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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
“Efeitos do CO
2
sobre a senescência e ativação dos ovários
de Apis mellifera”
Liliane Maria Fróes de Macedo
Dissertação apresentada à
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
da USP, como parte das exigências para a obtenção do
título de Mestre em Ciências, Área: Biologia Comparada
RIBEIRÃO PRETO - SP
2009
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
“Efeitos do CO
2
sobre a senescência e ativação dos ovários
de Apis mellifera”
Liliane Maria Fróes de Macedo
Orientadora: Profa. Dra. Zilá Luz Paulino Simões
Dissertação apresentada à
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
da USP, como parte das exigências para a obtenção do
título de Mestre em Ciências, Área: Biologia Comparada
RIBEIRÃO PRETO - SP
2009
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Macedo, Liliane Maria Fróes
“Efeitos do CO
2
sobre a senescência e ativação dos ovários de Apis mellifera”
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências,
Área: Biologia Comparada
1. Apis mellifera 2. Ativação dos ovários 3. Glândula Hipofaríngea 4. Expressão
Diferencial
Aos meus pais,
Elen Antônio de Macedo Júnior e Leda Maria Fróes de Macedo,
que me ensinaram a importância do estudo,
por darem amor, estímulo, apoio e compreensão,
pelo esforço e trabalho que me possibilitaram o estudo,
pela educação, lições de vida e moral
Às minhas avós,
Maria Nazareth Labella Macedo e Maria Edyr Silveira Fróes
pelo imenso carinho, amor e ensinamentos preciosos
Ao meu irmão,
Marcelo Alexandre Fróes de Macedo,
pelo amor, amizade e diversão
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Meu agradecimento especial Profa. Dra. Zilá Luz Paulino Simões, a quem muito
admiro pela competência profissional e genialidade, obrigada pela orientação e pela
oportunidade de crescimento pessoal e profissional.
À Dra. Karina R. Guidugli-Lazzrini, ao Dr. Francis de M. F. Nunes e a Dra. Aline
Mackert dos Santos, pela participação no desenvolvimento deste trabalho, agradeço também
pela companhia e amizade durante esses anos.
Aos Profs. Dr. Klaus Hartfelder, Dra. Márcia M. Gentile Bitondi, Dra. Ana Maria
Bonetti, pelas sugestões, incentivo e críticas durante a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Ademilson Espencer E. Soares, pelos estímulos recebidos e amizade ao
longo desses dois anos.
À Marcela A. F. Bezerra Laure, pela ajuda essencial nas dissecações e amizade.
À Vera L. C. Figueiredo, pelas conversas alegres, conselhos e ajuda em tudo que
tivesse ao seu alcance.
Aos técnicos do apiário experimental do Departamento de Genética, especialmente
Luiz Aguiar e Adelino Penatti pela grande contribuição neste trabalho e pelos ensinamentos
da biologia das abelhas.
Ao Carlos, Adriana, Anete, Barchuck, Tathyana, Rodrigo, Aline Aleixo, Fernanda
e Juliana, por terem me fornecido alguns dos primers que utilizei para a realização deste
trabalho, pelas idéias animadoras, discussões e amizade, agradeço também o Carlos e
Juliana pela ajuda na realização dos experimentos e Ana Durvalina e Tathyana pela ajuda,
conselhos e amizade.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Biologia do desenvolvimento de Abelhas,
Apilab e Bloco A do Departamento de Genética da FMRP, pelas discussões frutíferas, por
proporcionarem um ambiente harmonioso, com uma convivência agradável durante o período
do mestrado.
À Renata Andrade Cavallari, secretária da pós-graduação, por sua paciência, ajuda e
competência
Aos meus familiares pelo carinho e apoio em especial aos meus tios Elizabeth M. de
Macedo Viegas, Eliana G. de Macedo Lemos e Manuel Victor Lemos pelo grande estímulo,
entusiasmo e paixão contagiantes pela Ciência.
Ao meu namorado André de Oliveira Spano pelo amor, paciência e por me confortar
em momentos difíceis.
Aos meus amigos pelo carinho, amizade, respeito e por não hesitaram em apoiar-me.
Agradeço, enfim, a todas as pessoas que direta ou indiretamente auxiliaram na
execução da minha tese. Em especial àquelas que estiveram ao meu lado, se preocupando e
torcendo por mim.
À Fundação de Amparo e Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão
da bolsa de mestrado, pelo auxílio financeiro que tornou viável a realização deste trabalho.
... Muito obrigada!
INDICE
RESUMO .................................................................................................................. 01
ABSTRACT ............................................................................................................. 03
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 05
2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 16
2.1 Objetivo geral .......................................................................................... 17
2.2 Objetivos específicos ............................................................................... 17
3 MATERIAL e MÉTODOS .................................................................................. 19
3.1 Material biológico.................................................................................... 20
3.2 Coleta de hemolinfa ................................................................................. 22
3.3 Purificação do RNA total e síntese do cDNA ......................................... 22
3.4 Identificação dos genes selecionados ...................................................... 23
3.5 Quantificação dos transcritos: RT-PCR quantitativa em tempo real ....... 25
3.6 Padronização dos primers e das amostras para experimentos de PCR em
tempo real ............................................................................................... 26
3.7 Metodologia para análises de proteínas .................................................. 29
3.7.1 Eletroforese em poliacrilamida (SDS-PAGE) ............................... 29
3.7.2 Western Blot .................................................................................. 29
3.7.3 Imunoeletroforese .......................................................................... 31
3.8 Radioimunoensaio (RIA) para hormônio juvenil .................................... 32
4 RESULTADOS ..................................................................................................... 34
4.1 Análise dos ovários e glândulas hipofaríngeas das operárias mantidas em
condições experimentais ......................................................................... 35
4.2 Análise do perfil das proteínas da hemolinfa .......................................... 37
4.3 Análise do expressão dos genes selecionados em operárias experimentais
e controles ............................................................................................... 42
4.4 Análise do expressão dos genes selecionados em rainhas experimentais
e controles ............................................................................................... 45
4.5 Radioimunoensaio (RIA) para hormônio juvenil .................................... 47
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 48
5.1 Análise morfológica dos ovários e glândulas hipofaríngeas e títulos de
proteínas na hemolinfa de operárias e rainhas Apis mellifera ................ 49
5.2 Níveis de mRNA de genes possivelmente envolvidos na ativação de
ovários em operárias e rainhas de Apis mellifera ................................... 55
5.3 Expressão dos genes candidatos, em glândulas hipofaríngeas,
relacionados a aspectos comportamentais em operárias Apis mellifera . 62
6 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 67
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 69
1
Resumo
MACEDO, L.M.F. Efeitos do CO
2
sobre a senescência e ativação dos ovários de Apis
mellifera. 2009. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009
As diferenças estabelecidas entre as rainhas e operárias de Apis mellifera durante as fases
imaturas do desenvolvimento têm conseqüências na vida adulta, e vão além dos caracteres
morfológicos, atingindo importantes aspectos da fisiologia, principalmente aqueles ligados
à reprodução e senescência. Por exemplo, rainhas e operárias sintetizam vitelogenina (Vg),
a principal proteína do ovo, no entanto, a modulação da expressão do gene codificador
dessa proteína, e ainda, a função exercida por ela diferem nas duas castas. Inúmeros
agentes podem estimular ou reprimir a síntese da Vg. O tratamento com CO
2
desencadeia
efeitos sobre a reprodução, desenvolvimento, alimentação e aspectos comportamentais dos
insetos. Em rainhas A. mellifera o tratamento com CO
2
eleva os títulos de Vg na hemolinfa
e acelera o desenvolvimento ovariano. Nas operárias o efeito é antagônico. Dentro deste
cenário, nos propusemos verificar os possíveis efeitos do tratamento com CO
2
em ambas as
castas, analisando genes expressos no ovário, corpo gorduroso (responsável pela síntese de
grande parte das proteínas da hemolinfa) e nas glândulas hipofaríngeas (que produz geléia
real cujo tamanho e atividade caracterizam os estágios de nutridora e forrageira). Em
operárias adultas, o tratamento inibiu o desenvolvimento ovariano, atrofiou a glândula
hipofaríngea, aumentou os títulos de hormônio juvenil e causou uma diminuição na
abundância dos transcritos (sintetizados pelo corpo gorduroso) e nos títulos protéicos
(presentes na hemolinfa) de Vg e hexamerina 70a. Houve também redução da expressão de
mRNA de transferrina no corpo gorduroso dessas amostras. Sugerimos que estes genes
possam fazer parte da rede que regula a ativação dos ovários em operárias. Nos ovários,
observamos aumento de expressão, nos genes que codificam a lipoforina, “fushi tarazu
factor 1” e peroxidase. Possivelmente estes genes estão envolvidos na rede que regula a
esterilidade funcional das operárias. Na glândula hipofaríngea, o CO
2
provocou atrofia e
um aumento significativo na expressão dos genes α-glicosidase, e superóxido dismutase,
conhecidos marcadores de senescência em abelhas. Estes resultados indicam fortemente
uma mudança no perfil comportamental das operárias, de nutridoras para forrageiras. A
2
alta expressão da superóxido dismutase, no grupo tratado com o CO
2,
corrobora seu papel
como enzima antioxidante e indicador de estresse e envelhecimento. Nas rainhas o
tratamento com o CO
2
não modificou o padrão protéico e também não houve diferenças na
expressão dos genes analisados, o que pode ser interpretado como uma menor plasticidade
nas rainhas. Juntos, os resultados sugerem nítidas diferenças entre as castas, em resposta ao
tratamento com CO
2
.
3
Abstract
MACEDO, L.M.F. Effects of CO
2
on senescence and ovary activation in Apis mellifera.
2009. Thesis (Master) – Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009
Differences between Apis mellifera queens and workers during the immature
developmental stages have consequences in adult, ranging from morphology to important
aspects of physiology, especially those related to reproduction and senescence. For
example, queens and workers synthesize Vitellogenin (Vg), a conserved yolk precursor
protein, however, there are differences in this protein encoding gene expression
modulation and its function between these two castes. Numerous agents can stimulate or
repress Vg synthesis. Treatment with CO
2
triggers effects on reproduction, development,
feeding and behavioral aspects of insects. When A. mellifera queens are submitted to CO
2
treatment, the Vg hemolymph levels increase and accelerate ovarian development. The
effect of CO
2
treatment is antagonistic in workers. In this context, we proposed to
investigate the effects of CO
2
treatment in both castes, with emphasis on gene expression in
ovary, fat body (responsible for synthesis of most of the hemolymph proteins) and the
hypopharyngeal glands (royal jelly producing glands whose size and activity characterize
the shift from nursing to foraging behavior). In adult workers, CO
2
treatment inhibited
ovarian development, atrophied the hypopharyngeal glands, increased the titers of juvenile
hormone and caused a decrease in the transcripts abundance (synthesized by fat body) and
Vg and hexamerin 70a levels (present in the hemolymph). There was also reduction of
transferrin mRNA levels in fat body samples. We suggest that these genes might be part of
the network regulating ovaries activation in workers. In ovaries, we observed increased
expression of lipophorin, fushi tarazu factor 1 and peroxidase encoding genes. These
genes could be part of the network that maintains the workers functional sterility. In
hypopharyngeal gland, CO
2
caused atrophy and a significant increase in the expression of
α-glucosidase and superoxide dismutase encoding genes, recognized markers of
senescence in bees. These results strongly indicate a change in the behavioral profile of the
workers from nurse to forager. The high expression of superoxide dismutase in the group
treated with the CO
2
supports its role as antioxidative enzyme and indicator of stress and
4
aging. The CO
2
treatment in queens neither modified the hemolymph content nor caused
differences in the expression of the genes analyzed, which can be interpreted as a lower
plasticity in queen. Together these data suggest distinct differences between castes in
response to treatment with CO
2
.
1. INTRODUÇÃO
Introdução
6
1. Introdução
Os Hymenoptera eussociais, que incluem abelhas, vespas e formigas, têm como
características determinantes a sobreposição de gerações, divisão do trabalho reprodutivo e
cuidado cooperativo com a cria.
A diferenciação morfo-fisiológica das castas garante alta eficiência na divisão do
trabalho e organização da colônia. Na subfamília Apinae (sensu Michener 2000) apenas
duas tribos, Apini e Meliponini, apresentam essas características e apenas a elas pode ser
atribuída à classificação de altamente eussociais.
As abelhas A. mellifera (Apidae, Apinae, Apini) formam colônias com uma única
rainha, 10-30 mil operárias e algumas centenas de zangões. A divisão de trabalho para a
manutenção e proliferação da colônia compete às fêmeas. Os machos ou zangões possuem
a função de acasalar com a rainha. A abelha rainha é ativa reprodutivamente, sendo a única
fêmea com capacidade de acasalar e botar ovos fecundados. Além da função reprodutiva, é
capaz de manter a organização social da colônia por meio de feromônios, sintetizados por
glândulas especiais. As operárias, os organismos multitarefa da colônia, arcam com todos
os deveres não reprodutivos relacionados com a manutenção e desenvolvimento da
colônia, pelo cuidado e alimentação da prole, construção de favos, limpeza e guarda da
colméia, coleta e processamento do alimento. A divisão do trabalho entre as operárias está
relacionada com a idade, com as necessidades da colônia, condições hormonais e
fisiológicas, fenômeno conhecido como polietismo etário. Assim, operárias jovens
primeiramente cuidam e alimentam as larvas e a rainha, também exercem atividades de
limpeza do ninho, operárias com idades intermediárias guardam a colméia e estocam
alimento e as operárias mais velhas coletam pólen, néctar e água (Michener, 1974;
Introdução
7
Winston, 1992). Um dos fatores que leva a transição entre as tarefas nidais e extranidais é a
mudança das condições fisiológicas, refletidas no aumento dos títulos de hormônio juvenil
(HJ) (Huang et al., 1991).
Em A. mellifera, a determinação do sexo é genética, e como em todos
himenópteros, é haplodiplóide, ou seja, os machos desenvolvem-se por partenogênese, a
partir de ovócitos não fertilizados (indivíduos haplóides) e as fêmeas a partir de ovócitos
fecundados (diplóides) (Winston, 1987). Rainhas e operárias de A. mellifera possuem
mesmo potencial genético, no entanto, uma alimentação diferencial durante a fase larval
promove a diferenciação das duas castas (Figura 1). A rainha, além de ser maior,
apresentar uma taxa metabólica mais alta e uma longevidade aproximadamente vinte vezes
maior do que uma operária possui mais de 150 ovaríolos em cada ovários (Figura 2C),
permitindo-lhe botar 1000 ou mais ovos por dia. As operárias, que possuem apenas de 2 a
12 ovaríolos em cada ovário (revisado por Page e Peng, 2001), são facultativamente
estéreis, ou seja, na presença da rainha mantêm seus ovários inativos (Figura 2A),
enquanto que na ausência da influência da rainha são capazes de ativar seus ovários e botar
ovos não fecundados (Figura 2B) (Snodgrass, 1956, Winston, 1987). As operárias possuem
caracteres morfológicos e aspectos fisiológicos que as distinguem, têm cérebro e
capacidade cognitiva maiores, apresentam em seu corpo pêlos plumosos e nas pernas
posteriores, a corbícula (estrutura especializada para a coleta de pólen). Além disto, as
operárias apresentam glândulas de cera no seu abdômen e grandes glândulas hipofaríngeas
na cabeça. Diferenças marcantes entre as castas de A. mellifera estão resumidas abaixo na
Tabela 1; Michener, 1974.
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Introdução
9
Tabela 1: Diferenças entre rainhas e operárias de A. mellifera (modificado de Michener,
1974)
Característica Rainhas Operárias
Área relativa da superfície das antenas 1 2
Nº de placas quimio-receptoras por antena 1600 2400
Lobo antenal do cérebro Pequeno Grande
Mushroom bodies
Pequenos Grandes
Glândulas hipofaríngeas Vestigiais Grandes
Glândulas mandibulares Muito grandes Grandes
Glândulas de cera Ausentes Presentes
Glândula de Nasanov Ausente Presente
Ovários Muito grandes Pequenos
Nº de ovaríolos 150-180 2-12
Espermateca * Grande Vestigial
Eixo do Ferrão Curvo Reto
Longevidade** 1-2 anos 35-40 dias
Mandíbula Robusta Pequena
Proboscis Curta Comprida
Órgãos para coleta do pólen Ausentes Presentes
Tamanho corporal Grande Pequeno
Consumo de alimento protéico Grande Pequeno
*ver Silva et al. (2002, 2003)
**em clima tropical
O par de glândulas hipofaríngeas (Figura 3) é responsável pela secreção da geléia
real que é distribuída para as larvas de operárias, rainha e zangões (Halberstadt, 1980;
Knecht e Kaatz, 1990, Hanes e Simuth, 1992). O desenvolvimento e a atividade fisiológica
das glândulas hipofaríngeas variam ao longo da vida adulta das operárias. A glândula é
totalmente funcional, nos primeiros dias da vida adulta, quando a operária está auxiliando a
colméia como nutriz, alimentando as larvas e a rainha (Snodgrass, 1956). Segundo Soudek
(1927), as células glandulares estão vazias ou atrofiadas em abelhas que estão coletando
pólen e néctar (fase forrageira), a última tarefa de seu ciclo de vida.
Introdução
10
Figura 3- Morfologia da glândula hipofaríngea de A. mellifera. Esquema da
cabeça com destaque para a glândula hipofaríngea (A e B).
Fonte:http://www.dipualba.es/municipios/molinicosorg/agricultura/La%20abeja%20V.htm
O elevado grau de plasticidade no desenvolvimento de A. mellifera permite que
larvas de fêmeas com um tempo inferior a três dias e meio de vida (L
3
) sejam bipotentes,
podendo se desenvolver tanto em rainhas quanto em operárias (Shuel e Dixon, 1959;
Shuel, 1960; Jay, 1964). Seu destino no processo de diferenciação de castas depende da
quantidade e qualidade do alimento larval, que é fornecido pelas nutrizes, às larvas L
4
e L
5
(Haydak, 1943; Jay, 1964). Nesse período crítico, as larvas que continuam recebendo
alimento em maior quantidade e com maior proporção de secreções da glândula
mandibular ou hipofaríngea, a geléia real, ganham peso rapidamente e crescem em maior
escala (Weaver, 1955, 1957; Wang 1965), desenvolvendo-se em rainhas. As larvas que, a
partir do terceiro estágio, são alimentadas com a mistura de secreções glandulares (Liu e
Jay, 1976; Peng e Jay, 1977, 1979), pólen e mel mostram uma taxa de crescimento mais
lenta, menor peso e desenvolvem-se em operárias. A partir do quinto estágio larval (L
5
) a
Introdução
11
rainha continua a se desenvolver mais rapidamente, seu estágio pupal é mais curto,
emergindo cinco dias mais cedo do que as operárias.
O sistema neuroendócrino integra os estímulos nutritivos que uma larva recebe
durante o seu desenvolvimento e os transforma em títulos diferenciados de HJ e
ecdisteróides (Hartfelder e Engels, 1998). Estes hormônios, importantes na transdução de
sinais genéticos e ambientais, afetam a transcrição de genes nos tecidos alvo, originando
efeitos fenotípicos múltiplos (Flatt et al., 2005), sendo o HJ descrito como um dos
hormônios com a mais ampla ação pleiotrópica já descrita. O papel dos hormônios na
regulação dos efeitos nutricionais na diferenciação de castas tem sido estudado
extensivamente (de Wild e Beetsma, 1982; Rembold, 1987; Hartfelder e Engels, 1998). A
partir do final do terceiro estágio, a larva destinada a ser rainha apresenta os corpora allata
(par de glândulas endócrinas, que produzem e secretam HJ) maiores e altos títulos de HJ,
alcançando um pico máximo na fase inicial do quinto estágio larval. O quarto estágio
geralmente marca a divergência das duas castas, um processo que prossegue,
continuamente, sob a regulação do HJ. A diferenciação de órgãos reprodutores, tais como
ovários e espermateca, é estabelecida durante o quinto estágio e continua nas fases iniciais
de pupa (Schmidt Capella e Hartfelder, 2002; da Silva, 2005).
Capella e Hartfelder (1998) observaram que as sínteses de DNA e a apoptose dos
ovários das larvas das abelhas melíferas, durante a diferenciação de castas, são dependente
dos níveis de HJ na hemolinfa. Na fase adulta, este mesmo hormônio atua como regulador
da reprodução e divisão de trabalho (Hartfelder e Engels, 1998; Bloch et al., 2002;
Hartfelder e Emlen, 2004).
Estudos recentes demonstraram que em operárias existe uma associação, descrita
como duplamente repressora, entre HJ e a vitelogenina (Vg) - a principal proteína do ovo
Introdução
12
(Amdam e Omholt, 2003; Guidugli et al., 2005), em que a transição de operárias nutridoras
- com atividades intranidais - para forrageiras - atividades extranidais - é acompanhada por
aumento dos títulos de HJ e queda nos níveis de Vg (Figura 4). Por outro lado, os altos
níveis de Vg, nas operárias jovens, nutridoras, impedem a elevação dos títulos de HJ. O
cumprimento do polietismo etário, ou seja, a mudança das tarefas executadas pela operária
ao longo de sua vida adulta depende, não só de sua maturação, mas também das condições
da colônia, tais como, presença ou ausência da rainha, quantidade de alimento e pirâmide
demográfica (Tsuruda et al., 2008; Wang et al., 2009). Acredita-se que o envelhecimento
da abelha deva, também, ser influenciado pelos níveis de HJ (Finch, 1990; Amdam e
Omholt, 2003; Amdam et al., 2004) e tem sido proposto que a evolução e regulação da
longevidade das operárias estejam, conseqüentemente, vinculadas ao aproveitamento da
Vg e sua relação com HJ (Amdam et al., 2004). Apesar da Vg, freqüentemente, ser
associada aos processos reprodutivos (como por exemplo, a maturação dos óvocitos),
experimentos permitiram concluir que a Vg das abelhas melíferas está envolvida em vários
outros processos biológicos além da reprodução, como longevidade, imunidade, transporte
de zinco e síntese de alimento larval (Amdam e Omholt, 2002; Amdam et al., 2003;
Amdam e Omholt, 2003; Amdam et al., 2004; Amdam et al., 2005). A relação entre a
atividade da Vg e o ciclo de vida das abelhas melíferas é sustentada pela capacidade de
ligação dessa proteína com zinco (Amdam et al., 2004), que sugere uma função
antioxidante para a Vg (Goto et al., 1999; Amdam e Omholt, 2002; Quinlan et al., 2005),
sendo a modificação oxidativa de uma proteína intracelular um aspecto importante da
senescência, conforme descreveram Finkel e Holbrook (2000).
Introdução
13
Figura 4- Sistema de retro-alimentação entre os títulos de hormônio juvenil e de
vitelogenina circulantes na hemolinfa de operárias, regulando a divisão de trabalho.
Adaptado de Page e Amdam (2007).
Inúmeros agentes podem estimular ou reprimir a síntese da Vg, por exemplo, a
ingestão de diferentes dietas, ricas ou pobres em proteínas (Bitondi e Simões, 1996),
alterando o equilíbrio necessário para o cumprimento das diversas atividades ligadas a esta
proteína. A regulação do gene codificador da Vg e a síntese da proteína estão sob controles
diferentes em rainhas e operárias. Foi visto que as rainhas, quando expostas ao tratamento
com dióxido de carbono (CO
2
) normalmente usado em procedimentos para inseminação
instrumental, aumentam os títulos de Vg na hemolinfa, aceleram o desenvolvimento
ovariano e iniciam a postura de ovos mais cedo (Engels et al., 1976; Engels e Ramamurty,
1976). No prazo de 24 horas, após duas exposições ao CO
2
, a taxa de síntese de Vg
representava 60% de toda a síntese protéica das rainhas, sendo que no grupo sem o
tratamento, as taxas de síntese de Vg raramente excederam 30%, no mesmo período
Introdução
14
(Engels et al., 1976). Rainhas virgens e rainhas instrumentalmente inseminadas, sem a
exposição ao CO
2
, iniciam a postura de ovos entre 18-67 dias de idade, enquanto que,
rainhas expostas a dois tratamentos com CO
2
e re-introduzidas na colônia iniciam a postura
de ovos a partir de 11-23 dias de idade (Mackensen, 1947). Nas operárias, a exposição ao
CO
2
inibe a ativação dos ovários. Fyg (1950) verificou que 67% das operárias, em colônias
sem rainhas, desenvolveram ovários após quatro semanas, porém, com uma exposição
única ou uma série de três exposições ao CO
2
, apenas 5% das operárias ativaram os
ovários. Resultado semelhante foi obtido por Koywiwattraku et al. (2005) que verificaram
inibição do gene codificador da Vg e da transferrina em operárias tratadas com CO
2
, o que
pode explicar os resultados obtidos por outros pesquisadores.
O tratamento com CO
2
com o objetivo de antecipar e intensificar a atividade de
postura de ovos pelas rainhas tem sido usado por inúmeros pesquisadores, no entanto, não
se conhece o modo de ação desse agente. Esses efeitos na reprodução são, provavelmente,
mediados por alterações no sistema nervoso e endócrino das abelhas melíferas, por
exemplo, há aumento no volume dos corpora allata e dos títulos de HJ na hemolinfa de
operárias expostas ao CO
2
(Bühler et al., 1983), sugerindo que a síntese da Vg pode ter
sido inibida pela presença de altos níveis de HJ, como descrito por Amdam e Omholt
(2003) e Amdam et al. (2003).
Tratamento com CO
2
demonstrou efeitos sobre a reprodução (Engels et al., 1976),
desenvolvimento (Woodring et al., 1978), alimentação (Birkenmeyer e Dame, 1970;
Woodring et al., 1978) e aspectos comportamentais dos insetos (Ralph, 1959; Whisenant e
Brady, 1965; Mardan e Rinderer, 1980; Schneider e Gary, 1984). Inicialmente suspeitou-se
que os efeitos verificados pudessem ser devidos à anóxia provocada pelo tratamento com
CO
2
. No entanto, Fuse e Truman (2002) comprovaram que o CO
2
altera a expressão de
Introdução
15
genes específicos da metamorfose, quando comparado com os efeitos do nitrogênio (N
2
), o
qual não produziu efeito significativo. Isso pode ser uma forte indicação de que o CO
2
age
diretamente sobre o metabolismo das operárias, ativando ou reprimindo genes importantes
para os processos de amadurecimento e reprodução, bem como aqueles ligados ao
comportamento. O preciso mecanismo que associa CO
2
mudanças na fisiologia dos insetos
ainda não foi esclarecido, porém, traçar o perfil genético envolvido nesses processos em
abelhas A. mellifera é extremamente intrigante. A ativação dos ovários em rainhas, a
inativação dos ovários em operárias e outras possíveis mudanças, por meio de tratamentos
com o CO
2,
podem ser utilizados em conjunto com análises de expressão gênica com a
finalidade de projetar genes candidatos envolvidos nestes processos. Somado a isso, o fato
de operárias e rainhas responder de maneira diferente a um mesmo estímulo fornecem uma
oportunidade de comparar padrões genéticos que acompanham as castas na divisão de
trabalho. Para testar nossa hipótese nós expomos rainhas e operárias a dois tratamentos
com o CO
2
, dissecamos a glândula hipofaríngea em operárias, ovários e corpo gorduroso
em ambas as castas e comparamos os aspectos morfológicos de ovários e glândula
hipofaríngea. Posteriormente analisamos a expressão dos genes candidatos e os discutimos
no contexto reprodutivo e comportamental.
2. OBJETIVOS
Objetivos
17
2. Objetivos
2.1 Objetivo geral
O tratamento com CO
2
evidenciou efeitos sobre a reprodução, desenvolvimento,
alimentação e aspectos comportamentais dos insetos e em abelhas tem o especial efeito de
antecipar a atividade de postura em rainhas inseminadas artificialmente (Engels et al.,
1976). Em decorrência deste fato, o presente trabalho teve como objetivo verificar o efeito
do tratamento com CO
2
,
sobre a expressão de genes com provável envolvimento nos
processos de reprodução, maturação e/ou envelhecimento, em abelhas A. mellifera,
africanizadas.
2.2- Objetivos específicos
• Avaliar os efeitos da exposição ao CO
2
sobre a morfologia de glândulas
hipofaríngeas e ovários de abelhas operárias;
• Quantificar os títulos de proteínas na hemolinfa de abelhas operárias e
rainhas, controles e tratadas com CO
2
;
• Quantificar os títulos de hormônio juvenil de operárias, sem o tratamento, e
tratadas com o CO
2
;
• Verificar a expressão dos genes selecionados em ovário, corpo gorduroso e
glândula hipofaríngea de abelhas operárias submetidas ou não ao tratamento
Objetivos
18
com CO
2
, como tentativa de relacionar a expressão destes genes com
aspectos de envelhecimento e esterilidade;
• Verificar a expressão dos genes selecionados nos ovário e corpo gorduroso
de rainhas virgens submetidas ou não ao tratamento com CO
2
.
3. MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
20
3. Material e Métodos
3.1 Material Biológico
Foram utilizadas abelhas operárias e rainhas de A. mellifera (africanizada)
provenientes do Apiário Experimental do Departamento de Genética da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto – (USP), Ribeirão Preto , São Paulo.
Para obtenção de operárias adultas, um quadro com crias prestes a emergir foi
retirado da colônia e acondicionado em estufa a 34ºC e 80% de umidade relativa (UR).
Operárias que emergiram num período de 0-18 horas foram coletadas e transferidas para
caixas de confinamento medindo 8x11x13cm, mantidas em estufa (34ºC e 80% UR).
Diariamente foram trocados água e alimento e ambos foram oferecidos ad libitum, este foi
preparado com pólen coletado de colônias, açúcar e mel – 30%, 70% e 2ml,
respectivamente. Durante 4 dias, as abelhas receberam também geléia real diluída 1:1 em
xarope (50% açúcar em água). Em todos os experimentos realizados, com operárias, foram
montadas de três a cinco caixas de confinamento com abelhas controles e de três a cinco
caixas experimentais. Cada caixa de confinamento continha 55 abelhas. Após 3 dias de
confinamento em estufa, alíquotas de hemolinfa de algumas operárias foram extraídas para
análise do perfil de proteínas. Este grupo (3 dias) foi considerado marco zero nas nossas
análises. No quarto e quinto dia de confinamento, as operárias do grupo tratado foram
expostas ao CO
2
durante 15 minutos, num intervalo de 24 horas. Quarenta operárias de
cada grupo foram dissecadas (em Ringer para insetos), 5 dias após o tratamento. Os
ovários foram examinados, coletados e classificados como: 1 - inativos, se eles não
apresentavam ovaríolos contendo folículos em desenvolvimento, ou 2 - ativados, se eles
Material e Métodos
21
apresentavam folículos em vitelogênese ou ovócitos maduros. A glândula hipofaríngea foi
coletada e classificada como: 1 – funcional, se apresentavam ácinos cheios de secreção ou
2 – atrofiada, se apresentavam ácinos vazios. Também foram coletados corpo gorduroso e
hemolinfa. Os tecidos e órgãos foram colocados em tubo contendo 50 μl de meio de
cultivo para insetos (Rachinsky e Hartfelder, 1998) e, posteriormente, estocados em 500 μl
ou 1 ml de reagente TRIzol® (solução comercial de fenol e isotiocianato de guanidina para
isolamento de RNA total, Invitrogen) e congelados em freezer (- 80ºC) até o momento da
purificação do RNA total. Cada amostra analisada corresponde a um pool de 10
indivíduos. Foram analisadas 4 amostras do grupo controle e 4 do grupo tratado com CO
2
.
As rainhas utilizadas neste trabalho foram obtidas por meio de produção artificial.
Neste procedimento larvas de operárias de primeiro estágio larval são transferidas para
realeiras artificiais aprovisionadas com geléia real e colocadas em suportes especiais
dentro de colônias do tipo recria, para seu desenvolvimento até o estágio desejado. Para
este experimento, foram coletadas abelhas operárias que emergiram num período de 0-18
horas e transferidas para as caixas de confinamento com uma rainha, também, recém-
emergida. As caixas foram mantidas em estufa nas mesmas condições de temperatura, UR
e dieta acima citadas. Cada caixa de confinamento continha uma rainha e
aproximadamente 20 operárias, dois tratamentos foram realizados, o primeiro tratamento
foi realizado 24 horas após a emergência, e o segundo 72 horas após a emergência. A
hemolinfa de 18 rainhas virgens foi extraída para análise do perfil de proteínas, sendo nove
tratadas e nove controles. Também foram dissecados em Ringer para insetos corpo
gorduroso e ovário que foram colocados diretamente em reagente TRIzol® (Invitrogen) e
congelados em freezer (- 80ºC) até o momento da purificação total do RNA. Cada amostra
corresponde a um indivíduo.
Material e Métodos
22
3.2 Coleta de hemolinfa
Durante o procedimento de coleta da hemolinfa tanto operárias quanto rainhas eram
anestesiadas, dentro de sua caixa, em freezer -20°C, posteriormente, eram transferidas para
placas de Petri colocadas em contato ao gelo e então imobilizadas em placas de dissecção.
A hemolinfa foi coletada com auxílio de um microcapilar a partir de uma pequena incisão
lateral entre o 2º e 3º segmento abdominal da cutícula dorsal ou por meio de incisão na
inserção da asa. Durante a coleta, as amostras de hemolinfa permaneceram em gelo, sendo
adicionada ao tubo uma pitada de PTC (phenylthiocarbamide) para inibir a melanização da
hemolinfa. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 7500 rpm por 5 minutos à 8ºC,
para descarte de células contaminantes provenientes do corpo gorduroso ou hemócitos da
própria hemolinfa. Três amostras de operárias foram coletadas no terceiro dia após a
emergência, cada uma das amostras correspondia a um pool de hemolinfa de 4 indivíduos,
estas amostras foram chamadas de marco zero. No décimo dia após a emergência, oito
amostras foram coletadas, quatro do grupo controle e quatro do grupo tratado, sendo cada
uma destas amostras correspondente a um pool de hemolinfa de 10 indivíduos. Já as
amostras de hemolinfa obtidas de rainhas virgens foram analisadas individualmente, sendo
nove controles e nove tratadas, coletadas no sétimo dia após a emergência.
3.3 Purificação do RNA total e síntese do cDNA
O RNA total foi isolado utilizando-se de 1 ml ou 500 µl de reagente TRIzol®, para
cada amostra. O procedimento de extração conduzido foi o recomendado pelo fabricante.
Material e Métodos
23
O RNA obtido foi ressuspenso em água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) 0,1% para
evitar degradação.
A quantificação do RNA foi feita em espectrofotômetro NanoDrop ND‐1000 (Nano
Drop Tecnologies) em comprimento de onda igual a 260ηm
A síntese de cDNA foi feita utilizando-se o sistema de síntese Superscript II
(Invitrogen) e Oligo (dT)
12-18
(Invitrogen), seguindo instruções do fabricante. Por este
método, apenas a primeira fita do cDNA é sintetizada através de transcrição reversa. A
segunda fita é gerada posteriormente por PCR com o uso de primers específicos. Amostras
incubadas na ausência da enzima SuperScript
TM
II RT também foram preparadas como
controle da ausência de DNA contaminante na amostra. Por este método, apenas a primeira
fita do cDNA foi sintetizada através de transcrição reversa. A segunda fita foi gerada por
PCR com o uso de primers específicos.
3.4 Identificação dos genes selecionados
A maioria dos genes selecionados para análise já foi identificada no genoma de A.
mellifera versão 4.0 (disponibilizada no GenBank pelos membros do Honeybee Genome
Sequencing Consortium, 2006). Nesse projeto foram selecionados genes candidatos a
estarem envolvidos no processo reprodutivo, como os codificadores da Vg e seu receptor
(ReVg); Hexamerina 70a; Transferrina; Lipoforina e seu receptor (ReLp); “Buffy”,
Peroxidase; “Fushi tarazu factor 1” e Ultraspiracle”. E genes candidatos a estarem
relacionados ao comportamento como os codificadores da Superoxido dismutase; “Major
Royal Jelly Protein 4”; Amilase proximal; Alfa-glicosidase e “Buffy”. Levando-se em
Material e Métodos
24
conta funções descritas na literatura para a seleção dos genes candidatos. A tabela 2
fornece alguns detalhes dos genes selecionados.
Tabela 2 – Relação dos genes selecionados para análise de expressão gênica
Produto
Gênico*
Funções preditas
Órgão ou tecido
analisado por RT-
PCR
Referência
Alfa-glicosidase
Metabolismo de carboidrato Glândula hipofaríngea Kubo et al., 1996
Buffy
Inibidor de morte celular programada
Glândula hipofaríngea e
Ovário
Quinn et al., 2003
Amilase
proximal
Metabolismo de carboidrato Glândula hipofaríngea
Ohashi et al.,
1999
Fushi tarazu
factor 1
Fator de transcrição Ovário Zhu et al., 2006
Hexamerina
70a*
Proteína de estocagem – participação
no desenvolvimento de ovários
Corpo Gorduroso
Martins et al.,
2008
Lipoforina*
Transporte de lipídios
Ovário e Corpo
Gorduroso
Lazzarini, 2006
Major Royal
Jelly 4
Metabolismo de carboidratos Glândula hipofaríngea
Whitfield et al.,
2002
Peroxiadase
Enzima que catalisa a oxidação de
resíduos de tirosina
Ovário
Silva-Torres,
2009
Transferrina
Proteína ligante de íons ferro com
múltiplas funções
Corpo Gorduroso
Downer e Chino
1985
Superoxido
dismutase
Enzima antioxidativa Glândula hipofaríngea
Weirich et al.,
2002
Ultraspiracle
Receptor nuclear Ovário
Mangelsdorf e
Evans, 1995
Vitelogenina*
Principal proteína do ovo Corpo Gorduroso
Amdam e Omholt,
2003
*Genes selecionados para análise de expressão gênica em corpo gorduroso e ovário de
rainhas virgens, juntamente com o receptor da Vg e da Lp
Material e Métodos
25
3.5 Quantificação dos transcritos: RT-PCR quantitativa em tempo real
Os experimentos para quantificação relativa da expressão dos genes de interesse
por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) foram realizados utilizando-se metodologia
SYBR® Green em um aparelho de PCR em tempo real (7500 Real Time PCR, Applied
Biosystems).
A reação de amplificação foi feita utilizando-se 20μl de volume final, sendo: 10μl de
SYBR® Green PCR Master Mix (2x) (Applied Biosystems); 0,8μl de cada primer (sense e
antisense) específico para cada gene de interesse (Tabela 3) de uma solução estoque de
10ρmol; 7,4 μl de água deionizada esterilizada e uma alíquota de 1μl do cDNA sintetizado
segundo o item 5.3, o qual foi diluído (1:5 /v:v) em água destilada.
A quantificação dos transcritos do gene alvo foi calculada a partir da diferença
dos valores de Ct (threshold PCR cycle) em relação aos transcritos dos genes de controle
endógeno, proteína ribossomal -49 (rp49) e elongation factor 1-alpha (ef1-α), de acordo
dom instruções do User Bulletin #2 (Applied Biosystems). Primeiramente são feitas as
médias dos Ct das duas ou três leituras de cada amostra, tanto do gene alvo quanto do gene
de controle endógeno. De cada amostra, subtrai-se o valor da média de Ct
gene alvo
do Ct
gene de
controle endógeno
, obtendo-se o ∆Ct. Posteriormente escolhe-se um ∆Ct que corresponda a um
calibrador e normalizam-se todos valores subtraindo pelo ∆Ct escolhido. Obtemos então, o
∆∆Ct. Finalmente, o valor final de quantificação relativa é dado pelo 2
-∆∆Ct
,
onde o
calibrador ou amostra padrão escolhida é igual a um.
Material e Métodos
26
3.6 Padronização dos primers e das amostras para experimentos de PCR em tempo
real
Para as análises da eficiência dos primers foi montada uma curva padrão para
cada um dos pares de primers utilizando diluições seriadas de cDNA (sem diluição; 1:10;
1:100; 1:1000 e 1:10000). Os valores de eficiência da PCR (E) foram calculados para cada
gene individualmente a partir do valor obtido de slope após reações de curva padrão e
utilizando a fórmula: E= 10
-1/slope
.
Para a normalização dos experimentos de quantificação dos níveis de mRNA foi
utilizado os níveis de transcritos dos genes rp49 e elongation factor 1-alpha (ef1-α)
(números de acesso no GenBank: AF441189 e GB16844). Ambos os genes foram
considerados adequados para uso em experimentos de quantificação como normalizadores
da reação (Lourenço et al., 2008). Os primers específicos deste gene flanqueiam trechos de
150 e 154 nucleotídeos, respectivamente: RP49 (5’-CGTCATATGTTGCCAACTGGT-3’ -
sense), RP49 (5’-TTGAGCACGTTCAACAATGG-3’ - antisense), EF1-α (5’-
GGAGATGCTGCCATCGTTAT-3’ - sense) e EF1-α (5’-
CAGCAGCGTCCTTGAAAGTT-3’ - antisense).
Para monitorar a amplificação de apenas um único fragmento e a ausência de
contaminação de DNA genômico, foram utilizadas as análises de dissociação do gene
rp49. No caso de contaminação com DNA genômico dois picos de dissociação seriam
visualizados, pois, os primers para rp49 flanqueiam um íntron, e um fragmento de 240 pb e
78ºC de temperatura de Melting (Tm) seria esperado quando amplificado em DNA
genômico, enquanto um fragmento de 150 pb e Tm=76ºC era esperado em amplificações a
partir do cDNA. Sempre que possível os primers para amplificação dos genes de interesse
Material e Métodos
27
foram desenhados flanqueando um íntron. Na tabela 3 estão listados os genes selecionados,
a numeração que os identifica no Genoma de A. mellifera e as características do primers
correspondentes.
Material e Métodos
28
Tabela 3 – Genes selecionados segundo participação no processo de reprodução e de
longevidade de A. mellifera
Gene
Número de
acesso*
Seqüências dos primers Tp**
alfa-
glicosidase
GB12607
Sense → 5’ – TGC TTA TCG AGG CAT ACA CG – 3’
Antisense → 5’ – CGT CAT CCA ATT ATC GAC CA – 3’
60ºC
buffy
GB18455
Sense → 5’ – GGT GCA GTT GTG GGA GAA GT – 3’
Antisense → 5’ – CAG ATC TGT ATC GAG TTG CTA – 3’
60ºC
amilase
proximal
GB 18312
Sense → 5’ – AAA GCG GGT GTA CGG ATC TA – 3’
Antisense → 5’ – TAG GGC ACT TGC GGA TAG TC – 3’
58ºC
fushi tarazu
factor 1- ftz
GB16873
Sense → 5’ –TCT TCT CCA GAT TCG AGT CCA– 3’
Antisense → 5’ – GAA ATG TTT GGC TGG GAA GA – 3’
60ºC
hexamerina
hex 70a
GB15552
Sense → 5’ – AAA GCC AAT CAC GCT CTG AT– 3’
Antisense → 5’ – AAT CGT GAT TCA GAT ACC AGC – 3’
58ºC
lipoforina- lp
XM_392490
(GenBank)
Sense → 5’ – AGC GAA GAG GAT CGC AGA TA – 3’
Antisense → 5’ – AAC CCT TCG TTC CTC CTT TC – 3’
60ºC
major royal
jelly- mrjp-4
GB11768
Sense → 5’ – GAC GAC AGA GGT GAC GCT TT – 3’
Antisense → 5’ – TTC CAT CAT GCA CTG TGA AAC – 3’
58ºC
peroxiadase
GroupUn.1247 +
Group4.3
Sense → 5’ – TCC TGA CGA GGG TTA TCA CG – 3’
Antisense → 5’ – GGA GGA ATG TTG CCA TCG GC – 3’
60ºC
transferrina-
trf
NM_001011572
(GenBank)
Sense → 5’ – GAT GGC AAA GGA GAC GTA GC– 3’
Antisense → 5’ – GTT CCA GTC CCA AGT TGC AT –3’
60ºC
receptor da lp-
relp
AAZ42364
(GenBank)
Sense → 5’ – GGT CGT TCA TGT ATA TCA TC– 3’
Antisense → 5’ – CGG ACA AGC ACA ACT AAG AA –3’
60ºC
receptor da vg-
revg
GB16571
Sense → 5’ – TGA ACC TTA CGA CAT TGC CC– 3’
Antisense → 5’ – TGT GAT TTT CGG TCC AAG CC –3’
60ºC
superoxido
dismutase- sod
GB14346
Sense → 5’ – AGC AGA TGC AAG TGG TGT TG– 3’
Antisense → 5’ – GAG CAC CAG CAT TTC CTG TAG –3’
60ºC
ultraspiracle
usp
AY273778
Sense → 5’ – AGA CTG CCA AGA TGA TGA AG– 3’
Antisense → 5’ – TCT CTC TTC ATT CCC ATC GC– 3’
60ºC
vitelogenina-
vg
NM_001011578
(GenBank)
Sense → 5’ – ACG ACT CGA CCA ACG ACT T – 3’
Antisense → 5’ – ACG AAA GGA ACG GTC AAT TCC –
3’
60ºC
*Números de acesso iniciados pelas letras GB referem-se ao código dos genes preditos
depositados na base de dados Official Gene Set – Elsik et al., 2006
** Tp significa temperatura de pareamento dos primers
Material e Métodos
29
3.7 Metodologia para análises de proteínas
3.7.1 Eletroforese em poliacrilamida (SDS-PAGE)
Para a análise qualitativa do perfil das proteínas da hemolinfa, utilizou-se 0,5 - 1 µl
de hemolinfa dissolvida em tampão da amostra, Tris-HCl 0,25 M, pH 6,8, contendo 70%
de sacarose, 0,25% SDS, 0,1% bromofenol azul e 5% β-mercaptoetanol. A metodologia
usada foi descrita por Laemmli (1970) com algumas modificações. As amostras foram
submetidas à desnaturação térmica (100ºC durante 5 minutos) e após resfriamento,
aplicadas em géis de separação (100 x 120 x 0,9 mm), com concentração de poliacrilamida
de 7,5%. Um pente foi inserido no gel de empacotamento para a formação dos poços, onde
foram aplicadas as amostras. A migração das proteínas foi feita até que as amostras
atingissem o final do gel, sob temperatura de 4ºC, corrente constante de 12mA e utilizando
tampão Tris-glicina – SDS no compartimento dos eletrodos. Após a separação por
eletroforese, o gel foi impregnado com nitrato de prata, de acordo com o método proposto
por Caetano-Anollés et al. (1994). As proteínas Miosina, β-Galactosidase, Fosforilase-B,
Albumina sérica bovina, Ovoalbumina e Anidrase carbônica de 205, 116, 97, 66, 45 e
29kDa, respectivamente, foram utilizadas como marcadores de massa molecular.
3.7.2 Western Blot
Nos experimentos de Western Blot (WB), amostras de hemolinfa foram
quantificadas por meio da metodologia Bradford (1976), posteriormente foram submetidas
à eletroforese como descrito no item anterior. Imediatamente após a separação por
eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (HybondTM-
ECLTM Nitrocellulose membrane – Amersham Bioscience) utilizando como tampão de
Material e Métodos
30
transferência uma solução de 25 mM Tris, 400 mM Glicina e 5% etanol. A transferência
ocorreu por 2 horas à temperatura ambiente, sob voltagem constante de 30 V.
A detecção dos antígenos imobilizados na membrana após a transferência foi
realizada utilizando-se o Kit ECL Western Blotting Detection Reagents and Analysis
System (Amersham Biosciences), de acordo com as especificações do fabricante. Este
método de detecção consiste na emissão de energia não-radioativa (quimioluminescente),
por meio de anticorpo marcado com Horseradish Peroxidase (HPR).
Após a transferência as membranas foram coradas com solução de Ponceau para
marcação das bandas padrão, lavadas em água destilada por 5 minutos e incubadas por 16
horas a 4ºC em uma solução bloqueadora (SB) – 250 ml de tampão “A” (3,027 g Tris,
0,147 g CaCl
2
e 2,337 g NaCl, pH 8.5, em um volume final de 250 ml), 50 g de leite em pó
desnatado e 500 µl de azida sódica 10%, em um volume final de 500 ml. Após este
período, o anticorpo primário apropriado foi diluído (5000 vezes) em concentração
adequada em 20 ml de SB, em seguida, as membranas foram imersas nesta solução e
incubadas sob leve agitação por uma hora à temperatura ambiente. Para os experimentos
foi utilizado o anticorpo primário anti-rabbit HEX70a (Affinity BioReagents) obtido da
seqüência de proteína predita (SYKMHQKPYNKD).
Posteriormente, as membranas foram lavadas da seguinte forma: 2 lavagens
rápidas de 5 minutos cada e 1 lavagem de 15 minutos à temperatura ambiente, sob leve
agitação, em PBS-Tween - 500 µl de Tween em 1 litro de PBS 0,2 M, pH 7.2. Após as
lavagens, as membranas foram incubadas por 1 hora em diluição adequada do anticorpo
secundário (1:12000) em PBS-Tween. O anticorpo secundário utilizado foi anti-rabbit,
Horseradish Peroxidase-linked whole antibody, fornecido pelo fabricante do Kit.
Posteriormente, as membranas foram lavadas novamente em PBS-Tween, como descrito
Material e Métodos
31
acima. Para a detecção do sinal quimioluminescente, as membranas foram dispostas sobre
uma folha plástica e uma mistura dos reagentes de detecção (Kit) foi adicionada sobre as
mesmas. A reação de detecção foi processada por 1 minuto no escuro, e em seguida, as
membranas foram envolvidas em nova folha plástica e colocadas em cassetes para expor
filmes auto-radiográficos (Kodak® XR-Omat/ Hyperfilm
TM
MP, Amersham Biosciences)
por período adequado. A revelação do filme foi feita usando as soluções de revelação e
fixação GBX da Kodak®.
3.7.3 Imunoeletroforese
O soro contendo o anticorpo anti-ovo (Bitondi & Simões, 1996) foi utilizado a 1%
(peso/volume) em gel de agarose de baixa eletroendosmose, preparado com tampão Tris-
HCl 0,06 M, pH 8,6. Este mesmo tampão, 0,3 M, foi utilizado no compartimento dos
eletrodos. A imunoeletroforese foi processada a 4ºC, a uma corrente de 6-8V/cm de gel,
por 16 horas, usando-se a hemolinfa como fonte de antígeno. As amostras de hemolinfa
foram diluídas em tampão Tris-HCl 0,06 M, pH 8,6, antes de serem aplicadas ao gel de
agarose. Volumes idênticos das amostras foram aplicados aos géis. Após a eletroforese, o
gel foi incubado em solução salina para lavagem dos anticorpos e antígenos não
complexados e, em seguida, após a secagem, o gel foi corado com Comassie Brillant Blue
R-250, em etanol, água e ácido acético (5:5:1 v/v) para visualização das proteínas. O
excesso de corante foi retirado lavando-se o gel nesta mesma solução, sem o corante.
Material e Métodos
32
3.8 Radioimunoensaio (RIA) para hormônio juvenil
O método de extração de HJ a partir de hemolinfa foi baseado no protocolo descrito
por Huang et al. (1994), sendo feito em três etapas: (1) extração do HJ, (2) ligação entre
anticorpo e HJ e (3) preparo das amostrar para cintilação. (1) Extração do HJ: As amostras
contendo 1,5 μl de hemolinfa em 500 μl deacetonitrila foram colocadas em tubos de vidro
de 1 ml, misturadas e centrifugadas a 7500 rpm por 3 minutos a 4ºC. Após, centrifugação,
o sobrenadante foi transferido para tubos de extração (tubos de 5 ml), aos quais foram
também adicionados 1 ml de NaCl 0,9% e 1 ml de hexano. Esta mistura foi
cuidadosamente agitada e mantida em gelo por 10 minutos. Em seguida, as amostras foram
centrifugadas (750 rpm) a 4ºC por 5 minutos e tiveram o sobrenadante (fase hexano – fase
contendo o HJ) cuidadosamente transferido, com auxílio de uma pipeta Pasteur, para um
novo tubo de extração. O passo de extração foi repetido por mais duas vezes, perfazendo
um total de 3 ml de hexano no final do procedimento. O volume de hexano foi evaporado
utilizando-se centrifugação a vácuo (SpeedVac), por aproximadamente 15 minutos. O
pellet foi redissolvido em 100 μl de tolueno. (2) Reação entre anticorpo e HJ: Para a
construção da curva padrão, foram separados 0, 5, 1, 2, 5, 10, 50 e 100 μl de solução de
HJ-III (100ng/ml de metanol) em tubos de 1 ml, utilizando-se uma seringa Hamilton (1-50
μl). Os tubos das amostras e os da curva padrão foram centrifugados a vácuo para a
remoção do solvente, por aproximadamente 20 minutos. Em seguida, foram acrescentados
50 μl de solução Tracer (solução de 3H-HJ-III com atividade de 6500 cpm por 50 μl de
tampão fosfato 0,1 M, pH 7.2 e 0,02% azida sódica) em todos os tubos. Após agitação,
acrescentou-se em todos os tubos, exceto no controle zero da curva padrão, 200 μl de soro
anti-HJ-III específico, produzido em coelhos. Ao controle zero da curva padrão
Material e Métodos
33
acrescentou-se 200 μl de soro controle (10% de soro de coelho não-imunizado em tampão
fosfato). Todos os tubos foram agitados vigorosamente e mantidos a 4ºC por 16 horas. (3)
Preparo das amostras para cintilação: Após este período, foram adicionados às amostras
250 μl de solução saturada de sulfato de amônia (para a precipitação das proteínas), que em
seguida foram novamente agitados, deixados a 4ºC por 30 minutos e centrifugados a 7500
rpm por 15 minutos à 4ºC. Os sobrenadantes foram descartados. Aos precipitados foram
adicionados 500 μl de solução de sulfato de amônia 50%. Após agitação e permanência a
4ºC por mais 30 minutos, os tubos foram novamente centrifugados por 15 minutos a 7500
rpm, descartando-se em seguida o sobrenadante. Os precipitados foram ressuspendidos em
40 μl de água bidestilada estéril. Após agitação, estas amostras foram transferidas para
frascos especiais para cintilação líquida; os tubos que continham os precipitados foram
novamente lavados com mais 40 μl de água e este volume foi transferido, em seguida, para
os respectivos frascos. A estes frascos foram acrescentados 5 ml de líquido de cintilação
(90 mg de POPOP, 3,6 g de PPO, 300 ml de Triton X-100 e 600 μl de tolueno), e após
agitação procedeu-se a quantificação do HJ-III em espectrômetro de cintilação líquida
(Multi-Purpose Scintillation Counter/LS 6500 Beckman – USA).
4. RESULTADOS
Resultados
35
4. Resultados
4.1 Análise dos ovários e glândulas hipofaríngeas das operárias mantidas em
condições experimentais
Durante a elaboração deste trabalho, realizamos dois experimentos com operárias
órfãs, tanto para análises morfológicas quanto para extração de material para estudos
protéicos e moleculares. Em ambos os experimentos, em média, 90% das abelhas do grupo
controle sobreviveram até dez dias (referente a data da coleta). Em contra partida, no grupo
tratado, a taxa de sobrevivência mostrou-se menor, em média 60% dos indivíduos,
sobreviveram até o limite de 10 dias. Verificamos em ambos os experimentos que todas as
abelhas operárias analisadas (n= 40), quando recebiam tratamento com o CO
2
, não
ativavam seus ovários (Figura 5B) e atrofiavam suas glândulas hipofaríngeas (Figura 5D).
Já no grupo controle, em um primeiro experimento, 25% por cento das abelhas analisadas
(n= 40) ativaram seus ovários (Figura 5A) e 60% mantiveram suas glândulas hipofaríngeas
funcionais (Figura 5C). Em um experimento posterior, 60% das abelhas analisadas (n= 40)
ativaram seus ovários (Figura 5A) e 70% mantiveram suas glândulas hipofaríngeas
funcionais (Figura 5C) - característica esperada considerando-se a idade das abelhas (10
dias). A tabela 4 resume os resultados obtidos referentes à análise morfológica.
Resultados
36
5mm
5mm
C
D
Figura 5- Ovários (A e B) e glândulas hipofaríngeas (C e D) de abelhas operárias
A. mellifera órfãs com dez dias de vida adulta. (A) ativados, (B) não ativados, (C)
funcional e (D) atrofiada.
Resultados
37
Tabela 4: Percentagem de relativa aos ovários ativos e inativos e glândulas funcionais e
atrofiadas em ambos os grupos de estudo.
Grupo
Ovários Glândula Hipofaríngea
Ativo Inativo Funcional Atrofiada
1º Experimento
Controle 25% 75% 60% 40%
Tratado - 100% - 100%
2º Experimento
Controle 60% 40% 70% 30%
Tratado - 100% - 100%
4.2 Análise do perfil das proteínas da hemolinfa
Após dez dias de confinamento, os títulos de vitelogenina (Vg) presentes na
hemolinfa de abelhas operárias órfãs tratadas ou não com CO
2
foram avaliados por meio
das técnicas SDS-PAGE (Figura 6) e rocket imunoeletroforese (Figura 7). Foram utilizados
três grupos controles e três grupos tratados, para ambas as análises. Podemos observar que
as operárias tratadas com CO
2
apresentaram uma diminuição nos título de Vg em relação
às operárias controles (Figura 6 e 7). Além disso, também podemos notar que os níveis das
proteínas de estocagem (hexamerinas 70a, 70b e 70c) detectados nas operárias controles
foram maiores que os encontrados nas operárias tratadas (Figura 6). Realizamos análises
por Western blot (Figura 8) para quantificar os níveis de hexamerina 70a na hemolinfa de
operárias, com dez dias de vida adulta, controle e tratadas com CO
2
. Cada amostra
corresponde a um pool de 10 indivíduos. Neste experimento, 5 μg de proteína total foram
utilizados para o procedimento de SDS-PAGE, seguido de Western blot utilizando
anticorpo específico para esta proteína.
Resultados
38
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29
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Li
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Figura 6- Análise das proteínas presentes na hemolinfa de operárias órfãs de
abelhas A. mellifera com dez dias de vida adulta, tratadas (T) ou não (C) com CO
2
. Estão
indicadas as bandas referentes à Vg e Hexamerina 70a e 70b e c. M: marcador de peso
molecular; C1: controle um; C2: controle dois; C3: controle três; T1: tratado um; T2:
Tratado dois e T3: tratado três. Observar a sensível redução nos níveis de Vitelogenina e
Hexamerinas nos grupos tratados. Gel de SDS -PAGE, impregnado com nitrato de prata.
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Resultados
40
Figura 8- Análise por Western blot utilizando anti-HEX70a para evidenciar os
efeitos do tratamento de operárias órfãs com CO
2
,
,
sobre a proteína de estocagem,
Hexamerina 70a. As abelhas controles e submetidas ao tratamento com o CO
2
com dez
dias de vida adulta. O Marco zero são abelhas de três dias de idade, sem tratamento. 22d –
abelhas com 22 dias de vida adulta.
Nas rainhas virgens, após sete dias de confinamento os títulos de vitelogenina (Vg)
presentes na hemolinfa de abelhas tratadas ou não com CO
2
foram avaliados, também, por
meio da técnica de SDS-PAGE (Figura 9). Utilizamos nove indivíduos referentes ao grupo
controle e outros nove referentes ao grupo tratado com o CO
2
. As rainhas, diferentemente
das operárias, apresentaram títulos de Vitelogenina semelhantes, nas tratadas com CO
2
e
controle.
Resultados
41
Figura 9- Análise de proteínas presentes na hemolinfa de rainhas virgens de A.
mellifera com sete dias de vida adulta controles (C) e tratadas com CO
2
(T). Gel de SDS -
PAGE, corado por impregnação com prata. Estão indicadas as bandas referentes à Vg e
Hexamerina 70a e 70b e c. M: marcador de peso molecular; C1: controle um; C2: controle
dois; C3: controle três; C4: controle quatro; C5: controle cinco; C6: controle seis; C7:
controle sete; C8: controle oito; C9: controle nove; T1: tratado um; T2: Tratado dois e T3:
tratado três; T4: tratado quatro; T5: tratado cinco; T6: tratado seis; T7: tratado sete; T8:
Tratado oito e T9: tratado nove. Não houve diferença no perfil da Vitelogenina, em ambos
os grupos.
C1 T1 C2 C3 T2 T3 C4 C5 T4 T5 C6 C7 T6 T7 C8 C9 T8 T9 M
Vitelo
g
enina
Li
oforin
KDa
205
116
94,7
66
45
29
Resultados
42
4.3 Análises da expressão dos genes selecionados em operárias experimentais e
controles
O corpo gorduroso é o principal órgão de síntese das proteínas de reserva
Vitelogenina - Vg, Lipoforina - Lp, Transferrina - Trf e Hexamerina 70a – Hex 70a.
Acreditamos que os genes que codificam essas proteínas devam estar relacionados à
esterilidade funcional em operárias de A. mellifera. Logo, propusemos analisar a expressão
desses genes no corpo gorduroso de operárias órfãs, com dez dias de vida adulta, controles
e tratadas com CO
2
. Para tanto, utilizamos a técnica de PCR em tempo real (RT-PCR) e
assim pôde-se observar redução da quantidade de transcritos de vg , trf e hexa 70a em
abelhas que receberam o tratamento com o CO
2
quando comparadas com as que não
receberam o tratamento. A figura 10A ilustra que as abelhas expostas ao CO
2
,
apresentaram quantidades significativamente menores de transcritos de vg , trf e hexa 70a.
No entanto, nenhuma alteração significativa foi observada para a quantidade de transcritos
de lp e de seu receptor (relp) quando controles e tratados foram comparados (Figura 10A).
Considerando a sensibilidade da metodologia utilizada e o resultado observado na Figura
6, podemos afirmar que não houve alterações nos níveis de Lp presentes na hemolinfa de
operárias controles e tratadas com CO
2
.
A expressão do gene codificador do receptor da Vg (ReVg) foi analisada nos
ovários de operárias órfãs de A. mellifera, com dez dias de vida adulta. Já foi demonstrado
que os ovários representam o local de maior expressão deste gene (Guidugli et al., 2008).
Podemos observar na figura 10B uma maior expressão de revg nas operárias controles
quando comparadas com as tratadas com CO
2
, porém o teste estatístico não se mostrou
significativo. Neste mesmo experimento (Figura 10B) outros genes foram analisados e três
Resultados
43
deles apresentaram expressão significativamente maior no grupo tratado com CO
2
quando
comparados com o grupo controle, os genes são: lp, peroxidase e o fator de transcrição do
gene homeótico fushi tarazu – FTZ (ftz-f1). Nenhuma diferença estatisticamente
significante foi observada na quantidade de transcritos do gene codificador do ReLp,
Buffy e “Ultraspiracle” entre os grupos controle e tratado (Figura 10B).
As GH são indicadoras do momento fisiológico das abelhas, como produtoras e não
produtoras de geléia real, conseqüentemente de seu envelhecimento, sendo, portanto, um
importante modelo experimental. Selecionamos, assim, os genes buffy, alfa-glicosidase (α
-glico), amilase próximal (amip), superóxido dismutase (sod) e major royal jelly (mrjp-4)
para avaliar os efeitos do tratamento com o CO
2
(Figura 10C) e testar nossa hipótese de
envelhecimento, induzido pelo tratamento com CO
2
.
Foi significativa a diferença de
expressão gênica, nos grupo tratado e controle, para o gene que codifica a enzima
antioxidante Sod e para gene que codifica a proteína α-glico. O mesmo seria esperado para
o gene amip porém o teste não se mostrou estatisticamente diferente. Apesar da diferença
morfológica das GH, entre os grupos em estudo, não houve diferença significativa na
comparação da abundância dos transcritos para o gene buffy entre os grupos. Embora
nossos resultados evidenciem uma maior expressão do gene mrjp-4 no grupo controle,
também não houve significância no resultado do teste.
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Resultados
45
4.4 Análises da expressão dos genes selecionados em rainhas experimentais e
controles
Devido ao fato de rainhas e operárias responderem de maneira diferente a um
mesmo estímulo propusemos analisar, no corpo gorduroso (Figura 11A) e ovário (Figura
11B) de rainhas virgens, os níveis de mRNA de alguns genes estudados em operárias. Os
genes codificadores de Hex 70a, Lp, ReLp e Vg foram usados para verificar a sua
regulação após o tratamento no corpo gorduroso de rainhas, com sete dias de vida adulta.
Nos ovários dessas mesmas rainhas analisamos os níveis de transcritos dos genes lp, hexa
70a, revg e relp. De maneira geral (Figura 11), no corpo gorduroso e no ovário, o
tratamento não provocou alterações entres os transcritos quando comparamos os grupos
controle e tratado com CO
2
conforme demonstrado pelos testes estatísticos utilizados.
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5. DISCUSSÃO
Discussão
49
5. Discussão
5.1 Análise morfológica dos ovários e glândula hipofaríngea e títulos de proteínas na
hemolinfa de operárias e rainhas Apis mellifera
Durante a vida adulta das operárias a presença da rainha inibe a postura de ovos
pelas mesmas através da liberação de feromônios (de Groot e Voogd, 1954; Michener,
1969; Kubisova e Haslbachova, 1978; Winston et al., 1990). No entanto, a condição de
esterilidade das operárias pode ser revertida em situação de orfandade, ou seja, na ausência
da rainha as operárias podem ativar seus ovários (Ruttner e Hesse, 1981).
No presente trabalho, coletamos operárias recém-emergidas e as mantivemos em
caixas de confinamento sem rainha, com o objetivo de verificar os efeitos do tratamento
com dióxido de carbono (CO
2
) sobre a ativação dos
ovários desta casta, neste caso
originada de acasalamentos múltiplos, o que pode representar a presença, em um mesmo
experimento, de diferentes famílias de operárias. Este fato pode explicar a grande
variabilidade no comportamento de grupos de abelhas provenientes de uma mesma
colônia. Assim, podemos esperar, em uma colméia normal, a ocorrência de operárias com
ovários ativados, fenômeno denominado por Oldroyd et al. (1994), de comportamento
anarquista, bem como operárias, cujo padrão de comportamento foge do esperado
(revisado por Robinson, 1992).
O grupo de operárias expostas ao CO
2
nos permitiu confirmar que dois tratamentos
consecutivos com este gás inibem a ativação dos ovários, como esperado em operárias
órfãs (Biedermann, 1964; Harris e Harbo, 1990; Harris et al., 1996; Koywiwattrakul et al.,
2005). Segundo Koywiwattrakul et al. (2005), é possível verificar este resultado quando o
Discussão
50
tratamento é realizado em operárias jovens (segundo e terceiro dia de vida adulta) ou
levemente mais velhas (quarto e quinto dia de vida adulta) e em uma condição que precede
a ativação dos ovários. Isto porque, foi visto que operárias órfãs com cinco dias de vida
adulta quando expostas ao CO
2
desenvolveram seus ovários de maneira semelhante às que
não receberam o tratamento. Foi, então, levantada a seguinte questão: qual seria o fator
determinante para o tratamento com CO
2
inibir a ativação dos ovários em operárias órfãs?
(1) a idade cronológica das abelhas, ou (2) o grau de desenvolvimento do ovário no
momento da narcose com o CO
2
.
Os autores mostraram-se favoráveis a segunda opção,
visto que, seus resultados sugerem que este gás não inibe o desenvolvimento de ovários
que já iniciaram sua ativação (Harris e Harbo, 1990). Possivelmente este gás impossibilita
o disparo da cascata de eventos que conduz a ativação dos ovários em operárias órfãs. Seus
resultados também revelaram que as abelhas tratadas reduziram a quantidade de pólen na
sua dieta. E concluíram que a carência de proteínas no organismo poderia ser a causa do
retardo no desenvolvimento ovariano. Além disso, Bitondi et al. (1994), observaram que
operárias mais velhas consomem menos pólen e sintetizam menos vitelogenina, desta
maneira estariam menos aptas a ativarem os ovários.
A ativação dos ovários em operárias já foi relacionada a aumentos nos níveis de
dopamina no cérebro (Harris e Woodring, 1995). Assim, Harris et al. (1996), propuseram
testar o efeito do tratamento com CO
2
sobre os níveis de aminas biogênicas: octopamina
(OA), dopamina (DA), serotonina (5HT) presentes no cérebro de operárias e rainhas. Neste
caso, operárias tratadas com CO
2
tinham seus ovários menos desenvolvidos e redução
significativa de DA no cérebro quando comparadas com o grupo sem tratamento.
Posteriormente em um experimento similar, Chen et al. (2008) confirmaram este resultado.
Estes estudos apontam para uma provável relação entre DA e o processo
Discussão
51
reprodutivo em operárias e se isso for verdade, reduções nos níveis de DA causadas pela
exposição ao CO
2
pode parcialmente elucidar a associação que existe entre este gás e a
inativação dos ovários em operárias órfãs.
Coletamos hemolinfa de abelhas operárias do grupo controle e tratado com CO
2
e
observamos que no grupo controle, nas condições experimentais, um aumento nos títulos
de importantes proteínas de estocagem presente na hemolinfa, vitelogenina (Vg) e
hexamerina 70a (Hex 70a). O aumento dos títulos de Vg presentes na hemolinfa de
operárias que apresentam ativação de seus ovários é compatível com um aumento
significativo dos níveis de mRNA de Vg no corpo gorduroso destas abelhas (Guidugli et
al., 2005). Nas operárias poedeiras os altos títulos de Vg são comparáveis aos encontrados
em rainhas (Engels, 1974). Há evidências que Hex 70a, também uma proteína de
estocagem, esteja envolvida na reprodução, uma vez que, operárias com ovários ativados
também apresentam maior expressão de Hex 70a quando comparada à de operárias com
ovários inativos (Martins et al., 2008). O tratamento com CO
2
promoveu uma diminuição
nos títulos dessas proteínas. No primeiro experimento 100% das abelhas do grupo tratado
apresentaram seus ovários inativos, enquanto que 25% das abelhas do grupo controle
apresentavam seus ovários ativados.
Outro importante efeito do tratamento com CO
2,
verificado também em nossos
resultados, foi o aumento significativo nos títulos de hormônio juvenil (HJ) na hemolinfa
de operárias tratadas, este resultado é condizente com os achados de Buhler et al. (1983).
Na fase adulta, altos níveis de HJ estão associados com períodos de atividades relacionadas
ao vôo para forrageamento em operárias (Robinson et al., 1991); em rainhas e zangões o
vôo ocorre mais cedo na vida adulta e está associado com as atividade de cópula (Robinson
et al., 1991; Giray e Robinson, 1996; Tozetto et al., 1997). No caso das operárias o início
Discussão
52
da atividade de vôo inclui atividade de reconhecimento e forrageamento, estes controlados
por um mecanismo denominado polietismo etário (Fluri et al., 1982; Robinson, 1987;
Robinson et al., 1987; Huang et al., 1991). Operárias nutrizes apresentam alta produção de
Vg sob baixos títulos de HJ (Rutz et al., 1976). Juntos, a Vg e o HJ constituem parte de um
sistema regulatório de retro-alimentação (feedback), no qual um suprime o outro segundo a
hipótese do duplo repressor, proposta por Amdam e Omholt (2003). Assim, o título de HJ
não somente modula o desenvolvimento comportamental da operária na fase adulta como
também a expressão da Vg, por outro lado, também há uma influência da Vg sobre os
títulos de HJ para manutenção da operária em seu correto estado fisiológico. No entanto, os
mecanismos responsáveis pela ação inibitória da Vg sobre os títulos de HJ ainda não foram
determinados. Como em A. mellifera o título de HJ juvenil é primariamente dependente de
sua síntese pelos corpora allata (Rachinsky e Hartfelder, 1990; Huang et al., 1991), uma
das sugestões é que o efeito da Vg sobre os títulos de HJ pode ser mediado através de
peptídeos reguladores dos corpora allata, um par de glândulas responsáveis pela síntese de
HJ (Rachinsky e Feldlaufer, 2000). Assim, a Vg poderia eventualmente ligar a seus
receptores (ReVg) presentes no sistema neuroendócrino influenciando de algum modo, a
liberação de tais peptídeo reguladores dos corpora allata (Guidugli et al., 2008).
Altos níveis de hormônio juvenil, além de diminuir a síntese de Vg, também foram
associados à degeneração do corpo gorduroso e glândula hipofaríngea (Fluri et al., 1982;
Fahrbach e Robinson, 1996; Pinto et al., 2000). Isto pode justificar o fato de todas as
abelhas tratadas com o CO
2
, no presente trabalho, apresentarem suas glândulas
hipofaríngeas (GH) atrofiadas. A GH quando bem desenvolvida, ou seja, nas nutrizes,
forma cachos com ácinos pluricelulares se estendendo por mais de 1 cm de comprimento,
se enrolando sobre o cérebro. Os ácinos são ligados a um ducto central, o qual sintetiza e
Discussão
53
secreta uma substância protéica (geléia real) usada na alimentação das larvas (Painter e
Biesele, 1966; Huang et al., 1989). Conforme as operárias envelhecem, as glândulas
hipofaríngeas sofrem alterações funcionais e modificam o seu espectro protéico
sintetizando agora enzimas que participam na maturação do néctar e a sua transformação
em mel. Uma vez que as operárias iniciam a função de forrageamento a GH passa por um
processo de degeneração. O tamanho dos ácinos muda radicalmente com a idade (Deseyn e
Billien, 2005). A atrofia das GH, portanto, pode ser interpretada como um sinal de
envelhecimento precoce destas operárias tratadas com o CO
2
, que não mais produziriam
geléia real, como o que acontece com as forrageiras. Nossos resultados com Hex 70a,
reforçam a idéia que as abelhas operárias do grupo tratado apresentam um perfil mais
velho ou de forrageiras, uma vez que esta proteína se ausente ou em quantidades
indetectáveis neste grupo. O esperado para esta idade (10 dias de vida adulta) é que as
subunidades de Hex 70a, estivessem presentes em altos níveis e somente diminuíssem
quando as abelhas mudassem o comportamento para forrageiras (Martins et al., 2008).
O aumento nos títulos de hormônio juvenil na hemolinfa foi também verificado em
rainhas, quando estas foram expostas ao CO
2
(Herrmann, 1969). O efeito deste gás na
fisiologia das rainhas é diferente das operárias, pois, as rainhas aceleram o
desenvolvimento ovariano na presença de HJ (Engels e Ramamurty, 1976). As rainhas
virgens quando expostas, duas vezes, ao CO
2
iniciam a postura de ovos 5 - 6 dias após a
última exposição (Mackensen, 1947), e apresentam uma condição intermediária entre
rainhas virgens não tratadas, com poucos sinais de degeneração dos ovaríolos e rainhas
fecundadas, com ovário totalmente desenvolvido e um extenso vitelário (Berger et al.,
2005). A unidade funcional dos ovários dos insetos é o ovaríolo, este é dividido em três
regiões distintas: filamento terminal (região apical), germário (porção mediana) e vitelário
Discussão
54
(região basal). As rainhas logo que emergem até o quarto dia de vida adulta não
apresentam seus ovários totalmente desenvolvidos. À medida que a rainha amadurece e
fica apta ao vôo nupcial, o comprimento do germário aumenta e avança em direção à
região apical e o filamento terminal diminui. Os ovaríolos da rainha pronta para acasalar (6
a 8 dias) possuem um vitelário muito pequeno, com 1 ou 2 folículos ovarianos. A partir daí
a diferenciação somente continua quando a rainha é fecundada, se não ocorre o
acasalamento (12 – 16 dias) os ovaríolos se desestruturam (Patrício e Cruz-Landim, 2002).
Apesar do CO
2
não ter o mesmo efeito do acasalamento, ele protege o ovário do processo
de degeneração.
Neste trabalho, as rainhas virgens foram expostas a dois tratamentos com o CO
2
.
Durante a dissecção dos ovários e corpo gorduroso, aparentemente, todas exibiram um
nível similar de desenvolvimento ovariano. A hemolinfa destas abelhas foi coletada para
análise do perfil das proteínas e nesta, não verificamos diferenças nos títulos de
vitelogenina entre os grupos tratados e não tratados. O mesmo resultado foi obtido por
Engels et al., (1976), com rainhas mantidas, após o segundo tratamento, nas caixas de
confinamento. As rainhas que após o segundo tratamento aumentaram os níveis de
vitelogenina na hemolinfa haviam sido reintroduzidas nas colônias de origem (Engels et
al., 1976). No entanto, Berger et al. (2005), manteve as rainhas em caixas de confinamento
e obteve diferenças morfológicas entre rainhas controles e tratadas, em seu estudo sobre o
efeito do tratamento com CO
2
no desenvolvimento ovariano de rainhas A. mellifera.
Possivelmente, a condição social interfere na síntese de vitelogenina (Engels et al., 1976),
bem como o tempo de exposição ao CO
2
e o dia da coleta, parâmetros que variaram nos
experimentos descritos acima.
Discussão
55
Harris et al. (2006), observou que tratamentos com CO
2
não causaram diferenças
significantes nos níveis de DA no cérebro de rainhas controles e tratadas com CO
2
. Este
resultado indica que o sistema nervoso de rainhas e operárias respondem ao tratamento
com o CO
2
de maneira diferente. O cérebro de rainhas possui 3-5 vezes níveis mais altos
de DA do que o de operárias, o que pode explicar a diferença em relação ao tratamento.
Independente das alterações iniciais que o tratamento com o CO
2
causa no sistema
nervoso, como resultado observamos diferenças no que tange à ativação dos ovários e a
morfologia da glândula hipofaríngea em operárias órfãs. Assim, por meio de estudos de
expressão gênica diferencial em grupos de abelhas que possuem ovários ativados e
inativos, bem como glândulas hipofaríngeas, funcionais e atrofiadas, podemos inferir a
respeito de componentes que participam da rede que regulam estes eventos. Os genes
candidatos à validação que foram selecionados, apesar de não representarem moléculas que
iniciam o processo de ativação dos ovários e tampouco o processo de atrofia da glândula,
possivelmente estão envolvidos na cascata que regula estes eventos. A identificação de
genes envolvidos nestas redes nos permitirá reconhecer o sistema molecular de regulação
da reprodução e da mudança de comportamento ou envelhecimento.
5.2 Níveis de mRNA de genes possivelmente envolvidos na ativação de ovários em
operárias e rainhas de Apis mellifera
Nossos resultados referentes aos transcritos da vg e transferrina (trf), no corpo
gorduroso de operárias A. mellifera, estão em acordo com os descritos na literatura por
Koywiwattrakul et al. (2005). Estes autores observaram uma significante redução nos
níveis de vg e trf sobre o efeito da narcose, quando analisaram abdômen de abelhas A.
Discussão
56
mellifera, tratadas com o CO
2
no quarto e quinto dia de vida, durante dez e três minutos
respectivamente. Após 48 horas do tratamento, o RNA total foi extraído dos abdomens e as
amostras foram analisadas individualmente por PCR em tempo real. Foi observado que o
tratamento não apenas alterou a expressão dos genes que codificam a Vg e a Trf, como
também inibiu a ativação dos ovários.
Posteriormente, Koywiwattrakul e Sittipraneed (2009) verificaram níveis mais
baixos de transcrição da vg e trf em operárias que apresentavam seus ovários inativos.
Todo o experimento descrito por estes autores foi realizado em condições naturais, ou seja,
as operárias foram marcadas logo após a emergência, transferidas para colméias com e sem
rainha e com quinze dias de vida adulta foram coletadas. Os autores sugerem que estes dois
genes, dentre outros, possam fazer parte da rede que regula a esterilidade funcional em
operárias A. mellifera. E que, a Trf, tal como a Vg, está intimamente associada à ativação
ovariana nas abelhas operárias, porém, a relação entre a Trf e a ativação dos ovários ainda
é pouco compreendida devido às múltiplas funções que esta proteína desempenha. Sabe-se
que a Trf é uma proteína transportadora de ferro cuja principal função nos ovários é o
fornecimento essencial de íons de ferro necessários para o desenvolvimento dos ovócitos e
embriões (Hirai et al., 2000). Também participa do processo que controla a longevidade
(Weinberg, 1984), tem atividade antimicrobiana e antiparasitária (Kucharski e Maleszka,
2003; do Nascimento et al., 2004), mais especificamente, já foi relatado um importante
papel no seqüestro de íons ferro de patógenos que invadem ovos e para Yoshiga et al.
(1997), é um antibiótico nas reações imunes. Maior expressão deste gene é observada em
abelhas A. mellifera, nos primeiros estágios pupais, em cérebros de operárias adultas
forrageiras e em abdômen de rainhas virgens (Kucharski e Maleszka, 2003; do Nascimento
et al., 2004).
Discussão
57
Detectamos também, que os transcritos de hex 70a encontram-se,
significativamente, mais abundantes no corpo gorduroso de operárias do grupo controle
quando comparadas com as tratadas com o CO
2
. Os nossos resultados estão de acordo com
os dados descritos por Martins et al. (2008), que detectou aumento significativo na
expressão deste gene, em operárias órfãs com ovários ativos, em relação às órfãs
portadoras de ovários inativos. As hexamerinas dos insetos são proteínas de reserva
secretadas pelo corpo gorduroso larval e armazenadas na hemolinfa para serem utilizadas
após a transição larva-pupa (Telfer e Kunkel, 1991). Diferente da maioria das hexamerinas
caracterizadas em outros insetos, os transcritos de hex 70a são detectados em abelhas
adultas. Após a emergência, os níveis de mRNA do gene codificador de Hex 70a se elevam
em ambas as castas e sexos. Nas operárias, transcritos são detectados até o 35º dia da vida
adulta (Martins et al., 2008). Por esta razão, acredita-se que o produto do gene hex 70a
pode ter função associada ao desenvolvimento dos ovários e reprodução. As hexamerinas
são importantes em processos estruturais e metabólicos, como por exemplo, podem
integrar a cutícula pupal e adulta e contribuir com aminoácidos para a produção de vitelo
que será armazenado nos ovos, para nutrição do embrião em desenvolvimento. Além disso,
foi demonstrado que dois tipos de hexamerinas (SP1 e SP2) são seletivamente seqüestradas
pelas glândulas acessórias de machos de diversas espécies de Hemiptera e Diptera e,
subseqüentemente, liberadas no fluido seminal, sugerindo a participação de ambas na
fecundação e reprodução (Roberts et al., 1991; Faria et al., 1994). As hexamerinas já
foram também associadas à função de proteínas de ligação ao HJ (Zhou et al., 2006)
podendo dessa maneira, atuar como uma proteína reguladora da reprodução ou, mais
precisamente, da ativação dos ovários.
Discussão
58
Não encontramos diferenças na expressão do gene lp (lipoforina) e seu receptor
(relp), no corpo gorduroso, quando comparamos os grupos controle e tratado.
Aparentemente, também não houve alterações nos níveis de Lp presente na hemolinfa de
operárias, controle e tratada com CO
2
. Nos insetos, a Lp representa a maior lipoproteína
presente na hemolinfa, e é composta por duas apolipoproteínas apoLp – 1 e apoLp - 2. Em
A. mellifera, o mRNA referente ao gene lp foi encontrado nos ovários e em outros tecidos
além do corpo gorduroso, tais como cérebro, glândulas hipofaríngeas e intestino
(Lazzarini, 2006). A principal função da Lp é transportar lipídios entre os diversos tecidos
corporais dos insetos. Downer e Chino (1985) obtiveram resultados consistentes ao testar a
hipótese de que a Lp funciona como uma molécula carregadora e reutilizável no transporte
de várias classes de lipídios entre os sítios de absorção, estocagem e reutilização. Além de
transportar lipídios, a Lp dos insetos está envolvida no transporte de vários ligantes
hidrofóbicos, como por exemplo, o HJ (Trowell, 1992; Engelmann e Mala, 2005),
retinóides (Kutty et al., 1996) e morfógenos ligados a lipídios (Panakova et al., 2005).
Outra função está relacionada à participação em processos reprodutivos nos insetos.
Lazzarini (2006) detectou a proteína Lp em ovários e embriões de abelhas A. mellifera e
sugere que a Lp pode ser incorporada pelos ovócitos em crescimento como uma das
proteínas do ovo. Ela avaliou os níveis do mRNA de lp e relp durante o processo de
ativação dos ovários de operárias órfãs, e em concordância com o nosso estudo, estes
permaneceram constantes, no corpo gorduroso, independente do grau de ativação dos
ovários. O receptor da lp (relp) é transcrito em vários tecidos e células de abelhas A.
mellifera tais como, cérebro, corpo gorduroso, glândula hipofaríngea, intestino e ovários
(Guidugli-Lazzarini et al., 2008).
Discussão
59
Avaliamos a expressão do mRNA de vg, hex 70a, lp e relp, no corpo gorduroso e
hex 70a, lp, relp e revg, nos ovários de rainhas virgens A. mellifera controles e tratadas
com CO
2
. Em nosso estudo não observamos diferenças na expressão destes genes. Ainda
que tenha sido observado por Engels et al. (1976) a aceleração da atividade de postura após
tratamento com CO
2
este fato não se refletiu na expressão dos genes analisados. Rainhas
virgens submetidas ao mesmo tratamento (Berger et al, 2005) respondem acelerando o
processo de maturação e organização dos ovários.
A análise de nossos resultados nos mostra que nos ovários houve um aumento da
expressão do gene que codifica a Lp em operárias tratadas com CO
2
. Este efeito do CO
2
sobre a expressão da Lp é contrário ao observado na expressão de outra proteína de
estocagem, a Vg, que diminui nas operárias tratadas com CO
2
. Talvez, o aumento na
expressão de Lp nas abelhas tratadas com CO
2
possa ocorrer para compensar a diminuição
de Vg, isto porque, estas duas proteínas podem compartilhar funções como transporte de
lipídios e de estocagem. Outra hipótese que explicaria este resultado é que essas duas
proteínas desempenham papéis diferentes no ciclo de vida das abelhas, isto é confirmado
quando se analisa a expressão dos receptores durantes fases (Guidugli-Lazzarini et al.,
2008), a correlação negativa entre os receptores da Vg e Lp, descrita por estes autores, não
foi observada nos ovários de operárias, visto que não houve diferenças significativas entre
os grupos controle e tratado. As condições experimentais, confinamento, podem ter afetado
a expressão destes genes. A expressão do gene revg foi analisada somente nos ovários
porque, já foi demonstrado que os ovários representam o local de maior expressão deste
gene, por Guidugli-Lazzarini et al. (2008), que descreveram níveis de transcritos de revg
significantemente maiores em operárias e rainhas reprodutivas. Se maiores níveis de
mRNA de revg fossem detectados nos ovários ativados de operárias órfãs controles estaria
Discussão
60
em acordo com nosso resultado anterior com relação ao aumento da expressão de vg nestas
mesmas operárias. Assim, poderíamos sugerir que o aumento dos níveis do mRNA de revg
poderia estar relacionado com a necessidade de uma maior incorporação da Vg pelos
ovócitos em crescimento presentes nos ovários ativados.
Buffy é um inibidor de morte celular programada da família BCL2. A família Bcl
possui genes tidos como reguladores-chave de morte celular programada, desempenhando
funções na ativação ou na inibição deste processo (Quinn et al., 2003). A expressão do
gene que codifica a proteína Buffy foi analisada nos ovários de operárias e seria de se
esperar que, embora menores, os ovários desta casta se assemelhariam aos das rainhas, que
continuam seu processo de maturação na fase adulta. Assim, o tratamento com CO
2
protegeria os ovários das operárias preparando-os para ativação, o que não ocorreu,
confirmando portanto, que o tratamento impede a atividade de postura das operárias como
já descrito na literatura (Harris e Harbo, 1990; Haris et al., 1996; Koywiwattrakul et al.,
2005; Thompson et al., 2007).
Diferenças significativas foram encontradas na expressão do gene codificador da
peroxidase. No grupo tratado esta enzima mostra-se mais expressa do que no grupo
controle. A peroxidase catalisa a oxidação de resíduos de tirosina das proteínas em radicais
tirosina que interagem para formar di-tirosina, levando, com isso, a ligação cruzada de
proteínas (Heinecke et al., 1993). Em A. mellifera, o mRNA peroxidase, regulado por 20-
hidroxiecdisona - 20E, foi encontrado na cutícula bem como em cérebro, ovário e corpo
gorduroso de rainha e operária (Silva-Torres et al., 2009). E inúmeros insetos foram
sugeridas funções associadas ao processo de esclerotização e estresse oxidativo . O papel
desta enzima nos ovários não está claro, no entanto, como enzima relacionada ao estresse
Discussão
61
oxidativo, pode ter o mesmo efeito de outras enzimas desta mesma categoria, como a
superóxido dismutase, descrita abaixo.
Os transcritos do gene ftz factor 1 (ftz-f1) foram encontrados significativamente em
maior abundância no grupo tratado quando comparado com o grupo controle. A proteína
traduzida por este gene foi identificada como um ativador da transcrição do gene
homeótico fushi tarazu (ftz) em Drosophila melanogaster (Ueda et al., 1990), sendo
membro da superfamília dos receptores nucleares (Lavorgna et al., 1991). Em Aedes
aegypti, βFTZ-F1 está envolvido na vitelogênese. O silenciamento de ftz-f1 em Aedes
aegypti diminui o recrutamento de FISC na região promotora de vg diminuindo muito os
níveis de transcrição deste gene (Zhu et al., 2006). Dentro deste cenário, maior expressão
de ftz-f1 coincidiria com aumento nos níveis de Vg, porém, nossos resultados não
confirmaram esta relação em abelhas A. mellifera, visto que em operárias tratadas a
expressão de Vg é significativamente menor. Outra explicação é que este fator de
transcrição foi analisado em ovários de operárias, órgão que, em operárias, não sintetiza
Vg, portanto, possivelmente o ftz-f1 deve estar envolvido, nos ovários, na regulação da
expressão de outros genes.
Em operárias adultas altas doses de hormônio juvenil inibem a síntese de Vg (Pinto
et al., 2002). Os baixos níveis de expressão de vg detectados nos grupos tratados com CO
2
,
sugerem que o tratamento está mimetizando a queda de Vg verificada nas operárias que
estão entrando na fase de forrageiras. Esta hipótese é coerente se observamos o significante
aumento dos títulos de HJ na hemolinfa, no grupo tratado e queda dos transcritos e da
proteína Vg. Ultraspiracle é o mais forte candidato a receptor de HJ, o transcrito deste
gene apresentou uma ligeira elevação em sua expressão nos ovários de operárias tratadas
com CO
2
. Fato que também ocorreu em resposta ao silenciamento de vg,que também
Discussão
62
alterou os títulos de HJ (Guidugli et al., 2005). Assim, podemos afirmar que a não ativação
dos ovários nas operárias foi uma resposta em cadeia ao tratamento com CO
2,
envolvendo
o polietismo etário, ou seja, antecipando a atividade de forrageira, caracterizada por baixos
níveis de Vg e altos títulos de HJ.
5.3 Expressão dos genes candidatos, em glândulas hipofaríngeas, relacionados a
aspectos comportamentais em operárias Apis mellifera
No grupo tratado com CO
2,
todas as abelhas apresentaram suas glândulas
hipofaríngeas atrofiadas, enquanto que no grupo controle aproximadamente 70% das
abelhas apresentaram suas glândulas hipofaríngeas ativadas (característica considerada
normal para abelhas com dez dias de idade). A presença de glândulas hipofaríngeas
desativadas é característica de operárias mais velhas, as forrageiras. A transição de tarefas
intranidais para atividades de vôo e forrageamento é um dos exemplos de comportamento
característico das operárias e dependente da idade, maturação e necessidades imediatas da
colônia (revisado por Robinson et al., 2005). A mudança de atividades de nutridoras para
forrageiras é acompanhada do aparecimento de enzimas específicas em resposta às
modificações na dieta consumida pelas operárias durante sua vida adulta, ou seja, elas
passam de uma alimentação rica em proteínas, na fase jovem para uma dieta rica em
açúcares, quando mais velhas. Nestas abelhas, a presença de enzimas, α-amilase e α-
glicosidase, são essenciais para a tarefa da operária forrageira, para conversão de néctar em
mel (Kubo et al.,1996; Ohashi et al. 1999).
Nosso resultado referente ao gene que codifica a proteína α-glicosidase revela uma
expressão significantemente maior no grupo tratado com CO
2
, em comparação com grupo
Discussão
63
controle. Este resultado nos permite sugerir que CO
2
atue nas glândulas hipofaríngeas
acelerando o processo de atrofia e promovendo a expressão de genes codificadores de
enzimas necessárias para a produção de mel. Mais especificamente, a atividade dessa
enzima nas glândulas hipofaríngeas de operárias forrageiras indica um importante papel na
conversão da sacarose do néctar em glicose e frutose presentes no mel (Simpson et al.,
1968; Sasagawa et al., 1989 e Kubo et al., 1996). Ohashi et al. (1996) isolaram e
caracterizaram o gene codificador da α-glicosidase em GH de forrageiras, mas não
puderam excluir a possibilidade de que a expressão é devida a idade e não ao
comportamento. Em contra partida, todas as abelhas operárias no presente estudo tinham
dez dias de vida adulta, portanto, seriam normalmente nutridoras. No entanto, expressaram
o gene codificador da α-glicosidase, como nas forrageiras, sugerindo fortemente uma
ligação com o comportamento e não com a idade. Assim inferimos que este gene possa ser
caracterizado como um marcador de comportamento de forrageira, em abelhas A.
mellifera.
O mesmo era esperado para o gene amilase proximal, porém o teste não se mostrou
estatisticamente diferente, embora alguns trabalhos já tenham apontado a expressão deste
gene em forrageiras (Ohashi et al., 1999 e Santos et al., 2005). É sabido que fatores como,
por exemplo, resposta à dieta de carboidratos (Benkel e Hickey, 1986; Inomata et al.,
1995; Inomata e Yamazaki, 2000), especificidade a tecido (Abraham e Doane, 1978;
Powell et al., 1980; Klarenberg et al. 1986), e padrões de expressão fase-específica
(Yamazaki, 1986; Inomata e Yamazaki, 2000) estão envolvidos na regulação deste gene.
Yamazaki e Matsuo (1984) mostraram que a regulação de amilase proximal está
possivelmente relacionada com o fitness da produtividade e no ciclo de vida do indivíduo.
Discussão
64
O gene buffy é necessário para a sobrevivência celular, pode prevenir a morte
celular, e ainda, a super-expressão desse gene resulta em inibição do desenvolvimento por
morte celular programada (O'Reilly et al., 1996, Quinn et al., 2003). Sabemos que alta
expressão do gene buffy em nutridoras pode estar ligada a inibição de apoptose das
glândulas hipofaríngeas, prevenindo-as de atrofia precoce em operárias nutrizes e atrofia
nas operárias forrageiras. Apesar da diferença morfológica das glândulas hipofaríngeas,
entre os grupos em estudo, a análise dos transcritos para o gene buffy, não foi significativa,
lembramos ainda que este gene também não respondeu, quando se analisamos os ovários,
como citado acima, neste trabalho.
As proteínas constituintes da geléia real, na sua grande maioria, pertencem a
família das “Major Royal Jelly Proteins” - MRJPs (Schmitzová et al., 1998). Atualmente
se conhece 9 loci que codificam as MRJPs (MRJP-1 – MRJP-9) (The Honeybee Genome
Sequencing Consortium, 2006; Drapeau et al., 2006). Quando as operárias mudam suas
atividades de nutrizes para forrageiras a glândula hipofaríngea deixa de sintetizar proteínas
que compõe a geléia real para produzir enzimas que degradam sacarose, ou seja a α-
glicosidase (Ohashi et al., 1997). Foi descrito em nutrizes um fenômeno denominado de
“social exploitation of vitellogenin” - exploração social de vitelogenina (Amdam et al.
2003a). Na qual a glândula hipofaríngea capta vitelogenina (Vg) e a usa como fonte de
aminoácidos para garantir as altas taxas de produção de MRJPs (Amdam et al., 2003a). De
uma maneira geral, espera-se uma maior expressão dos genes que codificam a proteína
MRJP nas glândulas hipofaríngeas de operárias nutridoras (Santos et al., 2005; Klaudiny et
al., 1994a,b; Whitfield et al., 2002; Sano et al., 2004; Drapeau et al., 2006), embora nossos
resultados indiquem uma maior expressão no grupo controle, não houve significância no
teste. Apesar destes dados, esse gene já foi descrito como expresso em glândulas
Discussão
65
hipofaríngeas de operárias forrageiras (Santos et al., 2005; Klaudiny et al., 1994b a,b;
Whitfield et al., 2002; Sano et al., 2004; Drapeau et al., 2006), bem como em cérebro, o
que permitiu aos autores aventarem a hipótese de que genes desta família estariam também
ligados ao comportamento, uma vez que foram encontrados preferencialmente nos corpos
cogumelares (Garcia et al., 2009). Fato que indica que nem todas as MRJPs devam estar
somente relacionadas a funções nutricionais das proteínas da geléia real.
Foi significativa a diferença na expressão do gene da superóxido dismutase, nos
grupos tratados e controles. A alta expressão deste gene, no grupo tratado com o CO
2,
corrobora seu papel como enzima antioxidante (Weirich et al., 2002) e indicador de
estresse e de longevidade (Magwere et al., 2006), mais uma evidência do efeito do
tratamento sobre a fisiologia do grupo tratado. Já foi visto que enzimas anti-oxidantes,
como a superóxido dismutase, aumentam a longevidade dos espermatozóides armazenados
na espermateca das rainhas, através da redução dos níveis de substâncias oxidativas
danosas. Esta enzima é responsável pela redução do risco oxidativo enquanto durar o
estoque de espermatozóides nas abelhas (Weirich et al., 2002), cuja principal função é a
conversão de superóxidos a peróxidos de hidrogênio (H
2
O
2
), que são removidos pela
atividade da enzima catalase. A expressão do gene codificador da superóxido dismutase
nas GH está de acordo com o encontrado para peroxidase, cujo gene tem maiores níveis de
expressão nos ovários das operárias tratadas.
Abelhas nutridoras possuem glândulas hipofaríngeas bem desenvolvidas e
sintetizam proteínas relacionadas à produção da geléia real, além disso, apresentam altos
títulos de vitelogenina na hemolinfa. Em contra partida, as forrageiras possuem glândulas
hipofaríngeas atrofiadas, sintetizam a α-glicosidase e os títulos de vitelogenina na
hemolinfa são baixos. Segundo Nakaoka, 2008, operárias em colônia sem a presença da
Discussão
66
rainha, com ovários ativos, costumam exibir glândulas hipofaríngeas bastante
desenvolvidas, enquanto que operárias que exibem glândulas hipofaríngeas atrofiadas
apresentam ovários inativos. Este resultado e os descritos no presente trabalho encontram-
se em concordância e indicam que o estado fisiológico das operárias com ovários ativos é
similar ao das nutridoras, enquanto que o estado fisiológico das operárias com ovários
inativos é semelhante as forrageiras.
6. CONCLUSÕES
Conclusão
68
6. Conclusão
• O CO
2
é uma importante ferramenta para a manipulação da ativação dos
ovários e para a atrofia da glândula hipofaríngea em operárias, assim, nos proporciona um
poderoso modelo para estudos moleculares de momentos fisiológicos em Apis mellifera,
aqui associado à regulação do processo reprodutivo e envelhecimento.
• Relacionado à inibição do processo de ativação dos ovários, o tratamento
com CO
2
causou uma diminuição nos títulos de Vg e Hex 70a na hemolinfa; diminuição os
transcritos dos genes vg, trf e hex 70a, no corpo gorduroso e aumentou significantemente a
expressão dos genes lp,peroxidase e ftz, nos ovários;
• Em concordância com a atrofia da glândula hipofaríngea, o tratamento com
o CO
2
provocou um aumento da expressão dos genes α-glicosidase e sod nas operárias
tratadas com o CO
2,
genes considerados marcadores de envelhecimento e codificadores de
enzimas que diminuem o estresse oxidativo.
•
O tratamento com CO
2
afeta uma cascata gênica que dá às operárias
nutridoras, o perfil de forrageiras, ou seja: a expressão de vg diminui, os títulos de HJ
sobem, bem como a expressão do principal candidato a receptor de HJ, usp – ainda que não
significante
• Não houve alteração nos títulos de Vg na hemolinfa das rainhas tratadas
com o CO
2
, como também não observamos diferenças na expressão dos genes candidatos,
em ovários e corpo gorduroso. Este resultado corrobora menor plasticidade nas rainhas.
Juntos, os resultados sugerem nítidas diferenças entre as castas, em resposta ao tratamento
com CO
2
.
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