração

neutrofílica (LOFTUS et al., 2006; CHAKRABARTI et al., 2006; MIKAMI et al.,

2009). Houve aumento significativo da forma de MMP-9 conjugada ao NGAL

(C_MMP-9/NGAL), um composto associado a neutrófilos, o que suporta a

participação da MMP-9 na resposta inflamatória. Todavia não foi observada

relação de dependência entre esta protease e a intensidade das lesões teciduais,

o que indica que a MMP-9 contribui para a patogênese da laminite, mas de forma

secundária, uma vez que a enfermidade possui caráter multifatorial.

Não foi possível verificar a presença de leucócitos nos cortes do tecido

laminar, pois para isso deveriam ser empregados outros métodos laboratoriais

(BLACK et al., 2006; FALEIROS et al., 2008). Contudo, a presença da MMP-9

conjugada ao NGAL sugere que houve infiltração leucocitária nos animais dos

grupos Gi, Gt e Gnt, pois esta substância tem sido relacionada à infiltração

leucocitária tecidual sendo, inclusive, empregada como biomarcador de lesão

tecidual e de neutrófilos (NIELSEN et al., 1996; HEMDAHL et al., 2006, GUPTA et

al., 2007; BU et al., 2008; SMITH et al., 2008). Do mesmo modo, não houve

expressão da mesma no grupo controle, os quais supostamente não possuem

leucócitos ativados no tecido laminar (LOFTUS et al., 2006).

BLACK et al. (2006) analisando a microvasculatura dérmica do tecido

laminar do casco de animais com laminite induzida por extrato de nogueira preta,

observaram aumento no número de leucócitos, indicando similaridade com a

falência orgânica que ocorre na sepse humana, onde a migração leucocitária

desempenha papel lesivo significativo. Porém existem evidências de que o

processo inflamatório que precede a doença é sistêmico, e não apenas local, com

ativação de leucócitos sanguíneos (HURLEY et al., 2006).

A administração de glicocorticóides, em altas doses e por períodos

prolongados leva ao desenvolvimento da laminite (JOHNSON et al., 2002)

provavelmente devido à indução de resistência à insulina (TYLEI et al., 2007), ou

redução da perfusão sanguínea do casco (CORNELISSE et al., 2006), como

relatado por RYU et al (2004), em que um equino desenvolveu laminite aguda e

hepatopatia pela administração de triamcilonona durante dez dias consecutivos.

Considerando os achados deste estudo, não se pode concluir que a hidrocortisona

agravou as alterações morfológicas nos animais submetidos ao procedimento

cirúrgico (Gt), pois não houve diferença com aquelas do grupo que não recebeu

tratamento, corroborando com RIO TINTO et al. (2004).

ALJADA et al. (2001) observaram que a administração de hidrocortisona

inibe a atividade das MMPs 2 e 9. Todavia, esse efeito só foi observado em

relação a MMP-9 imunomarcada e a forma conjugada ao NGAL, os quais não

foram diferentes do grupo controle, apresentando valores intermediários entre os

grupos. Não foi possível observar efeito da hidrocortisona sobre a atividade da

MMP-2, a qual foi semelhante entre todos os animais submetidos ao procedimento

cirúrgico (Gi, Gt e Gnt).

A evolução da laminite, até o aparecimento dos sinais clínicos,

normalmente varia de 24 a 48 horas em animais com síndrome cólica (WHITE,

1990), sem que necessariamente ocorra estabilização da lesão laminar. Desta

forma, talvez o efeito da hidrocortisona, reduzindo as concentrações de MMP-9 e

da possível infiltração leucocitária, pudesse ser visualizado numa fase mais tardia,

considerando que as lesões pudessem ainda evoluir. Há, ainda, que se ponderar

que talvez houvesse a necessidade de outra administração de hidrocortisona, pois

sua meia-vida é menor que 12 horas, com duração de efeito de apenas 8 horas

(BEHREND & KEMPPAINEN, 1997), para controlar efetivamente a ativação

inflamatória desencadeada pela obstrução intestinal.

Estes resultados fornecem apenas indícios de que a hidrocortisona possa

trazer benefício para a prevenção da laminite. Deve-se destacar que a

administração deste costicosteróide não agravou as lesões teciduais, o que indica

que ele possa ser administrado em equinos com afecções agravadas pela

ativação sistêmica, com o intuito de coibir seus efeitos deletérios, como redução

de mediadores inflamatórios e do estresse oxidativo (KAUFMANN et al., 2008).

8. CONCLUSÕES

O modelo de injúria intestinal por obstrução jejunal foi eficiente em

reproduzir o quadro sistêmico presente nas afecções gastrintestinais necessário

para a observação de alterações laminares, com consequente aumento das

concentrações de metaloproteinases e provável infiltração leucocitária no tecido

laminar.

A apoptose não apresenta envolvimento com as lesões laminares durante

a fase inicial de desenvolvimento da doença.

A expressão de MMP-2 está relacionada à gravidade das alterações

morfológicas do tecido laminar. Mas não é possível afirmar que tenha relação

direta com a patogênese da laminite

A hidrocortisona reduz a expressão da MMP-9 no tecido laminar,

principalmente relacionada a leucócitos. Sua administração não agravou as lesões

do tecido laminar, tampouco a apoptose e a expressão de MMP-2, denotando

segurança para utilizá-la na terapia de equinos acometidos por afecções

gastrintestinais.

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