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LEANDRO MUTSCHALL
ANÁLISE DA RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DA PROTEÍNA VEGF E O
ESTADIAMENTO DO CÂNCER COLORRETAL
JOINVILLE
2009
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LEANDRO MUTSCHALL
ANÁLISE DA RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DA PROTEÍNA VEGF E O
ESTADIAMENTO DO CÂNCER COLORRETAL
JOINVILLE
2009
Dissertação de mestrado apresentada como
requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Saúde e Meio Ambiente, na
Universidade da Região de Joinville.
Orientador: Prof. Dr. Mauro de Souza Leite
Pinho.
Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Henrique
Condeixa de França.
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Dedico este trabalho à minha esposa Diana,
com amor, admiração e gratidão, por sua
compreensão, estímulos, carinho e presença que me
impulsionaram a buscar vida nova a cada dia. Meus
agradecimentos por ter aceito se privar de minha
companhia pelos estudos, concedendo a mim a
oportunidade de me realizar ainda mais.
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores Prof. Dr. Mauro de Souza Leite Pinho e Prof. Dr. Paulo
Henrique Condeixa de França;
A Leslie E. Ferreira pela sua paciência e atenção;
Ao Serviços Integrados de Patologia, especialmente ao Dr. Hercílio Fronza
Júnior e a Rodrigo Blasius;
Aos meus professores e colegas do Mestrado em Saúde e Meio Ambiente -
Turma VI, com os quais tive momentos agradáveis e inesquecíveis.
"Existe uma coisa que uma longa existência me
ensinou: toda a nossa ciência, comparada à realidade,
é primitiva e inocente; e, portanto, é o que temos de
mais valioso."
Albert Einstein
RESUMO
Os estudos em biologia molecular desenvolvidos nas últimas décadas,
possibilitaram grandes avanços para uma maior compreensão da carcinogênese
colorretal. Na década de 80 pesquisadores descobriram uma proteína com a
capacidade de aumentar a permeabilidade dos vasos sangüíneos. Inicialmente esta
proteína foi denominada como fator de permeabilidade vascular. Estudos posteriores
correlacionaram esta proteína com o crescimento de novos vasos sangüíneos
(angiogênese), quando passou a ser chamada de fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF). A proteína VEGF tem sido apontada como o principal fator promotor
da angiogênese, dentre os vários já conhecidos. Neste trabalho o objetivo foi quantificar
a proteína VEGF e correlacionar os resultados com o estadiamento tumoral em
amostras de adenocarcinoma colorretal. Foram incluídos 56 adenocarcinomas
colorretais, nos quais a detecção da proteína VEGF foi realizada por imunoistoquímica
através da construção de uma matriz tecidual e sua quantificação com análise digital de
imagens assistida por computador. Nossos resultados não evidenciaram relação
estatisticamente significativa entre a expressão da proteína VEGF e o estadiamento
tumoral ou presença e número de linfonodos comprometidos. Baseado no nível de
expressão da proteína VEGF não foi possível inferir a presença de linfonodos
comprometidos nas amostras analisadas.
Palavras-Chave: VEGF, cólon, câncer
ABSTRACT
Development of studies in molecular biology over last decades have contributed
for better knowledge about colorectal carcinogenesis. An important landmark in this
process was the identification of a protein with effect on vascular permeability eventually
named as vascular endothelial growth factor (VEGF), which seems to be essential for
the angiogenesis activation of tumor development. The aim of this study was to assess
the VEGF expression and correlate to tumor staging in colorectal cancer. Surgical
specimens from 56 colorectal cancer patients were analyzed by immunohistochemistry
for VEGF expression using a multitissue array and a computer-assisted image system.
No significant result was found between VEGF expression and tumor staging or lymph
nodes metastasis. We concluded that no predictive value for lymph nodes metastasis
could be demonstrated by VEGF immunostaining in this study.
Key-Words: VEGF, colon, cancer.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Modelo genético para a carcinogênese colorretal...........................................17
Figura 2: Extração do tecido para montagem do multibloco ..........................................35
Figura 3: Multibloco montado e seu respectivo molde ...................................................36
Figura 4: Obtenção das imagens. ..................................................................................39
Figura 6: Demonstração do processamento das imagens.............................................40
Figura 7: Exemplo de imunoistoquímica para detecção da proteína VEGF...................44
LISTA DE TABELAS
Tabela1: Estadiamento do câncer colorretal no sistema TNM.......................................20
Tabela 2: Dados pessoais e histopatológicos. ...............................................................43
Tabela 3: Valores do escore de expressão da proteína VEGF. .....................................45
Tabela 4: Dados estatísticos obtidos na comparação dos escores com o estadiamento
tumoral. ..........................................................................................................................46
Tabela 5: Comparação da expressão da proteína VEGF com a profundidade de invasão
tumoral. ..........................................................................................................................46
Tabela 6: Comparação da expressão da proteína VEGF com o número de linfonodos
invadidos........................................................................................................................47
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO...............................................................................................................10
OBJETIVO......................................................................................................................12
1 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................................13
1.1 O Câncer..................................................................................................................13
1.1.1 O Câncer Colorretal...............................................................................................15
1.1.2 O Estadiamento do Câncer Colorretal (sistema TNM) ..........................................18
1.2 A Angiogênese e a Proteína VEGF..........................................................................20
1.3 Os Tumores e a Proteína VEGF ..............................................................................22
1.4 O Carcinoma Colorretal e a Proteína VEGF.............................................................23
1.5 Análise Computadorizada para Quantificação Imunoistoquímica ............................28
1.6 Matriz de Amostras Teciduais (Tissue Array)...........................................................32
2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................34
2.1 Casuística.................................................................................................................34
2.2 Construção da Matriz de Amostras Teciduais (Tissue Array)...................................35
2.3 A Técnica de Imunoistoquímica ...............................................................................36
2.4 A quantificação da reação imunoistoquímica...........................................................37
2.4.1 Obtenção das Imagens .........................................................................................38
2.4.2 Determinação do Perfil de Segmentação..............................................................38
2.4.3 Processamento das Imagens (quantificação)........................................................40
3 RESULTADOS............................................................................................................42
4 DISCUSSÃO...............................................................................................................48
CONCLUSÃO.................................................................................................................53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................................54
INTRODUÇÃO
Estima-se que no ano de 2007 o câncer tenha causado 7,9 milhões de mortes no
mundo, representando aproximadamente 13% de todas as mortes ocorridas. O câncer
colorretal foi um dos mais prevalentes, representando a terceira causa mais comum,
alcançando 677 mil mortes (World Health Organization, 2008). No Brasil as estimativas
para o ano de 2008, válidas também para 2009, são de 466.730 novos casos de
câncer, destes casos aproximadamente 27.000 podem ter origem colorretal (BRASIL,
2007).
Os estudos em biologia molecular desenvolvidos ao longo das duas últimas
décadas possibilitaram grandes avanços no sentido de uma maior compreensão da
carcinogênese colorretal. Considerando a existência de estágios intermediários
determinados pela presença de pólipos com diferentes graus neoplásicos, Vogelstein e
colaboradores realizaram trabalhos pioneiros ao analisar o processo de degeneração
da mucosa colônica normal até o surgimento de um carcinoma em pacientes portadores
de polipose adenomatosa familiar, demonstrando a ocorrência de um acúmulo de
mutações em genes expressando proteínas com ação sobre as divisões celulares,
como a APC, k-ras, DCC e p53.
Embora estes conceitos iniciais tenham sido de grande valor, tornou-se logo
evidente sua excessiva simplicidade devido à demonstração de que estas proteínas
representavam não apenas um número extremamente reduzido de genes/proteínas
envolvidas no processo de carcinogênese, mas também contemplavam apenas um
aspecto desta, representada pelo distúrbio proliferativo, etapa primordial porém
insuficiente para o surgimento da neoplasia invasiva.
11
Folkman (1971) propôs no princípio da década de setenta a importante
participação do desenvolvimento de microcirculação no processo de crescimento
tumoral. Denominado como angiogênese, este processo tem sido demonstrado como
um fator de grande relevância, uma vez que o desenvolvimento de novos vasos
sangüíneos são necessários para o suporte de oxigênio, nutrientes e também remover
moléculas tóxicas. A indução da angiogênese é regulada por várias moléculas que
podem ser liberadas por células tumorais, ou células normais, incluindo células
endoteliais, células epiteliais, células mesoteliais e leucócitos. Dentre estas moléculas
esta um grupo de proteínas chamadas de VEGF (vascular endothelial growth factor),
sendo considerado um dos mais importantes fatores de crescimento endotelial e indutor
da angiogênese. Esta proteína, provavelmente está ligada ao crescimento tumoral e ao
aparecimento de metástases. Sendo assim, supomos que a expressão da proteína
VEGF, nos carcinomas colorretais possa apresentar-se de forma diretamente
proporcional ao grau de estadiamento tumoral, representado em especial pela presença
de metástases linfonodais.
A imunoistoquimica tem sido empregada como técnica padrão para a
identificação da expressão e quantificação tecidual de proteínas, sendo hoje uma
ferramenta básica nos estudos de biologia molecular. Utilizada usualmente na prática
clínica através da análise de espécimes individuais em lâminas, estudos realizados ao
longo dos últimos anos tem a associado com a técnica Matriz de Amostras Teciduais
(Tissue Array) através da qual podemos agregar múltiplas amostras de diferentes
tecidos em uma mesma lâmina. A quantificação imunoistoquímica normalmente é
realizada por observadores (semiquantitativa), porém a quantificação via análise de
imagens assistida por computador vem se tornando popular no meio científico.
OBJETIVO
Verificar a hipótese de que os níveis de expressão imunoistoquímica da proteína
VEGF nos carcinomas colorretais são superiores nos tumores com presença de
metástase em linfonodos regionais, utilizando-se uma Matriz de Amostras Teciduais e
análise de imagens assistida por computador.
1
REVISÃO DE LITERATURA
1.1 O Câncer
Um essencial componente da vida celular é a capacidade de produzir cópias de
si mesma, devendo estas serem realizadas com grande fidelidade. Para que isto ocorra
uma abrangente maquinaria molecular de controle do ciclo celular é acionada e a
elucidação do funcionamento deste complexo mecanismo está apenas no início. A
existência de uma múltipla sinalização intracelular e extracelular torna este estudo
extremamente complexo, sendo que a maior parte deste conhecimento é derivado de
modelos sistêmicos indutores da carcinogênese em animais (DEVITA, HELMAN,
ROSEMBERG, 1997).
Para a biologia celular o câncer tem uma importância singular. A família de
doenças agrupadas com este nome mostra distúrbios das regras fundamentais do
comportamento celular em um organismo multicelular. Nas células somáticas a
mutação, a competição e a seleção natural são os ingredientes básicos do câncer. As
células individuais e mutantes prosperam a custa das células vizinhas, levando o tecido
a um colapso, destruindo toda a sociedade celular (ALBERTS, 1997).
Nos últimos quinze anos, tem havido uma revolução no conhecimento da gênese
do câncer humano. Sua natureza genética foi estabelecida através da identificação de
genes e suas mutações, cuja contribuição funcional no aparecimento do câncer tem
sido bem definida (FENOGLIO-PREISER, 1998).
14
A divisão celular é um fator crítico na mutagênese e tecidos com uma baixa taxa
de mitose possuem uma pequena incidência de câncer. As mutações podem ocorrer
durante a duplicação do DNA, entretanto do ponto de vista mutagênico a enzima DNA
polimerase comete erros com uma freqüência muito baixa, sendo desprezíveis no
processo da carcinogênese. Produtos do metabolismo celular ou agentes mutagênicos
externos podem provocar lesões no DNA, sendo mais comuns que os erros causados
pela DNA polimerase. Tanto as lesões como os erros na duplicação do DNA, podem ser
corrigidos por mecanismos de reparo existentes nas células. Eventuais falhas nestes
mecanismos podem permitir que erros ou lesões sejam transmitidos para as células
filhas, resultando em mutações (ROSSI, 1999).
Uma só mutação não é suficiente para o aparecimento da célula cancerígena.
Evidências demonstram que como regra geral, vários, raros e independentes acidentes
causadores de mutações são necessários para a gênese de uma célula tumoral. Além
disto, o desenvolvimento de tecidos progressivamente indiferenciados possibilita o
acúmulo de novas mutações, as quais podem inclusive variar dentro do próprio tecido
tumoral (ALBERTS, 1997).
Estudos recentes sugerem que a renovação celular dos tecidos se inicia em um
grupo de células especiais, denominadas como células tronco, as quais apresentam um
ciclo de vida bastante longo, podendo aparentemente atingir anos. Acredita-se hoje que
isto ocorra inicialmente através da formação de um tipo especial de células
denominadas como progenitoras ou transitórias, as quais irão por seu turno gerar as
linhagens diferenciadas de células maduras. Em decorrência desta longevidade, estas
células tronco são provavelmente aquelas capazes de acumular mutações, as quais
15
irão então dar origem a uma população de células tumorais contendo um ganho
proliferativo, sendo então denominadas como células tronco tumorais.
1.1.1 O Câncer Colorretal
Os tumores gastrointestinais são responsáveis por uma grande fração dos
tumores humanos (DEVITA, HELMAN, ROSEMBERG, 1997). Dentre esses o câncer
colorretal é terceira causa mais comum de câncer no mundo, em ambos os sexos,
sendo a segunda em países desenvolvidos (BRASIL, 2007). Exibe amplas variações
geográficas na sua freqüência, sendo mais comum na região oeste da Europa, na
América do Norte, na Nova Zelândia e na Austrália. Estudos epidemiológicos japoneses
demonstraram que entre 1967 e 1971 o índice de casos de câncer de cólon era de 5.6
a cada cem mil habitantes. Um novo levantamento feito entre 1983 e 1987, mostrou que
este índice mudou para 17.1 casos a cada cem mil habitantes, revelando uma
tendência crescente desta doença (FENOGLIO-PREISER, 1998).
Estimativas de casos novos para o ano de 2008 são de 12.490 casos em
homens e 14.500 casos em mulheres. Estes valores correspondem a um risco estimado
de 13 novos casos a cada 100.000 homens e 15 para cada 100.000 mulheres.
Desconsiderando os tumores de pele não melanoma, entre os homens o câncer
colorretal é o terceiro mais freqüente na região Sudeste, seguido pelas regiões Sul e
Centro-Oeste onde é o quarto mais freqüente. Nas regiões Nordeste e Norte ocupa a
quinta e a sexta posição respectivamente. Para as mulheres é o segundo mais
freqüente na região sudeste. Nas regiões Sul, Centro-Oeste e Nordeste é o terceiro
mais freqüente enquanto na região norte é o quinto mais freqüente (BRASIL, 2007).
16
Pinho et al (2003) procederam um levantamento retrospectivo de todos os casos
de câncer colorretal diagnosticados na cidade de Joinville no período de 1995 a 1999.
Foram identificados 251 casos de carcinoma colorretal, representando um percentual
de 4,9% em relação ao total de tumores malignos diagnosticados e uma incidência
anual de 13,1 novos casos por 100.000 habitantes estando superior à média de novos
casos estimados para Santa Catarina (8,4), Região sul (11,64) e Brasil (9,65).
O câncer colorretal está associado principalmente a fatores ambientais e
genéticos. Estes dois fatores, provavelmente atuam em pontos diferentes da
progressão neoplásica. Estudos envolvendo vários pacientes portadores de câncer
colorretal, mostraram que a hereditariedade é muito importante no processo da
carcinogênese, sendo este o fator de risco mais importante para esse tipo de neoplasia
(FENOGLIO-PREISER, 1998; BRASIL, 2007).
Modelos sugerem que a carcinogênese possui muitas fases, guiadas pela
mutação num grupo variado de genes, havendo ainda um relacionamento direto com
fatores ambientais específicos (DEVITA, HELMAN, ROSEMBERG, 1997). Uma dieta
com base em gorduras animais, baixo consumo de cereais, frutas e outros vegetais,
associada ao tabagismo, consumo excessivo de álcool e sedentarismo servem como
exemplos de fatores ambientais que elevam o risco para o desenvolvimento do câncer
colorretal (BRASIL, 2007).
Neves (2006) demonstrou que as diferenças regionais no Brasil quanto à
distribuição da incidência do câncer colorretal, estão diretamente associadas aos
hábitos alimentares. O alto consumo de óleos, gorduras e carnes está ligado a taxas
mais elevadas da incidência do câncer colorretal. Este autor sugere ainda que a
17
associação entre o consumo de gordura e esta neoplasia pode estar relacionado à
maior excreção biliar e a formação de produtos metabólicos provenientes de lipídios.
O câncer colorretal, na maioria dos casos, tem sua origem em pólipos
neoplásicos, inicialmente não invasivos. Esta evolução do aspecto normal da mucosa
até o aparecimento de um carcinoma, passa por alterações morfológicas microscópicas
e depois macroscópicas. Isto possibilitou avanços no conhecimento da biologia
molecular do câncer, principalmente tratando-se do estudo da polipose adenomatosa
familiar (PINHO, 2005).
Num estudo realizado com 172 amostras de lesões colorretais, os resultados
reforçam a idéia da acumulação de alterações afetando pelo menos um oncogene e
vários genes supressores tumorais. Este estudo reforça a idéia da natureza progressiva
das alterações genéticas envolvidas na carcinogênese colorretal (VOGELSTEIN, et al,
1988).
Figura 1: Modelo genético para a carcinogênese colorretal proposto por Fearon e Vogelstein (1990).
Fearon e Vogelstein (1990), em artigo de revisão, relacionaram as principais
alterações genéticas do processo de carcinogênese colorretal, envolvendo oncogenes e
genes supressores de tumor. A figura 1 mostra um esquema produzido pelos autores
18
sugerindo que cada alteração ocorre geralmente numa determinada fase da progressão
neoplásica, estando possivelmente relacionada com um gene específico.
A mutação ou perda do gene FAP (familial adenomatous polyposis), localizado
no braço longo do cromossomo 5 ocorre na transição do epitélio normal para epitélio
hiperplásico. A hipometilação do DNA transforma o epitélio hiperplásico num adenoma
jovem, que associado a mutações no gene K-RAS (retrovirus-associated DNA
sequences), localizado no braço curto do cromossomo 12, transforma-o num adenoma
intermediário. A perda do gene DCC (deleted in colon carcinoma) localizado no braço
longo do cromossomo 18 faz com que o adenoma intermediário transforme-se em
adenoma tardio e sua função, aparentemente é de supressão tumoral. A transição de
adenoma para carcinoma foi relacionada com a perda da funcionalidade no gene p53
localizado no braço curto do cromossomo 17. Entretanto a ordem destas mutações
pode variar, bem como sua acumulação correlaciona-se com a capacidade do
carcinoma para metastatizar e reduzir a sobrevida do paciente.
1.1.2 O Estadiamento do Câncer Colorretal (sistema TNM)
O estadiamento tumoral é o elemento mais importante na avaliação prognóstica
do câncer, sendo hoje estabelecida internacionalmente a utilização do sistema TNM, o
qual classifica os tumores através pela extensão anatômica local e à distância,
determinada clínica e histopatologicamente. A letra “T” do sistema corresponde ao nível
de invasão local do tumor, a letra “N” à presença e extensão de metástases em
linfonodos regionais, enquanto a letra “M” relaciona-se à presença de metástase à
distância. A adição de números a essas letras indica a extensão do câncer: T0, T1, T2,
19
T3, T4; N0, N1, N2 e M0, M1, variando sua definição de acordo com o órgão ou tecido
de origem primária do tumor.
No câncer colorretal, a classificação TNM está baseada na profundidade da
invasão da parede intestinal, invasão de estruturas adjacentes, número de linfonodos
regionais envolvidos e a presença ou ausência de metástase à distância. O câncer
colorretal é classificado como TX se o tumor primário não puder se avaliado, T0 quando
não há evidência de tumor primário. Tumores classificados como Tis, são chamados de
carcinoma in situ, estando restrito à mucosa (intra-epitelial). O T1 invade a submucosa,
o T2 alcança a muscular própria, o T3 quando esta é ultrapassada, podendo atingir a
sub-serosa ou os tecidos peri-cólicos e peri-retais. O estadiamento T4 corresponde ao
comprometimento direto de outros órgãos ou estruturas, assim como as perfurações
livres para a cavidade peritonial.
Os linfonodos regionais são classificados como NX se não puderem ser
avaliados, N0 se não houver nenhum linfonodo comprometido, N1 se houverem 1 a 3
linfonodos com metástases e N2 se houverem 4 ou mais linfonodos comprometidos. A
metástase à distância é classificada como MX se não puder ser avaliada, como M0 se
não for detectada e como M1 se for detectada. Esta classificação quando feita pelo
exame histopatológico segue precedido da letra “p” minúscula (pT, pN, pM), sendo
dividido em grupos por estádios como mostra a tabela 1.
20
Tabela1: Estadiamento do câncer colorretal no sistema TNM.
Estádio Tumor primário Linfonodos Regionais Metástase a distância
0 Tis N0 M0
I T1, T2 N0 M0
IIA T3 N0 M0
IIB T4 N0 M0
IIIA T1, T2 N1 M0
IIIB T3, T4 N1 M0
IIIC Qualquer T N2 M0
IV Qualquer T Qualquer N M1
Fonte: BRASIL, 2004.
1.2 A Angiogênese e a Proteína VEGF
Em condições fisiológicas o endotélio vascular é quiescente, com uma taxa de
divisão celular muito baixa e com tempo de renovação de centenas de dias. Durante o
processo de angiogênese as células endoteliais saem do seu estado quiescente e
podem reproduzir-se rapidamente, mas este efeito é focal e curto (DEVITA, HELMAN,
ROSEMBERG, 1997).
Acredita-se que quando as células nos tecidos são privadas de oxigênio, estas
liberam fatores que induzem a formação de novos capilares. Provavelmente, por esta
razão, as células de um vertebrado estão localizadas a pelo menos 50 mm de um
capilar (ALBERTS, 1997), sendo que a proliferação e sobrevivência celular dependem
de um adequado suprimento de nutrientes, oxigênio e da remoção de moléculas
tóxicas.
O processo de angiogênese tem sido alvo de intensos estudos há décadas. É
resultado de um equilíbrio entre alguns fatores que estimulam e outros que inibem o
crescimento de novos vasos sangüíneos. Em tecidos normais predominam os fatores
21
de inibição da angiogênese. Nos tecidos neoplásicos há uma mudança no perfil,
passando para fenótipos estimuladores (DEVITA, HELMAN, ROSEMBERG, 1997).
A indução da angiogênese é mediada por múltiplas moléculas que regulam o
processo de invasão, penetração, proliferação e formação de novos vasos sangüíneos.
Aproximadamente quatorze proteínas ligadas a angiogênese já foram sequenciadas e
clonadas. Dentre elas podemos citar os fatores de crescimento de fibroblastos (FGF),
interleucina-8 (IL-8), angiogenina, angiotropina, fator de crescimento epitelial (EGF),
fibrina, nicotinamida, fator de necrose tumoral-α (TNF-α), etc. (DEVITA, HELMAN,
ROSEMBERG, 1997; FERRARA, GERBER, LE-COUTER, 2003).
Além destes fatores citados acima, devemos destacar uma proteína, conhecida
como VEGF (vascular endothelial growth factor), que atua seletivamente sobre as
células endoteliais, estimulando a angiogênese e a permeabilidade vascular em
situações diferentes, parecendo ser esta a via utilizada por alguns tumores para
aumentar o aporte sangüíneo (ALBERTS, 1997; FERRARA, GERBER, LE-COUTER,
2003).
Originalmente o VEGF foi descrito como fator de permeabilidade vascular (VPF),
identificado nos anos 80. Os experimentos de Senger et al (1983) perceberam que o
fluido derivado da ascite causada por tumores em cobaias tinha capacidade de
rapidamente elevar a permeabilidade microvascular. Atividade similar que também foi
secretada quando estas células tumorais e outras linhagens tumorais foram cultivadas
in vitro. Este fator, responsável pelo aumento da permeabilidade, foi purificado do
líquido ascítico e do meio de cultura de uma linhagem tumoral (10 hepatocarcinoma),
compreendendo uma proteína com peso molecular que varia entre 34 a 42 Kda.
22
Atualmente constitui uma família de glicoproteínas diméricas, pertencentes a
uma super família de fatores de crescimento derivados das plaquetas, a qual inclui sete
membros denominados como VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F
e o fator de crescimento placentário (PlGF). Todos os membros desta família possuem
um domínio do VEGF comum (HOEBEN et al, 2004).
O gene codificante do VEGF-A está no braço curto do cromossomo 6 (6p21.3),
constituído por 8 exons separados por 7 introns (PODAR, 2005). O peso molecular do
fator VEGF-A, varia entre 34 a 42 kDa e possui uma estrutura dimérica, sendo que os
níveis mais altos de expressão em tecidos normais são encontrados no pulmão, rim,
coração e glândula adrenal. Em níveis mais baixos porém ainda detectáveis, no fígado,
baço e mucosa gástrica. Em humanos, o splicing alternativo do gene codificante do
fator VEGF-A, pode gerar até sete isoformas: VEGF
121
, VEGF
145
, VEGF
148
VEGF
165
,
VEGF
183
, VEGF
189
e VEGF
206
(HOEBEN et al, 2004).
1.3 Os Tumores e a Proteína VEGF
O crescimento dos tumores é regulado pela angiogênese e se não fosse invadido
por capilares, seu tamanho não passaria de alguns poucos milímetros de diâmetro.
Para crescer mais um tumor deve induzir o crescimento endotelial em seu interior,
possibilitando a formação de uma rede capilar intra-tumoral. Os sinais gerados pela
necessidade de sangue estimulam uma resposta das células endoteliais que inclui pelo
menos quatro etapas consecutivas. Inicialmente, as células rompem a lâmina basal que
circundam um vaso sangüíneo existente. Em seqüência, as células endoteliais movem-
23
se em direção ao sinal, devendo em seguida proliferar até a etapa final, quando ocorre
a formação dos tubos capilares. (ALBERTS, 1997).
A hipótese de que o crescimento tumoral é dependente da angiogênese foi
inicialmente apresentada em 1971 por Judah Folkman. A capacidade tumoral de induzir
a angiogênese, independe aparentemente de seu grau de malignidade e há
considerável confusão na literatura sobre esta questão. O adenoma adrenal por
exemplo, é benigno e altamente angiogênico (FOLKMAN, 1990).
Uma grande variedade de tumores sólidos mostram uma super expressão da
proteína VEGF, incluindo carcinomas primários e metastáticos (ELLIS et al, 2000).
Tumores humanos de mama, pulmão, cérebro, pâncreas, ovário, rim e vesícula, super
expressam as isoformas VEGF
165,
VEGF
189
e VEGF
206
do fator VEGF-A (PODAR,
2005).
Catena et al (2007), demonstraram que a isoforma VEGF
121
é mais abundante
em tumores prostáticos do que em amostras de cultura de células de próstata normais.
Demonstraram também que este aumento está relacionado com o incremento da
angiogênese tumoral.
1.4 O Carcinoma Colorretal e a Proteína VEGF
Diversos trabalhos tem relacionado a proteína VEGF com o crescimento, fatores
prognósticos e a sobrevida de pacientes com carcinoma colorretal. Kekec et al (2006)
utilizando a técnica de imunoistoquímica, analisaram oitenta e nove casos de carcinoma
colorretal, e destes sessenta e cinco casos (73%) expressaram a proteína VEGF-A. Os
pacientes com maior sobrevida (59 meses) apresentaram resultados negativos para
24
VEGF-A. Os resultados positivos foram separados conforme a intensidade da reação,
positivo (+), (++) e (+++). Os pacientes com menor sobrevida (11 meses), tiveram
resultados positivo (+++). Entretanto, os resultados da expressão da proteína VEGF,
quando comparados com fatores prognósticos conhecidos, tais como, estadiamento e
grau de invasão tumoral, invasão da serosa, invasão linfática e metástase à distância
não mostraram diferenças estatisticamente relevantes.
Altomare et al (2007) avaliou a expressão da proteína VEGF e do fator tecidual
(TF), também conhecido como CD142. Utilizando a técnica de imunoistoquímica avaliou
a mucosa normal e o tecido tumoral de 50 pacientes com câncer colorretal. Estes
pacientes foram acompanhados por três anos para verificação da possível recorrência
da doença. Ambos os fatores foram detectados em todas as amostras tumorais sendo a
expressão da proteína VEGF maior no tecido tumoral que no tecido normal (p<0,0001),
resultado este também confirmado com a medição dos mRNA(s). Houve também uma
forte correlação entre os níveis de expressão da proteína VEGF e TF (p<0,0005) no
tecido tumoral, porém não observada no tecido normal. Não houve correlação
estatística dos níveis de expressão das proteínas VEGF e TF com o estádio, grau ou
tamanho tumoral. Os níveis do TF não mostraram correlação com o aumento no risco
de recorrência. Fato contrário foi observado quando os níveis de expressão da proteína
VEGF foi alto, sugerindo este ser um fator de risco independente para a recorrência
tumoral.
Zheng et al (2003) estudaram a densidade microvascular (MVD) e
correlacionaram com a expressão da proteína VEGF. Foram selecionados 97 casos de
carcinoma colorretal, submetidos a técnica de imunoistoquímica usando anticorpos
monoclonais anti-VEGF e anti-fator CD34. Significante correlação foi encontrada entre
25
MVD e a graduação do carcinoma. Não houve relação significativa entre MVD e idade,
sexo e estadiamento tumoral. A MVD foi maior e estatisticamente significativa no grupo
positivo para a proteína VEGF. Reação positiva para VEGF foi observada em 68 dos 97
casos estudados. Não foi observada correlação significativa entre a expressão da
proteína VEGF e o estadiamento tumoral.
Em estudo realizado por Doger et al (2006) foram correlacionadas a expressão
da proteína VEGF com a expressão do receptor para o fator de crescimento epidérmico
(EGFR) em 60 casos de carcinoma de cólon, utilizando imunoistoquímica. Os
resultados mostraram um tempo de sobrevivência médio de 28,93 (2-52) meses no
grupo negativo para EGFR, 23,92 (6-46) meses para o grupo com baixa expressão de
EGFR e de 17 (10-40) meses para os pacientes com alta expressão de EGFR. Os
casos VEGF negativos tiveram um tempo de sobrevivência médio de 27,50 (4-52)
meses, os grupos com baixa e alta expressão da proteína VEGF tiveram uma sobrevida
média de 29,33 (6-48) e 14,5 (2-40) meses respectivamente. Com estes dados os
autores concluíram que EGFR/VEGF não são indicadores da sobrevida dos pacientes e
o valor prognóstico de sua expressão talvez deva ser questionado.
Funaki et al (2003) estudaram oitenta e três pacientes com carcinoma colorretal
primário. Foram consideradas positivas para a proteína VEGF-D amostras com mais de
10% de células tumorais marcadas. As diferenças nos resultados de expressão da
proteína VEGF-D não foram estatisticamente relevantes quando comparadas com o
grau histológico, profundidade de invasão do tumor, metástase hepática, metástase
peritoneal, invasão linfática ou venosa. Também não houve relevância estatística nas
diferenças observadas entre o tempo de sobrevivência dos pacientes positivos e
negativos para a proteína VEGF-D. Entretanto, a expressão do fator VEGF-D
26
correlacionou-se significativamente com a presença de metástase em linfonodos, sendo
um fator independente. Cinqüenta e um casos não possuíam metástases em
linfonodos, sendo que destes apenas nove mostraram positividade para VEGF-D. Em
trinta e dois casos havia metástase em linfonodos e destes dezessete mostraram
positividade para VEGF-D (p<0,01).
Outro estudo realizado por Takahashi et al (1995) avaliou a expressão da
proteína VEGF e seu receptor KDR, bem como o fator VIII para contagem de vasos
sangüíneos. Foram incluídos 52 casos de carcinoma de cólon (24 com metástase e 28
sem metástase) e 10 adenomas. A intensidade da reação para detecção da proteína
VEGF foi significativamente maior nos tumores com metástase do que nos tumores sem
metástase e adenomas (p<0,001 e p<0,001 respectivamente). Porém não houve
diferença entre a intensidade de coloração dos tumores sem metástase e os adenomas.
A presença da reação positiva para o receptor KDR foi mais freqüente nos casos com
metástase que nos sem metástase (p=0,02), novamente pequenas diferenças foram
observadas entre adenomas e carcinomas sem metástase. A contagem dos vasos
sangüíneos correlacionou-se com a expressão da proteína VEGF, tanto no interior do
tumor (p < 0,05) como na borda invasiva (p<0,001). Esse achados suportam a hipótese
que a proteína VEGF é um importante fator angiogênico nos casos de carcinoma de
cólon primários e metastáticos. A avaliação da expressão da proteína VEGF e a
contagem de vasos podem servir de auxílio para detecção de pacientes com risco de
desenvolverem metástases originárias do carcinoma de cólon.
Kazama et al (2004) estudou a expressão da proteína VEGF-C em 79 adenomas
de cólon, 8 adenomas com carcinomas in situ e em 85 carcinomas invasivos de cólon.
Uma forte coloração foi obtida em 70 dos 79 adenomas, entretanto a coloração foi focal
27
em todos os casos e não houve correlação com o grau de displasia ou o tamanho dos
adenomas. Em 6 amostras dos adenomas com carcinoma in situ a região
carcinomatosa mostrou uma região positiva para a proteína VEGF-C maior que na
região adenomatosa. Das 85 amostras de carcinoma invasivo 83 foram claramente
positivas para a proteína VEGF-C. Foram observadas em 40% das amostras positivas
aspecto focal de coloração e em 60% aspecto difuso de coloração. Nos carcinomas
invasivos a expressão da proteína VEGF-C correlacionou-se significativamente com
invasão linfática, metástase em linfonodos e tamanho tumoral. Não houve correlação
com invasão venosa e metástase hepática. O tempo de sobrevida tendeu a ser menor
no grupo com forte expressão da proteína VEGF-C, porém essas diferenças não foram
estatisticamente relevantes quando comparadas com o grupo de baixa expressão.
Atualmente há poucas dúvidas de que a família VEGF tem um papel importante
na regulação da angiogênese embrionária e pós natal. A inibição de VEGF inibe a
angiogênese patológica numa ampla variedade de modelos tumorais. Este aspecto leva
ao desenvolvimento farmacológico de drogas que tenham como alvo a regulação deste
fator. Parece haver consenso entre os estudiosos a respeito da importância da proteína
VEGF no crescimento de tumores em geral, incluindo o câncer colorretal. Apesar disso
ainda há grande discordância quanto a correlação da expressão da proteína VEGF e o
estadiamento tumoral, bem como sua correlação com a presença e a ausência de
metástases em linfonodos e a distância.
28
1.5 Análise Computadorizada para Quantificação Imunoistoquímica
Na medida em que os anos passam, novas biomoléculas são identificadas e
correlacionadas às mais diversas patologias existentes. Baseado neste contexto faz se
também necessário o conjunto aperfeiçoamento das técnicas e equipamentos para a
correta identificação e quantificação destas biomoléculas. A técnica de
imunoistoquímica vem há muito sendo utilizada na detecção e quantificação de
antígenos/marcadores, que podem ser utilizados, por exemplo, na subtipagem e
prognóstico de neoplasias.
Os métodos padrão para medição da expressão de antígenos numa reação
imunoistoquímica são semiquantitativos, geralmente levando em consideração e
extensão e a intensidade da coloração obtida. Sannino e Shousha (1994) quantificaram
a expressão de receptores de estrogênio (ER) em carcinomas mamários. Utilizaram
cinco categorias para graduação da expressão, variando do negativo (-) até o
fortemente positivo (++++). O percentual de células coradas foi dividido em: ocasionais
células coradas/menos que 1/3 (escore 1); menos que 2/3 de células tumorais coradas
(escore 2) e mais que 2/3 de células coradas (escore 3). A intensidade da coloração foi
dividida em: moderada (escore 1) e intensa (escore 2). Portando foram considerados
como negativos (-) casos sem a marcação para ER; positivos (+) quando ocasionais
células foram observadas; positivo (++) quando ocasionais células com intensidade
moderada (escore 1X1); positivo (+++) quando o escore variar entre 2 e 4; e positivo
(++++) quando o escore for 6.
Outra forma de se realizar a quantificação das reações imunoistoquímicas é o
processamento de imagens assistida por computador. Hernadez-Blazquez et al (2000)
29
avaliaram o grau de metilação do DNA de 13 pacientes submetidos à cirurgia para
extração de carcinoma colorretal. A quantificação da reação imunoistoquímica para
detecção da proteína 5-methylcytidine foi realizada em áreas de tecido normal e
cancerígeno. Os núcleos morfologicamente alterados exibiram pontos densos dentro
de áreas fracamente coradas. Os núcleos normais exibiram coloração densa, escura e
uniforme. A análise das imagens possibilitou calcular a densidade óptica média de
ambos os tecidos, demostrando constante e significativa menor intensidade nas
amostras neoplásicas.
Foi desenvolvido no Departamento de Medicina da Universidade de Washington,
em trabalho realizado por Underwood et al (2001), um sistema de análise de imagens
assistida por computador baseado na subtração de cor, batizado como CS-CAIA.
Segundo este grupo de pesquisadores, a quantificação das reações imunoistoquímicas
pelos métodos tradicionais tende a ser difícil, exige múltiplos observadores e geram
dados qualitativos. Para desenvolver o método CS-CAIA, segmentos cutâneos de
camundongos diabéticos (db/db) e de seu tipo selvagem da mesma ninhada (db/-)
foram corados por imunoistoquímica para o marcador neural PGP 9.5 (protein gene
product 9.5). As áreas positivamente coradas foram isoladas da coloração de fundo
com a utilização de um protocolo previamente determinado. A coloração remanescente
teve determinado o número de regiões coradas, a fração de área corada e a densidade
da área medida. Os resultados mostraram que o sistema CS-CAIA é eficiente para
contagem dos nervos epidérmicos, medir a fração de área corada e a sua densidade, e
que as diferenças apuradas foram significativamente menores no camundongos db/db
quando comparados aos camundongos db/-.
30
Marks et al (2008) do Departamento de Pós-graduação em Cirurgia Experimental
da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) estudaram os efeitos da modulação
do inositol hexafostato (IP6). Utilizaram a técnica de imunoistoquímica para marcador
biológico de apoptose, num modelo de carcinogênese de cólon induzida por
azoximetano (AOM). Foram utilizado 112 ratos wistar, distribuídos em 4 grupos. Grupo
A (controle), grupo B (AOM 5 mg/Kg
-1
, 2x a partir da 3 semana), grupo C (IP6 em água
a 1%) e grupo D (IP6+AOM). A quantificação da imunoexpressão para o marcador
inositol 1,4,5 triphosphate receptor type III (Itpr3) foi realizada com o uso de
processamento de imagem assistida por computador. Foram capturadas 10 imagens de
cada amostra, centrando sempre as criptas. Utilizando o software Image Lab
TM
e o
método duplo-cego, foi quantificada a densidade da coloração marrom, correspondente
à expressão da proteína Itpr3 em percentual de área (com filtro RGB, fundo azul e
intervalo de cor 0 a 147). Os resultados mostraram significante diferença entre os
grupos na expressão da proteína Itpr3 sendo que o inositol hexafosfato promove a
modulação deste marcador na carcinogênese do cólon.
Rieux et al (2002) compararam a análise de imagens para obtenção da
densidade óptica e a contagem por observação visual de células coradas para o
produto do proto-oncogene c-fos (proteína Fos) no núcleo supraquiasmatico. A
contagem de células por observação visual foi mais subjetiva devido aos valores
limiares não serem precisamente definidos e variaram conforme o observador,
iluminação, intensidade da reação ou outros fatores. Por outro lado a medição da
densidade óptica é mais objetiva e pode ser realizada com mais parâmetros, condições
de iluminação e o limiar (cut off) pode ser mantido constante durante todo o
experimento. Estes autores concluíram que a análise computadorizada de imagens é
31
um método preciso e rápido para determinar a quantidade da proteina Fos no núcleo
supraquiasmatico, possibilitando compreender os mecanismos envolvidos no ciclo
circadiano.
Diaz et al (2004) também realizaram um estudo comparativo entre o método
manual (semiquantitativo) e o processamento de imagens assistida por computador.
Utilizaram neste estudo 70 amostras de carcinoma mamário invasivo corados pela
técnica de imunoistoquímica para o receptor de estrogênio (ER). A reação foi
quantificada por três patologistas e os escores obtidos foram comparados usando o
sistema QCA image-analysis (Lake Bluff, IL), utilizando 10% com nível de corte para
positividade. O escore de consenso dos patologistas foi altamente comparável com os
escores determinados pelo sistema QCA (Kappa= 0.84) podendo este último ser
utilizado na quantificação imunoistoquímica da expressão do receptor de estrogênio.
Carai et al (2002), usando o software Image-Pro Plus 4.1 (Media Cybernetics,
USA), baseado no processo de segmentação de cor, que visa identificar e isolar
determinadas estruturas, baseadas na sua cor, quantificaram a fibrose pulmonar.
Amostras pulmonares de dez pacientes com diferentes patologias e vários graus de
fibrose pulmonar foram submetidas à coloração de Masson. Os resultados dos
componentes identificados (área, tecido e fibrose) foram estatisticamente relevantes e
suportam a hipótese que a distribuição da fibrose depende da relativa quantidade de
tecido e ao mesmo tempo atesta a precisão do método. Baseado nestes resultados, o
método adotado pode ser utilizado nos trabalhos anátomo patológicos e na patologia
forense, tornando mais objetiva e reproduzível a quantificação da fibrose pulmonar em
amostras de autópsias ou biópsias.
32
Johansson et al (2001) avaliaram as diferenças na quantificação do infiltrado
leucocitário em imagens com alta (100X) e baixa (12.5X) magnificação usando o
software Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, USA). Neste estudo foram utilizados
344 ratos, implantados com células do modelo de tumor cerebral N32, e após 10 dias,
imunizados com células que expressam interferon-γ, com detecção do infiltrado
leucocitário por imunoistoquímica. Os resultados gerados por ambas as magnificações
não mostraram diferenças significativas e permitem eficiente e reprodutível método para
avaliar grandes fragmentos de tecido, reduzindo o tempo de trabalho, necessitando
apenas de equipamentos comuns aos laboratórios.
1.6 Matriz de Amostras Teciduais (Tissue Array)
As técnicas de rotina em histologia permitem somente uma amostra por lâmina.
Houve então a necessidade de desenvolver técnicas para aumentar o número de
amostras por lâmina (KRAAZ, RISBERG, HUSSEIN, 1998).
A expressão matriz tecidual ou matriz de amostras teciduais (tissue
array/multitissue array) faz referência a técnicas com objetivo de agrupar múltiplas
amostras em uma mesma lâmina. Em 1986 Batiffora descreveu uma metodologia que
tornou-se conhecida como "multitumor (sausage) tissue block", que traduzido para
português significaria bloco tecidual multitumoral (em forma de salsicha). Este aparenta
ter sido o princípio de vários e diferentes procedimentos já descritos, cujo objetivo
comum é otimizar o uso de múltiplas amostras.
33
Apresenta grandes vantagens referentes à uma redução de custos (economia de
reagentes e tempo do pesquisador) e possibilita uma melhor análise comparativa
devido à homogeneidade da técnica realizada e da comparação dos tecidos numa
mesma lâmina (KONONEN et al, 1998; ERGUÍLUS et al, 2006).
Em 1988 foi descrita a técnica de multibloco pelos pesquisadores KRAAZ,
RISBERG e HUSSEIN, a qual apresenta a grande vantagem de não necessitar
equipamento especial para ser realizada, ampliando sua aplicabilidade e com
importante redução de custos. Nesta técnica, lâminas de rotina do laboratório de
patologia foram utilizadas como orientação para seleção de áreas representativas dos
tumores. As áreas correspondentes nos blocos de parafina foram retiradas com o
auxílio de um "punch" para biópsia de pele. Multiblocos contendo diferentes tipos de
tecidos, tumores ou amostras foram montados usando parafina derretida, sempre
registrando a posição de cada amostra.
2
MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Casuística
Trata-se de um estudo retrospectivo onde foram selecionados espécimes
resultantes de 62 ressecções cirúrgicas colorretais com diagnóstico de
adenocarcinoma, entre os anos de 2004 a 2008. Essas amostras encontravam-se
arquivadas em blocos de parafina, disponíveis no Laboratório de Anatomia Patológica
SIP, localizado na cidade de Joinville, Santa Catarina, . As amostras foram numeradas
e os nomes dos pacientes não foram utilizados, mantendo-se o sigilo. Esta amostragem
foi subdividida em dois grupos, a saber: grupo A - adenocarcinomas colorretais
classificados como Estádio I e II pela classificação TNM, ou seja, aqueles nos quais não
foi identificada a presença de invasão neoplásica em linfonodos; grupo B -
adenocarcinomas colorretais classificados como Estádio III, ou seja, aqueles nos quais
foi identificada a presença de no mínimo um linfonodo comprometido pelo tecido
neoplásico. Foram incluídas apenas as amostras com estadiamento tumoral completo
pela classificação TNM e cujos blocos de parafina contendo tecido tumoral mostraram-
se adequados à realização do presente estudo.
35
A
B
2.2 Construção da Matriz de Amostras Teciduais (Tissue Array)
Após a seleção dos casos, foram escolhidos os blocos de parafina mais
representativos do espécime tumoral baseado na análise de sua lâmina correspondente
corada com Hematoxilina e Eosina (HE). Foi feita uma revisão microscópica desta para
identificação dos segmentos com tecido tumoral (figura 2A), dos quais foi extraída uma
amostra do bloco de parafina correspondente com a utilização de um "punch"
descartável para biópsia de pele, com 5 mm de diâmetro (figura 2B). Multiblocos destes
fragmentos de amostras foram montados, sempre registrando a posição de cada um
para posterior identificação (figura 3).
Figura 2: Extração do tecido para montagem do multibloco: A) Lâmina de amostra tumoral, corada com
HE para servir como referência na seleção da área tumoral de interesse. B) Bloco de parafina
correspondente à lâmina de HE, cuja amostra já foi retirada com o auxílio do "punch" descartável para
biópsia de pele.
36
Figura 3: Multibloco montado e seu respectivo molde. O tecido no canto superior direito foi colocado
como marcador da primeira amostra da matriz e não pertence às amostras do estudo.
2.3 A Técnica de Imunoistoquímica
De cada multibloco foi realizado um corte histológico o qual foi fixado em lâmina
de vidro previamente tratada com silano (3-Aminopropyl triethoxysilane, Sigma-Aldrich).
Após a completa secagem das lâminas os cortes foram desparafinados em xilol
aquecido a 60ºC por 10 minutos e por mais 10 minutos em outro banho de xilol a
temperatura ambiente para a completa remoção da parafina. A rehidratação foi
realizada em dois banhos de álcool absoluto, dois banhos de álcool etílico e por fim em
água destilada.
A recuperação antigênica foi efetuada com tampão citrato 10mM pH 6,0 (solução
recuperadora). As amostras foram completamente mergulhadas na solução
recuperadora, previamente aquecida a 95ºC em banho-maria. Após permanecerem por
15 minutos a 95ºC a solução recuperadora foi retirada do banho-maria para um
37
resfriamento de 25 minutos. Então as lâminas foram lavadas em água destilada e
tratadas por 30 minutos com uma solução de peróxido de hidrogênio a 5% em metanol
para bloqueio da enzima peroxidade endógena. O bloqueio da biotina endógena foi
realizado com a permanência das lâminas por 10 minutos numa solução de leite magro
desnatado a 3%.
A incubação com o anticorpo primário foi realizada à temperatura ambiente por
duas horas. Foi utilizado um anticorpo primário monoclonal, para detecção das
proteínas do grupo VEGF de origem humana. A diluição utilizada foi de 1/250 em
tampão PBS contendo 1% de albumina bovina. A marca do anticorpo utilizado foi
Affinity BioReagents cujo número de catálogo é MA1-16629.
A detecção do anticorpo primário foi realizada com o sistema LSAB
TM
+ System-
HRP do fabricante Dako (código K0690) e os tempos de incubação forma praticados
conforme instruções do fabricante. A visualização foi obtida com o kit DAB+ Substrate
Cromogen System do fabricante Dako (código K3468).
2.4 A quantificação da reação imunoistoquímica
A quantificação da reação imunoistoquímica foi realizada através da analise de
microfotografias das amostras, auxiliada pelo software Image Pro-Plus 6.0 (Media
Cybernetics, USA). Conforme instruções do manual do software utilizado, esta
quantificação foi dividida em três etapas: Obtenção da imagens (três imagens por
amostra); determinação do perfil de segmentação; e processamento das imagens.
38
2.4.1 Obtenção das Imagens
Usando idênticas configurações de microscopia e fotografia, foram obtidas três
imagens, correspondentes a três campos de cada amostra estudada (conforme
mostrado na figura 4). As fotos foram obtidas com a objetiva de 40 vezes em
microscópio Nikon, modelo Eclipse E200, e com sistema de foto documentação
composto pela máquina fotográfica Nikon Coolpix P5000. Com o software Microsoft
PhotoEditor as imagens foram tratadas (auto balanceadas) para melhorar o contraste e
o brilho das imagens.
Figura 4: Obtenção das imagens: Lâmina de multibloco submetida à detecção da proteína VEGF
juntamente com as três imagens obtidas de uma das amostras.
2.4.2 Determinação do Perfil de Segmentação
Realizar a segmentação das imagens significa identificar e isolar determinadas
estruturas, baseadas na sua cor, que podem ser processadas/medidas. Para
39
determinação do perfil de segmentação foi utilizado um dos casos deste estudo com
expressão imunoistoquímica positiva para a proteína VEGF.
No menu "process", função "segmentantion", utilizando o modelo RGB (red,
green e blue), com o auxílio da tecla "capturar cor" foi realizada a seleção dos pixels
que compõem as áreas positivamente coradas dentro da escala de tons pré-
determinada para a coloração desejada (marrom, nos casos em questão).
Figura 5: Demonstração do processo de segmentação. Letra A: Seleção do modelo RGB; Letra B:
Função "capturar cor"; Letra C: campo para exibição do perfil de segmentação.
Este perfil corresponde à importância/quantidade que cada cor do modelo RGB
deverá ter, determinando assim, automaticamente, se o pixel faz ou não parte da área
de interesse. Para o vermelho a amplitude foi de 87 até 203, para o verde foi de 15 a
165 e para o azul de 0 a 121. Este perfil foi salvo e utilizado como padrão em todas as
imagens avaliadas. Este processo está ilustrado na figura 5. A letra "A" corresponde ao
40
modelo utilizado na segmentação. A letra "B" mostra a tecla cuja a função é capturar as
cores de interesse e a letra "C" ao final do processo mostrará o perfil selecionado para
cada uma das cores do modelo RGB.
2.4.3 Processamento das Imagens (quantificação)
Cada imagem foi processada individualmente, utilizando-se o perfil de
segmentação padronizado para a quantificação das reações imunoistoquímicas descrito
no tópico anterior. As medições foram efetuadas pela função "Count/Size" do menu
"Measure" (figura 6) e então exportadas para o software exel.
Figura 6: Demonstração do processamento das imagens. Após carregar o perfil de segmentação as
áreas de interesse ficam marcadas em vermelho, sendo então avaliadas/medidas ao clicar na tecla
"Count".
41
As três imagens obtidas de cada amostra foram submetidas a este processo,
tendo a determinação do nível (escore) de expressão da proteína VEGF obtido pela
multiplicação da densidade média pelo percentual das áreas positivamente coradas
pela imunoistoquímica (áreas de coloração marrom). A obtenção do escore final de
expressão da proteína VEGF para cada amostra foi obtida através da média aritmética
entre o resultado individual de cada uma das três imagens das amostras.
2.5 Análise Estatística
O software Epi Info
TM
versão 3.5.1 foi utilizado para efetuar as análises
estatísticas deste trabalho. As comparações foram efetuadas com o teste ANOVA ou
com o teste Mann-Whitney/Kruskal-Wallis quando as variáveis não estavam
normalmente distribuídas. As variáveis categóricas foram analisadas usando-se o teste
χ
2
ou o exato de Fisher.
O projeto deste trabalho foi analisado pelo do Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade de Região de Joinville - UNIVILLE, e teve sua execução aprovada pelo
ofício nº 103/2007 por atender plenamente aos parâmetros descritos na Resolução
196/96 do Conselho Nacional de Saúde.
3
RESULTADOS
Das 62 amostras selecionadas, somente 56 foram incluídas neste estudo. Quatro
amostras foram excluídas devido a fragmentação do material e duas foram excluídas
devido a insuficiência de tecido para análise. Das amostras restantes, 28 pertencem ao
grupo A (sem metástase em linfonodos) e 28 pertencem ao grupo B (com metástase em
linfonodos), sendo os dados demográficos e histopatológicos apresentados na tabela 2.
A distribuição por sexo ficou em 29 pacientes (51,8%) para o sexo masculino e 27
pacientes (48,2%) para o sexo feminino. No grupo A, 16 pacientes (57,1%) são do sexo
masculino e 12 pacientes (42,9%) do sexo feminino. O grupo B possui 13 pacientes
(46,4%) do sexo masculino e 15 pacientes (53,6%) do sexo feminino. Não houve
diferença estatística significativa entre a freqüência de ambos sexos dentro dos dois
grupos de amostras (p= 0,42).
A média de idade dos pacientes do grupo A foi de 63,2 (43 - 98) anos e do grupo
B foi de 60,5 anos (23 - 93). Não houve diferença estatística significativa entre as
idades de ambos os grupos (p= 0,48).
43
Tabela 2: Dados pessoais e histopatológicos. Grupo A (linfonodos negativos) e grupo
B (linfonodos positivos).
Grupo A Grupo B Valor de p
Sexo
Masculino 16 13
Feminino 12 15
p= 0,42
Idade Média
63,2 60,5 p= 0,48
Estadiamento
I 7
IIA 20
IIB 1
IIIA 2
IIIB 16
IIIC 10
Profundidade do Tumor
pT2 7 1
pT3 20 23
pT4 1 4
Linfonodos Invadidos
pN0 28 -
pN1 17
pN2 11
Dentre as 56 amostras estudadas, o estádio I foi representado por sete
amostras, o estádio IIA representado por 20 amostras e o estádio IIB por uma amostra.
O estádio IIIA por duas amostras o IIIB com 16 amostras e o estádio IIIC com 10
amostras. A profundidade de invasão tumoral predominante foi a de nível pT3,
somando 43 amostras das 54 estudadas. Os níveis pT2 e pT4 foram representados por
oito e cinco amostras respectivamente. O nível pT1 não ocorreu em nenhuma amostra.
Considerando o número de linfonodos comprometidos, 28 amostras foram classificadas
como pN0 (amostras referentes ao grupo sem linfonodos comprometidos), 17 amostras
44
como pN1 (um a três linfonodos comprometidos) e 11 amostras foram classificadas
como pN2 (mais de quatro linfonodos comprometidos).
Figura 7: Exemplo de imunoistoquímica para detecção da proteína VEGF: Fotos A a C: caso nº 1, escore
médio de 2,15. Fotos D a F: caso nº 56, escore médio 48,36.
Os escores obtidos na avaliação da expressão da proteína VEGF das 56 amostras
deste estudo variaram de 2,15 até 48,36 (figura 7).
No grupo A o menor valor de escore foi de 2,15 e o maior 42,83, com uma média
de 24,49 e um desvio-padrão de 10,91. No grupo B o menor valor de escore foi de 7,86
e o maior 48,36, com uma média de 24,42 e desvio-padrão de 9,88. As variações entre
os escores obtidos nos grupos A e B não foram estatisticamente significativas (p= 0,98)
e os valores de cada caso podem ser observados na tabela 3.
A B C
D E F
Escore= 0,64 Escore= 2,70 Escore= 3,11
Escore= 50,02 Escore= 48,03 Escore= 47,03
45
Tabela 3: Valores do escore de expressão da proteína VEGF. Os dados estão
ordenados de forma crescente e separados por grupo.
Grupo A n= 28 Grupo B n= 28
Nº do exame Escore médio Nº do exame Escore médio
1 2,15 29 7,86
2 4,33 30 10,38
3 10,80 31 13,93
4 11,74 32 14,60
5 11,98 33 14,73
6 13,33 34 16,07
7 18,12 35 17,42
8 18,61 36 17,51
9 19,08 37 18,20
10 20,73 38 18,28
11 21,84 39 20,21
12 22,01 40 20,45
13 23,26 41 20,64
14 24,05 42 20,71
15 24,95 43 23,23
16 26,40 44 24,66
17 26,93 45 25,07
18 27,47 46 26,98
19 28,63 47 28,54
20 28,99 48 29,11
21 30,64 49 29,85
22 33,78 50 31,62
23 34,40 51 34,46
24 36,96 52 35,19
25 39,90 53 35,54
26 40,08 54 35,97
27 41,63 55 44,10
28 42,83 56 48,36
Média
24,49
Média
24,42
Desvio-padrão
10,91
Desvio-padrão
9,88
p= 0,98
Conforme o estadiamento tumoral, o menor escore pertenceu ao estádio I e o
maior ao estádio IIIC. Apenas uma amostra foi classificada como estádio IIB com um
escore de 34,40. O estádio IIIA foi representado por duas amostras, com uma média de
46
19,65. Como pode ser observado na tabela 4 entre as amostras restantes, a menor
média de escore pertence aos casos classificados como estádio I (23,16). A maior
média de escore pertence aos casos classificados como estádio IIIC (26,63).
Aparentemente há uma diferença entre média do escore de expressão das amostras
classificadas como estádio I e estádio IIIC, entretanto estatisticamente essas
diferenças não foram significativas (p= 0,84).
Tabela 4: Dados estatísticos obtidos na comparação dos escores com o estadiamento tumoral.
Estadiamento N
Menor
escore
Maior
escore
Média Desvio-padrão Valor de p
I 7 2,15 40,08 23,16 11,28
IIA 20 4,33 42,83 24,46 11,09
IIB 1 34,40 34,40 34,40 -
IIIA 2 16,07 23,23 19,65 5,06
IIIB 16 7,86 44,10 23,63 9,90
IIIC 10 13,93 48,36 26,63 10,74
0,84
Conforme a profundidade da invasão tumoral, a menor média do escore de
expressão da proteína VEGF foi de 22,92 e desvio-padrão de 7,06 pertencente aos
tumores classificados como pT4. A maior média de escore foi 24,87 com desvio-padrão
de 10,75 obtida dos tumores classificados como pT3. O grupo de amostras
classificadas como pT2 teve uma média de 23,16 e um desvio-padrão de 10,44. Como
pode ser observado na tabela 5 as diferenças observadas nas médias dos grupos
separados pela profundidade de invasão tumoral não foram estatisticamente relevantes
(p= 0,86).
Tabela 5: Comparação da expressão da proteína VEGF com a profundidade de invasão
tumoral.
Profundidade do tumor n= 56 Média Desvio-padrão Valor de p
pT2 8 23,16 10,44 0,86
47
pT3 43 24,87 10,75
pT4 5 22,92 7,06
Divididas as amostras conforme o número de linfonodos comprometidos (tabela
6), o grupo classificado como pN1 (1 a 3 linfonodos comprometidos) exibiu a menor
média de expressão da proteína VEGF, ficando em 23,61 com desvio-padrão de 9,59.
A maior média foi do grupo classificado como pN2 (4 ou mais linfonodos
comprometidos) 25,67 e desvio-padrão de 10,67. O grupo pN0 (sem linfonodos
comprometidos) ficou com uma média intermediária de 24,49 e desvio-padrão de 10,91.
As diferenças observadas não são relevantes estatisticamente (p= 0,87).
Tabela 6: Comparação da expressão da proteína VEGF com o número de linfonodos
invadidos.
Linfonodos Invadidos n= 56 Média Desvio-padrão Valor de p
pN0 28 24,49 10,91
pN1 17 23,61 9,59
pN2 11 25,67 10,67
0,87
4
DISCUSSÃO
Os resultados obtidos no presente estudo representam uma informação adicional
dentro do amplo espectro de achados que buscaram relacionar a expressão da proteína
VEGF e as diferentes variáveis no câncer colorretal como estadiamento, grau
histológico, tamanho do tumor, metástases linfonodais ou à distância e prognóstico.
A ausência de correlação significativa aqui observada entre a expressão tumoral
de VEGF, a presença de invasão linfonodal e o estadiamento corrobora outros estudos
já efetuados como o de Zheng et al (2003), Kekec et al (2006) e Altomare et al (2007)
os quais, embora utilizando metodologias distintas e analisando algumas outras
variáveis, também encontraram resultados que não confirmaram a possível relação
entre a expressão da proteína VEGF e outros fatores prognósticos padronizados,
atualmente utilizados em pacientes portadores de câncer colorretal.
Por outro lado, a controvérsia a este respeito reside na existência de outros
estudos os quais lograram evidenciar diferenças significativas relativas à expressão
desta proteína. Funaki et al (2003), embora não tenha observado relação significativa
com diversas variáveis tumorais, demonstrou uma diferença significativa de expressão
no que diz respeito à presença de metástases linfonodais. Resultados semelhantes
foram encontrados por Kazama et al (2004), os quais também encontraram diferença
significativa em relação à metástases linfonodais, invasão linfática e o tamanho do
tumor. No estudo realizado por Takahashi et al (1995) a intensidade da reação para
detecção da proteína VEGF foi significativamente maior nos tumores com metástase do
49
que nos tumores sem metástase e adenomas (p < 0,001 e p < 0,001 respectivamente),
embora não tenha ocorrido esta diferença entre a intensidade de coloração dos tumores
sem metástase e os adenomas. Cascinu et al (2000), após estudarem a expressão da
proteína VEGF em 121 pacientes com carcinoma colorretal, todos classificados em
estádio II, comprovaram a idéia de que a proteína VEGF pode ser utilizada para
identificar pacientes com alto risco de recorrência tumoral e que estes poderiam
beneficiar-se de um tratamento adjuvante.
A inexistência de consenso a respeito da correlação dos níveis de expressão da
proteína VEGF com outros fatores prognósticos contrasta com sua crescente
importância clínica. A expressão da proteína VEGF em vários tumores humanos
geralmente está correlacionada com a progressão tumoral e prognóstico ruim. Por outro
lado a importância da proteína VEGF na angiogênese adulta é diminuída, tornando-a
alvo ideal para o desenvolvimento de agentes terapêuticos (DIAZ-RUBIO, 2006).
Nos anos 90 um anticorpo monoclonal contra a proteína VEGF-A, chamado
bevacizumab, foi desenvolvido, o qual vem sendo utilizado com resultados bastante
promissores (FERRARA et al, 2004). Alguns estudos já demonstraram que a adição de
bevacizumab à quimioterapia tradicional mostrou aumento da sobrevida dos pacientes
com aceitável toxicidade. O FDA (Food and Drug Administration) dos Estados Unidos
aprovou a utilização do bevacizumab em pacientes com tumores de cólon irressecáveis
e tumores de pulmão não escamoso e não de pequenas células, também irressecáveis.
Em abril de 2007 o Ministro Japonês da Saúde, Trabalho e Bem Estar Social aprovou o
uso de bevacizumab para tratamento de pacientes com tumores de cólon irressecáveis
(YAMAZAKI, YOSHINO, BOKU, 2007).
50
Weihrauch et al (2008) relataram o caso de um paciente com 62 anos de idade,
que teve diagnosticado no ano de 2001 um adenocarcinoma de cólon estádio III. No
ano de 2008 apresentou uma grande metástase hepática, irressecável e com linfonodos
do hilo hepático envolvidos. Após o tratamento adjuvante com cetuximab, bevacizumab
e XELOX (Capecitabine Plus Oxaliplatin) o paciente mostrou completa remissão
tumoral. Foi então realizada cirurgia para remoção dos resíduos teciduais que ao serem
submetidos ao exame histopatológico não evidenciaram tumor residual.
RNA de inteferência (RNAi) é uma tecnologia emergente e potente, capaz de
reduzir a expressão de genes desejados. Estudos recentes tem utilizado esta
tecnologia para controlar a expressão da proteína VEGF em diversos modelos tumorais.
A utilização do RNAi não está em fase tão avançada como o bevacizumab, porém
resultados recentes mostram que esta tecnologia é bastante eficiente no controle da
expressão gênica.
Mulkeen et al (2006) testaram a capacidade do RNAi para reduzir a expressão
da proteína VEGF em células de câncer de colon. As células transfectadas com o RNAi
mostraram um decréscimo de 94% da expressão da proteina VEGF e 67% de
decréscimo na proliferação celular. Outro estudo realizado na China por He et al (2008)
utilizou RNAi para controlar a expressão da proteína VEGF in vivo e in vitro. A
expressão do RNA mensageiro para a proteína VEGF-C e da proteína VEGF-C in vitro
foi significativamente reduzida (45,3% e 35,3% respectivamente). In vivo, quatro
semanas após a injeção do RNAi o volume tumoral foi significativamente menor, bem
como a incidência de metástase em linfonodos (30%).
Outro aspecto a ser discutido referente ao trabalho aqui apresentado diz respeito
à aplicabilidade dos recursos utilizados para análise dos testes de imunoistoquímica, os
51
quais incluiram a elaboração de uma matriz de amostras teciduais e a leitura dos
resultados utilizando a análise de imagens assistida por computador.
Nossa experiência com a construção de uma matriz de amostras teciduais para a
análise conjunta retrospectiva de uma série de casos através de imunoistoquímica
confirmou os relatos favoráveis encontrados na literatura. Além de tecnicamente
simples e viável, sua utilização implicou em diversos benefícios entre os quais
poderíamos citar em especial a possibilidade de um maior controle de variações na
coloração relacionadas à necessidade de vários procedimentos (baterias), uma vez que
todas as lâminas podem ser coradas através de um único procedimento, o que implica
ainda, por seu turno em uma redução do custo devido à necessidade de menores
volumes de reagentes, incluindo anticorpos monoclonais.
No que diz respeito à utilização de análise digital de imagens, trata-se de uma
questão mais complexa de ser avaliada. Considerando-se que o procedimento padrão
para quantificação da coloração restringia-se à avaliação puramente subjetiva visual,
inexiste uma referência estritamente objetiva capaz de determinar a eficiência e
confiabilidade dos métodos de medida digital amplamente utilizados ao longo dos
últimos anos. Esta dificuldade é ainda agravada pelo fato de que estes últimos também
incluem um importante componente subjetivo como a determinação de campos e a
definição do espectro colorimétrico a ser empregado. Mesmo considerando estas
ressalvas, nossa experiência com a análise digital neste trabalho mostrou-se
aparentemente confiável e coerente com os resultados obtidos, confirmando os relatos
favoráveis de Rieux et al (2002), Carai et al (2002) e Diaz et al (2004).
Assim sendo, embora seja bastante evidente a importância da angiogênese e
seu principal fator promotor, a proteína VEGF, para o estudo da biologia e prognóstico
52
tumorais, torna-se necessário resolver questões que não estão claras, como aquelas
evidenciadas acima. É também fundamental continuar a busca por outros parâmetros
que poderão ajudar na identificação de pacientes que tenham necessidade de
tratamento adjuvante, possibilitando aumentar sua sobrevida e elevar as sua chances
de cura.
53
CONCLUSÃO
Não foi possível confirmar a hipótese de que os níveis de expressão
imunoistoquímica da proteína VEGF nos carcinomas colorretais são superiores nos
tumores com presença de metástase em linfonodos regionais, utilizando uma Matriz de
Amostras Teciduais e análise de imagens assistida por computador.
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