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MARIA IRACI BUARQUE VALENÇA
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) PARA O
DIAGNÓSTICO DO HIV-1 EM DOADORES DE SANGUE
COM RESULTADOS INCONCLUSIVOS
Recife
2007
MARIA IRACI BUARQUE VALENÇA
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Valença, Maria Iraci Buarque
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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) PARA O
DIAGNÓSTICO DO HIV-1 EM DOADORES DE SANGUE
COM RESULTADOS INCONCLUSIVOS
Dissertação apresentada ao curso do programa
de Pós-Graduação em Medicina Tropical do
Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal de Pernambuco como parte do
requisito para obtenção do titulo de Mestre em
Medicina Tropical.
ORIENTADORA:
Profª. Drª. Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho
Recife
2007
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
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Valença, Maria Iraci Buarque
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Valença, Maria Iraci Buarque
Relação em cadeia de polimerase (PCR) para o
diagnóstico do HIV-1 em doadores de sangue com
resultados inconclusivos / Maria Iraci Buarque
Valença. – Recife: O Autor, 2007.
69 folhas : il., fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal
de Pernambuco. CCS. Medicina Tropical, 2007.
Inclui bibliografia e anexos.
1. HIV – Doadores de sangue. I. Título.
616.97 CDU (2.ed.) UFPE
616.951
CDD (20.ed.) CCS2007-128
Valença, Maria Iraci Buarque
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REITOR
Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. José Tadeu Pinheiro
DIRETOR SUPERINTENDENTE DO HOSPITAL DAS CLÍNICAS
Prof. Heloísa Mendonça
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MEDICINA TROPICAL
Prof. Heloísa Ramos Lacerda de Melo
VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MEDICINA TROPICAL
Prof. Rosângela Cunha Duarte Coelho
CORPO DOCENTE
Profa. Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Profa. Elizabeth Malagueño de Santana
Profa. Heloísa Ramos Lacerda de Melo
Profa. Gerusa Dreyer Vieira
Prof. Joaquim Alfredo Alves Norões
Profa. Maria Amélia Vieira Maciel
Profa. Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque
Profa. Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho
Prof. Ricardo Arraes de Alencar Ximenes
Profa. Silvia Maria de Lemos Hinrichsen
Profa. Vera Magalhães da Silveira
Valença, Maria Iraci Buarque
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Valença, Maria Iraci Buarque
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Valença, Maria Iraci Buarque
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AGRADECIMENTOS
Valença, Maria Iraci Buarque
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À Deus pela constante presença em minha vida.
À minha família, especialmente a Jefferson, meu marido pela companhia e apoio que recebi
durante a realização deste trabalho.
À minha orientadora Profa
.
Dra. Rosangela Coelho agradeço pela confiança e aprendizado
transmitido durante esta orientação.
À amiga Dra. Ana Cristina de Souza Bezerra do Laboratório de Biologia Molecular de
Doadores que me incentivou e colaborou no planejamento deste projeto.
À Dra. Silvana Carneiro Leão, Gerente do Hemocentro Recife, e Dra. Inês pelo apoio
institucional na execução do projeto.
À Dra. Lúcia Dourado, Enfermeira Ana Lúcia, Rosangela, Tatiana, da coleta de doadores pela
enorme colaboração que prestaram na concretização do estudo.
Enorme gratidão ao Dr. Emanuel Borges pela concessão dos primers que foram utilizados
neste estudo e pela sua disponibilidade constante em colaborar.
Especial agradecimento pela contribuição inestimável da Dra. Bruna Arruda do Laboratório
de Biologia Molecular de Doadores, que me orientou e apoiou em todos os momentos de
dificuldades na execução dos procedimentos técnicos. Dr. Bruno Morais e Clara Vieira,
bolsista do laboratório meu agradecimento pelo apoio dado.
Valença, Maria Iraci Buarque
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Aos colegas do Laboratório de Sorologia de Doadores da Fundação HEMOPE, pelo apoio
técnico e orientação que me concederam colaborando no andamento do projeto. Dra. Lucília,
Dra. Emanulle, Dra. Wandeje, Raquel, Bergman e demais companheiros meus sinceros
agradecimentos.
Aos colegas do laboratório de Virologia - LIKA Paulo Souza, Lucas e Rafael agradeço pela
ajuda e orientação recebida.
À gerencia do UNILAB pelo apoio e compreensão nos momentos de ausência. À minha
companheira de trabalho, Vera Lúcia de Araújo do Laboratório de Imunopatologia, minha
sincera gratidão pela disponibilidade e grande ajuda prestada.
Ao Prof Dr. Ricardo Ximenes, Profª Dra. Heloísa Ramos e demais professores por
compartilhar conhecimentos com paciência e sabedoria.
Aos funcionários Walter Leite e Jupira Pinho Ramos .
Aos meus colegas de mestrado Joanna, Paulo, Araiz, Juliana, Rosangela, Cristiano e Fabiana
pelos bons momentos que passamos juntos nesta etapa tão importante para todos nós.
Valença, Maria Iraci Buarque
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LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Valença, Maria Iraci Buarque
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Artigo I
Figura 1. Algoritmo com os dois testes não reagentes .....................................................25
Figura 2. Algoritmo com dois testes reagentes .................................................................26
Figura 3. Algoritmo para o primeiro teste não reagente e segundo reagente ...................26
Figura 4. Algoritmo para o primeiro teste reagente e segundo não reagente ...................27
Artigo II
Tabela 1. Características dos ELISAS utilizados na triagem de doadores de sangue .......46
Tabela 2. Seqüência de primers (nucleotídeos iniciadores) utilizados na PCR e
Nested PCR e suas localizações no genoma do HIV-1.................................. 47
Tabela 3. Distribuição de doadores segundo sexo,idade, estado civil e tipo de doação... 49
Tabela 4. Distribuição de doadores segundo a idade e nº de doações realizadas ..............49
Tabela 5. Resultados do ELISA Ag/Ac na triagem e após o retorno................................ 50
Tabela 6. Resultados do ELISA Ac na triagem e após o retorno...................................... 50
Tabela 7. Resultados do ELISA AG/Ac versus da Nested- PCR ..................................... 51
Tabela 8. Resulatdos do ELISA Ac versus Nested –PCR ................................................ 52
Tabela 9. Medidas de qualidade dos testes diagnósticos ................................................ 52
Valença, Maria Iraci Buarque
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SUMÁRIO
Valença, Maria Iraci Buarque
______________________________________________________________________
LISTA DE FIGURAS E TABELAS ................................................................................ viii
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 12
Referências bibliograficas.................................................................................................. 16
ARTIGO I ........................................................................................................................ 19
Infecção pelo HIV na Hemoterapia.
Resumo .................................................................................................................... 20
Abstract .................................................................................................................... 20
Introdução ................................................................................................................ 21
Objetivo ................................................................................................................... 22
Método ..................................................................................................................... 22
Revisão da Literatura ................................................................................................ 23
Conclusão.................................................................................................................. 31
Referências Bibliográficas ....................................................................................... 32
ARTIGO II ...................................................................................................................... 38
Aplicação da Reação em cadeia da polimerase (PCR) para o diagnóstico do HIV em
doadores de sangue com resultados inconclusivos pelos métodos imunoenzimáticos
Resumo .................................................................................................................... 39
Abstract .................................................................................................................... 40
Introdução ................................................................................................................ 41
Material e Métodos ................................................................................................ 44
Resultados ................................................................................................................ 48
Discussão ................................................................................................................. 52
Conclusões................................................................................................................ 57
Referências Bibliográficas ....................................................................................... 58
ANEXOS ....................................................................................................................... 64
Anexo 1 – Aprovação do CEP........................................................................................ 65
Anexo 2 – Termo de consentimento .............................................................................. 66
Valença, Maria Iraci Buarque
______________________________________________________________________
12
INTRODUÇÃO
Valença, Maria Iraci Buarque
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13
A Síndrome da Imunodeficiência Humana Adquirida (AIDS) é a infecção provocada
pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), é transmitida por sangue e seus produtos,
pela via sexual e transmissão vertical (GONÇALVES et al.2006).
A preocupação com os riscos da transmissão envolvendo o ato transfusional, exige o
desenvolvimento de estudos sobre o processo de seleção de doadores e de segurança do ato
transfusional, constituindo grande interesse para pesquisadores da área de Saúde Pública
(GENDLER & PASCUCCIO, 2007).
Embora várias medidas sejam tomadas para garantir a segurança com o uso do sangue,
estima-se que cerca de 5% dos casos de AIDS no mundo ocorram através da transfusão
sanguínea (WAHDAN, 1995; GERMAN&GOLDMAN, 2002). O sangue é um meio eficiente
na transmissão do HIV com uma freqüência da soroconversão após transfusão de doadores
infectados acima de 90% (DONEGAN, 1990; SHRESTHA, 1996).
Os testes laboratoriais utilizados para o diagnóstico do HIV na triagem de doadores de
sangue, são essenciais para o seguimento dos pacientes infectados e na vigilância
epidemiológica da infecção e doença. As práticas realizadas nos serviços de hemoterapia são
regulamentadas pelo Ministério da Saúde, através do Regulamento Técnico para obtenção,
testagem, processamento e controle de qualidade do sangue e hemocomponentes para uso
humano (RDC 153). O regulamento é fiscalizado pela Agencia Nacional de Vigilância
Sanitária – ANVISA (BRASIL,2004).
A partir de 1985, quando os testes sorológicos para HIV foram disponibilizados para
uso, houve um decréscimo no percentual de transmissão. E com o desenvolvimento de
técnicas mais sensíveis, uma seleção mais rigorosa de doadores e o uso adequado do sangue
houve uma redução do risco para a infecção ( PILONEL & LAPERCHE, 2005).
Valença, Maria Iraci Buarque
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14
Portanto, a segurança da transfusão sanguínea depende de uma série de fatores, que
em conjunto podem proporcionar melhor qualidade do sangue e dos hemocomponentes a
serem utilizados. Dentre estes fatores, os mais importantes estão: a seleção da população de
doadores, a triagem clínica, a realização dos testes imunohematológicos, a triagem sorológica
e o uso racional de sangue e hemocomponentes (KIELLY&WOOD, 2005).
A triagem sorológica tem um significado estratégico especial, pois a partir de um
determinado momento, é o único procedimento que vai validar ou não a utilização do sangue.
Entretanto, triar doadores de sangue por testes sorológicos gera um número substancial de
resultados conflitantes, discordantes e conseqüentemente inconclusivos (BARBOSA et
al.1998).
Doadores com resultados inconclusivos na triagem sorológica são problemáticos para
os serviços de sangue por causa da perda do produto e pela condução clínica posterior deste
doador (KIELLY&WOOD, 2005). O desafio para os serviços de sangue é determinar quando
informar esses doadores sobre seus resultados e como isso deve ser feito para minimizar-lhes
a ansiedade (GASTALDELLO et al.,2001). É difícil explicar aos doadores que embora seus
resultados não indiquem infecção seu sangue não poderá ser utilizado para transfusão.
Os testes confirmatórios para pesquisa de anticorpos como Imunofluorescencia (IMF)
e Western Blot (WB), também são em diversas ocasiões inconclusivos, portanto os centros de
hemoterapia buscam a utilização de testes que elucidem satisfatoriamente a interpretação do
laudo.
Valença, Maria Iraci Buarque
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15
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e outros ensaios moleculares vêem sendo
usados com freqüência em vasto campo da ciência e medicina, especialmente no estudo do
HIV/AIDS (AMERICAN RED CROSS, 2005).
Pesquisas utilizando testes de triagem, confirmatórios e moleculares já foram
realizadas: um estudo investigou a freqüência de falsos positivos entre doadores de sangue
nos EUA na triagem de 5 milhões de doadores; dos quais 421 foram positivos no WB, dentre
estes, 20 apresentaram resultado com desfecho de testes negativos na PCR, concluindo que
doadores devem se possível, testados por PCR além da análise sorológica (MICHAEL &
LISA,1998).
Outro estudo realizado nos Estados Unidos pelo CDC (Center for Disease Control and
Prevention) para avaliar a correlação da PCR com os testes imunoenzimáticos para pesquisa
de anticorpos, investigou 242 pacientes que apresentavam risco para infecção por HIV e
concluiu que a PCR detectava a maioria das amostras que apresentavam sorologia com
anticorpos positivos, comprovando a sensibilidade e especificidade da técnica
(KIELLY&WOOOD, 2005).
Assim, o presente trabalho utilizou a Nested-PCR em amostras de sangue de doadores
com resultados inconclusivos, identificados na triagem sorológica e que retornaram ao
hemocentro para repetição nos dois ensaios imunoenzimáticos (ELISA) utilizados na triagem
sorológica.
A dissertação será apresentada em dois artigos: o primeiro traz uma atualização sobre
a infecção pelo HIV em doadores de sangue, com medidas e procedimentos adotados para
evitar a disseminação do vírus e os principais métodos de diagnóstico utilizados para sua
detecção. Apesar de não se tratar de uma revisão sistemática do ponto de vista de suas etapas
metodológicas, procurou-se dar abrangência à busca e à
Valença, Maria Iraci Buarque
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16
seleção de artigos mediante palavras – chave usando critérios que deram uma boa delimitação
ao tema.
No segundo artigo são apresentados os resultados da pesquisa e a análise das amostras
inconclusivas na sorologia, que foram submetidas à Nested-PCR para uma avaliação
qualitativa do HIV-DNA (provírus) em doadores de sangue da Fundação HEMOPE, realizada
no período de novembro de 2006 a Janeiro de 2007.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMERICAN RED CROSS,
Disponível em:http:/chapters.redcross.org/ca/norcal/phys/geninfo/abntests.htm.
Acesso: 15/10/2005.
BARBOSA, E.F.; CARNEIRO-PROIETTI, A.B.F.; OLIVEIRA, D.R.HIV-1 Detection and
subtyping by PCR and heteroduplex mobility assay in blood donors: Can these testes help to
elucidate conflicting serological results? Transf. Sci.Belo Horizonte,v.19, n.1, p.39-43,1998.
BRASIL. Resolução RDC nº153, de 14 de junho de 2004. ANVISA. Diário Oficial da
União, Brasília, DF, 24 jun.2004.
Disponível em: http://e-legis.bvs.br/leisref/public/showAct.php?id=11662. Acesso em: 10 de
dezembro de 2006.
Valença, Maria Iraci Buarque
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17
DONEGAN, E. et al. Infection with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) among
recipients of antibody-positive blood donations. Annals of Internal Medicine, n.113, p.733-
739, 1990.
GASTALDELLO, R.; GALLEGO, S.; ISA, M.B. Immunofluorescence assay reactivity
patterns of serum samples presenting indeterminate western blot results for antibodies to HIV-
1 and HTLV-I/II in Cordoba, Argentina. Rev. Inst.Med.Trop. S.Paulo, v.43, p. 277-282,
2001.
GENDLER ,S.A.; PASCUCCIO,M.S. Routine HIV screening among blood donors in Buenos
Ayres(Argentina): Results from six years’ experience and report of a single window-period
donation.Enferm.Infecc.Microbiol.Clin.,Argentina,v. 25, n.2,p.82-90, 2007.
GERMAIN, M.; GOLDMAN, M. Blood Donor Selection and Screening:Strategies to Reduce
Recipient Risk. American Journal of Therapeutics. v.9, n.5, p.406 – 410, 2002.
GONÇALVES,K.I. et al. Soroprevalência de HIV-1/2 entre doadores de sangue de Goiânia-
Goiás. RBAC, Goiás, v.38, n.4, p.263-266,2006.
KIELLY, P.; WOOD, E. Can we improve the management of blood donors with nonspecific
reactivity in viral screening and confirmatory assay? Transfusion Medicine
Reviews,Austrália, v.19, n. 1, p.58-65, 2005.
Valença, Maria Iraci Buarque
______________________________________________________________________
18
MICHAEL, P.; LISA, H. et al. False-Positive HIV-1 Test Results in a Low –Risk Screening
Setting of Voluntary Blood Donors. Journal of the American Medical association. v.280, p.
1080, 1998.
PILLONEL, J.; LAPERCHE, S. Trends in risk of transfusion-transmitted viral infections (HIV, HCV, HBV) in France between 1992 and 2003 and impact of
nucleic acid testing (NAT).Euro Surveill, v.10, n.2, p.5-8, 2005. Available online:
http://www.eurosurveillance.org/em/v10n02/1002-223.asp
SHRESTHA, P.N. Transmission of HIV through blood or blood products in the Eastern
Mediterranean Health Journal,v.2 , n.2,p.283-289,1996.Disponível em:
http://www.emro.who.int/Publications/EMHJ/0202/14.htm. Acesso: 8 de agosto de 2006.
WAHDAN,M.H. Epidemiology of acquired immunodeficiency syndrome. Alexandria,World
Health Organization, Regional Office for the Eastern Mediterranean, 1995.
Valença, Maria Iraci Buarque
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19
ARTIGO I
Valença, Maria Iraci Buarque
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20
INFECÇÃO PELO HIV EM DOADORES DE SANGUE
Resumo
O risco de transmissão do vírus da imunodeficiência humana (HIV) através de doações de
sangue constitui uma preocupação para os profissionais da saúde pública. Nestes últimos
anos, várias medidas foram adotadas e o avanço tecnológico no diagnóstico laboratorial tem
contribuído para reduzir a transmissão do vírus. Este artigo tem como objetivo fazer uma
atualização sobre a infecção pelo HIV na hemoterapia e os principais métodos de diagnóstico
utilizados para sua detecção. Realizou-se uma busca online, nas bases de dados Medline-
PubMed, Science Direct e Scielo. A pesquisa permitiu identificar as medidas que foram
introduzidas desde o surgimento da epidemia visando reduzir o risco da transmissão do HIV
nos bancos de sangue. Apesar do avanço dos métodos sorológicos apresentando maior
sensibilidade e melhor especificidade e a implantação de métodos moleculares em alguns
hemocentros do país, ainda permanece o risco residual de transmissão do vírus por transfusão
sanguínea.
Descritores: HIV, Doador de Sangue, Método sorológico, Método Molecular.
Abstract
The risk of transmission by the human immunodeficiency virus (HIV) through blood
donations constitutes a concern for the professionals of the public health. In the past years,
some measures had been adopted and the technological advance in the laboratorial diagnosis
has contributed to reduce the transmission of the virus. The purpose of this
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article is to make an update of HIV infection in the blood donors and the main methods of it
diagnostic. A search for relevant articles was conducted online, in the databases Medline-
PubMed, Science Direct and Scielo. The research allowed identifying the measures that had
been introduced since the sprouting of the epidemic aiming to reduce the risk of HIV
transmission in blood banks. Despite of the advance of serologic methods with bigger
sensitivity and better specificity and the implantation of molecular diagnostic in some blood
banks in the country, still remain the residual risk of transmission of the virus by blood
transfusion.
Key words: HIV, Blood donor, Serologic diagnostic, Molecular Diagnostic.
INTRODUÇÃO
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) pertence à família Retroviridae,
subfamília Retrovirinae e ao gênero Lentivirus. É o agente etiológico da síndrome da
imunodeficiência humana adquirida (AIDS).
De acordo com dados da UNAIDS (2006) sobre a Síndrome da Imunodeficiência
Humana (AIDS) mundial, a epidemia parece estar diminuindo lentamente, embora novas
infecções continuem a aumentar em certas regiões e países. Há uma estimativa que 39,5
milhões de pessoas estejam vivendo com HIV em todo o mundo (UNIAIDS, 2006).
Dentre as vias de transmissão do vírus da imunodeficiência humana (HIV), a
transfusão sanguínea ainda constitui um problema em todo mundo, particularmente quando se
trata de pacientes politransfundidos (de PAULA et al., 2005).
Valença, Maria Iraci Buarque
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A descoberta da AIDS gerou grande impacto na sociedade levando a mudança de
hábitos e costumes. Assim, legislações apropriadas para esta nova realidade foram elaboradas
para normatizar as práticas e os procedimentos da hemoterapia no Brasil com o objetivo de
garantir a qualidade do sangue (SPADA et al., 2005).
Considerando que o HIV nos bancos de sangue pode ser transmitido por eritrócitos,
plaquetas, crioprecipitados, plasma fresco, plasma congelado e possivelmente, por outros
componentes sanguíneos, a seleção e o recrutamento apropriados de doadores além da
adequada triagem laboratorial para marcadores infecciosos constitui fatores importantes para
diminuir o risco desta infecção (CRUZ; SPADA et al., 2005).
OBJETIVO
Revisar a literatura científica sobre a infecção pelo HIV na hemoterapia e os principais
métodos diagnósticos utilizados para sua detecção.
MÉTODO
Pesquisa bibliográfica nas bases de dados Medline-PubMed, Science Direct e Scielo
usando termos de busca como : serology , blood donors, molecular diagnostic, ,risk factors,
HIV, epidemiologic date,dando enfoque aos artigos que informam sobre os procedimentos e
medidas adotados desde o surgimento do HIV, como também o avanço tecnológico dos
métodos diagnósticos.
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REVISÃO DA LITERATURA
O risco de transmitir doenças infecciosas por transfusão sanguínea ainda permanece e
deve-se a vários fatores como: erro humano/técnico e presença de variantes virais não
reconhecidas por alguns ensaios. No entanto, o risco maior ocorre pela existência de uma fase
sorológica silenciosa, conhecida como pré-soroconversão ou janela imunológica, que
corresponde ao período entre o contágio e o aparecimento de anticorpos específicos
(PILONEL, 1998).
Nos Estados Unidos, segundo SCHEREIBER (1996) o risco de receber sangue
contaminado, foi estimado em 1: 660.000 doações no ano de 1996, porém este risco foi
reduzido para 1: 1.300,00 em 2000 (ALLAIN, 2000).
Na França, entre o período de 1990 a 1996 o risco estimado foi de 1: 400.000 e em
2000 reduziu para 1:1. 350.000 doações (DELBOK, 2000).
O risco residual de transmissão do HIV por transfusão, no Brasil mostrou-se sempre
mais alto em relação aos países citados acima (SPADA et al.,2005).
No Brasil, até junho de 2004, dos 63.000 infectados pelo HIV na categoria exposição
sanguínea, 2000 pessoas foram contaminadas por transfusão sanguínea (BRASIL, 2004).
Através de seus hemocentros, o estado de São Paulo foi o que mais publicou dados
sobre o risco residual de infecção pelo HIV em doadores de sangue. Em estudo de
HAMERSCHLACK et al. (1993) esse risco foi estimado em 1: 15.000 transfusões realizadas.
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No Hemocentro de Marília, foi de 1: 10.330 (CANUTTI, 1998); em Ribeirão Preto de
1: 77.000 (COVAS, 1998) e na Fundação Pró-Sangue - SP, foi de 1 em 64.000 doações
(SABINO et al., 1999).
Em Santa Catarina, o risco estimado foi de 1: 50.000 no período de 2000 a
2003(SPADA et al, 2005).
Diante dos índices de risco residual para a infecção pelo HIV comentados acima, o
diagnóstico laboratorial representa uma importante estratégia para o controle da transmissão
pela transfusão sanguínea (PASQUIER et al., 2003).
O diagnóstico da infecção pelo HIV na hemoterapia é baseado na demonstração de
anticorpos e/ou detecção de antígeno viral, por ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay), um ensaio imunoenzimático, e na presença do material genético do vírus, através de
método de amplificação do ácido nucléico, embora ainda restrito a alguns hemocentros
(MACHADO& COSTA,1999).
Para a detecção de anticorpos contra o HIV, desde a introdução do primeiro ELISA em
1985, o algoritmo mais utilizado, embora com algumas restrições, tem sido a triagem por este
método e quando necessário realiza-se o procedimento com métodos mais específicos, como o
Western Blot (WB) (CDC, 1988). No entanto, o uso do WB é limitado pelo alto custo
(MAHÉ et al.,2002).
Houve um grande avanço tecnológico nos ELISAs ao longo desses últimos anos, com
a introdução de testes mais sensíveis reduzindo-se a taxa de falsos negativos (SLOAND et al.,
1995;PASQUIER et al., 2004).
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Os ensaios de primeira geração com antígenos obtidos a partir de lisado viral eram
capazes de detectar apenas anti-HIV do tipo IgG. No entanto, anticorpos direcionados contra
esses antígenos causavam freqüentemente reatividade não específica (CARVALHO et al.
2005).
Os ensaios de segunda e terceira geração passaram a usar peptídeos sintéticos e
proteínas recombinantes que detectavam anti-HIV 1 e 2 dos tipos IgG e IgM, aumentando a
sensibilidade do ensaio e reduzindo o tempo médio para detectar a soroconversão para menos
de 20 dias (BUSH et al., 1995; LY et al., 2001).
Novos ensaios surgiram para aumentar a eficácia dos métodos convencionais para o
diagnóstico precoce da infecção, como a pesquisa da proteína p24 do capsídeo viral, que
detecta o antígeno do core, produzido pelo gene gag que codifica para proteínas da matriz do
HIV-1. Estes foram associados à pesquisa de anticorpos, e denominados de ensaios
combinados ou de quarta geração. São mais sensíveis que os de terceira geração, porém a
sensibilidade analítica para o p24 nos testes combinados é mais baixa do que sua
determinação isolada (GENDLER & PASCUCCIO, 2006).
No Brasil, o teste para triagem do HIV em doadores de sangue iniciou em 1985 e
atualmente segue a portaria nº 59 de janeiro/2003 , que determina o uso de dois ELISAs com
antígenos diferentes e/ou princípios metodológicos distintos em primeira linha e testes
confirmatórios (Western Blot, Imunofluorescência) no caso de positivos ou
indeterminados(BRASIL,2003).
As figuras 1, 2, 3 e 4 mostram os algoritmos usados para liberação de bolsa de sangue
em função dos resultados dos testes para HIV, reproduzidos da portaria nº 59:
Valença, Maria Iraci Buarque
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Figuras 1: Algoritmo para os dois testes não reagentes
Figura 2: Algoritmo para os dois testes reagentes.
Valença, Maria Iraci Buarque
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Figuras 3: Algoritmo para o primeiro teste não reagente e segundo reagente
Figura 4: Algoritmo para o primeiro teste reagente e segundo não reagente
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Quando os doadores são submetidos aos dois ensaios ELISA e são reagentes para o
HIV, são retestados com uma segunda amostra. Em caso positivo na segunda amostra o
resultado é submetido a um teste confirmatório. Em caso negativo, a ausência de anticorpos é
concluída. Nos casos em que os testes são inconclusivos, ou seja, reativo em um teste e não
reativo no outro, também se aplica um teste confirmatório. Porém resultados inconclusivos
podem também ocorrer mesmo com os testes confirmatórios, dificultando a interpretação
(PASQUIER et al.,2004; HUANG, et al.,2006).
Um resultado não reativo nos testes confirmatórios qualifica o sangue como liberado
para o uso. Porém, quando o sangue é reativo e ao ser repetido mantêm o resultado, o sangue
doado é descartado (BRASIL,2003).
Em síntese, os resultados destes testes podem se apresentar: positivo, confirmando os
testes de triagem; negativo quando confirma que o teste de triagem era falso positivo e
indeterminado ou inconclusivo quando os resultados são discordantes nos ELISAs utilizados.
Freqüentemente resultados inconclusivos podem significar duas possibilidades: o doador não
está infectado, mas reage inespecíficamente nos testes de triagem e por isso o resultado se
apresenta inconclusivo nos testes confirmatórios, o que é mais comum; ou o doador foi
recentemente infectado com o agente, mas ainda não desenvolveu anticorpos (AM.RED
CROSS, 2004).
É interessante lembrar que doadores de sangue são indivíduos que passam por triagem
clínica rigorosa e são avaliados em vários aspectos relacionados ao seu estado de saúde.
Portanto, um resultado indeterminado pode não significar sinal de infecção (CARVALHO et
al., 2005). Amostras repetidamente reativas nos ensaios imunoenzimáticos e que são
negativas por testes confirmatórios são referidas pelos termos: biológico falso positivo ou
falso positivo. Estas amostras são consideradas
Valença, Maria Iraci Buarque
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negativas para o marcador em questão e o resultado reativo não é considerado específico para
o HIV (KIELLY& WOOD, 2005).
A causa primária de resultados falsos positivos é a reatividade inespecífica do
anticorpo, tanto contra um agente viral, como contaminação com epitopo não viral (BUSH et
al.,1996). Existe uma freqüente associação de resultados falsos positivos com o aumento da
produção de anticorpos que ocorre durante uma resposta imune, como por exemplo, uma
vacina ( VARDINON & KATZ , 1999).
Por outro lado, KIELLY & WOOD (2005) também relatam que resultados falsos
positivos apresentam algumas características que podem estar relacionadas:
- ao ensaio: uma amostra com resultado falso positivo quando retestada com ensaio
alternativo frequentemente resulta em negativa. Portanto, resultados falsos positivos são
frequentemente ensaio-específicos.
- a diferentes lotes de reagentes: a taxa de reação repetida falso-positiva para anti-HIV varia
de 0,02% a 0,111% entre diferentes lotes.
- modificações do teste, isto é, mudanças na configuração de um ensaio ao incorporar novos
determinantes antigênicos.
Assim, diante das dificuldades na interpretação dos métodos sorológicos para a
triagem em banco de sangue, novas metodologias utilizando a biologia molecular vêm sendo
introduzidas na rotina de alguns hemocentros no país..
Os métodos moleculares tiveram um grande avanço dês de o surgimento da Reação
em Cadeia da Polimerase(PCR) Para sua realização, utiliza-se uma enzima termoestável
(DNA polimerase) que, na presença de um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers) e
dos nucleotídeos que compõem a molécula de DNA, amplificam a região de interesse a partir
de uma pequena quantidade de DNA. O produto
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amplificado pode, então, ser separado e visualizado em géis de agarose ou poliacrilamida e
utilizado para diversos fins (MOLINA & TOBO, 2004).
Entre as diversas técnicas resultantes de modificações da PCR, os autores MOLINA &
TOBO também citam:
-A RT-PCR que utiliza uma enzima chamada transcriptase reversa para converter uma
amostra de RNA em cDNA antes da etapa de amplificação da PCR, permitindo estudo de
vírus RNA e análises de expressão gênica;
-A nested PCR, que emprega uma segunda etapa de amplificação com par de primers
internos aos utilizados na primeira etapa e visa aumentar a sensibilidade e especificidade do
método;
- A PCR multiplex que é uma reação de amplificação desenhada para detectar
múltiplas seqüências alvos numa mesma amostra
- A PCR a partir de primes randômicos utilizando seqüências curtas de
oligonucleotídeos para amplificar regiões repetitivas do DNA genômico sendo bastante
empregada em estudos epidemiológicos;
- A PCR em tempo real permite que a amplificação e a detecção ocorram
simultaneamente em um sistema fechado, sendo necessário para isto um termociclador que
possua sistema de monitoramento de emissão de florescência.
A sensibilidade e a especificidade diagnóstica dessas metodologias são altas, 99% e
98% respectivamente (CALIENDO, 2003), estudos mostram que a adição de testes de
amplificação de ácidos nucléicos no algoritmo para HIV aumenta a identificação de casos da
infecção (PILCHER et al.,2001,2005)
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Alguns estudos já foram realizados como o de BARBOSA et al. (1998) que analisou
amostras de DNA de 50 doadores de sangue reativos no ELISA mas inconclusivos no WB
usando a PCR, elucidando os resultados de 5 doadores .
Na pesquisa de REZENDE et al. (2002), foram submetidas 200 amostras de doadores
de sangue por PCR, 75 amostras negativas e 90 indeterminadas no ELISA foram negativas na
PCR e das 35 consideradas positivas no ELISA , 25 confirmaram ser reagentes pelo método
molecular.
Considerando a sensibilidade e especificidade das técnicas de detecção de ácidos
nucléicos, o Ministério da Saúde, através da portaria nº112 de janeiro de 2004, determinou a
implantação do NAT (técnica de ácido nucléico) para o diagnóstico do HIV como método
mais seguro na triagem de doadores de sangue. Este medida visa diminuir ainda mais o
período da janela imunológica e reduzir o risco da transmissão do vírus por transfusões
sanguíneas, entretanto ainda não foi possível o uso simultâneo da técnica em todo o país
(BRASIL, 2004).
CONCLUSÕES
A avaliação laboratorial de indivíduos sob risco de infecção pelo vírus da
imunodeficiência humana assumiu importante papel na hemoterapia, confrontar a alta
sensibilidade dos testes moleculares versus métodos sorológicos e interpretar as associações
entre os métodos utilizados, representa um avanço no diagnóstico e monitoramento da
infecção pelo HIV (CLEMENTI et al. 1996; YILMAZ; SCHIMITT, 2001).
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ARTIGO II
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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) PARA O DIAGNÓSTICO DO
HIV-1 EM DOADORES DE SANGUE COM RESULTADOS INCONCLUSIVOS
Resumo
A transmissão do vírus da imunodeficiência humana (HIV) agente causador da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (AIDS), constitui uma preocupação constante nos hemocentros.
O objetivo do presente estudo foi utilizar a Nested-PCR para identificação qualitativa do
DNA-HIV (provírus) em doadores de sangue com resultados inconclusivos nos testes
imunoenzimáticos utilizados na triagem sorológica. Foram analisadas 104 amostras de
doadores de sangue, que retornaram ao hemocentro no período de novembro de 2006 a janeiro
de 2007, por apresentarem resultados inconclusivos para o HIV. Foram incluídos na pesquisa
os doadores que retornaram para a segunda coleta após o período mínimo de 20 dias e com
sorologia negativa para os demais marcadores usados na triagem sorológica. Para o
diagnóstico do HIV foram utilizados dois testes imunoenzimáticos (ELISAs): um kit de
terceira geração para pesquisa de anticorpos (Abbott-Murex HIV 1.2.0) e outro de quarta
geração para detecção combinada de antígeno e anticorpo (Abbott Hiv Ag/Ab Combination).
Para a elucidação dos resultados inconclusivos obtidos nos testes ELISAs, foi utilizada a
Nested-PCR com pares de primers específicos para a região gag (primers JA4-JA7) e duas
regiões env, JA13-JA16 e JA9-12, o último contendo a seqüência de nucleotídeos da alça V3.
A população de doadores estudada foi constituída principalmente por doadores do sexo
masculino (88,7%), idade média igual a 34 anos com variação entre 19 e 62 anos e 50% eram
casados.O número de doações variou de 1 a 21 até a data do retorno, sendo 54,5%
espontâneas e 45,5% vinculadas. Após a repetição da sorologia, 73 amostras permaneceram
inconclusivas e as demais apresentaram resultados negativos. A Nested-PCR foi realizada em
todas as amostras, porém apenas um doador, entre os 73 que permaneceram inconclusivos no
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retorno, apresentou amplificação na região env (JA13-16).O percentual de falsos positivos no
ELISA(Ag/Ac) e no ELISA(Ac) em relação à Nested-PCR foi de 45,6% e 26,2%
respectivamente. A utilização de primers para mais de uma região genômica do vírus é
necessária, tendo em vista a alta variabilidade genética do HIV.
Descritores: HIV, ELISA, Nested-PCR.
Abstract
The transmission of the human immunodeficiency virus (HIV), ethiological agent of the
Acquired Immunodeficiecy Syndrom e(AIDS), constitutes a great concern for blood banks.
The objective of this study was to use the Nested-PCR for qualitative identification of the
DNA-HIV (provirus) in blood donors with indeterminate results in the screening assays. One
hundred-four samples with indeteminate results were collected from November of 2006 to
January of 2007, and analysed for the presence of HIV with PCR. The donors that returned
for the second collection in a period greater than 20 days and non reactive serology in others
screening tests were enclosed in the research. For the diagnosis of the HIV two
immunoenzimatics tests had been used (ELISAs): a third generation kit for research of
antibodies (Abbott-Murex HIV 1.2.0) and another one a fourth generation assay for antigen
and antibody detection (Abbott Hiv Ag/Ab Combination). To clarify the indeterminate results
in the ELISAs tests, we used nested primers for gag region (primers JA4-JA7) and two env
regions, JA13-JA16 and JA9-12, the last one is the sequence of V3 loop. The population of
donors studied was constituted mainly by males (88.7%), with an average of 34 years ranging
from 19 to 62 years and 50% of them were married. The percentage of false positives results
in ELISA (Ag/Ab) and ELISA (Ab) in relation to the Nested-PCR was of 45,6% and 26,2%
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respectively. The use of primers for more than a genomic region of the virus is necessary, in
view of its high genetic variability.
Key words: HIV, ELISA, Nested-PCR.
INTRODUÇÃO
A sensibilidade e especificidade dos testes de triagem para o HIV melhoraram
consideravelmente nos últimos anos, entretanto, a ocorrência de resultados inconclusivos por
estes testes pode causar implicações quando se trata de populações com baixo-risco para a
infecção, como os doadores de sangue (KIELLY & WOOD, 2005).
Assim, os casos inconclusivos representam um constante desafio pela necessidade de
testes adicionais para elucidar os resultados, pelo estresse gerado por esta situação não só para
o doador, como também para os profissionais envolvidos no processo de doação (BARBOSA
et al., 1998 ).
Nos centros de hemoterapia a implantação de melhores critérios para seleção de
doadores, o desenvolvimento de técnicas sorológicas mais sensíveis e mais recentemente a
detecção viral através de métodos que utilizam ácidos nucléicos, vêem
reduzindo a transmissão das doenças infecciosas por transfusão sanguínea (AUBUCHON,
1997; SCARACCHIO, 2007).
Entretanto, continua como fonte principal de infecção viral pós-transfusão o sangue
coletado de doadores no estágio inicial da infecção, denominado período de pré-
soroconversão (janela imunológica), quando o doador ainda é assintomático, porém virêmico
e não apresenta reatividade nos testes de triagem nos bancos de sangue (STRONG & KATZ,
2002).
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42
Para minimizar o problema do período pré-soroconversão, técnicas imunológicas de
maior acurácia capazes de detectar de forma mais precoce a infecção, estão sendo
desenvolvidas e introduzidas na rotina laboratorial desde a comercialização dos primeiros
testes diagnósticos para HIV em 1985 (FERNANDES, 2001; ONUSIDA 2003).
Os ensaios imunoenzimáticos (ELISAs) conhecidos como testes de primeira geração,
empregavam antígenos procedentes de lisado viral para detecção de anticorpos anti-HIV
(IgG) , usando anticorpos antiimunoglobulina humana policlonais conjugados a uma enzima,
frequentemente apresentavam reações não-específicas. A partir daí, surgiram os testes de
segunda geração melhorando a especificidade pelo emprego de antígenos obtidos por técnica
de DNA recombinante e/ou peptídeo sintético, contudo a sensibilidade manteve-se a mesma
dos ensaios anteriores e não reduziram significativamente a taxa de resultados falsos positivos
porque apresentavam o mesmo principio técnico do teste anterior (THORSTENSSON et
al.,1998,BRUST et al,2000).
Para superar os limites dos ensaios de primeira e segunda geração, foram elaborados
os testes de terceira geração, que detectam simultaneamente HIV-1 e HIV-2 e usam na fase
sólida antígenos recombinantes e/ou peptídeos sintéticos. Baseados em
novo princípio, estes antígenos podem ser conjugados e utilizados para detecção enzimática
específica de anticorpos anti-HIV (IgG e IgM) (BRUST et al, 2000; LY, et al. 2001).
Apesar desta evolução os laboratórios relataram que os ensaios falhavam em detectar
alguns subtipos de HIV, particularmente o HIV-1 do grupo O (CRHISTIANSEN et al.,1996;
THORSTENSSON et al.,1998). Assim, os ensaios foram melhorados com modificações que
permitiram a detecção de subtipos do HIV (BRUST et al., 2000).
Entretanto, a detecção de anticorpos anti-HIV durante o período da janela imunológica
depende de diversos fatores, tais como: a resposta imune inata, a densidade de células alvo no
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local da infecção, o número de partículas virais transmitidas e o genoma daquela população
viral no hospedeiro (PINTO & STRUCHINER, 2006).
De uma maneira geral, anticorpos podem ser detectáveis em 1 a 2 semanas após a
infecção, porém na maior parte das circunstâncias são detectáveis em 30 a 90 dias, após o
evento que levou ao contágio em 95% dos indivíduos (GRANATO, 2001).
Atualmente, ensaios de quarta geração, baseados na detecção simultânea de antígeno
p24 e anticorpos anti-HIV-1, foram desenvolvidos com a grande vantagem de encurtar o
período da janela imunológica em uma a três semanas e teoricamente, estes testes oferecem
maior sensibilidade (WEBER et al.,2003; KWON et al.,2006).
Na pesquisa de YEOM et al.(2006) a redução no período da janela imunológica com
os testes de quarta geração em comparação aos de terceira geração, foi de 6,3 dias em estudo
utilizando três painéis de soroconversão.
Com a introdução dos testes moleculares houve acréscimo na sensibilidade para a
detecção do vírus em doações realizadas durante o período da janela imunológica (STRONG
& KATZ, 2002) e permitiram a detecção precoce da infecção pelo HIV antes da
soroconversão (CUNNINGHAM et al., 2003).
Para o diagnóstico laboratorial da infecção primária do HIV-1 por métodos
moleculares, é necessária a detecção precoce das seqüências de ácidos nucléicos no plasma
(RNA viral) ou do DNA em células mononucleares do sangue periférico (DNA proviral)
(BUSH & SATTEN,1997; KLEINMAN & BUSH,2000).
Entretanto, a detecção do provírus (HIV-DNA) é importante, pois este representa um
reservatório na fase inicial da infecção (CHUN et al., 1997; BRULSTEN et al.,1998). Assim,
a amplificação do DNA gênomico, em populações de baixo risco como os doadores de sangue
torna-se essencial para a confirmação do diagnóstico do HIV. O ácido nucléico viral pode ser
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detectado até 8 dias antes do aparecimento de anticorpos, otimizando a sensibilidade e a
especificidade em relação ao diagnóstico sorológico ( BUSH & SATTEN,1997).
CUNNINGHAM et al. (2003) demonstraram que no período de pré-soroconversão a
detecção do HIV-DNA em doadores de sangue pode esclarecer os resultados indeterminados
no teste Western Blot.
O objetivo deste estudo foi utilizar a Nested-PCR para identificação qualitativa do
DNA-HIV (provírus) obtido a partir de células mononucleares do sangue periférico de
doadores de sangue, com resultados inconclusivos na triagem sorológica.
MATERIAL E MÉTODOS
Local do estudo
O estudo foi realizado no Centro de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco
(HEMOPE), vinculado à Secretaria de Saúde do Estado, no período de novembro de 2006 a
janeiro de 2007.
População de estudo
A população foi composta por 104 doadores de sangue de ambos os sexos, que
retornaram ao Hemocentro por apresentaram resultados inconclusivos para o HIV na triagem
sorológica.
Doadores considerados inconclusivos são todos aqueles que apresentaram resultados
discordantes entre os dois ELISAs realizados na triagem sorológica.
Dados epidemiológicos como: sexo, idade, estado civil, tipo de doação e número de
doações realizadas foram obtidos a partir dos registros dos doadores. O tipo de doação foi
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categorizado como vinculada, quando a doação é destinada à reposição do estoque no
Hemocentro ou espontânea, quando realizada por motivação própria.
Coleta das amostras
As amostras de sangue dos doadores foram coletadas para a repetição da sorologia em
tubos sem anticoagulantes e para a realização dos testes moleculares em tubos com EDTA. O
resultado da sorologia de retorno só foi conhecido após realização da Nested-PCR.
Aspectos Éticos
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Fundação HEMOPE, sob
o número de 036/2006 de acordo com a resolução de nº. 196/96 do Conselho Nacional de
Saúde.
Método imunoenzimático (ELISA)
Para a repetição da sorologia foram utilizados kits comerciais com as características
apresentadas na tabela 1, seguindo as instruções do fabricante.
A interpretação objetiva dos resultados dos ELISAs requer um cálculo através da reação
de densidade ótica(DO) de cada doador e o valor do ponte de corte ou cut-off(CO) obtido na
reação. Os resultados entre – 10% e +10% do valor do cut-off são considerados
indeterminados e se encontram na zona cinza (boderline).
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Tabela 1. Características dos ELISAs utilizados na triagem de doadores de sangue.
Características Murex HIV Ag/Ab (Combination)
4
a
geração
MurexHIV1.2.0
3
a
geração
Metodologia EIA Antígeno e Anticorpo Sanduíche EIA Antígeno Sanduíche
Ac. Capturados na Placa Específicos Específicos
Antígenos HIV na placa
Anticorpos HIV na placa
Antígenos Recombinantes:
HIV-1 gp41;HIV-2 gp36 e HIV-1 pol
Peptídeo Sintético gp 41 do HIV-1 subgrupo “O”
Anticorpo Monoclonal contra p24 e p26
Antígenos Recombinantes em Baculovírus:
HIV-1 gp41;HIV-2 gp36 e HIV-1 p24
Peptídeo Sintético gp41 do HIV-1 subgrupo
“O”
Não existentes
Antígenos presentes no conjugado
Anticorpos HIV no Conjugado
Antígenos Recombinantes :
HIV-1 gp 41
HIV-2 gp 36
HIV-1 pol
Peptídeo Sintético gp41 do HIV-1 subgrupo “O”
Peptídeo Sintético região imunodominante do
HIV-2
Anticorpo Monoclonal contra p24
Antígenos Recombinantes em E.coli :
HIV-1 p24 e gp41 (pAx146) – níveis baixos
Antígenos recombinantes em E. coli :
HIV-1 p24 e gp41 (pDX589) seqüência
diferente do pAx146
Peptídeos Sintéticos para HIV-2 gp36
(MDL103)
Peptídeos Sintéticos para HIV-1 subgrupo
“O” (MDL604)
Não existentes
Anticorpos detectados IgG ; IgM e IgA IgG ; IgM e IgA
Tempo de Reação 120 minutos (60’/30’/30’) 90 minutos (30’/30’/30’)
Reação em Cadeia da Polimerase ( Nested-PCR)
Primers
As seqüências de nucleotídeos dos primers que codificam para a região gag e duas
regiões env do genoma viral e suas localizações no genoma do HIV-1 são apresentadas
na tabela 2.
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Tabela 2. Seqüência de primers (nucleotídeos iniciadores) utilizados na PCR e “Nested
PCR” e sua localização no genoma do HIV-1.
Primers Seqüência de nucleotídeos (5’ – 3’) Gene e localização
JA4 GAAGGCTTTCAGCCCAGAAG Gag (1319 – 1338)*
JA5 ACCATCAATGAGGAAGCTGC Gag (1446 – 1465)**
JA6 TATTTGTTCCTGAAGGGTAC Gag (1577 – 1558)**
JA7 TCTCCTACTGGGATAGGTGG Gag (1615 – 1596)*
JA9 CACAGTACAATGTACACATG Env (7137 – 7156)*
JA10 AAATGGCAGTCTAGCAGAAG Env (7191 – 7210)**
JA11 ACAATTTCTGGGTCCCCTCC Env (7532 – 7513)**
JA12 ACAGTAGAAAAATTCCCCTC Env (7572 – 7533)*
JA13 TTCCTTGGGTTCTTGGGAGC Env (8004 – 8023)*
JA14 GCAGCAGGAAGCACTATGGG Env (8022 – 8041)**
JA15 CCAGGACTCTTGCCTGGAGC Env (8194 – 8175)**
JA16 AGGTATCTTTCCACAGCCAG Env (8209 – 8190)*
* primers externos
* primers internos
Os primers utilizados foram descritos por Albert J. & Fenyö, E.M. (1990).
Ressaltando-se que o conjunto de primers JA9-JA12 (env) foi desenhado para amplificar
nucleotídeos que codificam para região determinante principal de neutralização (região
V3) da glicoproteína externa do HIV (gp 120), região hipervariável que possui a
capacidade de reconhecer diversas linhagens virais.
Para analisar a sensibilidade e especificidade da Nested-PCR utilizamos os primers
acima em amostras de doadores de sangue reagentes e não reagentes nos ELISAs para HIV.
As amostras apresentaram produto de amplificação com todos os pares de primers, porém, em
um deles foi visualizado apenas produto na região env JA13-16. Por outro lado, nos doadores
não reagentes para o HIV não foram visualizados produtos amplificados.
Valença, Maria Iraci Buarque
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48
Extração do DNA genômico total
O DNA foi extraído utilizando-se o kit para isolamento de DNA genômico EZ-
DNA (Biological Industries) seguindo as instruções do fabricante. O princípio segue
versão modificada de método Chomenzinski (1987).
Nested- PCR
A Nested PCR é assim denominada por ser realizada em dois ciclos, o que aumenta a
especificidade do método.
Para as reações foi preparado um mix com os seguintes reagentes: água
bidestilada(14,6 µl), Magnésio (0,8 µl), solução tampão(2,0 µl), taq-polimerase(0,1 µl),
DNTPs (0,5 µl), primers (1,0 µl ),amostras(1,0 µl). Os tubos em cada etapa foram levados ao
termociclador com o seguinte programa: 95ºC 5 min, 95ºC 10 seg, 45 ciclos de 60ºC, 94ºC,
50ºC e 1 ciclo de 72ºC 10 seg. Os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese em
gel de agarose (2%) corados com brometo de etídio e visualizados através da luz ultra-
violeta.
Análise estatística
Os programas utilizados foram : MS Office Excel (versão 2000), SPSS (Statistical
Pachage for the Social Science) for Windows (versão 12.0) para a execução dos cálculos
estatísticos, elaboração e edição de gráficos e na elaboração das tabelas e redação usamos o
MSOffice Word (versão 2000).
Valença, Maria Iraci Buarque
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49
RESULTADOS
Caracterização da amostra
Dos 104 doadores de sangue, 82,7% pertenciam ao sexo masculino, sendo 50,0%
casados e 54,4% fizeram doação espontaneamente (tabela 3).
Tabela 3: Distribuições dos doadores segundo sexo, idade, estado civil e tipo de doação.
Variável N %
SEXO (N=104)
Masculino
Feminino
86
18
82,7
17,3
ESTADO CIVIL (N=96)*
Solteiro(a)
Casado(a)
Divorciado(a)
Viúvo (a)
46
48
1
1
47,9
50,0
1,0
1,0
TIPO DE DOAÇÃO (N=99)**
Espontâneo
Vinculado
54
45
54,4
45,5
* não informado o estado civil de 8 doadores
** não informado o tipo de doação em 5 doadores
A tabela 4 mostra que as idades variaram de 19 a 62 anos com média de 34 anos, e a
média de doações foi de 3 por doador.
Tabela 4: Distribuição de doadores segundo a idade e nº de doações realizadas.
Variáveis
Quantitativas
Média Mediana
Desvio
Padrão
Mínimo Máximo
Idade
(anos)
34,59 32,00 10,40 19 62
Nº de doações
3,12 2,00 3,27 1 21
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50
Resultados da sorologia
A tabela 5 apresenta os resultados obtidos na triagem e na sorologia de retorno para o
ELISA Ag/Ac, onde observa-se que dos 24 casos que foram classificados como
indeterminados na triagem, na sorologia de retorno 8 permaneceram nesta categoria, 8 foram
negativos e 8 foram classificados como positivos.
Tabela 5: Resultados do ELISA Ag/Ac na triagem e após o
retorno.
43
8
7 57
91,3% 33,3% 20,6% 54,8%
1 8 3 12
2,2% 33,3% 8,8% 11,5%
3 8 24 35
6,5% 33,3% 70,6% 33,7%
47
24
34 104
100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
N
%
N
%
N
%
N
%
Negativo
Indeterminado
Positivo
ELISA Ag/Ac
Retorno
Total
Negativo Indeterminado Positivo
ELISA Ag/Ac Triagem
Total
A tabela 6 apresenta os resultados obtidos na triagem e na sorologia de retorno para o
ELISA Ac, onde observa-se que dos 23 casos que foram classificados como indeterminados
na triagem, na sorologia de retorno 7 permaneceram nesta categoria, 14 foram negativos e 2
foram classificados como positivos.
Tabela 6: Resultados do ELISA Ac na triagem e após o retorno.
5
6
1
4
6 7
6
98,2
%
62,5
%
25,0
%
73,1
%
1 7 4 1
2
1,8
%
29,2
%
16,7
%
11,5
%
0 2 1
4
1
6
0
%
8,3
%
58,3
%
15,4
%
5
2
3
2
4
10
4
100,0
%
100,0
%
100,0
%
100,0
%
N
%
N
%
N
%
N
%
Negativ
o
Indeterminad
o
Positiv
o
ELISA
Ac
Retorn
o
Tota
l
Negativ
o
Indeterminad
o
Positiv
o
ELISA Ac
Tria
g
em
Tota
l
Valença, Maria Iraci Buarque
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51
Nested -PCR
Das 104 amostras com resultados considerados inconclusivos na sorologia, apenas
uma apresentou amplificação pela Nested-PCR. A amplificação ocorreu na seqüência da
região env (JA13-16) não sendo visualizados produtos de amplificação para as outras regiões
testadas, gag (JA4-7) e env(JA9-12).
Sorologia versus Nested-PCR
Dos doadores com resultados negativos para o ELISA Ag/Ac, um apresentou
resultado positivo pela Nested-PCR, ou seja, um resultado falso negativo pelo método
sorológico. Houve também um percentual de 45,6%, de falsos positivos neste ELISA, uma
vez que em nenhuma dessas amostras foi detectado DNA viral (tabela 7).
Tabela 7: Resultados do ELISA Ag/Ac e da Nested-PCR
56 1 57
54,4% 100,0% 54,8%
47 0 47
45,6%
,0%
45,2%
103 1 104
100,0% 100,0%
N
%
N
%
N
%
Negativo
Positivo*
ELISA
Ag/Ac
Total
Negativo Positivo
PCR
Total
100,0%
*As amostras indeterminadas foram consideradas positivas por estarem mais 10% do valor do cutt-off.
O doador que amplificou na Nested-PCR foi também reagente no ELISA Ac. O kit
apresentou 26,2% de falsos positivos (tabela 8) .
Valença, Maria Iraci Buarque
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52
Tabela 8. Resultados do ELISA Ac versus Nested-PCR
76 0 76
73,8% ,0% 73,1%
27 1 28
26,2% 100,0% 26,9%
103 1 104
100,0% 100,0% 100,0%
N
%
N
%
N
%
Negativo
Positivo
ELISA
Ac
Total
Negativo Positivo
PCR
Total
Com os resultados das duas tabelas acima (tabelas 7 e 8), foram calculadas as
medidas de qualidade dos testes diagnósticos.
Tabela 9: Medidas de qualidade dos testes diagnósticos
Medidas ELISA Ag/Ac ELISA Ac
Sensibilidade (%) 0,0 100,0
Especificidade (%) 54,0 74,0
VPP (%) 0,0 4,0
VPN (%) 98,0 100
Acurária (%) 45,0 74,0
RV+ 0,0 3,85
RV- 1,84 0,0
DISCUSSÃO
Nos centros de hemoterapia a implantação de melhores critérios para seleção de
doadores de sangue e a triagem sorológica sistemática para a pesquisa de anticorpos
Valença, Maria Iraci Buarque
______________________________________________________________________
53
anti-HIV, reduziram significativamente o risco de infecção associado à transfusão sanguínea.
Porém raros casos ainda são relatados.
Existe efetivamente um período de “janela” entre o inicio da infecção e o
aparecimento de anticorpos específicos para HIV, que pode se estender até 90 dias
(GRANATO,2001), daí a importância de se considerar ensaios por métodos moleculares no
diagnóstico da infecção pelo HIV.
Neste trabalho, utilizamos a Nested-PCR para a identificação qualitativa de seqüências
do HIV-DNA, em 104 amostras de doadores de sangue com resultados inconclusivos para
HIV com base na reatividade dos ELISAs utilizados na triagem sorológica. Doadores com
resultados inconclusivos apresentam um maior risco de infecção quando comparados àqueles
com resultados negativos. No grupo estudado identificamos um doador com resultado
inconclusivo, que apresentou amplificação.
Publicação de PASQUIER et al. (2003) indica que uma investigação por métodos
moleculares poderá ser decisiva na interpretação definitiva do diagnóstico para
o HIV. Pesquisas mostram que a detecção da seqüências do HIV-DNA é possível antes do
aparecimento de anticorpos específicos, através da amplificação dessas seqüências de DNA
pela PCR (BUSH&SATTEN,1997;YILMAZ,2001).
Segundo DEMETER (2000) a sensibilidade da DNA-PCR é de 95% após 2 semanas
de infecção pelo HIV-1 e 99,9% após seis meses de infecção.
Porém, uma das limitações da tecnologia por PCR na identificação do HIV é a
variação do genoma e, de acordo com CUNNINGHAM et al. (2003) o percentual de detecção
do HIV-DNA pela PCR, em indivíduos sabidamente HIV-1 reagentes, pode variar
sensivelmente dependendo da escolha dos primers utilizados na reação.
Valença, Maria Iraci Buarque
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54
Neste estudo utilizamos pares de primers de uma região mais conservada do HIV, que
é o gene gag e dois pares de primers para duas regiões do gene env (JA9-12 e JA13-16).
Assim, para confirmar a escolha correta dos primers usados na Nested-PCR, foram
selecionadas amostras de doadores reagentes para HIV. As amostras apresentaram produto de
amplificação com todos os pares de primers, porém, em um deles foi visualizado apenas
produto na região env JA13-16. Por outro lado, nos doadores não reagentes para o HIV não
foram visualizados produtos amplificados.
Como dito anteriormente, nesse estudo, uma amostra com resultado inconclusivo, ou
seja, reagente no ELISA Ac (DO/CO=2,044) e não reagente no ELISA Ag/Ac, apresentou na
Nested-PCR produto de amplificação para uma das seqüências de
primers utilizados, a seqüência JA13-16; entretanto, a não visualização de produtos de
amplificação com os outros pares de primers, pode sugerir a presença de linhagem viral
diferente ou baixo número de células que albergam o genoma do HIV, o que resulta em
pequeno número de produto amplificado, como relatam alguns trabalhos (REZENDE et al.
2002; LY et al,2001; LAETHEM et al.,1998 ). Além disso, mutações na região onde se ligam
os primers podem impedir a formação de produtos de amplificação (REZENDE et al.2002).
Ainda a considerar, a região gag, mesmo sendo relativamente conservada pode
apresentar amplicons insuficientes levando a resultados falsos negativos, que podem ser
atribuídos a formação de dímeros nesta região (CHRISTOPHERSON et al.,2001).
Avaliando os resultados da sorologia dos demais doadores inconclusivos e que não
apresentaram produto de amplificação, sugere-se que não estejam infectados pelo HIV e que
os resultados sorológicos encontrados podem ser interpretados dentro do contexto das reações
não específicas, embora, devam ser modulados em relação a quantidade de DNA genômico
amplificado, a porcentagem de células mononucleares infectadas com o HIV, a sensibilidade
do método e possíveis variantes do vírus.
Valença, Maria Iraci Buarque
______________________________________________________________________
55
Segundo PANE et al. (1995), até mesmo amostras com resultados situados na zona
cinza (boderline) nos ELISAs podem significar infecção com pequeno número de cópias do
HIV-DNA.
Portanto, não se pode excluir completamente um baixo grau de infecção na população
estudada, a comparação da análise sorológica com os resultados da Nested-PCR sugere que
acompanhar e repetir a sorologia no intervalo de 3 a 12 meses pode ser satisfatório para
determinar com segurança a infecção em doadores que inicialmente se apresentaram
inconclusivos na sorologia.
Existe um percentual considerável de resultados falsos positivos nos imunoensaios
utilizados; o kit ELISA Ac apresentou 26,2% e o kit ELISA Ag/Ac 45,6% de resultados
falsos positivos em relação à Nested-PCR. Alguns autores relatam que ensaios que combinam
Ag/Ac reduzem a especificidade, e isto é um aspecto importante a ser considerado quando se
fala de ensaios combinados (LY et al.,2001;WEBER,2003).
Para PRAHARAJ et al.(2003) a utilização de kit que detecta o Ag-24 pode ser útil em
populações de alto risco, porém em populações de baixo risco, como doadores de sangue, este
pode não apresentar um bom custo-benefício. E de acordo com os autores, nos EUA em
bancos de sangue, em apenas 4% de indivíduos assintomáticos são detectados o Ag p24,
quando o método naqueles indivíduos com infecção aguda, o percentual de detecção varia de
50 a 75% .
Porém a não reatividade no kit ELISA Ag/Ac para o doador que apresentou produto de
amplificação na Nested- PCR, pode-se deduzir as seguintes situações: baixo nível de Ag p24,
uma vez que a detecção deste ocorre antes do aparecimento de anticorpos, ou seja, na fase
aguda da infecção; pela formação de complexos imunes quando da queda do Ag e elevação de
anticorpos o que pode inibir a sensibilidade dos ensaios; e pelo fato do kit ELISA (Ag/Ac)
Valença, Maria Iraci Buarque
______________________________________________________________________
56
não dispor de antígenos para detecção de anti – p24 (PRAHARAJ et al.2003). Antígeno este,
presente no Kit ELISA Ac onde a amostra foi reagente.
Com relação às medidas de qualidade dos testes diagnósticos observa-se um baixo
valor preditivo positivo (VPP) nos ELISAs, o que é compatível com a baixa prevalência da
infecção pelo HIV na população de doadores do HEMOPE, que foi de 0,1% (86/84.641) no
ano de 2006. Investigações realizadas em outras regiões do Brasil
e do mundo, apresentaram percentual de 0,2% (ANDRADE NETO et al.,2002;WANG et
al.,2004).
O ELISA(Ac) em relação à Nested- PCR, apresentou uma acurácia de 74% e a razão
de verossimilhança para o teste positivo, mostrou ser 4 vezes maior que a chance do mesmo
ser falso. Em relação à especificidade do ELISA(Ac), esta foi de 74% , percentual que
representa a capacidade do kit em afastar a infecção quando ela realmente não estava
presente.
Este estudo permitiu pela primeira vez neste serviço fazer uma avaliação sobre os
resultados dos doadores inconclusivos na sorologia para HIV através de métodos moleculares,
contribuindo para sugerir estratégias para o monitoramento dos doadores inconclusivos. O
protocolo do método utilizado nesse estudo fica disponível para utilização de estudos
posteriores no laboratório de biologia molecular em doadores de sangue.
Dessa forma, o trabalho permitiu realizar uma revisão da rotina laboratorial de
doadores de sangue, antecipando-se à proposta da portaria do Ministério da Saúde, que prevê
a implantação da técnica de detecção do ácido nucléico (NAT) em serviços de hemoterapia. A
determinação foi motivada pela necessidade de se evitar o risco transfusional.
Valença, Maria Iraci Buarque
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57
CONCLUSÕES
A presente investigação baseada nos primers gag e env se mostrou útil, sensível e
específica na PCR .
A utilização de um método de detecção por ácidos nucléicos, seja por PCR ou por
outros métodos resultantes de sua modificação como o NAT, deve ser considerada, porém se
faz necessária a utilização de primers para mais de uma região genômica do HIV pela alta
variabilidade genética que o vírus apresenta.
A aplicação da PCR não deve ser usada isoladamente, mas sempre acompanhada da
sorologia, dando subsídios para melhor uma melhor avaliação naqueles casos que se fizer
necessário.
A interpretação dos resultados de doadores inconclusivos mostra ser um desafio para
os laboratórios de banco de sangue, pela necessidade de testes adicionais e pelo estresse
gerado não só para o doador, como também para os profissionais envolvidos no processo de
doação e liberação do sangue.
Espera-se dessa forma contribuir para uma melhor compreensão nos resultados desse
grupo de doadores na rotina diária do banco de sangue, dando subsídios para a qualidade das
ações oferecidas a esta população.
Valença, Maria Iraci Buarque
______________________________________________________________________
58
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of a human Monoclonal Antibody is Determined by the GPGR V3 Motif of HIV Type
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Valença, Maria Iraci Buarque
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64
ANEXOS
Valença, Maria Iraci Buarque
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65
Valença, Maria Iraci Buarque
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66
FUNDAÇÃO HEMOPE
Rua Joaquim Nabuco,171
Recife-PE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu,___________________________________________________________________
RG:Nº_____________________,aceito participar do estudo:Aplicação de Testes Moleculares
em Doadores de Sangue da Fundação Hemope, que tem como objetivo melhorar o serviço
com métodos mais sensíveis e específicos, trazendo benefícios ao processo de doação.
Me foi esclarecido o seguinte:
• Que a minha colaboração consistirá em coletar amostras de sangue para serem
utilizadas no novo procedimento técnico
• Que a minha participação não é obrigatória e que, a qualquer momento, poderei
desistir ou retirar meu consentimento.
• Que durante a pesquisa poderei tirar qualquer dúvida, recebendo novos
esclarecimentos por parte do pesquisador através dos telefones:34164658/34164654.
• Que o pesquisador assegurará o sigilo absoluto sobre minha identidade.
Recife,____ de _____________ de 2006.
Assinatura do voluntário
Dados da pesquisadora
Nome:Maria Iraci Buarque Valença
Conselho Regional de Biomedicina Nº442
Fone:34164658/34164654
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