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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE

AMBIENTES AQUÁTICOS CONTINENTAIS

RODRIGO DE MELLO

Relações filogenéticas e biogeográficas entre espécies do gênero Astyanax

(Teleostei - Characidae) das bacias do rio Iguaçu, do alto rio Paraná e do rio

Paraguai baseadas em sequências de gene mitocondrial

Maringá

2009

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RODRIGO DE MELLO

Relações filogenéticas e biogeográficas entre espécies do gênero Astyanax

(Teleostei - Characidae) das bacias do rio Iguaçu, do alto rio Paraná e do rio

Paraguai baseadas em sequências de gene mitocondrial

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Ecologia de

Ambientes Aquáticos Continentais do

Departamento de Biologia, Centro de

Ciências Biológicas da Universidade

Estadual de Maringá, como requisito

parcial para a obtenção do título de

Mestre em Ciências Ambientais.

Área de Concentração: Ciências

Ambientais.

Orientador: Prof. Dr. Alberto José Prioli.

Maringá

2009

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"Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)"

(Biblioteca Setorial - UEM. Nupélia, Maringá, PR, Brasil)

M527r

Mello, Rodrigo de, 1980-

Relações filogenéticas e biogeográficas entre espécies do gênero Astyanax (Teleostei

- Characidae) das bacias do rio Iguaçu, do alto rio Paraná e do rio Paraguai baseadas em

seqüências de gene mitocondrial / Rodrigo de Mello. – Maringá, 2009.

43 f. : il. (algumas color.).

Dissertação (mestrado em Ecologia de Ambientes Aquáticos Continentais)--

Universidade Estadual de Maringá, Dep. de Biologia, 2009.

Orientador: Prof. Dr. Alberto José Prioli.

1. Astyanax (Teleostei - Characidae) “lambari” - Filogenia e biogeografia - Iguaçu,

Rio, Bacia. I. Universidade Estadual de Maringá. Departamento de Biologia. Programa

de Pós-Graduação em "Ecologia de Ambientes Aquáticos Continentais".

CDD 22. ed. -597.4813809816

NBR/CIP - 12899 AACR/2

Maria Salete Ribelatto Arita CRB 9/858

João Fábio Hildebrandt CRB 9/1140

FOLHA DE APROVAÇÃO

RODRIGO DE MELLO

Relações filogenéticas e biogeográficas entre espécies do gênero Astyanax

(Teleostei - Characidae) das bacias do rio Iguaçu, do alto rio Paraná e do rio

Paraguai baseadas em sequências de gene mitocondrial

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Ambientes

Aquáticos Continentais do Departamento de Biologia, Centro de Ciências Biológicas da

Universidade Estadual de Maringá, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre

em Ciências Ambientais pela Comissão Julgadora composta pelos membros:

COMISSÃO JULGADORA

Prof. Dr. Alberto José Prioli

Nupélia/Universidade Estadual de Maringá (Presidente)

Prof. Dr. Vladimir Pavan Margarido

Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE)

Profª Drª Carla Simone Pavanelli

Nupélia/Universidade Estadual de Maringá

Aprovado em: 27 de Janeiro de 2009.

Local de defesa: Anfiteatro do Nupélia, Bloco G-90, campus da Universidade Estadual de

Maringá.

“A orientação inicial que alguém recebe da educação

também o marca na sua conduta ulterior.”

(Platão)

"A educação faz com que as pessoas sejam fáceis de guiar,

mas difíceis de arrastar; fáceis de governar, mas impossíveis de escravizar."

(Henry Peter)

“Reconhece-se uma árvore pelos seus frutos”

(Mateus, 7)

Aos que estiveram e sempre estarão comigo, minha família. Em especial, aos ramos mais

recentes desta árvore: Leopoldo, Enzo, Maria Fernanda e Ana Carolina.

AGRADECIMENTOS

A Deus.

A minha família, pelas oportunidades, exemplos e amparo. Em especial ao meu pai, pela

confiança e paciência em minha ausência durante o desenvolvimento deste trabalho.

À Universidade Estadual de Maringá, pela formação.

Ao Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura (NUPELIA), pela

aprendizagem e oportunidades de aprimoramento pessoal e profissional.

Ao Prof. Dr. Alberto José Prioli, pela orientação, liberdade, confiança e portas dos

laboratórios sempre abertas.

Ao Programa Ecológico de Longa Duração (PELD-Site 6), pela oportunidade de aprendizado

biológico-prático e pelo sentimento de trabalho em equipe, desenvolvidos durante os

trabalhos esporádicos que participei.

À Aldenir Cruz Oliveira e Jocemara Celestino dos Santos, da secretaria do Programa de Pós-

graduação em Ambientes Aquáticos Continentais, pela eficiência dos trâmites burocráticos

que foram necessários ao longo do curso.

À Maria Salete R. Arita e João Fábio Hildebrandt, da biblioteca do NUPELIA, pela presteza e

agilidade prestadas às necessidades literárias requeridas durante o curso.

A todos os companheiros, alunos e funcionários do laboratório de Genética Geral do

NUPELIA pelas ajudas, companheirismo e aprendizado.

Ao Msc. Hector Veras Alcaraz, à Drª. Carla Pavanelli e ao Dr. Weferson Júnio da Graça do

Museu de Coleção Ictiológica do NUPELIA (UEM) pela identificação morfológica de

amostras.

Ao doutorando Thiago Cintra Maniglia, pela paciência, conhecimento partilhado e auxílio

com as análises estatísticas.

À Profª. Drª. Sônia Maria A. P. Prioli, (UEM) pelas amostras de DNA disponibilizadas e

pelos exemplo de conduta pessoal.

Ao Prof. Dr. Eduardo Palma (Universidade Católica do Chile) pela oportunidade concedida,

que me permitiu aprender mais sobre estudos de Filogenia e Biogeografia.

Ao doutorando Enrique Rodriguez-Serrano (Universidade Católica do Chile) pelas dicas e

esclarecimentos acerca de análises filogenéticas específicas.

Aos amigos de graduação, pós-graduação, de adolescência e de infância que, além da sincera

amizade, sempre me deram incentivo para o aperfeiçoamento.

Ao amigo e Prof. Msc. Rafael Rigolon (Universidade Federal de Viçosa), pela amizade, troca

de idéias e revisão textual.

A todos que de alguma forma me ajudaram a compreender melhor o pensamento biológico.

Aos pessimistas e invejosos, pelo incentivo.

Por fim, à Natureza, que proporciona contemplações e indagações para que continuemos em

busca constante de respostas, que lançam luz ao nosso limitado entendimento sobre o que nos

cerca.

“Todas as nossas incomodações, se verificarmos com cuidado suas origens, provém

quase todas do fato de não termos consciência da natureza do tempo”

(Dante Alighieri)

“Nasce-se, pois, com as forças desequilibradas

do pretérito para as tarefas do reajuste”

(Emmanuel)

Relações filogenéticas e biogeográficas entre espécies do gênero Astyanax

(Teleostei – Characidae) das bacias do rio Iguaçu, do Alto rio Paraná e do rio

Paraguai baseadas em seqüências de gene mitocondrial

RESUMO

As relações filogenéticas entre trinta e oito indivíduos de Astyanax provenientes do rio Iguaçu

e de bacias adjacentes, foram examinadas pelo seqüenciamento nucleotídico parcial do gene

mitocondrial citocromo b. Análises filogenéticas de união-de-vizinhos, máxima-

verossimilhança e de enfoque bayesiano foram realizadas utilizando-se de metodologias e

programas computacionais específicos. Os clados gerados no presente estudo sugerem o

reconhecimento de, no mínimo, três grupos que compartilham origens semelhantes aos

lambaris endêmicos do rio Iguaçu, sugerindo que os Astyanax do rio Iguaçu não se

diversificaram a partir de um único ancestral que ficou isolado quando a bacia se formou.

Portanto, o polifiletismo no Iguaçu seria intragenérico, referindo-se à possibilidade de três

grupos de Astyanax terem ficado isolados durante a formação da bacia. Astyanax sp. B teria

uma origem compartilhada com algumas espécies do ‘complexo altiparanae-bimaculatus’

enquanto que Astyanax sp. C seria do grupo que também abrigaria A. aff. paranae e A.

bockmanni. A divergência entre Astyanax sp. E e Astyanax sp. F teria ocorrido num passado

mais recente quando comparada à diferenciação da espécie Astyanax sp. D. Os eventos

geológicos e hidrológicos que teriam influenciado o padrão biogeográfico das espécies

analisadas são discutidas.

Palavras-chave: Filogenia. Citocromo b. Sequênciamento de DNA. Astyanax. Biogeografia.

Phylogenetic and Biogeographic relationships among species of the genus

Astyanax (Teleostei-Characidae) from Iguaçu River basin, Upper Paraná river

and Paraguay river basin based on sequences of mitochondrial gene

ABSTRACT

Phylogenetic relationships among thirty-eight individuals of Astyanax from Iguaçu River and

adjacent river basins, were examined by nucleotidic sequencing in the mitocondrial gene

cytochrome b. Phylogenetic analysis of neighbor-joining, maximum-likelihood and bayesian

approach were carried out using methodologies and specific computacional programs. The

clades brought up in this study suggest the recognition of, at least, three groups that share

similar origins with the endemic lambaris from Iguacu River, suggesting that there is

poliphyletism in the ancestry in Astyanax from this location, suggesting that Astyanax from

this river did not diversify from a unique ancestor group that was isolated when the Iguacu

River basin was formed. Thus, polyphyletism of this genera in Iguaçu River would be

intrageneric, when it refers to the possibility of three groups of Astyanax have been isolated

during the formation of this river basin. Astyanax sp. B would have an origin shared with

some especies from the ‘complex altiparanae-bimaculatus’ while Astyanax sp. C would be

from the same group that also hosts A. aff. paranae and A. bockmanni. The divergence

between Astyanax sp. E and Astyanax sp. F would have occured in a more recent past when

compared to the differenciation of the species Astyanax sp. D. Geological and hidrological

events that would have influenced the biogeography pattern of the analised species are

discussed.

Keywords: Phylogeny. Citocrhome b. DNA sequencing. Astyanax. Biogeography

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Tabela 1 Código amostral, espécies e localidades dos indivíduos analisados

Figura 1 Árvores de união-de-vizinhos e de máxima verossimilhança............

Tabela 2 Distâncias Genéticas dentro de cada clado.......................................

Tabela 3 Distâncias Genéticas entre os clados.................................................

Tabela 4 Distâncias Genéticas dentro de cada grande grupo............................

Tabela 5 Distâncias Genéticas entre os grandes grupos....................................

Figura 2 Gráfico 3D de dispersão em coordenadas principais (Auto-Vetores )

Figura 3 Árvore obtida pelo critério bayesiano a posteriori ............................

Dissertação elaborada e

formatada conforme as normas da

publicação científica Neotropical

Ichthyology. Disponível em:

<http://www.ufrgs.br/ni/>

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 13

2 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 17

2.1 Material biológico e locais de coleta ....................................................... 17

2.2 Extração de DNA...................................................................................... 17

2.2 DNA mitocondrial, amplificação e seqüenciamento ............................. 18

2.3 Análises filogenéticas e genealógicas ..................................................... 19

3 RESULTADOS..........................................................................................

4 DISCUSSÃO............................................................................................. 29

5 REFERÊNCIAS........................................................................................ 36

INTRODUÇÃO

Peixes caraciformes fornecem um exemplo dos complexos padrões evolutivos e

biogeográficos geralmente vistos nas faunas tropicais e subtropicais. Eles constituem um

grupo de peixes de divergências ecológicas e morfológicas em rios e lagos na África e nos

Neotrópicos. A vasta especialização trófica encontrada nos caraciformes é comparável aos

dos ciclídeos e incluem detritívoros, herbívoros, planctívoros e predadores. Algumas espécies

têm adaptações morfológicas e fisiológicas peculiares para sobrevivência em condições

extremas de hipoxia, condições estas geralmente encontradas em meio ambientes como

planícies de inundação (Orti & Meyer, 1997)

Dezoito famílias com cerca de 270 gêneros e, pelo menos, 1674 espécies compõem a

ordem Characiformes (Nelson, 2006). A maioria das linhagens (famílias) de peixes

caraciformes originou-se antes do evento vicariante que separou os táxons africanos e

neotropicais, há aproximadamente cem milhões de anos atrás (Greenwood, 1984; Meyer et

al., 1990; Meyer, 1993).

Characidae faz parte da ordem Characiformes e é uma grande e diversificada família

que tem mudado muito com a remoção das subfamílias Crenuchinae e Characidiinae, agora

reconhecidas na família Crenuchidae (Nelson, 2006). As variações nas estratégias de vida dos

caracídeos estão presentes de forma muito evidente, tanto que este grupo exibe uma

divergência fenotípica adaptativa tão grande que não se iguala a nenhuma outra ordem animal

(Fink & Fink, 1981). Engloba, ainda, a maior parte dos peixes brasileiros de água doce, sendo

que nas Américas do Sul e Central, devida à natureza de alta heterogeneidade, as espécies são

agrupadas por subfamílias com diferentes autorias. Somente aquelas subfamílias nas quais há

evidências de monofilia são retidas, deixando, desta forma, uma grande porção da diversidade

em Characidae listadas sob a denominação Incertae Sedis, que incorpora oitenta e oito

gêneros com cerca de 620 espécies reconhecidas. Entre elas, 64%, ou 399 espécies, são

atribuídas à especiose. (Reis et al., 2003).

O grande número de espécies incluídas nesta família, associado à imensa variedade

morfológica, de hábitos alimentares diversos e exploração de uma infinidade de habitats

(Britski et al., 1998) tem dificultado proposições de classificação que reflitam agrupamentos

naturais dentro dela. Como conseqüência, o reconhecimento das relações de parentesco com

as demais famílias da ordem Characiformes têm sido muito prejudicadas devido a dúvidas

sobre o monofiletismo da família Characidae (Lucena, 1993).

O gênero Astyanax Baird & Girard, 1854 é o mais comum e diversificado da família

Characidae na área de abrangência da região neotropical, indo desde o Texas ao nordeste da

Argentina, congregando aproximadamente uma centena de espécies abundantes nas bacias

hidrográficas brasileiras (Garutti & Britski, 2000; Lima et al., 2003). Até agora, o gênero

comporta cerca de cem espécies validadas e recentes descrições tendem a aumentar esse

número (e.g. Azpelicueta et al., 2002; Azpelicueta et al., 2003; Casciotta et al., 2003; Lima &

Zuanon, 2004; Bertaco & Lucinda, 2005; Haluch & Abilhoa, 2005; Bertaco & Lucena, 2006;

Melo & Buckup, 2006). São conhecidos vulgarmente como lambaris ou piabas e habitam

diversos ambientes, inclusive as águas de cabeceiras de rios e riachos. Seus exemplares

apresentam tamanho reduzido, tendo como principais características morfológicas: nadadeiras

adiposas geralmente presentes; linha lateral completa, pouco curva na frente; pré-maxilar não-

protráctil; dentes pré-maxilares dispostos em duas séries, a interna com cinco dentes; dentes

com cúspides; altura do corpo cerca de três vezes ou menos o comprimento padrão, e escamas

de tamanho normal, cobrindo apenas a base dos raios da nadadeira caudal (Britski et al.,

1988).

O grupo é reconhecidamente de difícil identificação taxonômica (Lowe-McConnell,

1975) e atualmente está alocado entre vários gêneros Incertae Sedis de Characidae,

anteriormente nominados entre os Tetragonopterinae (Lima et al., 2003). Estudos sistemáticos

têm enfatizado que os representantes de Astyanax compõem complexos de espécies distintos

de taxonomia controversa (Reis et al., 2003).

Apesar do grande número de estudos com Astyanax, há relativamente pouco enfoque

nas relações filogenéticas entre as espécies. É verdade que estudos citogenéticos (e.g. Pazza &

Kavalco, 2007; Pazza et al., 2007; Domingues, 2007; Hashimoto et al., 2008; Kantek et al.,

2008; Vicari et al., 2008; Medrado et al., 2008), de elucidação taxonômica entre espécies

duvidosas (e.g. Prioli et al., 2002), filogeografia intraespecífica (e.g Strecker et al., 2004) e de

revisão taxonômica específica (e.g. Melo, 2005) vêm contribuindo para a elucidação de

hipóteses formuladas acerca de relações e polimorfismos inter e intraespecíficos. Estudos

sobre relações filogenéticas e biogeográficas, no entanto, foram realizados mais ao nível de

famílias de Characiformes e suas potenciais dispersões (Orti & Meyer, 1997; Calcagnotto et

al., 2005). Moyses & Almeida-Toledo (2002) utilizaram o DNA mitocondrial de algumas

espécies de Astyanax que revelaram diversidade nucleotídica entre elas.

O conhecimento dos padrões de divergência genética de várias espécies e populações,

de suas relações histórico-evolutivas, bem como as peculiaridades do meio ambiente de cada

bacia hidrográfica são de suma importância para o maior entendimento das relações

filogenéticas e biogeográficas dos organismos (Futuyma, 1986). A distribuição das espécies

do gênero discutido tem influência direta nos processos evolutivos do grupo e em sua

exuberante diversidade. Estruturas populacionais e intraespecíficas dentro de um mesmo rio e

a capacidade de explorar grande variedade de micro habitats, formando pequenas populações

com dispersão relativamente restrita, levaram Garutti & Britski (2000) a sugerir que estes

peixes não formam um grupo uniforme e que apresentam variações de população para

população.

A ictiofauna da bacia do rio Iguaçu tem uma história evolutiva peculiar, com um alto

índice de endemismo, sendo que aproximadamente 80% das espécies são exclusivas a esta

bacia hidrográfica (Agostinho & Gomes, 1997). O processo geomorfológico de formação da

bacia do Iguaçu remonta do Período Terciário, estando associado a movimentos verticais

escalonados responsáveis pelo soerguimento da Serra do Mar e a origem dos três planaltos

paranaenses; sendo o primeiro na região de Curitiba, o segundo na região de Ponta

Grossa/Palmeira e o terceiro na região de Guarapuava/Palmas (Petri & Fulfaro, 1983). O

Iguaçu constitui-se, assim, num rio geologicamente antigo, porém rejuvenescido por

levantamentos diversos, caracterizados por corredeiras e saltos, alternados por meandros de

curvaturas amplas e várzeas extensas (Ministério das Minas e Energia, 1990).

Devido ao surgimento das Cataratas do Iguaçu, ocorrido há aproximadamente 22

milhões de anos (Período Oligo-Mioceno), as populações de peixes da bacia do rio Iguaçu

foram isoladas das do rio Paraná por estas quedas, que apresentam cerca de 70m de desnível

(Maack, 1981). Tal fato favoreceu um processo de especiação, que seria responsável pelo

considerável grau de endemismo apresentado por sua ictiofauna (Kantek et al., 2003). O rio

Iguaçu apresenta uma ictiofauna pobre comparada à do rio Paraná (Garavello et al., 1997).

Isto se deve principalmente a topografia do rio, com suas quedas e corredeiras, que

impossibilitam a subida de peixes e a realização de migrações.

O isolamento geográfico de espécies de peixes pode determinar processos evolutivos

significativos nas comunidades, eventualmente levando a especiações. Tais populações

isoladas são mais suscetíveis a mudanças evolutivas, que podem ser mais ou menos

aceleradas dependendo dos distintos ambientes em que estão inseridos. De acordo com

Futuyma (1986), populações distantes geograficamente ou aquelas nas quais não há fluxo

gênico são mais freqüentemente isoladas por esterilidade e diferenças comportamentais do

que populações próximas.

Este trabalho pretende contribuir para a elucidação das relações evolutivas entre as

espécies de Astyanax, que tem sido sugerida por vários autores (e.g.

Weitzman & Malabarba,

1998; Domingues et al., 2007; Pazza & Kavalco, 2007; Pazza et al., 2007; Kantek et al.,

2008; Medrado et al., 2008), os quais ressaltam a importância de aplicações de técnicas de

filogenias moleculares à sistemática dos caraciformes, mais especificamente dentro do gênero

Astyanax. Assim, o presente estudo comparou as espécies endêmicas do rio Iguaçu às espécies

de Astyanax de outras bacias. Além disso, contribui no aumento dos estudos em peixes de

água doce na América do Sul, que têm sido extremamente úteis para revelar diferenças

genéticas intra e interespecíficas, trazendo à tona dados relevantes acerca das espécies e a

evolução da biodiversidade na região tropical.

MATERIAL E MÉTODOS

Material Biológico e Locais de Coleta: Indivíduos do gênero Astyanax foram coletados nas

bacias do rio Iguaçu, do alto rio Paraná, do rio Paraguai, do rio Paranaíba e do rio Cuiabá;

além de cinco seqüências nucleotídicas que estavam disponibilizadas no Genbank (Acessos

AF287414.1; AY639091.2; AY639092.2 e AY639089.2, disponíveis em

http://www.ncbi.nlm.nih.gov) como podem ser vistos na Tabela 1. Os exemplares foram

preservados em álcool etílico comercial. A identificação morfológica da maioria dos

espécimes foi realizada baseando-se em Severi & Cordeiro (1994), Garavello et al. (1997),

Ingenito et al. (2004), Britski et al. (2007) e Graça & Pavanelli (2007) na Coleção Ictiológica

do Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura (NUPELIA) da

Universidade Estadual de Maringá (UEM).

Extração de DNA: A extração total do DNA ocorreu de acordo com a metodologia

fenol/clorofórmio de Laird et al. (1991) e Monesi et al. (1998) com poucas modificações.

Aproximadamente 100 mg de músculo de cada caracídeo foram macerados na presença de

nitrogênio líquido. Em seguida, homogeneizados em 500 µL de tampão PS (Tris–HCl 0,2 M,

EDTA 30 mM, SDS 2% e sacarose 5%) e 500 µL de tampão TH (Tris –HCL 10 mM, NaCl

60 mM, EDTA 10 mM, sacarose 5%, espermina 0,15 mM e espermidina 0,15 mM) pH 8,0 e 5

µL de proteinase K (20 µg/µL) em banho-maria com agitação a 37

C. Em seguida, o DNA

foi purificado por extração fenol/clorofórmio (1:1, v:v) e clorofórmio, respectivamente, sendo

centrifugado em 12.000 rpm por 12 minutos.

O DNA extraído foi precipitado com a adição de solução salina (NaCl 5 mM) e etanol

absoluto gelado, seguida de uma incubação a -20

C por 12 a 24 horas. O pellet obtido foi

ressuspendido em 50 µL de tampão TE (0,1 mM Tris-HCl pH 8,0; 0,01 mM EDTA), com

RNAse (20 µg/mL). A suspensão de DNA foi estocada a -20

C. Alíquotas do DNA de cada

exemplar foram utilizadas para uma estimação visual da quantidade de DNA, em gel de

agarose (1%) e corados com brometo de etídio (20 µg/100 mL), por comparação com

quantidades conhecidas de DNA do fago λ.

Tabela 1. Código amostral, espécies e localidades (BRA: Brasil; PRY: Paraguai) dos indivíduos

analisados. Os A. fasciatus com asteriscos (*) representam os haplótipos, denominados entre

parênteses.

Código Amostral Espécie Localidade

A.sp-481 Astyanax sp. Rio Pitangui – PR. Bacia do alto rio Paraná - BRA

A.sp-488 Astyanax sp. Rio Tibagi – PR. Bacia do alto rio Paraná - BRA

A.sp-12 Astyanax sp. Rio Manso - MT. Bacia do rio Paraguai - BRA

A.alti-674 A. altiparanae Rio Pitangui – PR. Bacia do alto rio Paraná - BRA

A.sp-5 Astyanax sp Rio Passa Cinco - SP. Bacia alto rio Paraná - BRA

A.abra-1 A. abramis Arroyo Yacaré – Dpto Neembucu. Bacia Rio Paraguai - PRY

A.abra-3 A. abramis Arroyo Yacaré – Dpto Neembucu. Bacia Rio Paraguai - PRY

A.abra-4 A. abramis Arroyo Yacaré – Dpto Neembucu. Bacia Rio Paraguai - PRY

A.abra-45 A. abramis Rio Cuiabá – MT. Bacia do Rio Paraguai -BRA

A.abra-51 A. abramis Rio Cuiabá – MT. Bacia do Rio Paraguai -BRA

A. asun-6 A. asuncionensis Rio Cuiabá – MT. Bacia do Rio Paraguai -BRA

A.asun-8 A. asuncionensis Rio Cuiabá – MT. Bacia do Rio Paraguai -BRA

A.fasc-496 A. fasciatus Rio Tibagi – PR. Bacia do alto rio Paraná - BRA

A.fasc-497 A. fasciatus Rio Tibagi – PR. Bacia do alto rio Paraná - BRA

A.fasc-498 A. fasciatus Rio Tibagi – PR. Bacia do alto rio Paraná - BRA

A.fasc-604 A. fasciatus Rio Pitangui – PR. Bacia do alto rio Paraná - BRA

A. fasciatus (FE)* A. fasciatus AY639088.2 – GeneBank (América Central)

A. fasciatus (GA)* A. fasciatus AY639089.2 – GeneBank (América Central)

A. fasciatus (GC)* A. fasciatus AY639091.2 – GeneBank (América Central)

A. fasciatus (GD)* A. fasciatus AY639092.2 – GeneBank (América Central)

AM AF287414.1 A. mexicanus AF287414.1 – GeneBank (América Central)

A.aff.bim-1 A. aff. bimaculatus Rio Doce – MG. Bacia Rio Doce - BRA

A.aff.para-1 A. aff. paranae Ribeirão Keller – PR. Bacia alto rio Paraná - BRA

A.bock-1 A. bockmanni Riacho “Lazinho” – GO. Bacia do rio Paranaíba - BRA

A.sp.B-1 Astyanax sp. B Salto Osório - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.C-2 Astyanax sp. C Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.C-10 Astyanax sp. C Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.C-11 Astyanax sp. C Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.D-25 Astyanax sp. D Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.D-26 Astyanax sp. D Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.D-27 Astyanax sp. D Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.E-1 Astyanax sp. E Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.E-2 Astyanax sp. E Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.E-3 Astyanax sp. E Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.F-2 Astyanax sp. F Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.F-56 Astyanax sp. F Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

A.sp.F-130 Astyanax sp. F Rio Iguaçu - PR. Bacia do rio Iguaçu - BRA

Moenkhausia M .aff. intermedia Rio Paraná – PR. Bacia do alto rio Paraná - BRA

DNA Mitocondrial, amplificação e seqüenciamento: O gene citocromo b (cytb) foi a região

do DNA mitocondrial (mtDNA) utilizada para a investigação das relações filogenéticas das

espécies de Astyanax estudadas. Amplificou-se parcialmente o gene cytb mediante a Reação

de Cadeira Polimerase (PCR) a partir do DNA total de indivíduos. Para tal feito, foi utilizado

o par de primers L14841 (5´-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3´) e H15149 (5´-

CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3´). As condições de amplificação seguiram as

apresentadas por Prioli et al. (2002). A mistura de reação de amplificação consistiu-se

basicamente de tampão Tris-KCl (Tris-HCl 20 mM pH 8,4 e KCl 50 mM), MgCl

1,5 mM,

2,5 µM de cada primer, 0,1 mM de cada dNTP, 2,5 U/Reação de Taq DNA polimerase, DNA

genômico 15 ng e água deionizada e autoclavada para completar 25 µL. O fragmentos de

mtDNA foram amplificados segundo o seguinte perfil térmico: desnaturação inicial a 95°C

por um minuto, continuando com 35 ciclos de 95°C (15 seg.), 53°C (30 seg.), 72°C (30 seg.).

Uma extensão final de 72°C por oito minutos terminou a reação.

Em seguida, alíquotas desses produtos foram visualizados num gel de agarose 1%,

corado com brometo de etídio 20 mg/100 mL) para comparação com quantidades conhecidas

de DNA do fago λ, determinando, assim, o tamanho da seqüência dos genes amplificados.

Posteriormente, as amostras foram purificadas usando-se polietileno glicol (PEG) para

eliminação do excesso de primers e resíduos de nucleotídeos segundo protocolo de Rosenthal

et al. (1993).

Por último, as amostras de DNA (cerca de 50 ng) amplificado em cada reação de

PCR foram usadas diretamente em reações de seqüenciamento com BigDye

Terminator

Cycle Sequencing, em um seqüenciador automático MegaBACE 1000 (DNA Analysis System),

de acordo com instruções do fabricante.

Análises filogenéticas e genealógicas: Todas as seqüências amplificadas do gene

mitocondrial citocromo b foram alinhadas com o programa ClustalW (Higgins et al., 1996) e

editadas pelo programa BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.1 (Hall, 1999). Em seguida as

seqüências foram analisadas utilizando-se o programa ModelTest 3.7 (Posada & Crandal,

1998) para seleção do melhor modelo de substituição nucleotídica entre as distintas taxas de

substituição que explica a matriz de dados gerados.

Para as análises filogenéticas foi usado o programa PAUP 4.0 (Phylogenetic Analysis

Using Parcimony, Sworfford, 2000). Todos os caracteres foram tratados como não-ordenados

com quatro estados possíveis (A, C, T e G) e excluindo-se aqueles caracteres

filogeneticamente não-informativos.

Num enfoque de inferência cladística, a análise dessa linha filogenética foi feita por meio

do critério de máxima-verossimilhança (maximum-likelihood) - método que elege o melhor

modelo de substituição nucleotídica que maximiza uma probabilidade, para gerar uma árvore

sob a hipótese inferida mais adequada. Uma análise genealógica de cunho fenético foi feita

mediante o algoritmo união-de-vizinhos (neighbor-joining) para gerar uma matriz de distância

a partir da opção de Tamura-Nei. A seleção desse algoritmo estima as relações genealógicas

pela minimização das distâncias entre os táxons e dentro da árvore, gerando assim, um índice

de semelhança. A construção da árvore neighbor-joining foi realizada usando-se do modelo

de substituição nucleotídica sugerido pelo Modeltest 3.7 (Posada & Crandall, 1998). Os

valores mais confidentes nos nodos foram avaliados perfazendo-se mil repetições (bootstrap)

retendo-se aqueles com freqüência maior que 50%, os quais foram utilizados para avaliar o

suporte para clados individuais dentro de cada árvore. Enraizaram-se as árvores geradas com

o critério de grupos externos (outgroups) usando-se Moenkhausia aff. intermedia pelo fato

deste gênero, que comporta essa espécie, ter sido colocado como táxon próximo de Astyanax

no estudo de Calcagnotto et al. (2005).

Utilizando-se o programa Mega 4.0, gerou-se uma matriz de distância Tamura-Nei das

seqüências nucleotídicas dos exemplares e, a partir dessa, obteve-se a matriz de auto-vetores

pelo programa DistPCoA (Legendre & Anderson, 1998). Em seguida, um gráfico de dispersão

em coordenadas principais foi confeccionado utilizando-se os três primeiros auto-vetores

(eixos) por meio do programa STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., 2001).

Também se realizou uma análise bayesiana, na qual calculou-se a probabilidade posterior

das relações genealógicas sob o melhor modelo de evolução previamente escolhido no

Modeltest 3.7. Para explorar melhor esse parâmetro, correu-se as Cadeias de Markov e

Simulação de Monte Carlo (MCMC) por meio do programa MrBayes 3.0 (Huelsenbeck &

Ronquist, 2001). As 20.000 primeiras gerações (e 1.333 árvores) foram descartadas pela

opção burn-in e somente os resultados das últimas 280.000 gerações (28.667 árvores) foram

usados para computar o consenso acima de 50% na retenção dos ramos da árvore gerada.

Por último, obtiveram-se as freqüências de bases nucleotídicas, números de transições e

transversões entre os indivíduos, mediante o programa Mega 4.0 - Molecular Evolutionary

Genetics Analysis (Tamura et al., 2007).

RESULTADOS

Um fragmento de 308 pares de bases (pb) do gene citocromo b do DNA mitocondrial

foi seqüenciado para cada espécime deste estudo (Tabela 1), com exceção dos indivíduos que

foram utilizados do GeneBank. Depois de alinhadas e editadas, utilizou-se uma seqüência de

200 pares de bases (pb) para as análises, devido a maior porcentagem de confiança encontrada

nesse intervalo.

As informações geradas pelo método likelihood, sob os critérios de correção Akaike

(AIC – Akaike, 1974), consideraram os valores de proporção de sítios variáveis; obtendo-se

como ótimo o modelo TrN+I (-lnL = 1008.1279, AICc = 2.290.8320). As freqüências das

bases nucleotídicas foram de freqA = 0.2743, freqC = 0.2862, freqG = 0.1473, freqT = 0.2922

e de substituição de modelos [A-C] = 1.0000, [A-G] = 4.3746, [A-T] = 1.0000, [C-G] =

1.0000, [C-T] = 0.9918 e [G-T] = 1.0000. A proporção de sítios invariáveis (I) foi de I =

0,5032; as taxas de razão transição/transversão foram de K

= 0,34 (purinas) e K

= 16, 23

(pirimidinas) e a razão geral de transições/transversões (R – [A*G*K

+ T*C*K

] /

[A/G]*[T/G] ) foi de R = 4,41.

Ambas as árvores geradas pelas inferências fenética (neighbor-joining, Figura 1 A) e

cladística (maximum-likelihood, Figura 1B) foram congruentes para gerar três grandes clados,

que foram denominados aqui como Grupo A, Grupo B e Grupo C.

A reconstrução filogenética de ambas as árvores mencionadas acima posiciona

algumas espécies que provavelmente haviam sido identificadas equivocadamente (por

exemplo, A.asun-6 e A.asun-8; que correspondem a A. abramis) e outras que não foi possível

identificar morfologicamente (e.g. A.sp-481 é da espécie A. altiparanae). Tendo-se altos

valores de bootstraps que suportam tais posicionamentos citados acima: 83/70 e 86,

respectivamente.

Figura 1. Árvores filogenéticas de união-de-vizinhos (A) e máxima-verossimilhança (B) geradas a partir das seqüências parciais do gene

citocromo b das espécies mostradas na Tabela 1. Os valores de bootstrap (1.000 repetições) encontram-se nas ramificações dos clados.

Dentro de cada um dos clados menores, denominados aqui como ASU (A.

asuncionensis), SP-B (Astyanax sp. B), aff.BIM (A. aff. bimaculatus) , ABRA (A. abramis),

ALTI (A. altiparanae), GB(fas/mex: A. fasciatus e A. mexicanus, das regiões da América

Central) , aff.PARA (A. aff. paranae), SP-C (Astyanax sp. C), BOCK (A. bockmanni), SP-488

(não-identificado), FASC (A. fasciatus), SP-D (Astyanax sp. D), SP-E (Astyanax sp. E) e SP-F

(Astyanax sp. F), observou-se baixa variação genética (Tabela 2); ou com índices não

computados (N/C) - quando havia apenas um indivíduo compondo o clado - ou com índices

menores de 0,007. É exceção, nesse caso, o agrupamento GB(fas/mex), que possui variação

de 0,023. Explica-se, porém, o valor mais elevado pelo fato de esse clado ser constituído por

espécies haplotípicas (A. fasciatus GD/GA/GC/FE) e de uma espécie distinta (A. mexicanus)

que foram agrupadas juntas aqui, em uma resolução filogenética mais baixa, para generalizar

um grupo mais amplo.

Tabela 2. Distância genética (Tamura-Nei) dentro de cada clado

Clados Distância (d)

1. ASU

0,000

2. SP-B

N/C

3. aff-BIM

N/C

4. ABRA

0,008

5. ALTI

0,000

6. GB(fas/mex)

0,023

7. aff-PARA

N/C

8. SP-C

0,007

9. BOCK

N/C

10. SP-488

N/C

11. FASC

0,005

12. SP-D

0,000

13. SP-F

0,000

14. SP-E

0,000

15. MOENK

N/C

Quando se compararam as distâncias genéticas entre os clados dentro dos grupos A, B

e C, notaram-se valores relativamente baixos (Tabela 3). Para exemplificar, dentro do grupo

A, a distância mais alta foi encontrada entre os clados ABRA e SP-B (0,074), o restante das

combinações possíveis não ultrapassa o valor de 0,047. Desta forma, evidencia-se maior ou

menor parentesco entre as espécies dentro de cada um dos três grandes grupos formados.

No grupo A, as menores distâncias genéticas foram entre ASU e aff. BIM (0,015) e

ASU e ALTI (0,010). No grupo C, os clados SP-F e SP-E também mostram alto grau de

parentesco entre si (distância genética de apenas 0,010). Por outro lado, o clado SP-D tem

uma distância grande dos clados SP-E e SP-F (0,154 e 0,165 respectivamente), além de alta

divergência da espécie Astyanax sp. D em relação às outras duas que compartilham o mesmo

agrupamento, com pode ser visto nas Figuras 2 e 3.

Dentro do grupo B foi onde se notou a maior distância genética das análises (entre

GB(fas/mex) e BOCK, que foi de 0,148). Isso provavelmente se explica pelo fato dos

indivíduos que tiveram suas seqüências adquiridas no GeneBank serem de regiões da América

Central, pois, vêem-se valores de distância genéticas relativamente baixas quando

comparados apenas os indivíduos (clados) das bacias do Brasil. O indivíduo SP-488 não se

agrupou em nenhum clado, mas possui menores distâncias com o clado FAS (0,034) e SP-C

(0,024) do que com, por exemplo, ABRA (0,160) ou ALTI (0,127) sugerindo que pode ser

uma espécie diferente das demais que foram agrupadas devidamente em seus clados, mas que

possui mais semelhança com os indivíduos dos clados FAS e SP-C.

Tabela 3. Distância genética (Tamura-Nei) entre os clados. A letras entre parênteses correspondem ao grupo que os clados se agruparam

(A=Grupo A; B= Grupo B. C= Grupo C)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 ABRA (A)

2 ALTI (A)

0,036 -

3. ASUN (A)

0,025 0,010 -

4. FASC (B)

0,198 0,157 0,163 -

5.GB(fas/mex) (B)

0,154 0,126 0,141 0,119 -

6. aff-BIM (A)

0,041 0,026 0,015 0,158 0,163 -

7. aff-PARA (B)

0,135 0,103 0,103 0,070 0,113 0,123 -

8. SP-488 (B)

0,160 0,127 0,127 0,034 0,115 0,147 0,042 -

9. BOCK (B)

0,180 0,145 0,145 0,068 0,148 0,151 0,047 0,052 -

10. SP-B (A)

0,074 0,047 0,047 0,158 0,170 0,031 0,135 0,148 0,151 -

11. SP-C (B)

0,152 0,118 0,118 0,040 0,120 0,124 0,035 0,024 0,034 0,124 -

12. SP-D (C)

0,191 0,173 0,190 0,251 0,183 0,213 0,216 0,244 0,262 0,216 0,244 -

13. SP-E (C)

0,177 0170 0,177 0,214 0,210 0,199 0,172 0,180 0,213 0,219 0,199 0,154 -

14. SP-F (C)

0,172 0,164 0,172 0,208 0,204 0,193 0,167 0,174 0,207 0,214 0,194 0,165 0,010 -

Dentro dos três grandes clados verificou-se diversidade genética de 0,023; 0,064 e

0,070 nos grupos A, B e C, respectivamente (Tabela 4) e, quando analisadas as distâncias

genéticas entre esses grupos, os valores colocam o Grupo A mais próximo do Grupo B

(0,122) e mais distante do Grupo C (0,159).

Tabela 4. Distância genética (Tamura-Nei) dentro de cada grupo

Grupo A

0,023

Grupo B

0,064

Grupo C

0,070

A maior distância entre esses grupos foi verificada entre os Grupos B e C, que foi de

0,185 (Tabela 5). Essas distâncias são melhor vistas no gráfico de dispersão (Figura 2), onde

as distâncias Tamura-Nei emparelhadas em escalas dimensionais geraram os respectivos

valores de auto-vetores.

Tabela 5. Distância genética (Tamura-Nei) entre os grupos.

Grupo A Grupo B Grupo C

Grupo A

- - -

Grupo B

0,122 - -

Grupo C

0,159 0,185 -

A. asuncionensis

A. altiparanae

A. abramis

A. fasciatus

GB (fasc/mex)

A. aff. bimaculatus

A. aff. paranae

Astyanax sp. 488

A. bockmanni

Astyanax sp. B

Astyasnax sp. C

Astyanax sp. D

Astyanax sp. E

Astyanax sp. F

Moenkhausia

Figura 2. Gráfico 3D de dispersão em coordenadas principais (auto-vetores 1, 2 e 3) de espécies

de Astyanax e do grupo externo Moenkhausia.

Com relação às probabilidades a posteriori, a árvore gerada pela inferência bayesiana

(Figura 3) também demonstra visualmente essas distâncias vistas no gráfico de dispersão

(Figura 2) e explicitadas na tabela de distância genética entre esses três grandes grupos

(Tabela 5). Além disso, apresenta altos valores de probabilidades posteriores, ou seja, a

tendência das ramificações geradas quando se supõe um grande número de gerações

posteriores possuírem valores acima e 97% nas ramificações que sustentam os clados de

maior pertinência.

Figura 3. Árvore filogenética bayesiana gerada sob as simulações das Cadeias de Markov e

Simulação de Monte Carlo (MCMC). Os semicírculos pontilhados ( ... ), tracejados ( _ _ _ ) e

tracejado-pontilhados ( _ . _ . _ . ) correspondem aos grupos C, A e B, respectivamente. Os

valores nas ramificações geradas correspondem a porcentagem da probabilidade posterior das

últimas 280.000 gerações simuladas segundo o modelo de substituição nucleotídica TrN+I.

DISCUSSÃO

Com o presente estudo filogenético pode-se sugerir que os Astyanax do rio Iguaçu não

se diversificaram a partir de um único ancestral que ficou isolado quando a bacia se formou,

sugerindo a possibilidade de pelo menos três grupos de Astyanax terem ficado isolados

durante a formação da bacia. Tais grupos foram denominados aqui como Grupos A, B e C,

reforçando hipóteses de que Astyanax representa um grupo de complexa identificação, como

vistos em estudos morfológicos (e.g. Weitzman & Malabarba, 1998) e de abordagens

genéticas (e.g Calcagnotto et al. 2005; Porter et al. 2007).

No grupo C, que agrupa as espécies Astyanax sp. F, Astyanax sp. E e Astynax sp. D, há

uma distância genética alta dessa última espécie em relação aos outros dois agrupamentos -

0,165 e 0,154, respectivamente (Tabela 3). A diversidade genética dentro deste grande grupo

também foi a maior dos três grandes grupos formados, ou seja, 0,070 (Tabela 4). Isso sugere

que os clados formados por Astyanax sp. F e Astyanax sp. E tendem a divergir de Astyanax sp.

D, como pode ser melhor observado na Figura 3. Esse tipo de análise, que tem inferência

bayesiana, mostra um alto valor de probabilidade a posteriori (98%) para a ramificação entre

esses dois sub grupos, que simula a tendência filogenética de futuras gerações.

A posição e distância genética de Astyanax sp. D em relação aos dois clados citados

anteriormente, sugerem que a separação dessa espécie dos grupos ancestrais que deram

origem às espécies agrupadas no Grupo C se deu num passado mais distante, enquanto

Astyanax sp. F e Astyanax sp. E teriam uma diferenciação mais recente (dentro do Grupo C),

o que se confirma com a baixa distância genética entre essas duas espécies, que foi de apenas

0,010. Kantek (2005) levantou a hipótese que as inversões e padrão de heterocromatina

observadas em cromossomos de Astyanax sp. D teriam sido decorrentes de fenômenos

geológicos que teriam dividido a espécie em várias populações isoladas entre si, permitindo,

deste modo, diferenciações ao nível heterocromático. Em algum momento da história

evolutiva recente da espécie, essa barreira teria desaparecido e os indivíduos das várias

localidades voltaram a se cruzar, impedindo a ocorrência de um evento de especiação.

Tais suposições corroboram-se às mudanças climáticas que ocorreram durante o

Período Quaternário, que influenciaram a distribuição da cobertura vegetal na região da bacia

do rio Iguaçu. Elas teriam causado, em períodos glaciais curtos, expansões e retrações

sucessivas, tanto das florestas, quanto das áreas de vegetação aberta. Durante os períodos

glaciais, ocorreu a expansão dos núcleos de aridez e semi-aridez e conseqüente retração das

florestas. Nos períodos interglaciais, porém, ocorreu expansão das florestas e retração das

áreas áridas (Van Der Hammem, 1974; Ab´saber, 1977; Bigarella & Andrade-Lima, 1982).

Com a expansão das florestas, aumento da precipitação e diminuição das áreas áridas, o rio

Iguaçu teria se tornado menos severo para estes organismos e, assim, as populações

anteriormente separadas teriam tornado a se cruzar (Kantek, 2005).

Devido ao surgimento das Cataratas do Iguaçu, ocorrido há aproximadamente 22

milhões de anos (Período Oligo-Mioceno), as populações de peixes da bacia do rio Iguaçu

foram isoladas por quedas que apresentam até cerca de 70m de desnível (Maack, 1981). Tal

fato teria favorecido um processo de especiação, que seria responsável pelo considerável grau

de endemismo apresentado por sua ictiofauna. Tomando-se em conta esses dados geológicos,

pode-se sugerir que Astyanax sp D teria se isolado reprodutivamente num pretérito mais

longínquo do que as espécies Astyanax sp E e Astyanax sp F, devido, provavelmente, à

especificidade de habitat da primeira espécie em questão.

Essas mudanças paloeclimáticas teriam causado a interrupção da distribuição

geográfica contínua de muitos táxons por meio da alteração de vários fatores limitantes à

distribuição, tais como alteração do nível d´água, temperatura e composição química da água.

A fragmentação de áreas de distribuição geográfica teria repercutido no isolamento de várias

de suas populações. Isto teria criado condições propícias para diferenciações locais e até

mesmo especiações, dependendo do tempo geológico envolvido (Bigarella &Andrade-Lima,

1982; Weitzman & Weitzman, 1982; Lucinda, 1995).

No grupo B, vêem-se dois grupos distintos de Astyanax fasciatus (Figs. 1A, 1B e 2): o

mais basal, proveniente do rio Tibagi, da bacia hidrográfica do alto rio Paraná e o clado

superior com haplótipos de regiões das bacias da América Central, além de um exemplar de

A. mexicanus da região do México. Os índices que suportam a separação destes clados em

ambas as árvores filogenéticas (Figura 1) geradas têm altos valores de bootstrap (75 e 80) nas

análises de união-de-vizinhos e máxima-verossimilhança, respectivamente. A distância

genética alta (0,119) entre os grupos corrobora que A. fasciatus é, na verdade, um complexo

de espécies. A espécie A. mexicanus aparecendo como grupo irmão de A. fasciatus

provenientes da América central está em congruência com os resultados de Strecker et al.

(2004) e Porter et al. (2007).

Melo (2005) salienta que somente os espécimes provenientes da bacia do rio São

Francisco, local de onde o material tipo dessa espécie foi primeiramente coletado

(Eigenmann, 1921), devam ter a denominação A. fasciatus, uma vez que se vêem diferenças

morfológicas em relação às outras espécies do complexo que ocorrem, por exemplo, no alto

curso do rio Paraná e no rio Paraíba do Sul (Melo, 2001). Os exemplares de outras bacias na

verdade seriam, segundo o último autor citado, espécies crípticas do “complexo de espécies A.

fasciatus”, ou ainda, outras espécies. Dados citogenéticos também confirmam a plasticidade

de organismos que são identificados como A. fasciatus, já que é possível identificar três

citótipos padrão com base no pareamento dos cromossomos homólogos, sendo 2n=46, 48 e

50, com pequenas diferenças cariotípicas populacionais dentro de cada citótipo (Artoni et al.,

2006; Pazza et al., 2006; Kavalco, 2008;).

Em relação aos dois clados de A. fasciatus analisados aqui, há estudos que levantam o

tempo de divergência para esses grupos. Porter et al. (2007), baseando-se em calibragem do

gene citocromo b, sugerem que a divergência de A. mexicanus na América Central tenha se

iniciado há cerca de 5-2 Ma (Plioceno), que é o grupo irmão de A. fasciatus daquela região.

Strecker et al. (2004) defendem a hipótese que a média de divergência para os A. fasciatus

(também da América Central) é de 3,1 Ma, que corresponderia à conclusão da formação do

Istmo do Panamá há cerca de 3 Ma (Bussing, 1985; Myers, 1966). Tal fato teria permitido A.

fasciatus ser capaz de invadir a América Central depois do fechamento terrestre; fato que

também é assumido para outros peixes de água doce (Bermingham & Martin, 1998; Perdices

et al., 2002). Kavalco (2008) também sugeriu um tempo de divergência para A. fasciatus,

desta vez para os provenientes da bacia do alto rio Paraná (entre outras localidades). Neste

estudo, tal espécie se situa em um clado que teria uma divergência estimada de 4,3 Ma. Além

disso, a mesma autora também realizou análises filogenéticas com o gene ATPase6/8, o qual

se mostrou pouco variável, sugerindo, também, uma separação recente para esse grupo.

Baseando-se nesses dados, pode-se inferir que as espécies da bacia do alto rio Paraná são de

uma linhagem mais antiga do que os espécimes do mesmo táxon das regiões da América

Central.

Um estudo de Pazza et al. (2006) ressaltou, por meio de dados gerados por padrões

cromossômicos, que os exemplares da bacia do Alto rio Paraná podem fazer parte de um

grupo mais diverso de peixes que estão organizados sob um mesmo gênero, o que sustentaria

a idéia de uma divergência relativamente antiga. No gráfico de dispersão de auto-vetores

(Figura 2) e nas árvores filogenéticas (Figuras 1 e 3), pode-se notar que mesmo entre os

quatro exemplares amostrados, um deles (fasc-604) é mais distante dos outros três indivíduos

sob a mesma nominação, o que sugere que pode ser um haplótipo distinto que demonstra, por

sua vez, que mesmo numa amostra pequena é notada variação intraespecífica acentuada.

Na pesquisa de Pazza et al. (2006), também é salientada a semelhança dos padrões de

distribuição dos genes de rDNA 5S, que são compartilhados entre A. aff. fasciatus e A.

bockmanni. O grupo B desse estudo comporta A. fasciatus e A. bockmanni, corroborando,

assim, a semelhança sugerida no estudo acima. No entanto, Kavalco (2008) ressalta a

dificuldade de se inferir relações evolutivas acerca desta espécie (A. bockmanni), uma vez

que, mesmo compartilhando genes de rDNA 5S em posição intersticial num cromossomo M

com A. fasciatus, A. bockmanni não apresenta DNA satélite As-51, que é notado nos citótipos

da espécie anterior. Esse impasse para relacionar A. bockmanni com robustez para com

outros táxons também é notado no presente estudo, pois mesmo tendo certa proximidade com

A. fasciatus (0,068) e Astyanax sp. C (0,034) a espécie em questão se encontra num ramo

evolutivo divergente de tais grupos, como pode ser melhor visto na árvore bayesiana (Figura

3).

Ainda em relação ao Grupo C, vê-se a maior proximidade genética da espécie

Astyanax sp C com A. bockmanni (distância genética de 0,034) com valores altos de bootstrap

nas árvores filogenéticas união-de-vizinhos (83) e máxima-verossimilhança (76) (vide Tabela

3 ou Figura 2). Kavalco (2008), levantando o provável tempo de divergência para A. fasciatus

e A. bockmanni, sugere um tempo de 4,3 Ma.

De acordo com Lundberg et al. (1998), no período Mioceno médio (20 -11,8 Ma), o

platô Sul-americano sofreu estresse compressivo no sudeste brasileiro, que teria resultado no

soerguimento da “estrutura Arujá” (Riccomini, 1989), que eventualmente separou as

drenagens do Tietê e Paraíba do sul. Ao oeste, um novo sistema fluvial foi estabelecido com a

direção atual leste-oeste para o presente rio Tietê (Coimbra et al., 1983). Ao leste, a

reorganização da drenagem do Paraíba do Sul encontrou um período de erosão durante o

tempo de atividade tectônica no Plioceno-Pleistoceno, provavelmente num ambiente mais

quente e úmido (Lunderberg et al, 1998). Tais processos evidenciam que a divergência das

espécies A. fasciatus e A. bockmanni é mais recente do que a separação de Astyanax sp. C dos

grupos ancestrais que teriam dado origem aos organismos do grupo B, uma vez que esta

última espécie, do rio Iguaçu, teria se isolado das bacias adjacentes num passado mais

longínquo (Mioceno).

No Grupo A, a tendência observada é que as espécies agrupadas aqui fazem parte do

“complexo de espécies A. altiparanae-bimaculatus” que, segundo Kavalco (2008),

compartilham características citogenéticas semelhantes, como traços simplesiomórficos já

vistos anteriormente em Characidae (Scheel, 1973; Morelli et al., 1983; Portela et al., 1988;

Daniel-Silva & Almeida-Toledo, 2001; 2005), e o número diplóide de 50 cromossomos

(Pazza & Kavalco, 2007). Ingenito et al. (2004) também ressaltam a alta similaridade de

aspectos morfológicos (mais especificamente, a coloração) entre A. aff. bimaculatus e A.

abramis que no presente estudo se agrupam no mesmo grande clado que comporta A.

asuncionensis e A. altiparane. Tais semelhanças já haviam sido vistas por Eigenmann (1921)

que, inclusive, teria agrupado as espécies A. abramis, A. asuncionensis (que hoje são

reconhecidas como espécies válidas) como subespécies de A. aff. bimaculatus. O

posicionamento de A. altiparanae também está de acordo com estudos anteriores (Graça &

Pavanelli, 2002; Prioli et al., 2002), que ressaltam essa espécie como uma designação recente

dada às populações do alto rio Paraná do grupo conhecido anteriormente como A. bimaculatus

(Garutti & Britski, 2000). A distância genética baixa (0,026, Tabela 3) entre essas duas

espécies (ALTI x aff. BIM) também sugere uma divergência mais recente.

A separação relativamente recente dos clados agrupados no Grupo A pode estar

relacionada ao “padrão C” de padrões de distribuição do trabalho de Ribeiro (2006). Segundo

este autor, a categoria de divisão mais recente dos padrões de distribuição de espécies de

peixes de água doce reflete os eventos vicariantes mais recentes entre os escudos cristalinos

de rios e as drenagens adjacentes costeiras que levaram ao reconhecimento de espécies

compartilhadas entre elas. Ativas áreas tectônicas ocorridas num período mais recente que 1,6

Ma (Saaid et al., 2002) teriam feito possível o compartilhamento da fauna ictiológica das

bacias centro-sul com as drenagens costeiras, ressaltando-se as áreas que incluem as

cabeceiras do rio Ribeira de Iguape, Iguaçu e Paranapanema, além da porção do alto rio Tietê.

Durante os períodos Pleistoceno e Holoceno, a costa sul-americana sofreu

transgressões marinhas e flutuações no nível do mar. Estudos sobre o Quaternário brasileiro

(Saadi, 1993; Riccomini & Assumpção, 1999; Saadi et al. 2002; Ribeiro, 2006) ressaltam que

a Fissura Continental do Sudeste Brasileiro (CRSB) teve pronunciada atividade e reativações

de estruturas geomorfológicas ancestrais que teriam gerado novas falhas. Essas mudanças

topográficas relativamente recentes teriam resultado na reativação de crostas litológicas

anciãs descontínuas, além dos rearranjos fluviais causados por esses processos geológicos. Na

família Characidae, há o exemplo dos membros da subfamília Glandulocaudinae, tribo

Glandulocaudini que têm, no gênero Mimagoniates, maior diversidade específica (seis

espécies) e distribuição mais ampla ao longo das drenagens costeiras. Por outro lado, seu

grupo irmão, do gênero Glandulocauda (duas espécies), que é primitivo em atributos

morfológicos, é endêmico ao escudo cristalino do sul do Brasil, mais especificamente nos rio

Tietê e alto Iguaçu (Weitzman et al., 1988; Weitzman & Menezes, 1998).

Uma das características geológicas mais proeminentes no sudeste do Brasil foi a

formação do Arco de Ponta Grossa, que se consistiu de um soerguimento do embasamento

cristalino da porção sudeste da bacia do Paraná (Petri & Fulfaro, 1983) que teria provocado a

aceleração do dinamismo fluvial entre os sistemas de drenagens adjacentes, acelerando o

intercâmbio ictiofaunístico entre elas. Movimentos verticais entre os blocos fraturados e

evolução erosiva dos rios ao longo de tais clivagens teriam promovido uma mistura entre as

drenagens adjacentes que explicaria, por exemplo, as trocas ictiológicas que ocorreram entre o

rio costeiro Ribeiro de Iguape e os rios Iguaçu e Paranapanema (Ribeiro, 2006).

O mesmo levantamento tectônico pode ser responsável por mandar de volta para a

bacia do Alto Paraná uma biota aquática que uma vez estava associada às drenagens costeiras

baixas durante uma fase erosiva e tectônica intermediária. De fato, a idéia do sudeste do

Brasil ser uma área ativa tectonicamente e propensa a sofrer deformações (Cobbold et al.,

2001) é fortemente suportada por estes complexos padrões de distribuição incluídos no

“padrão C” de Ribeiro (2006). A intensa atividade tectônica ao longo da fissura continental

do sudeste brasileiro também explicaria o porquê da bacia do Paraná contribuir mais (em

termos de estoques ancestrais) para o desenvolvimento de faunas ictiológicas, como foi

mencionado por Bizerril (1994). No entanto, há teorias que propõem que a diversificação da

fauna dos rios de drenagens costeiras da América do Sul também está relacionada às

mudanças do nível no mar durante o Pleistoceno tardio (Weitzman et al., 1988), que levanta a

hipótese de que, quando o nível no mar era em torno de cem metros mais baixo que hoje, a

fauna ictiológica foi capaz de se tornar mais dispersiva e, seguindo-se um levantamento do

nível marítimo, a especiação teria ocorrido dentro de bacias de rios isoladas. É, pois, nesse

período que ocorrem as oscilações da pressão aquática ao longo da plataforma relacionada a

mudanças no nível do mar (Almeida & Carneiro, 1998; Riccomini & Assumpção, 1999;

Cobbold et al., 2001; Riccomini et al., 2004).

O relevo atual do centro-sul brasileiro começa efetivamente a ser definido no limite

Mioceno/Plioceno, com a formação de uma grande bacia de drenagem que envolvia as bacias

do Paraná, Uruguai e Paraguai (King, 1956; Maack, 1968). Durante o Plioceno Médio ocorre

o soerguimento da serra de Maracaju (Fulfaro & Suguio, 1974), que vem a constituir o divisor

das bacias Paraná e Paraguai. O canal atual do rio Paraná, escavado nos resistentes paredões

do arenito Caiuá, instala-se provavelmente no início do Quaternário (Stevaux, 1994). Tais

dados geomorfológicos corroboram-se às inferências de divergência relativamente recente

sugeridas por distâncias genéticas baixas (0,010) entre as espécies da bacia do Paraguai

(ASU) e da bacia do rio Paraná (ALT); e destas com o clado composto, em sua maioria, com

espécimes provindos da bacia do rio Cuibá/Manso (ABRA), com distâncias genéticas de

0,025 (ABRA x ASU) e 0,036 (ABRA x ALTI).

Baseado nos dados geológicos mostrados acima se pode inferir que a diferenciação de

Astyanax sp. B, assim como as outras espécies endêmicas do rio Iguaçu discutidas aqui, teria

ocorrido num passado mais remoto, quando comparadas às prováveis especiações entre o

restante das espécies dentro do Grupo A (e das outras espécies endêmicas do Iguaçu, em seus

respectivos grupos). Uma vez que as distâncias genéticas entre Astyanax sp. B, quando

comparadas com o restante dos outros clados do Grupo A, são mais altas do que quando se

comparam as outras espécies em questão entre si, que não mostram valores maiores do que

0,041 (e.g. ABRA x aff. BIM, Tabela 3).

Kantek et al. (2008), trabalhando com as espécies Astyanax sp. B., Astyanax sp. C e

Astyanax sp. D, corroboram as divergências de tais espécies vistas no presente estudo. A

grande distância entre Astyanax sp. D com as demais espécies do rio Iguaçu está em

congruência com os dados destes autores, uma vez que ressaltam que Astyanax sp. D difere de

Astyanax sp. B e Astyanax sp. C sob abordagens cromossômicas específicas. Não obstante, os

dados que Kantek et al. (2008) geraram em relação aos padrões de sítios 5S rDNA reforçam a

diferenciação entre estas três espécies discutidas, uma vez que Astyanax sp. B pode ser

claramente diferenciada destas outras duas espécies por apresentar um cromossomo

metacêntrico portando locus de rDNA 5S, que não está presente em Astyanax sp. C e

Astyanax sp. D. Além disso, a presença destes sítios específicos em cromossomos

metacêntricos também são observados em outras espécies de Astyanax; entre elas a espécie A.

altiparanae, que no presente estudo ficou agrupada no mesmo grande grupo que Astyanax sp.

B (Grupo A).

Sendo o gênero Astyanax um grupo complexo, com histórias evolutiva e biogeográfica

não esclarecidas por inteiro, faz-se necessário o aumento de estudos que incitem a discussão e

agregação de dados para o afloramento de novas idéias e hipóteses para o melhor

entendimento deste táxon. O presente estudo contribui para o estabelecimento de algumas

relações entre algumas espécies, principalmente sobre a origem dos Astyanax do rio Iguaçu,

que já vinham sendo discutidas em trabalhos anteriores, e direciona novas linhas de

abordagens para a melhor compreensão das nebulosas relações filogenéticas e biogeográficas

implícitas na evolução deste grupo ictiológico. Os dados levantados aqui estão à disposição

para gerar corroborações e/ou contrariedades que dêem maior robustez na compreensão

taxonômica e evolutiva dos lambaris das bacias brasileiras e sul-americanas. Não obstante,

esses dados deixam a sugestão da importância da união de dados geomorfológicos (tais como

evoluções litológicas e hidrográficas das bacias sobre as quais a fauna a ser estudada se

estabeleceu) aos estudos de evolução biológica dos organismos que ali vivem, como bem

levantou Leopold et al. (1964), ao afirmarem que “um rio deve ser melhor pensado como

tendo uma herança do que uma origem”.

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