( PDF ) Comparação entre frutose - 1,6- bisfosfato e solução wisconsn na preservação de fígados de ratos: a influência do estado nutricional do doador

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO

SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA:

CIÊNCIAS EM GASTROENTEROLOGIA

COMPARAÇÃO ENTRE FRUTOSE -1,6 -

BISFOSFATO E SOLUÇÃO DE WISCONSIN

NA PRESERVAÇÃO DE FÍGADOS DE

RATOS:

A INFLUÊNCIA DO

ESTADO NUTRICIONAL DO DOADOR

Dissertação de Mestrado

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Stela Maria Mota

Porto Alegre, Dezembro de 2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO

SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA:

CIÊNCIAS EM GASTROENTEROLOGIA

COMPARAÇÃO ENTRE FRUTOSE -1,6 -

BISFOSFATO E SOLUÇÃO DE WISCONSIN

NA PRESERVAÇÃO DE FÍGADOS DE

RATOS:

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A INFLUÊNCIA DO

ESTADO NUTRICIONAL DO DOADOR

Dissertação de Mestrado

Stela Maria Mota

Orientador: Prof. Mário Reis Álvares-da-Silva

Porto Alegre, Dezembro de 2006

Olho o mapa da cidade

Como quem examinasse

A anatomia de um corpo...

(É nem que fosse o meu corpo!)

Sinto uma dor infinita

Das ruas de Porto Alegre

Onde jamais passarei...

Há tanta esquina esquisita,

Tanta nuança de paredes,

Há tanta moça bonita

Nas ruas que não andei

(E há uma rua encantada

Que nem em sonhos sonhei...)

Quando eu for, um dia desses,

Poeira ou folha levada

No vento da madrugada,

Serei um pouco do nada

Invisível, delicioso

Que faz que o teu ar

Pareça mais um olhar,

Suave mistério amoroso,

Cidade do meu andar

(Deste já tão longo andar!)

E talvez de meu repouso...

O MAPA

Mário Quintana

Dedicatória

Este trabalho é dedicado às pessoas que mais amo:

Especialmente ao grande amor Junior, que veio a mim como um presente de Deus. O seu

carinho, afeto e dedicação serviram como um esteio e permitiram que chegássemos juntos a

este momento tão feliz.

À minha avó Diva, que certamente está zelando por mim. Lamento por ela não estar mais

entre nós, e não poder participar deste momento especial e que tanto a orgulharia.

À minha mãe Elizabete, por ser meu maior exemplo de mulher, e que, como toda

“virginiana”, ensinou-me a chegar o mais próximo possível da perfeição.

Ao meu pai, Paulo, de quem herdei o amor à medicina e a coragem e perseverança para

perseguir minhas metas com determinação.

Ao meu estimado tio Oliver, que, ao longo da vida, tornou-se meu segundo pai.

Às minhas queridas irmãs Ana Paula e Betina.

Agradecimentos Especiais

Ao Prof. Dr. Mário Reis Álvares-da-Silva, meu orientador, que mesmo sem me

conhecer, prontamente confiou e apostou em minha capacidade. Reúne virtudes como

inteligência, perspicácia e equilíbrio emocional e dedica-se com especial devoção à profissão

e seus orientandos. Ao longo do caminho tornou-se um mestre e mais do que isto, um

grande amigo. Sinto um grande orgulho de poder participar da sua equipe. Agradeço

profundamente por tudo.

Ao Prof. Dr. Jarbas Rodrigues de Oliveira, meu co-orientador extra-oficial, sou

grata por ter-me aberto as portas do seu laboratório, no qual me senti tão confortável

quanto em minha própria casa. Pesquisador de renome, tem a alma inquieta de cientista, e

uma simplicidade no trato quase inacreditável para uma pessoa de tanta relevância no meio

acadêmico.

À Prof. Dra. Themis Reverbel da Silveira, por se constituir no meu maior

exemplo, meta inatingível. Mulher determinada, profissional brilhante, ser humano

iluminado, no qual humildemente me inspiro. A Hepatologia não seria a mesma sem a sua

presença.

Ao meu fiel bolsista e anjo da guarda Glauber Gasperin. O mestrado propiciou-me

entre outras tantas coisas maravilhosas, a oportunidade de tornarmos grandes amigos.

Agradecimentos

Ao Programa de Pós-Graduação em Gastroenterologia, na pessoa do Prof.

Dr. Sérgio Gabriel de Barros, pela oportunidade do aprendizado.

Ao Prof. Dr. Carlos Thadeu Schmidt Cerski, pela análise histológica.

À Prof. Dra. Roseli de Oliveira Möllerke, pelo seu entusiasmo e pelas sugestões

fornecidas.

À colega Daniela Rodrigues Keiserman, por ter me ensinado com paciência a técnica

cirúrgica experimental, fundamental para o desenvolvimento deste projeto.

Às queridas amigas Raquel Scherer de Fraga, Ana Carolina de Bragança e Vera

Camacho pela generosidade e coleguismo.

À Luciana Harlacher, pelo auxílio nos procedimentos cirúrgicos, coleta de material e as

intermináveis e prazerosas horas de conversas durante o longo tempo dedicado ao experimento.

À toda equipe da Unidade de Experimentação Animal do HCPA, em especial nas pessoas do

médico veterinário Marcos Eugênio Soares Duarte, pela sua dedicação, auxílio e paciência e do

biólogo e amigo Eduardo Mottola Amaro da Silveira, que tantas vezes madrugou para ajudar-

me nos experimentos, acabando por tornar-se meu anestesista oficial e de grande competência.

À Equipe do Laboratório de Biofísica da PUCRS, especialmente a Paula Elisa

Tischler Heinen, Henrique Bregolin Dias e Carlos Eduardo Leite, pelas inúmeras horas

dispensadas a este estudo, além da dedicação, amizade e disponibilidade demonstradas.

Às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Gastroenterologia, Moema Vianna

Goulart e Jamile da Silva Ladeira, pela competência, dedicação e carinho dispensados.

A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão desta tese e

que, involuntariamente, deixaram de ser nominadas.

E finalmente à Nossa Senhora, minha madrinha e intermediária junto a Deus que vem

me guiando ao longo desta existência.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE QUADROS

LISTA DE FIGURAS

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. O transplante hepático 1

1.2. Doadores com critérios estendidos 5

1.3. Considerações acerca do estado nutricional do doador 6

1.4. O dano de isquemia e reperfusão 7

1.4.1. Considerações gerais 7

1.4.2. A lesão de pré-preservação 8

1.4.3. A lesão de preservação a frio 9

1.4.4. A lesão de preservação a quente e a lesão de reperfusão 10

1.4.5. Aferição do dano de preservação 11

1.5. O estresse oxidativo 12

1.6. As soluções de preservação 14

1.6.1. A solução Universidade de Wisconsin 14

1.6.2. A frutose-1,6-bisfosfato como solução de preservação 15

2. JUSTIFICATIVA 18

3. OBJETIVOS 19

3.1. Objetivo geral 19

3.2. Objetivos específicos 19

4. MATERIAIS E MÉTODOS 20

4.1. Delineamento e tamanho da amostra 20

4.2. Os animais de experimentação 20

4.2.1. Aspectos gerais 20

4.2.2. Aspectos dietéticos 21

4.3. O experimento 23

4.3.1. Manipulação da Dieta Lieber-De Carli 23

4.3.2. Coleta de sangue para análise metabólica 24

4.3.3. O procedimento anestésico 24

4.3.4. O procedimento cirúrgico 24

4.3.5. A perfusão e preservação hepáticas 25

4.3.6. Avaliação metabólica e do estado nutricional 26

4.3.7. Avaliação do dano isquêmico, da lipoperoxidação e geração de

antioxidantes endógenos 28

4.3.8. A morte dos animais 29

4.3.9. Local de realização dos experimentos 29

4.3.10. Descarte dos materiais 30

4.4. Análise estatística 30

4.5. Aspectos éticos 30

5. FINANCIAMENTO 32

6. RESULTADOS 33

6.1. Aspectos gerais 33

6.2. Avaliação metabólica e do estado nutricional 36

6.2.1. Peso dos animais, dos fígados e relação peso dos fígados/peso

animais 36

6.2.2. Albumina e delta-albumina 37

6.2.3. Glicemia e delta-glicemia 37

6.2.4. Insulina 39

6.3. A avaliação do dano isquêmico, lipoperoxidação e geração de

antioxidantes endógenos 39

6.3.1. Aspectos gerais 39

6.3.2. Análise bioquímica da preservação a frio 39

6.3.3. Análise da lipoperoxidação e da geração de antioxidantes endógenos

6.4. Análise anatomopatológica 46

7. DISCUSSÃO 48

7.1. Em relação ao desenho do estudo 48

7.2. Em relação aos resultados da avaliação metabólica e estado nutricional

7.3. Em relação aos achados anatomopatológicos 55

7.4. Em relação aos resultados da avaliação bioquímica do dano da isquemia

7.5. Em relação aos resultados da lipoperoxidação e geração de antioxidantes

endógenos 59

7.6. Em relação aos estados nutricionais e a lesão de preservação nos fígados

dos ratos preservados com a solução padrão para transplante 62

7.7. Mecanismos sugeridos para ação protetora da FBP no modelo proposto

8. CONCLUSÕES 65

REFERÊNCIAS 66

ANEXOS 83

LISTA DE ABREVIATURAS

ABTO = Associação Brasileira de Transplante de Órgãos

AD = água destilada

ALT = alaninoaminotransferase

ANOVA = análise de variança

AST = aspartatoaminotransferase

CAPES = Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CIOMS = Council for International Organizations of Medical Science

COBEA = Manual Técnico em Bioterismo

CREAL = Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório

CTI = Centro de Tratamento Intensivo

DCE = depuração da creatinina endógena

DPC = desnutrição protéico-calórica

DMC = dieta deficiente em metionina e colina

EO = estresse oxidativo

FBP = frutose-1,6-bisfosfato

FIPE = Fundo de Incentivo a Pesquisa e Eventos

HCPA = Hospital de Clínicas de Porto Alegre

= peróxido de hidrogênio

HTK = Histidina-triptofano-cetoglutarato

IASP = International Association for the Study of Pain

IF = isquemia a frio

ILAR = Guide for Care and Use for Laboratory Animal

INR = International Normalized Ratio

I/R = isquemia e reperfusão

LDH = lactatodesidrogenase

LPO = lipoperoxidação

LSD = Least Significant Difference

MELD = Model for End-Stage Liver Disease

MDA = malondialdeído

NFPE = não-função primária do enxerto

NIH = National Instituts of Health

NO = óxido nítrico

= ânion superóxido

= radical hidroxil

ONOO

= peroxinitrito

ONT = Organización Nacional de Transplantes

PROF = Programa de Fomento à Pós-Graduação

PUCRS = Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul

RL = radicais livres

RNS = espécies reativas ao nitrogênio

ROS = espécies reativas ao oxigênio

SF = soro fisiológico

TBARS = substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TCA = ácido tricloroacético

= radical hidroxil

TNFα = fator de necrose tumoral α

= triiodotironina

Tx H = transplante hepático

UEA = Unidade de Experimentação Animal

UFRGS = Universidade Federal do Rio Grande do Sul

UNESCO = United Nation Education Science and Cultural Organization

UNOS = United Network for Organ Sharing

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Peso dos animais e dos fígados, em gramas, e relação entre o peso do

fígado/peso do animal, conforme o grupo, após a intervenção nutricional, no final

de 4 semanas 37

Tabela 2. Médias das dosagens séricas de albumina em mg/dL antes, após a

intervenção dietética e delta-albumina, conforme grupo 38

Tabela 3. Médias das glicemias em mg/dL antes, após a intervenção dietética e

delta- glicemia, conforme grupo 38

Tabela 4. Medianas de AST aferidas nas soluções de preservação dos fígados dos

animais após 2, 4, 6 e 8h de isquemia a frio, nos diferentes grupos estudados 41

Tabela 5. Medianas de ALT aferidos nas soluções de preservação dos fígados dos

animais após 2, 4, 6 e 8h de isquemia a frio, nos diferentes grupos estudados 42

Tabela 6. Medianas de LDH aferidas nas soluções de preservação dos fígados dos

animais com 2, 4, 6 e 8h, nos diferentes grupos estudados 43

Tabela 7. Médias e desvios-padrão de TBARS e catalase aferidas no tecido hepático

dos animais, nos diferentes grupos estudados 45

Tabela 8. Achados anatomopatológicos após a preservação a frio de fígados de

ratos, submetidos à intervenção dietética 46

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Composição da dieta Lieber-De Carli 22

Quadro 2. Os grupos de animais de acordo com a oferta calórica e a solução de

preservação a ser utilizada 26

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Evolução dos transplantes hepáticos nos Estados Unidos entre 1988 e

2005 2

Figura 2. Evolução dos transplantes de fígado no Brasil 4

Figura 3. Mecanismos relacionados à lesão celular durante o período de isquemia a

frio11

Figura 4. Rota glicolítica 17

Figura 5. Fluxograma do estudo 27

Figura 6. Caixas moradia individuais 34

Figura 7. Animais em suas caixas-moradia, alimentando-se conforme grupo 35

Figura 8. Animal sob campânula no momento da indução anestésica 35

Figura 9. Aspecto macroscópico dos animais após laparotomia, evidenciando-se a

gordura intrabdominal mais pronunciada na foto 2 36

Figura 10. Medianas de AST, ALT e LDH em UI/L em 2, 4, 6 e 8h nos 7 diferentes

grupos estudados 44

Figura 11. Aspecto do fígado de um animal alimentado com dieta normal,

preservado com UW 47

Figura 12. Aspecto do fígado de um animal alimentado com dieta hiperlipídica,

preservado com UW 47

RESUMO

O uso de órgãos provindos de doadores com critérios estendidos tem-se

tornado bastante comum em transplante hepático (TxH). Com freqüência, os

doadores encontram-se agudamente desnutridos ou apresentam critérios sugestivos

de síndrome metabólica e, conseqüentemente, esteatose hepática. Há sugestões de

que estados nutricionais alterados possam se refletir na qualidade do enxerto, e são

necessárias medidas para contrabalançar estes efeitos. A solução da Universidade de

Wisconsin (UW) é o padrão para TxH, e alguns estudos experimentais sugerem que a

frutose-1,6-bisfosfato (FBP) possa ser útil na preservação de órgãos. O presente

estudo tem o objetivo de comparar a influência do estado nutricional sobre o dano de

isquemia a frio, utilizando soluções de preservação distintas.

Foram utilizados ratos 35 Wistar machos, divididos em 3 grupos, de

acordo com a dieta: I: dieta normal; II: dieta restrita e III: dieta hiperlipídica (dieta

Lieber-De Carli modificada). Os animais foram aleatoriamente alocados e receberam

dieta padronizada por 4 semanas, de acordo com o grupo. Foi realizada

hepatectomia, sob anestesia inalatória, e os fígados foram preservados durante 8

horas em solução de FBP ou de UW. O dano de preservação foi estimado através de

alíquotas do líquido de preservação (LP), com dosagem de AST, ALT e LDH,

lipoperoxidação (através de TBARS), geração de antioxidantes endógenos e exame

anatomopatológico.

O estado nutricional teve influência na qualidade da preservação. Os

fígados de ratos submetidos à dieta restrita foram os que tiveram a menor lesão de

isquemia a frio, enquanto que os submetidos à dieta hiperlipídica, a pior (p<0,05).

Nos ratos submetidos à dieta normal e restrita, a lesão de isquemia a frio foi menos

intensa por todos os critérios nos ratos preservados com FBP (p<0,05). Nos ratos

submetidos à dieta hiperlipídica, não houve diferença entre as soluções.

ABSTRACT

Donor shortage is becoming a huge problem in the last years, and this

fact indeed stimulates the use of organs from extended criteria donors for liver

transplant (LT). These donors are submitted to the risks of acute malnutrition and,

often, there are metabolic syndrome and liver steatosis. Nutritional donor status may

influence graft quality after harvesting. Most of LT centers use to adopt University of

Wisconsin (UW) solution for preservation, and some experimental studies suggest

that in this scenario FBP also could be used. This study aims to evaluate the influence

of donor nutritional status on ischemic injury of UW or FBP preserved rat livers.

There were studied 35 male Wistar rats, randomly assigned into 3

groups, accordingly to the diet: I- normal diet; II: restricted diet; III: high-fat liquid

diet (Lieber-De Carli modified diet), offered by 4 weeks. Livers were preserved after

hepatectomy during 8 hours either with FBP or UW. Ischemic injury was assessed

by AST, ALT, LDH, TBARS, catalase and also by histopathological study.

Nutritional donor status does affected graft quality. Livers from rats

submitted to restricted diet had lower ischemic injury, while those from high-fat diet

got worse results (p<0.05). Regarding preservation solution, ischemic injury was less

pronounced in livers from rats that received normal or restricted diets, and were

preserved with FBP (p<0.05). There was no difference between both solutions on the

ischemic injury of livers from high-fat diet fed rats.

1. INTRODUÇÃO

1.1. O Transplante Hepático

O recrutamento de sofisticado armamentário terapêutico, tanto clínico-

endoscópico como cirúrgico, tem contribuído nos últimos anos para a melhor e mais

eficiente abordagem das hepatopatias. O transplante hepático (TxH) é um divisor de

águas, posto que modificou as perspectivas dos pacientes hepatopatas gravemente

enfermos. Foi com o advento do transplante que a medicina deixou de abandonar os

indivíduos portadores de hepatopatias terminais, antes condenados ao óbito.

O desenvolvimento técnico-cirúrgico e o surgimento de agentes

imunossupressores na década de 50 foram os alicerces fundamentais para que, em

1963, fosse realizado pela equipe de Thomas Starzl, em Denver Colorado, Estados

Unidos, o primeiro transplante em humanos (Starzl, 1996a). Os anos subseqüentes

foram marcados por insucessos, mas permitiram o aperfeiçoamento da técnica. Com

o advento da ciclosporina, um potente fármaco imunossupressor, em 1983, através

de um melhor controle da rejeição, o TxH pôde de fato alcançar melhores resultados,

estimulando sua disseminação. (Williams, 1990; Vera et al, 1993; Starzl, 1996b;

Yoshida & Lake, 1997).

Sendo assim, vinte anos após o primeiro TxH, na Conferência de

Consenso do National Institutes of Health (NIH), realizada em Bethesda, Estados

Unidos, o procedimento foi resgatado da condição de técnica experimental e passou

a ser considerado, então, um método terapêutico (Levy, 1998). Tendo recebido a

chancela do tempo, o transplante é atualmente o tratamento de escolha para uma

série de doenças crônicas e agudas graves do fígado (Everson & Trotter, 2003).

Segundo a United Network for Organ Sharing (UNOS), organização

americana responsável pela procura e distribuição de órgãos, foram realizados

78.935 transplantes hepáticos naquele país entre janeiro de 1998 e julho de 2006

(UNOS, 2006). A Figura 1 mostra a evolução no número de transplantes nos Estados

Unidos. Atualmente há 145 programas de TxH nos Estados Unidos, realizando uma

média de 45 transplantes ao ano, com sobrevida média do enxerto em 1 ano de

81,9%. (UNOS, 2006).

Figura 1. Evolução dos transplantes hepáticos nos Estados Unidos entre 1988 e julho

de 2006. Fonte: UNOS, 2006.

No Brasil, o primeiro transplante hepático foi realizado em São Paulo

em 1985, e os dados da Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos (ABTO) são

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 OO O1 O2 O3 O4 O5 O6

Número de transplantes

claros em demonstrar notável incremento no número de transplantes a partir do ano

de 1991. O número de centros transplantadores de fígado evoluiu de 2 em 1989 para

57 em 2005 (ABTO, 2005). O número de pacientes transplantados igualmente

aumentou: foram 10 em 1990 e 956 em 2005, realizados em 11 estados da federação

(ver Figura 2).

A despeito do aumento no número de transplantes, até o mês de julho

de 2006, 17.140 pacientes aguardavam por um novo fígado nos Estados Unidos,

sendo que 12.354 (72%) o faziam por mais de 12 meses. Isto é particularmente

perverso quando se analisa a evolução histórica, pois entre 1988 e 2004 houve um

incremento de 3,6 vezes no número de pacientes transplantados naquele país, mas a

lista de espera, em contrapartida, aumentou 12,1 vezes. Não surpreende, portanto,

que neste período o número de óbitos em lista tenha sofrido um acréscimo em torno

de 5 vezes. Estes fatos determinaram, em 2002, a introdução de uma nova política de

alocação de pacientes em lista, e desde então, número de mortes na espera por um

fígado, tem se mantido estável em torno de 1.800 óbitos/ano (UNOS, 2006). O

principal fator a limitar o número de pacientes beneficiados com transplantes, não

só nos Estados Unidos, é a escassez de órgãos (Norman, 1997; Bosch, 1999; Jiménez-

Romero et al, 1999; Melendez & Heaton, 1999; McMaster & Vadeyar, 2000; Busuttil &

Tanaka, 2003, Chang et al, 2003). Embora tenha havido aumento no número de

doadores nos últimos anos, o número de candidatos tem crescido de forma muito

mais rápida. A Espanha, considerada modelo na captação de órgãos, conseguiu a

impressionante taxa de 33,7 doadores por milhão de habitantes em 1999 (Chang et

al, 2003). Mesmo assim, o tempo de espera em lista também tem se estendido neste

país (ONT, 2005). Nos Estados Unidos a taxa de doadores efetivos não passou de

21,6 por milhão de habitantes naquele ano (Chang et al, 2003), e a situação brasileira

é ainda mais preocupante. Dados da ABTO dão conta que a taxa de doação de

órgãos e tecidos é muito baixa. No ano de 2005 a média foi de 6,3 doadores por

milhão de habitantes, ainda 10% menor que no ano de 2004. O Rio Grande do Sul,

por sua vez, tem a melhor captação do país, com uma taxa de 11,5 doadores de

fígado por milhão de habitantes (ABTO, 2005), mas estes números são insuficientes

para atender a demanda. A capacidade das sociedades em gerar mais órgãos para os

transplantes parece estar próxima de seu limite, o que deve trazer mais mortes nas

listas de espera em um futuro próximo.

A limitação de órgãos e a crescente mortalidade em lista de espera

impulsionaram a discussão dos critérios para alocação dos mesmos. Em fevereiro de

2002 foi adotado nos Estados Unidos, o escore MELD (Model for End-Stage Liver

Disease), desenvolvido por pesquisadores da Mayo Clinic, Rochester, Estados Unidos,

que privilegia dados objetivos para definir qual paciente deve receber o enxerto

disponível (Kamath et al, 2001; Freeman, 2004). Este modelo baseia-se em três

parâmetros laboratoriais: bilirrubina total, tempo de protrombina expresso em INR

(International normalized ratio) e creatinina, através de um cálculo logarítmico para se

obter um índice correlacionado à mortalidade esperada em 3 meses (Malinchoc et al,

2000). No Brasil, a política de alocação de órgãos, até início do corrente ano,

contemplava a cronologia e vinha sendo alvo de severas críticas (Sette et al, 2003).

Recentemente o MELD também foi adotado como critério vigente em nosso país,

através da Portaria Ministerial nº 1.160 publicada no Diário Oficial em 29 de maio.

(Ministério da Saúde, 2006).

Figura 2. Evolução dos transplantes hepáticos no BrasilFonte: ABTO, 2005. TxH=

transplantes hepáticos.

Em face da escassez de enxertos, a discussão não se restringe à

melhoria dos critérios de alocação dos pacientes. Novas estratégias, para

contrabalançar o desequilíbrio na equação candidatos-doadores, vêm sendo

consideradas. O uso de fígado artificial, o transplante de hepatócitos, o

xenotransplante constituem-se em promessas experimentais. O transplante

intervivos é uma alternativa, e vem sendo cada vez mais empregado em nosso país

(ABTO, 2005), embora isto possa ser motivo de crítica. A conseqüência natural é a

crescente aceitação de órgãos provindos dos chamados “doadores marginais”, mais

apropriadamente denominados doadores com critérios estendidos (Morris, et al,

2004; Pokorny et al, 2005).

200

400

600

800

1000

1200

No.centros No. TxH

1.2. Doadores com critérios estendidos:

Um conceito que defina doador com critérios estendidos (DCE), que

seja amplamente aceito, ainda não está disponível e vem evoluindo ao longo da

última década (Gruttadaria et al, 2005). Via de regra considera-se um órgão não ideal

aquele proveniente de um doador em condições não-ótimas, quais sejam: a) idade

superior a 60 anos; b) longa permanência em centros de tratamento intensivo (CTI),

em especial com mais de 4 dias de ventilação mecânica; c) prolongados períodos de

hipotensão ou altas doses de vasopressores; d) hipernatremia (sódio sérico acima de

155mEq/L); e) creatinina sérica acima de 1,2mg/dL; f) provas de função hepática

alteradas, embora este seja um quesito bastante polêmico; g) índice de massa

corporal acima de 30; h) presença de esteatose superior a 30%; e i) tempo de

isquemia a frio acima de 10 horas, entre outros critérios menos comuns e seguidos

de forma individual em cada centro transplantador (Gastaca et al, 2005; Pokorny et

al, 2005).

A aceitação destes doadores expande o número de órgãos utilizados e,

por conseguinte, tende a aumentar o número de transplantes realizados, mas expõe

os receptores a riscos ainda não conhecidos ou adequadamente documentados por

estudos clínicos (Busuttil & Tanaka, 2003; Pokorny et al, 2005). É de conhecimento

geral que pior o doador pior o enxerto, elevando-se as chances do mesmo ser

danificado durante os procedimentos de retirada e implante (De Carlis et al, 1996;

Pokorny et al, 2005). As conseqüências desta atitude por certo ainda não estão

devidamente calculadas. Para Schaffer & Sorrell, 1996, face à crônica escassez de

órgãos, qualquer medicação, técnica ou intervenção que contribua para a sua maior

disponibilidade ou que traga benefícios à sua viabilidade deve ser extremamente

bem-vinda.

Rocha et al, 2004, estudando retrospectivamente uma série brasileira de

148 pacientes submetidos a transplante hepático concluíram que o uso de doadores

marginais é seguro, com efeito positivo sobre o tempo de espera em lista.

1.3. Considerações acerca do estado nutricional do doador

Os doadores de órgãos podem pertencer a diferentes grupos, a saber:

a) doadores com coração batendo: doador com morte encefálica, doador vivo

relacionado, doador vivo não-relacionado e doador anencefálico; b) doadores com o

coração parado; e c) animais (Magalhães et al, 2004). O doador de múltiplos órgãos

costuma ser o indivíduo em morte encefálica internado em CTI. O motivo da morte

encefálica, via de regra, envolve dano direto ao sistema nervoso central. Segundo

dados da UNOS, 2006, nos Estados Unidos a causa de óbito em 55.370 (64,5%) de

85.966 doadores de fígado foi o traumatismo crânio-encefálico ou o acidente

vascular cerebral.

O estado nutricional dos doadores, por outro lado, pode variar

consideravelmente. Aquele indivíduo que ao ingressar na CTI evolui à morte

encefálica de forma rápida em geral não apresenta desnutrição protéico-calórica

(DPC). É o paciente que se encontra em seu estado de nutrição habitual, e muitas

vezes, está adequadamente nutrido. No entanto, mesmo este paciente pode

apresentar alterações nutricionais relevantes, em especial a obesidade, que é um

fator de risco associado ao desenvolvimento de eventos vasculares cerebrais. A

esteatose hepática, que pode ocorrer secundária à obesidade, é um reconhecido fator

de risco para não-função primária do enxerto (NFPE) (Takahashi et al, 2000; Fiorini

et al, 2005). Tanto isto é verdadeiro que a maior parte dos grupos de transplante não

aceita órgãos com esteatose acima de 65% (Imber et al, 2002). Além disto, uma

proporção significativa de doadores é constituída de suicidas e vítimas de acidentes

de trânsito, ambas as populações associadas a consumo de quantidades expressivas

de álcool e, por conseguinte, expostas a maior risco de esteatose.

Um grupo que merece especial atenção é aquele em que há uma longa

internação hospitalar em CTI, com um quadro grave que se arrasta por dias, com

infecção superposta na maioria dos casos. Os indivíduos que apresentam tal

evolução podem se tornar agudamente desnutridos. O estado nutricional tem

correlação íntima com o fígado: a presença de desnutrição protéico-calórica (DPC)

afeta negativamente o órgão, com menor tendência à regeneração hepatocelular

(McCullough, 2000). Assim, pode-se postular que um indivíduo agudamente

desnutrido apresentaria pior função hepática, e que um órgão retirado nestas

condições seria menos adequado para transplante do que aquele retirado de um

indivíduo bem nutrido.

A preocupação com o tema não é recente. O grupo de Belzer, em 1994,

publicou estudo em que discutia o assunto. Para eles, o estado nutricional do doador

afeta a evolução clínica pós-transplante (Sumimoto et al, 1994). Singer et al, 2001,

avaliaram o efeito do estado nutricional em doadores em morte encefálica,

chamando atenção para o fato de que a desnutrição é freqüente e pode interferir com

a função de diferentes órgãos, dentre eles o fígado. Os autores concluem que a

nutrição desempenha um papel importante na modulação da função orgânica pós-

transplante.

Ademais, os cirróticos com freqüência são desnutridos, especialmente

os candidatos a transplante (Álvares-da-Silva & Silveira, 1998; Figueiredo et al, 2000;

Stephenson et al, 2001; Álvares-da-Silva et al, 2004; Campos et al, 2004; Gottschall et

al, 2004; Álvares-da-Silva & Silveira, 2005). O transplante, por sua magnitude, os

expõe a um grande estresse cirúrgico adicional, e no período pós-operatório não é

raro que complicações clínicas retardem o início da alimentação. Isto significa a

persistência de um balanço energético negativo, o que poderia vir a ser ainda mais

prejudicial e deletério naquele paciente que recebe um fígado de um doador

desnutrido.

1.4. O dano de isquemia/reperfusão

1.4.1. Considerações gerais

A ausência de função do enxerto no período pós-transplante imediato

é provavelmente multifatorial, mas o dano de preservação tem sido freqüentemente

implicado (Natori et al, 1999; Cohen et al, 2000; Almada et al, 2003). Obrigatoriamente

a realização de um transplante envolve isquemia tecidual. A redução da oxigenação

pode atingir o enxerto em diferentes fases do processo de troca do órgão doente pelo

sadio (Carrasco et al, 1996; Shackleton, 1998). Acredita-se que virtualmente todos os

enxertos sejam danificados durante o transplante (Gaffey et al, 1997; Wang et al,

1998; Cohen et al, 2000).

Aos fenômenos nocivos secundários a este processo, tanto aqueles

decorrentes das condições pré-mórbidas do doador, da isquemia a quente do órgão

antes e durante a sua retirada, do estoque a frio, bem como daqueles provenientes

da restituição do fluxo sanguíneo, após sua implantação no receptor, dá-se o nome

de lesão de preservação ou ainda lesão de isquemia/reperfusão (I/R). A lesão de

I/R é o fenômeno pelo qual o dano celular em um órgão hipóxico é acentuado após

a restauração do fluxo de oxigênio (Teoh & Farrell, 2003).

A preservação de um órgão é a chave inicial para o sucesso do

transplante (Southard & Belzer, 1996). No entanto, vários fatores podem determinar

dano no enxerto, nas diferentes etapas envolvidas:

1.4.2. A lesão de pré-preservação

A lesão de pré-preservação origina-se de condições patológicas já

existentes no órgão doado, como esteatose, lesão por álcool ou fármacos, ou ainda a

presença concomitante de outras doenças hepáticas. Eventos associados à morte

cerebral, como hipotensão ou hipóxia, provocam efeito semelhante a uma isquemia

a quente e possuem a clara tendência de danificar o enxerto (Strasberg, 1997).

A estes fatores somam-se outros potenciais danos durante a cirurgia

para a ablação do órgão, como a hipotensão ou a parada cardiorrespiratória

(Strasberg, 1997). Nos indivíduos com morte cerebral podem ocorrer alterações

endocrinológicas, dentre elas a síndrome eutireóidea, situação em que há redução

dos níveis séricos de triiodotironina (T3). Isto pode levar à deterioração da função

cardíaca e estimular o metabolismo em anaerobiose (Imberti et al, 1998).

A hipóxia tecidual tem papel importante na gênese da lesão de pré-

preservação. Os doadores que necessitam de grandes doses de dopamina para

manter estável sua pressão arterial estão sob risco de considerável lesão hepática

(Mirza et al, 1999). A parada cardiorrespiratória, mesmo breve, pode induzir lesão

isquêmica adicional ao fígado.

A esteatose hepática é um fator de risco importante ao funcionamento

do enxerto pós-transplante (Markin et al, 1993; Strasberg, 1997; Miki et al, 1998,

Melendez & Heaton,1999, Imber et al, 2002). A análise da biópsia de congelação

realizada logo antes do transplante é considerada um método útil para excluir

órgãos lesados e, conseqüentemente, com maior risco de mau funcionamento

(Markin et al, 1993). Mesmo na avaliação de doador para transplante intervivos pode

haver espaço para uma biópsia pré-operatória, visando especialmente avaliar a

extensão da esteatose hepática (Flamm et al, 2000).

1.4.3. A lesão de preservação a frio

A conservação em gelo é a técnica rotineiramente empregada para a

preservação (Southard & Belzer, 1996), através da combinação do resfriamento da

superfície do órgão e da sua perfusão com solução de preservação gelada (Hertl et al,

1996). A hipotermia reduz a taxa metabólica e assim prolonga o tempo que as células

anóxicas podem reter atividades metabólicas essenciais (Jaeschnke, 1996). Para cada

10°C de redução da temperatura ocorre paralelamente uma queda de 50% na

atividade metabólica. A 1°C o metabolismo situa-se em torno de 5% do normal. No

entanto, a função de algumas proteases continua a despeito do frio, podendo

danificar o órgão (Strasberg, 1997).

Quando há isquemia, por definição há ausência de fluxo sanguíneo,

caracterizando hipóxia tecidual. A hipóxia determina a diminuição do aporte de

oxigênio à célula, com redução dos fosfatos ricos em energia, redução da atividade

da bomba Na/K e alteração na troca de água e íons. Isto promove acúmulo

intracelular de íons e conseqüente influxo de água, com edema celular, ao que se

seguem glicólise em anaerobiose e queda do pH, culminando em dano isquêmico

(Strasberg, 1997; Massberg & Messmer, 1998).

Durante a fase de isquemia o metabolismo celular anaeróbico promove

degradação da adenosina para hipoxantina e conversão da xantina-desidrogenase

para xantina-oxidase. Com o restabelecimento do fluxo sanguíneo, o oxigênio reage

com a hipoxantina e catalisado pela xantina-oxidase produz oxirradicais que

interagem de forma destrutiva com as membranas celulares. A hipoxantina

desempenha um papel fundamental nestes eventos (Shackleton, 1998). A Figura 3

resume o que ocorre no ambiente celular quando há isquemia tecidual.

1.4.4. A lesão de preservação a quente e a lesão de reperfusão

O dano de aquecimento ocorre no período entre a retirada do órgão do

gelo e sua efetiva implantação no receptor, intervalo este que varia habitualmente

entre 30 e 60 minutos. Períodos longos de isquemia a quente, especialmente de

acima de 90 (Cisneros et al, 1991) ou 120 minutos (Strasberg, 1997), correlacionam-se

diretamente com não-função primária do enxerto.

A reintrodução do fluxo, ou a reperfusão, quando o sangue portal está

novamente banhando o fígado (As et al, 1999) representa ainda outro momento de

potencial dano, por vezes mais notável que as fases prévias (Teoh & Farrell, 2003)

sendo sua extensão dependente do grau de comprometimento do enxerto nas fases

anteriores (Strasberg, 1997). O complexo I/R, por conseguinte, resulta tanto da

isquemia quanto da reintrodução do fluxo sangüíneo, no denominado “paradoxo do

oxigênio” (Minor & Isselhard, 1995; Post et al, 1995; Arora & Gores, 1996). A

manutenção inicial da isquemia e a geração de radicais livres de oxigênio

desempenham papel determinante na gênese da lesão de reperfusão (Minor &

Isselhard, 1995).

Figura 3. Mecanismos relacionados à lesão celular durante o período de isquemia a

frio. A hipoxantina desempenha papel central na lesão celular, que será agravada na fase seguinte

da lesão de I/R, a reintrodução do fluxo sanguíneo. Modificada de Schackleton, 1998.

1.4.5. A aferição do dano de preservação

A liberação das enzimas aspartato aminotransferase (AST), alanina

aminotransferase (ALT) e desidrogenase lática (LDH) na solução de preservação é

consideradas um importante índice para avaliar a qualidade da preservação do

órgão (Jamieson et al, 1988), sendo um sensível marcador de danos pré-existentes ou

adquiridos durante o período de isquemia a frio (Lange et al,1996). Enquanto as

aminotransferases são enzimas que marcam dano hepatocelular, elevando-se

HIPÓXIA

↓ ATP ↑ AMP ↑

Adenosina

↑ HIPOXANTINA

LESÃO CELULAR

Diminuição da perfusão

tecidual

quando há necrose ativa do parênquima, a LDH é uma enzima da rota glicolítica

que cataliza a conversão de lactato em piruvato, e que é liberada quando há lesão

celular, em situações inespecíficas em que há hipóxia e necrose (Souza et al, 2005).

Na prática clínica esta aferição não costuma ser realizada, sendo seu uso reservado à

pesquisa (Moresco et al, 2004).

Ademais, o exame anatomopatológico também pode ser utilizado na

avaliação do dano de I/R. A biópsia de congelação, realizada no período de

isquemia a frio, tem utilidade limitada neste contexto. De fato, seu uso é reservado

para aqueles casos em que existem dúvidas quanto à qualidade do enxerto, como,

por exemplo, em um doador infectado pelo vírus da hepatite B ou C, para

reconhecer a presença ou não de hepatite em atividade, o que restringiria

sobremaneira o aproveitamento do órgão. Por outro lado, naqueles casos em que há

esteatose hepática, sua quantificação pode ser decisiva na decisão de prosseguir ou

interromper o transplante. Já no que se refere apenas à detecção de lesão secundária

à isquemia, o exame anatomopatológico pouco acrescenta (Álvares-da-Silva, 2000;

Moresco et al, 2004), pois as lesões ainda mais evidentes surgem após a reperfusão.

1.5. O estresse oxidativo

Em um ambiente de pesquisa outros parâmetros podem ser avaliados

na tentativa de aferir o dano de preservação, em especial o estresse oxidativo (EO),

reconhecidamente envolvido na patogênese da disfunção inicial do enxerto no

período pós-transplante (Cogger et al, 2004). Os radicais livres (RL) podem ser

definidos como espécies químicas capazes de existirem de forma independente e

que apresentem um ou mais elétrons desemparelhados. As espécies reativas do

nitrogênio (RNS) incluem o óxido nítrico (NO) e o peroxinitrito (ONOO

), enquanto

as espécies reativas do oxigênio (ROS) incluem o ânion superóxido (O

), o radical

hidroxil (OH

) e o peróxido de hidrogênio (H

) (Halliwell & Gutteridge, 1989). Os

RL são altamente reativos, tem grande instabilidade e meia-vida curta, de forma que

não se deslocam para longe de seu sítio de formação, estabilizando-se ao interagir

com qualquer biomolécula adjacente (Southorn & Powis, 1988). Isto faz com que a

sua aferição se faça de maneira indireta (Burke et al, 2002). A lesão mitocondrial que

se segue à reperfusão do fígado em isquemia é considerada a principal fonte

geradora de ROS, pois durante a isquemia a cadeia respiratória está reduzida (Belló-

Klein, 2002; Teoh & Farrell, 2003).

A vida em aerobiose se caracteriza pela contínua produção de ROS que

é contrabalançada pelo consumo de defesas antioxidantes não enzimáticas e pela

atividade das enzimas antioxidantes. Assim, em condições fisiológicas, o balanço

entre agentes pró-oxidantes e as defesas antioxidantes mantém-se em equilíbrio.

Quando esse balanço é rompido em favor dos agentes oxidantes, diz-se que a célula

ou organismo se encontra sob estresse oxidativo, com potenciais danos (Belló-Klein,

2002; Busquets et al, 2002; Cogger et al, 2004). Conseqüentemente, a quantificação do

EO torna-se importante para inferir o grau de disfunção hepática no período de

preservação do enxerto. Vários fenômenos envolvidos neste processo podem ser

úteis na estimativa do grau de EO, como a oxidação de lipídios (lipoperoxidação), a

dosagem dos produtos do NO, e a quantificação de substâncias antioxidantes.

A lipoperoxidação (LPO) tem sido freqüentemente relatada como um

dos principais mecanismos de lesão celular provocada pelos ROS, sendo definida

como uma oxidação de lipídios poliinsaturados (Buege & Aust, 1978). Esse

mecanismo é uma reação em cadeia que dá origem a vários produtos de degradação,

entre eles o malondialdeído (MDA) que é utilizado como indicador de peroxidação

lipídica. O MDA pode ser medido através da dosagem das substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS) (Halliwell & Gutteridge, 1989) e vem sendo usado

como estimativa do EO em vários estudos (Rhoden et al, 1996; Lefevre et al, 1998;

Jain et al, 2002; Cogger et al, 2004, Moreira et al, 2004).

O NO é produzido a partir da L-arginina, através de uma reação

catalizada pela enzima óxido nítrico sintetase (NOS). Posteriormente, se decompõe

em NO

e NO

, que podem ser deletérios por promover a oxidação e

nitrosaminação de macromoléculas biológicas, incluindo a indução da LPO, danos

no DNA e inativação de enzimas ou proteínas estruturais (Cadmium, 2002).

Os antioxidantes, por sua vez, compreendem substâncias que retardam

ou inibem a ação das ROS e podem ser divididos em dois principais grupos:

enzimáticos e não-enzimáticos. Dentre os primeiros, a superóxido dismutase, a

catalase e a glutationa peroxidase são mais utilizadas na avaliação do EO (Llesuy,

2002; Cogger et al, 2004; Grezzana et al, 2004). Os métodos não-enzimáticos, como o

α-tocoferol, o ácido ascórbico e o ácido úrico são bem menos empregados.

1.6. As soluções de preservação

1.6.1. Solução Universidade de Wisconsin

A solução da Universidade de Wisconsin (UW) é a solução de

preservação mais utilizada pelos grupos de TxH há mais de 15 anos, tendo

substituído o uso da solução EuroCollins (Upadhya & Strasberg, 2000). A sua

introdução no mercado, no final dos anos 80, foi considerada um marco na história

do transplante (Vera et al, 1993; Kahn, 1996; Cohen et al, 2000) e possibilitou uma

isquemia a frio mais longa, com menor lesão tecidual. Outras soluções têm sido

sugeridas (Lemasters et al, 2001; Quintana et al, 2005), mas ainda não demonstraram

sua vantagem em relação à UW. A composição da solução UW visa reduzir os

efeitos negativos da hipotermia, combatendo o edema celular intersticial e a acidose,

bem como fornecer antioxidantes, inibindo ROS, e provendo substrato para a

repleção de ATP após a reperfusão (Southard & Belzer, 1996). Apesar deste desenho

teórico, ela protege principalmente o enxerto contra os danos decorrentes da fase

isquêmica, sendo menos protetora na reoxigenação (Kahn, 1996). Sua principal ação,

e o que lhe faz superior em relação a outras soluções, parece ser a capacidade de

proteção endotelial (Clavien, 1998). De fato, as células endoteliais dos sinusóides,

são os alvos iniciais do dano de preservação (Natori et al, 1999).

1.6.2. A frutose-1,6-bisfosfato como solução de preservação

A frutose-1,6-bisfosfato (FBP) é um intermediário altamente energético

da glicólise (Kirtley & McKay, 1977), formado endogenamente na rota glicolítica,

que tem sido relacionado a uma série de efeitos terapêuticos (Nunes et al, 2002;

Vexler et al, 2003). Ver Figura 4. Em 1991, Lazzarino et al, estudando corações de

ratos, demonstraram que a FBP preserva o ATP intracelular durante períodos de

perfusão anóxica, e outros estudos têm sido publicados acerca do uso de FBP na I/R

relacionada à cirurgia cardíaca (Riedel et al, 2004; Gal et al, 2000) e em modelos de

transplante, como o de intestino delgado (Sola et al, 2003; Sola et al, 2004; Genesca et

al, 2005) e o pulmonar (Chu et al, 2002).

A capacidade da FBP em preservar o ATP intracelular deve ser

discutida no contexto da morte celular após a reperfusão, que pode ser secundária à

necrose ou apoptose. A apoptose é uma forma programada de remoção de células

sem que haja o recrutamento de uma resposta inflamatória ou destruição do

ambiente celular, ao contrário da necrose, em que há perda de integridade da

membrana plasmática e um grande estímulo à resposta inflamatória (Teoh & Farrell,

2003). O que determina a forma de morte celular pós-reperfusão é o seu conteúdo de

ATP. Se diminuído, há necrose, e se mantido em níveis acima de 10 a 20% dos

valores habituais, há apoptose. Assim, o conteúdo de ATP intracelular age como

uma chave que determina o tipo de morte celular e a conseqüente resposta

inflamatória que ela desencadeará (Lemasters et al, 2001). Kim et al, 2003,

demonstraram em cultura de hepatócitos de ratos o aumento da apoptose quando as

células eram incubadas com frutose.

A FBP parece reduzir a lesão tecidual associada à isquemia, choque e

dano tóxico, por sua capacidade de aumentar a utilização anaeróbica de

carboidratos e inibir a geração de RL pelos neutrófilos (Markow et al, 1980; Rao &

Mehendale, 1989). Markow et al, 2002, demonstraram em modelo animal de

transplante cardíaco a redução na proliferação de células T com o uso de FBP.

Resultados similares, mas utilizando como modelo, sepse em humanos, foram

descritos (Nunes et al, 2003a), sugerindo que a FBP tenha um efeito

imunomodulador. O mesmo grupo demonstrou, estudando ratos com sepse

induzida pela infusão intraperitoneal de Escherichia coli, uma menor mortalidade nos

ratos tratados com FBP (Nunes et al, 2002). De acordo com Nunes et al, 2003b, esta

ação contra a sepse parece ser devida mais à ação antiinflamatória que

antimicrobiana da FBP.

Cuesta e colaboradores, em recente publicação, 2006, estudando a lesão

hepática induzida por D-galactosamina em ratos in vivo e in vitro, confirmaram as

atividades antiinflamatórias e imunomoduladoras da FBP, através da redução de

endotoxemia, da degradação mastocitária e da liberação de histamina e fator de

necrose tumoral- α (TNFα). Mais que isto, sugeriram um novo mecanismo de ação

da FBP. Esta teria uma capacidade exógena de reduzir o consumo de ATP através da

modulação dos canais de potássio das membranas das células de Kupffer.

Hirokawa et al, 2002, já havia estudado a ativação das células de

Kupffer em fígados de ratos, através da aferição de NO e TNFα no líquido de

preservação em modelo de isquemia a frio por 24 horas, comparando sua expressão

em fígados preservados com UW ou com UW associada à FBP. Os autores

concluíram que houve menor elevação de NO e TNFα nos fígados preservados com

solução de UW associada à FBP, salientando a proteção das células de Kupffer, que

mantiveram sua capacidade fagocítica. Resultados diversos encontraram, em 2004,

Moresco et al, estudando fígados de ratos submetidos a um período de 24 horas de

isquemia a frio. Comparando a solução de UW com FBP e, ainda, a solução de UW

acrescida de FBP, concluíram que a preservação hepática foi pior com esta última.

Os resultados foram similares entre FBP e UW. Ademais, a LPO aferida pela reação

de TBARS foi menor nos fígados preservados com FBP. Os autores sugeriram que,

considerando o alto custo da solução de UW, a FBP poderia ser uma alternativa

interessante na composição de outras soluções.

Glicose

Frutose-6-

fosfato

FRUTOSE-1,6-

BISFOSFATO

Glicose-6-

fosfato

Glucose-6-fofatase

Hexocinase

Piruvato-carboxilase

Piruvatocinase

Piruvato

Fosfofenolpiuva

Piruvato-carboxilase

Fructose-bifofatase

Figura 4: Rota glicolítica. O metabolismo da glicose inicia-se com a fosforilação de glicose em

glicose-6-fosfato (G6P), que é catalizada pela hexoquinase. Na etapa seguinte, a G6P é isomerizada

em frutose-6-fosfato, que é fosforilada a FBP. Posteriormente a FBP é convertida em

fosfoenolpiruvato, que sofre ação da piruvato-cinase e transfere um fosfato para o ADP,

transformando-se em piruvato. Há consumo de ATP em todas etapas da rota glicolítica. (Kirtley &

McKay, 1977).

O nosso grupo tem pesquisado acerca do tema, e resultados ainda

parciais e submetidos para publicação do uso de FBP em modelo animal de I/R em

comparação com UW têm confirmado os de Moresco et al, 2004. A FBP parece ser

uma boa alternativa para a preservação a frio do enxerto hepático (Fraga et al, 2005;

Dal Molin et al, 2005).

2. JUSTIFICATIVA

A preservação do enxerto é parte fundamental para o sucesso do

transplante hepático. Mesmo a solução de UW sendo bastante eficaz, ela ainda não é

a ideal, pois não são raros os casos de ausência de função de enxerto no período pós-

operatório. Ademais, seu custo é significativo. Neste cenário, a pesquisa de soluções

de preservação alternativas parece ser relevante.

O dano de I/R é um continuum de lesão que se inicia no doador,

mesmo antes da ablação do órgão. Desta forma, características do doador têm

influência no estímulo a maior ou menor lesão após o transplante, dentre elas o seu

estado nutricional. A presença de esteatose, freqüentemente relacionada à síndrome

metabólica e ao consumo de dietas ricas em lipídios, tem sido ligada à disfunção

mitocondrial, fonte inicial da geração de ROS. A restrição alimentar e a desnutrição

aguda, por sua vez, podem restringir a reserva energética celular. A FBP tem

demonstrado sua utilidade em situações de estresse oxidativo como sepse, e seu uso

em modelos de isquemia a frio têm produzido bons resultados. A sua oferta durante

a isquemia a frio, período em que há glicólise em anaerobiose, poderia poupar os

fosfatos intracelulares ricos em energia, diminuindo a tendência à necrose e

reduzindo a lesão celular.

A comparação entre FBP e solução de UW na isquemia hepática a frio,

em um cenário de diferentes estados nutricionais do doador, é o que justifica este

estudo. A hipótese é que a FBP, ao prover maior substrato energético ao hepatócito,

poderia ser protetora contra os danos promovidos pela restrição alimentar ou pela

dieta hiperlipídica.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Avaliar a influência do estado nutricional sobre o dano de isquemia a

frio, aferido por parâmetros bioquímicos (AST, ALT, LDH), anatomopatológicos, de

lipoperoxidação (TBARS) e geração de antioxidantes endógenos (catalase), em

fígados de ratos com dieta normal, restrita ou hiperlipídica.

3.2. Objetivos Específicos

3.2.1. Comparar o dano de isquemia a frio após a preservação de fígados de ratos

submetidos à dieta normal e preservados com FBF, solução UW ou solução

fisiológica (SF).

3.2.2. Comparar o dano de isquemia a frio após a preservação de fígados de ratos

submetidos à dieta de restrição e preservados com FBP ou solução UW.

3.2.3. Comparar o dano de isquemia a frio após a preservação de fígados de ratos

submetidos à dieta hiperlipídica e preservados com FBP ou solução UW.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Delineamento e tamanho da amostra

Foi realizado um estudo experimental, cujos fatores em estudo são o

estado nutricional e a solução de preservação, e o desfecho o dano de isquemia a

frio. Para determinar a dieta que foi oferecida aos animais foi feito um estudo inicial

em 10 ratos. Para posterior cálculo amostral realizou-se um estudo piloto com 5

animais em cada braço com observação dos resultados.

4.2. Os animais de experimentação

4.2.1. Aspectos gerais

Foram utilizados ratos da espécie Rattus norvegicus da linhagem

Wistar, machos em fase reprodutiva, com idade de aproximadamente 120 a 150 dias,

pesando entre 270 e 480g, provenientes do Centro de Reprodução e Experimentação

de Animais de Laboratório (CREAL) do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), alocados na Unidade de

Experimentação Animal (UEA) do Centro de Pesquisa do Hospital de Clínicas de

Porto Alegre (HCPA). Foram estudados também animais “idosos” com idade em

torno de 50 semanas, mas não considerados para os propósitos deste estudo. Os

resultados da avaliação destes animais estão descritos no Anexo 1.

Respeitou-se um período de observação dos animais de sete dias antes

do início de todos os experimentos. Os animais foram mantidos em caixas-moradia

individuais, confeccionadas em policarbonato, transparentes, medindo 65 x 25 x

15cm, com assoalho recoberto de serragem e contendo em seu interior comedor de

alumínio (20mm

) e toca de aço inoxidável desenvolvida para seu conforto. Estavam

submetidos a ciclo normal claro e escuro, com luzes acesas das 7 às 19h, em

ambiente com temperatura controlada, entre 18 e 22°C e receberam água ad libitum.

Os animais foram divididos em três grupos conforme a oferta nutricional, por 4

semanas até 12 horas antes do experimento: Grupo I: controles com dieta normal

(controle); Grupo II: animais submetidos à restrição alimentar (restrição); e Grupo

III: submetidos à dieta rica em lipídios (hiperlipídica).

4.2.2. Aspectos dietéticos:

Inicialmente, foi ofertada ad libitum a 10 animais a ração sólida,

habitualmente utilizada no UEA do HCPA (Nuvilab CR1-Nuvital Nutrientes Ltda,

Colombo, Paraná). Os animais foram mantidos em caixas-moradia individuais por 1

semana e a quantidade de ração consumida foi avaliada a cada dia. Os resultados

obtidos estão demonstrados no Anexo 2. A média diária resultante foi de 21,6g,

sendo adotados 22g como padrão. Esta foi a quantidade diária disponibilizada a

cada animal do Grupo I por 4 semanas.

Aos ratos do Grupo II a dieta proporcionada foi a metade daquela

oferecida aos ratos do Grupo I (11g/dia). Aos ratos do Grupo III foi ofertada por 4

semanas, ad libitum, dieta hiperlipídica com 1 kcal/mL, à base de óleos vegetais com

71% da energia derivada de gordura, 18% de proteína, e 11% de carboidrato,

denominada dieta Lieber-De Carli (Lieber et al, 2004). O Quadro 1 demonstra os

componentes da referida dieta.

A escolha dos animais e alocação dos mesmos em cada grupo foi

realizada de forma aleatória. Para a distribuição aleatória, os animais, em cotas de

10, foram previamente imobilizados (sendo envolvidos em tecido macio) e marcados

na cauda com uso de pincel atômico. A partir dessa numeração foi feita a

distribuição aleatória nos grupos.

Quadro 1. Composição da dieta Lieber-De Carli

Componentes Proporções em

g/L

Caseína 41,4

L-cistina 0,5

Dl-metionina 0,3

Óleo de milho 48,5

Óleo de oliva 28,4

Óleo de açafrão 2,7

Maltose

dextrina

25,6

Colina 0,53

Fibra 10,0

Goma Guar 3,0

Modificado de Lieber et al, 2004

Conteúdo vitamínico/1000 ml: tiamina 1,5 mg; riboflavina 1,5 mg, piridoxina 1,75 mg; ácido

nicotínico 7,5 mg; pantotenato de cálcio 4,0 mg; ácido fólico 0,5 mg; biotina 50 µg; vitamina B-12 25

µg; ácido p-aminobenzóico 12,5 mg; inositol 25 mg; vitamina A 6000 UI, vitamina D 400 UI, Vitamina

E 30 UI; vitamina K 125 µg. Conteúdo de oligoelementos e minerais/1000ml (em mg): cálcio 1300;

fósforo 1000; sódio 255; potássio 900; magnésio 125; manganês 13,5; ferro 8,8; cobre 1,5; zinco 7,5; iodo

0,05; selênio 0,025; crômio 0,5; cloretos 390; sulfatos 250; e fluoretos 0,25.

4.3. O experimento

4.3.1. Manipulação da Dieta Lieber -De Carli

A manipulação da dieta seguiu as seguintes etapas: a) foram pesadas

as vitaminas do complexo B e ácido fólico: B5 (400mg), B1 (150mg), B6 (175mg), B3

(750mg), B2 (150mg) e ác. fólico (50mg), diluídas em 100ml de água destilada (AD) e

reservado 1ml para a dieta; b) pesadas as vitaminas B12 (25mg) e biotina (50mg),

diluídas em 100ml de AD e reservado 0,1ml; c) pesados os óleos de milho 48,5g,

oliva 28,4g e prímula 2,7g (em substituição ao óleo de açafrão da dieta original) e

homogeneizados por 5 minutos; d) em Graal foram colocadas L-cistina (0,5g), DL-

metionina (0,3g) e bitartarato colina (0,53g), trituradas e acrescidas a 100ml de AD; e)

pesou-se e triturou-se vitamina A (6000UI), vitamina D (400UI), vitamina E (30UI),

vitamina K (125mcg), sendo estas acrescidas aos óleos homogeneizados; f) pesou-se

e triturou-se em Graal ácido para-aminobutírico (PABA) (12,5mg), inositol (25mg),

que foram misturados a 100ml de AD; g) pesou-se caseína (41,4g) e dissolveu-se em

100 ml de AD; h) pesou-se maltodextrina (25,6g), misturou-se em 100ml de AD; i)

pesou-se fibra - Psyllium sp – (10g) e goma-guar (3g), sendo misturados a 100ml de

AD; h) foram pesados e triturados os seguintes minerais e oligoelementos: quelato

de cálcio (1300mg), quelato de fósforo (1000mg), cloreto de sódio (255mg), quelato

de potássio (900mg), quelato de magnésio (125mg), quelato de manganês (13,5mg),

quelato de ferro (8,8mg), quelato de cobre (1,5mg), quelato de zinco (7,5mg), iodeto

de potássio (0,05mg), quelato de selênio (0,025mg) e picolinato de cromo (0,5mg) e

acrescidos a 100 ml de AD. Todas as pesagens dos substratos foram feitas em

balança de precisão marca Gehaka BG 400; i) todas as soluções hidrossolúveis foram

misturadas em Becker e acrescidas aos óleos contendo as vitaminas lipossolúveis; j)

foi acrescida AD até se atingir o volume final de 1000 ml; k) todo o conteúdo foi

então submetido ao mixer marca Black & Decker modelo SB 40, por 60 segundos,

resultando uma mistura líquida de densidade leve. A dieta foi mantida em frascos

plásticos de 1000ml, fechados e armazenados em geladeira, com validade de 30 dias.

4.3.2. Coleta de sangue para análise metabólica

Os animais dos Grupos II e III tiveram sangue coletado para análise

metabólica em dois momentos. A primeira, pela retirada de sangue do lago venoso

retro-ocular, antes do início do regime alimentar de 4 semanas, sob anestesia com

Ketamina 1,16mg/10ml (Laboratório Vetbrands) e Xilazina 200mg/10ml

(Laboratório Calier do Brasil Ldta.), por via intra-peritoneal. Após a perda do reflexo

doloroso, o sangue foi coletado com auxílio de capilar de vidro introduzido no plexo

venoso retro-ocular, conforme técnica padronizada. A segunda amostra foi obtida ao

final das 4 semanas, através de punção cardíaca, sob anestesia inalatória, durante o

procedimento cirúrgico, que será descrito a seguir.

Os animais do Grupo I, considerados controles, tiveram uma única

amostra sanguínea retirada, após 4 semanas de dieta, durante o procedimento

cirúrgico, conforme descrito para os demais grupos.

4.3.3. O procedimento anestésico

No dia da cirurgia, os animais foram retirados de sua caixa-moradia,

após 12h de jejum, e procedida indução anestésica com isoflurano 1,5%

(Isoflurano®, Laboratório Abbott) por via inalatória, em campânula de

policarbonato transparente. A seguir, após imobilidade e perda de reflexo de

endireitamento, o animal foi colocado em decúbito dorsal em mesa cirúrgica

apropriada. A manutenção da anestesia foi feita através da administração do

anestésico por meio de máscara inalatória conectada ao carro de anestesia. Para

controle das concentrações administradas de anestésico foi empregado vaporizador

calibrado.

4.3.4. O procedimento cirúrgico

Após anestesia, os animais foram submetidos aos seguintes

procedimentos: a) assepsia do abdômen com solução de iodo-povidine; b)

laparotomia ampla por meio de incisão em U; c) exposição de intestino, que

permaneceu rebatido à direita do operador sob proteção de gaze umedecida com

cloreto de sódio a 0,9%; d) dissecção romba delicada por meio de hastes plásticas

flexíveis com algodão e identificação das veias renal direita, cava inferior e porta; e)

punção da veia renal, injeção de 0,1ml (0,8U) de solução de heparina (Liquemine®,

Laboratório Roche) e posterior ligadura do vaso; f) passagem de fio de sutura de

seda 3-0 como reparo, um na veia cava inferior e dois na veia porta para auxílio dos

passos subseqüentes; g) canulação da veia porta com cateter intravenoso de

permanência 20G (Abbocath® no. 20, Johnson & Johnson); h) conexão do cateter

portal com o equipo ligado à solução de preservação; i) ampliação da laparotomia à

toracotomia, e coleta de sangue por punção cardíaca; j) liberação do fluxo da solução

de preservação para o veia porta; k) abertura da veia cava inferior para facilitar a

perfusão hepática; l) exsanguinação e morte do animal sob anestesia; m) retirada do

fígado para preservação.

4.3.5. A perfusão e preservação hepáticas

Foram utilizadas para perfusão e preservação hepáticas, de acordo com

o grupo, duas soluções distintas: solução de UW (Viaspan, 320mOsM/L) ou

solução salina de FBP (10mmol/l em NaCl 0,9%, 330 mOsM/L), ambas a 4ºC. A

infusão de 125ml, durante aproximadamente 2 minutos, da solução de preservação

foi feita através de cateter portal, de forma contínua, com pressão de 60cm H

Mais 5 animais submetidos ao regime alimentar determinado com

normal, bem como aos mesmos procedimentos anestésicos e cirúrgicos, conforme

descrito, tiveram seus fígados perfundidos e preservados apenas com solução salina

ou solução fisiológica (SF) (NaCl 0,9%, Laboratório B.Braun, 308mOsM/L), para

posterior comparação com os animais do Grupo I. Estes foram chamados de Grupo

IV. O Quadro 2 resume os grupos em estudo.

Quadro 2. Os grupos de animais de acordo com a oferta calórica e a solução de

preservação a ser utilizada

A preservação do fígado dos

animais ocorreu em 50ml de solução de UW ou

FBP, conforme o subgrupo, também à

temperatura controlada de 4ºC, por 8 horas. Os

fígados ficaram acondicionados em recipiente de

vidro. A Figura 5 demonstra o fluxograma de

atividades executadas.

4.3.6. A avaliação metabólica e do estado

nutricional

Os animais foram pesados em balança digital (Marte, modelo

AS5500C) antes do período de oferta dietética (grupos II e III) e imediatamente antes

do procedimento cirúrgico (todos os grupos). Os fígados de todos os animais foram

pesados na mesma balança no final do período de preservação.

Grupos Subgrupos

Grupo I Dieta normal UW

Dieta normal FBP

Grupo

Dieta restrita UW

Dieta restrita FBP

Grupo

III

Dieta hiperlipídica

FBP

Grupo

Dieta normal SF

Figura 5. Fluxograma do estudo. Os ratos foram observados durante 1 semana e após este

período alocados aleatoriamente em um dos grupos e submetidos à dieta por 4 semanas. Ao cabo

deste período foi realizada hepatectomia sob anestesia e os fígados preservados em solução de UW

ou de FBP por 8 horas. Os procedimentos relacionados à avaliação da lesão por isquemia a frio foram

então realizados. Onde: UW= solução da Universidade de Wisconsin; FBP= frutose-1,6-bisfosfato;

SF= soro fisiológico; IF= lesão de isquemia a frio.

A dosagem da glicemia de jejum de 12h foi realizada através do

método cinético UV (aparelho Hitachi 917-Roche) no sangue venoso do animal antes

do período de oferta dietética (grupos II e III) e durante o procedimento cirúrgicos

(todos os grupos). Através da fórmula: [glicemia pós-intervenção – glicemia pré-

intervenção], foi calculado o delta-glicemia. A dosagem da insulina de jejum de 12h,

através de radioimunoensaio (Aparelho ECLIA-Modular E 170-Roche), foi feita nos

mesmos períodos. Foi determinada a albumina pelo método colorimétrico verde

bromocresol (Aparelho Hitachi 917-Roche). Através da fórmula: [albumina pós-

intervenção – albumina pré-intervenção], foi calculado o delta-albumina.

DIETA

HIPERLIPÍDICA

DIETA

RESTRITA

FBPUW

FBP

SFFBP

DIETA

NORMAL

GRUPO II GRUPO III

GRUPO IV

GRUPO I

4 semanas

8 horas

1 semana

Avaliação

DIETA

NORMAL

Antes da oferta dietética (grupos II e III) e durante o procedimento

cirúrgico (todos os grupos), procedeu-se à coleta de sangue para a dosagem de

albumina com um kit para humanos através do método colorimétrico verde

bromocresol (aparelho Hitachi 917-Roche).

4.3.7. A avaliação do dano isquêmico e da lipoperoxidação e geração de

antioxidantes endógenos

Foram retiradas alíquotas da solução de preservação nos tempos 2, 4, 6

e 8 horas. Para avaliação de lesão por isquemia a frio foram dosadas no líquido de

preservação AST, ALT e LDH, através do método cinético UV (aparelho Hitachi 917-

Roche).

A coleta do material para as análises dependentes do tecido hepático

foi padronizada da forma que se segue: 2 finas fatias de aproximadamente 1mm de

espessura, eram retiradas com auxílio de lâmina de bisturi, no sentido crânio-caudal

da porção média de ambos lobos principais (mediano e esquerdo) e encaminhadas

para estudo anatomopatológico; o restante de cada lobo era bipartido em partes

iguais, sendo estas separadas em 2 porções, que então somadas a divisão dos lobos

secundários, totalizavam aproximadamente 3 a 7g cada; estas respectivas porções

eram então acondicionadas em Tubos Falcon contendo uma proporção de 9,0mL de

SF ou tampão fosfato para cada grama de tecido e mantida em gelo, para posterior

confecção dos homogeneizados e verificação de TBARS e atividade da catalase,

respectivamente.

A maceração do tecido hepático foi feita em homogeneizador

automatizado (Potter Elvehjem) a 1.500rpm, durante 2 minutos.

A medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi

feita com o aquecimento de 125µL do sobrenadante do homogeneizado do tecido

hepático, com TBA 0,67% e ácido tricloroacético (TCA) 10% por 15 minutos em

banho-maria fervente a 100°C. O produto corado extraído com ácido n-butílico,

centrifugado por 10 minutos a 3000rpm e medido por espectrofotometria em 535nm,

através da técnica descrita por Halliwell & Guteridge, 1989. Os dados foram

expressos em nmol/g de tecido.

A atividade da catalase foi determinada através da reação entre

tampão fosfato 50mM, de pH neutro, e peróxido de hidrogênio 0,3µmol, do

homogeneizado do tecido hepático, com a leitura realizada em espectrofotômetro de

240nm, conforme método de Boveris & Chance (1973). As dosagens das proteínas

foram feitas pelo método de biureto (Lowry et al, 1951). Os dados foram expressos

em UI/mg.-proteína de proteína.

A análise anatomopatológica dos segmentos de fígado foi realizada no

final das 8h de preservação a frio. Após fixação, o tecido foi embebido em parafina e

seccionado a 3µm. Os fragmentos foram montados sobre uma lâmina. Na seqüência

fixados com xilol e corados com hematoxilina/eosina. As lâminas foram observadas

em microscópio óptico a 40, 100 e 400x. A análise do dano de preservação a frio foi

feita por um único patologista, examinando amostras codificadas de tecido. Foram

analisadas a presença de infiltrado inflamatório portal e alterações isquêmicas

centrolobulares de acordo com sua intensidade: ausente (0), leve (1) e acentuada (2).

A esteatose foi classificada de acordo com o tipo (macro ou microvesicular) e

intensidade: ausente (0), menor que 5% (1), entre 5 e 33% (2), entre 33 e 66% (3) e

maior que 66% (4).

4.3.8. A morte dos animais

A morte dos animais ocorreu, sob anestesia, por sangria no momento

da abertura da veia cava inferior.

4.3.9. Local de realização dos experimentos

Os procedimentos anestésico-cirúrgicos foram realizados na UEA do

Centro de Pesquisa do HCPA. A centrifugação das alíquotas de líquido de

preservação e a dosagem de AST, ALT, LDH, glicemia, insulina e albumina feitas no

Laboratório de Patologia Clínica do Centro de Pesquisa do HCPA. A mensuração de

TBARS e catalase, feitas no Laboratório de Biofísica da Pontifícia Universidade

Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS). A análise anatomopatológica do tecido

hepático realizou-se no Laboratório de Patologia do CEA do Centro de Pesquisa do

HCPA. A manipulação das dietas foi feita no Blanc Laboratório de Manipulação, em

Porto Alegre, sob a supervisão da Farmacêutica Graciema Bauer Dini (CRF 4346).

4.3.10. Descarte de materiais

Todo o material biológico foi colocado em embalagens para resíduo

biológico e descartado no serviço de coleta do lixo hospitalar do HCPA. Quanto aos

procedimentos histológicos, obedeceram-se os cuidados pertinentes à adequada

manipulação do material utilizado como formol, Bouin e xilol, constando de luvas e

máscaras. Os resíduos químicos obtidos a partir desses experimentos foram

descartados por meio do Instituto de Química da UFRGS.

4.4. Análise estatística

A todas as variáveis foi aplicado o teste de normalidade Kolmogorov-

Smirnov, os dados que demonstraram normalidade serão expressos como média e

desvio padrão, os demais como mediana e intervalo interquartílico. Para comparar

as variáveis de medida única foi utilizada ANOVA one-way, seguida do teste de

comparações múltiplas de Duncan. A comparação de medidas seriadas foi feita pela

ANOVA para medidas repetidas, seguida do teste de Tukey e teste das diferenças

mínimas LSD (least significant difference), após transformação em postos ou ranks. O α

assumido como significativo foi de 0,05.

Os dados referentes à análise histológica serão apresentados de forma

descritiva. Serão apresentadas as freqüências relativas e absolutas de aparecimento

de eventuais alterações histológicas nos grupos estudados.

4.5. Aspectos éticos

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a

legislação vigente no Brasil, Lei 6.638 (Diário Oficial da União – 08/05/1979), que

estabelece normas para práticas didático-científicas da vivissecção de animais, assim

como regulamenta o registro dos Biotérios e Centros de Experimentação.

Atendendo a decreto que determina que o exercício da medicina de

animais de laboratório é atividade profissional privativa do médico veterinário -

Decreto Lei 64.704 de 17/06/1969 (Capítulo II, Art. 2º, itens “c” e “d”) -, o projeto foi

realizado sob a supervisão da médica veterinária Dra. Roseli de Oliveira Möllerker,

responsável técnica pelo CEA, especializada em animais de laboratório.

Todos os procedimentos operacionais realizados foram embasados em

Guide for the Care and Use for Laboratory Animals – ILAR/EUA e Manual para

Técnicos em Bioterismo (COBEA/Brasil), e em acordo com Ethical Guideline for

Investigations of Experimental Pain in Conscious Animals, conforme indicado por

International Association for the Study of Pain (IASP). Estes obedeceram às normas

propostas pela Declaração Universal dos Direitos dos Animais (UNESCO, 27 de

janeiro de 1978) e Princípios Internacionais Orientadores para a Pesquisa Biomédica

Envolvendo Animais (Council for International Organizations of Medical Sciences -

CIOMS). O projeto foi enviado e aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do

HCPA/UFRGS, em fevereiro de 2005, sob o número 05-048.

5. FINANCIAMENTO

O presente estudo foi financiado através do Fundo de Incentivo à

Pesquisa e Eventos (FIPE) HCPA (R$ 8.000,00 - oito mil reais), do Programa de

Fomento à Pós-Graduação da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior -PROF/CAPES - UFRGS (R$ 1.730,00 - um mil setecentos e trinta reais) e

por e recursos próprios (R$ 1.850,00 - um mil oitocentes e cinqüenta reais). O custo

totalizou R$ 11.580,00 - onze mil quinhentos e oitenta reais.

A aluna recebeu bolsa de mestrado da CAPES.

6. RESULTADOS

6.1. Aspectos gerais

Durante o período de quarentena inicial, nenhum animal apresentou

qualquer alteração física ou comportamental que sugerisse comprometimento de seu

estado de saúde, sendo todos incluídos no estudo.

No decorrer dos experimentos houve perda de 4 animais: 2 por

dificuldade de canulação da veia porta, durante o procedimento cirúrgico, tendo

ocorrido morte por hemorragia, sob anestesia; 1 por perfusão inadequada do fígado,

quando da liberação da solução de preservação, em razão da canulação seletiva de

um dos ramos portais e 1 em decorrência de depressão respiratória determinada pela

anestesia peritoneal, utilizada durante coleta sanguínea do lago venoso retro-ocular,

antes da intervenção alimentar. Todos os animais perdidos foram repostos por outros

de peso e idade semelhantes.

A Figura 6 demonstra os animais em suas caixas-moradia.

Durante as 4 semanas de regime alimentar, os animais do grupo

controle consumiram a totalidade da dieta ofertada (22g/dia), exceto raras sobras

ocasionais e desprezíveis. No grupo de restrição não se observou resíduos da dieta

diária ofertada em nenhuma ocasião. Os ratos do grupo da dieta hiperlipídica

consumiram 7.950mL da dieta Lieber-De Carli modificada ao final das 4 semanas,

perfazendo uma média de 26,5mL/animal/dia ou 26,5 kcal/animal/dia.

A Figura 7 demonstra os animais em suas caixas-moradia, recebendo a

dieta conforme o grupo e a Figura 8 a realização do procedimento anestésico, na fase

de indução e manutenção.

Os animais do grupo da dieta hiperlipídica apresentaram com

freqüência, evacuações pastosas, volumosas e fétidas. Com a evolução dos dias de

intervenção dietética foi observada pilo-ereção em todos os animais deste grupo,

tendo seus pêlos adotado uma coloração mais amarelada. O comportamento

também se modificou, tendo os mesmos se tornado mais agressivos que os animais

dos outros grupos.

Figura 6. Caixas moradia individuais. Confeccionadas em policarbonato transparente,

identificadas com o número do animal e alocadas na UEA-HCPA.

Estes animais apresentaram uma maior proporção de gordura intra-

abdominal, em relação aos controles e aos animais sob restrição alimentar – a Figura

9 demonstra estes achados.

A média de peso de todos os ratos incluídos foi de 356g (±42) e dos

fígados 11,67g (± 2,49). O Anexo 2 demonstra todos os dados encontrados neste

estudo.

Figura 7. Animais em suas caixas-moradia, alimentando-se conforme grupo. 1=

animal controle recebendo dieta normal (Nuvital CR1); 2= animal recebendo dieta hiperlipidica.

Figura 8. Animal sob campânula no momento da indução anestésica.

1 2

Figura 9. Aspecto macroscópico dos animais após laparotomia, evidenciando-se a

gordura intrabdominal mais pronunciada na foto 2. 1= animal controle com dieta normal;

2= animal do grupo da dieta hiperlipídica.

6.2. Avaliação metabólica e do estado nutricional

6.2.1. Peso dos animais, dos fígados e relação peso dos fígados/peso animais

Quando comparadas as médias de peso dos animais após 4 semanas de

intervenção nutricional, estas diferiram estatisticamente (p<0,05). A média de peso

dos animais com dieta restrita foi 10,3% menor que a encontrada nos animais que

receberam dieta normal, assim como a média dos pesos dos animais submetidos à

dieta hiperlipídica foi 10,8% maior que nestes últimos.

Com relação às médias dos pesos dos fígados e da relação peso

fígado/peso corpóreo do animal, estas foram estatisticamente inferiores no grupo de

1 2

animais sob restrição alimentar, quando comparadas aos demais (p<0,05). As

médias do peso dos animais, seus fígados e da relação peso do fígado/peso do

animal estão representadas na Tabela 1.

Tabela 1. Peso dos animais e dos fígados, em gramas, e relação entre o peso do

fígado/peso do animal, conforme o grupo, após a intervenção nutricional, no final

de 4 semanas.

Grupos N Peso animais

(g)

Peso

fígados (g)

Relação peso

fígado/peso animal

Grupo I

(controle)

10 357,70*

(±35,12)

12,51

(±1,80)

0,035

(±0,0054)

Grupo II

(restrição)

10 321,00*

(±22,23)

9,30**

(±1,60)

0,028***

(±0,0039)

Grupo III

(hiperlipídic

10 396,20*

(±35,98)

13,19

(± 2,16)

0,033

(±0,0033)

Os dados estão expressos como média e desvio padrão. * p<0,001 (entre os três grupos) ** p<0,001

(Grupo II vs demais grupos); *** p=0,07 (Grupo II vs I) – ANOVA, com análise pelo teste de

Duncan.

6.2.2. Albumina e delta-albumina

Não houve diferença estatística entre as médias das dosagens séricas

de albumina quando feita a comparação entre os grupos alimentares antes e após

intervenção dietética. Entretanto, quando avaliadas as médias do delta-albumina, os

animais controles que receberam dieta normal apresentaram uma variação

estatisticamente maior (p<0,05). Estes dados estão representados na Tabela 2.

6.2.3. Glicemia e delta-glicemia

As médias das glicemias antes e após a intervenção dietética, bem

como o delta-glicemia foram superiores nos animais submetidos à dieta

hiperlipídica, em comparação aos que receberam dieta normal ou restrita (p<0,05).

Não houve diferença entre as médias das glicemias e delta-glicemia entre estes dois

últimos grupos - ver Tabela 3.

Tabela 2. Médias das dosagens séricas de albumina em mg/dL antes, após a

intervenção dietética e delta-albumina, conforme grupo.

Grupos N Albumina-

pré

(mg/dL)

Albumina-

pós

(mg/dL)

∆ albumina

(mg/dL)

Grupo I

(controle)

10 3,83 2,9 -1,28*

Grupo II

(restrição)

10 3,85 3,4 -0,40

Grupo III

(hiperlipídica

)

10 4,0 3,2 -0,65

Os dados estão expressos como média e desvio padrão. * p=0,001 (Grupo I vs II) – ANOVA com

análise pelo teste de LSD

Tabela 3. Médias das glicemias em mg/dL antes, após a intervenção dietética e

delta- glicemia, conforme grupo.

Grupos N Glicemia-pré

(mg/dL)

Glicemia-pós

(mg/dL)

∆ glicemia

(mg/dL)

Grupo I

(controle)

10 316,2 225,5 -90,7

Grupo II

(restrição)

10 390,0 235,5 -143,0

Grupo III

(hiperlipídica

)

10 271,0* 374,0** +153,0***

Os dados estão expressos como média e desvio padrão. *p=0,02 (Grupo III vs demais); **p=0,002

(Grupo III vs demais); ***p=0,001 - ANOVA, com análise pelo teste de LSD.

6.2.4. Insulina

Foram obtidas leituras da dosagem sérica de insulina em apenas 3 dos

35 animais estudados com o método utilizado (quimio-luminescência ECLIA-

Aparelho Modular E 170-Roche). A faixa de detecção do método especificada pelo

fabricante, situa-se entre 2,6 e 24µUI/mL. O anexo 2 demonstra quais animais

tiveram insulina detectada, e suas as respectivas dosagens.

6.3. A avaliação do dano isquêmico, lipoperoxidação e geração de antioxidantes

endógenos

6.3.1. Aspectos gerais

As comparações que se seguem nos subitens abaixo referem-se aos

diferentes grupos citados no Quadro 2.

6.3.2. Análise bioquímica da preservação a frio

As medianas dos níveis de AST, ALT e LDH, aferidas nos líquidos de

preservação, estão descritas, respectivamente, nas Tabelas 4, 5 e 6.

Quando analisadas AST e LDH nos ratos controle, encontrou-se

diferença significativa entre os seus níveis quando comparadas as soluções de UW e

FBP. Nesta última, os níveis foram significativamente menores. Em relação à ALT,

no entanto, não houve diferença neste grupo em relação às soluções. Neste mesmo

grupo de animais, quando comparadas as soluções de UW e FBP com SF, notou-se

que em relação à AST e LDH, os achados com SF foram equivalentes aos obtidos

com FBP. Porém, em relação à ALT, os achados com SF foram inferiores àqueles

obtidos com UW e FBP.

Nos animais submetidos à dieta restrita, os achados foram idênticos

àqueles encontrados no grupo controle.

Nos animais submetidos à dieta hiperlipídica, no entanto, não houve

diferença significativa nos níveis de AST e LDH entre as soluções empregadas.

Neste grupo os níveis de ALT foram superiores nos fígados de ratos preservados

com FBP.

A figura 10 demonstra, respectivamente, a comparação entre as

medianas de AST, ALT e LDH entre os sete diferentes subgrupos estudados.

6.3.3. Análise da lipoperoxidação e da geração de antioxidantes endógenos

Ao compararmos os níveis de TBARS no homogeneizado do tecido

hepático após a preservação, estes foram significativamente menores nos subgrupos

de animais controle e naqueles submetidos à dieta restrita que tiveram seus fígados

preservados com FBP. Não houve diferença ao serem comparadas às duas soluções

nos fígados dos animais que receberam dieta hiperlipídica.

A atividade da enzima catalase foi significativamente maior nos

animais pertencentes aos subgrupos que tiveram seus fígados preservados com UW,

tanto nos que receberam dieta normal, restrita ou hiperlipídica.

A Tabela 7 demonstra as comparações entre os níveis de TBARS e a

atividade da catalase entre os sete grupos.

Tabela 4. Medianas de AST aferidas nas soluções de preservação dos fígados dos

animais após 2, 4, 6 e 8h de isquemia a frio, nos diferentes grupos estudados.

Grupos n AST 2h AST 4h AST 6h AST 8h

I-UW •

(controle)

5 121*

(86,5-146,5)

153*

(115,5-173,5)

181*

(133,5-193)

205*

(155-220)

I-FBP •

(controle)

5 24*

(17,5-37)

35*

(27,5-71,5)

53*

(32-104)

94*

(40-133)

II-UW ••

(restrição)

5 68**

(34,5-97,5)

80**

(44-120)

105**

(54-153)

113**

(75-184,5)

II-FBP ••

(restrição)

5 6**

(3-27,5)

9**

(8-39,5)

15**

(12,5-62,5)

24**

(18,5-80)

III-UW•••

(hiperlipídica

)

5 27#

(21,5-60,5)

39#

(27-72)

60#

(44,5-74,5)

65#

(54,5-85,5)

III-FBP•••

(hiperlipídica

)

5 19#

(16,5-32,5)

29#

(25,5-56)

38#

(35,5-59,5)

95#

(66,5-105)

IV-SF ••••

(controle)

5 31***

(25,5-53)

39***

(28,5-79,5)

61***

(44,5-106)

86***

(52-150,5)

Os dados estão expressos como mediana e amplitude interquartílica. Estas foram transformadas em

postos e analisadas, 2 a 2, conforme grupo alimentar pelo teste ANOVA para medidas repetidas.

•Comparação entre as medianas de AST dos animais controle que receberam dieta normal

preservados com UW ou FBP - *p=0,02. ••Comparação entre as medianas de AST dos animais do

grupo de dieta restrita preservados com UW e FBP – **p=0,01. •••Comparação entre as medianas

de AST dos animais que receberam dieta hiperlipídica preservados com UW e FBP- #p=NS.

••••Comparação entre as medianas de AST dos animais controle que receberam dieta normal e

foram preservados com SF em relação aos animais controle preservados com UW - ***p=0,003 ou

FBP -

p=NS. Onde AST= aspartatoaminotransferase, em UI/L.

Tabela 5. Medianas de ALT aferidos nas soluções de preservação dos fígados dos

animais após 2, 4, 6 e 8h de isquemia a frio, nos diferentes grupos estudados.

Grupos n ALT 2h ALT 4h ALT 6h ALT 8h

I-UW •

(controle)

5 75

(52-121)

104

(73-159,5)

129

(87-190)

141

(99,5-254)

I-FBP •

(controle)

5 65

(57-85,5)

(72,5-89)

127

(80,5-156)

150

(109,5-165)

II-UW ••

(restrição)

5 49

(33,5-54,5)

(39-71)

(49,5-103)

106

(68-162,5)

II-FBP ••

(restrição)

5 24

(22,5-28)

(32-61)

(36-72,5)

(49,5-95)

III-UW•••

(hiperlipídica

)

5 21*

(17,5-36)

52*

(28-65)

53*

(31-67,5)

76*

(50,5-78)

III-FBP•••

(hiperlipídica

)

5 64*

(36-87)

106*

(66-111,5)

114*

(71-134,5)

126*

(86,5-160)

IV-SF ••••

(controle)

5 28

(22-46,5)

26,0-59,5

(33-72,5)

(42-97)

Os dados estão expressos como mediana e amplitude interquartílica. Estas foram transformadas em

postos e analisadas, 2 a 2, conforme grupo alimentar pelo teste ANOVA para medidas repetidas.

•Comparação entre as medianas de AST dos animais controle que receberam dieta normal

preservados com UW ou FBP -

p=NS. ••Comparação entre as medianas de AST dos animais do

grupo de dieta restrita preservados com UW e FBP –

p=NS. •••Comparação entre as medianas

de AST dos animais que receberam dieta hiperlipídica preservados com UW e FBP-*p=0,O2.

••••Comparação entre as medianas de AST dos animais controle que receberam dieta normal e

foram preservados com SF em relação aos animais controle preservados com UW -

p=NS. Onde

AST= aspartatoaminotransferase, em UI/L.

Tabela 6. Medianas de LDH aferidas nas soluções de preservação dos fígados dos

animais com 2, 4, 6 e 8h, nos diferentes grupos estudados.

Grupos n LDH 2h LDH 4h LDH 6h LDH 8h

I-UW •

(controle)

5 664*

(490,5-805,5)

817*

(639,5-1010,5)

968*

(708-1188)

1062*

(809-1566)

I-FBP •

(controle)

5 178*

(55,5-254,5)

258*

(74,5-372,5)

380*

(91,5-458,5)

488*

(114-652,5)

II-UW ••

(restrição)

5 349**

(216-475,5)

358**

(268,5-562,5)

489**

(340-710)

619**

(380-802,5)

II-FBP ••

(restrição)

5 34**

(21,5-137)

56**

48,5-228,0

94**

(65-247,5)

173**

(102-442)

III-UW•••

(hiperlipídica

)

5 370#

(286-577)

729#

464,0-812,0

770#

(581,5-890)

881#

(583-1071)

III-FBP•••

(hiperlipídica

)

5 402#

(222,5-762,5)

730#

447,5-1056,5

802#

629,0-1157,5

1055#

(848,5-1636)

IV-SF •

(controle)

5 178***

(148-206)

240***

(194,5-338,5)

334***

(268,5-435,5)

368***

(343,5-517,5)

Os dados estão expressos como mediana e amplitude interquartílica. Estas foram transformadas em

postos e analisadas, 2 a 2, conforme grupo alimentar pelo teste ANOVA para medidas repetidas.

•Comparação entre as medianas de LDH dos animais controle que receberam dieta normal

preservados com UW ou FBP - *p=0,002. ••Comparação entre as medianas de LDH dos animais

do grupo de dieta restrita preservados com UW e FBP – **p=0,01. •••Comparação entre as

medianas de LDH dos animais que receberam dieta hiperlipídica preservados com UW e FBP-

#p=NS. ••••Comparação entre as medianas de AST dos animais controle que receberam dieta

normal e foram reservados com SF em relação aos animais controle preservados com UW -

***p=0,0001 ou FBP - +p=NS. Onde LDH= lactatodesidrogenase, em UI/L.

Figura 10: Medianas de AST, ALT e LDH em UI/L em 2, 4, 6 e 8h nos 7 diferentes

grupos estudados. Comparações: a) AST: C-UW vs C-FBP (p=0,0001); C-UW vs R-UW (p=0,004); C-UW

vs R-FBP (p=0,0001); C-UW vs H-UW (p=0,0001); C-UW vs H-FBP (p=0,0001); C-UW vs C-SF (p=0,0001), b)

ALT: C-UW vs C-FBP (p=NS); C-UW vs R-UW (p=NS); C-UW vs R-FBP (p=0,01); C-UW vs H-UW (p=0,02); C-

UW vs H-FBP (p=NS); C-UW vs C-SF (p=0,01), c) LDH: C-UW vs C-FBP (p=0,0001); C-UW vs R-UW (p=0,005);

C-UW vs R-FBP (p=0,0001); C-UW vs H-UW (p=NS); C-UW vs H-FBP (p=NS); C-UW vs C-SF (p=0,0001) Onde

AST=aspartatoaminotransferase; ALT=alaninoaminotransferase; LDH= lactatodesidrogenase; C-UW= controle

com dieta normal preservados com UW; C-FBP= controle com dieta normal preservados com FBP; R-UW=

100

150

200

250

2h 4h 6h 8h

C-UW

C-FBP

R-UW

R-FBP

H-UW

H-FBP

C-SF

100

120

140

160

2h 4h 6h 8h

C-UW

C-FBP

R-UW

R-FBP

H-UW

H-FBP

C-SF

200

400

600

800

1000

1200

2h 4h 6h 8h

C-UW

C-FBP

R-UW

R-FBP

H-UW

H-FBP

C-SF

dieta restrita preservados com UW; R-FBP= dieta restrita preservados com FBP; H-UW= dieta hiperlipídica

preservados com UW; H-FBP= dieta hiperlipídica preservados com FBP.

Tabela 7. Médias e desvios-padrão de TBARS e catalase aferidas no tecido hepático

dos animais, nos diferentes grupos estudados.

Grupos n TBARS Catalase

I-UW

(controle)

5 47,4

(±5,4)

130,1

(±32,6)

I-FBP

(controle)

5 35,6

(±4,9)

54,1

(±18,2)

II-UW

(restrição)

5 47

(±4,8)

70,9

(±13,7)

II-FBP

(restrição)

5 33,2

(±5,1)

(±10,2)

III-UW

(hiperlipídica

)

5 63,8

(±3,5)

34,6

(±7)

III-FBP

(hiperlipídica

)

5 57

(±10,9)

24,2

(±2,1)

IV-SF

(controle)

5 212,4

(±41,6)

53,5

(±6,2)

Os dados estão expressos como média e desvio-padrão. Os dados foram

transformados em ranks para as comparações: a) TBARS (nmol/g tecido): C-UW vs C-FBP

(p=0,01); C-UW vs R-UW (p=NS); C-UW vs R-FBP (p=0,002); C-UW vs H-UW (p=0,01); C-UW vs

H-FBP (p=NS); C-UW vs C-SF (p=0,001), b) Catalase (UI/mg.-proteína): C-UW vs C-FBP (p=0,001);

C-UW vs R-UW (p=NS); C-UW vs R-FBP (p=0,0001); C-UW vs H-UW (p=0,001); C-UW vs H-FBP

(p=0,0001); C-UW vs C-SF (p=0,03). Onde TBARS=substâncias reativas ao tiobarbitúrico; C-UW=

controle com dieta normal preservados com UW; C-FBP= controle com dieta normal preservados

com FBP; R-UW= dieta restrita preservados com UW; R-FBP= dieta restrita preservados com FBP;

H-UW= dieta hiperlipídica preservados com UW; H-FBP= dieta hiperlipídica preservados com FBP.

6.4. Análise anatomopatológica

Os resultados obtidos na análise histopatológica dos fígados dos

animais estão representados na tabela 8.

Tabela 8. Achados anatomopatológicos após a preservação a frio de fígados de

ratos, submetidos à intervenção dietética.

Grupo N Esteato

Infiltrado

inflamatório

Balonizaçã

Grupo I

(controle)

10 1

(10%)

(0%)

(40%)

Grupo II

(restrição)

10 0

(0%)

(20%)

Grupo III

(hiperlipídic

10 0

(0%)

(80%)

Proporções dos achados anatomopatológicos nos diferentes grupos estudados. Onde esteatose=

esteatose <5%; infiltrado inflamatório= infiltrado linfoplasmocitário; balonização= degeneração

hidrópica leve.

A Figura 11 demonstra os aspectos macroscópicos e microscópicos de

um fígado de um animal do grupo submetido à dieta normal.

A Figura 12 demonstra os aspectos macroscópicos e microscópicos de

um fígado de um animal do grupo submetido à dieta hiperlipídica.

Figura 11. Aspecto do fígado de um animal alimentado com dieta normal,

preservado com UW. 1= aspecto macroscópico; 2= aspecto histológico normal, HE, 100x.

1 2

Figura 12. Aspecto do fígado de um animal alimentado com dieta hiperlipídica,

preservado com UW. 1= aspecto macroscópico; 2= aspecto histológico: degeneração hidrópica

centrolobular, HE, 200x.

7.DISCUSSÃO

7.1. Em relação ao desenho do estudo

A busca por uma solução de preservação ideal, constitui-se ainda hoje

em uma das grandes fronteiras técnicas a ser vencida no transplante hepático.

Algumas soluções vêm sendo estudadas na prática médica, como as soluções de

Celsior e HTK (histidina-triptofano-cetoglutarato), sem que demonstrem uma

significativa superioridade em relação à UW (Berlakovich et al, 2000; Janssen et al,

2004; Cheng et al, 2005). No presente estudo, a opção feita pelo desenho

experimental deveu-se ao interesse na avaliação do papel da FBP neste cenário.

Embora já tenham sido atribuídas a ela inúmeras propriedades citoprotetoras em

diferentes situações patológicas, o seu uso restringe-se ao campo experimental.

A escolha desta substância decorreu de sua potencial capacidade em

prover o enxerto de substrato energético para contrapor os efeitos do dano de

preservação, o que poderia ser bastante útil nos órgãos retirados de doadores

nutricionalmente comprometidos, com reservas de ATP depletadas. De acordo com

nosso conhecimento, não há estudo publicado com desenho semelhante.

O TxH ortotópico em ratos constitui uma técnica amplamente adotada

no contexto da pesquisa. O uso de ratos apresenta algumas vantagens em relação às

demais espécies, sobretudo em razão da sua disponibilidade e baixo custo, embora

requeira um vasto treinamento técnico-cirúrgico (Lausada et al, 2002). No presente

estudo, o foco de interesse era o doador e a lesão decorrente da isquemia a frio.

Assim, optou-se por um modelo experimental sem a concorrência do transplante. Se

houvesse sido feita a reperfusão, por certo se estaria adicionando outras variáveis

independentes do estado inicial do enxerto. As alterações bioquímicas e

anatomopatológicas verificadas, neste caso, devem-se unicamente às condições do

doador e do tempo de isquemia definido pelo estudo.

Cabe ser discutido o tipo de anestesia. A droga escolhida como

anestésico foi o isoflurano, administrado por via inalatória, contrastando com

muitos trabalhos que utilizam anestésicos por via intraperitoneal (Moresco et al,

2004a; Kim et al, 2003; Nunes et al, 2002). A principal razão desta escolha, foi o desejo

de aproximar o experimento aos procedimentos rotineiros utilizados no TxH,

eliminando possíveis vieses. A técnica inalatória requer aparelhagem adequada,

além do risco de extravasamento do anestésico através das conexões, tornando o

pesquisador suscetível a risco. Por outro lado apresenta significativas vantagens,

como a facilidade de administração da droga, a concomitante oferta de oxigênio

através do vaporizador e a maior segurança do animal devido a possibilidade do

constante ajuste de doses conforme os seus parâmetros respiratórios (Waynforth &

Flecknell, 1992).

A preservação a frio foi feita durante 8 horas. Este tempo poderia ser

questionado, já que a solução de UW poderia ser capaz de garantir a viabilidade do

enxerto por até 24 horas. No entanto, este tempo não é utilizado na prática, uma vez

que acima de 12 horas há maior risco de lesão celular, especialmente do epitélio

biliar e conseqüentes piores resultados no período pós-transplante (Kahn, 1996;

Lemasters et al, 2001). A padronização de um período de 12 horas de isquemia frio

foi cogitada, já que em estudo anterior, foram suficientes para demonstrar dano de

preservação (Moresco et al, 2004a). No entanto, este período foi inviabilizado pelo

horário de funcionamento da UEA do HCPA, e foi adotado, então, para os

propósitos deste estudo, o maior tempo possível, 8 horas.

A aferição bioquímica da preservação a frio foi feita pela dosagem de

AST, ALT e LDH, nas alíquotas retiradas das soluções de preservação nos intervalos

padronizados. Estas enzimas costumam se alterar em situações de dano ao tecido

hepático. Na prática clínica são habitualmente aferidas no período pós-operatório.

Em ambiente de pesquisa, podem ser avaliadas no líquido de preservação e

correlacionam-se bem com a lesão de isquemia a frio. A AST é considerada o

marcador mais sensível de disfunção do enxerto (Everson & Kam, 2001). A LDH é

uma enzima da rota glicolítica, e embora pouco específica, é liberada quando há

dano celular, como hipóxia e necrose, como na situação de interesse.

O EO vem sendo apontado como um dos principais fatores

responsáveis por dano ao enxerto. Por certo, as lesões mais exuberantes relacionadas

ao dano de I/R ocorrem com a restauração do fluxo sanguíneo. A quantificação do

RL e de substâncias antioxidantes torna-se um importante parâmetro para inferir a

viabilidade do órgão no pós-transplante e costuma estar restrita ao ambiente de

pesquisa. Como o estímulo à geração de RL é mais intenso após a reperfusão,

estudos que se atêm à isquemia poderiam talvez prescindir desta avaliação. No

entanto, pareceu-nos interessante avaliar alguns parâmetros. A mitocôndria

representa o foco inicial da lesão de I/R, e ela é a responsável pela geração de ROS.

Estas substâncias reagem com os lipídios das membranas celulares adjacentes

provocando a lipoperoxidação. Esta pode ser avaliada indiretamente pela formação

de malondialdeído através da determinação de TBARS. Quando há geração de ROS,

costuma haver a ativação de substâncias antioxidantes endógenas, como a catalase.

Estes foram os dois fatores escolhidos para serem determinados no presente estudo.

Cabe salientar que muitas das publicações acerca do tema restringem a avaliação do

EO à determinação de apenas uma variável, em geral TBARS (Iasi et al, 2003;

Moresco et al, 2004a; Moresco et al, 2004b).

O destaque dado ao estado nutricional do doador reflete uma

realidade já discutida, mas também o interesse do grupo por este tema (Álvares-da-

Silva et al , 1998, Álvares-da-Silva et al 2004, Gottschal et al, 2004). Por certo, a

manipulação e o controle da ingestão calórica, bem como da qualidade dos

nutrientes, tornam-se facilitados no campo de experimentação. Isto permite a

simulação de situações clínicas. Estimamos que o estado nutricional do doador

possa modificar a qualidade do enxerto. Outros pesquisadores já traçaram

considerações a respeito deste tema (Sumimoto et al, 1994; Singer et al, 2001), mas

através do transplante em animais e da cultura de células.

A maioria dos modelos experimentais para determinação de obesidade

e insulino-resistência utilizam as chamadas “dietas de cafeteria” – ou seja, dietas em

que a ração é acrescida de suplementos calóricos (Tan et al, 2005; Campion &

Martinez, 2004). Estas dietas têm menor credibilidade científica e geralmente

demandam longo período de observação, ou se valem do uso de roedores com

defeitos genéticos que favorecem o surgimento de obesidade. A dieta deficiente em

colina e metionina (DMC) é largamente empregada na gênese de esteato-hepatite

não-alcoólica (Souza de Oliveira et al, 2006, Nagasawa et al, 2006), mas provocar esta

doença não era o foco de interesse do presente estudo. A opção pela dieta Lieber-De

Carli foi feita porque teoricamente ela contém todos os nutrientes essenciais de

acordo com as recomendações do National Research Council e NIH, órgãos

governamentais dos Estados Unidos, e poderia reproduzir o que ocorre em

humanos com aumento do peso. Mais ainda, a proposta era que os animais

apresentassem esteatose hepática ao final de quatro semanas de ingestão ad libitum,

sem a necessidade de gavagem, o que acrescentaria um estresse desnecessário aos

mesmos.

O fato de a Dieta Lieber-De Carli ser líquida, no entanto, motivou a

confecção de comedores especiais, desenvolvidos especialmente para isto. Os

animais alimentaram-se adequadamente com os referidos comedores.

Projetos utilizando intervenção dietética, em animais alojados em

grupo, na mesma caixa-moradia, vêm sendo rotineiramente criticados. Existe uma

hierarquia instintiva estabelecida entre os animais, de forma que o rato considerado

dominante acaba ingerindo maior quantidade de alimentos que os demais. Por isso,

foi tomado o cuidado de ser mantido um animal por gaiola, como em outros estudos

(Souza de Oliveira et al, 2006). Como o isolamento pode interferir no conforto destes

animais, foram utilizadas caixas-moradia de policarbonato transparentes, colocadas

lado a lado, de forma que eles tivessem a impressão de convivência em grupo. As

gaiolas eram dotadas de toca de aço inox, desenvolvida para os momentos onde o

animal desejasse proteção da luz e isolamento, como é comum em roedores.

É importante que se discuta os parâmetros utilizados para análise

nutricional e metabólica. O peso corpóreo do animal e do seu fígado, e a proporção

peso do fígado/peso do animal, bem como suas variações após intervenção

dietética, constituem-se em ferramentas simples, porém eficazes, para estimativa do

estado nutricional. Especialmente quando estas variações ultrapassam 10% do basal,

em um período de observação curto como o de quatro semanas. A dosagem sérica

de albumina é um parâmetro classicamente aceito para estimativa do estado

nutricional, tanto em ambiente de pesquisa, quanto na prática clínica. O interesse

especial na glicemia e insulina de jejum está relacionado à importância da resistência

periférica à insulina, seus desdobramentos fisiopatogênicos no fígado e suas

possíveis conseqüências sobre a lesão de preservação. Obesidade e diabetes melito

são condições comuns na população geral e freqüentemente correlacionadas à

doença hepática gordurosa não alcoólica. Acredita-se que uma das chaves para o

desenvolvimento de esteatose hepática e sua progressão para formas mais graves de

doença, como a esteato-hepatite não alcoólica, seja a insulino-resistência.(Lieber et al,

2005). O efeito da resistência periférica à insulina sobre a lesão de I/R ainda está

para ser definido. Outros parâmetros da síndrome metabólica poderiam ter sido

avaliados, assim como colesterol e triglicerídeos, mas a limitação orçamentária, e

especialmente, o pequeno volume de sangue que usualmente se obtém na coleta do

lago venoso retro-ocular, obrigaram a que fossem feitas escolhas.

A avaliação anatomopatológica é parte essencial de qualquer

experimento em Hepatologia. No estudo em questão, o principal foco desta

avaliação era surpreender as alterações decorrentes da manipulação nutricional,

especialmente a presença ou não de esteatose. As lesões decorrentes do dano de

preservação, por certo, teriam importância secundária, pois é sabido que a biópsia

hepática realizada imediatamente após a preservação costuma demonstrar

alterações pouco relevantes (Gaffey et al, 1997).

7.2.Em relação aos resultados da avaliação metabólica e estado nutricional

A avaliação metabólica e nutricional demonstrou, conforme eram

esperadas, diferenças entre os animais submetidos às diferentes dietas. No grupo

que recebeu dieta hiperlipídica, o peso dos animais foi superior àqueles dos demais

grupos após o período de intervenção nutricional. No entanto, os pesos dos fígados

e a relação entre o peso dos fígados/peso dos animais somente foi maior naqueles

submetidos à dieta hiperlipídica, quando em comparação com os que receberam

dieta restrita.

Igualmente, os ratos alimentados com a dieta Lieber-De Carli

apresentaram níveis mais altos de glicemia que os ratos dos demais grupos. É

interessante notar que este grupo apresentava índices de glicemia mais baixos que

os outros animais antes da intervenção nutricional, embora não tenha havido

diferença significativa neste aspecto. Quando também avaliado o delta-glicemia, este

foi significativamente maior nos ratos que receberam dieta à base de lipídios. Este

achado parece contundente, e salienta o estímulo à criação, neste modelo, de um

fator reconhecidamente ligado à esteatose, a hiperglicemia.

A determinação da insulinemia, ao lado dos níveis sanguíneos de

glicose, seria importante para evidenciar a presença de resistência insulínica. Houve,

no entanto, dificuldades com a dosagem de insulina na maioria dos animais.

Acredita-se que isto tenha ocorrido em função de que o teste por radioimunoensaio

empregado foi feito com kit para humanos. A determinação da insulina com kits

para ratos acrescentaria custos que não seriam suportados pelo orçamento do

estudo. De qualquer forma, há sangue estocado para análises posteriores,

especialmente de polipeptídeo C, a forma ideal para a confirmação da insulino-

resistência. Infelizmente, embora autorizada a importação do kit para sua realização,

este não foi desembaraçado pela Receita Federal a tempo dos resultados serem

apresentados neste momento.

Os animais submetidos à dieta hiperlipídica apresentaram

macroscopicamente maior concentração de gordura visceral que os outros animais.

A Figura 10 demonstra claramente estes achados. Deve-se salientar que a presença

de gordura visceral, é um dos principais eventos relacionados à síndrome

metabólica.

Desta forma, acredita-se que o método de indução de uma condição

metabólica que favorecesse o surgimento de esteatose hepática foi bem sucedido

neste modelo, ao menos pela presença de níveis elevados de glicemia e gordura

visceral. Em analogia com humanos doadores de órgãos e que apresentam esteatose

hepática, excluídos aqueles em que a causa é alcoólica, provavelmente os demais

sejam portadores de síndrome metabólica.

Outro achado interessante neste cenário é o fato de que os animais

submetidos à dieta restrita apresentaram menor peso corpóreo e menor peso do

fígado. Neste grupo, igualmente, a relação peso do fígado/peso corporal foi inferior.

De fato, esta a razão foi menor do que aquela descrita como normal, de 3 a 4% (Panis

et al, 1997).

Um achado intrigante foi a redução da albumina, aferida pelo delta-

albumina, no grupo de animais submetidos à dieta normal. Embora tenha sido feito

um estudo inicial para determinação dos requerimentos dietéticos habituais diários

dos animais, e mesmo que os achados tenham sido similares a de outro estudo

realizado neste mesmo centro (Horn et al, 2006) e estarem dentro dos limites

recomendados pelo fabricante da dieta utilizada (www.nuvital.com.br), talvez esta

oferta tenha sido insuficiente. No entanto, o que pode ser visto pela análise dos

dados apresentados no Anexo 3, a albumina sérica pré-intervenção foi obtida de

acordo com uma ferramenta estatística. Como não havia sido determinada a

albumina prévia neste grupo, esta foi estimada pela média das albuminemias dos

animais dos demais grupos antes do regime alimentar.

7.3. Em relação aos achados anatomopatológicos

O modelo de esteatose, desenvolvido por Lieber e colaboradores, 2004,

utilizava ratos Sprague-Dawley de 120 dias. No presente estudo os ratos eram da

linhagem Wistar com idade de 150 dias e nenhum deles desenvolveu esteatose após

intervenção nutricional. De fato, um único caso de esteatose leve, menor que 5%,

ocorreu em um animal do grupo de dieta normal. Isto poderia levar à consideração

de que não se tenha obtido êxito com o modelo proposto. No entanto, algumas

hipóteses foram levantadas para explicar este fato. Talvez a linhagem e a idade dos

animais, bem como o tempo da intervenção dietética, tenham interferido. Os

autores, no seu artigo original, utilizaram a dieta por 3 semanas. Teria uma semana a

mais de uso da dieta contribuído para uma piora do animal? Se do ponto de vista

clínico, na última semana estes animais tornaram-se visivelmente doentes, é difícil

crer que teriam perdido alguma esteatose hepática que se tivesse desenvolvido.

Outro dado a ser considerado é o formato e o tamanho dos comedores. Estes

propiciavam algum discreto extravasamento, e obrigava a reposição da dieta. Como

isto era impraticável à noite, e como os roedores têm hábito noturno, talvez possa ter

prejudicado o rendimento da intervenção dietética. Um fato interessante é que a

maioria dos animais acrescia serragem à dieta líquida, talvez movida pela

necessidade instintiva de roedor, na tentativa de deixar a dieta sólida, e nesta

situação ingeriam grande quantidade de celulose associada à dieta. No entanto, os

animais que receberam a dieta hiperlipídica obtiveram ganho de peso de 10,8%,

tinham subjetivamente mais gordura visceral, e apresentaram glicemia e delta-

glicemia mais elevadas em relação ao grupo controle, o que demonstra alguma

efetividade da dieta.

É notável que tenha sido observada, nos fígados destes animais, uma

proporção significativamente maior de degeneração hidrópica centrolobular

(degeneração balonizante) em relação aos ratos dos grupos controle e de dieta

restrita. A degeneração balonizante é descrita como uma alteração decorrente do

aumento anormal no diâmetro das células, que se tornam maior que 1,5 a 2 vezes o

habitual. Estudos recentes, baseados em análise de regressão logística múltipla,

destacam a degeneração balonizante hepatocitária como um fator independente

associado à esteato-hepatite não alcoólica (Gramlich et al, 2004; Kleiner et al, 2005).

Outros estudos semelhantes vão além, sugerindo que a degeneração hidrópica é

uma variável independente associada à fibrose sinusoidal e perivenular, e, portanto,

relacionada à maior progressão e gravidade da doença (Gramlich et al, 2004).

A degeneração balonizante hepatocitária nas hepatites virais é definida

como alteração hidrópica decorrente da dilatação irregular do retículo

endoplasmático liso (REL). Entretanto, na esteato-hepatite não-alcoólica não há uma

definição clara do que determina esta alteração. Estudos utilizando microscopia

eletrônica de transmissão sugerem que o alargamento hepatocitário decorra do

acúmulo de depósitos microscópicos de lipídios encapsulados no interior do REL,

com freqüência associados a um material eletrodenso semelhante à lipofucsina, que

determina a aparência de rarefação citoplasmática característica da degeneração

balonizante. Caldwell e colaboradores, 2006, salientam que a presença de lipofucsina

eletrodensa é um marcador de lipoperoxidação. Desta forma, o achado de

degeneração balonizante nos ratos submetidos à dieta hiperlipídica deve ser

valorizado.

7.4. Em relação aos resultados da avaliação bioquímica do dano isquêmico

Os resultados deste estudo devem ser analisados em dois cenários

distintos: primeiro, a comparação entre os animais controles e aqueles submetidos à

dieta restrita, e, segundo, os animais controles comparados aos que receberam dieta

hiperlipídica. Esta forma de análise facilita a compreensão dos fenômenos

observados. Esta comparação, por sua vez, será feita considerando-se as diferentes

soluções de preservação.

A avaliação do dano isquêmico, através da determinação de AST, ALT

e LDH no líquido de preservação, é um parâmetro utilizado em outros estudos.

Dentre eles, a AST é considerada o principal elemento, pois, em uma fase de dano

agudo, os seus níveis costumam alterar-se mais precocemente que os de ALT (Bao et

al, 1994; Rosen et al , 1998). No presente estudo, os níveis de AST e LDH foram

menores nos fígados de ratos submetidos à dieta normal ou restrita e preservados

com FBP, quando comparados com os correspondentes preservados com UW.

Moresco e colaboradores, 2004a e 2004b, estudando fígados de ratos alimentados

com dieta padrão e submetidos à preservação por 12 ou 24 horas, encontraram

resultados diferentes. Os autores demonstraram que FBP e UW foram equivalentes

em relação aos níveis de AST e LDH. O presente estudo, no entanto, sugere que a

FBP protege o fígado contra o dano isquêmico, quando em comparação com a UW,

quando este é avaliado por critérios bioquímicos. Estes achados, ao menos em

relação aos ratos que receberam dieta normal, são similares ao de outro estudo

realizado pelo nosso grupo (Fraga et al, 2005).

Um dado surpreendente foi obtido pela análise de outros cinco animais

que receberam dieta normal e que tiveram seus fígados preservados com SF. Este

subgrupo apresentou parâmetros bioquímicos de lesão isquêmica mais favoráveis,

do que aquele cujos fígados foram preservados com UW, equiparando-se aos bons

resultados obtidos com FBP. O fator determinante para que fosse feito o estudo da

preservação com SF decorreu dos achados superiores encontrados com o uso de FBP

no estudo supracitado de Fraga e colaboradores, 2005. A FBP é solubilizada em

cloreto de sódio 0,9% e isto levou ao questionamento dos bons resultados do

referido estudo: seriam eles atribuíveis à FBP ou à solução salina? Até este momento

da avaliação dos resultados do estudo em tela, a dúvida persiste.

Quando comparados os níveis de AST e LDH obtidos entre os grupos

preservados com FBP e submetidos à dieta normal e restrita, não houve diferença

significativa, sugerindo que esta solução pode ter propriedades protetoras a um

órgão nutricionalmente comprometido, em tese com substratos energéticos

depletados. Todavia, a mesma comparação feita entre os ratos que foram

preservados com UW demonstrou piores resultados nos animais que receberam

dieta normal. Este achado foi surpreendente, e não há uma explicação que pareça

lógica e o justifique.

A comparação entre os níveis de AST nos fígados de ratos submetidos

à dieta normal ou hiperlipídica e preservados com FBP, quando comparados com os

correspondentes preservados com UW, demonstrou terem ocorrido piores

resultados nos animais submetidos à dieta normal e preservados com UW. Quando

considerada a LDH, os melhores resultados foram obtidos com a preservação de

fígados de ratos com dieta normal, preservados com FBP. Nos ratos submetidos à

dieta hiperlipídica, não houve diferença entre as duas soluções.

Quando comparados os níveis de AST e LDH obtidos entre os grupos

preservados com FBP e submetidos à dieta normal ou hiperlipídica, não houve

diferença significativa em relação à AST, porém, em relação à LDH, o grupo que

recebeu dieta hiperlipídica apresentou piores resultados. Isto põe em dúvida a

propriedade protetora desta solução em um órgão potencialmente exposto à

síndrome metabólica. Talvez esta substância não consiga reverter o estímulo

patogênico determinado pela dieta hiperlipídica. A mesma comparação feita entre

os ratos que foram preservados com UW novamente demonstrou piores resultados

nos animais que receberam dieta normal em relação à AST. O motivo pelo qual isto

ocorreu não encontra ainda uma explicação. Não houve diferença em relação à LDH

na solução de preservação de fígados de ratos preservados com UW. Talvez, a UW

tenha conseguido neste grupo, os submetidos à dieta hiperlipídica exercer algum

papel protetor.

Isto fez com que fosse realizada uma análise comparativa de todos os

sete subgrupos em relação aos parâmetros bioquímicos estudados, de forma que

pudesse fornecer uma idéia mais clara e mais ampla dos resultados obtidos. A

Figura 11 demonstra estes resultados e deixa evidente que o grupo de pior

desempenho foi aquele dos ratos alimentados com dieta normal e preservados com

a solução padrão para TxH, a UW. Por outro lado, o grupo que apresentou os

resultados mais favoráveis foi o dos animais em restrição alimentar que tiveram seus

fígados preservados com FBP. Este fato sugere que a restrição alimentar, ou a

desnutrição aguda, atestada no estudo pela diminuição do peso corporal, pode não

estar associada a piores resultados no TxH. Este achado não é de todo inusitado. De

fato, outros estudos experimentais, desenvolvidos pelo grupo de Belzer, vêm

demonstrando que a restrição alimentar pode aumentar a tolerância à isquemia a

frio por períodos mais prolongados, bem como a sobrevida no TxH em animais,

mesmo que estes enxertos possam ter menores concentrações de glicogênio e ATP

celular (Sumimoto et al, 1993; Lindell et al,1996). A razão disto permanece ignorada.

Mais ainda, os autores sugerem que o uso de suplementos energéticos no período

pré-transplante imediato poderia contrabalançar a redução do glicogênio e ATP,

melhorando ainda mais esta tolerância à isquemia (Lindell et al,1996). No presente

estudo, pode-se inferir que a FBP tenha desempenhado exatamente este papel nos

ratos sob restrição alimentar.

7.5. Em relação aos resultados da lipoperoxidação e geração de antioxidantes

endógenos

A repercussão da lesão mitocondrial hepática representa o principal

mecanismo relacionado ao dano de preservação. De tal forma, avaliá-la é essencial.

Os níveis de TBARS no homogeneizado do tecido hepático após a preservação

foram significativamente inferiores nos subgrupos de animais controle e com dieta

restrita que tiveram seus fígados preservados com FBP, quando comparados aos

correspondentes preservados com UW. Isto não se evidenciou no grupo da dieta

hiperlipídica. Estes achados entram em total conformidade com aqueles obtidos na

avaliação bioquímica do dano de preservação, e reforçam o papel protetor da FBP

sobre os fígados dos animais controle e sob restrição. Novamente esta substância

parece não ter exercido proteção aos fígados dos ratos com dieta hiperlipídica, em

termos de lipoperoxidação.

É interessante notar que, com a análise das TBARS, ficou claro que os

bons resultados obtidos com a preservação com SF não se sustentam quando

avaliada a lipoperoxidação. Com isto, pode-se afirmar que a solução salina, como

era de se esperar, não protege contra o dano mitocondrial.

Quando comparadas as TBARS obtidas do tecido hepático, entre os

grupos preservados com FBP e submetidos à dieta normal e restrita, não houve

diferença significativa, reforçando a possibilidade de que esta realmente tenha

propriedades protetoras sobre um órgão nutricionalmente comprometido. As

TBARS dos fígados dos ratos destes estados alimentares e que foram preservados

com UW, também se comportaram de forma semelhante, demonstrando neste caso

que a UW, em termos de lipoperoxidação, como era esperado, também parece

exercer certa proteção ao fígado dos animais em restrição. Aqui não houve a figura

de um pior resultado nos fígados de ratos com dieta normal e preservados com UW,

como havia paradoxalmente ocorrido na avaliação bioquímica.

A comparação entre as TBARS nos fígados de ratos submetidos à dieta

normal ou hiperlipídica e preservados com FBP, quando comparados com os

correspondentes preservados com UW, demonstrou piores resultados nos animais

submetidos à dieta hiperlipídica e preservados com UW. Os melhores foram obtidos

com a preservação de fígados de ratos com dieta normal, preservados com FBP.

Não houve, considerando apenas os animais submetidos à dieta hiperlipídica,

diferença nos resultados alcançados com FBP ou UW. Ambas as soluções

apresentaram piores resultados quanto à lipoperoxidação neste grupo alimentar do

que no grupo controle.

Ademais, os resultados sugerem que a FBP não foi capaz de atenuar a

lipoperoxidação ocorrida nos animais que receberam a dieta hiperlipídica, já que

houve uma diferença desfavorável para os animais sob esta dieta em relação aos da

dieta normal. Novamente há uma convergência entre os achados bioquímicos da

preservação com os da avaliação da lipoperoxidação.

Quando feita a análise comparativa dos sete subgrupos estudados em

relação à TBARS, o de pior desempenho foi aquele dos animais com dieta normal

cujos fígados foram preservados com SF. Isto não surpreende, pois é sabido que a

solução de UW é dotada de componentes antioxidantes, como a glutationa, e a FBP,

como já mencionado, possui propriedades antioxidantes.

Quando consideradas as análises de TBARS das soluções de UW e FBP,

os piores resultados ocorreram no grupo de animais da dieta hiperlipídica,

independente da solução empregada. Este dado reforça a hipótese de que estes

fígados foram consideravelmente prejudicados pela intervenção dietética e que a

FBP não foi capaz de contrabalançar esta injúria. O grupo que parece ter tido menor

lesão isquêmica através das dosagens de TBARS foi aquele correspondente aos

animais sob restrição alimentar e cujos fígados foram preservados com FBP. Mais

uma vez a análise de lipoperoxidação confirmou os achados da bioquímica da

preservação, reforçando uma maior tolerância destes animais a isquemia a frio

determinada pela restrição alimentar e pelas propriedades protetoras da FBP.

A atividade da enzima catalase foi significativamente maior nos

animais pertencentes aos subgrupos que tiveram seus fígados preservados com UW,

tanto nos que receberam dieta normal ou restrita. Este achado vai de encontro

àqueles obtidos com a avaliação bioquímica da preservação e da lipoperoxidação, já

que se considera o aumento desta enzima desejável, sendo esta uma substância

antioxidante.

É interessante notar que, quando analisamos a atividade da catalase, os

maus resultados obtidos com a preservação com SF dos fígados dos animais que

receberam dieta normal, em termos de lipoperoxidação, não ficaram assim tão

claros, quando comparados aos obtidos com FBP. Estes tiveram resultados

semelhantes aos animais controle com dieta normal e sob restrição alimentar

preservados com FBP. Os piores resultados com a preservação com SF foram

observados quando este grupo foi comparado àquele cujos fígados foram

preservados com UW, que por este parâmetro acabou impondo-se como melhor

solução.

Quando comparada as dosagens de catalase obtidas do tecido hepático,

entre os grupos preservados com FBP e submetidos à dieta normal ou restrita, os

resultados foram idênticos aos observados com TBARS, não havendo diferença

significativa, reforçando mais uma vez a hipótese de que esta realmente tenha

propriedades protetoras sobre um órgão nutricionalmente comprometido. Por outro

lado, a mesma comparação feita entre os ratos que foram preservados com UW

demonstrou diferença estatística. Neste caso a preservação hepática foi mais

favorável ao grupo de animais controle com dieta normal, sugerindo que a solução

de UW talvez não seja capaz de exercer proteção hepática neste cenário.

Por fim, o pior desempenho, em relação à atividade da catalase,

ocorreu no grupo de animais com dieta hiperlipídica, independente da solução

empregada.

7.6. Em relação aos estados nutricionais e a lesão de preservação nos fígados dos

ratos preservados com a solução padrão para transplante

Este tópico analisa a influência dos diferentes estados nutricionais dos

animais estudados sobre a lesão de preservação, levando-se em consideração a

solução de UW. Porque analisá-la em separado remete à própria razão deste estudo:

verificar se o estado nutricional do doador interfere na lesão de preservação. Esta

análise, em um desenho contemplando apenas a isquemia a frio, como neste projeto,

é uma condição inovadora, e esta influência é, de fato, pouco conhecida. Da mesma

forma, o papel desempenhado pela UW, na proteção de órgãos alterados pelo estado

nutricional do doador, também não está bem sedimentada.

Quando analisado o dano de isquemia a frio através da dosagem de

AST, nas diferentes alíquotas retiradas da solução de UW, foi verificado que entre os

animais com dieta normal e restrita, não houve diferença significativa na qualidade

da preservação. Pode-se inferir que a solução de UW teria a capacidade de

contrabalançar a carência energética nos fígados retirados de animais sob dieta

restrita. O grupo de Singer e colaboradores (Singer et al, 2001; Singer et al, 2005)

publicou estudos acerca do tema, revisando os efeitos nutricionais da morte

encefálica, e sugerem que haja depleção dos estoques energéticos. Para estes autores,

talvez haja espaço para a intervenção nutricional nos doadores.

Nos ratos submetidos à dieta hiperlipídica, os resultados foram piores,

demonstrando certa limitação na preservação de órgãos alterados por dieta rica em

lipídios.

Quando considerados os níveis de LDH na solução de preservação de

fígados de ratos com dieta normal e hiperlipídica, não foi identificada diferença

estatística. Porém, os níveis desta enzima foram menores nas alíquotas retiradas da

solução de UW dos animais sob dieta restrita. Isto sugere que devem existir

componentes da solução da UW que minimizam os efeitos da desnutrição aguda.

Com base nos resultados de TBARS aferidos no tecido hepático

preservado com UW, os ratos alimentados com dieta normal e sob restrição tiveram

menor lesão por lipoperoxidação em relação aos da dieta hiperlipídica. Estes

achados entram em conformidade com achados bioquímicos já descritos.

A atividade da catalase foi maior nos animais que receberam dieta

normal, e menor nos que receberam dieta hiperlipídica - estes achados foram

significativos estatisticamente.

Analisando estes dados em conjunto, pode-se inferir que a restrição

alimentar não provoca uma lesão adicional ao fígado que se reflita em maior dano

de preservação do que aquele que ocorre com uma dieta normal. No entanto,

quando o fígado está submetido ao risco de desenvolvimento de lesão esteatótica,

parece haver maior estímulo ao surgimento de lesão isquêmica de preservação. Este

dado vai ao encontro do reconhecido impacto da esteatose sobre a qualidade do

enxerto. A novidade, é que a desnutrição não a afeta. É interessante notar que estes

resultados foram similares aos encontrados com a solução de FBP.

7.7. Mecanismos sugeridos para a ação protetora da FBP no modelo proposto

Os melhores resultados obtidos com a preservação dos fígados dos

animais submetidos à dieta normal e restrita com a solução salina de FBP em

comparação com UW, podem ser atribuídos a algumas propriedades peculiares

desta substância. A FBP é um substrato da rota glicolítica e que, acreditava-se no

passado, teria a capacidade de atravessar a membrana celular e fornecer ATP para o

funcionamento da célula (Catani et al, 1980; Eddy et al 1981; Hardin & Roberts, 1994).

No entanto, há fortes indícios de que a FBP, como outros açúcares

fosforilados, não consiga atravessar a membrana celular, em decorrência do

tamanho da sua molécula e polaridade. Foi apenas muito recentemente que Cuesta e

colaboradores, 2006, estudando a lesão hepática induzida por D-galactosamina,

comprovaram que a FBP teria uma capacidade exógena de reduzir o consumo de

ATP, e que esta se daria através da modulação dos canais de potássio nas

membranas das células de Kupffer. Assim, é feita a hipótese de que os resultados

obtidos com a preservação com FBP no presente estudo, devam-se à sua capacidade

de preservar o consumo de ATP intracelular. Neste sentido, é notável que os animais

submetidos à dieta restrita e preservados com FBP tenham tido o melhor

desempenho global neste estudo.

8. CONCLUSÕES

De acordo com os métodos utilizados neste estudo e os resultados

obtidos no mesmo, podem ser enunciadas as seguintes conclusões:

1. O estado nutricional exerce influência sobre o dano de isquemia a frio, quando

aferido por parâmetros bioquímicos, pela lipoperoxidação e geração de

antioxidantes endógenos, em fígados de ratos com dieta normal, restrita ou

hiperlipídica.

2. Os melhores resultados na avaliação do dano de preservação foram obtidos

nos animais que foram submetidos à restrição alimentar, enquanto que os

piores ocorreram nos animais que receberam dieta hiperlipídica.

3. A FBP foi superior à UW na preservação a frio de fígados de ratos alimentados

com dieta normal, através da avaliação de variáveis bioquímicas,

lipoperoxidação.

4. A FBP apresentou resultados similares aos da preservação com SF nos animais

submetidos à dieta normal, quando avaliada por critérios bioquímicos.

5. A preservação com SF demonstrou melhores resultados do que os obtidos

com UW na preservação a frio de fígados de ratos alimentados com dieta

normal, através da avaliação de variáveis bioquímicas.

6. A preservação com FBP nos animais que receberam dieta normal foi superior

à obtida com SF, quando analisadas variáveis relacionadas à lipoperoxidação.

7. A preservação com UW, embora com resultados inferiores à FBP, nos animais

que receberam dieta normal, foi superior à obtida com SF, quando analisadas

variáveis relacionadas à lipoperoxidação.

8. A solução de FBP foi superior à UW na preservação a frio de fígados de ratos

sob restrição alimentar, através da avaliação de variáveis bioquímicas,

lipoperoxidação.

9. As soluções de FBP e UW não diferiram na preservação a frio de fígados de

ratos submetidos à dieta hiperlipídica, através da avaliação de variáveis

bioquímicas e lipoperoxidação.

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ANEXOS

ANEXO 1

AGEING AND ITS THE IMPACT ON THE QUALITY OF GRAFTS:

AN EXPERIMENTAL STUDY IN RAT LIVERS

Mota SM, Fraga RS, Gasperin G, Harlacher L,

Cerski CT,Oliveira JR, Álvares-da-Silva MR

Introduction

Liver transplantation (LT) is currently the treatment of choice for end-

stage both chronic and acute hepatic diseases. As better are the results, more

patients are considered to be listed, and besides donor shortage, this is the cause of

the increases of waiting rolls and, consequently, increasing of mortality on the roll.

Donor shortage has made transplant groups to expand their limits for

acceptation of organs. Age of donors has been usually considered a limiting factor.

Some of the groups reject grafts from donors which are older than 60 or 65 years.

However, these data are matter of controversy. Regarding liver function, bilirubins

and aminotransferases are kept under the normal degree even in individuals with

extremes of age, but serum albumin levels use to decline as years go by, suggesting

damage on the protein synthesis.

The most common disease that leads to LT is cirrhosis due to hepatitis

C virus (HCV). There are consistent clues of worse results with grafts from older

donors in these recipients, with earlier recurrence of HCV, and lower survival both

of the graft and the patient. The use of those organs has been often unadvised in

HCV receptors. The best results with these donors occur in selected cases: well-

preserved liver function, less cold ischemia time, absent or mild graft steatosis or

hepatocellular carcinoma Child-Pugh A recipients. Also, patients presenting with

acute liver failure or chronic cholestatic diseases, use to get better results, focusing

the importance of host factors.

As expected, preservation solution seems to play a role on the

ischemia-reperfusion injury. LT is now being performed in the most of the centers

through preservation with University of Wisconsin (UW) solution. Its costs, and

evidences of non-universal protection, as seen by primary non-function rates, make

attempts to research of others solutions. In this way, fructose-1,6-bisphosphate

(FBP) may have some utility. It is an energetic mediator of glucolitic pathway, which

has been studied in the field of cell protection in many pathological situations, as

sepsis, and ischemia/reperfusion in organs other than the liver.

The aim of this study is to determinate the impact of the ageing of the

donor in the cold ischemia injury in rat livers, as well to compare two distinct

solutions of preservation: UW and FBP.

Materials and Methods

All the procedures were carried out according to the current legislation

in Brazil, and the study was approved by Ethics and Research Committee of

Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Were studied twenty adult male Wistar rats,

settled down separately in living-boxes of transparent polycarbonate, submitted to

clear-and-dark cycles of 12 hours, under controlled temperature (22ºC). The animals

were fed with regular diet and received water ad libitum.

Animals were divided into two groups: control group: 10 rats, ageing

20 weeks, randomly assigned 5 to preservation with UW (C-UW) and 5, FBP (C-

FBP); and older group: 10 rats, ageing 50 weeks, randomly assigned to same way: 5

to UW (I-UW) and 5 to FBP (I-FBP).

Rats were anesthesized through isofluorane 1,5% (Isofluorano®,

Abbott), using calibrated vaporizator. Later, they were submitted to laparotomy,

and portal vein was cannulated by an intravenous catheter of 20G (Abbocath®, n. 20

Johnson & Johnson), and connected to 125 mL of 4

◦

C preservation solution,

according to the group: UW (Viaspan®) or FBP saline solution at 10 mmol/L, under

a pressure of 60cmH2O. Finally, hepatectomy was performed, and the liver

preserved at 50mL of the respective solution, kept under 2-4ºC for 8 hours, during

which were taken out samples at 2, 4, 6, and 8 hours.

Animals were weighed on digital scale (Marte, model AS5500c) very

before the surgical procedure, as well were the livers at the end of the period of

preservation. Serum glucose and albumin were carried out through the kinetic

method UV (Hitachi 917-Roche). From the samples taken were determined

aspartato-aminotransferase (AST) and lactic dehidrogenase (LDH) – (kinetic method

UV, Hitachi 917-Roche).

At the end of the preservation period, thiobarbituric acid reactive

substances (TBARS), activity of catalase and the products of nitric oxide (NO) were

determined. TBARS was done through the technique described by Halliwell &

Guteridge, 1989), catalase by the reaction among phosphate buffer 50mH and

hydrogen peroxide 0,3M, in the homogenized of hepatic tissue, with reading

effected at the spectrophotometer of 240nm, and NO was done through the Griess'

method (Hevel & Marletta, 1994).

The specimens were stained with hematoxiline and eosine, observed

by a single and blinded pathologist, who examined coded samples of tissue.

Presences of portal inflammatory infiltrate, pericentral ischemic necrosis and

periductal fibrosis, as well as steatosis were analyzed.

The test of normality of Kolmogorov-Smirnov was applied to all

variables. In comparing the variables of unique measure ANOVA one-way was

employed, followed by the test of multiple comparisons of Duncan. The

comparisons of serial measures were done by ANOVA for repeated measures,

followed by the test of minimal differences. The α assumed as significant was of 0.05.

Results

The average weight of the animals from the control group was

respectively 354.7 g ± 22.23 and 425.2 g ± 23.42 -p<0.001. There was no difference

between the average liver weight between both groups (12.51g ± 1.8 and 13.45g ±

2.0, respectively). Regarding blood glucose levels, there was no difference between

the groups (226.9 g/dL ± 47.22 and 179.3 ± 76.25). Albumin was higher in the older

group (2.59 mg/dL ± 0.48 and 3.04 mg/dL ± 0.53), but there were no significant

difference (p=0.063).

When compared to the biochemical parameters of preservation, there

was significant difference between AST and LDH median levels. Both the

parameters were superior in samples taken from the control group preserved with

UW in relation to the other subgroups (p< 0.05). Regarding the older group, there

was a difference between UW and FBP preserved livers related to LDH, but not to

AST. The results are shown in Table 1.

TBARS were superior in control group than in the older one (4.14

nmol/ g tissue ± 0.79 vs 2.72 ± 0.85) - p=0.001, but there was no difference between

the preservation solutions (UW: 3.45 ± 1.45 vs FBP 3.48 ± 0.48 – p=0.94). Catalase

activity was similar between the both groups -control and older (92.1

mmol/min/mg protein ± 47.1 vs 65.4 ± 19.4) - p=0.11, but it was superior in UW

preserved animals (98.7 ± 43.2 vs 58.8 ± 15.6) - p=0.02.

Mild centrollobular ischemic injury was found in 4 livers of the control

group and in 2 of the older ones. In this group, 2 animals have had mild portal

inflammatory changes. No animal had steatosis.

Table 1: AST and LDH levels collected from the preservation solution at 2, 4, 6 and

8 hours, in the different studied groups

AST= aspartate-aminotransferase (UI/L). LDH= lactate desidrogenase (UI/L). C-

UW= control animals, preserved with UW, C-FBP= control animals, preserved with

Group C-UW

(n=5)

Group C-

FBP

(n=5)

Group E-UW

(n=5)

Group E-

FBP

(n=5)

AST

121

(86.5-146.5)

(17.5-37.0)

(36.5-78.0)

(5.5-45.0)

AST

153

(115.5-173.5)

(27.5-71.5)

(54.5-109.0)

(14.0-55.5)

AST

181

(133.5-193.0)

(32.0-104.0)

(68.0-157.0)

(23.0-106.0)

AST

205

(155.0-220.0)

(40.0-133.0)

103

(86.5-162.0)

(28.5-152.0)

LDH

664

(490.5-805.5)

178

(55.5-254.5)

291

(259.0-364.5)

157

(37.5-159.5)

LDH

817

(639.5-1010.5)

258

(74.5-372.5)

409

(280.0-527.0)

187

(50.5-196.0)

LDH

968

(708.0-1188.0)

380

(91.5-458.5)

457

(403.0-718.0)

272

(62.5-338.5)

LDH

1062

(809.0-1566.0)

488

(114.0-652,5)

658

(478.5-799.0)

290

(81.0-395.0)

FBP, E-UW= elderly animals, preserved with UW, E-FBP= elderly animals,

preserved with FBP.

Figure 1. Here are presented the results obtained with AST and their comparison between the

different groups. AST= aspartate-aminotransferase (UI/L). LDH= lactate desidrogenase (UI/L). C-

UW= control animals, preserved with UW, C-FBP= control animals, preserved with FBP, E-UW=

elderly animals, preserved with UW, E-FBP= elderly animals, preserved with FBP.

Figure 1. Here are presented the results obtained with LDH and their comparison between the

different groups. AST= aspartate-aminotransferase (UI/L). LDH= lactate desidrogenase (UI/L). C-

200

400

600

800

1000

1200

2 h 4h 6h 8h

LDH - CUW LDH - IUW

LDH -CFBP LDH -IFBP

100

150

200

250

2 h 4h 6h 8h

AST C-UW AST I-UW

AST C-FBP AST I-FBP

UW= control animals, preserved with UW, C-FBP= control animals, preserved with FBP, E-UW=

elderly animals, preserved with UW, E-FBP= elderly animals, preserved with FBP.

Discussion

Nowadays the use of donors with expanded criteria is the only

condition in the most groups of transplant, because of the lacking of organs. It

considered that this would be the last technical frontier to be transposed in the TxH.

Efforts to improve the quality of implant and its preservation represent an important

field to researching. In this study, it was opted for evaluation an injury originated

from the cold ischemia, since the interest focus was the donor. If it would have been

done the reperfusion, certainly it would be added other independent variables of the

initial state of the implant. The preservation at cold was done during 8 hours. That

time would be questioned, since the UW solution would guarantee the viability of

the implant just for 24 hours. However, that time is not used indeed, since more than

12 hours there is much more risk of cell injury, especially of the biliary epithelium.

In the previous study, 12 hours of cold preservation were sufficient to demonstrate

any injury. Because of inner logistical questions, preserving the organ for 12 hours

would cause some problems. The preservation was done with the UW solution,

which is the pattern in the most centers, but also with FBP. That solution could

preserve, for saving the intracellular ATP and allowing more tolerance to the

ischemia in non-ideal donors, as the old ones. Studying old donors is relevant

because of its frequency in the clinical practice. Many donors exist because of the

accidents and traumas, but a very significant quantity is of individuals with cerebral

vascular complications, but many of them are old and have com-morbidity.

Moreover, the reincidence of HVC post-HxT has attracted the attention to these

special groups of donors. In this context, defining old rats seems essential. The rats

used in this study were more than 50 weeks. This period of time is considered

sufficient to classify a rat as old. In this phase, the animals have already achieved

their growing top are not any more in their reproductive period and they already

tend to lose their weight. There are signs that the growing old process determines

structural changes of the livers in animals with the increase on the largeness of the

hepatics and their nuclei, as well as the number of multinucleated cells.

Furthermore, those changes continue after the transplant, even when the receptor is

young and its question, which affects the liver receptor n the clinical practice, it

would be interesting to study forms of reverting that situation in human beings. The

option for the experimental study was done, because the application of FBP is still

not restricted to it.

The weight of the livers of the animals did not differ among the old

group and the group-control, as it was expected. However, the weight of the old

animals was bigger than the control ones. Koh and his co-workers have

demonstrated that rats grow up until the 52 weeks, when they thley begin to lose

weight. The rats included in this study achieved 54 weeks of ages at the end of

observation period, in which they were submitted to the controlled diet. Perhaps

this has contributed to they not to lose weight significantly. In the same way, the

glicemia was not different among both groups. Considering that rats were sacrificed

after a period of 12 hours hasting, and taking into account that glicemia, during the

intervals between the meat, does not depend on the mobilization of hepatic

glycogen stocks, it is possible to infer that there was no difference the nutritional

situation of the animals, which was determined by the age. The averages of serial

albumin were, however, superior in the old animals. This fact surprises and

contradicts the expectations, since it was demonstrated that the age reduces the

albuminimia in animals.

It could be discussed whether this discovery puts in stake the

adequacy of the time chosen for considering the animal as adult. However, as there

is no more doubts in relation to the criteria which was chosen, it can be admitted

that this testifies a good nutritional state in these animals. Thus, it is eliminated the

point of view of the influence of innutrition in the unimportant of the implant from

an old animal.

In relation to the damage of the implant of the cold ischemia, verified

by biochemical criteria, it was demonstrated that the AST, and also the LDH, were

superior in the aliquots of the preservation solution in rats-control of the UW

groups, when compared to the others. That result surprises, since the expectation

was the contrary: major injury in the older ones. The reason why this occurs still

remains interrogated. It is interesting to notice that the FBP seems to have had livers

of rats-control. In relation both to the AST levels and to the LDH levels, the group

preserved with FBP has had better performance. That was statistically significant on

the control ones, confirming the discoveries by Moresco and his co-workers. In the

old ones, though the minor values of AST and LDH have been obtained in the livers

preserved with FBP, there was no statistical difference.

When oxide stress is evaluated, TBARS levels were superior in

animals-control, suggesting that a bigger stimulus to the tissue injury has occurred

in this group, independently of the preservation solution employed. The catalysis

activity was similar among both old and control, yet it was bigger in the livers

preserved with UW. Since the catalysis is liberated in order to counterpoint the

harmful effects of the oxidative stress, it could be inferred that more tissue damage

have occurred with UW than with FBP.

Thus, differences were found between rats-control submitted to the

preservation with UW and old animals on the cold ischemia, verified by the exposed

criteria. It has been suggested that the evaluation of the post transplant in human

beings and in rats seems to be inferior when old donors are used. The present study

data go towards to that statement. It is possible to conclude that livers from old

donors are not inferior to the younger ones, ore, it could be inferred that damages

which occur and influence the post transplant evolution depend especially than that

would occur in the reperfusion. The role of FBP in this context, it is still to be

demonstrated.

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ANEXO 2

Resultados do estudo inicial para cálculo da dieta padrão oferecida

para o Grupo I - controles com dieta normal. Foram ofertadas diariamente 30

gramas da ração Nuvilab CR1 (Nuvital Nutrientes Ltda, Colombo, Paraná) para

cada animal, sendo descontadas as sobras em gramas, chegando-se ao valor ingerido

no dia. A média final obtida foi de 21,56 g/dia, sendo adotado valor de 22 g como

dieta padrão – ver tabela abaixo.

Tabela 1. Quantidade diária (em gramas) ingerida pelos animais durante o período

de observação por 7 dias para cálculo da dieta normal a ser ofertada no estudo.

Dia

Rato

1 20,7 22,6 21,2 4,1 26,9 11,1 20,8 12 29,3 23,6

2 19,7 16,3 15,8 19,5 21,6 12,4 11,4 22,3 23,2 11,4

3 21,0 19,4 21,5 25 22,5 25,5 20,9 24,4 23,4 25,3

4 21,1 19,8 22,6 24,7 29,3 21,4 19,2 25,2 29,6 24,4

5 24,1 19 15 26 22,8 19 20,8 23,3 22,4 23,8

6 25,3 23,8 21,2 23,5 26,8 20 22,2 24,3 26 25,2

7 23,5 22,7 22 22,6 26 18,8 19,35 22,2 20,76 24,7

Média

gramas

22,2 20,51 19,9 20,77 25,13 18,32 19,24 21,96 24,95 22,63

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