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CRISTHIANE LEITE KRUEGER
SELEÇÃO DE LINHAGENS DE Bacillus PRODUTORAS DE
POLIHIDROXIALCANOATOS A PARTIR DE RESÍDUO DO
PROCESSAMENTO DE MANDIOCA
FLORIANÓPOLIS – SC
2009
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO TECNOLÓGICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE
ALIMENTOS
SELEÇÃO DE LINHAGENS DE Bacillus PRODUTORAS DE
POLIHIDROXIALCANOATOS A PARTIR DE RESÍDUO DO
PROCESSAMENTO DE MANDIOCA
Dissertação submetida ao
Curso de Pós-Graduação
em Engenharia de
Alimentos da Universidade
Federal de Santa Catarina
para obtenção do Grau de
Mestre em Engenharia de
Alimentos.
Orientadora: Profª Dr. Regina Vasconcellos Antônio
Co-orientador: Profº Dr. André Oliveira de Souza Lima
CRISTHIANE LEITE KRUEGER
Florianópolis, 20 de março de 2009.
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iii
Este trabalho foi desenvolvido
nos Laboratórios de Biologia
Molecular, Biotecnologia
Básica e Microbiologia
Aplicada do Centro de Ciências
Tecnológicas da Terra e do
Mar, da Universidade do Vale
do Itajaí – Itajaí, SC.
iv
Tudo que sou é reflexo
de duas vidas de
dedicação, incentivo e
amor: a vida de meus
pais!
v
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus por eu poder conquistar
mais este objetivo, por me dar força e garra quando era disso que eu
precisava.
Agradeço imensamente aos professores Regina e André, pela
oportunidade, pela orientação, pela dedicação, pela paciência, pelo
empenho e o amor em trabalhar com ensino e pesquisa. Posso dizer,
realmente, que vocês são exemplos de bons profissionais, e que
conquistaram minha admiração e meu carinho.
Agradeço ao professor Marcus Adonai e sua equipe de
pesquisa, que trabalharam para o desenvolvimento da coleção de
microrganismos do laboratório, e ao professor Carlos Renato Rambo,
pela análise de caracterização do polímero.
Ao professores que aceitaram participar da defesa desta
dissertação, professora Gláucia e professor Pessatti, obrigada por
fazerem parte deste trabalho, enriquecendo-o. E um agradecimento
especial ao prof. Pessatti, que me acompanha há algum tempo, por quem
tenho uma admiração enorme.
Agradeço à CAPES, pela bolsa de estudo, e ao CNPq e a
Indústria Corn Products pelo apoio financeiro.
Aos amigos do laboratório, meu especial carinho, Amanda, Ida,
Angélica, Felipe, Clederson, Thiago, Sara, Carlos, pelo apoio e
companheirismo durante os experimentos. Um “valeu” super especial
aos amigos que conquistei durante este tempo, Rossana, Bianca,
Andréia... tenho certeza de que estive em companhia de pessoas muito
especiais.
Agora gostaria de agradecer àquelas pessoas que me apoiaram
não só neste momento, mas sempre... Um muito obrigado todo especial
aos meus pais, a estas “pessoinhas” que me acompanharam, deram-me
todo carinho possível, e incentivaram-me para que eu estivesse
concluindo mais esta etapa na minha vida.
Ao meu irmão, à minha vó e meu vô (in memorian), que sempre
de perto me apoiaram e incentivaram-me. E a toda a minha família e
meus amigos, que me acompanharam durante todo este tempo.
Agradeço também a alguém muito especial, ao meu namorado Marcelo,
por seu companheirismo, seu carinho, sua atenção, seu amor e sua força,
que sempre me apoiaram muito.
Por fim, agradeço a todas as pessoas que participaram, direta ou
indiretamente, deste trabalho e deste momento, e que, de alguma forma,
me fizeram crescer como profissional e ser humano.
vi
RESUMO
Frente aos problemas ocasionados pelo uso dos plásticos de origem
petroquímica, surgiu a necessidade de se buscarem alternativas para
substituição deste material. Apresentam-se como solução os plásticos
biodegradáveis, ou bioplásticos, que são polímeros com as propriedades
desejáveis dos plásticos convencionais e rapidamente biodegradados
quando descartados no ambiente. Dentre eles, estão os
polihidroxialcanoatos (PHAs), poliésteres compostos por monômeros de
ácidos 3-hidroxialcanóicos, os quais são acumulados intracelularmente
por bactérias, como reserva de carbono e/ou energia, sob limitação de
um nutriente essencial ao seu crescimento, e o polímero mais estudado
atualmente é o P(3HB) - poli(3-hidroxibutirato). Entretanto, o custo de
produção de PHAs é um dos responsáveis pela limitação de sua
produção e comercialização. A utilização de substratos de baixo custo se
torna um fator importante para a redução do custo de produção, além da
busca e obtenção de linhagens eficientes na conversão do substrato em
polímero. O objetivo deste trabalho foi selecionar, numa coleção de
microrganismos do Laboratório de Microbiologia Aplicada -
UNIVALI/SC, uma linhagem bacteriana capaz de produzir PHA a partir
de resíduo do processamento de mandioca. Inicialmente, 72 isolados de
Bacillus, Paenibacillus e Geobacillus de 21 espécies diferentes foram
cultivados em meio com limitação de fósforo e 20g/L de resíduo
industrial oriundo do processamento de mandioca, rico em amido e
açúcares redutores. Foram avaliados o crescimento dos microrganismos
em meio com substrato amiláceo (técnica de MTT), sua capacidade de
secretar enzimas no meio (avaliação de degradação de amido) e a
produção de PHA (cultivo com corante vermelho do Nilo e observação
em microscópio de epifluorescência). Finalmente foram selecionados 4
isolados: LAMA073, LAMA095, LAMA262 e LAMA265, classificados
por métodos moleculares como Bacillus megaterium, os quais foram
capazes de produzir P(3HB) a partir do resíduo amiláceo. O resíduo
industrial utilizado mostrou-se, portanto, um substrato carbônico
aplicável à produção de compostos de maior valor agregado, como
P(3HB). Os isolados LAMA073, LAMA095, LAMA262 e LAMA265
acumularam 13,04% (p/p), 23,88% (p/p), 5,92% (p/p), e 25,00% (p/p)
de P(3HB), respectivamente, a partir de 20% de resíduo hidrolisado
adicionado ao meio. Quando adicionado resíduo hidrolisado na
concentração de 40%, os isolados LAMA073 e LAMA095 apresentaram
aumento na produção de P(3HB), para 30,45% (p/p) e 29,78% (p/p),
vii
respectivamente. A espectroscopia na região do infravermelho com
transformada de Fourier (FTIR), das amostras de PHAs produzidos,
mostraram bandas características da presença de P(3HB), confirmando a
produção deste polímero pelos microrganismos. Portanto, os isolados
identificados e caracterizados apresentam potencial para a produção de
P(3HB) em substrato de baixo custo, sendo um próximo passo avaliá-los
em uma escala superior de produção, bem como em outros resíduos
amiláceos.
viii
ABSTRACT
There are many problems caused by use of petrochemical plastics, then
it is necessary to find alternatives to replace this material. A solution for
this problem is the use of biodegradable plastic, or bioplastics, which are
polymers with desirable properties of conventional plastics, and they are
rapidly biodegraded in the environment when they are discarded.
Among the biodegradable plastics, there are the polyhydroxyalkanoates
(PHAs), polyester containing hydroxyalkanoic acid monomers. They are
accumulated intracellularly by bacteria as carbon or energy reserves,
when there is a limitation of an essencial nutrient, and P(3HB) – poly(3-
hydroxybutyrate) is the most studied polymer nowadays. However, the
use of PHA is limited due to its high cost production. The use of low
cost by-products becomes the main factor for the reduction of
production cost, besides that it is also necessary to obtain strains for
efficient substrate conversion into polymer. The objective of this work
was to select a bacterial strain capable of producing PHA from cassava
by-products as carbon source. First screening was conduced with 72
strains from culture collection of the Applied Microbiology Laboratory
(UNIVALI/SC/Brazil), covering three generas (Bacillus, Geobacillus
and Paenibacillus) and 21 different species, which were cultivated in
Minimal Medium (MM) with limited phosphate and 20g/L of cassava
by-product. It was evaluated microorganisms growth (measuring
respiration by MTT assay) in medium with starchy substrate, their
ability to secrete enzymes (starch degradation) and PHA production
(Nile red dying assay and observation in epifluorescence microscope).
Finally 4 isolates were selected: LAMA073, LAMA095, LAMA262 and
LAMA265, classified by molecular methods (16S rRNA sequencing) as
Bacillus megaterium, which were capable of producing P(3HB) from
cassava processing by-products as a sole carbon source. Strains
LAMA073, LAMA095, LAMA262 and LAMA265 were able to
produce 13,04% of P(3HB) (w/w), 23,88% (w/w), 5,92% (w/w) and
25,00% (w/w) respectively, when cultivated in MM supplemented with
20% of hydrolized cassava by-product. However, when 40% of
hydrolized cassava by-product was used, higher P(3HB) percentage,
30,45% and 29,78% (w/w), was observed for LAMA073 and
LAMA095, respectively. Fourier transform infrared spectroscopy
(FTIR) showed characteristic bands of P(3HB) presence, confirming
polymer production by microorganisms. Therefore, the identified and
characterized strains have potential to produce P(3HB) in low-cost
ix
substrate, and a next study would be evaluate them on a higher scale of
production, as well as production in others starchy waste.
x
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..................................................................................1
2. OBJETIVOS.......................................................................................4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..........................................................5
3.1. Polihidroxialcanoatos...................................................................5
3.1.1. Histórico................................................................................5
3.1.2. Características e propriedades...............................................6
3.1.3. Microrganismos produtores.................................................11
3.1.3.1. Bacillus........................................................................14
3.1.4. Biossíntese...........................................................................16
3.1.5. Biodegradabilidade..............................................................21
3.1.6. Produção Industrial..............................................................22
3.1.7. Aplicações...........................................................................25
4. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................27
4.1. Meios de cultura empregados.....................................................27
4.2. Coleção de microrganismos avaliada........................................28
4.3. Seleção dos microrganismos degradadores de amido................31
4.4. Caracterização do resíduo empregado como fonte de
carbono..............................................................................................32
4.4.1. Métodos Analíticos..............................................................32
4.4.1.1. Determinação de açúcares redutores............................32
4.4.1.2. Determinação de açúcares redutores presentes em
forma de amido.........................................................................33
4.4.1.3. Determinação de proteínas...........................................33
4.4.1.4. Determinação de nitrogênio total.................................33
4.5. Condições de cultivo para a produção, extração e
caracterização dos PHAs produzidos................................................34
4.5.1. Hidrólise do resíduo............................................................34
4.6. Métodos Analíticos......................................................................35
4.6.1. Determinação do índice enzimático....................................35
4.6.2. Determinação do crescimento bacteriano............................36
4.6.2.1. Determinação do crescimento bacteriano em resíduo
hidrolisado................................................................................36
4.6.3. Determinação de PHA.........................................................37
xi
4.6.4. Análise dos Dados...............................................................37
4.7. Avaliação da produção de PHA por microscopia de
epifluorescência.................................................................................38
4.8. Extração e Caracterização do PHA...........................................38
4.8.1. Extração do PHA.................................................................38
4.8.2. Caracterização do PHA.......................................................39
4.8.2.1. Espectroscopia na Região do Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR)..............................................39
4.9. Caracterização molecular dos microrganismos isolados..........39
4.9.1. Extração de DNA................................................................39
4.9.2. Amplificação do gene 16S rRNA por PCR........................40
4.9.3. Sequenciamento do DNA...................................................40
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................42
5.1. Caracterização do resíduo..........................................................42
5.2. Seleção de microrganismos degradadores de amido.................43
5.3. Avaliação quantitativa dos microrganismos selecionados.........47
5.3.1. Determinação do índice enzimático....................................47
5.3.2. Determinação do crescimento bacteriano............................49
5.4. Avaliação da Produção de PHA.................................................52
5.5. Caracterização dos filmes de PHB.............................................63
5.5.1. Espectroscopia na Região do Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR)...................................................63
5.6. Caracterização molecular dos isolados selecionados................65
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................69
7. PERSPECTIVAS..............................................................................71
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………...72
ANEXOS...............................................................................................87
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura geral dos polihidroxialcanoatos (LEE, 1996a).........7
Figura 2. Metabolismo em crescimento balanceado e em condição de
limitação de nutriente e excesso de carbono (Adaptado de BYROM,
1987).......................................................................................................17
Figura 3. Via de biossíntesse de poli(3-hidroxibutirato) (MADISON e
HUISMAN, 1999)..................................................................................18
Figura 4. Via de biossíntese de PHB e de PHBV a partir de glicose e
propionato (DOI et al., 1990).................................................................20
Figura 5. Isolados bacterianos crescidos em meio mínimo (M9) com
5g/L do resíduo do processamento de mandioca como única fonte de
carbono, após 24 horas de cultivo..........................................................46
Figura 6. Colônias de B. ehimensis LAMA190 (A) e B. subtilis
LAMA023 (B) e os halos de degradação do amido, revelados por
solução de iodo.......................................................................................47
Figura 7. Índice enzimático (relação halo enzimático/diâmetro colônia)
dos isolados selecionados, cultivados em meio M9, contendo 5g/L de
resíduo. Os isolados foram comparados estatisticamente pelo teste de
Tukey, e os isolados indicados com mesma letra não são diferentes ao
nível de 5% de significância. As barras verticais nas colunas se referem
ao desvio padrão das médias das amostras.............................................48
Figura 8. Crescimento celular dos isolados em meio contendo resíduo
bruto, por meio da técnica de redução de MTT, expresso como
absorbância ABS
540nm
. Os isolados foram comparados estatisticamente
pelo teste de Tukey, e os indicados com mesma letra não são diferentes
ao nível de 5% de significância. As barras verticais nas colunas se
referem ao desvio padrão das médias das amostras...............................50
Figura 9. Crescimento do isolado LAMA 262 em meio com resíduo
bruto e hidrolisado por meio da técnica de MTT, expresso como
ABS
540nm
, em que RB = resíduo bruto e RH = resíduo hidrolisado. Os
isolados foram comparados estatisticamente pelo teste de Tukey, e as
xiii
barras verticais nas colunas se referem ao desvio padrão das médias das
amostras..................................................................................................51
Figura 10. Quantidade de açúcares redutores totais (g/L) liberada nos
diferentes tratamentos (1 a 8) para hidrólise do resíduo do
processamento de mandioca. As identificações “a”, “b”, “c” e “d”
indicam a comparação estatística entre os tratamentos (teste de
Tukey)....................................................................................................53
Figura 11. Crescimento celular (redução de MTT ABS
540nm
) dos
isolados LAMA262 e LAMA268 cultivados em glicose ou resíduo
amiláceo hidrolisado, após 48 horas de cultivo a 37ºC. As barras
verticais nas colunas se referem ao desvio padrão das médias das
amostras..................................................................................................54
Figura 12. Acúmulo de PHA observado sob microscópio de
epifluorescência. A) LAMA262 cultivado com glicose; B) LAMA262
cultivado com resíduo; C) LAMA268 cultivado com glicose; D)
LAMA268 cultivado com resíduo..........................................................56
Figura 13. Acúmulo de PHA dos isolados cultivados com resíduo
observado sob microscópio de epifluorescência. A) LAMA 095; B)
LAMA 073; C) LAMA 262; D) LAMA 265.........................................59
Figura 14. Espectro de FTIR para o polímero produzido pelo isolado
LAMA095 - B. megaterium...................................................................64
Figura 15. Espectro de FTIR para o polímero produzido pelo isolado
LAMA265 - B. megaterium...................................................................64
Figura 16. A árvore filogenética, construída por meio do Programa
MEGA4, apresenta os isolados selecionados no trabalho e os
microrganismos com 99% de identidade selecionados a partir do
GenBank. No eixo x, encontra-se uma escala de identidade de
nucleotídeos, sendo que a distância é a proporção (p) de nucleotídeos
diferentes comparando-se duas sequências, e é obtido pela divisão do
número de nucleotídeos diferentes pelo número total de nucleotídeos
comparados. Os valores expressos na árvore, nos nós internos, se
referem aos valores de Bootstrap, em 100 réplicas................................67
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Comparação das propriedades físicas de alguns
polihidroxialcanoatos e do polipropileno ..............................................10
Tabela 2. Acúmulo de PHA por alguns microrganismos, sua fonte de
carbono e a composição do polímero.....................................................12
Tabela 3. Acúmulo de PHA por alguns Bacillus...................................15
Tabela 4. Características dos diferentes tipos de PHB polimerase........19
Tabela 5. Biodegradação de um filme de P(3HB-co-3HV) (80%
HB/20% HV)..........................................................................................22
Tabela 6. Efeito do custo do substrato e do rendimento de P(3HB) no
custo de produção...................................................................................24
Tabela 7. Elementos constituintes do meio M9 (g/L)...........................27
Tabela 8. Elementos constituintes do meio LB (g/L)............................27
Tabela 9. Elementos constituintes do meio descrito por Ramsay e
colaboradores (1990) (g/L).....................................................................28
Tabela 10. Microrganismos avaliados da coleção do Laboratório de
Microbiologia Aplicada/UNIVALI........................................................29
Tabela 11. Avaliação do crescimento dos isolados ambientais, após 48
horas de cultivo em meio M9 a 37ºC, contendo 5g/L de amido
puro.........................................................................................................44
Tabela 12. Microrganismos selecionados após avaliação do
crescimento, em meio M9 a 37ºC, contendo 5g/L de amido puro, em 24
horas.......................................................................................................45
Tabela 13. Isolados crescidos em meio limitado com glicose como fonte
de carbono e corante vermelho do Nilo a 37ºC......................................57
xv
Tabela 14. Isolados crescidos em meio limitado com 20% de resíduo
hidrolisado como fonte de carbono e corante vermelho do Nilo............58
Tabela 15. Biomassa produzida, quantidade de P(3HB) nas células e
porcentagem de recuperação do polímero dos isolados cultivados em
meio limitado com 20% de resíduo hidrolisado (v/v), e em 20g/L de
glicose por 48h a 37ºC............................................................................60
Tabela 16. Biomassa produzida, quantidade de P(3HB) nas células e
porcentagem de recuperação do polímero dos isolados cultivados em
meio limitado com 40% de resíduo hidrolisado (v/v), por 48h a
37ºC........................................................................................................62
Tabela 17. Identidade entre as sequências dos isolados selecionados e o
banco de dados GenBank (NCBI)..........................................................66
xvi
NOMENCLATURA
ABS Absorbância (ou Densidade Ótica – DO)
Acetil-CoA Acetil coenzima A
BSA Soro Albumina Bovina
CTC Cobre-tartarato-carbonato
DMP 2,6 Dimetilfenol
DMSO Dimetilsulfóxido
rRNA RNA ribossomal
DNS Ácido 3-5 dinitrosalicílico
FTIR Espectroscopia na Região do Infravermelho com
Transformada de Fourier
HAS Ácidos Hidroxialcanóicos
kDa Kilo Daltons
LB Meio Luria-Bertani
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5 difenil brometo de
tetrazolina)
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
P(3HB) Poli(3-hidroxibutirato)
P(3HB-co-3HV) Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)
P(3HB-co-4HB) Poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato)
P(3HHx) -co-
P(3HO)
Poli(3- hidroxihexanoato-co-3-hidroxioctanoato)
P(3HV) Poli(3-hidroxivalerato)
PBS Tampão fosfato-salina
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PHA Polihidroxialcanoato
PHA
LCL
Polihidroxialcanoato de cadeia lateral longa
PHA
MCL
Polihidroxialcanoato de cadeia lateral média
PHA
SCL
Polihidroxialcanoato de cadeia lateral curta
PHB Polihidroxibutirato
PHBHHx Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato)
PHBV Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)
SDS Dodecil sulfato de sódio
TE Tampão Tris-HCl 1M, pH 7,5
Tg Temperatura de transição vítrea
TGA Termogravimetria
Introdução
__________________________________________________
1
1. INTRODUÇÃO
Há muito tempo os materiais plásticos se tornaram parte
importante em nosso dia-a-dia, pelas suas características de
versatilidade, força, durabilidade, resistência à degradação. Desta forma,
tornaram-se essenciais para quase todas as indústrias, as quais trocaram
vidro e papel nas embalagens pelo plástico. No entanto, estas
propriedades consideradas desejáveis agora são consideradas
preocupantes, e o acúmulo de plásticos no ambiente tornou-se um
problema mundial (KHANNA e SRIVASTAVA, 2005).
O aumento da produção de lixo aparece como uma das principais
consequências do crescimento populacional e econômico, cujo índice é
alarmante: o Brasil produz diariamente em média 240 mil toneladas de
lixo, sendo que 88% são destinados a aterros e lixões (IBGE, 2003).
A presença de plástico de origem petroquímica representa um
grave problema, uma vez que permanece no meio ambiente por um
longo período de tempo, devido ao alto peso molecular e à conformação
da cadeia carbônica desses polímeros, o que dificulta a ação dos
microrganismos no processo degradativo. Além disso, devido à lenta
degradação, comprometem a circulação de gases e líquidos, dificultam a
degradação de outros constituintes do lixo, e retardam a estabilização
das áreas dos aterros (MOORE e SAUNDERS, 1997; GOMEZ e
BUENO NETTO, 1997).
Soluções para o gerenciamento do descarte de plásticos incluem
incineração, reciclagem e bio ou fotodegradação. Entretanto, incineração
e reciclagem apresentam alguns problemas associados, como o fato de a
incineração ser perigosa, pelos compostos formados, além de possuir
custo elevado, e a reciclagem, além de ser um processo demorado, pode
ser limitado pela presença de pigmentos e revestimentos dos plásticos.
Neste contexto, os plásticos biodegradáveis oferecem a melhor solução
para a manutenção da qualidade do ambiente (KHANNA e
SRIVASTAVA, 2005).
Os materiais plásticos biodegradáveis, então, devem possuir
propriedades físico-químicas desejáveis dos plásticos convencionais,
serem produzidos a partir de fontes renováveis de carbono e ainda serem
completa e rapidamente biodegradados quando descartados no meio
ambiente. Os plásticos biodegradáveis, ou bioplásticos, são polímeros
que se degradam ao ataque microbiano em curto espaço de tempo, sob
condições apropriadas do ambiente (PIEMOLINI, 2004).
Introdução
__________________________________________________
2
Nota-se o grande interesse da população mundial quanto ao
desenvolvimento destes polímeros quando se observa o aumento no
número de publicações e patentes sobre este assunto nos últimos 25
anos, passando de isoladas publicações em 1982 para aproximadamente
100 publicações e 40 patentes em 2004 (JACQUEL et al, 2008).
Dentre os biopolímeros em desenvolvimento, estão os
polihidroxialcanoatos (PHAs), os quais são acumulados
intracelularmente por bactérias produtoras, como reserva de carbono
e/ou energia, na maioria das vezes, sob limitação de um nutriente
essencial ao seu crescimento, como nitrogênio, fósforo, enxofre ou
oxigênio. São considerados uma importante alternativa aos materiais
plásticos convencionais (LEE et al., 1999).
Quimicamente, os PHAs são ésteres poliméricos de
hidroxiácidos. Devido às suas características físicas e químicas,
apresentam aplicações amplas tanto como matéria plástica convencional,
como na medicina, para fabricação de materiais de sutura e prótese
óssea, na indústria farmacêutica, para a produção de cápsulas para a
liberação controlada de fármacos, e, na indústria de alimentos, como
embalagens (STEINBÜCHEL e FÜCHTENBUSCH, 1998). Dentre os
PHAs, poli(3-hidroxibutirato) [P(3HB)] é o polímero mais estudado,
produzido naturalmente na presença de excesso de carbono por diversas
bactérias como grânulos de reserva de energia e poder redutor
(KHARDENAVIS et al., 2007).
Entretanto, o custo de produção de P(3HB) é cerca de nove
vezes maior em comparação aos plásticos sintéticos, já que envolve
produção de biomassa com fontes de carbono muitas vezes de valor
elevado, o que limita a produção deste biopolímero e sua substituição
em relação aos produtos normalmente comercializados
(KHARDENAVIS et al., 2007). Desta forma, a redução dos custos de
produção depende da obtenção de linhagens altamente eficientes na
conversão dos substratos no produto desejado, da utilização de
substratos de baixo custo, do desenvolvimento de processos de extração-
purificação a fim de tornar os custos de recuperação do polímero os
menores possíveis (KHANNA e SRIVASTAVA, 2005).
Neste contexto, dentre os substratos de baixo custo, destacam-se
os substratos amiláceos, disponíveis em grandes quantidades, e que
constituem componentes importantes de resíduos de inúmeras indústrias
(CEREDA, 1997). A mandioca se destaca no Brasil pela sua alta
produção e pela existência de diversas indústrias de processamento.
Desta forma, são necessários estudos para definição de destino
apropriado para os resíduos produzidos, os quais podem constituir fonte
Introdução
__________________________________________________
3
rica para produção de compostos de maior valor agregado, como é o
caso dos PHAs.
É necessário explorar também os microrganismos do ambiente,
e dentre os quais estão os Bacillus, os quais apresentam vantagens como
o curto tempo de geração e por ser bom “hospedeiro” para expressão de
genes heterólogos. Estas bactérias podem crescer facilmente até alcançar
uma alta densidade celular, utilizando fontes de carbono e nitrogênio de
baixo custo, além de serem capazes de secretar grande quantidade de
enzimas (LAW et al., 2003).
Objetivos
___________________________________________________
4
2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo geral a seleção de uma
linhagem bacteriana (Bacillus) capaz de produzir polihidroxialcanoatos
(PHA) a partir de resíduo do processamento de mandioca.
Os objetivos específicos foram:
• selecionar dentre isolados ambientais de Bacillus, Paenibacillus
e Geobacillus (disponíveis na coleção de microrganismos do
Laboratório de Microbiologia Aplicada da Universidade do
Vale do Itajaí - UNIVALI) aqueles capazes de crescer em meio
contendo amido, como única fonte de carbono;
• dentre os isolados amilolíticos, avaliar a produção de biomassa
a partir de substrato amiláceo;
• selecionar os isolados que produzem naturalmente PHA usando
o substrato amiláceo como única fonte de carbono;
• avaliar as bactérias selecionadas quanto à produção de PHA em
substrato amiláceo, comparativamente à produção a partir de
glicose;
• caracterizar os polímeros produzidos, quanto à composição;
• caracterizar molecularmente os microrganismos selecionados.
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
5
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Polihidroxialcanoatos
3.1.1. Histórico
Lemoigne, no Instituto Pasteur, em 1925, foi o primeiro
pesquisador a descrever o bioplástico, identificado como poli(3-
hidroxibutirato), sendo então marcada a descoberta do PHB, extraído de
Bacillus megaterium. Esta primeira observação foi praticamente
esquecida até meados da década de 70, quando, devido à crise do
petróleo, foi criado um movimento científico que visava descobrir
fontes alternativas de combustíveis, e, com isso, colocou-se em destaque
o tema (LUENGO et al., 2003). Em 1973, foram iniciados os estudos de
análise do controle metabólico, e em 1974 Wallen e Rohwedder
identificaram outros monômeros além do ácido 3-hidroxibutírico, como
poli(3-hidroxivalerato) em águas residuárias (ANDERSON e DAWES,
1990).
Em 1976, a empresa Imperial Chemical Industries iniciou a
avaliação do PHB, objetivando sua produção e comercialização, porém
os primeiros resultados demonstraram que era um material de dureza
elevada e quebradiço. Assim, em 1980, foi depositada a patente
descrevendo o processo de produção Biopol® (copolímero PHBV), a
partir da bactéria Cupriavidus necator (anteriormente Ralstonia
eutropha). E em 1990, foi lançado o primeiro produto comercial
baseado em PHAs; era um frasco de shampoo da Wella, na Alemanha
(BYROM, 1992; BRAUNEGG et al., 1998). Entre 1982 e 1988, as
empresas Chemie Linz e Petroquímica Danúbia produziram PHB a
partir de sacarose, e em 1991 iniciou-se a produção piloto de 2
toneladas/ano (BIOMER, 2009).
Em 1992, teve início no Brasil o desenvolvimento de tecnologia
para produção de bioplásticos empregando matéria-prima de baixo
custo, como a cana-de-açúcar, por meio da parceria entre
COPERSUCAR, Instituto de Pesquisas Tecnológicas e Universidade de
São Paulo (VASCONCELOS, 2002). Em 1996, a empresa Monsanto
adquiriu o processo de produção do BIOPOL®, focando suas
investigações em culturas geneticamente modificadas, e, em 2001, o
processo BIOPOL® foi vendido para a US Biotechnology Company
Metabolix, empresa que comercializa e investe em pesquisas para
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
6
produção de bioplástico a partir de fontes renováveis de carbono
(METABOLIX, 2009).
Em 2000, a empresa brasileira PHB Industrial S.A. começou a
produção em maior escala do bioplástico, denominado BioCycle®, o
qual é produzido a partir de sacarose extraída da cana-de-açúcar. Os
estudos de fermentação para a produção de polímero iniciaram-se em
1992, e em 1995 foi implantada uma planta piloto para testar a rota de
produção desenvolvida em laboratório, com capacidade de 5
toneladas/ano. Já em 2000, a estrutura foi adequada para produção de 50
toneladas/ano, e a próxima etapa da empresa é o desenvolvimento e
implantação de uma planta comercial de produção com capacidade de
30.000 toneladas/ano (PHB INDUSTRIAL, 2009).
3.1.2. Características e propriedades
Polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros acumulados
intracelularmente por microrganismos em forma de grânulos, os quais
constituem reserva de carbono e energia para estas células; usualmente,
são sintetizados mediante limitação de um nutriente essencial ao
crescimento bacteriano, como nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio, e o
excesso de carbono no meio onde o microrganismo se desenvolve. Estes
polímeros possuem propriedades similares a vários termoplásticos
sintéticos, como o polipropileno, podendo, desta forma, substituí-lo,
além do que são completamente degradados à água e dióxido de
carbono, sob condições aeróbias, e a metano sob condições anaeróbias,
por microrganismos presentes no solo, mar, lagos e esgoto (LEE et al.,
1999; REDDY et al., 2003; STEINBÜCHEL e FÜCHTENBUSCH,
1998).
Os PHAs são poliésteres compostos por monômeros de ácidos
3-hidroxialcanóicos. A Figura 1 apresenta a estrutura química geral de
unidade monomérica de PHA, sendo os diferentes polímeros e
copolímeros representados pelos diferentes tipos de radical R e número
de “n”.
Revisão Bibliográfica
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7
Figura 1. Estrutura geral dos polihidroxialcanoatos (LEE, 1996a).
O radical R pode variar de um único átomo de H até tridecil
(C
13
), podem conter insaturações, grupos aromáticos ou ainda ligações a
elementos como flúor, cloro e cromo. Os PHAs possuem cadeias
lineares, sendo que a polimerização acontece devido à ligação entre o
grupamento carboxila de um monômero e o grupamento hidroxila de
outro monômero, formando, então, o poliéster (MADISON e
HUISMAN, 1999; LUENGO et al., 2003).
Os PHAs são polímeros que apresentam 10
3
a 10
4
monômeros,
acumulados na forma de inclusões, com diâmetro variando entre 0,2 e
0,7 µm, as quais são sintetizadas e armazenadas por bactérias gram-
positivas e gram-negativas (MADISON e HUISMAN, 1999). Os
grânulos acumulados pelas bactérias são envoltos por uma camada
fosfolipídica, por polimerases, depolimerases e proteínas citosólicas não
específicas. Embora a função da monocamada fosfolipídica ainda não
esteja clara, supõe-se que ela seja necessária para evitar o contato dos
PHAs com a água, evitando assim a formação de grânulos com uma
forma cristalina mais estável, o que impediria a sua degradação posterior
pelas depolimerases (LUENGO et al., 2003). As depolimerases são
responsáveis pela degradação do polímero para a sua utilização como
fonte de energia, e, após extraído com solventes orgânicos, o polímero
Revisão Bibliográfica
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8
se torna altamente cristalino, e então as depolimerases ficam inativas
(YOO et al., 1997; STUBBE et al., 2005).
PHAs são divididos em três grupos de acordo com o
comprimento da cadeia da unidade monomérica principal: i)
polihidroxialcanoatos de cadeia curta (PHA
SCL
– short chain length
PHA), unidades monoméricas contendo de 3 a 5 átomos de carbono; ii)
polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHA
MCL
– medium chain length
PHA), contendo de 6 a 14 átomos de carbono; iii) polihidroxialcanoatos
de cadeia longa (PHA
LCL
– long chain length PHA), com mais de 14
átomos de carbono. PHA
MCL
possuem características próximas dos
termoplásticos, enquanto que as características dos PHA
SCL
aproximam-
se às dos polímeros termofixos (TIMM e STEINBÜCHEL, 1990;
MADISON e HUISMAN, 1999).
As diferenças entre os polímeros dependem da bactéria
utilizada, dos substratos e suplementos fornecidos e das condições de
cultivo, o que explica uma grande variedade de poliésteres que pode ser
sintetizada com diferentes composições poliméricas. Mais de 150
diferentes tipos de ácidos hidroxialcanóicos (HAs), naturais e sintéticos,
foram caracterizados como constituintes dos PHAs. Desta forma, a
variação do comprimento, da composição e a habilidade de modificar os
substituintes da cadeia lateral são a base para a diversidade de PHAs
existentes, permitindo uma extensa gama de aplicações. No entanto,
poucos PHAs são produzidos em quantidades suficientes para
caracterização e desenvolvimento de aplicações (LEE, 1996a; REHM,
2003; STEINBÜCHEL e EVERSLOH, 2003; GURIEFF e LANT,
2007).
O primeiro PHA descrito, sendo o mais estudado e melhor
caracterizado, é o poli(3-hidroxibutirato) [P(3HB) ou PHB]. O
homopolímero PHB é um poliéster largamente encontrado devido ao
grande número de bactérias, tanto gram positivas bem como gram
negativas, produtoras deste polímero, o qual pode ser produzido a partir
de fontes simples de carbono, como sacarose, glicose e frutose.
Entretanto, o PHB é um material rígido e quebradiço. Por isso, várias
pesquisas concentram-se em estabelecer condições ótimas e de baixo
custo para a produção de copolímeros, como P[3HB-co-3HV] - poli(3-
hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato). O P[3HB-co-3HV] é um
copolímero que apresenta, além das unidades de HB, unidades repetidas
de 3HV. A introdução de unidades de HV reduz a dureza, cristalinidade
e o ponto de fusão do copolímero, comparativamente ao homopolímero,
o que lhe confere aumento da flexibilidade e elasticidade (LEE et al.,
1999; DU et al., 2001; KHANNA e SRIVASTAVA, 2005).
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9
As propriedades dos PHAs estão diretamente relacionadas à
composição química, à estrutura e peso molecular do polímero, e estas
propriedades ao tipo de microrganismo produtor, bem como ao substrato
carbônico fornecido e às condições de cultivo. Alguns destes aspectos
serão tratados mais adiante, neste trabalho.
Os PHAs são termoplásticos que apresentam alto grau de
polimerização, são altamente cristalinos, opticamente ativos e insolúveis
em água, o que lhes confere propriedades plásticas que se comparam às
dos plásticos derivados do petróleo. Suas propriedades físicas estão
associadas ao tamanho das cadeias laterais do monômero, sendo que
PHASCL são frequentemente rígidos e quebradiços, enquanto
PHAMCL são elastoméricos (REDDY et al., 2003; SOLAIMAN et al.,
2008). A massa molecular dos PHAs pode variar de 50 a 1000 kDa
(MADISON e HUISMAN, 1999).
Considerando o PHB, este possui propriedades mecânicas
desejáveis, tais como elevada cristalinidade (55–80%), resistência à
mistura, resistência à água, pureza óptica, boa estabilidade à radiação
ultravioleta, barreira à permeabilidade de gases, biocompatibilidade, alta
regularidade da cadeia carbônica e elevada massa molecular. Entretanto,
é um material quebradiço devido a sua baixa estabilidade térmica e por
ser um material rígido. Por isso, os processos de produção de
copolímeros têm sido de grande interesse. Os copolímeros mais
estudados têm sido os que possuem unidades como 3-hidroxibutirato e
3-hidroxivalerato (PHBV), 3-hidroxibutirato e 3-hidroxihexanoato
(PHBHHx) e 3-hidroxibutirato e 4-hidroxibutirato [P(3HB-co-4HB)].
Estes copolímeros apresentam biodegradabilidade e biocompatibilidade,
possuindo propriedades mecânicas melhores do que as do PHB, como
pode ser observado na Tabela 1, em que o copolímero torna-se mais
flexível e resistente com a incorporação de 3HV (LEE, 1996a;
MADISON e HUISMAN, 1999; SUDESH et al., 2000; OJUMU et al.,
2004).
A introdução de unidades de ácido 3-hidroxivalérico (3HV) e 4-
hidroxibutírico (4HB) ao P(3HB) torna o copolímero mais flexível,
moldável e menos cristalino, possuindo menor ponto de fusão e maior
processabilidade do que o P(3HB) (MADISON e HUISMAN, 1999).
Revisão Bibliográfica
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10
Tabela 1. Comparação das propriedades físicas de alguns
polihidroxialcanoatos e do polipropileno .
Polímeros Temp.
fusão
(ºC)
Temp.
transição
Vítrea (ºC)
Cristalinidade
(%)
Alongamento
(%)
P(3HB)
177 2 70 5
P(3HB-co-
3HV)
80% HB/20%
HV
145
-1
56
50
P(3HB-co-
4HB)
84% 3HB/16%
4HB
150
-7
45
444
Polipropileno
176 -10 60 400
Fonte: Madison e Huisman, 1999
O ponto de fusão do P(3HB), 177ºC, indica baixa estabilidade,
pois o polímero se decompõe a aproximadamente 200ºC, temperatura
próxima à sua temperatura de fusão (SUDESH et al., 2000).
A temperatura de transição vítrea (Tg) está associada à região
amorfa dos polímeros e representa a temperatura em que a mobilidade
das cadeias moleculares se torna restrita pela coesão intermolecular. Em
temperaturas acima de Tg, as cadeias poliméricas podem adquirir
suficiente mobilidade para dar início ao processo de cristalização.
Abaixo de Tg, o material não tem energia interna suficiente para
permitir o deslocamento de uma cadeia com relação à outra, assim
desaparece a mobilidade das cadeias macromoleculares e o material
torna-se rígido. Portanto, os polímeros elastoméricos são aqueles com
Tg abaixo da temperatura ambiente (CANEVAROLO, 2002; SOUZA et
al., 2004). A incorporação de unidades de valerato ao copolímero
diminui a temperatura de transição vítrea, permitindo um maior
deslocamento das cadeias a temperaturas mais baixas, tornando o
material mais flexível.
O aumento da cristalinidade está associado a um maior aumento
da organização das cadeias dos polímeros, ocasionando aumento de
propriedades de densidade, rigidez, estabilidade dimensional, resistência
química e resistência à abrasão. A cristalinidade é dependente de
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11
características como peso molecular, em que cadeias de baixo peso
molecular favorecem uma maior cristalinidade; polímeros capazes de
formar ligações intermoleculares distribuídas ao longo da cadeia
favorecem um maior grau de cristalinidade; homopolímeros possuem
maiores condições de formar uma estrutura mais cristalina do que
copolímeros randômicos, já que os copolímeros possuem uma
distribuição não uniforme de forças intermoleculares (MARQUES et al.,
2002).
O alongamento dos polímeros se refere à sua flexibilidade,
desta forma, quanto menor a porcentagem de alongamento, mais
quebradiço é o material, apresentando baixa resistência à tração. Nota-se
um alongamento baixo do polímero P(3HB), o que é aumentado com a
formação de copolímeros, chegando-se próximo às características do
polipropileno quando há a incorporação de unidades de ácido 4-
hidroxibutírico (4HB) (MADISON e HUISMAN, 1999).
3.1.3. Microrganismos produtores
Como citado anteriormente, uma grande variedade de
microrganismos é capaz de produzir e acumular PHAs
intracelularmente. Produzem PHAs tanto bactérias gram positivas
quanto gram negativas presentes no solo, água e efluentes. No entanto, a
produção de PHAs só se torna economicamente viável quando ocorre
em quantidades suficientes para caracterização e desenvolvimento de
suas aplicações (ANDERSON e DAWES, 1990; GURIEFF e LANT,
2007).
A produção industrial de polihidroxialcanoatos requer a
utilização de bactérias que tenham elevada velocidade específica de
crescimento, que possam ser cultivadas utilizando substratos de baixo
custo e que acumulem alta concentração de polímeros em um período
relativamente curto de tempo. Desta forma, o microrganismo deve
acumular pelo menos 50% de sua massa celular em polímero
(RAMSAY, 1994).
Os microrganismos produtores de PHAs são divididos em dois
grupos, baseados nas condições de cultura: os dependentes e os não
dependentes de limitação de nutrientes para a indução da produção do
polímero. Em ambos os grupos, excesso de carbono é necessário. A
grande maioria dos microrganismos estudados pertence ao grupo
dependente de limitação de nutriente (p.e. nitrogênio, fósforo, oxigênio,
Revisão Bibliográfica
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12
enxofre) para acúmulo de PHA, sendo exemplos destes Cupriavidus
necator, Pseudomonas oleovorans e Chromobacterium violaceum.
Pertencentes ao outro grupo, citam-se Alcaligenes latus, Azotobacter
vinelandii e Escherichia coli recombinante, os quais acumulam
polímeros durante o seu crescimento, não necessitando de limitação
nutricional (LEE, 1996b).
Dos microrganismos estudados, capazes de sintetizar
biopolímeros, apenas alguns, atualmente, são considerados potenciais
para a produção em escala industrial, como Cupriavidus necator,
Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas oleovorans e
linhagens recombinantes de Cupriavidus necator, Escherichia coli e
Klebsiella aerogenes (LEE, 1996b).
Na Tabela 2 são apresentados alguns microrganismos, a
quantidade de PHA acumulada por eles, dependendo da fonte de
carbono, e sua composição química.
Tabela 2. Acúmulo de PHA por alguns microrganismos, sua fonte de
carbono e a composição do polímero.
Microrganismo Fonte de
Carbono
PHA Conteúdo
de PHA
(%)
Alcaligenes latus Sacarose P(3HB) 50
Azotobacter vinelandii Glicose P(3HB) 79,8
Chromobacterium
violaceum
Ácido valérico P(3HV) 62
Cupriavidus necator
Glicose
CO
2
Hidrolisado de
mandioca
Glicose+ácido
propiônico
P(3HB)
P(3HB)
P(3HB)
P(3HB)-
co-
P(3HV)
76
67,8
57,5
74
Pseudomonas oleovorans n-Octanoato
n-Octanoato
P(3HO)
P(3HHx)-
co-(3HO)
65
25
Escherichia coli
recombinante
Glicose P(3HB) 80,1
Klebsiella aerogenes
recombinante
Melaço P(3HB) 65
Fonte: Adaptado de LEE, 1996b.
Revisão Bibliográfica
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13
Cupriavidus necator tem sido o microrganismo mais estudado e
utilizado na produção industrial de PHA, já que apresenta elevados
valores de rendimento e velocidade de produção. Além disso, C. nector
cresce bem em meios mínimos, em várias fontes renováveis de carbono,
e acumula até 80% de seu peso seco em polímero. Industrialmente, C.
necator é amplamente utilizado para produção de PHA, em especial
P[3HB-co-3HV], em que é adicionado ao meio, durante a fase de
acúmulo, ácido propiônico, e a proporção de valerato incorporada é
dependente da razão de alimentação ácido propiônico/açúcar
(ANDERSON e DAWES, 1990; BYROM, 1992; KHANNA e
SRIVASTAVA, 2005).
Outra bactéria de destaque é a Azotobacter, que foi o primeiro
microrganismo a ser utilizado na síntese industrial de P(3HB), a partir
de sacarose e glicose, porém foi descartado pelo fato de produzir
paralelamente um polissacarídeo, dificultando o controle do processo e a
extração do polímero (BYROM, 1987).
Já Alcaligenes latus é um microrganismo capaz de sintetizar
PHA durante a sua fase de crescimento, o que o torna interessante; no
entanto, quando existe alguma limitação de nutriente, esta produção é
aumentada. Uma desvantagem é a sua sensibilidade aos precursores
utilizados na produção de copolímeros (CHOI e LEE, 1999a; RAMSAY
et al., 1990).
Pseudomonas oleovorans é capaz de sintetizar tanto PHAs de
cadeia média (PHAMCL) quanto de cadeia longa (PHALCL),
acumulando uma quantidade elevada de polímeros. As PHA sintases
deste microrganismo apresentam especificidade por hidroxiacil-CoA de
cadeia média, e estes substratos podem ser produzidos a partir da β-
oxidação de ácidos graxos (LEE, 1996a; COLIN et al., 2008).
Um microrganismo que também desperta grande interesse
devido ao seu potencial biotecnológico é Chromobacterium violaceum,
em especial no Brasil, onde foi realizado o sequenciamento do seu
genoma, por um consórcio de laboratórios. Destaca-se também por ser
capaz de sintetizar o homopolímero de 3-hidroxivalerato
(polihidroxivalerato ou PHV), quando cultivado na presença de valerato
como única fonte de carbono, e concentrações limitantes de nitrogênio,
bem como produz outros tipos de PHAs (STEINBÜCHEL et al., 1993;
BRAZILIAN NATIONAL GENOMA PROJECT CONSORTIUM,
2003).
Outro microrganismo também com grande potencial é
Escherichia coli recombinante, bactéria que tem seu genoma e fisiologia
bem caracterizados, o que facilita sua manipulação genética e
Revisão Bibliográfica
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14
desenvolvimento de estratégias de engenharia metabólica. Existem
trabalhos com E. coli recombinante contendo genes para a biossíntese de
PHA de C. necator, sendo capaz de acumular alto conteúdo de
polímero, sem necessidade de limitação nutricional, durante seu
crescimento (LEE, 1996a; LI et al., 2007; FONSECA, 2003).
3.1.3.1. Bacillus
Dentre os microrganismos produtores de PHA, existem também
os Bacillus, encontrados comumente no ambiente, porém, diante da
variedade de espécies existentes, ainda são pouco explorados. Bacillus
apresentam características desejáveis para a produção de PHA, como o
curto tempo de geração, crescem facilmente até alcançar uma alta
densidade celular, utilizam fontes de carbono e nitrogênio de baixo
custo, são capazes de secretar grande quantidade de enzimas, e são bons
“hospedeiros” para expressão de genes heterólogos (LAW et al., 2003).
Membros do gênero Bacillus, assim como vários outros
microrganismos produtores de PHA, produzem também copolímeros
contendo unidades de 3HB e 3HV, quando cultivadas em substratos
como ácido propiônico. Na Tabela 3 são apresentadas algumas espécies
de Bacillus estudadas quanto à sua capacidade de acumular PHA.
A síntese de PHB por Bacillus cereus linhagem T inicia-se após
o término da fase logarítmica, atingindo o acúmulo máximo até a
formação do esporo, e ocorre degradação durante o processo de
esporulação (VALAPPIL et al., 2007b). Já em B. megaterium, durante a
fase estacionária, os grânulos de polímeros decaem em tamanho e
número por célula (MCCOOL et al., 1996). Slepecky e Law (1961)
verificaram as condições e a relação entre a produção de polímero e a
formação de esporos em duas linhagens da bactéria B. megaterium,
sendo uma formadora de esporo e outra que não esporula (B.
megaterium KM). Quando a linhagem que esporula é cultivada em meio
que favorece a formação de polímero, não há praticamente formação de
esporo, e a produção e utilização do polímero seguem a cinética similar
da linhagem que não forma esporos, porém com rendimento menor. Em
meio favorável à formação de esporos, menor quantidade de polímero é
produzida e uma rápida utilização deste polímero precede a esporulação.
Revisão Bibliográfica
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15
Tabela 3. Acúmulo de PHA por alguns Bacillus.
Microrganismo Fonte de
Carbono
Unidades
Monoméricas
Conteúdo de
PHA (%)
Bacillus sp. JMa5 Melaço 3HB 35
B. circulans
DSM1529
Acetato
Ácido
propiônico
3HB
3HB, 3HV
43,7
6,8
B. sphaericus Sacarose 3HB 30,2
B. brevis Sacarose 3HB 32,1
B. licheniformis
DSM394
Acetato
Ácido
propiônico
3HB
3HB, 3HV
25,8
6,2
B.
amyloliquefaciens
DSM7
Acetato
Ácido
propiônico
3HB
3HB, 3HV
17,0
5,1
B. laterosporus
DSM335
Acetato
Ácido
propiônico
3HB
3HB, 3HV
29,5
5,0
B. macerans
DSM7068
Acetato
Ácido
propiônico
3HB
3HB, 3HV
40,5
4,7
B. subtilis DSM10 Acetato
Ácido valérico
3HB
3HB, 3HV
33,5
6,6
B. thuringiensis
DSM2046
Acetato
Ácido
propiônico
3HB
3HB, 3HV
47,6
7,2
B. mycoides
DSM2048
Acetato
Ácido
propiônico
3HB
3HB, 3HV
44,7
7,5
B. mycoides
RLJB107
Sacarose 3HB 69,4
B. megaterium
DSM90
Acetato
Ácido
propiônico
3HB
3HB, 3HV
47,2
8,2
B. cereus DSM31 Acetato
Ácido
propiônico
3HB
3HB, 3HV
41,4
7,3
B. cereus
ATCC14579
Hexanoato 3HB, 3HHx 2,2
Fonte: Adaptado de VALAPPIL et al., 2007a.
Revisão Bibliográfica
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16
Informações genéticas de B. megaterium têm sido utilizadas
para o desenvolvimento de uma linhagem capaz de autorromper-se, em
resposta à exaustão de substrato, durante a produção de PHB (HORI et
al., 2002). Além disso, genes de B. megaterium, para a produção de
PHB, estão sendo inseridos com sucesso em B. subtilis (LAW et al.,
2003).
Sabe-se que um dos fatores limitantes para a comercialização
de PHA é o custo do substrato para sua produção, por isso é possível
observar inúmeras pesquisas com a utilização de substratos de baixo
custo, como é o caso do uso de melaço de cana para a produção de
P(3HB) por B. megaterium, apresentando um rendimento de 46,2% de
P(3HB) sobre o peso seco da biomassa (GOUDA et al., 2001).
Omar e colaboradores (2001) cultivaram B. megaterium
utilizando como fonte de carbono xarope de tâmaras e melaço de
beterraba, e obtiveram um acúmulo de 52% e 50%, respectivamente.
Além disso, verificaram que o acúmulo de P(3HB) neste microrganismo
está associado ao crescimento celular.
Já Bacillus sp. JMa5 cultivado em melaço acumulou 35% de
P(3HB) sobre o peso seco (WU et al., 2001). Borah e colaboradores
(2002) estudaram a influência das condições nutricionais e do ambiente
para o acúmulo de P(3HB) em B. mycoides, o que indicou que sacarose,
extrato de carne e sulfato de amônio são elementos importantes para o
crescimento e acúmulo de polímero, obtendo rendimento de 69,4% de
P(3HB) sobre o peso seco da biomassa. B. cereus acumulou 40,3% de
polímero (75% de 3HB e 25% de 4HB) quando crescido em meio com
frutose (VALAPPIL et al., 2007c).
3.1.4. Biossíntese
O metabolismo dos microrganismos é direcionado,
principalmente, de acordo com o meio em que são cultivados.
Considerando um crescimento balanceado, o microrganismo utilizará o
substrato como fonte de energia e/ou para manutenção/formação de
material celular; já quando existe limitação de nutriente essencial e
excesso de carbono no meio, o substrato carbônico é utilizado para
formação de biopolímeros, estocados como reserva de energia para a
célula (Figura 2).
Revisão Bibliográfica
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17
Figura 2. Metabolismo em crescimento balanceado e em condição de
limitação de nutriente e excesso de carbono (Adaptado de BYROM,
1987).
A via de biossíntese de P(3HB) consiste em três reações
catalisadas enzimaticamente (Figura 3). A primeira reação consiste na
condensação de duas moléculas de acetil coenzima-A (acetil-CoA) em
acetoacetil-CoA, catalisada pela enzima β-cetotiolase (codificada pelo
gene phbA). A segunda reação é a redução de acetoacetil-CoA para
hidroxibutiril-CoA, catalisada por uma enzima NADPH-dependente:
acetoacetil-CoA redutase (codificada pelo gene phbB). E finalmente,
monômeros de hidroxibutiril-CoA são polimerizados em P(3HB) pela
PHB polimerase, codificada pelo gene phbC (REDDY et al., 2003).
O mecanismo de ação da enzima β-cetotiolase envolve duas
reações parciais, em que dois resíduos de cisteína fazem parte do sítio
ativo da enzima e são responsáveis pela ligação da primeira molécula de
acetil-CoA à enzima e pela ativação de uma segunda molécula de acetil-
CoA, ocorrendo a condensação e formação de acetoacetil-CoA
(MADISON e HUISMAN, 1999). A enzima acetoacetil-CoA redutase
catalisa a redução de acetil-CoA para D(-)3-hidroxiacil-CoA, e, apesar
de existirem dois tipos, apenas aquela que é dependente de NADPH é
envolvida na síntese de polímero, pois ela é ativa somente com
substratos de cadeia C
4
a C
6
D(-)3-hidroxiacil-CoA (STEINBÜCHEL et
al, 1993).
A PHB polimerase é considerada a enzima chave para o
acúmulo de P(3HB), pois catalisa o passo principal da via, a
polimerização de unidades D(-)-3-hidroxiacil-CoA, formando o
polímero. As PHB polimerases são classificadas em 4 tipos de acordo
com a especificidade ao substrato e a composição das subunidades
Substrato
Acetil-CoA
Crescimento
Balanceado
Energia
Material celular
PHA
Limitação de nutriente
Excesso de carbono
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
18
enzimáticas. Na Tabela 4 são apresentadas as diferentes PHB
polimerase.
Figura 3. Via de biossíntesse de poli(3-hidroxibutirato) (MADISON e
HUISMAN, 1999).
Grande parte dos microrganismos utiliza a via descrita
anteriormente (Figura 3) para síntese de P(3HB), no entanto alguns,
como é o caso de P. aeruginosa, utilizam o metabolismo dos ácidos
graxos para a síntese de PHAs, via β-oxidação dos ácidos graxos ou
metabolismo de novo de ácidos graxos, a partir dos quais os
hidroxialcanoatos intermediários são utilizados como substrato pela
PHB polimerase (STEINBÜCHEL e EVERSLOH, 2003).
Os genes de biossíntese de PHAs são arranjados em vários
clusters em diferentes bactérias. Entretanto, apesar das sequências das
enzimas serem bastante conservadas entre as espécies, o número de
genes envolvidos e a disposição dos mesmos nos grupos de genes
envolvidos diferem significativamente; por exemplo, em C. necator o
grupo de genes codificantes das três enzimas envolvidas na biossíntese
de P(3HB) formam um operon (como representado na Figura 3), porém
em outros microrganismos podem estar dispersos pelo genoma, como
em C. violaceum, em que os genes phaC (PHA sintase) e phaA (β-
cetotiolase) pertencem a um operon, e o gene phaB (acetoacetil-CoA
redutase) ocorre isoladamente no genoma (MADISON e HUISMAN,
1999; REHM e STEINBÜCHEL, 1999; KOLIBACHUK et al., 1999).
phbC
phbA
phbB
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
19
Tabela 4. Características dos diferentes tipos de PHB polimerase.
Tipo de
PHB
polimerase
Subuni-
dades
Substra-
to
Exemplos de
microrganis-
mos
Referência
I PhaC
(61-
73KDa)
Monôme-
ros de
cadeia
curta (C
3
-
C
5
)
C. necator SLATER et
al., 1988
II PhaC
(61-
73KDa)
Monôme-
ros de
cadeia
média
(C
6
-C
14
)
P. oleovorans e
P. aeruginosa
HUISMAN
et al., 1991
III PhaC
(40KDa)
PhaE
(40KDa)
Monôme-
ros de
cadeia
curta (C
3
-
C
5
)
Allochromatium
vinosum e
Thiocapsa
violacae
LIEBERGE-
SELL et al.,
2000
IV PhaC
(40KDa)
PhaR
(20KDa)
Monôme-
ros de
cadeia
curta (C
3
-
C
5
)
Bacillus
megaterium
MCCOOL e
CANNON,
2001
A PHB polimerase (phbC) é capaz de incorporar diversos
precursores de cadeia curta, como por exemplo, 3-hidroxibutiril-CoA, 3-
hidroxipropionil-CoA, 3-hidroxivaleril-CoA, bem como 4-
hidroxibutiril-CoA. Quando o tipo de substrato utilizado permite ao
metabolismo a formação de 3-hidroxivaleril-CoA, tem-se a formação do
copolímero PHBV (Figura 4). A fração de 3HB e 3HV no copolímero
pode ser manipulada alterando a concentração de propionato ou de
glicose no meio de cultura (LI et al., 2007).
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
20
Figura 4. Via de biossíntese de PHB e de PHBV a partir de glicose e
propionato (DOI et al., 1990).
Em geral, a regulação do metabolismo de PHA ocorre com a
ativação da expressão dos genes phaABC, devido a um sinal específico,
como o esgotamento de nutrientes, levando à ativação da enzima PHA
sintase e à inibição de enzimas das vias metabólicas que competem
pelos intermediários da biossíntese do polímero (LUENGO et al., 2003).
Alta concentração de acetil-CoA é necessária para que ocorra a
síntese de P(3HB), por outro lado, a alta concentração de coenzima
(CoA) livre, liberada quando o acetil-CoA entra no Ciclo de Krebs
(TCA), inibe a ação da 3-β-cetotiolase, inibindo a síntese do polímero.
A síntese é estimulada também pela alta concentração de NADPH e pela
alta razão NADPH/NADP, obtidas em condições de limitação de
nutrientes (LEE e CHANG, 1995). A limitação nutricional de oxigênio
aumenta a relação NADH/NAD
+
por não existir o aceptor final de
elétrons na cadeia respiratória, levando à formação de P(3HB). Sob
limitação de nitrogênio, as células não produzem mais proteínas e ocorre
acúmulo de ATP, provocando diminuição da fosforilação oxidativa e
acúmulo das coenzimas reduzidas (NADH), que leva à formação de
P(3HB), cuja via metabólica reoxida estas coenzimas (DAWES e
SENIOR, 1973). Já o fosfato é um componente vital para muitas
estruturas celulares como ácidos nucléicos e fosfolipídeos, além de estar
envolvido na energética celular (ASENJO et al., 1995).
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
21
3.1.5. Biodegradabilidade
Microrganismos como bactérias e fungos estão envolvidos no
processo de degradação tanto de bioplásticos como plásticos sintéticos.
A biodegradação ocorre em diferentes condições do ambiente, de acordo
com suas características, e cada microrganismo capaz de degradar
materiais difere um do outro, devido às suas condições ótimas de
crescimento no ambiente (LUCAS et al., 2008; SHAH et al., 2008).
O processo de biodegradação é dependente de diferentes
fatores, tais como: características dos polímeros, tipo de microrganismo
degradador, existência de algum pré-tratamento do polímero e condições
ambientais. As características dos polímeros como mobilidade,
cristalinidade, peso molecular, tipo dos grupos funcionais presentes na
estrutura, e presença de aditivos afetam diretamente a degradação
(ARTHAM e DOBLE, 2008; GU et al., 2003).
Vários microrganismos são hábeis para degradar PHAs por
meio da produção de enzimas com atividades de PHA hidrolases e PHA
depolimerases. A degradação enzimática do polímero é uma reação
heterogênea que envolve duas etapas, a adsorção e a hidrólise. A etapa
inicial consiste na adsorção da enzima à superfície do polímero, e a
etapa subsequente consiste na hidrólise das cadeias poliméricas,
realizada no sítio ativo das enzimas (SUDESH et al., 2000; KHANNA e
SRIVASTAVA, 2005).
Em geral, um aumento no peso molecular resulta no declínio da
biodegradabilidade do polímero pelos microrganismos. Polímeros com
alto peso molecular resultam em diminuição da solubilidade, tornando-
os desfavoráveis ao ataque microbiano, pois a bactéria deverá hidrolisar
o polímero a oligômeros ou monômeros que serão assimilados através
da membrana celular e, então, degradados por enzimas intracelulares.
Durante a degradação, enzimas extracelulares produzidas pelos
microrganismos primeiramente quebram os polímeros complexos
formando moléculas menores, para que, então, possam ser transportados
pela membrana semi-permeável, e utilizados como fonte de carbono e
energia (DOI et al,, 1990; GU et al., 2003).
Os grupos de microrganismos dominantes e as vias de
degradação são frequentemente determinadas pelas condições do
ambiente. Quando O
2
está disponível, microrganismos aeróbios são os
responsáveis pela degradação dos materiais, com formação de biomassa,
CO
2
e H
2
O como produtos finais. Por outro lado, em condições
anaeróbias, a degradação ocorrerá por conta dos microrganismos
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
22
anaeróbios, e os produtos serão biomassa, CO
2
, CH
4
e H
2
O (BARLAZ et
al., 1989).
Na tabela 5 é apresentado o tempo necessário para a degradação
completa de um filme de 1mm de P[3HB-co-3HV] em diferentes
ambientes.
Tabela 5. Biodegradação de um filme de P(3HB-co-3HV) (80%
HB/20% HV).
Ambiente Número de semanas necessárias para
100%de perda de massa
Ambiente anaeróbio 6
Sedimentos de estuários 40
Ambiente aeróbio 60
Solo 75
Água do mar 350
Fonte: Luzier, 1992
3.1.6. Produção Industrial
Embora sejam apresentadas todas as vantagens de utilização dos
bioplásticos, o acesso a estes ainda é muito restrito, especialmente
devido ao seu elevado custo quando comparado aos plásticos
convencionais, e a grande maioria dos consumidores não está disposta a
pagar valores elevados em prol da biodegradabilidade e sustentabilidade
dos produtos. Desta forma, é de extrema importância a redução dos
custos de produção.
Os fatores que influenciam diretamente nos custos de produção
são: uso de linhagens eficientes, a produtividade, a conversão de
substrato em produto, o conteúdo total de polímero acumulado, a
complexidade da tecnologia empregada, o capital investido na planta de
produção, o processo de extração e o custo do substrato (CHOI e LEE,
1999b).
A produtividade é definida como a quantidade de PHA produzida
por unidade de volume em uma unidade de tempo, e avaliações
econômicas mostram que o aumento da produtividade provoca uma
redução dos custos de capital fixo direto, mão-de-obra e equipamentos.
Já o conteúdo de PHA acumulado afeta fortemente a eficiência do
processo de recuperação, pois quanto maior o conteúdo de polímero,
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
23
menor é a quantidade utilizada do produto de digestão para separar os
grânulos de PHA de células, além de que baixo conteúdo de PHA leva à
grande quantidade de substrato desviado para outros materiais celulares
e vias metabólicas (CHOI e LEE, 1999b).
Outro ponto importante para os custos de produção é a extração
do polímero. Para a extração, é necessário um processo de quebra da
célula e solubilização dos outros materiais celulares que não o PHA para
obtenção de polímeros puros. A maioria dos processos de extração
utiliza solventes orgânicos como clorofórmio, carbonato de propileno e
dicloroetano, e, como são necessárias grandes quantidades destes
solventes, tem-se um aumento do custo e geram-se danos ao meio
ambiente. Pode-se também fazer uso de hipoclorito de sódio, no entanto
ocorre degradação de P(3HB), podendo resultar em 50% de redução da
massa molar, embora o uso de surfactantes reduza significativamente
esta degradação (LEE, 1996a). Outros métodos envolvem o uso de
enzimas, que, embora eficientes, resultam na elevação do custo (CHOI e
LEE, 1999b).
É importante, ainda, a obtenção de linhagens altamente eficientes
na conversão dos substratos no produto desejado, por isso são
necessários estudos para exploração de microrganismos produtores de
PHA, e estudos de bioquímica e biologia molecular para biossíntese do
polímero, além da clonagem de genes de síntese de PHA, permitindo o
desenvolvimento de bactérias recombinantes com capacidade superior
de produção (KHANNA e SRIVASTAVA, 2005; KHARDENAVIS et
al., 2007).
Provavelmente, o ponto mais crítico para o custo do processo de
produção de polímeros é o custo do substrato utilizado, podendo atingir
até 40% do custo total. Por isso, existem diversos estudos a fim de
explorar e otimizar a produção de PHAs a partir de fontes renováveis de
carbono de baixo custo (LEE et al., 1999).
Na Tabela 6 é apresentada uma comparação entre alguns
substratos, o seu valor e o rendimento de P(3HB), indicando o impacto
da escolha do substrato no custo final de produção do polímero.
Produtos como melaço de cana e beterraba, soro de leite, óleos
vegetais, hidrolisados de amido e bagaço de maçã são vistos como
excelentes substratos pelo seu baixo custo, sendo, na maioria das vezes,
resíduos de indústrias. Sua utilização como matéria-prima para outros
processos contribui, então, com o meio ambiente. Entretanto, a
utilização de tais substratos pode levar à diminuição do conteúdo de
polímero acumulado e da produtividade, quando comparado à utilização
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
24
de carbono purificado. Este problema tem sido objeto de inúmeros
estudos (LEE, 1996b).
Tabela 6. Efeito do custo do substrato e do rendimento de P(3HB) no
custo de produção.
Substrato Valor do
substrato
(US$/Kg)
Rendimento
(g polímero/g
substrato
Custo
de produção
(US$/Kg
P(3HB))
Glicose
0,493
0,381 1,30
Sacarose
0,290 0,40 0,72
Metanol
0,180 0,43 0,42
Ácido acético
0,595 0,38 1,56
Etanol
0,502 0,50 1,00
Melaço de cana
0,220 0,42 0,22
Soro de queijo
0,071 0,33 0,22
Hidrolisado de
hemicelulose
0,069 0,20 0,34
Fonte: MADISON e HUISMAN, 1999
Dentre os substratos de baixo custo, pode-se destacar o resíduo
amiláceo, que é uma fonte de carbono disponível em grandes
quantidades, e que são os principais componentes da demanda
bioquímica de oxigênio de efluentes de indústrias têxteis, fermentativas
e de alimentos e bebidas (CEREDA e WOSIACKI, 2002). Alguns
microrganismos não possuem a capacidade de assimilar o amido
diretamente, por isso é necessária a hidrólise à glicose antes do processo
fermentativo (KIM, 2000).
Dentre produtos amiláceos, a mandioca se destaca por ser de
grande relevância econômica como principal fonte de carboidratos para
milhões de pessoas, e o Brasil possui aproximadamente dois milhões de
hectares, destacando-se como um dos maiores produtores mundiais, com
produção de 23 milhões de toneladas de raízes frescas de mandioca.
Concentram-se no país diversas empresas de processamento de
mandioca, e consequentemente são geradas também grandes quantidade
de resíduo durante o processo (CEREDA, 1997; VIEIRA, 2005).
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
25
Uma alternativa proposta também para a redução de custos para
produção de biopolímeros é o uso de culturas mistas, como lodo ativado,
permitindo reduzir gastos com esterilização, equipamentos, mecanismos
de controle e fontes de carbono. Estes processos encontram-se em fase
de otimização (PIJUAN et al., 2009, HARDING et al., 2007).
3.1.7. Aplicações
Inúmeras aplicações estão sendo descritas para os bioplásticos
desde que foi lançado o primeiro produto industrial Biopol® pela
Imperial Chemical Industries em 1980. Inicialmente eles eram utilizados
para a manufatura de garrafas, fibras, filmes e diversos produtos de
interesse agrícola e de embalagens. Atualmente existe uma expansão
crescente do uso destes polímeros, visto que são biodegradáveis e
biocompatíveis, não causando efeitos tóxicos no hospedeiro, o que os
coloca em uma posição de vantagem em relação aos produtos sintéticos
convencionais (STEINBÜCHEL e FÜCHTENBUSCH, 1998;
LUENGO, 2003).
Filmes de PHA podem ser aplicados em papel ou papelão
formando uma película impermeável, em substituição ao papelão com
polietileno ou alumínio, e também como utensílios, produtos de higiene,
frascos para cosméticos e copos (STEINBÜCHEL e
FÜCHTENBUSCH, 1998; KHANNA e SRIVASTAVA, 2005).
Por serem polímeros biocompatíveis e não tóxicos, podendo ser
facilmente absorvidos e metabolizados pelo organismo, os PHAs têm
demonstrado uma larga aplicabilidade também na área médica, como
matéria-prima para a fabricação de materiais utilizados em intervenções
cirúrgicas e outros procedimentos, incluindo próteses ósseas, substratos
para o desenvolvimento celular in vitro e in vivo, além de fios de sutura,
reparo de cartilagem articular e material para reconstituição de vasos
sangüíneos (HASIRCI et al., 2001; CHEN e WU, 2005). Recentemente,
TephaFLEX®, uma sutura reabsorvível baseada no poli(4-
hidroxibutirato), foi aprovada pelo FDA (US Food and Drug
Administration) para aplicações clínicas (LI et al., 2008).
Os PHAs podem atuar também como carreadores
biodegradáveis para liberação
gradual de diversos fármacos, medicamentos, hormônios, inseticidas e
herbicidas. A utilização de PHAs para liberação gradual de antibióticos,
por exemplo, é particularmente útil no controle de infecções e formação
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
26
de biofilmes que podem ocorrer em implantes de próteses (HASIRCI et
al., 2001; REDDY et al., 2003).
É possível notar que o uso de embalagens de alimentos feitas
com plásticos de origem petroquímica continua em ascensão, devido ao
seu baixo custo e características desejáveis, como flexibilidade, barreira
para O
2
, CO
2
, entre outras. No entanto, despertou-se a atenção para o
fato de que estas embalagens não podem ser totalmente recicladas e/ou
biodegradadas, além de que são facilmente contaminadas por
microrganismos, por isso a reciclagem, muitas vezes, é impraticável e
não é economicamente conveniente. Desta forma, o uso de plásticos
biodegradáveis se torna a solução também para estes problemas
(SIRACUSA et al., 2008).
Material e Métodos
__________________________________________________
27
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Meios de cultura empregados
Para realização dos experimentos, foi utilizado, nos primeiros
ensaios de seleção dos microrganismos, o meio M9 – Sais Mínimos
(Sigma) (Tabela 7), apenas para avaliar o crescimento dos isolados em
meio com amido (5g/L) e resíduo do processamento de mandioca
(5g/L). Nos demais ensaios, foram utilizadas duas pré-culturas, uma em
sequência da outra, sendo a primeira em meio Luria-Bertani (LB)
(Tabela 8) e a segunda em meio descrito por Ramsay e colaboradores
(1990), sem limitação de nutrientes, e com 20g/L de resíduo de
mandioca, e este mesmo meio, agora limitado, foi utilizado como meio
para os ensaios de produção de PHA. Na Tabela 9 é apresenta a
constituição do meio descrito por Ramsay e colaboradores (1990).
Tabela 7. Elementos constituintes do meio M9 (g/L).
Elementos g/L
Na
2
HPO
4
. 7H
2
0 6,78
KH
2
PO
4
3,0
NaCl 0,5
NH
4
Cl 1,0
Tabela 8. Elementos constituintes do meio LB (g/L).
Elementos g/L
Triptona 10
Extrato de levedura 5
NaCl 10
Material e Métodos
__________________________________________________
28
Tabela 9. Elementos constituintes do meio descrito por Ramsay e
colaboradores (1990) (g/L).
Meio sem limitação (pré-cultura):
Elementos g/L
Na
2
HPO
4
. 7H
2
0 6,7
KH
2
PO
4
1,5
(NH
4
)
2
SO
4
1,0
MgSO
4
. 7H
2
0 0,2
CaCl
2
0,01
Citrato de amônio ferroso 0,06
Elementos traços 1 mL
Meio limitado:
Elementos g/L
Na
2
HPO
4
. 7H
2
0 2,5g
KH
2
PO
4
0,83g
(NH
4
)
2
SO
4
1,0
MgSO
4
. 7H
2
0 0,2
CaCl
2
0,01
Citrato de amônio ferroso 0,06
Elementos traços 1 Ml
Elementos traços:
Elementos g/L
H
3
BO
3
0,3
CoCl
2
. 6 H
2
0 0,2
ZnSO
4
. 7 H
2
0 0,1
MnCl
2
. 4 H
2
0 0,03
NaMoO
4
. 2 H
2
0 0,03
NiCl
2
. 6 H
2
0 0,02
CuSO
4
. 5 H
2
0 0,01
4.2. Coleção de microrganismos avaliada
Os microrganismos avaliados foram provenientes da coleção do
Laboratório de Microbiologia Aplicada (LAMA) da Universidade do
Material e Métodos
__________________________________________________
29
Vale do Itajaí (UNIVALI), partindo-se de 72 isolados de Bacillus,
Paenibacillus e Geobacillus pertencentes a 21 espécies diferentes
(Tabela 10). Os microrganismos foram identificados em Trabalhos de
Conclusão de Curso da Graduação em Ciências Biológicas, sob
orientação do prof. Marcus Adonai Castro da Silva.
Tabela 10. Microrganismos avaliados da coleção do Laboratório de
Microbiologia Aplicada/UNIVALI.
Código Espécie
Referência
LAMA002 Bacillus cereus WEINGARTNER, 2005
LAMA032 Bacillus cereus WEINGARTNER, 2005
LAMA055 Bacillus cereus WEINGARTNER, 2005
LAMA100 Bacillus cereus WEINGARTNER, 2005
LAMA102 Bacillus cereus WEINGARTNER, 2005
LAMA113 Bacillus cereus RIBEIRO, 2007
LAMA135 Bacillus cereus PEREIRA, 2005
LAMA142 Bacillus cereus PEREIRA, 2005
LAMA159 Bacillus cereus PEREIRA, 2005
LAMA167 Bacillus cereus PEREIRA, 2005
LAMA169 Bacillus cereus PEREIRA, 2005
LAMA174 Bacillus cereus PEREIRA, 2005
LAMA176 Bacillus cereus PEREIRA, 2005
LAMA180 Bacillus cereus PEREIRA, 2005
LAMA258 Bacillus cereus OLIVEIRA, 2007
LAMA260 Bacillus cereus OLIVEIRA, 2007
LAMA091 Bacillus ehimensis WEINGARTNER, 2005
LAMA190 Bacillus ehimensis WEINGARTNER, 2005
LAMA031 Bacillus firmus WEINGARTNER, 2005
LAMA018 Bacillus licheniformis WEINGARTNER, 2005
LAMA020 Bacillus licheniformis WEINGARTNER, 2005
LAMA062 Bacillus licheniformis WEINGARTNER, 2005
LAMA084 Bacillus licheniformis WEINGARTNER, 2005
LAMA259 Bacillus licheniformis OLIVEIRA, 2007
LAMA252 Bacillus megaterium OLIVEIRA, 2007
LAMA075 Bacillus mycoides WEINGARTNER, 2005
LAMA076 Bacillus mycoides WEINGARTNER, 2005
LAMA157
Bacillus mycoides
/pseudomycoides PEREIRA, 2005
Material e Métodos
__________________________________________________
30
(Continuação Tabela 10)
Código Espécie
Referência
LAMA054 Bacillus racemilacticus WEINGARTNER, 2005
LAMA083 Bacillus racemilacticus WEINGARTNER, 2005
LAMA086 Bacillus racemilacticus WEINGARTNER, 2005
LAMA092 Bacillus racemilacticus WEINGARTNER, 2005
LAMA090 Bacillus simplex WEINGARTNER, 2005
LAMA156 Bacillus smithii PEREIRA, 2005
LAMA023 Bacillus subtilis WEINGARTNER, 2005
LAMA095 Bacillus megaterium WEINGARTNER, 2005
LAMA146 Bacillus subtilis PEREIRA, 2005
LAMA148 Bacillus thuringiensis PEREIRA, 2005
LAMA098 Geobacillus kaustophilus WEINGARTNER, 2005
LAMA099 Geobacillus kaustophilus WEINGARTNER, 2005
LAMA139 Paenibacillus apiarius PEREIRA, 2005
LAMA149 Paenibacillus apiarius PEREIRA, 2005
LAMA151 Paenibacillus apiarius PEREIRA, 2005
LAMA181 Paenibacillus borealis PEREIRA, 2005
LAMA186 Paenibacillus borealis WEINGARTNER, 2005
LAMA262 Bacillus megaterium KITAMURA, 2007
LAMA272 Paenibacillus dendritiformis KITAMURA, 2007
LAMA273 Paenibacillus dendritiformis KITAMURA, 2007
LAMA274 Paenibacillus dendritiformis KITAMURA, 2007
CARLOS 32
Paenibacillus dendritiformis KITAMURA, 2007
LAMA073 Bacillus megaterium WEINGARTNER, 2005
LAMA094 Paenibacillus koreensis WEINGARTNER, 2005
LAMA097 Paenibacillus koreensis WEINGARTNER, 2005
LAMA261 Paenibacillus macquarensis KITAMURA, 2007
LAMA263 Paenibacillus macquarensis KITAMURA, 2007
LAMA264 Paenibacillus macquarensis KITAMURA, 2007
LAMA265 Bacillus megaterium KITAMURA, 2007
LAMA266 Paenibacillus macquarensis KITAMURA, 2007
CARLOS 10
Paenibacillus macquarensis KITAMURA, 2007
LAMA268 Paenibacillus macquarensis KITAMURA, 2007
LAMA051 Paenibacillus pallidus WEINGARTNER, 2005
CARLOS 12
Paenibacillus polymyxa KITAMURA, 2007
LAMA015 Paenibacillus polymyxa WEINGARTNER, 2005
Material e Métodos
__________________________________________________
31
(Continuação Tabela 10)
Código Espécie
Referência
LAMA050 Paenibacillus polymyxa WEINGARTNER, 2005
LAMA138 Paenibacillus polymyxa PEREIRA, 2005
LAMA184 Paenibacillus polymyxa WEINGARTNER, 2005
LAMA133 Paenibacillus thiaminolyticus PEREIRA, 2005
LAMA136 Paenibacillus thiaminolyticus PEREIRA, 2005
LAMA140 Paenibacillus thiaminolyticus PEREIRA, 2005
LAMA254 Paenibacillus thiaminolyticus OLIVEIRA, 2007
LAMA255 Paenibacillus thiaminolyticus OLIVEIRA, 2007
LAMA256 Paenibacillus thiaminolyticus OLIVEIRA, 2007
Estes microrganismos foram isolados de amostras ambientais e
classificados por meio de análises de suas características morfológicas,
de crescimento e bioquímicas, utilizando-se os métodos descritos por
Claus e Berkeley (1989). No total foram avaliadas 24 características
sendo estas: coloração de gram, produção de catalase e citocromo
oxidase, motilidade e diâmetro celular, morfologia e posição do esporo,
distenção da célula durante a esporulação, produção de ácido a partir da
glicose, frutose, manitol, maltose e xilose, utilização do citrato,
produção de acetoína pelo teste de Voges-Proskauer, hidrólise do amido,
da caseína, da uréia e da gelatina, crescimento em anaerobiose, a 20 ºC e
a 50 ºC, e redução do nitrato. A Tabela A.1 dos Anexos apresenta os
isolados e informações sobre onde foram coletados e a partir de qual
amostra.
4.3. Seleção dos microrganismos degradadores de amido
Inicialmente, todos os microrganismos foram repicados em meio
M9 (Sais Mínimos) sólido, contendo 5g/L de amido solúvel puro, como
única fonte de carbono. As placas foram incubadas a 37ºC, por 48h, e os
isolados avaliados quanto ao seu crescimento comparativamente, sendo
classificados em (1) sem crescimento, (2) pouco crescimento e (3) bom
crescimento.
Após 48h de cultivo, os microrganismos classificados com pouco
e bom crescimento foram novamente plaqueados em meio agar-M9,
tendo-se, agora, uma cultura nova, já que os microrganismos da coleção
não haviam sido repicados rotineiramente. Os isolados foram incubados
Material e Métodos
__________________________________________________
32
a 37ºC por 24h, e fez-se novamente uma análise comparativa de
crescimento, selecionando aqueles com crescimento vigoroso.
Em seguida, procedeu-se o cultivo dos isolados selecionados em
meio M9 com 5g/L de resíduo de processamento da mandioca, por 24h,
analisando novamente seu crescimento, sendo selecionados, para os
estudos de produção de biopolímeros, aqueles que cresceram bem neste
resíduo.
4.4. Caracterização do resíduo empregado como fonte de carbono
O resíduo utilizado como fonte de carbono para cultivo dos
microrganismos foi cedido pela Indústria Corn Products do Brasil.
Tratava-se de resíduo sólido do processamento de mandioca, de cor
marrom, que foi batido em liquidificador por 10 minutos para cortá-lo
em partes pequenas e facilitar a incorporação no meio de cultura. Para as
análises de caracterização do resíduo, foi preparada uma solução
pesando-se 2g de resíduo, adicionando-os a 100mL de água destilada,
seguido de agitação.
4.4.1. Métodos Analíticos
4.4.1.1. Determinação de açúcares redutores
A determinação de açúcares presentes no resíduo foi realizada
pelo método do ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) (MILLER, 1959), o
qual se baseia na redução do ácido 3,5 dinitrosalicílico, pelo açúcar, a
ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, ao mesmo tempo em que o grupo
aldeído do açúcar é oxidado a grupo carboxílico, com o
desenvolvimento de uma coloração avermelhada, a qual foi lida em
espectrofotômetro CECIL CE1020 a 540nm. Para a determinação da
concentração de açucares, foi utilizada uma curva padrão de glicose nas
concentrações de 0 a 3g/L (Figura A.1 dos Anexos). Recolheu-se uma
alíquota de 400 µl da solução com o resíduo (previamente diluído), à
qual se adicionaram 400 µl de DNS, deixando em banho-maria, em
ebulição, por 5 minutos. A amostra foi resfriada em banho de gelo e
adicionada de 4mL de água destilada. Após 15 minutos para
estabilização da temperatura, a amostra foi lida em espectrofotômetro a
540nm.
Material e Métodos
__________________________________________________
33
4.4.1.2. Determinação de açúcares redutores presentes em forma de
amido
A determinação de açúcares redutores presentes na amostra em
forma de amido foi realizada por meio da hidrólise ácida do resíduo a
2% (p/v) (HCl 10%), na proporção 1:10 (ácido:solução de resíduo), com
aquecimento a 100ºC por 2,5h. Após resfriamento, filtrou-se, para
retirada dos sólidos em suspensão. Posteriormente, foi realizada a
determinação de açúcares liberados, através do método DNS (descrito
anteriormente) (OLIVEIRA et al, 2007; DALCANTON, 2006).
4.4.1.3. Determinação de proteínas
Foi utilizado o método de Peterson (1977) (Lowry modificado)
para a determinação de proteínas do resíduo. Este método baseia-se
numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico (reagente
Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com proteínas,
na presença do catalisador cobre (II), e produz um composto com
absorção máxima em 750 nm. São utilizados, então, dois reagente:
Reagente de Lowry (solução composta por cobre-tartarato-carbonato,
detergente dodecil sulfato de sódio 10% e NaOH 1N) e Reagente de
Folin-Ciocalteu. Foi utilizada uma curva padrão de soro albumina
bovina (BSA) nas concentrações de 10 a 100ug/mL (Figura A.2 dos
Anexos). Seguiu-se o seguinte procedimento: à alíquota de 100µl da
solução com o resíduo (como preparada para a determinação de
açúcares) foram adicionados 400µl do Reativo de Lowry. Após
agitação, seguida de repouso, por 10 minutos, foram adicionados 200µl
do Reagente de Folin, novamente agitada e deixada em repouso, por 20
minutos. Em seguida, foi feita a leitura em espectrofotômetro a 750 nm.
4.4.1.4. Determinação de nitrogênio total
A determinação de nitrogênio total do resíduo foi realizada pelo
método colorimétrico descrito por Koroleff (1976), utilizando-se kit
comercial Spectroquant (Merck) – Nitrogen Total Cells Test, que
consiste na oxidação de compostos nitrogenados orgânicos e
inorgânicos em nitrato, pelo tratamento com um agente oxidante em um
termoreator. Em solução acidificada com ácido sulfúrico e fosfórico, o
nitrato formado reage com 2,6 dimetilfenol (DMP), produzindo 4-nitro-
Material e Métodos
__________________________________________________
34
2,6 dimetilfenol, que é determinado espectrofotometricamente. Para
tanto, uma alíquota de 1 mL da solução do resíduo foi utilizada para o
procedimento descrito no kit, em que a amostra foi oxidada em presença
do agente oxidante quando incubada por 1h a 120ºC, e, em seguida,
após resfriada, foi adicionada a uma solução acidificada com ácido
sulfúrico e fosfórico. Após agitação e 10 minutos em repouso, procedeu-
se a leitura em espectrofotômetro.
4.5. Condições de cultivo para a produção, extração e caracterização
dos PHAs produzidos
Para os ensaios de produção de PHA, foram utilizadas duas pré-
culturas, uma seguida da outra; os isolados foram cultivados
primeiramente em 5 mL de meio LB por um período de 24h a 37ºC, em
agitador orbital Tecnal TE-420, com agitação de 150rpm. A segunda
pré-cultura foi realizada em 50 mL de meio descrito por RAMSAY e
colaboradores (1990), sem limitação de nutrientes, com 20g/L de
resíduo, também por 24h. Em seguida, 10% (v/v) do pré-inóculo foi
transferido para 300 mL de meio agora com limitação de nutriente e
20g/L de resíduo, e cultivados por 48h.
Para os ensaios de determinação e extração de PHA, em que foi
utilizada massa celular seca, as culturas foram centrifugadas em tubos
Falcon por 10 minutos a 1800g, em centrífuga Eppendorf 5810R, e
congeladas em freezer. Posteriormente, foram colocadas em liofilizador
Jouan LP3 por 5 horas e, em seguida, mantidas em freezer (-20ºC) para
posterior análise. Os testes para determinação do PHA produzido, por
meio de metanólise e análise em cromatografia gasosa, foram realizados
com três repetições de cultura para cada microrganismo, e as células
liofilizadas foram misturadas em mesma proporção para se proceder a
metanólise e posterior leitura em cromatógrafo gasoso, assim o
resultado apresentado foi uma média das três culturas.
4.5.1. Hidrólise do resíduo
Partindo-se das metodologias propostas por Oliveira e
colaboradores (2007), Dalcanton (2006) e Law e colaboradores (2003)
para hidrólise ácida de resíduos amiláceos, foram criadas variações para
avaliação do melhor método considerando a quantidade de açúcar
Material e Métodos
__________________________________________________
35
liberado, por meio do teste de DNS, quantidade de ácido (na proporção
1:10 - ácido:solução de resíduo) e de resíduo utilizadas. Foram testadas
oito condições de hidrólise:
1.
15 minutos em autoclave (121ºC) + solução de 10% HCl +
200g/L de resíduo
2.
30 minutos em autoclave (121ºC) + solução de 10% HCl +
100g/L de resíduo
3.
30 minutos em autoclave (121ºC) + solução de 10% HCl +
200g/L de resíduo
4.
30 minutos em autoclave (121ºC) + solução de 10% HCl +
300g/L de resíduo
5.
30 minutos em autoclave (121ºC) + solução de 5% HCl +
200g/L de resíduo
6.
30 minutos em autoclave (121ºC) + solução de 15% HCl +
200g/L de resíduo
7.
30 minutos em banho-maria (100ºC) + solução de 10% HCl +
200g/L de resíduo
8.
60 minutos em banho-maria (100ºC) + solução de 10% HCl +
200g/L de resíduo
O resultado de quantidade de açúcar liberado em cada
tratamento, e o tratamento escolhido estão apresentados em resultados e
discussão.
4.6. Métodos Analíticos
4.6.1. Determinação do índice enzimático
Os microrganismos selecionados anteriormente como
degradadores de amido e capazes de crescer no resíduo, foram
inoculados em meio M9 com 5g/L de resíduo, em 4 pontos por placa, e
cultivados a 37ºC por 24h. Em seguida, as placas foram coradas com
solução de iodo, evidenciando-se o amido no meio. Foram medidos os
diâmetros da colônia e do halo de degradação do amido das quatro
repetições, e calculado o índice enzimático por meio da razão entre a
média do diâmetro do halo e da colônia. Desta forma, foi possível
avaliar a capacidade dos microrganismos de degradar o amido presente
no meio para sua utilização como fonte de carbono.
Material e Métodos
__________________________________________________
36
4.6.2. Determinação do crescimento bacteriano
Para determinação do crescimento bacteriano, tendo em vista a
influência do resíduo, com sólidos suspensos, além de sua coloração
amarronzada, foi realizado o teste de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5
difenil brometo de tetrazolina). O teste do MTT é utilizado para avaliar
viabilidade celular. O MTT, quando incubado com células vivas, é
reduzido, pela succinato desidrogenase, transformando-se de um
composto amarelo em um composto azul escuro (formazan), que,
quando dissolvido, adquire coloração violácea, avaliada por
espectrofotometria (FRESHNEY, 2005).
Inicialmente foi realizado um teste preliminar para determinação
de qual deveria ser a diluição das amostras para que fosse permitida a
leitura, bem como o tempo de exposição ao MTT. Em seguida, os
isolados foram cultivados como descrito no item 4.5. A cultura dos
isolados foi diluída 1:6 com o meio sem limitação e sem resíduo em
placa de 96 poços, adicionados a cada poço 10µl de MTT (5mg/mL
diluído em tampão PBS), e incubada a 37ºC por 1h. Foram adicionados
100µl de detergente SDS 10% em HCl 0,01N e incubado no escuro por
18h, para posterior leitura em espectrofotômetro (leitor de microplaca
Tecan - GENios) em 540nm. Como amostra controle, foi feito o
procedimento com apenas o meio de diluição e também com uma
solução de resíduo sem células, diluída na mesma concentração com
meio sem limitação. Os testes foram realizados com 6 repetições.
4.6.2.1. Determinação do crescimento bacteriano em resíduo
hidrolisado
Para hidrólise do resíduo, foi preparada uma solução de 200g/L
de resíduo em água destilada, e em seguida foi realizado o procedimento
para hidrólise ácida, em que foi utilizado HCl 10%, na proporção 1:10
(ácido:solução de resíduo), com aquecimento a 100ºC por 2,5h. Após
resfriamento, o pH foi ajustado com NaOH 1M, e filtrou-se para retirada
dos sólidos em suspensão (OLIVEIRA et al, 2007; DALCANTON,
2006). Foi adicionado ao meio de cultura, 2% do resíduo hidrolisado
(v/v), e determinado o crescimento dos microrganismos por meio da
técnica de MTT.
Material e Métodos
__________________________________________________
37
4.6.3. Determinação de PHA
A porcentagem de acúmulo de PHA foi determinada por
cromatografia gasosa conforme método descrito por Braunegg e
colaboradores (1978), com modificações propostas por Brandl e
colaboradores (1988).
Após cultivo em meio líquido (descrito no item 4.5), a cultura foi
centrifugada e as células liofilizadas. Pesou-se aproximadamente 50 mg
de massa celular seca em um microtubo e adicionou-se 1 mL de metanol
acidificado (H
2
SO
4
15% e 85% de metanol) com ácido benzóico na
concentração de 0,4 g/L, como padrão interno, e agitou-se, transferindo
a mistura para um tubo de ensaio com tampa rosqueada. Ao tubo,
adicionou-se 1 mL de clorofórmio e a suspensão foi aquecida a 100ºC
durante 3 horas, sendo que, após 1 hora de aquecimento, a mistura foi
agitada durante alguns segundos e depois devolvida ao aquecimento. As
amostras foram resfriadas em banho de gelo e adicionou-se 1 mL de
água destilada, agitou-se vigorosamente e deixou-se decantar. A fase
inferior (orgânica) foi recolhida com auxílio de uma pipeta Pasteur e
armazenada sob refrigeração para posterior análise em cromatografia
gasosa.
A análise foi realizada na Central de Análises do Departamento
de Química da Universidade Federal de Santa Catarina, utilizando
Cromatógrafo Gasoso CG90, equipado com detector de ionização de
chama (DIC ar-hidrogênio). A coluna utilizada no cromatógrafo é de
sílica fundida (0,53mm x 30m), modelo Supercowax-10. O gás de
arraste utilizado foi o nitrogênio a 20 mL.min
-1
e as temperaturas de
injeção, detecção e coluna foram, respectivamente, 90ºC, 230ºC e
110ºC, e o volume injetado foi de 1 ul.
Como controle, foi submetido também à metanolização o padrão
externo P[3HB] (PHB Industrial) com massa variando entre 5 e 25 mg.
A curva padrão foi estabelecida através da relação das áreas de
P(3HB)/padrão interno pela massa de polímero (Figura A.3 dos
Anexos).
4.6.4. Análise dos Dados
Os dados obtidos foram comparados entre os isolados estudados
por meio de análise de variância (ANOVA) e do teste de Tukey. As
análises foram realizadas utilizando o software Statistica versão 6.0.
Material e Métodos
__________________________________________________
38
4.7. Avaliação da produção de PHA por microscopia de
epifluorescência
Os isolados foram avaliados quanto à produção de PHA
utilizando-se o método proposto por Delegau e colaboradores (1995).
Para isto, os isolados foram cultivados em 50 ml de meio líquido, com
limitação de fósforo (RAMSAY et al, 1990), contendo 20g/L de glicose
ou 20g/L de resíduo e o corante vermelho do Nilo (0,5µg/mL, dissolvido
em dimetilsulfóxido – DMSO). Após 48h de cultivo, as células foram
observadas sob microscópio de epifluorescência Olympus BX40, com
fluorescência de excitação e emissão em 543 e 598nm, respectivamente,
e aumento de 1000x. O corante vermelho do Nilo é capaz de marcar
com fluorescência os grânulos de PHA.
4.8. Extração e Caracterização do PHA
4.8.1. Extração do PHA
A extração foi realizada segundo o método desenvolvido por
Shishatskaya e Volova (2004). Aproximadamente cinco gramas de
biomassa seca, macerada e triturada, foram colocadas em um balão de
fundo redondo com aproximadamente 250 ml de etanol 46% (v/v)
contendo 0,7 g/L de KOH. A solução foi aquecida até o ponto de
ebulição por aproximadamente 40 minutos em um condensador. Após
resfriado, o sobrenadante foi removido por centrifugação (1800g por 10
minutos), e 250 ml de etanol 96% (v/v) foram adicionados ao
precipitado para lavagem. A solução foi novamente centrifugada para
retirada do líquido de lavagem. O precipitado foi transferido para um
balão de fundo redondo, ao qual foram adicionados 250 ml de
clorofórmio. A solução foi aquecida até o ponto de ebulição em um
condensador por 40 minutos. Após resfriada à temperatura ambiente, a
solução foi filtrada com algodão para retirada do material sólido. Ao
filtrado foi acrescentado aproximadamente três vezes o seu volume de
etanol 96% (v/v) e colocado em geladeira por 24 horas. A mistura foi
filtrada, deixando o papel filtro secar durante dois dias. O polímero foi
obtido por raspagem do papel filtro.
Material e Métodos
__________________________________________________
39
4.8.2. Caracterização do PHA
4.8.2.1. Espectroscopia na Região do Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR)
A Espectroscopia na Região do Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR) permite analisar os compostos
presentes na estrutura dos polímeros e a interação entre eles. Exceto para
isômeros ópticos, não se conhecem compostos com um mesmo espectro
(GRAF et al., 1987). A Espectroscopia por Reflexão Interna (FTIR-
ATR) é utilizada devido à baixa transmissão (opacidade) dos
biopolímeros. A análise foi realizada na Central de Análises do
Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina,
utilizando equipamento Perkim Elmer no intervalo de 4.000 a 450 cm
-1
pela técnica de reflectância difusa.
4.9. Caracterização molecular dos microrganismos isolados
4.9.1. Extração de DNA
Os isolados selecionados foram cultivados em 5 mL de meio
LB, por 24 horas. Foram recolhidas alíquotas de 4 mL do caldo de
cultivo e centrifugadas por 2 minutos a 14000g, em centrífuga
Eppendorf - mini spin. O precipitado foi ressuspendido em 500µL de TE
(10mL de Tris-HCl 1M, pH 7,5; 2mL de EDTA 0,5M, pH 8; 1000mL de
água destilada) e centrifugado novamente, por 2 minutos a 14000g. O
precipitado foi novamente ressuspendido em 500µL de TE, ao qual
foram adicionados 30µL de SDS 10%, aproximadamente 500mg de
pérolas de vidro (2mm de diâmetro) e agitada em amalgamador
Vibramat por 1 minuto, para o rompimento das células. A esta
suspensão celular foram adicionados 500µL de fenol puro, e
centrifugou-se a 14000g por 10 minutos. A fase aquosa foi coletada,
adicionados 400µL de clorofane (25 fenol : 24 clorofórmio : 1 álcool
isoamílico), homogeneizado e centrifugado a 14000g por 5 minutos. A
fase aquosa foi coletada novamente, adicionados 400 µL de clorofil (24
clorofórmio : 1 álcool isoamílico), homogeneizado e centrifugado por 5
minutos. A fase superior foi coletada, e 0,1 volume de NaCl (5M) e 0,6
volume de isopropanol foram adicionados, incubando-se à temperatura
ambiente por 5 minutos. Esta solução foi centrifugada por 10 minutos. O
Material e Métodos
__________________________________________________
40
precipitado foi lavado com etanol 70% e seco a 37ºC por 15 minutos. O
DNA foi ressuspendido em 50 µL de água Milli-Q e a sua integridade
foi verificada correndo 5 µL em gel de agarose (0,8%) (TEIXEIRA et
al, 2007).
4.9.2. Amplificação do gene 16S rRNA por PCR
Para realização do sequenciamento, o DNA extraído foi
submetido à técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para
amplificação do segmento do gene 16S rRNA, utilizando-se um par de
iniciadores descritos por Hiraishi (1992) (16S-F:
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, e 16S-R:
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA). A reação de PCR foi realizada em
termociclador Eppendorf – Mastercycler Gradient, e constituiu-se de 50
µL contendo 1x tampão da enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen),
0,2mM de cada dNTP, 0,5µM de cada iniciador, 2mM de cloreto de
magnésio, 1U Taq DNA polimerase (Invitrogen), 50ng de DNA
genômico, sendo o volume final ajustado com água ultrapura. O
programa utilizado para a reação de PCR foi de 94ºC por 240s, seguido
de 35 ciclos de 94ºC por 30s, 50 ºC por 30s e 72ºC por 30s; por fim,
extensão a 72ºC por 360s.
4.9.3. Sequenciamento do DNA
Para caracterização molecular dos isolados e confirmação de suas
espécies, os produtos de amplificação 16S rRNA foram sequenciados
em empresa especializada Macrogen (Seoul, Coréia), utilizando-se
protocolos padrão com corante terminador e sequenciador capilar
(ABI3730XL, Applied Biosystems, CA). Para isso, os produtos de PCR
foram clonados em plasmídio utilizando o Kit InsTAclone
TM
PCR
Cloning (Fermentas, MD), e o plasmídio recombinante foi inserido em
célula competente E. coli DH10B por choque elétrico (SAMBROOK e
RUSSELL, 2001). As células transformadas foram inoculadas em meio
LB sólido suplementado de ampicilina (100µg/mL) e X-gal (0,02mg/mL
5-bromo-4-cloro-3-indolil b-D-galactopiranoside, Invitrogen - CA).
Colônias brancas de clones transformados foram recuperadas e
cultivadas em meio LB com ampicilina, a 37ºC, 150rpm, por 20h, e o
Material e Métodos
__________________________________________________
41
vetor foi isolado por meio do Kit PureLink
TM
Quick Plasmid Miniprep
(Invitrogen, CA). O plasmídio foi sequenciado utilizando-se os
iniciadores universais M13 (M13-F:
GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA, e M13-R:
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG) e o iniciador interno 16S
rRNA (GGATGACAGTACCTGAAGAATAAGCAC).
Para verificação das sequências, estas primeiramente foram
avaliadas no programa ContigExpress (NTI Vector) para eliminação das
regiões de baixa qualidade de sequenciamento. No site NCBI (National
Center for Biotechnology Information), foi utilizada a ferramenta
VecScreen para identificar as regiões da sequência referentes ao vetor, a
fim de eliminá-las. Por fim, a homologia das sequências de 16S rRNA
foi determinada pela sua comparação com as sequências depositadas no
banco de dados GenBank (NCBI), pelo método BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) (ALTSCHUL et al., 1990). A árvore
filogenética foi construída utilizando o Programa MEGA4 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis) (TAMURA et al., 2007).
Resultados e Discussão
___________________________________________________
42
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização do resíduo
A produção de PHA por microrganismos depende das
condições de cultivo e dos substratos e suplementos fornecidos. Grande
parte dos microrganismos, dentre eles os Bacillus, necessitam de
limitação de algum nutriente essencial assim como excesso de carbono
no meio em que se desenvolvem, para que, então, haja regulação de seu
metabolismo e inicie o processo de absorção de carbono e acúmulo do
mesmo em forma de grânulos como reserva de energia (LEE, 1996a;
LUENGO et al., 2003).
Como fonte de carbono para os microrganismos, foi utilizado
neste trabalho o resíduo do processamento de mandioca produzido pela
indústria Corn Products do Brasil.
Conhecidamente amiláceo, o resíduo do processamento de
mandioca, utilizado no trabalho, foi primeiramente caracterizado, a
partir de uma solução de 20g/L de resíduo, tendo em sua composição
16g/L de amido (80%), 1,31g/L de açucares redutores (6,56%), 0,22g/L
de proteínas totais (1,12%) e 0,07g/L de nitrogênio (0,36%).
Os elevados teores de amido e de açúcares redutores presentes
neste resíduo são, a princípio, motivos de preocupação, caso se deseje
descartá-lo. O amido, a principal fonte de carbono presente no resíduo, é
constituído de amilose e amilopectina. Estes polissacarídeos, fontes de
carbono ricos em energia, são facilmente metabolizados por
microrganismos presentes no ambiente. Estes microrganismos são
capazes de produzir e excretar enzimas amilolíticas que hidrolisam os
polissacarídeos até suas unidades monoméricas, as quais são
transportadas para o interior da célula microbiana e utilizadas para seus
processos metabólicos de produção de energia e crescimento celular
(PELCZAR et al., 1998). O descarte destes polissacarídeos em solos, ou
ainda em corpos d’água, constitui-se um problema ambiental sério, uma
vez que esta elevada concentração de matéria orgânica favorece o
crescimento de microrganismos aeróbios que acabam por esgotar o
oxigênio desses ambientes, levando à morte outros organismos que
demandem oxigênio, causando desequilíbrio ambiental. Assim, dar a
este resíduo, energeticamente rico, um destino que não seja o descarte
no ambiente, e sim seu aproveitamento para a produção biotecnológica
Resultados e Discussão
___________________________________________________
43
de produtos de algum valor agregado, é de grande importância
ambiental e econômica.
O elevado teor de matéria orgânica torna este material aplicável
à produção biotecnológica de biocombústiveis ou ainda compostos de
maior valor agregado, como é o caso dos biopolímeros. Particularmente
neste estudo, foi testada sua aplicação como fonte de substrato
carbônico para a produção de PHAs.
5.2. Seleção de microrganismos degradadores de amido
Dado o conteúdo de amido presente no resíduo do processamento
de mandioca utilizado neste estudo, seu aproveitamento para o
crescimento celular e para produção de PHA deve envolver dois
processos biológicos principais: degradação até suas unidades
monoméricas, a glicose, e a conversão desta em biopolímero. Havia,
portanto, a necessidade da escolha de um microrganismo capaz de
realizar ambos os processos descritos. Assim, a etapa subsequente deste
trabalho foi o de selecionar dentre 72 isolados de Bacillus, Paenibacillus
e Geobacillus pertencentes a 21 espécies diferentes, todos isolados
ambientais pertencentes a uma coleção depositada no Laboratório de
Microbiologia Aplicada (LAMA) da Universidade do Vale do Itajaí
(UNIVALI), aqueles capazes de crescer em amido solúvel e
consequentemente hidrolisá-lo. Cada um dos isolados, descritos na
Tabela 10, foram avaliados quanto à sua capacidade de crescer em
substrato de amido solúvel.
Inoculados em meio de cultura com amido como única fonte de
carbono, das 72 bactérias testadas, 55 foram capazes de crescer em meio
contendo amido como única fonte de carbono. Contudo, este
crescimento foi variável e empiricamente classificado como sendo
pouco ou bom crescimento, como apresentado na Tabela 11. Na Figura
5, é mostrada uma cultura na qual se pode observar o que se considerou
pouco e bom crescimento bacteriano, neste estudo. Dentre os
microrganismos listados, destacaram-se os isolados de Bacillus
megaterium, os quais apresentaram colônias significativamente maiores
que os demais isolados analisados.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
44
Tabela 11. Avaliação do crescimento dos isolados ambientais, após 48
horas de cultivo em meio M9 a 37ºC, contendo 5g/L de amido puro.
Código
Avaliação do
crescimento
Código
Avaliação do
crescimento
LAMA002 Pouco LAMA148 Pouco
LAMA032 Pouco LAMA098 Pouco
LAMA055 Pouco LAMA139 Bom
LAMA100 Pouco LAMA149 Pouco
LAMA102 Pouco LAMA151 Pouco
LAMA135 Bom LAMA181 Pouco
LAMA159 Pouco LAMA262 Bom
LAMA167 Pouco LAMA272 Bom
LAMA169 Pouco LAMA273 Bom
LAMA176 Pouco LAMA274 Bom
LAMA180 Pouco CARLOS32 Bom
LAMA258 Pouco LAMA073 Bom
LAMA091 Pouco LAMA094 Pouco
LAMA190 Bom LAMA097 Pouco
LAMA031 Pouco LAMA261 Bom
LAMA018 Bom LAMA263 Bom
LAMA020 Bom LAMA265 Bom
LAMA062 Pouco LAMA266 Pouco
LAMA084 Pouco CARLOS10 Bom
LAMA252 Bom LAMA268 Bom
LAMA075 Pouco LAMA015 Pouco
LAMA076 Pouco LAMA050 Pouco
LAMA157 Pouco LAMA138 Bom
LAMA086 Pouco LAMA133 Pouco
LAMA156 Pouco LAMA136 Bom
LAMA023 Bom LAMA140 Pouco
LAMA095 Bom LAMA254 Pouco
LAMA255 Bom
Uma das características desejáveis para a produção
biotecnológica de PHAs é que os microrganismos empregados tenham
elevada velocidade específica de crescimento, além de poderem ser
Resultados e Discussão
___________________________________________________
45
cultivados utilizando substratos de baixo custo (RAMSAY, 1994).
Assim, com o objetivo de selecionar as bactérias que apresentassem o
menor tempo de geração, procedeu-se um segundo cultivo idêntico ao
primeiro, utilizando-se os 55 isolados previamente selecionados
(descritos na Tabela 11), para se avaliar os que seriam capazes de
apresentar um crescimento vigoroso em 24 horas de cultivo. Na Tabela
12 é apresentada a relação dos 16 isolados selecionados, segundo este
critério.
Tabela 12. Microrganismos selecionados após avaliação do
crescimento, em meio M9 a 37ºC, contendo 5g/L de amido puro, em 24
horas.
Código Isolado
LAMA190 Bacillus ehimensis
LAMA023 Bacillus subtilis
LAMA073 Bacillus megaterium
LAMA095 Bacillus megaterium
LAMA262 Bacillus megaterium
LAMA265 Bacillus megaterium
LAMA098 Geobacillus kaustophilus
LAMA272 Paenibacillus dendritiformis
LAMA273 Paenibacillus dendritiformis
Carlos 32 Paenibacillus dendritiformis
LAMA261 Paenibacillus macquarensis
LAMA263 Paenibacillus macquarensis
Carlos 10 Paenibacillus macquarensis
LAMA268 Paenibacillus macquarensis
LAMA133 Paenibacillus thiaminolyticus
LAMA055 Bacillus cereus
Os isolados selecionados (Tabela 12) foram capazes de crescer
em meio M9, contendo como única fonte de carbono amido puro solúvel
(grau analítico). Finalmente, nesta etapa de seleção dos isolados
amilolíticos, foi empregado o resíduo amiláceo industrial previamente
caracterizado, como única fonte de carbono. Dos 16 isolados com
Resultados e Discussão
___________________________________________________
46
crescimento vigoroso em 24 horas, no amido puro, 14 apresentaram
bom crescimento também no resíduo, no mesmo período de incubação
(Figura 5). Na Figura 5, é possível observar dois isolados marcados com
um círculo: um isolado praticamente sem crescimento – B. cereus
LAMA055 – e outro com pouco crescimento – P. dendritiformis
LAMA273 – os quais foram descartados para os próximos testes. Na
etapa posterior, foram feitos ensaios utilizando o resíduo amiláceo,
como única fonte de carbono.
Figura 5. Isolados bacterianos crescidos em meio mínimo (M9) com
5g/L do resíduo do processamento de mandioca como única fonte de
carbono, após 24 horas de cultivo.
Com estes resultados, observa-se que o resíduo, de fato, pode ser
utilizado como substrato carbônico, necessário ao crescimento
bacteriano, e que, para a maioria das bactérias testadas, não causou
inibição de crescimento dos microrganismos. De qualquer modo, houve,
para dois dos isolados testados, uma provável inibição de crescimento,
que pode ter sido causada por uma diferença da atividade amilolítica
apresentada por estes dois isolados, quer seja pela especificidade das
enzimas pelo substrato amiláceo, ou pela acessibilidade das enzimas ao
substrato, aos grânulos de amido presentes no resíduo.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
47
5.3. Avaliação quantitativa dos microrganismos selecionados
5.3.1. Determinação do índice enzimático
Tendo em vista que muitos microrganismos não são capazes de
hidrolisar o resíduo para o seu consumo em forma de açúcar, foram
realizados testes para observação do índice enzimático, analisando a
atividade das enzimas amilolíticas, e este índice é determinado pela
razão entre o diâmetro do halo e o diâmetro da colônia (Figura 6).
Figura 6. Colônias de B. ehimensis LAMA190 (A) e B. subtilis
LAMA023 (B) e os halos de degradação do amido, revelados por
solução de iodo.
A
B
Resultados e Discussão
___________________________________________________
48
A partir dos halos de degradação de amido formados (Figura 6),
foi determinado o índice enzimático, e observam-se os resultados de
dois isolados: B. ehimensis LAMA190 apresentou colônias de 5,5mm ±
0,3mm de diâmetro e halo de degradação de 26,1mm ± 0,7mm, com
índice enzimático de 4,74 ± 0,28; já B. subtilis LAMA023 apresentou
colônias de 10,5mm ± 2,5mm de diâmetro e halo de degradação de
31,2mm ± 2,2mm, com índice enzimático de 2,97 ± 0,39.
Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente, sendo
significativa a variação entre os tratamentos, e foi realizada análise de
contraste de médias por meio do teste de Tukey, em que os isolados
indicados com mesma letra não são diferentes ao nível de 5% de
significância. Não existiram muitas diferenças entre os isolados, porém
puderam ser destacados os microrganismos B. ehimensis (LAMA190),
G. kaustophilus (LAMA098) e P. thiaminolyticus (LAMA133), os quais
apresentaram colônias pequenas, mas grande excreção de enzimas. Os
resultados apontam a capacidade de todos os isolados em secretar
enzimas amilolíticas no meio, degradando o amido para o consumo de
açúcares para seu crescimento (Figura 7).
0
1
2
3
4
5
6
7
LAM
A
19
0
LAMA02
3
LAMA09
5
LAM
A
09
8
LAM
A
26
2
LAMA27
2
L
A
M
A0
7
3
CARLOS32
LAMA261
L
A
M
A2
6
3
LAM
A
26
5
LAMA 2
6
8
CAR
L
OS10
L
A
M
A1
3
3
Ín dice e nzim ático
a
a
a
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
Figura 7. Índice enzimático (relação halo enzimático/diâmetro colônia)
dos isolados selecionados, cultivados em meio M9, contendo 5g/L de
resíduo. Os isolados foram comparados estatisticamente pelo teste de
Tukey, e os isolados indicados com mesma letra não são diferentes ao
Resultados e Discussão
___________________________________________________
49
nível de 5% de significância. As barras verticais nas colunas se referem
ao desvio padrão das médias das amostras.
A principal função das enzimas extracelulares é a de executar as
alterações necessárias à captação dos nutrientes para o interior das
células. As hidrolases compreendem as enzimas amilolíticas, que
hidrolisam as moléculas de amido em produtos, como dextrinas, e
pequenos polímeros compostos por unidades de glicose. Conforme o seu
modo de ação, as enzimas amilolíticas podem ser divididas em duas
grandes categorias: as endoamilases e exoamilases. As endoamilases
catalisam a hidrólise das ligações glicosídicas do tipo α-1,4, de uma
maneira aleatória, no interior da molécula de amido. Sua ação resulta na
formação de oligossacarídeos ramificados e lineares de vários
comprimentos de cadeias. Por outro lado, as exoamilases hidrolisam,
sucessivamente, ligações glicosídicas a partir da extremidade não
redutora das mesmas, resultando em produtos finais pequenos
(PELCZAR et al., 1998; GUPTA et al., 2003).
Observou-se que os isolados selecionados apresentam grande
potencial para a produção de enzimas, e indústrias de biotecnologia vêm
explorando intensamente esta produção por microrganismos,
principalmente de amilases, já que apresentam um amplo campo de
aplicações na indústria de alimentos, em cervejarias e bebidas
fermentadas, em cereais para alimentação infantil, ração animal,
indústrias de papel e celulose, têxtil, de detergentes, química e
farmacêutica. Entre as α-amilases bacterianas mais importantes
industrialmente, estão as secretadas pelo gênero Bacillus, destacando-se
as amilases ativas em altas temperaturas produzidas por B.
amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. subtilis, B. megaterium e
B. licheniformis (GUPTA et al., 2003; SCHALLMEY et al., 2004).
Além disso, pode ser interessante também o aproveitamento de resíduos
agroindustriais como fontes alternativas de substratos para produção de
enzimas, pois contêm quantidades residuais de amido suficientes para
este fim, e representam uma fonte de baixo valor comercial,
principalmente quando se visa à produção de enzimas em larga escala
(BOCCHINI et al., 2005).
5.3.2. Determinação do crescimento bacteriano
Para comparação do crescimento bacteriano, primeiramente foi
testada a determinação da densidade celular por meio da absorbância da
Resultados e Discussão
___________________________________________________
50
cultura, em espectrofotômetro (a unidade é a densidade óptica), e por
meio do peso seco das células. No entanto, o resíduo influenciou nestes
dois parâmetros, já que sua coloração marrom e alguns sólidos em
suspensão interferiram na leitura de absorbância, assim como estes
sólidos interferiram na medida do peso seco. E por mais que tenha sido
utilizada uma amostra controle, composta apenas de resíduo, a qual foi
exposta às mesmas leituras, e o seu valor subtraído das amostras
analisadas, não foi possível quantificar o consumo do substrato pelos
microrganismos diante destas variáveis coloração e peso dos sólidos em
suspensão.
Desta forma, buscou-se outra técnica que pudesse minimizar o
erro. Foi utilizada, então, a técnica do MTT, a partir da qual se
determinam as células vivas, por meio da respiração celular
(FRESHNEY, 2005). O teste piloto apontou crescimento mensurável em
1h de exposição ao MTT (dados não apresentados). As amostras foram
preparadas em diluição de 1:6 com meio de cultura sem limitação de
nutriente e sem resíduo, como descrito em material e métodos 4.6.2. Na
Figura 8, apresenta-se a comparação entre o crescimento dos isolados,
expressa como absorbância a 540nm (ABS
540nm
), crescidos em meio
mineral (Ramsay) contendo resíduo bruto do processamento de
mandioca, como fonte de carbono.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
LA
MA02
3
LA
MA07
3
LA
MA09
5
LAMA098
LAM
A
1
9
0
LA
MA
2
6
2
LA
MA26
5
LA
MA26
8
LA
MA27
2
LA
MA26
1
LA
MA26
3
LAMA133
C
AR
LO
S
3
2
C
AR
LO
S
1
0
Redução de MTT (ABS
540nm
)
a
a
a
a
ab
ab
ab
b
b
b
b
b
b
c
Figura 8. Crescimento celular dos isolados em meio contendo resíduo
bruto, por meio da técnica de redução de MTT, expresso como
absorbância ABS
540nm
. Os isolados foram comparados estatisticamente
pelo teste de Tukey, e os indicados com mesma letra não são diferentes
Resultados e Discussão
___________________________________________________
51
ao nível de 5% de significância. As barras verticais nas colunas se
referem ao desvio padrão das médias das amostras.
A partir dos resultados obtidos (Figura 8), é possível inferir que,
em geral, os isolados tiveram bom crescimento em meio limitado
adicionado do resíduo, destacando-se apenas o isolado LAMA261, que
obteve a menor concentração celular quando comparado com os demais
microrganismos.
Paralelamente, selecionou-se, de forma empírica, o isolado
LAMA262, o qual foi inoculado em meio com resíduo bruto e resíduo
hidrolisado (hidrólise ácida – metodologia descrita em 4.6.2.1), a fim de
comparar o seu crescimento nas duas apresentações do resíduo. Como
observado na Figura 9, não existiu diferença significativa no
crescimento do microrganismo com o resíduo bruto ou hidrolisado;
logo, os testes seguiram com utilização do resíduo bruto, o que também
minimiza custos para a produção do polímero. Este fato reafirma a
capacidade dos microrganismos de secretar enzimas amilolíticas no
meio, observado nos testes de determinação dos índices enzimáticos.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
RB sem inóculo RB com inóculo RH sem inóculo RH com inóculo
Redução de MTT (ABS
540nm
)
Figura 9. Crescimento do isolado LAMA 262 em meio com resíduo
bruto e hidrolisado por meio da técnica de redução de MTT, expresso
como ABS
540nm
, em que RB = resíduo bruto e RH = resíduo hidrolisado.
Os isolados foram comparados estatisticamente pelo teste de Tukey, e as
barras verticais nas colunas se referem ao desvio padrão das médias das
amostras.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
52
5.4. Avaliação da Produção de PHA
Com o objetivo de avaliar a produção de PHA, dois
microrganismos – LAMA262 e LAMA268 – foram escolhidos
empiricamente dentre os 14 isolados que apresentaram bom
crescimento, ou seja, os 14 microrganismos com crescimento superior
aos demais da coleção, e foram cultivados em meio mineral (Ramsay),
com limitação de fósforo, utilizando-se como fonte de carbono 20g/L de
glicose ou 20g/L de resíduo bruto, ambos com adição do corante
vermelho do Nilo, evidenciando as grânulos de PHA das bactérias
produtoras. Como controle positivo, foi utilizada uma linhagem de E.
coli (DH10B) transformada com o plasmídio pRLC2 (BRESSAN,
2007), contendo os genes necessários à produção de PHA, e
sabidamente produtora do polímero.
Após cultivo nas condições descritas acima, a observação em
microscópio de epifluorescência, que permite a visualização dos
microrganismos contendo polímero intracelular, mostrou que os
isolados cresceram bem tanto em glicose como no resíduo bruto, porém
não foram capazes de produzir PHA quando o resíduo bruto foi utilizado
como única fonte de carbono. Frente a estes resultados, procedeu-se a
hidrólise ácida do resíduo, visando tornar o açúcar prontamente
utilizável, e então facilitar o acesso dos microrganismos ao substrato e,
consequentemente, o acúmulo de polímero a partir deste. Encontram-se
na literatura diversos trabalhos nos quais foram utilizados resíduos ricos
em amido e que, previamente à adição no meio de cultivo, foram
hidrolisados, como de Dalcanton (2006) e Rodrigues (2005), que
utilizaram uma solução simulando resíduo de indústria de arroz para
produção de PHA por R. eutropha; Law e colaboradores (2003)
utilizaram resíduo de malte de cervejaria para produção de PHA por B.
subtilis recombinante. Para este trabalho, foram testadas oito condições
de hidrólise (material e métodos 4.5.1).
Resultados e Discussão
___________________________________________________
53
0
2
4
6
8
10
12
15m in autoclave
+10%HCl+200g/Lresíduo
30m in autoclave
+10%HCl+100g/Lresíduo
30m in autoclave
+10%HCl+200g/Lresíduo
30m in autoclave
+10%HCl+300g/Lresíduo
30m in autoclave
+5% HCl+200g/Lresíduo
30m in autoclave
+15%HCl+200g/Lresíduo
30m in banho-m aria
+10%HCl+200g/Lresíduo
60m in banho-m aria
+10%HCl+200g/Lresíduo
1 2 3 4 5 6 7 8
Açúcares Redutores Totais (g/L)
a
a
a
a
b
b
c
d
Figura 10. Quantidade de açúcares redutores totais (g/L) liberada nos
diferentes tratamentos (1 a 8) para hidrólise do resíduo do
processamento de mandioca. As identificações “a”, “b”, “c” e “d”
indicam a comparação estatística entre os tratamentos (teste de Tukey).
Os tratamentos realizados com 30 minutos de aquecimento em
autoclave (121ºC) foram os mais eficientes para a hidrólise do amido,
sendo que a hidrólise por 30 minutos em solução de HCl 10% (v/v) foi a
que proporcionou melhores resultados. Embora a solução de HCl 15%
também tenha gerado resultado satisfatório, porém analisando-se custos
e impactos ambientais, optou-se pela menor concentração. Quanto à
quantidade do resíduo, notou-se que utilizando tanto 100, 200 ou 300g/L
os resultados foram iguais estatisticamente, cerca de 10g/L de açúcar
liberado, e então se fez a opção por 200g/L, já que se tem o resíduo
disponível em grandes quantidades, e a concentração de açúcar liberado
foi maior (10,5g/L), apesar de não haver diferença estatística. O
tratamento para a hidrólise de amido escolhido foi de 30 minutos em
autoclave, 200g/L de resíduo em solução de HCl 10% (na proporção
Resultados e Discussão
___________________________________________________
54
1:10 - ácido:solução de resíduo em água destilada), sendo depois
ajustado o pH e adicionado ao meio.
Novamente os microrganismos foram inoculados em meio
Ramsay limitado e 20g/L de glicose, e em meio limitado e resíduo,
agora hidrolisado, na concentração de 2% (volume de
hidrolisado/volume de meio), com adição do corante vermelho do Nilo,
e, como controle positivo, foi utilizada uma linhagem de E.coli
(DH10B) transformada com o plasmídio pRLC2. Após 48h de cultivo,
alíquotas dos meios foram retiradas para teste de MTT (Figura 11) e
visualização em microscópio de epifluorescência para observação dos
grânulos de PHA intracelulares (Figura 12). Observa-se na Figura 11
que os isolados cultivados em glicose tiveram um crescimento superior,
ou seja, detectou-se um maior número de células ativas, uma vez que o
MTT determina respiração celular, do que aqueles cultivados com
resíduo.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Resíduo E. coli DH10B LAMA262 +
glicose
LAMA262 +
resíduo
LAMA268 +
glicose
LAMA268 +
resíduo
Redução de MTT (ABS
540nm
)
Figura 11. Crescimento celular (redução de MTT ABS
540nm
) dos
isolados LAMA262 e LAMA268 cultivados em glicose ou resíduo
amiláceo hidrolisado, após 48 horas de cultivo a 37ºC. As barras
verticais nas colunas se referem ao desvio padrão das médias das
amostras.
Quanto à visualização destas células em microscópio de
epifluorescência (Figura 12), o isolado LAMA 268 não apresentou
fluorescência, indicativa de acúmulo de PHA, como observado no
controle positivo. Já o isolado LAMA 262 apresentou pontos de
Resultados e Discussão
___________________________________________________
55
fluorescência referentes aos grânulos de PHA presentes dentro das
células. Nota-se que a quantidade de grânulos é maior nos isolados
cultivados com glicose, no entanto observa-se também naqueles
cultivados com resíduo. Pode-se justificar a menor quantidade quando
cultivado em resíduo devido ao menor número de células ativas,
indicado pelo teste de MTT (Figura 11). De qualquer forma, nota-se a
capacidade deste isolado em produzir PHA em presença do resíduo
como fonte de carbono.
A fluorescência emitida pelo uso do corante vermelho do Nilo
proporciona um fácil e rápido “rastreamento” para identificar
microrganismos produtores de PHAs, e pode ser utilizado para isolar
potenciais linhagens produtoras do polímero de amostras do ambiente
(BERLANGA et al., 2006). Spiekermann e colaboradores (1999), Rehm
e colaboradores (2002) e Berlanga e colaboradores (2006) utilizaram o
corante vermelho do Nilo para seleção de microrganismos com intensa
fluorescência, indicativa da produção de polímero. Assim como o
corante vermelho do Nilo, o corante azul do Nilo também é utilizado em
trabalho devido à sua capacidade de corar os grânulos de PHA
(ANTUNES, 2006).
Em seguida, tendo definidas as condições de cultivo e de
análise, todos os 14 isolados previamente selecionados foram inoculados
em meio limitado com glicose 20g/L e vermelho do Nilo, e 48h depois
foram observados em microscópio de epifluorescência para visualização
dos grânulos de PHA. A Tabela 13 apresenta os diferentes isolados e
algumas de suas características. Entre os isolados crescidos em glicose,
podem-se destacar LAMA073, LAMA262 e LAMA265, que
apresentaram alta fluorescência dos grânulos quando observados em
microscópio de epifluorescência. Dos 14 microrganismos selecionados
em etapas posteriores, 3 deles não cresceram quando realizado este teste
em glicose, por isso não foram incluídos na tabela a seguir.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
56
Figura 12. Acúmulo de PHA observado sob microscópio de
epifluorescência. A) LAMA262 cultivado com glicose; B) LAMA262
cultivado com resíduo; C) LAMA268 cultivado com glicose; D)
LAMA268 cultivado com resíduo.
Os isolados que cresceram e produziram PHA
significativamente em glicose, assim como aqueles que não cresceram
em glicose, foram testados em meio limitado e resíduo hidrolisado,
adicionado agora na concentração de 20% (volume de
hidrolisado/volume de meio), equivalente a 2g/L de açúcares redutores,
tendo em vista o menor crescimento dos microrganismos em meio com
2% de resíduo hidrolisado em relação àqueles cultivados em 20g/L de
glicose (teste MTT), e após 48h foram observados em microscópio de
epifluorescência para visualização dos grânulos de PHA. Os resultados
estão apresentados na Tabela 14.
A
B
C
D
Resultados e Discussão
___________________________________________________
57
Tabela 13. Isolados crescidos em meio limitado com glicose como fonte
de carbono e corante vermelho do Nilo a 37ºC.
Isolados Quantidade
de células
Tamanho
das células
Grânulos
de PHA
Intensidade
Fluorescência
B. ehimensis –
LAMA 190
Muitas Pequenas - -
G. kaustophilus –
LAMA 098
Muitas Grandes Pouco/
Pequenos
Baixa
P. dendritiformis
– LAMA 272
Poucas Grandes Maioria das
células/
Pequenos
Média
B. megaterium –
LAMA 073
Poucas Grandes Maioria das
células/
Bem
definidos
Alta
P. dendritiformis
– CARLOS 32
Poucas Muitas
rompidas
Maioria das
células/
Pequenos
Média
B. megaterium –
LAMA 262
Poucas Grandes Maioria das
células/
Bem
definidos
Alta
P. macquariensis
– LAMA 261
Poucas Grandes Maioria das
células/
Pequenos
Média
P. macquariensis
– LAMA 263
Poucas Pequenas Algumas
células/
Pequenos
Alguns claros,
outros mais
intensos
B. megaterium –
LAMA 265
Muitas Grandes Maioria das
células/
Bem
definidos
Alta
P. macquariensis
– CARLOS 10
Poucas Pequenas Algumas
células/
Pequenos
Baixa
P. macquariensis
– LAMA 268
Muitas Pequenas - -
Resultados e Discussão
___________________________________________________
58
Tabela 14. Isolados crescidos em meio limitado com 20% de resíduo
hidrolisado como fonte de carbono e corante vermelho do Nilo.
Desta forma, observa-se que os isolados LAMA095, LAMA073,
LAMA262 e LAMA265 são produtores naturais de PHA quando
cultivados em meio limitado com resíduo do processamento de
mandioca como única fonte de carbono (Figura 13). Estes dados
reforçam os estudos de produção de PHA por B. megaterium
(MCCOOL et al., 1996; LUVIZETTO, 2007; KULPREECHA et al.,
2009), indicando sua capacidade de produção também a partir deste
resíduo.
Apesar de o descobrimento dos PHAs ter iniciado há alguns anos
em cultivos com B. megaterium, aos poucos este foi deixado de lado em
detrimento de outras bactérias, talvez pelo fato da energia requerida para
esporulação vir do consumo do polímero e da fonte de carbono e
nutrientes do meio, ao passo que outras só consomem o polímero na
Isolados Quantidade
de células
Tamanho
das células
Grânulos
de PHA
Intensidade
Fluorescência
B. megaterium –
LAMA 095
Poucas Pequenas Algumas
células/
Bem
definidos
Média
B. subtilis –
LAMA 023
Muitas Pequenas - -
G. kaustophilus –
LAMA 098
Muitas Grandes - -
B. megaterium –
LAMA 073
Muitas Pequenas Maioria das
células/
Bem
definidos
Alta
B. megaterium –
LAMA 262
Muitas Grandes Maioria das
células/
Bem
definidos
Alta
B. megaterium –
LAMA 265
Poucas Grandes Maioria das
células/
Bem
definidos
Alta
P. thiaminolyticus
– LAMA 133
Poucas Grandes Poucas
células/
Poucos e
pequenos
Média
Resultados e Discussão
___________________________________________________
59
falta de fonte de carbono (WU et al., 2001). Entretanto, esta bactéria é
encontrada em abundância em solos e água, e possui uma grande
vantagem por crescer em diferentes fontes de carbono e também ser
capaz de produzir biopolímero utilizando resíduos agroindustriais
(GOUDA et al., 2001; LAW et al., 2003).
Figura 13. Acúmulo de PHA dos isolados cultivados com resíduo
observado sob microscópio de epifluorescência. A) LAMA 095; B)
LAMA 073; C) LAMA 262; D) LAMA 265.
Para os testes seguintes, foram selecionados os isolados
LAMA073, LAMA095, LAMA262 e LAMA265, que apresentaram
produção significativa de PHA quando cultivados em meio com 20% de
resíduo hidrolisado (v/v), e foram cultivados também os mesmos
isolados em 20g/L de glicose. As culturas liofilizadas destes isolados
sofreram, então, metanólise para determinação de PHA das células. O
PHA solúvel em clorofórmio foi dosado em cromatografia gasosa,
utilizando-se como padrão interno o ácido benzóico. A Figura A.4 dos
Anexos apresenta o exemplo de um cromatograma obtido a partir da
análise em cromatografia gasosa. A Tabela 15 apresenta a biomassa
produzida, a quantidade de P(3HB) nas células e a porcentagem de
A
B
C
D
Resultados e Discussão
___________________________________________________
60
recuperação do polímero em relação ao peso seco. Com o uso do resíduo
hidrolisado, não apresentando mais sólidos em suspensão, a biomassa
foi determinada pelo peso seco da cultura, que foi centrifugada e
liofilizada de acordo com metodologia apresentada anteriormente (4.5).
Tabela 15. Biomassa produzida, quantidade de P(3HB) nas células e
porcentagem de recuperação do polímero dos isolados cultivados em
meio limitado com 20% de resíduo hidrolisado (v/v), e em 20g/L de
glicose por 48h a 37ºC.
Isolado Substrato Biomassa
(g/L)
*
P(3HB)
(g/L)
P(3HB)
(%)
**
Glicose 1,74± 0,4 0,73 41,95 LAMA073
Resíduo 2,07± 0,9 0,27 13,04
Glicose 1,37± 0,5 0,33 24,09 LAMA095
Resíduo 4,48± 0,5 1,07 23,88
Glicose 1,58± 0,6 0,34 21,51 LAMA262
Resíduo 1,69± 0,3 0,10 5,92
Glicose 1,55± 0,7 0,49 31,61 LAMA265
Resíduo 1,40± 0,7 0,35 25,00
*
Determinado como descrito em material e métodos (4.5), para
determinação de PHA, em que foram feitas três repetições de cultura
para cada microrganismo, e as células liofilizadas foram misturadas para
se fazer a leitura, assim o resultado apresentado foi uma média das três
culturas.
**
% P(3HB) = (g de P(3HB)/g de biomassa) x 100
Na Tabela 15, é indicado que alguns isolados apresentaram maior
biomassa quando cultivados em resíduo, como é o caso de LAMA073 e
LAMA095. Entretanto, LAMA073 e LAMA262 produziram maiores
quantidades de P(3HB) quando cultivados em glicose, com aumento de
P(3HB) em relação ao peso seco das células de 28,91% (p/p) e 15,19%
(p/p) respectivamente, quando comparados ao cultivo em resíduo, sendo
que, para LAMA073, em glicose obteve-se uma biomassa de
1,74±0,4g/L e foram acumulados 41,95% de P(3HB) (p/p), e em
resíduo, foi obtida biomassa de 2,07±0,9g/L e acumulados 13,04% de
P(3HB) (p/p); para LAMA262, em glicose obteve-se uma biomassa de
1,58±0,6g/L e foram acumulados 21,51% de P(3HB) (p/p), e em
resíduo, biomassa de 1,69±0,3g/L e acumulados 5,92% de P(3HB) (p/p).
Resultados e Discussão
___________________________________________________
61
Já o isolado LAMA265 apresentou um aumento de apenas
6,61% (p/p) na quantidade de P(3HB) nas células com cultivo em
glicose, obtendo-se em resíduo uma biomassa de 1,40±0,7g/L, com
acúmulo de 25% de P(3HB) (p/p). É possível destacar o isolado
LAMA095, que apresentou maior biomassa quando cultivado em
resíduo e, consequentemente, maior quantidade de P(3HB); no entanto,
analisando-se as proporções, de acordo com a porcentagem de P(3HB)
nas células, esta é bastante semelhante comparando-se as duas fontes de
carbono (24,09% para cultivo em glicose, e 23,88% em resíduo).
Observadas as porcentagens de P(3HB) sobre o peso seco das
células dos isolados selecionados no trabalho, estas podem ser
comparadas com dados da literatura. Quanto à produção em resíduo
industrial, Dalcanton (2006) alcançou rendimento de 35% (p/p) de PHB
nas células, quando cultivado Ralstonia eutropha em resíduo de
processamento de arroz. E. coli recombinante apresentou 34,78% de
PHB em relação à sua massa seca quando cultivado em hidrolisado de
amido de milho (FONSECA, 2003). Zhang e colaboradores (1994)
examinaram linhagens de E. coli e Klebsiella aerogenes para a formação
de P(3HB) em melaço, que custa de 33 a 50% menos do que glicose, e
as linhagens de E. coli e Klebsiella aerogenes recombinantes,
carregando o locus de phb em um plasmídio, crescido em meio mínimo
com 6% de melaço de cana-de-açúcar, acumularam P(3HB) a
aproximadamente 3g/L, correspondendo a 45% (p/p) da massa celular
seca. Quando cultivada R. eutropha em extrato aquoso de bagaço de
maçã, Rodrigues (2005) obteve 14% de PHB em meio sem
suplementação de óleo, 34% de PHB em meio suplementado com ácido
oléico e 22% quando suplementado com óleo de soja.
Comparam-se também as porcentagens obtidas no trabalho com
estudos realizados com Bacillus, em que B. megaterium foi capaz de
produzir P(3HB) utilizando melaço de cana como fonte de carbono, rico
em sacarose, apresentando um rendimento de 46,2% (p/p) de P(3HB)
sobre o peso seco da célula (GOUDA et al., 2001). Omar e
colaboradores (2001) cultivaram B. megaterium utilizando como fonte
de carbono xarope de tâmaras e melaço de beterraba, e obtiveram um
acúmulo de 52% e 50% (p/p), respectivamente. Law e colaboradores
(2003) realizaram ensaios para construção de B. subtilis recombinante,
cultivando-o em meio com resíduo de malte para produção de PHA, e
alcançaram uma produção de 15,32% (p/p) do peso seco das células.
Kulpreecha e colaboradores (2009) obtiveram uma produção de 61,62%
de PHB (p/p) cultivando B. megaterium BA-019 por apenas 12h,
quando aumentada a concentração do substrato melaço de cana para
Resultados e Discussão
___________________________________________________
62
400g/L. E B. megaterium CQPBA036-07 DMP01 cultivado em 50g/L
de sacarose obteve 75% de PHB (p/p) (LUVIZETTO, 2007).
Diante dos dados apresentados, observa-se que a produção de
PHB obtida neste trabalho se assemelha com outros dados da literatura,
e que existem diversos estudos sobre a produção de P(3HB) por meio de
fontes de carbono de baixo custo por produtores naturais e
recombinantes de P(3HB). Todavia, a concentração de P(3HB) e o
conteúdo de P(3HB) obtidos são consideravelmente mais baixos do que
aqueles obtidos usando substratos purificados de carbono, como é o caso
de Cupriavidus necator cultivado em glicose, que pode alcançar mais de
80% de sua massa celular seca em polímero (BYROM, 1987).
Consequentemente, mais estratégias eficientes de cultivo devem ser
desenvolvidas para uma produção eficiente de P(3HB) a partir de fontes
de carbono de baixo custo. E se resíduos industriais puderem ser usados
como substratos para a produção de P(3HB), vantagens combinadas
para a redução de custos e obtenção de produtos de valor agregado
podem ser alcançados (KIM e CHANG, 1995; LEE, 1996b).
A fim de melhorar a produção de PHB, aumentou-se a quantidade
de resíduo hidrolisado de 20% para 40% (v/v), equivalente a um
aumento de 2g/L para 4g/L de açúcar redutor, sendo realizada
novamente a cultura em meio com limitação de fósforo por 48h a 37ºC,
em três repetições (Tabela 16).
Tabela 16. Biomassa produzida, quantidade de P(3HB) nas células e
porcentagem de recuperação do polímero dos isolados cultivados em
meio limitado com 40% de resíduo hidrolisado (v/v), por 48h a 37ºC.
Isolado Substrato Biomassa
(g/L)
*
P(3HB)
(g/L)
P(3HB)
(%)
**
LAMA073 Resíduo 3,35 ± 0,7 1,02 30,45
LAMA095 Resíduo 4,97 ± 0,9 1,48 29,78
LAMA262 Resíduo 3,36 ± 0,8 0,19 5,65
LAMA265 Resíduo 2,92 ± 0,5 0,52 17,81
*
Determinado como descrito em material e métodos (4.5), para
determinação de PHA, em que foram feitas três repetições de cultura
para cada microrganismo, e as células liofilizadas foram misturadas para
se fazer a leitura, assim o resultado apresentado foi uma média das três
culturas.
**
% P(3HB) = (g de P(3HB)/g de biomassa) x 100
Resultados e Discussão
___________________________________________________
63
De acordo com os dados das Tabelas 15 e 16, observa-se que o
aumento da quantidade de resíduo no meio de cultivo apresentou um
aumento de 38% de biomassa para o isolado LAMA073, 49% para
LAMA262 e 52% (p/p) para LAMA265, e o isolado LAMA095
apresentou 10% de aumento. Com o aumento da biomassa produzida,
consequentemente obteve-se um aumento do P(3HB) produzido, no
entanto este aumento não foi significativo para todos os isolados quando
observada a quantidade de polímero em relação à biomassa. Obteve-se
um incremento na produção para o isolado LAMA073, em que a
porcentagem de polímero nas células aumentou de 13,04% para 30,45%
(p/p), indicando uma produção cerca de 57% maior de polímero quando
utilizado 40% de resíduo hidrolisado (v/v) no meio de cultura. O isolado
LAMA095 obteve um incremento de aproximadamente 20% de
polímero. Já os isolados LAMA262 e LAMA265 apresentaram uma
diminuição de produção de polímero quando aumentada a quantidade de
resíduo. Entretanto, destaca-se que a quantidade de resíduo utilizada
ainda se encontra bastante abaixo do que é utilizado de glicose, podendo
gerar resultados mais significativos se a quantidade fosse equivalente.
É possível observar que, embora pertençam à mesma espécie, os
isolados de B. megaterium apresentam atividades diferentes, inerentes a
cada microrganismo em questão, devido à diversidade da espécie, ou
também podem estar relacionadas à amostra, ao local em que foram
coletados e à data da coleta.
5.5. Caracterização dos filmes de PHB
5.5.1. Espectroscopia na Região do Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR)
Visando caracterizar o tipo de PHA produzido por duas das
linhagens a partir das quais se obteve a maior produção de PHB,
utilizando-se 20% de resíduo hidrolisado como fonte de carbono, o
polímero produzido foi extraído da biomassa seca como descrito em
material e métodos (4.8.1). Os filmes obtidos foram analisados por
espectrofotometria FTIR. Os espectros de infravermelho (FTIR) dos
PHA purificados, produzidos pelos isolados LAMA095 e LAMA265,
estão apresentados nas Figuras 14 e 15, respectivamente.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
64
Figura 14. Espectro de FTIR para o polímero produzido pelo isolado
LAMA095 - B. megaterium.
Figura 15. Espectro de FTIR para o polímero produzido pelo isolado
LAMA265 - B. megaterium.
Em ambas as análises, observam-se as principais bandas
características da presença do polímero P(3HB): intensa banda a 1726
cm
-1
, devido aos estiramentos das carbonilas das ligações éster; várias
Resultados e Discussão
___________________________________________________
65
bandas de intensidade variável, entre 1450 e 1000 cm
-1
, devido às
deformações dos grupos metila (CH
3
) e metileno (CH
2
) e aos
estiramentos C-O-C. Estes dados estão de acordo com os reportados na
literatura por Kansiz e colaboradores (2000) para FTIR de PHB
produzido por E. coli recombinante, por Garcia (2006) para FTIR de
PHB produzido por Ralstonia eutropha, e por Carminatti (2008) para
FTIR de PHB produzido por Chromobacterium violaceum, e, portanto,
confirmam a produção do polímero pelos isolados testados.
5.6. Caracterização molecular dos isolados selecionados
As análises dos segmentos 16S rRNA sequenciados dos 4
isolados selecionados apontam grande identidade destas com as
sequências depositadas no banco de dados GenBank (NCBI). Este
resultado contribuiu para a confirmação das espécies, pois, por meio dos
testes morfológicos, de crescimento e bioquímicos, os microrganismos
foram identificados como B. megaterium atípicos, uma vez que a
maioria dos testes confirmava esta espécie, porém algumas
características (produção de catalase, distenção da célula durante a
esporulação, produção de acetoína, hidrólise de gelatina e crescimento
em anaerobiose) se apresentaram fora do padrão para a espécie. Na
Tabela A.2 dos Anexos é apresentada a sequência de nucleotídeos de
cada isolado. E os resultados das análises são apresentados na Tabela
17.
Foram apresentadas na tabela as indicações do banco de dados
que obtiveram 99% de identidade com os segmentos 16S rRNA
sequenciados. Os segmentos dos isolados LAMA073, LAMA095 e
LAMA262 obtiveram o mesmo grau de similaridade com os mesmos
segmentos das espécies do banco de dados, por isso foram apresentados
juntos na tabela, tendo 1544 nucleotídeos analisados. Quanto ao isolado
LAMA265, foi sequenciada parte do segmento de interesse, tendo 968
nucleotídeos analisados, por isso apresentou padrão de semelhança com
o banco de dados levemente diferente dos demais segmentos analisados,
e, como não apresentou o mesmo número de nucleotídeos, não foi
comparado com os demais na árvore filogenética.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
66
Tabela 17. Identidade entre as sequências dos isolados selecionados e o
banco de dados GenBank (NCBI).
GenBank – NCBI
Isolado
Espécie Gene
sequenciado
Acesso Identidade
(%)
Nucleotí-
deos
idênticos *
Bacillus sp.
Nº 49
16S rRNA AB066347.1 99% 1538/1542
Bacillus sp.
Nº 54
16S rRNA AB066345.1 99% 1538/1542
Bacillus sp.
Nº 44
16S rRNA AB066339.1 99% 1536/1542
Bacillus
megaterium
cepa MPF-
906
16S rRNA DQ660362.1 99% 1537/1544
Bacillus
megaterium
cepa 2-37-
4-1
16S rRNA DQ267829.1 99% 1537/1544
Bacillus sp.
Nº 51
16S rRNA AB066344.1 99% 1532/1536
Bacillus
megaterium
isolado
AC46b1
16S rRNA AJ717381.1 99% 1532/1538
LAMA
073
LAMA
095
LAMA
262
Bacillus
megaterium
plasmídio
pBM400
Sequência
completa
AF142677.4 99% 1535/1544
Bacillus sp.
Nº 49
16S rRNA AB066347.1 99% 966/968
Bacillus sp.
Nº 54
16S rRNA AB066345.1 99% 966/968
Bacillus
megaterium
cepa MPF-
906
16S rRNA DQ660362.1 99% 966/968
Bacillus
megaterium
cepa 2-37-
4-1
16S rRNA DQ267829.1 99% 966/968
LAMA
265
Resultados e Discussão
___________________________________________________
67
* Número de nucleotídeos idênticos em relação ao número total de
nucleotídeos comparados.
Os resultados, portanto, apontam que os isolados selecionados
realmente pertencem à espécie Bacillus megaterium, microrganismo
conhecidamente produtor de PHA em condições de excesso de carbono
no ambiente e limitação de nutriente. Na Figura 16, é apresentado o
resultado da análise filogenética dos 3 isolados selecionados no trabalho
e 7 acessos do banco de dados GenBank (NCBI).
Figura 16. A árvore filogenética, construída por meio do Programa
MEGA4, apresenta os isolados selecionados no trabalho e os
microrganismos com 99% de identidade selecionados a partir do
GenBank. No eixo x, encontra-se uma escala de identidade de
nucleotídeos, sendo que a distância é a proporção (p) de nucleotídeos
diferentes comparando-se duas sequências, e é obtido pela divisão do
número de nucleotídeos diferentes pelo número total de nucleotídeos
comparados. Os valores expressos na árvore, nos nós internos, se
referem aos valores de Bootstrap, em 100 réplicas.
Bacillus
megaterium
isolado
AC46b1
16S rRNA AJ717381.1 99% 966/968
Bacillus
megaterium
plasmídio
pBM400
Sequência
completa
AF142677.4 99% 966/968
B. megaterium cepa MPF-906 16SrRNA
B. megaterium cepa 2-37-4-1 16SrRNA
B. megaterium isolado AC46b1 16SrRNA
Bacillus sp. Nº 54 gene 16SrRNA
LAMA262 16SrRNA
LAMA095 16SrRNA
Bacillus sp. Nº 49 gene 16SrRNA
Bacillus sp. Nº 44 gene 16SrRNA
Bacillus sp. Nº 51 gene 16SrRNA
LAMA073 16SrRNA
Resultados e Discussão
___________________________________________________
68
A árvore filogenética representa as relações evolutivas entre
grupos de organismos, e pode ser utilizada em diversas aplicações da
biologia molecular. Uma árvore filogenética é composta de nós internos,
que representam as unidades ancestrais, e nós terminais, que são as
unidades taxonômicas operacionais (neste caso o segmento sequenciado
das espécies), além de ramos, que representam o número de mudanças
que ocorrem em relação ao último nó (FUTUYMA, 1992). Os valores
expressos na árvore, nos nós internos, se referem aos valores de
Bootstrap, cujo cálculo permite a obtenção de um parâmetro que reflita
a robustez da análise filogenética produzida. O Bootstrap consiste no
número de ocorrências deste nó interno em 100 réplicas, e é gerado a
partir da criação de vários conjuntos de sequências (NEI e KUMAR,
2000).
A árvore indica maior proximidade dos isolados LAMA095 e
LAMA262, os quais se encontram mais afastados de LAMA073, que
apresenta 0,25% de diferença em relação aos demais microrganismos
considerados, porém todos apresentam grande identidade entre si e com
as indicações do banco de dados (99%). No entanto, existem diferenças
entre os isolados para a produção de polímero, e estas podem estar
relacionadas à diversidade da espécie, à amostra, ao local e à data em
que foram coletados os microrganismos, o que influencia sua atividade.
Considerações Finais
___________________________________________________
69
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho teve como objetivo geral a seleção de uma linhagem
bacteriana capaz de produzir polihidroxialcanoatos (PHAs) a partir de
um resíduo do processamento de mandioca, partindo-se de 72 isolados
ambientais de Bacillus, Paenibacillus e Geobacillus disponíveis na
coleção de microrganismos do Laboratório de Microbiologia
Aplicada/UNIVALI.
De acordo com os resultados obtidos, foi possível concluir que:
• O resíduo do processamento de mandioca utilizado neste
trabalho apresenta elevados teores de amido e de açúcares
redutores, o que o torna aplicável ao crescimento de
microrganismos, capazes da excreção de enzimas amilolíticas,
bem como pode constituir um substrato carbônico adequado à
produção de compostos de maior valor agregado, como é o caso
dos PHAs.
• Dentre os 72 isolados estudados, 16 foram selecionados por
apresentarem um bom crescimento em substrato amiláceo,
como única fonte de carbono e, destes, 14 isolados foram
capazes de apresentar colônias vigorosas quando cultivados no
resíduo do processamento de mandioca, indicando que o
resíduo não causou inibição do crescimento dos
microrganismos selecionados.
• Todos os 14 isolados selecionados apresentaram capacidade de
secretar enzimas amilolíticas no meio, as quais são capazes de
hidrolisar amido até suas unidades monoméricas, que foram
utilizadas para o seu crescimento.
• Embora os isolados tenham crescido no meio contendo o
resíduo bruto do processamento de mandioca, estes foram
capazes de produzir PHA apenas quando o resíduo previamente
hidrolisado foi adicionado ao meio.
• Entre os isolados crescidos em glicose, LAMA073, LAMA262
e LAMA265 apresentaram, quando observados em microscópio
de epifluorescência, elevada fluorescência indicando a presença
dos grânulos intracelulares de PHA, os quais eram bem
definidos e estavam presentes na maioria das células.
• Os isolados LAMA073, LAMA095, LAMA262 e LAMA265,
todos Bacillus megaterium, são capazes de produzir P(3HB)
quando cultivados em meio limitado com resíduo hidrolisado
Considerações Finais
___________________________________________________
70
do processamento de mandioca – substrato de baixo custo –
como única fonte de carbono.
• A espectrometria na região do infravermelho com transformada
de Fourier (FTIR) mostrou bandas características da presença
de P(3HB), confirmando que o polímero quantificado por
cromatografia gasosa é P(3HB).
• O sequenciamento do segmento 16S rRNA dos isolados
selecionados mostrou que estes pertencem à mesma espécie, e
apesar de todos serem Bacillus megaterium, apresentaram
rendimentos diferentes na produção de PHA, o que reflete a
diversidade desta espécie.
Perspectivas
___________________________________________________
71
7. PERSPECTIVAS
Baseados nos resultados apresentados, sugerem-se alguns
estudos:
• Avaliar o efeito da concentração do resíduo do processamento
de mandioca, do nutriente limitante, da suplementação do meio
e da adição de co-substratos sobre o crescimento e produção de
PHA, pelas linhagens selecionadas.
• Realizar testes para modificar geneticamente os isolados
selecionados com inserção de genes para síntese de PHA, a fim
de ampliar a produção do polímero.
• Avaliar o cultivo dos isolados selecionados em uma escala
superior para produção de PHAs.
• Avaliar a produção de PHA pelos isolados selecionados
utilizando-se outros resíduos amiláceos.
Referências Bibliográficas
___________________________________________________
72
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Anexos
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87
ANEXOS
Anexos
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88
y = 0,5073x - 0,0038
R
2
= 0,9952
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Glicose (g/L)
Absorbância (540nm)
Figura A.1. Curva de calibração para determinação da concentração de
açúcares redutores pelo método do ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS).
y = 0,009x + 0,0398
R
2
= 0,9881
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 20 40 60 80 100 120
BSA (µg/ml)
Absorbância (750 nm)
Figura A.2. Curva de calibração para determinação da concentração de
proteínas totais pelo método de Peterson (1977) (Lowry modificado).
Anexos
___________________________________________________
89
y = 3,2783x - 0,7687
R
2
= 0,9914
0
5
10
15
20
25
30
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Área PHB/Ácido benzóico
Massa de PH B (m g)
Figura A.3. Curva padrão para determinação da concentração de
P(3HB), estabelecida por meio da relação das áreas de P(3HB)/padrão
interno pela massa de polímero.
Figura A.4. Exemplo de cromatograma obtido a partir da análise em
Cromatografia Gasosa para o polímero produzido por LAMA265,
cultivado em 20% de resíduo hidrolisado. O primeiro pico corresponde
ao P(3HB) e o segundo ao ácido benzóico.
Anexos
_____________________________________________________________________
90
Tabela A.1. Microrganismos da coleção do Laboratório de Microbiologia Aplicada (LAMA/UNIVALI) e
informações sobre onde foram isolados e a partir de qual amostra.
Código de
Referência
Município Local de Coleta Amostra Espécie
LAMA002 Capivari de Baixo Rejeitos piritosos Água Bacillus cereus
LAMA032 Capivari de Baixo Rejeitos piritosos Sedimento Bacillus cereus
LAMA055 Criciúma Carbonífera Criciúma Bacillus cereus
LAMA100 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Bacillus cereus
LAMA102 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Bacillus cereus
LAMA113 Itajaí - Sardinha Bacillus cereus
LAMA135 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Bacillus cereus
LAMA142 Capivari de Baixo rejeitos piritosos Solo rizosférico Bacillus cereus
LAMA159 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Bacillus cereus
LAMA167 Capivari de Baixo rejeitos piritosos Solo rizosférico Bacillus cereus
LAMA169 Capivari de Baixo rejeitos piritosos Solo rizosférico Bacillus cereus
LAMA174 Capivari de Baixo rejeitos piritosos Solo rizosférico Bacillus cereus
LAMA176 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Bacillus cereus
Anexos
_____________________________________________________________________
91
LAMA180 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Bacillus cereus
LAMA258 Araquari Bacillus cereus
LAMA260 Araquari Bacillus cereus
LAMA091 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Bacillus ehimensis
LAMA190 Indaial Rio Warnaw Água Bacillus ehimensis
LAMA031 Capivari de Baixo Rejeitos piritosos Sedimento Bacillus firmus
LAMA018 Capivari de Baixo Rejeitos piritosos Sedimento Bacillus licheniformis
LAMA020 Capivari de Baixo Rejeitos piritosos Sedimento Bacillus licheniformis
LAMA062 Criciúma Carbonífera Criciúma Bacillus licheniformis
LAMA084 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Bacillus licheniformis
LAMA259 Araquari Bacillus licheniformis
LAMA252 Araquari Bacillus megaterium
LAMA075 Brusque Rio Itajaí-mirim Bacillus mycoides
LAMA076 Itajaí Rio Itajaí-mirim Bacillus mycoides
LAMA157 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico
Bacillus
mycoides/pseudomycoides
LAMA054 Criciúma Carbonífera Criciúma Bacillus racemilacticus
Anexos
_____________________________________________________________________
92
LAMA083 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Bacillus racemilacticus
LAMA086 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Bacillus racemilacticus
LAMA092 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Bacillus racemilacticus
LAMA090 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Bacillus simplex
LAMA156 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Bacillus smithii
LAMA023 Capivari de Baixo Rejeitos piritosos Água Bacillus subtilis
LAMA095 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Bacillus megaterium
LAMA146 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Bacillus subtilis
LAMA148 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Bacillus thuringiensis
LAMA098 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Geobacillus kaustophilus
LAMA099 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Geobacillus kaustophilus
LAMA139 Capivari de Baixo rejeitos piritosos Solo rizosférico Paenibacillus apiarius
LAMA149 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Paenibacillus apiarius
LAMA151 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Paenibacillus apiarius
LAMA181 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Paenibacillus borealis
LAMA186 Indaial Rio Warnaw Água Paenibacillus borealis
LAMA262 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Bacillus megaterium
Anexos
_____________________________________________________________________
93
LAMA272 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus dendritiformis
LAMA273 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus dendritiformis
LAMA274 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus dendritiformis
Carlos32 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus dendritiformis
LAMA073 Criciúma Carbonífera Criciúma Bacillus megaterium
LAMA094 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Paenibacillus koreensis
LAMA097 Criciúma Rio Sangão Água+sedimento Paenibacillus koreensis
LAMA261 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus macquarensis
LAMA263 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus macquarensis
LAMA264 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus macquarensis
LAMA265 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Bacillus megaterium
LAMA266 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus macquarensis
Carlos10 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus macquarensis
LAMA268 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus macquarensis
LAMA051 Criciúma Carbonífera Criciúma Paenibacillus pallidus
Carlos12 Itajaí Rio Itajaí-mirim Água Paenibacillus polymyxa
LAMA015 Capivari de Baixo Rejeitos piritosos Sedimento Paenibacillus polymyxa
Anexos
_____________________________________________________________________
94
LAMA050 Criciúma Carbonífera Criciúma Paenibacillus polymyxa
LAMA138 Capivari de Baixo rejeitos piritosos Solo rizosférico Paenibacillus polymyxa
LAMA184 Indaial Rio Warnaw Água Paenibacillus polymyxa
LAMA133 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Paenibacillus thiaminolyticus
LAMA136 Capivari de Baixo área recuperada Solo rizosférico Paenibacillus thiaminolyticus
LAMA140 Capivari de Baixo rejeitos piritosos Solo rizosférico Paenibacillus thiaminolyticus
LAMA254 Araquari Paenibacillus thiaminolyticus
LAMA255 Araquari Paenibacillus thiaminolyticus
LAMA256 Araquari Paenibacillus thiaminolyticus
Anexos
_____________________________________________________________________
95
Tabela A.2. Sequência de nucleotídeos dos isolados selecionados.
Isolado Sequência16S rRNA
LAMA073
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAG
CTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTC
GGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCAC
TTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACC
TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT
CCGCAATGGACGAGAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGT
TAGGGAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACTTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT
GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTT
TCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAG
AGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTT
TTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCC
GTAAACGGTGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTG
GGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA
ATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCG
GGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA
GCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAA
GGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGG
GCTGCAAGACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTAC
ATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC
CCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCCTAAGGTGGGA
CAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT
Anexos
_____________________________________________________________________
96
LAMA095
AGAGTCTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAG
CTCGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCG
GGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTT
ACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTG
AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCG
CAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGG
GAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA
GCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTA
AGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAA
AGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAGGGCGGCTTTTTGGT
CTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC
GATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT
ACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA
GCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACA
GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC
CTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT
GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGAC
CGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGA
ATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAC
GAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGG
GTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT
Anexos
_____________________________________________________________________
97
LAMA262
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGC
TTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGG
GAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTA
CAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGA
GAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC
AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGG
GAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA
GCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTA
AGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAA
AGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGT
CTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC
GATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT
ACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA
GCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACA
GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC
CTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT
GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGAC
CGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGA
ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAC
GAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGG
GTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT
Anexos
_____________________________________________________________________
98
LAMA265
CGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGA
ACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGT
GGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC
TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATT
AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGG
AGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGA
GCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA
GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACA
AACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAT
GGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCA
ACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT
ACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCCT
AAGGTGGGACAGATGATTGGGGGGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT
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