( PDF ) Alta prevalência do subtipo C e da forma recombinante CRF31_BC em portadores do HIV-1 no município de Canoas, Rio Grande do Sul

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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

DIAGNÓSTICO GENÉTICO E MOLECULAR

ALTA PREVALÊNCIA DO SUBTIPO C E DA FORMA

RECOMBINANTE CRF31_BC EM PORTADORES DO HIV-1

NO MUNICÍPIO DE CANOAS, RIO GRANDE DO SUL

Dissertação para obtenção do título de

Mestre em Diagnóstico Genético e

Molecular.

RAFAELA DE CARLI

Orientador: Prof. Dr. VAGNER RICARDO LUNGE

CANOAS

2009

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Rafaela De Carli

Alta Prevalência do Subtipo C e da forma recombinante

CRF31_BC em pacientes portadores do HIV-1 no Município de

Canoas, Rio Grande dos Sul

Dissertação apresentada ao programa de pós-

graduação em Diagnóstico Genético e Molecular, da

Universidade Luterana do Brasil, como requisito

parcial e final para obtenção do grau de Mestre em

Diagnóstico Genético e Molecular, tendo como

orientador o Prof. Dr. Vagner Ricardo Lunge.

Canoas

2009

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Dedico este trabalho aos meus pais pelo incentivo

constante em todos os momentos da minha vida.

Agradeço aos meus pais por terem me

proporcionado à oportunidade de estudar e

entenderem a minha ausência durante o

desenvolvimento deste trabalho.

Ao meu namorado pela compreensão e apoio

constante.

Ao meu orientador pelo permanente incentivo,

paciência e ampliação dos meus conhecimentos.

A todos os meus amigos que de alguma forma

contribuíram para realização deste trabalho.

A Deus por ter me permitido realizar mais uma etapa

para o meu desenvolvimento.

RESUMO

O vírus da imunodeficiência humana – HIV é um retrovírus causador da Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Este retrovírus possui uma ampla variabilidade genética

(devido a altas taxas de mutações e recombinações), sendo classificado em 2 tipos principais

(HIV-1 e HIV-2), diversos subtipos, formas recombinantes circulantes (CRF) e formas

recombinantes únicas (URF). Os grupos e subtipos do HIV-1, especialmente os do grupo M,

estão disseminados pelo mundo inteiro e são responsáveis pela grande maioria dos casos de

AIDS. No entanto, os 9 subtipos deste grupo (A, B, C, D, F, G, H, J e K) e seus principais

CRFs apresentam distribuição variada conforme o país/região, estando associados à

capacidade de disseminação intrínseca do subtipo/CRF e características epidemiológicas

locais. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer a prevalência dos subtipos do HIV-

1 e do principal CRF encontrado previamente no sul do país (CRF31_BC) no Município de

Canoas, Rio Grande dos Sul. Foram seqüenciadas 50 amostras na região dos genes da

protease e da transcriptase reversa. Os resultados obtidos demonstraram uma maior

prevalência do subtipo C (42%), seguido de formas recombinantes BC (CRF31_BC) (40%),

subtipo B (14%) e subtipo F (4%). Não foram encontrados outros subtipos. Estes dados

confirmam a disseminação do subtipo C e da CRF31_BC no município de Canoas.

Palavras Chave: HIV-1 - Subtipos do HIV-1 – Recombinação - Genotipagem.

ABSTRACT

The Human Immunodeficiency Virus – HIV is a retrovirus causative agent of the

Acquired ImmunoDeficiency Syndrome (AIDS). This retrovirus has a wide genetic variability

(due to a high mutation and recombination rate characteristic of HIV), being assorted in two

main types (HIV-1 and HIV-2), subtypes, circulant recombinant forms (CRF) and unique

recombinant forms (URF). The groups and subtypes of HIV-1, especially those from the M

group, have a wide geographic distribution and are associated to the great majority of the

AIDS cases in the world. However, the nine subtypes of the M group (A, B, C, D, F, G, H, J

and K) and its main CRFs present a varied distribution according to the country or region,

being associated with the inherent dissemination capacity of the subtype or CRF and with

local epidemiologic characteristics. The aim of the present study is to establish the prevalence

of the HIV-1 subtypes and the main CRF found in the south of the country (CRF31_BC) in

Canoas city, Rio Grande do Sul. 50 samples had been sequenced in the region of the genes of

protease and reverse transcriptase. The results showed a higher prevalence of subtype C

(42%), followed by the recombinant form BC (CRF31_BC) (40%), subtype B (14%) and

subtype F (4%). Other subtypes were not found. This data confirm the dissemination of the

subtype C and the recombinant form CRF31_BC and in Canoas city.

Keywords: HIV-1 - HIV-1 subtypes – Recombination - Genotyping.

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO .................................................................................................................09

1. Origem e Perspectiva Histórica ...............................................................................09

2. Descrição do agente (HIV) e organização genômica ............................................. 11

3. Replicação viral .........................................................................................................13

4. Classificação ...............................................................................................................14

5. Transmissão ...............................................................................................................15

6. Evolução clínica .........................................................................................................16

7. Tratamento ................................................................................................................18

8. Testes Diagnósticos ...................................................................................................20

8.1 Detecção de anticorpos ......................................................................................21

8.2 Detecção de antígenos.........................................................................................22

8.3 Cultura viral .......................................................................................................22

8.4 Amplificação do genoma do vírus (diagnóstico molecular) ............................23

8.5 Genotipagem .......................................................................................................24

9. Epidemiologia ............................................................................................................25

9.1 Subtipos do HIV e CRFs ...................................................................................27

JUSTIFICATIVA E OBJETIVO ....................................................................................31

METODOLOGIA .............................................................................................................32

1. Caracterização da População Alvo e Coleta das Amostras ...................................32

2. Escolha da região alvo, desenho e síntese dos primers .......................................... 32

3. Extração e Amplificação das amostras ....................................................................35

4. Seqüenciamento .........................................................................................................35

5. Análise das seqüências .............................................................................................36

RESULTADOS .................................................................................................................37

1. Estabelecimento da técnica de amplificação por PCR nested ...............................37

2. Extração e amplificação das amostras de HIV-1 .................................................... 39

3. Seqüenciamento ...........................................................................................................41

4. Alinhamentos e Filogenia .......................................................................................... 41

DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 43

CONCLUSÕES ...................................................................................................................47

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................................48

ANEXO ................................................................................................................................62

INTRODUÇÃO

Até dezembro de 2007, segundo a UNAIDS (2008), o número de pessoas infectadas

com o vírus da imunodeficiência humana (HIV, do inglês “human immunodeficiency virus”)

no mundo era de 33,2 milhões, sendo que 2,5 milhões eram consideradas infecções recentes

ocorridas em 2007 e 2,1 milhões de indivíduos vieram ao óbito no mesmo ano.

No Brasil, estima-se que cerca de 593 mil pessoas estejam contaminadas com o vírus

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007c). Em 2006 o coeficiente de mortalidade por AIDS no país

era de 6,0 óbitos por 100 mil habitantes, sendo que de 1996 a 2006 se observou um aumento

desse índice nas regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste, estabilização na região Sul e redução

na região Sudeste (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007i).

1. Origem e Perspectiva Histórica

Acredita-se que o HIV foi originado do vírus da imunodeficiência símia, ou

simplesmente SIV (do inglês “Simian Immunodeficiency Virus”), que é um retrovírus que

acomete primatas africanos. Todas as variantes do SIV caracterizadas até agora têm a

capacidade de infectar linfócitos T CD4. Recentemente um estudo demonstrou que algumas

infecções começaram antes de 1910 no epicentro da epidemia, que são os países africanos. O

ancestral mais comum do HIV-1 encontrado pertence ao grupo M e coincide exatamente com

o surgimento dos primeiros aglomerados urbanos, o que sugere que o crescimento das cidades

poderia ter facilitado o estabelecimento inicial do vírus e sua conseqüente propagação

(WOROBEY et al., 2008). Portanto, a epidemia da AIDS teve como local de origem o Oeste

Central da África, onde se encontra a maior diversidade de variantes do vírus

(BUONAGURO et al., 2007).

Em meados de 1981 surgiu na cidade de Los Angeles, Califórnia, o relato de 5 casos

de homens homossexuais que apresentavam pneumonia pelo Pneumocystis carinnii (PCP),

um mês mais tarde, apareceram mais 26 casos em Nova York e na Califórnia de homens

homossexuais que apresentavam PCP, sarcoma de Kaposi, outras infecções oportunistas e

disfunção inexplicada do sistema imunológico. Os relatos de casos de pessoas com os

mesmos sintomas continuaram a crescer nos EUA e a conclusão que os especialistas

chegaram era de que se tratava de uma nova doença que ainda não tinha sido classificada e

que a sua etiologia era provavelmente infecciosa e transmissível (DEL RIO & CURRAN,

2001; KAISER FAMILY FOUNDATION, 2008).

Em 1982 os Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC – do inglês

U.S. Centers for Disease Control and Prevention) passaram a utilizar o termo AIDS (do

inglês “Acquired Immune Deficiency Syndrome”) para se referir a doença que tinha quatro

fatores de risco bem definidos: homens homossexuais, usuários de drogas injetáveis, origem

haitiana e hemofílicos (KAISER FAMILY FOUNDATION, 2008). A doença só ficou

conhecida na década de 80, mas em retrospecto podem ter ocorridos casos esporádicos nos

EUA, na Europa e na África até três décadas antes (DEL RIO & CURRAN, 2001).

Em 1983, os pesquisadores franceses Luc Montaigner e Françoise Barre-Sinoussi que

faziam parte da equipe de virologistas do Instituto Pausteur isolaram o HIV-1 de pacientes

com AIDS e descobriram o vírus causador da doença. O reconhecimento veio com o Nobel de

Medicina de 2008, quando esses dois cientistas foram premiados por esta descoberta. Esse

feito havia sido atribuído anteriormente ao americano Robert Gallo. Atualmente o mundo

científico reconhece que este pesquisador e sua equipe tiveram um papel fundamental na

demonstração de que o vírus era realmente o causador da AIDS, mas não participou da

descoberta (SEXOS, PLEXOS SAUDIS, 2008).

Voltando ao ano de 1983, o Serviço Público de Saúde dos EUA (U.S. Public Health

Service) passa a recomendar a prevenção da transmissão do vírus por contato sexual e

transfusão de sangue, ocorre à primeira notificação da doença em crianças e o primeiro caso

no sexo feminino no Brasil (KAISER FAMILY FOUNDATION, 2008; MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2007a). No ano de 1986 o HIV-2 foi identificado e o comitê internacional

recomendou o termo HIV para denominar os agentes etiológicos causadores da AIDS. Neste

mesmo ano, foi criado o Programa Nacional de DSTs (Doenças Sexualmente Transmissíveis)

e AIDS no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007a; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008g).

Em 1987, o órgão oficial do governo norte-americano responsável pela liberação de

alimentos e drogas (FDA do inglês “Food and Drug Administration”) aprova a primeira

droga antiretroviral (a Zidovudina ou AZT, um análogo de nucleosídeo) para o tratamento de

indivíduos infectados pelo HIV. Em 1995, o FDA aprova o primeiro inibidor de protease

(Saquinavir). Em 1996, o Dr. David Ho e sua equipe, após uma série de pesquisas,

demonstram que o uso combinado de drogas (o chamado “coquetel”) é mais eficiente no

controle da multiplicação do HIV, dando início a uma nova era: a da terapia antiretroviral

altamente ativa (HAART, do inglês “Highly Active Anti-Retroviral Therapy”) (MO et al.,

1996). Após a introdução do HAART se observou uma diminuição de 40% das mortes nos

EUA devido a AIDS e um aumento na expectativa de vida dos indivíduos infectados

(KAISER FAMILY FOUNDATION, 2008). Porém é importante lembrar que esta conquista

esteve restrita aos países desenvolvidos e alguns dos considerados em desenvolvimento (entre

os quais o Brasil). Na grande maioria dos locais mais pobres, incluindo praticamente toda a

África, a epidemia da AIDS continuou a aumentar e ser responsável pela grande maioria dos

óbitos (DEL RIO & CURRAN, 2001).

2. Descrição do agente (HIV) e organização genômica

O vírus da imunodeficiência humana – HIV é um retrovírus que pertence à família

Retroviridae e ao gênero Lentivirinae, causador da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

(AIDS). Este retrovírus é composto por duas fitas simples de RNA, que para multiplicar-se e

integrar-se ao genoma do hospedeiro necessita da enzima transcriptase reversa que faz com

que o RNA seja transcrito em DNA.

As partículas virais do HIV, também chamadas de virions, medem aproximadamente

100 a 150nm de diâmetro e possuem um núcleo cônico onde se encontram a enzima

transcriptase reversa, a integrase e as duas cópias idênticas de fitas de RNA que tem um

comprimento de 9-10 Kb. O núcleo é rodeado por proteínas estruturais que formam o

nucleocapsídeo, que por sua vez é protegido por proteínas estruturais da matriz, estas

envolvidas por um envelope lipídico que é produzido pela membrana celular. Na membrana

encontram-se ainda as glicoproteínas transmembrana e de superfície (SCHÜPBACH, 1999;

GRIFFTH et al., 1997).

O genoma do HIV é constituído por genes estruturais (gag, pol e env) e uma

combinação de outros genes considerados genes regulatórios (tat e rev) e acessórios (vif, vpu,

vpr, vpx e nef) (Figura 1). O gene gag é responsável pela codificação da maioria das proteínas

estruturais, o mesmo produz a proteína precursora p55 que é processada para formação das

proteínas que compõe a matriz (p17), o capsídeo (p24) e o nucleocapsídeo (p7 e p6). A região

pol produz as enzimas virais transcriptase reversa (p51 e p66), integrase (p32), protease (p11),

RNase e ribonuclease (GRIFFTH et al., 1997; MYERS et al., 2008). O gene env sintetiza a

glicoproteína precursora gp160 que quando clivada produz a glicoproteína glicosilada externa

gp120 e a glicoproteína transmembrana gp41, a gp120 contém o sítio que o receptor CD4+

dos linfócitos T se liga e a gp41 tem como função facilitar a fusão da membrana viral com a

membrana celular do hospedeiro. As proteínas regulatórias (tat e rev) desempenham papéis

importantes nas fases de transcrição e pós-transcrição do vírus e são essenciais para

propagação viral, enquanto que as proteínas acessórias (vif, vpu, vpr, vpx e nef) em geral, não

são necessárias para a propagação viral em cultura de tecidos, porém alguns experimentos

sugerem que elas desempenham papéis importantes e são fundamentais na regulação do ciclo

viral e na sua patogênisidade (SHAW, 2001; MYERS et al., 2008).

Figura 1: Genoma do HIV-1 e HIV-2. Os genes estruturais (gag, pol e env) estão representados na

cor vermelha, os genes regulatórios (tat e rev) na cor azul e os genes acessórios (vif, vpu, vpr, vpx e

nef) na cor verde (adaptado de Myers et al., 2008).

O HIV possui uma grande capacidade de mutar e se adaptar a diferentes condições do

ambiente humano. A grande variabilidade genética se deve principalmente às altas taxas de

mutações (deleções, inserções, substituições e repetições) e a capacidade de recombinação

(PINTO & STRUCHINER, 2006).

A alta incidência de erros que ocorre no processo de transcrição resulta em mudanças

de um ou mais nucleotídeos durante o ciclo reprodutivo do vírus (REQUEJO, 2006). A taxa

de erro durante um ciclo de replicação, na incorporação de nucleotídeos é de

aproximadamente 10

-3

a 10

-5

por sítio (PINTO & STRUCHINER, 2006). O HIV-1 possui

aproximadamente 10 mil pares de bases em seu genoma, e a cada ciclo de replicação ele

adquire em média uma substituição de nucleotídeo, sendo assim é possível imaginar a grande

diversidade de partículas virais geradas ao longo do curso da infecção (OVERBAUGH &

BANGHAM, 2001; PINTO & STRUCHINER, 2006).

A recombinação ocorre com muita freqüência nos retrovírus. Esse processo necessita

que uma célula tenha sido infectada em algum momento por 2 ou mais HIVs diferentes.

Nestes casos a enzima transcriptase reversa, durante o processo de transcrição, pode “saltar”

de uma fita de RNA para outra produzindo uma fita de DNA viral que contém partes das duas

fitas iniciais de RNA (HU & TEMIN, 1990; ZHUANG et al., 2002; PINTO &

STRUCHINER, 2006).

3. Replicação viral

Após a entrada no organismo, o HIV infecta principalmente os linfócitos T,

macrófagos, células dendríticas e outras células apresentadoras de antígenos, pois essas

células possuem em sua superfície os receptores CD4+ que interagem com a glicoproteína

gp120 presente na superfície do HIV, provocando mudanças conformacionais que faz com

que o vírus interaja com outros co-receptores celulares, CXCR4 (nos linfócitos T) ou CCR5

(nos macrófagos) (SCHÜPBACH, 1999; GRIFFITH et al., 2007).

Ocorrida à fusão do vírus com a célula hospedeira e as mudanças conformacionais, o

mesmo entra na célula e libera o seu material genético (RNA). Já dentro da célula, a

transcriptase reversa (TR) é clivada e ativada por outra enzima viral: a protease. Após ativa, a

TR converte o RNA viral em DNA complementar (cDNA), essa enzima também é

responsável pela degradação do RNA após sintetizar a fita de cDNA e pela duplicação da

mesma. Ainda na fita de RNA existem duas regiões regulatórias localizadas no final de ambos

os lados (R-U5 no final da extremidade 5´ e R-U3 no final da extremidade 3´), essas regiões

são conhecidas como regiões terminais longas e repetidas (LTRs, do inglês “Long Terminal

Repeats”), e também são transcritas pela TR. O cDNA com as LTRs e mais algumas

proteínas virais é chamado de complexo pré-integração, que migra até o núcleo da célula

hospedeira e se integra em seu DNA com a ajuda de uma enzima retroviral específica, a

integrase. Quando essa integração acontece o genoma da célula passa a ser chamado de pró-

vírus (SCHÜPBACH, 1999).

O material genético do pró-vírus vai ser transcrito e produzirá o RNA viral. O

processo de transcrição é regulado por proteínas virais conhecidas como tat, rev, nef e vpr. As

proteínas produzidas pelos genes regulatórios tat e rev possuem uma grande influência nas

taxas de replicação viral. As proteínas produzidas pelo gene tat causam um aumento de

transcrição nas LTRs, enquanto que as proteínas produzidas pelo gene rev são responsáveis

pelos “splicings” no RNA e posterior codificação em proteínas virais estruturais (GRIFFITH

et al., 2007). Depois de concluído o processo de transcrição o RNA viral sai do núcleo e, já no

citoplasma, ocorre o processo de tradução do RNA e a síntese de partículas virais que serão

montadas na superfície interna da membrana celular e liberadas para o meio externo por

brotamento, sendo essas partículas ainda imaturas e não infecciosas. Para ocorrer à maturação

dessas partículas, as proteínas virais precursoras gag e gag-pol devem ser clivadas pela

protease em diferentes subunidades, assim essas partículas encontram-se prontas para infectar

outras células do sistema imunológico (SCHÜPBACH, 1999).

Durante o processo de transcrição reversa pode ocorrer a formação de dois tipos de

RNAs recombinantes, os homólogos que são provenientes de moléculas idênticas ou similares

e geram uma molécula igual as que as deu origem e os não homólogos que provem de duas

moléculas diferentes de RNA e por sua vez geram uma nova molécula que difere da original

ou parenteral (COFFIN, 1979; ALEJSKA et al., 2001; BASU et al., 2008). Desta forma, o

processo de transcrição é o momento quando ocorrem as mudanças estruturais do genoma

viral através das recombinações, importantes para adequação do vírus a um novo ambiente,

como por exemplo na presença de drogas antiretrovirais (BASU et al., 2008). Existem vários

pontos de recombinação ao longo do genoma do HIV-1 em que a taxa de recombinação é

extremamente alta, em torno de 2,8 por ciclo de replicação (JETZT et al., 2000; ZHUANG et

al., 2002). De acordo com Jetzt et al. (2000), uma região do vírus que recombina com maior

freqüência, é a região pol no final da fita 5´, aproximadamente 40% das recombinações

ocorrem nessa região quando o HIV encontra-se na fase de pró-vírus. Porém, outro estudo

sugere que as regiões do genoma do HIV onde ocorrem o maior número de quebras, e

conseqüente recombinação, são as duas extremidades do gene env, provavelmente devido ao

fato desse gene ser transferido para o outro genoma quase de forma intacta (RAMIREZ et al.,

2008).

4. Classificação

O HIV é classificado em dois tipos: HIV-1 e HIV-2. O tipo 1 é considerado mais

agressivo e principal responsável pela pandemia da AIDS, enquanto que o tipo 2 é menos

patogênico e ocorre somente em algumas regiões da África Central e Ocidental

(SCHÜPBACK, 1999, SHARP et al., 2001; REQUEJO, 2006; HIV SEQUENCE

DATABASE, 2008a). O HIV-1 é dividido em três grupos distintos: M, O e N. O grupo M é o

maior deles, composto por 9 subtipos nomeados pelas letras A, B, C, D, F, G, H, J e K (os

subtipos A e F ainda possuem os sub subtipos A1 e A2 e F1 e F2) disseminados pelo mundo

inteiro. O grupo O (do inglês “outlier”) é menos comum e endêmico não sendo dividido em

subtipos, mas sim em 5 conjuntos filogenéticos classificados por números romanos de I a V,

todos com ocorrência restrita ao Oeste Central da África. O grupo N (do inglês “new” – novo)

forma uma linhagem independente próxima filogeneticamente ao SIV e é raramente

encontrado (PINTO & STRUCHINER, 2006; REQUEJO, 2006).

Além dos subtipos, é comum encontrar formas recombinantes de 2 ou mais subtipos e

que podem ser classificadas em Únicas ou Circulantes. Um isolado de HIV é considerado uma

forma recombinante única (ou URF, do inglês “Unique Recombinant Form”) quando, após

análise da seqüência nucleotídica, esta apresenta estrutura de mosaico formada por 2 ou mais

subtipos e não se assemelha a de nenhum subtipo ou forma recombinante circulante (ou CRF,

do inglês “Circulating Recombinant Form”) previamente descrito. Quando mais de três

subtipos estão envolvidos em um mesmo recombinante, este é denominado como “cpx” (do

inglês “complex”) (ROBERTSON, et al., 2008). Estas formas, em geral, são encontradas em

indivíduos isolados e não se disseminam na população. O CRF, por sua vez, é um

recombinante que originalmente era uma URF mas que, devido a uma significativa taxa de

disseminação em uma determinada população, passou a ser considerada como circulante.

URFs e CRFs são gerados continuamente em locais onde a epidemia está se propagando (HU

& TEMIN, 1990). Especificamente os CRFs são nomeados e identificados por um código

com números e letras que indicam a ordem de descoberta e os subtipos envolvidos, (Ex:

CRF31_BC – 31

CRF descoberto que é um recombinante BC). Até o momento já foram

descritos 43 CRFs na literatura (REQUEJO, 2006; HIV SEQUENCE DATABASE, 2008b;

LEITNER et al., 2008; ROBERTSON et al., 2008).

5. Transmissão

A forma mais comum de transmissão do HIV é por contato sexual, devido à

sensibilidade da mucosa genital e anal a fluidos de sangue, sêmen e secreção vaginal de

indivíduos infectados (SCHÜPBACK, 1999; DEL RIO & CURRAN, 2001; SAAG, 2001;

GRIFFITH et al., 2007). Mas também pode ocorrer pela transfusão de sangue, instrumentos

não esterilizados perfuro-cortantes, seringas e agulhas compartilhadas, sendo essa última

forma de contágio mais freqüente em usuários de drogas injetáveis (DEL RIO & CURRAN,

2001; SAAG, 2001).

Outra via de transmissão do HIV é a perinatal, que ocorre quando a mãe infectada

passa o vírus para o filho durante a gravidez, o parto ou na amamentação (SCHÜPBACK,

1999; DEL RIO & CURRAN, 2001; GRIFFITH et al., 2007). Entretanto, essa forma de

contágio tem diminuído muito desde a introdução do tratamento antiretroviral que é utilizado

na mãe durante a gestação, juntamente com a restrição a amamentação após o nascimento da

criança (GRIFFITH et al., 2007).

Devido às rotas comuns de transmissão do HIV, HBV (hepatite B) e HCV (hepatite C)

tem sido observada uma alta incidência de casos de co-infecção. A transmissão parenteral é

mais observada no HCV, enquanto a via sexual é mais eficiente para a transmissão do HIV

(MENDES-CORREA et al., 2001; SILVA & BARONE, 2006; TOVO et al., 2006; TOVO et

al., 2007). Os indivíduos com AIDS e com hepatite C possuem comprovadamente uma

sobrevivência menor do que os que são infectados apenas pelo HIV (MARINS et al., 2005).

No caso do HBV, estudo realizado nos EUA demonstrou aumento significativo de mortes

relacionadas a complicações hepáticas em pacientes co-infectados em relação à mono-

infecção pelo HIV (THIO et al., 2002).

6. Evolução clínica

De acordo com O Ministério da Saúde (2007g), a infecção pelo HIV possui quatro

fases clínicas:

A fase 1 é a infecção aguda ou primaria que ocorre entre 5 e 30 dias após o contato

com o vírus e durante a qual o diagnóstico clínico difícil devido à falta de manifestações

clínicas. Essa fase caracteriza-se por apresentar viremia elevada e resposta imune intensa

(CENTLIVRE et al., 2007; GRIFFITH et al., 2007). Durante o pico de viremia, o número de

linfócitos T CD4+ diminuem rapidamente enquanto os linfócitos T CD8 aumentam, refletindo

uma resposta T citotóxica potente. Posteriormente o número de linfócitos T CD4+ aumentam

porém não chegam a retornarem aos níveis prévios à infecção. A diminuição da contagem dos

linfócitos T CD4+, de 30 a 90 células por ano (o número normal é de 600 a 1.200 células

CD4/mm

), tem uma relação direta com a velocidade da replicação viral e com a progressão

para AIDS (GRIFFITH et al., 2007).

Quando o sistema imunológico encontra-se em grande atividade nos picos de viremia

é que as manifestações clínicas aparecem, podendo variar em intensidade, indo desde gripes

até uma síndrome que se assemelha à mononucleose. Outros sintomas de infecção viral que

podem aparecer nessa fase são: febre, faringite, cefaléia, ulcerações muco-cutâneas (na

mucosa oral, esofágica e genital), náusea, vômito, perda de peso, etc (SCHÜPBACH, 2005;

GRIFFITH et al., 2007). Em média, os sintomas duram em torno de 14 dias, sendo que a

persistência por mais de 14 dias parece estar associada a uma evolução mais rápida pra AIDS.

A fase 2 é chamada de assintomática ou latência clínica. O estado clínico básico do

portador do HIV é mínimo ou inexistente, ou seja, o paciente não apresenta qualquer sintoma

(SCHÜPBACH, 2005; GRIFFITH et al., 2007). Essa etapa de latência do vírus é

caracterizada pela interação do sistema imunológico com as rápidas e constantes mutações do

vírus, mantendo um equilíbrio de amadurecimento e morte (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2008e). Nesta fase também ocorre um aumento gradual da carga viral e uma diminuição

irreversível no número de células T CD4+ (CENTLIVRE et al., 2007).

Na fase 3, denominada sintomática inicial, o portador apresenta sinais e sintomas

inespecíficos e de intensidade variável, tais como sudorese noturna, emagrecimento, fadiga e

trombocitopenia (anormalidade hematológica), bem como processos oportunistas de menor

gravidade, principalmente na pele e nas mucosas. Os processos oportunistas mais comuns são:

candidíase oral e vaginal, gengivite, úlceras aftosas, diarréia, sinosopatias, herpes simples e

recorrentes, herpes Zoster e leucoplasia pilosa oral (espessamento epitelial benigno).

A fase 4 é a AIDS, mas também é chamada terminal ou final, e caracteriza-se por uma

redução crítica dos linfócitos T CD4+, chegando a menos de 200 unidades por mm

de sangue

(GRIFFITH et al., 2007). Devido à debilidade do sistema imunológico do hospedeiro é nesta

fase que começam a aparecer às doenças oportunistas típicas como tuberculose, pneumonia,

diarréia persistente, dores de cabeça, febre, náuseas, vômitos falta de coordenação, fadiga

extrema, perda de peso, tumores, entre outras (CONSTANTINE & ZINK, 2005;

MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008d; GRIFFITH et al., 2007).

Atualmente, é mais difícil encontrar um portador de HIV com AIDS, devido à

eficiência da terapia antiretroviral em evitar as principais infecções oportunistas causadas pela

imunodepressão. Porém, a terapia não consegue eliminar as complicações clínicas pela

presença dos vírus relacionados às hepatites, pelo contrário, as hepatites B e C tornaram-se

gradativamente as principais causas de mortalidade entre os pacientes infectados pelo HIV

(ROCKSTROH, 2006).

7. Tratamento

O Brasil é reconhecido mundialmente na luta contra a AIDS, pois foi o primeiro país a

fornecer gratuitamente o acesso ao tratamento antiretroviral a todos os pacientes infectados

(BRITO et al., 2005; CHEQUER et al., 2005). As drogas utilizadas na terapia antiretroviral

(HAART) têm causado um grande impacto sobre a história natural da infecção pelo HIV,

mostrando significativo decréscimo nos índices de mortalidade e aumentando a expectativa e

a qualidade de vida dos indivíduos infectados (BASTOS & SZWARCWALD, 2000;

LEWDEN et al., 2004; BRITO et al., 2005).

Existem hoje 17 tipos de medicamentos que podem ser divididos em quatro classes: os

inibidores de protease (bloqueiam a ação da enzima protease impedindo com isso, a produção

de novas cópias de células infectadas); os inibidores de fusão (fazem com que o vírus não

consiga entrar na célula); os inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos ou

nucleotídeos (inibem a atividade da enzima transcriptase reversa, os nucleotídeos se integram

à cadeia de DNA viral e a tornam defeituosa impedindo assim a reprodução viral) e os

inibidores de transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos (fazem o bloqueio direto da

ação da enzima transcriptase reversa) (YARCHOAN & BRODER, 2001; MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2008f). Para potencializar a terapia antiretroviral e combater o HIV com eficiência

faz-se necessária a utilização de no mínimo dois medicamentos de classes diferentes, sendo

que a maioria dos pacientes utiliza três a quatro drogas combinadas (MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2008f).

O início da terapia antiretroviral é definido por parâmetros laboratoriais e clínicos,

como a contagem de células T CD4+, a carga viral e a presença de sinais clínicos de

imunodeficiência (incluindo os processos oportunistas). Conforme os principais órgãos de

regulamentação norte-americanos e britânicos (US Department of Health and Human

Services, International AIDS Society-USA e British HIV Society) recomenda-se começar o

tratamento em pacientes assintomáticos quando a contagem de células T CD4+ for inferior a

200cells/µL (GALLANT, 2008). No Brasil, o tratamento tem sido indicado já quando o

número de células T CD4+ for inferior a 500cells/ µL ou a carga viral estiver acima de

10.000-30.000 cópias de RNA/ml (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008e).

A eficácia do tratamento anti-retroviral pode ser observada basicamente por três

aspectos: evolução da carga viral, contagem de linfócitos T CD4+ e ocorrência de eventos

clínicos. É considerada falha virológica quando não ocorre a manutenção da carga viral a

níveis indetectáveis, considerando-se carga viral acima de 400 partículas virais/ml após 24

semanas ou acima de 50 partículas virais/ml após 48 semanas de tratamento (GALLANT,

2007; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008h). A falha imunológica caracteriza-se por um

declínio progressivo na contagem dos linfócitos T CD4+ e quando a redução for maior do que

25% deve-se suspeitar de falha imunológica (TURNER et al., 1994). Considera-se falha

clínica quando o paciente começa a apresentar infecções oportunistas e tumores. Em geral, as

três falhas (virológica, imunológica e clínica) não costumam aparecer simultaneamente

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008h).

A falha virológica acarreta prejuízos imunológicos e clínicos além de conferir

resistência viral a drogas, e conseqüente, diminuição nas opções das mesmas para futuras

opções terapêuticas. Pode ocorrer um acúmulo de mutações de resistência caso haja

manutenção dos antiretrovirais em presença de carga viral detectável (MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2008h). Um estudo mostrou que o índice é de 1,61 mutações por ano por pessoa

(NAPRAVNIK et al., 2005). Quando a viremia é persistente durante um ano, ocorre a perda

de opção de pelo menos uma droga em 30% dos pacientes (HATANO et al., 2006). De acordo

com Murri et al. (2006), o tratamento mais longo com drogas antiretrovirais e supressão viral

a níveis indetectáveis parecem estar relacionados a uma proteção do paciente contra a

progressão clínica.

Em caso de mudança terapêutica, sugere-se que os exames sejam realizados em

intervalos menores (a cada mês) e que seja feita a genotipagem viral, a fim de investigar se o

paciente apresenta resistência a algum tipo de medicamento (HAMMER et al.; 2006;

MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008e).

8. Testes Diagnósticos

Segundo o Ministério da Saúde (2008g), existem basicamente 4 grupos de testes para

detecção da infecção pelo HIV: detecção de anticorpos, detecção de antígenos, cultura viral e

amplificação do genoma do vírus (ou diagnóstico molecular).

Independentemente do tipo de teste, todos os laboratórios (sejam eles privados,

públicos ou conveniados ao Sistema Único de Saúde - SUS) devem adotar obrigatoriamente

uma série de procedimentos seqüenciados para o diagnóstico inicial de infecção pelo HIV

(Figura 2), de acordo com a Portaria 59/GM/MS, de 28 de Janeiro de 2003 (MINISTÉRIO

DA SAÚDE, 2008h).

Figura 2: Fluxograma para detecção de anticorpos anti-HIV em indivíduos com idade acima de dois anos

(recomendado acima de 18 meses) (adaptado do MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008h).

8.1 Detecção de anticorpos

Os principais testes de detecção de anticorpos são ELISA, imunofluorescência,

Western blot e Radioimunoprecipitação.

- ELISA: é o teste mais utilizado no diagnóstico sorológico do HIV devido ao grande número

de amostras que podem ser processadas ao mesmo tempo com alta sensibilidade e custo

relativamente baixo (CONSTANTINE & ZINK, 2005; FEARON, 2005). O princípio do teste

consiste na utilização de antígenos virais (proteínas) que podem ser produzidos tanto por

cultura células (testes de primeira geração) quanto por tecnologia molecular (recombinantes),

esses antígenos encontram-se fixados ou adsorvidos em cavidades de uma placa de plástico

onde será adicionada a amostra de plasma ou soro do paciente. As próximas etapas do teste

consistem na adição de diferentes tipos de reagentes, se na amostra estiverem presentes

anticorpos contra o HIV, os mesmos se ligarão aos antígenos presentes no fundo da placa e

produzirão uma reação corada. Em caso de resultado positivo é indicada a realização de testes

adicionais confirmatórios (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008g).

- Imunofluorescência indireta: é utilizado como teste confirmatório. O antígeno do vírus é

fixado a uma lâmina de microscópio que será incubada com a amostra do paciente (soro ou

plasma). Após essas lâminas serão tratadas com um soro que contém anticorpos específicos

para imunoglobulina humana (anti-Ig) conjugados a um fluorocromo. A leitura é feita através

de um microscópio de fluorescência (CONSTANTINE & ZINK, 2005; GRIFFITH et al.,

2007; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008g).

- Western-blot: é o teste mais comumente utilizado como confirmatório. É bastante complexo

e de custo elevado, porém apresenta alta especificidade e sensibilidade. Brevemente, uma

membrana de nitrocelulose que possui as proteínas virais separadas por eletroforese é

colocada em contato com o soro do paciente pra que ocorra uma reação antígeno-anticorpo.

Essa reação será detectada por meio da reação com antiimunoglobulina humana conjugada

com uma enzima ou radioisótopo. A revelação da membrana é realizada com substrato

cromogênico e o resultado é dado por meio de leitura visual (CONSTANTINE & ZINK,

2005; FEARON, 2005; GRIFFITH et al., 2007; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008g).

- Radioimunoprecipitação: é uma técnica pouco conhecida utilizada para confirmação. Os

anticorpos são detectados a partir de reações que ocorrem com antígenos radioativos, esses

antígenos são provenientes de células infectadas que durante a síntese de proteínas virais são

mantidas em presença de radioisótopos. A reação antígeno-anticorpo produz um precipitado

que se sedimentará, após será dissociado com detergente e analisado por eletroforese em gel

de poliacrilamida (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008g).

Atualmente existem testes rápidos baseados em imunocromatografia e fluxo lateral

que detectam em menos de 30 minutos os anticorpos contra o HIV presentes no sangue do

paciente. Apresentam muitas vantagens, pois são de simples manuseio sendo dispensado os

equipamentos laboratoriais e a atuação de profissionais especializados, e o paciente fica

sabendo do resultado no momento da consulta e pode ter assistência imediata (SCHÜPBACH,

1999; CONSTANTINE & ZINK, 2005). Esses testes já são utilizados em paises

desenvolvidos e também no Brasil, principalmente quando se precisa fazer rastreamento de

grandes populações, estudos de campo e para decisões terapêuticas em situações de

emergência, como por exemplo, em maternidades (CONSTANTINE & ZINK, 2005;

MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008g).

8.2 Detecção de antígenos

O principal teste de detecção de antígenos realiza a pesquisa da proteína p24,

possibilitando a quantificação desta no plasma ou no sobrenadante de cultura de tecidos. Esta

proteína encontra-se no plasma dos indivíduos HIV – positivos durante todo processo

infeccioso, mas a prevalência é maior antes da soroconversão (positivação da sorologia para o

HIV) e nas fases mais avançadas da doença. A pesquisa de antígeno p24 é realizada mediante

a utilização da técnica de ELISA (FEARON, 2005; GRIFFITH et al., 2007; MINISTÉRIO

DA SAÚDE, 2008g).

8.3 Cultura viral

A cultura viral foi inicialmente utilizada para caracterização do HIV como sendo o

agente causador da AIDS. As culturas são realizadas a partir de células mononucleares de

sangue periférico e são consideradas positivas quando no sobrenadante for detectada a

atividade da enzima transcriptase reversa, produção do antígeno p24 ou ainda evidência de

formação sincicial, que são células gigantes multinucleadas (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2008g).

8.4 Amplificação do genoma do vírus (Diagnóstico Molecular)

Os testes de amplificação do genoma do vírus são utilizados para detecção e

quantificação do HIV-1. Esses testes são muito importantes para que ocorra o

acompanhamento da evolução da doença e monitoramento da eficácia do tratamento

antiretroviral (YARCHOAN & BRODER, 2001; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008g). Todos

os testes moleculares apresentam em comum três etapas, que incluem preparação da amostra e

extração dos ácidos nucléicos virais; amplificação da seqüência de interesse dos ácidos

nucléicos e detecção do produto amplificado (CONSTANTINE & ZINK, 2005). As 3

principais tecnologias são: PCR, NASBA e bDNA.

- PCR ( “Polymerase Chain Reaction” ou Reação em Cadeia da Polimerase): esta técnica

consiste na desnaturação da fita dupla de DNA em altas temperaturas (acima de 90ºC),

anelamento de primers específicos para região que se deseja amplificar em temperaturas mais

baixas (entre 50-72ºC) e síntese da nova fita de DNA através da enzima Taq polymerase em

uma temperatura intermediária (72ºC). Esse processo se repete em torno de 30 a 40 ciclos

com o objetivo de originar bilhões de cópias do DNA de interesse. Para avaliar o RNA viral é

utilizada a técnica de RT-PCR (RT do inglês “Reverse transcription”) quando a enzima

transcriptase reversa faz a síntese de um cDNA (DNA complementar) que será submetido ao

processo regular de PCR (SCHÜPBACH, 1999; CONSTANTINE & ZINK, 2005). Existem

também os testes de PCR e RT-PCR em tempo real, que apresentam algumas vantagens sobre

a PCR e RT-PCR tradicionais como maior especificidade, sensibilidade, rapidez no

diagnóstico e permitem que a amplificação possa ser avaliada no momento em que está

ocorrendo, ou seja em tempo real (BUSTIN, et al., 2005; DOMIATI-SAAD &

SCHEUERMANN, 2006; GUNSON, et al., 2006). Kits com estes testes são comercializados

por diversas empresas, tais como a “Roche Diagnostic Systems” que comercializa os kits

“Amplicor HIV-1 Monitor

versão 1.5” (Amplicor Monitor) e o “Cobas Amplicor HIV-1

Monitor

versão 1.5” (Cobas Amplicor) e a empresa “Abbott Molecular” que comercializa o

kit “LCx

HIV-1 RNA Quantitative assay” (LCx). Alguns laboratórios a fim de diminuir

custos desenvolveram as suas próprias técnicas (DOMIATI-SAAD & SCHEUERMANN,

2006).

- NASBA (“Nucleic Acid Sequence-Based Amplification” ou Amplificação Seqüencial de

ácidos nucléicos): esta técnica procura imitar o processo do ciclo de replicação retroviral,

portanto o seu produto final é o RNA. Para amplificação do RNA viral é utilizado um primer

para síntese de um cDNA, este, será transcrito em RNA que posteriormente através de vários

ciclos de repetição será amplificado. A amplificação do RNA viral ocorre através de um

procedimento isotérmico multienzimático mediado por 3 enzimas a transcriptase reversa,

RNase H e RNA polimerase dependente de DNA (SCHÜPBACH, 1999; CONSTANTINE &

ZINK, 2005).

- bDNA (“branched DNA” ou DNA ramificado): neste teste as partículas virais são rompidas

através de um detergente e da enzima proteinase K, liberando o RNA viral, portanto o mesmo

não requer um processo de purificação e com isso, reduz a possibilidade de contaminação.

Após a liberação, o RNA viral será capturado e se hibridizará a regiões específicas que

contém diferentes seqüências do gene pol, localizadas em micro poços de onde partem

prolongamentos de captura. Ocorre amplificação em todas as regiões híbridas formando um

complexo chamado de DNA ramificado ou bDNA. Por fim, a enzima fosfatase alcalina se

hibridizará a todas as ramificações e a detecção será realizada por quimioluminescência

(SCHÜPBACH, 1999; CONSTANTINE & ZINK, 2005; TSONGALIS, 2006; GRIFFITH et

al., 2007).

8.5 Genotipagem

Existem testes de genotipagem para determinar os subtipos (A, B, C, D, etc.) e para

verificar a resistência do HIV as drogas anti-retrovirais. Os testes para determinação do

subtipo não apresentam aplicação clínica, mas ajudam a monitorar as mudanças na epidemia,

possibilitando conhecer a prevalência dos genótipos nas diferentes regiões geográficas. Já os

testes de genotipagem consistem em uma ferramenta muito importante para detecção de

resistência do HIV a drogas utilizadas na terapia antiretroviral, pois auxiliam na escolha dos

medicamentos que terão maior êxito na supressão viral (GRIFFITH et al., 2007). Os testes

genotípicos mais utilizados são o ensaio de mobilidade do heteroduplex (HMA, do inglês

“Heteroduplex mobility assay”) e o seqüenciamento.

O HMA consiste em fazer uma desnaturação do DNA em temperaturas mais altas

(acima de 90ºC) e um posterior anelamento em temperaturas mais baixas (entre 50-72ºC)

como na técnica de PCR, formando fitas parciais e complementares de DNA. A variação nas

seqüências é determinada pela mobilidade reduzida do DNA em eletroforese, comparando

com seqüências de referências para determinação dos genótipos. Este teste tem sido

recomendado para a identificação de subtipos (DELWART et al., 1995).

O seqüenciamento envolve a análise parcial ou total do genoma do HIV. Para

realização do seqüenciamento primeiramente faz-se necessário à amplificação do RNA viral

pela técnica de RT-PCR, após, o produto da amplificação será submetido a um

seqüenciamento, onde será obtido e traduzido em ordem a seqüência de aminoácidos do gene

de interesse. Em posse das seqüências é preciso fazer um alinhamento e edição das mesmas,

para posteriormente comparar com a seqüência do tipo selvagem do vírus e determinar com

isso, o subtipo que vírus representa e as mutações que ele sofreu ao longo do tempo

(GRIFFITH et al., 2007). Este teste é normalmente utilizado tanto para identificação de

subtipos como para análise de resistência a drogas.

9. Epidemiologia

Atualmente, a estimativa do número de pessoas que vivem com HIV no mundo é de

38,6 milhões (World Health Orgazization – WHO, 2008). O número de casos conhecidos

eram bem menores nos anos 80 e início dos 90, perfazendo um total de 1,7 milhões de casos

de Aids em 1987 (DEL RIO & CURRAN, 2001). Em 1997, A Organização Mundial da Saúde

(OMS) e o Programa de AIDS das Nações Unidas (UNAIDS) calcularam que mais de 30

milhões de pessoas no mundo estavam contaminadas pelo HIV, sendo que a grande maioria

vivia em países desenvolvidos e não sabia que estava infectada. Dados recentes publicados

pela UNAIDS (2008) demonstram que em 2007 33,2 milhões de pessoas estavam

contaminadas pelo vírus (Figura 3), e 2,1 milhões vieram a óbito, sendo que 76% destas

pertenciam à região da África Subsariana. Esta região da África é a mais afetada

mundialmente, sendo a AIDS considerada a primeira causa de morte entre os africanos.

Figura 3: Estimativa de adultos e crianças que viviam com HIV no ano de 2007 (adaptado de

UNAIDS, 2008).

De acordo com o Boletim Epidemiológico divulgado pelo Ministério da Saúde

(2008i), no Brasil foram notificados 506.499 casos de AIDS de 1980 a junho de 2008, sendo

que 205.409 vieram a óbito até 2007. Esses números demonstram que a taxa de incidência de

pessoas infectadas pelo vírus, ainda está em um patamar elevado (19,5 casos por 100 mil

habitantes) no país, devido basicamente a uma tendência do crescimento persistente entre

mulheres (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007b). Em relação à variável sexo, de 1980 a junho

de 2008 foram identificados 333.485 casos de Aids no sexo masculino e 172.995 nos sexo

feminino. A razão de sexo no país vem diminuindo com o passar dos anos, em 1986 a razão

era de 15 homens para cada mulher infectada, em 2006 essa razão era de 1,5 homens para

cada mulher infectada (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008i). Esses dados podem ser

confirmados por uma pesquisa realizada em Mato Grosso que demonstrou que mulheres

monogâmicas HIV-positivas eram a maioria dentro da amostra de indivíduos analisados,

confirmando dados de outras pesquisas brasileiras que apontam que a maioria das portadoras

pesquisadas tem baixo nível sócio-econômico e de escolaridade (BRITO et al., 2005;

ORIONE et al., 2006). O aumento no número de mulheres contaminadas veio acompanhado

de um aumento nos casos de crianças infectadas por meio da via de transmissão vertical

(ORIONE et al., 2006). Dados adicionais demonstram que tem ocorrido uma estabilidade da

infecção em mulheres de 13 a 24 anos, entretanto em todas as outras faixas etárias se observa

um crescimento persistente

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007b).

A epidemia tem apresentado um declínio acentuado em crianças menores de 5 anos e

no sexo masculino, mostrando redução de incidência nas faixas etárias de 13 a 29 anos e

crescimento nas faixas posteriores, principalmente a partir dos 40 anos. Pode-se observar

também, em relação ao sexo masculino, uma estabilização nos casos de transmissão entre

homo/bissexuais, com aumento proporcional em heterossexuais, e com redução aparente e

persistente redução nos casos de usuários de drogas injetáveis (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2007b; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008i). Alguns estudos sugerem também a pauperização

e feminilização da epidemia (BASTOS & SZWARCWALD, 2000; BRITO et al., 2005;

ORIONE et al., 2006).

9.1 Subtipos do HIV e CRFs

O conhecimento da epidemiologia dos subtipos do HIV-1 e dos CRFs tem se tornado

cada vez mais importante para o monitoramento da AIDS no mundo, pois ocorrem diferenças

significativas de prevalência de região para região (REQUEJO, 2006). Os subtipos do grupo

M e respectivos CRFs são os que se encontram mais difundidos mundialmente e são

responsáveis pela maior parte das infecções (Tabela 1) (LAL et al., 2005).

Tabela 1 - Distribuição dos subtipos do HIV-1 e dos CRFs de acordo com os continentes.

CONTINENTES SUBTIPOS CRFs

América do Norte B Nenhum CRF identificado até o momento.

América Central B, C, G

CRF18_cpx, CRF19_cpx, CRF20_BG,

CRF23_BG, CRF24_BG.

América do Sul B, F, C

CRF02_AG, CRF12_BF, CRF16_A2D,

CRF17_BF, CRF28_BF, CRF29_BF,

CRF31_BC, CRF38_BF, CRF39_BF,

CRF40_BF.

Europa B, A, F, G

CRF03_AB, CRF04_cpx, CRF14_BG,

CRF32_06A1, CRF42_BF.

Ásia B, A, C

CRF01_AE, CRF02_AG, CRF07_BC,

CRF08_BC, CRF15_01B, CRF16_A2D,

CRF33_01B, CRF34_01B, CRF35_AD.

África

B, A, C, D, F, G, H,

J, K

* inclusive o Grupo O e o

HIV-2

CRF02_AG, CRF05_DF, CRF06_cpx,

CRF09_cpx, CRF10_CD, CRF11_cpx,

CRF13_cpx, CRF16_A2D, CRF18_cpx,

CRF21_A2D, CRF22_01A, CRF25_cpx,

CRF26_AU, CRF27_cpx, CRF30_0206,

CRF36_cpx, CRF37_cpx, CRF43_02G.

Oceania

B Nenhum CRF identificado até o momento.

Fonte: HIV Sequence Database, 29 out. 2008b.

Em geral, todos os grupos e subtipos do HIV podem ser encontrados na África, que é o

continente onde o vírus se originou (COLVEN, 2006; VAN HEUVERSWYN & PEETERS,

2007). A distribuição nos demais continentes e países é variada. O subtipo B é considerado

responsável pela primeira epidemia causada na Europa, América do Norte, Austrália e centros

metropolitanos de outros continentes, sendo o mesmo predominante em diversos países da

América do Sul, tais como Brasil, Peru, Paraguai, Bolívia, Equador e Chile (MORGADO et

al., 1998; SCHÜPBACH, 1999; RUSSELL et al., 2000; ROSSINI et al., 2001; GADELHA et

al., 2003; RIOS et al., 2003; MONTANO et al., 2005; BELLO et al., 2006; CABRAL et al.,

2006; EYER-SILVA & MORGADO, 2006; HEENEY et al., 2006; SANTOS et al., 2007;

STEFANI et al., 2007; SÁ-FERREIRA et al., 2007). Já no Uruguai e na Argentina ocorre

uma prevalência maior do subtipo F, também presente no Brasil (MORGADO et al., 1998;

ROSSINI et al., 2001; GADELHA et al., 2003; MONTANO et al., 2005; BELLO et al., 2006;

CABRAL et al., 2006; SABINO et al., 1996; STEFANI et al., 2007). O subtipo C pode ser

encontrado na África, Ásia e na América Latina, sendo que 50% das infecções no mundo todo

correspondem a esse subtipo (RODENBURG et al., 2001; ROSSINI et al., 2001;

ESMERALDA et al., 2003; SOARES et al., 2003b; LAL et al., 2005; KANDATHIL et al.,

2005; SALEMI et al., 2005; SOARES et al., 2005; CABRAL et al., 2006; SANTOS et al.,

2006; BUONAGURO et al., 2007; STEFANI et al., 2007; SANTOS et al., 2007).

Estudos realizados no Brasil, a maioria na década passada, demonstraram que o

subtipo B era mais prevalente na maior parte das regiões, seguido pelos subtipos F e C, com

poucos casos identificados do subtipo D e A (MORGADO et al., 1998; PINTO et al., 1998;

COUTO-FERNANDEZ et al., 1999; TANURI et al., 1999b; BONGERTZ, et al., 2000;

GUIMARÃES et al., 2002; BRINDEIRO et al., 2003; GADELHA et al., 2003; DE

QUEIROZ et al., 2007). Neste aspecto, a região Sul do Brasil caracterizou-se como sendo

uma exceção desde os primeiros trabalhos. Principalmente no estado do Rio Grande do Sul,

observou-se uma inversão na prevalência dos subtipos, com maior prevalência do subtipo C

do que o B (BRINDEIRO, et al., 2003; SOARES et al., 2003a; SOARES et al., 2003b;

SOARES et al., 2005; SANTOS et al., 2006; LOCATELI et al., 2007; SANTOS et al., 2007).

Diferentes CRFs são encontrados no mundo todo, mas cada CRF possui como

característica uma maior prevalência em determinado local e/ou região, provavelmente

relacionado à respectiva origem (REQUEJO, 2006). Alguns exemplos de CRFs são o

CRF01_AE que teve origem na África, mas pode ser encontrado também em alguns países da

Ásia (CARR et al., 1996; GAO et al., 1996), o CRF02_AG pode ser encontrado na África

Central e Ocidental e já se encontra difundido pela Europa em países como a Itália, França e

Reino Unido e mais recentemente encontrado no Brasil (CARR et al., 1998; PIRES et al.,

2004; TATT et al., 2004; VACHOT et al., 2004; COUTO-FERNANDEZ et al., 2005;

MONNO et al., 2005; REQUEJO, 2006; EYER-SILVA & MORGADO, 2007). Na China

ocorre uma alta prevalência dos recombinantes CRF07_BC e CRF08_BC, principalmente

entre os usuários de drogas injetáveis (REQUEJO, 2006, MENG et al., 2008). Na América

latina podem ser encontrados diversos CRFs tais como o CRF12_BF que está presente em

países como Brasil, Argentina e Uruguai (THOMSON et al., 2000; CARR et al., 2001;

THOMSON et al., 2002; SANABANI et al., 2006), o CRF28_BF e CRF29_BF com

ocorrência em vários países da América do Sul (DE SÁ FILHO, et al., 2006), o CRF31_BC

encontrado no Sul do Brasil (SANTOS et al., 2007), e mais recentemente os CRF39_BF e

CRF40_BF identificados no estado do Rio de Janeiro (GUIMARÃES et al., 2008).

Diversas evidências sugerem que os principais CRFs presentes no Brasil estão

circulando desde 1980, o que prova que a sua origem não é recente (CARR et al., 2001). Os

primeiros relatos de recombinantes no Brasil foram obtidos em um trabalho realizado com 43

doadores de sangue no Rio de Janeiro, onde foi demonstrada a alta prevalência do subtipo B

(76,7%), enquanto 14% pertenciam ao subtipo F e 9,3% eram mosaicos BF e BD (TANURI et

al., 1999a). Em um estudo que seqüenciou o DNA das regiões gp120 e gp41 do envelope, a

gag p17 e a nef, de 34 amostras provenientes das regiões sul e sudeste do Brasil confirmou a

alta prevalência (26,5%) de formas recombinantes no país (GUIMARÃES et al., 2002). Outro

estudo realizado na cidade de Manaus por Vicente et al. (2000), que apresentou uma alta

prevalência, 14 de 31 amostras (45,16%) eram recombinações entre os subtipos B, C e F. Nos

estados de Mato Grosso, Goiás e Mato Grosso do Sul o recombinante BF representou o

subtipo de segunda maior prevalência nos três estados (STEFANI et al., 2007). A prevalência

destes CRFs parece variar conforme os grupos de risco e gênero. Estudos realizados na

Argentina e Brasil demonstraram que usuários de drogas injetáveis e mulheres apresentaram

maior freqüência do recombinante BF (SABINO et al., 1994; THOMSON et al., 2000;

ESPINOSA et al., 2004).

O CRF31_BC tem apresentado prevalência bastante elevada (11%) na região Sul do

Brasil. O surgimento deste CRF ocorreu nesta região provavelmente logo após a introdução

do subtipo C, sendo a sua idade estimada em 16,9 anos (SANTOS et al., 2006; SANTOS et

al., 2007). Este CRF parece estar disseminando no estado vizinho de Santa Catarina e em

outros países limítrofes da América do Sul tais como Uruguai, Paraguai e Argentina

(RODENBURG et al., 2001; CARRION et al., 2004; AULICINO et al., 2005; SIDDAPPA et

al., 2005; TRIPATHY et al., 2005; BRÍGIDO et al., 2007). Estudo mais recente realizado na

cidade de Porto Alegre demonstrou que em 22 indivíduos HIV positivos, 8 (36,4%) possuíam

subtipo B, 6 (27,3%) subtipo C, 6 (27,4%) apresentavam o recombinante C/B, 1 (4,5%)

possuía o subtipo F e 1 (4,5%) o recombinante B/F (MONTEIRO et al., 2007).

JUSTIFICATIVA E OBJETIVO

Os estudos de prevalência dos subtipos do HIV-1 são fundamentais para o

acompanhamento da evolução da epidemia de AIDS no Brasil. Estes estudos têm sido

realizados com maior freqüência em capitais ou cidades grandes, pois esses locais possuem

uma rede de assistência especializada no atendimento aos portadores do HIV-1. Cidades de

médio e pequeno porte, em geral, não possuem dados epidemiológicos de prevalências dos

subtipos do HIV-1. Especificamente na Região Sul, esta informação seria bastante importante

para monitorar a disseminação do subtipo C e da forma recombinante CRF31_BC.

O objetivo deste trabalho foi estabelecer a prevalência dos subtipos do HIV-1 e dos

CRFs no Município de Canoas, cidade de porte médio do Rio Grande dos Sul localizada na

Região Metropolitana de Porto Alegre.

METODOLOGIA

O presente estudo foi desenvolvido a partir de um projeto maior que se intitula

“Estudo clínico-epidemiológico das co-infecções do HIV com hepatites B e C, HTLV-I e II

na população de um município de porte médio do Rio Grande do Sul (Canoas)” que é

financiado pelo Ministério da Saúde.

1. Caracterização da População Alvo e Coleta das Amostras

A população-alvo deste estudo foram os pacientes adultos, utilizando ou não a terapia

antiretroviral, atendidos no Serviço de Atendimento Especializado (SAE) do município de

Canoas, Rio Grande do Sul. Esta população consiste na totalidade de indivíduos

(aproximadamente 1.000) infectados pelo HIV e diagnosticados pela rede pública no

município de Canoas.

As amostras foram obtidas de 605 pacientes adultos HIV-positivos, atendidos no SAE

e que concordaram em participar do presente estudo pela assinatura do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo I). As amostras foram coletas entre os

meses Julho de 2008 a Janeiro de 2009 e consistiram de uma punção venosa de 10 mL

utilizando EDTA sódico como anticoagulante, após as mesmas foram centrifugadas para

separação do plasma e da papa leucocitária e estocadas à -20ºC. Os dados clínicos de cada

paciente como sexo, idade, tratamento, contagem de células T CD4+ e carga viral foram

obtidos dos prontuários de cada paciente em atendimento no SAE. O estudo foi aprovado pelo

Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos Universidade Luterana do Brasil (ULBRA).

2. Análise comparativa das seqüências e definição dos primers

Seqüências de diferentes subtipos e formas recombinantes circulantes (CRFs) do HIV-

1 foram obtidas a partir do Genebank (Tabela 2):

Tabela 2 - Subtipos e CRFs do HIV-1 com seus respectivos códigos de acesso no Genebank

Subtipo / CRFs Código

A1 AF484509

B K03455 / AY331295 / AY173951 / AY423387

AF067154 /AF067155 / AF110980 / AY727522 /

AY727523 / AY727526 / AY727527 / U46016 /

U52953

D AY371157

F1 AF005494 / AF075703 / AF077336 / AJ249238

F2 AF377956 / AJ249237

G AF061641

H AF190127

J AF082394

CRF07_BC EF420987

CRF31_BC

AY275747 / DQ343983 / EF091932 / EF379185 /

EF393882 / EU529853

CRF12_BF

AF385934 / AF385935 / AF385936 / AF408629 /

AF408630 / AY037279

CRF28_BF DQ085872 / DQ085873 / DQ085874

CRF29_BF DQ085871 / DQ085876 / AY455778

Cada seqüência de nucleotídeos foi editada mantendo apenas a região de interesse para

análise, ou seja, os genes GAG e POL do nucleotídeo 1.800 ao 4.000 (posições conforme a

cepa de referência HXB2). Essas seqüências editadas foram então alinhadas utilizando o

programa SeqAlign (DNAStar, Madison, Wisconsin, USA). Os iniciadores (primers) foram

definidos com base na análise do alinhamento e comparação com trabalhos previamente

publicados (STUYVER et al., 1997; SANTOS et al., 2006). A região escolhida para

amplificação foi dos genes da protease e transcriptase reversa (RT), que estão localizados no

gene pol e é o local onde ocorreu a recombinação para geração do CRF_31BC presente no

estado do Rio Grande do Sul (SANTOS et al., 2006; SÁ-FERREIRA et al., 2007). A tabela 3

demonstra as seqüências dos primers escolhidos e a figura 4 mostra a localização e orientação

dos primers em relação à seqüência da cepa de referência HXB2. Os primers foram

sintetizados pela empresa IDT.

Tabela 3 - Nomes e as seqüências de cada primer utilizado no estudo. Primers

“F” são senso e primers “R” anti-senso.

Primer Seqüências

SBI-11

5´ - AAT GAT GAC AGC ATG YCA GGG - 3´

GHIV-1F

5´ - CCA GAG CCA ACA GCC CCR CCA G - 3´

GHIV-3F*

5´ - GTA CAG TRT TAR TAG GAC CTA CAC CTG TC - 3´

GHIV-5F

5´ - TGA YTT GTA TGT AGG RTC TGA CTT AGA AAT AG - 3´

SBI-12

5´ - CTG SRT AAA TYT GAC TTG CCC - 3´

GHIV-2R

5´ - GGC CAT TGT TTA ACY TTT GGG CCA TCC - 3´

GHIV-4R*

5´ - ATC AGG ATG GAG TTC ATA MCC CAT CCA - 3´

GHIV-6R

5´ - GGA RTC TTT CCC CAT ATT ACT ATG CTT TC - 3´

GHIV-7R

5´ - CTT CCT YTR TCA GTA ACA TAY CCT GC - 3´

* primers adaptados do estudo de Stuyver et al., 1997.

Figura 4: Esquema da localização e do sentido dos primers no HIV-1

3. Extração e amplificação das amostras

Nos experimentos de desenvolvimento e implementação da técnica foram realizados

diferentes protocolos de extração de RNA (a partir das partículas virais presentes no plasma) e

DNA (a partir dos leucócitos das amostras de papa leucocitária) e de amplificação por nested

RT-PCR e nested PCR, respectivamente, até a definição do procedimento de análise. Também

foram testados os diferentes primers sintetizados em variadas combinações, bem como com

diferentes condições de amplificação (temperaturas e concentração salina nas soluções).

Abaixo segue a descrição do procedimento que foi padronizado e utilizada nas amostras dos

16 pacientes avaliados.

As amostras de papa leucocitária dos diferentes pacientes foram descongeladas e

processadas em conjunto com controles positivos e negativos. O DNA total foi extraído a

partir de 0,1 mL da amostra pelo método de fenol-clorofórmio (SAMBROOK et al., 1999). A

primeira amplificação foi realizada utilizando reação de 50µL contendo 1,5mM MgCl

0,05mM d’NTP’s, 0,25µM de cada primer (SBI-11 e GHIV-7R), 1U Taq polimerase, e 2µL

do material extraído. Já a segunda amplificação apresentava volume final de 25µL e continha

1,5mM MgCl

, 0,05mM d’NTP’s, 0,5µM de cada primer (GHIV-3F e GHIV-4R), 1U Taq

polimerase, e 1µL do material da primeira amplificação. Ambas reações foram executadas em

um termociclador ABI Prism 9700 (Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer), utilizando

desnaturação inicial à 94ºC por 3 min e extensão final de 72ºC por 5 min, e os seguintes

programas específicos: 1ª amplificação com 25 ciclos de 94ºC por 15s, 55ºC por 30s e 72°C

por 120s; e 2ª amplificação com 40 ciclos de 94ºC por 15s, 60ºC por 30s e 72°C por 120s.

Os resultados foram avaliados em gel de poliacrilamida 10% corado com nitrato de

prata. Os fragmentos amplificados foram posteriormente seqüenciados para determinação dos

subtipos e das formas recombinantes do HIV-1.

4. Seqüenciamento

O seqüenciamento das amostras foi realizado utilizando o seqüenciador automático

ABI 3130 XL Genetic Analyzer de 16 capilares (36 cm) e polímero POP 7 (Applied

Biosystems). Na primeira reação os DNAs-molde (15 - 30ng) foram marcados utilizando-se

3,2 pmol do primer GHIV-3F (Figura 5) e 4 µL do reagente BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing (Applied Biosystems) em um volume final de 20µL. Na segunda reação as

condições foram as mesmas da primeira, porem o primer utilizado foi o GHIV-4R (Figura 5).

As reações de seqüenciamento foram realizadas em termociclador Veriti 96 well

Thermal Cycler (Applied Biosystems) com uma etapa de desnaturação inicial a 95 ºC por 3

min seguida de 40 ciclos de 95 ºC por 10s, 60 ºC por 240s. Posteriormente, as amostras foram

purificadas pelo protocolo de etanol/EDTA/acetato de sódio e lavagem do pellet com 55µL de

etanol 96%, seguida de lavagem com etanol 70%. Os produtos precipitados foram diluídos em

10µL de formamida Hi-Di, desnaturados a 95 ºC por 2 min, resfriados em gelo por 2 min e

eletroinjetados no seqüenciador automático. Os dados de seqüenciamento foram coletados

utilizando-se o programa Data Collection v1.0.1 (Applied Biosystems) com os parâmetros

Dye Set “Z”. A análise dos eletroferogramas foi realizada através do software Sequencing

Analysis v.5.3.1 (Applied Biosystems) avaliando-se os parâmetros: dado bruto (raw data),

eletroferograma, EPT e valor de qualidade (QV, quality value) das bases seqüenciadas.

5. Análise das seqüências

As seqüências de nucleotídeos de mesma amostra com os primers GHIV-3F e GHIV-

4R foram editadas e montadas em 2 programas: SeqMan (DNAStar, Madison, Wisconsin,

USA) e BioEdit v7.0.9 (Windows 95/98/NT/2000/XP). As seqüências obtidas com cada

montagem foram comparadas estabelecendo-se a seqüência final de cada amostra. As

seqüências de todas as amostras foram então alinhadas com as seqüências dos subtipos e

formas recombinantes do HIV-1 (Figura 5) utilizando o programa SeqAlign (DNAStar,

Madison, Wisconsin, USA). Com este mesmo programa também foi obtido o quadro de

distâncias e construída a árvore filogenética.

RESULTADOS

1. Estabelecimento da técnica de amplificação

O delineamento inicial do trabalho previa uma etapa de amplificação única por PCR

ou RT-PCR. Desta forma, inicialmente foram testadas as combinações de primers GHIV-3F /

GHIV-4R e GHIV-5F / GHIV-6R utilizando-se 4 amostras de pacientes portadores do HIV-1.

Os resultados obtidos estão demonstrados nas figuras 5 e 6. A outra alternativa testada foi a

PCR nested feita a partir do pró-vírus (DNA). Na primeira reação foram utilizados os primers

SBI-11 e GHIV-7R que amplificam um fragmento de 2113bp. Na segunda reação, foram

utilizados os primers GHIV-3F e GHIV-4R que amplificam um fragmento de 790bp, na

região da RT. Os resultados obtidos com esta técnica estão demonstrados na Figura 7. Com

outras combinações de primers testadas não se obteve amplificação satisfatória (dados não

mostrados).

A técnica escolhida foi a PCR nested, devido ao fato dela apresentar uma amplificação

mais limpa na altura desejada, possibilitando o seqüenciamento.

Figura 5: Gel de poliacrilamida 10% mostrando as bandas produzidas pela técnica de PCR utilizando os pares

de primer GHIV-3F / GHIV-4R e GHIV-5F / GHIV-6R. As letras no alto da figura são referentes as

amostras, o C- representa o controle negativo e 50bp é o peso molecular.

Figura 6: Gel de poliacrilamida 10% mostrando as bandas produzidas pela

técnica de RT-PCR utilizando os pares de primer GHIV-3F / GHIV-4R e GHIV-

5F / GHIV-6R. As letras no alto da figura são referentes as amostras, o C-

representa o controle negativo e 50bp é o peso molecular.

Figura 7: A seta mostra a altura que a banda de interesse aparece no gel

de poliacrilamida 10% mostrando as bandas produzidas pela técnica de PCR nested

utilizando os pares de primer GHIV-3F / GHIV-4R. As letras no alto da figura são

referentes as amostras, 50bp é o peso molecular, C- representa o controle negativo,

C+ representa o controle positivo.

2. Extração e amplificação das amostras de HIV-1

Um total de 112 amostras foram selecionadas aleatoriamente, extraídas e submetidas

ao procedimento de amplificação por PCR nested utilizando a combinação de primers GHIV-

7F e SBI-11 (1

amplificação) e GHIV-3F e GHIV-4R (2

amplificação). As Figuras 8, 9, 10,

11 e 12 demonstram os resultados obtidos.

Figura 8: A seta mostra a altura que a banda de interesse aparece no gel de poliacrilamida 10%. Os números no

alta da figura são referentes as amostras. P.M é a abreviatura de peso molecular. C- se refere ao controle