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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE CLÍNICA MÉDICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA
SETOR DE CIÊNCIAS PNEUMOLÓGICAS
TESE DE DOUTORADO
Avaliação da acurácia e da reprodutibilidade da técnica MODS para
detecção de resistência de Mycobacterium tuberculosis a rifampicina e
isoniazida e sua inter-relação com os aspectos clínicos dos pacientes
incluindo a análise da discordância e outros métodos de biologia
molecular.
Avaliação da acurácia e da reprodutibilidade da técnica MODS para
detecção de resistência de Mycobacterium tuberculosis a rifampicina e
isoniazida e sua inter-relação com os aspectos clínicos dos pacientes
incluindo a análise da discordância e outros métodos de biologia
molecular.
Mônica Kramer de Noronha Andrade Mônica Kramer de Noronha Andrade
Orientadores: Orientadores:
Prof. Dr. Afrânio Lineu Kritski. Prof essor Associado do Departamento d e
Clínica Médica da Faculdade de Medici na da Universidade Federal do Rio
de Janeiro.
Prof. Dr. Afrânio Lineu Kritski. Prof essor Associado do Departamento d e
Clínica Médica da Faculdade de Medici na da Universidade Federal do Rio
de Janeiro.
Dr
a
Martha Maria de Oliveira. Pesquisa dora da Unidade de Pesquisa em
Tuberculose da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Dr
a
Martha Maria de Oliveira. Pesquisa dora da Unidade de Pesquisa em
Tuberculose da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Rio de Janeiro Rio de Janeiro
abril 2009 abril 2009
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Avaliação da acurácia e da reprodutibilidade da técnica MODS para detecção de
resistência do Mycobacterium tuberculosis a rifampicina e isoniazida e sua inter-
relação com os aspectos clínicos dos pacientes incluindo a análise da
discordância e outros métodos de biologia molecular.
Mônica Kramer de Noronha Andrade
Orientadores:
Prof. Dr Afrânio Lineu Kritski
Dra. Martha Maria de Oliveira
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Clínica Médica da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, como
requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Clínica Médica.
Banca Examinadora
Prof. Dr. Antônio Ruffino
Netto. Professor Titular de Medicina Social
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
Prof. Dr.Leila de Souza Fonseca .
Professor Titular da Universidade Federal do Rio de Janeiro
.
Prof. Maria Lucia Rossett. Profa Adjunto da Universidade Luterana do Brasil -Rio
Grande do Sul.
_________________________________________________
Prof Luiz Cláudio Lazarini –Prof. Adjunto Clinica Medica - Pneumologia - Universidade
Federal do Rio de Janeiro
ii
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_______________________________________________________
Prof Antonio Carlos Moreira Lemos Prof Associado da Universidade Federal da Bahia
iii
Andrade, Mônica Kramer de Noronha
Avaliação da acurácia e da reprodutibilidade da técnica MODS
para detecção de resistência de Mycobacterium tuberculosis a
rifampicina e isoniazida e sua inter-relação com os aspectos
clínicos dos pacientes incluindo a análise da discordância e outros
métodos de biologia / Mônica Kramer de Noronha Andrade. -- Rio
de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2009.
200 f: il.
; 31 cm.
Orientadores: Afrânio Lineu Kritski e Martha Maria de Oliveira
Tese (do
utorado) – UFRJ / Faculdade de Medicina / Clínica
Médica, 2009.
Referências bib
liográficas: f. 157-199
1. Tuberculose Resistente a múltiplos medicamentos. 2.
Mycobacterium tuberculosis. 3. Isoniazida. 4. Rifampina. 5.
Ciências Pneumológicas - Tese. I. Kritski, Afrânio. Lineu II.
Oliveira, Martha de III. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Faculdade de Medicina, Clínica Médica. IV. Título.
iv
A meu pai.
v
AGRADECIMENTOS
A todos aqueles que participaram direta ou indiretamente para a realização
deste trabalho.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.MODS 84
Figura 2. Localização dos primers RIF1 e RIF2, na seqüencia do gene
rpoB, de M.tuberculosis.
86
Lista de Fluxogramas.
Fluxograma 1. Pacientes elegíveis e incluídos no estudo. 90
Fluxograma 2. Análise comparativa MODS e Método das Proporções 95
Fluxograma 3. Distribuição dos pacientes segundo resultados dos testes 96
Fluxograma 4. Pacientes elegíveis e incluídos para avaliação molecular
para detecção de resistência a INH e a RMP.
115
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características demográficas e fatores associados entre
pacientes elegíveis; pacientes incluídos e excluídos no estudo
91
Tabela 2. Perfil de resistência aos fármacos anti-TB em pacientes
incluídos no estudo de acordo com a história de tratamento prévio e o
método utilizado, segundo os resultados concordantes inter-amostras
em cada método separadamente
98
Tabela 3. Método das proporções e MODS. Perfil de Sensibilidade
encontrado nas amostras respiratórias coletadas provenientes de 142
pacientes segundo história clínica de TB.
100
Tabela 4. Características demográficas e fatores associados em 124
pacientes com resultados do teste sorológico para HIV incluídos no
estudo.
102
Tabela 5 – Perfil de resistência aos fármacos anti-TB em pacientes
incluídos no estudo com resultado anti-HIV, de acordo com a história
de tratamento prévio e o método utilizado, segundo os resultados
concordantes inter-amostras analisadas em cada método
separadamente
104
Tabela 6. Método das Proporções: Perfil de Sensibilidade encontrado
nas amostras respiratórias coletadas provenientes de 124 pacientes
com resultado do teste sorológico para HIV segundo história clínica de
TB.
106
Tabela 7. Método MODS: Padrão de sensibilidade encontrado nas
amostras respiratórias coletadas provenientes de 124 pacientes com
resultado do teste sorológico para HIV segundo história clínica de TB.
107
Tabela 8 – Distribuição dos 93 pacientes quanto ao risco de
resistência e o desfecho clínico dos casos, segundo o padrão de
sensibilidade por ambos os métodos
109
Tabela 9. Diagnóstico de TBMR entre pacientes com amostras
concordantes de acordo com o risco de TB resistente
110
T
abela 10. Características demográficas e fatores associados aos 112
viii
g
rupos de pacientes com resultados concordantes e com resultados
d
iscordantes.
Tabela 11. Análise da acurácia dos testes MODS e Método de
Proporções para detecção de resistência a INH e RMP em 318
amostras respiratórias.
113
Tabela 12. Freqüência de mutações encontradas em katG; inhA (R e
org) e ahpC.
116
Tabela 13. Sequenciamento para detecção de mutações nos genes
katG, inhA (or) e ® e ahpC x MODS e Método de proporções para
detecção de resistência a isoniazida (INH).
117
Tabela 14. Lócus e freqüência absoluta das mutações encontradas em
25 cepas no gene rpoB.
118
Tabela 15. Sequenciamento para detecção de mutações no gene
RpoB x MODS e Método de proporções para detecção de resistência
rifampicina (RMP).
119
Tabela 16. Avaliação da acurácia do teste MODS e do Método das
Proporções para detecção de resistência a INH x seqüenciamento das
amostras segundo desfecho clínico dos pacientes.
120
Tabela 17. Avaliação da acurácia do teste MODS e do Método das
Proporções para detecção de resistência a RMP x seqüenciamento
das amostras segundo desfecho clínico dos pacientes
122
Tabela 18. Avaliação da acurácia do MODS e Método das Proporções
x Sequenciamento para detecção de resistência a INH e a RMP,
segundo desfecho clínico: valores comparativos, global e por amostra
respiratória/paciente no grupo com resultados discordantes.
124
Tabela 19. Análise da acurácia dos testes MODS em relação ao
Método das Proporções associado ao Seqüenciamento (katG, inhA e
ahpC) e RMP (rpoB) para detecção de resistência a INH em 318
amostras respiratórias
125
Tabela 20. Distribuição dos resultados da tipagem molecular por
Spoligotyping
127
Tabela 21. Relação entre os resultados do método de proporções, de
biologia molecular e o desfecho clínico nos casos de infecção múltipla
128
ix
associada ou não a heterorresistência.
Tabela 22. Relação entre os resultados do método de proporções, de
biologia molecular e o desfecho clínico nos casos sem infecção
múltipla, com ou sem heterorresistência.
131
x
SUMÁRIO
CAPITULO I - INTRODUÇÃO 1
CAPITULO II - OBJETIVOS 9
CAPITULO III - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Transmissão e Infecção da Tuberculose 11
3.2 Epidemiologia da Tuberculose 13
3.3 Resistência aos Fármacos Anti-TB 17
3.4 Histórico da Tuberculose Multirresistente 19
3.5 Inquéritos de Tuberculose Resistente no Brasil 29
3.6 Tuberculose Multirresistente e HIV 31
3.7 Situação Atual da Tuberculose Multirresistente no Brasil 36
3.8 Mycobacterium tuberculosis 37
3.9 Mecanismos de Resistência de M.tb 42
3.10 Fator Corda 52
3.11 Métodos Disponíveis para a Detecção da Resistência de
M.tuberculosis aos Fármacos Utilizados para o Tratamento da
Tuberculose e Estudos Comparativos
55
3.12 Epidemiologia Molecular 68
CAPITULO IV - PACIENTES E MÉTODOS
4.1 Tipo de Estudo 75
4.2 Período e Local do Estudo 75
4.3 Perfil da Amostra 76
4.4 Critérios de Inclusão 76
4.5 Critérios de Exclusão 76
4.6 Procedimentos Clínicos 77
4.7 Procedimentos de Laboratório 79
4.8 Análise Estatística 80
4.9 Técnicas Laboratoriais 80
4.10 Procedimentos Realizados nos Laboratórios de Biologia Molecular 84
4.11 Genotipagem das cepas 87
4.12 Aspectos Éticos 88
CAPITULO V - RESULTADOS 89
CAPITULO VI - DISCUSSÃO 134
xi
CAPITULO VII - LIMITAÇÕES DO ESTUDO 153
CAPITULO VIII - CONCLUSÕES 154
CAPITULO IX - PERSPECTIVAS 156
CAPITULO X - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 157
CAPITULO XI - ANEXOS 200
11.1 Termo de consentimento
11.2 Ficha de coleta de dados
11.3 Artigo publicado
xii
SIGLAS e ABREVIATURAS
ADN ou ARN: Ácido desoxirribonucléico
AMICA: Amicacina
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ARV: Anti-Retrovirais
BCG: Bacilo de Calmette Guerin
BMM: Método do Crescimento em Microdiluição
CDC: Centro de Controle de Doenças
CMI: Concentração Mínima Inibitória
CRPHF: Centro de Referência Professor Hélio Fraga
DOT: Tratamento Diretamente Observado
DOTS: Tratamento Diretamente Observado de Curta Duração
DR: Resistência a fármaco anti-TB
DRE-PCR: Double Repetitive Element
E. coli: Escherichia coli
EMB: Etambutol
ESF: Estratégia de Saúde da Família
ETH: Etionamida
EUA: Estados Unidos da América
FDA: Food Drug Administration
FUNASA: Fundação Nacional de Saúde
GLC: Green Light Committe
HAART: Tratamento Anti-Retroviral de Elevada Eficácia
HMRPS: Hospital Municipal Raphael de Paula Souza
HUCFF: Hospital Clementino Fraga Filho
HDF: PCR-Heteroduplex formation
HIV: Vírus Imunodeficiência Humana
IDT: Instituto de Doenças do Tórax
INH: Isoniazida
ISS6110: Sequência de Inserção M.tb
LAM: Genótipo Latino-Americano e Mediterrâneo
LJ: Lowenstein-Jensen
xiii
MABA :Método de Indicador de Oxi-Redução do Alamar Blue
MGIT 960: Mycobacterium Growth Indicator Tube
MODS: Microscopic Observation Broth Drug Susceptibity Assay
MP: Método das Proporções
MR: Multirresistência
MS: Ministério da Saúde
MSH : Management Sciences of Health
M. tb : Mycobacterium tuberculosis
MTT: Método 3-(4,5 dimetiltiazol 2-yl) 2,5-difenil Brometo de Tetrazolio
NRA: Redução da Nitratase
OFLOXA: Ofloxacina
OMS: Organização Mundial de Saúde
PCR: Reação de Polimerase em Cadeia
PCR-SSCP : Single Strand Conformation Polymorphism
Pb: Pares de Base
PGRS: Sequência Polimórfica Rica em GC
PIM: Fosfatidilinositol Manosídeo
PNCT: Programa Nacional de Controle de Tuberculose
PZA: Pirazinamida
RFLP: Restriction Fragment Polymorphism
RLB: Reverse Line Blot Hibridization Assay
RNAP: RNA Polimerase
RMP: Rifampicina
RIP: Rifampicina; Isoniazida; Pirazinamida
RRDR: Regiões do gene rpoB Resistência a RMP
RS: Rio Grande do Sul
SIDA: Síndrome da Imunodeficiência Humana Adquirida
SIM: Sistema de Informação de Mortalidade
SM: Estreptomicina
SMS – RJ: Secretaria Municipal Saúde – Rio de Janeiro
SBPT: Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia
SINAN: Sistema de Informação de Nacional de Agravos Notificados
SVS: Secretaria de Vigilância Sanitária
TDM: 6-6’dimicolato de trealose
xiv
TEMA: Tetrazolium Microplate Assay
TB: Tuberculose
TBR: Tuberculose Resistente
TBMR: Tuberculose Multirresistente
TB-XDR: Tuberculose Extensivamente Resistente
TSA: Teste Suscetibilidade aos Fármacos
UFRJ: Universidade Federal do Rio de Janeiro
UIATLD: União Internacional contra a TB e Doenças Pulmonares
UNAIDS: Joint United Nations Programme on HIV/AIDS
VE: Vigilância Epidemiológica
VNTR:Variables Numbers of Taden Repeats
XDR: Extensivamente Resistente
xv
DEFINIÇÕES:
1. Suspeita de resistência e de multirresistência : todos aqueles que
tivessem suspeita de recidiva de TB; falência ao tratamento TB instituído;
história de abandono ao tratamento; ser contato de TBMR; ter sorologia para
o HIV positiva; ser população de risco (população em situação de rua;
presidiário; interno em asilos, albergues e/ou hospital psiquiátrico).
2. TBMR: todos aqueles que apresentaram ao teste de sensibilidade,
resistência a RMP e a INH e mais um fármaco e também aqueles que não
responderam a todos os tratamentos de primeira linha (esquema I e IR) e de
falência (esquema III) com piora clínica e radiológica independente do
resultado encontrado nos testes de sensibilidade e em uso do esquema para
TBMR preconizado pelo MS em nosso meio.
3. Desfecho Clínico:
Falência: pacientes que permaneceram com positividade à cultura BK
em vigência de tratamento ou que retornaram a apresentar positividade
ao 4º mês de tratamento para TB.
Óbito: as mortes ocorridas durante o tratamento de TB.
Abandono: pacientes em vigência de tratamento para TB que não
retornaram ao serviço de saúde após 60 dias da última consulta médica.
4. Favorabilidade: aqueles que apresentaram negativação à curva
bacteriológica durante o tratamento observado.
xvi
Resultado favorável: aqueles que evoluíram para a cura após o
tratamento completo ou aqueles que apresentaram negativação à curva
bacteriológica durante o tratamento observado (favorabilidade);
Resultado desfavorável: aqueles que evoluíram para a falência e
óbito.
5. HIV
Infecção pelo HIV: diagnóstico segundo a positividade na sorologia
encontrada ao teste Elisa e confirmada ao Western Blot.
6. Risco: Classificação dos pacientes
Alto risco: aqueles com suspeita e/ou falência;
Risco intermediário: aqueles com história de abandono;
Risco intermediário baixo: aqueles com recidiva pós-cura;
Risco baixo: aqueles com suspeita de e /ou TB sem história prévia de
tratamento.
7. Heterorresistência: é caracterizada por diferentes resultados nos testes
de sensibilidade aos fármacos anti-TB, quer por meio fenotípico quer meio
genotípico, em diferentes amostras respiratórias do mesmo paciente.
8. Infecção Policlonal/Múltipla: presença de mais de uma cepa de M. tb na
amostra respiratória do mesmo paciente por meio da análise da técnica de
Spoligotyping.
xvii
RESUMO
Racional: Na avaliação da acurácia de novos testes diagnósticos para
tuberculose (TB), usualmente, não é incluída a análise dos resultados
discordantes.
Objetivo: Avaliar a acurácia da técnica MODS para a detecção de TB
resistente (TBR) a isoniazida (INH) e rifampicina (RMP) e sua relação com a
apresentação clínica dos pacientes, incluindo a análise dos resultados
discordantes por meio de métodos moleculares.
Métodos: 318 amostras respiratórias de 142 pacientes suspeitos de TBR,
atendidos numa unidade de referência do Rio de Janeiro, foram analisadas
pelo MODS e Método das Proporções (MP). Resultados discordantes
ocorreram em 43 (31%) pacientes, cujo material clínico foi submetido ao
seqüenciamento de genes associados resistência à INH e RMP e a técnica
spoligotyping. 69 amostras de 38 pacientes foram incluídas, sendo que em 23
pacientes, pelo menos 2 amostras.
Resultados: Sensibilidade, especificidade e kappa foram respectivamente,
para INH, de 96,5%; 79,8% e 77,5% e para RMP, de 95,7%;85,9% e 80,5%. O
sequenciamento proporcionou aumento da especificidade do MODS: INH para
82,2% e, RMP para 91,1%. A heterorresistência ocorreu em 34,7%(8/23), entre
eles, apenas 2 tiveram evolução clínica favorável. A infecção múltipla ocorreu
em 47,8% (11/23), todos com história de tratamento anterior. As famílias mais
prevalentes foram LAM (35,8%); Haarlen (20,7%) e T1 (18,1%).
Conclusão: Elevada sensibilidade do teste MODS sugere sua utilidade na
triagem de TBR. Foi elevada a proporção de heterorresistência e/ou infecção
múltipla nas amostras discordantes. Novos estudos são necessários para
avaliar o papel da heterorresistência e infecção múltipla na abordagem clínica
do pacientes com TBR.
xviii
xix
ABSTRACT
Rational: Accuracy evaluation of new diagnostic tests for TB, usually, does not
include discordant results analysis.
Objective: To evaluate the accuracy of technique MODS for drug resistant TB
(TBR) for isoniazid (INH) and rifampin (RMP) and its association with the
clinical profile, including the discordant results analysis by molecular tests.
Methods: 318 respiratory samples of 142 patients at risks of TBR, attended in a
Reference Unit (Rio de Janeiro) had been analyzed by MODS and Proportion
Method. Discordant results had occurred in 43 (31%) patients whose clinical
material was submitted to sequencing of genes associates for resistance to INH
and RMP and technique spoligotyping. 69 samples of 38 patients had been
included; and among 23 patients, at least with 2 samples.
Results: Sensitivity, specificity and kappa test had been respectively, for INH,
of 96.5%; 79.8% and 77.5% and for RMP, of 95.7%; 85.9% and 80.5%.
Sequencing increased MODS specificity for INH to 82.2% and for RMP to
91.1%. Heteroresistance occurred in 34.7% (8/23), among them, only 2 had
favorable clinical evolution. Multiple infection occurred in 47.8% (11/23), all of
them had previous history of TB treatment. The most prevalent families were
LAM (35.8%); Haarlen (20.7%) and T1 (18.1%).
Conclusion: High sensitivity of test MODS suggests its utility in the TBR triage.
There was a high rate of heteroresistance and/or multiple infection in the
discordant samples. New studies are necessary to evaluate the role of the
heteroresistance and multiple infection in the clinical approach for TBR patients.
1
CAPITULO I - INTRODUÇÃO
Nos últimos anos observou-se em várias regiões do globo, um aumento do
número de casos de tuberculose (TB), de TB multirresistente (TBMR) e, mais
recentemente de casos de TB extensivamente resistente (TB-XDR). Em 2005, a taxa
de incidência de TB permanecia aumentando na África, na Região do Mediterrâneo
Oriental e na Ásia (região leste-sul). (BASU e cols., 2007; SHAH e cols., 2007). Tal
fato foi atribuído ao impacto da epidemia de HIV/AIDS, à deterioração das condições
sócio-econômicas e à desestruturação dos sistemas de saúde, principalmente em
grandes metrópoles de países em desenvolvimento (KRITSKI & RUFFINO-NETO,
2000).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou que um terço da população
mundial esteja infectada por Mycobacterium tuberculosis (M. tb) e em 2006, foram
notificados cerca de 9,2 milhões de casos novos dos quais 4,1 milhões com
baciloscopia positiva e 0,7 milhões de casos com co-infecção TB/HIV (8%). Quanto ao
número de óbitos associados a TB, foram estimados 1,7 milhões de casos sendo
observado que as maiores taxas de mortalidade encontradas estavam relacionadas
aos países com elevada prevalência de infecção por HIV e TBMR/TB-XDR. (WHO,
2008)
A TB é responsável por 26% das mortes evitáveis e aproximadamente 80%
estão na faixa etária mais produtiva economicamente, de 15 a 54 anos. Entre
indivíduos do sexo feminino, a TB foi a principal causa de morte em jovens e adultos
em relação a outras causas de mortalidade materna combinada. (TINDO e cols, 2004)
De acordo com a OMS, são identificados 5 milhões de casos novos
soropositivos para o HIV e, o HIV/SIDA é a maior causa de morte por doenças
2
transmissíveis no mundo. Estima-se que em 2005 morreram 3.100.000 pessoas com
HIV/SIDA. Diversas evidências sugerem que a co-infecção TB/HIV é responsável pelo
aumento na incidência de TB em várias regiões do mundo. Em 2006, 8% dos adultos
com TB estavam infectados pelo HIV, com grandes variações de percentuais entre as
regiões do mundo. Por meio de dados de vigilância epidemiológica, em nível mundial,
estimou-se que das 1,7 milhões de mortes associadas a TB, 0,2 milhões estavam
infectados por HIV (WHO, 2008).
Em relação ao impacto da TB na epidemia HIV/AIDS, têm-se poucas
informações. Globalmente, em 2004, estimou-se que a TB esteve associada em 8%
dos óbitos ocorridos em pacientes soropositivos para o HIV. No entanto, estudos de
autópsia têm demonstrado que a TB é responsável por 33% dos pacientes
soropositivos que evoluem para o óbito mesmo naqueles que foram submetidos ao
tratamento anti-retroviral de elevada eficácia (HAART). Isto pode ser explicado pela
baixa sensibilidade da baciloscopia em pacientes infectados por HIV (20%- 50% entre
os infectados versus 60%-65% nos pacientes não infectados) e pela baixa prioridade
dada ao diagnóstico micobacteriológico nas Unidades de Saúde Ambulatoriais de
referência ou em Hospitais, nos países em desenvolvimento. Além disso, a
apresentação clínica atípica é frequente em pacientes soropositivos para o HIV o que
acarreta retardo no diagnóstico e no inicio do tratamento medicamentoso. Com a
associação destes múltiplos fatores sobrevém um aumento na morbi/mortalidade por
TB nestes pacientes, e também no risco de transmissão de M. tb em ambientes
fechados (hospitalares, albergues, prisões). (CDC, 1992; FISCHL e cols., 1992;
RITACCO e cols., 1997; HANNAN e cols., 2001; COSTA e cols., 2004; ZIGNOL e
cols, 2008; GANDHI e cols, 2006; LEMOS e cols, 2009).
3
Desde 1993, modelos variados de tratamento diretamente observado (DOT),
incluídos na estratégia DOTS proposta pela OMS, foram mundialmente adotados com
o objetivo de detectar 70% dos casos de TB e curar 85% daqueles identificados. A
estratégia DOTS proporcionou a elevação dos índices de cura em diversos lugares,
entretanto, observou-se que o sucesso em reduzir as taxas de incidência da TB e de
resistência aos fármacos anti-TB foi variável e limitado nos países em
desenvolvimento, principalmente em grandes metrópoles e em locais com elevada
prevalência de infecção pelo HIV. (ADATU e cols., 2003; DAVIES, 2003; DOSUMU e
cols, 2001; POPE e cols, 2003; SALANIPONI e cols., 2003 ; JASMER e cols., 2004;
TUSHIDA e cols., 2006; JOMBO e cols., 2008; TALAY e cols., 2008; TIGANI e cols.,
2007)
Em 2006, de forma global, a taxa de detecção de casos com baciloscopia
positiva alcançou 61% (meta de 70%) e a taxa de cura, 84,7% (meta de 85%). A
estratégia DOTS foi implementada em 184 países o que representa 99% dos casos
estimados de TB e 93% da população mundial. Em 2006, um total de 4,9 milhões de
casos novos foram notificados em unidades com DOTS (WHO, 2008).
A ocorrência de TBMR/TB-XDR é resultante do uso inadequado dos
medicamentos (TBMR adquirida) e de sua elevada transmissão (TBMR primária) em
locais com pouca ventilação (domicílios, ambulatórios, hospitais, prisões, asilos para
pessoas idosas ou albergues para indigentes), onde usualmente não há cuidados
adequados de biossegurança. Várias publicações apontaram para relação entre a
resistência adquirida e história prévia de tratamento para TB (KRITSKI e cols., 1997;
SEISCENTO e cols, 1997; MOORE e cols., 1997; DALCOLMO e cols., 1999;
PEREIRA PINTO, 1998; AL HAJJAJ e cols., 2001, NERALLA e cols, 2003; PALMERO
e cols., 2003; ZIGNOL e cols., 2006: NATHANSON e cols, 2006; BRITO, 2007;
4
JASSAL & BISHAI, 2007). A incidência global de TB multirresistente foi estimada em
0,5 milhões de casos de TB no mundo, no ano de 2006.
No Brasil, no período de 2002 a 2007, foram notificados 2269 casos de TBMR,
sendo que 53,2% dos casos ocorreram no Estado do Rio de Janeiro e no Estado de
São Paulo, em sua maioria na forma adquirida (> 90%) e associada ao retardo
diagnóstico de TB resistente.
Em inquérito realizado entre 2000 e 2004, incluindo 49 países 20% das cepas
de M.tb eram de TBMR, dos quais 2% eram de TB-XDR. (CDC, 2006).
Recentemente, uma epidemia de casos de TB-XDR foi descrita em pacientes
atendidos num hospital rural da África do Sul. A evolução rapidamente fatal desses
casos foi atribuída à elevada prevalência de infecção por HIV; a utilização de
tratamento inadequado diante do contexto de alta prevalência de HIV; deficiência no
diagnóstico e na implantação de medidas de controle de infecção. A epidemia teve
inicio em 2005 que se mantém até hoje, com 500 e 300 casos por ano,
respectivamente, de TBMR e de TB-XDR (GANDHI e cols., 2006).
Outra epidemia foi relatada na Ucrânia, em região com alta prevalência de HIV.
Em um ano, dentre os 1500 casos diagnosticados de TB, 2/3 eram casos novos e 1/3,
retratamento; e, 21% estavam co-infectados TB/HIV. Dentre 15% dos casos novos,
constatou-se TB multirresistente. Observou-se também que, nesta população, os
preditores de TBMR foram: a presença de infecção por HIV; ter história prévia de
tratamento anterior e de encarceramento. A taxa de mortalidade foi alta e maior no
grupo HIV positivo (ZIGNOL, 2008).
Com os dados disponíveis atualmente, por meio da utilização de modelo
matemático, estima-se que para interrupção do ciclo da transmissão de TBMR em
locais com elevada prevalência, seria necessária a detecção de aproximadamente
5
70% dos casos de TBMR anualmente e que pelo menos 80% destes, curados. (DYE,
2002) Neste contexto, emerge uma grande questão: como lidar com a ameaça de
TBMR/TB-XDR nas regiões com alta carga de TB e HIV?
Nos últimos anos, tornou-se consenso que a epidemia de TB nos países em
desenvolvimento requer uma avaliação de abordagens mais amplas, adicionais à
estratégia DOTS. Tais abordagens foram descritas no Plano STOP-TB/OMS de
controle mundial de TB para 2006-2015. Entre elas, têm-se priorizado: a) ampliação e
implementação do DOTS de alta qualidade b) priorização ao atendimento;
diagnóstico, tratamento e acompanhamento dos pacientes HIV com suspeição ou
confirmação de coinfecção TB/HIV e daqueles com suspeição ou confirmação
diagnóstica de TBMR/TBXDR; c) o fortalecimento dos sistemas de saúde – com
melhorias no acesso ao diagnóstico do usuário do Sistema de Saúde; d) a formação
de parcerias público-público e público-privado – com o engajamento de todos os
profissionais; e) o empoderamento dos pacientes e das comunidades; f) capacitação
e promoção de pesquisas - avaliação em condições de rotina a implantação de novas
tecnologias para o diagnóstico precoce de TB, TB resistente em pacientes com TB
paucibacilar, infectado pelo HIV ou suspeitos de TB resistente. (WHO REPORT, 2008)
O diagnóstico precoce de TB resistente a múltiplos fármacos é um permanente
desafio. Apesar da existência dos Programas Nacionais de Controle de Tuberculose
(PNCT), em várias países do mundo, as estratégias de controle são impedidas pelas
dificuldades constatadas para o diagnóstico laboratorial da TB resistente aos
medicamentos e consequentemente, torna-se crítico a solução destas para que se
tenha o incremento da efetividade das ações programáticas planejadas. Vários
estudos foram publicados sobre TB multirresistente nos quais evidenciou-se que o
atraso no diagnóstico apropriado pode diminuir a efetividade do tratamento e
6
contribuir para maior transmissão da TB resistente aos medicamentos (FARMER,
2001; MORO e cols., 2003; DALCOLMO e cols., 2007). Além disso, a resistência aos
medicamentos é um fator importante de risco para a falência ao tratamento instituído
(GARCIA-GARCIA e cols., 2000; CHEN e cols., 2007; COX e cols., 2007; QUY e
cols., 2003) e a falência ao tratamento supervisionado instituído para TB é um preditor
de multirresistência em locais com elevada prevalência de TBMR (BECERRA e cols.,
2000; COX e cols., 2007). Por esta razão, o desenvolvimento e a execução de
métodos rápidos para o diagnóstico da TB resistente aos medicamentos passam a ser
essenciais ao controle eficaz da TB a médio e longo prazo.
O teste convencional de suscetibilidade aos fármacos (TSA) é um
procedimento lento pois é realizado somente após o crescimento de M.tb, à cultura da
micobactéria por métodos fenotípicos. Assim sendo, enquanto o profissonal médico
aguarda o resultado do teste de suscetibilidade (2- 4 meses) para a adequação da
conduta terapêutica, o paciente pode permanecer submetido a um tratamento não
apropriado e efetivo. Os novos testes diagnósticos para TB publicados na literatura
internacional com melhor performance são: o teste automatizado de detecção (MGIT
960); a detecção do fator corda pela técnica MODS; o teste para detecção do
crescimento do bacilo por meio de fagos (FastPlaque); os testes moleculares (INNO-
Lipa e GenoType® MTBDRplus). Estes testes têm demonstrado resultados similares
ou superiores àqueles observados com o padrão ouro tanto para a detecção de M.tb,
como a detecção de resistência aos fármacos mais importantes nos regimes de
tratamento anti-TB de primeira linha: rifampicina e isoniazida.
Métodos moleculares disponíveis comercialmente como o kit INNO-LIPA Rif.TB
(Innogenetics, Zwijndrecht, Bélgica) e o ensaio de GenoType® MDRTBplus (Hain
Lifescience, GMBH, Alemanha) têm demonstrado boa eficácia, rapidez e são de fácil
7
execução o que pode auxiliar muito o diagnóstico precoce de casos de TBMR. No
entanto, eles têm um custo elevado para o uso rotineiro no diagnóstico laboratorial
para a detecção de resistência de M.tb aos fármacos RMP e INH, em países em
desenvolvimento. O mesmo acontece com os métodos baseados em meio líquido
como o sistema BACTEC; MGIT 960; ESP Culture System II que permitem a
obtenção de resultados em torno de 10 dias, mas requerem insumos e equipamentos
caros.
Entre os métodos fenotípicos não automatizados baseados em meio líquido a
base de ágar, mais apropriados para uso em países em desenvolvimento, destaca-se
a técnica MODS. Trata-se de um método rápido, simples e barato que permite a
realização dos testes de sensibilidade a RMP e a INH. Baseia-se numa metodologia
que, após 10 dias, podem ser observadas no microscópio com luz invertida e com
filtro para campo escuro, a visualização do fator corda formado pela micobactéria. Os
dados publicados sugerem que a técnica MODS pode ser útil na triagem de pacientes
sob suspeita de TBMR, em razão de elevada sensibilidade. (CAVIEDES e cols., 2000;
PARK e cols., 2002; MELLO e cols., 2007; EJIGU e cols., 2008).
São poucos os estudos, sobretudo em países em desenvolvimento, que
avaliaram em condições de rotina a performance de novas tecnologias diagnósticas
(fenotípicas e/ou genotípicas) em pacientes sob risco de albergarem cepas resistentes
aos fármacos. São também escassos os estudos que ao avaliarem a acurácia de
novas técnicas no diagnóstico de TBMR, compararam os resultados discordantes
obtidos pelo padrão ouro (teste fenotípico: Método das Proporções ou MGIT 960) com
o nível de resistência das cepas por meio da concentração inibitória mínima (CMI),
com o perfil molecular do gene envolvido com a resistência por meio do
8
seqüenciamento e com a evolução clínica dos pacientes após tratamento
medicamentoso.
O presente estudo tem como principal enfoque: avaliar a acurácia do teste
MODS (padrão ouro: Método das Proporções) para detecção de resistência aos
fármacos rifampicina e isoniazida em pacientes com suspeição de e/ou TB resistente
ou TB multirresistente e suas relações clínicas. Além disso, pretende-se também
realizar uma análise clínico- laboratorial dos pacientes e de suas respectivas amostras
clínicas nas quais se evidenciou resultados discordantes utilizando-se o
sequenciamento e a técnica de tipagem molecular: spoligotyping.
9
CAPITULO II - OBJETIVOS
2.1. Geral
2.1.1 Avaliar a acurácia do teste MODS em pacientes suspeitos de TB resistente,
atendidos em Unidade de Referência, na cidade do Rio de Janeiro.
2.1.2 Analisar os fatores clínicos associados nestes pacientes cujos resultados
encontrados foram concordantes e discordantes aos testes, MODS e Método das
Proporções (MP)
2.2. Especificos
Estimar a reprodutibilidade dos testes MODS e MP nas amostras clínicas dos
pacientes incluídos no estudo;
Estimar a acurácia do teste MODS para detecção de resistência a RMP e a
INH;
Analisar a acurácia da técnica MODS e do MP em relação o seqüenciamento
para detecção de resistência a RMP e INH, segundo o desfecho clínico dos
pacientes cujas as amostras clínicas apresentaram discordância inter-testes
MODS e MP;
Analisar a contribuição do seqüenciamento associado ao MP, após análise dos
resultados discordantes inter-testes (MODS e MP), na acurácia do teste MODS
para detecção de resistência a RMP e INH na amostra global estudada;
Analisar a freqüência de diferentes perfis moleculares de cepas de M.tb
encontradas nas amostras respiratórias com resultados discordantes inter-
testes, MODS e MP;
10
Analisar a ocorrência de infecção múltipla por M.tb num mesmo indivíduo no
mesmo episódio de doença, nas amostras respiratórias que apresentaram
discordância inter-amostras;
Estimar a prevalência de resistência primária e adquirida a INH associada a
RMP nos pacientes do estudo por ambos os testes e a relação com a história
clínica de TB pregressa ;
Estimar a prevalência de co-infecção TB/HIV nesta amostra estudada e fatores
associados;
Analisar a relação entre a classificação clínica de risco e o desfecho clínico dos
pacientes;
Analisar a relação entre o tipo de cepa de M.tb encontrado nas amostras
respiratórias dos pacientes que apresentaram discordância inter-testes, os
padrões de resistência encontrado ao MP; história clínica pregressa e o
desfecho clínico;
Analisar a relação entre a presença de heterorresistência ao MP; a ocorrência
de infecção múltipla por M.tb, a história clínica prévia de TB e o desfecho
clínico dos pacientes.
11
CAPITULO III - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Transmissão e Infecção da Tuberculose
A despeito de sua origem milenar, a TB, ainda hoje, permanece como uma das
maiores causas de morte por doença infecciosa no mundo (RAVIGLIONE, 2003). Tem
como agente etiológico M.tb, um bacilo álcool-ácido resistente, aeróbico e de
crescimento lento. A TB é uma doença que se propaga, de pessoa a pessoa, pela
inalação, a partir de aerossóis emitidos de um paciente bacilífero (produzidos durante
o ato de tossir, falar ou espirrar). Os aerossóis permanecem em suspensão no ar
ambiente como partículas microscópicas as quais, após desidratação, ao serem
aspiradas, vencem as barreiras de defesa da árvore respiratória e se depositam nos
alvéolos, onde tem início o processo da doença. (RATCLIFFE & WELLS, 1948) Na
comunidade, em média, estima-se que um doente bacilífero infecte anualmente 8 a 9
pessoas (RUFFINO & ARANTES, 1980). O risco de contágio para os contatos
próximos é de 5% a 20% e para os contatos casuais de 0,2% a 2%. Estima-se que é
necessária uma exposição de, pelo menos, 4 horas semanais para que ocorra o
contágio. (KRITSKI e cols., 2000). Dentre os infectados sem imunossupressão, cerca
de 5% a 10% desenvolve TB, com maior ocorrência nos primeiros dois anos após o
contágio (ELLNER, 1986; BLOOM, 1994). Os indivíduos infectados pelo HIV, ao
serem expostos ao bacilo da TB, apresentam uma chance de 7% a 10% ao ano de
desenvolver doença ativa. Assim sendo, o risco de adoecimento é 170 vezes maior
para o paciente soropositivo para o HIV, na fase avançada da infecção, SIDA é 113
vezes maior para aqueles em menor grau de imunossupressão. Nos indivíduos com
outro tipo de imunodepressão, como insuficiência renal crônica, portadores de
12
doenças malignas (câncer de cabeça e pescoço, uso de fármacos
imunossupressores), o risco é de 3,6 a 16 vezes maior. Nas crianças com idade
abaixo de quatro anos e nos indivíduos com idade superior a 60 anos, o risco de
adoecer é cerca de 2 a 5 vezes maior do que o de um adulto jovem (JACOBS e cols.,
1994). Recentemente, foi publicado um aumento do número de casos de TB, no
Japão, em indivíduos acima de 70 anos. Este fato foi associado ao aumento da
sobrevida dos indivíduos naquele país; a presença de co-morbidades que levam a um
maior número de complicações clínicas e que contribuem com a demora no
diagnóstico causando o aumento da morbi-mortalidade por TB. (YAMAGISHI, 2004).
A ventilação local é fundamental na prevenção da transmissão do bacilo da TB.
Nos últimos anos, foram descritos surtos de TB em ambientes fechados sem
ventilação apropriada, como em hospitais, prisões e albergues. Hoje, os profissionais
de saúde que trabalham em hospitais que atendem pacientes com TB pulmonar,
apresentam um risco mais elevado de se infectarem ou adoecerem por TB. Devido a
tal fato, tornou-se consenso nos últimos anos a necessidade da adoção de medidas
de biossegurança em tais ambientes (PEARSON e cols., 1992; VALWAY e cols.,
1994; KRITSKI & RUFFINO 2000; SILVA e cols, 2000; MUZY DE SOUZA e cols.,
2002; COSTA e cols., 2004).
Quanto ao gênero, o acometimento da TB é maior no sexo masculino do que
no feminino embora, nos últimos anos, devido o aumento do número de casos de
HIV/AIDS em mulheres, e, a presença de co-infecção TB/HIV associada, observa-se
uma mudança neste padrão. Em um estudo feito no município do Rio de Janeiro, com
o objetivo de descrever diferenças do comportamento da TB em ambos os sexos, por
meio do levantamento de 55.258 notificações de casos de TB, num período de 5
anos, observou-se que a informação sobre história de contato recente com indivíduo
13
com TB e a positividade ao teste tuberculínico foi maior no grupo do sexo feminino.
Quanto à faixa etária, a distribuição encontrada foi diferente entre ambos os grupos:
da puberdade a 34 anos, o risco relativo foi maior no sexo feminino;e, após, até
chegar a idade avançada, maior no sexo masculino quando então, os dois grupos
tendem a se aproximar. Alguns trabalhos sugerem que, em países com alta
prevalência de TB, mulheres em fase reprodutiva quando infectadas por M.tb
evoluem mais rapidamente para doença do que homens com a mesma faixa etária e,
ao se comparar dentro do grupo do sexo feminino, aquelas em fase puerperal
apresentam maior risco para o desenvolvimento de doença. (TINDO e cols., 2004;
HOLMES e cols., 1998)
3. 2 Epidemiologia da Tuberculose.
3.2.1 No Mundo.
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) em 2006, no mundo, a
incidência de TB, sob todas as formas clínicas, foi estimada em 9,2 milhões de novos
casos o que representa um aumento do número de casos em relação a 2005, a qual
foi atribuída ao crescimento populacional. China, Indonésia, África do Sul e Nigéria
são os primeiros na listagem mundial quanto ao número absoluto de casos. A região
da África tem a mais alta taxa de incidência per capita (363/100.000 habitantes). A
prevalência da TB estimada foi 14,4 milhões de casos e a mortalidade, 1,7 milhões de
casos sendo 1,5 milhões em pacientes HIV negativos e 0,2 milhões em indivíduos
coinfectados TB/ HIV. (WHO, 2008).
14
Em 2007, 202 dos 212 países e regiões relataram os dados de notificação
referentes a 2006: 5,1 milhões de casos de TB e dentre estes, 2,5 milhões eram
casos novos da forma pulmonar bacilífera. A África, sudeste asiático e região oeste do
Pacífico são responsáveis por 83% das notificações. (WHO REPORT, 2008).
Em 2006, foram estimados 0,5 milhões de casos de TBMR no mundo embora
tenham sido notificados 23.353 casos. Dentre estes, somente 2.032 casos fazem
parte do programa do Green Light Committe (GLC) o qual garante as diretrizes de
tratamento da OMS. Estima-se que 50.000 pacientes devam ser arrolados para
tratamento nos anos de 2007 e 2008, conforme as diretrizes da OMS.
3.2.2 No Brasil.
O Brasil ocupa a 14
a
posição no ranking dos 22 países responsáveis pela maior
carga de TB e 18º posição, nas formas bacilíferas. Segundo a OMS em 2006, a taxa
de incidência de TB (todas s formas) foi estimada em 50/100. 000 hab e 31/100. 000
hab, na forma pulmonar bacilífera, a taxa de mortalidade em 4,0/100.000 hab e a taxa
de co-infecção TB/HIV, de 12%. Foram notificados 83.293 casos de TB, todas as
formas sendo 77632 casos de TB pulmonar (casos novos e de recidiva) e 10.656
casos de TB extra-pulmonar. Dentre os casos novos e de recidiva, 41.117 foram
bacilíferos e os demais, não bacilíferos e/ou com exames não realizados. Em relação
à taxa de detecção estimada e a encontrada, para todas as formas, 79% e para os
casos bacilíferos, 69%. Foram notificados 8935 casos de retratamento e dentre estes,
3274 casos de recidiva; 219 pós falência; 2282 pós abandono e 3160 outras causas.
Quanto ao encerramento dos casos na coorte de 2005: i) para 26.224 casos novos
bacilíferos sob DOTS, a taxa de sucesso terapêutico foi de 76% sendo a taxa de cura
15
comprovada, 32% e a taxa dos que completaram o tratamento 44%%; taxa de
falência, 1 %%; taxa de abandono, 9% e a de óbito, 5%; ii) para 15869 casos novos
bacilíferos, não DOTS, a taxa de sucesso terapêutico foi de 72 %, a taxa de cura
comprovada foi 27 % e a taxa dos que completaram o tratamento de 45 %; taxa de
falência, 1 %; taxa de abandono , 10% e de óbito, 5%; iii) para 7394 casos de re-
tratamento bacilíferos, 47% tiveram sucesso terapêutico nos quais 26 % cura
comprovada e 21% completaram o tratamento; 2% falência; 18% abandono e 7%,
óbito (WHO, 2008).
Segundo os dados nacionais (SVS/SINAN, 2006), foram notificados 80.603
casos de TB pulmonar, sendo 43.776 casos da forma pulmonar bacilífera com
respectivos coeficientes de incidência de 43,8 e 22,8/100.000 hab. A taxa de
coinfecção TB/HIV foi de, em média, 14% dentre aqueles que realizaram o teste para
HIV. Ao ser avaliado o cruzamento de dados de notificação entre o sistema de
mortalidade (SIM) e de notificação de TB (SINAN), observou-se que a TB foi a causa
básica do óbito em 15.134 casos correspondendo a 0,5% do total de óbitos e a 6,0%
das causas infecciosas. No entanto, a TB quando apontada como causa básica ou
associada é responsável por 33.326 óbitos respectivamente, 0,7% do total dos óbitos
no País. A AIDS como causa básica foi responsável por 33.326 dos casos com os
respectivos coeficientes de 1,1 % do total dos óbitos e 13,3%, entre as causas
infecciosas. No entanto, a AIDS com TB como causa associada de mortalidade
acometeu 3.999 indivíduos correspondendo a 12 % do total de óbitos por AIDS.
A maioria dos casos notificados de TB está concentrada na região sudeste,
onde São Paulo contribui com o maior número seguido do Rio de Janeiro, porém o
estado do Rio de Janeiro tem o maior coeficiente de incidência de TB. Em 2005, neste
16
estado, a taxa de incidência foi de 82,1 por 100.000 habitantes; notificou-se 12.000
casos novos; 11.000 casos pulmonares sendo 6.000 bacilíferos. Trinta e dois
municípios são considerados prioritários com 90% dos casos concentrados nestes.
Dentre estes, o município do Rio de Janeiro com a taxa de incidência de 103,52 por
100.000 habitantes. A Região Metropolitana I que inclui o Município do Rio de Janeiro
e a Baixada Fluminense é responsável pela notificação de 10.000 casos
aproximadamente. No entanto, esta apresenta a menor cobertura (10%) de equipes
do Programa da Estratégia de Saúde da Família (ESF). (SINAN, 2006). Com o Pacto
pela Saúde, a TB passou a fazer parte do programa de Atenção Básica o que
implementará a descentralização do tratamento supervisionado (DOT) com a
esperada melhoria nas taxas de cura e abandono.
3.2.3 Município do Rio de Janeiro.
Foram notificados no Município do Rio de Janeiro, em 2006, 7734 casos. Ao se
avaliar o número de casos notificados comparativamente, entre o ano de 2001 a 2006,
nota-se uma diminuição no número de casos de TB, de 9323 casos em 2001 para
7734 em 2006. Observou-se que este declínio foi evidenciado tanto para os casos
novos como para os de retratamento (recidiva e reingresso pós – abandono). Neste
mesmo período (2001 a 2006), um declínio das notificações de TB tanto dos casos
novos (de 6613 para 5704) como naqueles de retratamento sendo que para recidiva,
de 861 para 519 e para o reingresso pós – abandono de 801 para 483. Quanto à taxa
de incidência houve também um declínio: de 115 por 100.000 habitantes para 93,7
por 100.000 habitantes.
À estratificação por sexo mantém-se o predomínio da doença TB no sexo
masculino (2:1) tendo como faixa etária predominante de 20 a 59 anos.
17
Quanto à forma clínica, a pulmonar isolada foi encontrada em média, durante o
período de 2001 a 2006, em 91% dos casos com a positividade variando de 54,1 a
42,8%.
As formas clínicas de apresentação extrapulmonar de maior acometimento
foram a pleural (45,8%); a ganglionar (21,5%); a miliar (4,5%) e a óssea (4,2%).
Houve aumento na oferta do teste anti-HIV: de 15,1% em 1998 a 46,1% em
2003. (p=0,001). No momento da notificação de TB, evidenciou-se um aumento do
diagnóstico de co-infecção TB/HIV, de 13,8% em 1998 para 17% em 2003. O
percentual de pacientes sabidamente HIV permaneceu estável em 8%.
Quanto ao encerramento dos casos, a taxa de cura foi, em média, 74,5%; a de
abandono, em torno de 13,8% e a de óbito, em média, 4,1% no período de 2001 a
2005.
Em média, nos últimos seis anos, 36% dos casos foram notificados por
unidades hospitalares e 64% por unidades básicas de saúde. A apresentação de TB
extrapulmonar e a associação pelo HIV foram mais freqüentes entre os pacientes
notificados pelos hospitais. (SMS – RJ, 2008)
3.3 Resistência aos Fármacos Anti-TB
3.3.1 Conceituação
A resistência de M.tb aos fármacos utilizados no tratamento da TB é
potencializada por prescrições incorretas (erro médico) e da falta de adesão do
paciente ao tratamento instituído, isto é, por abandono do tratamento (erro do
paciente). Em ambas as situações são selecionadas mutantes resistentes de M.tb a
um ou mais dos medicamentos prescritos. (VAN RIE e cols., 2000).
18
3.3.1.1 Resistência inicial.
O termo resistência inicial foi proposto para identificar pacientes que
apresentavam bacilos resistentes a um ou mais fármacos anti-TB, antes de iniciar o
tratamento específico. Entretanto, o uso desse termo é utilizado quando se
desconhece detalhes sobre a história de tratamentos anti-TB anteriores, informação
importante para diferenciar a TB primária da adquirida. (WHO, 2003)
3.3.1.2 Resistência primária.
Dá-se o nome de resistência primária à presença de bacilos resistentes aos
fármacos anti-TB, em pacientes com TB sem história de tratamento anterior ou com
história de tratamento prévio com duração inferior a 30 dias. (WHO, 2003)
3.3.1.3 Resistência adquirida.
A resistência adquirida caracteriza o paciente tratado com TB e do qual se
isolam bacilos resistentes a um ou mais dos fármacos utilizados. A resistência
adquirida está fortemente associada ao uso incorreto do medicamento e aos
pacientes submetidos ao tratamento anti-TB, por pelo menos um mês, os chamados
”pacientes previamente tratados”. Existem quatro grupos de pacientes previamente
tratados:
a) Aqueles em falência de tratamento, isto é, que permaneceram positivos e
ou que se tornaram novamente positivos após o quarto mês de tratamento;
b) Os que terminaram o tratamento por cura e que apresentaram recidiva da
doença com baciloscopia positiva;
19
c) Os que se trataram por mais de um mês, abandonaram o tratamento por
mais de dois meses e retornaram com TB bacteriologicamente confirmada;
d) Os que continuaram bacteriologicamente positivos após o término do
retratamento.(WHO, 2003.)
3.3.1.4 Multirresistência.
Em 1992, os Centers of Disease Control (CDC) definiu como TB
multirresistente (TBMR) todas as formas de TB causadas por bacilos resistentes a
RMP e a INH. Este conceito foi adotado internacionalmente, exceto pelo nosso país.
No Brasil, conforme aprovado pelo I Consenso Nacional em Tuberculose, em
1997, e por Normas recentemente revisadas (SPT/MS, 1998 e MS/FUNASA, 2000) e
II Diretrizes Brasileiras de Tuberculose (2004), consideram-se multirresistentes os
casos que apresentam resistência “in vitro” a RMP, a INH e a um terceiro fármaco dos
esquemas padronizados pelo Ministério da Saúde (MS). Dentro deste grupo estão,
também, os casos de falência operacional aos esquemas de tratamento e sem
resistência “ïn vitro” a RMP e a INH (MS.SVS.CRPHF, 2006).
3.4 Histórico da tuberculose multirresistente
3.4.1 No Mundo.
Entre 1982 e 1986, houve um aumento expressivo de formas de TB resistentes
aos fármacos devido a associação entre o aumento dos casos de AIDS
diagnosticados nos Estados Unidos da América do Norte e a desorganização dos
serviços públicos de saúde nos centros urbanos como Nova Iorque, Miami e São
Francisco, resultando no reconhecimento do problema como de saúde pública. No
20
início dos anos 90, foram relatados surtos de transmissão nosocomial de TBMR em
hospitais de Nova Iorque, todos estes caracterizados pelo diagnóstico tardio, pelo uso
de esquemas terapêuticos inadequados, pela alta mortalidade e elevada taxa de
transmissão, especialmente por se tratar de população hospitalizada e em sua grande
maioria, associada a AIDS. Outros autores já haviam relatado experiências
semelhantes entre pacientes soropositivos para o HIV, em estágio avançado de
imunodepressão, resultando em altas taxas de mortalidade, até 60%, num período de
16 semanas. (BUSILLO e cols, 1992; AITA e cols., 1996; HERRERA e cols, 1996;
MELLADO e cols, 1996; MORO e cols, 1998; BREATHNACH e cols, 1998; HANNAN
e cols. 1999).
Em 1994, a OMS e a União Internacional contra a TB e Doenças Pulmonares
(UIATLD) promoveram um inquérito de resistência abrangendo 35 países, com
metodologia padronizada, visando a mensuração da prevalência de resistência aos
fármacos de primeira linha e também, estudar a relação entre o nível de resistência
encontrada e o gerenciamento do tratamento nos diversos países. O objetivo maior
seria a implementação dos programas nacionais de controle da TB através de
recomendações para o tratamento. (WHO, 2003). Este inquérito teve a duração de
três anos. Nos pacientes sem história prévia de tratamento, em média 9,9% (2% a
41%) apresentaram resistência ao menos a um medicamento; a resistência a INH
(7,3%) e a estreptomicina (6,5%) foi maior do que a RMP (1,8%) e ao etambutol
(1,0%). A prevalência de resistência primária foi de 1,4% (0% a 14%). Nos pacientes
com história de tratamento anterior por pelo menos um mês, a prevalência de
resistência a qualquer um dos quatro fármacos foi, em média, 36%(5,3% a 100%); a
prevalência de resistência à RMP e à INH foi, em média,13 %(0% a 54%). No global,
a prevalência de resistência a um fármaco foi em média, 12,6% (2,3% a 42,4%) e
21
2,2%(0% a 22,1%), para resistência à RMP e INH. As maiores taxas foram
encontradas nas repúblicas da antiga União Soviética, na Ásia, na República
Dominicana e na Argentina. (PABLOS-MENDEZ e cols., 1998)
O outro inquérito realizado, de 1996 a 1999, abrangeu 58 regiões geográficas,
num total de 61.415 pacientes com TB. Dos casos novos com resistência a um
fármaco, houve uma variação de 1,7%, no Uruguai a 36,9%, na Estônia. A prevalência
da resistência a uma fármaco na Estônia aumentou de 28,2%, em 1994, para 36,9%,
em 1998; na Dinamarca, ela subiu de 9,9% em 1995 para 13,1% em 1998. A mediana
de prevalência TBMR primária foi de 1% porém, ela foi mais elevada em alguns
países como no Irã, com taxa de 5%; em Tomsk de 6,5%; na Letônia e Rússia, de
9%; na China, de 10,8% e na Estônia, de 14,1%. Dos casos tratados, a prevalência de
resistência a um fármaco, variou de 0% na Finlândia a 93,8% no Uruguai e a
prevalência de TBMR variou de 0% em 04 áreas para 48,2% no Irã. A mediana de
prevalência de resistência a um fármaco foi de 11,3% e a 4 fármacos de 1,8%. Ao ser
feita uma comparação com o inquérito anterior foram observadas mudanças
temporais com o aumento do número de casos em determinadas regiões. (WHO,
2000).
Num estudo de larga escala que incluiu pacientes da República Dominicana,
Itália, Hong Kong, Ivanov Oblast, Korea e Peru foram observados desfecho
desfavorável em pacientes que receberam tratamento encurtado com ou sem
supervisão da tomada de medicamentos. Foram incluídos 6402 casos com cultura
positiva para M.tb. Dos 5526 casos novos, 1148 (20,8%) apresentaram alguma
resistência (DR), sendo 184 MR e entre os 876 casos de retratamento, 390 (44,5%)
tinham DR com 169 MR. A falência ao tratamento e a mortalidade foram maiores de
22
forma estatisticamente significante entre os pacientes com TBMR e com
monorresistência a RMP ou INH (ESPINAL e cols, 2001).
Ruddy e cols (2004) promoveram um estudo na região de Samara, na Rússia
envolvendo população carcerária (de um hospital prisional) e população atendida em
unidades de referência para TB (2/3 dos pacientes). A prevalência de multirresistência
na população geral, prisional e civil foi de 22, 7%, 37,3% e 19,8%, respectivamente. A
ocorrência de resistência associou-se, de forma significante, a tratamento anterior
para TB por mais de 4 semanas; ao tabagismo; a presença de cavitação a radiologia
de tórax e estar em regime prisional.
Em 2000, a parceria STOP-TB foi criada para implementar o controle mundial da
TB estimulando entre outros ítens, a melhoria de acesso ao uso aos medicamentos de
segunda linha prevenindo assim, o aumento da resistência.
Em 2003, a TBMR primária ainda não era considerada um problema de grande
magnitude (1% dos casos no mundo, baseado nos inquéritos realizados), mas ocorria
em níveis críticos em algumas regiões como a Estônia, Letonia, Oblasts Ivanovo e
Tomsk na Rússia e nas províncias de Henan e Zhejiang na China (MDR hot spots).
Um modelo matemático estimou que 3,2% (273.000) dos casos novos da doença
eram TBMR em 2000. (ESPINAL, 2003).
Neste período, a resistência aos medicamentos de segunda linha passou a ser
relatada na literatura. Em razão disto, os CDC e a OMS decidiram pela realização de
um novo inquérito internacional para avaliação da sensibilidade de M.tb aos
medicamentos de primeira e segunda linha, abrangendo a rede laboratorial de TB. As
23
cepas que apresentassem resistência a RMP e a INH associada à resistência a pelo
menos três medicamentos utilizados no tratamento de segunda linha foram
denominados TB-XDR. Durante 2000 a 2004, foram analisados 17.690 cepas e os
resultados encontrados foram: 20% TBMR e 2%, TB-XDR. Estudos adicionais, com
base populacional, foram realizados em outros países como nos Estados Unidos
(1993 a 2004), Letônia (2000 -2002) e Coréia do Sul (2004) com os seguintes
resultados: 4%, 19% e 15% dos casos TBMR, respectivamente, eram TB-XDR (CDC,
2006)
No período de novembro de 2004 a novembro de 2005, foi proposta a
ampliação do inquérito com a inclusão da participação de 25 laboratórios
colaboradores, localizados em 06 continentes, que constituíam a Rede de Referência
Laboratorial Supranacional de TB. A amostragem foi de conveniência, com exceção
da Coréia do Sul. Entre os casos de TBMR, a TB-XDR foi identificada em todas as
regiões, porém com taxas mais elevadas na Coréia do Sul (15%) e nos países do
leste europeu/oeste da Ásia (14%). Assim, foi evidenciado, no mundo, o aumento do
número total de cepas TB-XDR e da proporção das cepas de 14 (5%) no ano de 2000
para 34 (7%) em 2004. Após a análise estratificada por região, evidenciou-se aumento
da proporção de cepas no leste europeu/oeste da Ásia (9% em 2000 para 17% em
2003) e no grupo dos países industrializados (3% em 2000 para 11% em 2004).
No inquérito nacional realizado nos EUA, no período de 1993 a 2004,
observou-se que a despeito do declínio na incidência de TBMR, a proporção de TB-
XDR teve um aumento discreto: 3,9% dos 944 casos (1993 – 1996); 4,1% dos 489
casos (1997 – 2000) e 4,5% dos 381 casos (2001 – 2004). No período de 1993 a
24
2002, os pacientes com TB-XDR apresentaram maior risco (1,6 vezes mais) de
mortalidade ou de falência de tratamento em comparação com pacientes com TBMR.
Na Letônia, no período de 2000 a 2002, entre 605 casos de TBMR, 115 (19%)
eram TB-XDR. Similar ao observado nos EUA, pacientes com TB-XDR apresentaram
maior risco (1,5 vezes mais) de mortalidade ou de falência de tratamento do que os
que eram TBMR (CDC, 2006)
O último boletim da OMS sinalizou para as maiores taxas de TBMR já
identificadas. O relato utiliza informações coletadas entre 2002 e 2006 referentes a
91.557 pacientes de 81 países e 02 regiões administrativas da China. Vinte e sete
países são responsáveis por 86% dos casos de TBMR e a maioria destes encontra-se
no leste europeu. Evidenciou-se a ocorrência de TBMR em níveis altos em 45 países
e, baseado nestes achados, a OMS estimou cerca de 489.139 casos de TBMR em
2006, com uma taxa de 4,8%. (WHO, 2008).
Múltiplos esforços têm sido realizados para o controle da TBMR e da TB-XDR,
porém ainda sem a obtenção de um resultado efetivo. Múltiplas causas foram
apontadas como a deficiente implantação/ implementação da Estratégia DOTS
(incluindo o Tratamento diretamente observado) uma vez que esta deveria ser a
estratégia de prevenção do aparecimento de novos casos de TB resistente; a falta de
novos medicamentos para o tratamento de TB resistente, o que nos leva a uma época
anterior em que não havia tratamento para TB; e, a dificuldade para a realização do
diagnóstico rápido destes casos para uma intervenção mais precoce. Com isto, ao
rever a literatura, esta nos conduz mais para o caminho da prevenção do
aparecimento de novos casos de TBMR por meio do aumento da cobertura de
25
implantação da estratégia DOTS levando a diminuição da taxa de abandono e
conseqüentemente, o controle da TBMR em regiões onde a maioria dos casos é de
resistência adquirida. Vários trabalhos apontam para a importância da participação
social neste processo de implantação do tratamento supervisionado nas
comunidades, por meio de relatos de experiências exitosas; como também, para a
formação de parcerias publico- privadas no intuito de implementar o controle da TB.
(DOSUMU, 2001; KIRONDE e cols, 2002; PASECHNIKOV e cols., 2006; ADATU e
cols, 2007; COX e cols., 2007; TÁVORA e cols, 2007).
3.4.2 No Brasil.
Experiências históricas, relatadas na literatura brasileira de décadas passadas,
por meio de autores como Poppe de Figueiredo, Jayme dos Santos Neves, Hélio
Fraga, Germano Gerhardt, José Rosemberg e outros, já mostravam a preocupação
nacional com a emergência de resistência. Nos anos de 1958-59, entre os pacientes
em tratamento no Estado da Guanabara, 66,6% tinham se tornados crônicos,
resistentes a dois ou três fármacos do esquema padronizado. O mesmo foi verificado
em várias capitais brasileiras, sendo então, um problema generalizado no país. No
Rio Grande do Sul (RS), em 1960, a taxa de cura era muito baixa, de apenas 12,9%,
correspondendo a uma mortalidade de 92 casos/100.000 habitantes. Em estudo
realizado entre 1962 e 1966 para documentar a sensibilidade aos fármacos à época
padronizados (SM, INH e PZA), demonstrou-se 20,5% (186/906) casos de resistência
primária a pelo menos dois deles. Em outro estudo, entre 1972 e 1978, foi relatada
uma resistência primária de 8,5% (86/1017) entre os pacientes estudados.
26
A partir de 1960, o Serviço Nacional de Tuberculose aplicou várias ações
corretivas para todo o Brasil tais como a padronização do esquema terapêutico para
os casos novos; dos esquemas com “fármacos de reserva” para os casos cirúrgicos e
a modificação dos critérios para internação dos pacientes. No entanto, estas não
surtiram o efeito esperado, pois, após 6 anos, a taxa de cura nos 19 dispensários do
RS era somente 36,9%.
A partir da década de 80, a Divisão Nacional de Pneumologia Sanitária do
Ministério da Saúde (MS), adotou a padronização do esquema de curta-duração (RIP)
para o primo-tratamento da TB, e do esquema de reserva (SM; ETH; EMB; PZA) para
o retratamento das falências do RIP; e houve a progressiva organização do
Programas Estaduais de Controle. Tais medidas de controle proporcionaram bons
resultados. No estudo que compara a evolução de três décadas do século passado
nas taxas de resistência a pelo menos um fármaco em pacientes atendidos no
Instituto Clemente Ferreira em São Paulo, observou-se uma queda da década de 60
para a de 80, sendo esta menos acentuada da década de 70 para a de 80 (9,6% para
7,4%). (DALCOLMO e cols, 2007; WHO, 2008)
Já na década de 90, houve o ressurgimento do problema de resistência aos
fármacos utilizados no tratamento da TB. Tal fato foi relacionado a descentralização
dos programas de controle da TB (da esfera federal para municipal) após a reforma
sanitária. Algumas publicações, à época, sinalizaram para este problema:
Na cidade do Rio de Janeiro, estudo caso-controle realizado em 1995 -
1996 avaliou o perfil de resistência de 457 pacientes com cultura positiva
27
para M.tb atendidos em unidades básicas de saúde. Foram encontradas
taxas de resistência inicial de 10,5% e de resistência adquirida de 6,8%.
No grupo com resistência adquirida 68% tinham resistência a um
fármaco e 32% a pelo menos dois fármacos. A resistência a RMP e INH
simultaneamente foi dez vezes maior no grupo com resistência adquirida
e a resistência a R, H e mais um fármaco ocorreu em 0,9% destes casos
(15 vezes maior que entre a população com resistência inicial) (NATAL,
2002).
Estudo realizado em unidades ambulatoriais, no período de 1986 a
1992, evidenciou a possibilidade de infecção recente por cepas MR em
pacientes HIV negativos. Foram analisados 218 contatos de 64
pacientes com diagnóstico de TBMR no Rio de Janeiro, 17 (7,8%)
contatos desenvolveram TB (1,6 casos por 1000-pessoas-meses de
contato). De 13 cepas isoladas de contatos, 06 (46%) apresentaram
perfil de sensibilidade idêntico ao seu caso-índice, 04 tinham perfil com
resistência diferente e 03 (23%) eram susceptíveis a qualquer fármaco.
A TB ocorreu com maior freqüência entre homens, com idade maior que
15 anos, não brancos e sem história de vacinação com o BCG (KRITSKI
e cols, 1996).
Entre 1986 e 1990, num estudo de coorte, KRITSKI e cols.(1997) ,
avaliaram a evolução clínica de pacientes com TB em retratamento e
não infectados pelo HIV. A resposta terapêutica desfavorável esteve
associada à resistência a dois ou mais fármacos, a presença de imagem
cavitária à radiografia de tórax e ao uso irregular de medicamentos. Os
28
autores sugeriram que a história de abandono de tratamento aliado às
características clínicas e epidemiológicas pudessem orientar o médico
assistente na seleção de pacientes candidatos a terapia supervisionada.
Logo, o problema da resistência e multirresistência aos fármacos foram
reconhecidos no Brasil e algumas medidas foram tomadas visando o controle da
TBMR: a) em 1995, a Coordenação Nacional de Pneumologia Sanitária do MS passa
a reconhecer as experiências locais de instituições como o Hospital Sanatório
Partenon, de Porto Alegre; o Instituto Clemente Ferreira, de São Paulo; o Hospital
Raphael de Paula Souza, do Rio de Janeiro e o Instituto de Tisiologia e Pneumologia
da UFRJ, na assistência a pacientes com TBMR; inaugura o ambulatório de referência
estadual para o atendimento destes pacientes, localizado no CRPH e a partir de 1998,
implanta o Protocolo Multicêntrico para tratamento de casos de TBMR, objetivando
validar um regime terapêutico padronizado; b) entre 1996 e 97, desenvolve-se o I
Inquérito Nacional de Resistência dos fármacos anti-TB no Brasil com a publicação
dos resultados em 1999 num periódico brasileiro; c) nesse mesmo ano foi feito o
registro de todos os fármacos na ANVISA (MS) e estabelecidos os mecanismos de
compra sistemática e a produção da maioria dos fármacos passa a ser feita pelos
laboratórios estatais exceto a terizidona; d) em 2000, o Ministério da Saúde considera
o regime validado e se inicia a Vigilância Epidemiológica (VE) com a Notificação de
casos “em tratamento” e criado um Banco de Dados original para a VE TBMR com a
entrada de casos; e) em 2004, segue-se a implementação do Sistema de VE da
TBMR, por meio de convênio de cooperação técnica entre o MS, pelo CRPHF e o
Projeto MSH (Management Sciences of Health); f) em 2005, desenvolve-se estudo de
controle de qualidade de todos os fármacos de primeira e segunda linha utilizada na
29
tuberculose, incluindo os da TBMR, revelando resultados satisfatórios quanto à
eficácia dos mesmos; g) em 2006, inicia-se o II Inquérito Nacional de Resistência aos
fármacos anti-tuberculose, que, por meio de amostra representativa para o país,
deverá revelar o atual padrão de resistência aos medicamentos de primeira e segunda
linha, em casos ambulatoriais e hospitalares.
3.5 Inquéritos de TB resistente no Brasil.
Os inquéritos de resistência os fármacos anti-TB são feitos com o objetivo de
monitorar a eficácia do programa de controle da TB, em nível nacional, e o
planejamento de intervenções, quando necessárias.
No inquérito epidemiológico da resistência aos fármacos anti-TB realizado no
Brasil no período de 1995 a 1997, encontrou-se uma taxa de resistência primária a
pelo menos um fármaco, de 8,6 % e taxa de multirresistência primária de 0,9%
(resistência conjunta a pelo menos, RMP e INH). Entre os pacientes com história de
tratamento prévio, a resistência adquirida a algum fármaco, foi de 21,0% e
multirresistência adquirida, 7,9%. Analisando-se a resistência combinada (primária +
adquirida) observou-se 10,6% de resistência a algum fármaco e 2,2% de
multirresistência combinada. A resistência aos fármacos foi maior para a INH, tanto
em pacientes virgens de tratamento quanto nos tratados anteriormente (4,4% e 11,3%
respectivamente) perfazendo um total de 7,0% de resistência. Estes valores foram
baixos para a RMP, ou seja, a resistência primária de 1,3%, a adquirida de 6,6% e a
combinada, de 3,3%. A resistência total para os outros fármacos foi mais baixa: 0,3%
para a SM, 0,1% para o EMB e 0% para a PZA e a ETH. Na análise por regiões, taxa
30
de resistência primária mais alta foi detectada na região Norte, 10,6%, e a mais baixa
de 6,3% na região Nordeste. As taxas de resistência combinada nas regiões Centro-
Oeste, Sudeste e Sul foram, respectivamente, 9,9%, 9,3% e 9,2%. Foi concluído que
a resistência às fármacos anti-TB era baixa no Brasil; a resistência adquirida foi maior
que a resistência primária e que a taxa multirresistência primária era baixa, mas que
deveria ser monitorada (BRAGA e cols, 2003)
Os resultados de inquéritos anteriores realizados no Brasil sobre TB resistente
apresentaram grande variação nas taxas de resistência. Tais divergências podem
refletir as diferentes metodologias empregadas, sendo que, em sua maioria, os
estudos foram baseados em amostras analisadas por demanda espontânea dos
laboratórios de saúde púbica. Em um estudo publicado por Magarão e colaboradores,
em 1967, sobre a experiência do Laboratório Central de Tuberculose (de 1958 a
1966) quando então foram analisados 4361 casos, observou-se que a taxa de
resistência primária, a pelo menos a um fármaco, foi de 11,2% e que a prevalência de
resistência a INH foi de 6,0%. Em outro estudo, no período de 1986 a 1988, dentre
928 pacientes sem história de tratamento prévio foi encontrada uma taxa de
resistência primária de 15,2% a pelo menos um fármaco; e a para a INH foi 6,83% e
no total, a taxa de resistência apenas às fármacos de primeira linha (RMP e INH) foi
de 7,1%. Para a RMP em combinação com a INH, a freqüência observada foi de
0,3%. (TEIXEIRA, 1993).
Encontra-se em desenvolvimento o II Inquérito Epidemiológico da
Resistência aos medicamentos utilizados no tratamento da TB no Brasil, com o
objetivo de atualizar as taxas de resistência nesta década e determinar a taxa de
coinfecção pelo HIV entre os casos de TB. A amostra do inquérito envolve todos os
31
estados do país, pacientes virgens e em retratamento, ambulatoriais e hospitalizados.
(MS. SVS. CRPHF. Projeto MSH, 2006).
3.6 Tuberculose Multirresistente e HIV
3.6.1 No Brasil.
Em nosso meio, são escassos os estudos sobre a associação de TB resistente,
TBMR ou TB-XDR entre pacientes co-infectados por TB e HIV. No I Inquérito de
Resistência realizado em 1996, a taxa de TBMR foi inferior a 2% porém neste, não foi
incluída a avaliação do status HIV.
Em pacientes infectados por HIV, estudo realizado entre 1992 e 1994 em
culturas de 228 pacientes na cidade de São Paulo oriundos de unidades de referência
para tratamento de TB e HIV mostrou que 47 pacientes (20,6%) tinham resistência a
um ou mais fármacos, sendo que 25 deles (10,9%) tinham referência a tratamento
anterior (resistência adquirida). Somente o alcoolismo e tratamento prévio estiveram
associados de forma independente com o desenvolvimento de resistência.
Em outro estudo na cidade do Rio de Janeiro, em hospital geral de referência
para tratamento de AIDS, foi descrita uma prevalência de resistência primária de 12%,
sendo que 3% eram resistentes à INH e RMP, simultaneamente. A taxa de TBMR
inicial foi de 9,4% em pacientes co-infectados pelo HIV. Na mesma cidade, no
Hospital Universitário Pedro Ernesto foi verificado uma taxa de resistência inicial a
pelo menos um fármaco de 20% com 3% de multirresistência. Esteve associada de
forma significante com a resistência inicial a variável ser profissional de saúde
(p=0,01) (BRITO e cols., 2004).
32
Recentemente, num inquérito de resistência aos fármacos antituberculose,
realizado em 595 pacientes atendidos em seis hospitais no Estado do Rio de Janeiro,
no período de 2004 a 2006, observou-se uma elevada prevalência de TBMR primária
(3,9%) entre 433 pacientes sem histórico de tratamentos anteriores. Na análise
multivariada, hospitais especializados para TB apresentaram taxas de resistência e
multirresistência significativamente maiores que os outros hospitais (p=0,000), locais
com poucas medidas de biossegurança implantadas. Nos dois hospitais de referência
analisados, a taxa de TBMR primária foram superiores 8,8 e 22,2% (BRITO, 2007).
No Rio de Janeiro, decorridos 10 anos de implantação de um Programa de
Controle de TB num hospital geral de referência para AIDS, as taxas de TBMR
diminuíram e não se observou a associação de TBMR e HIV identificada
anteriormente. Foram analisados 350 tratamentos, 62 dos quais realizados em
pacientes com passado de TB. A sorologia para o HIV foi positiva em 31,2%. A
resistência à qualquer fármaco foi encontrada em 15,7% dos casos e a TB-MR em
4,3% dos casos. As taxas de resistência primária encontradas foram de 10,0% e 3,0%
para resistência a qualquer fármaco e TBMR respectivamente (AGUIAR, 2007).
3.6.2 No mundo.
A co-infecção TB/HIV vem mudando o panorama epidemiológico da TB e,
segundo a OMS, a TB e AIDS juntas constituem uma calamidade sem precedentes na
história. Em 2007, segundo estimativas, havia 33,2 milhões de pessoas infectadas
pelo HIV em todo o mundo e ocorreram 2,5 milhões de novas infecções em 2007. O
número de óbitos por AIDS foi de 2,1 milhões de pessoas. A região da África Sub-
Saariana concentra 68% dos casos de pessoas infectadas pelo HIV e 76% das mortes
33
são devido a essa doença (UNAIDS/WHO, 2007).
As observações epidemiológicas apontam para a suspeita de que os
pacientes com TBMR têm o mesmo potencial de transmissão e infectividade que os
pacientes de TB sensível, comprovado por pesquisas de conversão tuberculínica
(CAMINERO, 2002).
Ainda não está definido se a infecção pelo HIV é um fator de risco para TB
resistente aos fármacos, pois na maioria dos inquéritos epidemiológicos de TB
realizados em países em desenvolvimento, não tem sido priorizada a testagem anti-
HIV. Estudos conduzidos na última década na Tanzânia, Botswana, Malawi,
Mozambique, Índia, Vietnam e Rússia não confirmaram um excesso de TBMR entre
pacientes infectados pelo HIV. Entretanto, num recente inquérito nacional de TB
resistente realizado na África do Sul, observou-se maior freqüência de TBMR em
paciente infectado por HIV, porém, somente naqueles em retratamento de TB. (NUNN
e cols., 2007).
A infecção pelo HIV tem sido associada com má absorção gastro-intestinal
de medicamentos antituberculose. Em Botswana, em 91 pacientes com TB (68%
infectados pelo HIV), observou-se baixo nível sérico de RMP e INH respectivamente
em 78% e 30% dos casos, decorridos 7 dias de terapia. Infelizmente, não foi
analisada a presença ou não de TB resistente (NUNN e cols., 2007). Outros fatores
têm sido relacionados à resistência tais como intolerância medicamentosa; interação
medicamentosa prinicipalmente com antiretrovirais levando a baixa adesão ao
tratamento para TB.
Importante ressaltar que a evolução clínica dos casos com TBMR
coinfectados pelo HIV é sombria, resultando em óbito em mais de 80% destes
34
(JACOBS e cols., 1994). Fischl e cols. (1992) classificaram os infectados pelo HIV
como “pacientes muito suscetíveis” ao óbito uma vez que 50% a 80% dos casos
coinfectados por TBMR/HIV apresentaram esta evolução num período de 4 a 6
semanas entre o diagnóstico e o óbito . (FRIEDEN e cols., 1995).
Uma grande microepidemia de TBMR e TB-XDR descrita recentemente, foi
identificada em pacientes infectados pelo HIV num hospital em KwaZulu, na África do
Sul. Entre 544 pacientes com cultura positiva para M.tb, 221 (41%) albergavam cepas
resistentes a INH e RMP (cepa MR) e 53 (10%) cepas de resistentes a INH, RMP e
pelo menos três fármacos de segunda linha (cepa XDR). Entre os pacientes com TB-
XDR, a mortalidade foi de 98%, com uma mediana de 16 dias de sintomatologia.
Diferente de outras situações anteriores, a terapia HAART era disponível na
comunidade, e todos os 16 pacientes que usavam HAART e estavam infectados por
cepa XDR, foram a óbito (GANDHI e cols, 2006; BASU e cols., 2007; JASSAL&
BISHAI, 2009).
Outra epidemia relatada foi na Ucrânia, em região com alta prevalência de HIV
(21%), observou-se a associação entre TBMR e HIV e, taxa de mortalidade foi alta e
maior no grupo HIV positivo (ZIGNOL, 2008).
Nos países em desenvolvimento, existe uma elevada associação entre a co-
infecção TB/TBMR, AIDS e a desigualdade sócio-econômica, afetando então, os mais
pobres e menos favorecidos praticamente de forma seletiva. Estas doenças agravam
a pobreza por afetarem adultos em sua idade mais produtiva. A falta de acesso ao
sistema de saúde; o retardo no diagnóstico da TB resistente e multirresistente devido
a estrutura deficiente dos laboratórios para realização de cultura para M.tb e testes de
sensibilidade aos medicamentos; o curso demorado da doença; o custo da medicação
35
e os gastos com o tratamento, freqüentemente esgotam os recursos dos programas
de saúde de países pobres. Tornou-se evidente que, por meio dos relatos da OMS e
da UNAIDS ao avaliarem a epidemia global da AIDS, que existe a convergência
geográfica da infecção pelo HIV e as epidemias de TBMR. Tais dados têm
preocupado os formuladores de políticas públicas e representantes da Sociedade Civil
em nível mundial (UNAIDS/WHO, 2007; WHO, 2008).
Pelo exposto, há consenso de que é possível uma grande disseminação de
cepas MR e XDR em várias regiões, como ocorreu em diferentes hospitais e prisões
na Estonia, Rússia, Geórgia. Nestes locais, evidenciou-se elevada transmissão de
TBMR entre pacientes, profissionais de saúde, prisioneiros que foi atribuída em parte
à ausência de medidas de biossegurança (WHO, 2008).
A análise dos dados relatados na literatura mostra que microepidemias por
cepas de M. tb multirresistentes tendem a ocorrer em pacientes soropositivos para o
HIV atendidos em ambientes fechados, como prisões e hospitais e em regiões onde
as taxas de abandono de tratamento são elevadas. No intuito de auxiliar as ações de
controle de TB e HIV/ AIDS, foram propostos o uso de indicadores em Unidades de
Saúde de acordo com o grau de complexidade de atendimento primário, secundário e
terciário os quais são descritos abaixo:
% de casos notificados de TB com resultado de teste anti-HIV, entre os
casos notificados;
% de pacientes HIV/AIDS entre o total de casos notificados de TB;
% de casos com TB confirmada por cultura, do total de casos notificados
de TB em pacientes HIV/AIDS;
36
% de pacientes utilizando anti-retrovirais (ARV) associados a RMP, do
total de pacientes utilizando ARV;
% de pacientes soropositivos para HIV (HIV+) com teste tuberculínico
realizado, do total estimado de pacientes HIV+ em atendimento nos
serviços;
% de pacientes HIV+ submetidos a tratamento para TB latente, do total
de pacientes HIV+ com critério para tal.
3.7 Situação atual da tuberculose multirresistente no Brasil.
Entre outubro de 1995 a agosto de 2006, foram notificados 2372 casos de TB
resistente no país. A região sudeste concentra o maior número de casos, 62,8%
(1488) destes. Ao ser analisado o perfil demográfico, evidencia-se o predomínio da
doença no sexo masculino (68,6%) e quanto à idade média, 39,08 anos. A freqüência
de associação com a infecção pelo HIV foi de 5,2% (124 pacientes). O padrão de
resistência encontrado foi 94,3% de resistência adquirida e 5,7% de resistência
primária. Este padrão de resistência adquirida é conseqüente a tratamentos anteriores
mal conduzidos quer pelo próprio paciente quer por serviços com estrutura deficiente.
Quanto ao desfecho dos casos novos de TBMR, excluindo-se os casos de
retratamento, de recidiva e aqueles ainda sob tratamento, no período de 2000 a 2005,
observou-se a tendência de melhoria dos indicadores de cura e mortalidade, porém
observou-se que as taxas de abandono e falência permaneceram mantidas. (KRITSKI
e cols, 1997; MOORE e cols, 1997; DALCOLMO e cols, 1999; PEREIRA PINTO,
1998; NERALLA e cols, 2003; PALMERO e cols, 2003; ZIGNOL e cols, 2006:
37
NATHANSON e cols, 2006; HU, 2008; BRITO, 2008; JASSAL & BISHAI, 2009).
Foram notificados 372 casos de TBMR, em 2006, sendo que 31(8,6%) destes foram
casos de recidiva de TBMR. (Dados CRPHF, 2008).
Quanto ao prognóstico destes pacientes dois trabalhos foram publicados: um
deles de publicação recente, onde analisou as características clínicas e a evolução de
um grupo de pacientes 50 TBMR desta coorte, num período de seguimento de 8 anos
e o outro sobre os fatores associados a falência ao tratamento de TBMR no RJ. No
primeiro, após 2 anos do tratamento inicial para TBMR, houve 2 abandonos, 8
óbitos,18 curas e 22 falências. Ao final do seguimento, 2 abandonos, 9 falências,17
curas e 22 óbitos. A análise bivariada evidenciou-se que a radiografia de tórax, o
comprometimento pulmonar bilateral e lesões cavitárias reduziram a possibilidade de
cura dos pacientes com TBMR e que a maioria dos pacientes com falha no
tratamento, evoluíram para o óbito em 8 anos. (SIQUEIRA e cols, 2009). No segundo
tiveram-se como fatores associados à falência, a variável ”ter feito tratamento prévio”
e o comprometimento bilateral à radiografia de tórax. (FORTES, 2000)
Ao ser avaliada a distribuição regional dos casos de coinfecção TBMR/HIV no
Brasil no período de outubro de 1995 a agosto de 2006, nota-se não existir uma
relação direta entre TBMR e a infecção pelo HIV. No total foram 124 casos sendo 12
na região Norte, 8, na região Nordeste, 93 na Sudeste; 7, no Sul e 4 no Centro-Oeste.
À análise quanto do desfecho clínico, foi evidenciada menor taxa de cura e maior taxa
de mortalidade no grupo com coinfecção em relação ao grupo HIV negativo: cura:
47%, abandono de 11%; falência de 9% e óbito de 31 %.( MS. SVS.CRPHF, 2006).
3.8 Mycobacterium tuberculosis.
38
As micobactérias pertencem à ordem dos Actinomycetales, família das
Mycobacteriaceae e gênero Mycobacterium. A família das Mycobacteriaceae
compreende atualmente 72 espécies diferentes com algumas características
taxonômicas comuns como a presença de ácidos graxos de cadeia longa e de um
ácido desoxirribonucléico, ADN ou ARN, com alto teor em guanina e citosina e ao
serem expostas à coloração tintorial pelo Ziehl Neelsen, apresentam álcool-ácido-
resistência (PFYFFER e cols, 2003).
O complexo Mycobacterium tuberculosis é composto por oito espécies
distintas: Mycobacterium tuberculosis (M.tb) (senso estrito) que, primariamente,
infecta o homem e primatas, Mycobacterium bovis que primariamente infecta o gado
bovino e outros animais, incluindo o homem, Mycobacterium bovis Calmette-Guérin,
cepa atenuada usada para a produção da vacina BCG, Mycobacterium africanum
grupo heterogêneo responsável pela TB em humanos na África e que parece ser
intermediário entre M.tb e M. bovis; Mycobacterium microti menos freqüente e que
causa TB em aves e em humanos imunocomprometidos; Mycobacterium canetti uma
variante nova de M.tb isolada, em 1969 e em 1970, de três pacientes: um deles que
morava em Madagascar, outro em Papete e o terceiro, na França; mais recentemente
essa micobactéria foi isolada de dois outros pacientes: um deles nascido na Somália,
o outro natural da Suíça, mas que havia se contaminado na África (GOH e cols.,
2001), Mycobacterium caprae cepa isolada, inicialmente, em rebanho de cabras na
Espanha; e Mycobacterium pinnipedii espécie nova, descoberta recentemente,
patogênico para cobaias, coelhos, tapires, humanos e, possivelmente, para o gado
bovino (COUSINS e cols, 2003).
39
M.tb é uma forma de transição entre as eubactérias e os actinomicetos. É um
bacilo não formador de esporos, sem flagelos, não produtor de toxina, espécie
aeróbica estrita e intracelular facultativo, medindo de 1 a 4 ųm de comprimento por 0,3
a 0,6 ųm de largura. Seu período de geração é longo (de 16 a 20 horas) e também o
de duplicação (de 18 a 48 horas), dependendo da oferta de oxigênio, de nutrientes e
do pH do meio (PFYFFER e cols, 2003). Em estudos realizados por DAFFÉ &
ETIENNE (1999), foi demonstrado que o envelope celular micobacteriano é
constituído por três componentes estruturais: a membrana plasmática; a parede e a
cápsula. A membrana plasmática que é vital para a micobactéria, assemelha-se à
membrana bacteriana típica e desempenha um papel pequeno no processo patológico
desencadeado pela micobatéria. Esta membrana é envolvida por uma parede celular
complexa, lembrando a parede das bactérias gram-positivas, diferenciando-se destas
últimas pela presença da camada lipídica constituída, essencialmente, por ésteres
micólicos. Esta camada lipídica, provavelmente, é responsável pela barreira de
permeabilidade às moléculas polares e apresenta associações de substâncias
covalentes e não covalentes ligadas ao esqueleto da parede celular. Em princípio, a
micobactéria deveria ter um compartimento entre a membrana e o peptídeoglicano,
análogo ao espaço periplasmático presente na bactéria gram-negativa, todavia, este
espaço ainda não foi demonstrado. O outro compartimento do envelope celular é
constituído por uma mistura de polissacarídeos, proteínas e lipídios que é
impropriamente denominado “cápsula”, vez que não tem ligações não covalentes com
a parede celular Ela é chamada de “cápsula” por ser a camada mais externa do
envoltório celular.
40
Cumpre ressaltar que a descrição do envelope micobacteriano,
conceitualmente, é simples, mas na realidade sua estrutura não o é.
Experimentalmente ainda não se conseguiu uma completa distinção entre os
componentes da parede celular e os da “cápsula”. Muitas substâncias,
aparentemente, estão presentes em mais de um dos compartimentos do envelope
micobacteriano. Alguns lipídios, notadamente o fosfatidilinositol manosídeo (PIM) e o
fosfatidiletanolamina estão presentes principalmente na membrana plasmática, mas,
estes também foram demonstrados na parede celular purificada e em menor
quantidade, na superfície capsular.
O envelope micobacteriano parece ser uma estrutura dinâmica com um
contínuo fluxo de moléculas micobacterianas dentro e através dele. Evidenciou-se
uma reconstrução contínua do estável arcabouço parietal.
Foram identificadas na “cápsula”, substâncias possivelmente envolvidas em
diferentes etapas da patogenia microbiana: glicanas mediadoras da adesão e da
penetração do bacilo nas células do hospedeiro; enzimas endocelulares ou de
superfície em filtrados recentes de cultura de M.tb, provavelmente envolvidas na
multiplicação intracelular da micobactéria e na desintoxicação de elementos
intermediários do processo de oxidação, envolvidos na resistência ativa do M.tb aos
mecanismos microbicidas do hospedeiro; proteases, lipases indutoras; substâncias
líticas contato-dependentes; lipídios tóxicos que inibem a linfoproliferação e a
presença de macrófagos, explicando, em parte, a imunopatologia da TB (DAFFÉ e
ETIENNE,1999).
41
A parede celular das micobactérias é constituída por um complexo de
polissacarídeo co-valente de arabinogalactanas ligado à peptideoglicanas e ácidos
micólicos, formando uma densa camada lipídica, de elevado peso molecular, com
estrutura -alquil e β-hidroxil responsável pela formação e uma película ao redor da
micobactéria que cresce em meio líquido. Os ácidos micólicos se ramificam em longas
cadeias de ácido graxo, com 60 a 90 átomos de carbono, empacotados lado a lado,
perpendicularmente à superfície celular. Estes ácidos micólicos têm uma camada
hidrofóbica muito pouco fluida que é uma efetiva barreira à penetração de nutrientes e
antibióticos no corpo bacilar (PARSONS e cols, 1997). A alta concentração de lipídios
na parede celular confere à micobactéria sua propriedade tintorial de álcool-ácido-
resistência. O ácido micólico mais importante é o 6-6’dimicolato de trealose (TDM),
glicopeptídeo conhecido como fator corda, ligado à virulência do M.tb. (CONVERSE e
cols, 2003; KARAKOUSIS e cols, 1985).
No final da década de 90, o genoma das linhagens de M.tb H37Rv foi
seqüenciado; seu DNA é composto por 4.411.529 pares de base; contém em torno de
4.000 genes e um conteúdo de glicina e citosina de 65%. Este genoma é rico em DNA
repetitivo, particularmente em seqüências de inserção. (COLE e cols, 1998).
Posteriormente, novos trabalhos aperfeiçoaram o estudo do genoma de M.tb,
identificando a função de inúmeras proteínas. Atualmente, é possível estabelecer a
função de 2058 proteínas o que corresponde a 52% do proteoma. Cerca de 400
proteínas não mostram similaridades àquelas presentes em outros microorganismos
e, deste modo, podem ser específicas de M.tb. Aproximadamente 170 genes
codificam famílias de proteínas envolvidas em sua variação antigênica, enquanto
cerca de 200 codificam enzimas para o metabolismo de ácidos graxos. Esta
42
capacidade codificadora direcionada à produção de enzimas envolvidas no
metabolismo dos ácidos graxos parece refletir a dependência da micobactéria na
degradação de lipídeos do hospedeiro, o que, em última análise, tem o objetivo de
obter nutrientes e precursores de constituintes da sua parede. (COELHO e cols, 2006)
3.9 Mecanismos de Resistência de M. tb.
A resistência do bacilo da TB resulta de mutações espontâneas de alguns
genes que irá alterar o “alvo” de um dado fármaco anti-TB. (TELENTI, 1997;
NACHEGA & CHAISSON, 2003).
A freqüência de mutantes resistentes numa estirpe selvagem depende,
essencialmente, da sua origem, do tipo e da concentração do medicamento que foi
utilizado e, em grande parte, do número total de bacilos que colonizam o hospedeiro.
Uma caverna tuberculosa, com cerca de 2,5 cm de diâmetro, tem uma população ao
redor de 100 milhões de bacilos, antes do início do tratamento (TOMAN, 1986). Nesta
população, a prevalência estimada de mutantes resistentes a INH é de 1 para 10
6
bacilos; para a RMP, de 1 para 10
8
bacilos, e a probabilidade de desenvolvimento de
resistência às duas fármacos será determinada pela multiplicação das probabilidades
de mutantes resistentes a cada um dos fármacos (10
6
x 10
8
= 10
48
). Se probabilidade
de seleção de mutantes resistentes é pequena em relação aos fármacos isolados, ela
se torna mínima se elas forem associadas e desde que usadas de maneira correta.
(TOMAN, 1986; GRANGE, 1990; NACHEGA e cols, 2003).
3.9.1 Mecanismos de Resistência a Isoniazida.
43
A hidrazida do ácido nicotínico ou isoniazida (INH) foi descoberta em 1912,
Somente em 1951 foi reconhecida a sua potente ação contra M.tb. Seu alvo é a
parede celular da micobactéria, inibindo a síntese dos ácidos micólicos. (COLE e cols,
1994)
Os mecanismos genéticos determinantes da resistência foram descritos em
diferentes “alvos”: i) bloqueio da ativação do fármaco, relacionado ao gene katG; ii)
inativação do intermediário tóxico da INH, atividade associada com o gene ahpC e iii)
bloqueio da biossíntese do ácido micólico (inhA e mabA)
A CMI da INH para M.tb varia de 0,02 a 0,2μg/ml. A INH é oxidada pela
catalase-peroxidase micobacteriana, motivo pelo qual a ausência da catalase foi
identificada há muito tempo, como marcador da resistência a esse fármaco.
Demonstrou-se que esta relação é dependente da deleção do gene katG responsável
pela síntese da catalase-peroxidase. O códon do katG mais comprometido é o 315.
Esta mutação ocorre de 53% a 96% dos casos de resistência a INH (COLE e cols,
1994; ZHANG & YOUNG, 1994; FERRAZOLI e cols., 1995; TELENTI, 1997; VAN
SOOLINGEN e cols., 1997; VAN DOORN e cols., 2006; HOFLING e cols., 2005). Num
estudo recente, publicado em 2007, em 66 cepas da cidade de Pequim, a mutação
em katG 315 (AGC>ACC) foi encontrada em 60,6% destas; 15,2% em inhA ( 15C>T)
e a associação para ambas esteve presente em 7,6% destas. (JIAO e cols., 2007;
MOKROUSOV e cols., 2002;). Alguns trabalhos evidenciaram que a presença de
mutação no aminoácido da posição 315 está associada a um elevado nível de
resistência a INH (CMI> 2), bem como a outras resistências (kasA e ahpC).(VAN
SOOLINGEN e cols., 2001; VAN DOORN, 2003; KIM e cols., 2003) Em 2006, o
estudo publicado de Van Doorn et al mostrou dentre 8332 cepas de M.tb, no período
44
de 1993 a 2002, 592 (7,1%) apresentaram resistência a INH e dentre estes,
prevalência da mutação no códon 315 katG foi de 54,6% (323/592). Evidenciou-se
também ao DNA fingerprinting (RFLP) que estes eram clusters sugerindo transmissão
recente tal como nas cepas suscetíveis a INH e que estes estavam também
associados a elevada resistência a INH. Num estudo recente realizado em 03 países
da América do Sul, dentre 224 cepas analisadas resistentes a INH, 181 (80.8%)
apresentaram mutação em katG cujos respectivos valores percentuais foram 81,3%
no Brasil; 82,4% no Peru e 71,4% na Argentina o que parece indicar não ter diferença
na frequência desta mutação entre os 03 países da América do Sul. Dentre os 181
cepas com mutação em katG, 178 a apresentavam no códon 315 com as seguintes
mutações pontuais: AGC→ACC, em 166(74,1%); AGC(S) → AAC(N) em 9 (5%) e
AGC(S) → ACG (L) em 3 (1,7%). (DALLA COSTA e cols, 2009). Outros estudos
anteriores mostraram também que mutação predominante em katG encontra-se no
ponto de mutação AGC→ACC (S315T). Três estudos foram realizados na Europa, em
cepas resistentes a INH nos quais as mutações no codon katG foram bem
caracterizadas: dentre 68 com estas ,62 (91%) apresentavam mutação AGC→ACC
(S315T); 4 (6%), AGC →AAC (S315N) e 02 (3%), AGC→ACA (S315T). Outras
mutações mais raras foram descritas na África: AGC→ATC (S315I) e AGC→CGC
(S315R).(VAN DOORN e cols., 2006). Parte do sucesso das cepas de M. tb com
mutação no códon 315 é, provavelmente, causada pelo fato da catalase peroxidase
estar ainda ativa nesses mutantes. Na verdade, de 30% a 40% da atividade da
catalase permanece presente, mesmo quando essa mutação acontece no katG
(ROUSE e cols., 1996). Vários estudos apontaram para que a ausência da catalase
esteja mais frequentemente associada a cepas de M.tb com alto nível de resistência a
INH. (WOLINSKY e cols., 1956; HEDGECOK e cols., 1957; RASTOGI e cols., 1993;
45
FERRAZOLI e cols., 2000; ZHANG, 2005;) Mutações no códon 463 do gene KatG
foram implicadas com o desenvolvimento de resistência, porém também foram
encontradas em cepas sensíveis (VAN DOORN e cols., 2001).
Em presença da catalase-peroxidase a INH é metabolizada em seu
componente ativo inibidor da enzima enoyl-ACP redutase. A enoyl-ACP redutase,
sintetizada pelo inhA, esta envolvida na síntese dos ácidos micólicos. A mutação no
gene promotor inhA é o segundo tipo mais freqüente encontrado, após a do katG.
Mutações no gene inhA são responsáveis por, aproximadamente, 25% (de 10 a 34%)
dos cepas clínicos resistentes à INH. (MUSSER e cols., 1995; ROUSE e cols., 1995;
TELENTI, 1997). A superexpressão do gene inhA incrementa a produção da enoyl-
ACP redutase,neutraliza a ação inibitória do INH, permitindo a síntese dos ácidos
micólicos. (COLE e cols., 1994; TELENTI, 1997). No Brasil, Silva e cols (2003) ao
avaliarem cepas da região sul e sudeste encontraram 14,4% de mutações em inhA
em cepas resistentes a INH.(KIEPIELA e cols., 2000; KIM e cols., 2003.)
A forma ativa da INH é destoxificada pela enzima alcalil-hidroperóxido
redutase, sintetizada pelo gene ahpC. Em algumas bactérias este gene é controlado
pelo gene oxyR, responsável pela regulação da resposta ao stress oxidativo.
Entretanto, em M.tb este gene oxyR encontra-se totalmente destroçado, motivo pelo
qual se questiona se, nesta situação, o gene ahpC é capaz de destoxificar o
metabólito ativo da INH. Encontram-se mutações em 10 a 15% das cepas com
resistência a INH, interpretando-se esse achado como marcador de mutações e/ou
deleção do gene katG, cujo papel ainda não está claramente estabelecido.
Mecanismos ainda desconhecidos podem ser responsáveis por, pelo menos, 10% da
resistência a INH (TELENTI, 1997; SRIVATSAN e cols., 1997).
46
Em 2003, Nachega descreveu o gene kasA que sintetiza o carreador de
proteína ketoacil sintase, atuante na biossíntese dos ácidos micólicos da parede do
M.tb (NACHEGA & CHAISSON, 2003). Mutações encontradas no kasA poderiam ser
responsável pela resistência do Mtb à INH. Cardoso e cols. (2004), ao estudar as
mutações para katG, kasA, inhA, oxyR-ahpC em cepas resistentes e sensíveis a INH
em 2 estados brasileiros, evidenciaram mutações em kasA tanto em cepas resistentes
como nas sensíveis. A mutação mais freqüente foi G(269)A. Outro trabalho publicado
também apontou a presença de mutação em kasA em cepas sensíveis a INH.
(HAZBON e cols, 2005)
Outros estudos foram publicados envolvendo a mutação no gene ndh com a
resistência a INH. O mecanismo de resistência postulado foi que a mutação neste
gene acarretaria uma diminuição na oxidação na NADH e com isto haveria uma
alteração na proporção NADH/NAD+ que é importante para a ativação da INH.
Posteriormente este gene foi seqüenciado e foi identificado 2 mutações
distintas.(CHEN & BISHAI, 1998; MIESEL e cols., 1998; LEE e cols., 2001). Cardoso
e cols (2007) ao estudarem 23 cepas de M.tb resistentes a INH, encontraram mutação
no gene ndh, em 2. Uma delas, com alto nível de resistência a INH (INH MIC>
32μg/ml), apresentavam mutação no códon 13(CGT para TGT) e a outra mutação no
códon 18 (GTG para GCG). Outros 2 cepas de M.tb não foi encontrada nenhuma
mutação sugerindo que possa haver a existência de um outro mecanismo de
resistência ainda não descrito.
Num estudo, em larga escala, onde foram analisadas 240 alelos previamente
associados com resistência a INH num universo de 608 cepas de M.tb suscetíveis e
403 resistentes, encontrou-se que as mutações em katG; ahpC e inhA estavam
47
fortemente associadas a resistência a INH enquanto que kasA, a suscetibilidade a
INH. Ressaltou-se uma diferença na distribuição das mutações entre as cepas com
monoresistência e aqueles com multirresistência. As mutações em katG foram mais
freqüentes nas cepas de M.tb com multirresistência. As mutações em inhA foram
significantes na associação com as cepas de M.tb com monorresistência. Neste
trabalho, foi testada a interação entre as mutações e a resistência a outros fármacos.
As mutações encontradas em katG, ahpC,inhA foram associadas a resistência a RMP
mas mutações no ndh e katG 15 estavam associadas a resistência a EMB. Foi
encontrada uma significante associação inversa entre katG 315 e as mutações em
ahpC ou inhA; e, entre kasA e ahpC. Os autores sugerem que a resistência a INH e a
evolução das cepas MR é um processo dinâmico, complexo que pode ser influenciado
pela interação entre os genes e os fenótipos de resistência aos fármacos. (HAZBON e
cols., 2005)
Na área de S. Petersburg na Rússia, Martilla e cols. (1998) ao analisarem
cepas resistentes a INH por meio de técnicas de seqüenciamento e RFLP
encontraram 91,7% das mutações no gene katG códon 315. Na África do Sul, Kiepiela
e cols. (2000) observaram 97,5% de mutações no gene katG, 24 % no gene inhA e
12,6% no gene ahpC. Em um estudo realizado na Escócia, em 10 cepas de M. tb MR,
um (1) isolado não apresentou mutação em nenhum dos três genes estudados para
resistência a INH (katG, inhA e ahpC), sugerindo mutação em outra região.
Estudos realizados no Laboratório de Saúde Pública do RS demonstraram que
a maioria (84,5%) das mutações encontradas nos bacilos resistentes a INH, de
diversas regiões do Brasil, ocorreram no gene katG; 15,5% na região promotora do
48
gene ahpC; 14,4% no gene inhA e , em 8,4% mutações simulâneas nos genes katG e
ahpC. (SILVA e cols., 2003).
Recentemente, Dalla Costa (2008) analisou 249 cepas de MTB resistentes a
isoniazida, oriundos de três países da América do Sul. Foi avaliada a freqüência de
mutações nos genes katG, ahpC e inhA região regulatória e estrutural, e sua relação
com as determinações in vitro de CMI e diferentes genótipos. Mutações no gene katG
foram observadas em 184 (73,9%) das cepas, sendo que 181 (72,7%) apresentaram
mutação no codon 315. Também foram encontrados 21 (8,4%) cepas com mutações
em oxyR-ahpC; 30 (12,0%) no inhA regulamentar e 3 (1,2%) cepas em inhA. Entre os
153 cepas com CMI ≥ 2,0 μg/mL, 127 (83,0%) tiveram mutação no codon 315 (p =
0,009). Mutações no codon 315 foram significativamente mais freqüentes em cepas
pertencentes à família Haarlem, quando comparados com outros genótipos [35
(89,7%) Haarlem isoladas, 81 (70,4%) LAM, 21 (59,6%) T] (p=0,009). A autora sugere
que a realização de uma triagem nas amostras clínicas de pacientes suspeitos de TB
resistente para detecção da presença da mutação S315T poderia ser útil na América
do Sul. Esta conduta poderia estabelecer uma terapêutica anti-tuberculose adequada,
monitorar o padrão de resistência medicamentosa e, eventualmente, e ser utilizado
como um marcador de maior transmissibilidade de cepas de MTB resistentes.
3.9.2 Mecanismos de Resistência a RMP.
A rifampicina é um derivado do 3,4-(metilpiperazinil-iminometilidine)- rifamicina
SV com ação bactericida potente contra M. tb que após 1972 passou a ser integrante
do esquema terapêutico de eleição para TB. (LAL & LAL, 1994). O CMI de
concentração da RMP varia de 5 a 10 μg/ml.
49
Vários estudos foram realizados sobre o mecanismo de ação e de resistência a
este fármaco. Foram utilizados inicialmente como modelo, a Escheria coli (E.coli) e M.
smegmatis. Em ambos, evidenciou-se que a RMP liga-se a subunidade β da RNA
polimerase (RNAP) resultando na inibição da transcrição (McCLURE & CECH, 1978;
GALE e cols., 1981; LEVIN & HATFULL, 1993). Segundo Lal & Lal (1994), a inibição
se dá através do bloqueio estérico da translocação da extremidade 5′ do RNA
existente impedindo a translocação do nucleotídio e conseqüentemente a síntese do
RNA. Chertov e cols. (1998) investigaram o modo exato de ação da RMP por meio do
estudo da ligação deste fármaco na RNAP de linhagens sensíveis e resistentes de E.
coli. Foi verificado que o RNA tem sítios análogos para a RMP: os grupos hidroxilas
no C12 e C23 da RMP, essenciais para a atividade antibiótica do fármaco, coincidem
com os grupos hidroxilas 3′e 5′ da ribose do dinucleotídeo. Foi observado também que
o resíduo do ácido aspártico¹6 na enzima RNAP faz uma ligação de um hidrogênio
com a hidroxila C23 da RMP e que na linhagem resistente da E. coli à RMP, onde foi
feita uma substituição do resíduo do ácido aspártico pela valina, a ligação da RMP foi
diminuída ou eliminada.
A reconstituição experimental com as subunidades em linhagens de
Escherichia coli demonstrou que a RNAP que contém as subunidades α e β′ de
linhagens sensíveis e a subunidade β de linhagens resistentes é resistente à RMP e a
RNAP que contém as subunidades α e β′ de v resistentes e a subunidade β de
linhagens sensíveis é sensível à RMP.
Com base nas descobertas acima, buscou-se caracterizar o gene rpoB de M.tb
Telenti e cols., (1993) foram os primeiros a demonstrar que a resistência a RMP
desenvolvida por M.tb está relacionada com trocas, principalmente a substituição de
50
aminoácidos, em uma região do gene rpoB. Eles desenvolveram um teste rápido para
detecção da resistência a RMP, onde mutações foram detectadas pela técnica de
ampliação pela Reação da Cadeia de Polimerase (PCR) de uma região de 157 pares
de bases e com o uso subseqüente da técnica de Single Strand Conformational
Polymorphism (SSCP).
Willians e cols., (1994) desenvolveram um método rápido, baseado no
sequenciamento de um produto de PCR de 305 pares de base (pb), com a região
amplificada localizada no gene rpoB. Foram analisadas 110 linhagens de M.tb
resistentes a RMP, onde foram encontrados 16 tipos diferentes de mutação. Dentre
estes, nove foram idênticos àqueles descritos por Telenti e cols.
Outros estudos foram realizados e os resultados compilados indicaram que
entre 329 cepas de M.tb resistentes a RMP cepas de pacientes não relacionados
epidemiologicamente, em 315 (96%) delas foram identificadas 35 diferentes pontos de
mutações, pequenas deleções ou inserções, localizados na região central de 81 pares
de base no gene rpoB, entre os códons 507 a 533, codificantes de 27 aminoácidos.
(MUSSER e cols., 1995; TELENTI e cols., 1993; HEYM e cols., 1994; WILLIAN e
cols., 1994; KAPUR e cols., 1995 AHMAD e cols., 2000; MANI e cols., 2001;
SIDDIQUI e cols., 2002; TRAVESKA e cols., 2002). O mecanismo de resistência não
foi identificado em 4% das cepas clínicos resistentes a RMP apesar de ter sido
seqüenciado todo o gene rpoB.
No Brasil, Valim e cols. (2000), analisaram a região de 157 pb no gene rpoB em
112 cepas de M. tb resistentes a RMP, provenientes de diferentes estados do Brasil.
Foram descritas 22 mutações diferentes, das quais 6 não tinham sido descritas
51
anteriormente. As mutações mais freqüentes ocorreram nos códons 531, 526 e 516.
Miranda e cols., (2001) encontraram o mesmo perfil (52,9%, no códon 531; 14,7%, no
526 e 11,8% , no 513).
Caws e cols., (2006), no Vietnam, as mutações mais prevalentes foram as
mesmas descritas acima; em 4 cepas não foi encontrada nenhuma mutação e foram
também identificadas 2 inserções raras, 541F e 521SGL e a mutação V146F na
região N- terminal também foi encontrada. Outros trabalhos também apontaram para
mutações e inserções incomuns. (HEEP e cols., 2001; ZHANG e cols., 2000;
HERRERA e cols., 1996; AHMAD e cols., 2005)
Numa revisão de diversos trabalhos publicados no mundo e no Brasil, foi
possível listar o perfil das mutações descritas no gene rpoB em cepas de M tb. (
SENNA e cols., 2006).
Telenti, em 1997, sinalizou a possibilidade de haver uma relação entre
mutações encontradas em determinados códons do gene rpoB e o nível de resistência
a RMP. Posteriormente, outros trabalhos foram publicados corroborando com Telenti
e os códons 531 e 526 foram relacionados com alto nível de resistência a RMP.
(MOGHAZEH e cols., 1996; OHNO e cols., 1997). Somoskovi e cols., (2006)
descreveram que alterações nos códons 511, 516, 518 e 522 resultavam em cepas de
M.tb com baixo nível de resistência a RMP.
Srivastava e cols., 2004, avaliaram o método do Inno-LiPA considerando a
relação entre a detecção de mutação para rpoB e os níveis de resistência a RMP e
constataram que algumas mutações foram encontradas mas que apresentavam baixo
nível de resistência a RMP e portanto, sem significância clínica.
52
3.10 Fator Corda.
Em 1947, Middlebrook, Dubois e Pierce em estudos in vitro sobre a
patogenicidade de M.tb, apontaram a “formação em corda” da micobactéria, cultivada
em meio líquido, como um indicador de sua patogenicidade. Posteriormente outros
pesquisadores como Roth (1949) e Bloch (1950) corroboraram essa conclusão.
Todavia Bloch, em 1949, constatou que o bacilo da TB ao ser exposto ao éter de
petróleo, perdia a sua capacidade de “formação em corda”, mantendo sua viabilidade
e patogenicidade. Mais tarde, foi evidenciada a mesma “formação em corda” em
cepas saprófitas e ou não letais de M.tb. Köebel, em 1951, e Engbaek, em 1952,
fotografaram a “formação em corda” em cepa do BCG. Darzins e Fahr (1958)
estudaram a relação da patogenicidade, em cobaias, com a “formação em corda” de
245 cepas de M.tb cultivadas em meio líquido; concluindo que havia boa relação entre
elas: 192 cepas patogênicas apresentaram “formação em corda” e 40 cepas
saprófitas não a apresentaram. Contudo, nas restantes 13 cepas não houve essa
mesma relação.
Lorain, em 1966, estudando comparativamente a velocidade de crescimento e
o tipo morfológico das colônias de M.tb no meio 7H10 e no 7H10 ao qual foi
adicionado o detergente WR 1.339, obteve como resultado, no meio 7H10 + WR
1339, em 12 dias, um incremento de 50% no tempo de detecção de M.tb, e a
presença de formação em cordas típicas de M.tb, visíveis diretamente no meio de
cultura. Em 1969, o mesmo autor, ao analisar 2.981 espécimes clínicas semeadas em
“Direct Cord Reading Agar” encontrou 16% de culturas positivas, destas, 312 de M.tb
e 18 de micobactérias não TB. Dentre as culturas de M.tb, 90,8% apresentaram
“formação em cordas” enquanto que as micobactérias não tuberculosas não a
53
apresentaram, que o levou à conclusão de que a presença da “formação em corda”
teria valor preditivo positivo para a presença de M. tb,e que deveria ser confirmada
por métodos validados. Na década de 90, os estudos sobre o fator corda foram
retomados com o objetivo de possibilitar um método rápido e presuntivo para a
identificação do complexo M.tb. Yagusky e cols. (1990) avaliaram, por meio de três
observadores diferentes, a presença da “formação em corda” no meio líquido
BACTEC 7H12: o fator corda foi identificado, respectivamente, em 93,2%, 88,6% e
83,0% das culturas positivas para o complexo M.tb, na conclusão de cada um dos
observadores; e a ausência desse fator, respectivamente, em 97,3%, 97,8% e 99,5%
das culturas positivas para micobactérias não TB. A concordância entre os
observadores foi de 93,3%. Utilizando a mesma técnica, Morris & Reller, em 1993,
encontraram nela uma baixa sensibilidade (22,9%), porém uma alta especificidade
(98,5%), razão pela qual recomendaram a realização de novas investigações a fim de
que fosse avaliada a sua confiabilidade. Para Bádak e cols (1999), a formação em
corda no meio MB/BacT, em local de prevalência alta para TB, seria um critério rápido
e presuntivo de identificação do complexo M.tb, desde que avaliado por um técnico
experiente. Köksalan e cols., em 2002, utilizando o mesmo método, porém com o
meio BACTEC 12B/13A, encontraram uma sensibilidade de 92,7% e uma
especificidade de 95,3% este método em meio BACTEC 12B/13A, confirmando os
trabalhos anteriores, assinalando que o tempo de incubação tem um papel efetivo no
resultado e não deveria ser menor do que quatro dias.
Em 2000, Caviedes e cols., apresentaram um novo método denominado
“Microscopic Observation broth-Drug Susceptible assay” (MODS), baseado, também,
na observação do crescimento característico da “formação em corda”. Este método,
54
além de rápido e barato, mostrou-se confiável para a detecção de M.tb, com uma
sensibilidade de 92%, próxima à do método MGIT utilizado concomitantemente e cuja
sensibilidade fora de 93%. Em nosso meio, Marsico (2004) avaliou a sensibilidade e a
especificidade deste método em amostras respiratórias de pacientes com suspeita de
TB pulmonar. Obteve como resultados, sensibilidade de 99,2%, especificidade de
93,3%; e o tempo médio de detecção foi cerca de três vezes menor (8,1 ± 5,8 dias)
que o tempo obtido no LJ (22,9 ± 5 dias) Diante destes resultados, a autora sugere
que o seja implantado na rotina dos laboratórios de Micobacteriologia dos países em
desenvolvimento. Em 2005, um estudo multicêntrico (Brasil e Honduras), prospectivo,
comparativo entre o método MODS e LJ para detecção de M.tb analisou 1639
amostras respiratórias de 854 pacientes. A sensibilidade do MODS foi 97,5% e a do
LJ, 98,9%. A especificidade do método MODS foi 95,1% e os valores preditivos
positivo e negativo foram, respectivamente, 93,6% e 98,1%. O tempo de detecção por
este método foi menor (7 dias versus 21 dias). Em relação à contaminação das
amostras, esta foi menor no método MODS do que no LJ (3,6% versus 5,8%, p <
0,0001).(Arias e cols, 2007). Em 2007, foi realizado um estudo na Etiópia, analisando
262 amostras respiratórias positivas de pacientes com TB. Quanto ao resultado das
culturas, pelo método MODS, foi detectada a formação de corda em 254 amostras
(96,9%) e pelo LJ, 247 (94,3%) (p=0,0016) (SHIFERAW e cols, 2007). Recentemente,
Moore e cols., investigaram a acurácia do MODS para detecção de M.tb
comparativamente ao MP e a um método de cultura automatizada, MB/Bact. Foram
analisadas 3760 amostras respiratórias e 401(10,7%) foram positivas para M.tb. A
sensibilidade foi 97,8% para o MODS; 89% para o método de cultura automatizada e
84% para a cultura em LJ (p<0,001). O tempo médio para a positividade a cultura foi
7,13 e 26 dias, respectivamente. Segundo os autores, o incremento diagnóstico com a
55
realização da segunda cultura pelo MODS foi mínimo (8,2%) prinicipalmente em
pacientes com alto risco de TB ou TBMR. O índice de contaminação foi menor na
técnica MODS (0,2%). As culturas com resultados discordantes foram analisadas por
meio de investigação epidemiológica; microbiológica e molecular. Foi possível
identificar em 17 culturas com contaminação cruzada (12 MODS; 4 culturas
automatizadas e 1 cultura pelo MP). (MOORE e cols., 2006). Os resultados obtidos
neste trabalho complementaram 2 publicações anteriores realizados no Peru onde um
dos quais mostrou que a sensibilidade encontrada pelo MODS havia sido igual a outro
método de cultura automatizada, o MGIT é melhor que a cultura em placa de Agar.
(CAVIEDES e cols., 2000; MOORE e cols., 2004). A dificuldade apontada para a
utilização deste método em condições de rotina, em países em desenvolvimento, é a
biossegurança. (ISEMAN e cols., 2006).
3.11 Métodos Disponíveis para a Detecção da Resistência de
M.Tuberculosis aos Fármacos Utilizados para o Tratamento da Tuberculose e
Estudos Comparativos.
Os testes laboratoriais para a detecção da resistência de M.tb às fármacos
utilizadas para o tratamento da TB, são importantes por três motivos:
a) Eles podem orientar o tratamento dos indivíduos considerados “de risco”
de albergarem cepas resistentes ás fármacos: pacientes com história de tratamento
anterior seguido de abandono ou uso irregular, contatos de TBMR, população de rua,
presidiários, pacientes confinados em hospitais psiquiátricos.
b) Para confirmar a resistência aos fármacos e orientar a terapêutica nos
casos de falência de tratamento de TB instituído.
56
c) Nos inquéritos de resistência para estimar a prevalência da resistência
primária e adquirida na comunidade (CANETTI e cols., 1963)
O estudo de sensibilidade de M.tb aos medicamentos pode ser realizado
por dois métodos: o fenotípico e o genotípico.
3.11.1 O MÉTODO FENOTÍPICO
O método fenotípico baseia-se no crescimento da micobactéria na presença de
uma concentração crítica dos fármacos anti-TB. (HEIFETS, 2000)
3.11.1.1 O MÉTODO DAS PROPORÇÕES.
O MP, padronizado por Canetti e Grosset na década de 60 do século passado,
utiliza o meio de LJ e baseia-se na determinação da concentração mínima de
medicamento anti-Tb capaz de inibir o crescimento de bacilos que lhes forem
sensíveis (CMI). O método é recomendado para os paises em desenvolvimento por
seu baixo custo e simplicidade, a despeito do inconveniente de exigir 42 dias para a
sua conclusão. (CAMINERO, 2002). O teste de sensibilidade direto pode ser realizado
quando a baciloscopia do material biológico for positiva e consiste na inoculação
desse material no meio de cultura contendo diferentes concentrações do fármaco anti-
TB a ser testada; o teste indireto é feito a partir de uma cultura positiva para M. tb. O
método das proporções é considerado padrão-ouro para os testes de sensibilidade de
M.tb.
3.11.1.2 O MÉTODO BACTEC 460.
57
Trabalhos anteriores, na década de 80, mostraram boa concordância deste
método, para a detecção de resistência as fármacos de primeira linha em relação aos
métodos convencionais tanto LJ como Middlebrook 7H10.(SIDDIQI e cols., 1981;
LASZLO e cols., 1983; SIDDIQI e cols., 1985). Após, a padronização da concentração
dos fármacos de primeira linha a ser utilizado por este método, o BACTEC 460 foi
validado e utilizado amplamente, com uma redução importante no tempo de detecção
da resistência aos fármacos anti-TB (7 a 14 dias). A validação do método BACTEC
460, para determinação do perfil de sensibilidade aos fármacos de segunda linha
(capreomicina, ciclosserina, etionamida, kanamicina) e aos novos fármacos
(amicacina, clofazimina, ofloxacina, rifabutina) foi realizada por meio de estudo
multicêntrico que incluiu EUA, Canadá e diversos países na Europa. Obteve-se uma
ótima correlação entre este método e o MP, Middlebrook 7H10, após ter sido
estabelecida a concentração crítica equivalente destes fármacos entre o meio sólido e
o líquido; com exceção da ciclosserina. (PFYFFER e cols., 1999). BACTEC 460 é um
método semi-automatizado rápido, mas que apresenta como inconveniente utilizar
material radioativo e ser de alto custo.
3.11.1.3 O MÉTODO MGIT
Telles e cols. (2002), em um estudo realizado no Brasil, compararam o MGIT
com dois outros métodos convencionais, o das proporções e o da “resistance ratio”. O
estudo incluía cepas de M.tb sensíveis e resistentes a INH e a RMP isoladas de
pacientes atendidos em Unidades de Referência em São Paulo. Observou-se boa
concordância (96%) do MGIT960 com os dois métodos empregados; com resultados,
em média, em seis dias. Macondo e cols.(2000) encontraram, num estudo
comparativo com o MP, LJ e Middllebrook 7H10, uma concordância de 100% para
58
RMP e para INH, em cepas clínicas no Senegal com o mesmo tempo médio de
detecção. Ardito e cols. (2000), comparando o MGIT com o BACTEC 460 TB,
encontraram o perfil de sensibilidade idêntico para os dois métodos, porém com
tempo médio de detecção diferente (MGIT, 5,38 dias x BACTEC, 7,33 dias). Em
estudo realizado no laboratório nacional de referência na Bélgica, foi encontrada uma
boa correlação com o LJ, ao se analisar individualmente os fármacos: quanto a
especificidade, 100% para INH, RMP; etambutol (EMB) e 92% para a estreptomicina
(SM); e, quanto a sensibilidade, 100%, 98%, 96,1% e 91%, respectivamente.
(PALOMINO e cols., 1999).
Em vários estudos observou-se uma boa concordância na determinação da
suscetibilidade de M.tb aos fármacos, entre o método BM960 e o padrão-ouro
adotado, seja o método das proporções ou o BACTEC 460, apresentando tempo
médio de detecção de sete dias. (REISNER e cols., 1995; RUSCH-GERDES e cols.,
1999; BERGMANN e cols., 2000; BEMER e cols., 2004; SCARPARO e cols., 2003;
KONTOS e cols., 2000; ARDITO e cols., 2000; HUANG e cols., 2002.; JOHANSEN e
cols., 2004 ).
Em nosso meio, Giampaglia e cols (2007), compararam a performance do
MGIT960 e os três métodos considerados padrão ouro para o diagnóstico de TB
resistente: a) Método de Proporções, b) Bactec 460, e c) Razão da resistência. A
concordância entre MGIT960 e MP foi de 91,6% para EMB, 94,7% para SM e 100%
para RIF e INH. A comparação entre MGIT960 e razão da resistência mostrou
concordância de 93,4% para RIF e INH e 97,9% para EMB. Em relação ao Bactec
460, o MGIT960 mostrou concordância de 100% para RIF e INH, 88,4% para EMB e
92,7% para SM.
59
O MGIT 960 foi validado recentemente e aprovado pela ANVISA para os
seguintes fármacos: estreptomicina, isoniazida, rifampicina e etambutol. O FDA já o
aprovou também para a pirazinamida.
3.11.1.4 O MÉTODO MB/BacT.
Método ainda não validado embora seus resultados sejam promissores. Ao ser
comparado ao MP, evidenciou-se uma concordância de 100% para as cepas
sensíveis e resistentes a rifampicina e a isoniazida, e para as cepas sensíveis à
estreptomicina. A concordância para as cepas resistentes à estreptomicina e ao
etambutol foi, respectivamente, de 96,4% e 90,4%. Em média, os resultados foram
obtidos em 7 dias (DIAZ-INFANTES, 2000). Em nosso meio, 50 espécimes clínicos
foram avaliados, com positividade a baciloscopia e indicação de teste de
sensibilidade, em condições de rotina do laboratório. O estudo foi feito, de forma
comparativa entre o método MB/BacT direto e o BACTEC 460TB (padrão-ouro), para
os fármacos RMP, INH, PZA, EMB e ETH. Os resultados foram ótimos para a RMP,
100% de sensibilidade e especificidade, seguida pela INH e o PZA; sem apresentar
contaminação em nenhum dos testes. (BARRETO e cols., 2002). Outro estudo,
conduzido pelo mesmo grupo, em 117 pacientes, avaliou-se o teste indireto de
susceptilidade para os novos fármacos, ofloxacina, amicacina e rifabutina assim como
para as fármacos padronizadas para tratamento de TB, com bons resultados:
sensibilidade, 100% para a amicacina (AMICA); RMP e ofloxacina (OFLOXA) e
especificidade, 100% para AMICA; RMP e OFLOXA quando comparado ao BACTEC.
Ao ser comparado ao LJ, a sensibilidade encontrada foi: 100% para RMP seguida da
INH, 95%; EMB, 94,7% e especificidade, 100% para todos os fármacos testados
exceto para a pirazinamida (PZA), que foi de 98,3%. (BARRETO e cols., 2003)
60
3.11.1.5 O MÉTODO ESP II.
Bergman e Wood (1998) avaliaram a confiabilidade deste método para estimar
a sensibilidade das cepas de M.tb à estreptomicina, isoniazida, rifampicina e
etambutol, usando como padrão ouro, o MP. Concluíram que o ESP II é um bom
método para a detecção da resistência a rifampicina e a isoniazida; porém não em
relação ao etambutol e à estreptomicina, recomendando que testes adicionais fossem
feitos para a avaliação acurada da resistência microbiana a esses fármacos.
3.11.1.6 MODS
Microscopic Observation Broth Drug Susceptibity Assay (MODS) é um método
rápido, simples e barato que permite a realização dos testes de sensibilidade a
rifampicina e a isoniazida; porém, ele ainda não foi validado. Baseia-se numa
metodologia manual realizada em meio líquido a base de ágar (7H9) em microplacas,
que após 10 dias podem ser observadas no microscópio com luz invertida com filtro
para campo escuro para visualizar o fator corda formado pela micobactéria.
Caviedes e cols., (2000) em estudo comparativo entre MABA e o MODS, em 88
amostras positivas para M.tb obtiveram uma concordância de 89%.
Em 2002, Park e cols comparando este método com o das proporções em ágar
7H10, com 53 amostras positivas para M.tb de pacientes com suspeita de
multirresistência, encontraram uma concordância de 100% entre os dois métodos em
leitura feita no 11º dia de incubação. Este método parece ser promissor, entretanto,
necessitaria ser testado em um maior número de amostras, para validação quanto à
sua confiabilidade.
61
Em um estudo comparativo entre o método MODS e LJ, foi avaliada a detecção
de resistência a INH e a RMP, em 188 pacientes com pelo menos um fator de risco à
resistência. A detecção de resistência a INH foi avaliada com os seguintes resultados:
sensibilidade, 97,2%; especificidade, 89,0%; valores preditivos positivo de 92,0% e
negativo de 96,1%. Quanto à detecção de resistência a RMP, os valores de
sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos foram,
respectivamente, 96,4%, 86,5%, 85,3%, 96,8%. (MOORE e cols., 2004). O MODS
demonstrou ser útil para triagem na detecção de resistência a RMP e a INH. Dados
similares foram observados por Mello e cols em nosso meio (2007). Estes autores
avaliaram a “performance” da técnica MODS para o diagnóstico de TB resistente em
pacientes suspeitos atendidos em Unidade de Saúde no Brasil e Hoduras,
comparando com método de proporções. Para o diagnóstico de resistência a INH,
MODS apresentou uma sensibilidade de 96,7%, especificidade de 78,4% e valores
preditivos positive e negativo de 82,4% e 95,8% respectivamente. Para o diagnóstico
de resistência a RMP, MODS apresentou uma sensibilidade de 96,0%, especificidade
de 82,9% e valores preditivos positivo e negativo, respectivamente, 80,0% e 96, 7%.
(Mello e cols., 2007). Os autores consideraram neste trabalho, os valores preditivos
embora estes não deveriam ter sido utilizados para análise uma vez que estes são
diretamente relacionados com a prevalência local do agravo.
Moore e cols., (2006) mostraram em sua publicação, uma ótima concordância
para detecção de resistência entre o MODS; o MB/Bact e o Método das Proporções:
100% para RMP; 97% para INH; 99% para RMP e INH; 95% para EMB e 92% para
SM com os seguintes valores respectivos de kappa, 1,0; 0,89; 0,93; 0,71 e 0,72. A
62
resistência a INH foi detectada em 19,5% das 349 culturas positivas para M.tb; 10,7%
para RMP; 10,4% para INH e RMP; 10,1% para o EMB e 21,4% para SM.
Bons resultados também foram descritos por Shifferaw e cols., em 2007, pois,
ao conduzirem um estudo comparativo entre o MODS e LJ para detecção de
resistência associada a INH e a RMP, os autores observaram uma sensibilidade de
92%, especificidade de 99,5% e uma acurácia de 98,8%. (concordância de 98,8%;
valor de kappa, 0,932).
3.11.1.7 MÉTODOS COLORIMÉTRICOS
Os métodos colorimétricos são simples, de leitura visual e que podem ser
praticados em laboratórios com recursos técnicos limitados; contudo, a sua
reprodutibilidade ainda não foi avaliada em diferentes laboratórios de países em
desenvolvimento. Existem vários métodos colorimétricos como o de Indicador de Oxi-
Redução do Alamar Blue (MABA); o Método 3-(4,5 dimetiltiazol 2-yl) 2,5-difenil
Brometo de Tetrazolio (MTT); e sua variante, o Método Tetrazolium Microplate Assay
(TEMA) e o de Redução da Nitratase (NRA). Vários estudos sobre o MABA e o NRA
foram publicados demonstrando boa concordância com o Método das Proporções não
somente para RMP e INH como também para o EMB e SM. (YAJKO e cols.,1995;
PALOMINO & PORTAELS, 1999; MSHANA, 1998; SETHI e cols., 2004; MARTIN e
cols., 2005; MONTORO e cols., 2005; KUMAR e cols., 2005; LEMUS, e cols., 2006;
MENGATTO, e cols., 2006). Já o MTT e o TEMA são utilizados para o diagnóstico de
detecção de resistência parcial (somente RMP e INH) e tem sido apontado como
desvantagem para o MTT, a necessidade da existência de condições adequadas de
biossegurança nos laboratórios (CAVIEDES e cols, 2002; FOONGLADDA e cols,
63
2002; ABATE e cols., 2004; MONTORO e cols., 2005; LEMUS e cols., 2006;
MENGATTO e cols., 2006; PALOMINO e cols., 2006).
3.11.1.8 TESTES QUANTITATIVOS
ETEST (AB BIODISK, Solna, Suécia) é um teste de sensibilidade quantitativo
(Wanger & Mills, 1996) cujo resultado se obtém 5 a 10 dias após o crescimento de
M.tb no meio de cultura. ETEST apresenta uma concordância média de 98,9% para a
detecção de cepas multirresistentes ao ser comparado com o MP; de 97,9% para a
RMP; de 96,0% para o EMB; de 94,7% para a INH e de 85,3% para a SM, quando
consideradas isoladamente. Por ser um método de baixo custo, após sua validação,
poderá ser utilizado em países em desenvolvimento para o diagnóstico rápido da
resistência micobacteriana. (HAZBÓN, 2000). Akcali e cols. (2005) fizeram um estudo
comparativo entre o Etest e o método indireto de proporções em ágar, em 100 cepas
testadas para RMP, INH, SM e EMB e observaram uma concordância de 100% entre
os dois.
O Método do Crescimento em Microdiluição (BMM) é um teste quantitativo que
utiliza o meio 7H9 com 96 microplacas. Coban e cols. (2004) publicaram os resultados
do estudo comparativo entre este método e o MP (LJ), em 43 cepas de Mtb para
detecção de resistência a RMP, INH, SM e EMB que apresentou uma boa
sensibilidade para os três primeiros dos quatro medicamentos e ser rápido com
resultados em 10 dias, porém baixa especificidade para RMP e EMB (85,7% e
90,9%). Em outro estudo comparativo, para avaliar a performance do MGIT e outros
três métodos MODS, NRA, MTT e BMM (N= 64) na detecção de resistência aos
fármacos de primeira linha, foi encontrada boa sensibilidade e especificidade para
64
RMP e INH (>90%) com tempo médio de 20 dias para a obtenção dos resultados
(MENGATTO e cols., 2006)
3.11.2 O Método Genotípico.
O método genotípico baseia-se na detecção da resistência utilizando o DNA da
própria micobactéria. Estudos sobre os mecanismos genéticos de resistência de M.tb
aos fármacos anti-TB e o desenvolvimento de novos métodos moleculares de
detecção dessa resistência só foram possíveis pelos avanços tecnológicos da biologia
molecular. A base genética da resistência de M.tb a RMP está bem caracterizada e foi
mais simples de ser demonstrada do que em relação às demais fármacos. Por isto, a
maioria dos testes está voltada para a detecção da resistência a RMP, considerada
preditora da multirresistência. (CHAVES e cols, 2000; SOINI & MUSSER, 2001;
SHARMA e cols., 2003).
Todas as técnicas genéticas são de custo elevado, pois exigem uma infra-
estrutura complexa tanto em equipamento quanto em material. Portanto, o
desenvolvimento de estudos nesta área fica reservado aos laboratórios de referência
(CAMINERO, 2002); além disto, estudos de custo-efetividade devem ser feitos, após
validação dessas técnicas.
Os estudos dos mecanismos moleculares de resistência aos fármacos têm
como resultados o desenvolvimento de alguns ensaios de genotipagem rápida para a
detecção da resistência.
65
A estratégia principal tem sido a amplificação enzimática de uma região
específica do genoma de M.tb e a análise do produto amplificado para a detecção de
mutações, inserções e/ou deleções atribuíveis à resistência apresentada.
3.11.2.1 SEQUENCIAMENTO.
Metodologia que analisa todos os nucleotídeos da região de DNA específica
escolhida do genoma. Por meio desta análise e comparação de uma cepa resistente
com uma sensível é possível identificar mutações na cepa resistente que podem estar
relacionadas com a resistência a um determinado fármaco. É uma metodologia muito
sensível, considerado como “padrão ouro” quando se trata de diagnóstico por biologia
molecular, porém de custo elevado. (VICTOR & VAN HELDEN, 2001)
O Seqüenciamento é a principal técnica utilizada para o estudo dos
mecanismos genéticos de resistência de M.tb aos fármacos anti-TB. Este método
apresenta maior confiabilidade para o estudo das mutações, e é bastante útil na
detecção da resistência a rifampicina uma vez que seu alvo é o gene rpoB, locus da
maioria das mutações a ela associada. (SOINI & MUSSER, 2001)
Em 1999, Musser e cols., avaliaram a presença de mutações em 51 cepas
resistentes a INH e em 10 sensíveis, originárias da Holanda, por meio do
sequenciamento do gene katG e de dois locus do gene inhA .A maioria dos cepas
(84%) apresentaram mutações no gene katG ou no inhA ou “lacked “ do katG. A
maioria apresentou substituição dos aminoácidos 315 ou 463 no katG ou substituição
do nucleotídeo no inhA.
66
Huang e cols. (2002), em seu estudo, avaliaram 242 cepas isoladas na China
através do sequenciamento, para determinar as regiões do gene rpoB de resistência a
RMP (RRDR). Dentre estas, 193 eram resistentes; 46 sensíveis e 03 foram
manualmente induzidas à resistência. Dentre as resistentes, 89,6% das mutações
localizavam-se no 81bp RRDR do gene rpoB e os códons mais acometidos foram
531-Ser e 526-His. As cepas com nível elevado de resistência a RMP apresentaram
maior freqüência de mutação encontrada no códon 531- Ser do que aquelas com nível
baixo. Nenhuma mutação foi evidenciada nas cepas sensíveis. O sequenciamento foi
útil para a predição do fenótipo de resistência a RMP.
À análise molecular, por sequenciamento, no estudo realizado na Coréia do
Sul, para detecção de mutações nos genes katG, inhA e ahpC em 71 cepas
resistentes a INH e em 21 cepas sensíveis, mostrou que nas cepas resistentes, as
mutações ocorreram tanto de forma isolada ou combinada: katG 315 (54,9%); katG
315 e inhA(2,8%); katG 315 e ahpC (1,4%); katG 309 (1,4%); katG 309 e inhA
(1,4%);inhA (19,7%); ahpC (5,6%). Não houve diferença estatisticamente significante
em relação a frequência encontrada nos isolado mono-resistentes e multirresistentes.
A mutação no códon katG 315 esteve associada com nível elevado de resistência a
INH (CMI>1μg/ml) ; a mutação na região promotora inhA esteve associada com níveis
baixos de resistência (CMI>0,2 μg/ml).A sensibilidade e a especificidade para a
análise molecular (katG e inhA) foi respectivamente, 80,3% e 100%. (KIM e cols.,
2003)
Num trabalho comparativo entre o sequenciamento e o LiPA , feito no Kuwait,
com a finalidade de detectar mutações em 32 cepas isoladas com resistência a RMP,
o LiPA identificou 24 (75%) como resistentes com detecção de mutações específicas
67
em 19.O sequenciamento do DNA do RRDR confirmou o resultado obtido pelo LiPA e
identificou mutações precisas em 05 das cepas que não poderiam ser identificadas
pelo LiPA como a mutação (inserção 514TTC) em 03(9%) e a V146F em 02 (6%) as
quais são de ocorrência rara. (AHMAD e cols., 2005).
3.11.2.2 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Existem várias técnicas descritas em biologia molecular para detecção de
resistência de M. tuberculosis aos medicamentos anti-tuberculose como PCR-
Heteroduplex formation (HDF); PCR-SSCP (Single Strand Conformation
Polymorphism); Real-time PCR; INNO-LiPA; GenoType MTBDR e mais recentemente
a nova versão deste teste, denominado GenoType MTBDR plus. Dentre estes, o
INNO-LiPA encontra-se validado na Europa para o uso em culturas de M. tuberculosis
com a finalidade de detecção de resistência a RMP. O INNO-LiPA e GenoType
MTBDR plus estão disponíveis comercialmente. Makinen e cols.(2006), realizaram
um estudo comparativo entre os kits comerciais, GenoType MTBDR e INNO-LiPA
Rif.TB, com o intuito de avaliar da capacidade destes para detecção de resistência a
RMP e a INH em 52 cepas M.tb. Foram utilizados como referência o teste de
sensibilidade convencional (fenotípico) e o sequenciamento. O Genotype MTBDR ao
ser comparado com o teste de sensibilidade convencional para INH, apresentou uma
concordância em 90,4% das cepas e em relação a RMP, Genotype MTBDR e INNO-
LiPA Rif.TB obtiveram concordância em 98,1% das cepas. Em relação ao
sequenciamento, o Genotype MTBDR obteve concordância em 92,3% das cepas e o
INNO-LiPA Rif.TB, 96,2%. Ambos foram úteis na detecção rápida da resistência,
porém, a vantagem do método Genotype MTBDR em relação ao INNO-LiPA Rif.TB é
a detecção simultânea da resistência a RMP e a INH.
68
Outras técnicas (Reverse-Line Blot Hibridization Assay: RLB E RIFO Assay)
foram descritas semelhantes ao INNO-LiPA pois utilizam sondas e hibridização
reversa, porém o tipo de membrana e a visualização dos resultados são diferentes.
Não se encontram validados e tem por finalidade a detecção de resistência a RMP.
(KREMER e cols., 1999; MORCILLO e cols., 2002).
Têm-se ainda outros métodos que não estão validados como o Report Systems
e o Micro-Arranjos DNA. O primeiro baseia-se na utilização de plasmídeos que
contém o gene marcado da luciferase que são incorporados ao genoma da
micobactéria e os resultados é obtido por meio da visualização da luz em uma caixa
escura. (JACOB e cols., 1993; RISKA e cols., 2000). O segundo é um método rápido
e tem sido utilizado principalmente, em estudos para detecção de resistência a RMP
apresentando boa concordância ao ser comparado com o método de
sequenciamento; porém, de custo elevado e reservado a pesquisa. (GINGERAS e
cols., 1998; TROESCH e cols., 1999; KIVI e cols., 2002; GRYADUNOV e cols., 2005;
PALOMINO e cols., 2007).
Por último, ainda existem outros métodos para detecção da resistência de M.tb
”in vitro”, tais como: métodos baseados em bacteriófagos e na técnica de citometria
de fluxo.
3.12 Epidemiologia Molecular
Atualmente, a análise e classificação das cepas do complexo M.tb por
meio de técnicas moleculares “fingerprinting” é a mais potente ferramenta para
investigação de surtos locais de TB, da transmissão nosocomial, de contaminação
cruzada em laboratórios; para o estudo de distribuição biogeográfica e espraiamento
69
da doença no mundo. Por meio destas técnicas, também o estudo filogenético de M.tb
tornou-se possível. (YANG e cols., 1995; SOLA e cols., 2001; VAN SOOLINGEN e
cols., 2007). Outro aspecto importante do emprego das técnicas moleculares foi
evidenciar a presença de sub-populações de M.tb nas amostras clínicas de pacientes
com TB. Em vários estudos publicados recentemente foi possível demonstrar que a
infecção policlonal/múltipla por diferentes linhagens de M.tb num, mesmo paciente
pode ser mais freqüente do que o esperado. (RICHARDSON e cols., 2002;
SHAMPUTA e cols., 2004, VAN RIE e cols., 2005; WARREN e cols., 2004).
O uso de elementos repetitivos para a tipagem molecular de cepas
de M.tb foi descrito por Eisenach et al, na década de 80.(EISENACH e cols., 1986;
EISENACH e cols., 1988). Van Soolingen e cols., (1993) ressaltaram que a
observação de que estes elementos estão localizados em sítios cromossômicos
diferentes foi de grande valia para o avanço dos estudos moleculares de genotipagem
das micobactérias. Foram identificados no bacilo da TB, vários elementos repetitivos
de DNA relacionados à variação de cepas: dois deles são sequências de inserção
(IS6110 e IS1081) e os demais, pequenas sequências repetitivas de DNA (DR - direct
repeated sequences), PGRS (seqüência rica em GC) e MTPRs (major polymorphic
tandem repeat sequences) (SUFFYS e cols., 1997). A sequência de inserção IS6110
está exclusivamente presente no complexo M.tb. (HERMANS e cols., 1990; BLOOM &
MURRAY,1992; VAN SOOLINGEN e cols., 1993; ZHANG e cols., 1992)
O método de polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição
(RFLP) é baseado no elemento de inserção IS6110, elemento genético móvel
presente em múltiplas cópias no complexo M.tb (McADAM e cols.,1990; THIERRY e
cols., 1990) Após a digestão do DNA por uma endonuclease específica, obtém-se
70
inúmeros fragmentos de tamanhos diferentes que são observados pela eletroforese
em gel de agarose, transferidos para uma membrana de nailon e hibridizados por uma
sonda genética marcada que se ligará as seqüências IS6110 próximo ao sítio de
restrição da enzima. Com isto, serão produzidos padrões de bandas denominados
RFLPs que funcionam como um “fingerprinting” do DNA das cepas de M.tb. (VAN
EMBDEN e cols., 1993; TENOVER e cols., 1997).
Padrões de IS6110 de cepas representam um cluster definido de casos de
M.tb quando diferem numa única banda no perfil RFLP (TENOVER e cols., 1997).
Friedman e cols., em 1995, descreveram o chamado “Double Repetitive
Element” ou DRE-PCR. Esta técnica utiliza a amplificação de segmentos do DNA de
M.tb localizados entre cópias dos elementos repetitivos IS6110 e a seqüência
polimórfica rica em GC (PGRS), por meio da técnica de PCR. Em M.tb, o PGRS está
presente no mínimo em 30 cópias, variando em número e distribuição de cepa. Desta
forma, são utilizados iniciadores construídos para se ligarem às sequências terminais
dos elementos S6110 e PGRS, permitindo a amplificação de segmentos entre estas
sequências repetitivas. O fundamento do método é que as distâncias entre estes
elementos repetitivos e o número de cópias do IS6110 e PGRS apresentam variação
de cepa a cepa. Com isto, a amplificação de fragmentos de DNA fornecerá padrão de
bandas individuais para diferentes cepas de M.tb.
O Spoligotyping tem como alvo a detecção do polimorfismo encontrado na
região chamada “direct repeat” das cepas de M.tb. Esta região é amplificada por PCR
com iniciadores dirigidos a estas repetições. Subseqüentemente, o produto obtido por
PCR é hibridizado para as seqüências “unique spacer” conhecidas; a detecção ECL é
71
obtida após a incubação “peroxidase-labelled streptavidin”. (KAMERBEEK e cols.,
1997). Esta técnica foi utilizada como um método de tipificação de triagem e como
marcador para o estudo filogenético do complexo M.tb. (VAN SOOLINGEN e cols.,
2007).
O Variable Numbers of Tandem Repeats (VNTR) é um método bastante
utilizado que, em breve, provavelmente poderá ser considerado o padrão-ouro para
tipificação molecular de M.tb. Os resultados deste método são expressos em códigos
numéricos. Cada um deles representa o número de “tandem repeat” num locus
particular. O número de repetições varia de acordo com a cepa e é determinado por
meio da amplificação por PCR do locus de repetição com iniciadores dirigidos a estas
regiões e a determinação do tamanho do produto do PCR. Cada tamanho de
amplicons reflete o número de “tandem repeats” presentes em um determinado locus.
A mensuração do tamanho pode ser feita por um sistema de capilaridade (ALLIX e
cols., 2004; SUPPLY e cols., 2006), eletroforese em gel (MAZARS e cols., 2001) ou
cromatografia líquida de alta performance (EVANS e cols., 2004).
Por meio de técnicas moleculares, foi criado um banco de dados que contém
3319 padrões de spoligotyping de M.tb, provenientes de 47 países, nos quais, 259
apresentam tipos compartilhados isto é, spoligotyping idênticos compartilhados por
dois ou mais cepas de pacientes com TB. Estes foram encontrados em 2779 (84%) do
total das cepas. Os sete grupos genéticos maiores representaram 37% das cepas
“cluster”. Nos Estados Unidos foram encontrados dois tipos, 119 e 137, que
contribuíram com 9% dos clusters encontrados. O restante dos 1517 cepas
apresentou 252 spoligotyping diferentes. (SOLA e cols., 2001). Em outra publicação,
em 2002, o banco de dados continha 11708 padrões de spoligotyping de cepas
72
provenientes de mais de 90 países. Dentre estes, 813 tipos compartilhados e 1300
com padrão “órfão” (cepas mostrando um único spoligotyping). Os autores mostraram
que houve um aumento da proporção de cepas clusters neste período (de 84% para
90%) e 50% dos clusters foram encontrados em 20 tipos compartilhados. (FILLIOL,
2002).
Foram caracterizadas 9 superfamílias de cepas: M. africanum, Beijing, M.
bovis, EAI, CAS, T, Haarlem, X, e LAM. (FARNIA e cols., 2004).
Na última década, abordagens epidemiológicas moleculares demonstraram
que alguns genótipos de M. tb estão induzindo formas mais graves de tuberculose, e
a maior ocorrência de falência ao tratamento medicamentoso e de recidiva do que
outros. Estas situações têm dificultado o controle da TB em algumas regiões, mesmo
em países com bons programas de controle TB, como o Vietnam (GLYNN e cols.,
2002; LAN e cols., 2003; VEER e cols., 2007).
Alguns genótipos foram associados à resistência aos fármacos usados para
o tratamento de TB como Genótipos Beijing/W e Haarlem (EUROPEAN, 2006;
MARAIS e cols., 2006). Algumas associações entre os genótipos Beijing e LAM e
mutações específicas conferindo resistência a rifampicina ou a estreptomicina já
foram descritas (LIPIN e cols., 2007). Em M. tuberculosis resistentes a INH, o
genótipo Haarlem esteve associado à alta freqüência de mutação no codón 315
(MARAIS e cols., 2006; MARDASSI e cols., 2005). No entanto, no trabalho de Dalla
Costa (2008), não foi encontrada esta asssociação. Estes cepas de M.tb, bem como
cepas MTB/Beijing apresentam mutações nos chamados genes “mutator” (OLANO e
cols., 2007; RAD e cols., 2003). Mutações em tais genes podem proporcionar a essas
linhagens uma maior adaptabilidade à ambientes hostis, como a exposição aos
73
fármacos antituberculose ou sobrevivência em macrófagos (RAD e cols., 2003). O
genótipo Haarlem parece favorecer o aparecimento de linhagens TBMR, e foi
associada com surtos na Argentina (RITTACCO e cols., 1997), República Checa
(KUBIN e cols., 1999) e Tunísia (MARDASSI e cols., 2005).
Numa revisão da literatura feita pelo CDC, de 49 estudos provenientes de
45 países sobre o genótipo Beijing, sua distribuição e associação com a resistência
aos medicamentos, encontrou-se 4 padrões para a TB: 1) endêmico, sem associação
com a resistência aos medicamentos ( maior no leste da Ásia e menor em regiões dos
Estados Unidos da América); 2) epidêmica, associada a resistência (maior em Cuba;
União Soviética;Vietnam e África do Sul; menor na Europa oriental); 3) epidêmica mas
sem associação com resistência (Malawi e Argentina); e, 4) baixa prevalência ou
inexistente (regiões da África e Europa).
Na América Latina, o genótipo latino-americano e mediterrâneo (LAM)
parece ser dominante, sendo o genótipo Beijing menos comum (1-5%) (FERRAZOLI e
cols., 2000). Numa publicação recente, Rittaco e cols.(2008), estudaram a frequência
do genótipo Beijing de M.tb em cepas provenientes de 7 países da América do Sul no
período de 1997 a 2003. No total, 1,6% dos casos de TB (19/1.202) tinham o genótipo
Beijing, com a seguinte distribuição: 5,9%, Peru;1%, Brasil; 0,8%, Argentina; 0,6%,
Paraguai e 0%, Chile, Colômbia e Equador. Todos eram nativos da América do Sul,
exceto 2 pacientes que eram imigrantes da Ásia. Segundo os autores, não houve
nenhuma associação entre a cepa Beijing e a presença de resistência ou
multirresistência aos medicamentos de TB e sugerem que será preciso definir melhor
a contribuição sobre a virulência desta e falta de resposta ao tratamento observada
em outras partes do mundo. Em outro estudo recente, realizado em 7 estados
74
brasileiros, em 195 cepas, o genótipo M.tb predominante foi LAM (51,8%) seguida da
família T (12,8%) e Haarlem (10,8%). (DALLA COSTA e cols., 2008)
Alguns relatos de casos foram publicados sinalizando, por meio da utilização da
genotipagem, a ocorrência de diferentes tipos de cepas causando doença TB no
mesmo paciente e com diferentes padrões de sensibilidade. Tal fato pode explicar a
falência ao tratamento de TB. (NIEMANN e cols., 2000; SMALL e cols., 1993;
ANDRADE e cols., 2009).
75
IV. PACIENTES E MÉTODOS
4.1. Tipo de Estudo
Estudo transversal para avaliação da acurácia da técnica MODS, utilizando-se
como padrão ouro o Método das Proporções, para o diagnóstico da detecção de
resistência de M. tuberculosis aos fármacos RMP e INH com consequente análise dos
resultados discordantes encontrados, por meio da utilização de outros métodos
diagnósticos de biologia molecular.
Estudo epidemiológico descritivo, de coorte observacional do comportamento
clínico dos pacientes desde a avaliação do risco até o desfecho clínico destes e sua
relação com os resultados encontrados ao teste MODS e ao Método das Proporções .
4.2. Período e Local do Estudo
No periodo de julho de 2003 a julho de 2004, foram arrolados 237 pacientes
oriundos de um Hospital Geral, referência para TB, TBMR e AIDS. As amostras
clínicas destes pacientes foram coletadas e enviadas ao Laboratório de
Micobacteriologia do complexo hospitalar do HUCFF-IDT/UFRJ para a realização dos
testes MODS e Método das Proporções. Após a realização destes, todas as culturas
foram armazenadas, congeladas e posteriormente, aquelas em que se evidenciou
discordância inter-testes e/ou inter-amostras provenientes do mesmo paciente foram
repicadas para os testes moleculares. Em relação aos testes moleculares, o
sequenciamento foi realizado no Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
76
Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde, Secretaria de Saúde, Rio
Grande do Sul e a técnica de Spoligotyping no Laboratório de Biologia Molecular da
Unidade de Pesquisa em Tuberculose – Programa Acadêmico de Tuberculose/
Complexo Hospitalar IDT-HUCFF-UFRJ.
O estudo foi avaliado e aprovado pela comissão de ética da Faculdade de
Medicina e HUCFF da UFRJ e do HMRPS da Secretaria Municipal do Rio de Janeiro .
4.3. Perfil da Amostra
As amostras clínicas analisadas foram provenientes de pacientes com suspeita
de TB resistente e/ou multirresistente e de pacientes falidos ao tratamento de TB
multirresistente (TBMR) oriundos de um hospital de referência para TB;TBMR e AIDS.
4.4. Critérios de Inclusão
Foram incluídos pacientes com pelo menos um fator de risco para resistência
e/ou multirresistência atendidos num hospital de referência para TB, TBMR e AIDS e
que assinaram o termo de consentimento.
Foram incluídos pacientes multirresistentes e falidos ao tratamento instituído
para TBMR que assinaram o termo de consentimento.
4.5. Critérios de Exclusão
Pacientes suspeitos de TB extra-pulmonar isolada;
77
Pacientes que apresentaram culturas negativas e/ou contaminadas.
Pacientes que apresentaram contaminação dos testes de sensibilidade por um
dos testes utilizados, MODS ou Método das Proporções.
Pacientes cujas respectivas cepas de M.tubeculosis não foram submetidos ao
sequenciamento devido à contaminação durante o procedimento.
4.6. Procedimentos Clínicos:
Na rotina de investigação dos pacientes foram coletadas, em formulário
padronizado, as seguintes informações: a) dados sócio-demográficos; b) exposição à
TB, doença e história de tratamento; d) história patológica pregressa; e) resultado da
radiografia de tórax; f) resultado da prova tuberculínica; h) resultado do teste de HIV.
Os pacientes foram, de forma dirigida, questionados quanto à presença ou não
dos seguintes sintomas: tosse, expectoração, hemoptise, sudorese noturna, febre,
dispnéia, perda de peso, adenopatia e diarréia. Foram também argüidos quanto ao
tempo de sintomas. Foram também questionados quanto a história atual ou prévia de:
pneumonia por pneumocistis carinii (PCP) candidíase (esôfago, brônquio, pulmão),
citomegalovirose, sarcoma de kaposi, disseminação pelo complexo M. avium,
pneumonia ou meningite por criptococo, histoplasmose disseminada, pneumonia
bacteriana repetida (≥ 2 episódio /1 ano), outras condições definidoras de SIDA.
Espécimes respiratórios incluíram escarro espontâneo; escarro induzido e
lavado broncoalveolar. Espécimes não respiratórios não foram incluídos no estudo.
78
Seguindo a rotina, as amostras clínicas foram encaminhadas ao laboratório de
micobacteriologia em até 48 horas.
A história clínica pregressa de TB de cada paciente foi tomada como base para
a classificação clínica de risco para resistência a RMP e a INH. Foram considerados
de alto risco, aqueles com suspeição de e/ou falência ao tratamento anti-TB; de risco
intermediário, aqueles com história de abandono; de risco intermediário baixo, com
recidiva pós-cura e de risco baixo, aqueles com suspeita e/ou TB sem tratamento
prévio.
A heterorresistência foi caracterizada por diferentes resultados nos testes de
sensibilidade aos fármacos anti-TB por meio fenotípico MP, em diferentes amostras
respiratórias do mesmo paciente.
A Infecção Policlonal/Múltipla foi caracterizada pela identificação da presença
de mais de uma cepa de M. tb na amostra respiratória do mesmo paciente por meio
da análise da técnica de Spoligotyping.
O tratamento instituído para cada paciente foi baseado em critérios clínicos;
laboratoriais e/ou radiológicos. À admissão no estudo, cada paciente coletou amostras
respiratórias, no total de até 03 amostras por paciente e cada uma destas foi semeada
tanto para cultura e TSA pela técnica MODS como pelo MP, em meio LJ. Naqueles
que já tinham anteriormente à inclusão do estudo, o diagnóstico de resistência pelo
MP, a orientação medicamentosa foi baseada nestes resultados anteriores. Os
médicos assistentes não tiveram acesso aos resultados dos exames de cultura e TSA
pela técnica MODS logo a orientação terapêutica foi baseada nos resultados obtidos
pelo padrão-ouro, MP, no meio LJ.
79
Para análise estatística, assumiu-se analisar o desfecho clinico final como uma
variável dicotômica, atribuindo os desfechos óbitos e falência como desfavorável e a
cura/favorabilidade, como favorável. Nesta análise, optou-se por excluir os casos de
abandono.
4.7. Procedimentos de laboratório
4.7.1 Metodos Fenotipicos
As leituras MODS e LJ para detecção do crescimento de M.tb foram
realizadas no mesmo laboratório em dias estipulados para que não houvesse
necessidade de realização de leituras nos finais de semana. Foram selecionadas as
segundas-feiras, terças-feiras e sextas-feiras para o processamento dos espécimes e
realização da baciloscopia, cultura em meio MODS e no meio de LJ. Todos os
espécimes foram processados de acordo com protocolos padrão para análise de
escarro, a cultura de LJ seguido de teste de sensibilidade no Laboratório de
Micobacteriologia participantes do projeto: Laboratório de Micobacteriologia do
complexo hospitalar IDT-HUCFF-UFRJ
4.7.2. Testes Moleculares
Amostras coletadas fo
ram encaminhadas para o Centro de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde) -
Secretaria de Saúde/RS. Neste laboratório foi realizado o seqüenciamento. No Rio de
Janeiro, as amostras foram submetidas a técnica de Spoligotyping no Laboratório de
80
Biologia Molecular da Unidade de Pesquisa em Tuberculose – Programa Acadêmico
de Tuberculose/Complexo Hospitalar IDT-HUCFF-UFRJ.
4.8. Análise Estatística
Os resultados foram analisados por meio do programa SPSS versão 10.0. A
sensibilidade e especificidade foram calculadas com intervalo de confiança de 95%.
Para a comparação das diferenças entre as freqüências de resultados obtidos nos
grupos estudados, foi empregado o teste de McNemar. O Índice de Kappa foi utilizado
para avaliar o grau de concordância entre os testes. As razões de verossimilhanças
foram calculadas com intervalo de confiança de 95%.
4.9.Técnicas Laboratoriais
4.9.1. Cultura para Micobactéria
Todas as culturas referentes a estes pacientes, após a leitura e a realização
do TSA foram armazenadas e congeladas a – 20˚C em um banco de cepas no
Laboratório de Micobacteriologia do complexo hospitalar HUCFF/IDT-UFRJ. Para a
análise molecular dos resultados discordantes, estas foram repicadas no meio
Lowenstein Jensen segundo o método de Canetti (1969).
4.9.2. Procedimentos Realizados No Laboratório De Micobactérias
4.9.2.1 Baciloscopia e cultura:
81
Os espécimes foram digeridos e descontaminados pelo método N-acetil-L-
cisteine-NaOH e concentrados por centrifugação no laboratório de Micobacteriologia
do HUCFF. Os materiais para análise microscópica foram preparados a partir de
espécimes concentrados. O sedimento restante re-suspensos em 2.0 mL em tampão
fosfato ph 7.0. Duas gotas (0.2mL cada uma) do sedimento resuspensos foram
colocadas em meio LJ. O material de escarro foi classificado por microscopia como
1+, 2+ ou 3+, de acordo com o número de bacilos observados em cada campo
microscópico e nas recomendações do Programa Brasileiro de Controle de TB ( KENT
& KUBICA, 1985).
O sedimento resuspenso foi colocado em meio solido LJ em estufa a 37ºC;
cepas de M. tb foram identificados combinando a morfologia da colônia com os
resultados dos critérios bioquímicos clássicos.
4.9.2.3. Teste de Sensibilidade àos Fármacos:
O método de proporções foi realizado em meio Löwenstein-Jensen (LJ.), de
acordo com procedimentos padrão. (CANETTI e col, 1969). As concentrações finais
dos fármacos foram 4,0 g/mL para SM; 0,2 g/mL para INH; 40,0 para RMP e 2,0
g/mL para EMB.
4.9.2.4. Controle de qualidade e verificação de pureza:
A cepa de referência M. tb H37Rv (ATCC 27294), suscetível a todos os
agentes anti-tuberculose padrão, foi usada em cada grupo dos meios preparados com
a fármaco. M. tuberculosis (ATCC 35822) I resistente, M. tuberculosis ATCC35820 S
resistente, M. tuberculosis ATCC 35838 R resistente, e M. tuberculosis ATCC 35837 E
resistente também foram incluídos como controle de qualidade. Todas as suspensões
82
bacterianas usadas para inoculação nos testes em MGIT 960 foram verificadas para
ver a pureza em ágar-sangue.
4.9.3. MODS
4.9.3.1 Material e cultura
O meio de cultura líquido MODS foi preparado conforme descrito
anteriormente (PARK e col, 2002) e armazenado em geladeira. Foi também preparado
meio adicionando o ácido para-nitrobenzóico (PNB) na concentração final de 500µ/ml.
A metodologia para a semeadura dos espécimes em meio líquido MODS foi
desenvolvida em placas descartáveis estéreis com 24 poços. Em 12 poços foi
adicionado 1 mL do meio de cultura líquido MODS e no restante dos poços foi
adicionado 1 mL do meio de cultura líquido MODS contendo PNB. Do sedimento
homogeneizado em tampão fosfato foram retirados dois inóculos de 0,2 mL cada um e
semeados em um poço contendo o meio de cultura líquido MODS e em um poço
contendo o meio de cultura líquido MODS adicionado do PNB. As placas foram
seladas com plástico permeável transparente e incubadas a temperatura de 37
o
C em
estufa com 10% de tensão de CO
2
.
As leituras foram realizadas em microscópio de luz invertida com objetiva de
40X. A morfologia característica do M. tuberculosis foi observada nos poços com meio
de cultura MODS sem a adição de PNB e a sua identificação presuntiva foi feita de
acordo com a observação do crescimento típico em forma de cordas no meio líquido.
O resultado foi considerado positivo quando microscopicamente foi observada a
morfologia característica da corda e, negativo, quando a corda não foi observada.
(Figuras 1A e 1B)
83
Nos poços contendo o meio de cultura MODS com PNB foi feita a observação
se as cepas que produziram cordas nos poços com meio MODS sem PNB tiveram o
seu crescimento inibido pelo PNB. Para a identificação presuntiva de M.tb não poderia
ocorrer crescimento em meio MODS adicionado de PNB e nem a observação de
cordas.
Foi utilizada a amostra padrão de M.tb H37Rv como controle positivo e como
controle de qualidade para as técnicas laboratoriais do método MODS. Durante o
estudo todas as cepas positivas em meio líquido MODS e negativas em meio de
cultura de LJ foram subcultivadas em meio sólido a partir do meio líquido MODS e
identificado para confirmação do resultado obtido no método MODS.
Todas as cepas participantes do estudo do MODS, para detecção de M.tb
foram estocadas a -20
0
C em um banco de cepas no Laboratório de Micobacteriologia
do complexo hospitalar HUCFF/IDT-UFRJ.
4.9.3.2 Testes de Sensibilidade aos Fármacos.
As soluções estocadas com antibióticos foram diluídas e adicionadas ao meio
líquido MODS com a seguinte concentração crítica: 0,1μg/ml para INH e 2,0 μg/ml
para RMP. Para cada amostra respiratória, 01 ml do meio líquido sem droga (INH) foi
colocado em 1 dos 24 poços e 01 ml de meio líquido com a INH foi colocado em 2
poços adjacentes. O mesmo aconteceu em relação a RMP. Após, 0,2 ml das
alíquotas descontaminadas do espécime clínico foram inoculadas nestes poços. Os
poços sem as drogas foram examinados 2 x por semana para avaliar o crescimento.
Os poços com drogas foram avaliados 14 dias após o crescimento observado nos
poços sem as drogas.
84
Figura 1. Técnica MODS
A.Visualização da formação de cordas B. Ausência de formação de cordas
4.10. Procedimentos Realizados nos Laboratórios de Biologia Molecular
4.10.1 Extração de DNA
A extração de DNA genômico foi isolado conforme metodologia descrita por
van Soolingen e colaboradores (2000). Os DNA extraídos foram visualizados em gel
de agarose 0,8% corado com brometo de etídio sob iluminação ultravioleta.
4.10.2 Amplificação dos genes de interesse
Oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados
Os primers construídos foram baseados em regiões dos genes katG, inhA e ahpC,
do genoma de M. tb (acesso no GenBank AL 123456) associados com a
resistência a INH (SILVA e cols., 2003) e para o diagnóstico de resistência a
rifampicina foi selecionado um fragmento da região hotspot (69 nucleotídeos), da
subunidade da RNA-polimerase.
85
4.10.3 Reação de PCR
A amplificação foi feita conforme o descrito por Silva e col (2003). Os
primers utilizados para as reações de PCR para diagnóstico de resistência a INH
estão descritos abaixo:
KatG FW - 5’ CAT GAA CGA CGT CGA AAC AG 3’
KatG RV - 5’ CGA GGA AAC TGT TGT CCC AT 3’
ahpC FW - 5’ GCC TGG GTG TTC GTC ATC GGT 3’
ahpC RV - 5’ CGC AAC GTC GAC TGG CTC ATA 3’
inhA (orf) FW - 5’ GAA CTC GAC GTG CAA AAC 3’
inhA (orf) RV - 5’ CAT CGA AGC ATA CGA ATA 3’
inhA (reg) FW - 5’ CCT CGG TGC CCA GAA AGG GA 3’
inhA (reg) RV - 5’ ATC CCC CGG TTT CCT CCG GT 3’
Os produtos obtidos por meio da PCR são de 232 pb para o gene katG, 359
pb para o gene ahpC, 206 pb para o gene inhA (orf) região estrutural do gene e 248
para o gene inhA(reg).
Para o diagnóstico de resistência a rifampicina foi realizada a amplificação
do fragmento de 159 pb e construídos oligonucleotídeos iniciadores (primers),
baseados em Telenti e cols (1993) e adquiridos de Invitrogen Brasil Ltda (Certificado
de Análise 012076 01):
RIF 1 5’ (GGTCGCCGCGATCAAGGAGT) leitura direta
RIF 2 5’ (TGCACGTCGCGGACCTCCA) leitura reversa
86
As reações foram realizadas em um termociclador (MiniCycler TM - Hot
Bonnet PTC - 100/MJ Research, INC, USA) nas seguintes condições: 94°C por 2 min,
seguido de 55°C por 1 min e 72°C por 2 min, repetidos por 30 vezes.
4.10.4 Detecção do Produto Amplificado
A detecção do produto amplificado foi feita em gel de agarose 1,5%, corado
com brometo de etídio e detectados em um transluminador de U.V. O marcador de
peso molecular utilizado durante as corridas eletroforéticas foi de 100pb - DNA Ladder
(Gibco-BRL).
4.10.5 Purificação dos fragmentos amplificados
Após a amplificação e checagem, os produtos foram purificados para
retirada de excesso de primers. Essa purificação de fragmentos amplificados foi feita,
inicialmente, por meio de colunas de purificação (Centri-Sep, Princeton Separation,
Inc. Adelphia, NJ), conforme protocolo do fabricante. No decorrer do trabalho,
passamos a purificar pelo método PEG (Neisseria MLST home page,
http://pubmlst.org/neisseria/mlst-info/nmeningitids/pcr.shtml),
RIF
1
2281 cccaggacgt ggaggcgatc acaccgcaga cgttgatcaa catccggccg gtggtcgccg
2341 cgatcaagga gt
tcttcggc accagccagc tgagccaatt catggaccag aacaacccgc
2401 tgtcggggtt gacccacaag cgccgactgt cggcgctggg gcccggcggt ctgtcacgtg
2461 agcgtgccgg gctggaggtc cgcgacgtgc a
cccgtcgca ctacggccgg atgtgcccga
RIF 2
Figura 2 . Localização dos primers RIF1 e RIF2, na seqüencia do gene rpoB, de M. tuberculosis.
87
4.10.6 Seqüenciamento
A reação da PCR para o sequenciamento foi realizada utilizando o BigDye®
Terminator Version 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA). As
condições da reação foram feitas conforme o descrito por SILVA, e cols., (2003).
Realizou-se a precipitação dos produtos da reação PCR-BigDye e estes foram
colocados no analisador genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).
As seqüências obtidas foram visualizadas no programa Chromas Lite 2.01,
que permite a visualização de arquivos dos cromatogramas gerados pelo analisador
genético.
A seqüência encontrada para cada isolado era comparada (alinhAda) com a
seqüência de M. tb H37Rv, por meio dos programas BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) (NCBI/Blast) que alinhAm a seqüência fornecida com seqüências
depositadas no GenBank ou era utilizado o programa ClustalW para alinhamento da
seqüência fornecida com uma seqüência padrão.
Calibrações no analisador genético foram feitas periodicamente conforme
instruções do fabricante. Em paralelo, o controle de qualidade das análises genéticas
realizadas foi feito através de um seqüenciamento simultâneo de uma amostra de
DNA controle (pGEM) (Applied Biossystems, CA, USA) para verificar que todos os
procedimentos foram realizados corretamente.
4.11 Genotipagem dos cepas
As cepas de M. tb foram tipificados pela técnica de spoligotyping . A técnica
foi realizada conforme padronizado por Kamerbeek e cols., 1997.
88
.
4.12 Aspectos Éticos
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Medicina e Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da UFRJ em junho de 2002
e recebeu número WIRB 2002077 (1 de junho , 2003. Olympia. WA)
89
V. RESULTADOS
5.1. Descrição da Amostra estudada
No período de estudo, em uma Unidade Hospitalar de Referência para TB
resistente e AIDS, 237 pacientes foram elegíveis para análise comparativa entre os
métodos fenotípicos: MODS e MP para detecção de resistência a RMP e a INH.
Houve um predomínio do sexo masculino (58,6%). A mediana de idade foi de
39 anos com a seguinte distribuição em percentis (25; 50 e 75): 31; 39 e 49 anos,
respectivamente. Dentre os 237 pacientes, em relação ao tipo de entrada no hospital,
103 (43,4%) apresentavam suspeição de falência ao tratamento de TB e 57 (42,5%)
eram virgens de tratamento anti-TB (Tabela 1). Em relação aos fatores de risco para
resistência, 49 (35,5%) eram casos de recidiva e 43 (31,2%) foram categorizados como
população de rua.
Os 237 pacientes contribuíram com um número diferenciado de amostras
respiratórias sendo aceito no máximo, 3 amostras por paciente, no momento da
investigação inicial. O número total de amostras respiratórias foi 565. Entre elas, foram
excluídas as amostras respiratórias de pacientes que: a) à cultura para M.tb foi negativa
a pelo menos um dos métodos utilizados (n=171); b) contaminaram (n=46); c) a
identificação da espécie foi classificada como micobactéria não tuberculosa (n=12) e d)
não foi possível realizar o teste de sensibilidade a RMP e/ou a INH a pelo menos um
dos dois métodos fenotípicos (n=18). Ao final foram incluídos 142 pacientes com
número total de amostras respiratórias de 318, sendo que 121 foram relativas à primeira
amostra respiratória; 104, à segunda amostra e 93, à terceira amostra.
90
Fluxograma 1. Pacientes elegíveis e incluídos no estudo.
Cento e setenta e três pacientes (73%) relataram história prévia de TB com os
seguintes desfechos clínicos ao último tratamento anterior: falência em 83 (48%) e cura
e abandono 44 (25,4%) cada. Quanto aos resultados da sorologia anti-HIV, dos 236
pacientes que a realizaram, foi positiva em 52 (21,9%) dos casos. Evidenciou-se, ao
padrão radiológico, o predomínio de imagem radiológica típica de TB (92,8%). (Tabela
1).
À comparação das características demográficas e os fatores associados entre
aqueles que foram incluídos no estudo e os demais que foram excluídos, está descrita
na tabela 1. No grupo de pacientes incluídos foi menor a média de idade (p =0,001) e
infecção por HIV (p=0,001), e foi maior a suspeita de falência na entrada no hospital
(p=0,02), como fator de risco suspeita de falência (p=0,03), história de tratamento prévio
(p=0,03), e evolução desfavorável no último tratamento (p=0,01).
Total de Pacientes Elegíveis no Estudo:
237
Total de Amostras Respiratórias Elegíveis no Estudo: 565
Total de Pacientes Incluídos no estudo: 142
Total de Amostras Respiratórias Incluídos no estudo: 318
Perdas:
% de Pacientes: 40,1%
% de Amostras: 43
,
7%
91
Tabela 1. C aracterísticas demográficas e fat ores associados entre pacientes elegíveis;
pacientes incluídos e excluídos no estudo
Paciente s Elegíveis
N=237
Pacientes Incluídos
N=142
Pacientes Excluídos
N=95
Intervalo de Confianç
a
Valor de p
1. Sexo
Masculino
139 (58,6) 86 (60,5) 53(55,7) 1,08 (0,87-1,34)
Feminino
98 (41,1) 56(39,4) 42 (44,2) 1 0,465
2. Idade
Media
40 37,9 43,2
Mediana
39 38 43 0,001
3. Tipo de Entrada
Suspeita de Falência 103 (43,4) 70 (49,2) 33 (34,7) 1,26 (1,03-1,55)
Outros: 134 (156,6) 72 (50,7) 62 (65,3) 1 0,02
Abandono 24 (17,9) 13 (18,1) 11 (17,8)
Recidiva 53 (39,6) 28 (38,8) 25 (40,3)
Casos Novos 57 (42,5) 31 (43,5) 26 (41,9)
4. Fator de Risco
Suspeita de Falência 99 (41,8) 67 (47,2) 32 (33,7) 1,24 (1,01-1,52)
Outros: 138 (58,2) 75 (52,8) 63 (66,3) 1 0,03
Abandono 25 (18,1) 14 (18,7) 11 (17,5)
Recidiva 49 (35,3) 25 (33,3) 24 (38,1)
Contato TB MDR 21 (15,2) 12 (16,0) 9 (14,3)
População de Rua 43 (31,2) 24 (32,0) 19 (30,1)
5. Historia Previa de TB
Sim 173 (73) 111 (78,2) 62 (65,9) 1,30 (0,99-1,71)
Não 64 (27) 31 (21,8) 32 (34,1) 1 0,03
6.DesfechoClinico
(Tratamento anterior)
Cura 44 (25,4) 21 (18,9) 23 (37,1) 1,45 (1,04-2,02)
Desfavoráve:l 127(73,4) 88 (79,3) 39 (62,9) 1 0,01
Falência 83 (48) 61 (69,3) 22 (56,4)
Abandono 44 (25,4) 27 (30,7) 17 (43,5)
Ignorado 0,2 (1,2) 02 (1,8) -
7. HIV
Positivo 52 (21,9) 23 (16,2) 29 (30,5) 0,60 (0,43-0,83)
Negativo 137 (57,8) 101 (71,1) 37 (38,9) 1 0,01
Ignorado 47 (19,8) 18 (12,7) 01 (1,1)
Não Realizado 01 (0,5) ------ 28 (29,5)
8. Padrão Radiológico
TB ativa 220 (92,8) 140 (98,6) 80 (84,2) 9,54 (1,43-63,57)
Outros 16 (6,3) 01 (0,7) 14 (14,7) 1 0,001
Normal 06 (40) 01 (100) 05 (35,7)
TB Seqüela 07 (46,7) ------- 07 (50)
Outra Patologia 03 (13,3) - ------ 02 (14,3)
Ignorado 02 (0,9) 01 (0,4) 01 (1,1)
92
Trezentos e dezoito amostras respiratórias de 142 pacientes foram analisadas pelo
MP e pela técnica MODS.
Como este estudo teve uma particularidade, diferente dos demais descritos na
literatura, onde cada paciente contribuiu com até 3 amostras respiratórias, optou-se
por avaliar a reprodutibilidade da técnica MODS e do MP para a detecção de
resistência a INH e a RMP. Fez-se a comparação dos resultados encontrados nas
amostras 1as e 2as; 1as e 3as; e, 2as e 3as por meio do teste Kappa e o cálculo do
intervalo de confiança (IC).
Para o MODS:
Em relação à INH, à comparação entre as 1as e 2as, 1as e 3as e, 2as e 3as
amostras, os valores dos IC se sobrepuseram indicando que não houve
diferença entre os resultados das amostras.
Amostras 1a e 2a: IC= (78,8 – 92,2) kappa: 0,69
Amostras 1a e 3a: IC= (77,8 – 94,2) kappa: 0,84
Amostras 2a e 3a: IC= (98,8 – 100) kappa: 0,75
Em relação à RMP, à comparação entre as 1as e 2as, 1as e 3as; e, 2as e 3as
amostras, os valores dos IC se sobrepuseram indicando ter havido concordância
entre os resultados.
Amostras 1a e 2a: IC= (82,5 – 94,6) kappa: 0,79
Amostras 1a e 3a IC= (88,3 – 99,5) kappa: 0,80
Amostras 2a e 3a: IC= (88,8 – 99,5) kappa: 0,82
Para o MP:
93
Em relação à INH, à comparação entre as 1as e 2as; 1as e 3as e, 2as e 3as
amostras, os valores dos IC se sobrepuseram indicando que não houve
diferença entre os resultados das amostras.
Amostras 1a e 2a: IC= (84,8 – 91,7) kappa: 0,84
Amostras 1a e 3a: IC= (89,5 – 99,9) kappa: 0,85
Amostras 2a e 3a: IC= (89,5 – 99,9) kappa: 0,82
Em relação à RMP, à comparação das 1as e 2as, 1as e 3as, 2as e 3as
amostras, os valores dos IC se sobrepuseram indicando ter havido concordância
entre os resultados.
Amostras 1a e 2a: IC= (85,9 – 92,1) kappa: 0,91
Amostras 1a e 3a: IC= (91,3 – 100) kappa: 0,88
Amostras 2a e 3a: IC= (84,1 – 97,8) kappa: 0,78
O percentual dos resultados discordantes entre os dois métodos utilizados
MODS e MP foram: 18,2% (22/121), na primeira amostra; 22,8% (24/105), na segunda
e 11,9% (11/92), na terceira amostra.
Pelo MP, em 16 (11,3%) pacientes observou-se padrões de resistência diferentes
inter-amostras, enquanto que pela técnica MODS, esta diferença ocorreu em 25
(17,3%) pacientes. O intervalo de confiança encontrado para o MP e para o MODS
foram respectivamente, IC= (5,2 – 17,4) e IC= (6,1 – 16,5) o que sugere não ter havido
diferença significante entre a proporção de resultados discordantes inter-amostras em
cada técnica diagnóstica.
Foram observados em 43 pacientes resultados discordantes inter-testes, MP e
MODS. Ao final, 63 amostras referentes a 43 pacientes as quais estavam armazenadas,
94
congeladas, num banco de cepas, foram repicadas em meio de cultura para que após
crescimento fossem submetidas a estudo molecular dos genes associados a resistência
a isoniazida e rifampicina e a genotipagem.
Em relação aos resultados discordantes inter-amostras, em cada método,
evidenciou-se que estes constituíam um subgrupo de 38 pacientes entre os 43
pacientes com resultados discordantes inter – testes. Foi acrescido a este subgrupo, 3
pacientes que apresentaram resultados diferentes inter – amostras porém concordantes
inter-testes. Todos os resultados que apresentaram discordância inter - amostras foram
processados conforme descrição anterior, resultando num acréscimo de 29 amostras e
um total de 92 amostras encaminhadas para repique e posterior análise por meio de
métodos de biologia molecular. Fluxograma 2 e 3.
95
Fluxograma 2. Análise comparativa dos testes MODS e MP.
Análise comparativa
dos testes MODS e
MP
N=318
Reprodutibilidade
MODS
LJ
Acurácia MODS
Padrão-ouro: MP
Análise Comparativa
dos Resultados
Concordantes e
Discordantes
Amostras
Discordantes Inter-
testes
N=63
Amostras
Concordantes Inter-
testes
N=255
Concordância Inter-
testes e inter-
amostras
N=226
Concordância Inter-
testes e Discordância
Inter-amostras
N=29
A
A
n
n
á
á
l
l
i
i
s
s
e
e
d
d
a
a
D
D
i
i
s
s
c
c
o
o
r
r
d
d
â
â
n
n
c
c
i
i
a
a
:
:
M
M
é
é
t
t
o
o
d
d
o
o
s
s
d
d
e
e
B
B
i
i
o
o
l
l
o
o
g
g
i
i
a
a
M
M
o
o
l
l
e
e
c
c
u
u
l
l
a
a
r
r
96
Fluxograma 3. Distribuição dos pacientes conforme resultados comparativos dos
testes MODS e MP.
Analisando-se separadamente cada teste, observou-se que ao MP, 126
pacientes apresentavam concordância inter-amostras e 117 pacientes, ao MODS
O perfil de resistência obtido por ambos os métodos em pacientes apenas com
resultados concordantes inter-amostras estão descritos na tabela 2. Em 126 pacientes
avaliados pelo MP, a resistência pelo menos a uma fármaco ocorreu em 17 (13,5%), e
em 117 pacientes avaliados pelo MODS, em 17 (14,5%). Com o MP, observou-se
Pacientes
Incluídos
N=142
Pacientes com
resultados
discordantes inter-
testes: MODS e MP
N=43
Pacientes com
resultados
concordantes inter-
testes: MODS e MP
N=99
Pacientes com
resultados
concordantes inter-
testes mas
discordantes inter-
amostras
N=3
Pacientes com
resultados
conconcordantes
inter-testes e inter-
amostras
N=96
Pacientes com
resultados
discordantes inter-
testes
N=5
Pacientes com
resultados
discordantes inter-
testes e inter-
amostras
N=38
97
resistência a rifampicina associada a isoniazida em 53 (42,0%), Com uso da técnica
MODS observou-se resistência a rifampicina associada a isoniazida em 61 (52,1%).
(Tabela 2)
Entre os 29 pacientes virgens de tratamento, com o MP, observou-se resistência
primária a rifampicina associada a isoniazida em 7 (24,1%). Com uso da técnica MODS
observou-se resistência primária a rifampicina associada a isoniazida em 6 (26,0%).
Entre os 97 pacientes com história de tratamento prévio, com o MP, observou-se
resistência a rifampicina associada a isoniazida em 46 (47,4%). Com uso da técnica
MODS observou-se resistência a rifampicina associada a isoniazida em 55 (57,9%).
Entre os 25 pacientes com suspeita de recidiva, com o MP, observou-se resistência a
rifampicina associada a isoniazida em 4 (16,0%). Com uso da técnica MODS observou-
se resistência a rifampicina associada a isoniazida em 5 (22,7%). Entre os 62 pacientes
em falência do tratamento, com o MP, observou-se resistência a rifampicina associada
a isoniazida em 40 (64,5%). Com uso da técnica MODS observou-se resistência a
rifampicina associada a isoniazida em 46 (73,0%).
Entre os 10 pacientes com história prévia de abandono, com o MP, observou-se
resistência a rifampicina associada a isoniazida em 2 (20,0%). Com uso da técnica
MODS observou-se resistência a rifampicina associada a isoniazida em 4 (36,4%).
(Tabela 2)
98
Tabela 2 – Perfil de re sistência aos fármacos anti-TB em pacientes incluídos no estudo
de acordo com a hi stória de t ratamento prévio e o método u tilizado, se gundo os
resultados concordantes inter-amostras em cada método separadamente.
Resistência aos fármacos Método de Proporções* Técnica MODS*
N= 126 (%) N=117 (%)
Geral
Pelo menos 1 fármaco 17 (13,5%) 17 (14,5)
Isoniazida 14 (11,1) 14 (11,9)
Rifampicina 3 (2,4) 3 (2,6)
Rifampicina+isoniazida 53 (42,0) 61 (52,1)
Virgem de Tratamento
N=29 N=23
Pelo menos 1 fármaco 2 (6,9) 3 (13,0)
Isoniazida 2 (6,9) 3 (13,0)
Rifampicina - -
Rifampicina+isoniazida 7 (24,1) 6 (26,0)
Tratamento anterior
N=97 N= 95
Pelo menos 1 fármaco 15 (15,4) 14 (14,7)
Isoniazida 12 (12,4) 11 (11,6)
Rifampicina 3 (3,1) 3 (3,2)
Rifampicina+isoniazida 46 (47,4) 55 (57,9)
Suspeita de recidiva
N=25 N=22
Rifampicina+isoniazida 4 (16,0) 5 (22,7)
Falência de tratamento N=62 N=63
Rifampicina+isoniazida 40 (64,5) 46 (73,0)
Abandono
N=10 N=11
Rifampicina+isoniazida 2 (20,0) 4 (36,4)
99
Entre os 142 pacientes (318 amostras clínicas), com o MP e a técnica MODS,
observou-se respectivamente que em 16 (11,3%) e em 23 (16,2%) pacientes houve
diferença no padrão de resistência entre as suas amostras, maioria entre aqueles em
recidiva e falência do tratamento (Tabela 3). Entre os 31 pacientes virgens de
tratamento, com MP e a técnica MODS, observou-se respectivamente que em dois
(6,4%) e em 06 (19,3%) pacientes houve diferença no padrão de resistência entre as
suas amostras. Entre os 111 pacientes com história prévia de tratamento anti-TB, com
MP e a técnica MODS, observou-se respectivamente que em 14 (12,6%) e em 13
(11,7%) pacientes houve diferença no padrão de resistência entre as suas amostras,
sendo a maioria entre aqueles em recidiva ou em falência do tratamento (tabela 3). A
freqüência do padrão de resistência a ambos os fármacos, INH e RMP foi maior
naqueles com suspeição de falência, sendo que, com a técnica MODS houve maior
número de casos discordantes em relação ao encontrado pelo MP. Em relação ao
padrão de resistência a INH e RIF de modo isolado, resultados discordantes foram
mais freqüentes nos pacientes em falência, tanto no MP como com a técnica MODS.
A freqüência do perfil múltiplo encontrado foi predominante também entre
pacientes em falência do tratamento. Na comparação entre o método MP e técnica
MODS, observou-se que MODS detecta mais resistência nos perfis de resistência
isolada a isoniazida ou sensibilidade a isoniazida e rifampicina.
Tabela 3. Método das proporções e MODS. Perfil de Sensibilidade encontrado
nas amostras respiratórias coletadas pr ovenientes de 142 pacientes segun do
história clínica de TB.
100
Historia Clinica Perfil de Sensibilidade a INH e RMP
RR* RS* RR**
SS
RS**
SS
RR**
RS
SR* RR**
SR
SS* RS***
SR
SS
SR**
SS
Caso Novo (N= 31)
MP 07 02 02 ----- ----- ----- ----- 20 ----- ----
MODS 06 03 05 02 ----- ----- ----- 14 ---- 01
Recidiva (N= 28)
MP 04 01 02 01 --- --- --- 20 --- ---
MODS 05 03 02 02 01 --- --- 14 --- 01
Suspeita de Falência
(N =70)
MP 40 10 01 02 01 03 03 09 01 ---
MODS 46 06 02 01 03 03 01 08 ---- ----
Abandono (N=13)
MP 02 01 --- 02 01 --- --- 07 --- ---
MODS 04 02 --- 02 --- --- --- 05 --- ---
Total
MP 53 14 05 05 02 03 03 56 01 ---
MODS 61 14 09 07 04 03 01 41 --- 02
RR: resistência à INH e RMP; RS: resistência à INH e sensibilidade à RMP; SS: sensibilidade à INH e à RMP; SR: sensibilidade à
INH e resistência à RMP.
* Um padrão de sensibilidade encontrado em amostras respiratórias/paciente;
** Dois padrões de sensibilidade encontrado com discordância inter-amostras/paciente;
*** Três padrões de sensibilidade encontrado com discordância inter-amostras/paciente.
5.2. Distribuição da população incluída no estudo de acordo com HIV
101
Quanto aos resultados da sorologia anti-HIV avaliados em 124 pacientes, esta
foi positiva em 23 pacientes (18,5%). (Tabela 4). À comparação sobre as características
demográficas e os fatores associados entre pacientes HIV positivos e HIV negativos,
observou-se que no grupo de pacientes HIV positivos, foi menos freqüente o sexo
masculino (p=0,01), tipo de entrada em falência do tratamento (p=0,04), história prévia
de tratamento anti-TB (p=0,01).
Tabela 4. Características demográficas e fato res associado s em 124 pacientes
com resultados do teste sorológico para HIV incluídos no estudo.
102
5.3. Estratificação por HIV, teste de sensibilidade e história clinica, ao Método das
proporções e ao MODS.
Cento e vinte e quatro pacientes com resultado do teste anti-HIV disponível
foram classificados de acordo com o perfil de resistência obtido por ambos os testes.
HIV Positivo HIV Negativo Odds Ratio
IC (95%)
Valor de p
1. Sexo
Masculino
08 64 0,38 (0,17-0,84)
Feminino
15 37 1 0,01
2. Idade
Media
35,5 38,4
Mediana
39 38 0,52
3. Tipo de Entrada
Suspeita de Falência 06 53 0,38 (0,16-0,92)
Outros: 17 48 1 0,04
Abandono 01 10
Suspeita de Recidiva 06 21
Casos Novos 10 17
4. Fator de Risco
Suspeita de Falência 06 50 0,42 (0,18-1,01)
Outros: 17 51 1 0,04
Abandono 01 12
Suspeita de Recidiva 06 18
Contato TB MDR --- 11
População de Rua 10 10
5. Historia Previa de TB
Sim
14 84 0,41 (0,20-0,84)
Não
09 17 1 0,01
6. Desfecho
Clinico (Trat. anterior)
Cura 03 16 1,23 (0,37-4,04)
Desfavorável: 10 68 1 0,71
Falência + Abandono
Ignorado
1 ----
7. Padrão Radiológico
Normal 01 --- 5,5 (3,79-8,09)
TB ativa 22 100 1 0,18
Ignorado 01 -
103
Pelo MP, foram incluídos 109 pacientes que apresentaram resultados de
sensibilidade concordantes inter-amostras, sendo 20 HIV positivos e 89 HIV
negativos. Pela técnica MODS, foram incluídos 103 pacientes com resultados
concordantes inter-amostras, sendo 19 HIV positivos e 84 HIV negativos.
Por meio do MP, entre 20 pacientes HIV positivos, resistência pelo menos a
um fármaco e resistência a rifampicina associada a isoniazida foi observada
respectivamente em 1 (5,0%) e em 9 (45%) dos casos. Entre os 89 pacientes HIV
negativos, resistência a pelo menos um fármaco e resistência a rifampicina associada
a isoniazida ocorreu respectivamente em 14 (15,7%) e em 33 (37,0%) dos casos.
Por meio da técnica MODS, entre 19 pacientes HIV positivos, resistência pelo
menos a um fármaco e resistência a rifampicina associada a isoniazida foi observada
respectivamente em 2 (10,5%) e em 8 (42,0%) dos casos. Entre os 84 pacientes HIV
negativos, resistência a pelo menos um fármaco e resistência a rifampicina associada a
isoniazida ocorreu respectivamente em 12 (14,3%) e em 41 (38,8%) dos casos.
(Tabela 5)
104
Tabela 5 – Perfil de resistência aos fármacos anti-TB dos pacientes incluídos no
estudo com resultado anti-HIV, de acordo co m a história de tratamento prévio e o
método utilizado, segundo os resultados c oncordantes inter-amostras analisadas
em cada método separadamente.
Resistência aos fármaco
s
Método de Proporções*
Técnica MODS*
HIV + HIV - HIV + HIV -
N=20 (%) N= 89 (%) N=19 (%) N= 84 (%)
Geral
Pelo menos 1 fármaco 1 (5,0) 14 (15,7) 2 (10,5) 12 (14,3)
Isoniazida 1 (5,0) 12 (13,5) 1 (5,3) 9 (10,7)
Rifampicina - 2 (2,3) 1 (5,3) 3 (3,6)
Rifampicina+isoniazida 9 (45,0) 33 (37,0) 8 (42,1) 41 (48,8)
Virgem de Tratamento N= 9 N= 16 N=9 N=10
Pelo menos 1 fármaco - 1 (6,2) - 2 (20,0)
Isoniazida - 1 (6,2) - -
Rifampicina - - - 2 (20,0)
Rifampicina+isoniazida 3 (30,0) 2 (12,5) 3 (30,0) 1 (10,0)
Tratamento anterior N= 11 N= 73 N=10 N= 72
Pelo menos 1 fármaco 1 ( 9,1) 13 ( 17,8) 2 (20,0) 10 (13,8)
Isoniazida 1 ( 9,1) 11 ( 15,1) 1 (10,0) 9 (12,5)
Rifampicina - 2 (2,7) 1 (10,0) 1 (1,4)
Rifampicina+isoniazida 6 ( 54,5) 31 (42,5) 5 (50,0) 40 (55,5)
Entre os 124 pacientes (302 amostras clínicas), com o MP observou-se
respectivamente entre 23 pacientes HIV positivos e 101 HIV negativos que em 3
(13,1%) e em 12 (11,9%) pacientes houve diferença no padrão de resistência entre as
105
suas amostras. Resultados discrepantes entre amostras ocorreram em 2 pacientes
virgens de tratamento (sendo um destes, paciente HIV positivo) e em 15 pacientes
com história de tratamento anterior (3 casos em pacientes HIV positivos) (tabela 6).
Com a técnica MODS observou-se respectivamente entre 23 pacientes HIV
positivos e 101 HIV negativos que em 4 (17,4%) e em 19 (18,9%) pacientes houve
diferença no padrão de resistência entre as suas amostras, similar ao observado com
o MP, a maioria de exames discordantes ocorreu entre aqueles com história de
tratamento anterior. Resultados discrepantes entre amostras ocorreram em 8
pacientes virgens de tratamento (somente 1 caso em paciente HIV positivo) e em 15
pacientes com história de tratamento anterior (3 casos em pacientes HIV positivos).
Houve um maior número de resultados discrepantes entre amostras em pacientes HIV
negativos, virgens de tratamento (n=7) (Tabela 6).
106
Tabela 6. Método das Proporções: Pe rfil de Sensibilida de encontrado nas
amostras respiratórias coletadas provenientes de 124 pacientes com resultad o
do teste sorológico para HIV segundo história clínica de TB.
Historia Clinica Perfil de Sensibilidade a INH e RMP
RR* RS* RR**
SS
RS**
SS
RS**
RR
SR* SR**
RR
SS* SS***
RS
SR
SR**
SS
total
Caso Novo
HIV + 03 --- 01 ----- ----- ----- ----- 06 ----- ---- 10
HIV- 02 01 01 ----- ----- ----- ----- 13 ---- ---- 17
Recidiva
HIV + 02 --- 01 --- --- --- --- 03 --- --- 06
HIV- 02 01 01 01 --- --- --- 16 --- ---- 21
Suspeita de Falência
HIV + 04 01 --- --- --- --- ---- 01 --- --- 06
HIV- 27 09 01 02 01 02 02 08 01 ---- 53
Abandono
HIV + --- --- --- 01 --- --- --- --- --- --- 1
HIV- 02 01 --- 01 01 --- --- 05 --- --- 10
Total
HIV + 09 01 02 01 --- --- --- 10 --- --- 23
HIV- 33 12 03 04 02 02 02 42 01 --- 101
RR: resistência à INH e RMP; RS: resistência à INH e sensibilidade à RMP; SS: sensibilidade à INH e à RMP; SR: sensibilidade à
INH e resistência à RMP. *Um padrão de sensibilidade encontrado nas amostras/ paciente; **Dois padrões de sensibilidade
encontrado com discordância inter-amostras/paciente; ***Três padrões de sensibilidade encontrado com discordância inter-
amostras/paciente.
107
Tabela 7. Método MODS: Padrão de sensibilidade encontrado nas amostras
respiratórias coletadas provenientes d e 124 pacientes co m resultado do teste
sorológico para HIV segundo história clínica de TB.
Historia Clinica Perfil de Sensibilidade a INH e RMP
RR* RS* RR**
SS
RS**
SS
RS**
RR
SR* SR**
RR
SS* SS***
RS
SR
SR**
SS
total
Caso Novo
HIV + 03 --- 01 ----- ----- ----- ----- 06 ----- ---- 10
HIV- 01 02 04 02 ----- ----- ----- 07 01 ---- 17
Recidiva
HIV + 02 --- 01 --- 01 --- --- 01 01 --- 06
HIV- 03 03 01 01 01 --- --- 12 --- ---- 21
Suspeita de Falência
HIV + 03 01 --- --- --- 01 ---- 01 --- --- 06
HIV- 33 05 01 01 03 01 01 07 01 ---- 53
Abandono
HIV + --- --- --- --- --- --- --- 01 --- --- 1
HIV- 04 01 --- 02 --- --- --- 03 --- --- 10
Total
HIV + 08 01 02 --- 01 01 --- 09 01 --- 23
HIV- 41 11 06 06 04 01 01 29 02 --- 101
RR: resistência à INH e RMP; RS: resistência à INH e sensibilidade à RMP; SS: sensibilidade à INH e à RMP; SR: sensibilidade à
INH e resistência à RMP. * padrão de resistência encontrado nas amostras; ** padrão de resistência encontrado com discordância
inter-amostras; *** padrão de resistência encontrado com discordância inter-amostras.
108
5.4. Distribuição do s 142 pacientes de aco rdo co m classificação de risco de
resistência a uma ou mais de um fármaco e o desfecho clínico dos casos,
segundo o padrão de resistência pelo Método das Proporções e do MODS
Dos 142 pacientes incluídos na análise do estudo, obteve-se informação quanto ao
desfecho clínico, em 120 pacientes. Destes, 51 obtiveram cura / favorabilidade; 20
falências; 27 abandono e 22, óbito. Na tabela 8 estão descritos os resultados de teste
de sensibilidade por meio da técnica MODS e MP de acordo com evolução favorável e
desfavorável ao tratamento anti-TB.
109
Tabela 8 – Distribuição dos 93 pacien tes quanto ao risco de resistência e o
desfecho clínico do s casos, segundo o padrão de sensibilidade por ambos os
métodos
Padrões de Sensibilid
encontrados nos teste
s
Risco Desfecho Clinico
Desfavorável Favorável
MODS MP MODS MP
1.RR* 1. Alto Risco 18 13 09 09
2. Sem alto risco 04 01 07 07
2.RS* 1. Alto Risco 04 06 01 02
2. Sem alto risco ---- 02 05 02
3.SR* 1. Alto Risco 01 02 01 01
2. Sem alto risco ---- ---- ---- ---
4. SS* 1. Alto Risco 02 03 01 01
2. Sem alto risco 02 05 17 26
5.RR** RS 1. Alto Risco 02 01 02 ---
2. Sem alto risco --- 01 ---- ----
6. RR**SR 1. Alto Risco 01 02 --- ---
2. Sem alto risco ---- --- --- ----
7. RR**SS 1. Alto Risco 02 01 ---- ----
2. Sem alto risco 02 01 03 02
8. RS**SS 1. Alto Risco 01 02 01 ----
2. Sem alto risco ---- 01 03 01
9. RS*** SR SS 1. Alto Risco --- 01 ---- ----
2. Sem alto risco ----- --- --- ----
10. SR**SS 1. Alto Risco ---- ---- ---- ----
2. Sem alto risco --- ---- 01 01
RR: resistência à INH e RMP; RS: resistência à INH e sensibilidade à RMP; SS: sensibilidade à INH e à RMP; SR: sensibilidade à
INH e resistência à RMP. *Padrão de sensibilidade encontrado nas amostras; ** padrão de sensibilidade encontrado com
discordância inter-amostras; *** padrão de sensibilidade encontrado com discordância inter-amostras. LJ: Método das proporções;
MODS: Microscopic Observation Direct Sensitivity.; NTBMR: não TBMR
110
Na tabela 9, observa-se o rendimento diagnóstico do critério de alto risco para
identificar TB multirresistente entre pacientes com amostras concordantes, assumindo o
padrão ouro o Método de proporções.
Tabela 9. Diagnóstico de TBMR entre pacientes com amostras concordantes de
acordo com o risco de TB resistente
Risco clínico de
resistente
Resistência
RMP+ INH
Sens.
(IC 95%)
Espec.
(IC 95%)
RV+
RV-
SIM Não
Alto 22 15
73,3% (63,6-82,9)
70% (60,2-80,7)
2,4
0,38
Intermediário ou baixo 08 35
RV+: razão de verossimilhança positiva, RV-: razão verossimilhança negativa
A comparação do grau de risco com o desfecho clínico dos casos, observou-se
que aqueles com história ou suspeita de falência tem 3 vezes mais chance de ter
evolução desfavorável. [OR=3,45 (1, 923 – 6,198); p=0,0001]. [dados não mostrados]
5.5. Distribuição do s 142 p acientes de acordo co m os resu ltados co mparativos
dos testes de sensibilidade, segundo o Método das Proporções e do MODS
Quanto à análise de concordância entre os testes MODS e Método das
Proporções observou-se que dentre os 142 pacientes, 99 pacientes (69,7%) obtiveram
concordância entre os resultados dos testes MODS e LJ para a detecção de resistência
a INH e a INH e 43 (30,3%) apresentaram alguma discordância entre os resultados dos
testes para INH; e/ou para RMP; e/ou para INH e RMP.
111
Entre os 99 pacientes com testes concordantes, evidenciou-se que 3 pacientes
apresentaram resultados concordantes nos testes MODS e LJ, porém com diferentes
resultados quanto ao padrão de resistência encontrado ao ser analisada as múltiplas
amostras provenientes do mesmo paciente. Dentre estes 3 pacientes, 2 eram casos
novos de TB tendo como fatores de risco: ser contato de TBMR em 1 e o outro
infectado pelo HIV. O terceiro paciente tinha história clínica prévia de TB com cura pós-
tratamento e infectado pelo HIV. Nestes 3 pacientes, 2 eram do sexo feminino e 1 do
sexo masculino.
Quanto à análise das características demográficas e dos fatores associados a
resistência aos fármacos anti-TB, a comparação dos dois grupos de pacientes, aqueles
que apresentaram resultados concordantes por ambos os métodos utilizados e aqueles
com resultados discordantes, não se observou nenhuma diferença significante entre
eles. (Tabela 10).
112
Tabela 10. Características demográficas e fa tores associados aos grupos d e
pacientes com resultados concordantes e com resultados discordantes.
Resultados Odds ratio
IC 95%
Valor de p
Conc ordantes
N=99 (%)
Discordantes
N=43 (%)
1. Sexo
Masculino
58 (58,6) 28 (65,1) 0,92 (0,72-1,14)
Feminino
41 (41,4) 15 (38,9) 0,75
2. Idade
Media
36,9 40,3
Mediana
37,0 39,0 0,35
3. Tipo de Entrada
Suspeita de Falência 49 (49,5) 20 (47,6) 1,00 (0,81-1,25)
Outros 50 (50,5) 22 (52,4) 1 0,94
Abandono 06 (12) 07 (31,8)
Recidiva 20 (40) 07 (36,4)
Casos Novos 24 (48) 07 (31,8)
4. Fator de Risco
Suspeita de Falência 46 (46,5) 21 (48,8) 0,97 (0,78-1,20)
Outros 53 (53,5) 22 (51,2) 1 0,79
Abandono 07 (7,1) 07 (31,8)
Recidiva 17 (17,2) 08 (36,4)
Contato TBMR 1 (10,1) 02 (9,1)
População de Rua 19 (19,2) 05 (22,7)
5. Historia Previa de TB
Sim 75 (75,8) 36 (83,7) 0,87 (0,69-1,09)
Não 24 (24,2) 07 (16,3) 1 0,29
6. Desf echo Cli
(Tratamento anterior)
Cura 14 (18,6) 07 (19,5) 1,01 (0,72-1,41)
Desfavorável: 60 (80) 29 (80,5) 1 0,94
Falência 43 (71,6) 19 (65,5)
Abandono 17 (28,4) 10 (34,5)
Ignorado 01 (1,4) ---
7. HIV
Positivo 19 (19,2) 04 (9,3) 1,34 (1,02-1,65)
Negativo 63 (63,6) 37 (86,1) 1 0,07
Ignorado 17 (17,2) 02 (4,6)
113
No grupo dos 99 pacientes com resultados concordantes inter–testes e inter-
amostras , MODS e MP, a distribuição evidenciada sob a variável risco foi: risco alto,
49 %(51%); risco intermediário, 26% e risco baixo, 22,9%.
5.6 Acurácia do teste MODS na detecção de resistência a INH e a RMP nas
amostras respiratórias dos pacientes incluídos no estudo.
Conforme descrito na tabela 11, ao analisarmos a detecção de resistência no
total das 318 amostras evidenciou-se que, a técnica MODS mostrou uma sensibilidade
e especificidade, isoladamente, para INH de 96,5 % e 79,8 %; concordância de 0,775
(Kappa); e diferença significativa entre os resultados discordantes obtidos pelo MODS e
MP (p=0,001).
Tabela 11. Análise da acurácia dos te stes MODS e Método de Proporções par a
detecção de resistência a INH e RMP em 318 amostras respiratórias.
Resistência
pela técnica
MODS
Ausência
Resistência
pelo MP
Ausência
Resistência
pelo MP
Sens
IC 95%
Espec
IC 95%
RV+ RV- Valor de p
Isoniazida
Presente 68 29
Ausente 06 115 96,5%
(95,4-97,5)
79,8%
(75,3-84,2)
27,5 0,043 0,001
Rifampicina
Presente 34 25
Ausente 06 153 95,7%
(93,4-97,9)
85,9%
(82,1-89,7)
22,2 0,05 0,0001
INH: Isoniazida; MODS: Microscopic Observation Direct Sensitivity. *: teste McNemar; RV+: razão de
verossimilhança positiva, RV-: razão verossimilhança negativa
114
Para a detecção de RMP, a técnica MODS mostrou sensibilidade e
specificidade respectivamente de 95,7% e 85,9%; concordância de 80,5% (Índice de
Kappa) e diferença significativa entre os resultados discordantes obtidos pelo MODS e
MP (p=0,001).
5.7. Avaliação dos 43 pacientes com r esultados discordantes segundo o Método
das Proporções e o MODS e, com result ados concordantes entre estas técnicas,
porém discordantes inter-amostras.
Foram selecionadas, para repique, 92 culturas de M.tb provenientes de 43
pacientes com resultados discordantes entre as técnicas MP e MODS, e as 06 culturas
provenientes de 3 pacientes que apresentaram resultados concordantes entre os testes
MODS e LJ, porém com resultados diferentes inter-amostras, no intuito de que,
posteriormente, fosse realizado o seqüenciamento para a detecção de mutações nos
genes katG, inhA(or) e inhA (reg), ahpC e rpoB. Destas, 74 (70,4%) foram recuperadas
e encaminhadas para a realização do sequenciamento. As demais não obtiveram
crescimento e/ou apresentaram contaminação. Nesta etapa, houve uma perda de 05
cepas sendo então realizado o sequenciamento para detecção de mutação no gene
katG em 69 (65,7%) cepas referentes a 35 pacientes com resultados discordantes aos
testes MODS e LJ e 03 pacientes com concordância aos testes mas resultados
diferentes quanto ao padrão de sensibilidade inter-amostras num total referente a 38
pacientes (Fluxograma 4).
115
Fluxograma 4. Pacientes elegíveis e incluídos para avaliação molecular para detecção
de resistência a INH e a RMP.
5.7.1. Resultados do seqüenciamento para detecção de resistência a INH
Quanto aos resultados em relação ao KatG, das 69 cepas analisadas 03 (4,3%)
referente a 03 pacientes tiveram resultados inconclusivos; 21(30,4%) apresentaram
mutação e 45 (65,2%) não a apresentaram. Dentre as 21 cepas com mutação presente
em katG, observou-se que em 95,2% (20/21) a mutação ocorreu no códon 315 e em
4,8% (1/21) , no códon 216. Naquelas 27 cepas nas quais apresentavam padrão de
resistência a INH ao teste de sensibilidade MODS e/ou LJ, não foi evidenciada mutação
e/ou sequenciamento inconclusivo para KatG, foi realizado seqüenciamento adicional
Total de Pacientes Elegíveis: 46
Total de culturas BK para repique: 92
Total de culturas BK encaminhadas para
seqüenciamento: 74
Perdas: 05
Total de pacientes incluídos para
avaliação : 38
Total de cepas: 69
116
para mutações em inhA (or); inhA (reg) e ahpC. Foram identificadas 03 cepas com
mutações, sendo 02 cepas com mutação em inhA (reg) no lócus C(-15T) e 01 cepa
com mutação em ahpC no lócus G(-6)A. (Tabela 13).
Tabela 12. Freqüência de mutações encontradas em katG; inhA (reg e org) e
ahpC.
Mutações Alvo
para INH
N % Locus
KatG
21 30,9 % (21/69) Codon 315 95,2%
Códon 216 4,8%
Outras mutações:
InhA (org) ------ -----
InhA (reg) 02 7,4% (2/27) C (-15T)
AhpC 01 3,7% (1/27) G (-6)A
katG: gene katG; inhAorg:gene inhA estrutural; inhAreg: gene inhA regulatótio; ahpÇ: gene ahpC
Utilizando o sequenciamento como padrão ouro para a detecção de
resistência a INH sendo o alvo a mutação no gene katG, encontrou-se que, para o
teste MODS, a sensibilidade, especificidade e kappa foi respectivamente de 85,7% e
43,2% e 0,227. Para o MP, a sensibilidade, especificidade e índice de Kappa foi
respectivamente de 76,2% e 73,2% e 0,503.
Considerando os resultados do sequenciamento para ahpC; inhA(or); inhA® e
KatG para detecção de resistência à INH, de forma global, em relação aos resultados
do teste MODS observou-se uma sensibilidade e especificidade, de 87,5% e 43,2% e
para o MP, de 79,1% e 81,8%, respectivamente . Os valores de kappa foram baixos
tanto para MODS, 0,25 como para o MP, 0,59. O teste de McNemar foi significante no
MODS (p= 0,0001). (Tabela 13).
117
Tabela 13. Sequenciamento para detecção de mutações nos genes katG, inhA (or)
e (reg) e ahpC x MODS e Método de proporções p ara detecção de resistência a
isoniazida (INH).
Resistência a INH Presença
Mutações INH
Ausência
Mutações INH
Sens
IC 95%
Espec
IC 95%
RV+ RV- Valor de p
MODS*
Presente 21 25
Ausente 03 19 87,5%
(79,6-95,3)
43,2%
(31,5-54,9)
7,0 0,29 0,01
MP**
Presente 9 08
Ausente 05 86 79,1%
(74,5-83,5)
81,8%
(77,6-86,03)
3,78 0,25 0,0001
* Kappa : 25%; ** Kappa: 59%: RV: RV+: razão de verossimilhança positiva, RV-: razão
verossimilhança negativa
5.7.2. Resultados do seqüenciamento para detecção de resistência a RMP.
Em relação ao sequenciamento para a detecção de resistência a RMP onde o
gene alvo foi o rpoB, evidenciou-se que das 74 cepas encaminhadas para o
sequenciamento, este foi realizado em 68. Dentre estas, os resultados obtidos foram:
em 40 (58,8%) cepas não foi detectada mutação; 03 (4,4%) foram inconclusivos; 25
(36,8%) apresentaram mutação em rpoB com maior freqüência absoluta encontrada no
códon 531 (TCG-TTC) e no códon 513 (CAA – CCA). (Tabela 14)
118
Tabela 14. Lócus e f reqüência absoluta d as mutações encontradas em 25 cep as
no gene rpoB
Lócus Freqüência
(N absoluto)
Códon 513 (CAA – CCA) 04
Códon 516 (GAC-GTC) 01
Códon 516 (GAC-TAC) 03
Códon 517 (CAG) 02
Códon 526 (CAC-TCC) 02
Códon 526 (CAC-CTC) 03
Códon 531 (TCG-TTC) 05
Códon 531 (TCG-TGG) 02
Códon 533 (CTG-CCG) 01
Códon 514 (TTC-GTC) e códon 531 (TCG-T
G
01
GGC (Gly) - GGA(Gly) Códon 517
AGC (Ser) - TCC(Ser) Códon 512
CAA(Gln) -CAG(Gln) Códon 513
TCG (Ser) -TCC(Ser) Códon 522
GGG(Gly) -GGA(Gly) Códon 523
TTG(Leu) -CTG(Leu) Códon 524
CGA(Arg) -CGC(Arg) Códon 529
CTG(Leu) -CTC(Leu) Códon 530
GGG(Gly) -GGC(Gly) Códon 534
CCA(Pro)-CCG(Pro) Códon 535
01
Utilizando o sequenciamento como padrão ouro para a detecção de resistência
a RMP, sendo o alvo a mutação em rpoB, encontrou-se que, para o teste MODS, os
seguintes resultados: a sensibilidade de 76%, especificidade de 75%, concordância
de 0,495 (Índice de Kappa). O MP apresentou sensibilidade de 40%, especificidade
119
de 92%, e concordância de 0,357 (Índice de Kappa). Observou-se diferença
significativa entre os resultados discordantes obtidos pelo MODS e MP em relação ao
seqüenciamento (p=0,0001).
O teste de McNemar foi significante para MP. A amostra total analisada foi de
65 cepas devido a exclusão de 3 cepas as quais tiveram o resultado inconclusivo no
sequenciamento para o gene rpoB. (Tabela 15).
Tabela 15. Sequenciamento para detecção de mutações no g ene RpoB x MODS e
Método de proporções para detecção de resistência a rifampicina (RMP).
Resistência a RMP Presença
Mutações RMP
Ausência
Mutações INH
Sens
IC 95%
Espec
IC 95%
RV+ RV- Valor de p
MODS*
Presente 19 10
Ausente 06 30 76,0%
(65,6-86,3)
75,0%
(72,9-77,1)
3,16 0,32 0,0000
MP**
Presente 10 03
Ausente 05 87 40,0%
(28,1-51,9)
92,5%
(86,1-98,9)
1,6 0,66 0,003
* Kappa : 0,49; ** Kappa: 0,36: RV: RV+: razão de verossimilhança positiva, RV-: razão
verossimilhança negativa
Para avaliar a acurácia de ambos os métodos para a resistência a INH em
relação ao seqüenciamento, segundo o desfecho clínico, considerando o número total
de amostras dos casos discordantes, encontrou-se: no grupo desfavorável, ao MODS
e Método das Proporções, respectivamente sensibilidade de 89,4% e 44,4%;
especificidade de 73% e 72,2%, concordância de 0,343 e 0,459 (Índice de kappa). No
120
grupo favorável, a técnica MODS e MP apresentaram o seguinte rendimento:
respectivamente de sensibilidade de 75% e 100%, especificidade de 33,3% e 94%,
concordância de 0,861 e 0,40 (Índice de kappa) (Tabela 16).
Tabela 16 . Avaliação da acurácia do tes te MODS e do Método das Proporçõ es
para detecção de r esistência a INH x seqüenciamento das amostras segund o
desfecho clínico dos pacientes.
Desfecho Clinico Mutação INH Sens Espec Valor de p
Sim Não
Grupo Desfavorável
MODS
Resistente 17 10
Sensível 02 08 89,4 44,4 0,029
MP
Resistente 14 05
Sensivel 05 13 73,7 72,2 0,009
Grupo Favorável
MODS
Resistente 03 12
Sensível 01 06 75,0 83,3 0,000
MP
Resistente 04 01
Sensivel ---- 17 100,0 94,4 0,001
121
Na tabela 17 estão descritos os resultados da acurácia de ambos os métodos
para a resistência a RMP em relação ao seqüenciamento, segundo o desfecho clínico,
considerando o número total de amostras dos casos discordantes. Encontrou-se: no
grupo desfavorável, ao MODS e MP, respectivamente sensibilidade de 89,5% e
50,0%; especificidade de 62,5% e 87,5%, concordância de 0,343 e 0,459 (kappa). No
grupo favorável, a técnica MODS e MP apresentaram o seguinte rendimento:
respectivamente de especificidade de 55,6% e 94,7%, concordância de 0,40 e 0,86 (
kappa).
122
Tabela 17 . Avaliação da acur ácia do teste MODS e do Método das Proporções
para detecção de resistência a RMP x seqüenci amento das amostras segundo
desfecho clínico dos pacientes
Desfecho Clinico Mutação RMP Sens Espec Valor de p
Sim Não
Grupo Desfavorável
MODS
Resistente 17 06
Sensível 03 10 89,5 62,5 0,005
MP
Resistente 10 06
Sensivel 10 10 60,0 87,5 0,032
Grupo Favorável
MODS
Resistente ---- 01
Sensível 02 18 94,7 1,000
MP
Resistente ---- 01
Sensivel 02 18 94,7 1,000
Na tabela 18, observam-se os valores comparativos entre a sensibilidade e a
especificidade encontrados entre as técnicas MODS e MP (usando seqüenciamento
como padrão ouro) no número total das amostras dos pacientes com resultados
discordantes e aqueles encontrados por amostra coletada (1ª; 2ª e 3ª ) referente a cada
paciente. Ressalta-se que há variação nos respectivos valores de sensibilidade e
especificidade tanto no MODS como no MP. No grupo desfavorável, MODS apresentou
melhor sensibilidade do que o MP enquanto que este último melhor especificidade. O
mesmo não ocorreu no grupo favorável.
123
No entanto, no grupo desfavorável, ao se comparar se há diferença nos valores
encontrados, tanto no MODS como no MP, observa-se que os valores de intervalo de
confiança se sobrepõem indicando que não houve diferença entre as amostras 1 e 2.
Para o MODS, 1ª amostra, IC= (79,7 – 100); 2ª amostra, (65,4 – 98,2). Para o MP, os
valores respectivos foram: IC= (56,5 – 83,9) e IC= (43,3 – 83,9). Para a amostra 3, não
foi realizado devido ao pequeno número total de amostras.
124
Tabela 18. Avaliação da acurácia do MODS e Mé todo das Proporções x
Sequenciamento para detecção de resistência a INH e a RMP, segundo desfecho
clínico: valores co mparativos, global e por am ostra respiratória/paciente n o
grupo com resultados discordantes.
Desfecho Clínico
Mutação INH
Total de Amostras
Amostras
Global 1 2 3
Mutação RMP
Total de Amostras
Amostras
Global 1 2 3
Grupo Desfavorável
a) MODS:
Sensibilidade
Especificidade
b) Método das Proporções:
Sensibilidade
Especificidade
Grupo Favorável
a) MODS:
Sensibilidade
Especificidade
b) Método das Proporções:
Sensibilidade
Especificidade
89,5%
44,4%
73%
72,2%
75%
33,3%
100%
94%
91,6%
33%
75%
55%
50%
50%
100%
100%
81,8
%
30%
63,6
%
80 %
66,3
%
11,1%
100
%
88%
100%
100%
100
%
100%
85
%
62,5%
50%
87,5%
----
78,9%
----
94,7%
92,3%
62,5%
53,8%
87,5%
----
90%
----
90%
75%
42,8
%
58,3
%
85,7%
--
--
63,6
%
--
--
90,9
%
100
%
100%
50%
100%
--
--
----
--
--
100
%
125
Na tabela 19, observa-se a acurácia do MODS no diagnóstico de TB resistente
a INH ou RMP em todas as amostras clínicas em relação ao Método das Proporções
de modo isolado entre grupo de resultados concordantes e MP associado ao
sequenciamento entre grupo de resultados discordantes
No diagnóstico de resistência a INH, em relação ao resultado obtido
anteriormente sem o seqüenciamento, houve mudança de resultados no padrão ouro
em 8 amostras com um incremento na especificidade de 79,8% para 82,2% .
No diagnóstico de resistência a RMP, em relação ao resultado obtido
anteriormente sem o seqüenciamento, houve mudança de resultados no padrão ouro
em 22 amostras com um incremento na especificidade de 85,9% para 91,1%.
Tabela 19. Análise da acurácia dos te stes MODS em relação ao Método das
Proporções associado ao Seqüenciamento (katG, inhA e ahpC) e RMP (rpoB) para
detecção de resistência a INH em 318 amostras respiratórias.
MODS Resistência Ausência de
Resistência
Sens Espec RV+ RV- Valor p
INH*
Presente 71 25 96,6% 82,2% 28,4 0,04 0,0001
Ausente 06 116
RMP**
Presente 46 15 96,6% 91,1% 28,4 0,04 0,0001
Ausente 05 155
* Kappa : 0,782; ** Kappa : 0,874: RV+: razão de verossimilhança positiva, RV-: razão verossimilhança
negativa
126
5.8. Spoligotyping
Realizou-se tipagem molecular em 77 cepas referentes a 38 pacientes desta
amostra, por meio da técnica spoligotyping. Dentre estes, em 23 (60,5%) casos
apresentavam pelo menos duas cepas por paciente.
A distribuição encontrada nesta amostra foi: maior freqüência da cepa LAM 9 e
T1 (16,9%), seguida da variante LAM2 (11,7%); Haarlen1 (10,4%); Haarlen 3 (9,1%)
; X 2 (7,9%); Família 36 (5,2%); e as demais, variante LAM 1; LAM 7; S; Família 34;
EAI5 e H37Rv na mesma proporção (2,5%) e LAM 3; X 1;X 3; T 4 e variante
Haarlen 3 na mesma proporção( 1,2%) respectivamente de cada caso. (Tabela 21).
Considerando a distribuição por famílias observou-se as seguintes frequências:
LAM, 35,8%; Haarlen, 20,7%; T, 18,1%; X, 10,3%; Família 36, 5,2%; EAI , 2,5% e
H37Rv, 2,5%.
127
Tabela 20. Distribuição dos resultados da tipagem molecular por spoligotyping
Família Numero de cepas de M.tb (%)
LAM 9 13 16,9
T1 13 16,9
Variante LAM 2 9 11,7
Haarlen 1 8 10,4
Haarlen 3 7 9,1
X2 6 7,9
Família 36 4 5,2
Variante LAM 1 2 2,5
Família 34 2 2,5
EAI5 2 2,5
LAM 7 2 2,5
H37Rv 2 2,5
S 2 2,5
X1 1 1,2
Variante Haarlen 3 1 1,2
X3 1 1,2
LAM 3 1 1,2
T4 1 1,2
Dentre os 23 pacientes dos quais se analisou pelo menos 2 amostras, 08
(34,7%) apresentaram heterorresistência utilizando resultados apenas do método de
proporções, sendo que em 4 pacientes, identificou-se concomitância, superinfecção.
Entre os 23 pacientes, 11 (47,8%) apresentaram infecção policlonal/múltipla
em suas amostras clínicas, sendo que em 10 foi referido tratamento no passado.
Optou-se então, por avaliar a relação entre os resultados da tipagem
molecular; os padrões de resistência pelo MP; os resultados do sequenciamento para
INH e RMP e o desfecho clínico. Em relação ao desfecho clínico destes pacientes
com heterorresistência nota-se que a evolução favorável ocorreu somente em 2
128
casos. Dentre os casos com evolução desfavorável, a cepa LAM esteve envolvida em
2 casos e o mesmo não ocorreu nos casos de evolução favorável. Nestes evidenciou-
se a cepa H37RV ora associada a X2 ora a T1. Os 2 casos que evoluíram para o
óbito, um deles havia a associação da variante LAM 3 e LAM 9 e o outro a X2. Não
houve um padrão único de resistência, aos métodos fenotípicos, nas cepas LAM: 2
apresentaram multirresistência (variante LAM 2 e a LAM 3); sem detecção de
mutações para INH e RMP. Outra cepa em que se evidenciou padrão de
mutlirresistência foi a H37RV com mutações detectadas para INH somente. A cepa X2
apresentou padrão de resistência a INH e a RMP com correspondência aos
resultados encontrados no sequenciamento. (Tabela 21 e 22.)
Tabela 21. Relação entre os resultados do Método de Prop orções, de biologia
molecular e o desfecho clínico nos casos de infecção múltipla associada ou não
a heterorresistência.
129
Pacientes
Tipagem
molecular
Método
proporções
INH / RMP
Sequenciamento
Hetero
Resistência
Sim / Não
TB prévia
Sim/
Não
Desfecho clínic
o
1ª 1. Variante LAM 2
2. S
RR
RR
KatG 315(AGC-ACC)
rpoB: 531(TCG-TTG)
KatG 315(AGC-ACC)
rpoB: sem mutação
Não Sim Falência
2ª. 1. X 2
2. H37RV
SS
RS
KatG inconclusivo; sem
mutações INH
rpoB: sem mutações
KatG inconclusivo; sem
mutações INH
rpoB: sem mutações
Sim Sim Cura
3ª. 1.Variante LAM 1
2. LAM 9
RS
SS
Sem mutações INH e RM
P
Sem mutações INH e RM
P
Sim Sim Óbito
4ª. 1.T 1
2. H37RV
SS
RR
Sem mutação INH
rpoB: 531 (AGC-ACC)
KatG 315 (AGC-ACC)
RpoB: inconclusiva
Sim Sim Cura
5ª. 1. LAM 3
2. T1
RR
SS
Sem mutações INH e RM
P
Sem mutações INH e RM
P
Sim Sim Falência
6a. 1. LAM 9
2. LAM 2
RS
RS
KatG 315 (AGC-ACC)
rpoB: sem mutação
KatG 315 (AGC-ACC)
rpoB: sem mutação
Não Sim Cura
7ª. 1. LAM 7
SS
Sem mutações INH e RM
P
Sem mutações INH e RM
P
Não
Sim Cura
130
2.T 1 SS
8ª. 1. T1
2. X 2
SS
SS
KatG inconclusivo; rpoB
seqüenciamento ruim
Sem mutações INH e RM
P
Não Sim
Óbito
9ª . 1. LAM 9
2.Haarlem 3
SS
SS
KatG 315 (AGC-ACC)
rpoB: sem mutação
Sem mutações INH e RM
P
Não SIM Óbito
10ª . 1. LAM 2
2. X 2
SS
SS
Sem mutações INH e RM
P
Sem mutações INH e RM
P
- NÃO Falência
11ª . 1. LAM 2
2. X 3
SS
SS
Sem mutações INH e RM
P
Sem mutações INH e RM
P
Não SIM Cura
Tabela 21. INH: isoniazida; RMP: rifampicina
131
Tabela 22. Relação entre os resultados do Método de Prop orções, de biologia
molecular e o desfecho clínico nos cas os sem in fecção mú ltipla, com ou sem
heterorresistência.
N. caso
s
Tipagem
molecular
n. amostras
Método
Proporções
INH /RMP
Seqüenciamento
Hetero
Resistênc
i
Sim / Não
TB prévia
Sim/
Não
Desfecho clíni
c
1b. 1. Haarlen
2. Haarlen
3. Haarlen
RS
RS
RS
315 (AGC-ACA)
315 (AGC-ACA)
315 (AGC-ACA)
Não SIM Óbito
2b. 1. X 2
2. X 2
3. X 2
RR
SR
RR
315(AGC-ACC); rpoB: 513(CAA-CCA)
315(AGC-ACC); rpoB: 513(CAA-CCA)
315(AGC-ACC); rpoB: 513(CAA-CCA)
Sim SIM Óbito
3b. 1. H37 RV SS 315(AGC-ACC); rpoB: 513(CAA-CCA - SIM Óbito
4b. 1. Variante LAM 2 SS Sem mutações INH e RMP
- SIM Óbito
6b. 1. LAM 9 SS Sem mutações INH e RMP
- SIM Óbito
7b. 1.LAM 9 RR KatG: 315; rpoB:514 (TTC-GTC);
531(TCG-TGG)
- SIM Obito
8b 1. Haarlen
2. Haarlen
1. RS
2.RS
KatG: sem mutação ; rpoB:517(CAG)
G(-6)A; rpoB:517(CAG)
Não SIM Óbito
9b 1. LAM 9
2. LAM 9
1.SS
2.SS
Sem mutações INH e RMP
Sem mutações INH e RMP
Não SIM Obito
10b. 1. Haarlen 1. RR DNA perdido - SIM Óbito
11b. 1.EAI 15 SS katG:315; sem mutação rpoB - SIM Óbito
12b. 1.EAI 15 RS KatG 315 (AGC-ACC);
RpoB 526(CAC-TCC)
- SIM Falência
13b. 1.Família 37 RS KatG 315 (AGC-ACC); - SIM Falência
132
RpoB 526(CAC-TCC)
14b. 1. Haarlen 1 SR INH: sem mutação; rpoB 531(TCG-TGG) - SIM Falência
15b. 1. H37Rv
2. H37Rv
SS
SR
KatG: sem mutação; rpoB: 531
(TCG-TGG)
KatG: sem mutação; rpoB: 531
(TCG-TGG)
Sim SIM Falência
16b. 1. EAI 15 SS Sem mutações INH e RMP
- SIM Falência
17b. 1. LAM 9
2.LAM 9
3. LAM 9
SS
SS
SS
Sem mutações INH e RMP
katG: sem mutações; 531 (TCG-TGG)
Sem mutações INH e RMP
Não NÃO Cura
18b. 1. Variante LAM 1 SS
SS
Sem mutações INH e RMP
Sem mutações INH e RMP
Não NÃO Cura
19b. 1. Variante LAM 1 SS
SS
Sem mutações INH e RMP
Sem mutações INH e RMP
Não NÃO Cura
20b. 1. Família 34 SS Sem mutações INH e RMP
- SIM Cura
21b. 1. LAM SS Sem mutações INH e RMP
- SIM Cura
22b. 1. H37Rv RR katG:315 - NÃO Cura
23b. 1.H37Rv SS
SS
Sem mutações INH e RMP
Sem mutações INH e RMP
Não SIM Cura
24b. 1. Família 34 SS Sem mutações INH e RMP
- SIM Cura
25b 1. T1 SS Sem mutações INH e RMP
- NÃO Abandono
26b. 1. T1 SS
RS
INH: sem mutações
rpoB: 10 (517;512;513;522;523;524;529;
530;534;535)
Sim SIM Abandono
27b. 1.H37Rv SR katG sem mutações; rpoB:531
(TCG-TGG)
- SIM Abandono
28b. 1.T 1 SS
SS
Sem mutações INH e RMP
INH: sem mutações; rpoB: 531
Sim SIM Abandono
133
(TCG-TTG)
29b. 1.Variante LAM 2 RR
SS
INH: sem mutação; rpoB: inconclusiva
Sem mutações INH e RMP
Sim SIM Abandono
Tabela 22. INH: isoniazida; RMP: rifampicina
134
CAPITULO V- DISCUSSÃO
O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição da técnica MODS no
diagnóstico de resistência a INH e a RMP em pacientes sob risco de albergarem
cepas de M.tb resistentes, atendidos em ambulatório e unidade de internação de
Hospital Geral, referência para o diagnóstico e tratamento de TB, TB resistente e
AIDS, no município do Rio de Janeiro. Algumas publicações anteriores apontaram
para a boa acurácia apresentada e a sua viabilidade em ser aplicado, em países em
desenvolvimento, devido ao baixo custo; rapidez e reprodutibilidade. (CAVIEDES e
cols, 2000; MOORE e cols, 2004; MELLO e cols, 2007). Na maioria dos estudos, foi
analisada a acurácia da técnica MODS sem a avaliação da ocorrência de resultados
discordantes com o padrão ouro, a presença de heterorresistência e/ou infecção
policlonal/múltipla e sua relação com a evolução clínica dos pacientes. Com isto, a
proposta deste estudo foi mais abrangente com a inclusão dos dados clínicos e
laboratoriais dos pacientes e concomitantemente a análise dos resultados
discordantes inter– testes e intra-testes, no MP e na técnica MODS. Para contribuir na
análise laboratorial dos resultados discordantes, utilizamos 2 métodos: o
Seqüenciamento para pesquisa de mutações em genes alvo para INH e RMP e o
Spoligotyping para avaliação da possibilidade de heterorresistência associada ou não
à infecção policlonal/múltipla de cepas de M.tb.
Avaliou-se a acurácia da técnica MODS para detecção de resistência a INH e a
RMP com resultados semelhantes aos da literatura, porém, com pequenas variações
na especificidade para detecção de resistência a INH e RMP. Tal fato pode ser
atribuído a diferente metodologia utilizada em nosso estudo, com a determinação do
tempo de leitura dos testes de sensibilidade, 14 dias após o crescimento identificado
135
nos poços das microplacas sem os fármacos enquanto que nos demais estudos, a
leitura foi realizada no mesmo dia da identificação do crescimento observado nos
poços de microplacas sem os fármacos. (CAVIEDES e cols, 2000; MOORE e cols,
2006; MELLO e cols, 2007). Outros fatores mencionados na literatura referem-se às
diferenças entre a concentração crítica dos fármacos e os diferentes métodos
comparativos utilizados como padrão ouro. (PARK e cols, 2002; MOORE e cols 2004;
MOORE e cols, 2006; MENGATTO e cols, 2006; MELLO e cols, 2007)
Dentre os 237 pacientes elegíveis, foram incluídos 142 pacientes. A média de
idade encontrada (37,9 anos) no grupo incluído foi comparável a descrita em outras
séries onde se evidencia elevada proporção de acometimento da população adulta
jovem, em fase economicamente ativa. Neste estudo, a TB resistente e/ou
multirresistente esteve associada a suspeita de falência; história de tratamento prévio,
e evolução desfavorável ao último tratamento, similar ao descrito na literatura
(KRITSKI e cols, 1997; DALCOLMO e cols, 1999; FORTES, 2000; BECERRA e cols,
2000; BRITO e cols, 2004; COX e cols 2007; BRITO e cols, 2007; NATHANSON e
cols, 2008),
Em relação aos pacientes que apresentaram resultados concordantes inter–
amostras, em cada método separadamente, nota-se um percentual elevado de
monorresistência e multirresistência encontrado tanto ao MP quanto ao MODS. A taxa
de resistência a INH foi maior que a RMP. Em relação à maior frequência encontrada
do padrão de monorresistência a INH nas amostras destes pacientes, este é similar
ao descrito nos últimos inquéritos nacionais sobre resistência em nosso país. O
primeiro destes que foi realizado no período de 1995 a 1997, a resistência aos
fármacos foi maior para a INH, tanto em pacientes virgens de tratamento quanto nos
136
tratados anteriormente (4,4% e 11,3% respectivamente) perfazendo um total de 7,0%
de resistência. (BRAGA e cols, 2003) Os resultados preliminares do II Inquérito
Nacional de Resistência realizado recentemente em 07 estados do Brasil, no período
de 2005 a 2008, mostraram também o predomínio do padrão de monorresistência a
INH (6%) (BRAGA, 2008 – comunicação pessoal). Considerando também estudos
anteriores sobre a prevalência de resistência aos fármacos, um na década 60 e o
outro, na década de 80, constatou-se, já àquela época, taxas maiores de resistência a
INH do que a RMP sendo estas (INH) respectivamente de 6,0% e de 6,8%. No
entanto, cumpre-se ressaltar que tanto os inquéritos como estudos citados acima
tiveram metodologias diferentes e, portanto não são comparáveis; estes dados
servem somente como uma evidência do padrão de monorresistêncìa a INH
encontrado desde a década de 60. (BRAGA e cols., 2003) Outros estudos
laboratoriais foram realizados visando esclarecer mecanismos causais de resistência
aos fármacos. Siddiqui e col, em 2007, evidenciaram, em estudo de laboratório, que a
INH foi indutora da própria resistência em cepas de M.tb “persistentes”, denominadas
aquelas sem replicação. O mesmo não foi observado em relação à RMP e os autores
sugeriram ser este o motivo da alta prevalência de resistência a INH.
Observou-se, por ambos os métodos, uma taxa elevada de multirresistência em
pacientes virgens de tratamento que, em sua maioria, eram contatos de TB resistente
ou apresentavam história de internação prévia em hospitais. Durante um longo tempo,
acreditou-se que a infecção e o adoecimento dos contatos de TBMR fossem menores
do que daqueles com TB (não TBMR) devido à menor transmissibilidade das cepas
resistentes. Pois, em estudos realizados na década de 50 do século passado, em
modelo animal, observou-se que as cepas com resistência a INH apresentavam
137
menor patogenicidade a qual foi atribuída à redução da atividade da catalase.
(MIDDLEBROOK e cols, 1954; COHN e cols, 1954; RILEY e cols, 1962). No entanto,
em estudos mais recentes de contatos, evidenciou-se que a infecção e a doença TB
causada por M.tb resistente é semelhante àquela causada por bacilos sensíveis.
(SNIDER e cols, 1985; KRITSKI e cols, 1996; VITAL e cols, 1997; SCHAFF e cols,
2000; TEIXEIRA e cols, 2001; MELO e cols, 2003 e BARROSO e cols, 2004). Na
década de 90, os estudos de epidemiologia molecular foram de grande valia, pois,
pode-se avaliar a transmissibilidade das cepas; os genes alvo para mutações a INH e
a RMP e tendo como exemplo a INH, a relação entre as mutações encontradas; a
atividade enzimática da catalase peroxidade e o nível de resistência das cepas a INH.
(WOLINSKY e cols, 1956; HEDGECOK e cols, 1957; RASTOGI e cols, 2004; ZHANG
e cols, 1992; FERRAZOLI e cols, 2000). A INH é oxidada pela catalase-peroxidase
micobacteriana, motivo pelo qual a ausência da catalase foi identificada há muito
tempo, como marcador da resistência a esse fármaco. Demonstrou-se que esta
relação é dependente da deleção do gene katG responsável pela síntese da catalase-
peroxidase e que parte do sucesso do bacilo da TB é devido a atividade presente da
catalase peroxidase mesmo nos mutantes, em torno de 30% a 40%.(COLE e cols,
1994; ZHANG e cols, 1994 ; FERRAZOLI e cols ,1995 ; ROUSE e cols , 1996;
TELENTI, 1997) .
Quanto à taxa elevada de TBMR, deve-se levar em conta que este estudo foi
realizado numa Unidade de Saúde referência municipal e estadual para TBMR e
AIDS, o que poderia explicar estes resultados. Porém, nos últimos anos, mesmo em
países em desenvolvimento, tem-se observado elevadas taxas de TB resistente em
hospitais, de referência ou não, provavelmente decorrente da transmissão intra-
138
hospitalar resultante da ausência de medidas adequadas e preconizadas de
biossegurança. (AGUIAR, 2009). Em 2 estudos sobre prevalência de resistência aos
fármacos anti-TB em hospitais, realizados no estado do Rio de Janeiro, as taxas
encontradas naquele referência para AIDS foram 13% (22/165) de resistência a INH;
1,8%(3/165) de resistência a RMP e 3,6%(6/165) a ambas; e, no outro, referência
para AIDS e TBMR, 7,4% (44/595) do total das cepas testadas; 3,9% (17/433) sem
história prévia de TB e 17,3% (27/156) com passado de TB (BRITO e cols., 2004;
BRITO, 2007).
Um estudo realizado na China, em pacientes atendidos em dois hospitais
distritais, a análise de 4379 culturas, a TBMR foi identificada em 246 (5,6%) dos casos
e, entre 175 casos de TBMR, a TB-XDR foi diagnosticado em 11 (6,3%). Mais de 50%
dos casos de TBMR e TB-XDR ocorreram em pacientes sem tratamento anterior,
sugerindo fortemente transmissão nosocomial e/ou na comunidade. (ZHAO e cols,
2009). Em revisão, Blumberg (1995) ressalta que a TB nosocomial é um reflexo da
situação epidemiológica encontrada na comunidade e que, portanto, não pode ser
desvinculada desta realidade. Consequentemente, torna-se prioritária a
implementação de medidas de biossegurança; suporte laboratorial para o diagnóstico
precoce dos casos de TB em hospitais para o controle da TB.
Quanto à história clínica pregressa, a falência esteve associada ao padrão de
multirresistência semelhante ao descrito na maioria dos estudos. (SIQUEIRA e cols,
2009; DALCOLMO e cols, 1999; FORTES, 2000; KRITSKI e cols, 1997; BECERRA e
cols, 2000; GARCIA-GARCIA e cols, 2000). Sabe-se que, em nosso país, a maioria
dos casos de TBMR é resultante da má qualidade da assistência devido à falta de
estrutura e desorganização dos serviços de saúde. (KRITSKI & RUFFINO-NETO,
139
2000). Parte pode ser explicada pela política de saúde adotada, pois, apesar do
enorme avanço na área de universalização do acesso a saúde, a descentralização
proporcionou, inicialmente, um impacto negativo nas ações de controle de TB e de
outras endemias devido ao planejamento inadequado para a transferência das
responsabilidades para a esfera municipal, permanecendo a precariedade existente
da estrutura técnico-administrativa voltada à prestação de serviço. O sistema de
financiamento das ações não foi direcionado a induzir a maior integração dos distintos
níveis de complexidade da atenção à saúde, bem como entre as diferentes esferas de
atuação: federal, estadual e municipal (KRITSKI & RUFFINO, 2000). Outro ponto a
ressaltar é que o atendimento ao paciente com TB deve ser baseado, de acordo com
os princípios do Sistema Único de Saúde (SUS), na integralidade e assim sendo, o
modelo da Estratégia de Saúde da Família (ESF) deveria resolver a assistência aos
pacientes das áreas adstritas, desde a prevenção até o atendimento das doenças
intercorrentes, como a TB. No entanto, apesar das medidas adotadas para a
descentralização do atendimento dos pacientes com TB para a Atenção Básica
pactuado pelos gestores, por meio do Pacto pela Vida, têm-se dois problemas: um
deles, a baixa cobertura deste nos grandes centros, onde é mais elevada a
prevalência de TB, TB associada ao HIV e TB resistete, e o outro, a inadequação
quanto ao conhecimento sobre TB dos profissionais de saúde envolvidos na ESF e o
estigma da doença TB. O tratamento supervisionado é uma recomendação para o
sucesso terapêutico. A ESF seria a melhor estratégia a ser utilizada para tal fim. As
barreiras ainda existem, mas têm-se envidado vários esforços para transpor-las tais
como capacitações em TB; sensibilização dos profissionais para a TB; readequação
dos processos de trabalho incluindo fluxos entre unidades de saúde e laboratórios.
Todos estes esforços ainda são tênues. Temos uma estrutura laboratorial deficiente.
140
Conforme preconizado pelo MS, todo paciente em retratamento, as amostras clínicas
deveriam ser encaminhadas para cultura e testes de sensibilidade. No entanto, no
país, foram realizadas apenas 30% das culturas para micobactéria com indicação
clínica na investigação de TB entre pacientes infectados ou não por HIV e, é estimado
que, em decorrência do baixo número de testes de sensibilidade realizado, são
diagnosticados apenas 20% dos casos de TBMR existentes no país. (Dados SINAN,
2008) Enfim, a prevenção da TBMR pode ser alcançada por meio de melhor
atendimento aos pacientes com TB, garantindo o sucesso terapêutico nos casos
novos como aqueles em recidiva e promovendo o diagnóstico precoce dos casos de
TB, por meio da solicitação sistemática de cultura para M.tb e testes de sensibilidade
em todo aquele suspeito de TBMR. (MS. SVS. CRPHF. MSH, 2006).
No grupo HIV +, foi menos freqüente o acometimento do sexo masculino por
TB o que pode ser explicado pelo comportamento da epidemia de HIV/AIDS, no
mundo e no Brasil. Na década de 80, no início da epidemia de AIDS, o sexo
masculino foi mais acometido principalmente os indivíduos homossexuais e usuários
de drogas endovenosas. Posteriormente, no final da década de 90, houve uma
mudança neste perfil devido à transmissão heterossexual. Consequentemente houve
o aumento de casos no sexo feminino. O relatório recente dos CDC-EUA, no período
de 1999 a 2003, observou-se que o crescimento no número de casos de AIDS foi
maior no sexo feminino (15%) que no masculino (1%). (CDC, 2009). No Brasil, ocorre
também um crescimento do número de casos no sexo feminino (UNAIDS, 2007). A
vulnerabilidade do sexo feminino ao HIV tem sido explicada pela combinação de
fatores sócio-econômicos e biológicos e mais recentemente na associação TB e AIDS
(TINDO e cols, 2004).
141
Evidenciou-se também, entre pacientes HIV positivos, menor freqüência de
falência ao tratamento de TB. Provavelmente, estes pacientes não são incluídos no
sistema ambulatorial de TB resistente devido a sua elevada taxa de mortalidade
(20%), usualmente associado ao retardo diagnóstico e maior gravidade (BUSILLO e
cols, 1992; FISCHL e cols, 1992; SALOMON e cols, 1995; DYE e cols, 2002;
ALBUQUERQUE e cols, 2001; SELIG e cols, 2004).
Em relação aos resultados concordantes inter-amostras, no padrão de
sensibilidade encontrado neste grupo de pacientes, em cada método, observa-se que
não houve diferença de taxa de resistência entre pacientes HIV positivos e HIV
negativos. A presença da co-infecção TB/HIV e sua associação com a resistência aos
fármacos tem sido controverso; ela ocorre em sua maioria nos surtos de TB intra-
hospitalar ou em prisões (POZNIAK e cols., 2003; ROBERT e cols., 2005, BRITO,
2007). Em nosso meio, a ausência de associação de resistência e infecção por HIV
pode resultar da falta de acesso aos serviços de saúde; estrutura diagnóstica
laboratorial deficiente e precárias condições sócio-econômicas e culturais.
(ALBUQUERQUE e cols., 2001; BARROSO e cols., 2003; BRITO e cols., 2004;
SELIG e cols., 2004; MORO e cols., 2005; SEVERO e cols., 2007; CHEN e cols.,
2007; UNAIDS, 2007; SIQUEIRA e cols., 2009)
Quanto à distribuição do perfil das 318 mostras provenientes de 142 pacientes
observaram-se resultados discordantes inter-amostras em cada método: sendo 16
(11,2%) ao MP e, 25 (17,3%) ao MODS. Este estudo teve uma particularidade,
diferente dos demais, onde cada paciente contribuiu com até 03 amostras
respiratórias e com isto, pode-se avaliar a reprodutibilidade de cada método, inter-
amostras, raramente descrito na literatura. Com isto, observou-se a boa
142
reprodutibilidade do MODS, mas inferior àquela encontrada com MP, considerado
padrão ouro por Canetti. (CANETTI e cols 1969)
Quanto à acurácia do teste MODS, em 318 amostras clínicas, os valores
encontrados para esta amostra populacional para detecção de resistência para INH e
RMP respectivamente, foram similares ao descrito na literatura, com especificidade
menor, que pode ser atribuída a diferentes fatores, conforme descritos anteriormente:
leitura dos testes de sensibilidade após 14 dias da identificação do crescimento em
poços sem os fármacos; as diferentes concentrações críticas dos fármacos utilizadas
nos diversos estudos e aos diferentes métodos como padrão ouro. (SHIFFERAW e
cols, 2007; PARK e cols, 2002:; CAVIEDES e cols, 2000; MELLO e cols, 2007). Na
maioria dos trabalhos publicados sobre a acurácia do MODS estimou-se a
sensibilidade, especificidade e valores preditivos, positivo e negativo. Em nosso
estudo, foi realizada análise das razões de verossimilhança entendendo-se que estas
se firmam como um conceito inovador, e mais preciso na avaliação de um teste
diagnóstico, pois tem menor interferência da prevalência do atributo (TB), e permitem
converter as probabilidades pré-teste de uma determinada doença em probabilidades
pós-teste. (HATANAKA & BENSENOR, 2005)
Utilizando o MP como referência, em nosso estudo, a heterorresistência foi
observada em 8 (34,7%) dos 23 pacientes que tiveram pelo menos duas amostras
analisadas também por testes moleculares. Alguns mecanismos têm sido levantados
para explicar a heterorresistência: a) a superinfecção exógena; b) a seleção de uma
única cepa em cepas sensíveis e resistentes uma vez expostas a uma terapêutica
inadequada; c) a superinfecção de infecção tuberculosa latente e reativação
endógena. Vários relatos foram publicados na literatura a respeito da infecção
143
exógena por outro tipo de cepa assim como nos casos de uma única cepa que devido
à exposição a uma terapêutica inadequada sofre seleção. (WARREN e cols, 2004;
COX e cols, 2004; WOODFORD e cols, 2006). No entanto, o terceiro mecanismo,
poderia ser a melhor explicação para aqueles que são virgens de tratamento embora
a hipótese de que a superinfecção possa desencadear uma reativação da tuberculose
latente pré-existente nunca ter sido comprovada (KAUFMAN e cols, 2005)
A detecção da presença de heterorresistência pode depender de vários fatores:
primeiro, a avaliação fenotípica, por meio dos testes de sensibilidade, de mais de uma
amostra de cada paciente; segundo, o perfil clínico dos pacientes, considerando a
história clínica prévia de TB e, terceiro, a realidade epidemiológica de cada local.
Em nossa casuística, os 142 pacientes coletaram mais de uma amostra
respiratória; todos apresentavam algum fator de risco para resistência e/ou
multirresistência sendo que 78,2% tinham história de tratamento anterior com
desfecho clínico ao último tratamento desfavorável (79,3%) e se observou uma
elevada taxa de TBMR nesta população estudada, 24,1% de resistência primária e
47,4% de resistência adquirida. Dentre os 142 pacientes incluídos no estudo, 46
(32,4%) apresentaram discordância inter-testes e/ou inter-amostras e destes, após as
perdas, 38 foram avaliados com testes moleculares, o Sequenciamento e o
Spoligotyping.
À análise dos casos discordantes, por meio do seqüenciamento, observou-se
30,9% das amostras apresentavam mutação em katG, sendo 95,2% desta presente
no códon 315. Em outros estudos realizados em nosso meio, entre cepas resistentes
a INH pelo método fenotípico, verificou-se freqüências maiores de mutação no gene
144
katG (53% a 96%) (DALLA COSTA e cols, in press; VALIM e cols, 2000; ROSSETT e
cols 2002). Tais resultados diferentes podem decorrer do fato que analisamos apenas
amostras discordantes, onde se considerou os resultados positivos dos testes
fenotípicos MODS e/ou MP, na detecção de resistência a INH. No entanto, maior
freqüência de mutação no códon 315 é similar ao descrito por outros autores. (VAN
DOOR e cols, 2001; ROSSETT e cols, 2002. SP; SILVA e cols, 2003; DALLA COSTA
e cols, 2008).
Uma vez que a literatura aponta ser a mutação em katG mais freqüente, optou-
se por utilizá-la como triagem no diagnóstico de detecção de resistência para INH e
caso esta fosse negativa ou inconclusiva, naquelas amostras com fenótipo de
resistência a INH, foi realizado o seqüenciamento para outros genes. Com isto, neste
estudo, não se pode avaliar a freqüência total da presença de mutações em outros
genes alvo para INH.
Em relação à avaliação da acurácia do MODS, a especificidade foi baixa e o
grau de concordância discreto. Não foi encontrado na literatura nenhum estudo que
avaliou a acurácia do MODS em que foi utilizado o seqüenciamento como padrão
ouro.
Utilizando o seqüenciamento como padrão ouro, observou-se sensibilidade
(79,1%) e especificidade (81,8%) do MP para o diagnóstico de resistência a INH,
valores inferiores ao relatado pela maioria dos autores, com sensibilidade de 88,4% a
100% e, especificidade de 100% (HILLEMAN e cols, 2005; SOMOSKOVI e cols, 2006;
KIEPIELA e cols, 2000; CARDOSO e cols, 2004). Em nosso estudo, foi evidenciada
presença de mutação para INH, por meio do seqüenciamento, em cinco amostras que
145
foram sensíveis ao MP, ao avaliarmos os alvos mais frequentemente relacionados à
resistência a INH: KatG, inhA e ahpC (HAZBON e cols., 2005). Outros fatores
associados a discordância de resultados entre sequenciamento e MP podem ser
elencados, tais como a estabilidade e validade do medicamento utilizado, a INH
(CANNETTI, 1969) e, nível de resistência da cepa M.tb à INH (CAVIEDES e cols,
2000; BROSSIER e cols, 2006; SOMOSKOVI e cols, 2007).
Quanto à presença de resistência ao MP e a ausência de mutações para INH
ao seqüenciamento, esta pode ser explicada pela ocorrência de outras mutações não
avaliadas e de outros mecanismos envolvidos como bomba de efluxo; degradação
enzimática ou modificação da INH. (KAPUR e cols, 1994; STRATTON, 2002; CAWS e
cols, 2004; SIDDIQUI e cols, 2004; SEKIGUSHI e cols, 2007).
Os resultados encontrados no seqüenciamento do gene rpoB para a detecção
de resistência a RMP, em 68 cepas, evidenciou-se mutação em 25 (36,8%) nas quais
a maior freqüência absoluta encontrada estava nos códons 513; 526 e 516, similares
ao descrito pela maioria dos autores. (COLE e cols., 1994; KAPPUR e cols., 1994,
TELENTI e col.s, 1997; AHMAD e cols., 2000; SOMOSKOVI e cols., 2001;
CAVUSOGLU e cols., 2002; YUE e cols., 2003; HOFLING e cols., 2005). No material
analisado em nosso estudo, 2 cepas apresentaram mais de um ponto de mutação;
uma delas 2 pontos (códon 514 e 531) e a outra, 10 pontos de mutação envolvendo
os códons 517; 512; 513; 522; 523; 524; 529; 530; 534 e 535. Valim e cols., em 2000,
ao analisarem as alterações genéticas com resistência a RMP do M.tb em amostras
do Brasil observaram que, os cepas de M.tb provenientes do Rio de Janeiro tinham
uma ampla variedade de alelos, incluindo os que apresentaram mais de um códon
146
mutado e outras alterações como deleções associadas a mutações de ponto e
deleção de 12 nucleotídeos.
Quanto a acurácia do MODS utilizando o sequenciamento para rpoB como
padrão ouro, observou-se que a sensibilidade, especificidade e razão de
verossimilhança positiva foram baixas, mas superiores aos valores alcançados pelo
MP. Caviedes e cols (2000), em seu estudo comparando MABA e MODS, utilizaram
PCR-SSCP para detecção de resistência a RMP nos 14 cepas de M.tb com
resistência a RMP e resultados discordantes sob avaliação de ambos os métodos, em
uma amostra clínica por paciente. O MODS apresentou boa concordância com o
PCR- SSCP. Neste estudo, todas as cepas que apresentaram mutação em rpoB
foram identificadas como resistentes pelo MODS. Porém, 3 cepas que não
apresentaram mutação para rpoB, foram identificadas como resistentes ao MODS
quando o ponto de corte utilizado foi 0,5μ/ml. Com a mudança do ponto de corte para
1,0μ/ml, 2 destas foram corretamente identificadas como sensíveis. Isto reforça a
importância da realização do MIC.
Quanto à acurácia do MP, a sensibilidade foi baixa a qual pode ser decorrente
do baixo grau de resistência das cepas a RMP, avaliação não disponível em nosso
estudo. Os trabalhos sugerem uma relação entre o nível de resistência a RMP e os
pontos de mutação encontrados. A maioria das cepas resistentes a RMP tem mais de
uma mutação. As mutações encontradas nos códons 513, 526 ou 531 estão
associadas a um elevado nível de resistência (50µg ml-1≤CMI) e outros pontos de
mutação localizados nesta mesma região como nos códons 514, 521 ou 533,
apresentam baixo nível de resistência (CMI=12,5µg ml-1). (TANIGUSHI e col, 1996)
embora alguns autores tenham achados diferentes em relação aos códons 514 ou
147
533 (YUE e cols, 2003). Em nosso estudo, 3 cepas de M.tb foram identificadas como
resistentes a RMP ao MP, embora não tenha sido detectada mutação em rpoB.
Outros pontos de mutação foram descritos fora da região 81 rpoB e alguns destes
como V146F e E562A, associados a baixa resistência. (SEKIGUCHI e cols., 2007).
Optou-se, em nosso estudo, analisar somente a região rpoB uma vez que 96% a
100% apresentam pelo menos, 1 ponto de mutação localizado neste sítio e portanto,
poderia haver a presença de mutações em outros lócus que foram não foram
identificados (ZHANG e cols., 1994; Telenti, 1993). A especificidade foi boa (92,5%)
similar ao descrito na maioria dos relatos. (WILLIAN e cols., 1994; SHARMA e cols,
2003; SRIVASTAVA e cols., 2004; SEKIGUCHI e cols.,2007). A concordância
encontrada foi baixa (kappa = 0,36) embora à literatura, o grau de concordância em
geral é alto, variando de 0,90 a 0,100.(CAVUSOGLU e cols., 2002). Tem-se que levar
em conta que as amostras clínicas aqui incluídas foram aquelas que apresentaram
aos testes fenotípicos MODS e MP, discordância inter-testes e intra-amostras o que
pode ter influenciado nos resultados. Outros mecanismos podem ser apontados como
bomba de efluxo; degradação enzimática ou modificação da RMP. .(KAPUR e cols.,
1994; SIDDIQUI e cols, 2004; SEKIGUCHI e cols, 2007; FREIXO, 2004; HOFFMAN e
cols, 2009)
Dentre os 38 pacientes que tiveram suas amostras analisadas por testes
moleculares, nos 23 pacientes nos quais foram analisadas duas amostras, a
heterorresistência foi detectada em 8 (34,7%) pacientes. Todos os pacientes tinham
história prévia de TB com desfecho ao tratamento anterior, desfavorável. Tais dados
são similares ao descrito por RINDER e cols que relataram uma taxa de 17%
(RINDER, 2001), ao utilizaram testes moleculares para identificar heterorresistência.
148
Canetti já citava, na década de 60, a composição mista de cepas sensíveis e
resistentes de M.tb em lesões pulmonares cavitárias e a seleção de cepas durante o
tratamento anti-TB toda vez que este não fosse eficaz sendo esta então, a base
terapêutica para a associação de fármacos até hoje utilizados para o tratamento da
TB e TBMR. Outro fator importante apontado por ele foi a necessidade da
padronização do inóculo para a reprodutibilidade do teste fenotípico MP (CANETTI e
cols, 1965) Assim sendo, houve uma padronização internacional para a realização
dos testes de sensibilidade pelo MP. Em nosso estudo, viu-se a ótima
reprodutibilidade deste método à comparação dos resultados encontrados na
detecção de INH e RMP nas múltiplas amostras referentes a cada paciente.
Atualmente, após a introdução da biologia molecular como ferramenta
diagnóstica, sabe-se que, além do que foi evidenciado por Canetti, há a possibilidade
de se confirmar a presença da infecção por cepas diferentes de M.tb embora ainda,
não se tenha estudos acerca da prevalência desta e seu impacto na abordagem
clínica diagnóstica e terapêutica de pacientes com TB multiresistente.
Por meio da tipagem molecular foi possível analisar a ocorrência de infecção
policlonal/múltipla por M.tb em 23 pacientes que tiveram pelo menos duas amostras
analisadas. Esta foi identificada em 11 (47,8%) pacientes. Tais resultados são
similares ao relatado na África do Sul. Nesta região, van Rie e cols. (2005), entre 11
pacientes com TB-MDR, observaram infecção policlonal/múltipla em 5 (45,4%).
Em outro estudo realizado na África do Sul que incluiu 366 pacientes com TB,
evidenciou-se que a infecção múlipla foi maior entre pacientes em retratamento (23%)
do que em pacientes sem história prévia de tratamento (17%) (WARREN e cols.,
149
2004). O mesmo foi evidenciado em nosso estudo, pois dentre os 11 pacientes com
superinfecção, 10 informaram história prévia de tratamento. Já no estudo de Hofmann
e cols. (2009), o acometimento de infecção policlonal/múltipla foi maior nos pacientes
virgens de tratamento.
Em ambos os estudos de Warren e cols. e Hofmann e cols, a infecção
policlonal/múltipla foi mais freqüente entre amostras clínicas que continham cepas
M.tb Beijing. No presente estudo, entre 11 pacientes que apresentaram infecção
policlonal/múltipla, 8 apresentaram em comum a Família LAM e dentre esta, a
variante cepa LAM 1; a variante cepa LAM 3; LAM 2; LAM 7 e LAM 9. À análise da
distribuição dos resultados da tipagem molecular das amostras clínicas, por meio do
Spoligotyping, evidenciou-se que as Famílias LAM 9 (16,9%); T1 (16,9%); Variante
LAM 2 (11,7%); Haarlen1 (10,4%); Haarlen 3 (9,1%) e X2 (7,9%) foram as mais
freqüentes. Nota-se que nestes 8 casos de infecção policlonal/múltipla, 6
apresentaram cepas LAM, de maior freqüência nesta amostra. Os 2 outros casos de
infecção policlonal/múltipla onde estava presente a cepas da Família LAM com menor
freqüência, LAM 7 (2,5%) e LAM 3 (1,2%) respectivamente, apresentavam-se em
associação com a Família T1 que teve a mesma distribuição de freqüência que a
cepa LAM 9 (16,5%).
Em nossa casuística, ao analisarmos a heterorresistência e sua associação
com a infecção policlonal/múltipla, observou-se que a coexistência de duas diferentes
cepas prevaleceu nos pacientes com história de tratamento prévio anti-TB. No grupo
de pacientes que apresentaram resultados discordantes com MP nas amostras
clínicas, nos casos de heterorresistência, não se observou a prevalência de um
150
determinado genótipo relacionado à presença de heterorresistência ou ao desfecho
clínico final desfavorável.
Em nossa casuística, todos pacientes com heterorresistência devido à única
cepa tiveram história de recidiva. Provavelmente, a pressão seletiva positiva de
terapia inadequada pode ter ampliado os organismos resistentes a proporções
detectáveis pelo sequenciamento. Se assim for, a taxa de heterorresistência com
cepas únicas poderia servir como um indicador para a qualidade dos programas de
controle de TB, o que poderia ser de ajuda para a saúde pública e também para o
manuseio clínico dos pacientes candidatos ao uso de esquemas terapêuticos de
segunda linha.
A heterorresistência é considerada como o primeiro passo para a
multirresistência. (Hofmann e cols, 2009). Acredita-se que somente uma amostra
respiratória é representativa da população bacilar. Em conseqüência disto, nos
inquéritos de resistência realizados em nível mundial e na rotina de investigação
laboratorial de resistência aos fármacos, é preconizada a coleta de apenas uma
amostra respiratória por paciente para a realização de cultura e testes de
sensibilidade aos fármacos. Caso os dados observados em nossa casuística sejam
confirmados em outras séries, provavelmente, com o uso de apenas uma amostra
clínica, a heterorresistência deve estar subestimada. Na última década, constataram-
se alguns relatos de caso e/ou comunicações pessoais, mas até então, o assunto não
foi amplamente discutido. (WILLIANS e cols, 1998; de OLIVEIRA e cols, 2003; POST
e cols, 2004; FREIXO e cols, 2004; HOFMANN e cols, 2009; ANDRADE e cols, 2009).
151
Na avaliação dos testes de sensibilidade, os resultados discordantes tem sido
uma preocupação sempre que dois métodos são comparados e em geral, é menor a
freqüência de resultados discordantes quando se analisa resistência aos fármacos
INH e RMP. (GIAMPALLA e cols, 2007).
No presente estudo, avaliou-se a acurácia do MODS na detecção de
resistência a INH e RMP, utilizando como padrão ouro o MP. O MODS detectou mais
casos discordantes do que o MP o que pode ser explicado com base em trabalhos
que evidenciaram: a) a aquisição de resistência do Mtb a um fármaco é
freqüentemente acompanhada pelo aumento do tempo de crescimento deste na
ausência do fármaco no meio de cultura; b) em presença de mais de uma cepa M.tb
na mesma amostra clínica, com tempos de crescimento diferentes, a que tiver tempo
de crescimento menor ocupa todo o meio de cultura; tal fato é melhor evidenciado em
meio líquido do que em meio sólido; c) a resistência parcial ou limítrofe não propicia
resultados reprodutíveis; d) diferenças nas taxas de crescimento durante a cultura
podem também interferir nos resultados de resistência por meio de testes fenotípicos
ou moleculares. (GILLESPIE e cols, 2002).
Em face destes resultados observados neste estudo, é preciso ressaltar quão
complexa é a abordagem diagnóstica e terapêutica dos pacientes com TB resistente.
Em relação ao diagnóstico, a análise e avaliação de uma única amostra respiratória
pode não ser representativa da população bacilar daquele indivíduo. Isto poderia ser
resolvido com a padronização do requerimento de mais de uma amostra respiratória a
ser coletada em cada paciente com suspeita de TBMR. Por outro lado, diante dos
resultados encontrados, qual a conduta terapêutica a ser adotada? Neste trabalho, a
análise dos discordantes foi direcionada para INH e RMP, mas na prática clínica,
152
utilizam-se outros fármacos que fazem parte do arsenal terapêutico. Sabe-se que
estes demais fármacos não têm a mesma robustez que a INH e a RMP tanto na parte
diagnóstica, na relação in vivo e in vitro (testes de sensibilidade) como na terapêutica.
A demora excessiva no diagnóstico desta leva à uma transmissão de cepas
resistentes e multirresistentes na comunidade; a infecção policlonal/múltipla pode ser
uma realidade, o que nos remete a questão dos hospitais onde a resistência
encontrada, em trabalhos anteriores, deve refletir a realidade epidemiológica da
comunidade. Qual seria o método diagnóstico mais rápido, preciso, com boa
reprodutibilidade e viável economicamente para estes pacientes e que pudesse
detectar a heterorresistência e a infecção policlonal/múltipla? Qual a abordagem
terapêutica para o tratamento da infecção latente tuberculosa dos contatos destes
pacientes?
O tratamento atual da TBMR é composto de cinco fármacos dos quais, dois são
de uso em todos os esquemas utilizados para o tratamento da TB. Dos três fármacos
restantes, tem-se dois com maior espectro e o terceiro, não é bactericida. Ainda não
existem disponíveis no mercado novas fármacos que possam ser utilizadas.
Em resumo, para o controle da TBMR no momento, tem-se que investir na
prevenção de novos casos de resistência adquirida, ou seja, concentrar esforços em
estudos que avaliem a incorporação de novos testes diagnósticos para TB resistente
e maior efetividade da Estratégia DOTS. Quanto aos pacientes com TBMR, implantar
o tratamento supervisionado para todos; implementar pesquisas operacionais e
ensaios clínicos pragmáticos com outros esquemas terapêuticos. Quanto ao controle
dos contatos, implantar uma política de vigilância epidemiológica e terapêutica.
153
CAPITULO VII- Limitações do estudo
Não realização da concentração mínima inibitória (CMI), o que auxiliaria
sobremaneira a análise dos resultados discordantes entre seqüenciamento e
testes fenotípicos para o diagnóstico de resistência a RMP e INH.
Não realização de seqüenciamento de todas as amostras clínicas, e não
apenas de amostras com resultados discordantes. Pois, caso tivéssemos
realizado seqüenciamento de todas as amostras, poder-se-ia identificar
possíveis discordâncias entre resultado do teste fenotipio (MP ou MODS) e
análise molecular com subseqüente modificação da acurácia diagnóstica.
Inclusão apenas de teste Spoligotypoing que, auxilia na identificação de
sub-famílias de M.tb mas apresenta baixa acurácia na identificação de clusters
entre cepas de M.tb de determinado grupo de pacientes.
Não realização de estudos adicionais como bombas de efluxo nas
amostras discordantes em que não se observou mutação no seqüenciamento.
Número reduzido de amostras discordantes com identificação de
mutações por meio do seqüenciamento.
154
CAPITULO VIII- Conclusões
A técnica MODS e o MP apresentaram boa reprodutibilidade na detecção de
resistência a INH e a RMP. Não houve diferença significante entre a proporção
de resultados discordantes inter-amostras de cada técnica diagnóstica, MODS
e MP.
Considerando os valores encontrados nas razões de verossimilhança, a técnica
MODS mostrou ser um teste diagnóstico que poderá ser utilizado como
triagem para a detecção precoce de resistência a RMP e a INH.
Observou-se que a acurácia da técnica MODS e do MP em relação ao
Seqüenciamento apresentou variações conforme o desfecho clínico dos
pacientes. Para detecção de resistência a INH e a RMP, no grupo com
desfecho clínico desfavorável (falência e óbito), o MODS apresentou melhor
sensibilidade do que o MP enquanto que o MP melhor especificidade.
O realização do Seqüenciamento contribuiu com o incremento na
especificidade da técnica MODS tanto para detecção precoce de resistência a
INH como para a RMP.
Os genótipos Mtb mais frequentes foram as Famílias LAM, 35,8%; Haarlen,
20,7%; T, 18,1%.
A infecção policlonal/múltipla foi detectada, por meio do Spoligotyping, em 8
(34,3%) dos 23 pacientes que tiveram pelo menos 02 amostras clínicas
analisadas naqueles que apresentaram discordância inter-amostras;
A prevalência de multirresistência primária foi alta e relacionada a contatos de
TBMR ou história prévia de internação em hospitais.
155
A prevalência de multirresistência adquirida em pacientes deste estudo foi alta
e esteve associada à falência ao tratamento anterior;
A prevalência da co-infecção TB/HIV foi alta (16,2%) e como fatores
associados evidenciou-se ter sido menos freqüente no sexo masculino; ter tido
história prévia de TB e suspeita de falência do tratamento de TB;
Os pacientes classificados como alto risco devido história ou suspeita de
falência tiveram 3 vezes mais chance de ter desfecho clínico desfavorável
(falência ou óbito) nesta amostra estudada.
Em relação a distribuição do tipo de cepa encontrado relacionada ao padrão
fenotípico de multirresistência presente em 08 pacientes, a mais frequente foi a
cepa LAM (50%); nestes casos, todos os pacientes tiveram história clínica
pregressa de TB e o desfecho clínico foi desfavorável em 75%.
Em relação a distribuição do tipo de cepa encontrado relacionada ao padrão
fenotípico de monorresistência presente em 12 pacientes, à INH (8 pacientes)
não se evidenciou nenhum tipo predominante e à RMP, a cepa H37Rv (50%);
todos estes relataram história pregressa de TB e dentre o desfecho clínico
desfavorável (8 pacientes), a cepa Haarlen esteve presente em 25% dos
pacientes.
O MP detectou uma elevada proporção de heterorresistência – 34,8% de 23
pacientes com duas amostras analisadas.
Todos os pacientes com heterorresistência relataram história clínica pregressa
de TB e ao desfecho clínico somente 02 tiveram evolução favorável.
156
CAPITULO IX – Perspectivas
Necessário confirmar a proporção elevada de casos de heterorresistência entre
pacientes suspeitos de TB resistente em outros estudos. Caso tais resultados
sejam mantidos, será prioritário implantar rotineiramente a solicitação de, pelo
menos 02 culturas para M. tb e testes de sensibilidade em todos os casos de
retratamento e de suspeita de resistência.
Consequentemente, ao ser evidenciada a presença de heterorresistência, a
aplicação de testes moleculares torna-se imprescindível para a identificação de
infecção policlonal/múltipla. Com isto, será preciso uma reestruturação da rede
de laboratórios do país para que se tenha laboratórios de referência com
capacidade para realizar testes moleculares de rotina, quando necessário.
Para os clínicos, caso a presença de heterorresistência passe a ser uma
realidade nos pacientes com suspeita de resistência e multirresistência, será
um dilema a decisão terapêutica.
Estudos transversais, observacionais e ensaios clínicos pragmáticos serão
necessários para estimar a prevalência da heterorresistência e/ou infecção
policlonal/múltipla, a evolução clínica e a resposta terapêutica destes
pacientes.
157
CAPITULO X- Referências Bibliográficas
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www.medscape.com/viewarticle/569880)
200
CAPITULO XI. Anexos
DATA MATRIX: MODS STUDY – PATIENT ENTRY FORM M. Arias
Variable
Name
Label
Type
Values
DEMOGRAPHICS
1. SID Study Identification Number N None
2. TYPEPX Type of participants N 1- new TB suspect or untreated case
2- relapse TB suspect
3- treatment failure suspect
4- TB treatment defaulter
3. MDRTB MDR TB risk N 1- Yes
2- No
4. RISKFAC MDR TB risk factors N 1- Relapse TB suspect
2- Treatment failure suspect
3- Close contact of MDR-TB case
4- TB treatment defaulter
5. RESID Residential area T None
6. CITY City of residence T None
7. DOB Date of birth MM-DD-YYY
Y
8. AGE Age N None
9. SEX Sex N 1- Male
2- Female
10. ETHNIC Ethnicity N 1- Hispanic or Latino
2- Non-Hispanic or Latino
11.
RACE
Race N 1- Black or African American
2- White
3- Pacific Islander
4- American Indian
5- Asian
6- Mixed
TB SIGNS AND SYMPTOMS
12. COUGH Cough N 1- Yes
2- No
13. CODUR Cough duration (in weeks) N None
14. EXPECT Expectoration N 1- Yes
2- No
15. EXDUR Expectoration duration (weeks) N None
16. HEMOPT Hemoptysis N 1- Yes
2- No
17. HEDUR Hemoptysis duration (weeks) N None
18. SWEATS Night sweats N 1- Yes
2- No
19. SWEDUR Night sweats duration (weeks) N None
20. FEVER Fever N 1- Yes
2- No
21. FEDUR Fever duration (weeks) N None
777
=
TEST NOT PERFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
DATA MATRIX: MODS STUDY - PATIENT ENTRY FORM M. Arias
Variable
Name
Label
Type
Values
22. DYSPNEA Dyspnea N 1- Yes
2- No
23. DYSDUR Dyspnea duration (weeks) N None
24. WEILOSS Weight loss (>10%) N 1- Yes
2- No
25. WEIDUR Weight loss duration (weeks) N None
26. ADENOP Adenopathies N 1- Yes
2- No
27. ADEDUR Adenopathies duration (weeks) N None
28. DIAR Diarrhea N 1- Yes
2- No
29. DIARDUR Diarrhea duration (weeks) N None
PAST TB HISTORY AND TREATMENT
30. PREVTB Previous TB N 1- Yes
2- No
31. PASINH Past INH N 1- Yes
2- No
32. PASRIF Past RIF N 1- Yes
2- No
33. DPREVTB Date previous TB D None
34. TBOUT TB outcome N 1- cured
2- completed treatment
3- failed
4- defaulted
HIV/AIDS HISTORY
35. HIVT HIV test results N 1- Positive
2- Negative
36. YHIVT Year of HIV test N None
37. CD4 CD4 test results (cells/mm3) N None
38. YCD4 Year of CD4 test N None
39. HXPCP History of PCP N 1- Yes
2- No
40. HXKAP History of Kaposi’s sarcoma N 1- Yes
2- No
41. HXCAND History of candidiasis N 1- Yes
2- No
Variable
Name
Label Type Values
42. HXCMV History of CMV N 1- Yes
2- No
43. HXMAC History disseminated MAC N 1- Yes
2- No
777
=
TEST NO
T PERFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
777
888
999
=
TEST NOT PERFORMED;
=
UNKNOWN;
=
MISSING
44. HXCRYPT History of crypto.l mening/pneum N 1- Yes
2- No
45. HXHISTO History dissem. histoplasmosis N 1- Yes
2- No
46. HXPNEU History recurrent bact. pneumpnia N 1- Yes
2- No
47. HXOTHER History of other AIDS def. cond.
N
1- Yes
2- No
TUBERCULIN SKIN TESTING (TST)
48. TST TST performed N 1- Yes
2- No
49. TSTRES TST results (mm) N None
50. DTST TST date D None
WEIGHT
51. WEIGHT Weight at entry (kg) N None
CHEST RADIOGRAPH (at study entry)
52. ECXRAY Entry chest X-Ray N 1- normal
2- active TB
3- TB sequellae
4- other pulmonary disease
53. ECXRAYD Entry chest X-Ray date D None
54. ECXRAYP Entry chest X-Ray pattern N 1- Cavitary
2- Typical
3- Compatible
4- Atypical
DATA MATRIX: MODS STUDY- SPECI
MEN 1 LAB FORM M. Arias
Variable
Name
Label
Type
Values
SECTION 1
1. SID Study Identification Number N None
2. TSPEC1 Type of specimen N 1- spontaneous
2- induced
3- BAL
4- Bronchial wash
5- Post
bronchoscopy
sputum
3. DATE1 Date specimen collected D None
4. TIME1 Time specimen collected T None
5. DATEREC1 Date specimen received by lab D None
6. TIMEREC1 Time received by lab T None
7.
AFB1 AFB results N 1- negative
2- 1+
3- 2+
4- 3+
8.
MODSG1 MODS growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
9.
MODSDY1 MODS number of days to growth N None
10.
MODSM1 MODS morphology N 1-positive, cords visible
2-negative, no cords visible
11. MODS1 MODS Identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
12. PNBG1 MODS/PNB growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
13. PNBDY1 Days to positive growth N None
14. PNB1 MODS/PNB identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
15. LJG1 LJ growth results N 1- 0, no growth
2- 1-9 colonies
3- 1+ (20-100 col.)
4- 2+ (>100 distinct col.)
5- 3+ (confluent growth)
6- contaminated
16. LJDY1 Days to positive growth N None
17. HSCAT1 Heat stable catalase N 1- positive
2- negative
18. RTCAT1 Room temp catalase N 1- positive
2- negative
19. NIT1 Nitrate reduction N 1- positive
2- negative
777
=
TEST NOT PERFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
20. NIA1 Niacin production N 1- positive
2- negative
Variable
Name
Label
Type
Values
21. LJ1
Final LJ identification
N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
3- Other microrganism
22. MGTG1 MGIT growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
23. MGTDY1 Days to MGT positive growth N None
24. MGT1 MGT final identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
25. GPNBG1 MGT/PNB growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
26. GPNBDY1 Days to MGT/PNB positive
growth
N None
27. GPNB1 MGT/PNB final identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
SECTION II
28. MIDST1 MODS INH DST result N 1- susceptible
2- resistant
29. MIDSTY1 MODS INH DST days to determ. N None
30. MRDST1 MODS RIF DST result N 1- susceptible
2- resistant
31. MRDSTY1 MODS RIF DST days to determ. N None
32. MIDST1DL MODS INH DST result-diluted N 1- susceptible
2- resistant
33. MIDSTY1DL MODS INH DST days to determ.
-diluted
N None
34. MRDST1DL MODS RIF DST result-diluted N 1- susceptible
2- resistant
35. MRDSTY1DL MODS RIF DST days to determ.-
diluted
N None
36. LJIDST1 LJ INH DST result N 1- susceptible
2- resistant
37. LJIDSTY1 LJ INH DST days to determ. N None
38. LJRDST1 LJ RIF DST results N 1- susceptible
2- resistant
39. LJRDSTY1 LJ INH DST days to determ. N None
40. GIDST1 MGIT INH DST results N 1- susceptible
2- resistant
41. GIDSTY1 MGT INH DST days to determ. N None
42. GRDST1 MGIT RIF DST results N 1- susceptible
2- resistant
43. GRDSTY1 MGT RIF DST days to determ. N None
777
=
TEST NOT PE
RFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
DATA MATRIX: MODS STUDY- SPECIMEN 2 LAB FORM M. Arias
Variable
Name
Label
Ty
pe
Values
SECTION 1
1. SID Study Identification Number N None
2. TSPEC2 Type of specimen N 1- spontaneous
2- induced
3- BAL
4- Bronchial wash
5- Post
bronchoscopy
sputum
3. DATE2 Date specimen collected D None
4. TIME2 Time specimen collected T None
5. DATEREC2 Date specimen received by lab D None
6. TIMEREC2 Time received by lab T None
7.
AFB2 AFB results N 1- negative
2- 1+
3- 2+
4- 3+
8.
MODSG2 MODS growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
9.
MODSDY2 MODS number of days to growth N None
10.
MODSM2 MODS morphology N 1-positive, cords visible
2-negative, no cords visible
11. MODS2 MODS Identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
12. PNBG2 MODS/PNB growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
13. PNBDY2 Days to positive growth N None
14. PNB2 MODS/PNB identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
15. LJG2 LJ growth results N 1- 0, no growth
2- 1-9 colonies
3- 1+ (20-100 col.)
4- 2+ (>100 distinct col.)
5- 3+ (confluent growth)
6- contaminated
16. LJDY2 Days to positive growth N None
17. HSCAT2 Heat stable catalase N 1- positive
2- negative
18. RTCAT2 Room temp catalase N 1- positive
2- negative
19. NIT2 Nitrate reduction N 1- positive
2- negative
777
=
TEST NOT PERFOR
MED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
20. NIA2 Niacin production N 1- positive
2- negative
Variable
Name
Label
Type
Values
21. LJ2
Final LJ identification
N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
3- Other microrganism
22. MGTG2 MGIT growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
23. MGTDY2 Days to MGT positive growth N None
24. MGT2 MGT final identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
25. GPNBG2 MGT/PNB growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
26. GPNBDY2 Days to MGT/PNB positive
growth
N None
27. GPNB2 MGT/PNB final identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
SECTION II
28. MIDST2 MODS INH DST result N 1. susceptible
3- resistant
29. MIDSTY2 MODS INH DST days to determ. N None
30. MRDST2 MODS RIF DST result N 1- susceptible
2- resistant
31. MRDSTY2 MODS RIF DST days to determ. N None
32. MIDST2DL MODS INH DST result-diluted N 1- susceptible
2- resistant
33. MIDSTY2DL MODS INH DST days to determ.
-diluted
N None
34. MRDST2DL MODS RIF DST result-diluted N 1- susceptible
2- resistant
35. MRDSTY2DL MODS RIF DST days to determ.-
diluted
N None
36. LJIDST2 LJ INH DST result N 1- susceptible
2- resistant
37. LJIDSTY2 LJ INH DST days to determ. N None
38. LJRDST2 LJ RIF DST results N 1- susceptible
2- resistant
39. LJRDSTY2 LJ INH DST days to determ. N None
40. GIDST2 MGIT INH DST results N 1- susceptible
2- resistant
41. GIDSTY2 MGT INH DST days to determ. N None
42. GRDST2 MGIT RIF DST results N 1- susceptible
2- resistant
43. GRDSTY2 MGT RIF DST days to determ. N None
777
=
TEST NOT PERFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
DATA MATRIX: MODS STUDY- SPECIMEN 3 LAB FORM M. Arias
Variable
Name
Label
Ty
pe
Values
SECTION 1
1. SID Study Identification Number N None
2. TSPEC3 Type of specimen N 1- spontaneous
2- induced
3- BAL
4- Bronchial wash
5- Post
bronchoscopy
sputum
3. DATE3 Date specimen collected D None
4. TIME3 Time specimen collected T None
5. DATEREC3 Date specimen received by lab D None
6. TIMEREC3 Time received by lab T None
7.
AFB3 AFB results N 1- negative
2- 1+
3- 2+
2- 3+
8.
MODSG3 MODS growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
9.
MODSDY3 MODS number of days to growth N None
10.
MODSM3 MODS morphology N 1-positive, cords visible
2-negative, no cords visible
11. MODS3 MODS Identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
12. PNBG3 MODS/PNB growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
13. PNBDY3 Days to positive growth N None
14. PNB3 MODS/PNB identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
15. LJG3 LJ growth results N 1. 0, no growth
2- 1-9 colonies
3- 1+ (20-100 col.)
4- 2+ (>100 distinct col.)
5- 3+ (confluent growth)
6- contaminated
16. LJDY3 Days to positive growth N None
17. HSCAT3 Heat stable catalase N 1- positive
2- negative
18. RTCAT3 Room temp catalase N 1- positive
2- negative
19. NIT3 Nitrate reduction N 1- positive
2- negative
777
=
TEST NOT PERFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
20. NIA3 Niacin production N 1- positive
2- negative
Variable
Name
Label
Type
Values
21. LJ3
Final LJ identification
N 1. M. tuberculosis
2- MOTT
3- Other microrganism
22. MGTG3 MGIT growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
23. MGTDY3 Days to MGT positive growth N None
24. MGT3 MGT final identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
25. GPNBG3 MGT/PNB growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
26. GPNBDY3 Days to MGT/PNB positive
growth
N None
27. GPNB3 MGT/PNB final identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
SECTION II
28. MIDST3 MODS INH DST result N 1. susceptible
2- resistant
29. MIDSTY3 MODS INH DST days to determ. N None
30. MRDST3 MODS RIF DST result N 1- susceptible
2- resistant
31. MRDSTY3 MODS RIF DST days to determ. N None
32. MIDST3DL MODS INH DST result-diluted N 1- susceptible
2- resistant
33. MIDSTY3DL MODS INH DST days to determ.
-diluted
N None
34. MRDST3DL MODS RIF DST result-diluted N 1- susceptible
2- resistant
35. MRDSTY3DL MODS RIF DST days to determ.-
diluted
N None
36. LJIDST3 LJ INH DST result N 1- susceptible
2- resistant
37. LJIDSTY3 LJ INH DST days to determ. N None
38. LJRDST3 LJ RIF DST results N 1- susceptible
2- resistant
39. LJRDSTY3 LJ INH DST days to determ. N None
40. GIDST3 MGIT INH DST results N 1- susceptible
2- resistant
41. GIDSTY3 MGT INH DST days to determ. N None
42. GRDST3 MGIT RIF DST results N 1- susceptible
2- resistant
43. GRDSTY3 MGT RIF DST days to determ. N None
777
=
TEST NOT PERFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
DATA MATRIX: MODS STUDY- 90-DAY FOLLOW-UP PATIENT FORM
M. Arias
Variable
Name
Label
Type
Values
1. SID Study Identification Number N None
2. WEIGHT2 Weight at follow-up N None
3. COUGH2 Cough diminished or absent N 1- Yes
2- No
4. DEATH Death at follow-up N 1- Yes
2- No
5. CAUSE Cause of death N 1- TB
2- Not TB
6. ALTDX Alternative diagnosis (other than
TB)
N 1- Yes
2- No
7. ALTDXLC Alternative diag. lung cancer N 1- Yes
2- No
8.
ALTDXBP Alternative diag. bacterial pneum. N 1- Yes
2- No
9.
ALTDXP Alternative diag. pneumocystosis N 1- Yes
2- No
10.
ALTDXPM Alternative diag. pulmon. mycosis N 1- Yes
2- No
11.
ALTDXVP Alternative diag. viral pneum. N 1- Yes
2- No
12. ALTDXAP Alternative diag. atypical pneum. N 1- Yes
2- No
13. ALTDXCF Alternative diag. cardiac failure N 1- Yes
2- No
14. ALTDXPC Alternative diag. pneumoconiosis N 1- Yes
2- No
15. ALTDXO Alternative diag. other N 1- Yes
2- No
16. TBTX Anti-TB treatment prescribed N 1- Yes
2- No
17. DTBTX Date TB treatment initiated D None
18. INHREC INH prescribed/received N 1- Yes
2- No
19. RIFREC RIF prescribed/received N 1- Yes
2- No
20. PZAREC Pyrazinamide
prescribed/received
N 1- Yes
2- No
21. EMBREC Ethambutol prescribed/rec N 1- Yes
2- No
22. STREC Streptomycin prescribed/rec N 1- Yes
2- No
23. ETREC Ethionamide prescribed/rec N 1- Yes
2- No
24. OFREC Ofloxacine prescribed/rec N 1- Yes
2- No
777
=
TEST NOT PERFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
DATA MATRIX: MODS STUDY- 90-DAY FOLLOW-UP FORM M. Arias
Variable
Name
Label
Type
Values
25. RIFAREC Rifabutin prescribed/rec N 1- Yes
2- No
26. KANREC Kanamycin prescribed/rec N 1- Yes
2- No
27. AMIREC Amikacyn prescribed/rec N 1- Yes
2- No
28. CIPREC Ciprofloxacine prescribed/rec N 1- Yes
2- No
29. CAPREC Capreomycine prescribed/rec N 1- Yes
2- No
30. CYCREC Cycloserine prescribed/rec N 1- Yes
2- No
31. AMCLREC Amoxiciline/clavulanic acid
(Augmentin)
N 1- Yes
2- No
32.
TBTXCG Change in TB treatment N 1- Yes
2- No
33.
RETXCG Reason for change N 1- Adverse reaction
2- Medication interaction
3- Failure
4- Other
34.
DTXCG Date of treatment change D MM-DD-YYYY
35.
INHREC2 Second regimen with INH N 1- Yes
2- No
36. RIFREC2 Second regimen with RIF N 1- Yes
2- No
37. PZAREC2 Second regimen with PZA N 1- Yes
2- No
38. EMBREC2 Second regimen with EMB N 1- Yes
2- No
39. STREC2 Second regimen with ST N 1- Yes
2- No
40. ETREC2 Second regimen with Ethionamid
e
N 1- Yes
2- No
41. OFREC2 Second regimen with Ofoloxacine N 1- Yes
2- No
42. RIFAREC2 Second regimen with Rifabutin N 1- Yes
2- No
43. KANREC2 Second regimen with Kanamycin N 1- Yes
2- No
44. AMIREC2 Second regimen with Amikacyn N 1- Yes
2- No
45. CIPREC2 Second regimen with Ciprofloxaci
n
N 1- Yes
2- No
46. CAPREC2 Second regimen with Capreomyci
n
N 1- Yes
2- No
777
=
TEST NOT PERFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
777
888
999
=
TEST NOT PERFORMED;
=
UNKNOWN;
=
MISSING
Variable
Name
Label
Type
Values
47. CYCREC2 Second regimen with Cycloserine N 1- Yes
2- No
48. AMCLREC2 Second regimen with Amox/
Clavulanic acid (Augmentin)
N 1- Yes
2- No
49. FCXRAY Follow-up chest X-Ray N 1- normal
2- active TB
3- TB sequellae
4- other pulmonary disease
50. FCXRAYD Follow-up chest X-Ray date D None
51. FCXRAYP Follow-up chest X-Ray pattern N 1- Cavitary
2- Typical
3- Compatible
4- Atypical
DATA MATRIX: MODS STUDY 90-DAY FOLLOW-UP MYCOBACTERIOLOGY LAB FORM
(Only for participants with≥1 POSITVE MODS c
ulture and all NEGATIVE LJ cultures)
M. Arias
777
=
TEST NOT PERFORMED;
888
=
UNKNOWN;
999
=
MISSING
Variable
Name
Label
Type
Values
1. SID Study Identification Number N None
2. TSPECF Type of specimen N 1- spontaneous
2- induced
3- BAL
4- Bronchial wash
5- Post
bronchoscopy
sputum
3. DATEF Date specimen collected D None
4. TIMEF Time specimen collected T None
5. DATERECF Date specimen received by lab D None
6. TIMERECF Time received by lab T None
7.
AFBF AFB results N 1- negative
2- 1+
3- 2+
4- 3+
8. LJGF LJ growth results N 1- 0, no growth
2- 1-9 colonies
3- 1+ (20-100 col.)
4- 2+ (>100 distinct col.)
5- 3+ (confluent growth)
6- contaminated
9. LJDYF Days to positive growth N None
10. HSCATF Heat stable catalase N 1- positive
2- negative
11. RTCATF Room temp catalase N 1- positive
2- negative
12. NITF Nitrate reduction N 1- positive
2- negative
13. NIAF Niacin production N 1- positive
2- negative
14. LJF
Final LJ identification
N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
15. MGTGF MGIT growth results N 1- positive
2- negative
3- contaminated
16. MGTDYF Days to MGT positive growth N None
17. MGTF MGT final identification N 1- M. tuberculosis
2- MOTT
TheJohns Hopkins }vledicallnstitutions
íThe .!ohns Hopkins HospilUl
TheJohns Hopkins Bayvielt' Jf:.:dicalCenler, dC
Aprovado em
13 dejzmho. 2003
\VIRB ,\;
Olympia. WA
Identificação do Indivíduo
INFORMAÇÃO SOBRE O OBJETiVO DA PESQUISA E TERl\IO DE
CONSENTIME~TO
TÍTULO:
ESlUdo Multicêntrico do Teste de Susceptibilidade e Detecção po
Observação Microscópica (MOOS) para o Diagnóstico da Tuberculosl
Pulmonar e da Tuberculose Resisteme a Drogas.
~Q PROTOCOLO.: WIRBp.:20()22077'
PATROCINADOR: Instituto Nacional de Saúde. Bethesda, Maryland, EUA
Agência dos Estados Unidos para o Desenvolvimento Internacional,
WashingtOn.DC, EUA
Iniciativa pela Tuberculose do Gorgas
INVESTIGADOR: Susan E. Dorman, MD
Escola de Medicina - Universidade Johns Hopkins
Centro de Pesquisa em Tuberculose
Room 107.424North BondStreet Baltimore.MO 21231
410-502-2717
LOCAIS:
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.
Ilha do Fundão
Rio de Janeiro. CEP 21945-590. Brasil.
Hospiral Raphael de Pauia Souza
Estrada do n° 2000, Curicica, Jacarepaguá
Rio de Janeiro, CEP: 222780-190, Brasil.
SUB-INVESTIGADOR [ES]: Afrânio Kritski, M.D., Ph.D.
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
Rio de Janeiro. CEP 21945-590. Brasil
(021) 5622426
Fernanda Mello, M.D.. Ph.D,
Hospital Universitário Clememino Fraga Filho
Rio de Janeiro, CEP 21945-590. Brasil
Mônica Andraàe. \1.0.
Hospital Raphaei de P~ula Souza
Rio de Janeiro. CEP 222780-190. Brasil
TheJohns Hopkins Aledicallnslitlllions
(The Johns Hopkins Ho.spital
file Johns Hopkins Ba.vviewMedical Cenler. eu:
Aprovado em
13 dejunho. 2003
WIRB'iJ
Olympia. WA
Este Termo de Consemimento pode conter palavras que você não entenda. Por favor. peça 2
médico responsável ou a equipe responsável pelo estudo que explique qualquer palavra c
informação que você não tenha entendido claramente. Voce pode levar para casa uma cópia m~
assinada deste termo de consemimento para pensar a respeito ou discutir com íàmiliares ou amigo
,lntes de tomar a sua decisão.
:\este termo de consentimento, "VGcê" refere-se sempre ao indivíduo. Se você é o representan
legal autorizado, por tàVOLlembre-se que "você" refere-se ao indivíduo em estudo.
OBJETIVO DO ESTUDO
() propósito deste estudo é descobrir se um teste d.:: investigação para tuberculose (TB) poc
ajudar a identificar indivíduos com TB no Brasil.
DESCRlÇ.,'\O DO ESTLDO
Pessoas em investigação para TB podem ingressar neste estudo. Espera-se que. aproximadamen
500 indivíduos ingressarão neste estudo no BrasiL e aproximadamente 500 indivídu<
ingressarão neste estudo em Honduras. O tratamento da TB não é uma parte deste estudo.
maioria dos indivíduos neste estudo será convidada a participar deste estudo por 2 a 3 dias a fi:
de fornecer 2 a 3 amostras de escarro. Uma pequena parte dos indivíduos será convidada
retomar para uma visita adicional após três meses do seu ingresso no estudo.
PROCEDIlVIENTOS
Caso eu concorde em ingressar neste estudo, as seguintes coisas acontecerão uma vez r
momento em que você ingresse no estudo:
1. Você responderá algumas questões sobre sua condição médica. Isto levará em torr
de 10 minutos.
2. As amostras de escarro que você fornecerá para os testes de rotina para TB sed
avaliadas no laboratório usando os testes rotineiros e o teste sob investigaçã
denominado MODS, que baseia-se na observação microscópica do escarro pai
detecção do bacilo da TB e determinação da sua sensibilidade às drogas anti-TJ
Para este estudo. as mesmas amostras de eSCaITOque você forneceu para os testl
rotineiros para TB serão usadas para o teste sob investigação.
3. Caso você tenha feito raio-x de tórax, teste tuberculínico ou teste para HIV con
parte de seus cuidados médicos regulares, estes dados serão considerados como par
das informações necessárias para o estudo. Você nào será submetido a estes testes p
causa do estudo.
Dependendo dos resultados dos testes para TB no escarro. as seguintes coisas poderão acontec(
após três meses do ingresso no estudo:
TheJohns Hopkins .\1edicallnslitutions
!lhe Johns Hopkins Hospiwl
TheJohns Hopkins Ba.vvinv Jfedieal Cenler. ele
Aprovado em
13 de junho. 2003
WIRB IÇ
Olympia, WA
1. Voce responderá a algumas questões sobre sua condição médica. Isto lev~
aproximadamente 10 minutos.
.
2. Se voce ainda tiver tosse. você terá uma amostra do seu escarro enviada ao laboratól
para ser testada para TB usando os testes rotineiros.
3. Voce fará um raio-x de tórax.
RISCOS POTENCIAIS
Os riscos para o desenvolvimento de problemas médicos por ingressar neste estudo são mui
pequenos, dado que na maioria das situações, as informações e as amostras de escarro a sere
usadas para a sua avaliação médica padrão serão utilizadas para este projeto de pesquisa. Pa
este projeto de pesquisa, alguns indivíduos serão convidados a realizar um raio-x de tórax ap
90 dias do seu ingresso no estudo. Este raio-x de tórax poderá aumentar seu risco de desenvolv
um câncer. mas isto é muito improvável. A exposição à radiação que você receberá pé
participação neste estudo é equivalente a uma exposição de 10 millirem por iOdoo seu corpo.
radiação a qual estamos naturalmente expostos (radiação cósmica. rádon. etc) determina ur
exposição de aproxidamente 300 millirem por todo o seu corpo, no período de um ano. Se vo
estiver grávida ou ficar grávida durante sua participação neste estudo, você deverá notificar.
responsável pelo estudo. Se você estiver grávida, este raio-x de tórax poderá prejudicar seu fe1
Você não será conviGadaa realizar um raio-x de tórax caso você esteja grávida.
NOVOS ACHADOS
Voce ficará ciente de qualquer nova infOlmação que possa mudar sua decisão de participar de~
estudo.
POSSÍVEIS BENEFÍCIOS
Este nào é um estudo sobre tratamento, e nào se espera que você receba qualquer beneí1c
médico direto pela sua participaçào neste estudo. Informações deste projeto de pesquisa poder;
ser Úteispara um melhor diagnóstico, no futuro, para as pessoas com TB.
CUSTOS
\!ão haverá nenhuma cobrança pelas visitas ou pelos testes em eSlUdo.Todos os testes em estw
serão oferecidos gratuitamente para voce.
AL TERNA TIV A!S
Este não é um estudo sobre tratamento. Sua alternativa é a de nào participar deste estudo.
CONFIDENCIABILIDADE
TheJohns Hopkins ,\'1edicallnstiuuions
! The Johns Hopkins Ho.~pita!
The johns Hopkins Ba.v,'iew .Hedicaj CenTe,.. ;:!C
Aprovado em
13 defunho. 2003
WIRB"
Olympia. WA
Inforn1ações individuais. a serem utilizadas somente para os propósitos do estudo. seI
identiticadas pelo número de identificação no estudo e nào pelos nomes dos indivídul
Inforn1ações deste estudo serão entregues para o patrocinador. A definição de "patrocinador" inc
qualquer pessoa ou empresa que for contrarada pelo responsável para ter acesso às infonnações
pesquisa durante e após o estudo. As infomaçàes poderão ser entregues às agênc
gO\êrnamentais no seu país onde este teste sob estudo poderá ser considerado para aprovaç;
Registros médiws que identifiquem voce e o termo de consentimento assinado por voce seI
guardados e/8U serão copiados para propósitos de pesquisa ou regulatórios pelos:
.
Patrocinadore::;.
E poderão ser guardados e/ou copiados para propósitos de pesquisa ou regulatóiios pelos:
.
Departamento de Saúde e Agência de Serviços Humanos (DHHS):
Agencias Governamentais no seu país:
Universidade .TohnsHopkins
Universidade Federaldo Rio de Janeiro: e
Junta Revisora Institucionaldo Oeste (WIRB~\
.
$
.
.
Ccnfidenciabilidade absoluta não poderá ser garantida porque é necessário dar informações a es
parceiros. Os resultados deste projeto de pesquisa poderão ser apresentados em reuniões ou .
publicações. Sua ideniidade não serárevelada nessas apresentações.
PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA/DESISTÊNCIA
Sua participação neste estudo é voluntária. Você pode decidir por não participar deste estudo. c:
voce participe. você poderá livremente desistir des,e estudo em qualquer momento. Sua decisão r
mudará seus cuidados médicos futuros nestes locais.
Se este estudo for finalizado, sua participação neste estudo poderá ser interrompida a qualq
momento. sem o seu consentimento, pelo médico responsável pelo estudo 011pelo patrocinador
çstudo.
COMPENSAÇÃO POR INJÚRIA
Se você achar que tenha sofrido alguma injúria como resultado da sua participaçào neste estu
ou achar que voce não tenha sido tratado adequadamente, por fàvor, contate o Dr. Afranio Krit
no telefone 021-:25622426 (Hospital Universitário Clementino Fraga Filho), ou a Dra. Su
Dorman no telefone 1-410-502-2717 (Universidade Johns Hopkir.s). O serviço no Hosp
Universitário Clementino Fraga Filho ou no Hospital Raphael de Paula Souza estará acessiv{
você no caso de qualquer injúria. No entanto. a Universidade Johns Hopkins e a Universid:
Fedeml do Rio de Janeiro. e o Governo Federal dos Estado Unidos nào possuem um progw
para pagá-Ia se você sofrer algum dano ou IÍver outro desfecho ruim. Pagamento por qualq
lraW111ento ou hospitalização que voce necessite. se sofrer injúria como resultado da
TheJohns Hopkins /yfedical InslÍlwio/1s
(The Johns Hopkins Ho.\pÜal
TheJohns Hopkins Bayview Medica/ Center. elC
Aprovado em
13 dejzmho, 2003
WIRB
.;
Olympia, WA
participação neste estudo, será financiado pelo \l1inistério da Saúde do Brasil através dos s~
hospitais e clínicas de acesso público. ..
Assinando este termo de consentimento. você não abrirá mão de qualquer direito legal que v(
de qualquer forma teria como um indivíduo participame de um projeto de pesquisa.
ORIGEM DO FINANCIAMENTO
o tinanciamento para este projeto de pesquisa st'rá provido pelo Instituto Nacional de Saúde c
Esraàos Unidos e pela Agência dos Estados Uúidos para o Desenvolvimento lntemacion
Iniciativa pela Tuberculose -Gorgas.
QUESTÕES
Se voce tiver qualquer questão com referência a sua participação neste estudo. ou se a qualq1
momento voce achar que sofreu algum dano relacionado com lipesquisa. contatar:
Dr. Afranio l<'..ritski(Hospital Universitário Clementino Fra!ZaFilho) no telefone O
,25622426.ou
Ora. Susan Dorman (Universidade Johns Hopkins) no telerone 1-410-502-2717
Se você tiver qualquer questão sobre seus direitos como indivíduo participante de um projeto
pesquisa, você deve contatar:
Westem Institutional Review Board@(WIRB@)
3535 Seventh Avenue S.W.
Olympia, \Vashington 98502
Telefone: 1-360-252-2500
WIRBJj:é um grupo de pessoas que realizam revisão independente de projetos de pesquisa.
Não assine este termo de consentimento a não ser que você tenha tido a chance de fa.l
perguntas e tenha recebido respostas satistàtórias para todas as suas questões.
Se você concordar em participar desse estudo. você receberá uma cópia deste termo
consentimento assinada e datada para arquivar.
CONSENTIMENTO
Eu li (ou alguém leu para mim) as informações contidas neste termo de consentimento. Todas
minhas questões sobre o estudo ç da minha (ou do meu filho) participação nele foram respondid
satistatoriamente. Eu concordo em participar deste estUdoou permito a participação do meu fil
neste estudo.
The Johns Hopkins Medical Institutions
IThe Johns Hopkins Ho,spiwl
TheJohns flopkins Ba_vvie~vJledical Cente,., ele
Aprovado em
13 de junho. 2003
WIRB'.:
Olympia. WA
Eu autorizo a exibição do meu (ou do meu tilho) prontuário médico para fins de pesquisa ou pa
propósitO regulador pelo patrocinador. as agências DHHS, as agências governamentais no país,
Universidade Johns Hopkins. a Universidade Federal do Rio de Janeiro e WIRB\B',
Pela assinatura deste termo de consentimento eu não desisti de qualquer direitO legai que eu «(
meu filho) teríamos. de outra forma, como um indivíduo participante de um projeto de pesquisa.
Comentfmento e instruções de Concordância:
(,'onsenrimento: IndivÍduo de 18 anos ou mais tem que assinar na linha abaixo,
Para individuos menores de 18, () consentimento é fornecido pe
Representante Legal Autorizado,
É necessário para os individuos com idade entre J2 e j 7anos, utilizando
seção de Concordância abaixo,
Concordância:
Nome do Indivíduo em letra de forma
ASSINATURA DE CONSENTIMENTO
Assinatura do Indivíduo (18 anos ou mais)
Data
Assinatura do Representante Legal Autorizado
(Se aplicável)
Data
Assinatura da Pessoa que conduziu a discussão para a obtenção
temlOde consentimento
Data
ASSINATURA DE CONCORDÂNCIA (para indivíduos com idade emre 12a 17anos)
Concordância:
Este projeto de pesquisa foi explicado para mim e concordei em participar neste estudo.
Assinatura do Indivíduo pela Concordância
Data
Idade (anos)
Eu confirmo que eu expliquei o estudo para o indivíduo com a profundidade o::ompatíveleon
compreensão do indivíduo e que o indivíduo concordou em panicipar do estudo,
6
The.Iohns Hopkins .\/edicai Inslitutions
!The Johns Hopkins Hospital
TheJohns Hopkins BayvicH'Jledical Center, ete
Aprovado em
13 dejunho. 2003
WIRB'~
Olympia. WA
Assinatura da Pessoa que conduziu a discussão para
a obtenção da concordância
Data
u Use o que segue somenTese aplicáve!----------------..---------------
Se eSle termo de consentimento foi lido para o indivíduo porque o indi,'íduo ou o s
representante legal autorizado são ini'apazes de ler o Termo, uma testemunha imparcial ri
uji/.iada ao pesquisador ou ao investigador deve estar presente para o consentimento
Llssinaturada declaraçào que se segue:
Eu confirmo que a informaçào neste termo de consentimento e quaisquer OUlrasinformaçõ
escritas foram explicadas cuidadosameme, e aparememente emendidas pelo indivíduo ou s
represenlOnte legal autori:::ado,O indivíduo ou ()seu representante legal autorizado consentire
livremente na participaçc7oneste projeto de pesquisa,
Assinatura da Testemunha Imparcial
Data
Nota: esta assinatUraneste bloco não poderá ser usada para a traduçÜoem outras línguas, L
consentimento tradu:::idoé necessário para o indivíduo inscrito que nãojala inglês.
JOURNAL OF CuNlCAL MICROBIOLOGY, Oct. 2007, p. 3387-3389
0095-1137/07/$08.00+0 doi: 10.1128/JCM.OO580-07
Copyright @ 2007, American Society for Microbiology. Ali Rights Reserved.
Vol. 45, No. 10
Clinical Evaluation of the Microscopic Observation Drug Susceptibility
Assay for Detection of Mycobacterium tuberculosis Resistance to
Isoniazid or Rifampin \7
Fernanda C. Q. Mello,1t Mayra S.Arias,2t Senia Rosales,3Anna Grazia Marsico,1Ada Pavón,4
Carlos Alvarado-Gálvez,4Carlos Leonardo Carvalho Pessôa,1Melly Pérez,3 Monica K Andrade,l
Afranio L. K.ritski,1Leila S. Fonseca, 1 Richard E. Chaisson,5
Michael E. Kimerling,2 and Susan E. Dorman5*
Federal Universityof Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil1; Universityof Alabama at Binningham, Binningham, Alabama2;
Gorgas TuberculosisInitiative-Honduras'3; National Thorax Institute, Tegucigalpa,Honduras4; and Johns Hopkins
UniversityScOOolof Medicine and Bloomberg School of Public Health, Baltimore, Maryland5
Received 15 March 2007/Retumed for modificati.on 24 June 2007/Accepted 29 Ju1y 2007
This prospective stndy evalnated the performance of the microscopic observation drog snsceptibility
(MODS) assay for the direct detection ofMycobacterium tuberculosis drng resistance. MODS assay sensitivity,
specificity, and positive and negative predictive values were 96.7% (95% confidence intervaI [95% CI], 92.1 to
98.8%),78.4% (95% Cl, 73.5 to 80.6%),82.4% (95% Cl, 78.4 to 84.2%), and 95.8% (95% Cl, 89.9 to 98.5%),
respectively, for isoniazid resistance and 96.0% (95% CI, 90.3 to 98.6%), 82.9% (95%Cl, 78.8 to 84.7%), 80.0%
(95% Cl, 75.2 to 82.1%), and 96.7% (95% Cl, 91.9 to 98.8%), respectively, for rifampin resistance. For both
rifampin and isoniazid testing, the likelihood ratio for a negative test was :50.05, indicating that the MODS
assay may be useful for ruling out drug resistance.
It is estimated that approximately 424,000 cases of multi-
drug-resistant tuberculosis (MDR-TB) occurred in 2004 (12).
Accordingly, the new Stop TB Strategyand The Global Plan to
Stop TB, 2006--2015inc1ude MDR-TB management as a basic
component of TB control (10, 11). The recognition of a duster
of patients with human immunodeficiency virus-associated, ex-
tensively drug-resistant TB (XDR-TB) in KwaZulu-Natal
province, South Africa, further underscores the need for the
prompt diagnosis of drug-resistant TB, since mortality among
these patients was nearly 100% (4). The WorId Health Orga-
nization Global Task Force on XDR-TB has recommended
timely access to drug susceptibility testing for alI patients at
risk for or suspected to have MDR- or XDR-TB (9).
The microscopic observation drug susceptibility (MODS)
assay is a relatively low-cost, simple liquid culture method that
relies on the microscopic detection of cording growth that is
characteristic of Mycobacterium tuberculosis (1, 3, 6, 7, 8). Po-
tential advantages of the MODS method are relatively rapid
mycobacterial growth in liquid media and reliance on micros-
copy skills similar to those used for smear microscopy. The
MODS assayhas been reported to reliably identify M tuber-
culosis isolates with resistance to isoniazid (INH) and/or ri-
fampin (RIF) (3, 6, 7, 8).
We undertook a prospective study in two settings to further
evaluate the performance of MODS testing for the direct de-
tection of M. tuberculosis drug resistance in specimens from
* Corresponding author. Mailing address: Johns Hopkins University
School of Medicine, 1503 East Jeíferson St., Room 105, Baltimore,
MD 21231. Phone: (410) 502-2717. Fax: (410) 955-0740. E-mail:
[email protected].
t These authors contributed equa1ly.
v Published ahead of print on 15 August 2007.
patients with suspected pulmonary TB at risk for drug resis-
tance.
This study was performed as part of a larger study to eval-
uate the performance of the MODS method for the diagnosis
of TB among patients suspected of having pulmonary TB at the
National Thorax Institute in Tegucigalpa, Honduras, and the
Federal University of Rio de Janeiro in Brazil (1). Suscepti-
bility testing was performed for alI suspected TB patients pro-
spectively identified as having one or more of the followingrisk
factors: (i) suspected TB treatment failure, (ii) suspected TB
relapse, (iii) treatment default, and (iv) dose contact with a
patient with MDR-TB (1)- Informed consent was obtained
from alI subjects, and this study was approved by the ethics
committees of alI involved institutions.
Respiratory specimens submitted for routine care purposes
were digested and decontaminated using the N-acetyl-L-CYs-
teine-sodium hydroxide method (5). Pellets were resuspended
in a final volume of 2 ml and used irnmediately for the inocu-
lation of culture media.
INH stock solution (10,000 J.Lg/rnI)was prepared by dissolv-
ing 100mg ofINH (Sigma) in a final volume of 10ml of sterile
distilled water. RIF stock solution (10,000 J.Lg/mI)wasprepared
by dissolving 100mg @~(Sign1a) in dimethyl sulfoxide and
then adding sterile distilled water to a volume of 10 mI. Ali-
quots were frozen.
MODS liquid medium was prepared as described previously
(8). Antibiotic stock solutions were diluted and added to
MODS liquid medium to give the following critical concentra-
tions: INH, 0.1 J.Lg/mI(MODS INH medium), and RIF, 2.0
J.Lg/rnI(MODS RIF medium). For each respiratory specimen,
1 mI of drug-free MODS medium was dispensed into one well
of a 24-weIl tissue culture plate (Costar, Corning, NY). One
milliliter of MODS INH medium was placed into each of two
3387
3388
NOTES
TABLE 1. Detection of resistance to INH and RIF by the MODS
assay
aD, Lowenstein-Jensen.
adjacent wells, and 1 ml of MODS RIF medium was placed
into each of two additional wells, for a total of five wells per
respiratory specimen. Aliquots (0.2 ml) of each decontami-
nated respiratory specimen were inoculated into one drug-free
well, one well containing MODS INH medium, and one well
containing MODS RIF medium. In addition, O.2-mlaliquots of
each decontaminated respiratory specimen diluted 1:10 in
MODS medium were inoculated into each of the remaining
INH- and RIF-containing wells. Specimens obtained from dif-
ferent subjects but processed on the same day were plated into
different rows of the same plate, and the plate was placed
within a gas-permeable plastic bago Plates were incubated at
37°C in 10% CO2. The drug-free well was examined twice
weekly for growth and pellicle morphology for 8 weeks by using
X40 inverted microscopy. A culture was considered positive for
M tubercu/osis if microscopically observed bacterial pellicles
had a corded appearance. Drug-containing wells were exam-
ined microscopically on the 14th day after cording bacterial
growth became visible in the corresponding drug-free welL
Drug-containing wells were recorded as positive (indicating
drug resistance) if corded growth was visible and negative
(indicating susceptibility) if no corded growth-was visible. The
time interval of 14 days was chosen because our previous work
showed that the susceptibility or resistance status indicated by
the MODS assay is stable for at least 2 weeks after the detec-
tion of growth (8) and because this strategy optimized effi-
ciency by eliminating the need for daily microscopic examina-
tion of all drug-containing wells. The MODS technologist was
not aware of the Lowenstein-Jensen (U) drug susceptibility
reference test results.
U slants were prepared from a commercially available pow-
der medium base according to the instructions of the manu-
facturer (Becton Dickinson). Primary cultures were inocu-
lated, examined, and interpreted as described previously (I).
J. CLIN. MICROBlOL.
For susceptibility testing, several spadesful of growth were
transferred from the primary U slant to a tube containing glass
beads and sterile saline and homogenized for 1 min. Afier
larger particles had been allowed to settle for 30 min, the
supematant was withdrawn, diluted to the turbidity of a 1
McFarland standard, and further diluted to 10-3 and 10-5 in
saline. For each dilution, 0.2-ml aliquots were inoculated onto
three U slants, one containing INH at 0.2 f-Lg/ml,one contain-
ing RIF at 40 f-Lg/ml,and one drug-free slant (2). Slants were
incubated at 37"C, and colonies were enumerated on day 28.
Drug resistance was defined as the growth of colonies on the
drug-containing slant equal to ;-::1%of that of colonies on the
drug-free slant. The U technologist was not aware of MODS
assay results.
-
Among 351 individuaIs at risk for drug-resistant TB, 180
(51.3%) were culture positive for M tuberculosis by both
MODS and U methods and were therefore included in this
analysis. By the comparator U testing method, 69 isolates
(38.3%) were resistant to both INH and RIF, 23 (12.8%) were
resistant to INH alone, 5 (2.8%) were RIF monoresistant, and
83 (46.1%) were susceptible to both INH and RIF. The per-
formance parameters of the MODS assay are shown in Tables
1 and 2. MODS test results are shown for undiluted MODS
inocula and for inocula diluted 1:10. The MODS assay indi-
cated some specimens to be resistant that the comparator
method indicated to be susceptible. This trend was slightly
more marked when undiluted inocula were used for MODS.
For INH testing, specimen dilution resuIted in the correct
rec1assification of fOlirspecimens as susceptible. For RIF test-
ing, specimen dilution resulted in the correct rec1assificationof
two specimens as susceptible. Of 69 isolates c1assifiedas MDR
by U testing, the MODS assay (with diluted or undiluted
inocula) correctIy identified 66 (95.7%) as MDR. Median
times to the availability of susceptibility results were 21 days
(interquartile range, 17to 24 days) for the MODS method and
49 days (interquartile range, 46 to 55 days) for the U method
(P, <0.001 by paired t test).
A possible expl~ation for the disagreement between
MODS test results and those of the comparator U proportion
method lies in the qualitative nature of the MODS assay. ln
MODS testing, unlike solid-agar methods, there are no dis-
crete colonies to count and, therefore, a resistance proportion
cannot be calculated. lu tJ:te MODS method, any growth in
drug-containing medium indicates drug resistance, whereas in
solid-agar testing, growth of less than 1% of that on drug-free
medium is interpreted as susceptibility. ln addition, the bacil-
lary burdens in the inocula appeared to have a small effect on
drug susceptibility testing, since the leveI of agreement be-
tween MODS and the reference standard was slightly higher
for l:lO-diluted inocula than for undiluted inocula. The impact
Antibiotic
% Sensitivity
PPV (%)
TABLE 2. Performance characteristics of MODS for detection of resistance to INH and RIF'
% Accuracy
InocuJum
% Specificity NPV (%)
Positive LR
Negative LR
RIF
Undiluted 96.7 (92.1-98.8) 78.4 (73.5-80.6) 82.4 (78.4-84.2) 95.8 (89.9-98.5) 4.48 (3.48-5.10) 0.04 (0.01-0.11) 87.8 (83.0--89.9)
Diluted 1:10 96.7 (92.2-98.8) 83.0 (78.2--85.1) 85.6 (81.5---87.4) 96.1 (90.5-98.6) 5.68 (4.22-6.65) 0.04 (0.01-0.10) 90.0 (85.3-92.1)
Undiluted 96.0 (90.3-98.6) 82.9 (78.8-84.7) 80.0 (75.2-82.1) 96.7 (91.9-98.8) 5.60 (4.25-6.44) 0.05 (0.02-0.12) 88.3 (83.6-90.5)
Diluted 1:10 96.0 (90.4--98.6) 84.8 (80.7-86.6) 81.8 (77.0-84.0) 96.7 (92.1-98.8) 6.30 (4.69-7.36) 0.05 (0.02-0.12) 89.4 (84.7-91.6)
INH
a Values in parentheses are 95% confidence intervals. PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value; LR, likehllood ratio.
No. of spccimenswith
Da referenccstandard
Antibiotic
Inoculum
MODSresult
rcsultof:
Resistant
Susccptible
INH
Undiluted Resistant 89 19
Susceptible
3 69
Diluted 1:10 Resistant 89 15
Susceptible
3
73
RIF Undiluted Resistant 72 18
Susceptible
3 87
Diluted 1:10 Resistant 72 16
Susceptible
3 89
VOL. 45, 2007
on MODS assay susceptibility results of the timing of readings
and inoculum bacillary burdens warrants further study.
Our results are generally similar to those reported by Cav-
iedes et aI. and initially by Moore et aI. (3, 6). Caviedes et aI.
showed that the results of MODS testing for RIF susceptibility
had approximately 90% concordance with the results of a mi-
crowell Alamar blue comparator assay. The MODS test was
sensitive for the detection of resistance to RIF (critical con-
centration, 0.5 fLg/ml),but as in our study, the MODS method
misclassified as resistant a number of strains that were classi-
fied as susceptible by the comparator method (3). ln a retro-
spective study, Moore et aloanalyzed their database of results
for 207 pretreatment respiratory specimens collected and cul-
tured by the MODS method as a component of epidemiolog-
ical studies in Peru (6). The comparator method was either an
indirect microwell Alamar blue comparator assay or a tetrazo-
lium microplate assay; critical concentrations for MODS test-
ing were 0.4 fLg/mlfor lNH and 1.0 I-Lg/mlfor RIF. MODS
assay sensitivities, specificities, positive predictive values
(PPVs), and negative predictive values (NPVs) were 81.1%,
96.9%, 85.7%, and 95.7% for INH and 100%, 98.3%, 57.1%,
and 100% for RIF. For both drugs, the low PPVs were a
consequence of the MODS test's indicating resistance in some
isolates that were susceptible by the reference standard
method. However, Moore et aL recently evaluated MODS
assay performance for direct susceptibility testing using indi-
rect susceptibility testing by the U method or the automated
MBBacT system as the reterence standard and a microwell
Alamar blue assay for the resolution of discordant reference
method results. For the MODS assay, critical concentrations
were 0.4 fLg/mlfor INH and 1.0 fLg/mlfor RIF. They reported
100% agreement for RIF results (338 isolates were tested,
among which 10.7% were RIF resistant by the reference
method) and 96.7% agreement for INH results (334 isolates
were tested, among which 19.5% were resistant) (7). Differ-
ences among the results of various studies may be attributable
in part to differences in MODS critical drug concentrations
and comparator methods across studies. In addition, in our
study, MODS drug-containing wellswere examined microscop-
ically on the 14th day after growth became visible in the cor-
responding drug free-well, whereas Caviedes et aI. and Moore
et aI. recorded MODS assay results on the same day that
growth was observed in the drug-free well (3, 6). ln our study,
the delayed reading of the MODS wells may have contributed
to the misclassification of some strains as resistant.
Taken together, the results of the available studies indicate
that the use of the MODS assay as the sole method for drug
susceptibility testing may lead, in a small proportion of cases,
to the inappropriate classification of isolates as INH and/or
RIF resistant. However, the very low likelihood ratio for a
negative test indicates that a negative MODS test (Le., a
MODS test that is negative for resistance) is useful for ruling
out resistance. This feature, and the relatively short time be-
tween specimen acquisition and susceptibility results, indicates
that the MODS assay may be useful as a direct drug suscepti-
bility screening tool in order to prioritize M. tuberculosis iso-
lates for subsequent indirect drug susceptibility testing using
NOTES 3389
conventional methods. There is a need for the standardization
of MODS methodology for drug susceptibility testing.
We thank Hilda Mernbrefio and Nery Alrnendarez (Central Tuber-
culosis Laboratory, Tegucigalpa, Honduras) and Gisele Vieira (Hos-
pital Vniversitario Clernentino Fraga Filho) for assistance with drug
susceptibility testing, Lygia Kitada for assistance with the recruitrnent
of study subjects at Hospital Universitario Clementino Fraga Filho,
Judith Hackman for assistance with data analysis, and Pina Maria
Boquin for facilitating the study at the National Thorax Institute.
This study was supported by the Gorgas Tuberculosis Initiative of
the V.S. Agency for Intemational Developrnent (GHS A 00 03 00020
00) and the National Institutes of Health (grants K23 AI 51528 to
S.E.D. and K24 Al16137 and U19 Al45432 to RE.C.).
Authors' speci:ficcontributions were as follows: study design, M. S.
Arias, F. C. Q. Mello, C.Alvarado-Gálvez, A L. Kritski, L. S.Fonseca,
R. E. Chaisson, M. E. Kirnerling, and S. E. Dorman; study implernen-
tation and data collection, M. S. Arias, F. C. Q. Mello, A Pavón, A G.
Marsico, C. Alvarado-Gálvez, S. Rosales, M. Pérez, M. K Andrade,
C. L. C. Pessôa, and L. S. Fonseca; data analysis, M. S. Arias, F. C. Q.
,Mello, M. E. Kirnerling, and S. E. Dorrnan; manuscript writing, M. S.
Arias, F. C. Q. Mello, R. E. Chaisson, M. E. Kimerling, and S. E.
Dorrnan; and manuscript review, ali authors. The corresponding au-
thor bas had full access to ali of the data in the study and had final
responsibility for the decision to subrnit for publication. None of the
authors bave any financial or personal relationsbips with other people
or organizations that rnay inappropriately influence tbeir work.
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