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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR
MESTRADO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS
FERNANDA ARAUJO PAES
ANÁLISE DE COMUNIDADES MICROBIANAS DE SOLO DE MANGUEZAL
POR T-RFLP E MICROARRANJOS DE DNA
ORIENTADORA: PROFA. DRA. VÂNIA MARIA MACIEL MELO
FORTALEZA - CE
2008
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i
Fernanda Araujo Paes
ANÁLISE DE COMUNIDADES MICROBIANAS DE SOLO DE MANGUEZAL
POR T-RFLP E MICROARRANJOS DE DNA
Dissertação submetida à Coordenação do Curso
de Pós-Graduação em Ciências Marinhas
Tropicais do Instituto de Ciências do Mar da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre.
Orientadora: Profa. Dra. Vânia Maria Maciel Melo
Fortaleza – Ce
2008
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ii
Esta dissertação foi submetida à coordenação do Curso de Pós-Graduação
em Ciências Marinhas Tropicais como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de Mestre, outorgado pela Universidade Federal do Ceará.
A transcrição de qualquer trecho desta dissertação é permitida, desde que
seja feita em conformidade às normas da ética científica.
_____________________________________
Fernanda Araujo Paes
Dissertação Aprovada em: 24/04/2008
_________________________________________
Profa. Dra. Vânia Maria Maciel Melo
Depto. de Biologia
Universidade Federal do Ceará
Orientadora
____________________________ _____________________________
Prof. Dr. Tito Monteiro da Cruz Lotufo
Depto. de Engenharia de Pesca
Universidade Federal do Ceará
Examinador
Prof. Dra. Vivian Helena Pellizari
Instituto de Ciências Biomédicas II
Universidade de São Paulo
Examinadora
iii
A meus pais, Iolanda e Aloizio
e aos meus irmãos, Luciana e Thiago,
dedico com carinho.
iv
Se eu fui capaz de ver um pouco mais adiante do que outros homens,
é porque eu montei nos ombros de gigantes.
Isaac Newton
v
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Vânia Maria Maciel Melo, pela orientação, pelo carinho, pelo
conhecimento compartilhado, pela ajuda e por ter sido o alicerce na construção deste
trabalho, ofertando-me oportunidades e apoio. Meu reconhecimento sincero pelo seu
exemplo de dedicação verdadeira e apaixonada pelo trabalho e, também, por acreditar e
lutar pelo sucesso de todos que a cercam. Agradeço pela amiga que é, e pelo papel de
mãe que agrega, no sentido de cuidar, incentivar, elogiar, responder, aconselhar,
algumas vezes com risos e lágrimas, mas sempre verdadeira e cheia de amor. Foram
inesquecíveis os momentos vividos em equipe, ao longo desses anos, em especial as
emoções divididas em 2007 (dos dias longos na frente do computador dedicando-se às
análises de T-RFLP, às conversas amenas na varanda, regadas a alguma cerveja e lua
cheia). Sou grata por sua relevante influência exercida em minha formação profissional
e pessoal.
Ao Prof. Dr. James Tiedje, pela oportunidade concedida e ajuda ofertada. Por
haver viabilizado a realização dos experimentos deste trabalho, em seu laboratório, além
da orientação complementar nos temas que circundam a biologia molecular.
Ao Prof. Dr. Tito Monteiro da Cruz Lotufo e à Profa. Dra. Vivian Pellizari,
pela honra de tê-los como participantes da comissão avaliadora deste trabalho.
Aos demais professores do curso de Ciências Marinhas Tropicais, responsáveis
direta ou indiretamente pela minha formação enquanto estudante, profissional e cidadã,
agradeço a oportunidade de tê-los conhecido.
À Profa. Dra. Ana de Fátima F. U. de Carvalho pelo exemplo de cientista e
educadora. Às Profas. Suzana Silveira Martins e Claudia Miranda, pela convivência nos
corredores do Laboratório de Microbiologia da UFC.
À Fundação Cearense de Amparo ao Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (FUNCAP), pela bolsa concedida.
vi
Aos meus colegas do Laboratório de Microbiologia da UFC: Alysson Angelim,
Caio Leão, Denise Hissa, Geórgia Colares, Glauber Melo, Luína Benevides, Tallita
Tavares, Vanessa Rodrigues, Yuri di Cavalcanti, Tecia Carvalho. À Lidianne Rocha,
pelo companheirismo e amizade intensificados durante esse curso de mestrado. À
Raphaela Gomes, pelo grande carinho e ajuda dispensada nos momentos difíceis,
incluindo a formatação deste trabalho. Aos demais amigos que fiz neste laboratório, mas
que já tomaram outros rumos: Gardênia Lima, Natasha Pinto, Samantha Costa e Sarah
Pinheiro.
À Rivalda Carmo, técnica de laboratório, por sua alegria, força e carinho. Ao
Valdenor de Oliveira, auxiliar de limpeza, que sempre zelou pelo ambiente de trabalho.
Aos meus colegas do Centro de Ecologia Molecular Microbiana da MSU:
Brian Campbell, Bob Stedtfeld, Cristina Harzman, Dra. Deborah Himes-Yoder, Dieter
Tourlousse, Fan Yang, Gregorie Seyrig, Jie Dang, Dr. Jorge Rodrigues, Patrick Chain,
Dr. Peter Bergholz, Dra. Shoko Iwai, Dr. Stephan Gardner, Tiffany Stedtfeld, Woo Jun
Sul, Dra. Youfeng Zhu e Yu Yang. Em especial, à Dra. Debora Rodrigues, uma amiga
cujo apoio foi fundamental para a existência deste trabalho, e à Dra. Aijie Wang pelas
muitas horas de trabalho compartilhadas e amizade construída. À Dra. Claudia
Etchebehere e à Erick Cardenas, pela ajuda nas análises dos dados de microarranjos de
DNA apresentados nessa dissertação.
À Maryam Thompson, técnica de laboratório, por ter sempre me ajudado tanto
dentro do laboratório como fora dele, resolvendo questões burocráticas da universidade.
A todos os meus colegas da turma de 2006.1 do curso de Mestrado em
Ciências Marinhas Tropicais, pelos momentos de crescimento e de estudo dentro e fora
das salas de aula, em especial, à Claudia Brandão, Rosa Rebolças e Samara Cardoso
que, juntamente com Lidianne Rocha, compartilharam muitas leituras de artigos
científicos e cafezinhos na sala de informática do Instituto. Ao colega Marcelo Sousa,
pela ajuda no uso dos programas estatísticos.
Aos amigos sempre presentes em minha vida, mesmo aqueles cuja distância
geográfica dificulta um pouco: Caroline Beserra, Dayane Castro, Felipe Bottona,
Gerson Moura, George Tabatinga, Georgia Tavares, Jeamylle Nilin, Lia Sales, Luciana
vii
Gil, Luciana Leitão, Marcel Coelho, Dr. Marcellus Caldas, Marcionília Pimentel,
Marina Viana, Dra. Martha Smith, Paulo Mesquita, Priscila Freitas, Raquel Mountoilas,
Raquel Gomes, Rodrigo Marco, Rômulo Freitas, Rosie Quackquarini, Sara Brasil,
Sidarta Lopes, Ticiana Bezerra e Tulio Oliveira. Em especial, aos meus grandes apoios
durante o ano de 2007 em Michigan: à Dra. Alejandra Manzan, que além de vizinha
tornou-se uma amiga muito querida. À minha irmã e roomate Manuela Melo, que
existiu em todos os meus momentos, humores e decisões, fossem bons ou ruins, certos
ou errados, pessoa maravilhosa de quem guardo muitas saudades. À Ritaumaria Pereira,
grande amiga com quem dividi almoços, conversas, caminhadas e desabafos. Todos
vocês tornaram (e tornam) a minha vida mais leve!
Aos meus amados pais, Iolanda Araujo e Aloizio Paes, pela dedicação e apoio
despretencioso e incondicional. Pelo suporte afetivo, psicológico e financeiro durante
toda a minha vida, particularmente nesses meus anos acadêmicos, por investirem no
meu potencial intelectual, acreditarem e sonharem comigo. À minha querida irmã
Luciana Paes e ao cunhado Alexandre Lasmar, pelo amor e amizade que temos, pelas
longas conversas, via internet, todos os domingos, pelo apoio e conselhos, sei que posso
sempre contar com vocês. Ao meu estimado irmão Thiago Paes, por estar sempre me
apoiando, acreditando e sonhando com minha carreira (até demais), por ter me
acompanhado nas muitas madrugadas que dediquei à escrita deste trabalho, incluindo o
período final, de maior exaustão e irritação, pelo amor e cumplicidade que tem por mim.
À Joana Rodrigues, pela dedicação a esta família. O apoio máximo de todos vocês foi
essencial e sou muito grata por isso.
A Deus, pela concessão da vida e da inteligência, por representar a calma, nos
momentos de sufoco, a esperança, nas noites em claro, o conforto, nos momentos de dor
e a força diante dos obstáculos julgados intransponíveis.
viii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS..............................................................................................................x
LISTA DE QU ADROS ...........................................................................................................xiii
LISTA DE TABELAS.............................................................................................................xiv
RESUMO ................................................................................................................................xv
ABSTRACT ............................................................................................................................xvi
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................................3
2.1. O Ecossistema Mangu ezal..................................... ......................................... ......3
2.2. Impactos causados pelo petróleo no Ambiente...................................................... 9
2.3. A Indústria do Petróleo na Baía de Todos os Santos..............................................13
2.4. Técnicas Moleculares Aplicadas a Estudos de Ecologia Microbiana .....................17
3. OBJETIVOS......................................................................................................................29
3.1. Gerais..................................................................................................................29
3.2. Específicos ..........................................................................................................29
4. MATERIAIS E MÉTODOS.............................. .................................................. ...............30
4.1. Sítios de Amostragem, Coleta e Variáveis Físico-químicas.................................. 30
4.2. Extração de DNA Total do Solo...........................................................................33
4.3. T-RFLP...............................................................................................................33
4.3.1 PCR .........................................................................................................34
4.3.2 Purificação do DNA.................................................................................35
4.3.3 Digestão Enzimática.................................................................................35
4.3.4 Geração dos Padrões de T-RFLP ........................................................ ..... .36
4.3.5 Análise dos Dados....................................................................................36
4.4. Microarranjos de DNA.........................................................................................37
4.4.1. Preparação das Lâminas de Microarranjos de DNA.................................. 37
4.4.2. Amplificação com Iniciad ores Randômicos .......................... ....................39
4.4.3. Marcação das Amostras............................................................................40
4.4.4. Hibridização.............................................................................................41
4.4.5. Lavagem das Lâminas..............................................................................42
4.4.6. Escaneamento, Geração e Tratamento da Imagem .................................... 43
4.4.7. Análise de Dados .....................................................................................43
4.5. Aná lise da Div ersi dade G en éti ca..........................................................................44
ix
5. RESULTADOS..................................................................................................................45
5.1. Dados Abióticos..................................................................................................45
5.2. T-RFLP...............................................................................................................45
5.3. Microarranjos de DNA ........................................................................................52
5.4. Índices de Diversidade ........................................................................................59
5. DISCUSSÃO.....................................................................................................................61
6.1. Variá veis Abi óticas..............................................................................................61
6.2. T-R FLP...............................................................................................................64
6.3. Microarranjos de DNA ........................................................................................68
6.4. Índices de Diversidade . ........................................................................................73
7. CONCLUSÃO...................................................................................................................75
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ............................ ........................... ........................76
ANE XOS. ................................................................................................................................96
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mapa da região da baía de Todos os Santos.......................................................13
Figura 2. Esquema geral da técnica do polimorfismo de comprimento de
fragmentos de restrição terminais (T-RFLP)......................................................25
Figura 3. Esquema geral da técnica de microarranjos de DNA (DNA
microarrays)......................................................................................................27
Figura 4. Mapa da baía de Todos os Santos (A) com localização dos sítios de
amostragem (B). ...............................................................................................32
Figura 5. Protocolo experimental da técnica do polimorfismo de comprimento de
fragmentos de restrição terminais (T-RFLP)......................................................34
Figura 6. Protocolo experimental da técnica de microarranjos de DNA............................37
Figura 7. Esquema de funcionamento do kit comercial Templiphi Amplification Kit .........40
Figura 8. Eletroforese de gel de agarose 1 % marcado com SYBR
®
Safe DNA..................46
Figura 9. Número total de T-RFs de comunidades bacterianas encontrados em
amostras de solos da baía de Todos os Santos (BA) revelados por
digestão enzimática com HhaI e MspI...............................................................47
Figura 10. Perfis de T-RFs obtidos pela digestão com HhaI para S1 (verde) e S2
(cinza) da baía de Todos os Santos (BA)...........................................................48
Figura 11. Perfis de T-RFs obtidos pela digestão com MspI para S1 (verde) e S2
(cinza) da baía de Todos os Santos (BA)...........................................................49
xi
Figura 12. T-RFs comuns a S1 e S2 da baía de Todos os Santos (BA) revelados com
a enzima HhaI...................................................................................................50
Figura 13. T-RFs comuns a S1 e S2 da baía de Todos os Santos (BA) revelados com
a enzima MspI...................................................................................................50
Figura 14. Proporção entre as unidades taxonomias cultiváveis e não cultiváveis
relacionadas com os T-RFs gerados com a enzima HhaI para S1 e S2 da
baía de Todos os Santos (BA) utilizando a ferramenta MICA para o
acesso a b ancos de dados. .................................................................................51
Figura 15. Proporção entre as unidades taxonômicas cultiváveis e não cultiváveis
relacionadas com os T-RFs gerados com a enzima MspI para S1 e S2 da
baía de Todos os Santos (BA) utilizando a ferramenta MICA para o
acesso a b ancos de dados ..................................................................................52
Figura 16. Eletroforese de gel de agarose 1 % marcado com SYBR
®
Safe DNA.................53
Figura 17. Proporção dos grupos genéticos das comunidades microbianas de S1 e
S2 da baía de Todos os Santos (BA) mostrada através da hibridização
com mic roar ranj os de DNA . .............................................................................55
Figura 18. Perfil detalhado dos tipos de sequências genéticas pertencentes ao grupo
de genes de remediação orgânica detectadas em amostras de solo de dois
sítios (S1 e S2) da baía de Todos os Santos (BA)..............................................56
Figura 19. Principais grupos de organismos cujas sequências genéticas relacionadas
à remediação orgânica hibridizaram com o DNA total do solo de
amostras de S1 da baía de Todos os Santos (BA). ............................................. 57
Figura 20. Principais grupos de organismos cujas sequências genéticas relacionadas
à remediação orgânica hibridizaram com o DNA total do solo de
amostras de S2 da baía de Todos os Santos (BA) .............................................. 58
xii
Figura 21. Diagrama de Venn mostrando o valor total das sequências hibridizadas
únicas e compartilhadas de cada um dos sítios (S1 e S2) estudados na
baía de Todos os Santos (BA)...........................................................................59
xiii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Vantagens e desvantagens das metodologias baseadas na bioquímica dos
microrganismos para estudo da diversidade dos solos.........................................19
Quadro 2. Vantagens e desvantagens de algumas metodologias baseadas em biologia
molecular para estudo da diversidade dos solos...................................................20
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição do ecossistema Manguezal no mundo............................................4
Tabela 2. Sumário dos grupos das sequências genéticas contidos nas lâminas de
microarranjos de DNA utilizadas nesse trabalho................................................39
Tabela 3. Localização e perfil abiótico de amostras de solos coletadas na região
Norte da Baía de Todos os Santos (BA).. .......................................................... 45
Tabela 4. Sequências genéticas dos microarranjos de DNA hibridizadas com o
DNA total de amostras de solos coletadas na Baía de Todos os Santos
(BA).................................................................................................................54
Tabela 5. Índices ecológicos calculados para comunidades microbianas de
amostras de solos coletadas na Baía de Todos os Santos (BA)...........................60
xv
RESUMO
Os manguezais são ecossistemas importantes e produtivos, encontrados ao longo da
linha da costa de regiões tropicais e subtropicias. Processos importantes, como a
ciclagem de nutrientes, estão diretamente conectados à atividade das comunidades
microbianas desses solos. Dada sua posição estratégica, os manguezais são bastante
impactados no mundo todo. No Brasil, áreas importantes como a da Baía de todos os
Santos (BA) são severamente afetadas pela presença do petróleo. Compreender as
adaptações da microbiota local e sua dinâmica, frente às alterações ambientais, é
essencial para que se consiga manter ou restaurar esses ecossistemas. A presente
dissertação investigou a estrutura e a função de comunidades microbianas em uma área
do manguezal da baía de Todos os Santos, poluída pela indústria do petróleo. Dois
locais foram amostrados – um, situado na área de refinamento dessa indústria e o outro,
distante desse local e usado como controle. Além dos dados abióticos medidos, dois
métodos independentes de cultivo foram utilizados: T-RFLP e microarranjos de DNA.
Os resultados de ambos os sítios, nos experimentos de T-RFLP, mostraram que as duas
comunidades bacterianas diferem quanto à sua estrutura. Para o sítio amostrado na área
da refinaria, um número maior de OTUs sugere um estímulo ambiental, na comunidade
bacteriana, fato associável ao alto teor de matéria orgânica desse local. Para os
microarranjos de DNA, categorias similares de genes foram detectadas, em ambos os
locais, mas a especificidade de suas sequências foi distinta. Os genes que codificam
para a remediação orgânica foram os mais representativos, mais de 40% do total nos
dois sítios. Mesmo detectando categorias semelhantes, apenas 4% das sequências
genéticas foram comuns aos sítios. Estes dados mostram que organismos diferentes são
responsáveis por funções similares em cada ponto. A diferença entre os locais,
observada nos experimentos, pode ser relacionada com o fato do sítio 1 situar-se numa
região fortemente afetada por hidrocarbonetos. Utilizando-se índices ecológicos, os
dados de T-RFLP indicaram o sítio 1 como mais diverso, enquanto os resultados dos
microarranjos de DNA mostraram o oposto. Concluindo, a estrutura e função da
microbiota local são afetadas pela presença da indústria do petróleo. Estudos adicionais
poderão ajudar a compreender a dinâmica dessas comunidades microbianas, frente às
futuras exposições ao óleo e/ou derivados.
Palavras-chaves – manguezais, diversidade microbiana, T-RFLP, microarranjos de
DNA.
xvi
ABSTRACT
Mangroves are important and productive intertidal ecosystems along subtropical and
tropical coastlines. Important processes such as nutrient cycling are directly connected
to the activity of the microbial communities of mangrove soils. Because of their
strategic location, mangroves have been widely impacted around the world. Important
mangrove areas, such as Todos os Santos bay (BA), are impacted by crude oil and its
derivates. Hence, understanding the local microbiota's dynamics and adaptations to
petroleum-induced environmental alterations is essential to assessing or restoring
desirable ecosystem functions. I investigated the structure and function of microbial
communities in a mangrove area located in the north of Todos os Santos bay. Two sites
were sampled – one located inside an industry refinery area and another located outside
that area in a place considered less affected by hydrocarbons. Temperature, pH, salinity
and organic matter content were measured. Two culture-independent community
analysis methods were used: T-RFLP and DNA microarray. The T-RFLP experiments
showed two distinct community structures. The site inside the refinery area showed a
higher amount of OTUs suggesting that the higher amount of organic matter may have
stimulated the bacterial community. The microarray experiments showed similar
functional gene categories found at both sites, but the particular sequences that
hybridized were different. The genes coding for organic carbon degradation were the
most frequently detected category counting for more than 40% of the total probes
hybridized at both sites. Even though the hybridized categories were similar, the sites
shared just 4% of the total hybridizing genes. These results show that different
organisms are responsible for similar functions on each site. Using diversity index, T-
RFLP data indicated that site near the refinery was more diverse than the distant site,
while microarrays results showed the opposite. The former method measures bacterial
populations while the latter measure sequence diversity of functional genes, which may
indicate that the polluted site is selecting for more different bacteria but that they have a
less diverse set of functional genes. In conclusion, the structure and function of the
microbiota may be affected by the presence of the petroleum industry products. Further
studies will help us understanding the dynamics of those communities following
petroleum exposure.
Keywords – contaminated mangroves, microbial diversity, T-RFLP, DNA microarrays.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
1
1 – INTRODUÇÃO
O impacto da existência e desenvolvimento das civilizações nas zonas costeiras,
espalhadas pelos cinco continentes existentes na Terra, ainda que não precisamente mensurado,
é
mundialmente reconhecido. Uma parte desse desequilíbrio ecológico
é
gerada pela indústria
petroquímica, cujos subprodutos representam poluentes altamente recalcitrantes. São
especialmente preocupantes as áreas consideradas de alta sensibilidade, como os manguezais,
pois são ecossistemas importantes, porém frágeis e de difícil recuperação. A perda anual dessas
áreas estuarinas
é estimada
em mais de um milhão de hectares
no mundo todo. Apesar do
crescente empenho científico para tentar reverter este quadro, ainda são poucos os registros de
resultados efetivamente bem sucedidos na remediação in situ de áreas de manguezais impactadas
por hidrocarbonetos. Tem-se, portanto, uma demanda na produção e aplicação de conhecimento
neste setor. Faz-se necessária a urgente geração de dados que ajudem a promover a inversão desta
realidade.
Os manguezais, considerados a coluna vertebral dos ambientes marinhos tropicais,
desempenham um papel essencial na manutenção da biodiversidade oceânica, funcionando como
berçário e fontes de alimento para peixes e outros animais. O papel de exportador de nutrientes
ocorre graças às altas concentrações de matéria orgânica e ao caráter
anóxico, propriedades
típicas das regiões de mangue. No entanto, essas mesmas condições igualmente favorecem a
permanência e acúmulo de poluentes, como os derivados de petróleo, em seus solos. Esses
xenobióticos podem persistir por décadas e, a
longo prazo,
causar desequilíbrio nos processos
essenciais para a manutenção do ambiente
, incluindo modificações nos ciclos biogeoquímicos e
na cadeia alimentar. Ambas as situações são consequências diretas de alterações na estrutura das
comunidades microbianas aut
ó
ctones.
Apesar dos microrganismos serem fundamentais para a manutenção dos ecossistemas, o
conhecimento acumulado sobre esses seres até recentemente foi limitado pelo uso de
metodologias dependentes de cultivo. Com o advento de técnicas moleculares baseadas na análise
do DNA de microrganismos retirado diretamente de amostras ambientais, avanços importantes
nos estudos de ecologia microbiana têm sido registrados. Todavia, dados científicos sobre a
estrutura e diversidade das comunidades microbianas de manguezais são ainda escassos, mas
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
2
podem ser úteis tanto para avaliar o grau de impactação causado pela ação antrópica nestes
ecossistemas peculiares, como para promover ações eficazes da remediação destes impactos.
O Brasil vive um momento de crescimento econômico no setor petroquímico, mas, em
algumas regiões do país, como no caso da baía de Todos os Santos, no estado da Bahia, a
exploração do petróleo data mais de 50 anos. Ao longo dessa consolidada exploração, muitos
eventos foram ou são responsáveis pelo impacto ambiental ali gerado. Atualmente, pesquisadores
de vários ramos da ciência têm trabalhado em conjunto para o desenvolvimento de soluções
eficazes para o problema.
Inserido nesse contexto e procurando acrescentar preciosas informações ao estudo dos
manguezais no Brasil, o presente trabalho se propõe a contribuir estudando
, através do uso de
técnicas moleculares avan
ç
adas, as comunidades microbianas do solo desse manguezal
contaminado com petróleo.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
3
2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. O Ecossistema Manguezal
Encontrados em áreas de transição entre o ambiente terrestre e marinho, característicos
de regiões costeiras tropicais e subtropicais, os manguezais desempenham um papel essencial na
manutenção da biodiversidade marinha. Estão associados às margens de baías, enseadas, barras,
desembocaduras de rios, lagunas e reentrâncias costeiras, podendo também ser encontrados em
exposicão direta à linha da costa (Quartel et al., 2006; Dittmar et al., 2001; Shriadah, 1998;
Walsh, 1974). Este ecossistema está sujeito ao regime das marés, gerador de um gradiente de
salinidade típico, e seu solo é predominantemente lamoso, com baixos teores de oxigênio. Além
disso, apresenta uma vegetação especializada e altamente típica de plantas lenhosas, comumente
chamadas de Mangue (Jennerjahn & Ittekkot, 2002; Schaeffer-Novelli, 1995).
Em todo o
mundo, estão sujeitos a impactos
naturais e/ou antrópicos associados às atividades das
civilizações nas zonas costeiras (NOAA, 2002). No Grande Dicionário Aurélio da Língua
Portuguesa, Manguezal é definido como um ambiente de solos pantanosos à margem de lagoas e
estuários; margens pantanosas de rios e portos; florestas ao longo de rios até o limite superior
atingido pela água do mar.
Os manguezais ocorrem em 122 países e cobrem aproximadamente 18 milhões de
hectares, ocupando cerca de um quarto das regiões costeiras dos cincos continentes do planeta,
como mostrado na Tabela 1 (Kathiresan & Qasim, 2005; Spalding et al., 1997). Distribuído entre
os trópicos de Câncer e de Capricórnio, é o ecossistema predominante das margens continentais
dessa região do globo, ocupando entre 60 a 75% da costa intertropical (Spalding et al., 1997).
Brasil, Indonésia, e Austrália são os países que possuem a maior abundância de áreas de
manguezais (Aksornkoae et al., 1984). Na America Latina, os mangues cobrem uma área pouco
inferior a 4 milhões de hectares na costa de ambos os oceanos, Atlântico e Pacífico (Lacerda et
al., 1993). No Brasil, podem ser encontrados desde o extremo norte, no Amapá, até o sul de Santa
Catarina, na foz do Rio Araranguá (Cury et al., 2002
). Podem, também, ser encontrados ao
longo de toda a faixa litorânea da região Nordeste, tendo maior extensão nos estados do
Maranhão e da Bahia (Vannucci, 1999).
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
4
Tabela 1 – Distribuição do ecossistema Manguezal no mundo.
Região Área (km
2
) Proporção global
Sul e Sudeste da Ásia
75.173 41,5 %
Australasia
18.789 10,4 %
Américas
49.096 27,1 %
Oeste da África
27.995 15,5 %
Leste da África e Oriente Médio
10.024 5,5 %
Total
181.077 100 %
FONTE: Adaptado de Spalding et al., 1997
Dentre as principais características ambientais condicionantes da ocorrência, estrutura
e funcionamento
do manguezal, destacam-se: temperaturas tropicais, substratos aluviais,
proteção contra ondas, presença de água salgada e considerável
amplitude de marés. A
formação do ecossistema é ainda diretamente vinculada
ao aporte de materiais sedimentares
tanto marinho quanto continental
, o que torna estes ambientes de transição altamente produtivos
(Cury et al., 2002; Walsh, 1974).
No tocante à temperatura, toda a biota típica de manguezal é, por definição, sensível
ao frio, por isso a ocorrência do ecossitema, em ambos os hemisférios, é limitada pela
temperatura mínima de 15 C. Este é o principal aspecto que justifica a localização predominante
de manguezais na costa oeste dos continentes entre os 30 de latitude norte e 30 de latitude
sul. Além disso, os manguezais têm um desenvolvimento muito escasso nas regiões com
ventos fortes, que provocam ressecamento e desenraizamento (Van Santen et al., 2007;
Fruehauf, 2005; Mastaller, 1990). A dependência por um abastecimento periódico de água
doce, por sua vez, explica a falta dessa vegetação nos litorais com clima desértico. De fato, as
áreas passíveis de ocupação por florestas de mangue apresentam algum aporte de água doce,
qual seja de rios, chuvas ou ainda da proximidade de corpos de água, cuja massa líquida atua
controlando o excesso de sal marinho (Dittmar et al., 2001; Schaeffer-Novelli et al., 2000;
Vannucci, 1999).
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
5
Fruehauf (2005) cita em seu trabalho que o ecossistema manguezal geralmente ocorre
em estuários protegidos e lagoas rasas. De fato, a
proteção contra a ação das ondas em
áreas
litorâneas planas e calmas
, favorece a permanência da vegetação típica, que possui raízes
pouco profundas. N
essas áreas aluviais, outras vantagens ambientais viabilizam a ocorrência de
mangues, quais sejam: troca regular de matéria orgânica proporcionada pelas águas das
marés e aportes pluviais e/ou fluviais; larga amplitude da maré e existência de água salobra,
formada pela mistura de água doce do rio com água salgada do mar (Schaeffer-Novelli, 1995;
Ceará, 1992).
Dada a peculiaridade das condições ambientais observadas na ocorrência dos
manguezais e as bruscas mudanças que ocorrem, naturalmente, nesse ecossistema, todo e
qualquer organismo nele vivente deve estar adaptado para reproduzir-se e desenvolver-se naquele
ambiente.
A vegetação dos manguezais é uma ótima figuração da paisagem descrita. Os
mangues são altamente especializados e
representados por poucas espécies geralmente
abundantes, como
Rhizophora mangle
,
Laguncularia racemosa
,
Avicennia tormentosa
e
Avicennia schaueriana
,
altamente adaptadas às condições de solos alagados, com baixas
concentrações de oxigênio e salinidade variável. Entre as adaptações podemos citar as raízes
escora, responsáveis pela sustentação das árvores sobre o sedimento, e glândulas excretoras de
sais que conferem tolerância à salinidade típica do ambiente (Rossi & Mattos, 2002).
A
distribuição de cada uma dessas espécies nos manguezais ocorre em
zonas bem definidas e é
determinada principalmente pelos fatores abióticos anteriormente descritos.
Com relação à fauna, os manguezais abrigam grande variedade de animais residentes,
semi-resistentes, visitantes constantes ou esporádicos. A maior parte provém do ambiente marinho
como moluscos, crustáceos e peixes, mas a água doce também contribui com algumas espécies.
Do ambiente terrestre provêm aves, répteis, anfíbios, mamíferos e insetos. Entre esses animais,
merecem destaque os crustáceos decápodas, característicos desse ecossitema e que desempenham
papel importante na manutenção da dinâmica do ambiente. Eles fragmentam folhas que caem
das árvores, facilitando sua utilização por microrganismos e, ao construírem suas tocas,
reviram a lama, trazendo à superfície grande quantidade de matéria orgânica. Entre os
caranguejos mais conhecidos destacam-se Goniopsis cruentata (aratu), Cardisoma guaiamuni
(guaiamum), Ucides cordatus (caranguejo-uçá) e os pequenos chama-marés do gênero Uca
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
6
(Fruehauf, 2005; Ceará, 1992).
Nos manguezais, bactérias, arqueas e fungos constituem cerca de 91% da biomassa
microbiana, enquanto microalgas e protozoários representam apenas 7% e 2% respectivamente
(Alongi, 1988). Apesar de existir um número menor de estudos reportados na literatura sobre a
composição da microbiota desse ecossistema, quando comparado aos aspectos abióticos e fauna e
flora associada, sabe-se que a microbiota é essencial para manutenção do manguezal, sendo sua
vasta diversidade filogenética e funcional a chave que governa o fluxo de energia e a ciclagem de
nutrientes. De acordo com Alongi (1994), os ecossistemas marinhos tropicais, aquáticos ou
terrestres, são bem mais dependentes da atividade microbiana que os ecossistemas de zonas
temperadas. Nos trópicos, a formação do húmus e a reciclagem de nutrientes por comunidades
microbianas é um processo bastante eficiente, sendo as bactérias responsáveis por grande parte
do fluxo de carbono nos sedimentos dos manguezais (Holguin et al., 2001). Vê-se, portanto, a
íntima relação entre a microbiota das florestas de mangue e os solos que habitam.
Os solos dos manguezais são formados pela deposição de partículas de origem
continental e marinha, orgânicas e inorgânicas, que estão em suspensão na água, e se
movimentam em função das correntes de fluxo e refluxo das marés (Stralher & Stralher, 2000).
No geral, estes solos apresentam granulometria caracteristicamente fina, com dominância das
frações de tamanho menor que 0,05 mm, ou seja, silte-argila. Possuem muita matéria
orgânica, alto conteúdo de sal, baixa consistência e cor cinza escuro. Também apresentam
amplas variações nos valores de potencial hidrogeniônico (pH), capacidade de troca catiônica
(CTC), capacidade de retenção de água, potencial redox (Eh), salinidade, nitrogênio e fósforo
extraível (Rossi & Mattos, 2002; Cardona & Botero, 1998), além de variações na composição
mineralógica.
Um aspecto importante desses solos é a presença de pirita (FeS
2
), comum nos
manguezais. Sua formação se dá em ambientes redutores, com presença de matéria orgânica,
ferro, enxofre proveniente do mar e microrganismos como, por exemplo, a bactéria
Acidithiobacillus ferrooxidans que reduzem os íons sulfato (SO
4
-2
) a sulfito (SO
3
-2
) e os íons
férrico (Fe
+3
) a ferroso (Fe
+2
), estável nessas condições; porém, quando os solos são drenados,
ocorre a oxidação da pirita e a produção de ácido sulfúrico (H
2
SO
4
), causando uma redução dos
valores de pH, podendo formar solos sulfato-ácidos em áreas mais elevadas, caso a
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
7
quantidade de ácido produzida seja maior que a capacidade de neutralização do solo
(Vannucci, 1999).
O equilíbrio das condições ambientais próprias do manguezal pode facilmente ser
perturbado por impactos antrópicos, revertendo os processos fundamentais do funcionamento
desse ambiente. Os danos causados pelo homem durante o desenvolvimento das civilizações em
zonas costeiras
é
atualmente reconhecido em nível mundial. No Brasil, as relações entre o
homem e os manguezais é antiga. Populações indígenas já utilizavam essas áreas antes da
chegada dos colonizadores europeus. No período colonial, além de fonte de alimento, o
manguezal era utilizado para retirada de madeira, lenha e tanino usado em curtumes. Em pleno
século XIX, no estado do Rio de Janeiro, descobriu-se que a cinza mineral do mangue
apresentava carbonato e cloreto de sódio, servindo na fabricação de sabão sólido. Historicamente,
uma ocupação mais massiva dos manguezais não ocorreu até a metade desse século, porque a
idéia da época era que as florestas de mangue constituiam-se de áreas com pouca salubridade,
sem muita utilidade para a agricultura e fonte potencial de doenças transmitidas pelos insetos
locais. Por conta disso, a atitude frente a esse ecossistema era drenar e aterrar, para posterior
uso. A partir da década de 1950, nas áreas estuarinas e de manguezal, começaram a implantar-se
indústrias e empreendimentos imobiliários, afetando tanto o ambiente, como as populações
tradicionais que sobreviviam dos recursos do manguezal (Fruehauf, 2005; Vannucci, 1999).
Atualmente, a importância ecológica e econômica do manguezal são bem estabelecidas,
sendo repetidamente citadas na literatura (Van Santen et al., 2007; Kathiresan & Qasim, 2005;
Vannucci, 1999; Ceara, 1992), tais como:
• Ser fonte de matéria orgânica e nutrientes para as águas costeiras adjacentes, contribuindo
para a produção primária da zona costeira;
• Atuar como local de abrigo, reprodução, desenvolvimento e alimentação de espécies
marinhas, estuarinas, terrestres e líminicas, contribuindo para a manutenção da diversidade
biológica costeira;
• Proteger a linha da costa, evitando erosão e assoreamento dos corpos d´água adjacentes;
• Agir como barreira para a contaminação marinha, retendo produtos químicos, como metais
e hidrocarbonetos provenientes da ação antrópica nos continentes;
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
8
• Ser fonte de produtos para comunidades humanas costeiras, principalmente no tocante à
pesca.
Apesar da clara valia do ecossistema manguezal, nos últimos 50 anos, aproximadamente
um terço das florestas de mangue, em todo o mundo, vêm sendo perdidas e, em paralelo, têm
ocorrido o desaparecimento de espécies biológicas (Kathiresan & Qasim, 2005). O
desenvolvimento não ecologicamente planejado de atividades portuárias, pesqueiras, de
agricultura e aquicultura, industriais, de exploração mineral, turísticas, dentre
outras, mantém
sob constante risco os
estuários e ecossistemas associados, como os manguezais. As florestas de
mangue são especialmente preocupantes, por se tratar de áreas consideradas de alta sensibilidade,
em razão da importância, fragilidade e difículdade de recuperação (SQA/MMA, 2002).
Com uma perda anual
estimada
em mais de um milhão de hectares
no mundo todo
(Moscatelli, 1999), os manguezais têm sido levados em conta cada vez maior no tocante à
implementação de leis de proteção ambiental. Embora menosprezados no passado, entende-se,
hoje, que a perda das áreas de manguezais implica diretamente na não execução do importante
papel que exercem nos setores ecológicos e econômicos, como nos casos previamente citados. O
desflorestamento do mangue, por exemplo, é apontado como uma das principais razões para a
diminuição da produção pesqueira em muitos paises tropicais e subtropicais (Kathiresan &
Qasim, 2005).
A preservação deste ecossistema é regida por leis federais e estaduais. Referidos
instrumentos legais impõem restrições ao uso das áreas de florestas de mangues. De acordo com
Cunha-Lignon (2001) a legislação federal que discorre sobre o ecossistema Manguezal
transparece sobre as seguintes citações: Art. 225 da Constituição Federal do Brasil (1988); Lei nº
4.771/65 do Código Florestal; Res. CONAMA n 4 de 18/09/85, Lei nº 9.605/98 de crimes
ambientais, Res. CONAMA 005/97 e Plano Nacional de Gerenciamento Costeiro (PNGC)
no art. 3°, §1°.
Embora protegido por lei, a falta de fiscalização e a dificuldade de gerenciar o avanço
industrial e tecnológico fazem com que esse ecossistema seja constantemente impactado. O
desenvolvimento de alternativas de manejo e de ferramentas biotecnológicas, capazes de
remediar as alterações antrópicas ocorrentes no ambiente, são alternativas promissoras que vêm
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
9
sendo cada vez mais estudadas. No sentindo de auxiliar este processo, o levantamento do
inventário vivo e o entendimento de como os organismos respondem às mudanças ambientais
contemporâneas torna-se artigo de primeira necessidade para o gerenciamento dos diferentes
ecossistemas do globo, incluindo as florestas de mangue e demais regiões costeiras.
2.2. Impactos Causados pelo Petróleo no Ambiente
O petróleo é um recurso natural consideravelmente abundante, cuja exploração
representou um marco no desenvolvimento da nossa civilização. Atualmente, é a principal fonte
de energia de diversos setores industriais e de bens de consumo. Serve como base para fabricação
dos mais variados produtos, dentre os quais se destacam: óleo diesel, gasolina, alcatrão,
polímeros plásticos e até mesmo medicamentos. Este recurso tem grande peso na economia
mundial e já motivou muitas guerras, sendo hoje a principal fonte de renda de muitos países,
sobretudo no Oriente Médio (Gomes, 2004).
Do latim petroleum, petrus, pedra e oleum, óleo, a palavra petróleo significa óleo da
pedra. É uma substância oleosa, inflamável, menos densa que a água, com cheiro característico e
coloração que varia do castanho claro ao preto, passando por verde e castanho escuro. Originado
da transformação de grandes deposições fósseis, é uma mistura complexa de compostos
orgânicos, com alto conteúdo energético. Contém hidrocarbonetos que variam de moléculas
simples, como metano, a moléculas com alta massa molecular. A fração saturada do petróleo
compreende os n-alcanos, considerados os mais facilmente degradáveis. Já a degradação de
compostos aromáticos e poliaromáticos é mais complexa. Também pode conter quantidades
pequenas de nitrogênio, oxigênio, compostos de enxofre e íons metálicos, principalmente de
níquel e vanádio (Mille et al., 2007; Bamforth & Singleton, 2005; Atlas, 1981). De acordo com
Gomes (2004), uma amostra de petróleo considerada padrão apresenta 14% de parafinas normais,
16% de parafinas ramificadas, 30% de naftênicos, 30% de aromáticos e 10% de resinas e
asfaltenos.
A utilização de energia é fundamental para o mundo contemporâneo e, nesse cenário, o
petróleo ocupa a liderança da matriz energética, com participação em torno de 35%. No Brasil, a
indústria do petróleo tem apresentado um crescimento intenso, sendo responsável por
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
10
aproximadamente 10% do PIB nacional e com uma produção que se aproxima da auto-suficiência
(ANP, 2007). Todavia, ela é igualmente uma importante fonte de poluição ambiental. Inúmeros
acidentes envolvendo vazamento ou derramamento de petróleo já foram reportados, tendo
causado prejuízos a curto e longo prazo (NRC, 2003).
Os grandes derramamentos de petróleo podem ocorrer durante atividades de exploração
ou produção tais como: acidentes com tanques marinhos, perfuração de leitos marinhos
complexos, frotas marítimas, refinarias costeiras e urbanas, e vazamentos associados (Mille et al.,
2007; El-Tarabily, 2002). Os derramamentos mais catastróficos ocorrem geralmente na região
costeira, afetando o ecossistema marinho e litorâneo, principalmente os manguezais (Mille
et al., 2007).
Dada a grande movimentação de petróleo por transporte marítimo, registrou-se em 1967,
o primeiro grande desastre ambiental pelo encalhemento do petroleiro Torrey Canyon, entre a
zona costeira da Inglaterra e da França, liberando 123.000 toneladas de óleo. Outro acidente
marcante na história da indústria petroquímica foi o que ocorreu nos EUA, com o Exxon Valdez
em 1989, quando 38 milhões de litros de petróleo vazaram no Alaska. Desde então, outros casos
ocorreram envolvendo navios, portos, terminais, oleodutos e refinarias entre outras fontes,
motivando a necessidade de investimentos na prevenção, no combate a essas ocorrências e nas
atividades de limpeza e remediação das áreas afetadas (Van Hamme et al., 2003; Sloan, 1999;
Atlas, 1981).
No Brasil, de acordo com o Sindicato dos Petroleiros, o SINDIPETRO, (2007), o
primeiro grande acidente petrolífero ocorreu em 1967 num terminal localizado na ilha de Madre
de Deus, baía de Todos os Santos. Outros acidentes de grande relevância também foram
registrados pelo SINDIPETRO, no decorrer das sucessivas décadas nos estados do Rio de Janeiro
(1972; 1984; 1988; 1991; 2001), Bahia (1982; 1992), São Paulo (1982; 1984), Minas Gerais
(1998) e Paraná (2000). Em adição, acidentes de menor porte ou não oficialmente registrados
pelo sindicato, bem como a contaminação diária e cumulativa das atividades petroquímicas são
igualmente danosos ao ecossistema. De acordo com Mille et al. (2007), quantidades de
hidrocarbonetos de aproximadamente 3x10
6
toneladas são introduzidas a cada ano nos ambientes
marinhos.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
11
As zonas costeiras são as áreas primeiramente expostas à poluição com petróleo. Em
escala mundial, a contaminação dessas áreas é relativamente bem conhecida, mas no nível local
existe ainda uma considerável falta de dados em muitos pontos, onde múltiplas fontes de
hidrocarbonetos estão estabelecidas, particularmente no caso dos manguezais. Assim como
outros ecossistemas costeiros, os manguezais estão expostos à contaminação por hidrocarbonetos
via águas de rios, esgotos urbanos e industriais, exaustores de veículos, tráfego de embarcações
etc. Sendo áreas caracterizadas por alta produtividade primária, possuindo altas concentrações de
matéria orgânica com abundância de detritos e condições de anoxia e potencial redox, os
manguezais representam um ambiente bastante favorável para a conservação e acúmulo de
hidrocarbonetos no solo (Mille et al., 2007; Zhang et al., 2004; Zheng et al., 2002; Tam et al.,
2001). Além disso, as condições de inundação e as características da vegetação, com raízes
abundantes, formam uma malha superficial, dificultando o acesso às regiões contaminadas, fato
que impede a descontaminação imediata em casos, por exemplo, de acidentes com petróleo e
derivados (NOAA, 1996).
Estabelecido no ambiente, o petróleo sofre alterações de suas características originais,
em razão de fatores físicos e biológicos como evaporação, dissolução, dispersão, oxidação
fotoquímica, adsorção às partículas e biodegradação. Essas transformações são reguladas pelas
características específicas do derramamento e do ambiente atingido. Geralmente, a persistência
desses hidrocarbonetos no ambiente dependerá de vários fatores, dentre os quais: estrutura
química, concentração e dispersão do contaminante no ambiente (Sloan, 1999). No caso dos
manguezais, estipula-se uma persistência igual ou superior a 20 anos (Michel, 2001; Cury et al.,
2002). Esse tempo prolongado é explicado pela lenta biodegradação dos hidrocarbonetos de
petróleo, devido à limitação de oxigenação do meio e lenta ciclagem dos nutrientes, essenciais
para a atividade microbiana aeróbia (Bamforth & Singleton, 2005; Scherrer & Mille, 1989).
A existência de microrganismos capazes de degradar os hidrocarbonetos do petróleo
utilizando-os como fonte de carbono foi demonstrada primeiramente por Zobell (1964), que
observou que esses organismos eram amplamente distribuídos na natureza. Atualmente, sabe-
se que parte são degradadores de alcanos, outros de aromáticos e alguns conseguem metabolizar
ambos (Atlas & Bartha, 1992). Grande parte desses microrganismos estão distribuídos pelos
oceanos. A exposição desses ambientes ao petróleo ocasiona um aumento na atividade e
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
12
abundância de organismos degradadores, com dominância de populações de bactérias que
contêm plasmídeos com genes para a degradação de hidrocarbonetos. Assim, ocorre a diminuição
da diversidade microbiana, alterando-se a estrutura das comunidades, podendo afetar a
função e a integridade do ecossistema (El-Tarabily, 2002; Braddock et al., 1996; Atlas, 1995). De
acordo com Atlas (1981), a proporção de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos do
petróleo aumenta de menos de 1%, em ambientes marinhos não contaminados, para mais de 10%,
em ambientes marinhos contaminados. Mesmo com a dominância de organismos degradadores
num dado ambiente contaminado, o petróleo cru nunca é completamente degradado, sempre
persistindo resíduos mais complexos e geralmente contendo compostos asfálticos, os quais são
mais inertes e possuem baixa disponibilidade (Atlas, 1995).
Diante da problemática gerada pelos grandes acidentes da indústria petroquímica e o
inestimável valor econômico e ecológico das áreas afetadas, muito se tem investido no
desenvolvimento de ferramentas capazes de remediar o impacto gerado por petróleo nos
ecossistemas. Atualmente, vários processos físico-químicos e biológicos têm sido utilizados na
remoção de hidrocarbonetos de petróleo em solos e águas, sendo a biorremediação a técnica mais
pesquisada e incentivada (Corseuil & Marins, 1997). Essa tecnologia consiste no uso de
microrganismos ou de seus metabólitos para a limpeza dos ambientes contaminados, mas seu
uso, bem como o uso de agentes químicos, pede um estudo prévio minucioso dos aspectos
bióticos e abióticos da área afetada (Ron & Rosenberg, 2002; White et al., 1996). Em outros
termos, qualquer tentativa de remediação ambiental, via agentes químicos ou biorremediação,
deve começar conhecendo-se a comunidade microbiana local, bem como as condições ambientais
prevalentes na área contaminada (Mills et al., 2003; Dowty et al., 2001; Iwamoto & Nasu, 2001).
Até o presente momento, a maioria das áreas potencialmente problemáticas, ou seja, altamente
suscetíveis à exposição por petróleo, em caso de acidentes durante atividades de exploração ou
processamento do óleo bruto, não possuem informação suficiente sobre os efeitos desses
contaminantes para as comunidades biológicas locais, no entanto esses dados são indispensáveis
para uma implementação bem sucedida das técnicas de remediação (Van Hamme et al., 2003).
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
13
2.3. A indústria do Petróleo na Baía de Todos os Santos
A baía de Todos os Santos, berço da indústria petrolífera no estado da Bahia, localiza-se
no Recôncavo Baiano e é a maior baía navegável do Brasil (Figura 1). Com aproximadamente
450 km de extensão, sua orla é recoberta por um extenso manguezal que se desenvolve sobre um
substrato úmido, rico em minerais argilosos e matéria orgânica. Com relação à geomorfologia,
pode ser considerada como uma baía de maré, sendo as suas características claramente marinhas.
O volume de água doce, oriundo dos diversos cursos fluviais que desaguam ali, é duas ordens de
grandeza inferior ao aporte de água salgada que entra pela abertura da baía (Leão & Dominguez,
2000; Lessa et al., 2001).
FONTE: Costa, 2006.
Figura 1 – Mapa da região da baía de Todos os Santos.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
14
A textura dos sedimentos superficiais de fundo da baía de Todos os Santos varia desde
argila a areia muito grossa (Lessa et al., 2001), com distribuição espacial diferenciada. Enquanto
os sedimentos argilosos predominam na porção norte da baía, ao sul verifica-se que as areias
médias e grossas são mais expressivas. Sedimentos carbonáticos e bioclastos ocorrem em
diversas áreas, tendo sido alvo da exploração para fabricação de cimento. Franjas estreitas, mais
ou menos contínuas, de recifes de corais bordejam as ilhas da baía de Todos os Santos (Leão &
Dominguez, 2000).
Nessa região, assistiu-se à implantação das primeiras unidades de exploração, produção
e refino de petróleo em território brasileiro. Como consequência desse pioneirismo, a baía, em
paticular na sua porção norte, apresenta sérios problemas de impactação antrópica via indústria
petroquímica. Este grande problema ambiental faz-se sentir pela biota local e está registrado nos
sedimentos superficiais dos manguezais, sob a forma de contaminação por hidrocarbonetos de
petróleo, aportados ao meio graças a derrames acidentais durantes as operações de exploração,
produção e refino (Veiga, 2003).
O início da história da indústria petrolífera brasileira ocorreu nessa mesma região
costeira. O descobrimento do petróleo no estado da Bahia e o início de sua exploração datam de
1939. Desde então foram perfurados 634 poços, dos quais sete ainda estão em funcionamento.
Até 1998, a região havia produzido 89 milhões de barris de óleo (ANP, 2002). A primeira
refinaria moderna de petróleo do Brasil foi inaugurada em 17 de setembro de 1950, sob o nome
de Refinaria Nacional de Petróleo S.A., tendo sido depois renomeada de Refinaria Landulpho
Alves – Mataripe (RLAM). Funcionando desde então, ela está localizada a 56 Km de Salvador,
no município de São Francisco do Conde, inserida no continente às margens da baía de Todos os
Santos e dentro de uma região de manguezal, ocupando uma área de 6,4 km
2
. Só em ICMS, a
refinaria paga R$ 750 milhões por ano (Veiga, 2003). A capacidade instalada chega a 307 mil
barris por dia, sendo a segunda maior refinaria do país. Possui 26 unidades de refino e produz 38
derivados dentre os quais propano, iso-butano, gás de cozinha, gasolina, querosene de aviação,
parafinas, óleos combustíveis e asfalto, abastecendo as regiões norte e nordeste do país
(Uderman, 2000).
O transporte marítimo de óleo e derivados provenientes da baía de Todos os Santos é
feito por meio do Terminal Almirante Alves Câmara (TEMADRE), segundo terminal portuário
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
15
mais importante da indústria petroquímica brasileira, localizado na Ilha de Madre Deus, logo a
frente do continente, a 10 km da RLAM. Este terminal foi construído em 1958 e ocupa cerca de
50% da ilha movimentando um volume de 1,5x10
9
litros/mês de petróleo e derivados em
operações de carga e descarga. Ainda na ilha Madre Deus, encontra-se em operação uma fábrica
de asfalto, localizada nas proximidades da região portuária e às margens de uma zona de
manguezal (Veiga, 2003). A baía de Todos os Santos abriga, também, o mais antigo parque de
tancagem, com capacidade para armazenar 320 milhões de litros de combustível (ANP, 2002) e o
Parque de Maria Quitéria, onde são guardados tanques com 28 x 10
6
Kg de GLP (gás liquefeito
de petróleo), também transportado por dutos.
Segundo observações de campo realizadas por Veiga (2003), o manguezal da porção
norte da baía de Todos os Santos encontra-se completamente degradado, sendo atravessado por
sistema de dutos, além de sofrer a ação direta dos diversos derrames ocorrentes na região. A
qualidade do ar local também é comprometida, como registrou Tavares (1997). A autora afirma
que o conjunto formado pelo complexo RLAM – TEMADRE constitui-se na maior fonte de n-
alcanos, principalmente os compostos de baixo peso molecular, na atmosfera do Recôncavo
Baiano, seja devido às atividades rotineiras ou em consequência de incêndios acidentais.
Um levantamento importante para que se dimensione a gravidade da impactação na zona
costeira baiana foi o feito por Veiga (2003), onde a autora citou todas as ocorrências de acidentes
ambientais noticiados no jornal diário A TARDE, veículo impresso consagrado do estado da
Bahia, entre os anos de 1992 e 2002. O estudo totalizou 16 grandes acidentes da indústria
petroquímica local, tendo sido o ano de 2000 o mais danoso, com cinco graves ocorrências. Dado
o longo tempo de permanência dos hidrocarbonetos de petróleo em áreas de mangue, o qual, de
acordo com Michel (2001) é de até 20 anos, a baía de Todos os Santos consagra-se uma região
altamente contaminada.
O governo do estado da Bahia, detendo conhecimento sobre a gravidade do problema,
criou a Área de Proteção Ambiental (APA) da baía de Todos os Santos, pelo Decreto Estadual nº
7.595, de 05/06/1999. A ação foi tomada com o objetivo de tentar garantir a proteção das ilhas da
baía, através da ordenação das atividades sócioeconômicas e a preservação de locais de grande
significado ecológico e cultural. A APA, incluindo as águas e as ilhas, tem uma superfície de 800
km
2
e abrange os municípios de Cachoeira, Candeias, Itaparica, Jaguaripe, Madre Deus,
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
16
Maragogipe, Salinas da Margarida, Salvador, Santo Amaro, São Francisco do Conde, Saubara,
Simões Filho e Vera Cruz (Venturini & Tommasi, 2004).
A empresa Petróleo Brasileiro S/A (PETROBRAS) é apontada como a maior
responsável pela emissão de efluentes nas águas da baía de Todos os Santos e na sua atmosfera.
Depois de mais de 50 anos de exploração do recurso na baía, um prejuízo incomensurável cai
sobre a responsabilidade dessa empresa. Ciente disso, a PETROBRAS tem investido, mais
recentemente, na melhoria da qualidade de suas instalações, tanto na área de meio ambiente
quanto na segurança industrial, o que levou a RLAM a ser nomeada a primeira refinaria brasileira
a receber os certificados ISO 9000 (qualidade de produção), ISO 14000 (meio ambiente) e BS
8800 (segurança industrial). Além disso, a empresa tem apoiado, desde 1994, estudos científicos
para que seja entendida, mensurada e finalmente modificada a impactação gerada pela exploração
do petróleo (Veiga, 2003). Como primeiros trabalhos apoiados pela empresa, em 1996, Tavares
(1997) desenvolveu um programa de monitoramento dos ecossistemas ao norte da baía de Todos
os Santos durante o período de 1994/1995, medindo as concentrações de hidrocarbonetos por
cromatografia gasosa. Martins et al. (2005) avaliaram a ocorrência de impacto ambiental crônico
na região norte da baía de Todos os Santos pelos níveis de hidrocarbonetos em sedimentos e as
respostas induzidas pela toxicidade em moluscos.
Atualmente, uma importante parceria foi selada com financiamento da FINEP –
CTPETRO – CNPq. A criação da Rede RECUPETRO – Rede Corporativa em recuperação de
áreas contaminadas por atividades petrolíferas, tem possibilitado estudos sobre a biota, sedimento
e água dos manguezais da região norte da baía de Todos os Santos, objetivando o levantamento
de dados e a elaboração de protocolos ambientais aplicáveis à recuperação de áreas impactadas
pela indústria do petróleo. Entre as universidades envolvidas estão a Universidade Federal da
Bahia (UFBA), Universidade Católica de Salvador (UCSal), Universidade Federal de Alagoas
(UFAL), Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Universidade Federal do Ceará
(UFC), Universidade Federal Tiradentes (UNIT), Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN) e a Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF / LENEP). Inserido nessa
importante rede de conhecimento, o presente trabalho goza do apoio da PETROBRAS para sua
execução. O levantamento de dados da microbiota de solos contaminados da baía de Todos os
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
17
Santos, utilizando-se de técnicas avançadas de Biologia Molecular, é um elemento chave para o
progresso das pesquisas na região.
2.4. Técnicas Moleculares Aplicadas a Estudos de Ecologia Microbiana
Os microrganismos representam as formas de vidas mais abundantes no planeta e sua
diversidade global excede, em muito, a dos demais organismos vivos. Adaptados a praticamente
todos os ambientes existentes na Terra, apresentam uma vasta diversidade metabólica. São
capazes de decompor todos os químicos sintetizados por organismos vivos e os principais
responsáveis pela decomposição e detoxificação de muitos contaminantes ambientais (Ovreas,
2000). Exercem, portanto, papéis essenciais para a funcionalidade dos ecossistemas.
O solo é um ambiente bastante propício ao desenvolvimento microbiano, apresentando
uma diversidade extremamente elevada. Estima-se que um grama de solo pode conter até 10
bilhões de microrganismos incluídos em cerca de 4 mil espécies diferentes (Torvisk & Ovreas,
2002; Mello & Azevedo, 1998; Pace, 1997). Nesse ambiente complexo, os microrganismos são
responsáveis por transformações importantes nos ciclos biogeoquímicos, como reciclagem da
matéria orgânica, degradação dos xenobióticos, fixação de nitrogênio atmosférico e produção de
gases relacionados ao efeito estufa, entre outros processos conhecidos ou ainda por se descobrir
(Hughes et al., 2001). A microbiota dos solos também está associada à formação e manutenção
da estabilidade de agregados e pode ser fator determinante no controle da diversidade da flora e
fauna que vivem no solo ou acima dele (Dabert et al., 2002; Burlage et al., 1998). Assim, a
diversidade microbiana exerce papel fundamental na manutenção da qualidade dos solos. A vasta
biodiversidade, fenotípica e genotípica, todavia, faz com que o solo seja um dos ecossistemas
mais difíceis de investigar (Ovreas et al., 1998).
Caracterizar a diversidade microbiana presente nos solos torna-se de fundamental
importância pois possibilita: aumentar o conhecimento das fontes de diversidade genética em
uma comunidade; entender os padrões estruturais de distribuição relativa dos microrganismos;
aumentar o conhecimento do papel funcional dessa diversidade em diferentes situações, dentre
elas a presença de contaminantes; entender a regulação da biodiversidade; entender o
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
18
envolvimento da biodiversidade no funcionamento e na sustentabilidade dos ecossistemas
(Ogram, 2000; Ovreas, 2000; Tiedje et al., 1999).
Trabalhos que abordam estudos relacionados à microbiologia de solos são encontrados,
com abundância, nas bases de dados científicas, porém limitações metodológicas restringiam, até
recentemente, o alcance de resultados verdadeiramente representativos (Rondon et al., 2000;
Kennedy & Smith, 1995). Isso é devido ao uso exclusivo de técnicas tradicionais, dependentes do
cultivo prévio dos microrganismos, que selecionava metabolicamente a diversidade a ser
acessada. A partir da década de 80, houve grande avanço nos estudos de ecologia microbiana,
com o advento de técnicas moleculares, baseadas na análise do DNA de microrganismos
retirados diretamente dos ambientes naturais, sem a necessidade de multiplicação prévia das
células (Amann et al., 1995; Benlloch et al., 1995). Com a publicação dos primeiros trabalhos
utilizando metodologias de biologia molecular, pôde-se estimar que o uso das técnicas
dependentes de cultivo proporcionava apenas uma quantificação de no máximo 1% dos
microrganismos existentes no planeta (Torvisk & Ovreas 2002; Torvisk et al., 1990). Diante
desse cenário, Kirk et al. (2004) organizaram de forma didática os métodos atuais mais utilizados
para estudar a estrutura das comunidades microbianas e medir sua diversidade em solos. Assim,
as técnicas são divididas em duas categorias: metodologias baseadas na bioquímica dos
organismos (Quadro 1), geralmente utilizando-se do cultivo prévio dos microrganismos, e
métodos baseados em biologia molecular (Quadro 2).
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
19
Quadro 1 – Vantagens e desvantagens das metodologias baseadas na bioquímica dos microrganismos para estudo da diversidade dos
solos.
Método Vantagens Desvantagens
Contagem em placas
Rápido;
Baixo custo.
Microrganismos não cultiváveis não são detectados;
Favorecimento de indivíduos com taxa rápida de
crescimento;
Favorecimento de fungos com maiores índices de
produção de esporos.
Nivel fisiológico do perfil
das comunidades
(CLPP)
Rápido;
Altamente reproduzível;
Baixo custo;
Detecta diferença entre comunidades
microbianas;
Gera grandes quantidades de dados;
Opções comerciais específicas para fungos e
bactérias ou fontes de carbono específicas
(Biolog).
Representa apenas a porção cultivável da
comunidade;
Favorecimento de organismos com taxa de
crescimento rápida;
Representa apenas a fração da comunidade capaz de
utilizar as fontes de carbono disponíveis;
Mostra a potencial diversidade metabólica, mas não a
diversidade existente in situ;
Sensível a densidade do inóculo.
Análise de ésteres
metílicos de ácidos
graxos
(FAME)
Não necessita do cultivo dos
microrganismos;
Extração direta dos solos;
Detecta comunidades específicas.
Para estudos com esporos de fungos, muito material é
necessário;
Pode ser facilmente influenciado por fatores
externos;
Resultados podem ser confundidos por outros
microrganismos.
FONTE: Adaptado de Kirk et al., 2004
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
20
Quadro 2 – Vantagens e desvantagens de algumas metodologias baseadas em biologia molecular para estudo da diversidade dos
solos.
Método Vantagens Desvantagens
Guanina+Citosina
(G+C)
Não é influenciado pelo enviesamento de PCR;
Inclui todo o DNA extraído;
Quantitativo;
Inclui os membros raros das comunidades.
Requer grandes quantidades de DNA;
Depende da eficiência da lise das células e da
extração;
Baixa resolução.
Re-associação de ácidos
nucléicos e hibridização
Utiliza o DNA total extraído;
Não é influenciado pelo enviesamento de PCR;
Estuda DNA ou RNA;
Pode ser realizado in situ.
Baixa sensibilidade;
Grandes quantidades de cópias das sequências são
requeridas para que ocorra a detecção;
Depende da eficiência da lise das células e da
extração.
Microarranjos de DNA e
hibridização de DNA
Semelhante à hidridização de ácidos nucléicos;
Grandes quantidades de genes podem ser
analisadas simultaneamente;
Se utilizando fragmentos de DNA, a
especificidade é aumentada.
Detecta apenas as espécies mais abundantes;
Custo elevado.
Eletroforese visualizada
em gel com gradiente de
desnaturação (DGGE) e
eletroforese visualizada
em gel com gradiente de
Temperatura (TGGE)
Grandes quantidades de amostras podem ser
analisadas simultaneamente;
Alta reprodutibilidade e rapidez.
Influenciado pelo enviesamento de PCR;
Depende da eficiência da lise das células e da
extração;
Manipulação das amostras pode alterar estrutura das
comunidades (ex.: longos períodos de estocagem);
Uma banda pode representar mais de uma espécie
(co- migração);
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
21
Detecta apenas espécies dominantes.
Polimorfismo de
conformação de fita
simples (SSCP)
Semelhante a DGGE/TGGE;
Ausência de Gradiente.
Influenciado pelo enviesamento de PCR;
Algumas ssDNA podem formar mais de um tipo de
conformação.
Análise de restrição de
rRNA amplificado
(ARDRA) ou
polimorfismo de
comprimento de
fragmentos de restrição
(RFLP)
Detecta mudanças estruturais nas comunidades
microbianas.
Influenciado pelo enviesamento de PCR;
Padrões de bandas geralmente são muito complexos.
Polimorfismo de
comprimento de
fragmentos de restrição
terminais
(T-RFLP)
Padrões de bandas mais simples que RFLP;
Pode ser automatizado;
Análise de um grande número de amostras;
Altamente reprodutível;
Compara diferença entre comunidades
microbianas;
Depende da eficiência da lise das células e da
extração;
Influenciado pelo enviesamento de PCR;
O tipo de Taq pode aumentar a variabilidade;
A escolha dos iniciadores universais e das enzimas
de restrição pode influenciar no fingerprinting das
comunidades.
Análises de espaçadores
intergênicos ribosomais
(RISA)
Altamente reprodutível;
Pode ser automatizado (ARISA).
Requer grandes quantidades de DNA;
Baixa resolução por conta do enviesamento de PCR.
FONTE: Adaptado de Kirk et al., 2004.
Continua Quadro 2
– Vantagens e desvantagens de algumas metodologias baseadas em biologia molecular para
estudo da diversidade dos solos.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
22
Tradicionalmente, os métodos dependentes de cultivo incluem o cultivo de amostras em
meios ricos ou seletivos com contagem direta e isolamento de células viáveis (Roling et al.,
2003). Referidos métodos são rápidos, de baixo custo e podem fornecer informações úteis a
respeito de células heterotróficas ativas, dentro da complexa população do solo (Orphan et al.,
2000). Um problema, porém, é a seleção metabólica feita pelo meio de cultura e condições de
crescimento como luminosidade, temperatura e pH, que acaba por não retratar a real estrutura
das populações microbianas. Diante disso, três grandes pontos devem ser analisados quando se
trata de metodologias dependentes de cultivo: primeiro, o nosso conhecimento microbiológico
limita-se ao número de espécies bacterianas e fúngicas capazes de crescer nos meios de cultura
atuais; segundo, a potencial inibição entre colônias diferentes pode alterar os resultados obtidos,
e, por último, a utilização de métodos dependentes de cultivo tende a favorecer organismos com
taxa de crescimento rápida (Kirk et al., 2004; Roling et al., 2003). Tem-se, como consequência,
uma substimação dos dados reais.
A incorporação das primeiras técnicas moleculares aos estudos de ecologia microbiana
na segunda metade do século XX abriu, para a Ciência, as portas da diversidade microbiológica.
Nos últimos 25 anos, reconhecido número de métodos foram desenvolvidos para o estudo
molecular dessa biodiversidade, como já enumerado na Quadro 2. Atualmente, a biologia
molecular é uma faceta indispensável da pesquisa em Microbiologia (Burlage et al., 1998). Entre
as técnicas moleculares mais citadas podemos enumerar: SSCP (Single Strand Conformation
Polymorphism, polimorfismo de conformação de fita simples) (Tiedje et al., 1999), ARDRA
(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses, análise de restrição de rRNA amplificado (Liu
et al., 1997), T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism, polimorfismo de
comprimento de fragmentos de restrição terminais) (Osborn et al., 2000), RISA (Ribosomal
Intergenic Spacer Analysis, análises de espaçadores intergênicos ribosomais), Bibliotecas
metagenômicas com o sequenciamento dos clones (Lee et al., 2004), Hibridização em
Microarranjos de DNA ( DNA Microarrays) (Cho & Tiedje, 2001), PCR-DGGE e PCR-TGGE
(Polimerase Chain Reaction-Denaturating Gradient Gel Eletrophoresis e Polimerase Chain
Reaction-Temperature Gradient Gel Eletrophoresis, reação em cadeia da polimerase –
eletroforese visualizada em gel com gradiente de desnaturação e reação em cadeia da polimerase
– eletroforese visualizada em gel com gradiente de temperatura) (Roling et al., 2003), RT-PCR
(Real time Polimerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase em tempo real) (Fierer et
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
23
al., 2005) e, mais recentemente, o pirosequenciamento pela técnica 4-5-4 (Edwards et al., 2006).
A informação gerada por essas técnicas é relevante e usualmente tratada por programas de
bioinformática, onde os dados são normalizados e as análises estatísticas e filogenéticas são
feitas (Ovreas, 2000).
Com a evolução da aplicação das técnicas moleculares para os estudos em ecologia
microbiana, passou a existir crescente interesse científico e industrial no desenvolvimento de
tecnologias que viabilizem uma extração de qualidade do DNA de amostras ambientais, haja
vista que esse ponto é fundamental para obtenção de sucesso desse tipo de estudo. A partir do
primeiro trabalho publicado sobre o assunto por Torvisk (1980), inúmeros métodos de extração
de DNA foram aperfeiçoados (Osborn & Smith, 2005). No entanto, para amostras de solo, um
grande problema enfrentado é a co-extração de ácidos húmicos, fração mais estável da matéria
orgânica e comum nesses ambientes. Essas substâncias orgânicas, ao serem extraídas juntamente
com o material genético, atuarão de forma inibitória nas reações da cadeia da polimerase (PCR).
As grandes empresas que desenvolvem materiais de laboratório como a Invitrogen (California,
USA), Promega (Wisconsin, USA), Mobio (California, USA), etc, oferecem, atualmente,
modernos Kits de extração de DNA capazes de contornar a co-extração de ácidos húmicos (Kirk
et al., 2004; Ogram, 2000).
O material genético extraído das amostras ambientais pode ser diretamente aplicado às
técnicas moleculares, caso se tenha a concentração requerida, ou amplificado através da reação
em cadeia da polimerase (PCR) mediante a utilização de iniciadores universais para os genes de
interesse, como por exemplo, o 16S rRNA (Roling et al., 2003; Orphan et al., 2000). A reação
pode amplificar todo o DNA metagenômico (mDNA) pela utilização de iniciadores randômicos
(random primers) (Dennis et al., 2003; He et al., 2005). Quando o objetivo de um estudo é
focado em análises estruturais de comunidades específicas ou inferências às relações
filogenéticas, produtos de PCR, tendo como alvo a região 16S rRNA, são geralmente utilizados
em técnicas como o T-RFLP (Osborn et al., 2000) e o sequenciamento de genes (Santos &
Ochman, 2004). Enquanto isso, grandes quantidades de mDNA são utilizados em experimentos
envolvendo o uso de microarranjos para a análise funcional das comunidades microbianas
(Tiedje et al., 2001).
Para acessar a estrutura de comunidades microbianas, o conteúdo genético de amostras
ambientais, amplificado por PCR, pode ser separado por diferentes métodos, dentre as quais o T-
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
24
RFLP (Marsh et al., 2000; Osborn et al., 2000). Nessa técnica, a porção terminal de um dos
iniciadores, 5’ ou 3’, utilizados na PCR, é marcada com fluorescência, permitindo separação por
tamanho dos fragmentos de restrição terminais (T-RFs) depois que os produtos dessa PCR forem
tratados com endonucleases de restrição e produzindo um perfil característico da comunidade
que é analisado (Thies, 2007; Marsh, 1999). Quando sequências altamente conservadas são
amplificadas, por exemplo, o gene 16S rRNA, os produtos de PCR terão tamanhos similares.
Para separá-los e obter-se um perfil distinto da comunidade microbiana em estudo é que o
produto da PCR é hidrolizado por enzimas de restrição.
DNAs amplificados de diferentes organismos possuidores de diferentes sítios de
restrição vão apresentar fragmentos marcados de diferentes tamanhos (Thies, 2007; Moeseneder
et al., 2000; Marsh, 1999). Como a porção terminal, marcada com a fluorescência, será detectada
pelo sequenciador automático de DNA, cada fragmento detectado representa uma unidade
taxonômica operacional (OTU) (Singh et al., 2006; Osborn et al., 2000). Esse método foi
descrito pela primeira vez, da forma como é utilizada atualmente, por Liu et al. (1997) e
diferentes autores a utilizaram para estudo de diversas comunidades microbianas, dentre as quais
populações de biofilmes (Wuertz et al., 2004), água (Dorigo et al., 2005), solos agrícolas (Tiedje
et al., 1999) e de florestas (Leckie, 2005), cavidade oral humana (Sakamoto et al., 2003), etc. No
trabalho de Marsh (2005), o autor apresenta protocolos detalhados para a execução de análises
com a técnica do T-RFLP. Um esquema geral, adaptado de Gruntzig et al. (2002), é apresentado
a seguir na Figura 2.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
25
FONTE: Adaptado de Gruntzig et al., 2002.
Figura 2 – Esquema geral da técnica do polimorfismo de comprimento de fragmentos de
restrição terminais (T-RFLP). 1- Extração do DNA; 2- PCR com um dos
iniciadores marcado com fluorescência; 3- Digestão com enzimas de restrição;
4- Separação dos fragmentos; 5- Detecção dos fragmentos por laser.
No tocante a estudos relacionados com a detecção funcional em comunidades
microbianas, uma tecnologia de crescente uso e constante amadurecimento é a de microarranjos
de DNA (tradução direta do termo DNA microarrays), também denominados Chips de DNA
(Nuber, 2005). Com quase 13 anos completos, desde a primeira menção dos microarranjos de
DNA em artigo científico publicado por Schena et al. (1995), a idéia de anexar sequências de
DNA a suportes sólidos, como vidro ou filtro de nylon, já havia sido concebida 12 anos antes por
Ed Southern na técnica Southern Blot. O diferencial da organização em arranjo de muitas
sequências com a possibilidade de uma análise paralela de muitos genes simultaneamente
impulsionou a estabilização dos microarranjos de DNA (Baldi & Hatfield, 2002). Os primeiros
estudos desenvolvidos com este método e que impulsionaram seu refinamento concentravam-se
na área médica, especialmente para a diagnose de câncer (Cheung et al., 1999). Em ecologia
microbiana, os microarranjos de DNA sustentam a promessa de detectar diferentes genes
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
26
envolvidos em ciclos biogeoquímicos, biodegradação e patogenicidade, de forma bastante
precisa (Dubey et al., 2006; Cho & Tiedje, 2001).
A técnica baseia-se no importante conceito bioquímico da hibridização específica: o
fato de que sequências complementares de nucleotídeos ligam-se de modo estável, ao passo
que as não complementares não o fazem (Lehninger, 2000). Assim, em termos gerais,
podemos dividir a técnica em cinco etapas. Primeiramente, os microarranjos de DNA são
preparados. Para experimentos acadêmicos utiliza-se a tecnologia desenvolvida por Patrick
Brown da Universidade de Stanford: um robô imprime, ordenadamente, em uma lâmina milhares
de fragmentos de DNA correspondente à sequência de genes, onde cada ponto (spot)
corresponde a uma sequência de DNA única (Baldi & Hatfield, 2002). Segundo, o material
genético a ser estudado é marcado com fluorescência (direta ou indireta) através de transcrição
reversa, em presença de nucleotídeos marcados com substâncias fluorescentes. Terceiro, o
microarranjo de DNA e a amostra marcada são hibridizados, sob condições específicas, e,
posteriormente, os suportes sólidos são lavados de forma especial para que apenas as sequências
marcadas que hibridizaram permaneçam no chip. Em cada lâmina de DNA, uma ou duas
amostras podem ser testadas (hibridizadas), desde que, cada amostra tenha sido marcada com
uma fluorescência diferente. Quarto, os microarranjos de DNA, hibridizados e lavados, são
escaneados para a geração de uma imagem. Por último, análises computacionais são então
minuciosamente executadas. Cada lâmina ou chip de DNA pode conter milhares de genes,
possibilitando, assim uma análise simultânea em larga escala (Ehrenreich, 2006; Zhou, 2003;
Duggan et al., 1999). Dependendo do tipo de investigação que se planeje fazer, a amostra a ser
testada, mRNA, DNA genômico ou produtos de PCR, bem como a escolha do tipo de chip de
DNA que será utilizado, é de extrema importância (Avarre et al., 2007).
Em microbiologia, os microarranjos de DNA foram primariamente desenvolvidos e
utilizados para perfis da expressão genética de culturas puras de organismos individuais, mas
alguns avançoes foram recentemente obtidos na sua aplicação para amostras ambientais (Gentry
et al., 2006). No caso da análise funcional de comunidades microbianas, recentemente, Zhou
(2003) desenvolveu protótipos de microarranjos de DNA para serem utilizados na detecção de
genes funcionais para amostras ambientais, contendo genes que codificam para diversas enzimas
envolvidas nos ciclos biogeoquímicos. Investigações metodológicas e otimização das técnicas
são necessárias antes dos microarranjos de DNA serem usados como ferramentas rápidas simples
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
27
e eficientes, para a avaliação das comunidades microbianas (Dubey et al., 2006). Um esquema
geral da experimentação com microarranjos de DNA está representado na Figura 3.
FONTE: Adaptado de Duggan et al., 1999.
Figura 3 – Esquema geral da técnica de microarranjos de DNA (DNA microarrays). 1-
Fabricação dos microarranjos de DNA; 2- Síntese para a marcação das amostras
com fluorescência; 3- Hibridização da amostras com as sequências imobilizadas
nos microarranjos; 4- Geração dos dados pelo escaneamento das lâminas
hibridizadas; 5- Análise da imagem obtida para posterior tratamento dos dados.
Desde a publicação do trabalho de Watson e Crick (1953) revelando a estrutura do ácido
desoxirribonucléico, muito se avançou sobre o conhecimento genético dos organismos vivos.
Com o desenvolvimento de técnicas capazes de extrair esse mesmo ácido desoxirribonucléico
diretamente das amostras ambientais, a microbiologia pode adentrar dimensões antes intocáveis
da biodiversidade microbiana. Atualmente, muitas são as possibilidades metodológicas
desenvolvidas ou em desenvolvimento para que se acesse o mundo microbiano de forma mais
acurada. Ainda assim, mesmo com tantas técnicas disponíveis, é difícil estudar a verdadeira
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
28
diversidade microbiana. Além de não sabermos a precisão efetiva dos métodos empregados, cada
técnica apresenta vantagens e desvantagens, como mostrado na Quadro 2. A escolha do melhor
método a ser aplicado em cada estudo deve ser feita de acordo com a hipótese levantada e a
disponibilidade das amostras e dos recursos laboratoriais (Kirk et al., 2004). Seja qual for o
método empregado para se estudar os microrganismos, o fundamental, hoje, é que dados sejam
gerados para que possamos melhor compreender esses organismos e os processos naturais nos
quais eles estão envolvidos.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
29
3 – OBJETIVOS
3.1. Gerais
Este trabalho teve por objetivo avaliar a microbiota de amostras de solos de áreas do
manguezal da baía de Todos os Santos (BA), através do uso de métodos moleculares. Com isso,
o presente estudo almeja gerar os primeiros dados moleculares sobre as comunidades
microbianas da região. Assim, os resultados obtidos no presente estudo poderão tanto servir de
alicerce para futuras ações de monitoramento dessa área considerada bastante sensível, como
embasar o conhecimento básico requerido para implementações de ações de biorremediação
nesse local severamente afetado pela presença de hidrocarbonetos.
3.2. Específicos
• Aplicar as técnicas de PCR e T-RFLP, para verificar a estrutura das comunidades
bacterianas de amostras de solo da baía de Todos os Santos, avaliando-as;
• Verificar o perfil funcional das comunidades microbianas de amostras de solo da baía
de Todos os Santos, pelo uso da técnica de microarranjos de DNA e compará-los
entre si;
• Analisar a diversidade genética das comunidades microbianas das amostras de solo da
baía de Todos os Santos a partir dos dados biológicos gerados utilizando índices de
diversidade.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
30
4 – MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Sítios de Amostragem, Coleta e Variáveis Físico-químicas
A área estudada neste trabalho localiza-se na porção norte da baía de Todos os Santos,
entre os pontos 12º42' - 12º45' S e 38º29' - 38º33' W, como mostrado na Figura 4. Trata-se de
uma região recoberta por manguezal, com substrato úmido, rico em minerais argilosos e matéria
orgânica. Como discorrido no tópico 2.3 dessa dissertação, grande parte da região tem sido
afetada pela indústria do petróleo ao longo de mais de 50 anos de atividades. Assim, visando
uma possível comparação de dados, a amostragem foi realizada em dois sítios: o primeiro,
localizado no município São Francisco do Conde, próximo à Refinaria Landulpho Alves –
Mataripe (RLAM), onde há uma impactação petrolífera crônica, e o outro sítio localizado na
praia do Caboto, município de Candeias, uma porção mais afastada do manguezal, e considerada
isenta ou pouco afetada pela atividade petrolífera. Para facilitar a identificação dos sítios
estudados durante os tópicos seguintes deste trabalho, chamaremos de sítio 1 (S1) o sítio de
coleta localizado dentro da região do complexo petrolífero, mais especificamente na região de
refino, e de sítio 2 (S2) o sítio de amostragem localizado fora do complexo petrolífero e, dessa
forma, considerado como não ou pouco contaminada por petróleo.
A coleta ocorreu em setembro de 2006, durante maré baixa, de acordo com o seguinte
procedimento para cada sítio de amostragem: foi realizada uma coleta em um ponto central e
quatro coletas numa distância de 4 a 5 metros em relação ao ponto central, formando um
quadrado. Coletou-se aproximadamente 200 g de solo da camada de 10 a 15 cm de cada ponto.
Para tanto, fêz-se uso de coletor de aço inoxidável e pás estéreis. A localização dos sítios e os
respectivos valores de temperatura, pH e salinidade foram medidos in situ utilizando-se GPS e
sonda portátil.
Os solos coletados foram armazenados em vasilhames plásticos estéreis e mantidos em
caixas térmicas, com gelo, sendo levados imediatamente ao laboratório para estocagem a -20 C.
Essa condição de congelamento foi mantida durante todo o transporte até o Centro de Ecologia
Microbiana da Universidade Estadual de Michigan (USA), onde todos os experimentos descritos
neste estudo foram realizados. Para a execução das estapas que seguem, as 5 amostras coletadas
em cada sítio de amostragem foram reunidas e homogeneizadas, gerando uma amostra composta
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
31
única para cada um dos dois sítios a serem estudados, como proposto na metodologia de Pereira
(2003).
Além dos valores de temperatura, pH e salinidade da água de percolação dos solos
medidos em campo, foi feita, em laboratório, a quantificação da matéria orgânica das amostras
coletadas na região norte da baía de Todos os Santos. Para tanto seguiu-se o método da perda de
peso por ignição descrita em Schulte e Hopkins (1996). Essa estapa foi realizada por técnicos do
laboratório de Solos e Nutrientes de Plantas do Departamento de Ciências Agrícolas da
Universidade Estadual de Michigan.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
32
(A) (B)
Figura 4 – Mapa da baía de Todos os Santos (A) com localização dos sítios de amostragem (B). 1) Sítio localizado dentro da região
do complexo petrolífero e 2) Sítio localizado fora do complexo petrolífero, considerado como não ou pouco contaminado
por petróleo.
Fonte: Adaptado de Veiga, 2003
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
33
4.2. Extração de DNA Total do Solo
A
extração do DNA total das duas amostras compostas de solos foi realizada utilizando-
se o kit comercial
PowerSoil
TM
DNA Isolation kit Sample
(MoBio, Catálogo n
12888-50),
seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante. A escolha pela utilização deste kit
específico deveu-se à sua comprovada eficiência na remoção de ácidos húmicos, geralmente um
problema para estudos com solos. Em linhas gerais, amostras de aproximadamente 0,5 g de solo
foram adicionadas a microtubos contendo beads em solução e homogeinizados. A líse celular
ocorreu por mecanismos físicos e químicos. Nas etapas que seguiram, o DNA genômico total de
cada amostra foi capturado por uma membrana de sílica contida em uma coluna do tipo spin. O
DNA foi lavado e, então, eluído da membrana utilizando-se 100 µL de água estéril ausente de
DNAse. A quantificação do DNA extraído foi feita através de um espectrofotômetro tipo
Nanodrop (NanoDrop Technologies, USA). No final, as amostras foram mantidas a -20 C.
4.3. T-RFLP
A metodologia seguida nesse trabalho é descrita por Marsh (2005) e todas as etapas executadas
serão detalhadas a seguir. Um esquema do protocolo experimental pode ser
visualizado na Figura 5 (ver também Figura 2, tópico 2.4).
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
34
Figura 5 – Protocolo experimental da técnica do polimorfismo de comprimento de fragmentos
de restrição terminais (T-RFLP).
4.3.1. PCR
Para a amplificação de fragmentos específicos do rRNA 16S de
Bactéria das
amostras, utilizou-se o seguinte conjunto de iniciadores: 63F
(5'-CAGGCCTAACACATGC
AAGTC-
3') marcado com 6-FAM (6-carboxifluoresceína) (63F-FAM) e 1389R (5'-ACGGG
CGGTGTGTACAAG-3') (Marsh, 2005; Osborn et al., 2000
).
A amplificação foi feita em solução contendo: 5,0 µL de tampão para
PCR 10 X;
2,0
µL
de MgCl
2
50mM; 1,0
µL
de dNTPs 10mM; 2
µL
de cada iniciador numa
concentração de 10 µM cada; 2U de Taq DNA polimerase
recombinante (Invitrogen, USA,
Catálogo n 18038-018); 20 ng de DNA genômico; água estéril ausente de DNAse para um
volume final de 50
µL
. Em um termociclador, as reações de amplificação foram realizadas nas
seguintes condições: 94 ºC por 3 min; 25 ciclos de 94 ºC por 1 min, 55 ºC por 1 min e 72 ºC por 2
min;
72
ºC
por 10 min.
Essas
condições ótimas de PCR haviam sido definidas em um estudo
realizado por Melo et al. (dados não publicados) utilizando mesmas amostras e foram
confirmadas neste trabalho, através de PCRs piloto. Em todas as PCRs, controles positivos e
negativos foram utilizados.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
35
Os produtos de PCR gerados foram visualisados através de eletroforese em gel de
agarose 1%, marcado com
SYBR® Safe DNA em 0,5X TBE (Invitrogen, Catálogo n S33100),
utilizando-se um fotodocumentador
.
Como padrão de tamanho de
DNA, foi utilizado um
marcador de massa molecular de DNA de 1 Kb (Invitrogen, Catálogo n 15615-016). Para a região
amplificada, o tamanho de fragmentos de DNA esperados para as amostras era em torno de 1,3 Kb.
4.3.2. Purificação do DNA
O DNA total dos sítios 1 e 2 amplificados para
fragmentos específicos do rRNA 16S de
bactérias,
gerados sob as condições acima descritas, foram purificados utilizando-se o kit
comercial QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, USA, Catálogo n 28104) seguindo-se as
recomendações do fabricante. Seguinte à purificação, as amostras foram quantificadas em
espectrofotômetro tipo Nanodrop.
4.3.3. Digestão Enzimática
Para digestão do material amplificado e purificado duas enzimas de restrição foram
selecionadas: HhaI (5'-G^C G C-3') e MspI (5'-C^C G G-3') (New England Labs, USA, Catálogo
R0139L e n R0106L respectivamente).
Reações de 15
µL foram executadas de acordo com a recomendação dos fabricantes,
utilizando-se os seguintes reagentes e concentrações:
Reação HhaI MspI
DNA 200 ng x µL x µL
Tampão 10X 1,5 µL 1,5 µL
Albumina Bovina Sérica (BSA) 10X 1,5 µL -
Enzima 10U 0,5 µL 0,5 µL
Água qsp 11,5 - x µL 13 - x µL
Total 15 µL 15 µL
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
36
As reações de digestão com as endonucleases de restrição HhaI e MspI foram
executadas em termociclador a 37 C, por 3 h, e paradas elevando a temperatura para 65C
por 20 min, seguindo-se resfriamento em gelo.
4.3.4. Geração dos padrões de T-RFLP
Os padrões de T-RFLP para as amostras de DNA amplificadas, marcadas com
fluorescência e digeridas com as enzimas de restrição HhaI e MspI, foram gerados no
Laboratório de Suporte Tecnológico para Pesquisas do Departamento de Biologia de Plantas da
Universidade Estadual de Michigan. Para tanto, utilizou-se a tecnologia da eletroforese de
capilaridade do sequenciador automatizado ABI 3100 Prism Genetic Analyser (Applied
Biosystems, USA). O programa GeneScan Analysis (Applied Biosystems), funcionando
juntamente com o sequenciador, viabilizou a medição do tamanho de fragmentos desconhecidos,
detectados nas amostras, por comparação da mobilidade eletroforética desses fragmentos com
um padrão interno. A análise de cada amostra foi realizada usando-se 2 µL de solução de DNA
digerido e 8 µL de uma solução contendo o padrão interno MapMaker
TM
1000 (Bioventures Inc.,
USA) marcado com ROX (6-carboxi-X-rodamina) e o tampão de corrida (formamida
deionizada). O tempo de injeção foi de 30 seg com um sinal mínimo detectável de 5 unidades de
fluorescência.
4.3.5. Análises dos Dados
Os resultados gerados pela eletroforese de capilaridade foram visualizados com o
programa GeneScan e exportados como arquivos texto, contendo informações relacionadas aos
fragmentos encontrados (marcador, altura do pico, área do pico e dados referentes a corrida da
eletroforese). Esses arquivos foram analisados com ferramentas do IBEST
(http://www.ibest.uidaho.edu/tools/index.php) usando-se um cutoff de 5 unidades de
fluorescência e filtrados no programa R (http://www.r-project.org) pelo algoritmo Gfiltering com
um desvio padrão de 3. Dois fragmentos, com diferença de até 1 par de base entre si, foram
considerados como fragmentos de mesmo tamanho. Os arquivos foram exportados do IBEST
para o T-align (http://inismor.ucd.ie/~talign) e as matrizes geradas foram, então, analisadas.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
37
Além disso, fêz-se um confrontamento das matrizes geradas com as bases de dados existentes
através do Microbial communities Analysis III, MICA (http://mica.ibest.uidaho.edu/trflp.php).
4.4. Microarranjos de DNA
Os ensaios relacionados com a detecção de genes funcionais das amostras em estudo
foram feitos pelo uso de microarranjos de DNA. Um esquema geral das etapas seguidas neste
trabalho é apresentado na Figura 6 (ver também Figura 3, tópico 2.4). Protocolos experimentais
como os executados no presente estudo, e detalhados a seguir, são descritos por He et al. (2005),
Denef et al. (2003) e Wu et al. (2001).
Figura 6 - Protocolo experimental da técnica de microarranjos de DNA.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
38
4.4.1. Preparação das Lâminas de Microarranjos de DNA
As lâminas de microarranjos de DNA utilizadas no presente estudo foram
disponibilizadas pela equipe do Dr. Zihoung Zhou, através de uma parceria entre o Instituto de
Genômica Ambiental da Universidade de Oklahoma (USA), dirigido pelo mesmo, e o grupo
liderado pelo Dr. James Tiedje no Centro de Ecologia Microbiana da Universidade Estadual de
Michigan. Esses microarranjos de DNA foram descritos por He et al. (2005) e tratam-se de
lâminas desenvolvidas para serem usadas em amostras ambientais diversas para a investigação
de genes envolvidos em processos biogeoquímicos-chaves mediados por microrganismos, incluindo
etapas dos ciclos de carbono, nitrogênio e enxofre, utilização de fósforo, degradação de compostos
orgânicos, resistência e redução de metais. Um sumário do total de spots em cada categoria de
genes utilizadas na fabricação das lâminas é mostrado na Tabela 2. Cada lâmina continha um
pouco mais de 8.000 genes impressos em até três réplicas, totalizando um valor final de 24.098
spots a serem testados, juntamente com 960 spots de sequências de genes eucarióticos (seis de
humanos e quatro de plantas) e 192 spots com sequências altamente conservadas de 16S rRNA
que serviram de controles negativos e positivos, respectivamente. Para cada amostra testada, três
lâminas foram utilizadas.
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
39
Tabela 2 – Sumário dos grupos das sequências genéticas contidos nas lâminas de microarranjos
de DNA utilizadas nesse trabalho.
Categoria de Genes Sigla Total
de spots
Degradação de Carbono CDEG 2808
Fixação de Carbono CFIX 1018
Redução de Sulfato DSR 1615
Redução de/Resistência a Metais MET 4546
Metano (outros) Metano 29
Geração de Metano Metano_gen 440
Oxidação de Metano Metano_ox 304
Fixação de Nitrogênio NFIX 1225
Nitrificação NIT 1764
Redução de Nitrogênio NRED 2321
Remediação Orgânica ORG 8007
Remediação de Perclorato PER 21
Total 24098
4.4.2. Amplificação com Inicadores Randômicos
O DNA total das amostras de solo em estudo, extraídos pelo kit comercial da Mobio
como descrito acima, foram amplificados utilizando-se o kit comercial Templiphi Amplification
Kit (GE Healthcare, USA, Catálogo n25-6400-10), modificando-se o protocolo como descrito a
seguir. Alíquotas de 10 ul do tampão de amostra fornecido pelo kit foram transferidas para tubos
de PCR onde 1ul de cada amostra de DNA foi então adicionado. A concentração das amostras de
DNA puderam variar de 1 a 100 ng/ul. Após agitação em vortex os tubos foram deixados em
descanso na temperatura ambiente por 10 minutos. Em paralelo uma mistura contendo 10 ul do
tampão de reação fornecido pelo kit e 1 ul da solução que continha a enzima foi preparada para
cada amostra a ser amplificada. Os 11 ul da mistura de reação preparados foram então
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
40
adicionado em cada amostra e a reação ocorreu durante 4 h a 30 ºC, sendo interrompida com o
aumento da temperatura para 65 ºC por 10 minutos. A amplificação exponencial do DNA através
desse kit ocorreu utilizando-se a DNA polimerase phi29 e iniciadores randômicos, o que garantiu
a amplificação de múltiplos sítios do DNA de interesse. O funcionamento desse sistema é
ilustrado na Figura 7. Iniciadores randômicos anelam em múltiplos sítios. A DNA polimerase
phi29 estende cada um desses iniciadores. Quando a DNA polimerase alcança a extremidade
final de um iniciador estendido, ocorre um deslocamento da síntese da fita. Essa porção não
sintetizada fica disponível para que outro iniciador possa alinhar. O processo continua resultando
em uma amplificação exponencial e isotérmica. Após a amplificação, o DNA é fragmentado
utilizando-se um sonicador para que se obtenham tamanhos de DNA entre 0,5 e 5 kb. A
eficiência dessa etapa é confirmada através da visualização de um rastro ao longo da corrida da
amostra em
eletroforese em gel de agarose 1%.
Figura 7 – Esquema de funcionamento do kit comercial Templiphi Amplification Kit.
4.4.3. Marcação das Amostras
A marcação das amostras amplificadas de DNA foi feita através da síntese de fitas
complementares, via iniciadores randômicos pela ação do fragmento Klenow da DNA
polimerase, tendo um dos tipos de desoxirribonucleotídeos fosfatados (dNTPs) marcados com
fluorocromo cianina 5 (Cy5-dUTP), como descrito por HE et al. (2005). Para tanto, utilizou-se o
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
41
kit comercial Bioprime® Array CGH Genomic Labeling System (Invitrogen, Catálogo n 18095-
011), dNTPs individuais (Invitrogen, Catálogo n 10297018) e o nucleotídeo marcado CyDye
labeled nucleotides – Cy5-dUTP (Amersham, USA, Catálogo n PA55022).
Uma alíquota de 35 µL de uma mistura I, contendo 500 ng de DNA genômico e 20 µL
de iniciadores randômicos (3 mg/mL) foi aquecida a 98°C por 5 min, rapidamente resfriada em
gelo e então centrifugada. Uma quantia de 15 µL de uma mistura II, contendo 2,5 µL de uma
solução composta por 5 mM dATP, 5 mM dGTP, 5 mM dCTP, e 2,5 mM dTTP; 2 µL do
fragmento Klenow (40 U/ µL) e 1 µL do marcador fluorescente Cy5-dUTP (25 nM) foi
adicionada a mistura I. O volume total de 50 µL de solução foi, então, incubado por 3 h a 37 °C.
Essa reação foi parada aquecendo-se a solução 95 °C por 3 min, seguindo-se o resfriamento em
gelo.
O DNA marcado foi purificado utilizando-se o kit comercial QIAquick PCR
Purification Kit, seguindo-se as recomendações do fabricante. Após essa etapa, a incorporação
do marcador ao DNA foi verificada pela leitura de 1 µL de cada amostra em espectrofotômetro
tipo Nanodrop, onde dados refentes a absorbância do marcador (A
650
) e do DNA (A
260
) foram
coletados para o cálculo da média de nucleotídeo marcado (Cy5-dUTP) / total de DNA
sintetizado. Uma média considerada boa deve ficar entre um intervalo de 1/50 a 1/100. As
amostras marcadas são secadas em um evaporador centrífugo, tipo Speed-Vac® (GMI, USA), e
mantidas a -20 C até o momento da hibridização.
4.4.4. Hibridização
Uma importante etapa do processo experimental é a hibridização das lâminas de
microarranjos de DNA com as amostras. Além das condições ideais para essa reação, a
preparação das lâminas e das amostras, individualmente, são passos fundamentais.
Antes de proceder a hibridização com as amostras a serem testadas, as lâminas de
microarranjos de DNA foram submetidas a uma imersão de 1h a 50 C, em uma solução de pré-
hibridização composta por formamida 50%, 5X solução citrato salina padrão (SSC), 0.1% Sódio
dodecil sulfato (SDS) e BSA 0,1 mg/ml, seguida de lavagem seriada com água Milli-Q (3 vezes)
e 1 lavagem com isopropanol, quando as lâminas foram secadas por centrifugação, a 1600 rpm
por 3 min (Denef et al., 2003). As lâminas e lamínulas utilizadas foram montadas nas devidas
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
42
câmaras de hibridização (Telechem, USA) e mantidas a 60 C, até o momento da montagem do
experimento.
Para a hibridização, as amostras marcadas e conservadas secas a -20 C foram
primeiramente ressuspensas em 38,4 µL de uma solução de hibridização, contendo 20 µL de
formamida; 10 µL de 20X SSC; 0,4 µL de SDS 10%; 0,4 µL de DNA de esperma de salmão (10
µg/ µL) (Invitrogen, Catálogo n 15634-017); 0,33 µL de Ditiotreitol (DTT) e 7,27 µL de água
livre de DNAse. Essa solução contendo o DNA ressuspenso foi incubada a 98 C por 3min e
mantida a 65 C, quando se adicionou 1,6 µL de recA. Uma solução final de 40 µL para cada
uma das amostras foi mantida nessa temperatura até a aplicação na lâmina.
Para a montagem do experimento, pipetou-se 15 µL de 5X SSC em cada lado de cada
câmara de hibridização utilizada, contendo uma lâmina de microarranjo de DNA previamente
montado com uma lâminula. Os 40 µL da solução final de cada amostra foi injetada entre a
lâmina e a lamínula e preencheu todo o espaço através da ação da capilaridade. As câmaras
foram então seladas, cobertas com papel alumínio e submetidas a hibridização por 12 h a 45 C,
como sugerido por Wu et al. (2001). Cada amostra foi testada em triplicata, ou seja, 6 lâminas
foram preparadas nesse estudo.
4.4.5. Lavagem das Lâminas
Após o período de hibridização, os microarranjos de DNA foram lavados de forma
serial utilizando-se de três tampões distintos:
Tampão de lavagem I Tampão de lavagem II Tampão de lavagem III
20X SSC 50 mL 5 mL 5 mL
SDS 20% 5 mL 5 mL -
água Milli-Q 945 mL 990 mL 995 mL
Cada lâmina hibridizada foi lavada individualmente em tubos do tipo Falcon™ (BD
Biosciences, USA, Catálogo n352070 ) contendo aproximadamente 50 mL de cada tampão de
lavagem. O tampão de lavagem I foi mantido a 50 C e cada lâmina foi lavada 3 vezes neste
tampão (cada imersão durou 5 min). O tampão de lavagem II foi utilizado em temperatura
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
43
ambiente de 25 C, duas vezes por 10 min cada imersão, e o tampão de lavagem III, utilizado
cinco vezes na mesma temperatura ambiente por 1 min de imersão cada. Após o processo de
lavagem, as lâminas foram secadas por centrifugação a 1600 rpm por 3min.
4.4.6. Escaneamento, Geração e Tratamento da Imagem
As lâminas secadas por centrifugação foram imediatamente escaneadas para a geração
da imagem da hibridização dos spots de DNA utilizando-se o aparelho GenePix 4000 laser
scanner (Axon Instruments, USA) com um tubo fotomultiplicador (PMT) numa voltagem ótima
de 600 V para Cy5 (laser de 635 nm). Primeiramente, uma imagem rascunho de baixa resolução
foi gerada para verificar a qualidade da lâmina e definir as condições ótimas para a geração da
imagem definitiva. Em geral, utilizou-se um poder de laser entre 95 a 100% e 70 a 90% da
eficiência do PMT. As imagens foram salvas em formato *.TIFF e analisadas no programa
Genepix 5.0 (Molecular Devices, USA).
Para o tratamento da imagem, utilizando o programa Genepix 5.0, uma grade de círculos
individuais, definindo a localização de cada spot de DNA, foi sobreposta à imagem obtida para
modelar a qualidade individual da hibridização. Spots mal formados, ou de intensidade baixa, ou
excessivamente fortes, foram descartados. Um índice relacionando a média da intesidade de
pixels dos spots e do background foi calculado (SNR). Dessa forma, os ruídos de fundo
(background) e a intensidade dos spots dos controles negativos foram subtraídos dos sinais de
hibridização. Ao final do tratamento da imagem, apenas os spots que apresentaram pelo menos
85% de sua área total com um SNR superior a 3,0 foram considerados válidos. Para cada lâmina
analisada, o programa de imagens gerou um arquivo do Excel (Microsoft, USA), que foi
exportado e analisado posteriormente.
4.4.7. Análises dos dados
Para comparar os resultados obtidos nas diferentes réplicas e entre as distintas amostras,
o sinal de cada spot de DNA foi normalizado e a significância e o erro padrão dos sinais
absolutos foram calculados. Uma matriz contendo a identidade e descrição de cada sequência de
gene hibridizada, a quantidade total e hibridizada dos spots, os dados normalizados, a
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
44
significância e o erro padrão foi obtida e os resultados analisados entre si. As análises descritas
acima e a construção do diagrama de Venn foram realizadas utilizando-se a plataforma
desenvolvida pelo Instituto de Genômica Ambiental da Universidade de Oklahoma
(http://ieg.ou.edu/) através de algoritmos do programa R.
4.5. Análise da Diversidade Genética
Utilizando-se as matrizes geradas com os resultados dos experimentos de T-RFLP e de
microarranjos de DNA, os índices de riqueza de Margalef, dominância de Simpson,
equitabilidade de Pielou e a diversidade de Shannon-Weaver foram calculados utilizando-se o
programa estatístico Primer 6.0 (PRIMER-E Ltd, Reino Unido).
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
45
5 – RESULTADOS
DADOS PROTEGIDOS PARA PUBLICAÇÃO
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
46
6 – DISCUSSÃO
DADOS PROTEGIDOS PARA PUBLICAÇÃO
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
47
7 – CONCLUSÃO
DADOS PROTEGIDOS PARA PUBLICAÇÃO
Paes, F. A. Análise de Comunidades Microbianas
48
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