ads:
PATRÍCIA RIBEIRO AZEVEDO
ANÁLISE DO GENE VHL EM PACIENTES COM
CLÍNICA SUGESTIVA DA SÍNDROME DE VON
HIPPEL-LINDAU NO MARANHÃO
São Luís
2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
PATRÍCIA RIBEIRO AZEVEDO
ANÁLISE DO GENE VHL EM PACIENTES COM CLÍNICA SUGESTIVA DA
SÍNDROME DE VON HIPPEL-LINDAU NO MARANHÃO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre em
Ciências da Saúde.
Orientadora: Profª. Dra. Emygdia Rosa do Rêgo
Barros Pires Leal Mesquita
São Luís
2009
ads:
Azevedo, Patrícia Ribeiro.
Análise do gene VHL em pacientes com clínica sugestiva da síndrome
de von Hippel-Lindau no maranhão._São Luís: UFMA, 2009.
38f.
Orientador: Emygdia Rosa do Rego Barros Pires Leal Mesquita
Dissertação (Mestrado). Curso de Mestrado em Ciências da Saúde
Universidade Federal do Maranhão, 2009.
1. Síndrome de von Hippel Lindau – Maranhão. I. Mesquita,
Emygdia Rosa do Rego Barros Pires Leal (Orient) II. Título.
CDU: 616.155.392
Patrícia Ribeiro Azevedo
ANÁLISE DO GENE VHL EM PACIENTES COM CLÍNICA SUGESTIVA DA
SÍNDROME DE VON HIPPEL-LINDAU NO MARANHÃO
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em
Ciências da Saúde, em sessão pública realizada no dia 06/01/2009, considerou o(a)
candidato(a) Patrícia Ribeiro Azevedo
( X ) APROVADA ( ) REPROVADA
1) Examinador ___________________________________
2) Examinador ___________________________________
3) Examinador ___________________________________
4) Presidente (Orientador)__________________________
1
À minha família que na labuta do dia-a-dia
mostra ser mais audaz que os obstáculos,
servindo de referencial às minhas atuais e
futuras conquistas.
Aos estudantes e profissionais de
Enfermagem, nós precisamos ousar!
2
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, irmãos e sobrinhos que sempre apostaram nos meus sonhos e
vibraram comigo pela concretização de cada um deles.
As minhas grandes amigas: Ana Caroline Silva Caldas, Ângela Mirella Magalhães
Amorim, Flávia Danyelle Oliveira Nunes e Marinilde Teles Souza por reconhecer nelas algo
fascinante: A AMIZADE.
À minha amiga e mestra Rosilda Silva Dias que faz renascer a cada dia a
esperança de uma vida mais digna, de uma Enfermagem atuante; e pela sua compreensão,
paciência e incentivo desde a minha vida acadêmica.
À Emygdia Rosa do Rêgo Barros Pires Leal Mesquita por me guiar na nova
trajetória acadêmica e por acreditar no meu projeto conduzindo-me carinhosamente na minha
orientação do mestrado.
Aos Professores Dr. Lívio Martins Costa Júnior por colaborar com este trabalho
participando da Banca de Qualificação, ao Dr. José Cláudio Casali Rocha por contribuir
participando da Banca de Defesa; e a Alcione Miranda dos Santos que desde a seleção do
mestrado foi minha conselheira, professora e amiga.
A “família LEGH” Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade
pelo carinho com que todos me receberam no desenvolvimento do meu estudo. Em especial a
Alexsandro dos Santos e Cícero Lima Júnior pelo companheirismo e pela paciência mútua
nesses dois anos de trabalho.
Ao Comitê Gestor, em especial ao Dr. Manuel dos Santos Faria pelo apoio
incondicional ao meu desenvolvimento profissional, e aos meus colegas de trabalho do
CEPEC: Nivânia Lisboa Camelo, Ênio Fernandes Aragão Soares e Bárbara de Jesus Reis
Pinheiro pelo incentivo constante e por “segurar as pontas” nas minhas ausências para
desenvolver minha pesquisa.
À família Ferreira Barbosa que confiou no meu trabalho e que na ausência dessa
confiança, esse trabalho jamais poderia ter sido realizado.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Maranhão – FAPEMA e a Financiadora de
Estudos e Pesquisa – FINEP pelo apoio financeiro.
3
“Bom mesmo é ir à luta com determinação,
abraçar a vida e viver com paixão, perder com
classe e vencer com ousadia; pois, o triunfo
pertence a quem mais se atreve e a vida é
muito para ser insignificante”.
Charles Chapplin
“– Qual é a cor verde? (Patrícia)
– É preta, pô! (Cícero)
Minutos depois...
– Por hoje chega, vamos embora! (Alex)”
(21h de sexta-feira)
4
RESUMO
A síndrome de von Hippel Lindau (VHL) é uma doença autossômica dominante, com
incidência de 1:36.000 indivíduos, caracterizada por múltiplos tumores, acometendo
indivíduos entre vinte a quarenta anos, com média de expectativa de vida de 49 anos e com
penetrância completa por volta dos 65 anos de idade. O objetivo deste estudo foi caracterizar
geneticamente a Síndrome de von Hippel-Lindau (VHL) em uma família com clínica
sugestiva. A amostra estudada foi composta por setenta e sete pessoas, pertencentes a uma
mesma família. As amostras foram seqüenciadas e, para a triagem de mutações, foram
analisadas utilizando-se o programa CodonCode Aligner (USA, 2007). Foram encontrados
dois polimorfismos já descritos na literatura (NM_000551:c.137C>T e
NM_000551:c.386insT) e cinco mutações sem registro no UMD-VHL (c.275insT, c.278insT
e c.246insT, c.148delC e c.111G>A), todas no éxon 1. Não encontramos polimorfismos ou
mutações no éxon 2 e no éxon 3 a única mutação encontrada foi c.470insA, também sem
registro no UMD-VHL. A ausência de mutação em indivíduos sintomáticos possa estar
relacionada a grandes deleções, mutações em regiões não codificantes ou a silencionamento
epigenético.
Palavras-chave: Síndrome de von Hippel-Lindau, genética, mutação, polimorfismo,
seqüenciamento.
5
ABSTRACT
Von Hippel-Lindau (VHL) syndrome is a dominantly inherited disorder with an estimated
incidence of 1 in 36,000, characterized by a multiple neoplasms, manifested after twenty
years old, and complete penetrance at 65 years old. The aim of this study was to characterize
genetically the VHL syndrome in individuals with suggestive diagnostic of a family from the
Maranhão State. The samples were from seventy seven individuals. Four individuals showed
clinical diagnostic of central nervous system (CNS) haemangioblastoma, one for central
nervous system haemangioblastoma (HB) simultaneously with pancreatic cists and another
one with retinal and CNS HB. The samples were automatically sequenced and for mutation
detection the software CodonCode Aligner (USA, 2007) and the UMD-VHL and NCBI SNPs
databank were used as reference. Two polymorphisms already published (NM
000551:c.137C>T e NM_000551:c.386insT) and five mutations (c.275insT, c.278insT,
c.246C>T, c.148delG and c.111G>A) without description in the UMD-VHL were detected,
all of then in the exon 1. No change was found in the exon 2 and in the exon 3 the mutation
c.470insA was detected, which also has any description published. Individuals without
mutations and positive diagnostic for the syndrome can suggest another genetic event, like
macrodeletions or epigenetic silencing.
Keywords: von Hippel-Lindau syndrome; genetic; mutation; polymorphism; automatic
sequencing.
6
LISTA DE SIGLAS
CCR - Carcinoma de células renais
DNA - Ácido desoxirribonucléico
HB - Hemangioblastoma
HIF-1 α - Fator de transcrição de hipóxia-induzido-1 α
PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas
SNC - Sistema Nervoso Central
TGF-α - Fator de crescimento tumoral- α
VCB - Complexo VHL-Elongina C-Elongina B
VEGF - Fator de crescimento do endotélio vascular
VHL - von Hippel Lindau
7
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................... viii
ABSTRACT................................................................................................. ix
LISTA DE SIGLAS..................................................................................... x
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 1
2 OBJETIVOS............................................................................................... 7
3 ARTIGO A SER SUBMETIDO............................................................... 8
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................... 25
REFERÊNCIAS........................................................................................... 26
APENDICE.................................................................................................. 28
APENDICE A.............................................................................................. 29
ANEXOS......................................................................................................
32
ANEXOS A..................................................................................................
33
ANEXOS B.................................................................................................. 39
8
1 INTRODUÇÃO
A síndrome de von Hippel Lindau (VHL) é uma doença autossômica dominante,
com incidência de 1:36.000 indivíduos, caracterizada por múltiplos tumores, alguns ricamente
vascularizados. Acomete os indivíduos entre vinte e quarenta anos, com uma média de
expectativa de vida de 49 anos e com penetrância completa por volta dos 65 anos de idade
(MARTELLA et al, 2006).
O oftalmologista alemão Eugen von Hippel foi o primeiro pesquisador a descrever
tumores de vasos retinianos associados a síndrome, em 1911. Somente em 1926, o patologista
sueco Arvid Lindau compilou informações sobre 40 casos de hemangioblastomas de cerebelo
e medula espinhal e descreveu pela primeira vez tumores de vasos do sistema nervoso central
e retina, e tumores em órgãos abdominais. Em 1964, Melmon e Rosen publicaram a primeira
revisão de literatura sobre a doença e, somente nos anos setenta, a doença passou a ser
comumente chamada de von Hippel-Lindau ou VHL (GOMY, 2008).
O gene VHL, identificado por Latif et al (1993), é um gene supressor tumoral,
localizado no cromossomo 3(3p25-26) e é composto por três éxons (Figura 1). No entanto,
para que a síndrome se desenvolva é necessária a inativação dos dois alelos para que ocorra a
transformação da célula normal em célula tumoral. O gene codifica uma proteína de 213
aminoácidos e outra de 160 aminoácidos. Os dois produtos gênicos apresentam características
bioquímicas e funcionais semelhantes e são expressos de maneira ubíqua em tecidos humanos
normais.
Figura 1: Gene VHL, supressor tumoral, localizado no cromossomo 3 (3p25-26)
(LOUREIRO, 2006).
A proteína VHL atua por meio da ligação com a Elongina C, Elongina B e Culina,
formando o complexo VHL-Elongina C-Elongina B (VCB). Esse complexo guia substratos
9
protéicos para a proteólise através da ubiquitinização, processo no qual o substrato a ser
degradado liga-se a ubiquitina e é encaminhado para o proteossoma, onde ocorre a digestão
enzimática. Dentre os substratos do complexo VCB está o HIF - 1α (fator de transcrição de
hipóxia-induzido), que aumenta a expressão de genes que codificam proteínas angiogênicas
(fator de crescimento do endotélio vascular – VEGF e fator de crescimento derivado de
plaquetas PDGF – ß) e mitogênicas (fator de crescimento transformante – TGF – α).
Em condições normais de oxigenação ocorre degradação do HIF - 1α, no entanto,
nas células submetidas a hipóxia, não ocorre degradação apropriada do HIF - 1α que irá
estimular a expressão do VEGF e PDGF – ß, com conseqüente formação de novos vasos
sangüíneos, na tentativa de regularizar o suprimento tecidual de oxigênio. Na ausência da
proteína VHL selvagem, como ocorre na Síndrome de von Hippel Lindau, o HIF - 1α deixa de
ser degradado e seu aumento intracelular estimula a expressão dos genes VEGF e PDGF – ß,
o que explica a grande vascularização de alguns dos tumores associados à síndrome
(HANSEN et al, 2002).
O espectro de mutações do gene VHL inclue grande quantidade de mutações do
tipo missense e nonsense, deleções ou inserções de um nucleotídeo, mutações no sítio do
splice e rearranjos consistindo em deleções parcial ou completa do gene.
Mais de 300
mutações já foram identificadas no gene VHL, com 100% de detecção nos portadores da
síndrome. Essas mutações estão localizadas nos três éxons do gene; entretanto, são mais
descritas nos éxons 1 e 3. Deleções e proteínas truncadas são associadas com o tipo VHL1,
enquanto que o tipo VHL 2 está mais associado com mutações missenses (TONG et al., 2006;
GARCIA et al., 1997; BLANSFIELD, 2007; HES et al., 2007).
Deleções no gene ou mutações que causem proteínas truncadas (mudança no
quadro de leitura (mutação frameshif) ou mutações sem sentido (nonsense) são observadas
mais freqüentemente em famílias sem a ocorrência de feocromocitoma, ou seja, o tipo 1 da
síndrome VHL. Em se tratando das mutações de sentido trocado (missense), são
particularmente encontradas no tipo 2B, com alta incidência de feocromocitomas entre os
familiares. Duas mutações missense específicas estão associadas com o tipo 2A (Tyr98His e
Tyr112His). As mutações Leu188Val, Val84Leu e Ser80Leu são consideradas mutações
missense específicas e estão relacionadas com o tipo 2C, onde há a presença apenas dos
feocromocitomas (RICHARDS, 2001).
A síndrome VHL é classificada em dois subtipos de acordo com o alto ou baixo
risco de desenvolver feocromocitoma. O tipo I é caracterizado por desenvolver VHL clássica,
ou seja, aquela com a presença de hemangioblastoma (HB) de Sistema Nervoso Central
10
(SNC) e/ou de retina sem feocromocitoma; o tipo II está subclassificado em 2A, 2B e 2C,
sendo considerado tipo 2A aquele portador da síndrome que apresentar baixo risco para
desenvolver carcinoma de células renais (CCR) e risco elevado para HB; o tipo 2B é
caracterizado por apresentar risco elevado para CCR e HB, e no tipo 2C os portadores com
quadro de feocromocitoma (ROCHA, 2003; ZEQUI, 2004; KAELIN, 2007).
Os tumores associados a essa síndrome ocorrem de forma isolada ou múltipla,
sendo os do SNC os de maior ocorrência. Além dos tumores de vasos do SNC, compõem
ainda a síndrome: os tumores de vasos da retina, tumores do saco endolinfático, neoplasias do
pâncreas, da glândula supra-renal, rins, epidídimos e do ligamento largo do útero (Figura 2).
Figura 2: Tumores característicos da Síndrome de von Hippel-Lindau (adaptada de
FRIEDRICH, 2001).
A angiomatose retiniana periférica é a complicação inicial mais freqüente da
síndrome de von Hippel-Lindau. É uma doença que consiste em lesões retinianas tumorais ou
císticas. Ocorre oftalmoscopicamente em duas formas distintas, a primeira caracterizada por
um tumor justapapilar ou uma apresentação periférica característica de tumor de von Hippel-
Lindau. O tumor justapapilar se apresenta à oftalmoscopia como uma massa de coloração
vermelho-alaranjada na retina sensorial. O angioma capilar retiniano geralmente fica
localizado na região equatorial temporal superior ou inferior, os vasos sangüíneos são
11
dilatados e calibrosos desde a sua saída a partir do nervo óptico até ao tumor (ANDRADE-
NETO, 2004).
A conduta na angiomatose capilar retiniana consiste primeiramente na avaliação
sistêmica de outros tumores associados com a síndrome de von Hippel-Lindau. O tratamento
do hemangioma capilar retiniano varia com a situação clínica. Pequenas lesões sem
associação com a síndrome de VHL, assintomáticas, podem ser observadas em intervalos
periódicos sem a necessidade de tratamento ativo. Tumores maiores, com sintomas visuais,
devem ser tratados por fotocoagulação laser, crioterapia ou outra medida apropriada. O
tratamento das lesões periféricas irá resultar no desaparecimento dos sintomas com
conseqüente melhora visual (ANDRADE NETO, 2004).
Os hemangioblastomas são neoplasias de origem vascular freqüente. Representam
apenas 2,5% entre todos os tumores intracranianos, entre os quais 7,0% a 12,0% são
localizados na fossa posterior, 85,0% no cerebelo, 3,0% na coluna, 2,0% a 3,0% na medula, e
1,5% no cérebro (FALAVIGNA, 2001; WOODWARD et al, 2007).
Podem pressionar um nervo ou tecido encefálico circundante e causar sintomas
como cefaléia, desequilíbrio em ortostatismo ou descoordenação motora. As lesões solitárias
representam 80,0%, mas as múltiplas podem ser envolvidas com a doença de von Hippel-
Lindau. Nessa doença, os hemangioblastomas do cerebelo são mais comuns do que o
envolvimento raquimedular, que nestes casos são mais freqüentes na medula cervical. Casos
esporádicos tendem a ocorrer na quarta década de vida (RICHARD, 1998; SHUIN et al.,
2006).
Pacientes jovens, com menos de 30 anos no momento do diagnóstico, doença de
VHL e tumores multicêntricos apresentam maiores índices de recidiva. O hemangioblastoma
de SNC permanece como a principal causa de morte na doença de VHL, embora o carcinoma
de células renais possa representar um problema maior no futuro. Hemangioblastomas
múltiplos em adolescente ou adulto jovem constituem evidência de um curso subseqüente
severo (RICHARD, 2000).
Os tumores de saco endolinfático, são tumores raros localizados no ouvido interno.
Estão associados a von Hippel-Lindau em 15,0% dos casos e nesta síndrome ocorrem em
9,0% dos pacientes. Embora não sejam tumores malignos eles são localmente invasivos e
podem provocar déficit auditivo, vertigens, desequilíbrio da marcha e paresia facial. O
diagnóstico radiológico é feito por tomografia computadorizada e ressonância magnética. O
tratamento é geralmente cirúrgico (VORTMEYER et al., 2000).
12
Cerca de 2,0% dos pacientes com carcinomas de células renais (CCR) podem ser
portadores de uma síndrome de CCR familiar. Tornando-se importante conhecer tal
possibilidade uma vez que essas neoplasias têm características clínicas singulares. Em geral,
tendem a bilateralidade e ao acometimento de indivíduos mais jovens do que os portadores de
CCR esporádico, e, portanto, requerem tratamentos conservadores a fim de preservar a
qualidade de vida, mantendo as unidades renais e evitando a imunossupressão decorrente de
um transplante renal precoce (ZEQUI, 2004).
A associação de feocromocitoma com a síndrome de von Hippel-Lindau é bem
conhecida, com a presença de feocromocitoma variando amplamente entre famílias afetadas.
Este fato, somado aos achados genotípicos com importante correlação com o fenótipo, levou a
uma nova subclassificação da doença. São reconhecidas duas principais variantes de VHL, de
acordo com a ausência ou presença de feocromocitoma, os tipos I e II, respectivamente
(CHEN, 1995; NEUMANN, 2002).
Os tumores sólidos são a circunstância mais preocupante no pâncreas. São raros,
mas parecem associar-se mais freqüentemente aos portadores de VHL com feocromocitoma.
Os tumores neuroendócrinos podem ser benignos ou malignos. Podem crescer rapidamente,
causar obstruções nos canais biliares, provocar uma diminuição da taxa de glicose no sangue
ou síncopes e podem mesmo metastizar para o fígado ou para os ossos. Normalmente os
tumores endócrinos devem ser removidos logo após o diagnósticoal., 2007).
Cistoadenoma papilar de epidídimo ocorre em 10,0% a 60,0% dos homens
portadores da síndrome de von Hippel-Lindau. São lesões benignas e, na maioria das vezes,
bilaterais, palpáveis e assintomáticas. Raramente, podem causar dor ou infertilidade. O
diagnóstico é feito por ultra-sonografía e o tratamento é expectante ou cirúrgico (CHOYKE et
al., 1997). Tumores correspondentes podem surgir nas mulheres como cistoadenomas no
ligamento largo perto das trompas de Falópio. São muito comuns cistos nesta área na
população feminina. Porém, se for encontrado um tumor fora do comum nesta zona, a
possibilidade de se tratar de cistoadenoma associado com VHL deve ser ponderada (VHL
FAMILY ALLIANCE, 1997).
Diante desta multiplicidade de tumores benignos e malignos em vários órgãos do
corpo e da grande variedade de sinais e sintomas faz-se necessário confirmar a existência
dessa síndrome familiar para garantir aos portadores um esquema de acompanhamento de
modo a assegurar a detecção precoce e tratamento das possíveis lesões. Assim como, reduzir
as conseqüências mais graves e outras inteiramente passíveis à prevenção.
13
No diagnóstico de doenças genéticas é extremamente importante conhecer a
história clínica da família tão detalhadamente quanto possível. Freqüentemente torna-se
necessário examinar vários membros da família do provável portador de uma doença genética
até se poder chegar a um diagnóstico. Para aumentar a confiabilidade do diagnóstico, é
necessária uma história da saúde familiar completa, possibilitando assim, um aconselhamento
genético mais eficaz, pois tal aconselhamento incide não só sobre a probabilidade de haver
outros membros da mesma família com o mesmo diagnóstico, mas, sobretudo projeção de
prognósticos, tratamentos e suporte emocional.
O conhecimento da história familiar e a confirmação do diagnóstico genético é um
importante instrumento, alertando para manifestações precoces ou potenciais conseqüências
mesmo antes do surgimento dos sintomas. Conhecer os problemas de saúde em uma família
com probabilidade de transmissão às próximas gerações poderá ser alerta suficiente para
prevenir ou minimizar os seus efeitos.
14
2 OBJETIVOS
Objetivo Geral
• Caracterizar geneticamente a Síndrome de von Hippel-Lindau (VHL) em uma
família com clínica sugestiva.
Objetivos Específicos:
• Identificar o tipo de mutação nos indivíduos com clínica sugestiva da síndrome
de VHL;
• Contribuir para uma melhor caracterização Clínica e Molecular da Síndrome
de von Hippel-Lindau (VHL) na população brasileira, desenvolvendo um estudo pioneiro no
Maranhão;
• Montar um banco de informações genéticas da família estudada;
• Fornecer informações para o aconselhamento genético em famílias com
histórico de tumores sugestivos para a Síndrome de VHL.
15
ANÁLISE DO GENE VHL EM PACIENTES COM CLÍNICA SUGESTIVA DA
SÍNDROME DE VON HIPPEL-LINDAU NO MARANHÃO
Patrícia Ribeiro Azevedo
1,2
, Cícero Alves Lima Júnior³, Alexsandro dos Santos
4
, Bruno
Almeida Nunes
4
, Emygdia Rosa Leal-Mesquita
5,6
1
Aluna do Mestrado em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Maranhão – UFMA,
São Luís, Maranhão, Brasil.
²Gerente do Centro de Pesquisa Clínica do Hospital Universitário da Universidade Federal do
Maranhão – HUUFMA, São Luís, Maranhão, Brasil.
³Aluno de Graduação do Curso de Ciências Biológicas da UFMA, São Luís, Maranhão,
Brasil.
4
Biólogo do Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade do HUUFMA, São
Luís, Maranhão, Brasil.
5
Departamento de Biologia da UFMA, São Luís, Maranhão, Brasil.
6
Coordenadora do Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade do
HUUFMA, São Luís, Maranhão, Brasil.
Mutações no Gene VHL no Maranhão
Palavras-chave: Síndrome de von Hippel-Lindau, genética, mutação, polimorfismo,
seqüenciamento.
Autor para correspondência: Emygdia Rosa Leal-Mesquita. Laboratório de Estudos
Genômicos e de Histocompatibilidade do Hospital Universitário da Universidade Federal do
Maranhão – LEGH-HUUFMA. Rua dos Prazeres, 215, Cobertura da Unidade Materno
Infantil, Centro. Telefone: (98) 2109-1265. CEP: 65020-070, São Luís, Maranhão, Brasil.
Email: [email protected]
16
ABSTRACT
Von Hippel-Lindau (VHL) syndrome is a dominantly inherited disorder with an estimated
incidence of 1 in 36,000, characterized by a multiple neoplasms, manifested after twenty
years old, and complete penetrance at 65 years old. The aim of this study was to characterize
genetically the VHL syndrome in individuals with suggestive diagnostic of a family from the
Maranhão State. The samples were from seventy seven individuals. Four individuals showed
clinical diagnostic of central nervous system (CNS) haemangioblastoma, one for central
nervous system haemangioblastoma (HB) simultaneously with pancreatic cists and another
one with retinal and CNS HB. The samples were automatically sequenced and for mutation
detection the software CodonCode Aligner (USA, 2007) and the UMD-VHL and NCBI SNPs
databank were used as reference. Two polymorphisms already published (NM
000551:c.137C>T e NM_000551:c.386insT) and five mutations (c.275insT, c.278insT,
c.246C>T, c.148delG and c.111G>A) without description in the UMD-VHL were detected,
all of then in the exon 1. No change was found in the exon 2 and in the exon 3 the mutation
c.470insA was detected, which also has any description published. Individuals without
mutations and positive diagnostic for the syndrome can suggest another genetic event, like
macrodeletions or epigenetic silencing.
17
INTRODUÇÃO
A síndrome de von Hippel Lindau (VHL) (OMIM 193300 – On line Mendelian
Inheritance in Man) é uma doença autossômica dominante, com incidência de 1:36.000
indivíduos, caracterizada por múltiplos tumores, alguns ricamente vascularizados, que
acomete indivíduos entre vinte e quarenta anos, com uma média de expectativa de vida de 49
anos e penetrância completa por volta dos 65 anos de idade. (Martella et al., 2006; Kaelin,
2007).
É classificada em dois subtipos de acordo com o alto ou baixo risco de
desenvolver feocromocitoma. O tipo I é caracterizado como VHL clássica, ou seja, presença
de hemangioblastoma (HB) de Sistema Nervoso Central (SNC) e/ou de retina sem
feocromocitoma; o tipo II está subclassificado em 2A, 2B e 2C, sendo considerado tipo 2A
baixo risco para desenvolver Carcinoma de Células Renais (CCR) e risco elevado para HB; o
tipo 2B é caracterizado por risco elevado para CCR e HB, e no tipo 2C feocromocitoma
isolado (VHL, 1997; Rocha et al., 2003; Zequi, 2004).
Os tumores associados a essa síndrome ocorrem de forma isolada ou múltipla,
sendo os do SNC os de maior ocorrência. Além dos tumores de vasos do SNC, compõem
ainda a síndrome: os tumores de vasos da retina, tumores do saco endolinfático, neoplasias do
pâncreas, da glândula supra-renal, rins, epidídimos e do ligamento largo do útero (Hattori et
al., 2006).
Usualmente a doença apresenta-se com história familiar presente, porém mutações
de novo têm sido observadas em 23% dos indivíduos com VHL (Sgambati, 2000). Mais de
300 mutações já foram identificadas no gene VHL e a ocorrência de mutações em portadores
de VHL é de 100%. Essas mutações estão localizadas nos três éxons do gene; entretanto, são
mais descritas nos éxons 1 e 3. Deleções e proteínas truncadas são associadas com o tipo
18
VHL I, enquanto que o tipo VHL II está mais associado com mutações missenses (Garcia et
al., 1997; Tong et al., 2006; Blansfield, 2007; Hes et al., 2007).
Assim, este estudo teve como objetivo principal a caracterização genética da
Síndrome de von Hippel-Lindau (VHL) em uma família com clínica sugestiva.
MATERIAIS E MÉTODOS
Aspectos Éticos
Este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospiatl Universitário da Universidade Federal do Maranhão - HUUFMA, sob processo
n.33104-647/2007. Antes da coleta do material biológico de cada indivíduo, foi lido e
entregue o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e, somente depois de
assinado, foi realizada a coleta.
Caracterização da Amostra
A família é composta de 108 indivíduos, residentes nos municípios de São Luís,
Bequimão, Pinheiro, São Bento e Alcântara. A amostra em estudo foi composta por 77
indivíduos de uma mesma família, com média de 18 anos de idade, 35 indivíduos do sexo
masculino (45,45%) e 42 feminino (54,54%). De acordo com o acompanhamento clínico,
exames de imagem (tomografia computadorizada e ressonância nuclear magnética), assim
como exame histopatológico, foram possíveis diagnosticar quatro indivíduos com
hemangioblastoma de sistema nervoso central (SNC), um com hemangioblastoma (HB) de
SNC e cisto pancreático e, por fim, um indivíduo com HB de SNC e retina (Azevedo, 2006)
(Figura 1). O estudo molecular foi realizado no Laboratório de Estudos Genômicos e de
Histocompatibilidade – LEGH.
19
Extração de DNA
Quatro mililitros de sangue periférico foram coletados e utilizados na extração de
DNA, seguindo os protocolos estabelecidos pelo fabricante do kit Charge Switch gDNA
(Invitrogen, USA). Após extração, as amostras foram quantificadas em espectrofotômetro
para verificar a concentração e a pureza do DNA, sendo confirmadas através de um check gel
de agarose a 1%.
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A amplificação dos três éxons que compõem o gene VHL foi feita através da reação
em cadeia da polimerase (PCR) em um volume total de 50µL, contendo 1X Tampão de
reação, 2mMol/L (para o éxon 1) ou 1mMol/L (para os éxons 2 e 3) de MgCl
2
, 200mMol/L
de cada DNTP, 0,8pMol/L de cada primer, 0,06U de GoTaq DNA Polymerase (Promega,
USA) e 50ng DNA (Adaptado de Rocha et al., 2003 com modificações).
Os primers utilizados na PCR foram: 1F (5’-CCATCCTCTACCGAGCGCGCG-3’) e
1R (5’-GGGCTTCAGACCGTGCTATCG-3’) para o éxon 1 (522 bp); 2F (5’-
TGCCCAGCCACCGGTGTG-3’) e 2R (5’-GTCTATCCTGTACTTACCACAACA-3’) para
o éxon 2 (232 pb); e 3F (5’-CACACTGCCACATACATGCACTC-3’) e 3R (5’-
ACTCATCAGTACCATCAAAAGCTG -3’) para o éxon 3 (383pb).
A programação dos ciclos da PCR foi: 95 ºC de desnaturação inicial por 5 minutos;
seguido de 35 ciclos a 95 ºC durante 1 minuto, 58 ºC (éxons 2 e 3) ou 68 ºC (éxon 1) durante
1 minuto e 72 ºC por mais 1 minuto; e 72 ºC para extensão final durante 1 minuto.
Para confirmação da amplificação, os produtos de PCR foram submetidos à
eletroforese (220v), durante uma hora. Cada produto de PCR foi analisado utilizando-se gel
de agarose a 2,5%, corado com brometo de etídeo e visualizado diretamente sob luz UV.
20
Reação de Seqüenciamento
Todos os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit Wizard SV Gel and
PCR Clean-up Systems (Promega, USA), seguindo os protocolos estabelecidos pelo
fabricante, e seqüenciados nas duas direções da fita (sense e antisense) com o kit BigDye
Terminator v3.0 (Applied Biosystems, Brasil). Para a triagem de mutações, todas as amostras
seqüenciadas foram analisadas utilizando-se o programa CodonCode Aligner (USA, 2007) e
comparadas com os bancos de dados Universal Mutation Database (UMD-VHL), Human
Gene Mutation Database e SNPDatabase.
RESULTADOS
Dos 77 indivíduos que compõem a amostra em estudo, quatro tiveram diagnóstico
de hemangioblastoma de sistema nervoso central (SNC), um de hemangioblastoma (HB) de
SNC e cisto pancreático e, por fim, um indivíduo com HB de SNC e retina. Foi realizado
seqüenciamento automático de todas as amostras para detecção de mutações pontuais no gene
VHL, sendo encontrados dois polimorfismos previamente descritos para o éxon 1,
NM_000551:c.137C>T, presente em 24 (31,1%) indivíduos analisados, e o polimorfismo
NM_000551:c.386insT (Figura 2) presente em apenas um indivíduo. Outras alterações na
seqüência do gene foram encontradas no éxon 1, porém, sem registro no UMD-VHL que são
c.275insT (pR58L), c.278insT (pE94R) (Figura 3) e c.246C>T, c.-66delG e c.-103G>A.
Não foi encontrada alteração no éxon 2, já no éxon 3 a única mutação detectada foi
c.470insA, que também não há registro nos bancos de dados.
Entre os seis indivíduos que tiveram diagnóstico de hemangioblastoma de SNC,
dois apresentaram alteração no eletroferograma, sendo que um apresentou o polimorfismo
NM_000551:c.137C>T, também presente em 23 indivíduos que não apresentaram, até o
momento, tumores associados com a síndrome, e um apresentou a mutação c.470insA no éxon
3.
21
Quatro indivíduos apresentaram duas alterações simultâneas, sendo um
polimorfismo e uma mutação; somente em um caso o indivíduo apresentou os dois
polimorfismos conjuntamente (Tabela 1).
DISCUSSÃO
A caracterização do gene VHL representa uma grande contribuição para o
entendimento das bases moleculares tanto de câncer familial quanto de tumores esporádicos.
Desde que o gene foi clonado em 1993, mais de 300 mutações já foram descritas utilizando-se
diferentes técnicas de rastreamento (Chen, 1995; Hansen et al., 2002; Shuin et al., 2006;
Zatyka et al., 2002).
No Brasil foram desenvolvidos trabalhos sobre a Síndrome de von Hippel-Lindau
que evidenciaram mutações diferentes das descritas nos outros continentes. As seis mutações
encontradas neste estudo corroboram com a hipótese de que a heterogeneidade da população
brasileira influencia no padrão de mutação do gene VHL (Gomy, 2008; Loureiro, 2006; Rocha
et al., 2003).
Tong et al (2006) relatam em seu estudo que há uma maior concentração de
mutações pontuais nos éxons 1 e 3, o que tanbém foi evidenciado pelos resultados aqui
descritos. Foram encontrados dois polimorfismos e cinco mutações no éxon 1 e uma mutação
no éxon 3.
Quanto à escolha da técnica utilizada, o seqüenciamento é considerado como
“padrão ouro” para a detecção de mutações pontuais. No entanto, várias técnicas são utilizadas
para a detecção de 100% de mutação para indivíduos portadores da síndrome. Dentre as
técnicas mais utilizadas estão, seqüenciamento direto, análise por Southern blot e hibridização
fluorescente in situ (FISH).
22
Cinco pacientes com diagnóstico clínico não apresentaram mutação o que sugere a
presença de macrodeleções, silenciamento epigenético ou mutações em regiões não
codificantes. Necessitando, dessa forma, de estudos com outras metodologias que possam
investigar essas hipóteses e proporcionar um aconselhamento genético mais eficaz. Além da
presença das mutações somáticas encontradas nesse estudo, faz-se indispensável a
continuação desta pesquisa com a utilização de outras técnicas para a detecção da mutação
germinativa que segrega nessa família.
A identificação de mutações no gene VHL pode ser utilizada não somente para
obter um pré-diagnóstico acurado dentro da família, mas também para prever o provável
fenótipo.
CONCLUSÃO
A análise molecular do gene VHL é extremamente importante para a confirmação
do diagnóstico da Síndrome de von Hippel-Lindau, assim como para identificar indivíduos
assintomáticos com risco para VHL. O presente estudo focalizou-se na detecção de mutações
pontuais, contribuindo com a descrição de dois polimorfismos (NM_000551:c.137C>T e
NM_000551:c.386insT) (Fig. 2) e seis mutações somáticas (c.275insT (pR58L), c.278insT
(pE94R) (Fig. 3) e c.246C>T, c.-66delG e c.-103G>A) que não foram publicadas na literatura
até o momento. É pertinente ressaltar a necessidade da utilização de outras técnicas,
considerando que não foi detectada, com a técnica do seqüenciamento automático, a mutação
germinativa dessa família.
23
24
REFERÊNCIAS
Azevedo (2006) Síndrome de von Hippel-Lindau: história familiar. Trabalho de conclusão de
curso de Especialização em enfermegem clínico-cirúrgica, Universidade Federal do
Maranhão.
Blansfield J, Choyke L, Morita S, Choyke P, Pingpank J, Alexander R, Seidel G, Schutack Y,
Yuldashev N e Eugeni M et al (2007) Clinical, genetic and radiographic analysis of 108
patients with von Hippel-Lindau disease (VHL) manifested by pancreatic neuroendocrine
tumors (PNETs). Journal Survery 142:814-818.
Chen F, K. (1995) Germline mutations in the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor
gene: correlations with phenotype. Hum Mutat 5:66-75.
Garcia A, Matias-Guiu X, Cabezas R, Chico A, Prat J, Baiget M e De Leiva A (1997)
Molecular diagnosis of von Hippel-Lindau disease in a kindred with a predominance of
familial phaeochromocytoma, Clinical Endocrinology 46:359-363.
Gomy I, (2008) Identificação e caracterização de mutações germinativas no gene VHL em
famílias com a doença de von Hippel-Lindau. Dissertação de Mestrado apresentado a
Faculdade de Medicina e Ribeirão Preto. Universidade de São Paulo.
Hansen W, Ohh M, Moslehi J, Kondo W, Kaelin W e Welch W (2002) Diverse effects of
mutation in Exon II of the von Hippel-Lindau (VHL) Tumor Suppressor Gene on the
interaction of pVHL with the Cytosolic Chaperonin and pVHL-dependent ubiquitin ligase
activity . Mol. Cell. Biol 22:1947-1960.
Hattori K, Teranishi J, Stolle C, Yoshida M e Kondo K, Kishida T, Kanno H, Baba M,
Kubota Y e Yao M (2006). Detection of germline deletions using real-time quantitative
polymerase chain reaction in Japonese patients with von Hippel-Lindau disease, Cancer Sci
97:400-405.
25
Hes F, van der Luigt R, Jansen A, Zewald R, Jong G, Lenders J, Links T, Luyten G, Sijmons
R, Eussen et al (2007) Frequency of von Hippel-Lindau germline mutation in classic and non-
classic von Hippel-Lindau disease identified by DNA sequencing, shouthern blot analysis and
multiplex ligation dependent probe amplification. Clinic genetic 72:122-129.
Kaelin, W (2007) von Hippel-Lindau Disease. Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis 2:145-173.
Loureiro, V(2006) Rastreamento de mutações VHL, SDHB e SDHD em pacientes portadores
de feocromocitoma ou também, paraganglioma esporádicos. Dissertação apresentada ao
Mestrado em Ciências da Universidade de São Paulo.
Martella M, Salviati L, Casarin A, Trevisson E, Opocher G, Polli R, Gross D e Murgia A
(2006) Molecular analisys of two uncharacterized sequence variants os the VHL gene. J. Hum
Genet 51:9968.
Shuin T, Yamasaki I, Tamura K, Okuda H, Furihata M e Ashida S (2006) Von Hippel-Lindau
disease: molecular pathological basis, clinical criteria, genetic testing, clinical features of
tumors and treatments. Jpn. J. Clin Oncol 36:337-343.
Richards (2001) Molecular pathology of von Hippel-Lindau disease and the VHL tumour
suppressor gene. Expert Reviews in Molecular Medicine 1-27.
Rocha J, Silva R, Mendonça B, Marui S, Simpson A e Camargo A (2003) High frequency of
novel germline mutations in the VHL gene in the heterogeneous population of Brazil, J. Med.
Genet: 40:e31.
Sgambati M, Stolle C, Choyke P, Walther M, Zbar B, Linehan W, Glenn G (2000) Mosaicism
in von Hippel-Lindau disease: lessons from kindreds with germline mutations identified in
offspring with mosaic parents. Am J Hum Genet 66:84-91.
Tong A, Zeng Z, Li H, Lu D et al (2006) von Hippel_Lindau gene mutation in Non-
Syndromic Familial Pheochromocytomas. New York Academy of Sciences 1053:203-207.
26
VHL Family Alliance (1997) Manual para pessoas com a doença de Von Hippel Lindau, para
as suas famílias e para apoio pessoal, 2ª ed.
Zatyka et al (2002) Genetic and functional analysis of the von Hippel-Lindau (VHL) tumour
suppressor gene promoter. J Med Genet. 39:463-472.
Zequi S. C. (2004) Carcinoma de Células Renais. Newsletter, 2:24.
Fontes de Internet
Codoncode Aligner. Codoncode Corporation. www.codoncode.com. (outubro 2, 2008).
Human Gene Mutation database. Cardiff University (HGMD) 2007. Von Hippel-Lindau gene.
http://uwcmml1s.uwcm.ac.uw/uwcm/mgqsearch/12488.html (novembro 4, 2008).
Single nucleotide polymorphism database (SNP), www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez
(novembro 3, 2008).
The universal mutation database (UMD-VHL), www.umd.be/VHL(novembro 9, 2008).
Online Mendelian Inheritance in man (OMIM), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM (Agosto
8, 2007) LEM Software, http://dir.niehs.nih.gov/dirbb/weinbergfiles/hybrid_design.htm
27
Tabela 1: Descrição das alterações encontradas em familiares com a Síndrome de von Hippel-Lindau.
LOCALIZAÇÃO
NO
HEREDOGRAMA
IDADE DO
INDIVÍDUO
IDADE DE
DIAGNÓSTICO
E/OU ÓBITO
DIAGNÓSTICO
CLÍNICO
MUTAÇÕES ÉXON
N. DE
INDIVÍDUOS
TIPO DE
ALTERAÇÃO
IV-16 23 anos 19 anos HB de SNC
c.137C>T
1 24 Polimorfismo
VI-10 3 anos - -
c.386insT
1 1 Polimorfismo
IV-15 32 anos - -
c.275insT
(pArg58Leu)
1 1 Mutação
IV-32 24 anos - -
c.278insT
(pGlu94Arg)
1 1 Mutação
VI-19 04 anos - -
c.246C>T
1 1 Mutação
VI-22 06 anos - -
c.148delC
1 1 Mutação
IV-9 14 anos - -
VI-3 08 anos - -
c.-103G>A
1 2 Mutação
III-10 56 anos 55 anos HB de SNC
c.470insA
3 1 Mutação
21
Figura 1: Heredograma da família. Legenda: Azul representa cefaléia intensa, vermelha
representa hemangioblastoma (HB) de Sistema Nervoso Central (SNC), roxo representa cisto
pancreático, amarelo representa HB de retina, verde representa o polimorfismo c.137C>T e
cinza representa óbito com causa desconhecida, porém com quadro clínico compatível com
VHL.
Figura 2: Eletroferogramas do éxon1 mostrando os polimorfismos: A) c.137C>T em
heterozigose; B) c.137C>T em homozigose e C) c.386insT. A primeira seqüência de cada
eletroferograma foi utilizada como referência (NM_000551).
Figura 3: Eletroferogramas do éxon1 mostrando as mutações: A) c.278insT; B) c.275insT.
Ambas levam a alterações no produto do gene VHL (pVHL). A primeira seqüência de cada
eletroferograma foi utilizada como referência (NM_000551).
22
Figura 1
23
Figura 2
24
Figura 3
25
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Além da necessidade do diagnóstico molecular dos portadores da Síndrome
de von Hippel-Lindau é aconselhável o acompanhamento dos familiares com risco para
o desenvolvimento da síndrome. Felizmente, neste estudo foi possível estudar além do
probando os outros componentes da família, o que atualmente, é considerado um dos
aspectos mais importantes no manejo das famílias com a síndrome VHL. Essa conduta
diminui a morbimortalidade da doença e proporciona uma melhor qualidade de vida aos
familiares.
A elaboração de estudos multicêntricos sobre a Síndrome VHL no Brasil irá
favorecer o melhor conhecimento dos padrões de mutação existentes no país e a
correlação desses padrões com os diferentes grupos étnicos. As mutações encontradas
no presente estudo, associadas às mutações descritas por outros grupos de pesquisadores
brasileiros, podem contribuir para uma melhor caracterização da síndrome.
Cinco pacientes com diagnóstico clínico não apresentaram mutação, o que
sugere a presença de macrodeleções, silenciamento epigenético ou mutações em regiões
não codificantes. Necessitando, dessa forma, de estudos com outras metodologias que
possam investigar essas hipóteses e proporcionar um aconselhamento genético mais
eficaz.
A construção deste trabalho contribuiu para um melhor entendimento sobre
câncer familial, biologia molecular e principalmente reforçou a importância da
investigação da história familiar para a Enfermagem. Sem a existência dessa coleta de
dados, como prática da assistência, jamais teria sido possível associar a presença de um
hemangioblastoma de sistema nervoso central a uma síndrome familiar com uma
história clínica tão vasta e rica no que diz respeito a ocorrência dos fenótipos
encontrados.
26
REFERÊNCIAS
ANDRADE NETO, Leiria de. Tumores Vasculares da Retina e do Nervo Óptico.
Revista da Sociedade Brasileira de Retina e Vítreo. v. 8, p. 20 - 21, 14 abr. 2004.
AZEVEDO, P. Síndrome de von Hippel Lindau: história familiar. Trabalho de
conclusão de curso de Especialização em Enfermagem Clínico-Cirúrgica, Universidade
Federal do Maranhão, 2007.
BLANSFIELD et al. Clinical, genetic and radiographic analysis of 108 patients with
von Hippel-Lindau disease (VHL) manifested by pancreatic neuroendocrine tumors
(PNETs). Journal Survery. v. 142, n. 6, p. 814-818, 2007.
CHEN F, K. Germline mutations in the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor
gene: correlations with phenotype. Hum Mutat, v. 5, p. 66-75, 1995.
CODONCODE ALIGNER. Codoncode Corporation. Disponível em:
www.codoncode.com. Acesso em 02 out 2008.
CHOYKE, P.L et al. Epididy-mal cystadenomas in von Hippel-Lindau disease.
Urology. 49 (6): 926. 1997.
FALAVIGNA, A, GRANDI. Hemangioblastoma em paciente com doença de von
Hippel- Lindau (VHL), Rev. Cient. AMECS, v. 10, p. 71-74, 2001.
FRIEDRICH, C.A. Genotype-phenotype correlation in von Hippel-Lindau syndrome.
Human Molecular Genetics, v. 10, n. 07, p. 763-767, fev. 2001
GLAVAC et al. Mutations in the VHL tumor suppressor gene and associated lesions
families with von Hippel-Lindau disease from central Europe. Hum Genet, 98:271-80,
1996.
GOMY, I. Identificação e caracterização de mutações germinativas no gene VHL
em famílias com a doença de von Hippel-Lindau. Universidade de São Paulo, 2008.
HANSEN, W. et al. Diverse effects of mutation in Exon II of the von Hippel-Lindau
(VHL) Tumor Suppressor Gene on the interaction of pVHL with the Cytosolic
Chaperonin and pVHL-dependent ubiquitin ligase activity . Mol. Cell. Biol. v. 22, n.6,
p. 1947-1960, mar. 2002.
KAELIN, W. von Hippel-Lindau Disease. Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. v. 2, p. 145-
173, 2007.
LOUREIRO, V. Rastreamento de mutações VHL, SDHB e SDHD em pacientes
portadores de feocromocitoma ou também, paraganglioma esporádico. Dissertação
apresentada ao Mestrado em Ciências da Universidade de São Paulo, 2006.
MADDOCK et al. A genetic register for von Hippel-Lindau disease. J Med Genet,
33:120-7, 1996.
27
MARTELLA, M et al. Molecular analisys of two uncharacterized sequence variants os
the VHL gene. J. Hum Genet. v. 51, p. 964-968, set. 2006.
NEUMANN et al. Germ-line mutations in non syndromic pheocromocytoma. N Engl J
Med, v. 343, p. 1459-1466, 2002.
RICHARD, S. et al. Haemangioblastoma of the central nervous system in von Hippel-
Lindau disease. French VHL Study Group. J Intern Med, 243: 547-53, 1998.
RICHARD, S. et al. Central nervous system hemangioblastomas, endolymphatic sac
tumors, and von Hippel-Lindau disease. Neurosurg Rev, 23: 1-22, 2000.
RICHARDS. Molecular pathology of von Hippel-Lindau disease and the VHL tumour
suppressor gene. Expert Reviews in Molecular Medicine. p. 1-27, 19 mar. 2001.
ROCHA J.C.C. et al. High frequency of novel germline mutations in the VHL gene in
the heterogeneous population of Brazil, J. Med. Genet, p. 31 a 40, mar/2003.
SHUIN, T et al. Von Hippel-Lindau disease: molecular pathological basis, clinical
criteria, genetic testing, clinical features of tumors and treatments. Jpn. J. Clin Oncol,
36(6), p. 337-343, mar. 2006.
SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM DATABASE. Disponivel em:
www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez. Acesso em 03 de nov. 2008.
THE UNIVERSAL MUTATION DATABASE – VHL, disponível em:
www.umd.be/VHL.Acesso em 05/11/2008.
VHL Family Alliance. Manual para pessoas com a doença de Von Hippel Lindau,
para as suas famílias e para apoio pessoal, 2ª ed. 1997.
VORTMEYER et al. Somatic von Hippel-Lindau gene mutations detected in sporadic
endolymphatic sac tumors. Cancer Research, v. 60, p. 5963-5965, nov. 2000.
WOODWARD et al. VHL mutation analysis in patients with isolated central nervous
system haemangioblastoma. Brain, n. 130, p. 836-846, 2007.
ZEQUI, Stênio de Cássio. Carcinoma de Células Renais. Newsletter, vol. 02, n. 24,
2004.
28
APÊNDICE
29
APÊNDICE I
UNIVERSIDADE FEDERAL O MARANHÃO
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO
LABORATÓRIO DE ESTUDOS GENÔMICOS E DE HISTOCOMPATIBILIDADE - LEGH
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
A Síndrome de von Hippel-Lindau (VHL) é uma doença hereditária e se
constitui basicamente pelo desenvolvimento de tumores benignos e malignos em uma
ou mais partes do corpo. Muitos desses tumores implicam em um desenvolvimento
anormal de vasos sangüíneos.
Diante desta multiplicidade de tumores benignos e malignos em vários órgãos do
corpo e da grande variedade de sinais e sintomas faz-se necessário confirmar a
existência dessa síndrome familiar para garantir aos portadores dessa doença um
esquema de acompanhamento de modo a assegurar a detecção precoce e tratamento das
possíveis lesões. Assim como, reduzir as conseqüências mais graves através da
prevenção.
O diagnóstico precoce permite à equipe médica a possibilidade de propiciar ao
paciente um tratamento mais direcionado e consequentemente uma melhora no quadro
clínico e na sua qualidade de vida.
Sendo assim, nós, da equipe de estudos da síndrome VHL no Maranhão,
convidamos você a participar de uma pesquisa com o nome de “ANÁLISE DO GENE
VHL EM PACIENTES COM CLÍNICA SUGESTIVA DA SÍNDROME DE VON
HIPPEL-LINDAU NO MARANHÃO” que tem como objetivo buscar conhecimento
sobre essa doença, orientar a sua família sobre a importância de ser atendida por uma
equipe de saúde e traçar um programa de acompanhamento clínico para prevenir e
detectar agravos referentes a essa doença.
30
UNIVERSIDADE FEDERAL O MARANHÃO
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO
LABORATÓRIO DE ESTUDOS GENÔMICOS E DE HISTOCOMPATIBILIDADE - LEGH
A pesquisa será realizada com os membros de sua família por meio de uma
entrevista com data e horários que estejam de acordo com a sua disponibilidade. O
benefício da pesquisa será prevenir e detectar agravos a sua saúde e orientar a sua
família quanto à importância do acompanhamento dos seus familiares.
Para a realização do exame genético será coletada uma pequena amostra de
sangue sem oferecer nenhum risco ao paciente, este sentirá apenas uma dor leve no
momento da introdução da agulha.
No demais, o desconforto que você terá será o tempo gasto com a entrevista
ou com alguma pergunta que lhe deixe constrangido.
O que você quiser saber sobre a pesquisa será esclarecido, sua identidade
será mantida em sigilo e você não terá danos moral, físico ou financeiro, se você
desejar sair da pesquisa não terá nenhum prejuízo.
Os resultados dessa pesquisa estarão em trabalhos de Conclusão do
Mestrado em Ciências da Saúde da aluna Patrícia Ribeiro Azevedo e do Curso de
Ciências Biológicas UFMA desenvolvido pela aluna Fabiana do Nascimento
Prazeres, ambos sob a orientação da Professora e Doutora Emygdia Rosa Leal
Mesquita. Provavelmente este trabalho será publicado em revista científica e
apresentado no auditório do Hospital Universitário, você está convidado a assistir
a apresentação do trabalho.
Tomando conhecimento do estudo, declaro concordar em participar da
pesquisa e que entendi as informações lidas nesse termo de consentimento.
31
UNIVERSIDADE FEDERAL O MARANHÃO
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO
LABORATÓRIO DE ESTUDOS GENÔMICOS E DE HISTOCOMPATIBILIDADE - LEGH
CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO
Eu, ________________________________________,
RG__________________________ CPF/
n.º_______________________________abaixo assino, concordo em participar do
estudo “Análise do gene VHL em pacientes com clínica sugestiva da Síndrome von
Hippel-Lindau”. Assim como permito o desenvolvimento de outras pesquisas desde que
entrem em contato prévio solicitando a minha participação, como sujeito. Fui
devidamente informado e esclarecido pelo pesquisador
______________________________________ sobre a pesquisa, os procedimentos nela
envolvidos, assim como os possíveis desconfortos e benefícios decorrentes de minha
participação. Foi-me garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer
momento, sem que isto leve a qualquer penalidade.
Local e data
______________________________________________________________
Nome e Assinatura do sujeito ou responsável:
__________________________________
Nome e Assinatura do pesquisador:
__________________________________________
Pesquisador Responsável:
Profª. Drª. Emygdia Rosa Leal Mesquita
Rua dos Prazeres, 215 (Cobertura do Hospital Materno Infantil), Centro.
CEP: 65020 - 090
Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade - LEGH
Fone: (098) 2109 – 12 65 ou 12 58
Pesquisador Técnico Responsável:
Patrícia Ribeiro Azevedo
Rua dos Prazeres, 215 (Cobertura do Hospital Materno Infantil), Centro.
CEP: 65020 - 090
Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade - LEGH
32
Fone: (098) 2109 – 12 65 ou 12 58
Coordenador do Comitê de Ética em Pesquisa – HUUFMA:
Profº. Dr. Wildoberto Batista Gurgel
Rua Barão de Itapary S/N - Centro
HUUFMA – Unidade Presidente Dutra
Fone: (098) 2109 – 12 23
33
ANEXOS
34
ANEXO I
NORMAS DA REVISTA PARA PUBLICAÇÃO
ISSN 1415-4757 printed version
ISSN 1678-4685 online version
INSTRUCTIONS TO AUTHORS
• Scope and policy
• Submission of papers
Scope and policy
Genetics and Molecular Biology (formerly named Revista Brasileira de
Genética/Brazilian Journal of Genetics - ISSN 0100-8455) is published is published by
the Sociedade Brasileira de Genética (Brazilian Society of Genetics).
The Journal considers contributions that present the results of original research in
genetics, evolution and related scientific disciplines.
Although Genetics and Molecular Biology is an official publication of the Brazilian
Society of Genetics, contributors are not required to be members of the Society.
It is a fundamental condition that submitted manuscripts have not been and will not be
published elsewhere. With the acceptance of a manuscript for publication, the
publishers acquire full and exclusive copyright for all languages and countries.
Manuscripts considered in conformity with the scope of the journal, judged by the
Editor in conjunction with the Editorial Board, are reviewed by the Associate Editor and
two or more external reviewers. Acceptance by the Editor is based on the quality of the
work as substantial contribution to the field and on the overall presentation of the
manuscript.
Submission of papers
1. Manuscripts should be submitted to:
Angela M. Vianna-Morgante, Editor-in-Chief
Genetics and Molecular Biology
By Postal Address: Or by Electronic Address
Rua Capitão Adelmio Norberto da Silva, 736
14025-670 Ribeirão Preto, SP - Brazil
2. A submission package sent to the Editorial Office must contain:
35
a) A cover letter stating that all authors have approved the submission of the
manuscript. The letter must be signed by the Corresponding Author and must inform the
e-mail addresses of all other authors so that they can be contacted by the Editorial
Office for confirmation of the submission.
b) An electronic copy of the text, tables and figures, including supplementary material
to be published online only. Formats for text are Word or RTF in Windows platform.
Images in TIFF or JPEG formats should be sent in separate files (For Figures, see
detailed instructions in 3.1.h). Mailed CD-ROMs must be labeled with the first author's
last name, platform and software. Failure to adhere to these guidelines can delay the
handling of your contribution and manuscripts may be returned before being reviewed.
c) Manuscripts including photos or any other identifiable data of human subjects must
be accompanied by a copy of the signed consent by the individual or his/her guardian.
3. Categories of Contribution
3.1. Research Articles
Manuscripts must be written in English in double-spaced, 12-point type throughout;
formatted to A4 paper with 2.5 cm margins; marked with consecutive line and page
numbers, beginning with the cover page.
The following elements must start on a new page and be ordered as they are listed
below:
a) The title page must contain: a concise and informative title; the authors’ names (first
name at full length); the authors’ institutional affiliation, including department,
institution, city, state or province and country; different affiliations indicated with
superscript numbers; a short running title of about 35 characters, including spaces; up to
five key words; the corresponding author’s name, postal address, phone and fax
numbers and email address. The corresponding author is the person responsible for
checking the page proofs, arranging for the payment of color illustrations and author’s
alteration charges.
b) The Abstract must be a single paragraph that does not exceed 200 words and
summarizes the main results and conclusions of the study. It should not contain
references.
c) The text must be as succinct as possible. Text citations: articles should be referred to
by authors’ surnames and date of publication; citations with two authors must include
both names; in citations with three or more authors, name the first author and use et al.
List two or more references in the same citation in chronological order, separated by
semi-colons. When two or more works in a citation were published in the same year, list
them alphabetically by the first author surname. For two or more works by the same
author(s) in a citation, list them chronologically, with the years separated by commas.
(Example: Freire-Maia et al., 1966a, 1966b, 2000). Only articles that are published or in
press should be cited. In the case of personal communications or unpublished results, all
contributors must be listed by initials and last name (et al. should not be used).
Numbers: In the text, numbers nine or less must be written out except as part of a date, a
fraction or decimal, a percentage, or a unit of measurement. Use Arabic numerals for
36
numbers larger than nine. Avoid starting a sentence with a number. Binomial Names:
Latin names of genera, species and intraspecific taxa in the text must be printed in
italics; names of orders and families should appear in the Title and also when first
mentioned in the text. URLs for programs, data or other sources should be listed in the
Internet Resources Section, immediately after the References Section, not in the text.
URLs for citations of publications in electronic journals should appear in the reference
section.
The text includes the following elements:
Introduction - Description of the background that led to the study.
Material (or Subjects) and Methods - Details relevant to the conduct of the study.
Statistical methods should be explained at the end of this section.
Results - Undue repetition in text and tables should be avoided. Comment on
significance of results is appropriate but broader discussion should be part of the
Discussion section.
Discussion - The findings of the study should be placed in context of relevant published
data. Ideas presented in other publications should not be discussed solely to make an
exhaustive presentation.
Some manuscripts may require different formats appropriate to their content.
d) The Acknowledgments must be a single paragraph that immediately follows the
discussion and includes references to grant support.
e) The References Section: references must be ordered alphabetically by the first
author surname; references with the same first author should be ordered as follows:
first, as single author in chronological order; next, with only one more co-author in
alphabetical order by the second author; and finally followed by references with more
than two co-authors, in chronological order, independent of the second author surnames.
In references with more than 10 authors only the first ten should be listed, followed by
et al. Use standard abbreviations for journal titles as suggested by ISI Web of
Knowledge or PubMed.
Only articles that are published or in press should be included in this section. Works
submitted for publication but not yet accepted, personal communications and
unpublished data must be cited within the text. “Personal communication” refers to
individuals other than the authors of the manuscript being submitted; “unpublished
data” refers to data produced by at least one of the authors of the manuscript being
submitted.
Sample journal article citation:
Breuer ME and Pavan C (1955) Behaviour of polytene chromosomes of Rhynchosciara
angelae at different stages of larval development. Chromosoma 7:371-386.
Yonenaga-Yassuda Y, Rodrigues MT and Pellegrino KCM (2005) Chromosomal
banding patterns in the eyelid-less microteiid lizard radiation: The X1X1X2X2:X1X2Y
37
sex chromosome system in Calyptommatus and the karyotypes of Psilophtalmus and
Tretioscincus (Squamata, Gymnophthalmidae). Genet Mol Biol 28:700-709.
Sample book citation:
Dobzhansky T (1951) Genetics and Origin of Species. 3rd edition. Columbia University
Press, New York, 364 pp.
Sample chapter-in-book citation:
Crawford DC and Howard-Peebles PN (2005) Fragile X: From cytogenetics to
molecular genetics. In: Gersen SL and Keagle MB (eds) The Principles of Clinical
Cytogenetics. 2nd edition. Humana Press, New Jersey, pp 495-513.
Sample electronic article citation:
Simin K, Wu H, Lu L, Pinkel D, Albertson D, Cardiff RD and Van Dyke T (2004) pRb
inactivation in mammary cells reveals common mechanisms for tumor initiation and
progression in divergent epithelia. Plos Biol 2:194-205. http://www.plosbiology.org.
f) Internet Resources Section: this section should contain a list of URLs referring to
data presented in the text, software programs and other Internet resources used during
data processing. Date of consultation must be stated.
Sample Internet resource citation:
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM
(September 4, 2005) LEM Software,
http://dir.niehs.nih.gov/dirbb/weinbergfiles/hybrid_design.htm
g) Tables: must be inserted at the end of the main text file, each table starting on a new
page. A concise title should be provided above the table. Tables must be numbered
consecutively in Arabic numerals. Each column must have a title in the box head.
Footnotes typed directly below the table should be indicated in lowercase superscript
numbers.
h) Figures must be numbered consecutively in Arabic numerals. Legends should be
typed on a new page that immediately follows the tables. Images should be in TIFF or
JPEG format and provided in separate files. Identify each illustration by the first author
name and the number of the respective figure. Figures in Word, PowerPoint or Excel
format cannot be published. Journal quality reproduction will require grayscale
resolution yielding 300 dpi, color figures should be at 600 dpi. These resolutions refer
to the output size of the file; if it is anticipated that images will be enlarged or reduced,
the resolutions should be adjusted accordingly. Figures composed of several elements
should be sent as a single panel, obeying the print size definitions of the journal (single
or two columns width). Scanned figures should not be submitted. Color illustrations can
be accepted, but authors may be asked to defray the cost.
Authors should submit bitmapped line art at resolution yielding 600-1200 dpi. These
resolutions refer to the output size of the file; if it is anticipated that images will be
enlarged or reduced, the resolutions should be adjusted accordingly. Scanned figures
should not be submitted. Identify each illustration by the first author name and the
number of the respective figure. Color illustration can be accepted, but authors may be
asked to defray the cost.
38
i) Nomenclature should adhere to current international standards.
j) Sequences may appear in text or in figure. DNA, RNA and protein sequences equal
to or greater than 50 units must be entered into public databases. The accession number
must be provided and released to the general public together with publication of the
article. Long sequences requiring more than two pages to reproduce will not be
published unless the Editorial decision is that the publication is necessary. Complete
mtDNA sequence will not be published.
k) Data access: reference should be made to availability of detailed data and materials
used for reported studies.
l) Ethical issues: Reports of experiments on live vertebrates must include a brief
statement that the institutional review board approved the work and the protocol number
must be provided. For experiments involving human subjects, authors must also include
a statement that informed consent was obtained from all subjects. If photos or any other
identifiable data are included, a copy of the signed consent must accompany the
manuscript.
m) Supplementary Material: Data that the authors consider of importance for
completeness of a study, but which are too extensive to be included in the published
version, can be submitted as Supplementary Material. This material will be made
available together with the electronic version. In case a manuscript contains such
material, it should be appropriately identified within the text. Supplementary material in
tables should be identified as Table S1, Table S2, etc., in case of figures, they should be
named accordingly, Figure S1, Figure S2. For online access, Supplementary material
should be in PDF, JPEG or GIFF formats In addition, a list of this material should be
presented at the end of the manuscript text file, containing the following statement:
Supplementary material - the following online material is available for this article:
- Table S1
.....
This material is available as part of the online article from http://www.scielo.br/gmb
3.2 Short Communications
Present brief observations that do not warrant full-length articles. They should not be
considered preliminary communications. They should be 15 or fewer typed pages in
double spaced 12-point type, including literature cited. They should include an Abstract
no longer than five percent of the paper’s length and no further subdivision with
introduction, material and methods, results and discussion in a single section. Up to two
tables and two figures may be submitted. The title page and reference section format is
that of full-length article.
3.3 Letters to the Editor
Relate or respond to recent published items in the journal. Discussions of political,
social and ethical issues of interest to geneticists are also welcome in this form.
39
3.4 Review Articles
Review Articles are welcome.
3.5 Book Reviews
Publishers are invited to submit books on Genetics, Evolution and related disciplines,
for review in the journal. Aspiring reviewers may propose writing a review.
3.6 History, Story and Memories
Accounts on historical aspects of Genetics relating to Brazil.
4. Proofs and Copyright Transfer
Page proofs will be sent to the corresponding author. Changes made to page proofs,
apart from printer’s errors, will be charged to the authors. Notes added in proof require
Editorial approval. A form of consent to publish and transfer of copyright will have to
be signed by the corresponding author, also on behalf of any co-authors.
5. Reprints
Reprints are free of charge and provided as a pdf-file.
[Home] [About this journal] [Editorial board] [Subscription]
© 2002-2008 Sociedade Brasileira de Genética
Av. Cap. Adelmio Norberto da Silva, 736
14025-670 Ribeirão Preto SP Brasil
Phone: +55 16 3911-4130
Fax: + 55 11 3369-6164
40
ANEXO II
PARECER CONSUBSTANCIADO
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
