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UNIVERSIDADE FEDERAL DE RORAIMA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA - POSAGRO
ROSIANNE NARA THOMÉ BARBOSA
SELEÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS VISANDO O CONTROLE
BIOLÓGICO DA MURCHA-DE-ESCLERÓCIO EM TOMATEIRO
(Solanum lycopersicum L.)
BOA VISTA
RORAIMA - BRASIL
2009
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ROSIANNE NARA THOMÉ BARBOSA
SELEÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS VISANDO O CONTROLE
BIOLÓGICO DA MURCHA-DE-ESCLERÓCIO EM TOMATEIRO
(Solanum lycopersicum L.)
Dissertação apresentada ao programa
de pós-graduação em Agronomia da
Universidade Federal de Roraima, em
parceria com a Embrapa Roraima,
como pré-requisito para obtenção do
título de Mestre em Agronomia, Área
de Concentração Produção Vegetal.
Orientador (a): Pesquisador Dr. Bernardo
de Almeida Halfeld Vieira
Boa Vista
Roraima - Brasil
2009
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Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
B238s Barbosa, Rosianne Nara Thomé.
Seleção de rizobactérias visando o controle biológico
da murcha-de-esclerócio em tomateiro (Solanum
lycopersicum L.) / Rosianne Nara Thomé Barbosa – Boa
Vista, 2009.
44 f. : il
Orientador: Dr. Bernardo de Almeida Halfeld Vieira.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação
em Agronomia - POSAGRO, Universidade Federal de
Roraima.
1 – Agronomia. 2 – Sclerotium rolfsii. 3 – Produção de
inóculo. 4 – Métodos de inoculação. 5 – Fungo de solo. 6
– Antibiose. 7 - Ácido oxálico. I – Título. II – Vieira,
Bernardo de Almeida Halfeld.
CDU
–
635.64
ROSIANNE NARA THOMÉ BARBOSA
SELEÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS VISANDO O CONTROLE
BIOLÓGICO DA MURCHA-DE-ESCLERÓCIO EM TOMATEIRO
(Solanum lycopersicum L.)
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Agronomia da
Universidade Federal de Roraima, em
parceria com a Embrapa Roraima,
como pré-requisito para obtenção do
título de Mestre em Agronomia, Área
de Concentração Produção Vegetal.
Aprovada: 18 de março de 2009
_____________________________________________
Pesquisador Dr. Bernardo de Almeida Halfeld Vieira
Orientador - Embrapa Roraima
___________________________________________
Pesquisadora Dra. Kátia de Lima Nechet
Coorientadora - Embrapa Roraima
___________________________________________
Profa. Dra. Gisele Barata da Silva
UFRA
___________________________________________
Prof. Dr. Jefferson Fernandes do Nascimento
UFRR
ii
DEDICATÓRIA
Aos meus queridos pais, Lázaro e Ivilete.
Ao meu esposo, Antônio Maurício.
Dedico.
iii
AGRADECIMENTOS
À Deus.
À Universidade Federal de Roraima e Embrapa Roraima, pelo Programa de Pós-
Graduação em Agronomia.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior – CAPES, por
aprovar o Programa de Pós-Graduação em Agronomia.
Ao Dr. Bernardo de Almeida Halfeld Vieira e a Dra. Kátia de Lima Nechet, pela
excelente orientação, paciência, dedicação e amizade.
Aos membros da banca Profa. Dra. Gisele Barata da Silva e Prof. Dr. Jefferson
Fernandes do Nascimento pelas excelentes sugestões para a conclusão deste trabalho.
Aos demais professores do curso pelo empenho, dedicação, paciência e compreensão.
Ao Ex-Secretário Adjunto de Estado da Agricultura, Pecuária e Abastecimento,
Wellington Costa Rodrigues do Ó, pela amizade e pelo consentimento para cursar o Mestrado
em Agronomia.
Ao Técnico em laboratório Giovanni Ribeiro de Souza, às estagiárias Dayane
Rodrigues Youssef e Larisse Carneiro Amorim, à mestranda Gabriela Queiroz Pelzer e ao
estagiário Wellington Robson Soares Cizino de Paiva, pela amizade e apoio na execução deste
trabalho.
Aos produtores rurais, Luís O. S. Mendes, Edijar Diniz da Silva, Dionísio Pereira
Carlos, Evangelista Isidoro Ângelo, Gilmar Araújo, Antônio dos Santos Lima, José Ferino da
Rocha e Jainy Rouse Magalhães Gomes pelo fornecimento das plantas de tomateiro utilizadas
neste trabalho.
Aos Engenheiros Agrônomos, Erwin João de Morais Lima, Diego da Silva Barberena,
Emerson Guedes dos Santos e Emerson Ricardo Vieira dos Santos e aos Técnicos em
Agropecuária, Antônio Alves de Oliveira e Vilson Silva Chaves, pelo auxílio nas coletas.
Aos meus pais, Lázaro Barbosa e Ivilete Thomé Barbosa e ao meu esposo, Antônio
Maurício da Silva Peixoto, por sempre acreditarem mim e pelo constante apoio para esta
conquista.
Aos amigos Samuel Carlos de Santana, Marta Cecília Mota de Macêdo Henchen e
Roberto Carlos da Silva pela compreensão e constante apoio para a conclusão deste trabalho.
Às amigas Cylles Zara dos Reis Barbosa, Lionésia da Silva Esbell e Shirlany Ribeiro de
Melo, pelo companheirismo, carinho e incentivo em todos os momentos do curso.
À todos meu muito obrigada.
iv
BIOGRAFIA
ROSIANNE NARA THOMÉ BARBOSA, filha de Lázaro Barbosa e Ivilete
Thomé Barbosa, nasceu em 16 de fevereiro de 1979, em Boa Vista-RR.
Em outubro de 2002, concluiu o curso de graduação em Bacharel em
Agronomia, pela Universidade Federal de Roraima.
Em janeiro de 2003, foi admitida no curso de Pós-Graduação “lato sensu”
em Recursos Naturais da Universidade Federal de Roraima, submetendo-se à
defesa de monografia em 03 de junho de 2004.
Em maio de 2005, foi admitida no curso de Pós-Graduação “lato sensu” em
Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Roraima,
submetendo-se à defesa de monografia em 18 de agosto de 2006.
Em abril de 2006, prestou concurso público no Governo do Estado de
Roraima, sendo empossada no cargo de Engenheiro Agrônomo em 06 dezembro
2006.
Em março de 2007, foi admitida no curso de Mestrado em Agronomia da
Universidade Federal de Roraima, submetendo-se à defesa de dissertação em 18 de
março de 2009.
v
BARBOSA, Rosianne Nara Thomé. Seleção de rizobactérias visando o controle
biológico da murcha-de-esclerócio em tomateiro (Solanum lycopersicum L.).
2009. 44 p., Dissertação de Mestrado / Dissertação de Mestrado em Agronomia –
Universidade Federal de Roraima, Boa Vista, 2009.
RESUMO
A murcha-de-esclerócio causada por Sclerotium rolfsii é uma das mais importantes
doenças do tomateiro em regiões tropicais. Seu controle é difícil, havendo
perspectivas do uso de microrganismos antagônicos, já que medidas convencionais
não apresentam eficiência satisfatória. O uso de rizobactérias é uma das alternativas
viáveis no controle de doenças e na redução ou substituição do uso de defensivos
químicos no controle de doenças de plantas, principalmente causadas por
patógenos de solo. O presente trabalho foi realizado com o objetivo de selecionar
rizobactérias que promovam o controle da murcha-de-esclerócio sem afetar o
crescimento das plantas de tomateiro e verificar se o mecanismo de antibiose e a
inibição da difusão do ácido oxálico têm relação com a capacidade de controle.
Ajustes metodológicos para indução da murcha-de-esclerócio, sem a incitação de
ferimentos em plantas de tomateiro, foram realizados previamente utilizando-se 2, 4,
8 e 16 g de arroz colonizado.L
-1
incorporados ao solo e 2, 4, 6 e 8 escleródios ou
discos de micélio, depositados na superfície do solo. A seleção de rizobactérias foi
realizada em casa de vegetação através de seis ciclos de seleção massal, e os
melhores isolados foram reavaliados em três experimentos, utilizando-se como
variáveis a severidade da doença, altura e matéria seca das plantas. Todos os
isolados também foram avaliados por testes de antibiose e inibição da difusão do
ácido oxálico in vitro. Os resultados obtidos demonstram que: a incorporação de 8 g
de arroz colonizado.L
-1
de solo é a concentração e o tipo de inóculo ideal para a
inoculação do patógeno, sem incitação de ferimentos; o isolado 38291 foi o único a
restringir o desenvolvimento do patógeno in vitro por meio de antibiose e de controlar
a murcha-de-esclerócio in vivo. Os isolados 31233, 32238, 33282 e 41296
promoveram controle da murcha-de-esclerócio em casa de vegetação, sem atividade
detectável in vitro.
Palavras-chave: Sclerotium rolfsii, produção de inóculo, métodos de inoculação,
fungo de solo, antibiose, ácido oxálico.
vi
BARBOSA, Rosianne Nara Thomé. Selection of rhizobacteria to the biological
control of southern blight in tomato (Solanum lycopersicum L.). 2009.
Dissertação de Mestrado em Agronomia – Universidade Federal de Roraima, Boa
Vista, 2009.
ABSTRACT
The southern blight caused by Sclerotium rolfsii is one of the most important
diseases of tomato in tropical countries. The control is difficult and it is possible to
use antagonist microorganisms, once conventional controls are not efficient. The use
of rhizobacteria is one of viable disease control and on reduction or replace for the
chemical products on plant disease control, meanly that caused by soil pathogen.
The aim of this work was select rhizobacteria capable to control the southern blight
with no effect on tomato growth and investigate the correlation of antibiosis
mechanism and inhibition of oxalic acid diffusion with the control of disease.
Methodological adjustments for induction of southern blight with no plant wounds
were preview performed using 2, 4, 8 e 16 g of colonized rice.L
-1
mixed on soil and 2,
4, 6 e 8 sclerotia or micelial discs deposited on soil surface. The selection of
rhizobacteria was performed on greenhouse through six cycles of massal selection
and the best isolates were revaluated in three experiments using the disease severity
and plant growth as variables. All the isolates were evaluated for antibiosis tests and
inhibition of oxalic acid diffusion in vitro. The results demonstrated that the mixed of 8
g of colonized rice.L
-1
on the soil is the best concentration and inoculum source for
the pathogen inoculation with no wounds; the 38291 isolate was the only to restrict
the pathogen development in vitro through antibiosis and to control the southern
blight in vivo. The 31233, 32238, 33282 e 41296 isolates promoted control of
southern blight on greenhouse conditions with no activity detected in in vitro assays.
Keywords: Sclerotium rolfsii, inoculum production, inoculation methods, soil
inhabiting fungi, antibiosis, oxalic acid.
vii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
2 REFERENCIAL TEÓRICO.......................................................................................3
2.1 O TOMATEIRO .....................................................................................................3
2.2 Sclerotium rolfsii Sacc. ..........................................................................................4
2.3 MURCHA-DE-ESCLERÓCIO................................................................................6
2.4 RIZOBACTÉRIAS .................................................................................................7
2.4.1 Mecanismos de antagonismo das rizobactérias.................................................8
2.4.1.1 Antibiose..........................................................................................................8
2.4.1.2 Competição .....................................................................................................9
2.4.1.3 Indução de resistência sistêmica...................................................................10
3 ARTIGO A: MÉTODO DE INOCULAÇÃO DE Sclerotium rolfsii EM TOMATEIRO
..................................................................................................................................12
3.1 RESUMO.............................................................................................................12
3.2 ABSTRACT .........................................................................................................12
3.3 INTRODUÇÃO ....................................................................................................13
3.4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................14
3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................16
3.6 CONCLUSÕES ...................................................................................................19
4 ARTIGO B: SELEÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS VISANDO O CONTROLE
BIOLÓGICO DA MURCHA-DE-ESCLERÓCIO (Sclerotium rolfsii) EM
TOMATEIRO.............................................................................................................20
4.1 RESUMO.............................................................................................................20
4.2 ABSTRACT .........................................................................................................20
4.3 INTRODUÇÃO ....................................................................................................21
4.4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................23
4.4.1 Coletas de plantas de tomateiro.......................................................................23
4.4.2 Isolamento das rizobactérias............................................................................23
4.4.3 Testes de antibiose e supressão da difusão do ácido oxálico..........................24
4.4.4 Seleção massal ................................................................................................24
4.4.5 Confirmação da efetividade das rizobactérias selecionadas ............................25
4.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................27
4.6 CONCLUSÕES ...................................................................................................35
5 CONCLUSÕES GERAIS .......................................................................................36
REFERÊNCIAS.........................................................................................................37
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.5.1 Comparação das dissimilaridades estatísticas das retas realizada
por teste t para os valores de intercepto e do coeficiente angular da
reta........................................................................................................ 17
Tabela 4.5.1 Valores médios da severidade inicial da doença, severidade final e
área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) em plantas
de tomateiro colonizadas por diferentes isolados de rizobactérias...... 30
Tabela 4.5.2 Valores médios da Altura, da Matéria Seca Total (M. S. Total),
Matéria Seca da Raiz (M. S. Raiz) e Matéria Seca da Parte Área (M.
S. Parte Aérea) de plantas de tomateiro inoculadas com diferentes
isolados de rizobactérias...................................................................... 33
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.5.1. Incidência da murcha-de-esclerócio em função da concentração
de grãos de arroz colonizados......................................................... 16
Figura 4.5.1. Redução do crescimento micelial de S. rolfsii por rizobactérias...... 27
Figura 4.5.2. Supressão da difusão do ácido oxálico por rizobactérias................ 27
1
1 INTRODUÇÃO
O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das hortaliças mais cultivadas
(CARVALHO et al., 2002) e consumidas no mundo, sendo, portanto considerada
uma cultura de grande importância econômica (FERNANDES et al., 2007).
No Brasil, essa cultura foi introduzida no final do século XIX por imigrantes
europeus (ALVARENGA, 2004) e se tornou uma das atividades mais importantes na
economia brasileira, tanto pelo seu valor econômico quanto por gerar inúmeros
empregos (CARVALHO et al., 2003).
Em 2007, o Brasil se destacou como nono produtor mundial de tomate, com
uma produção em torno de 3,3 milhões de toneladas, em aproximadamente 57 mil
hectares (FAO, 2007). Os estados de Goiás, São Paulo e Minas Gerais são os
maiores produtores de tomate no país, respondendo juntos por 57,89% da produção
nacional. Os demais estados brasileiros são responsáveis pelos 42,10% restantes
da produção. Na região Norte, Roraima se destacou como o terceiro maior produtor
de tomate, com produção estimada de 5.268 toneladas (IBGE, 2007).
Por ser uma das culturas mais cultivadas no Brasil, e, portanto estar
distribuída em quase todos os Estados, a mesma está sujeita ao ataque de uma
grande diversidade de patógenos, sendo os fungos os maiores responsáveis pelas
doenças que ocorrem no tomateiro (LOPES e SANTOS, 1994). Dentre as doenças
fúngicas, a murcha-de-esclerócio, causada por Sclerotium rolfsii Sacc. é uma das
mais importantes em regiões tropicais, uma vez que provoca perdas na produção,
em conseqüência da redução do estande durante o ciclo da cultura (CHAVES e
COSTA, 1999).
A murcha-de-esclerócio é uma doença extremamente difícil de ser
controlada (SERRA e SILVA, 2005), em função da ampla gama de hospedeiros, do
crescimento prolífico do fungo e da produção de estruturas de resistência,
denominadas escleródios (CARDOSO, 1990). Em função disso, medidas de
controle como rotação de cultura, aração profunda, adubação com fertilizantes
amoniacais, aplicação de calcário, e, em alguns casos, aplicação de fungicidas ao
solo promovem apenas o controle parcial da doença. Algumas medidas de controle
têm sido implementadas, como a solarização do solo e o uso de espécies de
microrganismos antagonistas (AGRIOS, 2005).
2
Dentre os microrganismos antagônicos, as rizobactérias promotoras de
crescimento de plantas são atualmente os mais estudados e com potencial para
serem utilizados na agricultura (ZAGO et al., 2000). Esses antagonistas são
bactérias de solo que colonizam raízes e promovem o aumento no crescimento
dessas plantas. Além disso, as rizobactérias se utilizam de diversos mecanismos
específicos para promover a supressão de patógenos. Dentre esses, se inclui a
antibiose, competição por substrato, parasitismo e indução de resistência sistêmica
do hospedeiro (KOKALIS-BURELLE et al., 2006).
Assim, diante da importância que a murcha-de-esclerócio representa para a
cultura do tomateiro no Brasil, e de não haver implementado o uso prático, referente
ao controle biológico, através de rizobactérias promotoras de crescimento de
plantas, torna-se relevante conhecer o efeito destas bactérias sobre essa doença.
Portanto, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de selecionar rizobactérias
que promovam o controle da murcha-de-esclerócio, sem restringir o crescimento
das plantas de tomateiro, investigando se a supressão da difusão de ácido oxálico e
o mecanismo de antibiose estão relacionados com a capacidade de controle. Além
de determinar tipo e concentração de inóculo mais adequados para induzir a
murcha-de-esclerócio, sem provocar ferimentos em plantas de tomateiro.
3
2 REVISÃO DE LITERARURA
2.1 O TOMATEIRO
O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma solanácea originária da
América do Sul, de uma região compreendida entre o Equador e o Norte do
Chile, sendo encontrado na forma silvestre ou cultivado, desde o nível do mar
até 2.000 m de altitude (GOMES, 2005).
Os primeiros a domesticá-lo e cultivá-lo foram os povos das antigas
civilizações mexicanas (KRONKA, 2004). Em 1544, o tomateiro foi introduzido
na Europa, sendo mais tarde, disseminado da Europa para a Ásia meridional e
oriental, África e Oriente Médio. Recentemente, distribuiu-se o tomate silvestre
para outras partes da América do Sul e do México (NAIKA et al., 2006).
Atualmente, é uma das hortaliças mais cultivadas (CARVALHO et al.,
2002) e consumidas no mundo, sendo considerada uma cultura de grande
importância econômica (FERNANDES et al., 2007). Os frutos são consumidos
tanto in natura quanto na forma industrializada, devido a fatores, como por
exemplo, a versatilidade de uso, ao valor nutricional, a menor perecibilidade
quando comparado a outras hortaliças e a possibilidade de processamento
industrial (KRONKA, 2004).
No Brasil, foi introduzido no final do século XIX por imigrantes
europeus (ALVARENGA, 2004) e a cultura se tornou uma das mais importantes
na economia brasileira, tanto pelo seu valor econômico quanto por gerar
inúmeros empregos (CARVALHO et al., 2003).
Em 2007, o Brasil destacou-se como nono produtor mundial de tomate,
com uma produção em torno de 3,3 milhões de toneladas, em
aproximadamente 57 mil hectares (FAO, 2007). Os estados de Goiás, São
Paulo e Minas Gerais são os maiores produtores de tomate no país,
respondendo juntos por 57,89% da produção nacional. Os demais estados
brasileiros são responsáveis pelos 42,10% restantes da produção (IBGE,
2007).
Nos últimos anos, Roraima apresentou um aumento da área cultivada
4
e da produção de tomate, o que permitiu ao Estado reduzir a dependência do
produto proveniente do mercado externo (HALFELD-VIEIRA et al., 2006).
Atualmente, o Estado conta com produção estimada de 5.268 toneladas,
obtidas de uma área plantada de 449 hectares, destacando-se, no ano de
2007, como o terceiro maior produtor de tomate da região Norte (IBGE, 2007).
Contudo, até recentemente, a demanda local por essa hortaliça não era
atendida devido à baixa produtividade do Estado em relação à média nacional,
ocasionado pelo baixo nível tecnológico na condução da cultura.
Consequentemente, o mercado local era suprido com importações de outros
centros produtores, o que elevava demasiadamente os preços para o
consumidor. Mesmo com o alto preço no mercado local, o cultivo do tomate em
Roraima enfrenta entraves devido às exigências da cultura. Frequentemente,
as causas de queda de safra são ataques de pragas e doenças, tratos
culturais, adubação inadequada e uso de variedades não adaptadas à região
(LUZ et al., 2002).
Segundo Halfeld-Vieira et al. (2006) dentre as doenças da cultura
diagnosticadas no Estado, a murcha-de-esclerócio (S. rolfsii), ocorre
amplamente em Roraima e tem sido frequentemente observada, causando
danos principalmente em cultivos de tomateiro e pimentão.
2.2 Sclerotium rolfsii Sacc.
Sclerotium rolfsii Sacc. é um fungo polífago (CHAVES e COSTA, 1999),
habitante de solo, que exerce parasitismo do tipo necrotrófico. Neste tipo de
parasitismo, o patógeno mata o tecido da planta antes da penetração e causa
grandes danos ao hospedeiro (LUTRELL, 1974).
O fungo predomina em regiões de clima tropical e subtropical do mundo,
onde as condições de temperaturas e umidades do ar elevadas favorecem o
desenvolvimento e a sobrevivência do patógeno (MARTINS, 2003).
Este patógeno produz um abundante e espesso micélio branco,
frequentemente estéril, capaz apenas de formar uma estrutura de resistência
denominada escleródio (AGRIOS, 2005). Os escleródios são formados por uma
5
massa compactada e melanizada de micélio (BLUM et al., 2002), que
internamente é rico em glicogênio, lipídeos e trealose (DEACON, 1997). São
estruturas esféricas com diâmetro de aproximadamente 2 mm, que inicialmente
se apresentam brancas e posteriormente tornam-se marrons (INSTITUTO
BIOLÓGICO DE SÃO PAULO, s.d). Através dos escleródios, o patógeno
sobrevive no solo e em plantas doentes por longos períodos sob condições
adversas, pois possui a capacidade de resistir à degradação química e
biológica (ABO ELLIL, 1999).
A faixa de temperatura ideal para o seu crescimento vegetativo e
formação de escleródios varia entre 27 e 30 ºC, mas pode se desenvolver em
uma faixa de temperatura que varia de 8 a 40 ºC (PUNJA, 1985). Temperaturas
abaixo de 0 ºC e acima de 50 ºC por longos períodos promovem a degradação
dos escleródios (ADANDONON, 2004).
O fungo se desenvolve em diferentes tipos de solos e variações de pH,
sendo que a umidade do solo entre 25 e 35% (CORTEZI et al., 2005) e pH em
torno de 5,6 (CHAVES e COSTA, 1999) são condições ideais para seu
desenvolvimento. Entretanto, solos com pH em torno de 7 promovem a inibição
da germinação dos escleródios (PUNJA, 1985).
S. rolfsii tem como gama de hospedeiros cerca de 500 espécies de
plantas cultivadas no mundo (ALMEIDA et al., 2001), sendo a grande maioria
espécies dicotiledôneas (ADANDONON, 2004). Dentre estes hospedeiros,
estão incluídos milho, feijão, batata doce, tomate, melancia, banana, beterraba,
repolho, cenoura, café, algodão, alho, alface, manga e abacaxi (FERREIRA e
BOLEY, 1992).
A ampla gama de hospedeiros do fungo se deve, principalmente, ao seu
rápido crescimento, à produção de ácido oxálico e de enzimas degradadoras
de parede celular (ALMEIDA et al., 2001). O ácido oxálico produzido durante o
processo de parasitismo se combina com o cálcio, presente no tecido da planta
afetada, e propicia a ação de enzimas pectolíticas. Estas enzimas são as
responsáveis pela degradação dos tecidos (DEACON, 1997).
6
2.3 MURCHA-DE-ESCLERÓCIO
Uma vez estabelecido na planta S. rolfsii é responsável pela ocorrência
de uma importante doença: a murcha-de-esclerócio. Essa doença ocasiona
sérias perdas de produção nas plantas infectadas, provocadas pela redução do
estande durante o ciclo da cultura (CHAVES e COSTA, 1999; EMBRAPA
RONDÔNIA, 2005).
A murcha-de-esclerócio surge geralmente em pequenas reboleiras ou
em plantas isoladas (LOPES e ÁVILA, 2005) e ocorre tanto em mudas como
em plantas adultas. Em geral, as mudas são mais suscetíveis e morrem logo
após a infecção (FERREIRA e BOLEY, 1992).
Os primeiros sintomas surgem no colo da planta, através de lesões
marrons e aquosas. Com o desenvolvimento da doença, essas lesões
avançam, produzem escurecimento e podridão do caule, causando a
destruição do córtex e da raiz principal. Consequentemente, ocorre o
amarelecimento das folhas inferiores e posteriormente das folhas superiores.
Com o progresso da doença, ocorre o estrangulamento do colo das plantas
afetadas (BLUM et al., 2003), onde pode ser observado um micélio cotonoso
branco com ou sem escleródios (LOPES e ÁVILA, 2005). Esse
estrangulamento ocasiona murcha e seca na parte aérea, queda de folhas e
consequentemente a morte da planta (BLUM et al., 2003). Do mesmo modo, a
doença também ocorre em frutos que entram em contanto com solo
contaminado, os quais se desintegram em uma podridão mole (LOPES e
SANTOS, 1994).
A disseminação da doença no campo ocorre por meio do solo,
ferramentas e mudas contaminadas, água, vento e, em alguns casos,
possivelmente por sementes (FERREIRA e BOLEY, 1992).
A murcha-de-esclerócio é uma doença extremamente difícil de ser
controlada (SERRA e SILVA, 2005), em função da ampla gama de
hospedeiros, do crescimento prolífico do fungo e da produção de estruturas de
resistência, denominadas escleródios (CARDOSO, 1990). Em função disso,
medidas de controle como rotação de cultura, aração profunda, adubação com
fertilizantes amoniacais, aplicação de calcário, e, em alguns casos, aplicação
7
de fungicidas como PCNB ao solo promovem apenas o controle parcial da
doença. A redução na severidade da doença, em baixos níveis, tem sido
obtida pela solarização do solo e pelo uso de espécies de microrganismos
antagonistas. Os últimos são utilizados para o tratamento de sementes ou
órgãos propagativos cultivados em campos infestados pela doença.
Entretanto, tais medidas ainda estão em fase experimental (AGRIOS, 2005).
Segundo Zago et al. (2000) atualmente as rizobactérias promotoras de
crescimento de plantas são os microrganismos antagônicos mais estudados e
com potencial para serem utilizados na agricultura.
2.4 RIZOBACTÉRIAS
As pesquisas com rizobactérias não simbióticas foram iniciadas com o
objetivo de aumentar o crescimento e o rendimento das plantas. Essas
investigações começaram em 1885 na Rússia e na Ucrânia, usando-se
Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium e outras espécies do gênero
Bacillus. Contudo, somente após os trabalhos de Kloepper e Schroth, em
1978, com batata e rabanete, em que os autores comprovaram a capacidade
das rizobactérias em promover o crescimento e a bioproteção de plantas, é
que foi estabelecido o conceito de rizobactérias promotoras de crescimento de
plantas (LUZ, 1996).
Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas são bactérias de
solo que colonizam raízes de plantas, promovendo o aumento no seu
crescimento, e que utilizam de diversos mecanismos específicos para
promover a supressão de patógenos (KOKALIS-BURELLE et al., 2006).
As principais rizobactérias promotoras de crescimento de plantas são
as Pseudomonas spp. Migula 1894, espécies de Bacillus Cohn 1872,
Streptomyces Waksman e Henrici 1943, Rhizobium Frank 1889; emend Young,
Kuykendall, Martinez-Romero, Kerr e Sawada 2001a; Bradyrhizobium;
Acetobacter Beijerinck 1898; Herbaspirilum Baldani, Baldani, Seldin &
Döbereiner 1986; Agrobacterium radiobacter (Beijerinck & van Delden 1902)
Conn 1942; Enterobacter cloacae e Burkholderia cepacia (Palleroni e Holmes
8
1981 ex Burkholder 1950) Yabuuchi, Kosako, Oyaizu, Yano, Hotta, Hashimoto,
Ezaki e Arakawa 1993 (MARIANO et al., 2004).
Os efeitos benéficos, exercidos pelas rizobactérias promotoras de
crescimento de plantas podem ser conseguidos de forma direta através do
estímulo ao crescimento da planta, principalmente na ausência dos
microrganismos patogênicos, ou de forma indireta, através da proteção
microbiológica (BERNADES, 2006).
A promoção direta do crescimento das plantas através das
rizobactérias ocorre por meio da produção de ácido cianídrico, fitormônios,
enzimas como a ACC-deaminas, mineralização de nutrientes, solubilização de
fosfatos, fixação do nitrogênio e aumento da absorção pelas raízes, entre
outros. A promoção indireta do crescimento ocorre quando as rizobactérias
atuam como agentes de controle biológico através da produção de ácido
cianídrico, bacteriocinas e antibióticos, competição por espaço, Fe
+3
e outros
nutrientes, parasitismo, indução de resistência e proteção cruzada (MARIANO
et al., 2004).
Apesar dessa divisão, o agente de controle biológico pode atuar
através de mais de um mecanismo de interações antagonistas, aumentando
assim suas chances de sucesso (BETTIOL, 1991).
2.4.1 Mecanismos de antagonismo das rizobactérias
2.4.1.1 Antibiose
É uma interação entre organismos na qual um ou mais metabólitos
produzidos por um organismo tem efeito nocivo sobre o outro (BETTIOL,
1991), inibindo a germinação e crescimento ou inativando a célula por
toxicidade química (SILVEIRA, 2001).
Na antibiose, são produzidos compostos bactericidas, fungicidas ou
micostáticos e nematicidas. Os antibióticos são compostos orgânicos de baixo
9
peso molecular que, em baixas concentrações, são deletérios ao crescimento
ou às atividades metabólicas de outros organismos (FRAVEL, 1988).
Uma grande variedade de antibióticos como fenazinas, pioluteorinas,
pirrolnitrinas, tropolonas, piocianinas e 2,4 diacetilfloroglucinol têm sido
isolados, principalmente de diferentes estirpes de Pseudomonas spp. do solo.
Estes, junto com os sideróforos e o ácido hicrociânico (HCN), parecem ser
derivados do ácido corísmico, um intermediário da rota do ácido chiquímico.
Alguns compostos, como as tropolonas, têm amplo espectro de ação, o que
pode não ser desejável por eliminar outros organismos benéficos (ZAGO et al.,
2000).
Segundo Brunetta (2006) a eficácia no controle de patógenos através
dos antibióticos depende da suscetibilidade da população do patógeno-alvo.
Assim, a introdução de diferentes isolados de rizobactérias que produzem
antibióticos e que diferem no modo de ação, pode resultar num controle mais
eficaz e reduzir a inconsistência do controle.
2.4.1.2 Competição
Competição é a interação entre dois ou mais organismos empenhados
na mesma ação por alimento (nutrientes), espaço e oxigênio (BETTIOL, 1991).
A competição por espaço se dá, principalmente, pela ocupação dos
sítios de colonização e a competição por nutrientes, pelos três elementos
essenciais para a maioria dos patógenos: carbono, nitrogênio e ferro
(PAULITZ, 1990). A competição por nutrientes fornecidos por raízes e
exsudados de sementes ocorre na maior parte das interações entre bactérias
e patógenos nas raízes, sendo responsável, pelo menos, por um pequeno
coeficiente no biocontrole, observado pela introdução de bactérias (WELLER,
1988).
Rizobactérias com alta afinidade por ferro possuem a capacidade de
inibir patógenos nos solos com a restrição desse nutriente (BRUNETTA, 2006).
Segundo Buysens et al. (1996) bactérias do gênero Pseudomonas
fluorescentes são os principais microrganismos que apresentam a competição
10
pelo Fe
+3
, realizada por sideróforos. Além disso, grandes populações dessas
bactérias estabelecidas em plantas e raízes podem permanecer parcialmente
imersas em nutrientes na rizosfera (WELLER, 1988), restringindo, assim, a
quantidade de carbono e nitrogênio disponíveis, tanto para a germinação dos
esporos, quanto para os processos de pré-infecção radicular do agente
patogênico (BRUNETTA, 2006).
A exclusão de nicho é potencialmente outro importante mecanismo de
antagonismo de patógenos por rizobactérias. Espaços intercelulares e pontos
de emergência das raízes laterais são locais favoráveis à colonização por
muitas espécies de patógenos, devido à abundância em exsudados
radiculares nessas áreas. A inoculação de plantas com rizobactérias
supostamente previne ou reduz o estabelecimento de microrganismos
deletérios nestes locais (SUSLOW, 1982).
2.4.1.3 Indução de resistência sistêmica
Quando uma rizobactéria coloniza a raiz, moléculas constituintes da
célula bacteriana ou por ela sintetizada atuam como eliciadores. Esses
eliciadores agem como sinais e acionam genes codificadores de compostos de
defesa, havendo, assim, a indução de resistência sistêmica (VAN LOON et al,
1998).
Indução de resistência sistêmica é o aumento da capacidade de defesa
da planta contra diversos patógenos após estimulação apropriada, tornando-a
mais resistente. A indução de resistência sistêmica está diretamente ligada a
alterações bioquímicas e estruturais na planta (SOTTERO, 2003).
Vários processos bioquímicos como o aumento da produção das
proteínas solúveis em ácido, acúmulo de fitoalexinas, lignificação, ácido
salicílico em baixa concentração de ferro, estímulo da atividade da peroxidase
e cadeia lateral antigênica-O de lipossacarídeos de membrana externa são
propostos como mecanismos para indução de resistência sistêmica das
plantas por rizobactérias (ZAGO et al., 2000).
11
Além da peroxidase, um significativo número de outras enzimas é
associado à indução de resistência sistêmica, como por exemplo, fenilalanina-
amônia-liase, lipoxigenase, β-1,3-glucanase e chitinase. O incremento na
atividade e concentração dessas enzimas depende principalmente do agente
indutor, mas também do genótipo da planta, das condições fisiológicas e do
patógeno (SILVA et al., 2004).
Segundo Bernardes (2006) o desempenho da indução de resistência
sistêmica pode variar com a idade da planta, o tratamento indutor, o intervalo
de tempo entre o tratamento indutor e a inoculação do patógeno, os fatores
ambientais, as condições de cultivo, o estado nutricional das plantas e as
diferentes cultivares em relação ao indutor de resistência.
12
3 ARTIGO A: MÉTODO DE INOCULAÇÃO DE Sclerotium rolfsii EM
TOMATEIRO
3.1 RESUMO
O objetivo deste trabalho foi determinar o tipo e concentração de
inóculo mais adequados para induzir a murcha-de-esclerócio, sem provocar
ferimentos em plantas de tomateiro. Os tratamentos foram: 2, 4, 8 e 16 g de
arroz colonizado.L
-1
incorporados ao solo; 2, 4, 6 e 8 escleródios ou discos de
micélio depositados na superfície do solo. A deposição de discos de micélio e
escleródios não ocasionaram a incidência da doença, entretanto, 8 g de arroz
colonizado.L
-1
de solo demonstrou ser a concentração e o tipo de inóculo ideal
para experimentos que visem a inoculação do patógeno sem incitação de
ferimento.
Palavras-chave: Solanum lycopersicum, produção de inóculo, fungo de solo,
murcha-de-esclerócio.
INOCULATION METHODS OF Sclerotium rolfsii IN TOMATO
3.2 ABSTRACT
The objective of this work was to determinate the source and inoculum
concentration suitable to induce southern blight symptoms in tomato plants, with
no induced wounds. The performed treatments consisted by 2, 4, 8 and 16 g of
colonized rice grains.L-1 soil; 2, 4, 6 and 8 sclerotia or mycelium disks
deposited in soil surface. Deposition of mycelium disks or sclerotia no result in
disease, however, 8 g of colonized rice grains.L-1 soil demonstrate to be the
suitable concentration and inoculum source to induce southern blight with no
wound induction in tomato plants.
Keywords: Solanum lycopersicum, inoculum production, soilborne fungi,
southern blight.
13
3.3 INTRODUÇÃO
A murcha-de-esclerócio causada pelo fungo de solo (LUTRELL, 1974)
Sclerotium rolfsii Sacc. é uma doença de difícil controle (AGRIOS, 2005) que
predomina em regiões de clima tropical e subtropical, e ocasiona tombamento,
podridão radicular e murcha em mais de 500 espécies de plantas cultivadas no
mundo (PUNJA, 1985).
Apesar da sua importância, a definição de um método para inoculação
da doença, visando o estabelecimento das condições experimentais
adequadas para expressão dos sintomas típicos, em condições mais próximas
às que ocorrem em campo, não está estabelecida. Os métodos usados por
diferentes autores têm sido utilizados sem critérios, havendo diversas variações
nos procedimentos de inoculação. Alguns induzem condições altamente
propícias à infecção pelo patógeno, como deposição de escleródios sobre ou
junto às sementes (MATSUMOTO et al., 2000; BLUM et al., 2003), ou
diretamente em ferimentos provocados nas plantas (DANTAS et al., 2002).
Outros usam fontes ricas em carbono para promover a infestação do solo com
inóculo do fungo, induzindo a ocorrência da doença sem causar ferimentos
(FALCÃO et al., 2005; FLORES-MOCTEZUMA et al., 2006) e a deposição de
discos de micélio diretamente no colo da planta (PRATT e ROWE, 2002).
Portanto, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de determinar qual o
tipo e concentração de inóculo mais adequados para induzir a murcha-de-
esclerócio, sem provocar ferimentos em plantas de tomateiro.
14
3.4 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no período de maio a junho de 2007, no
Laboratório de Fitopatologia e em casa de vegetação, com temperatura
controlada a ±28 ºC, na Embrapa Roraima, Boa Vista, RR, Brasil.
Para ajustar a concentração de inóculo ideal para causar o máximo de
incidência de doença, foram utilizados grãos de arroz colonizados, escleródios
e discos de micélio. Como padrão, foi usado o isolado de S. rolfsii 258, obtido
do pimentão e mantido pela Coleção de Fungos Fitopatogênicos da Embrapa
Roraima.
Grãos de arroz beneficiados foram submersos em água destilada por
duas horas e em seguida autoclavados a 120 ºC durante 20 min, segundo
metodologia adaptada de Serra e Silva (2005). Posteriormente, foram
distribuídos sobre colônias de S. rolfsii, crescidas em placas de Petri, com meio
de cultura Batata-Dextrose-Ágar (BDA), durante sete dias em incubadora a ±25
ºC, em regime de fotoperíodo de 12 horas. Após sete dias, os grãos já se
encontravam colonizados em sua totalidade.
A produção dos escleródios e discos de micélio foi feita mediante o
cultivo do patógeno, por meio de discos de micélio de 0,5 cm em placas de
Petri com BDA, durante sete dias em incubadora a ±25 ºC, em regime de
fotoperíodo de 12 horas. Os escleródios foram retirados das colônias e
transferidos para placas de Petri esterilizadas. Já as colônias do fungo foram
mantidas nas placas para, posteriormente, serem retirados os discos de
micélio.
Mudas de tomateiro da cv. Santa Clara foram semeadas em bandejas
de isopor com substrato Plantmax
®
, sendo transplantadas com raiz nua para
vasos plásticos de 0,5 L, contendo solo esterilizado quando apresentavam
duas folhas compostas.
A infestação do solo com escleródios e discos de micélio foi feita
depositando-se os propágulos sobre a superfície do substrato a um centímetro
da planta, com 2, 4, 6 ou 8 propágulos por tratamento. Os grãos de arroz
colonizados foram incorporados e homogeneizados ao solo antes do
transplante das mudas, nas concentrações de 2, 4, 8 ou 16 g.L
-1
de solo, por
15
tratamento. Foram utilizadas oito plantas por tratamento e as testemunhas
foram constituídas por discos de BDA e grãos de arroz não colonizados. Após
a infestação, o solo foi irrigado uma vez ao dia.
As avaliações foram realizadas diariamente até 14 dias após a
inoculação. As variáveis avaliadas foram: incidência de plantas com sintomas
aos 14 dias após a infestação do solo e período de incubação. Os resultados
foram analisados por análise de regressão (MADDEN et al., 2007) utilizando-se
os pacotes estatísticos SigmaPlot 8.02 e Microsoft Excel 2000.
16
3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os tratamentos em que houve incidência da doença foram os
inoculados com arroz beneficiado. Os experimentos com a deposição de discos
de micélio e escleródios foram repetidos, mantendo-se os resultados de
insucesso destes propágulos como fonte de inóculo para as condições
experimentais. A incidência da doença em função da concentração de inóculo
no solo foi ajustada ao modelo monomolecular (HARTMAN et al., 1999),
segundo a equação: y= 96,2748*(1-exp(-0,2877*x)), com R
2
= 0,96 (Figura
3.5.1). Verifica-se que a partir da concentração de inóculo de 8 g.L
-1
há uma
tendência de estabilização da curva, atingindo o valor máximo de incidência da
doença.
Incidência da murcha-de-esclerócio (%)
y= 96,2748*(1-exp(-0,2877*x))
ncentração de grãos de arroz colonizados (g.L
-
1
de soloCo )
Figura 3.5.1 - Incidência da murcha-de-esclerócio em função da concentração de grãos de
arroz colonizados.
A comparação das dissimilaridades estatísticas das retas realizada por
teste t (NUTTER Jr., 1997; MADDEN et al., 2007), demonstrou diferenças entre
os valores de intercepto. Este parâmetro indica a estimativa da incidência inicial
da doença. Na Tabela 3.5.1 observa-se que as concentrações de inóculo de 8
g e 16 g de arroz colonizado.L
-1
de solo, proporcionaram intensidade de
17
doença inicial superior à 2 g.L
-1
. Logo, esta concentração demanda maior
período para que uma epidemia se inicie. Para o coeficiente angular da reta,
que corresponde à taxa de progresso da doença (MADDEN et al., 2007),
observa-se que há diferença estatística entre os valores das concentrações de
8 e 2 g de inóculo.L
-1
de solo (Tabela 3.5.1). Portanto, a concentração de
inóculo de 8 g.L
-1
apresenta incidência maior em um mesmo período de tempo,
quando comparado à 2 g.L
-1
e, por conseguinte, uma maior taxa de progresso
da doença.
Tabela 3.5.1 - Comparação das dissimilaridades estatísticas das retas
realizada por teste t para os valores de intercepto e do coeficiente angular da
reta.
Intercepto Coeficiente angular da reta
Concentrações de inóculo
2 g.L
-1
4 g.L
-1
8 g.L
-1
2 g.L
-1
4 g.L
-1
8 g.L
-1
2 g.L
-1
- - - - - -
4 g.L
-1
-1,70 - - 1,73 - -
8 g.L
-1
2,60* 0,93 - 2,98* -1,21 -
16 g.L
-1
3,33* 0,93 -0,17 2,03 0,017 1,33
* Valores de t calculado acompanhados de asterisco diferem estatisticamente a p≤0,05.
Os dados da incidência da doença em função da concentração de
inóculo, aos 14 dias após a infestação do solo, demonstra que existe uma
tendência em se atingir o máximo da incidência da doença em concentrações
de inóculo a partir de 8 g.L
-1
de solo, corroborando com os dados observados
nas análises de regressão linear.
Os resultados para o uso de arroz colonizado como substrato para
inoculação de S. rolfsii podem ser comparados com os obtidos por Falcão et al.
(2005), que verificaram que 5 g de arroz colonizado.kg
-1
de solo foi um dos
substratos mais eficientes para avaliar a intensidade da murcha-de-esclerócio
em soja, acarretando em 100% de mortalidade. Entretanto, isso não foi
verificado quando utilizadas 4 g de arroz colonizado.kg
-1
de solo, para avaliar a
incidência em tomateiro. Essa concentração ocasionou 60% de mortalidade
após 14 dias de inoculação.
18
Matsumoto et al. (2000) e Blum et al. (2003) verificaram que dois
escleródios, junto e sobre sementes de feijoeiro, proporcionaram incidência da
doença, variando entre de 51 a 72% e de 12 a 94%, respectivamente. Dantas
et al. (2002) constataram que 10 escleródios sobre o colo de feijoeiro
levemente ferido foram suficientes para causar a doença. Pratt e Rowe (2002)
constataram que a deposição de discos de micélio diretamente no colo da
planta causou entre 60% e 61% de mortalidade em plantas de alfafa, três a
quatro semanas após a inoculação. Porém, em tomateiro, quando usadas às
concentrações de dois a oito escleródios ou discos de micélio. kg
-1
de solo, não
houve ocorrência da doença após duas semanas de inoculação, demonstrando
uma discordância com os resultados obtidos por Matsumoto et al. (2000),
Dantas et al. (2002), Pratt e Rowe (2002) e Blum et al. (2003).
Resultados obtidos para a influência de discos de micélio na
incidência murcha-de-esclerócio do tomateiro mostraram-se semelhantes aos
observados em soja, por Falcão et al. (2005). Em ambos os experimentos, não
houve mortalidade de plantas após 14 dias de inoculação, indicando que as
concentrações e o tipo de inóculo não são os mais adequados para avaliar a
incidência da doença nas duas culturas estudadas. Além disso, Falcão et al.
(2005) indicaram o uso de arroz como substrato para o cultivo de S. rolfsii e
veiculação de inóculo para infestação de solo, demonstrando uma
concordância com os resultados obtidos neste trabalho, no qual o arroz
beneficiado foi o único substrato de cultivo que proporcionou a produção de
inóculo e a incidência da doença no tomateiro, sem causar ferimentos nas
plantas.
19
3.6 CONCLUSÕES
A inoculação de plantas de tomateiro, sem ferimentos com discos de
micélio e escleródios, não constitui um método de inoculação que promova
incidência da murcha-de-esclerócio em tomateiro.
A infestação do solo com grãos de arroz colonizados com S. rolfsii é
um método indicado para experimentos que visem a inoculação do patógeno,
sem causar ferimentos em plantas de tomateiro, a partir da concentração de 8
g de arroz colonizado.L
-1
de solo.
20
4 ARTIGO B: SELEÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS VISANDO O CONTROLE
BIOLÓGICO DA MURCHA-DE-ESCLERÓCIO (Sclerotium rolfsii) EM
TOMATEIRO
4.1 RESUMO
Os objetivos deste trabalho foram selecionar, dentre 274 isolados de
rizobactérias, agentes de biocontrole da murcha-de-esclerócio, sem efeito
deletério no crescimento de plantas de tomateiro, e verificar a relação da
supressão da difusão de ácido oxálico e do mecanismo de antibiose com a
capacidade de controle. Seis ciclos de seleção massal in vivo foram realizados,
e os melhores isolados foram reavaliados em três experimentos com maior
número de repetições, sendo selecionadas as rizobactérias que promoveram
menor severidade da doença, maior altura e matéria seca de plantas. O isolado
38291 destacou-se entre os demais, pela maior redução na severidade da
doença, em todas as etapas de seleção, e por restringir o desenvolvimento do
patógeno por antibiose.
Palavras-chave: Solanum lycopersicum, antibiose, ácido oxálico, seleção
massal.
SELECTION OF RHIZOBACTERIA TO THE BIOLOGICAL CONTROL OF
SOUTHERN BLIGHT (Sclerotium rolfsii) IN TOMATO
4.2 ABSTRACT
The objective of this work was select trough 274 rhizobacteria isolates,
biocontrol agents of southern blight with no deleterial effect in plant growth, and
to verify the relationship of oxalic acid diffusion and antibiosis with the capacity
of control. Six steps of bulk selection in vivo were performed, and the selected
isolates were evaluated three times with more replies, resulting in the selection
of rhizobacteria that promoted reduction of disease severity and highest growth
of plants. The isolate 38291 outstand the others, in largest reduction of disease
severity, in all selection steps, and restrict the pathogen growth through
antibiosis mechanism.
Keywords: Solanum lycopersicum, antibiosis, oxalic acid, mass selection.
21
4.3 INTRODUÇÃO
Há muito se sabe que certas bactérias, quando aplicadas às sementes,
solo, ou material de propagação, podem suprimir doenças de solo e promover
o crescimento das plantas cultivadas (THOMASHOW, 1996), e ainda reduzir
ou substituir o uso de produtos químicos sintéticos, na produção de alimentos
(FREITAS e AGUILAR-VILDOSO, 2004). Esses agentes de controle biológico
que, em geral, são autóctones da rizosfera, são denominados de rizobactérias
promotoras de crescimento das plantas (THOMASHOW, 1996).
As rizobactérias promotoras de crescimento das plantas utilizam
diferentes mecanismos para supressão de fitopatógenos. Entre esses
mecanismos, está incluída a competição por nutrientes e espaço, antibiose
através de metabólitos antimicrobianos e produção de sideróforos
(RAMAMOORTHY et al., 2001). De todos esses mecanismos, a antibiose
talvez seja o mais amplamente conhecido (PAPAVIZAS e LUMSDEN, 1980) e
o mais utilizado pelas rizobactérias no controle de fitopatógenos (GLICK e
BASHAN, 1997). É através dessa forma específica de antagonismo que muitas
rizobactérias são capazes de reduzir ou prevenir a germinação de propágulos
fúngicos; ou inibir o crescimento após a germinação (PAPAVIZAS e
LUMSDEN, 1980). Ainda, segundo Fravel (1988) em baixas concentrações, os
antibióticos produzidos por rizobactérias, também são deletérios a outras
atividades metabólicas de outros organismos.
O uso da antibiose como critério de seleção de antagonistas é
considerado por alguns autores um dos principais problemas na seleção de
agentes de controle biológico (FRAVEL, 1988; WELLER, 1988; BAKER, 1968),
já que muitos dos candidatos a agentes de controle, obtidos por meio de testes
de antibiose, podem não apresentar bom desempenho em ensaios de casa de
vegetação e campo (MARIANO, 1993). Além disso, a seleção baseada
somente no mecanismo de antibiose, pode não detectar outros mecanismos
cruciais para o sucesso do controle in vivo, como a competição por nutrientes
ou nichos ecológicos, habilidade de colonizar e sobreviver na rizosfera do
hospedeiro (BETTIOL, 1991). Apesar das restrições, os estudos realizados in
vitro apresentam-se como um passo importante para conhecer o
22
comportamento e prováveis mecanismos de ação dos biocontroladores, frente
aos patógenos desafiantes (STEINER e SHONBECK, 1995). Em função disso,
são ainda bastante utilizados por vários autores, como um dos critérios para
detecção de potenciais agentes de controle biológico das diversas doenças de
plantas (ALIYE et al., 2008; SILVA et al., 2008; RAN et al.,2005; SUSILO,
2004; AYSAN et al., 2003; HALFELD-VIEIRA, 2002; WILLIAMS e ASHER,
1996).
Uma outra alternativa que pode ser viável é detectar microrganismos
que possam interferir em fases importantes durante o processo de infecção do
patógeno. Para S. rolfsii, a interferência na difusão do ácido oxálico é um
processo que, em tese, pode influenciar no controle deste patógeno, já que
este metabólito se combina com o cálcio, presente no tecido do hospedeiro, e
propicia a ação de enzimas pectolíticas, responsáveis pela degradação dos
tecidos (DEACON, 1997).
Devido à dificuldade no controle da murcha-de-esclerócio do tomateiro,
principalmente devido à sua grande gama de hospedeiros, formação de
estruturas de resistência que permanecem no solo (PUNJA, 1985) e pouca
eficiência do uso de fungicidas, o controle biológico pode ser uma alternativa
viável por meio da busca por agentes eficazes ao controle dessa doença.
Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram selecionar, dentre 274 isolados
de rizobactérias, agentes de biocontrole da murcha-de-esclerócio, sem efeito
deletério no crescimento de plantas de tomateiro, e verificar a relação da
supressão da difusão de ácido oxálico e do mecanismo de antibiose com a
capacidade de controle.
23
4.4 MATERIAL E MÉTODOS
4.4.1 Coletas de plantas de tomateiro
As plantas de tomateiro foram coletadas em plantios caseiros e
comerciais de diferentes municípios do estado de Roraima, recolhendo-se em
média cinco plantas por área cultivada, em pelo menos seis períodos de coleta.
Após a coleta, as plantas foram encaminhadas ao Laboratório de Fitopatologia
da Embrapa Roraima, onde foi realizada a eliminação da parte aérea da planta
e a retirada do excesso de solo das raízes através de agitação manual. Em
seguida, foi realizado o corte e a pesagem de um grama de raiz de cada uma
das plantas coletadas, para o isolamento das rizobactérias.
4.4.2 Isolamento das rizobactérias
As amostras de raízes, provenientes das plantas de tomateiro, foram
colocadas em Erlenmeyer de 250 ml de capacidade, contendo 50 ml de
solução salina (0,85% de NaCl) estéril e submetidas a agitação em incubadora
por 15 min para obtenção da população bacteriana.
Após a agitação, 500 µl das suspensões bacterianas foram pipetados
em tubos de ensaio, contendo 4,5 ml de solução salina, até a diluição em série
10
-6
, sendo depositados 100 µl das amostras obtidas em cada uma das três
últimas diluições em uma placa de Petri, contendo meio de cultura 523 (KADO
e HESKETT, 1970), espalhando-se com alça de Drigalski sobre a superfície do
meio.
As placas foram mantidas em incubadora a ±25 ºC, em fotoperíodo de
12 horas, para obtenção de culturas puras cujo fator de diluição permita o
crescimento de colônias isoladas. Após o crescimento, foram selecionadas
colônias morfologicamente distintas, sendo transferidas para tubos de ensaio
contendo meio de cultura 523. Com o isolamento das rizobactérias, foram
24
realizados os testes de antagonismo in vitro e controle da doença em
condições de casa de vegetação.
4.4.3 Testes de antibiose e supressão da difusão do ácido oxálico
Os 274 isolados de rizobactérias obtidos foram testados em meio de
cultura 523 + azul de bromotimol a 0,005% (adaptado de STEADMAN et al.,
1994), semeando-se quatro das bactérias isoladas nas extremidades da placa
de Petri e um disco de micélio de S. rolfsii de 0,5 cm no centro. Em seguida, foi
observada a capacidade das rizobactérias em reduzir o crescimento micelial e
em alcalinizar o meio de cultura, restringindo a difusão do ácido oxálico,
evidenciado por uma coloração amarela. Este teste foi repetido somente com
as rizobactérias que mostraram efeito inibitório no crescimento micelial de S.
rolfsii ou que foram capazes de alcalinizar o meio. Posteriormente, todas as
rizobactérias testadas in vitro foram avaliadas em casa de vegetação.
4.4.4 Seleção massal
Para a realização do experimento, sementes de tomateiro cv. Santa
Clara foram semeadas em bandejas de isopor com 128 células, contendo
substrato Plantmax
®
. Quando as mudas apresentaram duas folhas compostas,
foram transplantadas para copos plásticos descartáveis de 0,5 L, contendo solo
artificialmente infestado com 4 g de arroz colonizado com o patógeno.
Imediatamente após a infestação do solo, foi realizada a deposição de
50 ml da suspensão bacteriana, ajustada em absorbância a 540 nm (A
540
),
igual a 0,3 de uma das rizobactérias a serem testadas sobre a superfície do
substrato em cada grupo de três plantas. Para a testemunha, ao invés da
incorporação de uma suspensão bacteriana foram adicionados 50 ml de água.
Foi testado um total de 274 isolados de rizobactérias obtidas de
diferentes áreas de cultivo de tomateiro, em pelo menos seis ciclos de seleção,
25
utilizando-se, em média, de quarenta a sessenta isolados por ciclo.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado,
com três repetições para cada tratamento, onde cada repetição foi
representada por uma planta de tomateiro cv. Santa Clara, com duas folhas
compostas, transplantadas para vasos independentes.
As avaliações foram realizadas até 14 dias após a infestação do solo,
em que somente os tratamentos em que não foi observada incidência da
doença nas três repetições, mantendo-se uma maior altura das plantas, tiveram
suas respectivas rizobactérias selecionadas.
A análise dos dados da altura da plantas foi realizada através do
programa Sistema de Análise Estatística e Genética (S.A.E.G-5.0), efetuando-
se a análise de variância e a comparação das médias, utilizando-se o teste de
Tukey e Scott-Knott no nível de 5% de probabilidade.
4.4.5 Confirmação da efetividade das rizobactérias selecionadas
Para confirmar a efetividade das rizobactérias selecionadas na seleção
massal, foi adotado o delineamento inteiramente casualizado com dez
repetições para cada tratamento, em que cada repetição foi representada por
três plantas de tomateiro cv. Santa Clara, com duas folhas compostas em
expansão.
As mudas foram transplantadas para vasos plásticos de 1,0 L contendo
solo infestado com 8 g de arroz colonizado com S. rolfsii. Após a infestação do
solo, foi realizada a deposição de 100 ml da suspensão bacteriana, ajustada
em absorbância a 540 nm (A
540
), igual a 0,3 de uma das rizobactérias a serem
testadas sobre o substrato. Na testemunha, foi realizada a deposição de 100
mL de água destilada sobre solo infestado com o patógeno.
Para avaliar a severidade da doença, foi utilizada uma escala de notas
com cinco graus, adaptada de Fery e Dukes Sr. (2002) e Blum et al. (2003),
onde 1= plantas sem sintomas; 2= plantas com escurecimento do coleto; 3=
plantas com estrangulamento do coleto, porém ainda viva; 4= plantas com
estrangulamento e crescimento fúngico no coleto, porém ainda viva; 5= planta
26
morta. Os valores de severidade da doença, segundo a escala descritiva, foram
transformados para valores quantitativos, utilizando-se o índice de McKinney
(1923). Foram estimados a área abaixo da curva do progresso de doença
(AACPD), a taxa de progresso da doença, a severidade inicial da doença,
altura e matéria seca de plantas. Todas as variáveis foram analisadas
estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade por meio
do comando proc GLM utilizando-se o programa SAS, versão 9. O experimento
foi repetido três vezes.
27
4.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nos testes de antagonismo in vitro, apenas 54 de 274 rizobactérias
testadas apresentaram redução do crescimento micelial de S. rolfsii, sugerindo
que a inibição do crescimento fúngico ocorreu, provavelmente, pela produção
de compostos antimicrobianos (Figura 4.5.1). Destes 54 isolados, doze também
promoveram a supressão da difusão do ácido oxálico, através da alcalinização
do meio de cultura (Figura 4.5.2). Contudo, nenhum desses doze isolados
conseguiu apresentar redução da severidade da doença em casa de
vegetação.
Figura 4.5.1 - Redução do crescimento
micelial de S. rolfsii por
rizobactérias.
Figura 4.5.2 - Supressão da difusão
do ácido oxálico por
rizobactérias.
Na seleção massal, apenas 35 das 274 rizobactérias testadas, foram
pré-selecionadas. Quando comparados quanto à promoção de crescimento do
tomateiro, apenas 13 (217, 218, 539, 829, 18108, 18109, 28181, 29199, 31223,
32238, 33282, 38291 e 41296) dos 35 isolados selecionados in vivo, quanto à
redução da incidência da murcha-de-esclerócio, também apresentaram as
maiores médias de altura de plantas, sendo os mesmos reservados para os
testes de confirmação de efetividade.
Os resultados dos testes de confirmação da efetividade das
28
rizobactérias selecionadas, quanto à severidade da doença, estão presentes na
Tabela 4.5.1. Os valores médios apresentados foram obtidos eliminando-se os
dois valores extremos de cada variável. As variáveis: severidade inicial da
doença, severidade final e AACPD apresentaram, nos três experimentos de
confirmação, os menores coeficientes de variação (entre 25 e 40%). Por outro
lado, a taxa de progresso da doença apresentou coeficiente de variação acima
de 54%, indicando não ser um parâmetro adequado para avaliar o
desempenho de diferentes isolados de rizobactérias quanto à redução da
severidade da murcha-de-esclerócio.
A partir das variáveis utilizadas para avaliar a severidade da doença, foi
possível observar que dos treze isolados, obtidos na fase de seleção massal,
somente cinco apresentaram capacidade de controle da doença e sua
eficiência em mais de uma etapa de confirmação (Tabela 4.5.1).
Quando se comparam os valores obtidos nas etapas de confirmação,
verifica-se que apenas o isolado 38291 foi capaz de manter em todos os
ensaios uma tendência em reduzir os níveis de severidade da doença. Dentre
os isolados avaliados, 38291 foi o único que também restringiu o crescimento
do patógeno em meio de cultura, através do mecanismo de antibiose. No
entanto, o mesmo não suprimiu a difusão do ácido oxálico. Outros dois
isolados, 31223 e 41296, apresentaram desempenho semelhante ao obtido
pelo isolado 38291, no controle do patógeno desafiante. Ambos foram capazes
de reduzir a severidade a níveis similares aos observados para o isolado
38291; entretanto, somente em duas etapas de confirmação. Porém, não
conseguiram reduzir com o mesmo desempenho a severidade inicial da
doença. Os demais isolados, 32238 e 33282 também demonstraram
capacidade em controlar a doença, já que em duas etapas de confirmação
reduziram tanto a severidade quanto o período para surgimento dos sintomas
da doença.
Apesar dos isolados selecionados evidenciarem capacidade de
controlar a murcha-de-esclerócio, deve-se considerar que as condições
experimentais não permitiram que estes expressassem seu total potencial no
controle da doença, pois as plantas foram colonizadas imediatamente no
momento do transplantio em substrato contaminado. Os resultados obtidos
podem ser otimizados utilizando-se a microbiolização de sementes, em que há
29
um maior período para que as rizobactérias colonizem as plantas, atuando com
maior eficiência.
31
Segundo Weller (1988) nem sempre existe correlação entre a
capacidade de uma bactéria inibir um patógeno in vitro e controlar a doença.
Isolados que produzem zonas de inibição em meio de cultura, nem sempre são
os melhores agentes no controle biológico. De acordo com Barker (1968), esta
inexistência de correlação se deve à inativação dos antibióticos produzidos no
solo por uma série de processos, como adsorção em argila e húmus,
degradação microbiológicas e instabilidade devido ao pH. Esta inativação
também pode explicar a ineficiência da supressão da difusão do ácido oxálico
em solo, pelas rizobactérias, já que esta capacidade foi detectada nos ensaios
in vitro.
Essas afirmações se baseiam no fato de que vários autores relatam a
ausência de correlação entre a antibiose e a seleção de agentes de controle
biológico in vivo, afirmando que a seleção baseada apenas em testes in vitro
não é adequada. Silva et al. (2008) visando determinar os possíveis
mecanismos de ação de agentes biocontroladores de Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli, verificaram que de seis bactérias testadas, apenas
um isolado se destacou, inibindo o crescimento de todos os isolados do
patógeno in vitro. Contudo, a maior capacidade de biocontrole não foi conferida
pelo mesmo isolado. Halfeld-Vieira (2002) avaliando o efeito de compostos
produzidos em meio de cultura por bactérias do filoplano do tomateiro sobre
Alternaria solani, Pseudomonas syringae pv. tomato e Xanthomonas
vesicatoria, verificou que somente dois de dez antagonistas selecionados in
vivo foram capazes de inibir o desenvolvimento desses patógenos in vitro.
Também, Aysan et al. (2003) estudando o uso de antagonistas para o controle
de Erwinia chrysanthemi, agente causal da podridão mole do tomateiro,
verificaram que dois isolados eficientes contra a bactéria em ensaios in vitro
não reduziram o desenvolvimento dos sintomas em fatias de batata e em
plantas de tomateiro testadas em casa de vegetação. Em outro exemplo,
Williams e Asher (1996) observaram que todos os isolados de rizobactérias
testados contra Pythium ultimum e Aphanomyces cochlioides não
apresentaram correlação entre o grau de inibição no meio de cultura e a
supressão da doença em mudas de beterraba. Do mesmo modo, Ran et al.
(2005) não encontraram correlações entre a atividade antagônica de
Pseudomonas spp. in vitro e biocontrole de murcha bacteriana em Eucalyptus
32
in vivo.
Contudo, os resultados indicam que a antibiose promovida pelo isolado
38291 deve ser um mecanismo importante no controle da murcha-de-
esclerócio, já que este foi, dentre os selecionados, o único capaz de restringir o
desenvolvimento do patógeno in vitro e de reduzir com maior repetibilidade a
severidade da doença.
Outros autores também observaram esta mesma tendência para
diferentes patossistemas. Susilo (2004) avaliando o potencial de rizobactérias
como promotoras de crescimento do tomateiro e agentes de controle biológico
da murcha bacteriana (Ralstonia solanacearum), verificou que cinco
rizobactérias demonstraram atividade antagônica contra o patógeno através da
produção de antibióticos e sideróforos. Também reduziram significativamente a
severidade e a incidência da doença quando comparados à testemunha,
demonstrando que rizobactérias com antagonismo detectado in vitro podem ser
consideradas como agentes potenciais para supressão de patógenos.
Um fato a ser considerado é que S. rolfsii nem sempre está fisicamente
em contato com o tecido hospedeiro na fase de pré-penetração. Logo,
possivelmente, os compostos microbianos produzidos por essa rizobactéria in
vitro podem ter suprimido o crescimento do patógeno no solo, impedindo ou
retardando o processo de infecção.
Em relação à promoção do crescimento de plantas, embora existam
diversos exemplos de bactérias capazes de promover simultaneamente o
controle de doenças e crescimento (ALIYE et al. 2008; SUSILO, 2004), as
variáveis utilizadas para avaliar o desempenho dos treze isolados sobre o
tomateiro, não permitiram observar influência dessas rizobactérias, tanto em
incrementos de altura quanto no aumento quantitativo nos teores de matéria
seca das plantas. Verificou-se, também, que nenhum dos isolados
selecionados diferiram da testemunha em relação à altura e matéria seca das
plantas, nas etapas de confirmação (Tabela 4.5.2).
Portanto, verifica-se que nenhuma das rizobactérias apresentou
capacidade de atuar como promotor de crescimento do tomateiro. Porém, por
outro lado, também não apresentaram efeito deletério às plantas. Da mesma
forma, Silva et al. (2008a) observaram em um dos ensaios realizados que a
altura das plantas não diferiu entre os isolados testados e a testemunha.
34
De acordo com El Hassni et al. (2007) a utilização de agentes
biológicos para ativar os mecanismos de defesa da planta contra os agentes
patogênicos constitui uma alternativa ecológica aos pesticidas repetidamente
utilizados para controle de doenças de plantas, além de ser uma estratégia
significativa contra os patógenos de solo, para os quais medidas de controle
são muito restritas ou quase indisponíveis.
Os resultados obtidos para o isolado 38291 podem ser considerados
promissores, já que essa rizobactéria demonstrou tanto em laboratório quanto
em casa de vegetação ter potencial para ser utilizada como agente de
biocontrole da murcha-de-esclerócio do tomateiro, quando comparada aos
isolados 31223, 32238, 33282 e 41296. Contudo, ainda há a necessidade de
estudo do efeito desses isolados sobre a murcha-de-esclerócio em condições
de campo.
35
4.6 CONCLUSÕES
Nenhuma rizobactéria que suprimiu a difusão de ácido oxálico nos
testes in vitro foi capaz de controlar a murcha-de-esclerócio em casa de
vegetação.
O isolado 38291 foi o único que apresentou efeito de antibiose
detectável in vitro e estabilidade no controle da murcha-de-esclerócio em casa
de vegetação, sugerindo que a antibiose seja um importante mecanismo no
biocontrole da doença em tomateiro.
Os isolados 31223, 32238, 33282 e 4129 promoveram apenas controle
in vivo da murcha-de-esclerócio.
Nenhum dos cinco isolados com potencial a agentes de biocontrole
contra a murcha-de-esclerócio apresentaram a capacidade de promover
crescimento nem efeito deletério em plantas de tomateiro.
36
5 CONCLUSÕES GERAIS
As mais altas taxas de incidência da murcha-de-esclerócio em plantas
de tomateiro, sem indução de ferimento, e os menores períodos para início da
epidemia, foram observados quando inoculadas com 8 g.L
-1
de grãos de arroz
colonizados com S. rolfsii.
Discos de micélio e escleródios não demonstraram eficiência na
indução da murcha-de-esclerócio, quando inoculados em plantas de tomateiro
sem ferimentos.
Não houve relação entre a supressão da difusão de ácido oxálico e a
capacidade de controle da murcha-de-esclerócio, pois nenhuma rizobactéria
que apresentou esse mecanismo em meio de cultura controlou a doença em
casa de vegetação.
O isolado 38291 foi o único que apresentou efeito de antibiose
detectável in vitro e estabilidade no controle da murcha-de-esclerócio em casa
de vegetação, sugerindo que a antibiose seja um importante mecanismo no
biocontrole da doença em tomateiro.
Os isolados 31223, 32238, 33282 e 4129 promoveram apenas controle
in vivo da murcha-de-esclerócio.
Nenhum dos cinco isolados com potencial a agentes de biocontrole
contra a murcha-de-esclerócio apresentaram a capacidade de promover
crescimento nem efeito deletério em plantas de tomateiro.
37
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