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MDM2 e CDK4 no diagnóstico de
lipossarcoma bem
tumor lipomatoso atípico
lipossarcoma desdiferenciado
Nome do autor:
Nome do orientador:
Dissertação submetida ao
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como
requisito para a obtenção do grau de Mestre
MDM2 e CDK4 no diagnóstico de
lipossarcoma bem
-
diferenciado
tumor lipomatoso atípico
lipossarcoma desdiferenciado
Nome do autor:
Pedro Bandeira Aleixo
Nome do orientador:
Antônio Atalíbio
Dissertação submetida ao
Programa de Pós-
Graduação em Patologia da
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como
requisito para a obtenção do grau de Mestre
2009
MDM2 e CDK4 no diagnóstico de
diferenciado
/
tumor lipomatoso atípico
e
lipossarcoma desdiferenciado
.
Pedro Bandeira Aleixo
Antônio Atalíbio
Hartmann
Graduação em Patologia da
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como
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MDM2 e CDK4 no diagnóstico de
lipossarcoma bem-diferenciado /
tumor lipomatoso atípico e
lipossarcoma desdiferenciado
Nome do autor: Pedro Bandeira Aleixo
Nome do orientador: Antônio Atalíbio Hartmann
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como
requisito para a obtenção do grau de Mestre
2009
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Catalogação na Publicação:
Bibliotecário Vladimir Luciano Pinto - CRB 10/1112
A366m Aleixo, Pedro Bandeira
MDM2 e CDK4 no diagnóstico de lipossarcoma bem-
diferenciado/tumor lipomatoso atípico e lipossarcoma
desdiferenciado / Pedro Bandeira Aleixo. – 2009.
139 f. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) -- Universidade Federal de Ciências
da Saúde de Porto Alegre, Programa de Pós-Graduação em
Patologia, 2009.
“Orientador: Prof. Dr. Antônio Atalíbio Hartmann”.
1. Lipossarcoma – Diagnóstico. 2. Tumores de tecidos
moles. 3. Sarcoma. 4. Lipoma. 5. Imuno-histoquímica I. Título.
CDD 616.994018
CDU 616-006.04
1
DEDICATÓRIA
Ao meu pai e minha mãe, José Antônio Aleixo e Maria Auxiliadora Bandeira
Aleixo, pelo incentivo e apoio, dedico todo meu esforço.
Aos meus avôs e avós, Salvador e Maria Aleixo e Osvaldo e Vicência Bandeira,
pelo amor.
2
AGRADECIMENTOS
Ao Prof
o
. Dr. Antonio Atalíbio Hartmann, meu orientador, pela confiança e
estímulo.
Ao Dr. Antônio Nascimento, pelo conhecimento e amizade.
Ao Dr. André Oliveira, pela inspiração e constante apoio.
Ao Dr. Roque Furian, pela confiança e apoio.
Ao Dr. Claudio Zettler, pelo auxílio.
À Dr. Marinez Barra, pelo incentivo.
À Dr. Márcia Graudenz, pela ajuda e contribuição.
À Rosalva Meurer, pela ajuda com a imuno-histoquímica.
À Itiana Meneses, pela ajuda com as informações clínicas dos casos.
Ao Dr. Rafael Nazário, pela amizade.
Às técnicas em patologia Teresinha Stein, Dagmar, Andréia Silva, Paula Buhler
e Juliana, pela ajuda.
Aos meus colegas de mestrado, pela amizade.
Aos funcionários da secretaria da pós-graduação, pela atenção.
A todos meus familiares Sabina, Marina, Pulido, Umar, Alice, Elan e João
Pedro, pelo incentivo.
À Bárbara de Lavra Pinto, minha namorada, pelo incentivo, apoio e
companheirismo.
3
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas ....................................................................................... 5
Lista de tabelas ................................................................................................ 6
Lista de figuras ................................................................................................ 7
1. Introdução .................................................................................................... 8
2. Revisão da literatura .................................................................................. 18
2.1 Lipossarcomas ......................................................................................... 18
2.2 Lipossarcoma bem-diferenciado / tumor lipomatoso atípico .............. 20
2.2.1 Definição e terminologia ............................................................... 20
2.2.2 Epidemiologia e características clínicas ....................................... 22
2.2.3 Achados macroscópicos .............................................................. 23
2.2.4 Histopatologia ............................................................................... 23
2.2.5 Genética ....................................................................................... 26
2.2.5.1 Citogenética convencional .............................................. 26
2.2.5.2 Citogenética molecular ................................................... 27
2.2.6 Imunofenótipo ............................................................................... 28
2.2.7 Diagnóstico diferencial ................................................................. 29
2.2.8 Prognóstico .................................................................................. 32
2.3 Lipossarcoma desdiferenciado .............................................................. 33
2.3.1 Definição e terminologia ............................................................... 33
2.3.2 Epidemiologia e características clínicas ....................................... 34
2.3.3 Achados macroscópicos .............................................................. 35
2.3.4 Histopatologia ............................................................................... 36
2.3.5 Genética ....................................................................................... 38
4
2.3.5.1 Citogenética convencional .............................................. 38
2.3.5.2 Citogenética molecular ................................................... 39
2.3.6 Imunofenótipo ............................................................................... 40
2.3.7 Diagnóstico diferencial ................................................................. 40
2.3.8 Prognóstico .................................................................................. 42
2.4 Murine Double Minute Clone 2 (MDM2) ................................................. 43
2.4.1 O ciclo celular e MDM2 ................................................................ 43
2.4.2 Alterações de MDM2 no câncer ................................................... 44
2.5 Cyclin Dependent Kinase 4 (CDK4) ........................................................ 45
2.5.1 O ciclo celular e CDK4 ................................................................. 45
2.5.2 Alterações de CDK4 no câncer .................................................... 46
3. Referências ................................................................................................. 48
4. Objetivos ..................................................................................................... 57
5. Artigo em inglês ......................................................................................... 58
6. Artigo em português .................................................................................. 96
7. Conclusões finais .................................................................................... 137
8. Anexos ...................................................................................................... 138
5
LISTA DE ABREVIATURAS
CDK4: proteína ciclina kinase dependente 4
CDK4: gene ciclina kinase dependente 4
CGH: comparative genomic hybridization
FISH: fluorescence in situ hybridization
GIST: tumor do estroma gastrointestinal
HFM: histiocitoma fibroso maligno
HMGA2: gene High mobility group AT-hook 2
IHQ: imuno-histoquímica
LP-CF: lipoma de células fusiformes
LP-PL: lipoma pleomórfico
LPS: lipossarcoma
LPS-BD: lipossarcoma bem-diferenciado
LPS-DD: lipossarcoma desdiferenciado
LPS-Mix/CR: lipossarcoma mixóide-células redondas
LPS-PL: lipossarcoma pleomórfico
MDM2: proteína murine double minute 2
MDM2: gene murine double minute 2
RB: proteína retinoblastoma
SIP: sarcoma indiferenciado pleomórfico
ONM: outras neoplasias mesenquimais
OMS: Organização Mundial da Saúde
P53: proteína P53
TP53: gene TP53
TLA: tumor lipomatoso atípico
TAB: tumores adipocíticos benignos
6
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Características clínico-patológicas, diagnóstico, morfologia e
expressão imuno-histoquímica no grupo LPS-BD e LPS-DD ........................ 127
Tabela 2: Características clínico-patológicas, diagnóstico, dados morfológicos e
expressão imuno-histoquímica no grupo TAB ............................................... 128
Tabela 3: Características clínico-patológicas, diagnóstico, dados morfológicos e
expressão imuno-histoquímica no grupo ONM .............................................. 129
Tabela 4: Resultados da imuno-histoquímica para MDM2 e CDK4 nos vários
tipos de tumores de tecidos moles ................................................................ 131
Tabela 5: Análise estatística dos resultados da imuno-histoquímica para MDM2
e CDK4 nos grupos histopatológicos estudados ........................................... 132
Tabela 6: Análise estatística dos resultados com imunomarcação difusa para
MDM2 e CDK4 nos grupos histopatológicos estudados ................................ 133
Tabela 7: Sensibilidade, Especificidade e Teste Youden para expressão de
MDM2 e CDK4 em LPS-BD e LPS-DD contra outras neoplasias mesenquimais
descritos na literatura ..................................................................................... 134
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Imunomarcação para MDM2. (A) Caso 29 – Imunomarcação difusa
em um LPS-DD de baixo grau. (B) Caso 23 – Lipoma não-convencional com
imunomarcação focal em células reativas. (C) Caso 70 – Área bem
diferenciada de um LPS-DD. (D) Caso 27 – LPS-BD retroperitonial
esclerosante. (E) Caso 13 – Célula gigante multinucleada de um LPS-DD de
alto grau. (F) Caso 17 – Case 17 – Mulher de 48 anos com um LPS-BD
esclerosante ................................................................................................... 135
Figura 2: Imunomarcação de CDK4. (A) Caso 75 – Lipoblasto em um LPS-BD
retroperitonial esclerosante. (B) Caso 29 – Imunomarcação difusa em um LPS-
DD retroperitonial. (C) Caso 70 – Área bem diferenciada de um LPS-DD. (D)
Caso 27 – LPS-BD esclerosante retroperitonial. (E) Caso 18 – LPS-BD
retroperitonial adjacente ao parênquima renal. (F) Case 17 – Mulher de 48 anos
com um LPS-BD esclerosante ....................................................................... 136
8
1. Introdução:
A freqüência real dos tumores de tecidos moles é difícil de ser estimada
porque a maioria das lesões benignas não é removida. Uma das estimativas é
a de que as lesões benignas de tecidos moles superam as malignas numa
razão de 100:1 (Kotran e cols., 2007). Os tecidos moles constituem os tecidos
mesenquimais não-epiteliais extra-esqueléticos do corpo, excluindo-se o
sistema reticuloendotelial e a glia (Weiss e Goldblum, 2008).
Embriologicamente têm origem mesodérmica com alguma contribuição
neuroectodérmica. Os tecidos moles incluem tendões, ligamentos, fáscias,
tecido fibroso (e conjuntivo), tecido adiposo, tecido muscular, vasos e
membranas sinoviais. Por convenção se incluiu o sistema nervoso periférico
nesse grupo, pois tumores originados de nervos também se apresentam como
massas em tecidos moles.
Os tumores de tecidos moles formam um grupo grande e heterogêneo
de tumores classificados histológica e geneticamente de acordo com o tecido
adulto maduro que recapitulam. Dentro de suas várias categorias, usualmente
são divididos em benignos e malignos (sarcomas). Os tumores benignos têm
pequena tendência de invasão local e têm uma baixa taxa de recidiva local
após tratamento conservador. Os tumores malignos, ou sarcomas, são
localmente agressivos, têm crescimento infiltrativo, recorrem com freqüência e
dão metástases a distância (Fletcher, 2007; Weiss e Goldblum, 2008).
As neoplasias adipocíticas representam o grupo mais comum de
tumores de origem mesenquimal, principalmente pelo grande número de
lipomas (Weiss e Goldblum, 2008). Os sarcomas de tecidos moles constituem
9
um grupo heterogêneo de tumores mesenquimais agressivos que representam
1% dos tumores malignos em adultos e 20% das neoplasias malignas em
crianças (Fletcher, 2007). O lipossarcoma é o tipo mais comum de sarcoma de
tecidos moles (Fletcher e cols., 2002). Entre os lipossarcomas, três grupos
distintos com características clínicas, biológicas, histológicas e genéticas são
identificados: o grupo do lipossarcoma bem-diferenciado com ou sem
desdiferenciação, o espectro do lipossarcoma mixóide-células redondas (LPS-
Mix/CR) e o lipossarcoma pleomórfico (LPS-PL) (Fletcher, 2007; Weiss e
Goldblum, 2008). O lipossarcoma bem-diferenciado (LPS-BD), também
chamado tumor lipomatoso atípico (TLA), representa cerca de 50% de todos os
lipossarcomas, sendo o subgrupo mais comum. Os sarcomas de retroperitônio
representam 10 a 15% dos sarcomas em adultos, a maioria sendo LPS-BD e
lipossarcoma desdiferenciado (LPS-DD) (Fletcher e cols., 2002). Estes dois
sarcomas são comuns ainda nos tecidos moles profundos das extremidades
(principalmente coxa) e região paratesticular/inguinal. Podem se desenvolver
também mais raramente no mediastino, tecido celular subcutâneo, pele e
vísceras (Fletcher, 2007).
O LPS-BD foi também chamado de lipoma atípico, neoplasia lipomatosa
atípica ou TLA por diversos autores (Kindblom e cols., 1982; Evans, 1988; Dei
Tos e cols., 2001). Atualmente, segundo a Organização Mundial da Saúde
(OMS) essas denominações são consideradas sinônimos (Fletcher e cols.,
2002). O LPS-BD é um tumor que mostra agressividade local, recorre em
aproximadamente 30% dos casos e não metastatiza sem antes sofrer
desdiferenciação. As duas principais formas de apresentação do LPS-BD são
na forma adipocítica (lipoma-like) e na forma esclerosante. Mais raramente se
10
apresenta na forma de lesões com numerosas células fusiformes (lipossarcoma
de células fusiformes) (Dei Tos e cols., 1994) ou com associação de células
inflamatórias (lipossarcoma bem-diferenciado inflamatório) (Kraus e cols.,
1997). Microscopicamente o diagnóstico do LPS-BD baseia-se na identificação
de uma proliferação de células adipocíticas com grande variação de tamanho,
com núcleos atípicos e hipercromáticos; pela presença de lipoblastos em
número variável e de células estromais atípicas hipercromáticas, que em
alguns casos podem se mostrar multinucleados (Laurino e cols., 2001). A
presença de lipoblastos não é condição necessária para o diagnóstico de LPS-
BD (Dei Tos, 2000), pois já é de conhecimento que muitas neoplasias
adipocíticas benignas (lipoma pleomórfico, lipoblastoma e lipoma condróide)
semelhantes ao LPS-BD podem conter lipoblastos, tornando clinicamente
importante seu diagnóstico diferencial.
O LPS-DD é considerado uma forma de progressão histológica (tumoral)
do LPS-BD. Em torno de 15% dos casos têm um potencial para metastatizar,
mostrando o restante apenas uma agressividade local com alta taxa de
recorrência (Fletcher e cols., 2002) semelhante a outros sarcomas de alto grau.
Já que o LPS-DD pode mimetizar morfologicamente outros sarcomas que têm
maiores taxas de metastatização, principalmente no retroperitônio e canal
inguinal, o diagnóstico e classificação correta do LPS-DD são fundamentais
para se determinar um prognóstico adequado ao paciente (Weiss e Goldblum,
2008). Na microscopia o LPS-DD é diagnosticado pela identificação de uma
transição de um LPS-BD para outro sarcoma não lipogênico, de alto ou baixo
grau (Nascimento, 2001). Um dos tumores que o LPS-DD pode imitar
morfologicamente é o histiocitoma fibroso maligno (HFM), sinônimo de sarcoma
11
indiferenciado pleomórfico (SIP) de alto grau, categoria histológica atualmente
sem linha de diferenciação celular definida (Fletcher e cols., 2002).
Recentemente se evidenciou que no mínimo 20% dos casos de sarcoma
pleomórfico diagnosticados previamente como HFM no retroperitônio são, na
verdade, LPS-DD (Coindre e cols., 2003).
O estudo citogenético e de genética molecular de tumores de tecidos
moles têm contribuído significativamente para o entendimento de sua biologia
tumoral (Fletcher e cols., 2002). Anormalidades cromossômicas e alterações
genéticas específicas podem ser usadas como marcadores tumorais, dando
muita informação sobre a gênese dessas neoplasias (Sandberg, 2002). A
análise do cariótipo do LPS-BD e do LPS-DD demonstra caracteristicamente a
presença de cromossomos marcadores supranumerários em anel e/ou
gigantes (Pedeutour e cols., 1999 e Rosai e cols., 1996). Estudos com FISH
(fluorescence in situ hybridization), CGH (comparative genomic hybridization) e
Southern Blot demonstraram que esses cromossomos gigantes e em anel
possuem amplificação de seqüências do cromossomo 12q14-15, com
constante presença de aumento do número de cópias dos genes murine double
minute type 2 (MDM2) e cyclin dependent kinase 4 (CDK4) (Dei Tos e cols.,
2000 e Hostein e cols., 2004). Estes dois genes atuam como reguladores
positivos da progressão do ciclo celular no checkpoint entre as fases G1-S. A
região 12q14-15 é complexa e contém, além de MDM2 e CDK4, vários proto-
oncogenes como HMGA2 (HMGI-C), SAS, GLI, CHOP, OSI e OS9, envolvidos
na patologia molecular de várias outras neoplasias (Alberts e cols., 2002).
A identificação da concomitante amplificação de HMGA2 (HMGIC), gene
que codifica um fator de transcrição arquitetural envolvido na diferenciação
12
adipocítica, junto com MDM2 e CDK4 em LPS-BD, e a observação de que
lipomas têm rearranjos (translocações) de 12q13-15 com ativação de HMGA2,
levaram a postular que existe um contínuo morfológico e genético na neoplasia
adipocítica bem diferenciada. Ou seja, primeiro o lipoma sofre uma
translocação de HMGA2 e depois sofre amplificação desse gene para se tornar
um LPS-BD (Dei Tos e cols., 2000). Essas alterações em MDM2 e CDK4 são
reconhecidas como eventos essenciais na tumorigênese do LPS-BD. A
amplificação desses genes resulta em uma expressão aumentada de seus
produtos correspondentes, as oncoproteínas MDM2 e CDK4. A
superexpressão destas proteínas pode ser detectada através de imuno-
histoquímica em tumores fixados em formalina e embebidos em parafina. O
seu uso foi sugerido, então, como um método confiável para realizar o
diagnóstico de LPS-BD e LPS-DD (Binh e cols., 2005).
A expressão aumentada da oncoproteína MDM2 parece atuar
alternativamente à mutação direta do gene TP53 para a inativação da via
supressora de crescimento celular mediada pelo fator de transcrição P53
(Momand e cols., 2000; Yoo e cols., 2002). MDM2 é um regulador negativo da
proteína P53 e atua regulando os seus níveis através da inativação de sua
atividade de transcrição e degradação. A P53 normalmente tem como função a
defesa contra a transformação neoplásica nas células com mutações no
genoma (Momand e cols., 2000). Já a expressão aumentada do oncogene
CDK4 interfere com a via mediada pelo gene retinoblastoma 1 (RB1), que
codifica proteína retinoblastoma (RB) (Ortega e cols., 2002). A oncoproteína
CDK4 se liga à proteína RB e, através de fosforilação, causa a inativação de
13
seu efeito supressor no ciclo celular, estimulando a proliferação e crescimento
celular (Yoo e cols., 2002).
O LPS-DD é uma neoplasia que, apesar da presença de uma transição
para sarcoma de alto grau morfológico, exibe um comportamento clínico bem
menos agressivo que qualquer outro sarcoma pleomórfico de alto grau
(McCormick e cols., 1994). É interessante notar que os LPS-DD,
diferentemente de outros sarcomas pleomórficos de alto grau que
invariavelmente apresentam cariótipos complexos, se caracterizam pelas
mesmas alterações cromossômicas (cromossomos em anel e/ou gigantes) dos
LPS-BD (Fletcher e cols., 1996). Adicionalmente, os genes alvo no LPS-DD
são os mesmos do LPS-BD (MDM2, CDK4 e HMGA2), com uma possível
diferença observada apenas no nível de amplificação destes genes (Dei Tos e
cols., 1997 e Nakayama e cols., 1995). Esses dados genéticos, junto com
dados clínicos, suportam a hipótese de que existe um espectro de
diferenciação entre o LPS-BD e o LPS-DD, sendo a extremidade pouco
diferenciada o LPS-DD (Dei Tos e cols., 2000). Outro achado adicional foi a
identificação de casos de LPS-DD que recidivaram como uma lesão bem-
diferenciada (Dei Tos e cols., 2000).
Os aspectos prognósticos dos sarcomas de tecidos moles incluem
dados clínicos e histopatológicos como: grau histológico, tamanho do tumor,
profundidade da lesão, localização do tumor e status de margens cirúrgicas. A
presença de necrose e alto índice mitótico também são de comprovada
validade prognóstica (Fletcher e cols., 2002). Os sarcomas são geralmente
graduados em três ou quatro graus histológicos, sendo os de alto grau (Graus
3 e 4) neoplasias agressivas com altas taxas de metástase (Lucas e cols.,
14
1994; Fletcher e cols., 2002 e 2007). Esses marcadores prognósticos refletem
o fenótipo de um tumor agressivo, isto é, com invasão vascular, metástase e
recorrência local.
O estudo de marcadores tumorais prognósticos através de imuno-
histoquímica identifica alterações nos pilares do crescimento tumoral:
proliferação celular, apoptose e angiogênese. Entre estes marcadores estão o
Fator VIII, que mede densidade vascular; o Ki-67, que é um marcador de
proliferação celular; e as proteínas P53, P27 e BCL2, que estão ligadas à
regulação do ciclo celular e apoptose (Yoo e cols., 2002; Sabah e cols., 2007).
Além desses, existem o CD44 e a ezrin que estão relacionados com adesão
celular, migração e metástase (Weiss e Goldblum, 2008). Marcadores
genéticos de mau prognóstico em sarcomas incluem mutações em C-KIT e
PDGFRA no tumor do estroma gastrointestinal, em inglês gastrointestinal
stromal tumor (GIST), e a presença do oncogene fusionado SS18-SSX em
sarcomas sinoviais (Fletcher, 2007; Weiss e Goldblum, 2008). Um possível
marcador genético de mau prognóstico nos lipossarcomas inclui ganhos em
13q (Schmidt e cols., 2005).
O tratamento do LPS-BD e LPS-DD, assim como de outros sarcomas,
tem como modalidade principal a excisão cirúrgica. A ressecção ampla local
com margens livres é muito importante para controle local do tumor (Weiss e
Goldblum, 2008). Margens cirúrgicas em sarcomas de tecidos moles podem
ser definidas como intralesional (tumor visto micro ou macroscopicamente na
margem), marginal (lesão dissecado em uma peça através da pseudocápsula
ou tecido reativo peritumoral), ampla (tumor removido em bloco com tecido
sadio ao redor de pelo menos um centímetro) ou compartimental (remoção de
15
um compartimento além da fáscia do músculo envolvido pelo tumor) (Enneking
e cols., 1980). Atualmente há uma tendência em se referir as margens
cirúrgicas como positiva (tumor visto micro ou macroscopicamente na margem)
ou negativa (quando o tumor não é visto microscopicamente na margem). Uma
margem seria considerada ampla apenas quando se observa mais de dois
centímetros de tecido sadio ou fáscia integra recobrindo todo o tumor (Weiss e
Goldblum, 2008).
A radioterapia tem um papel bem estabelecido no tratamento adjuvante
de sarcomas em casos com margens de ressecção positiva (Strander e cols.,
2003). Um trabalho demonstrou que a terapia adjuvante pós-operatória com
radiação melhora o controle local de sarcomas de extremidades de alto e baixo
grau tratados com cirurgia conservadora que apresentaram margens positivas,
marginais ou negativas (Yang e cols., 1998). A maioria dos sarcomas
irressecáveis não responde bem a radioterapia para diminuição de volume
tumoral (Strander e cols., 2003).
A quimioterapia é usada principalmente de forma paliativa no tratamento
de sarcomas de alto grau. Algumas instituições possuem protocolos com
terapia quimioterápica adjuvante para o tratamento dos sarcomas de alto grau
(Tierney e cols., 1995). Drogas como a doxorubicina e a isofosfamida
demonstraram benefícios em termos de diminuição da taxa de recorrência local
e de metástases à distância, mas não mostraram um aumento de sobrevida
(Tierney e cols., 1995; Cornier e cols., 2004). Recentemente terapias mais
efetivas contra o câncer têm visado atuar em alterações genéticas específicas
de cada tumor. Exemplos incluem o tratamento com o anticorpo monoclonal
trastuzumab (Herceptin) nos casos de carcinoma de mama que apresentam
16
amplificação do gene HER2 (Hudis, 2007) e o uso do inibidor de tirosina kinase
imatinib (Gleevec). Este último é utilizado nos casos de leucemia mielóide
crônica e de GIST que demonstram mutações nos genes ABL, e C-KIT e
PDGFRA, respectivamente (Olsen e cols., 2002; Soverini e cols., 2008).
A restauração da função da proteína P53 em células cancerígenas com
P53 mutante induz a morte celular nesses tumores (Bullock e Fersht, 2001). A
ativação da proteína P53 selvagem em tumores que demonstram outras vias
de supressão do P53 diferentes de mutação também demonstrou ser uma boa
estratégia de tratamento de cânceres (Lane, 1999). Um desses mecanismos de
supressão do P53 utiliza o aumento da expressão de seu regulador negativo a
proteína MDM2 (Fakharzadeh, 1993). O gene MDM2 está amplificado em
diversos tumores, incluindo o LPS-BD/LPS-DD (Momand e cols., 1998). A
maioria desses tumores com amplificação e aumento de expressão de MDM2
expressa a proteína P53 selvagem (Momand e cols. 1998). A inibição da
interação P53-MDM2 pode reativar a função do P53 nesses tumores, levando a
morte de suas células neoplásicas (Vassilev, 2007). Recentemente, pequenas
moléculas inibidoras seletivas de MDM2 (chamadas nutlins) foram identificadas
e o seu uso como estratégia terapêutica para o câncer já foi testado in vitro
com bons resultados (Vassilev e cols., 2004; Vassilev, 2007).
Evidências atuais suportam a existência de uma forte correlação entre
morfologia e genética na história natural do lipossarcoma bem-diferenciado e
desdiferenciado. O diagnóstico diferencial entre lipomas e o LPS-BD e entre
alguns sarcomas e o LPS-DD pode ser muito difícil para o patologista quando
apenas a histologia do tumor é estudada. A identificação de alterações
genéticas específicas através de métodos confiáveis pode ser usada como
17
marcador diagnóstico complementar à morfologia e pode também ser alvo,
futuramente, de tratamento desses dois tumores.
O presente trabalho propõe avaliar a utilidade clínica do uso de
anticorpos contra MDM2 e CDK4 para auxiliar no diagnóstico histopatológico
do lipossarcoma bem-diferenciado e lipossarcoma desdiferenciado.
18
2. Revisão da Literatura:
2.1 Lipossarcoma
O lipossarcoma é um dos sarcomas de tecidos moles mais comuns em
adultos. Uma incidência anual estimada de 2.5 por milhão foi descrita em uma
população (Kindblom e cols., 1975). Entre outros sarcomas, a incidência anual
estimada do LPS é de 9% e 16% (Hashimoto e cols., 1982). Fletcher (2007)
reconhece os lipossarcomas como o sarcoma mais comum de tecidos moles,
sendo responsável por pelo menos 20% de todos os sarcomas em adultos.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) (Fletcher e cols., 2002) divide
os lipossarcomas em cinco subtipos: lipossarcoma bem-diferenciado/tumor
lipomatoso atípico (LPS-BD/TLA), lipossarcoma desdiferenciado (LPS-DD),
lipossarcoma mixóide/células redondas (LPS-Mix/CR), lipossarcoma
pleomórfico (LPS-PL) e o lipossarcoma de tipo misto. Porém, conceitualmente
esses subtipos formam três grandes grupos com características histológicas,
biológicas, citogenéticas e moleculares distintas umas das outras: o grupo do
LPS-BD com ou sem desdiferenciação, o grupo do LPS-Mix com ou sem a
presença de células redondas e o grupo do LPS-PL (Snover e cols., 1982; Dei
Tos e cols., 2000b; Fletcher e cols., 2007; Weiss e Goldblum, 2008). Esses
grupos vão desde neoplasias com comportamento agressivo apenas local
(lipossarcoma bem-diferenciado), até sarcomas metastatizantes de alto grau
(lipossarcoma pleomórfico). Há uma grande tendência em se subclassificar
corretamente esses tumores, pois foi demonstrado que cada subtipo histológico
se traduz num grau e comportamento biológico específico, influenciando,
19
assim, na definição de tratamento e prognóstico do paciente (Kooby e cols.,
2004).
O LPS-BD / TLA e o lipossarcoma desdiferenciado formam um subgrupo
com comportamento biológico bem distinto. Apesar disso, eles têm uma
relação semelhante na sua patogênese molecular. Uma parte dos LPS-BD
progride histologicamente para outro sarcoma indiferenciado, fenômeno
chamado de desdiferenciação. A desdiferenciação confere um potencial
metastático a esses tumores. A sobrevida dos pacientes com tumores
desdiferenciados é baixa quando comparada com a dos tumores bem-
diferenciados (Dei Tos, 2000; Fletcher, 2007; Weiss e Goldblum, 2008).
O grupo do LPS-Mix/CR tem um espectro de diferenciação que vai
desde uma neoplasia puramente mixóide com poucas células fusiformes em
um extremo, até um tumor mixóide pouco diferenciado com muitas células
redondas (também chamado LPS-Mix pouco diferenciado) no outro. O LPS-PL
forma um subgrupo complexo, ainda pouco caracterizado, que não apresenta
uma alteração genética específica e é definido morfologicamente pela
identificação de lipoblastos pleomórficos bizarros dentro de um sarcoma
indiferenciado de alto grau (Dei Tos e cols., 2000; Weiss e Goldblum, 2008).
Além disso, há ainda um pequeno grupo de lipossarcomas que demonstram
características não usuais e/ou mostram misturas dos padrões dos outros
grupos de lipossarcomas descritos. Esses tumores híbridos com características
de mais de um grupo de LPS são descritos como lipossarcomas de tipo misto
(Fletcher e cols., 2002).
20
A maioria dos lipossarcomas se desenvolve nos tecidos moles profundos
das extremidades e retroperitônio, ao contrário de lipomas, que se localizam
nos tecidos moles superficiais (derma e hipoderma) do tronco (Fletcher, 2007).
Ao se considerar o diagnóstico de LPS-BD / TLA em tecidos superficiais, deve-
se sempre incluir no diagnóstico diferencial, as principais lesões mimetizantes
desse tumor nessa localização: lipoma de células fusiformes (LP-CF) e lipoma
pleomórfico (LP-PL). Existe ainda pouca evidência da transformação maligna
de um lipoma para lipossarcoma, principalmente pela marcada diferença de
localização desses tumores. Provavelmente os poucos casos de lipomas
descritos que sugerem essa transformação, sejam, na realidade, casos de
lipossarcoma onde a pouca amostragem do material original não levaram ao
diagnóstico de malignidade (Weiss e Goldblum, 2008). O diagnóstico de lipoma
no retroperitônio é considerado muito difícil e só deve ser realizado após
amostragem extensa e estudo molecular do tumor (Ida e cols., 2008). Os
lipossarcomas raramente ocorrem em crianças e o tumor de origem adipocítica
mais comum nessa faixa etária é o lipoblastoma, uma forma fetal de lipoma
(Weiss e Goldblum, 2008).
2.2 Lipossarcoma bem-diferenciado / tumor lipomatoso atípico
2.2.1 Definição e terminologia
O LPS-BD ou TLA é uma neoplasia mesenquimal maligna com
agressividade local constituída por uma proliferação de adipócitos atípicos com
grande variação de tamanho e com presença de atipias nucleares em células
estromais (Fletcher e cols., 2002). A presença de células estromais
21
hipercromáticas atípicas é o principal fator definidor do diagnóstico de LPS-BD.
A identificação de lipoblastos não é uma condição necessária para realizar o
diagnóstico morfológico do LPS-BD (Dei Tos e cols., 2000).
O uso do termo TLA geralmente é determinado pela localização do
tumor e sua ressecabilidade (Fletcher e cols., 2002). O fato de o LPS-BD não
ter potencial metastático sem antes sofrer desdiferenciação levou a introdução
de termos como lipoma atípico ou TLA (Evans, 1979) para tumores em locais
como extremidades e tronco. Nesses locais onde a cirurgia com margens de
ressecção livre é possível, o índice de recidiva é muito baixo. Sendo essa
cirurgia praticamente curativa, o emprego do termo sarcoma seria de muito
impacto para médicos e pacientes na visão de alguns autores (Evans e cols.,
2007).
Porém a aplicação dessa nova terminologia, para muitos, controversa,
gerou um potencial de confusão diagnóstica entre médicos (Weiss e cols.,
1992; Kindblom e cols., 1982; Evans e cols., 1988 e 2007). O LPS-BD e o TLA
representam lesões idênticas tanto na morfologia e cariótipo quanto em termos
de potencial biológico (Fletcher e cols., 2002). Por outro lado, em locais como
o retroperitônio e o mediastino, a ressecção de tumores com margens
cirúrgicas amplas é muito difícil. Nesses casos é comum ocorrer múltiplas
recorrências de difícil controle que levam a morte do paciente. Alguns autores
defendem o uso do termo LPS-BD nesses locais (Fletcher e cols., 2002). A
escolha da terminologia a ser usada (LPS-BD ou TLA) deve ser determinada,
principalmente, pelo grau de reciprocidade e entendimento entre o cirurgião e o
patologista para prevenir tratamento inadequado ou em excesso ao paciente
(Dei Tos e cols., 2000).
22
2.2.2 Epidemiologia e características clínicas
O grupo do LPS-BD constitui cerca de 40-45% de todos os
lipossarcomas, representando o maior subgrupo de neoplasias malignas de
origem adipocítica (Fletcher e cols., 2002 e 2007). Esse tumor geralmente se
apresenta em adultos e idosos, sendo o pico de incidência entre os 60 e 70
anos. Casos de LPS-BD em crianças são muito raros (Alaggio e cols., 2009).
Homens e mulheres são igualmente afetados, com exceção dos casos em que
o tumor ocorre no cordão espermático e região inguinal, os quais afetam mais
os homens (Enzinger e cols., 1962; Fletcher e cols., 2007; Weiss e Goldblum,
2008).
O LPS-BD aparece mais frequentemente nos tecidos moles profundos
das extremidades, principalmente na coxa; no retroperitônio, seguido da região
paratesticular e do mediastino (Fletcher e cols., 2007; Weiss e Goldblum,
2008). Nos estudos da AFIP e da Clínica Mayo, 75% dos casos se
desenvolveram nos tecidos profundos das extremidades e 20% no
retroperitônio, sendo os casos restantes divididos entre região inguinal, cordão
espermático e outros locais (Lucas e cols., 1994; Weiss, 1992). Também
podem se desenvolver no tecido celular subcutâneo e mais raramente na pele
e no parênquima de vísceras sólidas (Fletcher e cols., 2002).
Usualmente o LPS-BD se apresenta como uma massa profunda indolor
que lentamente aumenta de tamanho, atingindo grandes volumes. Lesões de
retroperitônio geralmente são assintomáticas até o tumor ultrapassar 20 cm de
diâmetro, sendo muitas vezes identificados ao acaso (Weiss e Goldblum,
2008).
23
2.2.3 Achados Macroscópicos
Na macroscopia o LPS-BD se apresenta como uma lesão multilobulada
grande com coloração mostrando várias tonalidades de amarelo-dourado até
esbranquiçado, dependendo da quantidade de tecido fibroso e/ou mixóide
presente (Fletcher e cols., 2002). Geralmente é circunscrito, mas um padrão
infiltrativo também pode ser encontrado. Muitas vezes mostram áreas
gelatinosas-mixóides, traves fibrosas e pontos de hemorragia (Weiss e
Goldblum, 2008). Em tumores grandes, áreas de necrose são comumente
encontradas.
Como na macroscopia o LPS-BD pode ser quase indistinguível de
lipomas benignos, o exame microscópico é essencial para o diagnóstico
diferencial (Laurino e cols., 2001). Ao examinar tumores adipocíticos grandes, a
inspeção cuidadosa e a amostragem extensa do tumor são fundamentais para
o reconhecimento específico dos vários subtipos de LPS. Um exemplo é a
identificação de uma área desdiferenciada pequena em um LPS-BD (Dei Tos,
2001).
2.2.4 Histopatologia
O LPS-BD pode ser dividido morfologicamente em quatro subtipos
segundo a OMS: adipocítico (lipoma-like), esclerosante, inflamatório e de
células fusiformes (Fletcher e cols., 2002). Na microscopia óptica o LPS-BD
adipocítico é constituído por uma proliferação de adipócitos maduros com
grande variação de tamanho. A presença de atipia e hipercromasia nuclear no
mínimo focal em adipócitos e células estromais compõem os achados
24
morfológicos definidores desse tumor. Frequentemente o diagnóstico do LPS-
BD lipoma-like se baseia apenas na identificação de células estromais atípicas
hipercromáticas ou multinucleadas (Dei Tos e cols., 2001). Essas células
estromais com atipias são mais numerosas nas regiões fibrosas e mixóides do
tumor.
Numa série de Evans (2007), os adipócitos se mostraram, na maioria
das vezes, grandes e monovacuolados; ocasionalmente, apresentaram células
multivacuoladas ou semelhantes às células de um hibernoma. A identificação
de lipoblastos, definidos pela presença de um ou mais vacúolos citoplasmáticos
causando saliência/endentação no núcleo hipercromático de um adipócito,
pode ser encontrada em número variável no LPS-BD adipocítico (Dei Tos,
2001).
O LPS-BD esclerosante é o segundo subtipo mais frequente de LPS-BD
(Fletcher e cols., 2002). Esse padrão é mais comum no retroperitônio e região
inguinal. Microscopicamente, sua histologia mostra células estromais atípicas
exibindo marcada hipercromasia nuclear; e raros lipoblastos multinucleados em
meio a um estroma colagenizado fibrilar. Tipicamente aparecem zonas de
fibrose densa alternadas com áreas de proliferação de adipócitos maduros.
Muitas vezes o componente fibroso pode predominar na neoplasia, o que pode
levar a não identificação das áreas lipogênicas no tumor se ele for pouco
amostrado (Laurino e cols., 2001; Fletcher e cols., 2002).
O lipossarcoma inflamatório é uma variante mais rara do LPS-BD (Kraus
e cols., 1997; Fletcher e cols., 2002). Sua localização mais comum é no
retroperitônio. Esse subtipo de LPS-BD se caracteriza pela presença de um
25
componente inflamatório crônico extenso com predomínio linfocitário que pode
obscurecer a origem adipocítica da neoplasia (Fletcher e cols., 2002). O seu
diagnóstico diferencial pode ser difícil, pois inclui lesões não-adipocíticas como
tumor miofibroblástico inflamatório, doença de Castleman e linfomas Hodgkin e
não-Hodgkin (Kraus e cols., 1997; Argani e cols., 1997). Nesses casos a
melhor pista para suspeitar de LPS-BD inflamatório é a identificação das
células estromais atípicas multinucleadas características do LPS-BD (Laurino e
cols., 2001; Fletcher e cols., 2002). Também é importante enfatizar que se
deve separar o LPS-BD inflamatório dos casos de LPS-PL, neoplasia que,
diferentemente do LPS-BD, se comporta como um sarcoma de alto grau. O
LPS-PL mostra um infiltrado inflamatório agudo rico em neutrófilos, além de
lipoblastos bizarros (Laurino e cols., 2001).
O último subtipo de LPS-BD é o de células fusiformes (Dei Tos e cols.,
1994), que é composto morfologicamente por uma proliferação de células
fusiformes brandas neural-like dentro de um estroma fibroso e/ou mixóide.
Associado a esse subtipo aparece um componente de LPS-BD adipocítico, que
usualmente inclui lipoblastos (Laurino e cols., 2001). Essa variante ocorre mais
em adultos e comumente envolve o tecido celular subcutâneo (Dei Tos e cols.,
1994; Nascimento, 1995). Essa neoplasia lipogênica não deve ser confundida
com um padrão de desdiferenciação de baixo grau que pode ser observado no
LPS-DD (Elgar e Goldblum, 1997).
Um achado raro que pode ser encontrado no LPS-BD é a presença de
diferenciação heteróloga (Weiss e Goldblum, 2008). A formação de tecido
ósseo metaplásico e o desenvolvimento de tecido muscular liso bem-
diferenciado e tecido muscular estriado podem ser observados no LPS-BD
26
(Laurino e cols., 2001; Fletcher e cols., 2002). Deve-se tomar cuidado ao se
estudar esses tumores, para se separar esse fenômeno da diferenciação
heteróloga que pode surgir no contexto de desdiferenciação (Suster e cols.,
1993).
2.2.5 Genética
2.2.5.1 Citogenética convencional
A análise de tumores mesenquimais com a integração da morfologia e
genética tem se mostrado muito útil em neoplasias adipocíticas (Fletcher e
cols., 1996 e 2002). A análise do cariótipo do LPS-BD mostra como
característica genética a presença de cromossomos marcadores gigantes e /
ou em anel supranumerários (Dal Cin e cols., 1993; Rosai e cols., 1996;
Fletcher e cols., 2002). Células neoplásicas contendo esses cromossomos
marcadores em anel e/ou gigantes podem ser vistas no mesmo tumor. Esses
achados podem estar ainda associados, algumas vezes, com algumas outras
anormalidades numéricas ou estruturais (Forus e cols., 2001; Mitelman e cols.,
2008).
Também é frequente a presença de associações teloméricas não-
randômicas, alterações que podem dar uma falsa impressão de complexidade
no cariótipo do LPS-BD (Mandahl e cols., 1998). A presença de cromossomos
supranumerários em anel não é absolutamente específica do LPS-BD/TLA,
pois já foi descrito em alguns casos de lipoma (Mandahl e cols., 1994;
Pedeutour e cols., 1999).
27
2.2.5.2 Citogenética molecular
Estudos com FISH e CGH mostraram que esses cromossomos gigantes
ou em anel supranumerários presentes no LPS-BD são compostos de
seqüências amplificadas intercaladas derivadas do cromossomo 12q14-15 (Dal
Cin e cols., 1993; Szymanska e cols., 1996). Outras regiões cromossômicas,
como 12q21-22 e 1q21-25, estão freqüentemente coamplificadas com 12q14-
15 (Mandahl e cols., 1994; Pedeutour e cols., 1994 e 1999; Suijkerbuijk e cols.,
1994; Nilsson e cols., 2004). A região 12q14-15 é complexa e contêm vários
proto-oncogenes como MDM2, CDK4, SAS, HMGA2 (HMGIC), GLI, CHOP
(DDIT3), OSI e OS9, os quais estão envolvidos na patologia molecular de
várias neoplasias (Rubin e Dal Cin, 2001; Alberts e cols., 2002).
Investigações usando FISH e Southern Blot mostraram que MDM2 está
constantemente amplificado nesses cromossomos marcadores, estando,
também, frequentemente acompanhado pela amplificação de genes vizinhos
como CDK4 e HMGA2 (Dei Tos e cols., 2000). O gene CHOP, localizado em
12q13 e envolvido na translocação t(12;16) e t(12;22) característica do LPS-
Mix/CR, e o gene GLI, com localização mais centromérica a 12q14-15, não
estão coamplificados no LPS-BD (Dei Tos e cols., 2000). A amplificação de
12q14-15 não é observada em lipomas, apesar de rearranjos nessa região
serem comuns nesses tumores (principalmente translocações de HMGA2)
(Schoenmakers e cols., 1995). A identificação dessa amplificação pode servir,
então, para distinguir o LPS-BD de outros tumores adipocíticos benignos
(Fletcher e cols., 2002). Em um estudo (Hostein e cols., 2004) usando reação
em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), foi demonstrado que os
níveis de amplificação de MDM2 e CDK4 podem ser usados com boa
28
sensibilidade e especificidade para separar o LPS-BD de lipomas. Outros
genes envolvidos na carcinogênese de vários tumores, como o TP53,
geralmente não sofrem mutações no LPS-BD (Pilotti e cols., 1997; Schneider-
Stock e cols., 1998).
Essas alterações sugerem, então, que o mecanismo de tumorigênese do
LPS-BD ocorre por um controle direto e indireto da proliferação celular. Os
genes MDM2 e CDK4 codificam as proteínas MDM2 e CDK4, que estão
diretamente envolvidas no controle do ciclo celular. Estas duas proteínas atuam
como reguladores positivos do ciclo celular no checkpoint entre as fases G1-S.
MDM2 inibe a ação da proteína P53 e o CDK4 regula, através de fosforilação, a
proteína supressora tumoral RB (ver item 2.5). O gene HMGA2 (envolvido na
diferenciação adipocítica) tem um efeito indireto para a estimulação da
proliferação celular, pois ele modifica a estrutura do DNA e facilita a formação
de complexos de transcrição, que são essenciais para a progressão do ciclo
celular (Hess, 1998).
2.2.6 Imunofenótipo
A imuno-histoquímica não tem grande destaque na caracterização e
diagnóstico do LPS-BD (Fletcher e cols., 2002). A sua aplicação fica restrita ao
uso da proteína S100, pois essa proteína usualmente mostra-se imunorreativa
em adipócitos e lipoblastos (Dei Tos e cols., 1996). A imunomarcação para a
proteína HMB-45 pode auxiliar no diagnóstico diferencial do LPS-BD com
angiomiolipomas, já que esses tumores ocasionalmente mimetizam
lipossarcomas (Fletcher e cols., 2002). Recentemente, se observou que a IHQ
29
pode identificar a superexpressão das proteínas MDM2 e CDK4, decorrentes
da amplificação de seus respectivos genes no LPS-BD (Dei Tos, 2000; Pilotti e
cols., 2000). A possibilidade de essa positividade estar restrita apenas ao LPS-
BD, sendo negativa em lipomas, faz da imuno-histoquímica um potencial aliado
no diagnóstico diferencial de tumores que se confundem com o LPS-BD (Binh e
cols., 2005).
Outra aplicação potencial seria o uso da IHQ para MDM2 e CDK4 em
material de biópsia incisional ou em tumores pouco amostrados (Brimo e cols.,
2008). Em um estudo recente (Binh e cols., 2005), a sensibilidade e a
especificidade da IHQ para MDM2 e CDK4 na identificação do LPS-BD e LPS-
DD entre outros tumores de tecidos moles foi de 97% e 92%, e 83% e 95%,
respectivamente. Outro estudo (Sirvent e cols., 2007) achou sensibilidade e
especificidade de MDM2 e CDK4 de 80% e 87%, e 93% e 100%,
respectivamente.
2.2.7 Diagnóstico Diferencial
Uma série de lesões neoplásicas e não-neoplásicas entra no diagnóstico
diferencial do LPS-BD / TLA. Alguns tipos especiais de lipoma e lipomas com
características degenerativas podem ser quase indistinguíveis do LPS-BD. O
tecido adiposo maduro normal é constituído por células esféricas com vacúolo
lipídico único que desloca o núcleo da célula para sua periferia. Esse núcleo é
geralmente pequeno, podendo, muitas vezes, nem ser perceptível. O chamado
efeito lockern frequentemente confunde patologistas inexperientes. Esse efeito
aparece como um vacúolo central no núcleo de adipócitos e acontece quando
30
um corte histológico atinge um adipócito no núcleo. Essas células com lockern
são muitas vezes confundidas com lipoblastos. Núcleos com lockern aparecem
em cortes espessos e podem, muitas vezes, ser interpretados erroneamente
como uma diferenciação lipoblástica e consequentemente como um
lipossarcoma (Weiss e Goldblum, 2008).
Em áreas de esteatonecrose, adipócitos adjacentes às células
necrosadas tornam-se atróficos e mostram infiltração de células inflamatórias e
muitos histiócitos vacuolados, que podem simular lipoblastos (Fletcher, 2007).
Esses histiócitos, diferentemente de lipoblastos, apresentam núcleos ovalados
sem endentação pelos vacúolos citoplasmáticos. A atrofia adiposa causa perda
do lipídio intracelular e diminui o tamanho do adipócito. Isso o transforma em
uma célula com forma mais epitelióide e torna o seu núcleo proeminente,
ficando a célula semelhante a um lipoblasto. Desnutrição e trauma geralmente
causam atrofia adiposa (Weiss e Goldblum, 2008). Lipomas intramusculares se
desenvolvem no tecido muscular esquelético e, muitas vezes, causam atrofia
de fibras musculares que se tornam degeneradas. Essas fibras degeneradas
mostram núcleos hipercromáticos e escasso citoplasma, lembrando uma célula
atípica de sarcoma. Quando é difícil a identificação desse fenômeno, a IHQ
para desmina pode ser feita para se determinar a natureza dessas células.
Além disso, cortes de tecido adiposo muito espesso podem causar uma falsa
aparência de hipercromasia nuclear que imita as células estromais atípicas do
LPS-BD (Weiss e Goldblum, 2008).
O linfedema massivo localizado que ocorre nas extremidades proximais
de pessoas obesas pode simular clínica e morfologicamente o LPS-BD-TLA
(Farshid e Weiss, 1998), principalmente quando agravado por fatores como
31
linfadenectomia. Na microscopia, apresenta tecido adiposo com espessamento
de septos conjuntivos e células estromais com fibroblastos levemente atípicos,
imitando o LPS-BD. Essas são as mesmas alterações do linfedema crônico que
incluem, ainda, espessamento da pele, fibrose do derma, expansão de septos
conjuntivos e ectasia e proliferação de linfáticos (às vezes formando cistos)
(Weiss e Goldblum, 2008).
A injeção de silicone e vários outros polímeros para uso terapêutico ou
por cosmética (Dadzie e cols., 2008) pode produzir uma reação inflamatória
com infiltração difusa de histiócitos multivacuolados distendidos de vários
tamanhos, incrivelmente semelhantes a lipoblastos. A presença de tamanha
infiltração de lipoblastos raramente acontece em lipossarcomas e a maioria das
reações por silicone ocorre junto a próteses mamárias.
Dentre as neoplasias adipocíticas, o LP-PL e o LP-CF podem ser difíceis
de distinguir do LPS-BD esclerosante e do LPS-BD de células fusiformes,
respectivamente. O LP-PL é um tumor circunscrito, de pequenas dimensões,
muito comum na região de cabeça e pescoço e ombro (Fletcher e cols., 2002).
A presença das células multinucleadas e atípicas “em florete” características do
LP-PL podem também aparecer no LPS-BD, causando uma enorme dificuldade
no diagnostico diferencial (Dei Tos, 2001). Uma característica presente no LP-
PL e não no LPS-BD é a presença de pequenas fibras colágenas tortuosas em
cordões, que auxiliam muito no seu diagnostico (Weiss e Goldblum, 2008). O
LPS de células fusiformes caracteriza-se por uma proliferação de células
fusiformes brandas em meio a tecido adiposo maduro com presença de alguns
raros lipoblastos, semelhante ao que ocorre no LP-CF. Ao contrário do LP-PL e
do LP-CF, que coram forte e difusamente suas células com o CD34, os LPS
32
coram apenas algumas células com esse marcador (Fletcher, 2007). Nos casos
difíceis onde nenhuma característica for suficiente para o diagnóstico
diferencial, o estudo molecular para identificação das alterações citogenéticas
específicas de cada grupo de tumores pode ser de extrema importância (Weiss
e Goldblum, 2008).
2.2.8 Prognóstico
O fator prognóstico mais importante no LPS-BD/TLA é sua localização
anatômica (Fletcher e cols., 2002; Evans, 2007). Esse aspecto prognóstico
influencia principalmente nas taxas de recorrência local e mortalidade
relacionada à doença. O LPS-BD é um tumor não metastatizante geralmente
atribuído grau 1 ou baixo grau nos vários esquemas de graduação de
sarcomas (Fletcher e cols., 2002). Tumores de extremidades têm taxas de
recorrência significativamente menores que tumores originados em
localizações anatômicas profundas, principalmente no retroperitônio e,
também, no cordão espermático e mediastino (Evans e cols., 1979; Lucas e
cols., 1994). Esses tumores profundos tendem a recidivar repetidamente e
podem levar o paciente a morte por falta de controle dos efeitos locais, ou por
uma desdiferenciação (progressão tumoral) e conseqüente metástase da
neoplasia. Weiss e cols. (1994) referiram uma taxa de recorrência de 43% para
neoplasias de extremidades e 91% e 79% para tumores originados no
retroperitônio e região inguinal, respectivamente.
O risco de desdiferenciação varia de acordo com a localização e
duração da doença e fica entre 15-20% para lesões de retroperitônio e 5% para
33
lesões de extremidades (Weiss e Goldblum, 2008). Apesar de esse fenômeno
ser mais freqüente nas lesões de retroperitônio (lesão considerada incurável
por muitos), ele pode ocorrer também nas lesões profundas das extremidades
e mais raramente nos tumores subcutâneos (Fletcher, 2007). Em casos de
LPS-BD que foram acompanhados longitudinalmente, a desdiferenciação
ocorreu em média depois de 7-8 anos, podendo chegar a 20 anos do
diagnóstico inicial (Lucas e cols., 1994; Weiss e Rao, 1992). A mortalidade
geral para lesões de extremidades é praticamente zero, podendo subir para
mais de 80% nas lesões de retroperitônio se os pacientes forem
acompanhados por 10-20 anos (Fletcher e cols., 2002).
2.3 Lipossarcoma desdiferenciado
2.3.1 Definição e terminologia
O termo LPS-DD se refere ao desenvolvimento de um sarcoma não
lipogênico geralmente de alto grau adjacente a um LPS-BD. Também se refere
ao aparecimento de um sarcoma não lipogênico de alto grau em um local de
ressecção prévia de um LPS-BD, contando que esse local não tenha sido
tratado com radioterapia para tratamento do tumor primário (Evans, 1979;
Henricks e cols., 1997; Nascimento, 1998). A desdiferenciação é considerada
um fenômeno tempo dependente; contudo, a maioria (80 a 90%) desses
tumores ocorre primariamente “de novo”. O aparecimento secundário é
responsável por aproximadamente 10% dos casos e está relacionado com
casos de LPS-BD que tiveram múltiplas recidivas (Henricks e cols., 1997;
McCormick e cols., 1998; Lucas e cols., 1994).
34
Os termos desdiferenciação tumoral e progressão histológica foram
adotados por patologistas para designar um fenômeno onde neoplasias
malignas de baixo grau, caracterizadas morfologicamente por uma aparência
microscópica bem-diferenciada, sofrem uma inesperada mudança na
histologia, resultando na formação de componente com morfologia pouco
diferenciada ou indiferenciada. Essa progressão histológica (tumoral) foi
observada por Dahlin (1971) como uma complicação tardia na história natural
do condrossarcoma bem-diferenciado. O fenômeno de desdiferenciação ou
progressão histológica seria caracterizado então pela identificação
microscópica de dois componentes celulares, um bem-diferenciado e outro
indiferenciado, lado a lado, formando um padrão bifásico num mesmo tumor.
Nesse componente desdiferenciado (ou indiferenciado), seja de alto ou baixo
grau, não deve haver nenhuma evidência morfológica de diferenciação para a
neoplasia que lhe deu origem, ou seja, a porção desdiferenciada de um
lipossarcoma não deve mostrar nenhum sinal de diferenciação lipogênica. Além
disso, com a identificação desse padrão deve-se observar uma piora no na
evolução clínica (prognóstico) do paciente (Dahlin e Beabout, 1971; Meiss,
1991).
2.3.2 Epidemiologia e características clínicas
O LPS-DD é observado mais frequentemente entre os 60 aos 70 anos
de vida, mas pode aparecer em qualquer idade. Predomina um pouco mais em
homens (Henricks e cols., 1997 e McCormick e cols., 1998). Esse tumor não foi
diagnosticado em crianças e o paciente mais novo de uma série grande tinha
35
21 anos de idade (Lucas e cols., 1994). O local mais comum de apresentação é
intra-abdominal (75%), incluindo aí o retroperitônio, a cavidade peritoneal, a
pelve e o cordão espermático. Também se desenvolvem nos tecidos profundos
das extremidades (15%) e no tronco (7%). Mais raramente aparecem no tecido
celular subcutâneo, vísceras e região de cabeça e pescoço (Lucas e cols.,
1994; Henricks e cols., 1997 e McCormick e cols., 1998). LPS-DD secundários
são menos comuns que os casos primários e são diagnosticados numa média
de 6-7 anos depois da ressecção inicial de um LPS-BD (Lucas e cols., 1994).
Lipossarcomas com áreas desdiferenciadas de alto grau, lembrando
histiocitoma fibroso maligno, estão associados com o aparecimento de reação
leucemóide no sangue (Hisaoka e cols., 1997).
2.3.3 Achados Macroscópicos
O exame macroscópico do LPS-DD revela um tumor grande multinodular
e lobulado. O aspecto da superfície de corte do tumor depende da quantidade
(proporção) de componente bem-diferenciado e desdiferenciado presente na
neoplasia. Nos tumores onde o componente desdiferenciado predomina, o
aspecto macroscópico é semelhante ao de um sarcoma de alto grau, com
áreas carnosas, cinzento-pardas e brilhantes. Tumores de grande volume
apresentam áreas degeneradas friáveis, necróticas e/ou de hemorragia
(Nascimento, 2001). A parte bem-diferenciada do tumor mostra macroscopia
semelhante ao LPS-BD (ver item 2.2.3) (Weiss e Goldblum, 2008).
36
2.3.4 Histopatologia
A desdiferenciação é caracterizada histologicamente quando se
identifica uma transição abrupta da morfologia de um LPS-BD para outro tipo
de sarcoma não-lipogênico com morfologia de alto ou baixo grau (Fletcher e
cols., 2002). Em alguns casos essa transição pode ser mais gradual, com
aumento gradativo da celularidade e atipia (Lucas e cols., 1994), podendo
apresentar o componente de alto grau intrincado junto ao LPS-BD, num padrão
lembrando um mosaico (Henricks e cols., 1997). A área desdiferenciada tem
morfologia variável e pode comprometer desde uma pequena fração do tumor
até a sua maior parte, sendo muitas vezes a identificação do componente bem-
diferenciado muito difícil. Por isso é essencial uma grande amostragem dos
tumores suspeitos de ser LPS-DD e de todos que entram no seu diagnóstico
diferencial.
O fenótipo mais freqüente (90%) mostrado pelo LPS-DD segundo Weiss
e Goldblum (2008) é o de um sarcoma indiferenciado pleomórfico de alto grau
(histiocitoma fibroso maligno-like) ou fibrossarcoma de alto grau. Essas áreas
semelhantes ao histiocitoma fibroso maligno podem mostrar seus vários
subtipos na área desdiferenciada, incluindo o padrão clássico do tipo
estoriforme, pleomórfico e mixóide (mixofibrossarcoma). Também podem
ocorrer formas menos comuns como a de células gigantes ou do tipo
inflamatória (Kuhnen e cols., 2005, Weiss e Goldblum, 2008). Estudos
investigando o perfil genômico e o status de MDM2/CDK4 (ver item 2.3.5)
sugeriram que a maioria dos tumores de retroperitônio diagnosticados como
HFM e os chamados HFM inflamatórios são, na realidade, lipossarcomas
desdiferenciados (Coindre e cols., 2003 e 2004).
37
Outros padrões histológicos observados com menos freqüência nas
áreas desdiferenciadas incluem tumores com presença de células grandes
indiferenciadas semelhantes a carcinoma ou melanoma, áreas
hemangiopericitoma-like, com fibras amiantóides (Henricks e cols., 1997) ou
com células fusiformes formando estruturas arredondadas neural-like ou
menigotelial-like (Nascimento e cols., 1998; Fanburg-Smith e Miettinen, 1998).
A diferenciação heteróloga ocorre em cerca de 10% dos casos de LPS-DD e
pode ser rabdomiossarcomatosa, leiomiossarcomatosa,
osteocondrossarcomatosa e angiossarcomatosa (Evans e cols., 1994; Lucas e
cols., 1994; Henricks e cols., 1997).
Originalmente, Evans (1979) definiu a área de desdiferenciação com
uma morfologia de alto grau, entretanto, a presença e o significado de áreas
desdiferenciadas de baixo grau semelhantes à fibrossarcoma de baixo grau ou
fibromatoses têm sido cada vez mais reconhecidos (Elgar e Goldblum, 1997;
Henricks e cols., 1997). Essas áreas mostram proliferação de células
fusiformes fibroblásticas com mínima atipia nuclear, arranjadas em um padrão
fascicular, com celularidade intermediária entre um LPS-BD esclerosante e
uma lesão fusocelular de alto grau. A desdiferenciação de baixo grau não deve
ser confundida com um LPS-BD de células fusiformes, lesão que mostra
lipoblastos e adipócitos atípicos. Áreas desdiferenciadas tanto de baixo grau
quanto de alto grau são, por definição, não-lipogênicas (Dei Tos e cols., 1994;
Fletcher e cols., 2002).
Esse conceito de desdiferenciação de baixo grau ainda é considerado
para alguns autores arbitrário e subjetivo (Nascimento, 2001). Segundo Evans
(2007), essas áreas devem apresentar mais de cinco mitoses por dez campos
38
de grande aumento para serem chamadas de desdiferenciadas. Os que não
preenchem esse critério seriam, então, considerados exemplos de tumor
lipomatoso atípico celular. Destacam-se, ainda, casos de LPS-DD com recidiva
local apresentando um componente inteiramente de morfologia bem-
diferenciada (Weiss e cols., 1992; McCormick e cols., 1994).
2.3.5 Genética
2.3.5.1 Citogenética convencional
Assim como o LPS-BD/TLA, o LPS-DD mostra cromossomos
marcadores gigantes e/ou em anel supranumerários (Fletcher e cols., 1996;
Rosai e cols., 1996; Szymanska e cols., 1996; Pilotti e cols., 1997; Mertens e
cols., 1998; Gisselsson e cols., 1999; Sirvent e cols., 2000; Meis-Kindblom e
cols., 2001). Esse achado é consistente com a classificação morfológica do
LPS-DD, definida pela presença de uma transição de um LPS-BD para um
sarcoma não-lipogênico de grau variável. A presença de múltiplos clones
dentro do mesmo tumor, apresentando um ou mais cromossomos
supranumerários marcadores em anel ou gigante, foi observada em alguns
casos de LPS-DD e pode sugerir uma diferença entre o LPS-DD e o LPS-BD
(Mertens e cols., 1998; Meis-Kindblom e cols., 2001).
39
2.3.5.2 Citogenética molecular
A análise por FISH e CGH revelou que o LPS-DD apresenta amplicons
de 12q14-15, assim como o LPS-BD, nos seus cromossomos marcadores.
Com menos frequência, outras regiões cromossômicas podem estar
coamplificadas (Dei Tos e cols., 1997; Schneider-Stock e cols., 1998; Pilotti e
cols., 2000). A maioria dos LPS-DD também apresenta amplificação dos genes
MDM2 e CDK4 (Pilotti e cols., 2000; Schneider-Stock e cols., 1998; Binh e
cols., 2005; Sirvent e cols., 2007). Essas anomalias citogenéticas são idênticas
ao dos LPS-BD/TLA e, também, bem diferentes das mutações genéticas
complexas do LPS-PL (Fletcher e cols., 1996). Pode, ainda, ocorrer alguma
variabilidade na expressão de MDM2 no LPS-DD relacionada à sua localização
anatômica e outras aberrações genéticas adicionais (Mertens e cols., 1998;
Pilotti cols., 2000). Mutações adicionais nos genes TP53 e RB1 podem estar
relacionadas com a progressão tumoral nesse subtipo de sarcoma (Dei Tos e
cols., 1997; Schneider-Stock e cols., 1998; Pilotti e cols., 2000).
Um estudo de Coindre e cols. (2003) demonstrou, através de CGH, que
a maioria dos tumores diagnosticados como HFM no retroperitônio são, na
verdade, LPS-DD. Nesse estudo, de vinte e cinco tumores estudados,
dezessete foram reclassificados como LPS-DD (Coindre e cols., 2003). Todos
esses casos apresentaram amplificação de MDM2 e CDK4 e, após revisão, a
maioria demonstrou pelo menos um foco de LPS-BD não identificado
previamente.
40
2.3.6 Imunofenótipo
A imuno-histoquímica permite o diagnóstico diferencial com outros
tumores e o reconhecimento de diferenciação heteróloga dentro de um LPS-DD
(Fletcher e cols., 2002). A imunoexpressão de MDM2 e CDK4 é característica
do LPS-DD e, apesar de não totalmente específica, pode ser útil no diagnóstico
diferencial com outros sarcomas pleomórficos (Coindre e cols., 2003 e 2004;
Binh e cols., 2005; Sirvent e cols., 2007). Recentemente foi identificado que a
imunoexpressão do receptor hormonal nuclear PPAR-γ (peroxisome
proliferator-activated receptor gamma), responsável pela diferenciação
adipocítica, mantém-se expressada no componente desdiferenciado do LPS-
DD (Horvai e cols., 2008). Esse marcador poderia, então, ser usado junto com
MDM2 e CDK4 para auxiliar no estabelecimento do diagnóstico de LPS-DD
(Horvai e cols., 2008).
2.3.7 Diagnóstico Diferencial
Entre os problemas para se diagnosticar o LPS-DD encontram-se a
diferenciação de outros sarcomas de alto e baixo grau e a distinção entre um
LPS-DD e um SIP infiltrando tecido adiposo. Para o último, é recomendada
uma amostragem extensa do tumor e a identificação clara de um componente
bem-diferenciado um pouco distante da área desdiferenciada. A avaliação do
SIP de alto grau na interface com o tecido adiposo normal pode ser de extrema
dificuldade quando este tumor indiferenciado infiltra o adiposo, já que pode se
parecer muito com um LPS-DD. A avaliação desses sarcomas de alto grau
apenas nessa interface pode ter baixo valor para o diagnóstico de LPS-DD
41
(Weiss e Goldblum, 2008). O recomendado é a identificação de uma área de
LPS-BD um pouco mais distante do sarcoma pleomórfico para estabelecer o
diagnóstico do LPS-DD. Outro problema que pode acontecer no diagnóstico do
LPS-DD é a identificação de um foco pequeno de desdiferenciação dentro do
LPS-BD. Segundo Weiss e Goldblum (2008), até tumores com pequenas áreas
de desdiferenciação (entre 1-3 cm) estão associados com piora do curso clínico
dos pacientes.
Atualmente, dois fatores levaram a uma mudança na maneira de se
examinar e estudar tumores pleomórficos, principalmente no retroperitônio.
Primeiro, foi a identificação de que um grande número de tumores de
retroperitônio, classificados como HFM e mixofibrossarcoma, são, na realidade
de LPS-DD (Coindre e cols., 2003 e 2004). Segundo, alguns estudos
identificaram um prognóstico melhor para o LPS-DD quando comparado com
outros sarcomas de retroperitônio, como leiomiossarcoma ou SIP (McCormick
e cols., 1994; Henricks e cols., 1997).
O diagnóstico de LPS-DD se tornou, então, um desafio e também um
problema, já que em casos onde a amostra tumoral é muito pequena (casos
mal amostrados ou biópsias incisionais) a chance de não se identificar o
componente de LPS-BD é muito grande. Associa-se a isso a evidência de que
o prognóstico do LPS-DD independe do grau histológico do componente
desdiferenciado, já que lesões fusocelulares de baixo grau, semelhante à
fibromatoses, mostram um potencial metastático (Henricks e cols., 1997).
42
2.3.8 Prognóstico
O LPS-DD tende a recorrer em cerca de 40% dos casos. Entretanto, em
locais de difícil tratamento como o retroperitônio, a recidiva pode chegar a
100% dos casos se estes forem acompanhados por longos períodos (10-20
anos) (Fletcher e cols., 2002). A possibilidade de metástase pode chegar a
20% dos casos. A mortalidade geral atinge 30% em cinco anos e aumenta com
o acompanhamento maior dos casos (Weiss e cols., 1992; McCormick e cols.,
1994, Henricks e cols., 1997; Fletcher e cols., 2002). A localização anatômica é
o fator prognóstico mais importante nesse tumor, já que em locais não
passíveis de ressecção total com margens amplas, como o retroperitônio, exibe
pior comportamento clínico (Weiss e Goldblum, 2008).
O tamanho (quantidade) e o grau histológico da área desdiferenciada
não parecem alterar a história natural da neoplasia lipomatosa desdiferenciada
(Elgar e cols., 1997; Henricks e cols., 1997). Surpreendentemente, apesar de a
maioria dos LPS-DD apresentar uma morfologia de alto grau, eles exibem um
comportamento clínico menos agressivo do que outros sarcomas pleomórficos
de alto grau (McComnick e cols., 1994; Fletcher e cols., 2002). Uma possível
explicação para essa discrepância entre a morfologia e a evolução clínica
desses tumores pode ser a não identificação de cariótipos complexos no LPS-
DD, muito observado em outros sarcomas de alto grau. Mutações no gene
TP53 ocorrem na maioria dos casos de LPS-DD, mas sua influência no
prognóstico dos pacientes não foi demonstrada (Cordon-Cardo e cols., 1994;
Dei Tos e cols., 1997).
43
2.4 Murine Double Minute Clone 2 (MDM2)
2.4.1 O Ciclo celular e MDM2
MDM2 (transformed mouse 3T3 cell double minute 2, p53 binding
protein, murine double minute clone 2) é uma proteína de 90 kilodaltons (Kda)
constituída por 491 aminoácidos e é codificada pelo gene MDM2 localizado no
braço longo do cromossomo 12 (12q15). Essa proteína é encontrada
principalmente no núcleo, mas também no citoplasma de todas as células
(Duan e Villalona-Calero, 2006).
MDM2 exerce funções de ubiquitina E3 ligase, marcando a proteína P53
para exportação ao citoplasma e degradação pelo complexo de proteínas do
proteassomo (Haupt e cols., 1997). O P53 é um fator de transcrição nuclear
que regula a transcrição do DNA, parando o ciclo celular na fase G1 se o DNA
apresentar algum tipo dano, sendo considerado o guardião do genoma (Lane,
1992; Efeyan e Serrano, 2007). A transcrição de MDM2 é alvo também da
atuação do P53, isto é, a atividade da proteína P53 controla a expressão e o
nível da proteína MDM2, seu próprio regulador negativo, formando, assim, um
feedback regulatório negativo (Momand e cols., 2000). O MDM2 também
parece ajudar na degradação da proteína RB, outra proteína que funciona
como um supressor tumoral (Duan e Villalona-Calero, 2006).
44
2.4.2 Alterações de MDM2 no câncer
O gene Murine Double Minute Clone 2 (MDM2) foi originalmente clonado
de cromossomos acêntricos chamados “double minutes”, advindos de uma
linhagem celular de Balb/c3T3 designada 3T3DM (Cahilly-Snyder e cols.,
1987). Esses cromossomos anormais freqüentemente contêm genes
amplificados que contribuem para proliferação celular e tumorigênese. A
primeira sugestão que MDM2 fosse um oncogene foi observada por
Fakharzadeh e cols. (1991), após amplificarem um clone genômico de MDM2
em células de roedores e, em seguida, injetarem em ratos atímicos conferindo-
lhes um potencial tumorigênico aumentado.
Ao estudar proteínas ligadas à proteína supressora tumoral P53,
Momand e cols. (1992) isolaram uma proteína de 90 kDa que foi identificada
como sendo o produto do gene MDM2. Foi ainda observado que o aumento da
expressão do gene MDM2 bloqueava a transativação de outros genes
mediados pelo TP53. Com isso, a inativação da proteína P53 foi estabelecida
como um mecanismo oncogênico mediado pelo MDM2 (Momand e cols, 1992).
O homólogo humano de MDM2 foi mapeado no cromossomo 12q15 e foi
observado sua amplificação em osteossarcomas e outros tumores de tecidos
moles (Oliner e cols., 1992). Esse novo oncogene foi então descoberto, um
mecanismo de ação foi proposto e seu envolvimento no câncer humano foi
identificado (Momand e cols., 2000).
Atualmente, o aumento da expressão de MDM2, causado principalmente
por amplificação gênica, é considerado um fator essencial na tumorigênese de
neoplasias humanas (Momand e cols., 2000). Alterações de MDM2 já foram
45
implicadas em tumores de tecidos moles, carcinomas de esôfago e linfomas
(Watanabe e cols., 1996; Momand e cols., 1998; Sandberg, 2002).
2.5 Cyclin Dependent Kinase 4 (CDK4)
2.5.1 O Ciclo celular e CDK4
O gene CDK4 (cyclin-dependent kinase 4) está localizado no braço
longo do cromossomo 12 (12q14) e codifica a proteína CDK4 constituída por
303 aminoácidos e com peso molecular de aproximadamente 33.7 kDa
(Molven, 2007). Na fase inicial de G1 do ciclo celular, a proteína RB é inativada
por fosforilação, que é mediada por várias proteínas kinase ciclina dependentes
(CDK), principalmente as proteínas CDK4 e CDK6.
A proteína CDK4 é uma subunidade catalítica de uma proteína kinase
serina-treonina heterodimérica envolvida na progressão do ciclo celular na fase
G1 (Ortega e cols., 2002). A presença de ciclinas do tipo-D (destaca-se a
ciclina-D1) possibilita a formação de complexos CDK4/CDK6-ciclina D1 ativos
que inativam a RB. Isso resulta na ativação dos fatores de transcrição E2F,
responsáveis pela síntese de novas proteínas que levam o ciclo celular adiante,
passando pelo ponto de restrição de G1, até a fase final da transição G1-S.
Essas ciclinas do tipo D, que são o principal alvo downstream de várias
vias de sinalização extracelular, são as principais reguladoras da proteína
CDK4. Além disso, esse complexo CDK4/CDK6/CICLINA-D1 se liga a
proteínas inibidoras do ciclo celular da família Cip/Kip, que têm como função
46
inibir a atividade do complexo formado por CDK2/CICLINA-E. Esse complexo é
sintetizado por proteínas E2F e é responsável pela evolução G1-S em sua fase
tardia. A atividade da CDK4 é regulada, também, pela família de proteínas
inibidoras do ciclo celular INK4, principalmente o P16 (INK4A), que impede a
formação do complexo CDK4/CDK6/CICLINA-D1 (Ortega e cols., 2002).
2.5.2 Alterações de CDK4 no câncer
A via CDK4/CDK6/ciclina-D1/INK4/pRB é uma das mais mutadas em
cânceres humanos (Malumbres e Barbacid, 2001). O gene CDK4 está
amplificado e superexpressado em várias neoplasias, incluindo gliomas (Perry
e cols., 1999), sarcomas, carcinomas mamários e da cérvice uterina
(Malumbres e Barbacid, 2001). Os sarcomas freqüentemente apresentam co-
amplificação de MDM2 junto com CDK4, já que têm localização muito próxima
na região do cromossomo 12q13-15. Dei Tos e cols. (2000) descreveram a
constante amplificação e expressão dos genes MDM2, CDK4 e HMGA2 em
neoplasias adipocíticas bem-diferenciadas (LPS-BD). Algumas mutações
pontuais em CDK4 e CDK6 foram descritas em linhagens celulares tumorais de
melanoma e neuroblastoma (Easton e cols., 1998). Essas alterações genéticas
no gene CDK4, quando presentes em células tumorais, desregulam a atividade
da proteína CDK4 porque previnem a ligação de suas proteínas reguladoras,
as proteínas do grupo INK4 (Ranade e cols., 1995). O envolvimento de
inibidores das CDK (INK4A e INK4B), localizados na região do cromossomo
9q21, podem ocorrer por vários tipos de mutações como perda de
heterozigosidade, alterações epigenéticas e, principalmente, por deleções
47
(Ruas e Peters, 1998). Esses eventos já foram descritos em melanomas,
gliomas e tumores de bexiga, pancreáticos, pulmonares e de cabeça e pescoço
(Ortega e cols., 2002).
Os níveis adequados de CDK4 (e também CDK6) podem ser afetados
por mutações envolvendo também as ciclinas do tipo D. A amplificação é a
principal alteração encontrada para o aumento da expressão da proteína
CICLINA-D1 em tumores de mama, esofágicos, colorretais, pulmonares e de
cabeça e pescoço (Donnellan e Chetty, 1998). Existem, também, casos de
translocações com rearranjos cromossômicos que posicionam seqüências
reguladoras mais próximas de seqüências codificadoras do gene CICLINA-D1,
levando a um aumento na expressão. Esse mecanismo de aumento de
expressão foi descrito em linfomas do manto e adenomas de paratireóide
(Donnellan e Chetty, 1998; Lee e cols., 2000). A CICLINA-D1 também é um
alvo downstream de estimulação oncogênica mediado por tirosinas kinases
como HER2, oncogenes RAS e a β-CATENINA (Robles e cols., 1998; Tetsu e
McCormick, 1999).
48
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57
4. Objetivos
4.1 Geral:
- Avaliar a sensibilidade e especificidade da expressão positiva das
proteínas MDM2 e CDK4 por imuno-histoquímica para estabelecer o
diagnóstico de lipossarcoma bem-diferenciado/tumor lipomatoso atípico e
lipossarcoma desdiferenciado.
4.2 Específicos:
- Realizar imuno-histoquímica para as proteínas MDM2 e CDK4 numa
série de tumores mesenquimais de tecido moles.
- Determinar a sensibilidade, especificidade e valores preditivos do teste
de imuno-histoquímica para MDM2 e CDK4 para identificar LPS-BD/TLA e
LPS-DD entre outras neoplasias mesenquimais.
- Determinar a acurácia do teste de imuno-histoquímica para MDM2 e
CDK4 para estabelecer o diagnóstico de LPS-BD e LPS-DD.
- Avaliar o poder do teste de imuno-histoquímica para MDM2 e CDK4 no
diagnóstico de LPS-BD/LPS-DD, calculando o valor de kappa (k) e índice de
Youden (J).
- Determinar um padrão de coloração para caracterizar o nível de
expressão das proteínas através da contagem porcentual de células
imunorreativas.
58
MDM2 and CDK4 in the diagnosis of well-differentiated
liposarcoma/atypical lipomatous tumor and dedifferentiated liposarcoma:
an immunohistochemical study on 129 soft tissue tumors.
Aleixo PB
1
, Hartmann AA
2
, Menezes IC
3
, Meurer R
4
, Oliveira AM
5
1 – M.D., Post-graduation Program, UFCSPA, Porto Alegre, Brazil.
2 – Ph.D., Assistant Professor in Pathology, UFSCPA, Porto Alegre, Brazil.
3 – Grad., Faculty of Biomedicine, UFCSPA, Porto Alegre, Brazil.
4 – M.Sc., Pathology Research Laboratory, UFCSPA, Porto Alegre, Brazil.
5 – M.D., Department of Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA.
59
Abstract
Benign and malignant adipose tissue tumors are among the most
common surgical tissue specimens to arrive in most busy pathology
laboratories. Well-differentiated liposarcoma (WDLPS) is the most frequent
subtype of liposarcoma and can be confused histologically with several types of
lipomas. Dedifferentiated liposarcoma (DDLPS) is a tumor composed by an
undifferentiated non-lipogenic sarcoma juxtaposed to a WDLPS. In many cases
DDLPS can be confused with other high grade sarcomas when its WDLPS
component is not identified. WDLPS and DDLPS were shown to have ring
and/or giant marker chromosomes that contain amplified sequences of the
MDM2 and CDK4 genes. Corresponding proteins, MDM2 and CDK4, were
demonstrated to be overexpressed in these tumors and immunohistochemistry
(IHC) was suggested as a reliable method to detect this characteristic in
WDLPS and DDLPS. In order evaluate further clinical application in the
histopathological diagnosis of WDLPS and DDLPS, this study performed IHC to
investigate MDM2 and CDK4 expression in a series of 129 paraffin-embedded
lipomatous and non-lipomatous soft tissue tumors. The cases were divided in
four groups of study: WDLPS (n=19), DDLPS (n=10), benign adipocytic tumors
(n=17) and other mesenquimal tumors (n=83). IHC results were compared in
each group to determine sensitivity and specificity of positive testing to identify
WDLPS and DDLPS. A percentage of tumor cell positivity was determined to
better characterize the pattern of tumor staining. The sensitivity and specificity
of positive MDM2 and CDK4 immunostainings to identify WDLPS/ALT among
several types of lipomas was 100% and 58,8%, and 68,4% and 88,2%,
respectively. When trying to distinguish DDLPS from other mesenquimal
60
tumors, sensitivity and specificity of MDM2 and CDK4 was 90% and 65%, and
70% and 96,3%, respectively. In both situations the best specificity was
achieved when a case was considered positive for MDM2 or CDK4
immunostaining only when strong and diffuse immunoreactivity was seen in
more than 30% of the neoplastic cells (94,1% and 100%, and 77,1% and
98,8%, respectively). This study concludes that detection of MDM2 and CDK4
protein overexpression by IHC can be used for clinical purposes to diagnose
WDLPS and DDLPS. It was also observed that considering a strong and diffuse
immunostaining pattern in most of the neoplastic cells achieves the best results
in identifying these tumors.
Keywords: well-differentiated liposarcoma, dedifferentiated liposarcoma,
MDM2, CDK4, immunohistochemistry, immunostaining pattern.
61
1. Introduction
Benign and malignant adipose tissue tumors are among the most
common surgical tissue specimens to arrive on a routine basis in most
pathology laboratories. They are considered the most common type of soft
tissue tumor.
1,2
Lipomatous tumors represent a large group of heterogeneous
mesenquimal neoplasms that can, in some settings, cause diagnostic
difficulties
3
. Liposarcomas (LPS) are aggressive malignant neoplasms
considered by many authors as the most common soft tissue sarcoma in late
adult life.
1-3
These tumors are divided by the World Health Organization (WHO)
2
in four subtypes: well-differentiated liposarcoma (WDLPS)/atypical lipomatous
tumor (ALT), dedifferentiated liposarcoma (DDLPS), myxoid/round cell
liposarcoma (MRLPS) and pleomorphic liposarcoma (PLPS).
WDLPS is a non-metastasizing tumor that often recurs if incompletely
excised and represents the most prevalent subtype of LPS.
2-5
Morphologically,
its diagnosis resides on the identification of atypical hyperchromatic stromal
cells amid more mature adipocytes, around vessels or in fibrous areas of the
tumor, independently of the presence of lipoblasts.
6-7
This type of tumor can
show a broad range of histological appearances and can be called lipoma-like
(minimal fibrous areas), sclerosing (extensive fibrous component sometimes
forming non-lipogenic zones), inflammatory
8
(presence of a dense
lymphoplasmacytic infiltrate) and, also, spindle cell
9
(presence of numerous
fibroblast-like spindle cells). Additionally, extensive myxoid areas
10
(recapitulating areas of a MRLPS) or heterologous differentiation
11
(e.g.
leiomyosarcomatous) can be seem. A side from the superficial subcutaneous
ordinary lipomas, several forms of lipoma variants (pleomorphic and spindle cell
62
type) or characteristics (deep location and presence of secondary changes) can
be misinterpreted by optical microscopy alone as a feature of a WDLPS by
some pathologists.
DDLPS is a biphasic metastasizing tumor, most frequently located in the
retroperitoneum, groin and deep soft tissue of the extremities, with genetic
features related to WDLPS/ALT.
2
Its defining histopathological pattern shows an
abrupt transition of a WDLPS to another non-lipogenic sarcoma.
12
This non-
lipogenic dedifferentiated area can range morphologically from a high-grade
undifferentiated pleomorphic sarcoma (UPS) (so-called malignant fibrous
histiocytoma) to a low-grade fascicular bland spindle cell lesion.
13-15
But this
collision pattern is not always present or identified. That occurs because
pathologists many times deal with limited tissue samples like incisional biopsies
or poorly sampled large tumors. Also, it is well known that the dedifferentiated
area can grow to an extent that the WDLPS component is to almost disappear.
1
In this way, one has to always consider a DDLPS in the differential diagnosis of
almost any sarcoma, primarily in the retroperitoneum.
16
This concept of a DDLPS being a form a histologic progression of a
WDLPS has further been characterized by cytogenetic and molecular genetic
studies.
17-19
WDLPS cells were found to contain a characteristic genetic
hallmark, the presence of supernumerary ring and/or giant marker
chromosomes, a feature identified subsequentially in DDLPS cells.
18
These
anomalous chromosomes were shown to be composed of amplified sequences
of the chromosome 12q14-15 region, among other less recurrent co-amplified
regions.
20,21
Two important cell cycle oncogenes localized in the 12q14-15
region, MDM2 and CDK4, are constantly amplified and overexpressed in both
63
WDLPS and DDLPS.
22,23
This feature is not exclusive of these tumors and has
been reported in other benign and malignant mesenquimal neoplasms, some of
which are simulators of WDLPS and DDLPS (e.g. lipomas, high-grade
pleomorphic sarcomas).
24,25
These findings prompted some authors to
categorize WDLPS and DDLPS together in a conceptual point of view.
1,4
This
approach works, in a similar way, like the creation of the MRLPS spectrum after
the discovery of the translocations t (12;16) and t (12;22).
3
Both the low-grade
well-differentiated hypocellular myxoid end (classic myxoid LPS) and the high-
grade, predominantly round cell, poorly differentiated end (round cell LPS),
have the same unique characteristic translocation, which frequently is used for
diagnostic purposes.
2,26
Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) studies demonstrated
increased amplification and, also, transcription of MDM2 and CDK4 genes at
the 12q14-15 region in WDLPS and DDLPS.
27-29
In agreement with RT-PCR
results, overexpression of the corresponding proteins of these genes, MDM2
and CDK4, were detected by immunohistochemistry (IHC).
22
Although MDM2
and CDK4 immunostainings are fairly reproducible in soft tissue tumors,
30
they
are not restricted to WDLPS and DDLPS. They were shown to be positive in
some benign adipose tissue neoplasms
29
and several other sarcomas,
30
even in
the absence of gene amplification.
29
Despite this, some authors have proposed
that MDM2/CDK4 immunostaining is a reliable method to distinguish
WDLPS/DDLPS from other soft tissue tumors.
30-32
IHC is the most common ancillary diagnostic technique used to assist
pathologists on routine clinical settings. When compared to in-situ hybridization
techniques (FISH, CISH, CGH) and RT-PCR, IHC is still a reliable, less
64
expensive and rapid diagnostic tool. Some studies
30,32
have already used
immunostaining to address MDM2/CDK4 status for diagnostic purposes. The
two largest series
29-30
that have investigated the use of MDM2/CDK4 IHC to
identify WDLPS and DDLPS among other adipose tissue tumors and other,
benign and malignant mesenquimal neoplasms suggested: (1) the combination
of both proteins to achieve better specificity
30
and (2) complete analysis by
FISH or RT-PCR in cases with unexpected IHC staining or with confusing
features.
29
In order to evaluate the support for further clinical application, this study
performed IHC to investigate MDM2 and CDK4 expression in a series of 129
paraffin-embedded lipomatous and non-lipomatous soft tissue tumors. The
cases were divided in four groups of study: WDLPS, DDLPS, benign adipocytic
tumors and other mesenquimal tumors. IHC results for MDM2 and CDK4 test
were compared in each group. Sensitivity and specificity of positive expression
for these two proteins to identify WDLPS and DDLPS among other soft tissue
tumors was determined. Additionally, a percentage of tumor cell positivity was
determined to better characterize the pattern of tumor staining.
2. Materials and methods
2.1 Selection of cases
After approval of the Research Ethics Committee, one hundred and
twenty seven cases of soft tissue tumors were selected from the surgical
pathology archives of the Santa Rita’s Hospital of Cancer. The cases were
studied at the Pathology Research Laboratory, Federal University for Health
Sciences of Porto Alegre (Porto Alegre, RS, Brazil). To include a case in the
65
study it was necessary at least one histological paraffin-embedded tissue block
with viable tumor to be available. All tumor specimens were fixed in buffered
formalin and surgeries were held between 1997 and 2007. The initial diagnoses
were based on light microscopic haematoxylin and eosin (HE) stains,
immunohistochemical stains and clinical features when available.
The specimens included incisional and excisional biopsies from primary,
recurrent or metastatic tumors. One to twenty eight HE slides were reviewed in
each case. All diagnoses were reviewed and reclassified by two general
surgical pathologists (P.B.A. and A.A.H.) according to the latest WHO
classification of bone and soft tissue tumors.
2
Selected controversial cases
were reviewed by a well known soft tissue pathologist (A.M.O.). IHC and FISH
analyses were performed in some cases to corroborate histopathologic
classification.
The tumors final diagnoses were as follows: well-differentiated
liposarcoma/atypical lipomatous tumor (n=19), dedifferentiated liposarcoma
(n=10), spindle cell lipoma (SC-LP) (n=3), pleomorphic lipoma (PL-LP) (n=2),
non-conventional lipoma (NC-LP) (n=6), hibernoma (n=1), timolipoma (n=1),
angiomyolipoma (n=1), neural fibrolipoma (n=1), intramuscular lipoma (n=1),
fibrolipoma (n=1); angiosarcoma (n=1), gastrointestinal stromal tumor (GIST)
(n=4), synovial sarcoma (SS) (n=8), clear cell sarcoma (n=1), pleomorphic
liposarcoma (PLPS) (n=2), myxoid-round cell liposarcoma (MRLPS) (n=4),
malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST) (n=7), fibrosarcoma (FBS)
(n=3), leiomyosarcoma (LMS) (n=8), Kaposi sarcoma (n=2), epithelioid sarcoma
(EPITS) (n=3), dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) (n=1), high grade
undifferentiated pleomorphic sarcoma (UPS) (n=26), epithelioid
66
hemangioendothelioma (n=1), osteosarcoma (n=3), rhabdomyosarcoma (RMS)
(n=2), mixofibrosarcoma (MXFBS) (n=5), low grade fibromyxoid sarcoma
(LGFMS) (n=1), solitary fibrous tumor (SFT) (n=1).
2.2 Immunohistochemistry
IHC staining for MDM2 and CDK4 was performed on representative
paraffin blocks. Four-micron thick sections were cut and mounted on previously
silanized glass slides. The slides were dried for 60 minutes at 60
o
C and were
left resting overnight at room temperature. On the nest morning, sections were
deparaffinized with xylene and rehydrated with ethanol. Then, they were treated
with citrate buffer (0.01 M citric acid, pH 6.0) and heat-based antigen retrieval
was carried out in a hot bath at 94
o
C for 40 minutes. Endogenous peroxidase
was blocked using 95ml of methanol plus 5ml of 3% hydrogen peroxide
solution. After that, preparations were washed in distilled water and PBS
solution. Unspecific protein binding was blocked with 1% bovine serum albumin
for 30 minutes.
The primary antibodies MDM2 (clone 1B10, dilution 1:50, Novocastra)
and CDK4 (clone DCS-31, dilution 1:200, Biosource International) were
incubated overnight at 4
o
C on a level surface and in a dark humid chamber. On
the next day, sections were stained by the streptavidin-biotin-peroxidase
technique using the LSAB kit plus HRP system (DAKO), according to
manufacturer’s directions. To reveal the reaction a diaminobenzidine (DAB)
solution was employed and counterstaining was made with hematoxylin.
Appropriate positive and negative controls were used in each staining run.
67
Both antibodies react to their proteins inside the nucleus of the cells, so
any specific nuclear weak to strong staining was evaluated by optic microscopy.
The cases were stratified into four categories of staining pattern: (1) diffuse
positivity, when more than 30% of cells were immunoreactive; (2) moderate
positivity, when 29% to 10% of cells were immunoreactive; (3) focal positivity,
when less than 10% of cells were immunoreactive; and (4) negative, when no
cell was immunoreactive. Percentage of tumor cell immunoreactivity was
determined, approximately, by eyeballing the slides and counting 100 tumor
cells, at medium and high power, in at least five different fields. A cutoff point of
more than 10% moderate to strong nuclear immunoreactivity on the tumor cells
was defined as a positive expression of MDM2 or CDK4. Stains were evaluated
individually by two independent pathologists (P.B.A. and A.A.H.) and discordant
cases were revised together.
2.3 Fluorescence in situ hybridization
Fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis was performed on
paraffin-embedded tissue sections with appropriate controls as previously
described
39
using MDM2 and CPM amplification probes.
2.4 Statistical Analysis
The cases were divided in four groups of study: (I) well-differentiated
liposarcoma/atypical lipomatous tumor, (II) dedifferentiated liposarcoma, (III)
benign adipocytic tumors (BAT) and (IV) other mesenquimal tumors (OMT). IHC
results were appraised in each group. Sensitivity, specificity, predictive values
and accuracy of positive expression for MDM2/CDK4 proteins was determined
68
in WDLPS/ALT and DDLPS groups. Additionally, results were examined when
only diffuse immunoreactivity was considered to define a case as positive.
The tested hypothesis expected positive nuclear immunostaining for
MDM2 and/or CDK2 on WDLPS and DDLPS groups and negative staining for
these immunomarkers on the BAT and OMT groups. Considering
histopathologic classification as the gold standard test, sensitivity for MDM2 and
CDK4 was calculated as the number of WDLPS or DDLPS cases that tested
positive for these immunomarkers, divided by the total number of cases in each
group. Specificity for MDM2 and CDK4 was calculated by dividing the number
of BAT and OMT cases that tested negative for these immunomarkers, divided
by the total number of cases in each group.
The power of the new diagnostic test was measured by calculating the
kappa (k) and the Youden index (J) value. Kappa represented the proportion of
agreements between the histomorphological classification and the
immunohistochemical test panel. Kappa should be at least different than zero.
The Youden index is the sum of sensitivity and specificity minus 1 with the best
index being near 1. Statistical significance considered P<0.05.
3. Results
Clinical and pathological data, histological diagnoses,
immunohistochemistry results and statistical analyses of all tumor groups are
detailed on Tables 1 trough 6.
69
3.1 Well-differentiated lipossarcoma (Tables 1 and 4)
Of the nineteen WDLPS specimens analyzed, two (case 32 and 126)
were from incisional biopsies and seventeen from excisional biopsies. In two the
tissue studied was from a recurrent tumor (cases 1 and 18). Ten cases selected
presented with a lipoma-like and eight with a predominantly sclerosing subtype
morphology. One case showed a proliferation of numerous spindle cells with
hyperchromatic nuclei and with presence of few lipoblasts, consistent with a
spindle-cell WDLPS (case 126). The remaining cases had variation in adipocyte
size, presence of atypical stromal spindled cells, with hyperchromatic nuclei,
and multivacuolated lipoblasts.
In the predominantly sclerosing subtype cases, only scattered mature
adipocytes were seen in a fibrous, collagenous or myxoid stroma. Identification
of lipoblasts was not considered necessary for the histopathologic diagnosis.
Cases 18 and 106 showed numerous floret-like cells, as those described in
SC/PL-LP. The stroma in one case showed some small myxoid areas (case 1).
Scattered multivacuolated brown fat-like cells (hibernomatous cells) were
present in case 16.
MDM2 immunoreactivity was seen in all nineteen cases (100%) of
WDLPS (Fig. 1D,F). The positivity was strong and diffuse in 17/19 (89,4%)
cases. Only two cases, both sclerosing subtype retroperitoneal tumors (cases 2
and 9), showed expression in no more than 30% of the neoplastic cells.
Immunoreactivity for CDK4 was observed in 13/19 cases (68,4%) and it was
strong and diffuse in 12/13 cases (92,3%) (Fig. 2A,D-F). On case 106,
moderate positivity was seen in no more than 30% of the neoplastic cells. Both
MDM2 and CDK4 protein expression was seen in 13/19 (68,4%) cases, being
70
both strong and diffuse in 11/13 cases (84,6%). The case that showed
moderate positivity for CDK4 (case 106) stained strong and diffuse for MDM2.
3.2 Dedifferentiated liposarcoma (Tables 1 and 4)
Ten dedifferentiated lipossarcoma cases were analyzed and all were
from excisional biopsy specimens. In three cases (cases 19, 68 e 73) the
tissues studied were from recurrent tumors. Seven cases developed in the
retroperitoneum (70%), two in the thigh (20%) and one in the pelvic cavity
(10%). The gold standard defining histopathologic feature in all cases was the
identification of WDLPS morphology adjacent to a non-lipogenic, high to low
grade, sarcoma. The non-lipogenic dedifferentiated area was composed of a
high grade sarcoma in eight (80%) cases, a low grade sarcoma in one case
(10%) e an intermediate sarcoma in one case (10%). The dedifferentiated
component in 6/8 (75%) high grade cases was of a purely high grade UPS
(malignant fibrous histiocytoma-like). In cases 68 and 70, along with the high
grade pleomorphic cells, an abundant myxoid stroma was a striking feature.
Specifically in case 70, the cellularity and myxoid stroma were similar to a
MXFBS. Case 29 presented low grade spindle cell sarcoma cells, in short
cellular fascicles, resembling a fibroblastic lesion. Mitotic index in this area
reached nine mitoses per 10 high power fields. Case 127 is an example of the
rare DDLPS with neural-like elements and metaplastic bone formation in the
dedifferentiated area.
33
This case was considered an intermediate grade
DDLPS.
MDM2 immunoreactivity was seen in 9/10 cases (90%) of DDLPS. The
staining pattern was strong and diffuse in all nine cases (100%) (Fig. 1A,C,E).
71
Case 19 did not show more than 10% cells immunoreactive and was
considered negative for MDM2 expression. Immunoreactivity for CDK4 was
observed in 7/10 cases (70%) and it was strong and diffuse in all seven cases
(100%) (Fig. 2B,C). Both MDM2 and CDK4 protein immunoreactivity was seen
in seven cases (70%) cases of DDLPS, being strong and diffuse in all seven
cases (100%).
3.3 Benign adipocytic neoplasms (Tables 2 and 4)
All seventeen benign adipocytic tumors consisted of excisional biopsies
specimens and only one specimen was from a recurrent tumor (case 110). The
six cases of non-conventional lipoma had features (size, location or
morphology) that imposed a differential diagnosis with WDLPS, but with strict
histologic criteria (lack of atypical stromal cells) these cases were classified as
benign adipose tissue tumors. Two cases showed secondary changes (cases
12 and 23) composed of steatonecrosis, variation in adipocyte size, presence of
myofibroblasts and reactive multinucleated giant cells. A large deep-seated
lipoma (case 12) consisted of adipocytic atypical cells and lipoblast-like cells,
localized in the deep muscles of the dorsum. This case did not show MDM2
gene amplification by FISH (Mayo Clinic, MN, USA). Cases 24 and 113 had
areas with hypercellular myxoid stroma. Large tumors located at the gluteus
(case 26) and inguinal region (case 47) had adipocyte size variation and
nuclear atypia in adipocytes.
Case 35 consisted of a giant lipoma-like hibernoma, with extensive
fibrous stroma located in the thigh. This case did not show CPM gene
amplification by FISH (Mayo Clinic, MN, USA). The three cases of SC-LP
72
(cases 11, 49 and 110) consisted of aggregates of mature fat cells with variable
number of spindle shaped cells and abundant fibrillary collagen. On case 49 a
denser fibrous stroma was seen. The two PL-LP cases (cases 3 and 128) had
similar histology as SC-LP cases except for the presence of numerous
multinucleated hyperchromatic floret cells. Case 128 did not show CPM gene
amplification by FISH (Mayo Clinic, MN, USA). All SC/PL-LP cases were
positive for CD34. The remaining adipose tumor cases consisted of one
angiomiolipoma (case 55), one fibrolipoma (case 25), one timolipoma (case 6),
one neural fibrolipoma (case 42) and one intramuscular lipoma (case 76).
MDM2 immunoreactivity was seen in seven cases of the seventeen
benign adipocytic tumors (41,1%). In one SC-LP case the immunoreactivity
pattern was strong and diffuse (case 110). The remaining six positive cases
(85,7%) demonstrated moderate immunoreactivity in no more than 30% of the
neoplastic cells (cases 23, 25, 49, 55, 76 and 113) (Fig. 1B). Immunoexpression
for CDK4 was observed in two (11,7%) of the seventeen cases and it was not
strong and diffuse in any case. One PL-LP (case 3) and one SC-LP (case 49)
stained in no more than 30% of the neoplastic cells. Only case 49 expressed
both MDM2 and CDK4 of all 17 benign adipose tissue tumors (5,8%) and both
proteins were expressed in moderate levels.
3.4 Other mesenquimal tumors (Table 3 and 4)
The specimens analyzed from the eighty three other mesenquimal
tumors consisted of 72 excisional biopsies and 11 incisional biopsies. In nine
cases the tissue studied was from a recurrent tumor (cases 20, 30, 34, 43, 46,
64, 94, 101 and 117) and in four cases from a metastatic tumor (cases 33, 37,
73
86 and 95). All twenty six high-grade UPS cases selected had marked cellularity
composed of pleomorphic or spindled atypical cells. Overall proliferation
patterns included a fascicular, storiform or diffuse distribution. In some cases
frequent bizarre multinucleated tumoral giant cells (case 63), rhabdoid cells
(cases 71 and 122) or epithelioid cells (case 96) were seen. No specific line of
differentiation was identified in any case.
Eight cases of LMS (cases 34, 41, 45, 53, 56, 61, 82 and 90) showed
morphological and/or immunohistochemical features of smooth muscle
differentiation. Cellularity in most cases showed strong eosinophilic spindle
cells with a fascicular growth pattern and blunt ended nuclei. In three cases
(cases 41, 45 and 61) pleomorphic areas were identified. Case 53 showed, in
addition to the fascicular areas, a peculiar morphology with strong eosinophilic
epithelioid and rhabdoid cells, within an osteoid-like stroma that had metaplastic
bone formation. This case was strongly positive on IHC for vimentin, desmin,
muscle specific actin and smooth muscle actin; and was negative for
cytokeratins, S100, CD34, myoD1 and myogenin.
The SS cases were classified as monophasic fibrous type in five cases
(cases 36, 64, 80, 94 and 99), biphasic type in two cases (cases 37 and 60) and
poorly differentiated type in one case (case 92). In all cases
immunohistochemical evidence of epithelial membrane antigen (EMA) and/or
cytokeratin positivity was observed. Seven cases of MPNST were diagnosed
based on clinical features, morphology and immunohistochemical evidence of
S100 positivity. All cases showed a proliferation of spindled tortuous cells, with
hyper and hypocellular zones and medium to large sclerosed vessels. Two
cases (cases 59 and 81) were found to be originated in a previous
74
neurofibroma. In some cases, features like predominantly chondroid (case 59)
or osteoid (case 81) stroma or numerous tumor giant cells (cases 59 and 101)
were seen. All five MXFBS cases exhibited an abundant myxoid stroma, with
curvilinear vessels and spindled, stellate or pleomorphic cells with atypical
hyperchromatic nuclei. Two cases were classified as low grade (cases 20 and
79) and three as high grade (cases 30, 43 and 46).
MRLPS cases (cases 31, 52, 57 and 85) exhibited a proliferation of bland
spindle cells in an abundant myxoid matrix, with a background composed of a
plexiform capillary vascular network, and scattered vacuolated lipoblasts. One
case showed a poorly differentiated round cell area (case 57). Two PLPS cases
were diagnosed based on the presence of multivacuolated pleomorphic
lipoblasts (cases 40 and 100) and one exhibited, also, MXFBS-like areas (case
40).
The two high risk (cases 8 and 66) and the two low risk (cases 87 and
117) GIST cases stained for c-KIT and CD34. The three FBS (cases 7, 39 and
63) showed a proliferation of fibroblast spindle cells with a fascicular-
herringbone pattern. Their stroma was composed of a deposited collagen
between the cells. Vimentin was the only protein detected by IHC in these
cases. All three EPITS cases (cases 95, 123 and 124) were from the distal type,
and showed classic necrotic zones surrounded by atypical epithelioid cells.
Two RMS cases, one alveolar (case 97) and one pleomorphic (case 98),
showed diffuse immunoexpression for desmin and for MyoD1. The poorly
differentiated angiosarcoma case (case 72) was strongly positive for CD31. Two
HHV8 positive Kaposi sarcomas (cases 111 and 115); two conventional
osteosarcomas (case 58 and 103); one soft tissue osteosarcoma (case 69); one
75
LGFMS (case 91); one HMB45 and S100 positive clear cell sarcoma (case
125); one abdominal cavity epithelioid hemangioendothelioma (case 102), one
DFSP (case 67) and one CD34 positive SFT (case 88) we also reviewed.
MDM2 immunoreactivity was seen in 29 of the 83 (34,9%) cases from the
OMT group. The immunoreactivity pattern was strong and diffuse in 19/29
(65,5%) positive cases, specifically: six UPS, two MPNST, two LMS, two
MXFBS, two SS and one FBS, one DFSP, one MRLPS, one LGFMS and one
ES. Ten positive cases (34,4%) showed moderate immunoexpression in no
more than 30% of the neoplastic cells (four UPS, two GIST, two MXFBS, one
LPS-PL and one MPNST). Immunoreactivity for CDK4 was observed in 3
(3,6%) of the 83 cases (cases 21, 40 and 43) and it was strong and diffuse in
only one UPS case located in the thorax (case 21). One PLPS (case 40) and
one MXFBS (case 43) exhibited moderate positivity in no more than 30% of the
neoplastic cells. Both MDM2 and CDK4 protein immunoexpression was seen in
2/83 (2,4%) other mesenquimal tumors (cases 40 and 43) and the
immunostaining pattern was moderate in both cases.
3.5 Statistical Analysis (Tables 5 and 6)
Alone or together, both MDM2 and CDK4, were accurate in detecting
WDLPS and DDLPS among other soft tissue tumors. Sensitivity and specificity
for MDM2 and CDK4 immunoexpression in WDLPS/DDLPS was 96,5% and
64%, and 68,9% and 95%, respectively. The combination of MDM2 and CDK4
immunoreactivity increased the specificity of the test (97%), with no increase in
the sensitivity (68,9%). But still, this staining panel was a powerful test (J=0.66),
with a good agreement with morphology (k=0.71). When considering a case
76
positive with only strong and diffuse immunoexpression for MDM2 and CDK4,
the test gained in specificity (80% and 99%, respectively), but loosed in
sensitivity (89,6% and 65,5% respectively). In combination, diffuse positivity for
MDM2 and CDK4 achieved the best specificity (100%), but still loosed in
sensitivity (62%). This panel was an overall powerful test (k=0.71; J=0.62).
In distinguishing WDLPS from the potential confusing benign adipose
tumors the sensitivity and specificity for MDM2 and CDK4 immunoexpression
was 100% and 58,8%, and 68,4% and 88,2%, respectively. With the
combination of MDM2 and CDK4 the specificity of the test increased (94,1%),
with no increase in sensitivity (68,4%). This was considered a fairly good test
(k=0.61; J=0.62). When considering only diffuse positivity, MDM2 and CDK4
alone, gained in specificity (94,1% and 100%, respectively) but loosed in
sensitivity (89,4% and 63,1%, respectively). MDM2 diffuse positivity alone
became a powerful test (k=0.83; J=0.83). When combining MDM2 and CDK4,
diffuse immunoreactivity gained in specificity (100%), but loosed in sensitivity
(57,2%) (J=0.57, k=0.56).
In detecting DDLPS among other mesenquimal tumors the sensitivity and
specificity for MDM2 and CDK4 positive expression was 90% and 65%, and
70% and 96,3%, respectively. With the combination of MDM2 and CDK4 the
specificity of the panel increased (97,5%), with no increase in the sensitivity
(70%). This was considered a fairly good test (J=0.67, k=0.7). When
considering only diffuse positivity for MDM2 and CDK4, the test gained in
specificity (77,1% and 98,8%, respectively), with no change in the sensitivity
(70%). In combination, diffuse positivity for MDM2 and CDK4 gained in
77
specificity (100%), with no loose in sensitivity (70%), becoming a powerful test
(J=0.7, k=0.8).
4. Discussion
Benign and malignant adipose tissue neoplasms are common tumors
that can cause diagnostic difficulties to general surgical pathologists. Excluding
superficial subcutaneous lipomas, some benign adipose tumors can present
with attributes such as deep location (deep-seated lipomas), infiltrative pattern
(inter and intramuscular lipomas) or high cellularity (pleomorphic/spindle-cell
lipomas),
3
that prompt pathologists to consider a WDLPS in the differential
diagnosis. In the same way, some sarcomas (UPS, FBS, and MXFBS) can be
difficult to differentiate from non-lipogenic sarcomas present in dedifferentiated
areas of DDLPS.
12
This usually happens when the well-differentiated
component is not easily identified next to the dedifferentiated area (e.g.
incisional biopsies, poorly sampled tumors).
1,34
Both WDLPS and DDLPS share
the same genomic profile characterized by the presence of ring and/or giant
marker chromosomes that harbour amplified sequences of the 12q14-15
chromosomal region.
18,20-22
This chromosomal region contains several genes
(MDM2, CDK4, HMGA2, OS9, SAS), but two, MDM2 and CDK4, were shown to
be constantly amplified and superexpressed in these tumors.
20,22-25
Several
diagnostic methods like FISH and RT-PCR confirmed these findings.
26-28
IHC is one of the most used diagnostic tools to assist the pathologist on a
routine basis. The implementation of molecular diagnostic techniques, like RT-
PCR and in situ hybridization (e.g. FISH and CISH), is still expensive to most
small surgical pathology laboratories. IHC was known to have no role in
78
diagnosing lipomatous tumors.
2,4
Rarely, one uses S100 protein
immunoreactivity to identify adipocytic cells and lipoblasts in liposarcomas.
2
Recently, PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) a
nuclear receptor that regulates growth and differentiation of adipocytes was
shown to stain lipogenic and non-lipogenic areas of DDLPS.
35
In this study, the expression of MDM2 and CDK4 was examined by IHC
in a series of soft tissue tumors. It was demonstrated that positive
immunoreactivity for these proteins could be used to identify WDLPS and
DDLPS among other benign adipocytic tumors and other mesenquimal tumors
(including high-grade UPS). In this series, all nineteen (100%) cases of WDLPS
were positive for MDM2 immunostaining and most (13/19) were also positive for
CDK4. In the benign adipose tissue tumor group, MDM2 was positive in seven
(41,1%) cases and CDK4 was positive in only two (11,7%) cases. When trying
to differentiate WDLPS from benign adipocytic tumors, MDM2 demonstrated
good sensitivity (100%) and CDK4 demonstrated good specificity (88,2%).
These findings are similar to those reported by Binh et al (100% and 96%,
respectively) in a study with 44 WDLPS and 48 benign adipose tissue tumors
(Table 7). Also in agreement with their findings, the combination of MDM2 and
CDK4 immunostaining increased the specificity of the test (94,1%). Moreover, it
was demonstrated that, when dealing with WDLPS, it is better to consider only
strong and diffuse immunoreactivity in more than 30% of the neoplastic cells.
This achieves the best specificity for MDM2 (94,1%) and CDK4 (100%) when
they are used separately.
All SC/PL-LP in this series stained strong and diffuse for CD34, a
diagnostic feature characteristic of these tumors. One study reported MDM2
79
and CDK4 staining in SC/PL-LP.
30
In this study, immunopositivity for MDM2 was
observed in two SC-LP and of CDK4 in one PL-LP and one SC-LP. Molecular
cytogenetic studies using FISH were available on three cases of the benign
adipocytic tumor group (one deep-seated non-conventional lipoma, one giant
hibernoma and one PL-LP). Results revealed that the lesional cells did not
contain MDM2 gene (case 12) or CPM (carboxypeptidase M) gene (case 65
and 128) amplification (Mayo Clinic, MN, EUA). These three cases were both
negative for MDM2 and CDK4 immunostaining. The CPM gene is telomeric to
the MDM2 locus on chromosome 12q15 and is, also, co-amplified with MDM2 in
virtually all cases of WDLPS/ALT (data non-published, Dr. Oliveira, Mayo Clinic,
MN). After revising all unexpected IHQ results, one fibrolipoma (case 42)
revealed positivity of some cells for CD34 and a diagnosis of Gardner-type
fibroma was considered.
MDM2 and CDK4 proteins when overexpressed act as stimulators of the
cell cycle through the G1-S phase.
36,37
In normal levels, MDM2 regulates P53
protein function by inactivation of its transcriptional activity, protein binding and
degradation.
37
P53 acts in response to DNA damage by cell cycle arrest or
apoptosis, and has been called the guardian of the genome. P53 transactivation
also diminishes the transcription of the MDM2 gene, creating an autoregulatory
feedback loop that regulates both protein levels.
36
After activation by D type
cyclins, CDK4 phosphorylates and inactivates the retinoblastoma protein (RB),
activating and releasing E2F proteins required for cell cycle progression.
37
Overexpression of these two proteins (MDM2 and CDK4) could lead too
loss of cell cycle control with consequent development of neoplastic growth.
36-38
This mechanism of oncogenesis by gene amplification with protein
80
overexpression could be important in the development of WDLPS and
DDLPS.
30
Expression of MDM2 and CDK4 was detected also by IHC in other
tumors like MXFBS, UPS (malignant fibrous histiocytomas), MPNST, LMS,
RMS, SS and sarcomatoid carcinomas.
29,30
This study, found 90% (9/10) of the DDLPS cases to have positive
immunoreactivity for MDM2 and 70% to be immunoreactive for CDK4. In the
other group with several types of mesenquimal tumors, MDM2 was expressed
in 34,9% (29/83) of the cases and CDK4 was expressed in only 3,6% (3/83) of
the cases. When trying to identify DDLPS among other mesenquimal tumors
(including its simulators), MDM2 demonstrated good sensitivity (90%) and
CDK4 demonstrated good specificity (96,3%). These findings corroborate those
reported by Binh et al
30
that found 95% of sensitivity and specificity for MDM2
and CDK4. Like them, this study also observed that combining MDM2 and
CDK4 positive immunostaining increased the specificity of the test (97,5%). In
addition, it was demonstrated that the most specific way to separate DDLPS
from other sarcomas is to combine MDM2 and CDK4 testing, considering a
case positive only when strong and diffuse immunoreactivity is seen in more
than 30% of the neoplastic cells (97,5%).
One study investigated MDM2 and CDK4 alterations by IHC in 200 soft
tissue tumors and compared the results with FISH and RT-PCR.
29
Their results
observed that several tumors expressed these two proteins despite the absence
of gene amplification, suggesting a mechanism of protein overexpression other
than gene amplification. They them stated that immunoreactivity alone for
MDM2 or CDK4 does not always correlate with the diagnosis of
WDLPS/DDLPS.
29
81
This study demonstrated MDM2 immunoexpression in ten UPS, four
MXFBS, one FBS, two LMS, three MPNST, two SS, one EPITS, two GIST, one
DFSP, one Mix/RC-LPS, one PL-LPS and one LGFMS; and CDK4 expression
in one UPS, one MXFBS and one PL-LPS. After review of all unexpected IHC
results, no WDLPS areas were found in any of these mesenquimal tumors.
Although we cannot totally exclude that some of these cases maybe in fact
DDLPS (e.g. case 35), this study reinforces that MDM2 IHC alone has low
specificity in diagnosing DDLPS. The possibility that some of these positive
MDM2 cases could be a result of a false-positive artifact has to be considered
too. This feature could have influenced negatively in the specificity of the test.
Further molecular studies are needed in these cases to investigate MDM2 and
CDK4 gene amplification.
In summary, this study gathered good evidence that the detection of
MDM2 and CDK4 protein overexpression by IHC can be used for clinical
purposes to diagnose WDLPS and DDLPS. Any discrepant diagnostic feature
or unexpected IHC result should prompt a complementary molecular study, by
FISH or RT-PCR, to identify MDM2 and CDK4 gene amplification. The best
specificity results in diagnosing these tumors were achieved with the
combination MDM2 and CDK4 immunoreactivity. Furthermore, it was
demonstrated that specificity could be even higher if one considers a case
positive for MDM2 or CDK4 expression only when strong and diffuse
immunoreactivity is seen in more than 30% of the neoplastic cells.
82
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86
Table 1
– Clinical and pathological data, histological diagnoses, morphology and immunohistochemical expression in the WDLPS and DDLPS cases.
Case No.
SEX/AGE
Localization/Size (cm)
Diagnosis
Subtype or
dedifferentiated
area morphology
IHC MDM2/CDK4
MDM2/CDK4
staining pattern
Observations
1 M / 65
Retroperitoneum / 17
WDLPS
Lipoma-like + / +
1 / 1
Stroma with myxoid areas
2 M / 76
Retroperitoneum / 15
WDLPS
Esclerosing + / +
2 / 1
4 M / 68
Thorax / 7
WDLPS
Lipoma-like
+ / - 1 / 4
5 M / 63
Retroperitoneum / 31
WDLPS
Esclerosing
+ / - 1 / 3
9 M / NI
Retroperitoneum / 44
WDLPS
Esclerosing
+ / - 2 / 4
10 M / 59
Retroperitoneum / 10
DDLPS
UPS
+ / + 1 / 1
13 M / 35
Retroperitoneum / 17
DDLPS
UPS
+ / + 1 / 1
14 M / 72
Cervical / BI
WDLPS
Lipoma-like
+ / - 1 / 4
16 M / 66
Thigh / 6
WDLPS
Lipoma-like
+ / + 1 / 1
Hibernomatous-like cells
17 F / 48
Retroperitoneum / 25
WDLPS
Esclerosing
+ / + 1 / 1
18 M / 58
Retroperitoneum / 19
WDLPS
Lipoma-like
+ / + 1 / 1
Floret-like cells
19 F / 73
Thigh / 33
DDLPS
UPS
- / - 3 / 4
22 F / 32
Leg / 14
WDLPS
Lipoma-like
+ / - 1 / 4
27 M / 77
Retroperitoneum / 12
WDLPS
Esclerosing
+ / + 1 / 1
28 F / 55
Retroperitoneum / 11
DDLPS
UPS
+ / + 1 / 1
29 F / 73
Retroperitoneum / 24
DDLPS
LG-SCS
+ / + 1 / 1
32 NI / NI
Knee / IB
WDLPS
Esclerosing
+ / + 1 / 1
38 NI / NI
NI / NI
WDLPS
Esclerosing
+ / + 1 / 1
50 F / 49
Thigh / 7
WDLPS
Lipoma-like
+ / - 1 / 4
51 M / 58
Thigh / 10
DDLPS
UPS
+ / - 1 / 4
68 F / 80
Pelvis / 22
DDLPS
Myx-UPS
+ / - 1 / 4
70 F / 80
Retroperitoneum / 35
DDLPS
MXFBS-like
+ / + 1 / 1
73 M / 65
Retroperitoneum / 15
DDLPS
UPS
+ / + 1 / 1
75 M / 70
Retroperitoneum / 40
WDLPS
Esclerosing
+ / + 1 / 1
106 F / 49
Arm / 15
WDLPS
Lipoma-like
+ / + 1 / 2
112 M / 56
Scalp / 5
WDLPS
Esclerosing
+ / + 1 / 1
126 M / 54
Cervical / 10
WDLPS
Spindle cell
+ / + 1 / 1
Myxoid stroma
127 F / 38
Retroperitoneum / 6
DDLPS
Neural-like nodules
+ / + 1 / 1
With metaplastic bone
129 M / 47
Dorsal / 7
WDLPS
Lipoma-like
+ / + 1 / 1
M=male; F=female; IB=incisional biopsy; NI=non-informed; WDLPS=well-differentiated liposarcoma; DDLPS=dedifferentiated liposarcoma; UPS=undifferentiated pleomorphic sarcoma; LG-SCS=low grade spindle cell
sarcoma; Myx-UPS=myxoid undifferentiated pleomorphic sarcoma; MXFBS= mixofibrossarcoma.
87
Table 2 –
Clinical and pathological data, histological diagnoses, histology findings and immunohistochemical expression in the benign adipose tumors group
.
Case
No.
SEX / AGE Localization / Size (cm) Diagnoses Histology
IHC
MDM2/CDK4
Pattern of staining
Observations
3 M / 51
Cervical / 4
PL-LP
Numerous floret cells, fibrillary collagen - / +
4 / 2
CD34+
6 F / 24
Mediastinum / 8
TLP
Infiltrative adipocytes - / -
4 / 4
11 F / 72
Cervical / 3
SC-LP
Spindle cells, fibrillary collagen
- / -
4 / 4
CD34+
12 M / 33
Dorsum / 15
NC-LP
Esteatonecrosis, atypical nuclei, reactive
myofibroblasts, lockern
- / -
4 / 4
No MDM2 amplification by
FISH*
23 M / 44
Dorsum / 3
NC-LP
Esteatonecrosis, atypical nuclei, reactive
myofibroblasts
+ / -
2 / 4
24 M / 49
Cervical / 15
NC-LP
Myxoid stroma
- / -
4 / 4
25 F / 19
Knee / 14
FBLP
Fibrous sclerotic stroma
+ / -
2 / 4
26 F / 32
Gluteus / 15
NC-LP
Adipocyte size variation, atypical/large nuclei
- / -
4 / 4
42 M / 28
Forearm / 2
NFBLP
Infiltrative adipocytes
- / -
4 / 4
47 F / 41
Inguinal / 13
NC-LP
Adipocyte size variation, atypical/large nuclei
- / -
4 / 4
49 F / 45
Cervical / 3
SC-LP
Spindle cells, fibrillary collagen
+ / +
2 / 2
CD34+
55 F / 37
Kidney / 12
AMLP
Perirrenal fat infiltration
+ / -
2 / 4
65 M / 35
Thigh / 38
HIB
Hibernoma cells, dense fibrous stroma
- / -
4 / 4
No CPM amplification by
FISH*
76 M / 37
Thigh / 25
IM-LP
Rare hibernomatous cells, infiltrative pattern
+ / -
2 / 4
110 F / 62
Malar / NI
SC-LP
Spindle cells, fibrillary collagen
+ / -
1 / 4
CD34+
113 F / 57
Hand / 7
NC-LP
Myxoid stroma
+ / -
2 / 4
128 F / 47
Arm / 4
PL-LP
Hyperchromatic cells, fibrillary collagen
- / -
4 / 4
CD34+, no CPM
amplification by FISH*
M=male; F=female; PL-LP=pleomorphic lipoma; TLP=timolipoma; SC-LP=spindle cell lipoma; NC-LP=non-conventional lipoma; FBLP=fibrolipoma; NFBLP=neural fibrolipoma; AMLP=angiomyolipoma; HIB=hibernoma;
IM-LP=intramuscular lipoma.* Mayo Clinic, Rochester, MN, EUA.
88
Table 3
– Clinical-pathological data, histological diagnoses, histology findings and immunohistochemical expression in the other mesenquimal tumor group.
Case No. Sex / Age Localization / Size (cm) Diagnoses Histology IHC MDM2/CDK4
Pattern of
staining
Observations
7 M / 14 Tongue / 3 FBS Spindle cell, fascicular - / - 3 / 3
8 M / 69 Colon / 22 GIST Spindle cell, malignant - / - 4 / 4 CD117+, CD34+
15 M / 71 Leg / NI MPNST High grade - / - 4 / 4
20 M / 69 Inguinal / IB MXFBS Low grade - / - 3 / 4
21 M / 27 Thorax / IB HG-UPS Pleomorphic - / + 3 / 1
30 F / 84 Dorsum / 6 MXFBS High grade + / - 1 / 3
31 M / 50 Thigh / IB MRLPS Low grade, purely myxoid - / - 4 / 4
33 F / 42 Spine / MET HG-UPS Pleomorphic - / - 4 / 4
34 F / 65 Leg / NI LMS Fascicular, moderately differentiated + / - 1 / 3
35 F / 24 Retroperitoneum / IB HG-UPS Pleomorphic + / - 2 / 4
36 F / 24 Leg / 6 SS Monophasic, fibrous type - / - 4 / 4
37 M / 31 Maxilla / 9 SS Biphasic type, epithelial and spindle cells + / - 1 / 4
39 M / NI Thorax / 6 FBS Spindle cell, fascicular + / - 1 / 4 Low grade
40 M / 20
Lumbar / 4
PLPS
Myxofibrosarcoma-like
+ / + 2 / 2
41 M / 56 Mesentery / 23 LMS Pleomorphic cells + / - 1 / 4 Desmin+, CD117-, CD34-
43 M / 46 Arm / 3 LMS Pleomorphic cells + / + 2 / 2
44 M / 33 Arm / 2 HG-UPS Pleomorphic - / - 4 / 4
45 F / 58 Uterus / 14 LMS Pleomorphic - / - 4 / 4
46 F / 53 Thigh / 12 MXFBS High grade + / - 2 / 3
48 F / 62 Forearm / 2 HG-UPS Pleomorphic, storiform + / - 1 / 4
52 M / 39 Gluteus / 6 MRLPS Low grade + / - 1 / 4
53 M / 44 Thigh / 5 LMS
Pleomorphic, epithelioid and rhabdoid
cells, osteoid-like stroma
- / - 4 / 4
HHF35+, SMA+, Desmin+,
Myogenin-, MyoD1-, CK-
54 M / 71 Shoulder / 15 HG-UPS Pleomorphic + / - 1 / 4
56 M / 37 Thigh / 14 LMS Fascicular, moderately differentiated - / - 4 / 4
57 F / 33 Pelvis / 15 MRLPS Round cells, hypercellular - / - 4 / 4
58 M / 36 Scapula / 11 OTS Conventional, osteogenic - / - 4 / 4
59 F / 29 Diaphragm / 15 MPNST Intermediate grade - / - 4 / 4
60 M / 59 Cervical / 7 SS Biphasic type, epithelial and spindle cells - / - 4 / 4
61 F / 79 Mesocolon / 13 LMS Pleomorphic - / - 4 / 4
62 F / 69 Cervical / 4 HG-UPS Spindle cell - / - 4 / 4
63 M / 27 NI / 1 FBS Fascicular, high grade - / - 3 / 4
64 F / 58 Bladder / IB SS Monophasic, fibrous type - / - 4 / 4
66 F / 60 Colon / 9 GIST Epithelioid cell, malignant - / - 4 / 4 CD117+
67 F / 16 Thigh / 2 DFSP Storiform + / - 1 / 4
69 M / 59 Thigh / 16 OTS Soft tissue origin - / - 4 / 4
71 F / 66 Arm / 8 HG-UPS Pleomorphic - / - 4 / 4
72 M / 80 Arm / 10 AGS Poorly differentiated - / - 4 / 4
CD31+, Negative for muscle
markers
74 F / 28 Thigh / 20 MPNST High grade - / - 4 / 4
77 F / 81
Shoulder / 8
HG-UPS Myxoid, pleomorphic + / - 2 / 4
78 M / 77 Scalp / 2 HG-UPS Pleomorphic + / - 1 / 4
79 M / 58 Dorsum / 4 MXFBS Low grade + / - 1 / 4
80 M / 44 Shoulder / 21 SS Monophasic, fibrous type - / - 4 / 4
89
81 F / 39 Forearm / 9 MPNST High grade, osteoid-like stroma + / - 2 / 4
82 M / 37 Inguinal / 14 LMS Fascicular, moderately differentiated - / - 4 / 4
83 F / 78 Thigh / 8 HG-UPS Pleomorphic + / - 2 / 4
84 M / 41 Retroperitoneum / 8 MPNST High grade - / - 3 / 4 S100+
85 F / 69 Forearm / 2 MRLPS Low grade - / - 3 / 4
86 F / 49 Thigh / 6 HG-UPS Inflammatory, pleomorphic - / - 4 / 4
87 M / 43 Stomach / 2 GIST Low risk + / - 2 / 4 CD117+
88 M / 77 Pelvis / NI SFT Storiform - / - 4 / 4 CD34+
89 F / 48 Leg / 7 HG-UPS Pleomorphic - / - 4 / 3
90 F / 56 Forearm / 6 LMS Fascicular, moderately differentiated - / - 4 / 4
91 F / 27 Forearm / 6 LGFMS Spindle cell, hypercellular areas + / - 1 / 4
92 F / 50 Thigh / 6 SS Poorly differentiated, round cells - / - 4 / 4
93 M / 63 Thigh / 4 HG-UPS Pleomorphic - / - 4 / 4
94 F / 34 Thigh / NI SS Monophasic, fibrous type - / - 4 / 4
95 M / 34 Arm / 1 EPITS Distal type + / - 1 / 4
96 M / 50 Thorax / IB HG-UPS Epitelióide/rabdóide + / - 1 / 4
97 F / 14 Breast / 11 RBMS Alveolar - / - 4 / 4
98 M / 24 Orbital / IB RBMS Pleomorphic - / - 4 / 4
99 F / 22 Arm / 15 SS Monophasic, fibrous type + / - 1 / 4
100 F / 70 Leg / 7 PLPS Pleomorphic - / - 3 / 4
101 F / 74 Forearm / 9 MPNST High grade, tumoral giant cells + / - 1 / 4
102 F / 48 Omentum / 22 EPITH Epithelioid cells - / - 3 / 3 CD31+
103 F / NI Thigh / 27 OTS Conventional, Osteoblastic - / - 4 / 4
104 F / 50 Retroperitoneum / 14 HG-UPS Spindle cell - / - 4 / 4
105 M / 76 Arm / 4 HG-UPS Pleomorphic + / - 1 / 4
107 F / 73 Arm / 3 MPNST Intermediate grade + / - 1 / 3
108 F / 62 Mama / 12 HG-UPS Spindle cell - / - 3 / 4
109 F / 82 Thigh / 5 HG-UPS Pleomorphic, inflammatory - / - 4 / 4
111 M / 36 Foot / 2 KS Nodular phase - / - 4 / 4
114 M / 51 Forearm / IB HG-UPS Pleomorphic - / - 4 / 4
115 M / 49 Thigh / 1 KS Plaque phase - / - 3 / 4
116 F / 61 Supraclavicular / IB HG-UPS Spindle cell + / - 1 / 4
117 M / 40 Small intestine / 10 GIST Spindle cell, low risk + / - 2 / 3 CD117+
118 M / 90 Scalp / 1 HG-UPS Pleomorphic - / - 4 / 4
119 F / 37 Thigh / 7 HG-UPS Pleomorphic - / - 4 / 4
120 F / 78 Dorsum / 2 HG-UPS Pleomorphic, spindle cell + / - 2 / 4
121 M / 80 Retroperitoneum / 6 HG-UPS Storiform - / - 4 / 4
122 M / 22 Retroperitoneum / 13 HG-UPS Rhabdoid cells - / - 4 / 4
123 M / 25 Foot / 2 EPITS Distal type - / - 4 / 4
124 M / 52 Forearm / 2 EPITS Distal type - / - 4 / 4
125 F / 53 Foot / 6 CCS Fascicular - / - 4 / 4
NI=non-informed; BI=incisional biopsy; FBS=fibrosarcoma; GIST=gastrointestinal stromal tumor; MPNST=malignant peripheral nerve sheath tumor; MXFBS=myxofibrosarcoma; HG-UPS=high grade undifferentiated
pleomorphic sarcoma; MRLPS= myxoid round cell liposarcoma; LMS=leiomyosarcoma; SS= synovial sarcoma; PLPS= pleomorphic liposarcoma; OTS=osteosarcoma; DFSP=dermatofibrossarcoma protuberans;
AGS=angiosarcoma; SFT=solitary fibrous tumors; LGFMS=low grade fibromyxoid sarcoma; EPITS=epithelioid sarcoma; RBMS=rhabdomyosarcoma; EPITH=epithelioid hemangioendothelioma; KS=Kaposi sarcoma;
CCS=clear cell sarcoma.
90
Table 4 – MDM2 and CDK4 immunohistochemistry results in all tumor groups.
Groups/Diagnoses
(T)
MDM2
N/T (%)
CDK4
N/T (%)
MDM2 e CDK4
N/T (%)
WDLPS (19) 19/19 (100) 13/19 (68,4) 13/19 (68,4)
DDLPS (10) 9/10 (90) 7/10 (70) 7/10 (70)
WDLPS/DDLPS (29) 28/29 (96,5) 20/29 (68,9) 20/29 (68,9)
Other mesenquimal
tumors (83)
29/83 (34,9) 3/83 (3,6) 2/83 (2,4)
HG-UPS* (26) 10/26 (38,4) 1/26 (3,8) 0/26 (0)
MXFBS* (5) 4/5 (80) 1/5 (20) 1/5 (20)
FBS* (3) 1/3 (33,3) 0/3 (0) 0/3 (0)
LMS* (8) 2/8 (25) 0/8 (0) 0/8 (0)
RBMS* (2) 0/2 (0) 0/2 (0) 0/2 (0)
MPNST* (7) 3/7 (42,8) 0/7 (0) 0/7 (0)
SS (8) 2/8 (25) 0/8 (0) 0/8 (0)
EPITS (3) 1/3 (33,3) 0/3 (0) 0/3 (0)
KS (2) 0/2 (0) 0/2 (0) 0/2 (0)
GIST (4) 2/4 (50) 0/4 (0) 0/4 (0)
OTS* (3) 0/3 (0) 0/3 (0) 0/3 (0)
DFSP (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
MRLPS* (4) 1/4 (25) 0/4 (0) 0/4 (0)
CCS (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
PLPS* (2) 1/2 (50) 1/2 (50) 1/2 (50)
LGFMS (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
AGS* (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
EPITH (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
SFT (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
Benign adipocytic
tumors (17)
7/17 (41,1) 2/17 (11,7) 1/17 (5,8)
NC-LP (6) 2/6 (33,3) 0/6 (0) 0/6 (0)
CF-LP (3) 2/3 (66,6) 1/3 (33.3) 1/3 (33,3)
PL-LP (2) 0/2 (0) 1/2 (50) 0/2 (0)
HIB (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
FBLP (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
IM-LP (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
AMLP (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
NFBLP (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
TLP (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
T=total number of cases; N=number of cases; WDLPS=well-differentiated liposarcoma; DDLPS=dedifferentiated
liposarcoma; PL-LP=pleomorphic lipoma; TLP=timolipoma; SC-LP=spindle cell lipoma; NC-LP=non-conventional lipoma;
FBLP=fibrolipoma; NFBLP=neural fibrolipoma; AMLP=angiomyolipoma; HIB=hibernoma; IM-LP=intramuscular lipoma;
FBS=fibrosarcoma; GIST=gastrointestinal stromal tumor; MPNST=malignant peripheral nerve sheath tumor;
MXFBS=myxofibrosarcoma; HG-UPS=high grade undifferentiated pleomorphic sarcoma; MRLPS= myxoid round cell
liposarcoma; LMS=leiomyosarcoma; SS= synovial sarcoma; PLPS= pleomorphic liposarcoma; OTS=osteosarcoma;
DFSP=dermatofibrossarcoma protuberans; AGS=angiosarcoma; SFT=solitary fibrous tumors; LGFMS=low grade
fibromyxoid sarcoma; EPITS=epithelioid sarcoma; RBMS=rhabdomyosarcoma; EPITH=epithelioid
hemangioendothelioma; KS=Kaposi sarcoma; CCS=clear cell sarcoma. *Neoplasia can simulate DDLPS.
91
Table 5 – Statistical analyses of immunohistochemistry results for MDM2 and CDK4 in the
diagnostic groups.
Protein
Comparisons
WDLPS/DDLPS
vs. BAT/OMT
(N=129)
WDLPS vs. BAT
(N=36)
DDLPS vs. OMT
(N=93)
MDM2
Sensitivity 96,5% 100% 90%
Specificity 64% 58,8% 65%
PPV 43,8% 73,1% 23,7%
NPV 98,5% 100% 98,2%
Accuracy 71% 81% 68%
Youden’s J 0.6 0.58 0.55
Kappa (p) 0.42 (<0,001) 0.6 (<0,001) 0.24 (<0,001)
CDK4
Sensitivity 68,9% 68,4% 70%
Specificity 95% 88,2% 96,3%
VPP 80% 86,7% 70%
VPN 91,3% 71,4% 96,4%
Accuracy 89% 78% 94%
Youden’s J 0.64 0.56 0.66
Kappa (p) 0.67 (<0,001) 0.56 (0,001) 0.66 (<0,001)
MDM2 e CDK4
Sensitivity 68,9% 68,4% 70%
Specificity 97% 94,1% 97,5%
PPV 87% 92,9% 77,8%
NPV 91,5% 72,7% 96,4%
Accuracy 91% 81% 95%
Youden’s J 0.66 0.62 0.67
Kappa (p) 0.71 (<0,001) 0.61 (<0,001) 0.7 (<0,001)
PPV=positive predictive value; NPV=negative predictive value; WDLPS=well-differentiated liposarcoma;
DDLPS=dedifferentiated liposarcoma; BAT=benign adipose tumors; OMT=other mesenquimal tumors
92
Table 6 - Statistical analyses of immunohistochemistry results for MDM2 and
CDK4 in the diagnostic groups considering only diffuse positivity.
Protein
Comparisons
WDLPS/DDLPS
vs. BAT/OMT
(n=129)
WDLPS vs. BAT
(n=36)
DDLPS vs. OMT
(n=93)
MDM2
Sensitivity 89,6% 89,4% 90%
Specificity 80% 94,1% 77,1%
PPV 56,5% 94,4% 32,1%
NPV 96,4% 88,9% 98,5%
Accuracy 82% 92% 78%
Youden’s J 0.69 0.83 0.67
Kappa (p) 0.57 (<0,001) 0.83 (<0,001) 0.37 (<0,001)
CDK4
Sensitivity 65,5% 63,1% 70%
Specificity 99% 100% 98,8%
PPV 95% 100% 87,5%
NPV 90,8% 70,8% 96,5%
Accuracy 91% 81% 96%
Youden’s J 0.64 0.63 0.68
Kappa (p) 0.72 (<0,001) 0.61 (<0,001) 0.75 (<0,001)
MDM2 e CDK4
Sensitivity 62% 57,8% 70%
Specificity 100% 100% 100%
PPV 100% 100% 100%
NPV 90,1% 68% 96,5%
Accuracy 91% 78% 97%
Youden’s J 0.62 0.57 0.7
Kappa (p) 0.71 (<0,001) 0.56 (<0,001) 0.8 (<0,001)
PPV=positive predictive value; NPV=negative predictive value; WDLPS=well-differentiated liposarcoma;
DDLPS=dedifferentiated liposarcoma; BAT=benign adipose tumors; OMT=other mesenquimal tumors
93
Table 7 – Sensitivity, specificity and Youden Index for MDM2 and CDK4
expression in WDLPS and DDLPS described in the literature.
Reports
Sensitivity
Specificity Youden’s J
MDM2 CDK4 MDM2 CDK4 MDM2 CDK4
Bihn et al
30
97% 92% 83% 95% 0.8 0.87
Sirvent et al
29
80% 87% 93% 100% 0.73 0.87
Our series
96,5% 68,9% 64% 95% 0.6 0.64
Diffuse positivity
89,6% 65,5% 80% 99% 0.69 0.64
94
Figure 1 – MDM2 immunostainings. (A) Case 29 – Diffuse immunostaining in a
retroperitoneal low grade DDLPS. (B) Case 23 – A non-conventional lipoma
stained focally in reactive cells. (C) Case 70 – Well differentiated area of a
DDLPS. (D) Case 27 – Sclerosing retroperitoneal WDLPS. (E) Case 13 –
Multinucleated giant tumoral cells in a high-grade DDLPS. (F) Case 17 – 48-
year-old woman; sclerosing retroperitoneal WDLPS.
95
Figure 2 – CDK4 immunostainings. (A) Case 75 – Lipoblast in a retroperitoneal
sclerosing WDLPS. (B) Case 29 – Diffuse immunostaining in a retroperitoneal
DDLPS. (C) Case 70 – Well differentiated area of a DDLPS. (D) Case 27 –
Sclerosing retroperitoneal WDLPS. (E) Case 18 – WDLPS adjacent to renal
parenchyma. (F) Case 17 – 48-year-old woman; sclerosing retroperitoneal
WDLPS.
96
MDM2 and CDK4 no diagnóstico do lipossarcoma bem diferenciado /
tumor lipomatoso atípico e lipossarcoma desdiferenciado: um estudo
imuno-histoquímico de 129 tumores de tecidos moles.
Aleixo PB
1
, Hartmann AA
2
, Menezes IC
3
, Meurer R
4
, Oliveira AM
5
1 – M.D., Programa de Pós-graduação em Patologia, UFCSPA, Porto Alegre,
Brasil.
2 – M.D., Ph.D., Professor Assistente de Patologia, UFSCPA, Porto Alegre,
Brasil.
3 – B.Sc., Faculdade de Biomedicina, UFCSPA, Porto Alegre, Brasil.
4 – M.Sc., Laboratório de Pesquisa em Patologia, Programa de Pós-graduação
em Patologia, UFCSPA, Porto Alegre, Brasil.
5 – M.D., Department of Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA.
97
Resumo
Os tumores de tecido adiposo estão entre os espécimes cirúrgicos
recebidos com maior freqüência na rotina dos laboratórios de patologia. São
considerados por muitos autores como o tipo mais comum de tumor de tecidos
moles. O lipossarcoma bem-diferenciado (LPS-BD) é o subtipo mais frequente
de lipossarcoma e pode ser confundido morfologicamente com vários tipos de
lipomas. O lipossarcoma desdiferenciado (LPS-DD) é um tumor constituído
histologicamente por um componente de sarcoma não-lipogênico de alto grau
adjacente a um LPS-BD. Quando o componente de LPS-BD não é identificado,
esse tumor é, muitas vezes, confundido com outros sarcomas de alto grau. Foi
demonstrado que LPS-BD e LPS-DD apresentam cromossomos marcadores
gigantes ou em anel supranumerários que contém sequencias amplificadas dos
genes MDM2 e CDK4. Identificou-se, também, que as proteínas
correspondentes MDM2 e CDK4 estão superexpressadas nesses tumores.
Assim, foi sugerida a técnica de imuno-histoquímica (IHQ) como um método
confiável para a identificação dessa característica fenotípica. Com o objetivo de
avaliar o suporte à aplicação no diagnóstico histopatológico do LPS-BD e LPS-
DD, este estudo realizou IHQ para investigar a expressão de MDM2 e CDK4
em uma série de 129 tumores de tecidos moles lipomatosos e não lipomatosos
arquivados em blocos de parafina. Os casos foram divididos em quatro grupos
de estudo: LPS-BD (n=19), LPS-DD (n=10), tumores adipocíticos benignos
(n=17) e outras neoplasias mesenquimais (n=83). Os resultados da IHQ para
MDM2 e CDK4 de cada grupo foram comparados. A sensibilidade e a
especificidade do teste positivo para identificar LPS-BD e LPS-DD entre as
outras neoplasias de tecidos moles foram determinadas. Identificamos, ainda,
98
uma porcentagem de células neoplásicas coradas positivas para melhor
caracterizar o padrão de expressão da proteína no tumor. A sensibilidade e
especificidade da imunomarcação positiva para MDM2 e CDK4 com o objetivo
de identificar LPS-BD entre vários tipos de lipomas foi de 100% e 58,8%, e
68,4% e 88,2%, respectivamente. Quando se tentou distinguir LPS-DD de
outras neoplasias mesenquimais a sensibilidade e especificidade foram de 90%
e 65% para MDM2, e 70% e 96,3% para CDK4. Nas duas situações a maior
especificidade foi atingida quando se considerou um caso positivo para MDM2
e CDK4 quando mais de 30% das células neoplásicas foram imunorreativas
(94,1% e 100%, e 77,1% and 98,8%, respectivamente). Este estudo conclui
que a detecção do aumento da expressão de MDM2 e CDK4 através da
técnica de IHQ pode ser usada para realizar o diagnóstico de LPS-BD e LPS-
DD. Conclui-se ainda que, considerando imunomarcação forte e difusa na
maioria das células neoplásicas, se tem o melhor resultado para identificar
esses tumores.
Palavras-chave: lipossarcoma bem-diferenciado, lipossarcoma
desdiferenciado, MDM2, CDK4, imuno-histoquímica, padrão de
imunomarcação.
99
1. Introdução
Os tumores de tecido adiposo estão entre os espécimes cirúrgicos
recebidos com maior freqüência na rotina dos laboratórios de patologia, sendo
considerado por muitos autores como o tipo mais comum de tumor de tecidos
moles.
1,2
Tumores lipomatosos benignos e malignos representam um grande
grupo de neoplasmas mesenquimais heterogêneos que podem ser difíceis de
diagnosticar em determinadas circunstâncias.
3
Lipossarcomas (LPS) são
neoplasias malignas agressivas, considerados por muitos estudiosos como
sendo o sarcoma de tecido mole mais comum no adulto.
1-3
A Organização
Mundial da Saúde
2
(OMS) divide esses tumores de origem adipocítica em
quatro subtipos: lipossarcoma bem-diferenciado (LPS-BD)/tumor lipomatoso
atípico (TLA), lipossarcoma desdiferenciado (LPS-DD), lipossarcoma mixóide-
células redondas (LPS-Mix/CR) e lipossarcoma pleomórfico (LPS-PL).
O LPS-BD é um tumor não metastatizante que frequentemente recorre
se sua excisão for incompleta e representa o subtipo mais prevalente de LPS.
2-
5
Morfologicamente, seu diagnóstico se baseia na identificação de células
estromais hipercromáticas atípicas circundadas por adipócitos mais maduros,
ao redor de vasos ou em áreas fibrosas do tumor, independente da presença
de lipoblastos. O LPS-BD pode se apresentar com histologia variada e são
classificados em lipoma-like (muito semelhante a um lipoma, com pequenas
traves fibrosas), esclerosante (componente fibroso extenso, algumas vezes
formando zonas não lipogênicas), inflamatório (presença de infiltrado
linfoplasmocitário denso) e de células fusiformes (presença de grande número
de células fusiformes similares a fibroblastos). Algumas vezes se apresentam
com áreas mixóides extensas (recapitulando o estroma do LPS-Mix/CR) ou
100
com áreas de diferenciação heteróloga (p. ex. leiomiosarcomatosa). Muitas
vezes o diagnóstico diferencial entre um LPS-BD e um lipoma pode ser difícil.
Esses tumores benignos podem mostrar características peculiares como
localização profunda e alterações degenerativas e, ainda, variações como a
presença de células pleomórficas ou fusiformes, que podem confundir o
patologista.
O LPS-DD é um tumor bifásico agressivo e metastatizante, que
apresenta características genéticas relacionadas ao LPS-BD. Frequentemente
se localiza no retroperitônio, na região inguinal e nos tecidos moles profundos
das extremidades.
2
Seu achado histopatológico definidor mostra uma transição
abrupta de um LPS-BD para outro sarcoma não lipogênico indiferenciado.
12
Essa área de sarcoma não lipogênico indiferenciado ou desdiferenciado pode
apresentar morfologia variada, indo desde um sarcoma indiferenciado
pleomórfico de alto grau (SIP) (também chamado histiocitoma fibroso maligno),
até uma lesão fascicular branda de baixo grau com células fusiformes, muito
semelhante as fibromatoses.
13-15
Mas este padrão bifásico, com colisão de dois
tumores, pode não estar sempre presente ou pode não ser identificado. Isto
ocorre quando tumores grandes são inadequadamente amostrados ou quando
patologistas dispõem apenas de biópsias incisionais. Sabe-se também que a
área desdiferenciada pode crescer ao ponto de fazer desaparecer quase
completamente o componente de LPS-BD.
1
Assim, ao se estudar um sarcoma
pleomórfico, deve-se sempre considerar o LPS-DD no diagnóstico diferencial,
principalmente no retroperitônio.
16
Esse conceito de desdiferenciação (ou progressão) histológica de um
LPS-BD para um LPS-DD foi caracterizado com estudos citogenéticos e
101
moleculares.
17-19
Células de LPS-BD possuem uma alteração genética
específica que é a presença de cromossomos marcadores em anel e/ou
gigantes supranumerários. Esse mesmo achado foi identificado posteriormente
em casos de LPS-DD.
18
Foi também demonstrado que esses cromossomos
anômalos possuem seqüências amplificadas de outros cromossomos,
destacando-se a região q14-15 do cromossomo 12.
20-21
Dois oncogenes com
funções importantes no ciclo celular, MDM2 e CDK4, se localizam na região
12q14-15 e estão constantemente amplificados e super-expressados em LPS-
BD/TLA e LPS-DD.
22-23
Essas características não são exclusivas de LPS-BD/LPS-DD e foram
descritas em outras neoplasias mesenquimais benignas e malignas. Muitas
dessas outras neoplasias podem simular morfologicamente LPS-BD/TLA e
LPS-DD (p. ex. lipomas e sarcomas indiferenciados pleomórficos).
24,25
Esses
achados morfológicos e genéticos levaram alguns autores a colocar LPS-BD e
LPS-DD, sob um ponto de vista conceitual, em uma mesma categoria.
1,4
Esse
enfoque foi similar ao da criação do conceito do espectro celular do
lipossarcoma mixóide/células redondas (LPS-Mix/CR), após a descoberta das
translocações t(12;16) e t(12;22), características desses tumores.
3
Essas
translocações específicas estão presentes tanto no extremo hipocelular de
baixo grau dessa neoplasia quanto no extremo hipercelular de alto grau em que
predominam células redondas pouco diferenciadas. Frequentemente, a
identificação dessas translocações é usada para realizar o diagnóstico do LPS-
Mix/CR.
2,26
A amplificação e aumento da transcrição dos genes MDM2 e CDK4 na
região 12q14-15 foi demonstrada em LPS-BD e LPS-DD através da técnica de
102
reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR).
27-29
Em
concordância com os resultados da RT-PCR, o aumento da expressão das
proteínas codificadas por esses genes, MDM2 e CDK4, foi detectado por
imunohistoquímica (IHQ).
22
Embora a imunomarcação de MDM2 e CDK4 seja
facilmente reproduzível em tumores de tecidos moles
30
, ela não se restringe
apenas a LPS-BD e LPS-DD. Sua positividade foi demonstrada em neoplasias
benignas de tecido adiposo
29
e em vários outros sarcomas
30
, mesmo sem
evidência de amplificação gênica.
29
Apesar disso, o uso de IHQ para MDM2 e
CDK4 foi sugerido como um método confiável para distinguir LPS-BD/LPS-DD
de outros tumores de tecidos moles benignos e malignos.
30-32
IHQ é a técnica de auxílio diagnóstico mais utilizado por patologistas no
cenário clínico rotineiro. Quando comparada às técnicas de hibridização in situ
(FISH, CISH, CGH) e também com RT-PCR, a IHQ mostrou-se uma ferramenta
diagnóstica confiável, rápida e barata. Alguns estudos
30, 32
já usaram IHQ para
verificar o status de MDM2 e CDK4 com finalidade diagnóstica. As duas
maiores séries que usaram a imunomarcação de MDM2 e CDK4 para
identificar LPS-BD e LPS-DD entre outros tumores de tecido adiposo e
neoplasias mesenquimais benignas e malignas sugeriram: (1) a combinação
das duas proteínas para conseguir melhor especificidade diagnóstica,
30
(2)
análise completa por FISH ou RT-PCR quando se encontrar um resultado de
IHC inesperado em um caso suspeito, ou em casos problemáticos com
características clínico-patológicas confusas.
29
Com o objetivo de dar suporte à aplicação clínica, este estudo realizou
IHQ para investigar a expressão de MDM2 e CDK4 em uma série de 129
tumores de tecidos moles lipomatosos e não lipomatosos arquivados em blocos
103
de parafina. Os casos foram divididos em quatro grupos de estudo: LPS-BD,
LPS-DD, tumores adipocíticos benignos e outras neoplasias mesenquimais. Os
resultados da IHQ para MDM2 e CDK4 de cada grupo foram comparados. A
sensibilidade e a especificidade do teste para identificar LPS-BD e LPS-DD
entre as outras neoplasias de tecidos moles foram determinadas. Além disso,
buscou-se identificar uma porcentagem de células tumorais positivas para
melhor caracterizar o padrão de marcação tumoral.
2. Material e método
2.1. Seleção dos Casos
Depois de aprovado pelo comitê de ética em pesquisa, cento e vinte e
nove casos de tumores de tecidos moles emblocados em parafina foram
selecionados do arquivo do Laboratório de Patologia do Hospital Santa Rita.
Esses casos foram estudados no Laboratório de Pesquisa em Patologia da
Universidade Federal De Ciências da Saúde de Porto Alegre (Porto Alegre, RS,
Brasil). O mínimo de um bloco de parafina com neoplasia viável foi necessário
para se incluir o caso no estudo. Todos os espécimes cirúrgicos foram fixados
em solução de formalina tamponada. Os casos selecionados tiveram
diagnóstico inicial entre os anos 1997 e 2007 e foram separadas as lâminas de
hematoxilina e eosina (HE) e seus respectivos blocos de parafina. Colorações
de imuno-histoquímica, quando presentes, foram avaliadas e dados clínicos
foram coletados. O material incluiu biópsias incisionais e excisionais de
tumores primários, recorrentes ou de metástases. O numero de lâminas em
cada caso variou entre 1 e 28. Todos os casos foram revisados e
104
reclassificados por dois patologistas (P.B.A. e A.A.H.) segundo a última
classificação da OMS de tumores de tecidos moles e ósseos. Casos
controversos foram revisados por um especialista em patologia de tecidos
moles (AMO). Em alguns casos foram realizados reações de IHQ e FISH
(Mayo Clinic, Rochester, MN, EUA) para corroborar o diagnóstico
histopatológico.
O diagnóstico final dos casos foram: lipossarcoma bem-
diferenciado/tumor lipomatoso atípico (n=19), lipossarcoma desdiferenciado
(n=10), lipoma de células fusiformes (LP-CF) (n=3), lipoma pleomórfico (LP-PL)
(n=2), lipoma não-convencional (LP-NC) (n=6), hibernoma (n=1), timolipoma
(n=1), angiomiolipoma (n=1), fibrolipoma neural (n=1), lipoma intramuscular
(n=1), fibrolipoma (n=1); angiossarcoma (n=1), tumor do estroma
gastrointestinal (GIST) (n=4), sarcoma sinovial (SS) (n=8), sarcoma de células
claras (n=1), lipossarcoma pleomórfico (LPS-PL) (n=2), lipossarcoma mixóide-
células redondas (LPS-Mix/CR) (n=4), tumor maligno de bainha periférica
(MPNST) (n=7), fibrossarcoma (FBS) (n=3), leiomiossarcoma (LMS) (n=8),
sarcoma de Kaposi (n=2), sarcoma epitelióide (SEPIT) (n=3),
dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) (n=1), sarcoma indiferenciado
pleomórfico (UPS) (n=26), hemangioendotelioma epitelióide (n=1),
osteossarcoma (n=3), rabdomiossarcoma (RMS) (n=2), mixofibrossarcoma
(MXFBS) (n=5), sarcoma fibromixóide de baixo grau (SFMBG) (n=1), tumor
fibroso solitário (SFT) (n=1).
105
2.2 Imuno-histoquímica
A reação de IHQ com anticorpos para MDM2 e CDK4 foi realizada em
material representativo da neoplasia emblocado em parafina. Cortes
histológicos de quatro micras de espessura foram montados em lâminas de
vidro silanizadas. Em seguida foram secadas em estufa por 60 minutos a 60
o
C
e foram deixadas descansando durante a noite em temperatura ambiente. No
dia seguinte, os corte foram desparafinados em xileno e reidratados em álcool.
Depois disso, as laminas foram colocadas em tampão de citrato (acido cítrico
0.01M, pH 6.0), sendo, em seguida, realizada recuperação antigênica em
banho-maria a 94
o
C por 40 minutos. A peroxidase endógena foi bloqueada
utilizando-se 95 ml de metanol mais 5 ml de solução de peróxido de hidrogênio
a 3%. A preparação foi então lavada com água destilada e solução de PBS.
Albumina de soro bovino foi usada para bloquear ligações de proteínas
não específicas. Os anticorpos primários MDM2 e CDK4 foram incubados
durante a noite a 4
o
C em uma câmara úmida escura. No dia seguinte, para a
revelação da reação foi aplicado o método de detecção através da técnica da
estreptoavidina-biotina-peroxidase, usando-se o kit LSAB mais o sistema HRP
da DAKO, conforme orientações do fabricante. As reações foram reveladas em
uma solução de diaminobenzidina (DAB) e foram contra-coradas durante um
minuto em hematoxilina. Controles positivos e negativos foram feitos em cada
rodada de coloração. Os dois anticorpos reagem com suas proteínas no núcleo
das células, sendo assim, qualquer coloração nuclear fraca, moderada ou forte
foi avaliada.
Os casos foram estratificados em quatro categorias de acordo com seu
padrão de coloração: (1) positividade difusa, quando mais de 30% das células
106
neoplásicas foram imunorreativas; (2) positividade moderada, quando 29% a
10% das células neoplásicas foram imunorreativas; (3) positividade focal,
quando menos de 10% das células neoplásicas foram imunorreativas e (4)
negativa, quando nenhuma célula neoplásica foi imunorreativa. A porcentagem
de células positivas foi determinada aproximadamente através da contagem de
100 células neoplásicas, com ocular em médio ou grande aumento, em pelo
menos cinco campos diferentes. Um ponto de corte de pelo menos 10% de
células neoplásicas com imunorreatividade nuclear de moderada a forte foi
definido como necessário para caracterizar como positiva a expressão de
MDM2 ou CDK4 nos tumores. As lâminas foram avaliadas independentemente
por dois patologistas (PBA e AAH) e casos discordantes foram reavaliados em
conjunto.
2.3 Hibridização in situ por fluorescência
A análise de hibridização in situ por fluorescência (FISH) foi realizada em
cortes histológicos não corados do material emblocado em parafina. A reação
seguiu protocolo já descrito
39
e utilizou sondas de amplificação para os genes
MDM2 e CPM. Controles apropriados para cada reação foram realizados.
2.4 Análise estatística
Os casos foram divididos em quarto grupos de estudo: (I) lipossarcoma
bem-diferenciado, (II) lipossarcoma desdiferenciado, (III) tumores adipocíticos
benignos (TAB) e (IV) outras neoplasias mesenquimais (ONM). Os resultados
da IHQ foram avaliados em cada grupo. A sensibilidade, a especificidade, os
valores preditivos e a acurácia para a positividade de expressão das proteínas
107
MDM2 e CDK4 nos grupos do LPS-BD/TLA e LPS-DD foram determinados.
Adicionalmente, foram avaliados esses resultados quando apenas casos com
positividade difusa foram considerados positivos.
A hipótese testada esperava que os casos dos grupos LPS-BD/TLA e
LPS-DD fossem positivos na IHQ para MDM2 e CDK2, e que fossem negativos
para esses marcadores nos grupos dos TAB e ONM. Considerando a
classificação histopatológica como o teste padrão-ouro, calculou-se a
sensibilidade de MDM2 e CDK4 dividindo o número de casos de LPS-BD ou de
LPS-DD com resultado positivo na IHQ pelo número total de casos em cada
grupo. A especificidade de MDM2 e CDK4 foi determinada dividindo o número
de casos de TAB ou ONM com resultado negativo na IHQ pelo número total de
casos em cada grupo.
O poder do teste diagnóstico investigado foi avaliado calculando os
valores de kappa (k) e o índice de Youden (J). O valor de kappa exclui o acaso
e deve ser pelo menos diferente de zero. O seu resultado demonstra a
proporção de concordância entre a classificação histológica e os resultados da
IHQ. O índice de Youden é o resultado da somatória da sensibilidade e da
especificidade menos 1, sendo o melhor índice o valor mais próximo de 1. A
significância estatística considerou um P<0.05.
3. Resultados
Os dados clínico-patológicos, os diagnósticos histológicos, os resultados
da imuno-histoquímica e a análise estatística estão detalhados nas tabelas 1 a
6.
108
3.1 Lipossarcoma bem-diferenciado (tabelas 1 e 4)
Dos dezenove casos de LPS-BD/TLA analisados, dois apresentavam
material de biópsia incisional (casos 32 e 126) e dezessete de biopsia
excisional. Em dois casos o material estudado foi de tumor recorrente (casos 1
e 18). Dez casos tinham morfologia semelhante a lipoma (lipoma-like) e oito
tinham estroma predominantemente esclerosante. Um caso demonstrou
numerosas células fusiformes com núcleos hipercromáticos, estroma mixóide e
alguns lipoblastos, sendo classificado como LPS-BD de células fusiformes
(caso 126). Os casos semelhantes a lipomas apresentavam adipócitos atípicos
com grande variação de tamanho, células estromais atípicas com núcleos
hipercromáticos e, às vezes, lipoblastos multivacuolados. Nos casos
esclerosantes, adipócitos maduros foram identificados em meio a um estroma
fibroso, colagenizado ou levemente mixóide, que, muitas vezes, formava áreas
não lipogênicas. A presença de lipoblastos não foi considerada necessária
para estabelecer o diagnóstico dos casos. Os casos 18 e 106 apresentavam
numerosas células em florete semelhantes às descritas no LP-PL e no LP-CF.
O caso 1 mostrou algumas áreas pequenas mixóides. O caso 16 mostrou focos
com células adiposas multivacuoladas semelhante às células de hibernoma
(célula hibernomatosas).
O resultado da imuno-histoquímica para MDM2 foi positivo em todos os
dezenove casos (100%) de LPS-BD/TLA (Fig. 1D,F). A expressão foi intensa e
difusa em 17 dos 19 casos (89,4%). Apenas dois tumores retroperitoniais
(casos 2 e 9) mostraram marcação em menos de 30% das células neoplásicas.
A imuno-histoquímica para CDK4 foi positiva em 13 dos 19 casos (68,4%),
sendo intensa e difusa em doze casos (92,3%) (Fig. 2A,D-F) No caso 106, a
109
marcação do CDK4 foi moderada, corando em menos de 30% das células
neoplásicas. A expressão tanto de MDM2 quanto de CDK4 foi observada em
13 dos 19 casos (68,4%), sendo forte e difusa em 11 dos 13 casos (84,6%). O
caso 106 que mostrou positividade moderada para CDK4 teve imunomarcação
forte e difusa para MDM2.
3.2 Lipossarcoma desdiferenciado (tabelas 1 e 4)
Foram analisados 10 lipossarcomas desdiferenciados, todos sendo
biópsias excisionais. Em três casos (casos 19, 68 e 73) o tecido estudado foi
de uma lesão recorrente (30%). Sete casos (70%) se desenvolveram no
retroperitônio, dois (20%) na coxa e um (10%) na pelve. O achado
histopatológico definidor em todos os casos foi a identificação de uma área
com morfologia de LPS-BD adjacente a outro sarcoma não lipogênico de alto
ou baixo grau.
A histologia na área desdiferenciada mostrou um sarcoma de alto grau
em oito casos (80%), de grau intermediário em um caso (10%) e de baixo grau
em um caso (10%). O componente desdiferenciado em seis dos oito casos
(75%) de alto grau foi um sarcoma indiferenciado pleomórfico (histiocitoma
fibroso maligno). Nos casos 68 e 70, além das células pleomórficas de alto
grau, foram identificadas extensas áreas de estroma mixóide. Especificamente
no caso 70, essas áreas eram quase indistinguíveis das de um
mixofibrossarcoma. A área desdiferenciada do caso 29 mostrou um sarcoma
fusocelular de baixo grau, constituído por células fusiformes em fascículos
curtos semelhantes a uma lesão fibroblástica. O índice mitótico nessa área
atingiu nove mitoses por dez campos de grande aumento. O caso 127 foi
110
considerado um sarcoma de grau intermediário e demonstrou nódulos neural-
like com formação de tecido ósseo metaplásico na área desdiferenciada.
A imuno-histoquímica para MDM2 foi positiva em 9 dos 10 casos (90%)
de LPS-DD (Fig. 1A,C,E). A positividade foi intensa e difusa em todos os nove
casos (100%). O caso 19 mostrou marcação fraca e focal em menos de 10%
das células neoplásicas, sendo considerado negativo para MDM2. A imuno-
histoquímica para CDK4 foi positivo em sete dos dez casos (60%) de LPS-DD,
sendo intensa e difusa em todos os sete casos (100%) (Fig. 2B,C). O resultado
foi positivo tanto para MDM2 quanto para CDK4 em sete casos (70%) de LPS-
DD, sendo a marcação forte e difusa em todos os sete casos (100%).
3.3 Tumores adipocíticos benignos (tabelas 2 e 4)
O material utilizado em todos os dezessete casos de TAB foi de biópsia
excisional. Em um caso, o tecido estudado foi de um tumor recorrente (caso
110). Os seis casos de lipoma não-convencional selecionados apresentavam
características peculiares (tamanho, localização ou morfologia), onde se impôs
o diagnóstico diferencial com um LPS-BD. Entretanto, usando critérios
histológicos estritos (ausência de células estromais atípicas), esses casos
foram classificados como tumores de tecido adiposo benignos. Dois casos
mostraram alterações degenerativas (casos 12 e 23) que incluiu
esteatonecrose, variação de tamanho em adipócitos, presença de
miofibroblastos e células gigantes multinucleadas reativas. O caso 12 se
tratava de um lipoma profundo grande localizado na musculatura profunda do
dorso, que apresentava células simulando lipoblastos e atipias em adipócitos.
Esse caso não demonstrou amplificação de MDM2 por FISH (Mayo Clinic, MN,
111
EUA). Os casos 24 e 113 mostravam áreas de estroma mixóide levemente
hipercelular. Dois lipomas grandes em regiões glútea (caso 26) e inguinal (caso
47) apresentavam adipócitos com variação de tamanho e núcleos aumentados
de volume.
O caso 35 era um tumor de coxa de grandes dimensões classificado
como hibernoma lipoma-like, que apresentava estroma com extensas áreas de
fibrose. Esse caso não apresentou amplificação do gene CPM por FISH (Mayo
Clinic, MN, USA). Os três casos de LP-CF (casos 11, 49 e 110) apresentavam
células fusiformes em meio a um tecido adiposo maduro e com estroma
contendo colágeno fibrilar abundante. No caso 49, o estroma fibroso
predominou e um colágeno mais denso foi observado.
Os dois casos de LP-PL (casos 3 e 128) mostraram morfologia
semelhante aos LP-CF, além da presença de numerosas células
multinucleadas hipercromáticas (células em florete). O caso 128 não
apresentou amplificação do gene CPM por FISH (Mayo Clinic, MN, USA).
Todos os casos de lipoma de células fusiformes e lipoma pleomórfico foram
positivos para CD34 na IHQ. O restante dos TAB estudados mostrou
morfologia padrão descrito na literatura e consistiram em: um angiolipoma
(caso 55), um fibrolipoma (caso 25), um timolipoma (caso 6), um fibrolipoma
neural (caso 42) e um lipoma intramuscular (caso 76).
A imuno-histoquímica para MDM2 foi positiva em 7 dos 17 casos de TAB
(41,1%). A positividade foi intensa e difusa em apenas um caso (caso 110) dos
sete positivos (14,2%). Os outros seis casos positivos (85,7%) mostraram
positividade focal em menos de 30% das células neoplásicas (casos 23, 25, 49,
55, 76 e 113) (Fig. 1B). A imuno-histoquímica para CDK4 foi positiva em dois
112
dos dezessete casos (11,7%). Nenhum desses casos demonstrou marcação
forte e difusa. Um LP-PL (caso 3) e um LP-CF (caso 49) mostrou marcação
moderada em menos de 30% das células neoplásicas. De todos os casos de
TAB, apenas o caso 49 (5,8%) foi positivo tanto para MDM2 quanto para
CDK4, sendo as duas proteínas expressas em baixos níveis (imunomarcação
moderada).
3.4 Outras neoplasias mesenquimais (tabelas 3 e 4)
Os espécimes cirúrgicos analisados das 83 outras neoplasias
mesenquimais consistiram em 72 biópsias excisionais e 11 de biópsias
incisionais. Em nove casos o material estudado foi de tumor recorrente (casos
20, 30, 34, 43, 46, 64, 94, 101 e 117) e em quatro casos, de tumor metastático
(casos 33, 37, 86 e 95). Todos os 26 casos de sarcoma indiferenciado
pleomórfico de alto grau se tratavam de tumores hipercelulares heterogêneos,
constituídos por células pleomórficas e/ou fusiformes, com marcado
pleomorfismo nuclear. O padrão de proliferação incluía áreas fasciculares,
estoriformes ou difusas. Em alguns casos, era frequente a presença de células
gigantes tumorais multinucleadas (caso 63), células rabdóides (casos 71 e 122)
ou células epitelióides (caso 96). Nenhuma linhagem celular específica de
diferenciação foi identificada nesses tumores.
Os oito casos de leiomiosarcoma (casos 34, 41, 45, 53, 56, 61, 82 e 90)
mostraram características morfológicas e imuno-histoquímicas de diferenciação
para músculo liso. A celularidade na maioria dos casos mostrou células
eosinofilicas fusiformes formando fascículos curtos. Em três casos áreas
pleomórficas foram identificadas (casos 41, 45 e 61). O caso 53 demonstrou
113
uma morfologia peculiar com presença de células eosinofílicas epitelióides e
rabdóides dentro de um estroma semelhante à osteóide com focos de
ossificação metaplásica. Nesse caso o estudo IHC mostrou positividade para
vimentina, desmina, actina músculo específica e actina de músculo liso, sendo
negativa para citoqueratinas, S100, CD34, MYOD1 e miogenina.
Os casos de sarcoma sinovial foram classificados como tipo monofásico
fibroso em cinco casos (casos 36, 64, 80, 94 e 99), bifásico em dois casos
(casos 37 e 60) e como pouco diferenciado em um caso (caso 92). Em todos
os casos positividade para EMA (antígeno de membrana epitelial) e/ou
citoqueratina foi vista. Os sete casos de tumor maligno de bainha de nervo
periférico tiveram diagnóstico baseado na morfologia e evidencia IHQ de forte
expressão da proteína S100. Todos os casos mostraram células fusiformes
tortuosas em fascículos, contendo zonas hipercelulares e hipocelulares e,
ainda, presença de vasos com paredes esclerosadas. Dois casos tiveram um
diagnóstico prévio de neurofibroma no mesmo local (casos 59 e 81). Em alguns
casos foram identificadas características como matriz condróide/osteóide (caso
59 e 81) ou presença de células gigantes tumorais (casos 59 e 101). Os cinco
casos de mixofibrosarcoma exibiram um estroma mixóide abundante, com
presença de vasos curvilíneos e com células fusiformes, estreladas ou
pleomórficas contendo núcleos hipercromáticos atípicos. Dois casos foram
classificados como de baixo grau (casos 20 e 79) e três de alto grau (casos 30,
43 e 46).
Os quatro casos de lipossarcoma mixóide/células redondas (casos 31,
52, 57 e 85) exibiram células fusiformes brandas dentro de um estroma mixóide
abundante, que apresentava uma complexa rede vascular constituída por
114
capilares, e com presença de alguns lipoblastos. Um caso mostrou áreas
pouco diferenciadas com células redondas (caso 57). Dois casos de LPS-PL
(casos 40 e 100) foram diagnosticados pela identificação de lipoblastos
pleomórficos multivacuolados. O caso 40 mostrou estroma com áreas
semelhantes a um MXFBS.
Os casos de GIST, dois malignos (casos 8 e 66) e dois de baixo risco
(casos 87 e 117), foram positivos na IHQ para CD117 (c-KIT) e CD34. Os três
casos de FBS (casos 7, 39 e 63) mostraram uma proliferação de células
fusiformes em fascículos entrelaçados na sua maior parte, com deposição de
colágeno entre as células. Vimentina foi a única proteína identificada por IHQ
nesses casos. Os três casos de SEPIT (casos 95, 123 e 125) estudados eram
do tipo distal e mostraram morfologia com células epitelióides atípicas
circundando extensas áreas necrosadas.
Os dois casos de rabdomiossarcoma, um alveolar (caso 97) e um
pleomórfico (caso 98), mostraram expressão difusa para desmina e MyoD1.
Os demais casos mostraram morfologia clássica descrita. O angiossarcoma
pouco diferenciado (caso 72) foi fortemente positivo para CD31. Também foram
identificados dois casos de sarcoma de Kaposi positivos para HHV8 por IHQ
(casos 111 e 115), dois osteossarcomas convencionais (casos 58 e 103), um
osteossarcoma de tecidos moles (caso 69), um sarcoma fibromixóide de baixo
grau (caso 91), um sarcoma de células claras positivo para S100 e HMB45
(caso 125), um hemangioendotelioma epitelióide de cavidade abdominal (caso
102), um DFSP (caso 67) e um tumor fibroso solitário positivo para CD34 (caso
88).
115
A imuno-histoquímica para MDM2 foi positiva em 29 dos 83 casos
(34,9%) do grupo dos outros tumores mesenquimais. A positividade foi intensa
e difusa em 19 casos dos 29 positivos (65,5%): seis SIP-AG, dois MPNST, dois
LMS, dois MXFBS, dois SS, um FBS, um DFSP, um LPS-Mix/CR, um SFMBG
e um SEPIT. Dez casos (34,4%) mostraram marcação moderada em menos de
30% das células neoplásicas: quatro SIP-AG, dois GIST, dois MXFBS, um
LPS-PL e um MPNST. A imuno-histoquímica para CDK4 foi positiva em 3 dos
83 casos (3,6%) do grupo dos outros tumores mesenquimais, sendo intensa e
difusa apenas em um caso de SIP (caso 21). Um caso de LPS-PL (caso 40) e
um caso de MXFBS (caso 43) mostraram marcação moderada em menos de
30% das células neoplásicas. A marcação positiva tanto para MDM2 quanto
para CDK4 foi vista em dois dos 83 casos (2,4%) e a imunoreatividade foi
apenas moderada nos dois casos (casos 40 e 43).
3.5 Análise Estatística (tabelas 5 e 6)
A análise estatística está resumida nas Tabelas 5 e 6. Sozinhos ou em
conjunto, tanto MDM2 quanto CDK4 tiveram boa acurácia para detectar LPS-
BD e LPS-DD entre outros tumores de tecidos moles. A sensibilidade e
especificidade da expressão positiva para MDM2 e CDK4 nos LPS-BD/LPS-DD
foi de 96,5% e 64%, e 68,9% e 95%, respectivamente. A combinação da
positividade de MDM2 mais CDK4 num mesmo tumor elevou a especificidade
do teste para 97% e a acurácia para 91%, ficando a sensibilidade inalterada.
Entretanto, esse último resultado teve um bom poder diagnóstico (J=0.66) com
bom índice de concordância pela classificação histopatológica (k=0.71).
Quando apenas casos com expressão forte e difusa para MDM2 e CDK4 foram
116
considerados positivos, o teste ganhou em especificidade (80% e 99%,
respectivamente) e perdeu em sensibilidade (89,6% e 65,5%,
respectivamente). Em combinação, a expressão difusa tanto de MDM2 quanto
de CDK4 elevou a especificidade para 100% e diminuiu a sensibilidade para
62%, mas, no geral, o teste manteve um bom poder diagnóstico (J=0.62;
k=0.71).
Ao se distinguir LPS-BD/TLA de outros tumores adipocíticos benignos, a
sensibilidade e a especificidade da expressão positiva de MDM2 e CDK4 foram
de 100% e 58,8%, e 68,4% e 88,2%, respectivamente. A combinação de
MDM2 e CDK4 elevou a especificidade do teste para 94,1%, sem alteração na
sensibilidade, sendo considerado um bom teste diagnóstico (J=0.62; k=0.61).
Ao se considerar apenas os casos com expressão difusa para MDM2 e CDK4
como casos positivos, o teste aumentou em especificidade (94,1% e 100%,
respectivamente) e perdeu em sensibilidade (89,4% e 63,1%,
respectivamente). Isoladamente MDM2 se tornou teste com alto poder
diagnóstico (J=0.83, k=0.83). Em combinação, a expressão difusa tanto de
MDM2 quanto de CDK4 elevou a especificidade para 100% e diminuiu a
sensibilidade para 57,2% (J=0.57; k=0.56).
Ao se distinguir LPS-DD de outras neoplasias mesenquimais, a
sensibilidade e a especificidade da expressão positiva de MDM2 e CDK4 foram
de 90% e 65%, e 70% e 96,3%, respectivamente. A combinação de MDM2 e
CDK4 elevou a especificidade do teste para 97,5%, sem alteração na
sensibilidade, sendo considerado um bom teste diagnóstico (J=0.67; k=0.7). Ao
se considerar apenas os casos com expressão difusa para MDM2 e CDK4
como casos positivos, o teste aumentou em especificidade (77,1% e 98,8%,
117
respectivamente) e não sofreu alterações na sensibilidade. Em combinação, a
expressão difusa tanto de MDM2 quanto de CDK4 elevou a especificidade do
teste para 100%, sem alterações na sensibilidade, tornando-se também um
teste com bom poder diagnóstico (J=0.7; k=0.8).
4. Discussão
Neoplasias de tecido adiposo comumente causam dificuldades
diagnósticas para os patologistas cirúrgicos. Muitos tumores benignos de tecido
adiposo, excluindo-se lipomas subcutâneos superficiais, apresentam
características como localização profunda (lipomas profundos), padrão
infiltrativo (lipomas inter e intramusculares) ou alta celularidade (lipomas
pleomórficos ou de células fusiformes)
3
, que fazem com que patologistas
considerem o LPS-BD no diagnóstico diferencial. Da mesma forma, pode ser
difícil classificar e diferenciar alguns subtipos de sarcomas (SIP, FBS e
MXFBS) dos sarcomas não lipogênicos presentes nas áreas desdiferenciadas
de LPS-DD.
12
Isso geralmente acontece quando o componente bem-
diferenciado de um LPS-DD não é identificado próximo à área desdiferenciada
desse tumor (p.ex. em biópsias incisionais e tumores com amostra
inadequada).
1,34
O LPS-BD e o LPS-DD compartilham do mesmo perfil
genômico, caracterizado pela presença de cromossomos supranumerários em
anel e/ou gigantes, que possuem sequências amplificadas da região do
cromossomo 12q14-15.
18,20-22
Entre os vários genes contidos nessa região
cromossômica (MDM2, CDK4, HMGA2, OS9 e SAS), dois deles, MDM2 e
CDK4, estão constantemente amplificados e superexpressados nesses
118
tumores.
20,22-25
Essa observação foi confirmada por métodos diagnósticos
como FISH e RT-PCR.
26-28
A IHQ é uma das ferramentas diagnósticas cada vez mais usadas por
patologistas na rotina laboratorial. A implantação de técnicas de diagnóstico
molecular, como RT-PCR e hibridização in situ (p.ex. FISH e CISH), ainda tem
custo muito alto para pequenos laboratórios de patologia cirúrgica. A IHQ não
desempenha um papel muito importante no diagnóstico diferencial de tumores
lipomatosos;
2,4
raramente pode se utilizar a imunomarcação para a proteína
S100, pois ela identifica células adipocíticas e lipoblastos em lipossarcomas.
2
Recentemente, foi demonstrado através de IHQ que o receptor nuclear PPAR-γ
(peroxisome proliferator-activated receptor gamma), responsável pela
regulação do crescimento e diferenciação dos adipócitos, ainda continua
expresso em áreas não lipogênicas indiferenciadas de LPS-DD.
35
Nesse estudo, examinou-se a expressão de MDM2 e CDK4 por IHQ em
uma série de tumores de tecidos moles e foi demonstrado que a marcação
positiva para essas proteínas pode ser usada para identificar LPS-BD/TLA
entre tumores adipocíticos benignos e, também, LPS-DD entre outras
neoplasias mesenquimais (incluindo SIP). Em nossa série, a IHQ para MDM2
foi positiva em todos os dezenove (100%) casos de LPS-BD, sendo que a
maioria desses casos (13 de 19) também foi positiva para CDK4. No grupo de
dezessete tumores de tecido adiposo benignos, MDM2 foi positivo em sete
(41,1%) casos e CDK4 foi positivo em somente dois casos (11,7%). Quando se
tentou diferenciar LPS-BD de tumores adipocíticos benignos, MDM2
demonstrou boa sensibilidade (100%) e CDK4 demonstrou boa especificidade
(88,2%). Esses resultados são similares àqueles relatados por Binh et al.
30
119
(100% e 96%, respectivamente) em um estudo com 44 LPS-BD e com 48
tumores de tecido adiposo benigno (Tabela 7). Também em concordância com
o relatado naquele estudo, a combinação da imunomarcação de MDM2 e
CDK4 aumentou a especificidade do teste para 94,1%. Além disso, foi
demonstrado neste estudo que é melhor considerar um caso positivo somente
quando a imunomarcação for forte e difusa em mais de 30% de células
neoplásicas para, assim, atingir a melhor especificidade para MDM2 (94,1%) e
CDK4 (100%) quando esses anticorpos forem usados separadamente.
Todos os casos de LP-PL e LP-CF deste trabalho tiveram marcação
positiva difusa para CD34, achado característico que também é usado para
realizar o diagnóstico desses tumores. A marcação de MDM2 e CDK4 nesses
subtipos de lipomas já foi relatada em um estudo.
30
No presente estudo foi
observado imunomarcação para MDM2 em dois casos de LP-CF e de CDK4
em um caso de LP-PL e um caso de LP-CF. Foram realizados estudos
citogenéticos moleculares com FISH (Mayo Clinic, MN, EUA) em três dos
tumores adipocíticos benignos da amostra (um lipoma profundo não
convencional, um hibernoma gigante e um LP-PL). Os resultados mostraram
que as células neoplásicas desses tumores não mostraram amplificação dos
genes MDM2 (caso 12) e CPM (carboxipeptidase M) (casos 65 e 128). Os
resultados da IHQ nesses três casos foram negativos para imunomarcação
tanto de MDM2 quanto de CDK4. O gene CPM é telomérico ao lócus de MDM2
no cromossomo 12q15 e está co-amplificado com MDM2 em praticamente
todos os casos de LPS-BD/TLA (dados não publicados, Dr. Oliveira, Mayo
Clinic, MN). Após reavaliação dos resultados inesperados na IHQ, realizamos
IHQ para CD34 no caso classificado como fibrolipoma (caso 42). A reação
120
revelou algumas células positivas para CD34 e a possibilidade do diagnóstico
de um fibroma tipo Gardner foi considerada para este caso.
Quando superexpressadas, as proteínas MDM2 e CDK4 atuam como
oncoproteínas estimulando o ciclo celular nas fases G1 e S.
36,37
MDM2 atua na
regulação dos níveis da proteína P53 através da inativação de sua atividade de
transcrição, ligação e degradação. A proteína P53 atua parando o ciclo celular
e também causando apoptose frente a danos no DNA nuclear, sendo
conhecida como guardião do genoma. Normalmente os níveis de MDM2 são
regulados pela própria transativação do P53, isso porque ele atua diminuindo a
transcrição do gene MDM2, criando, assim, um feedback negativo
autoregulatório.
36
Já a proteína CDK4, após ser ativada pelas ciclinas do tipo D,
atua na fosforilação e inativação da proteína retinoblastoma (RB), que ativa e
libera as proteínas E2F necessárias para progressão do ciclo celular na
transição G1-S.
37
O aumento da expressão dessas duas proteínas (MDM2 e
CDK4) pode levar a uma perda de controle do ciclo celular com o consequente
desenvolvimento de neoplasias.
36-38
Esse mecanismo de oncogênese através
de amplificação gênica com superexpressão de oncoproteínas pode ser
importante no desenvolvimento do LPS-BD e LPS-DD.
30
A expressão de MDM2
e CDK4 foi também detectada por IHC em outros tumores como MXFBS, SIP
(histiocitoma fibroso maligno), TMBNP, LMS, RMS, SS e carcinomas
sarcomatóides.
29,30
Neste estudo foi observado através de
IHQ que 90% (9/10) dos casos de LPS-DD tiveram imunomarcação positiva
para MDM2 e que 70% (7/10) foram positivos para CDK4. No outro grupo com
vários tipos de tumores mesenquimais, MDM2 foi expresso em 29 dos 83
121
(34,9%) casos e CDK4 foi expresso em somente três (3,6%) casos. Quando se
tentou identificar LPS-DD entre outras neoplasias mesenquimais (incluindo
seus simuladores), MDM2 demonstrou boa sensibilidade (90%) e CDK4
demonstrou boa especificidade (96,3%). Esses resultados corroboram o que foi
relatado por Binh et al.
30
, os quais obtiveram 95% de sensibilidade e de
especificidade para MDM2 e CDK4, respectivamente. Também foi constatado
no presente trabalho que a combinação dos resultados da imunomarcação
para MDM2 e CDK4 aumentou a especificidade do teste (97,5%). Além disso,
foi demonstrado que a maneira mais específica de se identificar LPS-DD entre
outros sarcomas através de IHQ é usar MDM2 junto com CDK4, considerando
um caso positivo apenas quando a imunomarcação for forte e difusa em mais
de 30% das células neoplásicas (97,5%).
Em outro estudo, a IHQ foi utilizada para investigar alterações de MDM2
e CDK4 em 200 tumores, sendo depois os resultados comparados com
estudos moleculares de FISH e RT-PCR.
29
Os seus achados observaram que
vários tumores expressaram intensamente as duas proteínas, mesmo na
ausência de amplificação gênica comprovada por estudo molecular. Esses
achados sugerem a existência de outro mecanismo de aumento de expressão
protéica diferente da amplificação gênica nesses casos. Os autores afirmaram,
então, que a imunomarcação de MDM2 ou CDK4 através de IHQ sozinha não é
suficiente para diagnosticar LPS-BD/LPS-DD. No presente estudo, foi
encontrada expressão de MDM2 em dez SIP, quatro MXFBS, um FBS, dois
LMS, três TMBNP, dois SS, um SEPIT, dois GIST, um DFSP, um LPS-Mix/CR,
um LPS-PL e um SFMBG; e expressão de CDK4 em um SIP, um MXFBS e um
122
LPS-PL. Após revisão dos resultados inesperados de IHQ nesse grupo de
tumores mesenquimais, nenhuma área de LPS-BD foi encontrada.
Embora não se possa excluir totalmente que alguns desses casos
possam ser de fato LPS-DD (p.ex. caso 35), esse estudo reforça que apenas a
imunomarcação de MDM2 possui baixa especificidade para diagnosticar LPS-
DD. Deve-se considerar, também, que, possivelmente, o teste de IHQ positivo
para MDM2 em alguns desses casos seja um resultado falso-positivo.
Possibilidade que influenciaria negativamente na especificidade do teste com
essa proteína. Estudos adicionais através de técnicas moleculares são
necessários para investigar o status da amplificação gênica de MDM2 e CDK4
nesses tumores.
Em resumo, os resultados desse estudo permitem concluir que a
detecção da superexpressão das proteínas MDM2 e CDK4 através de IHQ
pode ser usada por patologistas experientes para realizar o diagnóstico de
LPS-BD e LPS-DD. Qualquer característica diagnóstica discrepante ou
resultado IHQ inesperado deve motivar um estudo molecular complementar
com FISH ou RT-PCR, por exemplo, para identificar o status de amplificação
gênica MDM2 e CDK4. A melhor especificidade para realizar o diagnóstico de
LPS-BD e LPS-DD foi conseguida quando se combinou os resultados de
imunomarcação para MDM2 e CDK4 nos mesmo tumor. Além disso, foi
demonstrado que a especificidade pode ser ainda mais alta, se o caso for
considerado positivo apenas quando apresentar imunomarcação forte e difusa
em mais de 30% das células neoplásicas.
123
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127
Tabela 1
– Características clínico-patológicas, diagnóstico, morfologia e expressão imuno-histoquímica nos casos de LPS-BD e LPS-DD.
Caso
No.
SEXO/IDADE
Localização/Tamanho (cm)
Diagnóstico
Subt
ipo /
Morfologia da área
desdiferenciada
IHQ MDM2/CDK4
Padrão de
coloração
MDM2/CDK4
Considerações
1 M / 65
Retroperitônio / 17
LPS-BD
Lipoma-like
+ / +
1 / 1
Estroma com áreas mixóides
2 M / 76
Retroperitônio / 15
LPS-BD
Esclerosante + / +
2 / 1
4 M / 68
Torácica / 7
LPS-BD
Lipoma-like
+ / - 1 / 4
5 M / 63
Retroperitônio / 31
LPS-BD
Esclerosante
+ / - 1 / 3
9 M / NI
Retroperitônio / 44
LPS-BD
Esclerosante
+ / - 2 / 4
10 M / 59
Retroperitônio / 10
LPS-DD
SIP
+ / + 1 / 1
13 M / 35
Retroperitônio / 17
LPS-DD
SIP
+ / + 1 / 1
14 M / 72
Cervical / BI
LPS-BD
Lipoma-like
+ / - 1 / 4
16 M / 66
Coxa / 6
LPS-BD
Lipoma-like
+ / + 1 / 1
Com células hibernomatosas
17 F / 48
Retroperitônio / 25
LPS-BD
Esclerosante
+ / + 1 / 1
18 M / 58
Retroperitônio / 19
LPS-BD
Lipoma-like
+ / + 1 / 1
Com células em florete
19 F / 73
Coxa / 33
LPS-DD
SIP
- / - 3 / 4
22 F / 32
Perna / 14
LPS-BD
Lipoma-like
+ / - 1 / 4
27 M / 77
Retroperitônio / 12
LPS-BD
Esclerosante
+ / + 1 / 1
28 F / 55
Retroperitônio / 11
LPS-DD
SIP
+ / + 1 / 1
29 F / 73
Retroperitônio / 24
LPS-DD
SF-BG
+ / + 1 / 1
32 NI / NI
Joelho / BI
LPS-BD
Esclerosante
+ / + 1 / 1
38 NI / NI
NI / NI
LPS-BD
Esclerosante
+ / + 1 / 1
50 F / 49
Coxa / 7
LPS-BD
Lipoma-like
+ / - 1 / 4
51 M / 58
Coxa / 10
LPS-DD
SIP
+ / - 1 / 4
68 F / 80
Pelve / 22
LPS-DD
SIP-Mix
+ / - 1 / 4
70 F / 80
Retroperitônio / 35
LPS-DD
MXFBS-like
+ / + 1 / 1
73 M / 65
Retroperitônio / 15
LPS-DD
SIP
+ / + 1 / 1
75 M / 70
Retroperitônio / 40
LPS-BD
Esclerosante
+ / + 1 / 1
106 F / 49
Braço / 15
LPS-BD
Lipoma-like
+ / + 1 / 2
112 M / 56
Couro Cabeludo / 5
LPS-BD
Esclerosante
+ / + 1 / 1
126 M / 54
Cervical / 10
LPS-BD
Células fusiformes
+ / + 1 / 1
Estroma mixóide
127 F / 38
Retroperitônio / 6
LPS-DD
Nódulos neural-like
+ / + 1 / 1
Com metaplasia óssea
129 M / 47
Flanco / 7
LPS-BD
Lipoma-like
+ / + 1 / 1
BI=biópsia incisional; NI=não informado; SIP=sarcoma indiferenciado pleomórfico; LPS-BD=lipossarcoma bem-diferenciado; LPS-DD=lipossarcoma desdiferenciado; SF-BG=sarcoma fusocelular de baixo grau; SIP-
Mix=sarcoma indiferenciado pleomórfico mixóide; MXFBS= mixofibrossarcoma; LPS-Mix=lipossarcoma mixóide; IHQ=imuno-histoquímica.
128
Tabela 2
– Características clínico-patológicas, diagnóstico histológico e expressão imuno-histoquímica dos tumores adipocíticos benignos.
Caso
No.
SEXO/IDADE
Localização/Tamanho
(cm)
Diagnóstico Morfologia
IHQ
MDM2/CDK4
Padrão de coloração
MDM2/CDK4
Considerações
3 M / 51
Cervical / 4
LP-PL
Numerosas células em florete, colágeno
fibrilar
- / +
4 / 2
CD34+
6 F / 24
Mediastino / 8
TLP
Adipócitos com padrão infiltrativo - / -
4 / 4
11 F / 72
Cervical / 3
LP-CF
Células fusiformes, colágeno fibrilar
- / -
4 / 4
CD34+
12 M / 33
Dorso / 15
LP-NC
Esteatonecrose, núcleos atípicos, células
miofibroblásticas reativas, efeito lockern
- / -
4 / 4
Sem amplificação de
MDM2 por FISH*
23 M / 44
Dorso / 3
LP-NC
Esteatonecrose, núcleos atípicos, células
miofibroblásticas reativas
+ / -
2 / 4
24 M / 49
Cervical / 15
LP-NC
Estroma mixóide
- / -
4 / 4
25 F / 19
Joelho / 14
FBLP
Estroma fibroso, esclerótico
+ / -
2 / 4
26 F / 32
Glúteo / 15
LP-NC
Variação no tamanho adipócitos e núcleos
aumentados
- / -
4 / 4
42 M / 28
Mão / 2
FBLPN
Adipócitos com padrão infiltrativo
- / -
4 / 4
47 F / 41
Inguinal / 13
LP-NC
Variação no tamanho dos adipócitos e
núcleos aumentados
- / -
4 / 4
49 F / 45
Cervical / 3
LP-CF
Células fusiformes, colágeno fibrilar
+ / +
2 / 2
CD34+
55 F / 37
Rim / 12
AMLP
Invasão da gordura perirrenal
+ / -
2 / 4
65 M / 35
Coxa / 38
HIB
Células hibernomatosas vacuoladas e
estroma fibrosado
- / -
4 / 4
Sem amplificação de
CPM por FISH*
76 M / 37
Coxa / 25
LP-IM
Células hibernomatosas, padrão infiltrativo
+ / -
2 / 4
110 F / 62
Malar / NI
LP-CF
Células fusiformes, colágeno fibrilar
+ / -
1 / 4
CD34+
113 F / 57
Mão / 7
LP-NC
Estroma mixóide
+ / -
2 / 4
128 F / 47
Braço / 4
LP-PL
Células hipercromáticas, colágeno fibrilar
- / -
4 / 4
CD34+ , Sem
amplificação de CPM por
FISH*
M=masculino; F=feminino; LP-PL=lipoma pleomórfico; TLP=timolipoma; LP-CF=lipoma de células fusiformes; LP-NC=lipoma não-convencional; FBLP=fibrolipoma; FBLPN=fibrolipoma neural; AMLP=angiomiolipoma;
HIB=hibernoma; LP-IM=lipoma intramuscular.
*Mayo Clinic, Rochester, MN, EUA.
129
Tabela 3
– Características clínico-patológicas, diagnóstico, morfologia e expressão imunohistoquímica nas outras neoplasias mesenquimais.
Caso No. SEXO/IDADE Localização/Tamanho (cm) Diagnóstico Morfologia
IHQ
MDM2/CDK4
Padrão de
coloração
MDM2/CDK4
Considerações
7 M / 14 Língua / 3 FBS Fusocelular - / - 3 / 3 Baixo grau
8 M / 69 Cólon / 22 GIST Maligno fusocelular - / - 4 / 4 CD117+, CD34+
15 M / 71 Perna / NI MPNST - / - 4 / 4
20 M / 69 Inguinal / BI MXFBS Baixo grau - / - 3 / 4
21 M / 27 Tórax / BI SIP-AG Pleomórfico - / + 3 / 1
30 F / 84 Dorso / 6 MXFBS Alto grau + / - 1 / 3
31 M / 50 Coxa / BI LPS-Mix Mixóide - / - 4 / 4
33 F / 42 Coluna vertebral / MET SIP-AG Pleomórfico - / - 4 / 4
34 F / 65 Perna / NI LMS Fusiforme + / - 1 / 3
35 F / 24 Retroperitônio / BI SIP-AG Pleomórfico + / - 2 / 4
36 F / 24 Perna / 6 SS Monofásico fusocelular - / - 4 / 4
37 M / 31 Maxila / 9 SS Bifásico + / - 1 / 4
39 M / NI Parede torácica / 6 FBS Fusocelular + / - 1 / 4 Baixo grau
40 M / 20
Lombar / 4
LPS-PL
Mixofibrossarcoma-like
+ / + 2 / 2
Estroma mixóide
41 M / 56 Mesentério / 23 LMS Pleomórfico + / - 1 / 4 Desmina+, CD117-, CD34-
43 M / 46 Braço / 3 LMS Pleomórfico + / + 2 / 2
44 M / 33 Braço / 2 SIP-AG Pleomórfico - / - 4 / 4
45 F / 58 Útero / 14 LMS Pleomórfico - / - 4 / 4
46 F / 53 Coxa / 12 MXFBS Alto grau + / - 2 / 3
48 F / 62 Antebraço / 2 SIP-AG Pleomórfico/estoriforme + / - 1 / 4
52 M / 39 Glúteo / 6 LPS-Mix + / - 1 / 4
53 M / 44 Coxa / 5 LMS Epitelióide, Células rabdóides - / - 4 / 4
HHF35+, SMA+, Desmina+,
Miogenina-, MyoD1-, CK-
54 M / 71 Ombro / 15 SIP-AG Pleomórfico + / - 1 / 4
56 M / 37 Coxa / 14 LMS Alto grau - / - 4 / 4
57 F / 33 Pelve / 15 LPS-Mix Com células redondas - / - 4 / 4
58 M / 36 Escapula / 11 OTS Convencional - / - 4 / 4
59 F / 29 Diafragma / 15 MPNST - / - 4 / 4
60 M / 59 Cervical / 7 SS Bifásico - / - 4 / 4
61 F / 79 Mesocólon / 13 LMS Pleomórfico - / - 4 / 4
62 F / 69 Cervical / 4 SIP-AG Fusocelular - / - 4 / 4
63 M / 27 NI / 1 FBS Fusocelular - / - 3 / 4 Alto grau
64 F / 58 Bexiga / BI SS Monofásico fusocelular - / - 4 / 4
66 F / 60 Cólon / 9 GIST Maligno epitelióide - / - 4 / 4 CD117+
67 F / 16 Coxa / 2 DFSP Estoriforme + / - 1 / 4 Nenhuma área fascicular
69 M / 59 Coxa / 16 OTS De partes moles - / - 4 / 4
71 F / 66 Braço / 8 SIP-AG Pleomórfico - / - 4 / 4
72 M / 80 Braço / 10 AGS Pouco diferenciado - / - 4 / 4
CD31+, marcadores musculares
negativos
74 F / 28 Coxa / 20 MPNST - / - 4 / 4
77 F / 81
Ombro / 8
SIP-AG
Mixóide pleomórfico
+ / - 2 / 4
78 M / 77 Couro cabeludo / 2 SIP-AG Pleomórfico + / - 1 / 4
79 M / 58 Dorso / 4 MXFBS Baixo grau + / - 1 / 4
130
80 M / 44 Ombro / 21 SS Monofásico fusocelular - / - 4 / 4
81 F / 39 Antebraço / 9 MPNST Estroma osteóide + / - 2 / 4
82 M / 37 Inguinal / 14 LMS Fusiforme - / - 4 / 4
83 F / 78 Coxa / 8 SIP-AG Pleomórfico + / - 2 / 4
84 M / 41 Retroperitônio / 8 MPNST - / - 3 / 4
85 F / 69 Antebraço / 2 LPS-Mix Baixo grau - / - 3 / 4
86 F / 49 Coxa / 6 SIP-AG Inflamatório/pleomórfico - / - 4 / 4
87 M / 43 Estômago / 2 GIST Benigno + / - 2 / 4 CD117+
88 M / 77 Pelve / NI SFT Benigno - / - 4 / 4
89 F / 48 Perna / 7 SIP-AG Pleomórfico - / - 4 / 3
90 F / 56 Antebraço / 6 LMS Fusocelular - / - 4 / 4
91 F / 27 Antebraço / 6 SFMBG Baixo grau + / - 1 / 4
92 F / 50 Coxa / 6 SS Monofásico pouco diferenciado - / - 4 / 4
93 M / 63 Coxa / 4 SIP-AG Pleomórfico - / - 4 / 4
94 F / 34 Coxa / NI SS Monofásico fusiforme - / - 4 / 4
95 M / 34 Braço / 1 SEPIT Tipo distal + / - 1 / 4
96 M / 50 Tórax / BI SIP-AG Epitelióide/rabdóide + / - 1 / 4
97 F / 14 Mama / 11 RBMS Alveolar - / - 4 / 4
98 M / 24 Órbita / BI RBMS Pleomórfico - / - 4 / 4
99 F / 22 Braço / 15 SS Monofásico fusiforme + / - 1 / 4
100 F / 70 Perna / 7 LPS-PL Pleomórfico - / - 3 / 4
101 F / 74 Antebraço / 9 MPNST Com células gigantes tumorais + / - 1 / 4
102 F / 48 Epíploon / 22 HEPIT Epitelióide - / - 3 / 3 CD31+
103 F / NI Coxa / 27 OTS Osteoblástico - / - 4 / 4
104 F / 50 Retroperitônio / 14 SIP-AG Monofásico fusiforme - / - 4 / 4
105 M / 76 Braço / 4 SIP-AG Pleomórfico + / - 1 / 4
107 F / 73 Braço / 3 MPNST + / - 1 / 3
108 F / 62 Mama / 12 SIP-AG Fusocelular - / - 3 / 4
109 F / 82 Coxa / 5 SIP-AG Pleomórfico/inflamatório - / - 4 / 4
111 M / 36 Pé / 2 SK Nodular - / - 4 / 4
114 M / 51 Antebraço / BI SIP-AG Pleomórfico - / - 4 / 4
115 M / 49 Coxa / 1 SK Placa - / - 3 / 4
116 F / 61 Supraclavicular / BI SIP-AG Fusocelular + / - 1 / 4
117 M / 40 Intestino delgado / 10 GIST Baixo risco + / - 2 / 3 CD117+
118 M / 90 Couro cabeludo / 1 SIP-AG Pleomórfico - / - 4 / 4
119 F / 37 Coxa / 7 SIP-AG Pleomórfico - / - 4 / 4
120 F / 78 Dorso / 2 SIP-AG Pleomórfico/fusocelular + / - 2 / 4
121 M / 80 Retroperitônio / 6 SIP-AG Estoriforme - / - 4 / 4
122 M / 22 Retroperitônio / 13 SIP-AG Células rabdóides - / - 4 / 4
123 M / 25 Pé / 2 SEPIT Tipo distal - / - 4 / 4
124 M / 52 Antebraço / 2 SEPIT Tipo distal - / - 4 / 4
125 F / 53 Pé / 6 SCC Fascicular - / - 4 / 4
BI=biópsia incisional; NI=não informado; SIP-AG=sarcoma indiferenciado pleomórfico de alto grau; MXFBS=mixofibrossarcoma; FBS=fibrossarcoma; LMS=leiomiossarcoma; RBMS=rabdomiossarcoma;
MPNST=tumor de bainha de nervo periférico maligno; SS=sarcoma sinovial; SEPIT=sarcoma epitelióide; SK=sarcoma de Kaposi; GIST=tumor estromal gastrointestinal; OTS=osteossarcoma;
DFSP=dermatofibrossarcoma protuberans; LPS-Mix/CR=lipossarcoma mixóide/células redondas; SCC=sarcoma de células claras; LPS-PL=lipossarcoma pleomórfico; SFMBG=sarcoma fibromixóide de baixo grau;
AGS=angiossarcoma; HEPIT=hemangioendotelioma epitelióide; SFT=tumor fibroso solitário.
131
Tabela 4
– Resultados da imunohistoquímica para MDM2 e CDK4 nos vários subtipos
tumores de tecidos moles.
Diagnóstico
(Total de Casos)
MDM2
N/T(%)
CDK4
N/T(%)
MDM2 e CDK4
N/T(%)
LPS-BD (19) 19/19 (100) 13/19 (68,4) 13/19 (68,4)
LPS-DD (10) 9/10 (90) 7/10 (70) 7/10 (70)
LPS-BD/DD (29) 28/29 (96,5) 20/29 (68,9) 20/29 (68,9)
Outras Neoplasias
Mesenquimais (83)
29/83 (34,9) 3/83 (3,6) 2/83 (2,4)
SIP-AG* (26) 10/26 (38,4) 1/26 (3,8) 0/26 (0)
MXFBS* (5) 4/5 (80) 1/5 (20) 1/5 (20)
FBS* (3) 1/3 (33,3) 0/3 (0) 0/3 (0)
LMS* (8) 2/8 (25) 0/8 (0) 0/8 (0)
RBMS* (2) 0/2 (0) 0/2 (0) 0/2 (0)
MPNST* (7) 3/7 (42,8) 0/7 (0) 0/7 (0)
SS (8) 2/8 (25) 0/8 (0) 0/8 (0)
SEPIT (3) 1/3 (33,3) 0/3 (0) 0/3 (0)
SK (2) 0/2 (0) 0/2 (0) 0/2 (0)
GIST (4) 2/4 (50) 0/4 (0) 0/4 (0)
OTS* (3) 0/3 (0) 0/3 (0) 0/3 (0)
DFSP (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
LPS-Mix-CR* (4) 1/4 (25) 0/4 (0) 0/4 (0)
SCC (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
LPS-PL* (2) 1/2 (50) 1/2 (50) 1/2 (50)
SFMBG (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
AGS* (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
HEPIT (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
SFT (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
Neoplasias
Adipocíticas (17)
7/17 (41,1) 2/17 (11,7) 1/17 (5,8)
LP-NC (6) 2/6 (33,3) 0/6 (0) 0/6 (0)
LP-CF (3) 2/3 (66,6) 1/3 (33.3) 1/3 (33,3)
LP-PL (2) 0/2 (0) 1/2 (50) 0/2 (0)
HIB (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
FBLP (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
LP-IM (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
AMLP (1) 1/1 (100) 0/1 (0) 0/1 (0)
FBLPN (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
TLP (1) 0/1 (0) 0/1 (0) 0/1 (0)
*Neoplasia pode simular LPS-DD.
LPS-BD=lipossarcoma bem-diferenciado; LPS-DD=lipossarcoma desdiferenciado; SIP-AG=sarcoma indiferenciado
pleomórfico de alto grau; MXFBS=mixofibrossarcoma; FBS=fibrossarcoma; LMS=leiomiossarcoma;
RBMS=rabdomiossarcoma; MPNST=tumor de bainha de nervo periférico maligno; SS=sarcoma sinovial;
SEPIT=sarcoma epitelióide; SK=sarcoma de Kaposi; GIST=tumor estromal gastrointestinal; OTS=osteossarcoma;
DFSP=dermatofibrossarcoma protuberans; LPS-Mix/CR=lipossarcoma mixóide/células redondas; SCC=sarcoma de
células claras; LPS-PL=lipossarcoma pleomórfico; SFMBG=sarcoma fibromixóide de baixo grau; AGS=angiossarcoma;
HEPIT=hemangioendotelioma epitelióide; SFT=tumor fibroso solitário; LP-NC=lipoma não-convencional; LP-CF=lipoma
de células fusiformes; LP-PL=lipoma pleomórfico; HIB=hibernoma; FBLP=fibrolipoma; LP-IM=lipoma intramuscular;
AMLP=angiomiolipoma; FBLPN=fibrolipoma neural; TLP=timolipoma.
132
Tabela 5 - Análise estatística dos resultados da imunoistoquímica para MDM2 e
CDK4 nos grupos histopatológicos estudados.
Proteína
Comparações
LPS-BD e LPS-DD
vs. Outros
Tumores
(n=129)
LPS-BD vs. Tumores
Adipocíticos
Benignos
(n=36)
LPS-DD vs. Outras
Neoplasias
Mesenquimais
(n=93)
MDM2
Sensibilidade 96,5% 100% 90%
Especificidade 64% 58,8% 65%
VPP 43,8% 73,1% 23,7%
VPN 98,5% 100% 98,2%
Accuracy 71% 81% 68%
Youden’s J 0.6 0.58 0.55
Kappa (p) 0.42 (<0,001) 0.6 (<0,001) 0.24 (<0,001)
CDK4
Sensibilidade 68,9% 68,4% 70%
Especificidade 95% 88,2% 96,3%
VPP 80% 86,7% 70%
VPN 91,3% 71,4% 96,4%
Accuracy 89% 78% 94%
Youden’s J 0.64 0.56 0.66
Kappa (p) 0.67 (<0,001) 0.56 (0,001) 0.66 (<0,001)
MDM2 e CDK4
Sensibilidade 68,9% 68,4% 70%
Especificidade 97% 94,1% 97,5%
VPP 87% 92,9% 77,8%
VPN 91,5% 72,7% 96,4%
Accuracy 91% 81% 95%
Youden’s J 0.66 0.62 0.67
Kappa (p) 0.71 (<0,001) 0.61 (<0,001) 0.7 (<0,001)
VPP=valor preditivo positivo; VPN=valor preditivo negativo;n=número total de casos..
133
Tabela 6 - Análise estatística dos resultados com imunomarcação difusa para
MDM2 e CDK4 nos grupos histopatológicos estudados.
Proteína
Comparações
LPS-BD e LPS-DD
vs. Outros
Tumores
(n=129)
LPS-BD vs. Tumores
Benignos
(n=36)
LPS-DD vs. Outras
Neoplasias
Mesenquimais
(n=93)
MDM2
Sensibilidade 89,6% 89,4% 90%
Especificidade 80% 94,1% 77,1%
VPP 56,5% 94,4% 32,1%
VPN 96,4% 88,9% 98,5%
Accuracy 82% 92% 78%
Youden’s J 0.69 0.83 0.67
Kappa (p) 0.57 (<0,001) 0.83 (<0,001) 0.37 (<0,001)
CDK4
Sensibilidade 65,5% 63,1% 70%
Especificidade 99% 100% 98,8%
VPP 95% 100% 87,5%
VPN 90,8% 70,8% 96,5%
Accuracy 91% 81% 96%
Youden’s J 0.64 0.63 0.68
Kappa (p) 0.72 (<0,001) 0.61 (<0,001) 0.75 (<0,001)
MDM2 e CDK4
Sensibilidade 62% 57,8% 70%
Especificidade 100% 100% 100%
VPP 100% 100% 100%
VPN 90,1% 68% 96,5%
Accuracy 91% 78% 97%
Youden’s J 0.62 0.57 0.7
Kappa (p) 0.71 (<0,001) 0.56 (<0,001) 0.8 (<0,001)
VPP=valor preditivo positivo; VPN=valor preditivo negativo;n=número total de casos.
134
Tabela 7 – Sensibilidade, Especificidade e Teste Youden para expressão de
MDM2 e CDK4 em LPS-BD/TLA e LPS-DD contra outras neoplasias
mesenquimais descritos na literatura.
Grupo
Sensibilidade
Especificidade Teste Youden
MDM2 CDK4 MDM2 CDK4 MDM2 CDK4
Bihn et al 97% 92% 83% 95% 0.8 0.87
Sirvent et al 80% 87% 93% 100% 0.73 0.87
Nossa série
96,5% 68,9% 64% 95% 0.6 0.64
Padrão difuso
89,6% 65,5% 80% 99% 0.69 0.64
135
Figura 1 – Imunomarcação para MDM2. (A) Caso 29 – Imunomarcação difusa
em um LPS-DD de baixo grau. (B) Caso 23 – Lipoma não-convencional com
imunomarcação focal em células reativas. (C) Caso 70 – Área bem
diferenciada de um LPS-DD. (D) Caso 27 – LPS-BD retroperitonial
esclerosante. (E) Caso 13 – Célula gigante multinucleada de um LPS-DD de
alto grau. (F) Caso 17 – Case 17 – Mulher de 48 anos com um LPS-BD
esclerosante.
136
Figura 2 – Imunomarcação de CDK4. (A) Caso 75 – Lipoblasto em um LPS-BD
retroperitonial esclerosante. (B) Caso 29 – Imunomarcação difusa em um LPS-
DD retroperitonial. (C) Caso 70 – Área bem diferenciada de um LPS-DD. (D)
Caso 27 – LPS-BD esclerosante retroperitonial. (E) Caso 18 – LPS-BD
retroperitonial adjacente ao parênquima renal. (F) Case 17 – Mulher de 48 anos
com um LPS-BD esclerosante.
137
7. Conclusões
Após realizar um teste diagnóstico utilizando a técnica de imuno-
histoquímica para identificar a expressão aumentada das proteínas MDM2 e
CDK4 em lipossarcomas bem-diferenciados e desdiferenciados, foi levantada
uma boa evidência em favor da nossa hipótese. Os resultados desse estudo
permitiram concluir que a imunodetecção do aumento da expressão destas
proteínas através de IHQ pode ser usada por patologistas experientes para
realizar o diagnóstico de LPS-BD e LPS-DD.
A proteína MDM2 apresentou boa sensibilidade para identificar LPS-BD
entre lipomas e a proteína CDK4 apresentou boa especificidade para identificar
LPS-DD entre outros sarcomas. A melhor especificidade para realizar o
diagnóstico de LPS-BD e LPS-DD entre as outras neoplasias foi conseguida
quando se combinou os resultados de imunomarcação para MDM2 e CDK4 no
mesmo tumor. Foi demonstrado, também, que a especificidade pode ser ainda
maior se o caso suspeito for considerado positivo apenas quando apresentar
imunomarcação forte e difusa em mais de 30% das células neoplásicas.
Assim, recomenda-se o uso das duas proteínas para atingir tanto alta
sensibilidade quanto alta especificidade para realizar o diagnóstico desses
tumores. É de se ressaltar que qualquer característica diagnóstica discrepante,
ou resultado de IHQ inesperado, deve motivar um estudo molecular
complementar com FISH ou RT-PCR, para identificar o status de amplificação
gênica MDM2 e CDK4.
138
8. Anexos
ANEXO A
139
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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