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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS
UNIFAL-MG
Mariana Bastos Bernardes de Oliveira Camilo
Análise da atividade biológica de própolis de Uruçu (Melipona
scutellaris) proveniente do estado da Bahia
Alfenas/MG
2008
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2
Mariana Bastos Bernardes de Oliveira Camilo
Análise da atividade biológica de Própolis de Uruçu (Melipona
scutellaris) proveniente do Estado da Bahia
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para a obtenção do título de mestre
em Ciências Farmacêuticas pela Universidade
Federal de Alfenas. Área de concentração:
Obtenção de insumos farmacêuticos e avaliação
da atividade biológica.
Orientador: Prof. Dr. Masaharu Ikegaki.
Alfenas/MG
2008
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4
UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS – UNIFAL/MG
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
A banca examinadora, abaixo-assinada, aprova a
dissertação "Análise da atividade biológica de
Própolis de Uruçu (Melipona scutellaris)
proveniente do Estado da Bahia", elaborada por
Mariana Bastos Bernardes de Oliveira Camilo,
como requisito parcial para conclusão do Curso
de Mestrado em Ciências Farmacêuticas. Área
de concentração: Obtenção de insumos
farmacêuticos e avaliação da atividade biológica.
Aprovada em:
____________________________________________________________
Prof. Masaharu Ikegaki - Orientador UNIFAL/MG
Prof. _________________________________________________________________
Instituição: Assinatura: __________________________
Prof. _________________________________________________________________
Instituição: Assinatura: __________________________
5
A Deus por me ter me dado a vida e por sempre guiar meus
caminhos.
Aos meus amados pais, Marcial e Lucília, pelo amor
incondicional e pelo exemplo de luta, perseverança e honestidade.
Ao meu esposo Rafaell por compreender minha ausência e por
estar sempre ao meu lado quando preciso de apoio. Pelo grande
amor que tem por mim e por sua paciência.
Aos meus irmãos Pedro, Eugênio e Lila, pela união e amizade em
todos os momentos de nossas vidas.
E em especial aos meus saudosos avós Nilo e Therezinha, grandes
incentivadores de minha caminhada, exemplos de amor e ternura.
Dedico este trabalho.
6
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, a Deus pela vida que me foi concedida e por sempre guiar meus
caminhos.
Aos meus pais, Marcial e Lucília, pelo grande exemplo de força e determinação
na vida, por nunca desistirem e pelo seu amor incondicional.
Ao meu marido Rafaell, pelo amor que nos une e por seu companheirismo, pela
compreensão nos momentos de ausência, pelo apoio e por sua alegria de viver. Meu
agradecimento especial por estar sempre ao meu lado.
Aos meus irmãos, Pedro, Eugênio e Marília, pela felicidade que transmitem e
pela amizade que nos une.
Aos meus avós, Nilo e Therezinha, pela proteção celestial em minha vida.
Aos meus avós Marcionil e Maria pelo exemplo de vida.
A todos os meus tios e tias, em especial Tia Helena, Tia Lúcia e Tio Luiz,
grandes incentivadores na minha vida.
Ao Curso de Pós-graduação e à Unifal- MG pela oportunidade fornecida.
Ao prof. Dr. Masaharu Ikegaki pela orientação, pelos ensinamentos e pela
paciência que teve comigo durante estes dois anos de intenso trabalho.
Às amigas Maurette, Angélica, Marina e Lidiane pela amizade adquirida durante
estes dois anos e pela grande apoio nos experimentos.
Ao Prof. Dr. Severino Matias de Alencar pela parceria nos testes realizados.
A todos da equipe de professores e alunos do Laboratório de Farmacologia do
CPQBA – Unicamp, em especial a Ana Ruiz, pelo grande auxílio nos testes de atividade
citotóxica e pela receptividade.
À CAPES pelo suporte financeiro.
A todos os amigos que por perto estiveram e souberam compreender esta etapa
de minha vida.
7
RESUMO
As abelhas sem ferrão, ou meliponíneos, são assim chamadas por apresentarem
este instrumento de defesa atrofiado. Pertencem à ordem Hymenoptera, à sub-família
Meliponinae e são agrupadas em três tribos distintas: Meliponini, Trigonini e
Lestrimelitini. Estão distribuídas nas zonas tropical e subtropical, nas Américas do Sul e
Central, Malásia, Indonésia, África e Austrália. Possuem tamanho, forma e coloração
variada e um nível de organização social comparável ao das abelhas Apis mellifera. Para
a construção do ninho estas abelhas utilizam cera pura, cerume (mistura de cera e
própolis) ou ainda o batume (mistura de própolis e barro, conhecida como geoprópolis).
As espécies brasileiras são divididas em Meliponas e Trigonas, sendo uma das
representantes mais populares a Uruçu (Melipona scutellaris). O objetivo deste trabalho
foi analisar a própolis de uruçu (Melipona scutellaris) proveniente do estado da Bahia
quanto a suas características físicas e químicas e algumas propriedades biológicas. A
própolis analisada apresentou coloração marrom escura, flexível e odor acre. O teor de
fenólicos totais pelo método de Folin-Ciocalteu foi de 0,105 mg /mg de própolis em
equivalentes de ácido gálico. O extrato bruto da própolis demonstrou significativa
atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus nos testes de antibiograma em
difusão em ágar com diâmetro de halo de 27 mm e na determinação da concentração
inibitória mínima (CIM), de 3,12 a 1,56 ppm. O extrato foi fracionado, fornecendo
quatro frações, numeradas em ordem decrescente de polaridade (0- mais polar e 3-
menos polar). Estas frações também foram avaliadas quanto à atividade antimicrobiana
e antioxidante. A fração 3 demonstrou atividade antioxidante em relação ao radical
DPPH menor que a observada para o extrato, sendo de 67,36% na concentração de 90
ppm. Avaliou-se ainda a atividade citotóxica do extrato bruto sobre nove linhagens de
células tumorais humanas, tendo apresentado toxicidade para todas as linhagens de
maneira dose-dependente.
Palavras-chave: Própolis. Meliponíneos. Atividades biológicas.
8
ABSTRACT
The stingless bees are so called because they presented this defense tool
atrophied. They belong to the order Hymenoptera, sub-family Meliponinae and are
grouped into three distinct tribes: Meliponini, Trigonini and Lestrimelitini. They are
distributed in tropical and subtropical areas in Central and South America, Malaysia,
Indonesia, Africa and Australia. They have size, shape and color variation and a level of
social organization comparable to that of bee Apis mellifera. For the construction of the
nests some of these bess use the geopropolis (mixture of plant resins, wax and soil).
The Brazilian species are divided into Melipona and Trigona and one of the most
popular specie is Uruçu (Melipona scutellaris). The purpose of this study was to nalyse
some physical, chemical and biological properties of Uruçu (Melipona scutellaris)
propolis from the state of Bahia, Brazil.Propolis examined showed dark brown color,
flexible and pungent odor. The content of phenolic compounds by the method of Folin-
Ciocalteu was 0,105 mg/mg of propolis. The crude extract of propolis has significant
antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in the test of antibiogram by agar
diffusion and in the determination of minimum inhibitory concentration (MIC), with a
diameter of 27 mm of inhibition zone and MIC from 3.12 to 1.56 ppm. The most apolar
fraction showed higher antimicrobial activity, with a diameter of 33 mm of inhibition
zone for the fraction 5 and the MIC obtained was from 1.56 to 0.78 ppm. Was also
evaluated the antioxidant activity using the DPPH radical scavenging activity and crude
extract showed dose-dependent response, and 89.05% in the concentration of 90 ppm.
The less apolar fraction showed the higher antioxidant activity against DPPH, it was
67.36% for the concentration of 90 ppm. We also evaluated the cytotoxic activity of the
crude extract on eight cancer cell lines, and it showed toxicity in a dose-dependent
manner.
Keywords: Propolis, Meliponinae and Biological Activities.
9
SUMÁRIO
1
REVISÃO DE LITERATURA................................................................
1
1.1
PRODUTOS NATURAIS.........................................................................
1
1.2
ABELHAS..................................................................................................
3
1.3
ABELHAS NATIVAS (MELIPONÍNEOS)..............................................
4
1.4
PRÓPOLIS E GEOPRÓPOLIS..................................................................
5
1.5
CLASSIFICAÇÃO DA PRÓPOLIS .........................................................
7
1.6
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA PRÓPOLIS.............................................
7
1.7
ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA PRÓPOLIS........................................
9
1.8
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE...............................................................
9
1.9
ANTIOXIDANTES DA PRÓPOLIS.........................................................
10
1.10
ATIVIDADE CITOTÓXICA ....................................................................
12
1.11
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA PRÓPOLIS...............................
13
REFERÊNCIAS.........................................................................................
14
ARTIGO CIENTÍFICO..........................................................................
18
1
1 REVISÃO DE LITERATURA
1.1 Produtos naturais
Desde tempos imemoriais, produtos naturais são utilizados pelo homem, que
buscava o alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folhas, o que talvez tenha
sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais (BARREIRO;
VIEGAS; BOLZANI, 2006).
A natureza, de forma geral, tem produzido a maioria das substâncias orgânicas
conhecidas. O reino vegetal é o que tem contribuído de forma mais significativa para o
fornecimento de metabólitos secundários, os quais possuem grande valor agregado
devido às suas aplicações como medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos
(PINTO et al, 2002).
Devido à importância das plantas consagradas pelo uso popular, os químicos as
estudavam, isolando e determinando as estruturas de substâncias ativas. Muitas
substâncias foram determinadas e introduzidas na terapêutica, permanecendo até os dias
de hoje como medicamentos. Os alcalóides de Cinchona e de Papaver são grandes
exemplos. Entre os alcalóides de Papaver, encontram-se codeína e morfina e entre os
alcalóides de Cinchona, a quinina – responsável pelo desenvolvimento dos
antimaláricos sintéticos (BARREIRO; VIEGAS; BOLZANI, 2006).
Os produtos naturais desempenham um papel altamente significativo na
descoberta e no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de várias
doenças humanas. Para o combate ao câncer e às doenças infecciosas, mais de 60% e
75% dos fármacos utilizados são originários de produtos naturais (NEWMAN;
CRAGG; SNADER, 2003).
Em particular, a terapia contra o câncer representa a oportunidade ideal para a
descoberta e desenvolvimento de novos fármacos a partir de produtos naturais. Porém,
muitos destes compostos naturais promissores estão disponíveis em quantidades
extremamente pequenas, especialmente os de organismos marinhos, como as esponjas
(PATERSON; ANDERSON, 2005).
Ao longo da história, o homem aprendeu a utilizar os produtos naturais na
medicina, destacando-se as plantas brutas (ervas) e as tradicionais preparações galênicas
(extratos). Um dos muitos produtos naturais utilizados durante séculos pela humanidade
é a própolis (CAS N° 9009-62-5) administrada sob diversas formas. A própolis é um
remédio natural utilizado desde tempos remotos. No antigo Egito era conhecida como
2
“cera negra” e utilizada para embalsamar os mortos (PEREIRA; SEIXAS; NETO,
2002).
A própolis teve suas propriedades medicinais reconhecidas por médicos gregos e
romanos (Aristóteles, Plínio e Galeno), sendo empregada como antisséptico e
cicatrizante no tratamento de feridas. Os incas utilizaram a própolis como agente anti-
pirético, consta na farmacopéia britânica como medicamento oficial e se tornou popular
por sua atividade antibacteriana (CASTALDO; CAPASSO, 2002).
Os produtos naturais estão recuperando espaço e importância no mercado
farmacêutico, seja por suas atividades ou como fonte inspiradora de novos padrões
moleculares bioativos (BARREIRO; VIEGAS; BOLZANI, 2006).
A própolis é um dos produtos naturais que tem mantido sua popularidade por um
longo período de tempo e quando utilizada de forma padronizada é mais segura e menos
tóxica que muitos medicamentos sintéticos (CASTALDO; CAPASSO, 2002). Segundo
Pereira, Seixas e Neto (2002), própolis não significa modismo terapêutico, pois suas
virtudes são reconhecidas há séculos, sendo relatadas em inúmeros trabalhos que
demonstram diferentes tipos de atividades biológicas e aplicações em diversas terapias.
A grande questão para o futuro é responder a uma pergunta antiga: qual própolis serve
para qual ação terapêutica?
1.2 Abelhas
Insetos pertencentes à ordem dos Himenópteros e à família dos Apídeos, as
abelhas representam os principais polinizadores da vegetação natural (SOUZA;
CAMPOS, 2008).
No Brasil, as primeiras abelhas européias Apis mellifera foram introduzidas pelo
padre português Antônio C. Aureliano em 1839. A partir deste momento, diversas raças
de abelhas européias do gênero Apis foram trazidas para o Brasil por diferentes
imigrantes. Na década de 1950 foram trazidas para pesquisa algumas espécies de
abelhas africanas, que escaparam acidentalmente e se miscigenaram com as européias
aqui existentes, resultando assim nas Apis mellifera africanizadas (GONÇALVES,
1992).
São conhecidas cerca de vinte mil espécies diferentes de abelhas, destacando-se
as espécies do gênero Apis devido à importância econômica e às características
3
fisiológicas. A maioria das abelhas do gênero Apis são produtoras de mel e a palavra
mellifera significa “carrega o mel”, muito embora as abelhas carreguem o néctar. As
espécies encontradas hoje em dia no Brasil são as Apis mellifera africanizadas e as
centenas de espécies nativas, muitas delas ainda sem classificação (NOGUEIRA-
NETO, 1997).
As abelhas do gênero Apis constituem, hoje em dia, um material de trabalho para
os apicultores brasileiros, gerando assim uma atividade sustentável, pois apesar de sua
maior agressividade, elas começam a produzir mais cedo, param mais tarde e não
apresentam o instinto de hibernação comum às raças européias. Por outro lado as
abelhas nativas, sem ferrão, destacam-se pela sua importância para a manutenção de
áreas naturais (IMPERATRIZ, 1998).
1.3 Abelhas nativas (Meliponíneos)
As abelhas nativas pertencem à tribo Meliponini, subfamília Apinae e englobam
todas as abelhas conhecidas como “abelhas sem ferrão” encontradas nas regiões tropical
e subtropical do planeta (NATES-PARRA, 2001).
Assim como as abelhas melíferas, as abelhas sem ferrão são insetos sociais. Têm
sido conhecidas pela sua produção de mel, mas seu papel na manutenção do ecossistema
tem sido reconhecido atualmente (CORTOPASSI-LAURINO et al, 2006).
São considerados somente três gêneros de abelhas sem ferrão: Melipona,
Lestrimelita e Trigona, sendo que o último é subdividido em vários subgêneros
(NATES-PARRA, 2001).
As abelhas sem ferrão constituem polinizadores nativos de angiospermas nos
trópicos e incluem abelhas pequenas e médias (2 mm a 1,5 cm) com um nível de
organização social semelhante ao das abelhas Apis mellifera (HEARD, 1999).
As tribos de meliponíneos incluem várias centenas de espécies, mas o número
real é difícil de ser estabelecido devido às espécies serem específicas de cada região
geográfica e diferirem em características muito sutis (MICHENER, 1990).
As abelhas sem ferrão se caracterizam principalmente por terem ferrão reduzido
e constroem ninhos muito peculiares, que podem ser utilizados para a identificação da
espécie (NATES-PARRA, 2001).
Os Meliponini fazem seus ninhos nos mais diversos tipos de substratos, como
cavidades subterrâneas (associados ou não com ninhos de outros insetos sociais), ocos
4
de árvores e cipós, fendas em paredes e rochas, em ninhos de formigas arborícolas, em
ninhos abandonados de aves ou ninhos livres, fixados em galhos e troncos de árvores.
Todas as espécies conhecidas utilizam cera e resinas vegetais puras ou misturadas
(cerume) para a construção das edificações. Algumas espécies usam terra misturada
com resinas (batume) como as espécies de Melipona (CAMARGO; PEDRO, 2003).
Por serem resistentes às doenças e aos parasitas das abelhas melíferas, a
propagação de suas colônias contibuem para a preservação da biodiversidade.
Entretanto, sua densidade pode ser diminuída em casos de desmatamento (ELTZ et al,
2002).
Segundo Bankova e Popova (2007), as abelhas sem ferrão habitam o continente
americano há séculos, muito antes da chegada de Colombo e das abelhas melíferas.
Atualmente, a meliponicultura vem alcançando grande popularidade no Brasil
(CORTOPASSI-LAURINO et al, 2006). Assim como ocorre com as Apis mellifera, as
abelhas nativas são criadas devido à produção de mel, que é medicinal e mais caro que o
das abelhas melíferas. As abelhas sem ferrão coletam resinas vegetais e armazenam em
grandes depósitos dentro de seus ninhos e são de manejo mais fácil que o das abelhas
melíferas (BANKOVA; POPOVA, 2007).
A criação de abelhas sem ferrão é conhecida como meliponicultura, que
associada ao melhoramento genético permite o desenvolvimento de uma agricultura
sustentável e a preservação da vida selvagem. Porém para muitas espécies, a
meliponicultura exige técnicas especiais de manejo e o ambiente natural intacto
(CORTOPASSI-LAURINO et al, 2006).
Assim como as abelhas melíferas, as abelhas sem ferrão produzem própolis, que
tem demonstrado considerável atividade antimicrobiana (FERNANDES et al, 2001;
VELIKOVA et al, 2000a).
1.4 Própolis e geoprópolis
A palavra própolis é de origem grega e derivada de pro, em defesa de, e polis,
cidade. Isto implica em um produto usado na defesa da comunidade das abelhas
(SALATINO et al, 2005).
Geoprópolis é um tipo especial de própolis produzida por abelhas sem ferrão,
formado por uma mistura de resinas vegetais, cera e terra (BARTH, 2006).
5
O reconhecimento da atividade antisséptica da própolis é antigo. Aristóteles
recomendava o uso da própolis para tratar abscessos e feridas. Os soldados romanos
levavam própolis para o campo de guerra como um remédio de emergência. Um
remédio contendo própolis e vaselina foi usado para tratar as feridas durante várias
guerras (SALATINO et al, 2005).
A própolis é um produto resinoso complexo das abelhas que varia de acordo
com diversos fatores. A cor pode ser creme, amarela, verde, marrom claro ou escuro.
Algumas amostras têm uma textura friável e dura, enquanto outras são elásticas e
colantes (SALATINO et al, 2005).
A própolis é utilizada pelas abelhas na entrada das colméias, fechando frestas
para redução da entrada do vento frio e, principalmente, dos inimigos naturais (fungos e
bactérias), além de ser utilizada para embalsamar pequenos animais mortos pelas
abelhas e que não puderam ser retirados, evitando a putrefação. A própolis também é
utilizada como material de construção no interior da colméia, soldando favos, quadros e
envernizando o interior dos alvéolos para que a rainha faça a postura. A literatura
mostra a atividade desta resina natural contra uma variedade de patógenos humanos e
animais (SALOMÃO et al, 2004).
A composição da própolis é extremamente complexa. Os constituintes mais
importantes são cera de abelha, resina vegetal e compostos voláteis. Os insetos secretam
cera, enquanto os dois últimos constituintes são obtidos das plantas. As abelhas
geralmente coletam o material para a própolis de secreções das plantas ou cortando
fragmentos de tecidos vegetais. A atividade biológica é atribuída às substâncias
derivadas das plantas (SALATINO et al, 2005).
A composição química da própolis é determinada principalmente pelas
características fitogeográficas existentes ao redor da colméia (KUMAZAWA;
HAMASAKA; NAKAYAMA, 2004), vegetação da região, mas também reservas de
pólen e mel. Como conseqüência desta composição química diferenciada da própolis,
ocorre também uma variação na sua atividade farmacológica (MENEZES, 2005).
A amplitude das atividades farmacológicas da própolis é maior em regiões
tropicais do planeta e menor nas regiões temperadas, refletindo a diversidade vegetal
destas regiões (BANKOVA, 2005a). A própolis possui um grande potencial terapêutico,
principalmente, em relação às atividades antiinflamatória, antimicrobiana,
antineoplásica e antioxidante (MENEZES, 2005).
6
As propriedades da própolis têm atraído a atenção de cientistas desde o final dos
anos 1960. Durante os últimos quarenta anos, muitas pesquisas têm sido publicadas
sobre a composição química, atividade biológica, usos farmacêuticos e terapêuticos da
própolis (BANKOVA; CASTRO; MARCUCCI, 2000).
1.5 Classificação da própolis
A variabilidade química da própolis é discutida devido ao problema da
padronização. Muitos tipos químicos de própolis são formulados baseados na planta de
origem. O conhecimento da planta de origem combinado ao conhecimento dos
princípios ativos fornece bases para a padronização e o controle de qualidade,
permitindo a especificação dos tipos de própolis que têm diferentes composições
químicas. Os tipos de própolis de abelhas melíferas são: “Poplar Propolis”, “Birch
Propolis”, “Green Propolis” (Brasil), “Red Propolis”, “Pacific Propolis” e “Canarian
Propolis” (BANKOVA, 2005a).
A própolis de Apis mellifera no Brasil foi classificada em doze grupos de acordo
com suas características físicas e químicas: cinco pertencentes ao grupo do sul do
Brasil, um ao grupo do sudeste do Brasil e seis ao grupo do nordeste do Brasil (PARK
et al, 2000). Ainda segundo Bankova e Popova(2007), existe ainda a própolis de abelha
sem ferrão ou abelha nativa, que deve ter sua composição química e origem botânica e
ainda elucidada. De acordo com Velikova et al (2000b), a composição da própolis de
abelhas sem ferrão é determinada pela espécie da abelha e por sua localização
geográfica.
1.6 Composição química da própolis
Própolis usualmente contém uma variedade de compostos químicos, como
polifenóis (flavonóides, ácidos fenólicos e seus ésteres), terpenóides, esteróides e
aminoácidos. A composição da própolis depende da vegetação no local de coleta.
Devido às diferenças na composição química, as atividades biológicas de tipos distintos
de própolis também variam (BANKOVA, 2005a). As moléculas farmacologicamente
ativas na própolis são flavonóides e ácidos fenólicos e seus ésteres (CASTALDO;
CAPASSO, 2002).
7
Os constituintes da própolis variam de acordo com a estação do ano e o tipo de
vegetação disponível na região onde cada própolis é produzida (AHN et al, 2007).
Segundo Bankova e Popova (2007), benzofenonas preniladas foram isoladas de
cinco tipos diferentes de própolis de abelhas sem ferrão na Venezuela.
Velikova et al (2000b) analisou vinte e uma amostras de própolis de doze
espécies diferentes de Meliponinae por Cromatografia gasosa associada a espectrômetro
de massa (CG-EM) e agrupou vários tipos químicos de própolis de abelhas sem ferrão
de acordo com o composto majoritário: ácido gálico, diterpenóides e triterpenóide
(Tabela 1).
Tabela 1: Composição química de própolis de abelha sem ferrão.
Espécie da Abelha
Origem
Composto
Friesomelitta silvestrii
Goiás, Brasil
Monoterpenos
Sesquiterpenos
Friesomelitta silvestrii languida
Minas Gerais, Brasil
Monoterpenos
Sesquiterpenos
Diterpenos
Triterpenos
Friesomelitta varia
São Paulo, Brasil
Monoterpenos
Sesquiterpenos
Triterpenos
Venezuela
Prenilados
Benzofenonas
Lestrimellata spp.
Paraná, Brasil
Diterpenos
Triterpenos
Melipona beechei
Yucatan, México
Monoterpenos
Sesquiterpenos
Melipona compressipes
Piauí, Brasil
Sesquiterpenos
Ac. Fenólicos
Flavonóides
Açúcares
Diterpenos
Triterpenos
Ác. Graxos
Venezuela
Benzofenonas preniladas
Melipona favora orlinge
Mato Grosso do Sul, Brasil
Diterpenos
Triterpenos
Melipona favosa
Venezuela
Benzofenonas preniladas
Melipona marginata
Pernambuco, Brasil
Ác. Fenólicos
Açúcares
Melipona quadrifasciata
Paraná, Brasil
Ác. Fenólicos
Açúcares
Monoterpenos
Sesquiterpenos
Diterpenos
Triterpenos
Ác. Graxos
Espírito Santo, Brasil
Ác. Fenólicos
Diterpenos
São Paulo A, Brasil
Ác. Fenólicos
Triterpenos
Açúcares
8
São Paulo B, Brasil
Diterpenos
Ác. Fenólicos
Triterpenos
Minas Gerais, Brasil
Ác. Fenólicos
Triterpenos
Açúcares
Pernambuco, Brasil
Ác. Fenólicos
Açúcares
Melipona scutellaris
Pernambuco, Brasil
Ác. Fenólicos
Açúcares
Nanotrigona testaceicornis
Minas Gerais, Brasil
Diterpenos
Triterpenos
Fonte: Bankova e Popova, 2007
1.7 Atividades biológicas da própolis
Devido à popularidade na medicina tradicional, própolis tem se tornado objeto
de intensos estudos de química e farmacologia nos últimos trinta anos (BANKOVA,
2005b). Várias atividades biológicas, como anticâncer (BANSKOTA et al, 1999; AHN
et al, 2007), antioxidante (KUMAZAWA; HAMASAKA; NAKAYAMA, 2004;
ALENCAR et al, 2007), antiinflamatória (MENEZES, 2005), antibiótica (SALOMÃO
et al, 2004; SCAZZOCHIO et al, 2005), anti-HIV (ITO et al, 2001), antifúngica
(SALOMÃO et al, 2004) e anticárie (DUARTE et al, 2003; HAYACIBARA et al,
2005; DUARTE et al, 2006) têm sido relatadas para a própolis e seus constituintes.
De acordo com Castaldo e Capasso (2002), os componentes da própolis
apresentam efeitos múltiplos em bactérias, fungos e vírus. Ainda possuem efeito
antiinflamatório e atividades imunomodulatórias, além de ter demonstrado atividades
hipotensora e hipocolesterolêmica.
Recentemente, a própolis tem sido extensamente utilizada para melhorar a saúde
e prevenir doenças como inflamações, doenças do coração, diabetes e até mesmo o
câncer (BANSKOTA et al, 1999). A própolis foi utilizada até mesmo para tratar
tuberculose, úlceras e distúrbios gástricos, dermatites e para reduzir a febre. Dois usos
persistiram pelos séculos: o uso externo como antisséptico e cicatrizante e o uso interno
para o tratamento de úlceras gastroduodenais. Estudos clínicos estão em andamento para
verificar o seu uso no tratamento e na prevenção da aterosclerose (CASTALDO;
CAPASSO, 2002).
9
1.8 Atividade antioxidante
As reações metabólicas permitem a formação de espécies reativas de oxigênio,
que estão envolvidas em uma série de danos oxidativos (danos em lipídio proteínas,
carboidratos e DNA), podendo ser ou gerar radicais livres (VANNUCCHI et al, 1998).
Nas plantas podem ser encontrados diversos tipos potentes de espécies reativas de
oxigênio, que podem estar envolvidas no metabolismo normal, como na fotossíntese e
na respiração (MITTLER, 2002).
Devido à produção contínua de radicais livres nos processos metabólicos,
mecanismos de defesa antioxidante foram desenvolvidos para impedir a indução de
danos e para limitar os níveis intracelulares de oxidantes. Assim, os antioxidantes são os
agentes responsáveis por inibir e reduzir as lesões causadas pelos oxidantes (BIANCHI;
ANTUNES, 1999).
Antioxidantes podem ser definidos como qualquer substância que, em baixa
concentração quando comparada à do substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação
deste substrato de maneira eficaz (SIES; STAHL, 1995).
Vários compostos e alguns metais pertencem ao grupo de antioxidantes, que
pode ser dividido em dois principais grupos: agentes redutores (betacaroteno e
vitaminas C e E) e nucleofílicos (glutationa, selênio e ácido lipóico). Além disto,
também podem ser classificados em enzimáticos e não-enzimáticos (SEIFRIED, 2007).
1.9 Antioxidantes da Própolis
Várias doenças estão relacionadas com os níveis de radicais livres no
organismo, tais como: doenças cardiovasculares, doenças reumáticas, doenças
neurológicas, doenças psiquiátricas, envelhecimento precoce, osteoporose, diabetes,
inflamação e neoplasias (MENEZES, 2005). Para o controle e prevenção destas
doenças, há uma forte tendência em se usar produtos naturais contendo polifenóis com
propriedades antioxidantes (URQUIAGA; LEIGHTON, 2000).
A própolis contém uma série de polifenóis e vários outros compostos capazes de
remover os radicais livres em excesso do organismo (MENEZES, 2005). Um possível
10
mecanismo de reação antioxidante da própolis seria o seqüestro de radicais livres
gerados por neutrófilos, que resultaria em uma atividade final antiinflamatória
(MORENO et al, 2000).
De acordo com Kumazawa, Hamasaka e Nakayama (2004), a própolis possui
atividade antioxidante já relatada em muitos estudos e alguns compostos foram
identificados como sendo responsáveis pela ação antioxidante de amostras de própolis
de diferentes origens. Estas estruturas foram isoladas e identificadas em análises por
meio de cromatografia líquida de alta eficiência. Alguns destes compostos são: ácido
caféico, ácido ρ-cumárico, ácido dimetoxicinâmico, quercetina, apigenina, kaempferol,
artepelina C, entre outros (FIGURA 1).
Figura 1: Estruturas de compostos antioxidantes identificados na própolis. 1, Ácido
caféico; 2, ácido ρ-cumárico; 3, ácido 3,4-dimetoxicinâmico; 4, quercetina; 5, éter 5-metil
pinobanksin; 6, apigenina; 7, kaempferol; 8, pinobanksin; 9, ácido cinamilacético; 10,
crisina; 11, pinocembrina; 12, galangina; 13, pinobanksin 3-acetato; 14, fenetil cafeato; 15,
cinamil cafeato; 16, tectocrisina; 17, artepelina C. Fonte: Kumazawa; Hamasaka; Nakayama,
2004.
11
1.10 Atividade citotóxica
Uma diversidade de compostos apresentando atividade citotóxica foi isolada da
própolis, os quais apresentam atividade inibitória do crescimento de diversas células
tumorais. Compostos hidrossolúveis isolados da própolis podem atuar sinergicamente
potencializando a atividade de drogas tumoricidas (MENEZES, 2005).
De acordo com Ahn et al (2007), o composto artepelina C (FIGURA 2) pode ser
útil no desenvolvimento de agentes e de alimentos com atividade preventiva ou
terapêutica contra a angiogênese tumoral, apresentando assim, ação tumoricida.
Artepelina C (ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinamico) é um dos principais ácidos
fenólicos encontrados especificamente na própolis brasileira. Apresenta várias
atividades biológicas, sendo as principais: antioxidante e anticarcinogênica. No estudo
de Ahn et al (2007), foi analisada a composição química de própolis de várias origens
geográficas. A própolis brasileira apresentou pequenas quantidades de flavonóides
como quercetina e kaempferol e ésteres de ácidos fenólicos, como éster fenetil do ácido
caféico; os quais são componentes comuns em própolis de outras origens. O
componente mais abundante e presente apenas na própolis brasileira foi a artepelina C,
na concentração de 40mg por grama de extrato etanólico.
Figura 2: Estrutura química da artepelina C.
A atividade anticâncer da própolis brasileira é devida primariamente aos
compostos fenólicos e está intrinsecamente relacionada à atividade antioxidante. Os
constituintes que apresentam atividade são ácido caféico e seus derivados, flavonóides,
12
ácido 2,2-dimetil-8-prenilcromona-6-propenóico, artepelina e ácido 17-hidroxicleroda-
3-dien-15-óico (BANSKOTA et al, 1999).
O potencial citotóxico da própolis de abelhas nativas sem ferrão tem sido
estudado e própolis de Melipona quadrifasciata e Nanotrigona testacularis
demonstraram toxicidade promissora e melhor que a apresentada pela própolis de
abelhas melíferas (BANKOVA; POPOVA, 2007).
1.11 Atividade antimicrobiana da própolis
A capacidade da própolis em inibir o crescimento de microrganismos é a
atividade farmacológica mais popularmente conhecida e comprovada cientificamente
(MENEZES, 2005).
Alguns fatores podem influenciar a capacidade inibitória da própolis, tais como
preparo do extrato, microrganismo testado, origem da própolis e espécie da abelha
(FERNANDES et al, 2001).
Velikova et al (2000a) isolou três diterpenóides da própolis de abelha nativa
brasileira Melipona quadrifasciata anthidioides e um deles, o ácido caurenóico
demonstrou atividade antibacteriana moderada contra S. aureus e E. coli.
A própolis de Meliponíneos tem sido estudada principalmente por suas
atividades antibacteriana e antimicótica. Em geral a atividade antibacteriana tem se
mostrado similar à atividade da própolis de abelhas melíferas, sendo mais ativa contra
microrganismos Gram-positivos do que contra Gram-negativos. Ácidos diterpênicos
têm sido associados à atividade antibacteriana destas própolis (BANKOVA; POPOVA,
2007).
Segundo um estudo estatístico de Popova et al (2004), a própolis de
meliponíneos brasileiros apresenta menor atividade antibacteriana contra S. aureus do
que a própolis de abelhas melíferas brasileiras e européias.
A tabela 2 apresenta a relação das espécies de abelhas sem ferrão e os
microrganismos que são capazes de inibir, de acordo com Bankova e Popova (2007).
13
Tabela 2: Atividade antimicrobiana das própolis de abelhas nativas.
Espécie da Abelha
Microrganismo
Lestrimellata spp.
Staphylococcus aureus
Candida albicans
Melipona favora orlinge
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Candida albicans
Melipona mandacaia
Staphylococcus aureus
Enterococcus spp.
Melipona marginata
Staphylococcus aureus
Candida albicans
Melipona quadrifasciata
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Candida albicans
Melipona scutellaris
Staphylococcus aureus
Candida albicans
Enterococcus spp.
Melipona spp.
Staphylococcus aureus
Enterococcus spp.
Escherichia coli
Nanotrigona testaceicornis
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Candida albicans
Partamona spp.
Staphylococcus aureus
Enterococcus spp.
Plebeia droriana
Staphylococcus aureus
Candida albicans
Fonte: Bankova, 2007
14
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18
A Promising Natural Product: Propolis of Stingless Bee
(Melipona scutellaris) from Bahia
Mariana Bastos Bernardes de Oliveira Camilo
1
; Severino Matias de Alencar
2
; João
Ernesto de Carvalho
3
; Ana Lúcia Tasca Góis Ruiz
3
; Tatiane Luíza Cadorin Oldoni
2
;
Masaharu Ikegaki
1*
1
Universidade Federal de Alfenas / Unifal - MG; Departamento de Farmácia; Alfenas /MG;
2
Esalq / USP; Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição; Piracicaba-SP;
3
Divisão de Farmacologia e Toxicologia, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas,
Biológicas e Agrícolas - CPQBA, Universidade Estadual de Campinas-UNICAMP, Campinas-
SP.
________________________________
*Correspondence:
Masaharu Ikegaki
Universidade Federal de Alfenas, Unifal-MG
Rua Gabriel Monteiro da Silva, 700 - centro
37130-000 Alfenas-MG
Tel: 55-35-3299-1102
E-mail address: masaharu@unifal-mg.edu.br
19
ABSTRACT
The purpose of this study was to analyze propolis from Uruçu (Melipona
scutellaris) on its biological properties. The content of phenolic compounds by the
method of Folin-Ciocalteu was 0,105 mg/mg of propolis. The crude extract of propolis
presented significant antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in the test of
antibiogram by agar diffusion and in the determination of minimum inhibitory
concentration (MIC), with a diameter of 27 mm of inhibition zone and MIC from 3.12
to 1.56 ppm. The most apolar fraction showed higher antimicrobial activity, with a
diameter of 33 mm of inhibition zone for the fraction 3 and the MIC obtained was from
1.56 to 0.78 ppm. We also evaluated the antioxidant activity using the DPPH radical
scavenging activity and crude extract showed dose-dependent response, and 89.05% in
the concentration of 90 ppm. The less apolar fraction showed the higher antioxidant
activity against DPPH, it was 67.36% for the concentration of 90 ppm. We also
evaluated the cytotoxic activity of the crude extract on nine cancer cell lines, and it
showed toxicity in a dose-dependent manner.
Uniterms: Propolis, Stingless Bees, Meliponinae, Biological Activities
20
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi analisar a própolis de uruçu (Melipona scutellaris)
quanto a suas propriedades biológicas. O teor de fenólicos totais pelo método de Folin-
Ciocalteu foi de 0,105 mg/mg de própolis. O extrato bruto da própolis demonstrou
significativa atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus nos testes de
antibiograma em difusão em ágar e na determinação da concentração inibitória mínima
(CIM), com diâmetro de halo de 27 mm e CIM de 3,12 a 1,56 ppm. A fração mais
apolar apresentou maior atividade antimicrobiana, com diâmetro de halo de 33 mm para
a fração 3 e CIM de 1,56 a 0,78 ppm. Avaliou-se também a atividade antioxidante
utilizando o radical DPPH e o extrato bruto apresentou atividade dose-dependente,
sendo de 89,05% na concentração de 90 ppm. A fração menos apolar demonstrou maior
atividade antioxidante em relação ao radical DPPH, sendo de 67,36% na concentração
de 90 ppm. Avaliou-se ainda a atividade citotóxica do extrato bruto sobre nove
linhagens de células tumorais humanas, tendo apresentado toxicidade para todas as
linhagens de maneira dose-dependente.
Unitermos: Própolis; Abelhas sem ferrão; Meliponíneos; Atividades Biológicas.
21
INTRODUCTION
Nature, in general, has produced the majority of organic substances known. The
plants contribute more significantly to supply secondary metabolites, which have great
value as medicines, cosmetics, food and agrochemical (PINTO et al, 2002).
Bees have been in existence for more than 125 million years and their
evolutionary success has allowed them to exploit all habitats on Earth. This success is
largely because of the chemistry and application of the specific products that bees
manufacture: honey, beeswax, venom, propolis, pollen and royal jelly (BANKOVA et
al, 2005a).
Throughout history, man has learned to use natural products in medicine,
propolis is one of many natural products used for centuries for humanity (PEREIRA et
al, 2002).
Propolis (bee glue) is the generic name for the resinous substance collected by
bees from the buds and exudates of various plant sources. The name derived from the
Greek words pro, meaning in front of and polis, which is city or community, so propolis
means a substance in defense of the hive (JASPRICA et al, 2007;
CASTALDO;CAPASSO, 2002; LI et al, 2008).
Propolis is used by bees mainly against natural enemies (fungi and bacteria) at
the entrance of hives to close cracks reducing the entry of wind and cold and is used to
embalm small animals killed by bees avoiding putrefaction. Propolis is also used as a
building material inside the beehives for the maintenance of their structure. The
literature shows the activity of this natural resin against a variety of human and animal
pathogens (SALOMÃO et al, 2004).
The native bees belong to tribe Meliponinae (subfamily Apinae) and encompass
all the bees known as “stingless bees” found in tropical and subtropical regions of the
planet (NATES-PARRA, 2001). Like honeybees, they are social insects that have been
known for their production of honey, pollen and propolis, but their role in maintaining
the ecosystem has been recognized nowadays (CORTOPASSI-LAURINO et al, 2006).
Stingless bees are essential pollinators, mainly in rainforests. Some of these bees
prepare a special kind of propolis, called geopropolis. Geopropolis is quite different
from propolis produced by Apis mellifera because geopropolis is a mixture of resins,
wax and soil (BARTH, 2006).
22
The constituents of propolis vary according to the season and type of vegetation
available in each region where propolis is produced (AHN et al, 2007).
According to Bankova and Popova (2007), prenylated benzophenones were
isolated from five different types of propolis of stingless bees in Venezuela. Velikova et
al (2000b) analyzed twenty-one samples of propolis of twelve different species of
Meliponinae by GC-MS and grouped various types of chemical propolis of stingless
bees according to prevailing type of compounds in alcohol extract: diterpenic,
triterpenic, and gallic acid type. Mixed-type propolis was also observed.
Various biological activities, such as anticancer, antioxidant, antiinflamatory,
antibiotic and antifungal have been demonstrated for propolis from the honey bee Apis
mellifera and its constituents (BANSKOTA et al, 1999; LI et al, 2008). Propolis
extracts show in vitro activity mainly against Gram-positive and Gram-negative
bacteria, fungi and viruses (CASTALDO; CAPASSO, 2002).
People keep stinglees bees for honey, but these bees also collect plant resin and
store in large deposits within their nests that are much easier to harvest compared to
honey bee propolis and stingless bee propolis can be used in a similar way as honey bee
propolis (BANKOVA; POPOVA, 2007).
Because of the popularity in traditional medicine, propolis has become object of
intense study of chemistry and pharmacology in the last thirty years (BANKOVA et al,
2005b).
The purpose of this study was to analyze the propolis of Uruçu (Melipona
scutellaris) from the state of Bahia for its physical and chemical characteristics and
some biological properties. It was a very challenging study because the research is
needed to scientifically support the medicinal properties of stingless bee propolis.
MATERIALS AND METHODS
Propolis Sample and Extraction
Stingless bee (Melipona scutellaris) propolis was collected in Entre Rios city in
the state of Bahia – Brazil. The bees were set up in a box (20 cm x 20 cm) divided in
two parts: the lower part, which was the nest and the top of the box that was the deposit
of honey and pollen. Between the top and the lid of the box the bees made a layer of
geopropolis, which was collected.
23
Propolis was ground to a fine powder and 50 g were mixed with 350 mL of
absolute ethanol and shaken at 70°C for 30 minutes. After extraction, mixture was
centrifuged and supernatant was collected.Residual propolis was extracted again with
more 150 mL of absolute ethanol. After second centrifugation supernatants were
evaporated under low pressure to obtain ethanolic extract of propolis of uruçu (EEPU)
which was used in the tests.
Fractionation of Ethanolic Extract of Propolis of Uruçu
The fractionation of EEPU (1.0 g) was done using chromatography in a flash
column of cellulose (20 cm x 3.0 cm). Cellulose was chosen because it is flexible,
strong, inert to solvents used and transparent to the natural light and ultraviolet light.
First, the column has been treated with hexane to remove the oily layer of protection.
After this, the lower end was closed and the column was packed with silica gel 60.
The sample (1.0 g) was solubilized with absolute ethanol (2.0 mL) and mixed
with approximately 3 g of silica gel 60. Solvent was evaporated at room temperature to
obtain the mixture of EEPU and silica as a fine powder.
This fine powder was placed in the top of the column, and the mobile phase (a
mixture of 94% chloroform and 6% ethyl acetate plus 1% of acetic acid) was added
until it reaches the front line in the base of the column. After the development, the
colored bands that appeared were cuted with a sharp blade. The bands were solubilized
with absolute ethanol and filtered using a filter paper. After this, the fractions obtained
were evaporated at room temperature and the fractions were applied in a TLC plate
using the same mobile phase.
Determination of total phenolic content
The phenolic compounds content of crude extract was determined based on the
method described by Woisky and Salatino (1998) and gallic acid was used as the
standard.
At room temperature, 0.5 mL of EEPU dilutions (from 62.5 to 1000 μg/mL)
were oxidized with a dilution 1:10 of the Folin- Ciocalteau reagent (2.5 mL) for 3 to 8
minutes. This mixture was neutralized with a solution of sodium carbonate 4%. The
absorbance of the final color (blue) was measured in spectrophometer at 740 nm after
24
incubation at room temperature and darkness for 2 hours. All tests were carried out in
triplicate and the results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ dry weight
of the crude extract).
Determination of total flavonoids content
The total flavonoids content of the crude extract was determined using the
method of Park et al (1998) and the quercetin was used as the standard.
At room temperature, 0.5 mL of EEPU dilutions (from 62.5 to 1000 μg/mL)
were mixtured with 4.3 mL of absolute ethanol and alcoholic solutions of 10 %
aluminum nitrate (0.1 mL) and 1 M potassium acetate (0, 1 mL). After 40 minutes at
room temperature, the absorbance was measured in spectrophotometer at 415 nm and
results were expressed as quercetin equivalent (mg / g). All tests were carried out in
triplicate.
Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography (RP–HPLC)
According to Silva et al (2008), crude extract of Propolis of Uruçu and its
fractions were analysed by RP-HPLC using a chromatograph equipped with a Shimadzu
ODS-A column (RP-18, column size 250 mm; particle size, 5 mm) and photodiode
array detector (SPD-M10AVp, Shimadzu Co.). EEPU and fractions were filtered with
0.22 mm filter (Millipore) prior to 20 mL injected into the HPLC system. For crude
extract, the column was eluted using a linear gradient of water (solvent A) and methanol
(solvent B), starting with 40% B and increasing to 60% B (45 min), held at 90% B (45–
75 min), and decreasing to 30% B (75–85 min) with a solvent flow rate of 1 mL/min
and detection with a diode array detector.
For fractions the method was changed by wich the compound was eluted before. The
column was eluted by using a linear gradient of water (solvent A) and methanol (solvent
B), starting with 60% B, increasing to 90% B (70 min) and decreasing to 60% B (75
min).
Chromatograms were recorded at 260nm as described by Park et al (2004). The
following authentic standards of phenolic acids and flavonoids (Extrasynthese Co.)
were examined: p-coumaric, ferulic acid, cinnamic acid, gallic acid, quercetin,
kaempferol, kaempferide, apigenin, isorhamnetin, rhamnetin, sakuranetin,
25
isosakuranetin, hesperidin, hesperetin, pinocembrin, chrysin, acacetin, galangin,
myricetin, tectochrysin and artepillin C.
Antioxidant assay
Free radical-scavenging activity measurement (DPPH)
Several methods are used to determine the antioxidant activity in extracts and
substances isolated. One of the most used is the measure of the scavenging of free
radical 2,2-diphenyl-1-picryl-hidrazide (DPPH).
Two mL of dilutions of crude extract (22.5, 45, 90, 180 e 360 μg/mL) and of the
three fractions (90 μg/mL) in absolute ethanol were added to 0.5 mL of 0.5 mM DPPH
in absolute ethanol (YEN; CHANG; DUH, 2005, little modified). BHT and ascorbic
acid were used as standards in the same concentrations of the crude extract. The
mixtures were left for 30 minutes in darkness at room temperature and the final color
were measured in spectrophotometer at 517 nm. A negative control was used, consisting
of 4 mL of ethanol and 1 mL of DPPH solution. The DPPH radical-scavenging capacity
was calculated by the formula:
%SC = {[Abs negative control – (Abs sample – Abs blank)] x 100} / Abs negative control
Where % SC = % scavenging capacity, Abs = Absorbance
Antimicrobial Assays
The following methods were used to evaluate the activity of propolis extract and
its fractions. All tests were performed in triplicate, using ethanol without propolis as a
control of the solvent inhibitory effect and sterile saline was used as a negative control.
Green propolis was used to compare the activity of stingless bee propolis and Apis
mellifera propolis.
Microorganisms
The microorganisms used in these tests were obtained cultures of 24 hours and
suspended in sterile saline solution to obtain concentrations of approximately 10
7
26
CFU/mL. In this study the microorganisms used were Staphylococcus aureus ATCC
6538 and Escherichia coli ATCC 25922, donated by the Microbiology Laboratory of
Unifal-MG. The cultures were stored in Nutrient agar at 4 to 8°C.
Agar Diffusion Method
Crude extract and its fractions were tested against Staphylococcus aureus ATCC
6538 and Escherichia coli ATCC 25922 troughs the agar diffusion method described in
Lorian (1996). The plates were prepared using sterile Nutrient Agar with 1% of the
saline solution containing the microorganism inoculated. All plates tested were
incubated at 37 ºC for 24 hours. The inhibition zones were observed and measured.
Crude extract presented activity only against the Gram-positive bacteria, so the next
tests were done only against Staphylococcus aureus ATCC 6538.
Minimum Inhibitory Concentration and Minimum Bactericidal Concentration
Dilutions of crude extract and its fractions were tested against Staphylococcus
aureus ATCC 6538 in the concentrations of: 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 12.5, 6.25,
3.12, 1.56 and 0.78 μg/mL all in absolute ethanol. The minimum inhibitory
concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were determined
in accordance with CLSI guidelines (M100-S15, 2005) and Duarte et al. (2003), with
few modifications.
Sterile saline solution containing the bacteria obtained from 24 hours culture was
inoculated in Nutrient Broth in a concentration of 1%. Test was performed in triplicate
for each concentration of extract and fractions. 4950 μL of medium were incubated with
50 μL of each concentration of extract or fractions for 24 hours at 37°C. Medium
without bacteria was used as negative control and medium without bacteria containing
only extract or fractions were used as propolis control. The lowest concentration with
no visible growth (absorbance < 0.05 at 660 nm) was the MIC. After this, 50 μL of the
tubes with concentrations higher than MIC were cultured on Nutrient Agar for 24 hours,
at 37° C and the lowest concentration that allowed no visible growth was the MBC.
27
Cytotoxic assay
Crude extract was evaluated for its antiproliferative activity in a panel of tumor
cells lines and cell growth was calculated using Sulforhodamine B (SRB) Assay
(SHOEMAKER, 2006). The cell lines tested are in the table I.
TABLE I: Cell lines used in antiproliferative activity assay.
Cell line
Cell type
Embrionary origin
K562 (Leukemia)
Lymphoblastic
Mesenchyma
NCI-H460 (Lung)
Epithelial
Endoderm
MCF-7 (Breast)
Epithelial
Ectoderm
NCI-ADR/RES (Ovary*)
Epithelial
Ectoderm
UACC-62 (Melanoma)
Fibroblastic
Ectoderm
786-O (Renal)
Epithelial
Mesoderm
HT-29 (Colon)
Epithelial
Endoderm
OVCAR-3 (Ovary)
Epithelial
Mesoderm
PC-3 (Prostate)
Epithelial
Mesoderm
* This line is resistant to multiple drugs.
These cell lines were maintained in the laboratory of cell culture in bottles of 25
cm
3
containing 5 mL of medium RPMI 1640 (Gibco
) supplemented with 5% of Fetal
Bovine Serum (SFB) (Gibco
) and were incubated at 37°C in humid atmosphere with
5% CO
2
.
The antiproliferative activity assay consisted on the inoculation of 100 L/well,
in a 96 well plate (Nunc
), of a suspension with density between 3x10
4
and 6.5x10
4
cel/mL in medium RPMI/SFB plus gentamicin 50 g/mL. That was also prepared a
plate called T0, in which cell lines were inoculated in only six wells (100 L/well).
After incubation for 24 hours at 37°C in humid atmosphere with 5% CO
2
,
sample was added (100 L/well) in four concentrations (0.25; 2.5; 25 e 250 g/mL).
Doxorrubicin was used as positive control in concentrations of 0.025; 0.25; 2.5 e 25
g/mL.
Immediately after inoculate samples in the test plate, the T0 plate was fixed with
50 L/well of 50% trichloroacetic acid (TCA) and maintained for 1 hour at 4°C. After
this, the plate was washed with water four times to remove TCA waste, SFB and
secondary metabolites and left to dry at room temperature. This plate indicated the
amount of cells present in test plate at the time of samples inoculation.
After 48 hours of incubation, test plate with samples was fixed as described for
T0 plate. After dry at room temperature, plates were stained with 50 L/well of 0.4%
28
SRB (in acetic acid 1% v/v) and maintained at 4°C for 60 minutes. Finally, SRB were
solubilized with Trizma Base (Sigma
, 150 L/well, 10M, pH 10.5). The absorbance
was measured in spectrophotometer at 540 nm.
With the absorbance values for each sample, the percent of growth was
calculated by the formula:
If T > C → increases cellular growth
If T ≥ T
0
< C → cytostatic activity: 100 x [(T-T
0
)/(C-T
0
)]
If T< T
0
→ cytotoxic activity: 100 x [(T-T
0
)/ T
0
]
Where:
T = absorbance of the treated cells – absorbance of the sample without cells.
C = absorbance of the untreated cells.
T
0
= Absorbance of the cell control in T0 plate.
A graphic of percent of growth x concentration was done by using software
Origin 7.5. The total growth inhibition (TGI) was calculated using this graphic and
represent the concentration necessary to have 0% of cell growth.
Statistical analysis
All of the data was expressed as a mean ± s.d. from at least three separated
experiments (repetitions) performed in triplicate. The ANOVA test for unpaired
observation between controls and experimental samples and Tukey´s test for multiple
comparisons were conducted to evaluate statistical differences; p values of 0.05 or less
were considered statistically significant.
RESULTS AND DISCUSSION
Propolis Sample, EEPU and fractions
The crude propolis of Uruçu and EEPU obtained showed dark brown color,
flexibility and a pungent smell.
After extraction of the crude propolis of uruçu, was made the fractionation using
a flash column and four distinct fractions (Table II) were obtained.
29
TABLE II: Fractions obtained from EEPU after the process of fractionation with a cellulose column.
Fraction
Color
0
Dark Brown
1
Reddish Brown
2
Yellow
3
Yellowish Brown
Every column used 1.0g of EEPU and were made five columns, totaling 5.0 g of
the crude extract of propolis of Uruçu. The mass and yield of each fraction after the
evaporation of the solvent are presented in Table III.
TABLE III: The mass and the yield of the fractions obtained from EEPU after development of five
cellulose columns.
Fraction
Mass (g)
Yield (%)
0
0.1854
3.708
1
0.0474
0.948
2
0.7669
15.338
3
1.188
23.76
Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography (RP–HPLC)
EEPU and its fractions were analysed by RP-HPLC and the results are shown in
Figure 1 and 3.
Figure 1: Chromatogram of EEPU. The composition of EEPU observed after the reversed phase HPLC
analysis is mostly apolar and the peaks obtained were not identified in comparison with the standards
used.
30
The EEPU chromatogram is very similar to the chromatogram (Figure 2) of
propolis type 6 produced by Apis mellifera bees analysed by Castro et al (2007), which
has a composition mostly apolar. Castro et al (2005) identified in this propolis esters of
fatty acids, aromatic compounds and terpenoids.
Figure 2: Chromatogram of propolis type 6 produced by Apis mellifera with a composition mostly apolar,
like EEPU (CASTRO et al, 2005).
Figure 3: A- Chromatogram of fraction 0, the less apolar fraction. B- Chromatogram of fraction 1, the
fraction with the higher antioxidant activity. C – Chromatogram of the fraction 2, a fraction with
intermediate polarity. D– Chromatogram of the fraction 3, the most active fraction against S. aureus,
which contains a peak of interest with a retention time of 53.554 min. That is possible to observe that the
fractionation was effective.
31
In crude EEPU a majority peak was found at retention time of 100.16 min (peak
6) and the fraction 3 showed a peak at 53.66 min (peak 7), with a similar UV spectrum.
This peak is important because fraction 3 showed high antimicrobial and antioxidant
activities. That is shown in Figure 4.
Figure 4: UV spectrum of the interest peak in the EEPU and in the fraction 3. It shows that the
fractionation was efficient.
In fraction 1 the majority peak was peak 4 and in fraction 2, was peak 1. The
spectrums of aUV of these peaks are shown in Figure 5.
Figure 5: Spectrum of UV of the peak 4 from fraction 1 at time 59.98 min and peak 1 from fraction 2 at
time 35.94 min. Fraction 1 showed a high antioxidant activity and none antimicrobial activity and fraction
2 showed moderate antioxidant and antimicrobial activities.
The spectrum of UV of the majority peaks of fractions and crude extract are
important to show that the fractionation was efficient once all these peaks are different
between them. The same peak is presented only in crude extract and in fraction 3, wich
demonstrated the higher antimicrobial activity.
32
Total phenolic and flavonoid contents
The total phenolic contents of crude extract analyzed by the Folin-Ciocalteau
method was 0.105 mg GAE/mg EEPU. That is a moderate value comparing to propolis
of Apis mellifera (red propolis), wich presented a total of phenolic compounds of 232
mg GAE/g EEP, according to Alencar et al (2007). None flavonoids were found in
EEPU.
The composition of propolis from Uruçu (Melipona scutellaris) was analysed
only by Velikova et al (2000b), but was a sample collected in Pernambuco state
(Brazil). Velikova et al (2000b) identified by GC-MS phenolic acids and sugars in this
sample.
The previously constituents isolated from Meliponinae propolis are flavonoids
aglycones, aromatic alcohols, aldehydes, acids and esters, aliphatic acids and esters,
hydrocarbons, terpenoids. Three ent-kaurene diterpenoids were isolated from a propolis
sample collected by Brazilian native bees Melipona quadrifasciata anthidioides. One of
them was the kaurenoic acid that displayed moderate antibacterial activity (VELIKOVA
et al, 2000a).
The composition of the propolis depends on the place and time of collection.
More than 160 constituents have been identified in propolis of Apis mellifera so far,
among which phenolic compounds, including flavonoids, are major constituents
(NIEVA et al, 2000; BONVEHÍ et al, 1994).
In propolis of Apis mellifera, the major polyphenols are flavonoids, followed by
phenolic acids and esters, phenolic aldehydes and ketones. Antimicrobial activity has
been atributade mainly to the flavonoids pinocembrin, galangin and pinobanksin. Other
active compounds are ester of coumaric and caffeic acids. Caffeic acid phenethyl ester
(CAPE) is cytotoxic towards tumor cells (CASTALDO; CAPASSO, 2002).
Silva et al (2006) studied the correlation between total phenolic and flavonoid
levels and founded that flavonoids levels had a greater influence on the antioxidant
activity of the honey bee propolis extracts than on their antimicrobial profiles. In one
group of extracts, there was a strong linear relationship between total phenolic contents
and biological activities.
Antioxidant Activity
Crude extract of propolis of Uruçu and its fractions were analyzed for their
antioxidant activity by the DPPH scavenging activity assay (YEN et al, 2005, little
33
modified). Crude extract was tested in five concentrations: 360, 180, 90, 45 and 22.5
μg/mL and the fractions were analyzed at the concentration of 90 ppm. All tests were
done in triplicate using BHT and ascorbic acid as standards. The results are shown in
Figure 6.
FIGURE 6 – DPPH scavenging activity of the standards and EEPU. EEPU showed a high and a dose-
dependent DPPH scavenging activity.
The crude extract showed a dose dependent response and a high DPPH
scavenging activity (90 μg/ml – 89.05%) compared to the standard ascorbic acid (90
μg/ml – 96.67%).
The fractions obtained from EEPU were also tested by the same method and the
results are presented in Figure 7.
34
Figure 7: DPPH scavenging activity of the fractions from EEPU. The most active fractions obtained were
fraction 1 and fraction 3 with DPPH scavenging capacity of 67.36% and 68.74% respectively.
A significant difference between EEPU, fractions and standards sequestering
capability of DPPH radicals was observed after statistical analysis. Only between BHT
versus fraction 0 and between fractions 1 and 3, the results showed less significance (p
< 0.05). This result indicates the presence of antioxidant compounds in the crude extract
and its fractions.
This result indicates a synergic action of the fractions because of the higher
activity of the crude extract comparing with each fraction and the efficiency of the
fractionation process, the activities of the fractions are different between them.
EEPPU showed a little content of phenolic compound and none flavonoids
compounds, but a high antioxidant activity, comparable to the standard. Silva et al
(2006), analyzing commercial propolis extracts observed that there are linear correlation
between phenolic or flavonoids contents and biological activities.
Several diseases are related to the high levels of free radicals in the body, such
as cardiovascular disease, arthritis, neurological disorders, psychiatric illness, aging,
osteoporosis, diabetes, inflammation and cancer (MENEZES, 2005). For the control and
prevention of these diseases, there is a strong tendency to use natural products
containing polyphenols with antioxidant properties (URQUIAGA, 2000).
Propolis of Apis mellifera contains a series of polyphenols and several other
compounds able to remove the excess of free radicals in the body (MENEZES, 2005).
35
A study about antioxidant activity of honey bee propolis of various geographic
origins was made by Kumazawa et al (2004). They used two different assays: inhibition
of linoleic acid oxidation and free radical scavenging activity with DPPH. They
conclude that propolis with strong antioxidant activity contained antioxidative
compounds such as kaempferol and phenethyl caffeate.
There is also one communication about antioxidant activity of Meliponae
propolis that by Manrique and Santana (2004). They worked with ethanolic extracts
from Melipona quadrifasciata, Tetragonisca angustula and Nannotrigona sp that
showed low flavonoids contents (from 0.19% to 0.32%) and high antioxidant activity.
Antimicrobial assay
Crude extract of Melipona scutellaris propolis was tested against S. aureus
ATCC 6538 and E. coli ATCC 25922 by an agar diffusion method. The EEPU showed
a high activity against S. aureus ATCC 6538 and no activity against E. coli ATCC
35922. The results against S. aureus ATCC 6538 are presented in Tables IV and V.
Table IV: Diameter of the inhibition zone obtained for EEPU and Green Propolis. This result shows the
higher antimicrobial activity of EEPU against S. aureus than the Green Propolis from Apis Mellifera.
Sample
Diameter of the inhibition zone (mm)
Melipona scutellaris Propolis
27
Green Propolis
18
Absolute Ethanol
0
Sterile 0,85% saline
0
Table V: Diameter of the inhibition zone for the fractions of EEPU. The same test was done to the
fractions and the most apolars fractions showed higher antimicrobial activity.
Sample
Diameter of the inhibition zone (mm)
Fraction 0
0
Fraction 1
0
Fraction 2
14
Fraction 3
33
This result indicates that the fractionation process increased the antimicrobial
activity.
36
After this screening, crude extract and fraction 3 were tested for their Minimum
Inhibitory Concentration (MIC) and the results are in Table VI.
Table VI: MIC values from crude extract and its fractions. The crude extract of propolis of Uruçu and its
fractions showed a high antimicrobial activity against S. aureus ATCC 6538 compared to the Green
Propolis, with extremely low values.
According to Rios and Recio (2005), MIC values below 100 μg/mL for extracts
and 10 μg/mL for isolated compounds are considered active. This way, EEPU and
fraction 3 are very promising for antibacterial activity.
Manrique and Santana (2004) studied ethanolic extracts from Melipona
quadrifasciata, Tetragonisca angustula and Nannotrigona sp against S. aureus ATCC
25.943 and Micrococcus luteus ATCC 9.341 and obtained inhibition zone from 11 to 25
mm.
Fernandes et al (2001) studied the antibacterial activity of propolis produced by
Apis mellifera and Brazilian stingless bees and one of their samples was from Melipona
scutellaris from state of Pernambuco (Brazil).This sample showed better activity against
S. aureus, with a MIC 90% value of 230 μg/mL. The MIC 90% values aginst
Enterococcus sp and E. coli were 2.37 mg/mL and 5.33 mg/mL, respectively.
The antibacterial activity of stingless bee propolis was found similar to that of
honeybee propolis, Meliponinae propolis was active against Gram-positive
microorganisms and less active or inactive against Gram-negative ones (BANKOVA et
al, 2007).
Cytotoxic assay
Crude extract was tested for its antiproliferative activity in a panel of tumor cells
lines and TGI was calculated (Table VII). Doxorrubicina was used as a positive control.
The results are shown in Figure 8 and 9.
Sample
MIC (μg/mL)
Melipona scutellaris Propolis
3.12 – 1.56
Fraction 3
1.56 – 0.78
Green Propolis
50-25
37
Figure 8: Cytotoxic assay for the standard Doxorrubicin.
Figure 8: Cytotoxic assay for the sample of EEPU.
38
Table VII: Total growth inhibition (TGI (μg/mL) – concentration needed to 0% growth. Where: U =
UACC-62, M = MCF-7, A = NCI-ADR/RES, 7 = 786-0, 4 = NCI-H460, P = PC-3, O = OVCAR-3, H =
HT-29, K = K562.
U
M
A
7
4
P
O
H
K
Doxo
0.30
>25
>25
8.81
1.44
1.66
2.73
17.91
0.40
EEPU
19.12
72.45
19.29
28.42
33.06
23.32
27.40
31.05
12.22
EEPU presented a dose dependent activity against all cell line tested and the
standard doxorrubicin presented an activity 10 x higher than EEPU, but the most
interesting result was against NCI-ADR/RES cell line, which is a cell line resistant to
multiple drugs. The crude extract showed better results (19.29 μg/mL) in this cell line
than the standard doxorubicin (>25 μg/mL).
A variety of compounds showing growth inhibitory activity on various tumors
was isolated from propolis produced by Apis mellifera. Compounds isolated from
propolis can act synergistically increasing the activity of tumoricidal drugs (MENEZES,
2005).
According to Bankova and Popova (2007), the potencial cytotoxity of stingless
bee propolis from several species has been studied. Samples from Melipona
quadrifasciata and Nanotrigona testacularis demonstrated toxicity much better than
honeybee propolis and all these propolis samples belonged to the diterpenic type.
Propolis of stingless bee is a promising natural product and need further studies
about chemical constituents.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors would like to thank Mr. José Emídio Borges de Souza for providing
the propolis samples, Unifal-MG and CAPES for the financial support.
39
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