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COMPARAÇÃO DO EFEITO ANTIOXIDANTE DO VINHO TINTO E
DO RESVERATROL SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO E
PROLIFERAÇÃO CELULAR NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
DE RATOS DIABÉTICOS
Carina Duarte Venturini
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Claudia Ramos Rhoden
Co-Orientatora: Prof
a
. Dra. Rosane Gomez
Colaboradores: Prof
a
. Dr
a
. Marilda da Cruz Fernandes
Prof. Dr. André Arigony Souto
Porto Alegre
2009
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2
AGRADECIMENTOS
À professora Claudia Rhoden, pela oportunidade que me concedeu de fazer
parte do seu grupo de pesquisa, pela confiança depositada desde o início e pelos
ensinamentos que foram muito além do conteúdo deste trabalho.
À professora Rosane Gomez, pela dedicada orientação, apoio e paciência em
transmitir seu conhecimento. Obrigada por estar sempre disponível, por me mostrar
o melhor caminho e por todas as correções necessárias à minha formação.
Ao Alencar, fiel companheiro e amigo de todas as horas. Exemplo de força de
vontade e persistência na busca de um ideal. Obrigada imensamente pelo amor e pelo
apoio emocional e intelectual, sem os quais esse importante passo na minha vida não
teria sido alcançado.
À minha mãe, Ivone, que desde tenra idade ensinou-me a seguir meus próprios
passos através do seu exemplo de independência e determinação e pela primordial
importância destinada à educação dos filhos.
Ao meu pai, Ivo (in memoriam), pelo amor incondicional e exemplo de
humildade, honestidade e dedicação à família.
Aos colegas do laboratório, pela amizade e apoio nos vários e tão necessários
momentos.
Ao pessoal técnico, Letícia, Iara, Terezinha e Rosalva, pelo apoio e
aprendizado fundamentais.
Às minhas amigas, pelo carinho e compreensão apesar da minha ausência.
E a todos os que colaboraram direta ou indiretamente na execução deste
trabalho, meus sinceros agradecimentos.
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3
RESUMO
Muitos estudos demonstram forte associação entre estresse oxidativo e complicações
centrais e periféricas em indivíduos diabéticos. Resveratrol, um antioxidante natural,
presente nos vinhos tintos, poderia representar uma alternativa terapêutica para prevenir os
danos oxidativos produzidos pela hiperglicemia. Neste estudo, foi nosso objetivo:
comparar o efeito antioxidante do vinho tinto e do resveratrol no sistema nervoso central e
o efeito de ambos os tratamentos sobre a proliferação celular no hipocampo de ratos
diabéticos e não diabéticos. No primeiro experimento, ratos Wistar machos, adultos, foram
divididos em dois grupos: controle (CTR) e diabéticos induzidos por estreptozotocina
(STZ), 60 mg/kg, i.p. Após confirmado o diabetes, os grupos foram subdivididos segundo
o tratamento (n=8/grupo): vinho tinto (VIN) (4 mL/Kg), resveratrol (RES) (20 mg/Kg) e
solução salina (4 mL/Kg), administrados via oral, por 21 dias. No 21º dia, 1h após a última
administração os animais foram sacrificados, o hipocampo, o córtex frontal e o estriado
foram dissecados para análise do estresse oxidativo pela determinação da lipoperoxidação
e atividade das enzimas antioxidantes catalase e superóxido dismutase. O segundo
experimento obedeceu ao mesmo protocolo de tratamento, porém, ao final do experimento,
os cérebros dos ratos foram fixados em paraformaldeído por infusão intracardíaca. A
quantificação de células marcadas por 5-bromo-2’-deoxiuridina (Brdu), indicador de
proliferação celular, foi determinada no giro denteado do hipocampo por técnica de
imunohistoquímica. O estudo sugere que o vinho tinto e o resveratrol apresentam
propriedades antioxidantes que variam conforme a área estudada e com a condição
hiperglicêmica. Mais especificamente, o resveratrol apresentau melhor efeito antioxidante
em animais diabéticos.
Palavras-chave: Lipoperoxidação, polifenóis, uva, BRDU.
4
ABSTRACT
Evidences demonstrate strong correlation between oxidative stress and central and
peripheral complications in diabetic individuals. Resveratrol, a natural antioxidant present
in red wine, could be an alternative treatment to prevent oxidative damage produced by
hyperglycemia. In this study our objective was to compare the antioxidant effect of red
wine and resveratrol on oxidative stress in the brain of diabetic and non diabetic rats and to
evaluate the antioxidant effect of red wine and resveratrol on cell proliferation in the
hippocampus of diabetic and non-diabetic rats. In the first experiment, Wistar male rats
were divided in control (CTR) and diabetic groups (STZ, streptozotocin: 60 mg/kg, ip).
Each group (n = 8/group) was subdivided by treatment as control saline group (4 mL/Kg),
red wine (4 mL/Kg) or resveratrol (RES: 20 mg/Kg), administered by daily oral gavage for
21 days. One hour after the last administration, they were euthanized and the hippocampus,
central cortex and striatum were removed and quickly frozen in liquid nitrogen to measure
oxidative stress by determination of lipid peroxidation concentration and catalase and
superoxide dismutase activity, both antioxidant enzymes. The second experiment followed
the same protocol, except that at the end brains were fixed by an intracardial perfusion with
paraformaldeyde. The total number of stained 5-bromo-2’-deoxiuridine (BrdU)-positive
cells, an indicator of cell proliferation, was determined in the dentate gyrus of the
hippocampus using immunohistochemical method. This study indicates that both red wine
and resveratrol have antioxidant properties according to the brain area and hyperglycemic
condition. However, resveratrol resveratrol produced a better response in diabetic rats.
Key-words: Lipid peroxidation, polyphenols, grape, BRDU.
5
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Aumento da atividade da aldose redutase pela via dos polióis / 14
Figura 2: Aumento da formação de AGEs e dano celular / 16
Figura 3: Mecanismos de dano celular induzido pela hiperglicemia / 17
Figura 4: Conseqüências patológicas da hiperglicemia / 17
Tabela 1: Exemplos de espécies reativas de oxigênio / 22
Figura 5: Doenças relacionadas às espécies reativas de oxigênio / 26
Figura 6: Marcação de células BrdU positivas no giro denteado do hipocampo / 28
Figura 7: Decomposição do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio pela catalase / 30
Figura 8: Dismutação do ânion superóxido em peróxido de hidrogênio pela superóxido
dismutase / 31
Figura 9: Redução da glutationa pela glutationa peroxidase e transformação de peróxido
de hidrogênio em água / 32
Figura 10: Fontes de resveratrol em diferentes plantas / 34
Figura 11: Resveratrol e derivados / 35
6
LISTA DE ABREVIATURAS
AGEs: produtos finais de glicação
ATP: adenosina trifosfato
BrdU: 5-bromo-2’-deoxiuridina
CAT: catalase
CDK: ciclina dependente de cinases
COX-2: ciclooxigenase-2
CPR: proteína C reativa
Cu/ZnSOD: superóxido dismutase dependente de cobre e zinco
DAG: diacilglicerol
DHA: ácido graxo docosahexanóico
DM: diabetes mellitus
DM1: diabetes mellitus tipo 1
DM2: diabetes mellitus tipo 2
ERO: espécies reativas de oxigênio
FeSOD: superóxido dismutase dependente de ferro
GAD: descarboxilase do ácido glutâmico
GLUT4: transportadores de glicose
GSH: glutationa
GSH-Px: glutationa peroxidase
H
2
O
2
: peróxido de hidrogênio
ICAM-1: moléculas de adesão intracelular 1
iNOS : oxido nítrico induzida
LADA: diabetes latente auto-imune do adulto
MMP: metalopreteinases de matriz
MnSOD: superóxido dismutase dependente de manganês
NAD
+
: nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida)
O
2
: oxigênio singlete
O
2
•-
: ânion superóxido
7
OH
•
: radical hidroxil
PKC: proteína cinase C
RAGEs: receptores de produtos finais de glicação
SNC: sistema nervoso central
SOD: superóxido dismutase
TNF: fator de necrose tumoral
VEGF: fator de crescimento endotelial vascular
8
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO / 9
1. Diabetes mellitus / 9
1.1 Prevalência e valoração / 9
1.2 Caracterização e diagnóstico / 10
1.3 Alterações bioquímicas e dano celular / 13
1.4 Diabetes e sistema nervoso central / 18
1.5 Modelo animal para o estudo do diabetes / 20
2. Estresse oxidativo / 21
2.1 Espécies reativas de oxigênio / 21
2.2 Estresse oxidativo dano celular / 24
2.3 Estresse oxidativo e proliferação celular / 27
2.4 Defesas antioxidantes / 29
2.4.1 Defesas antioxidantes enzimáticas / 30
2.4.2 Defesas antioxidantes não enzimáticas / 32
3. Resveratrol / 33
3.1 Fontes e características químicas / 33
3.2 Propriedades farmacológicas / 36
4. Vinho Tinto / 38
4.1 Caracterização / 38
4.2 Propriedades farmacológicas / 39
OBJETIVOS / 41
REFERÊNCIAS / 42
ARTIGO CIENTÍFICO / 52
CONCLUSÕES / 77
ANEXOS / 78
9
INTRODUÇÃO
1. Diabetes Mellitus (DM)
1.1 Prevalência e Valoração Econômica
No mundo, o número de pessoas com diabetes está aumentando drasticamente,
devido ao crescimento e envelhecimento populacional, maior urbanização, maior
prevalência de obesidade e sedentarismo e maior sobrevida de indivíduos diabéticos (Wild
et al., 2004). Nos Estados Unidos, cerca de 7% da população apresenta diagnóstico
positivo para o diabetes (American Diabetes Association, 2008). Projeções apontam um
aumento da prevalência da doença em torno de 7 milhões a cada ano, podendo chegar a
380 milhões de diabéticos em 2030 (International Diabetes Federation, 2008). No Brasil,
um levantamento realizado em 1988 já mostrava uma prevalência de diabetes em torno de
7,6% na população urbana com idade entre 30 e 70 anos (Malerbi & Franco, 1992). Porto
Alegre foi a segunda capital brasileira com a maior taxa (8,9%), sendo superada apenas por
São Paulo (9,7%) (Malerbi & Franco, 1992). Estudo realizado em 1996 em Ribeirão Preto,
São Paulo, mostrou que a prevalência era ainda maior (12%), igualando os índices de
países desenvolvidos, com estimativa de 10 milhões de indivíduos diabéticos no Brasil
para aquele ano (Torquato et al., 2003).
O DM representa uma crescente carga para os sistemas de saúde, pois acarreta altos
custos diretos e indiretos (Ramachandran et al., 2007; Ballesta et al., 2006). Os custos
diretos incluem serviços médicos e cuidados de enfermagem, gastos hospitalares, exames
laboratoriais, tratamento, material de monitoramento e de apoio. Os custos indiretos
envolvem o tratamento de co-morbidades, incapacitação e, muitas vezes, mortalidade
10
prematura (Hogan et al., 2003; Barceló et al., 2003). Sabe-se que o DM é a principal causa
de amputações de membros inferiores e de cegueira adquirida, além de representar grande
parte dos pacientes internados em unidades coronarianas intensivas e dos tratamentos com
diálise (Happich et al., 2008). O DM também contribui, de forma significativa, para
internações por hipertensão arterial e acidente vascular cerebral (Hogan et al., 2003;
Barceló et al., 2003).
Até o momento, dois grandes estudos de DM foram conduzidos: o primeiro, de
diabetes tipo 1 (DM1), foi realizado nos Estados Unidos e cujos resultados foram
publicados em 1993, foi denominado Diabetes Control and Complications Trial (DCCT).
Esse estudo determinou que o monitoramento adequado da glicemia associado a um
esquema terapêutico intensivo de insulina pode reduzir de 50 à 70% os riscos de
complicações da doença (Cranston & Evans, 1995). O segundo, foi um estudo de diabetes
tipo 2 (DM2), prospectivo, realizado no Reino Unido em 1998, denominado United
Kingdom Prospective Diabetes Study Group (UKPDS). Esse estudo, cujos resultados de 30
anos de seguimento foram publicados em 2008, demonstrou que as complicações crônicas
do DM podem ser prevenidas ou adiadas mediante rigoroso controle da hiperglicemia e da
hipertensão arterial, o que previne complicações micro e macrovasculares (Genuth, 2008).
1.2 Caracterização e Diagnóstico
O diabetes mellitus é uma doença metabólica de etiologia múltipla, caracterizada
por hiperglicemia crônica, com distúrbio do metabolismo dos carboidratos, proteínas e
lipídios, resultantes da deficiência da secreção de insulina pelo pâncreas e/ou resistência a
ela pelos tecidos (Giugliano et al., 2008). Os sintomas decorrentes da hiperglicemia
incluem poliúria, polifagia, polidipsia e perda de peso (Eastman & Vinicor, 1997; Aronson
11
2008). A hiperglicemia crônica resulta em alterações micro e macrovasculares, podendo
levar à disfunção e falência de múltiplos órgãos, como nervos, rins, olhos, coração e vasos
sangüíneos (Aronson, 2008). É frequentemente acompanhada por dislipidemia, hipertensão
arterial e disfunção endotelial (Milutinović & Karadzić, 2008; Aronson, 2008), além de
neuropatia periférica, retinopatia, nefropatia, e disfunções gastrintestinais (WHO, 1999).
Afora as complicações periféricas, a hiperglicemia também afeta o sistema nervoso central,
causando alterações neurofisiológicas e déficit cognitivo em indivíduos diabéticos,
condição conhecida como encéfalopatia diabética (Ceriello, 2003; Biessels et al., 2002;
Kikuchi et al., 2003).
O DM1 é caracterizado pela auto-destruição das células beta pancreáticas, gerando
deficiência absoluta da secreção de insulina. Representa 5 a 10% dos casos e normalmente
acomete indivíduos jovens, tornando-os dependentes da reposição desse hormônio. A
complicação aguda mais comum é a cetoacidose. Após instalada a doença, o diagnóstico é
feito imediatamente, através da pesquisa de auto-imunidade ou auto-anticorpos, como por
exemplo, antidescarboxilase do ácido glutâmico (GAD) e anti-insulina. A taxa de
destruição das células beta é variável, sendo rápida principalmente em crianças e
adolescentes e lenta em adultos (Leslie et al., 2008; Sue et al., 2008). Entretanto, o DM
decorrente da destruição de células beta pancreáticas, mas sem evidência de agressão
imune ou de qualquer processo conhecido de agressão pancreática, refere-se ao DM1B ou
idiopático (Libman et al., 1998). Quando a forma auto-imune é lentamente progressiva,
ocorrendo geralmente em adultos, é referida como diabetes latente auto-imune do adulto
(LADA). Nesse caso, há uma maior propensão a outras patologias auto-imunes, como
doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, doença de Addison, vitiligo, doença celíaca,
entre outras (WHO, 1999).
12
O DM2 representa mais de 85% dos casos e ocorre com maior freqüência em
indivíduos acima de 40 anos. A doença se caracteriza por anormalidades na produção e/ou
resistência à insulina, observada por uma menor captação de glicose pelos tecidos,
principalmente muscular e hepático. Pode haver variações entre resistência insulínica,
deficiência relativa de insulina e, até mesmo, defeito essencialmente secretório com ou sem
resistência à insulina (Ferrannini et al., 2007; Nishikawa et al., 2000; Porte, 2001). Ao
contrário do tipo 1, a evolução é lenta e gradual com sintomas leves ou imperceptíveis. No
entanto, há elevado risco para o desenvolvimento de complicações micro e
macrovasculares, sendo o estado hiperosmolar não-cetótico a complicação aguda mais
comum (Nishikawa et al., 2000). A maioria dos portadores de DM2 apresenta sobrepeso,
obesidade ou deposição de gordura abdominal, fatores responsáveis pela resistência à
insulina (Ferrannini et al., 2007)
Em resposta à resistência à insulina tecidual, há uma elevação compensatória da
concentração plasmática do hormônio, com o objetivo de manter a glicemia dentro dos
valores normais. A resistência insulínica é acompanhada de obesidade e de aumento da
gordura visceral, condições que determinam maior mobilização de ácidos graxos do tecido
adiposo (Fonseca, 2006). São fatores de risco de desenvolver DM2: idade avançada,
história familiar, sedentarismo, hipertensão, dislipidemia e diabetes gestacional (WHO,
1999).
Além do diabetes tipos 1 e 2, há também estados hiperglicêmicos associados às
doenças do pâncreas exócrino, como por exemplo, uso de alguns fármacos ou agentes
químicos, presença de infecções, de algumas síndromes genéticas, e ainda, diabetes
gestacional (Sociedade Brasileira de Diabetes, 2003).
13
O DM é diagnosticado através do reconhecimento dos seus sinais e sintomas mais
comuns, como polidipsia, poliúria e polifagia, e também por avaliação laboratorial. O
método primário utilizado para o diagnóstico laboratorial é a medida da glicose de jejum,
cujos níveis séricos normais devem ser menores ou iguais a 100mg/dL e, 2 horas após o
teste de tolerância à glicose oral, menores que 140mg/dL. O indivíduo é diagnosticado
diabético quando os valores da glicose de jejum apontam glicemia > 126mg/dL ou >
200mg/dL, 2 horas após a ingestão de 75g de glicose oral (American Diabetes Association,
2006).
1.3 Alterações Bioquímicas e Dano Celular
Em condições normais, a glicose, ao entrar na célula, é rapidamente fosforilada por
hexoquinases. A partir daí, a glicose pode sofrer glicólise pelo ciclo de Krebs, pode ser
estocada como glicogênio, ou ainda, pode ser transformada em outros açúcares e
metabólitos intermediários (Voet et al., 2000). Durante o metabolismo da glicose há
produção de moléculas reduzidas, utilizadas para a síntese de adenosina trifosfato (ATP),
via fosforilação oxidativa mitocondrial, cujos produtos incluem ânion superóxido (O
2
•-
),
uma espécie reativa de oxigênio (ERO) (Wolff & Dean, 1986; Girotti, 1985). Tal espécie é
altamente reativa e produzida constantemente, sendo imediatamente neutralizada pela ação
de enzimas antioxidantes endógenas (Opara, 2006).
Na condição de hiperglicemia pós-prandial ou em caso de diabetes, o aumento da
glicose sanguínea ocorre, proporcionalmente à produção desse ânion superóxido, formado
durante as reações químicas que ocorrem na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial
(Giugliano et al., 2008; Aronson, 2008).
14
Mais especificamente, no caso do DM, a produção de ERO suplanta os mecanismos
de neutralização, produzindo dano celular (Opara, 2006). Isso acontece porque, além da
produção de ERO pelo ciclo de Krebs, em condições de hiperglicemia crônica, outras três
vias bioquímicas são ativadas. Uma delas é a via do poliol que produz dano celular por
acúmulo de sorbitol citoplasmático (Aronson, 2008). O sorbitol acumulado é resultante da
conversão da glicose excedente, desviada do ciclo de Krebs pela enzima aldose redutase,
causando um desequilíbrio no estado redox da célula (Figura 1). (Aronson, 2008).
O aumento do fluxo pela via dos polióis, induzido pelo aumento de ERO, determina
maior conversão de glicose em sorbitol, reduzindo NADPH e glutationa (antioxidante
intracelular) e aumentando o estresse oxidativo induzido pela hiperglicemia. O sorbitol é
convertido em frutose, resultando aumento da relação NADH: NAD+ , o que aumentaria a
síntese de novo de diacilglicerol (DAG), principal ativador fsiológico da proteína cinase C
(PKC) (Reis et al., 2008).
ROS = espécies reativas de oxigênio; NAD+ = nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidada; NADH =
nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida; NADPH = nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
reduzida; NADP+ = nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidada; GSSG = glutationa oxidada; GSH
= glutationa reduzida.
Figura 1: Aumento da atividade da aldose redutase pela via dos polióis (com permissão de Reis et al., 2008).
15
Outra via bioquímica ativada pela condição de hiperglicemia é aquela associada à
formação de produtos finais de glicação (AGEs) (Ceriello, 1999). Esses produtos são
proteínas ou lipídios que se tornam glicados após a exposição a açúcares oxidados. São
formados após uma sequência de reações de desidratação, condensação, fragmentação,
oxidação e ciclização, sofridas pela glicose ou outros açúcares redutores presentes nas
células. Essas reações de auto-oxidação da glicose são irreversíveis e os produtos
avançados de glicação formados acabam por reagir, por mecanismo não enzimático, com
aminoácidos localizados no resíduo N-terminal de proteínas (Reação de Maillard)
(Ceriello, 1999; Kikuchi et al., 2003). Além da perda da funcionalidade da proteína,
durante o processo de glicação são produzidas inúmeras ERO que aumentam ainda mais o
risco de dano celular (Kikuchi et al., 2003). Os AGEs modificam proteínas intracelulares
envolvidas na regulação gênica, alteram moléculas da matriz extracelular vizinha,
interferindo na sinalização entre a matriz e a célula, causando disfunção celular. Proteínas
como a albumina ativam os receptores de AGEs (RAGEs), estimulam a produção de
citocinas inflamatórias, fator de crescimento I, fator de necrose tumoral alfa,
prostaglandinas e fator estimulador de colônias de granulócitos, deflagrando uma resposta
inflamatória clássica acompanhada de dano celular (Figura 2) (Reis et al., 2008).
16
AGEs = produtos finais de glicação; ROS = espécies reativas de oxigênio; NFkB = fator nuclear k-B
RNA = ácido ribonucléico; mRNA = ácido ribonucléico mensageiro
Figura 2: Aumento da formação de AGEs e dano celular pela glicose (com permissão de Reis et al., 2008).
O aumento da atividade da fosfocinase C (PKC) é outra via bioquímica
responsabilizada por dano celular no diabetes (Brownlee, 2001). De fato, a ativação da
PKC resulta do aumento do segundo mensageiro diacilglicerol (DAG), em condições de
hiperglicemia intracelular, principalmente pela síntese de novo deste segundo mensageiro
por intermediários glicolíticos, dihidroxiacetona e glicerol 3-fosfato (Das Evcimen & King,
2007). A ativação da PKC afeta fatores de crescimento e enzimas intracelulares, alterando
a permeabilidade vascular e o fluxo sanguíneo, além de aumentar a expressão de
mediadores pró-inflamatórios (Nishikawa et al., 2000).
Coincidentemente, a ativação de todas essas vias envolve aumento da produção de
ânion superóxido pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, sugerindo uma
participação importante dessas ERO no dano celular no diabetes (Brownlee, 2001) (Figuras
3 e 4).
17
ROS = espécies reativas de oxigênio; PARP = poli ADP-ribose polimerase; GAPDH = gliceraldeído-3-
fosfato desidrogenase; AGEs = produtos finais de glicação; PKC = proteína cinase C; NFkB = fator nuclear
k-B
Figura 3: Mecanismos de dano celular induzido pela hiperglicemia (com permissão de Reis et al., 2008).
DAG = diacilglicerol; PKC = proteína cinase C; ET-1 = endotelina-1; NO = óxido nítrico; VEGF = fator de
crescimento celular endotlial; TGF-β = fator transformador do crescimento beta; PAI-1 = inibidor do ativador
do plasminogênio 1; NFkB = fator nuclear k-B; NAD(P) = H forma reduzida de NADP+; ROS = espécies
reativas de oxigênio.
Figura 4: Conseqüências patológicas da hiperglicemia (com permissão de Reis et al., 2008).
Nos tecidos periféricos, o desequilíbrio entre os mecanismos antioxidantes e os
produtos das reações de glicação, resultantes da hiperglicemia, têm sido associados ao
dano celular em indivíduos com hiperglicemia crônica (Ceriello et al., 2000; Giugliano et
18
al., 2008). No SNC, o estresse oxidativo tem sido associado ao aumento do dano neuronal.
Devido ao seu alto conteúdo lipídico e elevado consumo de oxigênio, o cérebro é
particularmente vulnerável ao dano oxidativo. Além disso, no cérebro a produção de
enzimas antioxidantes é menor em relação aos outros tecidos (Kikuchi et al., 2003;
Simonian & Coyle, 1996).
1.4 Diabetes e Sistema Nervoso Central (SNC)
Em pacientes diabéticos, a hiperglicemia crônica tem sido associada a alterações na
função do SNC, resultando em hipersensibilidade ao estresse, risco aumentado de derrame
cerebral, demência e déficit de aprendizado e de memória (Alvarez et al., 2009; Biessels et
al., 2002). Além disso, pacientes diabéticos apresentam maior risco de desordens afetivas,
demência e Alzheimer (Alvarez et al, 2009). Essas manifestações centrais têm sido
nomeadas “encefalopatia diabética” (Biessels et al., 2002, Brands et al, 2003). Alguns
autores correlacionam tais alterações centrais com aquelas que acontecem no processo
natural de senilidade (Biessels et al., 2002).
Porém, os mecanismos responsáveis pela associação entre os distúrbios neuronais e
de humor observados em pacientes diabéticos ainda não estão compreendidos, embora se
saiba que são acompanhadas de alterações no transporte de glicose, no fluxo sanguíneo e
no metabolismo cerebral (McCall, 1992; Biessels et al., 2002). Defeitos na cadeia de
transporte de elétrons mitocondrial, à semelhança com o aumento da idade, também estão
presentes na encefalopatia diabética, elevando a produção mitocondrial de espécies
reativas de oxigênio (ERO) em diversos tecidos, inclusive no cérebro (Halliwell &
Gutteridge, 2007).
19
Parece evidente que alterações vasculares decorrentes da hiperglicemia crônica no
SNC, semelhantes àquelas observadas na periferia, também contribuem para o
aparecimento da encefalopatia diabética (Álvares et al., 2009). Também se faz necessário
considerar variações não controladas dos níveis glicêmicos por alguns pacientes com
repetidos episódios de hipoglicemia, hiperglicemia, estado de acidose, cetose e coma
hiperosmolar que resultam em alterações neuroendócrinas e neuroquímicas que podem
afetar o equilíbrio dinâmico do SNC (Giugliano et al., 2008; Ceriello, 2003; Mooradian,
1997). Situações extremas de hiperglicemia ou hipoglicemia são geralmente acompanhadas
de perda da consciência, convulsão e coma (Mooradian, 1997). A hipoglicemia aguda,
resultante da administração de doses elevadas de agentes hipoglicemiantes, está
relacionada com o aumento da liberação de aminoácidos excitatórios com potencial
citotóxico para o neurônio (McCall, 1992). Por outro lado, a elevada concentração de
glicose circulante nos indivíduos diabéticos, resultado do controle glicêmico inadequado,
pode resultar em isquemia, cuja ausência de oxigênio leva à metabolização da glicose a
ácido lático. A redução do pH intra e extracelular pelo ácido lático, bem como o próprio
ácido lático, apresentam potencial neurotóxico (McCall, 1992).
Adicionalmente, biomarcadores de envelhecimento celular como a lipofucsina
estão aumentados em animais diabéticos, enquanto biomarcadores de proliferação celular
no hipocampo estão diminuídos (Gao & Gao, 2007; Alvarez et al., 2009; Simonian &
Coyle, 1996; Assunção et al., 2007a). Tais alterações podem estar relacionadas às
mudanças de comportamento e déficit cognitivo observados na encefalopatia diabética. A
lipoperoxidação também está aumentada no tecido cerebral de ratos diabéticos submetidos
a um modelo animal de depressão (Haeser et al., 2007). Estudos têm mostrado que a
administração de antioxidantes diminui o estresse oxidativo em diferentes áreas cerebrais
20
de ratos diabéticos, sendo capaz de melhorar as funções cognitivas, indicando que o
estresse oxidativo pode estar associado à encefalopatia diabética (Tuzcu & Baydas, 2006).
1.5 Modelo Animal para o Estudo do DM
Existem vários modelos animais para o estudo do DM. O modelo mais antigo, em
desuso nos dias de hoje, é a pancreatectomia total ou parcial. Atualmente, o DM é
reproduzido pelo emprego de substâncias tóxicas às células beta, como a estreptozotocina e
o aloxano, sendo a primeira a mais utilizada (Rhoden & Rhoden, 2006).
A estreptozotocina é uma nitrosuréia derivada do fungo Streptomyces
Achromogenes e possui propriedades antitumorais, oncogênicas e diabetogênicas. Seu
mecanismo de ação para a indução do diabetes, refere-se a sua capacidade de destruir
seletivamente as células beta-pancreáticas, mimetizando o diabetes insulino-dependente
em humanos (Gomez & Barros, 2006). Estudos pré-clínicos revelam que a
estreptozotocina provoca ruptura das ilhotas de Langherans com conseqüente diminuição
ou ausência dos grânulos das células beta (Delfino et al.,2002), levando à pronunciada
hiperglicemia, alteração nos níveis séricos de corpos cetônicos, de ácidos graxos livres e de
intermediários glicolíticos (glicogênio e citrato) (Sato et al., 2006). A estreptozotocina
possui meia-vida plasmática de 15 minutos, iniciando-se a necrose celular apenas 45
minutos após a administração. O DM ocorre em 1 ou 2 dias (Gomez & Barros, 2006).
Neste estudo, foi seguido o protocolo preconizado por Gomez & Barros (2003).
Após jejum de 12 horas, os animais receberam uma dose única de estreptozotocina
intraperitoneal (60mg/Kg) dissolvida em tampão citrato de sódio, pH 4,5. Foram
considerados diabéticos os animais que apresentaram glicemia > 200mg/dL. Após 72 horas
21
da administração, pode-se observar os sinais clínicos da hiperglicemia (400-600mg/dL):
poliúria, polidipsia, polifagia e perda de peso.
2. Estresse Oxidativo
2.1 Espécies Reativas de Oxigênio (ERO)
As ERO são espécies químicas produzidas durante processos metabólicos
aeróbicos, possuem natureza altamente reativa e enorme capacidade de causar dano celular
(Opara, 2006). A produção de ERO pode ser induzida tanto por fonte endógena quanto
exógena. Dentre as principais fontes endógenas, estão aquelas associadas ao metabolismo
normal de células como transporte de elétrons e reações de oxidação. Tais espécies podem
ser ativadas intracelularmente no local de produção ou podem ser liberadas, atuando em
áreas subjacentes (Halliwell & Gutteridge, 2007). As fontes exógenas podem ser
representadas por diferentes agentes, dentre eles podemos destacar: fumaça do cigarro,
poluentes ambientais, pesticidas, radiação, solventes orgânicos, entre outros (Opara, 2006).
O metabolismo normal do oxigênio envolve sua redução completa à água,
incorporando 4 elétrons ao final da cadeia respiratória mitocondrial. As ERO são
produzidas quando há redução monovalente da molécula do oxigênio com número menor
de elétrons, gerando espécies reativas intermediárias, sendo as principais: oxigênio singlete
(O
2
), radical hidroxil (OH
•
), ânion superóxido (O
2
•-
) e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
(Halliwell & Gutteridge, 2007; Opara, 2006).
22
Tabela 1: Exemplos de espécies reativas de oxigênio.
Radicais Livres Não radicais
Superóxido O
2
· -
Peróxido de hidrogênio H
2
O
2
Hidroxil OH
·
Ácido hipocloroso HOCl
Peroxil RO
2
·
Ozônio O
3
Alcoxil RO
·
Oxigênio Singlete O
2
Hidroperoxil HO
2
·
Peroxinitrito ONOO
-
O termo radical livre designa um átomo ou grupo de átomos com um elétron
desemparelhado, ou seja, um elétron não pareado na sua órbita externa, o que confere a
essas espécies, alta reatividade. Na verdade, o termo radical livre não é apropriadamente
empregado para designar agentes reativos patogênicos, pois alguns deles não apresentam
elétrons desemparelhados em sua última camada, como é o caso do peróxido de
hidrogênio. Por isso, é preferível utilizar a expressão “espécies reativas” (Halliwell &
Gutteridge, 2007).
A formação das espécies reativas de oxigênio ocorre da seguinte maneira:
Reação 1: Adição de um elétron à molécula de oxigênio gera um radical superóxido.
O
2
+ 1e
-
→ O
2
- •
Reação 2: O ânion superóxido, ao receber um elétron e dois íons hidrogênio, gera
peróxido de hidrogênio.
2O
2
-•
+ 2H
+
SOD
H
2
O
2
+ O
2
23
Reação 3: O peróxido de hidrogênio, ao receber um elétron e um hidrogênio, gera o
radical hidroxil. Esse radical também pode ser formado a partir de reações
com íons ferro ou cobre (reação de Fenton).
Fe
+2
/Cu + H
2
O
2
Fe
+3
/Cu
+2
+ OH
•
+ OH
•
Reação 4: O peróxido de hidrogênio, ao reagir com ânion superóxido, forma o radical
hidroxil (reação de Haber-Weiss).
O
2
-•
+ H
2
O
2
Fe/Cu
O
2
+ H
2
O + OH
•
O radical hidroxil, com meia vida de cerca de 10
-6
milissegundos, é o mais reativo
das ERO e, portanto, o mais prejudicial às estruturas celulares. O ânion superóxido é
menos reativo que o radical hidroxil e apresenta meia vida mais longa (t
1/2
= 10
5
milissegundos). É gerado principalmente na mitocôndria, microssomas e peroxissomas
(Halliwell & Gutteridge, 2007). Em meio ácido, rapidamente forma peróxido de
hidrogênio. Em meio neutro ou básico, o ânion superóxido sofre dismutação, reação
catalizada pela enzima superóxido dismutase (SOD) (Fridovich, 1975). Ao reagir com
óxido nítrico, o ânion superóxido forma peroxinitrito, outro potente agente oxidante
(Halliwell & Gutteridge, 2007; Opara, 2006). O peróxido de hidrogênio, por sua vez,
embora não seja classificado como um radical, pode reagir com metais como ferro e cobre,
produzindo novas ERO. Possui meia-vida longa (t
1/2
= 7 segundos) quando comparado às
outras ERO e apresenta grande capacidade de se difundir através das membranas celulares
hidrofóbicas, com taxa de difusão semelhante à água (Valko et al., 2005; Berg et al.,
2004).
Inevitavelmente, todas essas espécies, produzidas durante reações bioquímicas
essenciais, por serem muito reativas e instáveis, podem reagir com estruturas celulares
24
como lipídios de membrana, proteínas, carboidratos ou o próprio DNA, comprometendo
suas funções de modo irreversível (Berg et al., 2004). Em condições normais, sistemas
antioxidantes endógenos e exógenos neutralizam essas ERO, reduzindo o dano celular
sobre o organismo. Porém, pelo envelhecimento, ou alterações metabólicas como aquelas
presentes no diabetes, ou outras doenças crônicas, percebe-se um desequilíbrio entre a
produção de ERO e sua neutralização, resultando em dano celular (Opara, 2006; Ferreira &
Matsubara, 1997).
2.2 Estresse Oxidativo e Dano Celular
Na condição de desequilíbrio, quando a produção de ERO supera as defesas
antioxidantes se estabelece a condição conhecida como estresse oxidativo (Halliwell,
2007). Portanto, o estresse oxidativo é decorrente de um excesso de formação ou
insuficiente remoção de espécies reativas, não só de oxigênio, mas também de nitrogênio,
de enxofre, de cloro, de carbono ou mesmo na presença de metais de transição. Tais
radicais podem reagir e formar ligações cruzadas com lipídeos, proteínas e ácidos
nucléicos, causando danos em macromoléculas essenciais aos tecidos biológicos (Halliwell
& Gutteridge, 2007; Opara, 2006).
As lesões teciduais causadas pelas ERO estão presentes em várias condições, como
por exemplo, resposta inflamatória, sepse, insuficiência cardíaca, transplantes, diabetes,
entre outras. Essas situações clínicas possuem um ponto comum: existência de hipóxia
seguida de reoxigenação, ou seja, isquemia seguida de reperfusão, condições que
propiciam a geração de mais espécies reativas (Halliwell, 2007; Ferreira & Matsubara,
1997).
25
O dano oxidativo causado pelas ERO às estruturas celulares inclui: fragmentação,
agregação e digestão proteolítica em proteínas e aminoácidos, cujo principal responsável é
o radical hidroxil. Nos lipídeos, ocorre peroxidação de ácidos graxos poliinsaturados,
especialmente o linoléico, araquidônico e docosahexanóico (DHA), com formação de
hidroperóxidos (Mylonas & Kouretas, 1999). Em relação aos carboidratos, os
monossacarídeos em condições fisiológicas sofrem auto-oxidação, gerando peróxido de
hidrogênio. A glicose oxidada pode reagir com proteínas em um processo denominado
glicosilação ou glicação, condição especialmente importante no diabetes (Wolff & Dean,
1986; Girotti, 1985), conforme descrito anteriormente.
A lipoperoxidação é um dos principais mecanismos de lesão das membranas
celulares, uma vez que as mesmas contêm grandes quantidades de ácidos graxos
poliinsaturados, menos resistentes aos ataques das espécies reativas do que os ácidos
graxos saturados ou monoinsaturados (Girotti, 1985). Uma vez iniciado, o processo de
lipoperoxidação se autopropaga, produzindo dano à membrana, levando à perda de fluidez,
perda de alinhamento de receptores e até lise celular (Mylonas & Kouretas, 1999). A
lipoperoxidação pode alterar a permeabilidade das membranas, induzindo à formação de
poros. No enterócito, esse processo pode levar à alteração da permeabilidade vascular,
edema e inflamação (Girotti, 1985).
O dano oxidativo lipídico pode ser mensurado através da quantificação dos
produtos da lipoperoxidação, como por exemplo, o malondialdeído. Esse metabólito da
lipoperoxidação pode ser medido por uma técnica denominada “Técnica das Substâncias
Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico”, proposta por Buege e Aust (1978).
Uma infinidade de doenças tem sido relacionadas às ERO (Figura 5), tais como
diabetes, aterosclerose, cardiopatias, pneumopatias, injúria de isquemia-reperfusão,
26
doenças crônico-degenerativas, artrite reumatóide, infecção pelo vírus HIV, doenças auto-
imunes, catarata, câncer, entre outras (Ferreira & Matsubara, 1997).
Figura 5: Doenças relacionas às espécies reativas de oxigênio (adaptado de Belló-Klein, 2001).
Todas as doenças são desencadeadas por uma injúria inicial (isquemia, trauma,
toxinas, radiação, infecção, etc) que determina alterações intracelulares, como:
recrutamento de macrófagos, dano mitocondrial, alterações nas defesas antioxidantes,
aumento do cálcio intracelular, conversão da xantina desidrogenase a xantina oxidase
(Halliwell, 2007). Tais alterações geram estresse oxidativo, levando o organismo a três
possibilidades: adaptação, por aumento na atividade dos sistemas antioxidantes; dano
tecidual, por agressão a lipídios, carboidratos ou proteínas; morte celuar por necrose ou
apoptose (Opara, 2006; Halliwell, 2007).
Coração
Trombose
Hipertrofia
Multiórgão
Inflamação
Intoxicações
Envelhecimento
Isquemia
Câncer
Olho
Catarata
Retinopatia
TGI
Pancreatite
Hepatotoxicidade
Eritrócitos
Anemia (Fanconi)
Malária
Pulmão
Asma
Enfisema
Pele
Psoríase
Queimadura
Vasos
Aterosclerose
SNC
Parkinson
Demência
Articulações
Artrite
Rim
Transplante
ERO
27
2.3 Estresse Oxidativo e Proliferação Celular
É importante salientar que o aumento da produção de ERO intracelular promove
ambiente mais oxidado, favorecendo processos de apoptose. Ao contrário, ambientes mais
reduzidos estão associados à estimulação da proliferação celular (Hengartner, 2000; Valko
et al., 2006). Os mecanismos de apoptose estão baseados no equilíbrio entre a ausência de
sinais positivos como, por exemplo, fatores de crescimento neuronal, interleucina 2, entre
outros, e a presença de sinais negativos, como níveis elevados de oxidantes dentro da
célula, dano do DNA, irradiação de alta energia, quimioterapia, etc. (Hengartner, 2000).
Sendo assim, a hiperglicemia crônica pode estimular mecanismos de apoptose, o que
significa que a utilização de substâncias com propriedades antioxidantes pode suprimir a
apoptose e promover a proliferação celular.
Desde 1980, estudos de proliferação celular e neurogênese são conduzidos,
utilizando-se BrdU (5-bromo-2’-deoxiuridina) como marcador de células em divisão (Yu
et al., 1992). Análogo sintético à timidina, o BrdU é capaz de marcar núcleos celulares em
diferentes estágios do ciclo celular: proliferação, sobrevivência e diferenciação (Taupin,
2007; Yu et al., 1992;). Da mesma forma que a timidina, o BrdU é captado pelas células
durante a fase de síntese do ciclo celular, permitindo a visualização dos núcleos marcados
através de técnicas de imunohistoquímica (Figura 6 ) (Novakowski et al., 1989).
28
Figura 6: Exemplo de marcação de células BrdU positivas no giro denteado do hipocampo.
No SNC, a região mais frequentemente estudada é a região hipocampal,
sabidamente envolvida com mecanismos cognitivos, de aprendizado e de memória, além
de participar do circuito límbico, relacionado às emoções (Bear et al., 2002). Essa região
parece particularmente sensível aos estímulos neurogênicos e tem sido alvo de
investigação (Gould & Tanapat, 1997; Eriksson et al., 1998; Gross, 2000).
Em animais diabéticos, estudos mostram que a hiperglicemia crônica diminui a
neurogênese no hipocampo, fator que pode estar relacionado à deficiência cognitiva e de
memória e que pode levar ao desenvolvimento de encefalopatia diabética (Zhang et al.,
2008; Jackson-Guilford et al, 2000). Assim, juntos, o estresse oxidativo e a diminuição da
proliferação celuar no hipocampo parecem contribuir para o desenvolvimento de
encefalopatia em indivíduos com hiperglicemia crônica.
Embora não se saiba exatamente quais são os estímulos negativos associados à
redução da proliferação celular e neurogênese no hipocampo de indivíduos diabéticos,
alguns resultados apontam para o aumento da produção de ERO pela hiperglicemia crônica
(Zhang et al., 2008). Alguns poucos estudos indicam que a administração de substâncias
antioxidantes pode reverter esse efeito anti-proliferativo da hiperglicemia crônica (Ates et
29
al., 2007; Montilla et al., 2004). O SNC, especialmente o hipocampo, o córtex frontal e o
estriado, por serem estruturas do sistema límbico, mostram maior vulnerabilidade à
lipoperoxidação e à neuroplasticidade nas doenças neurodegenerativas, distúrbios do
envelhecimento e transtornos do humor (Biessels et al., 2002; Simonian & Coyle, 1996,
Tsaluchidu et al., 2008), motivo pelo qual o efeito de antioxidantes sobre a proliferação
celular no hipocampo também foi objetivo deste estudo.
Hipotetizando-se que a encefalopatia diabética esteja relacionada ao desequilíbrio
entre produção e neutralização de ERO e prejuízo da proliferação celular no hipocampo, a
prevenção do estresse oxidativo poderia ser considerada a primeira defesa contra o
desenvolvimento de complicações no SNC de indivíduos diabéticos.
2.4 Defesas Antioxidantes
Define-se antioxidante como sendo “qualquer substância que retarda, previne ou
remove o dano oxidativo de uma molécula alvo” (Halliwell & Gutteridge, 2007). Essas
substâncias podem ser sintetizadas in vivo ou podem ser obtidas através da dieta. In vivo,
sistemas não enzimáticos e enzimáticos atuam interconectados. O sistema antioxidante
enzimático é constituído por metaloenzimas como a catalase (CAT), a superóxido
dismutase (SOD) e a glutationa peroxidase (GSH-Px), todas ativadas na presença de metais
(Halliwell & Gutteridge, 2007).
30
2.4.1 Defesas Antioxidantes Enzimáticas
Catalase (CAT)
A CAT, dependente de ferro, é encontrada em maior quantidade no citosol e nos
peroxissomas. Nos tecidos, a CAT é encontrada em maior concentração no fígado e em
baixas concentrações no cérebro, no coração e no músculo esquelético. É considerada a
principal enzima de defesa antioxidante, atuando principalmente na decomposição do H
2
O
2
em água (Figura 7). A CAT é especialmente estimulada pela presença de concentrações
elevadas de H
2
O
2
(Bartosz, 2005; Ferreira & Matsubara, 1997).
H
2
O
2
CAT H
2
O + O
2
Figura 7: Decomposição do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio pela catalase (Halliwell &
Gutteridge, 2007).
A atividade da CAT pode ser determinada pela taxa de decomposição do peróxido
de hidrogênio em água e oxigênio molecular. Peróxido de hidrogênio é colocado em uma
amostra de tecido e a concentração da enzima existente nesse tecido é proporcional à
quantidade de peróxido de hidrogênio decomposto pela enzima (Aebi, 1984).
Superóxido Dismutase (SOD)
A SOD previne o acúmulo do radical superóxido (O
2
•-
), acelerando sua conversão
em H
2
O
2
(Figura 8). A SOD é classificada em três tipos: a Cu/ZnSOD, a MnSOD e a
FeSOD. A Cu/ZnSOD catalisa a reação de dismutação do radical ânion superóxido e se
encontra distribuída principalmente no citosol. A MnSOD catalisa a mesma reação da
Cu/Zn e se localiza na mitocôndria. Possui sensibilidade ao calor e à ação de produtos
químicos, podendo sofrer desnaturação. FeSOD encontra-se, na sua maioria, na matriz
31
extracelular, no plasma, na linfa, nos fluidos cerebroespinhal e peritoneal (Fridovich, 1975;
Bartosz, 2005). Nos tecidos, a SOD está presente em grandes concentrações no músculo
esquelético e nos pulmões (Halliwell & Gutteridge, 2007).
2O
2
• -
+ 2H
+
H
2
O
2
+ O
2
Figura 8: Dismutação do ânion superóxido em peróxido de hidrogênio (Halliwell & Gutteridge,
2007).
A concentração de SOD em tecidos biológicos pode ser determinada, utilizando-se
pirogalol, uma substância com grande poder de auto-oxidação. A SOD existente no tecido
analisado impedirá a oxidação do pirogalol, inibindo a reação em 50% (Marklund, 1985).
Glutationa Peroxidase (GSH-Px)
Existem dois tipos principais de glutationa: seleno-dependente, que reage
espontaneamente com o peróxido de hidrogênio, e seleno-independente, ou transferases
que só reagem com outros hidroperóxidos e praticamente não reagem na presença de H
2
O
2
.
No fígado, 70% da atividade da glutationa é citossólica, sendo o restante mitocondrial
(Mannervik, 1985). A GSH-Px dependente de selênio se localiza no citosol e em grande
quantidade no meio extra-celular. Encontra-se distribuída em todos os sistemas celulares,
em grande quantidade no cérebro, sendo responsável, juntamente com a catalase, pela
conversão de H
2
O
2
em água (Figura 9) (Halliwell & Gutteridge, 2007; Ferreira &
Matsubara, 1997).
SOD
32
H
2
O
2
+ 2GSH GSSG + 2H
2
O
Figura 9: Redução da glutationa pela glutationa peroxidase e transformação de peróxido de
hidrogênio em água (Halliwell & Gutteridge, 2007).
O conteúdo de glutationa pode ser determinado através da técnica proposta por
Wendel (1981), na qual é adicionado NADPH na amostra do tecido estudado. A atividade
da glutationa é proporcional à quantidade de NADPH consumida por minuto pela enzima,
monitorado por espectrofotômetro.
2.4.2 Defesas Antioxidantes Não Enzimáticas
A defesa antioxidante não enzimática é constituída por moléculas pequenas como a
glutationa (GSH) e vários micronutrientes: vitaminas A, B
1
, B
2
, B
6,
B
12
, C e E, cobre,
zinco, selênio, carotenóides, ácido α-lipóico, ácido fólico, ácido úrico, albumina,
glutationa, coenzima Q
10
(Johansen et al., 2005). A glutationa e as vitaminas A, C e E
atuam como aceptores de elétrons (Halliwell & Gutteridge, 2007), enquanto que os
elementos-traço selênio, ferro, zinco, cobre e manganês atuam como cofatores para
enzimas antioxidantes, porém sem ação intrínseca (Machlin & Bendich, 1987; Opara,
2006).
Como mencionado, a dieta é importante fonte de antioxidantes. Antioxidantes
exógenos obtidos da dieta, como licopeno, β-caroteno, vitamina C, ácido lipóico e
polifenóis têm sido investigados pelos seus benefícios potenciais em diminuir ou proteger
contra o dano oxidativo, atenuando o estresse oxidativo no estado diabético (Kuhad et al.,
2008; Sadi et al., 2008; Hamblin, et al., 2007).
Polifenóis, presentes em frutas e vegetais como uva, tomate, chá verde, azeitonas,
chocolate, entre outros, também têm demonstrado atividade antioxidante, neutralizando
GPx
33
ERO e espécies reativas de nitrogênio (ERN) (Singh, et al., 2008; Johansen et al., 2005;
Olas & Wachowicz, 2002). Dentre estes, o resveratrol, um polifenol encontrado em grande
quantidade nas cascas de uvas, nozes, chocolate e em bebidas como vinho tinto, vem se
destacando pelas suas propriedades antioxidantes e eficácia farmacológica (Orallo, 2008;
D’Archivio, et al. 2007).
3. Resveratrol
3.1 Fontes e Características Químicas
O resveratrol foi primeiramente detectado em videiras Vitis vinifera, no ano de
1976, por Langcake e Pryce que verificaram que esse composto era sintetizado pelos
tecidos vegetais em resposta à infecção por fungos e à exposição à luz ultravioleta
(Langcake & Pryce, 1977). Somente a partir de 1992 o resveratrol passou a ser estudado
como um ingrediente biologicamente ativo presente nos vinhos, principalmente os tintos.
Nesse mesmo ano, foi comprovada a presença de trans-resveratrol nos vinhos, chamando
atenção ao fato do composto ser também um constituinte da popular medicina oriental.
O resveratrol (trans-3,5,4-trihidroxi-trans-estilbeno) é encontrado em mais de 70
espécies de plantas, entre elas, amendoim, pinhão, amoras e uvas (Figura 10). Também
pode ser isolado de sementes, raízes, frutas e inflorescências de acordo com as espécies
(Burns et al., 2002). No entanto, é nas cascas das uvas e vinhos tintos que o resveratrol é
encontrado em maior concentração (Waterhouse et al., 1993; Jeandet et al., 1995;
Bavaresco, 2003). Nas cascas das uvas a concentração de resveratrol varia entre 50 e
34
100µ/g, enquanto nos vinhos pode variar de 0,2 à 7,7mg/L, dependendo de diversos fatores
como:
• Em relação à uva: tipo de uva, características do clima e do solo, modo de cultivo,
infecção por fungos, origem geográfica, entre outros;
• Em relação ao vinho: tipo de vinho, processo de vinificação, técnica enológica,
tempo de fermentação, entre outros.
Nos vinhos tintos brasileiros o resveratrol está presente em concentração que varia
entre 0,82 e 5,75mg/L, com um valor médio de 2,57mg/L. Análise realizada em vinhos
tintos provenientes da região sul do Brasil mostra concentração significativa de trans-
resveratrol (Souto et al., 2001).
Figura 10: Fontes de resveratrol em diferentes plantas (adaptado de Aggarwal et al., 2004).
35
A estrutura do resveratrol consiste de dois anéis fenólicos unidos por uma ligação
dupla de estireno que gera um 3,5,4-trihidroxiestilbeno, sendo que os grupos hidroxil
podem mudar de número e de posição (Figura 11). O resveratrol é uma fitoalexina
pertencente ao grupo dos estilbenos, uma subclasse dos compostos fenólicos (Roupe et al.,
2006; López-Vélez et al., 2003). Entende-se por fitoalexina a classe de vegetais superiores
que, em resposta a algum tipo de estresse, produz um composto tóxico como forma de
proteção. É insolúvel em água, porém solúvel em etanol e dimetilsulfóxido. Ocorre na
forma de isômeros cis e trans, sendo o trans-resveratrol encontrado em maior quantidade
na natureza e relacionado aos benefícios medicinais deste composto (Ovesná &
Horváthová-Kozics, 2005).
Figura 11: Estrutura química do resveratrol e seus derivados (Adaptado de Frémont, 2000).
A forma trans é comercialmente disponível e se converte na forma cis mediante
exposição à irradiação ultravioleta. O trans-resveratrol se mantém estável por meses se for
mantido protegido da luz, porém é instável ao pH elevado. O isômero cis é extremamente
sensível à luz, mas pode se manter estável ao abrigo da luz, à temperatura ambiente e em
36
etanol 50% por no máximo 35 dias. A presença da forma cis encontrada, por exemplo, em
alguns tipos de vinho, é atribuída à reação enzimática de conversão fotoisomérica que
ocorre durante o processo de fermentação ou à liberação de oligômeros do resveratrol
(Roupe et al., 2006).
3.2 Propriedades Farmacológicas
As propriedades farmacológicas do resveratrol revelam que ele possui eficácia
antioxidante, anti-inflamatória, anti-proliferativa e inibidora da agregação plaquetária,
sendo considerado clinicamente efetivo no controle da aterosclerose, doenças cardíacas e
câncer (Huang et al., 2001; Orallo, 2006).
O mecanismo de ação do resveratrol ainda não está completamente elucidado, mas
sabe-se, até o momento, que ele regula e/ou modula cascatas sinalizadoras intracelulares
(Harikumar & Aggarwal, 2008). Estudos indicam que o resveratrol inibe diretamente a
proteína cinase C, interferindo sobre a função celular (Slater et al., 2003). Além disso, o
resveratrol também inibe aromatases (Neves et al., 2007), β-lactoglobulinas (Liang et al,
2008), topoisomerase II (Jo et al., 2006), lipoproteínas plasmáticas (Belguendouz et al.,
1998), ácidos nucléicos (Usha et al., 2005), receptores para estrogênio α e β (Abou-Zeid &
El-Mowafy, 2004), receptores para sulfoniluréias (Hambrock et al., 2007), entre tantos
outros (Harikumar & Aggarwal, 2008). De modo indireto, o resveratrol pode inibir alguns
fatores de crescimento, modulando genes reguladores do ciclo celular (Kim et al., 2006),
ciclina dependente de cinases (CDK) e c-myc (Zhang et al., 2006). Além disso, o
resveratrol induz apoptose pelo aumento da expressão da p53 e redução da expressão de
inibidores de apoptose como o Bcl-2, Bcl-X, survivina e fator-2 associado ao receptor do
TNF (TRAF2) (Brito et al., 2008; Tikoo et al., 2008). Também apresenta efeito inibitório
37
sobre mecanismos de angiogênese e vias metastásicas, modulando a expressão de
metaloproteinases de matriz (MMP), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),
catepsina D, moléculas de adesão intracelular 1 (ICAM-1) e selectina-E (Bhardwaj et al.,
2007). Suas propriedades antiinflamatórias são mediadas pela inibição de vários
biomarcadores como fator de necrose tumoral (TNF), ciclooxigenase-2 (COX-2), oxido
nítrico induzida (iNOS), proteína C reativa (CPR), γ-interferon e várias interleucinas
(Udenigwe et al., 2008). Seu efeito antioxidante é observado pelo aumento da expressão de
enzimas antioxidantes como SOD, CAT e GSH-Px (Harikumar & Aggarwal, 2008).
Estudos em humanos mostram que após administração oral de 25 mg, cerca de 70%
do resveratrol é absorvido, atingindo picos plasmáticos de 469 ± 90 ng/mL após 30-60
minutos, com meia vida plasmática de 9,2 ± 0,6 h (Goldberg et al., 2003). Grande parte do
resveratrol sofre conjugação ou glicuronidação, sendo que apenas traços do resveratrol
estão presentes no plasma na sua forma não modificada (Walle et al., 2004). A recuperação
urinária do resveratrol varia de 53 a 85% em humanos, sendo eliminada nas fezes em
concentrações que variam de 0,6 a 22,7% após administração endovenosa (Goldberg et al.,
2003).
Alguns poucos estudos pré-clínicos mostram que o tratamento crônico com
resveratrol melhora a condição de ratos diabéticos, atenuando sintomas como polifagia e
polidipsia, além de redução da taxa de perda de peso (Su et al., 2006). Seu efeito
hipoglicemiante parece estar associado ao aumento dos níveis de insulina,
concomitantemente ao aumento da expressão dos transportadores de glicose (GLUT4) no
músculo esquelético (Chi et al., 2007; Su et al., 2006). O resveratrol também melhora a
função cardiovascular de ratos diabéticos, atribuído em parte ao relaxamento vascular da
aorta, associado à melhora da função ventricular e redução dos níveis séricos de colesterol
38
(Thirunavukkarasu et al., 2007; Silan, 2008;). A função renal também melhora após
administração de resveratrol em ratos diabéticos, acompanhada de aumento da expressão
de enzimas antioxidantes como a SOD e CAT, nesse órgão (Jesus Soares et al, 2007;
Sharma et al., 2006; Tikoo et al., 2008). Um único estudo mostra que, no SNC, o
resveratrol reduz o estresse oxidativo e aumenta os níveis de glutationa peroxidase no
hipocampo, córtex e cerebelo de ratos diabéticos, sugerindo efeito neuroprotetor (Ates et
al., 2007).
O resveratrol atua também removendo ERO, quelando metais e modulando enzimas
(Saiko et al., 2008; Robb et al., 2008). Além disso, o vinho tinto e o resveratrol também
mostraram ser capazes de reduzir a lipoperoxidação e aumentar os níveis de enzimas
antioxidantes em diferentes áreas cerebrais de ratos diabéticos (Ates et al., 2007; Assunção
et al., 2007b).
4. Vinho Tinto
4.1 Caracterização
O vinho tinto é resultado da fermentação alcoólica do mosto ou suco de uva,
através da transformação dos açúcares da uva em álcool etílico, processo resultante da ação
de leveduras. Contém entre 10 e 15% de álcool e possui mais de 200 componentes,
incluindo água, álcool etílico, anidrido carbônico, ácidos orgânicos, aldeídos e ésteres, sais
minerais, compostos nitrogenados, proteínas e carboidratos (Salvador & Picada, 2002).
Ao contrário dos vinhos brancos, elaborados somente com o suco ou polpa da uva,
os tintos são resultantes da permanência da casca com o suco, processo denominado
maceração. Essa etapa é de fundamental importância, já que o tempo de maceração
39
determina a concentração dos componentes que são extratídos da casca da uva, bem como
o tipo de vinho tinto que se deseja elaborar (Lona, 2006).
4.2 Propriedades Farmacológicas
Um estudo realizado na França mostrou menor incidência de doenças coronarianas
naquele país do que em outros países industrializados, embora fatores de risco como
consumo de gordura saturada, níveis séricos de colesterol, pressão arterial, índice de massa
corporal, tabagismo e sedentarismo não fossem menores. Esse fenômeno foi denominado
“Paradoxo Francês” e foi atribuído ao consumo regular de vinho tinto durante as refeições,
o que seria responsável pelo menor índice de morbi-mortalidade por doenças arteriais
coronarianas entre os franceses (Renaud & Lorgeril, 1993).
Atualmente, sabe-se que o vinho tinto exerce efeito cardioprotetor devido a uma
combinação de diversas ações bioquímicas e moleculares que incluem: alterações no
metabolismo lipídico, efeito antioxidante, alterações na agregação plaquetária,
vasodilatação arterial mediada pelo óxido nítrico, indução da expressão de proteínas
cardioprotetoras, aumento da sensibilidade à insulina e baixos níveis de marcadores
inflamatórios (Providência, 2006; Olas & Wachowicz, 2005; Sun et al., 2002). Alguns
autores afirmam que tais propriedades, observadas especialmente pelo consumo de vinho
tinto, se devem à presença de resveratrol, presente na sua matriz complexa (Wu et al.,
2001). De fato, os níveis plasmáticos de antioxidantes mostram-se mais elevados pelo
consumo de vinho tinto do que somente de etanol após uma refeição rica em gorduras
(Natella et al., 2001). Em ratos, o tratamento crônico com vinho tinto também se mostrou
superior ao tratamento com solução alcoólica, reduzindo o estresse oxidativo no
hipocampo desses animais (Assunção et al., 2007b).
40
Em indivíduos diabéticos, o vinho tinto também se mostrou benéfico, reduzindo o
estresse oxidativo e o risco de doença cardiovascular em pacientes com DM2 (Caimi et al.,
2003, Ceriello et al., 2001). Em animais diabéticos, o vinho tinto apresenta eficácia
antioxidante e protetora sobre pâncreas, rim e fígado (Montilla et al., 2004). Além desses
órgãos, o vinho tinto também mostra efeito neuroprotetor quando administrado
cronicamente e em doses moderadas (Montilla et al., 2005).
41
OBJETIVO GERAL
Comparar o efeito antioxidante do vinho tinto e do resveratrol sobre o estresse
oxidativo e proliferação celular no sistema nervoso central de ratos diabéticos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a lipoperoxidação no sistema nervoso central (hipocampo, córtex e
estriado) de ratos diabéticos e não diabéticos tratados cronicamente com vinho
tinto ou resveratrol;
2. Avaliar a atividade das enzimas antioxidantes catalase e superóxido dismutase
no sistema nervoso central (hipocampo, córtex e estriado) de ratos diabéticos e
não diabéticos tratados cronicamente com vinho tinto ou resveratrol;
3. Avaliar o efeito do vinho tinto e do resveratrol sobre os mecanismos de
proliferação celular no hipocampo de ratos diabéticos e não diabéticos.
42
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52
ARTIGO CIENTÍFICO
Submetido à Diabetes (Fator de Impacto: 8,261 - JCR-2007).
Submissão n
o
DB-09-0153.
53
Diabetes, oxidative stress and neuronal proliferation in the central nervous system of
rats: the effect of chronic treatment with red wine or resveratrol
Carina D Venturini
1
, Suélen Merlo
1
, André A Souto
2
, Marilda C Fernandes
1
, Rosane
Gomez
1,3
, Claudia R Rhoden
1
1
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil
2
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil
3
Centro Universitário Metodista IPA, Porto Alegre, Brazil
Rosane Gomez
Division of Pharmacology
Rua Sarmento Leite, 245
PC 90050-170 - Porto Alegre - Brazil
Phone: +55 (51) 3303-9000
Fax +55 (51) 3303-8810
E-mail: [email protected]
1. RUNNING TITLE: RED WINE, RESVERATROL AND DIABETES
2. WORD COUNT: 3,970
3. NUMBER OF FIGURES: 4
54
Abstract
Objective: Chronic hyperglycemia increases oxidative stress status and has been associated
with neurological complications in diabetic individuals. Here we compared the antioxidant
properties of moderate doses of red wine or resveratrol supplements in different brain areas
of diabetic and non-diabetic rats, and investigated the effect of these natural antioxidants
on hippocampal proliferation in diabetic rats.
Research design and methods: Streptozotocin-induced diabetic rats and control rats were
treated with red wine (4mL/kg), resveratrol (20 mg/kg), or saline, orally administered, by
oral gavage, for 21 days. Lipid peroxidation (TBARS), catalase and superoxide dismutase
were measured to evaluate the oxidative stress and the BrdU-positive cells were assessed
to measure changes in neuronal proliferation.
Results: In diabetic animals, resveratrol showed antioxidant property in the hippocampus
and in the striatum, evidenced by a decrease in lipid peroxidation and an increase of
catalase activity. For the same diabetic group, red wine had an antioxidant effect only in
the hippocampus. In non-diabetic rats both red wine and resveratrol decreased lipid
peroxidation in the frontal cortex and in the striatum and resveratrol increased the catalase
activity in the striatum and in the hippocampus. Diabetic rats presented a lower
hippocampal proliferation compared with non-diabetic rats, and neither red wine nor
resveratrol treatment reversed this effect.
Conclusion: Daily doses of red wine or resveratrol have an antioxidant effect in rats
depending on the brain area and the glycemic status, with resveratrol producing a better
response in diabetic rats.
Key-words: Antioxidants, hippocampus, striatum, frontal cortex, grape, polyphenol,
diabetic encephalopathy
55
Diabetes mellitus is a chronic disease characterized by metabolic disorders, in
which glucose is underused, resulting in hyperglycemia. Poor glycemic control results in
peripheral complications such as retinopathy, cardiopathy, nephropathy and neuropathy (1;
2). Chronic hyperglycemia also affects the central nervous system (CNS) and the term
“diabetic encephalopathy” has been used to identify structural and neurophysiologic
changes in the brain, as well cognitive deficit, in diabetic patients (1; 3).
In peripheral tissues, the imbalance between endogenous enzymatic and
nonenzymatic antioxidant mechanisms and products from glycation reactions, as a
consequence of the elevated blood glucose, has been associated with cell injury in
chronically hyperglycemic individuals (4; 5). This condition, named oxidative stress, has
also been associated with neuronal injury in the CNS. In fact, the brain is particularly
vulnerable to oxidative damage because it has abundant lipid content, a high oxygen
consumption rate, and relatively scarce antioxidant enzymes compare with peripheral
tissues (3; 6). Chronic hyperglycemia has also been related to the impairment of
hippocampal neurogenesis in diabetic animals, decreasing it by about 45% compare with
non-diabetic animals (7). Lower neuronal proliferation in the hippocampus has been
implicated in lower cognitive performance in rodents, mainly in memory tasks (7; 8). Both
oxidative stress and the impairment of hippocampal neurogenesis seem to contribute to the
diabetic encephalopathy in chronically hyperglycemic individuals.
Exogenous antioxidants have been investigated as being potentially beneficial to
decreasing or protecting against oxidative damage. It is already known that dietary
supplementation with natural antioxidants such as lycopene, β-carotene, vitamin C, and
lipoic acid, attenuate oxidative stress and diabetic state (9-11). Recent studies have
demonstrated that red wine or its natural polyphenol, resveratrol (3,5’,4-trihydroxy-trans-
stilbene), have a protective effect against oxidative stress in different tissues and in
56
pathological conditions such as cardiovascular diseases, inflammatory response, cancer
and diabetes (12-14). Resveratrol, especially abundant in grape skins and red wine,
behaves as a reactive oxygen species (ROS) scavenger, metal chelator, and enzyme
modulator (15; 16). Although some studies show that red wine or resveratrol decrease lipid
peroxidation and increase antioxidant enzyme levels in different brain areas of diabetic rats
(17; 18), no study has compare the efficacy of red wine, a source of resveratrol and other
compounds, with resveratrol per se, a dietetic supplement.
If diabetic encephalopathy is related to the imbalance between the production and
the neutralization of ROS, and impairment in the hippocampal proliferation, prevention of
oxidative stress could be considered a primary defense against development of
complications in the CNS of diabetic individuals. Therefore, the goal of this study was to
compare the antioxidant effect of a moderate consumption of red wine (2 glasses/day) and
resveratrol supplementation in the brain of diabetic and non-diabetic rats. Additionally, we
studied the effect of red wine or resveratrol on cell proliferation in the hippocampus of
diabetic and non-diabetic rats. We focused our attention on the hippocampus, frontal
cortex, and striatum because such limbic structures have shown special vulnerability to
lipid peroxidation and neuroplasticity in neurodegenerative diseases, aging and mood
disorders (1; 6; 19).
RESEARCH DESIGN AND METHODS
Animals
Experiments were carried out with 96 male Wistar rats (n=8/group), weighing 250-
300g. Rats were reared in the Animal Facility of Universidade Federal de Ciências da
Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) – Brazil. Rats were housed in groups of 4 in
polypropylene cages under standard environmental conditions with free access to food and
57
water. The experimental protocol was approved by the Animal Ethical Committee of
UFCSPA and was conducted in accordance with the International Council for Laboratory
Animal Science (ICLAS) codes.
Diabetes induction and treatments
In the first experiment, diabetes was induced in 24 animals by an i.p. injection of
streptozotocin 60 mg/Kg (STZ) (Sigma Co., St. Louis, USA), dissolved in 0.05 M citrate
buffer, pH 4.3. The control group (n = 24) received an equal volume of vehicle, i.p.
Diabetes was confirmed with a glucometer device (Glucotrend, Boehringer Institute,
Mannheim, Germany) 48 hours later and weekly until the end of the experiment. Animals
with blood glucose levels < 200 mg/dL were discarded.
Immediately after diabetes status was confirmed, diabetic (STZ) and non-diabetic
(CTR) groups were subdivided according to red wine (WINE; n=8) (Merlot Varietal,
Vinícola Miolo, Bento Gonçalves-RS, Brazil), resveratrol (RES; n=8) (Panvel-Pharma
Nostra, Porto Alegre - RS, Brazil) or saline (CTR; n=8). All groups were treated via the
oral route (gavage), for 3 weeks. Resveratrol was dispersed in saline with 0.05% of Tween
80 and administered at a dose of 20 mg/Kg. Red wine was administered at a volume of 4
mL/kg. The dose was calculated based on the daily intake of 2 glasses of red wine (300
mL) by an adult man weighting 70kg, containing about 0.5 mL/Kg/day of ethanol. Saline
was administered (0.9% NaCl) at the same volume (4 mL/kg) to CTR and STZ control
groups. All solutions were stored at 5
o
C in amber flasks, protected from light. In the last
day, treatments were administered 1 h before euthanasia.
58
Oxidative stress assay
One hour from the last administration, rats were euthanatized by decapitation, and
trunk blood was collected for glycemic dosage. Brain tissues were immediately dissected
and quickly frozen in liquid nitrogen and individually stored at -80ºC. When the
measurements of lipid peroxidation and enzymes analysis were performed, the
hippocampus, the frontal cortex and the striatum were homogenized in 120 mM KCl and
30 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.5 mM phenylmethanesulfonyl
fluoride as a protease inhibitor, at 0-4 ºC. The suspensions were centrifuged at 1000 × g for
10 min at 0-4 ºC (Sorvall RC 5B - Rotor SM 24) and the supernatant was used for the
measurements.
Determination of lipid peroxidation
Lipid peroxidation processes were determined in different brain areas by measuring
thiobarbituric acid reactive species (TBARS). Homogenized tissues were precipitated with
10% of trichloroacetic acid, centrifuged, and incubated with thiobarbituric acid (Sigma, St.
Louis, MO, USA) for 60 min at 100ºC and TBARS were extracted with butanol (1:1 v/v).
After centrifugation, the absorbance of the butanol was measured at 535 nm.
Malondialdehyde (MDA) standards were prepared from 1,1,3,3,-tetramethoxypropane.
Protein concentration in the homogenates was measured by the Bradford protein assay
using bovine serum albumin as standard. Measurements were carried out in a Perkin Elmer
Lambda 40 spectrophotometer (Shelton, CT, USA) and results were expressed as
concentration of MDA (nmol) per mg of protein.
59
Catalase assay
Catalase (CAT) activity was assayed with the method developed by Aebi (20),
which is based on the disappearance of H
2
O
2
at 240nm. One unit was defined as 1 µmol of
hydrogen peroxide consumed per min, and the specific activity was reported as units per
mg/protein.
Superoxide dismutase assay
Superoxide dismutase (SOD) activity was assayed using the method described by
Marklund (21). Cerebral tissue was homogenized 1:9 (w/v) in 50 mM Tris–HCl buffer pH
8.2 containing 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). One unit of SOD activity
was defined as the amount of SOD that inhibits 50% of the pyrogallol autoxidation, and the
specific activity was represented as units per mg protein.
Cell proliferation assay
In the second experiment we followed exactly the same protocol for oxidative stress
evaluation as describe above, except that we administered 5-bromo-2’-deoxyuridine
(BrdU) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), to detect and measure the S phase of
cell proliferation, at 48, 24 and 2 hours before euthanasia. For this triple regime, BrDU was
previously dissolved in 20 mg/mL of NH
4
OH 0.05 M and injected at the dose of 100
mg/kg, i.p. Two hours after the last BrdU administration and 1 hour after the last treatment
(saline, red wine or resveratrol), rats were anesthetized with ketamine (100 mg/kg) and
xylazine (50 mg/kg) i.p. and the brains were fixed by an intracardial perfusion with 4%
paraformaldeyde. After dissection, the brain was post-fixed in paraformaldeyde (4%)
followed by 70% ethanol at room temperature until it was embedded in paraffin.
60
For BrdU immunohistochemistry, 5µm brain sections were cut through the
hippocampus, and slices were first deparaffinized (1h at 60
o
C) and rinsed in xylol.
Sections were then rinsed in phosphate-buffered saline (PBS) and blocked in bovine serum
albumin (BSA). Afterward, the slices were treated with 1.5% H
2
O
2
in 0.3% methanol and
washed in 0.05% Triton X-100 diluted in PBS, and then were incubated with a mouse
monoclonal anti-BrdU antibody (1:100) overnight at 4 °C. Subsequently, the sections were
incubated with a secondary antibody (1.5:100) for 60 min at room temperature. Bound
antibody was detected in a humidified chamber using a peroxidase kit (Sigma Chemical
Company, St. Louis, MO), developed in buffered solution of 0.05% diaminobenzidine
(DAB) as the chromogen. Then, sections were washed 3 times for 5 min in distilled water,
lightly counterstained with hematoxylin, differentiated in lithium carbonate and dehydrated
in ethanol. For each brain, BrdU-positive cells were identified by their brown stain and
were counted visually using an Olympus BX-41 microscope at 40× objective
magnification. The total number of stained BrdU cells was determined through 10 cuts per
animal with an interval of 80 µm in the dentate gyrus of the hippocampus (22). Each image
was analyzed twice to obtain an average labeling index.
Resveratrol concentration in the red wine
Samples from the red wine (Merlot Varietal, Vinícola Miolo, Bento Gonçalves-RS,
Brazil) were collected and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC -
Perkin-Elmer 785A), according to Souto et al. (23). The trans-resveratrol standards were
supplied by PharmaScience Inc. (Montreal, Canada), and the red wine was purchased from
a commercial supplier. Before being analyzed, the wine was kept refrigerated at 4
o
C, but
the analyses were performed at 24
o
C, and repeated 4 times. For quantification, an external
61
standard calibration curve was done ranging from 0.10 to 10.0 mg/L of trans-resveratrol.
The square regression coefficient of the analytical curve was near unity (r
2
=0.9986).
Statistical analyses
Data were analyzed by a three-way ANOVA, considering diabetic condition,
resveratrol or red wine treatment, and different brain areas as independent variables, and
lipid peroxidation, or changes in the enzyme activity as dependent variables. To evaluate
the effect of the diabetes or treatments on neurogenesis we performed a two-way ANOVA
test, considering diabetic condition and treatments as independent variables and stained
cells in the dentate gyrus of the hippocampus as the dependent variable. Differences
between groups were distinguished by the Student-Newman-Keuls post hoc test,
considering p<0.05 as an indication of statistical significance. Results were represented as
mean ± S.E.M.
RESULTS
The concentration of resveratrol in red wine (Merlot varietal) was 3.2 µg/mL. As
rats were treated with 4 mL/kg/day of red wine we can estimate that they received around
1/1500 of the resveratrol received by rats treated with resveratrol solution (20 mg/kg),
suggesting that any results from red wine are owing to its inherent properties rather than its
resveratrol contend.
In this study, we initially evaluated the effect of red wine and resveratrol on
oxidative stress by measuring the levels of lipid peroxidation and antioxidant enzymes
activity, such as catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in the hippocampus, the
frontal cortex and the striatum of chronically treated diabetic and non-diabetic rats.
62
In the hippocampus, both red wine and resveratrol decreased lipid peroxidation in
diabetic rats (F
(2,32)
= 5.114; p = 0.012) (Figure 1-A). The antioxidant property of the red
wine in this brain area of diabetic rats was supported by an increase of CAT activity
(Figure 1-B; F
(2,28)
= 26.19; p<0.001). Resveratrol also decreased the lipid peroxidation in
diabetic rats, but we did not observe concomitant changes in antioxidant enzymes (Figure
1-B and C). Resveratrol increased CAT activity only in non-diabetic rats (F
(2,28)
= 9.076;
p<0.001), supporting the idea that chronic hyperglycemia may affect the response of this
enzyme in the hippocampus. Under our experimental conditions we did not see a
significant increase of lipid peroxidation in the hippocampus of diabetic rats compared
with non-diabetic rats.
In the frontal cortex, however, lipid peroxidation was higher in diabetic rats than in
non-diabetic rats, as seen in Figure 2-A (F
(1,18)
= 15.01; p = 0.001). In the same figure, we
show that red wine decreased the lipid peroxidation specifically for non-diabetic rats
(F
(1,18)
= 19.10; p < 0.001). We could infer an antioxidant effect of the red wine, but it also
decreased the SOD activity in the group of control rats (Figure 2-C; F
(2,27)
= 8.16; p =
0.007). In the frontal cortex, resveratrol had antioxidant activity in both diabetic and non-
diabetic rats, indicated by the lower level of lipid peroxidation (Figure 2-A; p < 0.001 and
p = 0.003, respectively).
Surprisingly, our results showed that in the striatum, diabetic rats presented a lower
level of lipid peroxidation compared with non-diabetic rats (Figure 3-A). One hypothesis
for this result is that, in this brain area, hyperglycemia may overstimulate CAT activity
(Figure 3-B; F
(1,35)
= 19.80; p < 0.001) and thereby decrease the production of ROS
production to levels below those found in non-diabetic rats. The other unexpected result
from our study is that resveratrol presented, in this brain area, a pro-oxidant effect in
diabetic rats (Figure 3-A; F
(1,35)
= 6.72; p = 0.004 ). Red wine and resveratrol both had an
63
antioxidant effect in non-diabetic rats (Figure 3-A; F
(1,16)
= 8.47; p = 0.004), but only red
wine increased CAT activity in these rats (Figure 3-B; F
(1,16)
= 3.83; p = 0.047). In diabetic
rats, red wine decreased SOD activity (Figure 3-C; F
(2,21)
= 3.87; p = 0.039). These results
point to the interference of glycemia in the response to red wine or resveratrol.
Upon comparing different brain areas we observed that CAT was expressed at a
higher level in the hippocampus than in the striatum or the frontal cortex (Figures 1-B, 2-B
and 3-B: p = 0.011), whereas SOD was higher in the frontal cortex than in other brain areas
(Figures 1-C, 2-C and 3-C: p = 0.006) in non-diabetic rats. In diabetic rats, CAT was also
higher in the hippocampus (p < 0.001).
Our second experiment examined the effect of chronic hyperglycemia, red wine,
and resveratrol on cell proliferation in the hippocampus of diabetic and non-diabetic rats.
Results indicated that neuronal proliferation was lower in diabetic rats, compared with
other groups (Figure 4; F
(1,26)
= 7.408; p = 0.011). However, under our experimental
conditions, neither red wine nor resveratrol affected cell proliferation in diabetic or non-
diabetic rats.
As expected, diabetic rats lost significantly more weight than non-diabetic rats
(F
(1,2)
= 257.0; p < 0.001) and neither red wine nor resveratrol interfered with this
parameter. The average weight loss during the 3 weeks of the treatment was around 62 ± 4
g for diabetic rats, whereas the control rats gained 39 ± 5 g. Glycemia also was higher in
diabetic (536.5 ± 63.2 mg/dL) than in non-diabetic rats (97.1 ± 10.9 mg/dL) (p < 0.001),
and neither red wine nor resveratrol changed this. To assure that glycemia was not affected
by our dosing of red wine or resveratrol, we performed a temporal analysis of glycemia,
collecting blood samples by a puncture on the distal end of the rat’s tail and measuring
glycemia with a glucometer every 15 min after 2 hours of the treatment. This test was
performed in the second experiment and rats were given free access to food. There were no
64
differences in glycemia after red wine or resveratrol treatment in diabetic and non-diabetic
rats (data not show).
DISCUSSION
In this study, we showed that daily doses of red wine and resveratrol have an
antioxidant effect in rats that was dependent on the brain area and glycemic status. In
diabetic rats, red wine treatment had an antioxidant effect in the hippocampus, whereas in
non-diabetic rats this antioxidant effect was seen in both the frontal cortex and the
striatum. In contrast, resveratrol had an antioxidant effect in the hippocampus and in the
frontal cortex of diabetic rats, and in all of the studied brain areas of non-diabetic rats.
It is improbable that the antioxidant effect of red wine shown here for different
brain areas of diabetic and non-diabetic rats is related to its resveratrol content, since our
sample of wine only contained trace amounts of this compound. Analyses of the Merlot
wine used in the study confirmed that the daily ingestion of resveratrol from the wine-
treated rats was 1/1500 of the amount ingested by the resveratrol-treated rats. Although a
large number of studies credit the antioxidant properties of red wine to the polyphenolic
antioxidants present in this alcoholic beverage (24; 25), other studies have shown that
alcohol per se also has an antioxidant effect when administered at low to moderate doses
(26). Ingestion of alcoholic beverages at low to moderate levels 24 h prior to ischemia and
reperfusion prevents postischemic deleterious effects on neurons, a phenomenon referred
to as ethanol preconditioning (27; 28). To explain this phenomenon, authors have
hypothesized that ROS formed during the first day of ethanol exposure elicit the
development of a protective response in the brain that attenuates deleterious post-ischemic
processes by an oxidant-dependent triggering mechanism. Although it is a consensus that
red wine is more protective against coronary disease than are liquor or beer, prospective
65
studies have also shown apparent protection from beer and liquor (29; 30). Thus, the
apparent benefit of daily ingestion of red wine is not only related to its non-alcoholic
components such as resveratrol, but also to its levels of ethanol. In fact, Conigrave et al.
(31) showed that frequent low-to-moderate alcohol consumption is inversely associated
with risk of type 2 diabetes in men. Studies have focused their attention on isolated red
wine antioxidants, whereas no studies have compared red wine, with its complex matrix,
and resveratrol, an antioxidant polyphenol present in wine at a relatively low
concentration. To our knowledge, this is the first study to compare the antioxidant
properties of red wine and resveratrol. Our results indicate that, in spite of the trace
quantity of resveratrol, red wine had an antioxidant effect in different brain areas of
diabetic and non-diabetic rats.
Our results showed that red wine had a selective antioxidant effect in the
hippocampus of diabetic rats, demonstrated by the decrease of malondialdehyde (MDA)
and an increase of CAT activity. In non-diabetic rats, red wine barely decreased the lipid
peroxidation in the hippocampus, eliciting a better antioxidant response in the frontal
cortex and the striatum. This regional response is not unusual, as lower doses of ethanol
increase the rates of glucose utilization specifically in the nucleus accumbens, the caudate,
the prefrontal cortex, the ventral tegmental area, and the substantia nigra, whereas
moderate doses increase it only in the somatosensory cortex, the nucleus accumbens and
the hippocampus of non-diabetic rats (32). Moreover, antioxidant enzymes are also
expressed at different concentration depending on the brain areas, as shown here and other
studies (33). Some studies, focused on the hippocampus or the cerebellum, have found an
antioxidant effect of the red wine after chronic treatment (18; 34). For diabetic rats, we
only have results from the whole-brain analysis, which supported the antioxidant property
of this alcoholic beverage (24; 35).
66
An issue that warrants consideration is the interference of chronic hyperglycemia in
the response to red wine. In the rat brain, substantial evidences supports the presence of
both insulin and insulin glucose-sensitive receptors (36). These receptors are distributed in
a highly specific pattern with the highest density in the hippocampus (37). Like in the
periphery, chronic hyperglycemia has been associated with neuronal insulin deficiency
and/or resistance, and the development of neurodegenerative diseases in animal models
(38-40). As we know from in vivo studies, glucose is elevated in the brains of diabetic rats
(41; 42), and we suggest that insulin resistance may interfere with the antioxidant effect of
red wine, except in the hippocampus, which contains the highest density of insulin
receptors. Interestingly, Carneiro et al. (43), showed that Port wine, despite similar
quantities of flavanols as red wine, lacks antioxidant property of wine. The authors
proposed that the high content of sugars, known to have potent pro-oxidant effects, induces
neuronal damage, but we cannot discard the possibility that this effect could be also related
to insulin resistance in the brain.
The present results with resveratrol showed a diverse response pattern that was
dependent on brain area and diabetes condition. Several papers have focused on the
antioxidant effect of resveratrol treatment in the brain (17; 44-46). Most of them presented
results from the whole brain and made few attempt to analyze distinct brain areas. The
hippocampus is the most commonly explored area in this respect, and results from previous
studies suggest an antioxidant effect of resveratrol in non-diabetic rats, showing not only
an increase of the antioxidant enzyme activity but also a decrease of lipid peroxidation (44-
46). Whereas our study did not detect a significant difference on the MDA parameter, the
antioxidant effect of resveratrol was suggested by the enhancement of CAT activity, which
was 2.5 times higher than that in non-treated control animals, showing that resveratrol
stimulated endogenous antioxidant defenses. Only one study has shown an antioxidant
67
effect of resveratrol in the hippocampus, the cortex, and the cerebellum of diabetic rats,
and the authors neither specified which part of the cortical tissue was studied nor include
the striatum in their analysis (17). The authors showed that resveratrol decreased MDA
levels and increased SOD and CAT activity in all brain areas explored. Presently, we have
reproduced these results in the hippocampus, showing that resveratrol is an effective
antioxidant. In diabetic rats an unexpected result was obtained in the striatum. Rather than
reducing lipid peroxidation, resveratrol increased it, suggesting, in this specific brain area,
a pro-oxidant effect. We propose that, in the same way that the antioxidant effect of the red
wine is dependent on glycemic status, resveratrol presents a pro-oxidant effect selectively
in the brain regions that express a lower density of insulin receptors, such as the striatum
(47). Moreover, controversial studies have shown that resveratrol decreases insulin
secretion from pancreatic islets after glucose stimulation in non-diabetic rats or type 2
diabetic rats (48; 49). Resveratrol does not affect basal insulin release from pancreatic
islets isolated from normal rats, but clearly decreases insulin-secretory responses after
glucose stimulation (48). Studies should be conducted to clarify whether this peripheral
effect is reproduced in the brain and whether it may affect local insulin release in diabetic
rats treated with resveratrol.
In order to explore if the antioxidant effect of red wine or resveratrol could interfere
with neuronal proliferation we conducted an additional experiment. The result indicated
that neither red wine nor resveratrol were able to reverse the reduced cell proliferation in
the hippocampus of diabetic rats. This reproduced the results of previous studies, which
showed that the neuronal proliferation rate in diabetic rats is about 40% lower compared
with non-diabetic rats (7; 50). We cannot exclude the possibility that these negative results
are related to our experimental protocol. Future studies will help to clarify whether higher
doses of resveratrol or longer treatment would interfere with the neuronal proliferation in
68
diabetic rats. As neural tissue is particularly vulnerable to ROS, we should better explore
the properties of exogenous antioxidants like red wine or resveratrol in order to prevent or
delay diabetic comorbidities, such as cognitive deficit, memory impairment and depression
related to diabetic encephalopathy (15).
In summary, we can conclude that, in diabetic animals, moderate daily doses of red
wine have an antioxidant effect in the hippocampus and that resveratrol has an antioxidant
effect in both the hippocampus and the frontal cortex. Except for the pro-oxidant effect of
resveratrol in the striatum, we are inclined to state that resveratrol has a more favorable
profile than red wine for diabetic individuals, as it decreases lipid peroxidation in the
hippocampus and the frontal cortex. In non-diabetic rats, we cannot distinguish the effects
of red wine from that of resveratrol, although red wine has a better profile in the striatum,
decreasing lipid peroxidation and increasing CAT activity. Further study is necessary to
determine the optimum treatment with resveratrol or red wine to reverse the lower
neuronal proliferation seen in the hippocampus of diabetic rats.
Acknowledgements
This work was supported by Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto
Alegre, Brazil. CD Venturini is supported by a fellowship from Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES. CR Rhoden is supported by
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq.
No potential conflicts of interest relevant to this article were reported.
A part of this manuscript was presented in abstract form at the Annual meeting of
the Society for Neuroscience in 2008, Washington, DC, USA.
We thank Vinícola Miolo Ltda, Bento Gonçalves – RS, Brazil for providing the red
wine.
69
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neural progenitors in mouse embryonic spinal cord. Int J Dev Neurosci 25:349-357, 2007
72
Figure legends
Figure 1. Antioxidant effect of red wine (WINE) or resveratrol (RES) in the hippocampus
of diabetic (STZ) and non-diabetic rats (CTR). (a) Lipid peroxidation, measured by
malondialdehyde levels (MDA). (b) Variation of catalase (CAT) and (c) superoxide
dismutase (SOD) levels. * Different from other treatments; p<0.05. Results are expressed
as mean ± S.E.M. n=8 rats/group.
Figure 2. Antioxidant effect of red wine (WINE) or resveratrol (RES) in the frontal cortex
of diabetic (STZ) and non-diabetic rats (CTR). (a) Lipid peroxidation, measured by
malondialdehyde levels (MDA); (b) Variation of catalase (CAT) and (c) superoxide
dismutase (SOD) levels. # Different from CTR. * Different from other treatments; p<0.05.
Results are expressed as mean ± S.E.M. n=8 rats/group.
Figure 3. Antioxidant effect of red wine (WINE) or resveratrol (RES) in the frontal cortex
of diabetic (STZ) and non-diabetic rats (CTR). (a) Lipid peroxidation, measured by
malondialdehyde levels (MDA); (b) Variation of catalase (CAT) and (c) superoxide
dismutase (SOD) levels. # Different from CTR; * different from other treatments; **
Different from STZ; p<0.05. Results are expressed as mean ± S.E.M. n=8 rats/group.
Figure 4. Cellular proliferation in the hippocampus of diabetic (STZ) and non-diabetic
(CTR) rats treated with red wine (WINE) and resveratrol (RES). *different from CTR
rats. Results are expressed as mean ± S.E.M. *p<0.05, n=8 rats/group.
73
Figure 1. Hippocampus
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
CTR CTR/WINE CTR/RES STZ STZ/WINE STZ/RES
[CAT] pmol/mg protein
*
*
B
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CTR CTR/WINE CTR/RES STZ STZ/WINE STZ/RES
[SOD] U/mg protein
C
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
CTR CTR/WINE CTR/RES STZ STZ/WINE STZ/RES
[MDA] nmol/mg protein
*
*
A
Hippocampus
74
Figure 2. Frontal Cortex
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
CTR CTR/W INE CTR/RES STZ STZ/W INE STZ/RES
[CAT] pmol/mg protein
B
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CTR CTR/w ine CTR/RES STZ STZ/wine STZ/RES
[SOD] U/mg protein
C
*
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
CTR CTR/WINE CTR/RES STZ STZ/WINE STZ/RES
[MDA] nmol/mg protein
#
*
*
*
A
Frontal Cortex
75
Figure 3. Striatum
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
CTR CTR/W INE CTR/RES STZ STZ/WINE STZ/RES
[CAT] pmol/mg protein
#
B
#
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CTR CTR/WINE CTR/RES STZ STZ/WINE STZ/RES
[SOD] U/mg protein
*
C
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
CTR CTR/WIN E CTR/RES STZ STZ/WINE STZ/RES
[MDA] nmol/mg protein
*
#
A
*
**
Striatum
76
Figure 4. –Cell Proliferation
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CTR CTR/WINE CTR/RES STZ STZ/WINE STZ/RES
BrdU Proliferation Cells
*
Hippocampus
77
CONCLUSÕES
1. O tratamento crônico com vinho tinto reduziu a lipoperoxidação no hipocampo de
animais diabéticos enquanto que o resveratrol diminuiu a lipoperoxidação no
hipocampo e córtex frontal desses animais. Para os não diabéticos, o tratamento
crônico com vinho tinto e resveratrol reduziu a lipoperoxidação no córtex frontal e
estriado;
2. O tratamento crônico com vinho tinto aumentou a atividade da enzima catalase no
hipocampo de animais diabéticos. Para os não diabéticos, o tratamento com vinho
tinto aumentou a atividade da catalase no estriado enquanto o resveratrol aumentou
sua atividade no hipocampo;
3. Houve redução da proliferação celular no hipocampo de animais diabéticos, porém
nem o vinho tinto nem o resveratrol modificaram essa proliferação.
No conjunto, nossos resultados demonstram que ambos, vinho tinto e resveratrol
apresentam propriedades antioxidantes de acordo com o tecido estudado e condição de
hiperglicemia. De um modo geral, no cérebro, o resveratrol parece possuir melhor
efeito que o vinho, pois apresenta propriedades antioxidantes em todas as áreas
estudadas.
78
ANEXOS
I. Normas da revista Diabetes (Manuscript Format), para a qual o artigo foi submetido.
II. Consentimento informado dos autores (Manuscript Submission Form).
79
DIABETES
MANUSCRIPT FORMAT
Every manuscript must have an accompanying title page. In addition to the full title, the
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name, middle initial, and last name of each author; the affiliation (in English) of each
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Design and Methods," the basic design, setting, number of participants and
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significant data found; and "Conclusions," validity and relevance. Each heading
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Please make sure your figures will fit in one or two columns in width. Multi-paneled
figures should be assembled in a layout that leaves the least amount of blank space.
1 column = 21 picas wide, 3.5 in, 8.9 cm; 2 columns = 43 picas wide, 7.1 in, 18 cm
Font. At 100% size, fonts should be 8-10 points and used consistently throughout all
figures.
Text. Information on the axes should be succinct, using abbreviations where possible, and
the label on the y-axis should read vertically, not horizontally. Key information should be
placed in any available white space within the figure; if space is not available, the
information should be placed in the legend. In general, figures with multiple parts should
be marked A, B, C, etc., with a description of each panel included in the legend rather than
on the figure.
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Line and bar graphs. Lines in graphs should be bold enough to be easily read after
reduction, as should all symbols used in the figure. Data points are best marked with the
following symbols, again assuring that they will be readily distinguishable after reduction:
. In the figure legend, please use words rather than the symbols; e.g.,
"black circles = group 1; white squares = group 2; black bars = blood glucose; white bars =
C-peptide." Bars should be black or white only, unless more than two datasets are being
presented; additional bars should be drawn with clear bold hatch marks or stripes, not
shades of gray.
Line or bar graphs or flow charts with text should be created in black and white, not shades
of gray, which are difficult to reproduce in even tones.
Color figures. Color figures incur an additional charge of $570 per color figure. (Note:
Charges apply to each figure as a whole, not by the part, i.e., A, B, C, etc.). Color figures
should not be submitted for reproduction in black and white. If you submit figures in color
but request to have them reproduced in black and white or submit charts or graphs with
gray backgrounds or bars, you will be asked to send new figures and the publication of
your paper may be delayed. If you choose not to submit new figures, the publisher cannot
be held responsible for the print quality of the images.
Reproductions. If materials (e.g., figures and/or tables) are taken from other sources, it
should be noted in the legend, and the author must be able to provide written permission
for reproduction obtained from the original publisher and author.
Figure legends. Figure legends should be clearly numbered and included at the very end
of your document and should not be included on the separate figure/image files. Please use
words to describe symbols used in the figure; e.g., "black circles = group 1; white squares
= group 2; black bars = blood glucose; white bars = C-peptide."
Formatting digital files for print reproduction. The Diabetes Editorial Office will
properly convert digital figure files as a courtesy for authors. To facilitate this process,
please indicate the type of software application(s) used to generate the figure in the form of
an e-mail to the Editorial Office (address below) and make sure original source files (the
initial images created by the original software application) are either uploaded to the
[email protected]). If figure files are too large to upload or e-mail, please mail or
overnight a CD containing the original source files to the Editorial Office at:
Diabetes Editorial Office 1033 Gayley St., Ste. 216 Los Angeles, CA 90024
Digital specifications for authors that are able and prefer to convert digital figures
themselves: Please use applications capable of creating high-resolution TIFF or EPS files.
Color or grayscale images with no text or arrows (halftone images) should be at least 300
dpi. Color or grayscale images with any text or arrows (combination halftone images)
should be at least 600 dpi. Black and white images with no shades of gray (line drawings)
should be at least 1000 dpi. Color images should be created as RGB.
It is strongly recommended that authors converting their own digital files also send the
original source files to the Diabetes Editorial Office in the event that the converted files
84
are not acceptable for publication for any reason. Unacceptable files include those of poor
quality due to improper conversion and/or incorrect resolution (dpi) and/or the use of too
many software applications in the creation of the file.
Digital image manipulation. No specific feature within an image may be enhanced,
obscured, moved, removed, or introduced. The grouping of images from different parts of
the same gel, or from different gels, fields, or exposures must be made explicit by the
arrangement of the figure (i.e., using dividing lines) and in the text of the figure legend.
Adjustments of brightness, contrast, or color balance are acceptable if they are applied to
the whole image and as long as they do not obscure, eliminate, or misrepresent any
information present in the original, including backgrounds. Without any background
information, it is not possible to see exactly how much of the original gel is actually
shown. Non-linear adjustments (e.g., changes to gamma settings) must be disclosed in the
figure legend.
All digital images in manuscripts accepted for publication will be scrutinized by our
production department for any indication of improper manipulation. Questions raised by
the production department will be referred to the Editors, who will request the original data
from the authors for comparison to the prepared figures. If the original data cannot be
produced, the acceptance of the manuscript may be revoked. Cases of deliberate
misrepresentation of data will result in revocation of acceptance, and will be reported to
the corresponding author's home institution or funding agency.
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Republication Permission Request Form
Title of publication: Estresse Oxidativo: Revisão da Sinalização Metabólica no Diabetes Tipo 1.
Authors: Reis, JS; Veloso, CA; Mattos, RT; Purish, S; Nogueira-Machado, JÁ
ABE&M Volume: 52 Number: 7 Page: 1096-1105 Year: 2008
Material to be republish or reuse (manuscript, figure, table): figures 1, 2, 5, 7.
Describe your intended use of ABEM content:
As figuras serão utilizadas como ilustração de uma dissertação de mestrado.
Type of publication: dissertação de mestrado.
Language of publication: português. Number of printed copy: 1 para a biblioteca local.
Date of publication: março de 2009. Intended Audience: alunos da instituição.
Sponsor: Claudia Ramos Rhoden
Contact Information
Name: Carina Duarte Venturini
Organization Name: Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA)
Adresss: Rua Sarmento Leite, 245. Centro, Porto Alegre – RS. CEP: 90050-170
Telephone/Fax: (51) 33039000 / FAX: (51) 33038810
Email: carinaventurini@terra.com.br
A copy of your revised figure/table must be attached to receive permission.
Livros Grátis
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