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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS
UNIFAL-MG
Marina de Mesquita Padilha
Estudo farmacognóstico, fitoquímico e farmacológico
das folhas de Morus nigra L. (amoreira-preta)
Alfenas/MG
2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS
UNIFAL-MG
Marina de Mesquita Padilha
Estudo farmacognóstico, fitoquímico e farmacológico
das folhas de Morus nigra L. (amoreira-preta)
Alfenas/MG
2009
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado do Programa de Pós- Graduação
em Ciências Farmacêuticas da Universidade
Federal de Alfenas, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas. Área de
Concentração: Obtenção de insumos
farmacêuticos e avaliação da atividade
biológica
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Alves da Silva
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Padilha, Marina de Mesquita.
Estudo farmacognóstico, fitoquímico e farmacológico das folhas de
Morus nigra L. (amoreira-preta) / Marina de Mesquita Padilha.-
Alfenas, 2008.
63 f. : il.-
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)-Universidade
Federal de Alfenas.
Bibliografia.
1. Morus nigra. 2. Nocicepção. 3. Medição da Dor. I. Título.
CDD: 615.1
Marina de Mesquita Padilha
Estudo farmacognóstico, fitoquímico e farmacológico das folhas de Morus nigra
L. (amoreira-preta)
Aprovada em:
Profº.: Cibele Marli Cação Paiva Gouvêa
Instituição: Universidade Federal de Alfenas Assinatura: ____________________
Profº.: Elfriede Marianne Bacchi
Instituição: Universidade de São Paulo Assinatura: ______________________
Profº.: Geraldo Alves da Silva
Instituição: Universidade Federal de Alfenas Assinatura: ___________________
A Banca examinadora, abaixo-assinada,
aprova a Dissertação apresentada como
parte dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas pela Universidade Federal
de Alfenas. Área de concentração:
Obtenção de insumos farmacêuticos e
avaliação da atividade biológica.
A sabedoria é saber o que se deve fazer;
a virtude é fazê-lo.
(David Starr Jordan)
AGRADECIMENTOS
À Deus, que tornou possível concretizar esse sonho e a vencer os obstáculos;
Ao Professor Dr. Geraldo Alves da Silva pela constante presença, pela orientação deste
valioso trabalho e acima de tudo pela amizade;
Aos Professores Dr. Marcelo Henrique dos Santos e Dr. Alexandre Giusti Paiva pelo auxílio,
e amizade.
Ao meu avô Afrânio por uma vida de esforço dedicada ao magistério nos mostrando que o
caminho está no conhecimento;
À minha mãe, meu irmão, minha avó Gláuca pelo incentivo, compreensão e tolerância;
Aos professores e aos colegas do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas;
Aos colegas do Laboratório de Plantas Medicinais e Fitoterápicos pela colaboração e
amizade;
Às mestrandas Fabiana Cardoso Vilela e Lidiane Orlandi pela amizade que indubitavelmente
se eternizará;
Aos amigos Marcelo José Dias e Cláudia Rocha pela parceria constante na realização deste
trabalho;
À CAPES pelo apoio financeiro.
RESUMO
Plantas medicinais são utilizadas no tratamento e na cura de enfermidades desde a
antiguidade. Pela sua riqueza química e farmacológica, têm sido alvo de crescentes estudos no
intuito de comprovar atividades atribuídas pela crença popular ou mesmo obter novos
compostos ativos. Morus nigra L. é uma espécie pertencente à família Moraceae, conhecida
comumente como amoreira-preta. Na Medicina popular o chá é empregado nos casos de
ondas de calor e até mesmo indicada como terapia de reposição hormonal. As folhas possuem
atividade antioxidante, hipoglicemiante, antiinflamatória e antimicrobiana. Neste trabalho, a
folha de Morus nigra foi estudada em relação à caracterização estrutural, de modo a contribuir
na morfodiagnose para o controle de qualidade deste vegetal. O presente trabalho também
verificou a possível ação antinociceptiva e antiinflamatória do extrato diclorometânico em
modelos químicos e térmicos de nocicepção e inflamação em camundongos e ratos. O extrato,
administrado por via oral, produziu atividade antinociceptiva significativa e dependente da
dose contra os modelos de nocicepção, como nos testes de contorções, formalina, placa
quente e imersão da cauda. O extrato também apresentou efeito antiinflamatório nos modelos
de indução do tecido granulomatoso e edema de pata induzido por carragenina quando
comparado às drogas padrões dexametasona e indometacina respectivamente. A partir do
extrato diclorometânico das folhas de Morus nigra foi possível o isolamento de um triterpeno,
conhecido como germanicol.
Palavras-chave: Morus nigra; nocicepção; medição da dor
ABSTRACT
Medicinal plants have been used in the treatment and cure of illnesses for many, many years.
Due to their chemical and pharmaceutical characteristics, an increasing number of studies
have been conducted to prove their theoretical medicinal capabilities or to obtain new active
components. Morus nigra L. is a specie belonging to the family of the Moraceae usually
known as a black mulberry tree. In traditional medicine, tea of M. nigra is used in cases of
heat waves and even suitable as a therapy of hormonal replacement. This specie has
antioxidant, hypoglycemic, anti-inflammatory and antimicrobial activities. This work, the
Morus nigra leaf was studied regarding to structural diagnosis in order to contribute to its
quality control this vegetable. The present study also examined the possible antinociceptive
and anti-inflammatory actions of the methylene chloride extract (MnE) in chemical and
thermal behavioural models of pain and inflammation in mice and rats. The MnE given orally
produced a marked and a dose-related antinociception against the chemical models of pain,
such as writhing, formalin, hot-plate and tail-immersion tests. The extract also presented anti-
inflammatory effect in models of granulomatous tissue formation and carrageenan-induced
paw edema in comparison to the reference drugs dexamethasone and indomethacin
respectively. Using the methylene chloride extract of Morus nigra leaves, it was possible to
isolate one terpenoid known as germanicol.
Key-words: Morus nigra; nociception; pain measurement
LISTA DE ABREVIATURAS
AINES – antiinflamatório não esteroidal
C5a – fator de complemento C5a
DPPH – radical 1,1-difenil-2-picrilidrazil (ou 2,2-difenil-1-picrilidrazil)
FAP – fator de ativação plaquetária
IL-8 – interleucina - 8
LDL – lipoproteína de baixa densidade
PGE 1 – Prostaglandina 1
PGE 2- Prostaglandina 2
SNC – Sistema Nervoso Central
SUMÁRIO
1
REVISÃO DE LITERATURA............................................................
11
1.1
PLANTAS MEDICINAIS......................................................................
11
1.2
ESPÉCIE MEDICINAL Morus nigra....................................................
13
1.3
FARMACOLOGIA DOS COMPOSTOS TERPÊNICOS.....................
15
1.3.1
Germanicol.............................................................................................
17
1.4
O PROCESSO INFLAMATÓRIO.........................................................
17
1.5
DOR........................................................................................................
20
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................
23
2
RESULTADOS.....................................................................................
28
2.1
ARTIGO I..............................................................................................
28
2.2
ARTIGO II ............................................................................................
40
2.3
ARTIGO III ...........................................................................................
54
1 REVISÃO DE LITERATURA
1.1 PLANTAS MEDICINAIS
O uso de plantas medicinais pela humanidade é tão antigo quanto a origem das
civilizações, sendo descrito em todas as populações e grupos étnicos. No início dos tempos, a
fitoterapia representava a principal forma terapêutica conhecida. Os primeiros relatos escritos
dos quais se tem conhecimento sobre a ação medicinal de plantas são datados antes de Cristo.
Existem registros de uso de plantas medicinais na antiga China nos anos 3000 a. C., onde
várias plantas são mencionadas, entre elas, o ópio, extraído da papoula e empregado como
narcótico e o ginseng, que apresenta propriedades contra reumatismo, problemas respiratórios,
digestivos, entre outras (MARTINS, 2000).
O Reino Vegetal, além de ser o maior reservatório de moléculas orgânicas conhecido,
é um poderoso laboratório de síntese. Até hoje diversas moléculas com estrutura complexa
dependem de síntese biológica (MONTANARI; BOLZANI, 2001).
Os produtos naturais vêm recuperando espaço e importância na indústria farmacêutica,
seja por si só, seja como fonte inspiradora de novos padrões moleculares bioativos. Na
Europa, a fitoterapia já é parte da medicina tradicional, sendo que extratos de plantas e
componentes ativos, além de produtos medicinais acabados, estão descritos em muitas
farmacopéias (VIEGAS JR; BOLZANI; BARREIRO, 2006).
A busca, nas últimas décadas, pelo emprego de plantas medicinais e medicamentos
delas derivados, deve-se, entre outras razões, à frustrações advindas à exagerada expectativa
em torno dos fármacos de origem sintética, aos efeitos indesejáveis e prejuízos causados tanto
pelo uso incorreto quanto pelo uso abusivo destes, como também pelo reconhecimento de que
vários vegetais exercem papel importante no desenvolvimento de novas substâncias
terapeuticamente ativas e a crescente atenção que vem sendo dada pela comunidade científica
para produtos fitoterápicos (De PAULA, 1996; VINATORU, 2001).
Os fitoterápicos possuem algumas vantagens que atualmente justificam seu uso,
podendo-se citar por exemplo: efeitos sinérgicos; associação de mecanismos por compostos
agindo em alvos moleculares diferentes; menores riscos de efeitos colaterais e menores custos
de pesquisa (MONTANARI; BOLZANI, 2001).
No Brasil existem cerca de 250.000 espécies de vegetais e, segundo alguns autores,
pelo menos a metade pode ter alguma propriedade terapêutica útil à população. Porém, menos
de 1% dessas espécies com potencial já foram objeto de estudos. Muitas substâncias
exclusivas de plantas brasileiras encontram-se patenteadas por empresas ou órgãos
governamentais estrangeiros, porque a pesquisa nacional não recebe o devido incentivo.
Como por exemplo, podemos citar a Merck, que possui plantações próprias no Brasil de
jaborandi e fava-d’anta, para a extração de pilocarpina e rutina, respectivamente, que são
comercializadas no mercado externo (ACADEMIA BRASILEIRA DE CIÊNCIAS, 1998).
Atualmente, as substâncias vegetais, na indústria farmacêutica, são empregadas como
matéria-prima para a extração de princípios ativos ou precursores e, principalmente, para a
produção de tinturas, xaropes, chás, extratos fluidos e secos. Elas são muito cogitadas por
profissionais e por órgãos governamentais como um recurso terapêutico nos serviços de
saúde. Porém, para que isto ocorra, os compostos vegetais devem estar em formas
padronizadas, com a caracterização qualitativa e quantitativa dos seus princípios ativos,
fornecendo os requisitos de qualidade, efetividade e segurança exigidos em uma preparação
farmacêutica moderna, o que, de modo geral, não acontece nas indústrias fitoterápicas (De
SOUZA, 2003).
Parâmetros morfo-anatômicos possibilitam o controle botânico de qualidade de
insumos farmacêuticos auxiliando a autenticidade de drogas e seus adulterantes, identificando
e separando uma determinada espécie vegetal de outras. Di Stasi (1996) assinala a
importância da análise morfo-anatômica para o controle de qualidade da matéria-prima
vegetal na indústria farmacêutica, justificando que esta análise fornece subsídios que
contribuem na padronização dos insumos, permitindo a diferenciação inclusive entre espécies
botanicamente próximas. Dentre os ensaios anatômicos destacam-se os referentes a
histoquímica, pois auxiliam na caracterização de drogas e no monitoramento de análises
fitoquímicas, bem como no aproveitamento racional da droga vegetal.
A espécie medicinal Morus nigra vem sendo muito utilizada pela população como
fitoterápico, mas ainda não apresenta estudos para que possa ser empregado de maneira
racional. Sendo assim, estudos que forneçam parâmetros de qualidade e segurança, bem como
ensaios biológicos e farmacológicos, são fundamentais para que se possa dar crédito ao uso de
plantas medicinais.
1.2 ESPÉCIE MEDICINAL Morus nigra
A Morus nigra, também conhecida como amoreira-preta, é uma espécie vegetal que
tem sua origem na Ásia, frutificando com maior intensidade e abundância sobretudo na Ásia
Menor e estando plenamente aclimatizada no Brasil (CRUZ, 1979). Sua introdução nos
diversos países e continentes ocorreu aos poucos, e hoje está espalhada por todo o mundo
(DORIGAN, 1996). É uma planta temporária, de crescimento rápido que se desenvolve sob
diferentes condições climáticas (SRIVASTAVA et al., 2003) e é apreciada por sua folhagem,
que constitue o mais importante alimento para o bicho da seda (SASTRI, 1962).
Pertence ao gênero Morus e a família Moraceae, sendo conhecida aproximadamente
24 espécies de Morus, com pelos menos 100 variedades (MACHII; KOYAAMA;
YMANOUCHI, 2000; TUTIN, 1996).
A amoreira possui grande potencial para as regiões brasileiras com período de inverno
marcante e propícia para pequenas propriedades agrícolas. Os frutos podem ser utilizados para
consumo in natura e para produção de doces caseiros, sendo assim, potencial para as famílias
que trabalham com o ecoturismo regional. Além destas características, praticamente não
necessita de insumos químicos, sendo ótima opção para o cultivo orgânico. A amoreira é uma
das espécies que têm apresentado sensível crescimento de área cultivada nos últimos anos no
Rio Grande do Sul (principal produtor brasileiro) e tem elevado potencial para os demais
estados de características climáticas semelhantes. Em São Paulo a produção concentra-se na
região de Jundiaí e em Minas Gerais no Sul (Planalto de Poços de Caldas) e Zona da Mata
(Barbacena) (ANTUNES et al., 2000).
A árvore pode atingir de 5 a 20m de altura com folhas bastante grossas, simples e
alternas, cordiformes, simétricas na base, de cor verde escura, pecíolos curtos, ásperas, com
dentes largos e regulares, estípulas longas, membranosas e felpudas (MORGAN, 1982)
(FIGURA 1). As gemas são protegidas por estípulas caducas, inflorescência na forma de
espiga ou sicônio. As flores são unissexuais; as masculinas monoclamídeas, isostêmones e as
femininas aclamídeas, ovário súpero, bi ou unicarpelar, unilocular, uniovulado, com dois
estigmas (AGAREZ; CÉZIO; CECÍLIA, 1994). As infrutescências são grandes, ovaladas,
negras ou vermelhas brilhantes, quase sésseis. Suas amoras são comestíveis de sabor agridoce
e muito sumosas (MORGAN, 1982).
No Brasil, a Morus nigra só começou a ser pesquisada em 1972 pela EMBRAPA, na
qual foi dado início ao programa de melhoramento genético com o plantio de sementes
produzidas por mais de cinqüenta cruzamentos efetuados na Universidade de Arkansas, que
originaram mais de 12.000 plântulas, e deram origem às primeiras cultivares brasileiras
(BASSOLS; MOORE, 1981). O fruto da amoreira in natura é altamente nutritiva, contendo
85% de água, 10% de carboidratos, com elevado conteúdo de minerais, vitaminas B, A e
cálcio. Uma série de funções e constituintes químicos são relatados na literatura internacional
relacionados às qualidades da Morus nigra, estando, entre eles, o ácido elágico. Foi
demonstrado que o ácido elágico possui funções anti-mutagênica, anticancerígena,
antiinflamatória e além de ser um potente inibidor da indução química de vários tipos de
câncer (ANTUNES et al., 2000).
O gênero Morus é conhecido por conter uma variedade de compostos fenólicos
incluindo flavonóides isoprenilados, cumarinas, cromonas e xantonas e fitoalexinas
(NOMURA, 1988; NOMURA; HANO, 1994). Muitos destes compostos exibem propriedades
biológicas interessantes, tais como atividades antiinflamatória, diurética e efeitos
hipotensores, (NOMURA, 1988; TAKASUGI et al., 1978).
Os compostos fenólicos presentes no fruto da Morus nigra e de outras espécies
apresentam amplo espectro de atividade bioquímica tais como propriedades antioxidantes,
antimutagênicas e anticarcinogênicas bem como a capacidade moduladora da expressão
gênica (NAKAMURA et al., 2003).
Folhas, raízes e galhos de espécies do gênero Morus tem sido amplamente usados na
Medicina Chinesa para tratamento da febre, proteção hepática, melhora da visão,
fortalecimento das articulações e redução da pressão arterial (ZHISHEN; MENGCHENG;
Figura 1 : Fotografia das folhas da amora – Morus nigra
Fonte: De SÁ; MORAIS (2008, p. 23)
JIANMING, 1999). As folhas de algumas espécies de amora são consumidas na Coréia e
Japão como alimento nutracêutico hipoglicemiante por pacientes com diabetes melllitus
devido a presença da 1-deoxinojirimicina, conhecida por ser um dos mais potentes inibidores
da α-glicosidase (KIM et al., 2003).
Extratos das folhas e raízes de Morus alba mostraram significativa atividade
sequestrante de radicais livres e exibiram atividades antioxidantes (ANDALLU;
VARADACJARYULU, 2003; FANG; HOU; CHAO, 2005). O extrato butanólico das folhas
da amora também apresentou atividade seqüestrante do radical DPPH e inibiu a oxidação do
LDL em humanos e coelhos (DOI; KOJIMA; FUJIMOTO, 2000).
Segundo Toshio et al. (2005), foi isolada uma substância denominada chalcomoracina
de espécies de Morus, a qual apresentou considerável atividade antimicrobiana contra
Staphylococcus aureus resistentes à meticilina. A potência da atividade inibitória contra o
crescimento microbiano foi similar a vancomicina.
Dai et al. (2004) isolaram e identificaram três constituintes presentes na casca da
espécie vegetal Morus macroura, o guangsangon H, o guangsangon I e o guangsangon J. que
mostraram significativa atividade antiinflamatória e antioxidante experimentalmente.
1.3 FARMACOLOGIA DOS COMPOSTOS TERPÊNICOS
Umas das características dos seres vivos é a presença de atividade metabólica. O
metabolismo é a representação do conjunto de reações químicas que ocorrem no interior das
células. No caso das células vegetais, o metabolismo costuma ser dividido em primário
(atividades metabólicas essenciais que envolvem aminoácidos, carboidratos, lipídios e ácidos
nucléicos) e secundário (envolvendo compostos que não possuem distribuição universal e,
portanto, não são necessários a todas as plantas como, por exemplo, os alcalóides e
flavonóides) (KAUFMAN et al., 1999).
Uma importante classe de metabólitos secundários é representada pelos terpenos, um
grupo de compostos naturais com ampla distribuição, compreendendo mais de 1500
compostos, além de uma variedade estrutural envolvendo mais de 40 tipos de esqueletos
básicos (NES; ZHOU, 2001).
Triterpenos representam uma classe variada derivada dos terpenos (LIU, 2005), sendo
um dos constituintes majoritários na maioria das plantas medicinais e são tradicionalmente
utilizados na medicina de muitos países Asiáticos (OVESNA et al., 2004; HUANG; CHEN,
2003). Triterpenos pentacíclicos são conhecidos por apresentarem amplo espectro de
atividade farmacológica com toxicidade mínima (POZO et al., 2006). São moléculas
constituídas por trinta átomos de carbono contendo seis unidades isoprenóides, derivadas do
arranjo do epóxido do esqualeno num arranjo cadeira-cadeira-cadeira-barco seguido de uma
condensação (PATOCKA, 2003). Milhares de estruturas têm sido descritas na literatura até o
presente momento com centenas de novos derivados descobertos a cada ano (CHATURVEDI
et al., 2008).
Devido à sua grande diversidade, o estudo dos triterpenos têm sido de grande interesse
na tentativa de novas e reais aplicabilidades. Diversos trabalhos referem-se a atividade dos
triterpenos na oncologia por exibir atividade antineoplásica em vários tipos de células
tumorais, incluindo atividades antimutagênica, antiangiogênica e antiviral (HUANG; CHEN,
2003). Estes compostos também têm demonstrado apresentar atividade antiinflamatória por
inibir as enzimas lipoxigenase, ciclooxigenase 2 e induzir a óxido nítrico sintetase (SUH et
al., 1998). Além disso, alguns triterpenos estão relacionados à supressão da geração do ânion
superóxido e prevenção da peroxidação lipídica devido as suas propriedades antioxidantes
(SAFAYHI; SAILER, 1997).
Os triterpenóides são compostos constituídos basicamente de trinta unidades de
carbono – seis isoprenos (CARDOSO et al., 2001). A maioria possui em sua constituição
hidroxilas que podem ser glicosiladas, produzindo os heterosídeos cardiotônicos, importantes
agentes terapêuticos para doenças cardiovasculares. Biossinteticamente são derivados de
condensação de duas moléculas de farnesilpirofosfato (FPP) unidas cauda-cauda, produzindo
o esqualeno, precursor acíclico desta classe de compostos. A provável ciclização da molécula
de esqualeno leva à formação da estrutura básica dos triterpenóides, o
ciclopentanoidrofenantreno, importante precursor dos esteróides vegetais e animais.
Apesar de haver muitos relatos de atividades biológicas relacionadas aos triterpenos
pentacíclicos, o atual conhecimento dos efeitos destes e o estudo da relação estrutura-
atividade são preliminares merecendo mais estudos (RECIO et al., 1995).
A baixa toxicidade aguda destes compostos naturais e os indícios revelados pelos
estudos de relação estrutura-atividade sugerem que os substituintes no esqueleto lipofílico de
cinco membros destas moléculas podem aumentar a seletividade e a potência para uma
determinada ação, indicando que os triterpenos pentacíclicos podem ser um recurso natural de
extrema importância para o desenvolvimento de novos fármacos (SAFAYHI; SAILER,
1997).
1.3.1 Germanicol
A literatura revela que o germanicol (FIGURA 2), exemplo de triterpeno pentacíclico
pertencente à classe dos oleananos já foi identificado em diversas espécies vegetais: Lactuca
indica, Schaefferia cuneifólia (PARK et al., 1995; GONZALEZ et al., 1989), Pilocarpus
grandiflorus, Marsypianthes chamaedrys (GOMEZ et al., 1997) e Salvia macrochlamys
(TOPÇU et al., 2007).
Experimentos mostraram que o germanicol apresenta atividade antitumoral (KUNDU
et al., 2000). Apenas poucos estudos têm sido conduzidos para avaliar outros efeitos
farmacológicos deste triterpeno.
H
HO
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
23
24
25
26
27
19
20
21
22
29
30
28
Figura 2: Estrutura química do triterpeno pentacíclico germanicol
1.4 O PROCESSO INFLAMATÓRIO
Por muito tempo, a inflamação foi considerada como doença, e somente a partir do
século XVIII, é que Hunter propôs ser ela uma resposta benéfica. Desde Celsus
(contemporâneo de Cristo), caracteriza-se a inflamação por quatro sinais: rubor, calor, tumor e
dor. Virchow, no século XIX, acrescentou um quinto sinal: a perda da função (BIANCHETTI,
2006).
Carvalho (2004) descreveu a inflamação como uma resposta protetora imediata que
ocorre nos tecidos circunjacentes, sempre que há lesão ou destruição celular. O processo
inflamatório envolve uma série de fenômenos que podem ser desencadeados não só por
agentes infecciosos, como também por agentes físicos (radiação, queimadura, trauma),
químicos (substâncias cáusticas), isquemia, células tumorais e interações antígeno-anticorpo
(KRISHNAMOORTHY; HONN, 2006; CARVALHO, 2004).
O ponto final da inflamação é, frequentemente, um resultado favorável, mas às vezes a
inflamação pode se prolongar levando a várias condições patológicas ou também agravar
alguma doença já existente. Pesquisas recentes indicam existir uma ligação entre a inflamação
e a progressão de muitas patologias no homem (KRISHNAMOORTHY; HONN, 2006).
A inflamação é uma resposta celular e humoral de magnitude variável com repercussões
meramente locais ou sistêmicas, cujo disparo é produtor de uma cascata de eventos que
envolvem complementos, cininas, fibrinolíticos e coagulantes estimulados, juntos, com a
ativação de fagócitos e das células endoteliais. É um processo mediado por diferentes
mecanismos, ela ocorre em três fases distintas, aguda, evento transitório caracterizado pelos
sinais clássicos da inflamação; subaguda, retardada, onde se nota, predominantemente, a
infiltração leucocitária e fase crônica, onde está destacado a ocorrência da degeneração
tissular e da reparação fibrótica (SANTOS JÚNIOR, 2003).
As alterações vasculares ou hemodinâmicas que ocorrem com a inflamação instalam-
se quase imediatamente após a lesão e iniciam-se por meio de constrição momentânea dos
pequenos vasos da região. A vasoconstrição é seguida imediatamente pela vasodilatação das
arteríolas e vênulas que suprem a área. Como resultado, a área torna-se congesta, causando o
rubor (eritema) e calor associado com a inflamação aguda. Estas respostas de hiperemia são
acompanhadas pelo aumento da permeabilidade capilar, permitindo que os fluidos escapem
para dentro dos tecidos, causando inchaço (edema). Dor e incapacidade funcional seguem-se
como resultado do edema tissular e liberação de mediadores químicos (KUMAR; ABBAS;
FAUSTO, 2005).
O estágio celular da inflamação aguda é marcado pelo movimento dos leucócitos para
a área de lesão ou trauma. As primeiras células fagocitárias a responder são principalmente os
neutrófilos e em seguida macrófagos. Estes fagócitos de vida mais longa ajudam a destruir o
agente causador, auxiliam na sinalização do processo de imunidade específica e atuam na
resolução do processo inflamatório. A resposta celular dos fagócitos consiste na marginação
ou pavimentação das paredes capilares por leucócitos devido ao aumento da adesividade
molecular, emigração dos leucócitos, quimiotaxia ou migração positiva das células para o
local de adesão, além da fagocitose (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Apesar da inflamação ser precipitada pela lesão, seus sinais e sintomas são produzidos
através de mediadores químicos constituindo uma “orquestra biológica”, os quais podem ser
classificados de acordo com sua função: aqueles com propriedades vasoativas e propriedades
de contração dos músculos lisos tais como histamina, prostaglandinas, leucotrienos e o fator
de ativação das plaquetas (FAP); os fatores quimiotáticos, tais como os fragmentos do
complemento (C5a) e citocinas (IL-8); as proteases do plasma capazes de ativar o
complemento e os componentes do sistema de coagulação, bem como, moléculas reativas e
citocinas liberadas dos leucócitos que, uma vez liberadas para o meio extracelular, são
capazes de danificar o tecido adjacente (PORTH; KUNERT, 2004).
A histamina é amplamente distribuída por todo o organismo, sendo encontrada em alta
concentração nas plaquetas, basófilos e mastócitos. Provoca a dilatação e aumento da
permeabilidade capilar. É um dos primeiros mediadores da resposta inflamatória (RANG et
al., 2004).
As proteases do plasma consistem nas cininas, complementos protéicos ativados e
fatores de coagulação. Uma cinina, a bradicinina, provoca o aumento da permeabilidade
capilar e dor. O sistema de coagulação contribui com a fase vascular da inflamação,
principalmente através dos fibrinopeptídeos formados durante os passos finais do processo de
coagulação (RANG et al., 2004).
As prostaglandinas são moléculas lipossolúveis onipresentes, derivadas do ácido
araquidônico, um ácido graxo liberado pelos fosfolipídeos da membrana celular. Diversas
prostaglandinas são sintetizadas do ácido araquidônico por meio da via metabólica da
ciclooxigenase. As prostaglandinas contribuem com a vasodilatação, permeabilidade capilar,
bem como dor e febre que acompanham a inflamação. As prostaglandinas estáveis (PGE1 e
PGE2) induzem a inflamação e potencializam os efeitos da histamina e outros mediadores
inflamatórios. A prostaglandina tromboxano A2 promove a agregação plaquetária e
vasoconstrição (FUCHS; WANNMACHER; FERREIRA, 2004).
Os leucotrienos consistem nos mediadores químicos primeiramente descobertos nos
leucócitos. Como as prostaglandinas, são formados a partir do ácido araquidônico, porém
através da via da lipoxigenase. A histamina e os leucotrienos são complementares em sua
ação e possuem funções similares. A histamina é produzida rápida e transitoriamente,
enquanto os leucotrienos mais potentes estão sendo sintetizados. Um leucotrieno provoca a
constrição lenta e sustentada dos bronquíolos, sendo um importante mediador inflamatório da
asma brônquica e das reações imediatas de hipersensibilidade. Os leucotrienos também têm
sido descritos como capazes de afetar a permeabilidade das vênulas pós capilares, as
propriedades de adesão das células endoteliais, bem como a quimiotaxia e extravascularização
dos neutrófilos, eosinófilos e monócitos (RANG et al., 2004).
Gerado de um complexo lipídico armazenado nas membranas celulares, o FAP afeta
uma variedade de tipos celulares e induz a agregação plaquetária. Promove ativação dos
netrófilos e é quimioatraente potente de eosinófilos (FUCHS; WANNMACHER;
FERREIRA, 2004).
As inflamações agudas, geralmente, são auto-limitantes e rapidamente controladas
pelas defesas do hospedeiro. Por outro lado, a inflamação crônica é autoperpetuante e podem
durar semanas, meses ou, anos. Podem desenvolver-se durante o processo inflamatório agudo
recorrente ou progressivo, ou ainda, de respostas insidiosas, de baixo grau, geralmente
assintomáticas, incapazes de evocar uma resposta aguda. A inflamação crônica é considerada
uma inflamação prolongada, na qual a inflamação ativa, a destruição tissular e a tentativa de
reparar os danos ocorrem simultaneamente. Em contraste com a inflamação aguda, que
manifesta alterações, edema e infiltrado predominantemente neutrofílico, a inflamação
crônica é caracterizada por infiltrado de células monucleares, incluindo macrófagos, linfócitos
e plasmócitos, por destruição tecidual induzida pela persistência do agente nocivo ou pelas
células inflamatórias, e pelas tentativas de cicatrização pela substituição do tecido danificado
por tecido conjuntivo, efetuado por meio da proliferação de pequenos vasos sanguíneos e, em
particular, fibrose (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
1.5 DOR
A dor pode ser definida como uma experiência sensorial e emocional desagradável,
associada a um dano tecidual potencial ou de fato, ou ainda descrita em termos que sugerem
tal dano (MERSKEY; BOGDUK, 1994). A dor, além de uma sensação, é uma experiência.
Isto é importante porque as sensações possuem vias neuroanatômicas, com receptores
específicos que permitem a detecção e medida de um estímulo. Já as experiências incorporam
componentes sensoriais com influências pessoais e ambientais importantes (MILLAN, 1999).
Nocicepção é um termo aplicado aos mecanismos neurológicos que detectam o
estímulo lesivo (FERREIRA, 2004). Essa detecção de lesão tecidual ocorre através de
transdutores especializados ligados a fibras dos nervos periféricos do tipo A delta e C. Se a
estimulação dos nociceptores vai resultar ou não em dor depende de inúmeros fatores
moduladores. A intensidade da dor percebida varia consideravelmente, dependendo do humor
do indivíduo, da quantidade de distração com relação à dor, e das sugestões positivas ou
negativas de outras pessoas, assim como de vários sistemas neurológicos periféricos e centrais
que são capazes de modular a transmissão nas sinapses nas vias nociceptivas (UMPHERED,
1994).
A transmissão do estímulo doloroso, assim como sua inibição, envolve múltiplos
mecanismos (LEWIS; CANNON; LIEBESKIND, 1980). A percepção da dor se inicia na
periferia pela estimulação dos nociceptores, que são neurônios diferenciados com função
sensitiva cujos corpos celulares encontram-se nos gânglios das raízes dorsais ou trigeminal, e
projetam seus axônios até o corno dorsal da medula e na ponte. Os nociceptores estão
presentes em todo o corpo e podem ser divididos em três subtipos: mecanoceptores, com alto
limiar, que respondem à pressão; receptores mecanotérmicos, com baixo limiar, que
respondem à pressão e calor e os receptores polimodais, que respondem à pressão, calor e
estímulos químicos nocivos (NATALINI, 2000). Os mecanoceptores e os receptores
mecanotérmicos são compostos por terminações nervosas livres de fibras A delta, que são
fibras mielinizadas e de condução rápida que se projetam nas lâminas II e III da medula. Por
outro lado, os receptores polimodais são inervados pelas fibras C, que não são mielinizadas e,
portanto, transmitem o estímulo de forma mais lenta. Essas fibras projetam-se nas lâminas I e
II, e são estimuladas por mediadores endógenos (NATALINI, 2000). Essas substâncias
endógenas que são produzidas e/ou liberadas pelo tecido lesado (prostaglandinas,
neuropeptídeos, cininas, aminoácidos excitatórios e outros) estimulam os terminais nervosos
sensitivos agindo em receptores presentes na membrana desses neurônios. Além disso, os
mediadores inflamatórios liberados facilitam a neurotransmissão e sensibilizam o nociceptor
para o estímulo nocivo (BJÖRKMAN, 1995). Mais especificamente, as prostaglandinas e os
leucotrienos sensibilizam os terminais aferentes primários, tornando os nociceptores
periféricos mais sensíveis à bradicinina (TAIWO; LEVINE, 1988; COHEN; PERL, 1990). A
ativação dos terminais periféricos resulta na liberação de mediadores nociceptivos no corno
dorsal da medula espinhal.
Do ponto de vista temporal, a dor é classificada como aguda e crônica e, sob a óptica
da fisiopatologia, descreve-se a dor como associada à inflamação, à neuropatia e à de
influência pelo sistema nervoso simpático. A dor aguda é aquela que está relacionada à
instalação de um processo patológico, seja ele de origem traumática ou inflamatória. A dor
deriva normalmente do excesso de nocicepção, porém pode resultar também da sensibilização
ou da hipoatividade do sistema supressor da dor ou ambos. Ela serve como sinal de alerta para
a ocorrência da lesão. A resolução desse quadro normalmente acompanha a finalização do
quadro doloroso. Caso a dor não se resolva com o fim do processo causal, persistindo, além
da ausência da lesão, vai configurar um dos quadros possíveis de dor crônica
(CAVALCANTI; MADDALENA, 2003).
Na terapia da dor existem duas classes principais de drogas analgésicas: opióides e
antiinflamatórios. Os opióides abolem diretamente a transmissão nociceptiva no sistema
nervosa central (SNC) (VANE, 1971; AGUIRRE-BANUELOS; GRANADOS-SOTO, 1999).
Os antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) são moléculas sintéticas que possuem ações
antiinflamatórias, antipiréticas e analgésicas (BORNE, 1995). No entanto, os efeitos colaterais
descritos para muitos AINES, como irritação gastrointestinal e anormalidades da função renal,
têm limitado o uso dessas substâncias, especialmente no tratamento da dor crônica
(FERNANDEZ; SALCEDO; PALACIOS, 1995; LICHTENBERGER et al.,1995).
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2 RESULTADOS
2.1 Artigo I
Estudo farmacobotânico das folhas de Morus nigra L. (amoreira-preta)
Marina M. Padilha*, Lucimara Q. Moreira, Fernanda F. Morais, Tomáz. H. Araújo,
Geraldo Alves-da-Silva
Laboratório de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, Departamento de Farmácia,
Universidade Federal de Alfenas, Rua Gabriel Monteiro da Silva, 700, CEP 37.130-000 -
Alfenas- MG, Brasil
RESUMO: Morus nigra L. é uma espécie pertencente à família Moraceae, conhecida
comumente como amoreira-preta. Na Medicina popular é empregada nos casos de ondas de
calor e até mesmo indicada como terapia de reposição hormonal. Possui atividade
antioxidante, hipoglicemiante, antiinflamatória e antimicrobiana. O presente trabalho trata da
caracterização estrutural da folha, de modo a contribuir na morfodiagnose para o controle de
qualidade da espécie M. nigra. Amostras do material vegetal foram seccionadas, fixadas e
coradas com fucsina e toluidina. A folha apresenta estômatos anomocíticos na face abaxial,
tricomas tectores, mesofilo bifacial, drusas, nervura central semi-convexa e o pecíolo exibe
feixes vasculares em arco fechado.
Unitermos: amoreira-preta, Morus nigra, Moraceae, morfodiagnose.
ABSTRACT: Morus nigra L. is a specie belonging to the family of the Moraceae usually
known as a black mulberry tree. In traditional medicine, M. nigra is used in cases of heat
waves and even suitable as a therapy of hormonal replacement. This specie has antioxidant,
hypoglycemic, anti-inflammatory and antimicrobial activities. This work has dealt with the
structural diagnosis of the leaf, in order to contribute to its quality control of M. nigra specie.
Samples of the botanical material were sectioned, fixed and stained with fuchsine and
toluidine. The leaf has anomocytic stomata on the abaxial side, non-glandular trichomes,
biface mesophyll, druses, semiconvex midrib and the petiole exhibits a vascular bundle in a
closed arch shape.
Keywords: black-mulberry, Morus nigra, Moraceae, structural diagnosis.
INTRODUÇÃO
Os parâmetros morfo-anatômicos possibilitam o controle botânico de qualidade de
insumos farmacêuticos auxiliando a autenticidade de drogas e seus adulterantes, identificando
e separando uma determinada espécie vegetal de outras. Di Stasi (1996) assinala a
importância da análise morfo-anâtomica para o controle de qualidade da matéria-prima
vegetal na indústria farmacêutica, justificando que esta análise fornece subsídios que
contribuem na padronização dos insumos, permitindo a diferenciação inclusive entre espécies
botanicamente próximas. Dentre os ensaios anatômicos destacam-se os referentes a
histoquímica, pois auxiliam na caracterização de drogas e no monitoramento de análises
fitoquímicas, bem como no aproveitamento racional de insumos vegetais.
Morus nigra é uma espécie vegetal que tem sua origem na Ásia, frutificando com
maior intensidade e abundância sobretudo na Ásia Menor e estando plenamente aclimatizada
no Brasil (Cruz, 1979). Pertence à família Moraceae, sendo conhecida aproximadamente 24
espécies de Morus e uma sub-espécie, com pelos menos 100 variedades (Machii et al., 2000;
Tutin et al., 1996). A árvore pode atingir de 5 a 20m de altura com folhas bastante grossas,
simples e alternas, cordiformes, simétricas na base, de cor verde escura, pecíolos curtos,
ásperas, com dentes largos e regulares, estípulas longas, membranosas e felpudas (Morgan,
1982). As gemas são protegidas por estípulas caducas, inflorescência na forma de espiga ou
sicônio. As flores são unissexuais; as masculinas monoclamídeas, isostêmones e as femininas
aclamídeas, ovário súpero, bi ou unicarpelar, unilocular, uniovulado, com dois estigmas
(Agarez et al., 1994). As infrutescências são grandes, ovaladas, negras ou vermelhas
brilhantes, quase sésseis. Suas amoras são comestíveis de sabor agridoce, muito sumosas e
refrescantes (Morgan, 1982). Na medicina popular as folhas da amoreira-preta têm sido
indicadas para mulheres durante a menopausa. Estudos estão sendo realizados para a
comprovação da ação em receptores estrogênicos (Franzotti et al., 2004). Os compostos
fenólicos presentes no fruto da Morus nigra e de outras espécies apresentam amplo espectro
de atividade bioquímica tais como propriedades antioxidantes, antimutagênicas e
anticarcinogênicas bem como a capacidade de modificar a expressão gênica (Nakamura et al.,
2003).
Diferentes grupos de compostos químicos têm sido investigados no gênero Morus, tais
como alcalóides, cumarinas, flavonóides, triterpenos e esteróides (Toshio et al., 2005;
Camélia et al., 1997). Numerosos ensaios farmacológicos têm comprovado propriedades
laxativas, anti-helmínticas, expectorantes e hipoglicêmicas em diversas espécies da família
Moraceae. Na medicina chinesa, as plantas do gênero Morus são usadas como
antiinflamatório, diurético, antitussígeno, analgésico e antipirético (Nomura, 1988; Jiang,
1977). As raízes são utilizadas no tratamento de hipertensão arterial, reumatismo, problemas
oculares e espasmos infantis. O fruto da amora é usado para doenças hepáticas e renais e suas
folhas utilizadas para o tratamento de febre, dor de cabeça, beribéri, vômitos e dor estomacal
causada pelo agente da cólera Os ramos jovens da árvore são usados para o tratamento de
hipertensão e paralisia de braços e pernas (Jiang, 1977). Segundo Toshio et al. (2005), foi
isolado uma substância denominada chalcomoracina de espécies de Morus, a qual apresentou
considerável atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus resistentes á meticilina.
A potência da atividade inibitória contra o crescimento microbiano foi similar a vancomicina.
Do mesmo modo que a morfo-anatomia de algumas plantas de interesse medicinal foi
investigada em trabalhos anteriores (Duarte; Debur, 2003; Souza et al., 2003; Duarte;
Hayashi, 2005; Duarte; Wolf, 2005; Farago et al., 2005; Larrosa; Duarte, 2005; Budel et al.,
2006; Toledo et al., 2006), a presente investigação tem por objetivo abordar os caracteres
anatômicos foliar de Morus nigra, de modo a contribuir na morfodiagnose dessa espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
As amostras do material vegetal foram coletadas de plantas cultivadas no município de
Alfenas, MG, Brasil, em agosto de 2007, cujas coordenadas aproximadas são 21º26’ S e
45º56’ W. A identificação botânica foi realizada pelo Prof. Dr. Geraldo Alves da Silva,
responsável pelo Laboratório de Plantas Medicinais e Fitoterápicos da Universidade Federal
de Alfenas e a exsicata foi depositada no herbário, sob o nº HUNIFAL 00193.
Caracterização Macroscópica
A morfodiagnose macroscópica da folha foi realizada com auxílio de lupa e à vista
desarmada, utilizando como instrumento de medida uma régua. Foram realizadas fotografias
para documentar a caracterização (Silva & Akisue, 2000).
Caracterização Microscópica
O estudo anatômico, visando a caracterização microscópica da droga vegetal, foi
realizado de acordo com as técnicas de Kraus e Ardruin (1997) e Oliveira et al. (1991). A
folha adulta foi seccionada transversalmente em micrótomo, na espessura de 10 a 20 µm. As
secções paradérmicas foram realizadas em lâminas temporárias, com material fresco,
seccionado a mão livre, e coradas com fucsina e toluidina. Todas as secções foram analisadas
e fotografadas em microscópio com câmara digital.
RESULTADOS
Caracterização Macroscópica
As folhas apresentaram o limbo simples, com coloração verde escuro na face ventral e
coloração verde claro na face dorsal, flexível e membranácea. O limbo apresenta subdivisão
íntegra, superfície rugosa e forma oval. Em média, as folhas atingem 16,0 x 8,0 cm. A
margem é levemente serrilhada, apresentando base arredondada e ápice acuminado. A
nervação é do tipo peninérvia, apresentando cor mais clara que o limbo (Figura 1).
O pecíolo apresenta coloração verde claro, é torcido, curto, podendo aparecer
exemplares medianamente peciolados. Atingem em média 9 cm, possue superfície pilosa,
inserção lateral e é biconvexo em secção transversal (Figura 1).
Caracterização Microscópica
Em secção paradérmica as células epidérmicas apresentam contorno levemente
ondulado, com paredes finas e justapostas (Figura 2). Os estômatos anomocíticos localizam-
se exclusivamente na face abaxial (Figura 3) e inserem-se no mesmo nível das células
circunvizinhas, podendo estar rodeados de 3, 4, 5 até 6 células. A análise possibilitou a
observação de cutícula estriada na epiderme inferior e cutícula lisa na epiderme superior.
A folha em seção transversal apresenta mesofilo heterogêneo bifacial, com
aproximadamente 50% de parênquima paliçádico. As células da epiderme inferior se
apresentam menores que as células da epiderme superior. No mesofilo observou-se presença
de litocistos com cistólitos em forma de pêndulo ou badalo de sino (Figuras 5 e 6).
Em cortes tranversais da nervura central observou-se a presença de tricomas tectores e
captados (Figura 4). A nervura central tem secção semi-convexa (Figura 7) e a epiderme
possui as mesmas características previamente descritas. Subjacente ao sistema de
revestimento, nota-se o colênquima angular, formado por cerca de 5 a 6 camadas junto a face
adaxial e 4 a 5 no lado oposto. Mergulhado no parênquima fundamental encontra-se um feixe
vascular colateral em arco aberto. Internamente ao sistema vascular, localizado entre o
parênquima fundamental e o colênquima, ocorre a presença de pequenos cordões de xilema e
floema (Figura 8). Observou-se a presença de drusas no parênquima fundamental (Figuras 9,
10 e 11)
Observou-se também a presença de tricomas tectores e captados em secções
transversais do pecíolo. Este revela organização interna mostrando feixes vasculares do tipo
colateral, constituído de floema e xilema e separados por raios de parênquima fundamental
(Figura 12). Apresenta também uma camada de epiderme com cutículas bem espessas e
presença de pêlos. O colênquima é do tipo angular, e formado por aproximadamente 12
camadas, seguido de células parenquimáticas (Figura 12).
DISCUSSÃO
Em relação a análise macroscópica da M. nigra foi verificado que as características
morfológicas da folha não destoam do gênero como um todo. Mas segundo Morgan, 1982, as
folhas são cordiformes e apresentam pecíolos curtos. No entanto na espécie estudada as folhas
apresentaram forma oval e pecíolo curto, podendo aparecer exemplares medianamente
peciolados.
Os caracteres da epiderme foliar são discordantes com a descrição de Sonibare et al.,
2006, quanto ao formato das células epidérmicas, que segundo os autores são retangulares, e
no presente estudo observou-se que estas células apresentam contorno levemente ondulado.
Diferentemente ainda foi observado por Sonibare et al., 2006, que algumas espécies da
família Moraceae apresentam 2 a 3 camadas de células no parênquima paliçádico. Embora
tenha observado a presença do parênquima paliçádico no mesofilo da espécie estudada, este
se encontra com o mesmo número de camadas do parênquima lacunoso (torno de 50% em
cada).
Na epiderme deve ser destacada a presença de tricomas captados e tectores que
concordam com a descrição de Sonibare et al., 2006 e Biasiolo et al., 2004. Outra
característica relevante na anatomia foliar desta espécie, que pode ser útil em sua diagnose
como insumo farmacêutico, é que as células da epiderme inferior apresentam-se menores que
na epiderme superior.
A análise microscópica revelou a ocorrência de estômatos do tipo anomocítico,
localizando-se exclusivamente na face abaxial, o que não foi encontrado em literatura.
Metcalfe & Chalk (1957) caracterizaram a anatomia foliar de plantas da família
Moraceae, tendo constatado na epiderme de Morus spp, a presença de idioblastos de
mucilagens e cistólitos. Katsumata (1971) e Fujita & Uchikawa (1986) também observaram
idioblastos de cistólitos na epiderme foliar de amoreira. Segundo Mauseth (1988), os cristais
podem ocorrer em diferentes órgãos das plantas e em vários formatos, tais como drusas,
cristais prismáticos e estilóides. Entretanto cristais de carbonato de cálcio são encontrados
apenas em poucas famílias como Moraceae, Urticaceae e Acanthaceae. O cistólito de
carbonato de cálcio é localizado no litocisto e ocorrem principalmente na epiderme das folhas.
Existe um número crescente de registros revelando a formação de cristais de cálcio que tanto
podem ser de oxalato (Franceschi & Horner, 1980; Borchert, 1986; Doaigey, 1991; Kuo-
Huang et al., 1994) como cristais de carbonato de cálcio (Watt et al., 1987; Yu e Li, 1990;
Kuo-Huang & Yen, 1996). Apenas poucos relatos descrevem a presença de ambos cristais em
uma mesma espécie (Fahn, 1990) e tem correspondência com o verificado neste estudo, onde
foi observado apenas cistólitos com inclusões de carbonato de cálcio.
CONCLUSÕES
Vários parâmetros morfo-anatômicos listados neste trabalho são significativos na
diagnose da M. nigra como insumo farmacêutico. Como características relevantes no controle
botânico de qualidade desta planta destaca-se a presença de estômatos anomocíticos
exclusivamente na face abaxial, feixe vascular colateral em arco aberto, mesofilo
heterogêneo, drusas no parênquima fundamental, tricomas tectores e captados e cistólitos com
inclusões de carbonato de cálcio. Todavia, devem ser considerados em conjunto levando-se
em conta que alguns caracteres são comuns a outros representantes do gênero e isoladamente
não apresentam valor taxonômico para sua diferenciação, uma vez que espécies em grupos
muito próximos apresentam caracteres estruturais e compostos químicos em comum.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a CAPES e PIBIC/CNPq pelas bolsas concedidas.
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_
1cm
es
tr
co
pf
ep.s
pp
pl
ep.i
_
50µm
_
50µm
_
50µm
_
50µm
_
50µm
_
1000µm
1 2
4
3
5
6
cis
co
pf
dr
fl
xl
7
Figuras 1–7. Morus nigra(L): 1. folhas; 2. face epidérmica adaxial; 3. face epidérmica abaxial; 4. nervura central, em secção transversal, indicando a epiderme
com tricoma, colênquima e parênquima fundamental; 5, 6. secção transversal do mesofilo dorsiventral; mostrando epiderme, parênquimas paliçádico e lacunoso,
feixe vascular marginal e detalhe do cistólito em forma de pêndulo; 7. secção transversal da nervura central semi-convexa. cis – cistólito, co – colênquima, dr –
drusas, ep.i – epiderme inferior, ep.s – epiderme superior, es – estômato, fl – floema, pf – parênquima fundamental, pl – parênquima lacunoso, pp – parênquima
paliçádico, tr – tricomas, xi –xilema.
8
9
11
12
xi
pf
co
ep
tr
ep
co
pc
pf
fl
xi
dr
fl
10
_
200µm
_
50µm
_
50µm
_
200µm
_
50µm
xi
fl
ep
xi fl pf
dr
co
pf
dr
fl
xi
Figuras 8–12. Morus nigra(L): 8, 9, 10 e 11. nervura central, em secção transversal, onde se notam detalhes dos feixes vasculares e drusas; 12. pecíolo, em
secção transversal, onde se evidencia feixes vasculares do tipo colateral e presença de pêlos. co – colênquima, dr – drusas, ep – epiderme, fl – floema, pc –
parênquima clorofiliano, pf – parênquima fundamental, tr – tricoma, xi – xilema.
2.2 Artigo II
Antinociceptive effect of the extract of Morus nigra leaves in mice
Marina de Mesquita Padilha
a
, Fabiana Cardoso Vilela
b
, Marcelo José Dias da Silva
a
, Marcelo
Henrique dos Santos
a
, Geraldo Alves-da-Silva
a
, Alexandre Giusti-Paiva
b
a
Department of Pharmacy of Federal University of Alfenas–MG, Alfenas, Brazil.
b
Department of Biological Science of Federal University of Alfenas–MG, Alfenas, Brazil.
E-mail: giustipaiva@unifal-mg.edu.br
Corresponding author:
Alexandre Giusti-Paiva, PhD
Departamento de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Alfenas–MG
37130-000 - Alfenas - MG
Brazil
Phone: 55-35-3299-1303
FAX: 55-35-3299-1063
E-mail: giustipaiva@unifal-mg.edu.br
Abstract
Ethnopharmacological relevance: Several Morus species have been used to relieve pain in
Brazilian folk medicine.
Aim of the study: To evaluate the antinociceptive activities of dichloromethane extract from
leaves of Morus nigra.
Material and methods: Investigate the antinociceptive activity in mice using acetic acid-
induced writhing, formalin, and hot-plate test and tail-immersion test.
Results: The extract at test doses of 100 and 300 mg/kg, p.o. clearly demonstrated
antinociceptive activity in all tests. The extract administered at 300 mg/kg, p.o. had a stronger
antinociceptive effect than indomethacin (5 mg/kg, p.o.) and morphine (10 mg/kg, p.o.).
Conclusion: The extract of Morus nigra markedly exhibited antinociceptive action in mice.
Key words: Nociception; Inflammatory pain; Analgesia; Tail flick assay; Tail formalin test;
Writhing test
1. Introduction
Morus nigra L. is a species belonging to the family of the Moraceae and the genus Morus,
usually known as a black mulberry, and has been widely cultivated to feed silkworms
(Nomura, 1988). M. nigra is found in the temperate and subtropical regions of the Northern
Hemisphere. The cultivation of M. nigra in Brazil began with the Japanese migration into the
country.
Several species of Morus are widely used in traditional medicine as an analgesic, diuretic,
antitussive, sedative, anxiolytic, hypotensive, and for the treatment of edema (Nomura, 1998;
Nomura and Hano, 1994; Yadav et al., 2008).
This genus contains a variety of phenolic compounds that exhibit interesting biological
properties such as antioxidants or free radical scavengers effects (Kim et al., 1999; Sharma et
al., 2001; Nomura, 1988; Nomura and Hano, 1994; Takasugi et al., 1978). The leaves of
mulberry species are consumed in Korea and Japan as anti-hyperglycemic nutracetical foods
for patients with diabetes mellitus because the leaves contain 1-deoxynojirimycin, known to
be one of the most potent α-glycosidase inhibitors (Kim et al., 2003). Many extracts from
plants of this family have been proven to possess anti-inflammatory activities in many animal
models. The ethanolic extract from the leaves of Morus indica showed anti-inflammatory
activity on carrageenan-induced edema in rats and cotton-pellet granuloma models
(Balasubramanian et al., 2005).
On the basis of the traditional claim on M. nigra and the lack of scientific studies to establish
its potential pharmacological properties, the objective of this study was to evaluate the
antinociceptive properties of methylene chloride extract of M. nigra leaves in mice.
2. Material and methods
2.1. Plant material
Leaves of M. nigra L. (Moraceae) were collected in January 2008 in Alfenas, Minas Gerais,
Brazil. The plant was identified by Dr. Geraldo A. da Silva, Department of Pharmacy of
Federal University of Alfenas and voucher specimen is deposited at the Herbarium of Federal
University of Alfenas–MG, Brazil (voucher number HUNIFAL–00193).
2.2. Preparation of the plant extracts and reference drugs
Leaves of M. nigra were air dried at 40º C and powdered. The dried powders were extracted
with hydroethanolic solution 50%, and followed by percolation with methylene chloride at
room temperature. The solvent was removed under reduced pressure to obtain a residue for
bioactivity determination. The M. nigra extract (MnE) was administered in 30, 100, and 300
mg/kg doses after suspending in vehicle (1% sodium carboxymethylcellulose suspension in
distilled water). Indomethacin (5 mg/kg) and morphine sulphate (10 mg/kg) in vehicle were
used as reference drugs. All test drugs were orally administered in an equivalent volume of 10
ml/kg body weight of the animal.
2.3. Assessment of antinociceptive activity of M. nigra extract
2.3.1. Animals
Adult male Swiss mice (22–28 g) obtained from the Central Animal Facility of Federal
University of Alfenas, were housed in a temperature-controlled room, with access to water
and food ad libitum until they were used. All experiments were conducted in accordance with
the Declaration of Helsinki on the welfare of experimental animals and with the approval of
the Ethics Committee of the Federal University of Alfenas.
2.3.2. Acetic acid-induced writhing in mice
Acetic acid (0.6% v/v, 10 ml/kg) was injected into the peritoneal cavities of mice, which were
placed in a large glass cylinder, and the intensity of nociceptive behavior was quantified by
counting the total number of writhes occurring between 0 and 20 min after stimulus injection,
as described earlier (Collier et al. 1968). Oral treatments (p.o.) with vehicle, indomethacin, or
MnE were given 1 h prior to acetic acid injection (n = 8 per group). The writhing response
consists of a contraction of the abdominal muscle together with a stretching of the hind limbs.
The antinociceptive activity was expressed as the writhing scores over a period of 20 min.
2.3.3. Formalin-induced nociception
The method used was according to the process described earlier (Santos and Calixto, 1997).
Formalin solution (5% in 0.9% saline; 20µl/paw) was injected into the hind paw plantar
surface (i.pl.) and the animals were individually placed in transparent cage observation
chambers. Oral treatments (p.o.) with vehicle, indomethacin, or MnE were given 1 h prior to
formalin injection (n = 8 per group). Morphine sulphate was administrated 30 min before the
test. The time spent in licking the injected paw was recorded and expressed as the total licking
time in the early phase (0–5 min) and late phase (20–30 min) after formalin injection.
2.3.4. Tail-immersion test
The lower two-thirds of the tail were immersed in a beaker containing water kept at 50 ±
0.5°C (Wang et al., 2000). The time in seconds until the tail was withdrawn from the water
was considered as the reaction time. The reaction time was then measured 30, 60, and 120
min after the oral administration of vehicle, MnE, and morphine (n = 8 per group). The mice
were exposed to hot water for no longer than 12 s to avoid tissue injury.
2.3.5. Hot-plate test
The hot plate consisted of an electrically heated surface kept at a constant temperature of 50.0
± 0.5°C. Mice were placed on the heated surface, within the Plexiglas walls to constrain their
locomotion on the plate, and the latency to a discomfort reaction (licking of the paws or
jumping) was recorded 0, 30, 60, and 120 min after oral administration of vehicle, morphine,
or MnE (n = 8 per group). A cut-off time of 20 s was chosen to indicate complete analgesia
and to avoid tissue injury. The latencies for paw licking or jumping were recorded for each
animal.
2.3.6. Open-field test
In order to discard possible nonspecific muscle relaxant or the sedative effects of extract,
mice-motor performance were evaluated on the open-field apparatus (Archer, 1973). Groups
of mice (n = 6) were treated with vehicle (10 ml/kg, p.o.) or MnE (30, 100, 300 mg/kg, p.o.) 1
h before the performance of test. For the test, each animal was placed in the center of open-
field arena and allowed to have free ambulation for 5 min of observation of the locomotion
frequency (number of floor units the animal entered on all its limbs).
2.4. Evaluation of acute toxicity of the M. nigra extract
The MnE was orally administered to a group of mice, both male and female. Behavior
parameters observed after administration were convulsion, hyperactivity, sedation, grooming,
loss of righting reflex, and increased or decreased respiration during a period of 8 h and 7
days. Food and water were provided ad libitum.
2.5. Statistical analysis
The data obtained were analyzed using GraphPad software program Version 4.0 and
expressed as a mean ± S.E.M. Statistically significant differences between groups was
calculated by the application of analysis of variance (ANOVA) followed by Newman-Keuls
test. p–values less than 0.05 (p < 0.05) were used as the significance level.
3. Results
3.1. Acetic acid-induced writhing in mice
The MnE administered orally at different doses (100 and 300mg/kg) caused a significant
reduction in the number of writhing episodes induced by acetic acid (p < 0.05), compared to
the control. Indomethacin produced a 53.35% reduction compared to the control. The results
are depicted in Fig. 1.
3.2. Formalin test in mice
The MnE at doses of 100 and 300mg/kg, p.o. had a significant antinociceptive activity (p <
0.01) compared to the control in both the early and late phase. The reference drug,
indomethacin, suppressed only the second phase of the formalin test, while morphine
inhibited both phases of the pain stimulus (Fig. 2).
3.3. Tail-immersion and hot-plate test induced nociception in mice
As demonstrated in Fig. 3A, MnE administrated at doses of 30–300 mg/kg caused a
significant increase in tail-flick response latency time as compared to the control animals. In
the hot-plate test, oral treatment with MnE at doses of 30–300 mg/kg increased the latency
time as compared to the control group (Fig. 3B). Morphine significantly increased the latency-
time response in both tests.
3.4. Open-field test
Mice treated with MnE at 30–300 mg/kg did not cause reduction in the numbers of crossings
and rearings when compared to the control group in the open-field test (data not shown).
3.5. Acute toxicity
The MnE at the dose of 0.5–5 g/kg, p.o. given to mice had no affect on their behavioral
responses during the observation periods of 8 h and 7 days after administration. No mortality
was observed up to 7 days of monitoring. The LD
50
value of the extract in mice was therefore
estimated to more than 5 g/kg, p.o. As the effective dose used in the present study (100
mg/kg, p.o.) was 50-fold less than the dose used in this acute toxicity test, it was safe to
assume that the normal doses of 30, 100, and 300 mg/kg, p.o. given to mice in this study were
safe.
4. Discussion
Morus nigra extract demonstrated potent analgesic effect both in the visceral and
central nociceptive mouse models. Intraperitoneal injection of acetic acid can produce
peritoneal inflammation (acute peritonitis), which causes the response characterized by
contraction of the abdominal muscle accompanied by an extension of the forelimbs and
elongation of the body. This writhing response is considered as a visceral inflammatory pain
model (Koster et al., 1959). This method has been associated with the increased levels of
prostaglandins in the peritoneal fluids (Derardt et al., 1980). The results in this study revealed
that MnE significantly reduced the acetic acid-induced writhing responses similar to that of
the reference drug, indomethacin.
The formalin test produced a distinct biphasic response, and different analgesics may
act differently in this test (Dubuisson and Dennis, 1977; Morteza-Semmani et al., 2002;
Nascimento and Branco, 2007). The first phase results from direct chemical stimulation of the
nociceptive afferent fibers, mainly C fibers, and may be inhibited by centrally acting
analgesics such as morphine. The second phase results from the action of inflammatory
mediators released locally, such as prostaglandins, serotonin, histamine, and bradykinin
(Rujjanawate et al., 2003) and also from enhanced synaptic transmission in the spinal cord
(Tjolsen et al., 1992; França et al., 2001). Drugs whose principal mode of action is central
inhibit both phases of this test, whereas peripherally acting drugs only inhibit the second
phase. As other substances that act on the central nervous system (CNS), MnE inhibited both
phases of the test in a manner similar to that of morphine. Moreover, the results of this test are
in agreement with those obtained in the hot-plate and tail-immersion tests, confirming the
central antinociceptive effect of this extract.
In the tail-immersion test, which consists of a thermal stimulus, an increase in the
reaction time is generally considered as an important parameter for evaluating central
antinociceptive activity (Rujjanawate et al., 2003). This test is able to differentiate between
central opioid like analgesics and peripheral analgesics (Asongalem et al., 2004). The
antinociceptive activity of MnE was observed at a dose of 100 and 300 mg/kg, showing a
similar effect to that of morphine. This test also revealed that the antinociceptive effect of
MnE on mice remained present for at least up to 120 min after administration of the extract.
The tail-flick response is believed to be a spinally mediated reflex (Chapman et al., 1985).
The MnE was found to have antinociceptive activity in the hot-plate test, which is a specific
central antinociceptive test. The antinociceptive effect of MnE involves supraspinal as well as
spinal components, as demonstrated by the use of the hot-plate (Yaksh and Rudy, 1976;
Yaksh and Rudy, 1977; Yeung et al., 1977) and tail-immersion (Woolf et al., 1980; Luttinger,
1985) tests, respectively. The results suggest that MnE has a central antinociceptive effect, as
shown by the prolonged delay in response when mice were subjected to a nociceptive
stimulus in the tail-immersion test, and also by the increase in reaction time of the mice in the
hot-plate test.
The present study showed the efficacy of the MnE in different antinociceptive
responses generated by chemical noxious stimulus in the tissue injury produced by formalin,
or acetic acid injections, or by an exposure to thermal noxious stimulus in the hot-plate and
tail-immersion tests. The antinociceptive effect of MnE would appear to occur at doses that
evoked no visible modification in the overall behavior of the animals. However, further
studies should be carried out to investigate the molecular mechanism of action of MnE and its
participation in the inhibitory mechanisms of pain in the CNS.
Acknowledgments
This work was supported by FAPEMIG and CNPq. A Giusti-Paiva received a research
fellowship from CNPq.
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Figure 1. Effect of M. nigra extract (MnE) administered orally against acetic acid- induced
writhing movements in mice. Animals were pretreated orally with vehicle, MnE (doses 30,
100, and 300 mg/kg) or indomethacin for 30 min prior to the acetic acid (0.6%, i.p.). Each
column represents the mean with S.E.M. for six mice in each group. The asterisks denote the
significance levels when compared with control group (one-way ANOVA followed by
Newman–Keuls test): *p<0.05.
Figure 2. Effect of M. nigra extract (MnE) given by oral route on the licking induced by
formalin in mice. Animals were pretreated orally with vehicle, MnE (doses from 30–300
mg/kg), indomethacin or morphine for 30 min prior to formalin. The total time spent licking
the hind paw was measured in the first (Panel A) and the second (Panel B) phases after
intraplantar injection of formalin. Each column represents the mean with S.E.M. for eight
mice in each group. The asterisks denote the significance levels when compared with control
group (one-way ANOVA followed by Newman–Keuls test): *p<0.05.
Figure 3. Effect of M. nigra extract (MnE) administered orally on the tail-immersion test (A)
or hot-plate test (B) in mice. Animals were pretreated orally with vehicle, MnE (doses from
30–300 mg/kg) or morphine for 30 min prior to tail-immersion or hot-plate test at 50°C. Each
column represents the mean with S.E.M. for eight mice in each group. The asterisks denote
the significance levels when compared with control group (one-way ANOVA followed by
Newman–Keuls test): *p<0.05.
0
10
20
30
40
50
**
**
**
Vehicle
Indo
Extract (mg/kg)
30 100 300
Number of writhing episodes
Figure 1. Padilha et al.
First phase
0
25
50
75
100
Vehicle
Indo
Extract (mg/kg)
30 100 300 Morphine
*
***
***
Time licking (s)
Second phase
0
20
40
60
Vehicle
Indo
Extract (m g/kg)
30 100 300 Morphine
***
***
***
***
Time licking (s)
Figure 2. Padilha et al.
0
30
60
120
0
5
10
15
V ehicle
M nE 30 m g/kg
M nE 100 m g/kg
M nE 300 m g/kg
M orphine (10 m g/kg)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Time (min)
Time tail withdrawal (s)
0
30
60
120
0
5
10
15
20
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Time (min)
Latency (s)
A
B
Figure 3. Padilha et al.
2.3 Artigo III
Anti-inflammatory activity and isolation of pentacyclic triterpene from Morus nigra
leaves
Marina de M. Padilha
1
*, Fabiana C. Vilela
2
, Marcelo José Dias
1
, Cláudia Q. da Rocha
3
,
Alexandre Giusti-Paiva
2
, Marcelo H. dos Santos
3
, Geraldo Alves-da-Silva
1
1
Departamento de Farmácia, Laboratório de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, UNIFAL –
MG, Rua Gabriel Monteiro da Silva, 714, Alfenas-MG, CEP:37130-000, Brazil.
2
Departamento de Ciências Biológicas, Laboratório de Fisiologia, UNIFAL-MG, Alfenas,
MG, Brazil.
3
Departamento de Farmácia, Laboratório de Fitoquímica e Química Medicinal, UNIFAL-
MG, Alfenas, MG, Brazil.
Corresponding author
Marina de M. Padilha. e-mail: marina[email protected]; phone: (+55)-35-32991343; Fax:
(+55)-35-32991067
Abstract
The present study describes the chemical constituent isolated and anti-inflammatory
evaluation of Morus nigra leaves grown in Brazil. The plant materials were extracted
previously with hydroethanolic solution 50%, following by percolation with methylene
chloride at room temperature. From the extract were obtained the pentacyclic triterpene
named germanicol. The structure of natural product were identified on basis of spectral data.
The anti-inflammatory effect of M. nigra extract were studied at doses of 30, 100 and 300
mg/Kg p.o. using carrageenan-induced edema and granulomatous tissue formation tests. The
extract produced a significant decrease in edema caused by carrageenan and inhibited the
granulomatous tissue formation. The results of pharmacological tests performed in the present
study suggest that the extract of M. nigra presents anti-inflammatory effect.
1. Introduction
Medicinal plants are still a major part of traditional medical systems in developing
countries. Several herbal remedies are now being intensively used in therapy. The use of
medicinal plants as analgesic and anti-inflammatory drugs in folk medicine is a common
practice, although in most cases the active principles of the plants are unknown. However
evaluation of the pharmacological effects of the herbals crude extracts can still be used as a
logical research strategy for searching of new drugs (Nafisy, 1989; Javan et al., 1997).
Morus nigra L. (Moraceae) – known in Brazil as “amoreira-preta” – has been used as
an analgesic, diuretic, antitussive, sedative, anxiolytic, hypotensive, and also has been used
for the treatment of a variety of ailments including inflammatory disorders (Nomura, 1998;
Nomura and Hano, 1994). This vegetal variety is geographically distributed throughout Brazil
and temperate and subtropical regions of the Northern Hemisphere. Many extracts from plants
of this family have been proven to posses anti-inflammatory and analgesic activities in many
animal models. The ethanolic extract from the leaves of Morus indica showed anti-
inflammatory activity on carrageenan-induced edema in rats and cotton pellet granuloma
models (Balasubramanian et al., 2005). We have previously shown a antinociceptive action
for the methylene chloride extract of M. nigra leaves in models of nociception in mice.
However, no report on the chemical constituents of M. nigra leaves has been published. Thus,
this study was undertaken to investigate the anti-inflammatory activity of the methylene
chloride extract and to describe the isolation and identification of one terpenoid from M. nigra
leaves.
2. Material and methods
2.1. Plant material
Leaves of Morus nigra L. were collected in January 2008, in Alfenas, Minas Gerais,
Brazil. The plant was identified by Dr. Geraldo A. da Silva, from the Department of
Pharmacy of Federal University of Alfenas and voucher specimen is deposited at the Botanic
Departament Herbarium of Federal University of Alfenas - MG (voucher number HUNIFAL-
00193).
2.2. Preparation of the plant extract and reference drugs
Leaves of M. nigra were air dried at 40º C and powdered. The dried powder was
extracted with hydroethanolic solution 50%, following by percolation with methylene
chloride at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure to obtain a
residue for bioactivity determination. The Morus nigra extract (MnE) was administered in 30,
100 and 300 mg/kg doses after suspending in vehicle (1% sodium carboxymethylcellulose
suspension in distilled water). Indomethacin (5 mg/kg) and dexamethasone (0,2 mg/Kg) in
vehicle were used as reference drugs. All test drugs were orally administered in an equivalent
volume of 10 mL/Kg body weight of the animal.
2.3. Phytochemical tests
The extract of the plant material was screened for various classes of natural products
using standard qualitative methods as described by Harborne (1973). The test for tannins was
carried out by subjecting 1 g of plant extract in 2 mL of distilled water, filtered and ferric
chloride reagents added to the filtrate. For alkaloids, the test was carried out by subjecting 1 g
extract in 10 mL 1% HCl, boiled, filtered and Mayer’s reagent. The extract was subjected to
frothing test for the identification of saponins. The presence of flavonoids was determined
using 1% aluminum chloride solution in methanol concentrated HCl, magnesium turnins, and
potassium hydroxide solution. Steroids and Triterpenes were screened by adding 1 mL of
acetic anhydride to 0,25 g extract with 1 mL H
2
SO
4
.
2.4. Isolation of terpenoid
The MnE, which demonstrated the most promising analgesic activity, was estudied in
more detail. A part of this extract (6 g) was chromatographed using a silica gel column eluted
with n-hexane, ethyl-acetate and ethanol in order to result fifty-seven fractions that were
rejoinded in groups for similarity in TLC (thin layer chromatography). The most promising
group, denoted as F1 (2,5 g), was rechromatographed over a silica gel column eluted with
same solvents, given about eighty-four fractions. The fraction 35 (0,15g) was
rechromatographed again obtaining a compound pure named as Compound A. The chemical
structures of isolated compound was identified on the basis of nuclear magnetic resonance
(NMR).
2.5. Animals
Adult male Wistar rats (120-180 g) obtained from the Central Animal Facility of
Federal University of Alfenas, were housed in a temperature-controlled room, with access to
water and food ad libitum until use. All experiments were conducted in accordance with the
Declaration of Helsinki on the welfare of experimental animals and with the approval of Ethics
Committee of the Federal University of Alfenas.
2.6. Anti-inflammatory activity
2.6.1.Granulomatous tissue formation
This assay was described by Niemeggers et al. (1975), Swingle & Shideman (1972)
and Meier et al. (1950). Pellets weighing approximately 40 mg each were made with 5 mm of
dental cotton tampon. The pellets were sterilized and then impregnated with 0,4 mL
ampicillin aqueous solution at the moment of implantation. Having the animals anaesthetized,
the pellets were subcutaneously introduced , through abdominal skin incision. The MnE group
was daily treated (30, 100 e 300 mg/Kg), for six consecutive days. The second group was
treated, during six-day period, with dexamethasone (0,2 mg/Kg). The third group (control)
was treated daily, for six consecutive days, with 1% sodium carboxymethylcellulose
suspension in distilled water (p.o). This treatment was initiated 2 hours following the
implantation of pellets and continued until the sixth day. In the seventh day, the animals were
sacrificed and the granulomas removed, dried for 24 hours (60ºC) and the weigh determined.
The difference between the initial and final weighs was considerate the weigh of the produced
granulomatous tissue.
2.6.2. Carrageenan-induced rat paw edema
The method used was described by Winter et al. (1962) and modified by Carvalho et
al. (1999). The animals were divided into five groups consisting of eigth rats each. The
control group received vehicle (10 mL/Kg), the standard group received indomethacin (5
mg/Kg) and the test groups received the extract at the dose of 30, 100 e 300 mg/Kg, p.o. One
hour after oral administration of different substances, 0,1 mL (1000 μg/paw) of carrageenin
suspension was injected to all animals in the right paw and 0,1 mL of saline 0,9% solution
into the left paw. The paw volume, up to the tibiotarsal articulation, was measured using a
plethysmometer (model 7150, Ugo Basile). The measures were determined at 0 h (before
carrageenin injection) and 1, 2, 3 and 4 h later.
2.7.Statistical analysis
The data obtained were analyzed using GraphPad software program version 4.0 and
expressed as a mean±S.E.M. Statistically significant differences between groups was
calculated by the application of analysis of variance (ANOVA) followed by Newman–Keuls
test. p-Values less than 0.05 (p < 0.05) were used as the significance level.
3. Results
3.1. Phytochemical tests
The crude extract was found to be positive for the presence of steroids and
triterpenoids. However the crude extract was found negative for the presence of tannins,
alkaloids, saponins and flavonoids (phenols and polyphenols).
3.2. Isolation of terpenoid
Fig.1 shows the molecular structure of compound isolated of extract of M. nigra. The
compound was deduced using
13
C NMR analyse, which was afterwards confirmed by
comparison with data from literature.
ppm (f1)
0
50
100
150
0
50000
100000
150000
140.792
121.737
77.347
77.235
77.030
76.712
71.849
56.816
56.111
50.189
45.896
42.366
39.827
37.303
36.553
36.184
34.002
31.958
31.721
29.220
28.282
26.153
24.344
23.123
21.131
19.849
19.432
19.080
18.820
12.022
11.901
Fig.1. NMR data of pentacyclic triterpene germanicol
3.3. Granulomatous tissue formation
Daily administration of MnE (300 mg/Kg, p.o) inhibited the formation of
granulomatous tissue by 39,7% in comparison to the control group (p< 0,05). Moreover, the
administration of dexamethasone reduced its formation by 72,2% when compared to the
control group (p< 0,001). These results are depicted in Figure 2.
Fig.2. Effect of administration of MnE (30, 100 and 300 mg/Kg, p.o.), dexamethasone (0,2 mg/Kg p.o.) and 1%
sodium carboxymethylcellulose suspension on the formation granulomatous tissue. Each point represent the
mean ± S.E.M. of eight animals. The asterisks denote the significance levels when compared with control group
(one-way ANOVA followed by Newman–Keuls test): *p<0.05, ***p,0,001
H
HO
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
23
24
25
26
27
19
20
21
22
29
30
28
germanicol
0
100
200
300
400
500
*
***
Vehicle
MnE 30 mg/kg
MnE 100 m g/kg
MnE 300 m g/kg
Dexam ethasone
Granulom atous tissue (mg)
3.4. Carrageenan-induced rat paw edema
The results obtained with extract and indomethacin in the carrageenan-induced edema
test are showed in Figure 3. The degree of swelling of the carrageenan-injeted paws maximal
3 h after carrageenan injection. Statistical analysis shows that 3 h after carrageenan injection,
the MnE at doses of 30, 100 and 300 mg/Kg produced a significant decrease in the degree of
sweeling in comparison with the control group (p< 0,05) by 45,5, 59,5 and 53,2%
respectively. This result is quite similar to the one observed for the group treated with
indomethacin, which inhibited edema formation by 66,9% (p<0,001).
Fig.3. Effect of administration of MnE (30, 100 and 300 mg/Kg, p.o.), indomethacin (5mg/Kg, p.o.) and 1%
sodium carboxymethylcellulose suspension on the rat paw edema induced by intraplantar carrageenan injection
(1000 μg/paw). Each point represent the mean ± S.E.M. of eight animals. The asterisks denote the significance
levels when compared with control group (one-way ANOVA followed by Newman–Keuls test): *p<0.05,
**p<0,01, ***p,0,001
4. Discussion
The study of ethnopharmacological uses, phytochemistry and pharmacology of M.
nigra represents a successfully combination of efforts to discover new compounds related to
some properties of this medicinal specie. The results reported in the present investigation
0 1 2 3 4
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Vehicle
Indomethacin
MnE 30 mg/kg
MnE 100 mg/kg
MnE 300 mg/kg
***
***
***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Time (h)
Edema volume (ml)
demonstrate for the first time that M. nigra grown in Brazil exerts anti-inflammatory effects in
rats, which are related specially to the presence of terpenoids.
Carrageenan-induced edema has been commonly used as an experimental animal
model for acute inflammation and is believed to be biphasic. The early phase (1 – 2 h) of the
carrageenan model is mainly mediated by histamine, serotonin and increased synthesis of
prostaglandins in the damaged tissues surroundings. The late phase is sustained by
prostaglandin release and mediated by bradykinin, leukotrienes, polymorphonuclear cells and
prostaglandins produced by tissue macrophages (Brito and Antonio, 1998). The inhibitory
activity shown by the extract of Morus nigra leaves (30, 100 e 300 mg/Kg) over period of 4 h
in carrageenan-induced paw inflammation was quite similar to that exhibited by the group
treated with indomethacin. These results indicate that is acts in later phases, probably
involving arachidonic acid metabolites, which produce an edema dependent on neutrophils
mobilization (Just et al., 1998).
The induction of granulamatous tissue presented a chronic inflammatory response as
reported by Swingle and Shideman, 1972. These authors showed that non-steroidal anti-
inflammatory agents such as aspirin give only slight inhibition whereas steroidal anti-
inflammatory agents have a strong inhibition on the transudative and proliferative phases. In
present study, MnE (300 mg/Kg) inhibited significantly this process although dexamethasone,
a steroidal anti-inflammatory drug, inhibited more 50% in this process.
In summary, our results demonstrate that M. nigra cultivated in Brazil produces active
compounds which act as anti-inflammatory in differents models in animals. Presence of
phytoconstituents like pentacyclic triterpenes and steroids have been previously found to be
responsible for analgesic, anti-inflammatory and antipyretic activities in plants. Through
NMR technique it was possible to identify the compound germanicol as belonging to class of
triterpenes. Due to the strong anti-inflammatory activity presented by M. nigra extract, it can
be concluded that the germanicol is an important source of natural anti-inflammatory
compound. We can suggest that the extracts of M. nigra leaves possess an anti-inflammatory
property supporting its folk use in the treatment of inflammatory disorders.
Acknowledgements
This work was supported by CAPES and CNPq.
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