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VINICIUS DE TOLEDO RIBAS
PARTICIPAÇÃO DE JNK NA FOSFORILAÇÃO
DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO ATF-2 E
NA DEGENERAÇÃO RETRÓGRADA DAS
CÉLULAS GANGLIONARES DA RETINA,
INDUZIDA POR AXOTOMIA.
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE
EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2007
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ii
Participação de JNK na fosforilaçao do fator de transcrição
ATF-2 e na degeneração retrógrada das células ganglionares
da retina, induzida por axotomia.
Vinicius de Toledo Ribas
Dissertação submetida à Universidade Federal
do Rio de Janeiro para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica)
Orientador: Prof. Luciana Chiarini
Co-Orientador: Prof. Rafael Linden
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Março – 2007
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iii
Ficha Catalográfica:
Ribas, Vinicius de Toledo
Participação de JNK na fosforilaçao do fator de transcrição ATF-2 e na
degeneração retrógrada das células ganglionares da retina, induzida por
axotomia / Vinicius de Toledo Ribas. Rio de Janeiro: UFRJ/IBCCF, 2007.
N° de folhas xii, 97p.
Dissertação: Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica) – UFRJ, IBCCF
1.Retina 2. Morte celular programada 3. ATF-2
I. Participação de JNK na fosforilaçao do fator de transcrição ATF-2 e na degeneração
retrógrada das células ganglionares da retina, induzida por axotomia.
II. Mestre
iv
Vinicius de Toledo Ribas
Participação de JNK na fosforilaçao do fator de
transcrição ATF-2 e na degeneração retrógrada das
células ganglionares da retina, induzida por axotomia
Dissertação submetida à Universidade Federal
do Rio de Janeiro para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica)
Rio de Janeiro, 16 de março de 2007
_________________________________________
(Prof
a
. Cláudia Campos, Membro da Banca)
_________________________________________
(Prof
a
. Maria Christina Fialho de Mello, Membro da Banca)
_________________________________________
(Prof. Cláudio Akio Masuda, Membro da Banca)
_________________________________________
(Prof
a
. Cecília Hedin Pereira, Revisora e Suplente)
_________________________________________
(Prof
a
. Silvana Allodi, Suplente)
_________________________________________
(Prof
a
. Luciana Barreto Chiarini, Orientadora)
_________________________________________
(Prof. Rafael Linden, Co-orientador)
v
Dedico esta dissertação a todas as pessoas
que contribuíram, de alguma forma
para a concretização
deste trabalho.
vi
Agradecimentos:
Aos meus Pais, pois sem eles eu não existiria.
Aos meus tios Alonso e Carmen, por terem me criado e dado a oportunidade de estudar.
A minha namorada Olga, sempre ao meu lado me incentivando.
A minha tia Lídia, por ter me acolhido quando vim morar no Rio de Janeiro.
A minha irmã Daniela e meu irmão Junior, por terem me ajudado sempre.
A minhas primas Karina e Carolina, que foram como irmãs.
Aos meus orientadores Luciana Chiarini e Rafael Linden pelas críticas construtivas e por me
incentivarem em todas as minhas decisões.
A minha sogra Patrícia que sempre me ajudou.
A toda minha família que sempre acreditou em mim.
A Professora Cecília Hedin: por ser minha revisora na dissertação de mestrado.
A todos os membros do Laboratório de Neurogênese, que sempre me ajudaram tirando
dúvidas.
Aos técnicos Gildo, Tibúrcio, Nilson e Talita.
A Sandrinha e Diogo da secretaria de pós-graduação, sempre ajudando.
A todos os meus professores, por me ensinarem tudo que sei sobre ciência.
Aos meus amigos pelas horas de lazer e descontração.
vii
Esta dissertação foi desenvolvida na vigências de auxílios concedidos pela Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo a Pesquisa do
Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), PRONEX-MCT.
viii
RESUMO
Na retina em desenvolvimento a degeneração de células ganglionares pode
ser bloqueada por inibidor da síntese protéica. Isso sugere que a expressão de
genes específicos é necessária para o programa de morte celular. Nesse estudo, foi
investigado o comportamento do fator de transcrição ATF-2 e das cinases que o
ativam, p38 e JNK, durante a degeneração retrógrada induzida por axotomia, das
células ganglionares da retina.
Explantes de retina de ratos neonatos foram preparados e mantidos in vitro
por diferentes intervalos de tempo e sob diferentes tratamentos após a axotomia das
células ganglionares. Cortes transversais de explantes retinianos foram usados para
detecção da proteína ATF-2 através de imunohistoquímica com o anticorpo sc-187.
Foram usados também os anticorpos fosfo-ATF-2 (Thr69/71) para a detecção de
ATF-2 fosforilado nos resíduos Thr 69 e Thr 71, fosfo-p38 e fosfo-JNK. A
condensação da cromatina é uma característica da morte celular programada, e foi
detectada após marcação com intercalante de DNA fluorescente Sytox Green. A
localização subcelular de ATF-2 foi analisada por dupla marcação com Sytox Green
e anticorpo contra ATF-2. Os cortes de explantes retinianos foram analisados por
microscopia de fluorescência e microscopia confocal. A expressão de ATF-2 na
retina em desenvolvimento foi analisada também por Western blot.
Na retina de ratos neonatos, a proteína ATF-2 está localizada
predominantemente no núcleo das células ganglionares. Foi detectada uma perda
progressiva da imunorreatividade para ATF-2 após a axotomia das células
ganglionares. Imunorreatividade para ATF-2 foi observada no núcleo apenas nas
células com a cromatina normal mesmo após 18 horas da axotomia. O tratamento
de explantes de retina com o inibidor da síntese protéica anisomicina bloqueia a
perda da imunorreatividade para ATF-2 e a morte celular induzida pela axotomia das
células ganglionares.
Foi verificado que após a axotomia das células ganglionares ocorre a
fosforilação de ATF-2 nos resíduos Thr69/71. Três horas após a axotomia há um
pico de fosforilação de ATF-2, que precede o pico de morte celular que ocorre após
18 horas. Foi verificado também por imunohistoquímica que apenas JNK está sendo
fosforilada nas células ganglionares, o que não aconteceu com a cinase p38.
O tratamento com um inibidor de JNK bloqueia completamente a
fosforilação de ATF-2 e quase totalmente a morte das células ganglionares.
Entretanto o tratamento com um inibidor de p38 não interferiu na fosforilação de
ATF-2 e apenas diminui um pouco a taxa de morte das células ganglionares.
Os resultados mostraram que a fosforilação de ATF-2 e a degeneração
retrógrada das células ganglionares da retina induzida pela axotomia ocorrem de
forma dependente da ativação de JNK.
ix
ABSTRACT
In the developing retina the degeneration of ganglion cells can be blocked by
an inhibitor of protein synthesis. This suggests that the expression of specific genes
is necessary for the program of cell death. In this study, the behavior of both the
transcription factor ATF-2 and of cinases that activate ATF-2, p38 and JNK, was
investigated during retrograde degeneration of retinal ganglion cells induced by
axotomy.
Explants of the retina of neonatal rats were prepared and kept in vitro for
various intervals and under different treatments after axotomy of the ganglion cells.
Cross sections of retinal explants were used for the detection of protein ATF-2 by
imunohistochemistry with the antibody sc-187. Antibodies to phospho-ATF-2
(Thr69/71), for the detection of ATF-2 phosphorylated in residues Thr 69 and Thr 71,
to phospho-p38 and to phospho-JNK were also used. The condensation of the
chromatin is a characteristic of programmed cell death, and was detected using the
fluorescent DNA marker Sytox Green. The subcellular localization of ATF-2 was
analyzed by double staining with both Sytox Green and antibody to ATF-2. The
sections of retinal explantes were analyzed by both fluorescence and confocal
microscopy. The expression of ATF-2 in the developing retina was also analyzed by
Western blot.
In the retina of neonatal rats, the ATF-2 protein is predominantly located in the
nucleus of the ganglion cells. It was verified that a gradual loss of the imunorreactivity
for ATF-2 occurs after axotomy of the ganglion cells. ATF-2 imunorreactivity in the
nucleus was observed only in cells with normal chromatin at 18 hours after axotomy.
The treatment of retinal explants with the inhibitor of the protein synthesis anisomicin,
blocked both the loss of ATF-2 imunorreactivity and the cell death induced by the
axotomy of the ganglion cells.
It was found that following axotomy of the ganglion cells, phosphorylation of
ATF-2 occurred in the residues Thr69/71. The peak of phosphorylation of ATF-2
occurs within 3 hours after axotomy, and precedes the peak of cell death that occurs
at 18 hours. It was also verified by imunohistochemistry that only JNK is
phosphorylated in the ganglion cells, but not p38.
Treatment with a JNK inhibitor completely blocked the phosphorylation of ATF-
2 and almost completely the death of the ganglion cells. However, the treatment with
an inhibitor of p38 did not change the phosphorylation of ATF-2 and reduced only
slightly the rate of ganglion cell death.
The results showed that both the phosphorylation of ATF-2 and the retrograde
degeneration of the retinal ganglion cells induced by axotomy depend on the
activation of JNK.
x
Lista de Abreviaturas:
ANI – anisomicina
APAF-1 – fator ativador de protease apoptótica
ATF-2 – Activating Transcription Factor 2
bZIP- zipper de leucina
CAD – desoxiribonuclease ativada por caspase
CTR – controle
d-ATP – adenosina trifosfato
DNA – ácido desoxirribonucleico
GCL – camada de células ganglionares
HAT – histona acetil-transferase
ICAD – proteína inibidora de desoxirribonuclease ativada por caspase
INL – camada nuclear interna
IPL – camada plexiforme interna
JNK/SAPK – c-Jun N-terminal cinase/proteína cinase ativada por estresse
MAPK – proteína cinase ativada por mitógenos
NBL – camada neuroblástica
NGF – fator de crescimento neuronal
ONL – camada nuclear externa
OPL – camada plexiforme externa
RNA – ácido ribonucléico
RPE – epitélio pigmentado
SB – inibidor de p38
SP – inibidor de JNK
TNF – fator de necrose tumoral
Thr69/71 – Treoninas 69 e 71
xi
SUMÁRIO:
RESUMO...................................................................................................... VII
ABSTRACT.................................................................................................. IX
Lista de Abreviaturas.................................................................................. X
INTRODUÇÃO.............................................................................................. 01
Morte celular................................................................................................ 01
Mecanismos de morte celular programada.............................................. 05
ATF-2 (activating transcription factor 2)................................................... 10
MAPKs (JNK e p38)..................................................................................... 14
Figura 1 - Esquema de sinalização por MAPKs em mamíferos........... 15
MAPK e morte celular no tecido nervoso................................................. 19
A retina......................................................................................................... 21
Figura 2 - Esquema da retina de ratos neonatos (A) e de
ratos adultos (B).................................................................................... 25
O modelo de explantes de retina............................................................... 26
MAPKs e morte celular na retina............................................................... 27
Figura 3 – Expressão de ATF-2 nas células ganglionares da
retina de rato neonato........................................................................... 31
OBJETIVOS.................................................................................................. 32
METODOLOGIA........................................................................................... 33
Preparação de explantes e cortes histológicos....................................... 33
Coloração histológica com vermelho neutro........................................... 34
Detecção de morte celular programada.................................................... 35
Metodologia de contagem da camada de células ganglionares............ 35
Imunohistoquímica..................................................................................... 36
xii
Extração de proteínas................................................................................. 38
Dosagem de proteínas pelo método de Bradford.................................... 38
Western blot................................................................................................ 39
RESULTADOS............................................................................................. 40
Expressão de ATF-2 na retina de ratos neonatos.................................... 40
Figura 4 - Expressão de ATF-2 na retina de rato neonato................... 41
Figura 5 - Expressão de ATF-2 nas células ganglionares da retina
de rato neonato..................................................................................... 42
Após a axotomia, as células ganglionares da retina
sofrem morte celular programada............................................................. 43
Figura 6 - Degeneração retrógrada de células ganglionares
após axotomia....................................................................................... 45
Desaparecimento de ATF-2 associado com a degeneração
retrógrada das células ganglionares........................................................ 46
Figura 7 - Localização sub-celular de ATF-2 após axotomia das
células ganglionares............................................................................. 48
Figura 8 - Análise de ATF-2 após indução de degeneração
retrógrada das células ganglionares..................................................... 49
Anisomicina bloqueia o desaparecimento de ATF-2 induzido pela
axotomia das células ganglionares da retina........................................... 50
Figura 9 - Anisomicina bloqueia o desaparecimento de ATF-2
após axotomia das células ganglionares da retina............................... 51
Após a axotomia ocorre a fosforilação de ATF-2 nos
resíduos Thr 69 e Thr 71............................................................................. 52
Figura 10 - Imunohistoquímica para ATF-2 fosforilado........................ 53
Figura 11 - Fosforilação de ATF-2 nos resíduos Thr 69 e Thr 71
após axotomia das células ganglionares.............................................. 54
xiii
JNK é responsável por fosforilar ATF-2 após a
axotomia das células ganglionares........................................................... 55
Figura 12 - Fosforilação de JNK na camada de células
ganglionares.......................................................................................... 57
Figura 13 - Imunohistoquímica para ATF-2 fosforilado,
após inibição de JNK ou p38................................................................ 58
Figura 14 – O inibidor de JNK bloqueia a fosforilaçao de ATF-2......... 59
O inibidor de JNK bloqueia a morte das células
ganglionares da retina................................................................................ 60
Figura 15 - Inibição de JNK bloqueia a degeneração das
células ganglionares induzida por axotomia........................................ 62
Figura 16 - Inibição de JNK diminui o número de células
ganglionares com a cromatina condensada......................................... 63
DISCUSSÃO................................................................................................. 64
ATF-2 e degeneração de células ganglionares da retina........................ 64
Localização subcelular de ATF-2.............................................................. 66
Desaparecimento da marcação de ATF-2 nas células
ganglionares em degeneração.................................................................. 67
Ativação de ATF-2 e a morte celular programada de células
ganglionares da retina................................................................................ 69
Degradação de ATF-2 e morte celular....................................................... 72
JNK e fosforilação de ATF-2 nas células ganglionares axotomizadas.. 73
JNK e degeneração das células ganglionares da retina......................... 75
ATF-2 e outros alvos de JNK..................................................................... 76
p38 e degeneração de células ganglionares............................................ 78
Conclusões.................................................................................................. 80
BIBLIOGRAFIA............................................................................................ 81
1
INTRODUÇÃO
Morte celular
O estudo ultraestrutural clássico de Kerr e colaboradores (Kerr et al., 1972)
mostrou evidências de que ocorrem pelo menos dois tipos distintos de morte celular:
O primeiro chamado de necrose, uma violenta e rápida forma de degeneração que
afeta uma grande população celular. As características da necrose são: rompimento
da membrana plasmática, destruição de organelas, liberação de componentes
intracelulares que levam ao desenvolvimento de um processo inflamatório, afetando
as células vizinhas. Esse tipo de morte celular pode ser causado por traumas
intensos, altas concentrações de detergente, agentes oxidantes e pela alta
intensidade de danos patológicos (Nicotera et al., 1999).
No trabalho de Kerr e colaboradores foi observado ao redor da lesão
necrótica, células com características morfológicas distintas das células necróticas,
como a condensação da cromatina (Kerr et al., 1972). Esse tipo de morte celular foi
denominado de apoptose. Nessa época a necrose era considerada como um tipo de
morte celular acidental, uma degeneração descontrolada, enquanto que a apoptose
era definida como sendo um tipo de morte celular programada. Durante muitos anos,
a morte celular foi usualmente classificada desta forma dicotômica..
Entretanto, atualmente, evidências mostram que existem vários tipos de morte
celular programada que variam de acordo com o estímulo, o tipo celular, e o
mecanismo responsável por executá-la. O conceito de morte celular programada
consiste em uma seqüência de eventos baseada no metabolismo celular que
2
culmina com a morte celular, mas não necessariamente apresenta características
morfológicas da apoptose (Lockshin & Zakeri, 1991).
A forma de morte celular programada mais bem estudada é a apoptose. A
apoptose é um tipo de morte celular que foi primeiramente descrito através de
análises morfológicas por Kerr e colaboradores (Kerr et al., 1972). As características
da apoptose são: diminuição do volume celular, formação de convoluções de
membrana, condensação e marginalização da cromatina, exposição de
fosfatidilserina, acompanhadas porém, pela manutenção da integridade de
organelas citoplasmáticas (Kerr et al., 1972). Por último formam-se corpos
apoptóticos, formados por fragmentos das células mortas, que são rapidamente
fagocitados por macrófagos ou células vizinhas (Wyllie, 1980, Walker et al, 1988).
Por isso, poucas células apoptóticas são encontradas in vivo, mesmo quando um
grande número está morrendo.
Bioquimicamente, a apoptose é caracterizada pela clivagem
internucleossomal do DNA (ácido desoxiribonucléico) em fragmentos múltiplos de
180-200 pares de bases por ação de endonucleases. Esse padrão de clivagem pode
ser detectado, após a separação dos fragmentos de DNA, através de eletroforese
em gel de agarose (Wyllie et al., 1984). Entretanto, a fragmentação do DNA não é
determinante para o processo de apoptose, pois não é em todos os tipos celulares
que a inibição da endonuclease bloqueia a apoptose (Cohen et al., 1992; Nakamura
et al., 1995).
Um outro tipo de morte celular programada é a autofagia (Clarke, 1990).
Células no estágio inicial da autofagia contém vários vacúolos autofágicos. A
mitocôndria, complexo de Golgi e o retículo endoplasmático estão algumas vezes
dilatados. A membrana plasmática perde especializações como os complexos
3
juncionais. Em alguns casos, uma intensa taxa de endocitose é observada, levando
a uma redução da área da membrana plasmática. Durante os estágios tardios,
ambos o número e o tamanho dos vacúolos aumentam (Clarke, 1990), podendo
haver a formação de núcleos picnóticos tardios (Schweichel & Merker, 1973).
Entretanto, na autofagia a condensação nuclear não é tão comum e nem tão
marcante como na apoptose (Clarke, 1990; para revisão Guimarães & Linden,
2004). O processo de autofagia também está relacionado normalmente com a
degradação de organelas e de proteínas (para revisão Kimura et al., 2006).
Em outra forma de morte celular programada, denominada necrose
programada (Guimarães & Linden, 2004), as organelas intracelulares incham, ocorre
a formação de espaços vazios no citoplasma e posterior lise celular. Sua descrição
se aproxima da necrose, sendo chamada também de necropoptose (Degterev et al.,
2005). Esse tipo de morte celular ocorre geralmente quando a via de morte celular
apoptótica está inibida (para revisão Leist & Jaattela, 2001).
Diversas patologias são causadas por distúrbios da homeostasia celular.
Evidências indicam que alterações do balanço entre morte e sobrevivência celular
contribuem para a patogênese de muitas doenças. Doenças relacionadas com a
supressão da morte celular programada incluem doenças autoimunes, como o
Lupus eritematoso (White & Rosen, 2003), o câncer (Reed, 1997; Hu & Kavanagh,
2003) e infecções virais, como por herpesvírus, poxvírus e adenovírus (Barber,
2001; Schultz & Harrington, 2003). Doenças relacionadas com o aumento da
incidência de morte celular programada incluem AIDS (Gougeon, 2003), o glaucoma
(Quigley et al., 1997; Ji et al., 2005) e doenças neurodegenerativas, como
Parkinson, Alzheimer, Huntington (Heidenreich, 2003; Jellinger, 2003; Vila &
Przedborski, 2003) e retinose pigmentar (Ripps, 2002).
4
A morte celular programada ocorre durante a embriogênese (Wyllie, 1980), no
sistema imune em desenvolvimento e maduro (Duvall & Wyllie, 1986) e na
eritropoese normal (Koury & Bondurant, 1990). Dois exemplos marcantes de morte
celular programada que ocorre durante o desenvolvimento, são a formação dos
dedos através da degeneração da membrana interdigital e a degeneração da cauda
do girino. A morte celular programada também tem sido documentada no
desenvolvimento do sistema nervoso central, incluindo a retina. A perda celular pode
chegar a 70-80% do número de neurônios existentes durante os estágios precoces
do desenvolvimento (Linden, 1994).
O processo de morte celular programada pode ser ativado ou inibido por uma
variedade de estímulos, relacionados com processos fisiológicos ou patológicos.
Podemos, simplificadamente, dividir o controle da morte celular programada em 3
níveis: sinais extracelulares e seus receptores; mecanismos de transdução de sinal,
segundos mensageiros e fatores de transcrição; e genes e proteínas moduladoras
da morte celular programada. A sensibilidade das células a diferentes estímulos de
indução e bloqueio de morte parece variar de acordo com o tipo celular e com as
condições de indução. Estudos revelaram que o contexto em que a célula se
encontra é importante para desencadear o programa de morte celular. O estágio de
desenvolvimento da célula, o tipo celular, as interações a que essas células foram
expostas, como fatores extracelulares (fatores tróficos, hormônios, citocinas e
neurotransmissores) e a matriz extracelular são fatores importantes para a ativação
do programa de morte celular (Sampath et al., 2003; Stupack & Cheresh, 2003;
Nilsson & Cleveland, 2003).
5
Mecanismos de morte celular programada
Os primeiros trabalhos sobre os mecanismos de morte celular programada
revelaram a existência de pelo menos dois mecanismos de indução de morte celular
programada: um que depende de síntese de novo de mediadores responsáveis por
ativar o programa de morte, sendo este bloqueado por inibidores de síntese protéica.
Outro, no qual foi mostrado haver um programa latente de morte celular
constantemente reprimido por proteínas responsáveis por sua inibição, e que era
ativado quando a síntese de proteínas estava inibida. Demonstrou-se em várias
situações que para que ocorra a morte celular é necessário que haja síntese de
novo de proteína e RNA (ácido ribonucléico), logo a expressão de genes específicos
é crucial para que esse programa de morte seja executado (Rehen & Linden, 1994;
Martin et al., 1998). Por sua vez, foi mostrado em macrófagos que a inibição da
transcrição induziu a morte por apoptose (Lewis et al., 1995). Entretanto, a morte
celular programada de células PC12 mantidas em meio de cultura sem soro e na
ausência de NGF (fator de crescimento neuronal) ocorreu independente da síntese
de proteínas e de RNA (Ruckenstein et al., 1991), sugerindo a existência de outro
mecanismo de execução independente da síntese protéica, envolvendo apenas a
regulação das moléculas presentes na célula.
Os primeiros estudos genéticos que levaram à identificação de proteínas que
eram necessárias para a ocorrência de morte celular programada foram feitos com o
nematódeo C. elegans (Ellis & Horvitz, 1986). Esses estudos levaram à identificação
de dois genes (ced-3 e ced-4) necessários para que ocorra a morte de 131 células
no processo de desenvolvimento (Ellis et al., 1991) e um gene (ced-9) capaz de
bloquear a morte celular programada (Hengartner et al., 1992). Esses genes do
6
nematódeo C. Elegans possuem homólogos em vertebrados que codificam uma
série de proteínas com papéis importantes na modulação da morte celular
programada.
O gene ced-3 codifica uma cisteína protease que é homóloga a uma família
de cisteína proteases de mamíferos (Yuan et al., 1993). Essas proteases são agora
referidas como caspases (Alnemri et al., 1996) e estão constitutivamente presentes
na forma de zimogênio na maioria das células, sendo chamadas de pró-caspases.
Para que ocorra a ativação das caspases é necessário que ocorra uma clivagem
proteolítica, que pode ser via auto-catálise, via ação de outras caspases ou outras
proteases. As caspases são divididas em duas classes: caspases iniciadoras e
caspases efetoras, que funcionam em uma cascata de ativação.
As caspases iniciadoras desempenham um papel regulatório no processo de
apoptose. Essas proteases são ativadas por diferentes estímulos, e uma vez
ativadas catalisam a clivagem das pró-caspases efetoras transformando-as em
caspases ativas. Existem três vias principais que ativam as caspases iniciadoras,
uma iniciada através da liberação de co-fatores no citosol da célula pela mitocôndria,
outra ativada pelo retículo endoplasmático e outra iniciada por receptores.
Na via de ativação pela liberação de co-fatores citosólicos ocorre a ativação
da caspase 9. Para que ocorra a ativação da caspase 9, é necessária a formação de
um complexo chamado apoptossomo. A formação do apoptossomo requer a
presença da pró-caspase 9, da proteína APAF-1 (fator ativador de protease
apoptótica, homólogo à proteína codificada pelo gene ced-4 do nematódeo C.
elegans), do citocromo c, que é liberado pela mitocôndria e do nucleotídeo d-ATP
(adenosina trifosfato). Na presença de todos esses componentes a caspase 9 se
7
torna ativa, podendo clivar e ativar a caspase 3, que é uma das principais caspases
efetoras.
O gene ced-9 de C. elegans possui um homólogo estrutural e funcional em
mamífero que é o gene bcl-2. A proteína Bcl-2 pertence à família Bcl-2. Essa família
possui proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 e Bcl-xL) e proteínas pró-apoptóticas (Bax,
Bid e Bad) que podem formar diferentes dímeros (Liston et al., 2003).
Estudos revelaram que a super-expressão de Bcl-2 pode inibir a apoptose de
diferentes tipos celulares induzida por diferentes estímulos. Entretanto, Bcl-2 não é
capaz de bloquear a apoptose em todas as situações. Demonstrou-se que a
atividade anti-apoptótica de Bcl-2 é devida ao bloqueio da ativação de caspases
efetoras, responsáveis pela fase de execução da apoptose (Green & Reed, 1998).
Dados da literatura sugeriram que a dimerização de Bad com proteínas anti-
apoptóticas como Bcl-2 e Bcl-xL permitia que Bax ficasse livre e promovesse a
apoptose (Yang et al., 1995). Foi descrito também que a fosforilação de Bad
promovia sua ligação com a proteína 14-3-3, com isso Bad não mais se ligaria a Bcl-
2 ou Bcl-xL e estes, agora livres, poderiam inibir a ação pró-apoptótica de Bax (Zha
et al., 1996). Uma hipótese da ação dessas proteínas é a formação de poros na
membrana da mitocôndria, controlando a passagem de moléculas como o citocromo
c, que é um co-fator importante para a ativação da caspase 9 (Schendel et al.,
1997).
Uma outra via de ativação de caspases iniciadoras é a via do retículo
endoplasmático. O retículo endoplasmático regula a síntese, o enovelamento e o
tráfego de proteínas, respostas celulares ao estresse e o nível intracelular de cálcio.
O retículo endoplasmático é altamente sensível a alterações na homeostase do
cálcio. Logo, agentes que depletam os níveis de cálcio no lúmen do retículo
8
endoplasmático, inibidores de glicosilação, estresse oxidativo e/ou acumulação de
proteínas mal enoveladas podem causar danos na sua função, resultando em um
evento chamado de “estresse do retículo endoplasmático” (para revisão Rao et al.,
2004). Se o estresse do retículo endoplasmático for duradouro, pode levar à morte
celular, através da ativação de três vias: ativação do fator de transcrição CHOP,
ativação da via de JNK (c-Jun N-terminal cinase) pelo complexo IRE1-TRAF2-ASK1,
e ativação de caspase 12. O estresse do retículo endoplasmático é detectado por
proteínas sensoras como: PERK, IRE1 e ATF-6. Proteínas mal enoveladas se ligam
à proteína GRP78/BiP, induzindo a dissociação de GRP78/BiP e PERK,
conseqüentemente permitindo a ativação de PERK. PERK ativa é responsável por
ativar eIF2-α, que por sua vez diminui a taxa de síntese de proteínas. O estresse do
retículo endoplasmático leva à dissociação de TRAF2 da caspase 12 e subsequente
dimerização e auto-clivagem da caspase 12 (para revisão Rao et al., 2004). A
dissociação de TRAF2 promove o recrutamento de ASK1 e JNK (Nishitoh et al.,
2002), com consequente ativação da via pró-apoptótica de JNK (para revisão Benn
& Woolf, 2004). Portanto, a via do retículo endoplasmático é uma importante via de
ativação de morte celular programada.
Na ativação por receptores de membrana, o sinal apoptótico pode ser
transmitido por receptores da família TNF (fator de necrose tumoral), que inclui o
receptor Fas. Esses receptores quando ativados, levam à ativação da pró-caspase
8, que agora ativa torna-se capaz de clivar e ativar a caspase 3. Após a ligação de
FasL com seu receptor Fas, ocorre a trimerização do receptor, com conseqüente
ativação da molécula adaptadora FADD, levando à ativação de caspase 8 (para
revisão Nagata, 1997). A ativação de caspase 8 pelo receptor TNF-R1 ocorre de
modo semelhante, entretanto é necessário uma molécula adaptadora TRADD para
9
que ocorra o recrutamento de FADD e ativação de caspase 8 (para revisão Leist &
Jaattela, 2001; Hsu et al., 1996). Os receptores de membrana Fas e TNF-R1 são os
principais receptores de morte conhecidos (para revisão Nagata, 1997).
A função das caspases efetoras, como a caspase 3, ocorre no estágio final da
apoptose, chamado de execução. Essas caspases são as responsáveis pela
degeneração da célula. Um dos substratos celulares clivados pelas caspases
efetoras são proteínas da lâmina nuclear, responsável pela estruturação da
membrana nuclear e pela organização da cromatina. Outro substrato chave clivado
pelas caspases efetoras é a proteína ICAD (proteína inibidora de desoxiribonuclease
ativada por caspase), que forma um complexo com a proteína CAD
(desoxiribonuclease ativada por caspase), impedindo CAD de clivar o DNA (Green,
1998; Degterev et al., 2003; Enari et al., 1998).
Além do envolvimento das caspases tradicionais na apoptose, tem sido
mostrado que várias outras proteases, incluindo outras cisteína proteases, também
são ativadas no processo de morte celular programada. As catepsinas são cisteína
proteases lisossomais liberadas para o citossol pela indução de morte celular
programada por TNF, e uma vez no citossol, estas proteases são capazes de
promover a liberação de citocromo c pela mitocôndria (para revisão Leist & Jaattela,
2001). Um outro exemplo é a família das calpaínas, que são cisteína proteases
ativadas por Ca
++
, que clivam uma série de substratos também clivados por
caspases, como a α-fodrina (Nath et al., 1996). Foi mostrado que inibidores de
calpaínas são capazes de bloquear apoptose induzida por danos na medula
espinhal (Ray et al., 2003).
Além de proteases, diversas outras proteínas estão envolvidas no controle de
morte celular programada. O conjunto de proteínas sintetizadas a cada momento é
10
determinado pela atividade de fatores de transcrição. Diversas cinases responsáveis
por ativar ou inibir outras proteínas através de fosforilação, modulam a atividade de
fatores de transcrição envolvidos no processo de morte celular. Portanto, o estudo
dos fatores de transcrição envolvidos no controle da expressão de proteínas
relacionadas com a morte celular tem grande importância.
ATF-2 (activating transcription factor 2)
A proteína ATF-2 (activating transcription factor 2) é um membro da família de
fatores de transcrição ATF/CREB (Maekawa et al., 1989), que se liga à sequência de
DNA AP1 e/ou CRE. Esta família de proteínas está relacionada com o controle do
crescimento celular, progressão do ciclo celular, diferenciação, transformação e
morte celular (Persengiev & Green, 2003). Essa família de proteínas contém uma
alta divergência no domínio N–terminal, mas possuem no seu domínio C–terminal
uma região básica de zipper de leucina (bZIP) responsável pela dimerização. A
proteína ATF-2 possui um peso molecular de 68 kDa.
Normalmente o fator de transcrição ATF-2 está inativado através de uma
ligação intramolecular inibitória entre a porção C-terminal e a porção N-terminal (Li &
Green, 1996). Várias formas de estresse celular, incluindo agentes genotóxicos,
citocinas inflamatórias e irradiação UV, estimulam a atividade transcricional de ATF-
2 (Ssang-Goo Cho & Ronai, 2001). A regulação pós-traducional da atividade dos
fatores de transcrição tem sido reconhecida como o mecanismo central da resposta
de células de mamíferos ao estresse (Karin & Hunter, 1995). Em mamíferos, três
MAPKs podem fosforilar e ativar ATF-2, são elas ERK, JNK e p38 (Davis, 2000;
Kyriakis & Avruch, 2001). O mapeamento de fosfopeptídeos e análises de mutação
11
revelaram que a fosforilação de ATF-2, induzida por radiação UV, ocorre nos
resíduos Thr 69, Thr 71 e Ser 90, sendo que p38 e JNK fosforilam ambos os
resíduos Thr 69 e Thr 71 e apenas JNK fosforila o resíduo Ser 90 (Morton et al.,
2004). A fosforilação dos resíduos Thr 69 e Thr 71 é necessária para que ocorra a
ativação do fator de transcrição ATF-2 em resposta à radiação UV e agentes
genotóxicos. A ativação de ATF-2 não ocorre quando um dos resíduos ou ambos
estão mutados para alanina (Gupta et al., 1995; van Dam et al., 1995). Entretanto, a
mutação do resíduo Ser 90 para alanina teve apenas um pequeno efeito na
atividade transcricional (van Dam et al., 1995). Além de p38 e JNK, foi visto em
células tumorais epidermais de camundongo irradiadas com UV-C que ERK-2
também é capaz de fosforilar ATF-2 no resíduo Thr 71 (Zhu et al., 2004).
A atividade transcricional de ATF-2 depende de dimerização, formando homo
ou heterodímeros com outros membros da família ATF/CREB ou com membros de
outras famílias, como a de Jun e de Fos (Hai & Green, 1989), sendo que a
dimerização depende de fosforilação. Dentre os fatores de transcrição que se
dimerizam com ATF-2, c-Jun é o mais comum, reconhecendo a sequência alvo AP1
no DNA (van Dam et al., 1995).
Estudos in vitro revelaram que a ubiquitinação e posterior degradação de
ATF-2 via proteassoma depende de dimerização (Fuchs & Ronai, 1999), sendo
necessário um ciclo de fosforilação, dimerização e desfosforilação para que ocorra a
degradação.
Além de fosforilação, dimerização e degradação, a localização sub-celular de
ATF-2 também é capaz de controlar sua atividade. Em um trabalho recente, usando
proteínas fusionadas com marcadores flurescentes, foi demonstrado que o fator de
transcrição ATF-2 possui dois sinais de localização nuclear no seu domínio de
12
ligação com o DNA e um sinal de exportação nuclear na região de zipper de leucina
(Liu et al., 2006). Esses sinais de transporte nuclear contribuem para a translocação
de ATF-2 entre o citoplasma e o núcleo. Nesse trabalho, foi demonstrado pela
primeira vez que a heterodimerização de ATF-2 com c-Jun bloqueia a exportação
nuclear de ATF-2, sendo um evento chave para a localização nuclear do dímero
ATF-2/c-Jun. Acredita-se que a heterodimerização de ATF-2 com c-Jun mascara o
sinal de exportação nuclear, retendo o dímero no núcleo. Entretanto, monômeros de
ATF-2 estariam com seu sinal de exportação nuclear exposto, permanecendo no
citoplasma.
Estudos in vitro revelaram que o fator de transcrição ATF-2 possui atividade
histona acetil-transferase (HAT), acetilando especificamente histonas H2B e H4
(Kawasaki et al., 2000). Foi visto que a atividade histona acetil-transferase (HAT) de
ATF-2 é dependente da fosforilação nos resíduos Thr 69 e Thr 71, mas não da
fosforilação do resíduo Ser 90 (Kawasaki et al., 2000).
Um dos principais papéis do fator de transcrição ATF-2 é regular a resposta
de células ao estresse (Gupta et al., 1995; Whitmarsh & Davis, 1996; Karin et al.,
1997; Hayakawa et al., 2004; Bhoumik et al., 2005). ATF-2 está associado ao
controle de transcrição de vários genes envolvidos com o crescimento celular,
diferenciação, resposta imune, morte celular e genes responsivos a estresse. Dentre
esses, encontramos genes que codificam proteínas como: colagenase (SteinMüller
et al., 2001), c-Jun (van Dam et al., 1995; Anderson et al., 1995), interferon-β (Du et
al., 1993), TGF-β2 (Kim et al., 1992), TNF-α (Tsai et al., 1996; Ivanov & Ronai,
1999), ciclina A (Shimizu et al., 1998), E-selectina (Kaszubska et al., 1993), DNA
polimerase-β (Narayan et al., 1995), Fas e FasL (Kasibhatla et al., 1998).
13
Os principais estudos sobre o fator de transcrição ATF-2 foram feitos com
células tumorais. O nível de mRNA de ATF-2 é alto em tumores humanos
comparados com tecidos normais. Estudos revelaram a contribuição de ATF-2 na
resistência de células de melanoma humano contra irradiação e tratamentos
químicos (Ivanov & Ronai, 1999; Hayakawa & Mercola, 2003). Células de melanoma
de camundongo são mais sensíveis à morte celular induzida por anisomicina quando
a expressão de ATF-2 é bloqueada por RNAsi (Bhoumik & Ronai, 2002). Esses
dados indicam que o fator de transcrição ATF-2 está envolvido no controle de morte
celular programada de células tumorais.
No sistema nervoso, já foi descrita a supressão da expressão de ATF-2 em
vários tipos celulares que sofreram morte celular (Herdegen et al., 1997; Martin-
Villalba et al., 1998; Buschmann et al., 1998; Robinson, 1996). Além disso, já foi
descrita a fosforilação de ATF-2 no resíduo Thr 71, através de imunohistoquímica,
na camada de células piramidais CA1 do hipocampo após isquemia unilateral em
ratos (Walton et al. 1998). Neste mesmo trabalho foi mostrado em células PC12
indiferenciadas tratadas com ácido ocadaico, um inibidor não específico de
fosfatases, que ATF-2 também é fosforilado no resíduo Thr 71, sendo que em
ambos os casos a fosforilação de ATF-2 precedia o aparecimento de células
apoptóticas. Em outro trabalho com células PC12 indiferenciadas, foi demonstrado
que a superexpressão de uma construção da proteína ATF-2 constitutivamente
ativa, aumentava a morte celular, enquanto a superexpressão de uma construção da
proteína ATF-2 em que os sítios de fosforilação foram mutados para alanina não
teve nenhum efeito na taxa de apoptose (Leppa et al., 2001).
14
Estes resultados indicam que o fator de transcrição ATF-2 participa do
controle da morte de células neuronais, entretanto o papel de ATF-2 neste controle
não está bem esclarecido.
MAPKs (JNK e p38)
MAPK (proteína cinase ativada por mitógenos) são enzimas conservadas
durante a evolução, responsáveis por transmitir sinais de receptores da superfície
celular para moléculas alvos no interior da célula. As MAPKs formam uma família de
cinases de serina e treonina que compreende três grupos de enzimas: as JNK/SAPK
(c-Jun N-terminal cinase/proteína cinase ativada por estresse) e p38, ativadas
primariamente por estímulos estressantes e as ERKs (cinase regulada por sinais
extracelulares), ativadas essencialmente por sinais mitogênicos e de sobrevivência
(para revisão Chang & Karin, 2001). Diferentes tipos de estresses químicos e físicos
ativam as MAPKs, que controlam a sobrevivência e adaptação celular. As MAPKs
são ativadas por cinases que as fosforilam em resíduos de treonina e tirosina num
sítio consenso TxY (Cooper, 1995). Esta regulação ocorre através de uma cascata
de sinalização composta pelas MAPK cinase (MAPKK, MKK ou MEK) e pelas
MAPKK cinase (MAPKKK ou MEKK). Essas moléculas podem ser ativadas pelas
STE20 cinases ou pelas GTPases de baixo peso molecular (para revisão Chang &
Karin, 2001). Normalmente as MAPKs são ativadas por MAPKKs específicas e
inativadas pelas MAPK fosfatases (MKP) (Muda et al., 1996; Franklin & Kraft, 1997;
para revisão Farooq & Zhou, 2004). As vias de sinalização de JNK e p38 estão
representadas na figura 1.
15
MEKK
MLK3
MEKK1-4
DLK
Tpl-2
TAO1,2
ASK
TAK
MEKK1-4
MEK
MKK4,7 MKK3,6
MAPK
p38α,β,γ
JNK1-3
MEKK
MLK3
MEKK1-4
DLK
Tpl-2
TAO1,2
ASK
TAK
MEKK1-4
MEK
MKK4,7 MKK3,6
MAPK
p38α,β,γ
JNK1-3
Figura 1 – Esquema de sinalização por MAPKs em mamíferos (modificado de
Pearson et al, 2001).
16
As cinases JNK/SAPK são codificadas por três genes diferentes jnk1, jnk2 e
jnk3 (Gupta et al., 1996). Os genes jnk1 e jnk2 são expressos em todos os tecidos.
Entretanto o gene jnk3 é expresso especificamente no sistema nervoso central,
coração e testículo (Gupta et al., 1996). Diferentes funções são atribuídas a esses
três diferentes genes. O animal deletado dos genes jnk1 e jnk2 morre durante o
desenvolvimento embrionário com defeitos no tubo neural (Kuan et al., 1999;
Sabapathy et al., 1999). Entretanto, o animal deletado do gene jnk3 tem uma
diminuição na morte de neurônios induzida por vários estímulos (Yang et al., 1997,
Kuan et al., 2003). Portanto acredita-se que JNK3 esteja envolvida principalmente no
controle de degeneração neuronal. Os transcritos de todos os três genes sofrem
“splicing“ alternativo, formando um total de 10 variantes.
JNKs são ativadas por fosforilação em resíduos de treonina e tirosina nas
posições 183 e 185 para JNK1 e JNK2, e nas posições 221 e 223 para JNK3.
Diversos estímulos extracelulares ativam JNK incluindo citocinas, como o TNFα e IL-
1 (interleucina-1) (Minden et al., 1994; Kallunki et al., 1994), radiação UV (Derijard,
et al., 1994), ciclohexamida, anisomicina e choque térmico (Kyriakis et al., 1994). A
ativação de JNK faz com que ela seja capaz de fosforilar substratos tanto no núcleo
como no citoplasma. A fosforilação de JNK é realizada por uma família de proteína
cinases chamadas de JNK cinase (JNKKs ou MKK). JNKK1/MKK4 é um ativador
fisiológico de JNK, mas pode fosforilar também p38 in vitro, entretanto JNKK2/MKK7
ativa especificamente as JNKs (para revisão Mielke & Herdegen, 2000). A atividade
de JNK pode ser modulada através do controle da translocação para o núcleo,
sendo esse controle feito por uma família de proteínas chamada JIP (proteína que
interage com JNK) (Dickens et al., 1997). JIPs são proteínas adaptadoras que se
17
ligam a JNK e MKK7 favorecendo a fosforilação de JNK no citoplasma (Kelkar et al.,
2000). Além disso, JIPs funcionam como uma âncora citoplasmática, impedindo que
JNK transloque para o núcleo. Apesar do envolvimento das MKKs e JIPs, a ativação
de JNK depende das fosfatases, os principais antagonistas da função catalítica
dessas cinases. A família das MAPK fosfatase (MKP) são enzimas fosfatases
responsáveis por desfosforilar as MAPKs. Foi demonstrado que MKPs são capazes
de desfosforilar JNK in vivo (Hirsch & Stork, 1997). MKPs são codificadas por genes
de resposta imediata, que são induzidos em resposta a diferentes agentes
estressantes (Liu et al., 1995) e através da estimulação com fatores de crescimento
(Misra-Press et al., 1995). Três isoformas prevalentes MKP1, MKP2 e MKP3 são
expressas em uma variedade de tipos celulares, entretanto apenas MKP1 e MKP2
são capazes de desfosforilar JNK (Camps et al., 1998; Misra-Press et al., 1995).
JNK pode fosforilar uma variedade de substratos nucleares e citoplasmáticos.
Os fatores de transcrição são os principais alvos nucleares de JNK. O principal fator
de transcrição fosforilado por JNK é o c-Jun. Foi demonstrado in vivo que JNK é
capaz de fosforilar c-Jun nos resíduos serina 63 e 73 (Gupta et al., 1996; Kallunki et
al., 1996; Kyriakis & Avruch, 1996). Entretanto outros fatores de transcrição podem
ser fosforilados por JNK, como: ATF-2 nos resíduos treonina 69 e 71 (Gupta et al.,
1995; van Dam et al., 1995) ou ELK-1 nos resíduos serina 383 e 389 (Cavigelli et al.,
1995) com subsequente ativação desses fatores de transcrição (para revisão
Herdegen & Waetzig, 2001). No sistema nervoso, JNK está envolvida na transcrição
de genes que codificam proteínas pró-apoptóticas como TNF, Bim e FasL (Putcha et
al., 2003). Dados recentes indicaram que a ativação dos fatores de transcrição é
feita preferencialmente pelas JNK2 e JNK3, que são capazes de translocar
rapidamente para o núcleo (Coffey et al., 2000, 2002).
18
Além dos alvos nucleares, JNK é capaz de fosforilar uma variedade de
substratos citoplasmáticos como proteínas do citoesqueleto (Giasson & Mushynski,
1997; Chang et al., 2003), p53 (Fuchs et al., 1998), proteínas da família Bcl-2
(Maundrell et al, 1997) e receptores glicocorticóides (Rogatsky et al., 1998).
Já foram identificados cinco isoformas de p38, todas com 38kDa de peso
molecular: p38α (Han et al., 1997), p38β (Jiang et al., 1996), p38β2 (Kumar et al.,
1997), p38γ (Li et al., 1996), p38δ (Wang et al., 1997), que são expressas em vários
tecidos, incluindo o sistema nervoso central. Geralmente a p38 é ativada em
resposta a estresse como hiperosmolaridade, radiação UV e citocinas inflamatórias
(Woodgett et al., 1996), e é classicamente descrita com uma proteína pró-apoptótica
(Wada & Penninger, 2004). Entretanto, p38 está envolvida na regulação de diversas
funções celulares, incluindo proliferação, diferenciação e mobilidade (Martin-Blanco,
2000; Houde et al., 2001; Tadlock & Patel, 2001; Zhang and Liu, 2002; Campos et
al., 2002). p38 é ativada através de fosforilação nos resíduos Treonina 180 e
Tirosina 182 por duas cinases chamadas MKK3 e MKK6 (Raingeaud et al., 1996).
MKK3 ativa p38α e p38γ, enquanto MKK6 ativa p38α, p38β2 e p38
γ (Enslen et al.,
1998). Assim como JNK, p38 também fosforila e ativa vários substratos no
citoplasma e núcleo. No núcleo, p38 fosforila diversos fatores de transcrição como
ELK-1, CHOP e ATF-2. Dentre os substratos citoplasmáticos encontram-se
proteínas de citoesqueleto do tipo tau, MAPKAP3, MAPKAP5, e Mnk1/2 (para
revisão Mielke & Herdegen, 2000).
19
MAPK e morte celular no tecido nervoso
A morte celular programada é crucial para o desenvolvimento do sistema
nervoso. Um excesso de neurônios é produzido durante o desenvolvimento, e
muitos deles que não conseguem formar conexões sinápticas apropriadas morrem
por um processo de morte celular programada. A conectividade sináptica do sistema
nervoso é essencialmente esculpida através de uma combinação limitada de fatores
tróficos. Neurônios que não conseguem um suprimento mínimo de fatores tróficos
são eliminados (para revisão Benn & Woolf, 2004).
Diversos trabalhos mostraram o envolvimento de JNK na morte de neurônios
em cultura. Xia e colaboradores mostraram a ativação de JNK em células PC12 em
resposta à retirada de fatores neurotróficos (Xia et al., 1995). Mais recentemente,
Mielke e colaboradores mostraram ativação de JNK em células PC12, Neuro 2A e
SHSY5Y em resposta a diferentes estímulos (Mielke et al., 2000). Em outro trabalho
foi demonstrado que em neurônios simpáticos em cultura mantidos na ausência do
fator neurotrófico NGF, ocorre um aumento da atividade de JNK e morte celular.
Entretanto, a supressão da atividade de JNK salva esses neurônios da morte
induzida pela retirada do fator (Virdee et al., 1997). Ainda nesse mesmo modelo, a
ativação de MEKK1, que ativa a via de JNK, induz um aumento da expressão e
fosforilação do fator de transcrição c-Jun e morte por apoptose, mesmo na presença
de NGF (Eilers et al., 1998). Em culturas primárias estriatais, o tratamento com
glutamato, que causa morte celular por excitotoxicidade, induz, através de
receptores do tipo NMDA, um aumento da atividade de JNK (Schawrzschild et al.,
1997). Esses dados, todos in vitro, sugerem que a ativação de JNK é importante em
20
uma variedade de neurônios na ausência de fatores neurotróficos ou submetidos à
excitotoxidade.
Os primeiros trabalhos que mostraram a ação apoptótica de JNK no sistema
nervoso in vivo foram feitos através de técnicas de deleção de genes. Demonstrou-
se que a deleção de JNK3 em camundongos levava a uma diminuição da morte
celular de neurônios hipocampais induzida por excitotoxidade (Yang et al., 1997),
MPTP (Hunot et al., 2004) e hipoxia (Kuan et al., 2003). Vários estudos mostraram a
ativação de JNK em processos de morte celular induzido por isquemia. Hayashi e
colaboradores mostraram ativação de JNK após a oclusão da artéria cerebral medial
(Hayashi et al., 2000). Gillardon e colaboradores mostraram ativação de JNK após
isquemia global no tronco encefálico (Gillardon et al., 1999). Interessante foi que a
adição de PACAP, um neuropeptídeo, bloqueou a apoptose induzida por isquemia
através da inibição da via de JNK e p38 (Shioda et al., 1998), sugerindo que
inibidores de JNK podem ser neuroprotetores em modelos de isquemia. Em outro
trabalho, foi mostrado que a deleção de JNK3 induz uma diminuição da morte de
neurônios dopaminérgicos da substância negra compacta induzida por axotomia, e
que esse efeito envolve o fator de transcrição c-Jun (Crocker et al., 2001).
Entretanto, as JNKs não estão só envolvidas com morte celular. Alguns trabalhos
mostraram a participação de JNK em eventos como a diferenciação de células PC12
(Waetzig & Herdegen, 2003a ,2003b).
A primeira evidência substancial do papel de p38 na morte neuronal foi
através do uso de células PC12. O tratamento dessas células com NGF induz uma
ativação sustentada de ERK e inibição de JNK e p38. Entretanto, a retirada desse
fator causa apoptose nessas células e induz a ativação da via de p38 e JNK,
enquanto inibe a via de ERK (Xia et al., 1995). Esses dados foram confirmados por
21
Kummer e colaboradores, que mostraram que p38 tem sua atividade aumentada
após a retirada de fatores neurotróficos em células PC12, e que essa elevação da
atividade de p38 é acompanhada por morte celular e que pode ser bloqueada por
inibidores de p38 (Kummer et al., 1997). Além disso, Kawasaki e colaboradores
observaram que p38 é ativada em neurônios granulares do cerebelo tratados com
glutamato e que essa ativação era dependente de receptores do tipo NMDA
(Kawasaki et al., 1997). Em outro trabalho foi demonstrado que a inibição de p38 era
capaz de bloquear a morte de células pós-mitóticas indiferenciadas da retina de rato
em desenvolvimento induzida pelo tratamento com anisomicina (Campos et al.,
2006). Esses resultados indicam um papel pró-apoptótico para p38 no sistema
nervoso.
Trabalhos do Laboratório de Neurogênese mostraram que proteínas da
família das MAPKs estão envolvidas no processo de morte celular na retina. Neste
trabalho foi usada a retina como modelo de estudo dos mecanismos de morte celular
programada no sistema nervoso central.
A retina
A retina se desenvolve a partir de vesículas ópticas que surgem do diencéfalo
embrionário, portanto, fazendo parte do sistema nervoso central (SNC). A retina se
localiza na porção interna do olho, sendo a parte responsável por captar e transmitir
os sinais luminosos para o cérebro. Os raios luminosos que incidem no olho
estimulam os fotorreceptores, que são os neurônios responsáveis por captar os
fótons de energia luminosa e depois estimular uma série de interneurônios que
processam a informação e a transmitem para as células ganglionares. Os sinais
22
codificados na retina são transmitidos através das células ganglionares para as
regiões mais centrais do sistema nervoso central, onde então a informação visual é
decodificada e interpretada, resultando na visão.
A retina é composta por dois tecidos, um epitelial e o outro nervoso. O tecido
epitelial se localiza mais externamente, é composto por células que possuem
melanina, um pigmento escuro que tem a função de reduzir a reflexão da luz que
incide no olho, facilitando a captação dessa luz pelos fotorreceptores.
Para realizar suas complexas funções, a retina é formada por uma grande
diversidade de neurônios que possuem uma variedade de propriedades
neuroquímicas, características morfológicas e localização histotípica. Para o
desenvolvimento correto do tecido retiniano são necessários eventos como
proliferação, diferenciação e morte celular, que ocorrem com precisão determinada
(Whiteley & Young, 1986; Donovan & Dyer, 2005; Linden & Reese, 2006; Linden,
1994). A retina embrionária é formada por um epitélio colunar pseudoestratificado
onde os núcleos das células proliferantes migram ao longo da zona proliferativa
sintetizando DNA (fase S) próximo à membrana limitante interna e sofrendo mitose
(fase M) próximo à membrana limitante externa. Durante esse percurso entre a
região mais interna e a mais externa da retina as células passam pelas fases G1 e
G2 do ciclo celular, respectivamente (Whiteley & Young, 1986).
As primeiras células a se diferenciarem são as células ganglionares (RGC –
Retinal Ganglion Cells), que enviam seus axônios, formando o nervo óptico, para os
alvos centrais do sistema nervoso e os dendritos para a camada plexiforme interna
(IPL – Inner Plexiform Layer). Os fotorreceptores do tipo cone e as células
horizontais começam a ser geradas na mesma época que as células ganglionares,
23
depois começam a ser geradas as células amácrinas, fotorreceptores do tipo
bastonete, bipolares e as células da glia (Young, 1985).
A retina de ratos neonatos (P1 – um dia após o nascimento) possui uma
espessura entre 150 e 200 um e é composta por duas camadas celulares e uma
plexiforme. A camada mais interna é a camada de células ganglionares (GCL -
Ganglion Cells Layer), composta basicamente por células ganglionares, sendo que
durante o desenvolvimento pós-natal passa a ser constituída também por células
amácrinas deslocadas (Perry et al., 1983). Em seguida, encontra-se a camada
plexiforme interna (IPL) composta por prolongamentos celulares e sinapses. Perto
da camada plexiforme interna, encontra-se uma camada nuclear interna (INL – Inner
Nuclear Layer) em formação (contendo células amácrinas recém-diferenciadas). Em
seguida, encontra-se a camada neuroblástica (NBL – Neuroblastic Layer), composta
por células em proliferação, os neuroblastos, que darão origem às células que
formarão as outras camadas da retina adulta. Embebidas entre os neuroblastos são
encontradas células pós-mitóticas em processo de diferenciação e diferenciadas,
como as células horizontais e fotorreceptores do tipo cone (Adler, 1986; Sparrow et
al, 1990; Linden et al., 1999).
De um modo geral, a retina de vertebrados adultos está organizada em três
camadas nucleares intercaladas por duas camadas de processos celulares. No
sentido da região interna para a região mais externa do globo ocular observamos:
(1) a camada de células ganglionares (GCL) que é composta por células
ganglionares e amácrinas deslocadas (Adler, 1986); (2) a camada plexiforme interna
(IPL), formada por processos celulares das células das camadas GCL e INL; (3) a
camada nuclear interna (INL) composta pelos corpos das células bipolares,
amácrinas, horizontais e gliais de Müller; (4) A camada plexiforme externa (OPL –
24
Outer Plexiform Layer) composta por prolongamentos das células das camadas INL
e ONL e (5) a camada nuclear externa (ONL – Outer Nuclear Layer), composta por
fotorreceptores do tipo cone e bastonete, que são as células responsáveis pela
captação dos sinais luminosos e pela sua transdução em sinal elétrico. As retinas de
ratos neonatos (2A) e de ratos adultos (2B) estão representadas na figura 2.
25
Amácrina
Muller
A
B
M
H
I
G
P
m
m
m
A
G
m
m m
H
GCL
IPL
INL
OPL
ONL
A
B
GCL
IPL
NBL
Amácrina
Muller
A
B
M
H
I
G
P
m
m
m
A
G
m
m m
H
GCL
IPL
INL
OPL
ONL
A
B
GCL
IPL
NBL
Figura 2 – Esquema da retina de ratos neonatos (A) e de ratos adultos (B).
Esquema de um corte histológico transversal da retina evidenciando suas camadas.
Abreviaturas: GCL - camada de células ganglionares, IPL - camada plexiforme
interna, NBL - camada neuroblástica, INL - camada nuclear interna, OPL - camada
plexiforme externa, ONL - camada nuclear externa. Os principais tipos celulares
retinianos estão designados como: G - ganglionares, A - amácrinas, B - bipolares, H
- horizontais, M - células gliais de Müller, P - fotorreceptores, I - interplexiformes, m -
microglia.
26
O modelo de explantes de retina
A retina é amplamente usada como modelo de estudo do sistema nervoso
central, pois é uma região de fácil acesso, o que facilita as manobras experimentais.
A manipulação cirúrgica da retina é relativamente fácil, pois somente a secção do
nervo óptico e a retirada do epitélio pigmentado são necessárias para a dissecção
da retina neural. O tecido nervoso retiniano é formado por camadas distintas onde
estão presentes neurônios, glia e seus prolongamentos. Além disso, cada tipo
celular pode ser detectado diferencialmente através de marcadores bioquímicos
específicos dentro da mesma camada (Brecha, 1983). As células ganglionares e
seus longos axônios são típicos de neurônios de projeção, ao passo que os outros
tipos celulares da retina são neurônios intrínsecos, garantindo que na dissecção da
retina somente as células ganglionares serão axotomizadas mantendo as outras
camadas celulares íntegras.
O modelo de explantes de retina que foi adotado neste trabalho é um método
de manipulação da retina in vitro, no qual a retina é isolada e cultivada em meio de
cultura em um erlenmeyer, sob contínua agitação orbital, e em um ambiente com a
temperatura controlada. A utilização de explantes de retina in vitro reúne as
vantagens da cultura in vitro e se aproxima da condição fisiológica devido ao fato de
que os explantes retinianos em cultura conservam sua estrutura histotípica e se
desenvolvem de maneira semelhante à observada in vivo enquanto o meio de
cultura fornece condições externas controladas. Já foi demonstrado que explantes
de retina de rato neonato mantém a estrutura do tecido por pelo menos 2 dias in
vitro (Rehen et al., 1996; Araújo & Linden, 1993). Além disso, os moduladores
farmacológicos utilizados no meio têm acesso a todas as camadas da retina. Sendo
27
assim, essa combinação de diversidade de tipos celulares, de células em distintos
estágios do desenvolvimento e organização estrutural bem conhecida torna o
modelo de explantes de retina de rato neonato mantidos in vitro, um bom modelo de
estudo dos mecanismos de proliferação, diferenciação e morte celular no sistema
nervoso central.
Ao longo de todo este trabalho utilizamos o modelo de explantes de retina de
rato neonato para analisar o comportamento do fator de transcrição ATF-2 e das
cinases que o ativam, p38 e JNK, na degeneração retrógrada das células
ganglionares da retina de ratos neonatos (P1 - um dia após o nascimento) induzida
por axotomia.
MAPKs e morte celular na retina
Durante o desenvolvimento, na retina de ratos, a morte celular programada
natural ocorre principalmente no período pós-natal. As primeiras células da retina
que sofrem morte celular são as células ganglionares. Estima-se que
aproximadamente 50% das células ganglionares da retina morrem durante o
período pós-natal em ratos (Perry et al., 1983). Essa morte natural possui
características clássicas de apoptose, como a condensação da cromatina e
fagocitose por macrófagos (Perry et al., 1983; Linden et al., 1986), entretanto ainda
não estão definidos os mecanismos de morte celular.
Diversas patologias levam à degeneração de células da retina e causam
cegueira. No glaucoma, as células ganglionares degeneram provavelmente devido a
um bloqueio da transmissão de sinais neurotróficos do terminal axonal localizado no
cérebro para o corpo celular localizado na retina, ocasionada pela compressão do
28
nervo óptico devido à elevada pressão intraocular (Quigley et al., 1997). Na retinose
pigmentar, mutações em diferentes genes levam os fotorreceptores à morte celular
programada (Sullivan & Daiger, 1996). Além dessas patologias, hipoxia e isquemia
afetam as células da retina interna como as células ganglionares (Levin & Louhab,
1996).
Trabalhos do Laboratório de Neurogênese mostraram diferentes mecanismos
de morte celular programada na retina em desenvolvimento. O tratamento de
explantes com um inibidor de síntese protéica, anisomicina, bloqueia a morte de
células diferenciadas (ganglionares e fotorreceptores), e a induz na camada
neuroblástica, notadamente nas células pós-mitóticas indiferenciadas. O estágio de
desenvolvimento e o tipo celular influenciam a sensibilidade a indutores de morte
(Rehen & Linden, 1994; Rehen et al., 1996; Chiarini, L.B. 1999; Chiarini et al., 2003).
Em diferentes condições de indução de morte das células ganglionares da
retina de animal adulto, como a axotomia do nervo óptico, exposição a níveis
elevados de aminoácidos excitatórios e neuropatias ópticas, como o glaucoma
induzido experimentalmente, as células ganglionares morrem com características de
apoptose, havendo a participação das caspases 3 e 7 e liberação de citocromo c da
mitocôndria (Li et al., 2000; Ji et al., 2005; Chaudhary et al., 1999; Weishaupt et al.,
2003; Mckinnon et al., 2002). Entretanto, os mecanismos de morte das células
ganglionares da retina do rato em desenvolvimento ainda não são bem conhecidos.
Na morte das células ganglionares da retina induzida por diferentes estímulos
foi demonstrada a participação de proteínas da família das MAPKs. Diversos
trabalhos mostraram a participação de p38 na morte das células ganglionares da
retina. Em ratos adultos, após a axotomia do nervo óptico, foi demonstrada a
ativação de p38 e consequente morte celular (Kikuchi et al., 2000). Além disso, o
29
tratamento com inibidores de p38 foi capaz de aumentar a sobrevivência das células
ganglionares da retina axotomizadas em ratos adultos (Kikuchi et al., 2000) e em um
modelo similar com embriões de galinha (Castagne & Clarke, 1999). p38 também é
ativada nas células ganglionares após a injeção intravítrea de NMDA, e a sua
inibição é capaz de diminuir a morte dessas células (Kikuchi et al., 2000; Manabe &
Lipton, 2003). Portanto, os dados da literatura indicam que p38 está envolvida na
sinalização para a morte nas células ganglionares da retina.
Além da via de p38, foi demonstrado que a via de JNK também está
envolvida no processo de morte das células ganglionares. Yoshida e colaboradores
demonstraram em 2002 que a fosforilação do fator de transcrição c-Jun nos
resíduos serina 63 e 73 contribuia significativamente para a indução de apoptose
nas células ganglionares da retina de camundongos adultos após a axotomia.
Nesses camundongos, em que os resíduos de serina 63 e 73 estavam mutados
para alanina, a apoptose das células ganglionares induzida por axotomia estava
diminuída (Yoshida et al., 2002). Levkovitch-Verbin e colaboradores demonstraram,
através de imunohistoquímica em retinas de ratos adultos, que a transecção do
nervo óptico induzia um aumento na fosforilação e expressão de c-Jun, entretanto
neste mesmo trabalho não foi vista nenhuma diferença na fosforilação de JNK
(Levkovitch-Verbin et al., 2005). No entanto em outro trabalho, utilizando retinas de
camundongos adultos, foi demonstrado que a inibição de JNK era capaz de diminuir
a taxa de apoptose das células ganglionares da retina induzida pelo esmagamento
do nervo óptico (Tezel et al., 2004). Esses resultados sugerem que a via de
sinalização de JNK e c-Jun seria pró-apóptótica nas células ganglionares da retina.
Na retina de rato adulto, já foi demonstrado que o fator de transcrição ATF-2
está presente nas células ganglionares, entretanto a axotomia dessas células que
30
induz morte celular programada, leva a uma diminuição da expressão de ATF-2. Na
retina de ratos neonatos, o fator de transcrição ATF-2 é encontrado
predominantemente no núcleo das células ganglionares (Chiarini, 1999) (Fig 3).
Entretanto, o papel de ATF-2 na morte celular no tecido retiniano ainda não é
conhecido.
Resultados anteriores do Laboratório de Neurogênese mostraram que a
degeneração de células ganglionares da retina pode ser bloqueada por um inibidor
da síntese protéica, tanto in vitro quanto in vivo (Rehen et al., 1996). Através desse
resultado sugere-se que ap ós o estímulo apoptótico, proteínas pró-apoptóticas
teriam sua síntese aumentada, levando a célula à morte. Portanto, o estudo dos
fatores de transcrição presentes nas células ganglionares é importante para a
compreensão dos mecanismos de morte celular programada nesta população
celular.
31
Figura 3 – Expressão de ATF-2 nas células ganglionares da retina de rato
neonato. Fotomicrografia mostrando imunohistoquímica para ATF-2 em um corte
transversal de explante de retina de rato neonato. GCL: camada de células
ganglionares; IPL: camada plexiforme interna; NBL: camada neuroblástica; RPE:
epitélio pigmentado. (modificado de Chiarini, 1999).
32
OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho é analisar se existe associação do fator de
transcrição ATF-2 e das cinases que o ativam p38 e JNK com a degeneração
retrógrada das células ganglionares da retina de ratos neonatos (P1 – um dia após o
nascimento) induzida por axotomia.
Objetivos Específicos:
Utilizando o modelo de degeneração retrógrada das células ganglionares da
retina de ratos neonatos (P1), através de axotomia será analisado:
1. A expressão e a localização sub-celular do fator de transcrição ATF-2.
2. Se ocorre a fosforilação (ativação) do fator de transcrição ATF-2 nos
resíduos Thr69 e Thr71.
3. Se ocorre fosforilação (ativação) das MAPKs JNK e p38.
4. Se a atividade das MAPKs JNK e p38 são importantes para que ocorra a
fosforilação de ATF-2.
5. Se a atividade das MAPKs JNK e p38 são importantes para que ocorra a
morte das células ganglionares.
33
METODOLOGIA
- Preparação de explantes e cortes histológicos
Foram utilizados ratos da linhagem Lister Hooded, crescidos no biotério do
Laboratório de Neurogênese do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho para fazer
uma preparação de explantes de retina em suspensão. Os protocolos experimentais
de obtenção de retinas utilizados neste trabalho foram aprovados pela Comissão de
Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa (CAUAP) do IBCCF°.
Os ratos neonatos (P1 – um dia após o nascimento) foram sacrificados
através de decapitação instantânea, os globos oculares foram removidos e
transferidos para uma placa de Petri contendo meio de cultura BME (Basal Medium
of Eagle – Gibco) onde foi feita a limpeza dos globos oculares.
As retinas foram então dissecadas de forma a obter somente tecido retiniano
neural, livre de epitélio pigmentado. Em seguida, com um bisturi, as retinas foram
cortadas em fragmentos de aproximadamente 1mm² e então separadas
proporcionalmente entre os grupos experimentais. Cada grupo de explantes foi
colocado em erlenmeyers com 5mL de meio de cultura BME suplementado com 5%
de soro fetal bovino – FCS (Gibco), 2mM de glutamina (Sigma) e 10µg/ml de
gentamicina (Gibco) e mantidas em uma atmosfera de 5% de CO
2
à temperatura de
37°C em um agitador orbital a 80-90 r.p.m. por diferentes períodos de tempo. Os
tratamentos usados incluíram as seguintes drogas: inibidor de síntese protéica
anisomicina (1µg/mL), inibidor de p38 SB239063 (20µM) e inibidor de JNK
SP600125 (20µM).
34
Após os intervalos de tempo determinados, de acordo com cada protocolo
experimental, os explantes foram fixados com paraformaldeído 4% em tampão
fosfato por 24h. Em seguida foram colocados em uma solução de sacarose 20% em
tampão fosfato, por no mínimo uma hora, para crioproteção.
Os explantes foram imersos em meio de inclusão OCT (Sakura - 4583) e
orientados transversalmente com um instrumento orientador de explantes (maiores
detalhes em Rehen, 1996). Estes foram então congelados em nitrogênio líquido,
afixados no criostato e após a homogenização da temperatura cortados
transversalmente a 10µm de espessura com imediata montagem em lâminas
histológicas cobertas com poli-L-lisina. Essas lâminas foram guardadas no freezer
para posterior utilização em imunohistoquímica e para a detecção de morte celular
programada.
- Coloração histológica com vermelho neutro
Para a análise da histologia do tecido foi utilizada uma coloração com uma
anilina básica, o vermelho neutro.
A marcação para vermelho neutro é feita a partir da incubação das lâminas
com 5% de tampão acetato 0,1M, pH 3,3 por dois minutos. A solução de vermelho
neutro fica por 2 minutos com as lâminas, havendo uma nova lavagem logo em
seguida com 5% de tampão acetato 0,1M, pH 3,3, por dois minutos.
As lâminas são então desidratadas por 30 segundos no etanol absoluto
seguidos de 5 minutos no Xilol, solvente orgânico. A montagem com lamínula é feita
com Entellan.
35
- Detecção de morte celular programada
Sytox Green
A morte celular programada pode ser detectada pela condensação da
cromatina a partir da marcação da cromatina com um intercalante de DNA. Foi
utilizado o intercalante de DNA fluorescente Sytox Green (Molecular Probes) ou
DAPI.
A marcação com Sytox Green é feita a partir de uma incubação da lâmina
contendo os cortes de explantes retinianos com o corante por 10 minutos na
concentração de 500nM. Após a incubação com o corante, a lâmina é lavada com
água por 10 minutos.
DAPI
A marcação com DAPI é feita a partir de uma incubação da lâmina contendo
os cortes de explantes retinianos com o intercalante de DNA por 30 segundos na
concentração de 1µg/mL. Após a incubação com o intercalante de DNA, a lâmina é
lavada com PBS por 10 minutos.
- Metodologia de contagem da camada de células ganglionares
Foi utilizado para a contagem de células apoptóticas o microscópio Zeiss
Axiophot no aumento de 1000 vezes. As células em apoptose foram reconhecidas
pela cromatina condensada e densamente corada, comparadas com as células não
apoptóticas. As células marcadas por imunocitoquímica foram quantificadas de
acordo com a localização subcelular da marcação. A análise foi feita através de
36
microscopia de contraste de fase e com microscopia de fluorescência. Algumas
imagens foram feitas em um microscópio confocal LSM 510.
Em ambos os casos foi quantificada toda a camada de células ganglionares
de três explantes distintos para cada grupo experimental, e foi realizada a
porcentagem de células com a cromatina condensada e de células marcadas por
imunohistoquímica em relação ao número total de células contadas.
- Imunohistoquímica
Nas lâminas com cortes de explantes retinianos se faz primeiramente uma
incubação para permeabilização com Triton 0,5% – para que os anticorpos penetrem
no tecido é necessário torná-lo mais acessível. Em seguida é feita uma lavagem
com tampão fosfato salina - PBS (CaCl
2
0,680 mM, KCl 2,7mM, KH
2
PO
4
1,47mM,
MgSO
4
0,489mM, NaCl 136mM e Na
2
HPO
4
8mM) e uma pré-incubação com uma
solução de BSA 1% (Bovine Serum Albumin) em PBS. Esta pré-incubação diminui
ligações inespecíficas do anticorpo, para que em etapas futuras do processo seja
marcada somente a proteína de interesse.
À pré-incubação segue a incubação com o anticorpo primário, que é
produzido de forma complementar ao seu antígeno específico, mantendo uma
ligação que servirá de âncora para o próximo passo. Esta incubação é feita por
aproximadamente 12 horas. Para detecção da proteína ATF-2, o anticorpo usado foi
o anti-ATF-2 (sc-187) da Santa Cruz Biotechnology com uma diluição de 1:100 em
BSA 1% em PBS. Para a detecção de ATF-2 fosforilado, foi usado um anticorpo da
Cell Signaling Technology que reconhece o fator de transcrição ATF-2 somente
quando ele está fosforilado nos resíduos Thr69 e Thr 71. Para a detecção de p38 e
37
JNK fosforiladas foram usados os anticorpos anti-fosfo-p38 (Thr180/Tyr182) e anti-
fosfo-JNK (Thr183/Tyr185) todos da Cell Signaling Technology na diluição de 1:100
(vide tabela 1 para lista de anticorpos). Após esse tempo é feita uma lavagem com
tampão PBS para retirar o excesso de anticorpo.
Em seguida é feita uma incubação com um anticorpo secundário gerado
contra as imunoglobulinas do animal onde o anticorpo primário foi gerado. Este
último é ligado a um marcador que permite a localização histológica do complexo.
Foi usado o anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado à biotina do Kit ABC
(Molecular Probes) na diluição de 1:200 em BSA 1% em PBS. A incubação com
anticorpo secundário foi mantida por uma hora à temperatura de 37° C.
ANTICORPO ORIGEM DILUIÇÃO FONTE
ATF-2 (sc-187) coelho 1:100 Santa Cruz Biotechnology
fosfo-ATF-2 (Thr69/71) coelho 1:300 Cell Signaling Technology
fosfo-p38 (Thr180/Tyr182) coelho 1:100 Cell Signaling Technology
fosfo-JNK (Thr183/Tyr185) coelho 1:100 Cell Signaling Technology
Tabela 1: Anticorpos usados nos ensaios de imunohistoquímica e
imunofluorescência.
Para revelar a biotina conjugada ao anticorpo por fluorescência utilizamos
dois métodos: um com a estreptavidina 555 e outro com a Tyramida Cy3. A
estreptavidina 555, na diluição de 1:500 em BSA 1% em PBS, foi incubada por 2
horas, à temperatura ambiente, no escuro. A Tiramida Cy3 na diluição de 1:150 em
PBS, foi incubada por 10 minutos, à temperatura ambiente, no escuro. Em seguida
as lâminas foram lavadas em PBS e cobertas com lamínulas utilizando como meio
de montagem uma gota de glicerol com N-propil-Galato 5%, para minimizar a perda
de fluorescência. As lâminas foram mantidas ao abrigo da luz e à temperatura de -
20°C.
38
Como controle negativo, o anticorpo primário foi omitido, enquanto todo resto
do procedimento foi repetido.
- Extração de proteínas
As retinas dissecadas contendo somente tecido retiniano, livre de epitélio
pigmentado foram lavadas com PBS gelado para retirar todo e qualquer resquício de
substâncias que possam interferir na dosagem de proteínas.
Após retirar o PBS, as retinas foram incubadas com Tampão de lise Laemmli
contendo: 5% de β-Mercaptoetanol, um agente redutor; 1mM de PMSF, 2µg/mL de
Leupeptina, 2µg/mL de Pepstatina, 10µg/mL de Aprotinina, que são inibidores de
proteases; 1mM de Ortovanadato de Sódio que é um inibidor da Tirosina Fosfatase;
5mM de NaF que é um inibidor da Serina-Treonina Fosfatase. O tubo foi mantido por
30 minutos, à 4°C, sendo que a cada 5 minutos foi feita agitação em vortex. A seguir
foi feita centrifugação na microcentrífuga à 4°C, por 15 minutos, à 14.000 rpm, para
baixar restos de membrana e outras partes da célula. Recolheu-se o sobrenadante
para a dosagem de proteínas. Foram utilizados 150µL de tampão de lise para 3
retinas de ratos P1.
- Dosagem de proteínas pelo método de Bradford
Inicialmente foi preparada uma curva padrão com 1µg a 10µg de BSA em
1,2mL da solução de Bradford. Em seguida, 3µL de cada uma das amostras foram
adicionadas em 1mL da solução de Bradford, homogeneizados e deixados a
temperatura ambiente por 10 minutos. A densidade óptica medida em
39
espectrofotômetro a 595 nm de comprimento de onda. A razão entre a concentração
e a densidade óptica de cada um dos pontos da curva padrão resultou em um valor
ou Fator (F=C/DO). A concentração final das amostras protéicas foi resultado da
multiplicação da média dos fatores da curva padrão pela densidade óptica de cada
uma das amostras experimentais (C=média de F x DO).
- Western blot
Foi aplicado 20µg de proteína por poço. Foi corrido um gel de 12,5% de SDS-
PAGE por 2h, a 120 Volts e transferido para membrana de nitrocelulose (Amersham)
a 200mA por 2hs. Para detecção da proteína ATF-2 foi utilizado o mesmo anticorpo
descrito para imunohistoquímica. As membranas foram bloqueadas com 5% de BSA
(bovine serum albumin - Sigma) em TBS (Tris buffer solution) com 0.05% de Tween-
20 (Sigma) por 2hs. As membranas foram incubadas com o anticorpo primário para
ATF-2 na concentração de 1:5.000, por 12 horas (pernoite), à 4°C na solução de
TBS-T 5% BSA. A membrana foi então lavada e incubada com anticorpo secundário
anti-IgG de coelho conjugado a peroxidase (Cell Signaling Technology) na
concentração de 1:2000, por 1h, à temperatura ambiente, diluído em 5% de BSA em
tampão TBS (Tris buffer solution) com 0.05% de Tween-20 (Sigma). Após nova
lavagem as proteínas marcadas foram detectadas expondo-se a membrana de
nitrocelulose por 5 minutos ao reagente ECL-plus (Amersham), depois expondo o
filme fotográfico à membrana.
40
RESULTADOS
Expressão de ATF-2 na retina de ratos neonatos
A análise da expressão de ATF-2 por Western blot de extratos protéicos de
tecido retiniano de ratos neonatos (P1) mostrou uma banda de 68KDa
correspondente ao peso molecular da proteína ATF-2 (fig. 4), indicando que o fator
de transcrição ATF-2 está presente na retina de ratos
Em seguida, foi analisada especificamente através de imunohistoquímica em
quais camadas da retina o fator de transcrição ATF-2 está sendo expresso.
Utilizando cortes de explantes de retina fixados imediatamente após a axotomia das
células ganglionares, foi feita dupla marcação com o anticorpo que reconhece ATF-2
e marcação da cromatina através de um intercalante de DNA DAPI. Com a
marcação da cromatina pode-se diferenciar as camadas da retina de ratos neonatos.
A imunohistoquímica mostrou uma colocalização entre a marcação para ATF-2 (fig.
5a) e a marcação da cromatina nas células da camada de células ganglionares (fig.
5b). Essa análise confirmou dados de Chiarini (Chiarini, 1999), que o fator de
transcrição ATF-2 é expresso na camada de células ganglionares da retina de rato
neonato (fig. 5). No rato neonato (P1) a camada de células ganglionares é formada
apenas pelas células ganglionares. Portanto, esta análise mostra que ATF-2 está
presente no núcleo das células ganglionares da retina de rato neonato.
41
79 KDa
62,4 KDa
79 KDa
62,4 KDa
Figura 4 – Expressão de ATF-2 na retina de rato neonato.
Western blot de extrato protéico do tecido retiniano de rato neonato (P1), mostrando
uma banda de 68 Kda correspondente ao peso molecular da proteína ATF-2.
42
A
B
C
A
B
C
B
C
Figura 5 – Expressão de ATF-2 nas células ganglionares da retina de rato
neonato. A - Fotomicrografia mostrando imunohistoquímica com o anticorpo contra
ATF-2 (sc-187) conjugado com fluorocromo vermelho de um corte transversal de
explante de retina de rato neonato, imediatamente após a axotomia das células
ganglionares. B - Fotomicrografia mostrando marcação da cromatina com o
intercalante de DNA fluorescente DAPI. C - Sobreposição de A e B.
43
Após a axotomia, as células ganglionares da retina sofrem morte celular
programada.
Quando se retira o globo ocular, o nervo óptico é rompido. Nesse momento
ocorre a axotomia das células ganglionares da retina. Após a axotomia, há um
aumento na incidência de morte das células ganglionares. Essa morte causada pela
axotomia é chamada de degeneração retrógrada. As células ganglionares
axotomizadas morrem com características da apoptose, como a condensação da
cromatina e fragmentação do DNA (Rehen et al., 1996).
Para analisar a morte das células ganglionares, explantes de rato neonato
foram mantidos in vitro por diferentes intervalos de tempo após a axotomia das
células ganglionares. Os explantes foram fixados 0, 3, 6, 12, 18 e 24 horas após a
axotomia das células ganglionares. Após a fixação, cortes transversais de explantes
retinianos foram usados para análise da morte celular.
A análise da morte das células ganglionares da retina de ratos neonatos, foi
feita após a marcação com o intercalante de DNA Sytox Green, através da
identificação da condensação da cromatina em diferentes intervalos de tempo (3, 6,
12, 18 e 24h) após a axotomia. Foram quantificadas as células da camada de
células ganglionares com a cromatina totalmente condensada (fig. 6B) e
parcialmente condensada (fig. 6C). Esta análise mostrou que a incidência de morte
aumenta após a axotomia, sendo que em 18 horas ocorre o pico de morte celular
(fig. 6). Foi verificado que após a axotomia das células ganglionares ocorreu o
aparecimento de células com a cromatina parcialmente ou totalmente condensada.
Nas primeiras 3 horas após a axotomia a maioria das células que apresentam algum
nível de condensação da cromatina, estão com a cromatina parcialmente
44
condensada, entretanto, após essas 3 horas iniciais o número de células com a
cromatina parcialmente condensada diminui. O número de células com a cromatina
totalmente condensada é menor que 5% do total de células nas 6 primeiras horas
após a axotomia, no entanto após essas 6 horas iniciais, o número de células com a
cromatina condensada aumenta, chegando a um pico de aproximadamente 40% do
total de células após 18 horas da axotomia (fig 6).
Portanto, estes resultados mostram que ocorre um aumento da incidência de
morte celular programada após a axotomia das células ganglionares da retina de
ratos neonatos, sendo que ocorre um pico com 18 horas após a axotomia, o que
corrobora os dados anteriores obtidos no Laboratório de Neurogênese.
45
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
horas após a axotomia
% de células na GCL
A
cromatina
condensada
cromatina
parcialmente
condensada
B
C
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
horas após a axotomia
% de células na GCL
A
cromatina
condensada
cromatina
parcialmente
condensada
B
C
Figura 6 – Degeneração retrógrada de células ganglionares após axotomia.
A: Análise da morte celular programada das células ganglionares de explantes de
retina de rato neonato mantidos in vitro por 3, 6, 12, 18 e 24 horas após a axotomia.
A morte celular programada foi detectada pela condensação da cromatina através
de marcação do DNA com o intercalante fluorescente Sytox Green. Foram
quantificados três explantes diferentes de cada tempo após axotomia. B-C: Cortes
de explantes de retina com 12 horas após axotomia das células ganglionares
marcados com Sytox Green. B: setas – célula cromatina condensada; C: seta –
célula cromatina parcialmente condensada.
46
Desaparecimento de ATF-2 associado com a degeneração retrógrada das
células ganglionares
Para analisar a expressão de ATF-2 após a axotomia das células
ganglionares, explantes de rato neonato foram mantidos in vitro por diferentes
intervalos de tempo após a axotomia das células ganglionares. Os explantes foram
fixados 0, 3, 6, 12, 18 e 24 horas após a axotomia das células ganglionares. Após a
fixação, cortes transversais de explantes retinianos foram usados para
imunohistoquímica com anticorpo contra ATF-2 (figs. 7 e 8).
Na retina de ratos neonatos (P1), imediatamente após a axotomia, quase
todas as células ganglionares apresentam imunorreatividade para ATF-2 no núcleo.
Essas células não estão com a cromatina condensada, indicando que elas não
sofreram morte celular programada (fig. 8). Esse resultado é semelhante ao padrão
de marcação para ATF-2, encontrado na retina in vivo (fig. 3).
Análise da imunorreatividade para ATF-2 nas células ganglionares da retina
de ratos neonatos mostrou que há uma progressiva perda da imunorreatividade
após a axotomia (fig. 8). Foi visto que três horas após a axotomia das células
ganglionares, aparecem células com a cromatina parcialmente condensada sem
imunorreatividade para ATF-2, entretanto as células com essa característica são
encontradas em uma baixa porcentagem. Com 12 horas após a axotomia, o número
de células ganglionares que apresentam imunorreatividade para ATF-2 no núcleo
diminui drasticamente. Foi verificado que logo após a axotomia o número de células
que possui a cromatina condensada e não apresenta imunorreatividade para ATF-2
foi praticamente zero. No entanto, decorridas 18 horas da axotomia esse valor chega
a quase 40% do total de células ganglionares (fig. 8). Nenhuma célula com a
47
cromatina condensada apresentou imunorreatividade para ATF-2 no núcleo.
Entretanto as células com a cromatina condensada que apresentaram
imunorreatividade para ATF-2, esta se encontrava no citoplasma (fig. 7 e 8). Esse
tipo de marcação foi encontrado raramente.
Esses dados sugerem que após a axotomia das células ganglionares ocorre
uma perda progressiva da imunorreatividade para ATF-2 associada à degeneração
retrógrada das células ganglionares.
48
ATF- 2
sobreposição
DNA
Cromatina condensada negativa para ATF-2
Cromatina condensada positiva para ATF-2 no citoplasma
Cromatina normal positiva para ATF-2 no núcleo
Cromatina normal negativa para ATF-2
A
B
C
ATF- 2
sobreposição
DNA
Cromatina condensada negativa para ATF-2
Cromatina condensada positiva para ATF-2 no citoplasma
Cromatina normal positiva para ATF-2 no núcleo
Cromatina normal negativa para ATF-2
A
B
C
Figura 7 – Localização sub-celular de ATF-2 após axotomia das células
ganglionares. Fotomicrografia confocal mostrando a camada de células
ganglionares (GCL) submetida a imunohistoquímica com anticorpo anti-ATF-2
conjugado com fluorocromo (B) e marcação do DNA com intercalante fluorescente
Sytox Green (A) de um corte transversal de explante de retina mantido in vitro por 12
horas após axotomia das células ganglionares. A – Marcação do DNA; B –
Marcação para ATF-2; C – Sobreposição
49
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
% de células na GCL
horas após axotomia
Cromatina condensada
negativa para ATF-2
Cromatina normal
ATF-2 positivo no núcleo
Cromatina condensada
ATF-2 positivo no citoplasma
Cromatina normal
negativa para ATF-2
Cromatina parcialmente condensada
negativa para ATF-2
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
% de células na GCL
horas após axotomia
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
% de células na GCL
horas após axotomia
Cromatina condensada
negativa para ATF-2
Cromatina normal
ATF-2 positivo no núcleo
Cromatina condensada
ATF-2 positivo no citoplasma
Cromatina normal
negativa para ATF-2
Cromatina parcialmente condensada
negativa para ATF-2
Figura 8 – Análise de ATF-2 após indução de degeneração retrógrada das
células ganglionares.
Quantificação da imunohistoquímica para ATF-2 e marcação do DNA com o
intercalante de DNA fluorescente Sytox Green de cortes transversais de explantes
de retina e análise da localização subcelular de ATF-2. A análise foi feita em
diferentes intervalos de tempo após a axotomia das células ganglionares.
50
Anisomicina bloqueia o desaparecimento de ATF-2, induzido pela axotomia
das células ganglionares da retina.
Estudos desenvolvidos anteriormente no Laboratório de Neurogênese
demonstraram que a incubação de explantes de retina com um inibidor da síntese
protéica, bloqueava a morte das células ganglionares axotomizadas (Rehen et al,
1996). A partir desse resultado, foi investigado o que ocorria com o fator de
transcrição ATF-2 nas células ganglionares axotomizadas quando os explantes de
retina foram incubados com o inibidor da síntese protéica, anisomicina. Foi visto,
através de imunohistoquímica para ATF-2, que além de bloquear a morte das
células ganglionares axotomizadas, a anisomicina também bloqueou o
desaparecimento do fator de transcrição ATF-2 dessas células (fig. 9).
Esse resultado reforça o resultado anterior que sugere que o
desaparecimento de ATF-2 após a axotomia das células ganglionares está
associado com a degeneração retrógrada das células ganglionares da retina.
51
0h CTR 18h CTR 18h ANI
0
25
50
75
100
0h CTR
18h CTR
18h ANI
% de células marcadas para ATF-2 e com
a cromatina normal na GCL
Figura 9
– Anisomicina bloqueia o desaparecimento de ATF-2 após axotomia
das células ganglionares da retina.
Quantificação da imunohistoquímica para
ATF-2 e marcação do DNA com o intercalante de DNA fluorescente Sytox Green em
cortes transversais de explantes de retina imediatamente após a axotomia ou
mantidos por 18 horas após axotomia sem tratamento (CTR) e por 18 horas após a
axotomia tratado com o inibidor da síntese protéica anisomicina (1mg/ml). Análise da
localização subcelular de ATF-2 através da dupla marcação.
52
Após a axotomia ocorre a fosforilação de ATF-2 nos resíduos Thr 69 e Thr 71
Já havia sido descrito que várias formas de estresse celular estimulam a
atividade transcricional de ATF-2 (Ssang-Goo Cho & Ronai, 2001), e que esta
estimulação pode resultar de sua fosforilação nos resíduos Thr 69 e Thr 71 por
cinases que respondem a estresse como p38 cinase ou JNK (Ronai, 2000).
Portanto, foi analisado se após a axotomia das células ganglionares, o fator de
transcrição ATF-2 está sendo fosforilado. A análise foi feita através de
imunohistoquímica em cortes transversais de explantes de retina mantidos
in vitro
por 3, 6, 12, 18 e 24 horas após a axotomia das células ganglionares. Foi utilizado
um anticorpo que reconhece o ATF-2 apenas quando ele está fosforilado nos
resíduos Thr 69 e Thr 71.
A quantificação dessa imunohistoquímica revelou que após a axotomia das
células ganglionares, o fator de transcrição ATF-2 está sendo fosforilado nos
resíduos Thr 69 e Thr 71 (fig. 10 e 11). Imediatamente após a axotomia,
aproximadamente 25% das células ganglionares apresentam marcação para fosfo-
ATF-2. Entretanto, com 3 horas após a axotomia ocorre o pico de fosforilação, com
mais que 65% das células ganglionares apresentando a marcação para fosfo-ATF-2.
Após essas 3 horas iniciais, o número de células ganglionares marcadas com o
anticorpo contra ATF-2 fosforilado diminui, chegando a menos que 5% com 24 horas
após a axotomia (fig. 11). Esses dados sugerem que o fator de transcrição ATF-2
está sendo ativado após a axotomia das células ganglionares da retina de ratos
neonatos e que após as 3 horas iniciais da axotomia essa ativação diminui,
chegando a um nível menor que o basal com 24 horas após a axotomia.
53
p-ATF-2
DNA
GCL
GCL
IPL
IPL
NBL
NBL
A
B
p-ATF-2
DNA
GCL
GCL
IPL
IPL
NBL
NBL
p-ATF-2
DNA
GCL
GCL
IPL
IPL
NBL
NBL
A
B
Figura 10
– Imunohistoquímica para ATF-2 fosforilado. Fotomicrografia
mostrando um corte transversal de explante de retina de rato neonato mantido
in
vitro
por 3 horas após a axotomia com marcação fluorescente para ATF-2 fosforilado
nos resíduos Thr69 e Thr71.
A – marcação para fosfo-ATF-2; B – marcação DNA
(
Sytox Green). GCL: camada de células ganglionares; IPL: camada plexiforme
interna; NBL: camada neuroblástica.
54
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 3 6 9 1215182124
horas após a axotomia
% de células fosfo-ATF-2 positivas na GCL
*
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 3 6 9 1215182124
horas após a axotomia
% de células fosfo-ATF-2 positivas na GCL
*
% de células fosfo-ATF-2 positivas na GCL
*
Figura 11 – Fosforilação de ATF-2 após axotomia das células ganglionares.
Quantificação da porcentagem de células imunorreativas para ATF-2 fosforilado nos
resíduos Thr69 e Thr71 presentes na camada de células ganglionares da retina. Os
explantes de retina foram mantidos
in vitro por 3, 6, 12, 18 e 24 horas após a
axotomia das células ganglionares. Foram quantificados três explantes de cada
grupo de três experimentos diferentes.
n = 3
* p < 0.01 comparado com 0h (imediatamente após a axotomia)
One Way Anova (Bonferroni post test)
55
JNK é responsável por fosforilar o fator de transcrição ATF-2 após a axotomia
das células ganglionares
Como foi visto que o fator de transcrição ATF-2 está sendo fosforilado após a
axotomia das células ganglionares, foi investigado se as cinases p38 e JNK, que são
capazes de fosforilar ATF-2, estão sendo fosforiladas após a axotomia das células
ganglionares. A análise foi feita através de imunohistoquímica de cortes transversais
de explantes de retina mantidos
in vitro por diferentes intervalos de tempo após a
axotomia (3, 6, 12, 18 e 24 horas), com anticorpos que reconhecem as formas
fosforiladas de p38 (Thr180/Tyr182) e JNK (Thr183/Tyr185).
A análise mostrou que após a axotomia das células ganglionares da retina de
ratos neonatos, foi encontrado apenas marcação para JNK fosforilada nos resíduos
Thr183 e Tyr185 (fig. 12a), entretanto não foi encontrada marcação para p38
fosforilada nos resíduos Thr180 e Tyr182 (fig. 12b). Foi encontrada marcação para
JNK fosforilada imediatamente após a axotomia, mantendo-se um alto nível de
fosforilação até as 6 primeiras horas após a axotomia, diminuindo após 12 horas (fig.
12a). Entretanto, a marcação para JNK fosforilada não é claramente identificada no
núcleo das células ganglionares. Por esse motivo não foi possível fazer uma
quantificação da marcação para JNK fosforilada.
Não foi encontrada marcação para p38 fosforilada na camada de células
ganglionares em nenhum dos tempos analisados. Como um controle interno do
anticorpo que reconhece p38 fosforilado nos resíduos Thr180 e Tyr182, foi visto que
esse anticorpo marca uma população celular que está localizada na margem mais
externa da camada neuroblástica da retina de ratos neonatos e algumas células na
parte mais interna da camada neuroblástica (dados não mostrados). Este dado
mostra que o anticorpo usado para detectar p38 fosforilada está funcionando. É
56
nessa margem mais externa da camada neuroblástica da retina de ratos neonatos
que as células proliferantes sofrem mitose. Esse dado corrobora os dados de
Campos e colaboradores (Campos
et al., 2002) que mostram que p38 é fosforilada
nas células que estão em mitose na retina de ratos neonatos. As poucas células da
parte mais interna da camada neuroblástica marcadas para p38 fosforilado podem
ser células amácrinas.
Além da análise da fosforilação das cinases p38 e JNK, foi testado se a
atividade dessas cinases são necessárias para que ocorra a fosforilação de ATF-2.
A análise foi feita através do tratamento de explantes retinianos de ratos neonatos
mantidos
in vitro por 3 horas após a axotomia das células ganglionares com
inibidores específicos da atividade de p38 (SB239063) e JNK (SP600125) (Bennet
et
al.
, 2001). Esses inibidores são análogos de ATP e se ligam ao sítio ativo da cinase,
impedindo que a cinase seja capaz de fosforilar seus substratos alvos. Após o
tratamento dos explantes com esses inibidores, cortes transversais de explantes
retinianos foram usados para imunohistoquímica com o anticorpo contra ATF-2 que
o reconhece apenas quando ele está fosforilado nos resíduos Thr 69 e Thr 71. A
análise da marcação para ATF-2 fosforilado mostrou que o inibidor de JNK foi capaz
de bloquear totalmente a fosforilação de ATF-2 após 3 horas da axotomia das
células ganglionares. Além disso, o inibidor de JNK foi capaz de bloquear totalmente
a fosforilação de ATF-2 após 6, 12, 18 e 24 horas da axotomia (dados não
mostrados). Entretanto o inibidor de p38 não foi capaz de bloquear a fosforilação de
ATF-2 após 3 horas da axotomia (figs. 13 e 14).
Esses resultados indicam que a cinase JNK é a responsável por fosforilar o
fator de transcrição ATF-2 após a axotomia das células ganglionares da retina de
ratos neonatos.
57
6h
3h
0h
3h
6h
0h
AB
6h
3h
0h
3h
6h
0h
AB
Figura 12
– Fosforilação de JNK na camada de células ganglionares.
Fotomicrografia mostrando a camada de células ganglionares após
imunohistoquímica (
A) para fosfo-JNK (Thr183/Tyr185) e (B) para fosfo-p38
(Thr180/Tyr182) em cortes transversais de explantes retinianos mantidos
in vitro por
diferentes intervalos de tempo após a axotomia das células ganglionares.
58
CTR
p-ATF-2
p-ATF-2
p-ATF-2
p-ATF-2
p-ATF-2
p-ATF-2
DNA
CTR
SB 239063
DNA
DNA
SP 600125
A
B
C
D
E
F
CTR
DNA
CTR
SB 239063
DNA
DNA
SP 600125
A
B
C
D
E
F
59
Figura 13 –
Imunohistoquímica para ATF-2 fosforilado após inibição de JNK ou
p38. Fotomicrografias mostrando a camada de células ganglionares após
imunohistoquímica para ATF-2 fosforilado e marcação com o interalante de Dna
S
ytox Green em cortes transversais de explantes retinianos mantidos in vitro por 3
horas após axotomia das células ganglionares na presença de inibidores de JNK ou
p38. (
A) fosfo-ATF-2 CTR; (B) marcação para DNA CTR; (C) fosfo-ATF-2
SB239063; (
D) marcação para DNA SB239063; (E) fosfo-ATF-2 SP600125; (F)
marcação para DNA SP600125. CTR – controle; SB239063 – inibidor de p38
(20uM); SP600125 – inibidor de JNK (20uM).
60
CTR SB SP
0
20
40
60
80
100
% de cél. p-ATF2 positivas na GCL
*
CTR SB SP
0
20
40
60
80
100
% de cél. p-ATF2 positivas na GCL
*
Figura 14 – Inibidor de JNK bloqueia a fosforilaçao de ATF-2.
Quantificação da
imunohistoquímica para ATF-2 fosforilado na camada de células ganglionares de
explantes retinianos mantidos
in vitro por 3 horas após axotomia das células
ganglionares na presença de inibidores de JNK ou p38. Foram quantificados três
explantes de cada grupo de três experimentos diferentes. CTR – controle; SB –
inibidor de p38 SB239063 (20uM); SP – inibidor de JNK SP600125 (20uM).
n = 3
* p < 0.01 comparado com CTR e SB
One Way Anova (Bonferroni post test)
61
O inibidor de JNK bloqueia a morte das células ganglionares da retina
Após a axotomia das células ganglionares da retina de rato neonato essas
células morrem por morte celular programada. Com isso foi analisado se os
inibidores de p38 e JNK são capazes de bloquear a morte dessas células. A análise
foi feita através do tratamento de explantes retinianos de ratos neonatos mantidos
in
vitro
por 18 horas após a axotomia das células ganglionares com inibidores
específicos da atividade de p38 (SB239063) e JNK (SP600125). Após o tratamento
dos explantes com esses inibidores, cortes transversais de explantes retinianos
foram usados para a detecção de morte celular através da identificação da
condensação da cromatina, após a marcação com um intercalante de DNA
fluorescente
Sytox Green.
Fotomicrografias de explantes retinianos mantidos
in vitro por 18 horas após a
axotomia das células ganglionares marcados com um intercalante de DNA
fluorescente
Sytox Green mostrou que ocorre uma diminuição de células com a
cromatina condensada nos explantes tratados com o inibidor de JNK (fig. 15).
A porcentagem de células ganglionares com a cromatina condensada 18
horas após a axotomia no grupo controle foi de aproximadamente 45%, entretanto,
foi visto que o inibidor de JNK bloqueou quase que totalmente a morte das células
ganglionares (fig. 16). A percentagem de células ganglionares com a cromatina
condensada 18 horas após a axotomia no grupo tratado com o inibidor de JNK
SP600125 foi de aproximadamente 5% do total de células ganglionares. Entretanto o
inibidor de p38 bloqueou apenas parcialmente a morte das células ganglionares. A
porcentagem de células ganglionares com a cromatina condensada 18 horas após a
62
axotomia no grupo tratado com o inibidor de p38 SB foi de aproximadamente 35%
(figs. 15 e 16).
Portanto os resultados sugerem que a atividade de JNK é pró-apoptótica nas
células ganglionares da retina de ratos neonatos após axotomia.
63
SB239063
CTR
SP600125
A
C
B
SB239063
CTR
SP600125
A
C
B
Figura 15 – Inibição de JNK bloqueia a degeneração das células ganglionares
induzida por axotomia.
Fotomicrografia mostrando a camada de células
ganglionares após marcação com o intercalante de DNA fluorescente Sytox Green
de cortes transversais de explantes retinianos mantidos
in vitro por 18 horas após
axotomia das células ganglionares na presença de inibidores de JNK ou p38. (
A)
controle; (
B) inibidor de p38; (C) inibidor de JNK. Setas - células com a cromatina
condensada. CTR – controle; SB239063 – inibidor de p38 (20uM); SP600125 –
inibidor de JNK (20uM).
64
CTR SB SP
0
20
40
60
80
100
% de células com a cromatina
condensada na GCL
*
* *
CTR SB SP
0
20
40
60
80
100
% de células com a cromatina
condensada na GCL
*
* *
Figura 16 – Inibição de JNK diminui o número de células ganglionares com a
cromatina condensada.
Quantificação da morte celular na camada de células
ganglionares após 18 horas da axotomia das células ganglionares na presença de
inibidores de JNK ou p38. A morte celular foi detectada através da condensação da
cromatina após marcação com o intercalante de DNA fluorescente Sytox Green.
Foram quantificados três explantes de cada grupo de três experimentos diferentes.
CTR – controle; SB239063 – inibidor de p38 (20uM); SP600125 – inibidor de JNK
(20uM).
n = 3
* p < 0.01 comparado com CTR
* * p < 0.001 comparado com CTR e SB
One Way Anova (Bonferroni post test)
65
DISCUSSÃO
Os resultados obtidos mostraram que células ganglionares da retina de ratos
neonatos, sem a cromatina condensada, expressam a proteína ATF-2 e esta se
localiza no núcleo. Após a axotomia das células ganglionares ocorre a fosforilação
de ATF-2 nos resíduos Thr 69 e 71. Células com cromatina condensada,
característica de morte celular, não apresentam ATF-2 no núcleo. O pico de
fosforilação de ATF-2 precede tanto o pico de desaparecimento de ATF-2 quanto o
pico de incidência de morte celular. Foi identificada a JNK como a proteína cinase
responsável pela fosforilação de ATF-2 que ocorre após a axotomia. A inibição da
JNK bloqueia tanto a fosforilação de ATF-2 quanto a degeneração retrógrada das
células ganglionares. Na presença do inibidor de síntese protéica, anisomicina, que
bloqueia a morte de células ganglionares, ATF-2 permanece no núcleo destas
células mesmo após a axotomia. Estes resultados mostram que JNK participa da
fosforilação de ATF-2 e da morte de células ganglionares após a axotomia. Além
disso, estes resultados levantam a hipótese da fosforilação de ATF-2 por JNK, que
provoca tanto a ativação quanto a degradação desta proteína, estar associada com
a ocorrência de degeneração de células ganglionares da retina de ratos neonatos.
ATF-2 e degeneração de células ganglionares da retina
Para verificar se existe relação entre o fator de transcrição ATF-2 e a morte
das células ganglionares, o curso temporal da morte das células ganglionares
induzida por axotomia foi realizado conjuntamente com a análise da expressão de
ATF-2 por imunohistoquímica neste mesmo material. A morte das células
ganglionares foi detectada pela condensação da cromatina. Foram analisadas
66
células com a cromatina completamente condensada e parcialmente condensada.
De acordo com descrições anteriores, foi verificado que após a axotomia há um
aumento da incidência de morte das células ganglionares da retina de ratos
neonatos, sendo que após 18 horas da axotomia ocorre o pico de células com
cromatina totalmente condensada, refletindo um aumento na morte celular. Além
disso, foram observadas células com a cromatina parcialmente condensada em
maior número 3 horas após a axotomia.
A condensação da cromatina total ou parcial pode refletir a ocorrência de
programas distintos de morte celular programada. Alternativamente, a condensação
parcial pode ser uma etapa intermediária da condensação total da cromatina.
Foi descrito que em outro tipo de morte celular programada chamado de
autofagia, pode ocorrer condensação da cromatina, entretanto o nível de
condensação não é tão marcante como no processo apoptótico (Clarke, 1990).
Logo, as poucas células com cromatina parcialmente condensada podem ter sofrido
um tipo de morte celular programada como a autofagia.
Resultados do nosso laboratório mostraram que o tratamento de explantes
retinianos com um inibidor de pan-caspases era capaz de aumentar o número de
células com a cromatina parcialmente condensada, enquanto diminuía a incidência
de células com cromatina totalmente condensada na camada de células
ganglionares (Chiarini, L.B. dados não publicados). Portanto, células ganglionares
da retina com a cromatina parcialmente condensada, encontradas após a axotomia,
podem estar morrendo de forma independente de caspases.
Foi verificado que a imunorreatividade para ATF-2 diminui após a indução de
morte das células ganglionares da retina. Células ganglionares axotomizadas, com
cromatina total ou parcialmente condensada, não apresentaram marcação para
67
ATF-2. Portanto, mesmo que o padrão distinto de condensação da cromatina seja
reflexo da ocorrência de tipos diferentes de morte celular, como autofagia e
apoptose, ou de programas de execução de morte celular distintos, independentes e
dependentes de caspases, foi verificado que ocorre o desaparecimento de ATF-2
associado à degeneração de células ganglionares.
Localização subcelular de ATF-2
Foi verificado que a imunorreatividade para ATF-2 diminui após a indução de
morte das células ganglionares da retina. A marcação para ATF-2 se encontra quase
que toda no núcleo das células ganglionares imediatamente após a axotomia.
Entretanto, com 18 horas após a axotomia das células ganglionares, o número de
células marcadas para ATF-2 diminui drasticamente. Quase todas as células viáveis
apresentam imunorreatividade para ATF-2 no núcleo. No entanto não há
imunorreatividade para ATF-2 no núcleo quando a célula está com a cromatina
condensada.
Já foi demonstrada a ocorrência de exclusão nuclear de fatores de transcrição
associada à degeneração das células ganglionares axotomizadas. Foi demonstrado,
através de imunohistoquímica, que o fator de transcrição Max desaparece do núcleo
e aparece no citoplasma após a axotomia das células ganglionares de rato P13
(Petrs et al., 2004). Diferente do que ocorre com o Max, o ATF-2 é raramente
encontrado no citoplasma de células ganglionares da retina axotomizadas.
Foi verificado que a maioria das células com cromatina condensada não
apresenta nenhuma marcação para ATF-2. Quando há imunorreatividade para ATF-
2, esta se localiza no citoplasma, sendo que células com essa característica são
encontradas raramente.
68
A imunorreatividade para ATF-2 no citoplasma pode ser devido à
translocação de ATF-2 do núcleo para o citoplasma, já que foi demonstrado
recentemente que o fator de transcrição ATF-2 possui dois sinais de localização
nuclear no seu domínio de ligação com o DNA e um sinal de exportação nuclear na
região de
zipper de leucina (Liu et al., 2006). Esses sinais de transporte nuclear
contribuem para a translocação de ATF-2 entre o citoplasma e o núcleo.
O fato do desaparecimento de ATF-2 ocorrer apenas nas células com a
cromatina condensada sugere uma associação da degeneração retrógrada das
células ganglionares com o desaparecimento do fator de transcrição ATF-2. No
entanto, não foi determinado o que provoca o desaparecimento de ATF-2, e nem se
esse desaparecimento é importante para a ocorrência da morte celular ou se é
conseqüência da ocorrência do processo de morte celular programada. Estes
tópicos serão discutidos mais adiante.
Desaparecimento da marcação de ATF-2 nas células ganglionares em
degeneração
Duas hipóteses foram propostas para explicar o desaparecimento da
marcação de ATF-2 que ocorre após a axotomia das células ganglionares. A
primeira hipótese é que a proteína ATF-2 pode estar sendo clivada por proteases
como as caspases, e o anticorpo usado para detectar a proteína não mais a
reconheceria. De fato, a fragmentação de DNA e a condensação total da cromatina,
que ocorre nas células ganglionares após a axotomia, podem ser completamente
bloqueadas por inibidores de pan-caspases (Chiarini, L.B., dados não publicados).
Estes resultados indicam o envolvimento de caspases na degeneração destas
células. No entanto, foi observado que o tratamento de explantes de retina com
69
inibidores de caspases aumentou a incidência de células ganglionares com
cromatina parcialmente condensada (Chiarini LB não publicados). Este resultado
levanta a possibilidade das células ganglionares que apresentam a cromatina
parcialmente condensada, encontradas no nosso trabalho, estarem morrendo de
forma independente de caspases. Foi verificado que ocorre o desaparecimento de
ATF-2 também nestas células que apresentam a condensação parcial da cromatina.
Logo, o desaparecimento de ATF-2 após a axotomia das células ganglionares pode
ser independente de caspases. Para determinar se o fator de transcrição ATF-2 está
sendo clivado por caspases durante o processo de degeneração de células
ganglionares após a axotomia será analisada a presença de ATF-2 nestas células
após o tratamento com inibidores de pan-caspases.
A segunda hipótese para explicar o desaparecimento de ATF-2 é que a
degradação de ATF-2 por proteassoma esteja aumentada. Demonstrou-se que após
a fosforilação e conseqüente ativação do fator de transcrição ATF-2, ocorre uma
rápida ação de fosfatases que defosforilam e inativam o fator de transcrição ATF-2
(Ronai, 2000). Esse ciclo de fosforilação e defosforilação da proteína ATF-2 leva a
ação de proteínas que promovem a ligação de ubiquitinas à proteína ATF-2, fazendo
com que um complexo chamado de proteassoma, responsável pela degradação de
proteínas marcadas com ubiquitina, reconheça e degrade a proteína ATF-2
rapidamente (Ronai, 2000). Esses dados sugerem que o desaparecimento de ATF-2
pode ocorrer via degradação por proteassoma, já que ocorre um aumento e depois
uma diminuição do nível de fosforilação de ATF-2 antes do desaparecimento da
imunorreatividade para ATF-2.
Já foi demonstrado que o tratamento de explantes retinianos de ratos P3, com
o inibidor de proteassoma MG132 não foi capaz de bloquear a morte das células
70
ganglionares induzida por axotomia (Neves et al., 2001), sugerindo então que a
morte das células ganglionares da retina de rato em desenvolvimento não é
controlada pelo complexo proteassoma. Será analisado futuramente se ainda ocorre
a diminuição da imunorreatividade para ATF-2 após a axotomia na presença de
inibidores de proteassoma.
Como já havia sido descrito que o inibidor da síntese protéica anisomicina
bloqueava a morte das células ganglionares (Rehen & Linden, 1994) foi analisado o
que ocorria com o fator de transcrição ATF-2 nas células ganglionares axotomizadas
tratadas com anisomicina. Foi verificado que além de bloquear a morte das células
ganglionares axotomizadas, a anisomicina também bloqueou o desaparecimento do
fator de transcrição ATF-2. Este é mais um dado que sugere que o desaparecimento
de ATF-2 está associado com a degeneração retrógrada das células ganglionares.
Proteínas envolvidas na degradação de ATF-2 poderiam ter sua síntese aumentada
após a axotomia das células ganglionares, o que explicaria o bloqueio do
desaparecimento de ATF-2 com o tratamento com anisomicina. Outras proteínas,
como Ref-1 e Max, também têm seu nível intracelular mantido nas células
ganglionares da retina na presença de anisomicina (Chiarini, 1999, Petrs
et al 2005).
Ativação de ATF-2 e a morte celular programada de células ganglionares da
retina
Já foi descrito que, em situações de estresse, a fosforilação do fator de
transcrição ATF-2 nos resíduos Thr 69 e Thr 71 por cinases que respondem a
estresse como p38 cinase ou JNK leva à ativação do fator de transcrição ATF-2
(Ronai, 2000). Foi verificado que após a axotomia das células ganglionares ocorre
um aumento do nível de fosforilação do fator de transcrição ATF-2 nos resíduos Thr
71
69 e Thr 71 pela JNK, o que deve estar levando á ativação deste fator de transcrição
nas células ganglionares da retina. Essa fosforilação precede a condensação da
cromatina que é característica de morte celular programada. Foi descrito
anteriormente que a degeneração retrógrada das células ganglionares é dependente
de síntese protéica. Nossa hipótese é que o ATF-2 fosforilado pela JNK, após a
axotomia, poderia modular a expressão de genes associados à indução da morte
celular programada de células ganglionares da retina e dessa forma participar do
controle da degeneração destas células.
O fator de transcrição ATF-2 está envolvido no controle da expressão de
vários genes relacionados com a morte celular programada como
c-jun (van Dam et
al., 1995), TNF-α (Tsai et al., 1996; Ivanov & Ronai, 1999), Fas e FasL (Kasibhatla et
al
., 1998).
Um desses genes ativados pelo fator de transcrição ATF-2 que tem relação
com a morte celular programada neuronal é o gene
c-jun (Ham et al., 2000). Já foi
mostrado que o fator de transcrição ATF-2 aumenta a expressão de c-Jun (van Dam
et al., 1995; Eilers et al., 2001). O heterodímero ATF-2/c-Jun se liga e ativa o
promotor do gene
c-jun (Eilers et al., 2001). Uma hipótese da participação de ATF-2
na morte celular neuronal é o aumento da expressão de c-Jun, que foi descrito ser
necessário para que ocorra a morte celular neuronal induzida pela retirada de
fatores neurotróficos (Estus
et al., 1994; Watson et al., 1998). Além disso, Yoshida e
colaboradores mostraram que a degeneração retrógrada das células ganglionares
da retina de camundongos adultos induzida por axotomia é regulada pela
fosforilação de c-Jun (Yoshida
et al., 2002).
Outro gene alvo do fator de transcrição ATF-2 que codifica uma proteína que
tem participação na degeneração retrógrada das células ganglionares é a citocina
72
inflamatória TNF-α (Tsai et al., 1996; Ivanov & Ronai, 1999; Tezel et al., 2001). Tezel
e colaboradores mostraram em camundongos adultos submetidos ao esmagamento
do nervo óptico que TNF-
α está envolvido na degeneração secundária das células
ganglionares (Tezel
et al., 2004). Neste trabalho, camundongos deletados do gene
que codifica o receptor de TNF-
α relacionado com morte celular, TNF-R1, tinham
uma diminuição na degeneração secundária das células ganglionares induzida pelo
esmagamento do nervo óptico.
O receptor Fas e seu ligante FasL, que tem sua expressão modulada por
ATF-2, também foram relacionados com o controle da degeneração de células
ganglionares (Kim & Park, 2005; Weishaupt
et al., 2003). Após a ligação de FasL
com seu receptor Fas, ocorre a trimerização do receptor, com conseqüente ativação
da molécula adaptadora FADD, levando à ativação de caspase 8 (para revisão
Nagata, 1997). Portanto, a ligação de FasL com seu receptor Fas, induz a ativação
de caspase 8 e conseqüente morte celular. A regulação da transcrição dos genes
que codificam as proteínas Fas e FasL foi mostrada ser dependente dos fatores de
transcrição NF-kB, c-Jun, NF-AT, ATF-2 e Egr3 (Holtz-Heppelmann
et al., 1998;
Kasibhatla
et al., 1998; Latinis et al.,1997; Mittelstadt & Ashwell, 1998). Como além
de ATF-2, c-Jun também está envolvido na regulação da expressão de Fas e FasL,
estes genes são possíveis alvos de ATF-2 e/ou c-Jun após axotomia das células
ganglionares da retina.
Portanto, a proposta é que o fator de transcrição ATF-2 ativado após ser
fosforilado pela JNK, leve ao aumento da expressão de genes envolvidos na morte
de células ganglionares da retina, como c-Jun, TNF-
α, Fas e/ou FasL.
73
Degradação de ATF-2 e morte celular
Foi verificado neste trabalho que ocorre um desaparecimento da marcação
para ATF-2, feita por imunohistoquímica, em células ganglionares da retina
axotomizadas. Este desaparecimento de ATF-2 foi associado à ocorrência de
degeneração destas células. No sistema nervoso, já foi descrito, através de
imunohistoquímica, a diminuição da expressão de ATF-2 em vários tipos celulares
que sofreram morte celular, inclusive nas células ganglionares da retina de rato
adulto (Herdegen
et al., 1997; Martin-Villalba et al., 1998; Buschmann et al., 1998;
Robinson, 1996).
Não se sabe se a degradação de ATF-2 é uma etapa importante no controle
da morte de células ganglionares ou se essa diminuição é apenas conseqüência do
processo de morte. Porém, ATF-2 além de regular a expressão de c-Jun, forma
dímeros com esta proteína. Juntos, ATF-2/c-Jun regulam a expressão de diferentes
genes envolvidos no processo de morte. Portanto, a presença de ATF-2 pode
regular a seletividade de c-Jun por diferentes promotores de genes. Já foi
demonstrado que a heterodimerização de ATF-2 com c-Jun induz uma troca de
preferência de ligação de ATF-2 da seqüência CRE para a seqüência AP-1 no DNA
(Benbrook & Jones, 1991; Hai & Curran, 1991). Além disso, foi demonstrado que c-
Jun se liga preferencialmente aos sítios AP-1 quando se dimeriza com c-Fos, mas
se liga preferencialmente à seqüência CRE quando está dimerizado com ATF-2
(Benbrook & Jones, 1991; Hai & Curran, 1991). Logo, o fator de transcrição ATF-2
pode estar envolvido não só na regulação da expressão de c-Jun, mas também na
regulação dos genes alvos de c-Jun, já que a presença de ATF-2 pode influenciar na
preferência dos genes alvos de c-Jun. Portanto, enquanto a fosforilação de ATF-2
pela JNK, que leva à sua ativação, pode estar sendo importante para aumentar a
74
transcrição de c-Jun, a desfosforilação de ATF-2 e sua posterior degradação pode
ser uma etapa importante para a ocorrência da morte celular por, na sua ausência,
alterar o grupo de genes regulado pelo c-Jun. Além disso, a concentração relativa de
ATF-2 e outras proteínas que formam dímeros com o c-Jun poderia alterar o grupo
de genes alvo que teria a transcrição alterada após a axotomia. Desta forma, em
diferentes tempos após a axotomia os dímeros formados pelo c-Jun poderiam ser
distintos, com gradativa diminuição de dímeros formados com ATF-2 o que teria
reflexo no grupo de genes regulados por c-Jun.
Como o ATF-2 é capaz de se dimerizar com c-Jun, especula-se que os dois
fatores de transcrição estariam formando um heterodímero, aumentando ainda mais
a expressão de c-Jun, formando uma alça de retroalimentação positiva. Entretanto,
para que essa alça de retroalimentação positiva acabe, é necessária a degradação
de ATF-2. Portanto o ATF-2 estaria sendo defosforilado por fosfatases, sendo
desfeito o heterodímero ATF-2/c-Jun. Logo, o fator de transcrição ATF-2
desfosforilado seria degradado pelo complexo proteassoma, deixando c-Jun livre
para se dimerizar com o próprio c-Jun, formando homodímeros, ou com outros
fatores de transcrição, formando heterodímeros. Por fim, dímeros formados pelo c-
Jun poderiam ativar genes alvos envolvidos na morte das células ganglionares.
Portanto, a degradação de ATF-2 pode ser importante para que ocorra a morte das
células ganglionares.
JNK e fosforilação de ATF-2 nas células ganglionares axotomizadas
Como já está bem descrito na literatura que as cinases p38 e JNK são
capazes de fosforilar e ativar o fator de transcrição ATF-2 (Ronai, 2000), foi
analisado se essas duas cinases estão ativadas nas células ganglionares
75
axotomizadas. A ativação dessas cinases ocorre por fosforilação. Logo, foi
investigado através de imunohistoquímica se essas cinases estão fosforiladas após
a axotomia das células ganglionares. A análise mostrou que apenas JNK, e não a
p38, está fosforilada nas células ganglionares axotomizadas.
O anticorpo utilizado detecta apenas as JNK1 e JNK2 fosforiladas (resíduos
de treonina e tirosina nas posições 183 e 185) e não a JNK3 (fosforilada nos
resíduos de treonina e tirosina nas posições 221 e 223). Foi descrito que a ativação
de fatores de transcrição é feita preferencialmente pelas JNK2 e JNK3, que são
capazes de translocar rapidamente para o núcleo (Coffey
et al., 2000, 2002).
Recentemente foi demonstrado que a deleção de JNK3 leva a uma diminuição da
fosforilaçao de c–Jun e ATF-2 e da morte de células do córtex cerebral, hipocampo,
estriado e tálamo após isquemia global em camundongos neonatos. Estes dados
sugerem que JNK3 tem um papel pró-apoptótico no sistema nervoso em
desenvolvimento. Como JNK3 é que está classicamente descrita como sendo pró-
apoptótica no sistema nervoso, pretendemos no futuro analisar esta cinase
especificamente.
Para investigar qual cinase seria a responsável por fosforilar o fator de
transcrição ATF-2, foram usados inibidores específicos de p38 e JNK. O tratamento
de explantes de retina com o inibidor de JNK foi capaz de bloquear totalmente a
fosforilação de ATF-2 nos resíduos Thr 69 e Thr 71, em todos os tempos analisados
(dados não mostrados 3, 6, 12, 18 e 24 horas). Entretanto o inibidor de p38 não teve
nenhum efeito sobre a fosforilação de ATF-2 nesses resíduos. Resultado que
corrobora dados anteriores de que apenas JNK está sendo ativada nas células
ganglionares. Logo, conclui-se que JNK é a responsável por ativar o fator de
transcrição ATF-2 após a axotomia das células ganglionares da retina.
76
JNK e degeneração das células ganglionares da retina
Além de bloquear totalmente a fosforilação de ATF-2, o inibidor de JNK foi
capaz de bloquear quase que totalmente a morte das células ganglionares da retina
de ratos neonatos induzida por axotomia.
Foi detectado, por imunohistoquímica, a JNK fosforilada nas células
ganglionares axotomizadas e a necessidade da atividade de JNK para a ocorrência
da degeneração retrógrada das células ganglionares da retina em desenvolvimento.
Porém, não sabemos se JNK já estava fosforilada e ativa antes da axotomia.
Resultados prévios do Laboratório de Neurogênese (Campos, 1999) mostraram
imunorreatividade para JNK fosforilada na camada de fibras ópticas de retinas de
ratos neonatos fixadas
in vivo, ou seja antes da axotomia. Entretanto, não foi
observada marcação nas células ganglionares. Entretanto os anticorpos usados
eram diferentes dos usados neste trabalho. Para determinar se a axotomia está
induzindo a fosforilação e ativação da JNK será necessária uma análise da
imunorreatividade para JNK fosforilada da retina de rato neonato perfundido, antes
da axotomia.
Já foi demonstrado em um trabalho com camundongos adultos submetidos a
esmagamento do nervo óptico que a diminuição da morte secundária das células
ganglionares nos camundongos deletados para o receptor TNF-R1 era devido a uma
diminuição da fosforilação de JNK. Já que a adição de um inibidor de JNK nos
animais mutantes não teve nenhum efeito sobre a morte das células ganglionares
(Tezel
et al., 2004). Entretanto, o inibidor de JNK foi capaz de diminuir a
degeneração secundária das células ganglionares da retina de camundongos
selvagens. Além disso, foi visto neste trabalho imunorreatividade para TNF-
α em
77
células marcadas para GFAP, que marca células da glia ativada. Acredita-se que
após o dano axonal, células da glia seriam ativadas, liberando citocinas inflamatórias
como TNF-
α. O TNF-α se ligaria ao seu receptor de morte TNF-R1 expresso nas
células ganglionares ativando-o. Portanto, os resultados da literatura sugerem que a
ativação de JNK em resposta a dano axonal nas células ganglionares da retina de
rato adulto seja devido à ativação do receptor TNF-R1. Logo, é possível que na
retina de rato neonato, JNK esteja sendo ativada através da ativação do receptor
TNF-R1 pela citocina inflamatória TNF-α.
Em outro trabalho, Tezel e colaboradores mostraram a fosforilação de JNK
nas células ganglionares da retina de doadores humanos com glaucoma (Tezel
et
al., 2003). Além disso, recentemente demonstrou-se a ativação de JNK nas células
ganglionares da retina de ratos adultos submetidos ao aumento da pressão
intraocular (Kwong & Caprioli, 2006). Esses dados da literatura indicam uma ação
pró-apoptótica de JNK nas células ganglionares da retina madura.
Portanto, JNK é necessária para a indução da morte de células ganglionares
tanto na retina de adulto quanto no tecido retiniano em desenvolvimento.
ATF-2 e outros alvos de JNK
No sistema nervoso, JNK está envolvida na sinalização que estimula a
transcrição de genes que codificam proteínas pró-apoptóticas como TNF, Bim e
FasL (Putcha
et al., 2003). Além de ativar o fator de transcrição ATF-2, JNK é capaz
de fosforilar diversos outros substratos, incluindo outros fatores de transcrição.
Foi demonstrado
in vivo que JNK é capaz de fosforilar c-Jun nos resíduos
serina 63 e 73 (Gupta
et al., 1996; Kallunki et al., 1996; Kyriakis & Avruch, 1996),
sendo que esse fator de transcrição está envolvido com a morte das células
78
ganglionares de camundongo adulto (Yoshida et al., 2002). Foi demonstrado que a
inibição de JNK foi capaz de diminuir a fosforilação de c-Jun, diminuindo a
expressão de Fas-L e a morte de células da região CA1 do hipocampo de ratos
adultos induzida por isquemia (Guan
et al., 2006).
Além dos alvos nucleares, JNK é capaz de fosforilar uma variedade de
substratos citoplasmáticos. Já foi demonstrado que JNK é capaz de fosforilar
proteínas da família Bcl-2 (Maundrell
et al, 1997). Também foi mostrado que a
inibição de JNK foi capaz de diminuir a fosforilação de Bcl-2, diminuindo a liberação
de Bax do dímero Bcl-2/Bax, atenuando a translocação de Bax para a mitocôndria e
a liberação de citicromo c, consequentemente diminuindo a morte de células da
região CA1 do hipocampo, induzida por isquemia (Guan
et al., 2006).
Portanto, não se pode assumir que o efeito do inibidor de JNK sobre a morte
das células ganglionares da retina de rato neonato induzida por axotomia seja
devido apenas à inibição da fosforilação de ATF-2, pois JNK possui outros alvos
envolvidos com morte celular neuronal.
Para analisar especificamente se a fosforilação de ATF-2 é importante para a
morte de células ganglionares será usada futuramente uma construção de ATF-2 em
que os sítios de fosforilação serão mutados para alanina. Após a construção desse
gene mutante, ele será inserido em um vetor viral AAV2 e superexpresso nas células
ganglionares. Após a superexpressão dessa construção de ATF-2 nas células
ganglionares, estas serão submetidas à axotomia, e será analisada a incidência de
morte dessas células.
79
p38 e degeneração de células ganglionares
Na retina de ratos adultos, p38 é ativada nas células ganglionares após dano
ao nervo óptico ou injeção intravítrea de NMDA, sendo que a sua inibição resulta em
uma diminuição da morte das células ganglionares induzida por ambos os estímulos
(Kikuchi
et al., 2000; Manabe & Lipton, 2003).
O papel de p38 na morte celular na retina em desenvolvimento foi
recentemente mostrado por Campos e colaboradores (Campos
et al., 2006). Nesse
trabalho demonstrou-se que a taxa de morte das células pós-mitóticas
indiferenciadas da camada neuroblástica induzida pelo tratamento com anisomicina
era diminuída após o tratamento com um inibidor de p38, SB203580. Entretanto, a
morte das células ganglionares induzida pela axotomia não foi alterada pelo
tratamento com este inibidor de p38. Portanto, sugere-se que a cinase p38 não está
envolvida na degeneração das células ganglionares, induzida por axotomia, na
retina em desenvolvimento.
Não foi detectada marcação para p38 fosforilada na camada de células
ganglionares. Entretanto, foi observado marcação para p38 fosforilada na margem
mais externa da retina, onde as células sofrem mitose. Esses dados corroboram os
dados de Campos e colaboradores que mostraram que p38 não é ativada nas
células ganglionares da retina de ratos neonatos após a axotomia (Campos
et al.,
2006).
Foi visto neste trabalho que o inibidor de p38, SB239063, foi capaz de
bloquear parcialmente a morte das células ganglionares. Esses dados entram em
contradição com os dados de Campos e colaboradores que mostraram que um
inibidor de p38, SB203580, não teve efeito sobre a morte das células ganglionares
da retina de ratos neonatos. Uma explicação para esta contradição pode estar no
80
fato dos inibidores de p38 utilizados nestes trabalhos serem diferentes. Os inibidores
SB203580 e SB239063 podem ter efeitos distintos sobre a atividade das diferentes
isoformas de p38.
Como explicar o efeito do inibidor de p38, SB239063, já que não vemos
fosforilação de p38 nas células ganglionares axotomizadas? Uma hipótese seria a
de que p38 estaria sendo fosforilado em um nível muito baixo, não sendo detectado
pelo anticorpo usado na técnica de imunohistoquímica. Outra hipótese seria a de
que o inibidor de p38 estaria inibindo outras moléculas envolvidas na morte das
células ganglionares, como a própria JNK. Uma outra hipótese ainda é a de que o
inibidor de p38 estaria inibindo a atividade de p38 em outras células, como por
exemplo, as células da parte mais interna da camada neuroblástica, possivelmente
células amácrinas, que estão marcadas para p38 fosforilado, impedindo a liberação
de algum fator responsável por aumentar a morte das células ganglionares.
81
Conclusões
Nesta dissertação de mestrado foi verificado que:
- Células ganglionares da retina em desenvolvimento apresentam ATF-2 no
núcleo.
- Ocorre o desaparecimento progressivo de ATF-2 das células ganglionares
após a axotomia. Células com cromatina condensada, característica de morte
celular, não apresentam ATF-2.
- Ocorre um aumento da incidência de células com a proteína ATF-2
fosforilada 3 horas após a axotomia.
- O tratamento de explantes de retina com o inibidor da síntese protéica
anisomicina, bloqueia a perda da imunorreatividade para ATF-2 e a morte celular
programada, induzida pela axotomia das células ganglionares.
- O tratamento com um inibidor de JNK bloqueia a fosforilação de ATF-2 e a
morte das células ganglionares.
- O tratamento com um inibidor de p38 não interfere no nível de fosforilação
de ATF-2 e apenas diminui um pouco a taxa de apoptose das células ganglionares.
Os resultados mostraram que a fosforilação de ATF-2 e a degeneração
retrógrada das células ganglionares da retina induzida pela axotomia ocorre de
forma dependente da ativação de JNK.
82
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