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UFRRJ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DISSERTAÇÃO
Desenvolvimento de um Modelo Empírico de Predição da
Atividade de Inibidores da Esterol 14α
αα
α-Desmetilase
(CYP51) utilizando o Método Semi-Empírico PM6
JOSÉ GERALDO ROCHA JÚNIOR
2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO EMPÍRICO DE PREDIÇÃO
DA ATIVIDADE DE INIBIDORES DA ESTEROL 14α
αα
α-DESMETILASE
(CYP51) UTILIZANDO O MÉTODO SEMI-EMPÍRICO PM6
JOSÉ GERALDO ROCHA JÚNIOR
Sob a Orientação do Professor
Dr. Carlos Mauricio Rabello de Sant’Anna
Dissertação submetida como requisito
parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências, no Curso de Pós-
Graduação em Química, Área de
Concentração em Química Orgânica.
Seropédica, RJ
Abril de 2009
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UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos
540
R672d
T
Rocha Júnior, José Geraldo, 1984-
Desenvolvimento de um modelo
empírico de predição da atividade de
inibidores da Esterol 14α–
Desmetilase (CYP51) utilizando o
método semi-empírico PM6/ José
Geraldo Rocha Júnior – 2009.
98 f. : il.
Orientador: Carlos Mauricio
Rabello de Sant’Anna.
Dissertação (mestrado) –
Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro, Programa de Pós-
Graduação em Química.
Bibliografia: f. 74-86
1. Química orgânica – Teses. 2.
Fungos Fitopatogenicos - Teses. 3.
Fungicidas – Teses. 4.
Mycobacterium tuberculosis – Teses.
I. Sant’Anna, Carlos Mauricio
Rabello de, 1965-. II. Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro.
Programa de Pós-Graduação em
Química. III. Título.
A glória de Deus é encobrir as coisas,
mas a glória dos reis é esquadrinhá-las.
Bíblia Sagrada (Pv. 25:2)
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me dar uma nova e viva esperança em meu Senhor e Salvador Jesus
Cristo. Pelo seu amor e cuidado sempre constantes na minha vida. Pela Universidade Rural.
Por trazer a existência este grande momento. Por já ter preparado momentos ainda melhores
do que este.
À minha mãe, por renunciar tantas coisas para que eu pudesse ter êxito durante o
tempo em que estive fora de casa. Ao meu pai e à Danielle, por sempre me dizer “te amo”. Ao
Rodrigo e Oscar pelo encorajamento.
À família Corrêa por ter acreditado e me incentivado desde o princípio.
Aos docentes deste Departamento, pela amizade e incentivo, especialmente aos
professores Mário Geraldo e Rosane, pelo carinho demonstrado e pelos aconselhamentos.
Ao professor Carlos Maurício, pela oportunidade de participar de seu grupo de
pesquisa, pela compreensão e pela confiança.
Aos amigos do LabMol/UFRRJ pela amizade e apoio prestado durante esta jornada.
Ao Felipe, Isabel, Sheisi e Luíza, pela amizade sincera e incondicional. Por gastarem
longos momentos de suas vidas comigo, me ajudando a superar crises e sonhando junto
comigo.
Aos irmãos da Célula Peniel e da ABU-Rural, pela “amizade que dá força, fé que
sustenta”.
Aos amigos Vinícius, Guilherme, Dalton e Márcio, pelos momentos de descontração.
Ao LASSBio/UFRJ pela doação da licença do Spartan’08.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos.
Ao PPGQ/UFRRJ por proporcionar este acontecimento.
RESUMO
ROCHA Jr., José Geraldo. Desenvolvimento de um modelo empírico de predição da
atividade de inibidores da esterol 14α
αα
α-desmetilase (CYP51) utilizando o método semi-
empírico PM6. 2009. 82p. Dissertação (Mestrado em Química, Química Orgânica). Instituto
de Ciências Exatas, Departamento de Química, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,
Seropédica, RJ, 2009.
A esterol 14α-desmetilase (CYP51) é um dos maiores alvos para o desenvolvimento de
fungicidas. Seus inibidores (os DMIs) bloqueiam a biossíntese do ergosterol, e
consequentemente o crescimento de fungos, por se ligarem na cavidade do sítio ativo da
enzima fazendo uma ligação coordenativa com o átomo de ferro do heme. Neste trabalho, um
modelo de substituição quimérica do sítio da CYP51 de um fungo fitopatogênico
Mycosphaerella graminicola foi construído baseado na estrutura cristalográfica da CYP51 de
Mycobacterium tuberculosis. Este fungo pertence ao mesmo gênero do fungo Mycosphaerella
fragariae, o causador da mancha-de-micosferela em morangos. Utilizando este modelo, foram
calculadas as entalpias de interação de uma série de fungicidas triazólicos pelo método do
orbital semi-empírico PM6. Foi constatado que fatores como a entalpia de interação, a
solubilidade em água e as perdas entrópicas devido a restrições rotacionais destes inibidores
são importantes parâmetros a serem considerados na síntese de novos fungicidas DMIs. A
quantificação destes parâmetros para os triazóis nos possibilitou o desenvolvimento de um
modelo empírico para determinação da atividade de DMIs com boa correlação com dados
experimentais (r=0,94, SD=0,63). Este modelo foi utilizado na predição da atividade relativa
de novos compostos, sintetizados pelo grupo de síntese de organofosforados da UFRRJ. Foi
possível identificar quais compostos são os mais promissores da série proposta e quais fatores
devem ser alterados para otimizar o perfil de inibição da CYP51, como o número de rotações
livres perdidas após interação com o sítio ativo da enzima.
Palavras-chave: Fungos fitopatogênicos. Fungicidas. Modelos empíricos de predição de
energia livre. CYP51.
ABSTRACT
The enzyme sterol 14α-demethylase (CYP51) is one of the major targets for the design of
new fungicides. The CYP51 inhibitors or demethylase inhibitors (DMIs) act by interruption
of ergosterol biosynthesis and, as a consequence, of fungi growth. The DMIs bind to the
enzyme active site by means of a coordinative bond to the iron atom of the enzyme heme
group. In the present work, a chimeric substitution model of the phytopathogenic fungus
Mycosphaerella graminicola CYP51 was constructed based on the crystallographic structure
of the Mycobacterium tuberculosis CYP51. Based on this model, the interaction enthalpies of
a series of triazolic fungicides was obtained with the semiempirical molecular orbital model
PM6. It was observed that the interaction enthalpy, the water solubility and the entropic losses
associated to the freezing of bonds after the binding of the inhibitors to the enzyme are
important parameters for the design of new DMIs. It was possible to obtain a good empirical
model for the correlation between experimental activity data and the theoretical parameters of
triazolic DMIs (r=0.94, SD=0.63). The model was employed for the prediction of the relative
activity of a series of new proposed fungicides synthetised by the organophosphorous
synthesis group of UFRRJ. It was possible to identify which compounds are the most
promising and which are the main factors that should be modified in order to optimize the
inhibition profile of CYP51, such as the number of rotatable bonds frozen after the binding to
the enzyme active site.
Keywords: Phytopathogenic fungi. Fungicides. Empirical models for prediction of free
energy. CYP51.
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Redução das doses de aplicação de fungicidas e o aumento da segurança
com o desenvolvimento de novas substâncias.
6
Tabela 2. Eficiências dos fungicidas estrobilurínicos contra algumas doenças
consideradas prejudiciais à produção agrícola.
6
Tabela 3. Classificação dos SBIs, alvos de inibição e seus compostos bioativos. 8
Tabela 4. Compostos utilizados para a construção do modelo de predição da
atividade de novos inibidores da CYP51 e suas respectivas atividades experimentais
contra C. albicans. 38
Tabela 5. Constituintes do sítio selecionado da CYP51MT, usado nos cálculos. 42
Tabela 6. Constituintes do sítio selecionado da CYP51MG
H
, usado nos cálculos. 43
Tabela 7. Nomenclatura dos aminoácidos presentes no sítio ativo da CYP51MG
após a substituição de alguns resíduos da CYP51MT.
45
Tabela 8. Entalpias de interação calculadas na formação do complexo CYP51MT-
inibidor (∆H
PM6
, kcal/mol) e a atividade inibitória experimental (µmol/L).
53
Tabela 9. Entalpias de interação calculadas na formação dos complexos CYP51MG-
inibidor (∆H
PM6
, kcal/mol), para os diferentes modelos do sítio de interação da
CYP51MG, e a atividade inibitória experimental (µmol/L).
56
Tabela 10. Valores de IC
50
medidos experimentalmente (µmol/L), energia de
interação calculada pelo PM6 (∆H
PM6
, kcal/mol), número de ligações rotacionáveis
(N
LR
) “congeladas” durante a ligação e o log da solubilidade estimada em meio
aquoso (logWS) dos inibidores triazólicos utilizados neste trabalho. 61
Tabela 11. Contribuição de cada termo variável da equação 27, lnIC
50
medido
experimentalmente, lnIC
50
calculado pela equação 27, e a diferença entre os valores
de ∆ln IC
50
experimentais e calculados. 63
Tabela 12. Energia de interação calculada pelo método PM6 (∆H
PM6
, kcal/mol),
número de ligações rotacionáveis (N
LR
) congeladas durante a ligação e o log da
solubilidade estimada em meio aquoso (logWS) dos compostos organofosforados
utilizados neste trabalho. 66
Tabela 13. Contribuição de cada termo variável da equação 27 e o lnIC
50
predito
pela equação 27 para os compostos organofosforados. 68
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Venda de defensivos agrícolas no Brasil entre os anos de 2004 e 2008. 4
Figura 2. Alguns DMIs utilizados na agricultura. 7
Figura 3. Participação da CYP51 na biossíntese de esteróis de animais, fungos e
plantas.
9
Figura 4. As três etapas da reação de desmetilação no C14 catalisada pela CYP51. 10
Figura 5. Representação do heme ligado ao sítio ativo da CYP51 de M. tuberculosis
na ausência de um substrato. 10
Figura 6. Manchas foliares causadas por M. fragariae em morangueiros. 13
Figura 7. As quatro etapas principais da modelagem por homologia. 21
Figura 8. Representação da face distal de uma P450 (CYP2C5). 23
Figura 9. Alinhamento das estruturas primárias da CYP51 de M. graminicola
(CYP51MG) e M. tuberculosis (CYP51MT).
44
Figura 10. Sítio de ativo da CYP51MT. 46
Figura 11. Representação da estrutura do heme presente na CYP51. 48
Figura 12. Alinhamento das estruturas primárias da CYP51 de C. albicans
(CYP51CA), M. graminicola (CYP51MG) e M. tuberculosis (CYP51MT). 49
Figura 13. Estruturas propostas para avaliação de potencial fungicida, testadas no
modelo de CYP51MG. 50
Figura 14. Comparação entre as distâncias, em Å, de algumas ligações do heme da
CYP51MT após otimização com o método PM6 e as distâncias de referência obtidas
à partir de dados cristalográficos. 52
Figura 15. Sobreposição dos modelos do sítio ativo da CYP51MG
SQ
e CYP51MG
H
. 55
Figura 16. Representação das interações específicas encontradas entre os inibidores
triazólicos e os modelos da CYP51MG
SQ1
e CYP51MT após minimização. 59
Figura 17. Gráfico de correlação entre lnIC
50
experimental e calculado. 64
Figura 18. Proposta de estrutura com os melhores termos de energia combinados. 69
Figura 19. Exemplo das interações encontradas entre os organofosforados e o sítio
ativo da CYP51MG
SQ1
. 70
ÍNDICE DE ABREVIAÇÕES
AM1 Austin Model 1
AMBER Assisted Model Building and Energy Refinement
CYP51 Esterol 14α-desmetilase
CYP51AF CYP51 de Aspergillus fumigatus
CYP51MG CYP51 de Mycosphaerella graminicola
CYP51MG
H
Modelo de CYP51 de M, graminicola feito por homologia
CYP51MG
SQ1
Modelo de CYP51 de M. graminicola construído por substituição
quimérica com carga +1
CYP51MG
SQ2
Modelo de CYP51 de M. graminicola construído por substituição
quimérica com carga +2
CYP51MT CYP51 de Mycobacterium tuberculosis
DMIs Demethylase Inhibitors
FEP Free Energy Perturbation
GA Genetic Algorithm
HF Hartree-Fock
IT Integração Termodinâmica
LCAO Linear Combination of Atomic Orbitals
LIE Linear Interaction Energy
MM2 Molecular Mechanics 2
MNDO Modified Neglect of Diatomic Overlap
MNDO/d Modified Neglect of Diatomic Overlap, incluindo orbitais d
MQ Mecânica Quântica
NDDO Neglect of Diatomic Differential Overlap
N
LR
Número de Ligações Rotacionáveis
OM Orbital Molecular
PDB Protein Data Bank
PM3 Parametric Method 3
PM5 Parametric Method 5
PM6 Parametric Method 6
RM1 Recife Model 2
SBIs Sterol Biosyntheses Inhibitors
STO Slater Type Orbitals
WS Water Solubility
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO DE LITERATURA 4
2.1 Controle Químico de Fungos Fitopatogênicos 4
2.2 Fungicidas Inibidores da Desmetilação do Esterol 7
2.3 A Cultura do Morangueiro e a Mancha-de-Micosferela 12
2.4 Interação Enzima-Ligante 14
2.5 Modelos Quantitativos de Interação 16
2.6 Determinação da Estrutura da CYP51 20
2.6.1 Modelagem por homologia 20
2.6.2 Modelagem de proteínas da família citocromo P450 22
2.7 Métodos de Química Computacional 25
2.7.1 Métodos Quanto-mecânicos 25
2.7.2 Métodos de Mecânica Molecular 32
2.8 Modelos de Predição da Solubilidade em Água de Moléculas Orgânicas 34
3 OBJETIVOS 37
4 METODOLOGIA 38
4.1 Modelo Empírico Usado na Predição da Atividade Inibitória da CYP51 38
4.2 Obtenção da Estrutura 3D da CYP51MT e Seleção de seu Sítio de Interação 41
4.3 Modelagem do Sito Ativo da CYP51 de Fungo Fitopatogênico 42
4.3.1 Modelagem por homologia 43
4.3.2 Modelagem por substituição quimérica 44
4.4 Otimização dos Sítios CYP51MT e CYP51MG com o Fluconazol 45
4.5 Substituição dos Inibidores no Sítio Ativo da CYP51 48
4.6 Modelagem dos Inibidores 51
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 52
5.1 Estudo Semi-empírico no Modelo do Sítio de Ativo da CYP51MT 52
5.2 Construção do Modelo do Sítio Ativo de CYP51MG 54
5.3 Interações dos Triazóis com a CYP51MG 57
5.4 Modelo Empírico de Predição da Atividade de Inibidores da CYP51MG 60
5.5 Predição de Atividade Antifúngica de Compostos Organofosforados Sintetizados
pelo Grupo da UFRRJ 64
5.6 Interações Específicas dos Organofosforados com a CYP51MG 69
6 CONCLUSÕES 72
7 CONSIDERAÇÕES GERAIS 73
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 74
1 INTRODUÇÃO
Neste início de milênio, quando a sustentabilidade econômica, técnica e ambiental
torna-se um dos objetivos principais da agricultura moderna, o Brasil, um país cuja economia
depende em grande parte da atividade agrícola, não poderia fechar os olhos para os problemas
causados pela ação de fungos na agricultura.
Se um fungicida possui atividade intrínseca, ou seja, a sua atividade é baseada na
afinidade específica e na força de ligação com o seu sítio-alvo, então a atividade da enzima-
alvo, a montagem das subunidades bioquímicas ou a tradução dos sinais podem ser inibidas
pelo fungicida. Dessa forma, o conhecimento das interações moleculares mais relevantes que
um fungicida intrínseco apresenta com o seu alvo bioquímico pode ajudar a prever se novas
moléculas serão mais eficientes como fungicidas, com o mesmo alvo de ação.
A Química Computacional é uma ferramenta muito útil para elucidação das estruturas
moleculares. Quando métodos de química computacional são utilizados em estudos
envolvendo a ligação entre uma enzima com algum ligante, é possível ter informações sobre
quais as principais interações moleculares que estão promovendo esta ligação. Quando os
resultados previstos por estes métodos para a eficiência da inibição enzimática podem ser de
algum modo correlacionados com a atividade inibitória obtida experimentalmente (i.e. K
i
,
IC
50
), então o modelo proposto pode ser explorado para se obter alguma previsão se novas
moléculas serão mais ou menos ativas como inibidores enzimáticos.
O processo de reconhecimento molecular enzima-ligante é dirigido por uma
combinação de efeitos entálpicos e entrópicos. Estes efeitos podem ser estimados através da
energia livre de Gibbs da interação enzima-ligante que está diretamente relacionada à
constante de inibição K
i
, a qual pode ser medida experimentalmente. Diferentes métodos
computacionais têm sido desenvolvidos para estimar a energia livre de interação, tais como os
métodos de integração termodinâmica (IT) [KOLLMAN, 1993], da perturbação da energia
livre (FEP) [VAN GUNSTEREN et al., 1994; BROOKS et al., 1988] e o método da energia
de interação linear (LIE) [ASI et al., 2004; AQVIST et al., 2002; HANSSON et al., 1998],
embora a obtenção de estimativas muito precisas de
∆
G
int
envolva um custo computacional
muitas vezes proibitivo.
Uma maneira encontrada para se solucionar este problema está no desenvolvimento de
equações empíricas. Estas equações são ajustadas aos valores experimentais de K
i
ou IC
50
e
associam termos de energia que são mais facilmente calculados, importantes no fenômeno de
interação enzima-ligante.
A cultura de morango no Brasil apresenta grande importância econômica,
principalmente nos Estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio Grande do Sul. Ela tem sido
frequentemente atacada pelo fungo Mycosphaerella fragariae, causador de uma doença foliar
no morangueiro, a mancha-de-micosferela. O controle químico desta doença utilizando
compostos inibidores da enzima esterol 14α-desmetilase (CYP51) tem se demonstrado
altamente eficaz [TÖFOLI & DOMINGUES]. Esta enzima atua catalisando uma etapa
importante na biossíntese de esteróis e sua inibição pode acarretar a morte de fungos por
afetar a integridade das membranas celulares.
Trabalhos realizados anteriormente para a predição da atividade de inibidores da
CYP51 utilizaram métodos quânticos ab initio e de campo de força clássico para calcular as
contribuições de termos de energia envolvidos na interação CYP51-inibidor de Candida
albicans e Mycobacterium tuberculosis [ZAMPIERI et al., 2007; BANFI et al., 2006]. Neste
trabalho, buscou-se desenvolver uma equação empírica para a predição da atividade de
inibidores de um fungo fitopatogênico relacionado ao fungo M. fragariae, baseada na
estimativa de termos de energia, incluindo o uso do método do orbital molecular semi-
empírico PM6 [STEWART, 2007] para calcular a entalpia envolvida nesta interação.
Este hamiltoniano, desenvolvido recentemente e disponível nos programas
Mopac2007 e Mopac2009, dispõe de parâmetros para metais de transição. Esta característica,
essencial para a descrição dos aspectos estereo-eletrônicos associados à complexação de
fungicidas com o átomo de ferro localizado no sítio ativo da CYP51, soma-se à rapidez dos
métodos semi-empíricos, que permite que sejam utilizados para modelar sistemas contendo
uma quantidade elevada de átomos. Como a entalpia de interação calculada pelo método
semi-empírico corresponde a apenas um dos termos de energia envolvidos na interação
enzima-ligante, outras contribuições energéticas baseadas em propostas da literatura foram
calculadas e consideradas na tentativa de se obter uma melhor correlação com os dados
experimentais.
Na primeira etapa deste trabalho buscou-se fazer uma avaliação sobre o uso do método
PM6 para cálculos de entalpia de interação entre a CYP51 e alguns inibidores, utilizando o
sítio ativo obtido da estrutura cristalográfica da CYP51 de M. tuberculosis e comparando-se
os resultados obtidos com dados de atividade antifúngica encontrados na literatura.
Na segunda etapa foi feita a construção de um modelo do sítio ativo da CYP51 de um
fungo fitopatogênico que poderia ser utilizado para propor novos inibidores contra M.
fragariae. Como ainda não foi obtido a sequência primária da CYP51 desta espécie, este
modelo foi construido a partir da sequência da CYP51 de Mycosphaerella graminicola, por
esta espécie pertencer ao mesmo gênero. Este modelo foi utilizado nos cálculos de entalpia de
interação enzima-ligante com o método PM6.
A seguir, buscou-se desenvolver uma equação empírica de predição da atividade de
substâncias com potencial inibidor da CYP51, baseado nos dados de atividade inibitória
experimentais da literatura. Com esta equação, procurou-se combinar parâmetros teóricos
importantes no fenômeno de interação enzima-ligante, como a entalpia de interação calculada
na etapa anterior, e utilizá-los na predição da atividade relativa de compostos com potencial
antifúngico sintetizados pelo grupo de síntese de organofosforados da UFRRJ.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Controle Químico de Fungos Fitopatogênicos
Através do uso de defensivos agrícolas, muitas perdas nas diversas culturas podem ser
evitadas. Os defensivos agrícolas reduzem consideravelmente perdas causadas por insetos,
plantas competidoras e fungos patogênicos. Comparando a produção agrícola com e sem o
uso de defensivos, o uso de defensivos mostra um resultado muito superior em produtividade
e qualidade. Nas culturas de arroz, milho, batata, soja, algodão, café, trigo e cevada, por
exemplo, a produção sem o uso de defensivos agrícolas significa perdas de até 70% de
produtividade causadas pela incidência de insetos, doenças e plantas competidoras. Essa perda
vem sendo significativamente reduzida pelo uso de defensivos agrícolas nas lavouras. Hoje,
16% destas perdas são evitadas apenas com o uso de herbicidas para controle de plantas
competidoras. Com o uso de inseticidas é possível reduzir as perdas em mais 7% e com
fungicidas mais 4% [© CHEMINOVA BRASIL].
As vendas de defensivos agrícolas no Brasil cresceram nos últimos dois anos,
recuperando-se da queda observada até 2006 [CONEXÃO SINDAG, 2008] (figura 1). No ano
de 2008, com o aumento de 24% nas vendas de defensivos agrícolas em relação ao ano
anterior, o Brasil assumiu a liderança no consumo mundial de agroquímicos, posição que
antes era ocupada pelos Estados Unidos [CONEXÃO SINDAG, 2009].
2004 2005 2006 2007 2008
0
2.000.000
4.000.000
6.000.000
8.000.000
10.000.000
12.000.000
14.000.000
Valor R$ 1.000
Figura 1. Venda de defensivos agrícolas no Brasil entre os anos de 2004 e 2008.
Os fungicidas são considerados fatores de produção importantes na cadeia produtiva
de alimentos. Eles têm sido empregados, por cerca de 200 anos, para proteger as plantas de
doenças provocadas por ataques de fungos. Inicialmente seu uso foi voltado principalmente
para proteção de sementes de cereais e videiras. Após a segunda guerra mundial, o número de
culturas e das doenças tratadas, a variedade de compostos químicos disponíveis, a área e
frequência de seu uso e a eficiência dos tratamentos aumentaram extraordinariamente. Porém,
somente na última década que a quantidade e a variedade de tratamentos com fungicidas
atingiram algum grau de estabilidade e maturidade [RUSSEL, 2005].
Alguns fungicidas muito antigos, formulados à base de cobre e enxofre, ainda são
empregados e efetivos. Vários fungicidas de “meia-idade”, como ftalamidas, ditiocarbamatos,
dinitrofenólicos e clorofenólicos, têm sido utilizados de modo constante há mais de 30 anos.
Um grande número de fungicidas mais potentes, com novas estruturas e, na sua maioria, com
atividade sistêmica que não se encontrava nos produtos anteriores, foram introduzidos no final
dos anos 1960 e 1970 [BRENT, 1995]. Dentre estes se incluem as 2-amino-pirimidinas,
benzimidazóis, carboxanilidas, fosforotiolatos, morfolinas, dicarboximidas, fenilamidas e
compostos que atuam como inibidores da desmetilação do esterol (DMIs). As introduções de
fungicidas realizadas a partir de 1980 foram basicamente de análogos de fungicidas que já
existiam, particularmente DMIs em geral, com propriedades semelhantes mas com algum
incremento. No entanto, nos últimos anos, vários compostos realmente novos foram lançados
comercialmente ou estão em estágio avançado de desenvolvimento – entre estes se encontram
os fenilpirróis, anilinopirimidinas e análogos da estrobilurina [BRENT, 1995].
Além dos fungicidas mais recentes serem utilizados em quantidades relativamente
pequenas devido à sua ação mais potente contra os patógenos de plantas, sua toxicidade para
mamíferos tem em geral diminuído, o que tem tornado seu uso mais seguro (tabela 1).
Alguns fungicidas controlam uma ampla gama de doenças fúngicas, enquanto outros
apresentam um espectro limitado de atividade contra um ou dois grupos específicos de
patógenos de plantas (tabela 2). Embora muitos fungicidas sejam comercializados, qualquer
uma das principais doenças de plantas cultivadas seria tipicamente controlada por apenas três
ou quatro tipos diferentes de fungicida. Com o aparecimento da resistência, o controle de
algumas doenças, como o mofo cinzento em videiras (Botrytis cinerea) e a sigatoca negra em
bananeiras (Mycosphaerella fijiensis var. difformis), depende agora muito mais da ação de
apenas um ou dois tipos de fungicida [BARTLETT et al., 2002; BRENT, 1995].
Tabela 1. Redução das doses de aplicação de fungicidas e o aumento da segurança com o
desenvolvimento de novas substâncias (Adaptado: RUSSEL, 2005).
Fungicida Ano de introdução
Quantidade aplicada
kg i.a.
a
/ha
LD
50 mg
oral i.a.
a
/kg
(mamíferos)
Sulfato cúprico 1760 10-20 472
Enxofre 1824 10-20 400-500
Ditiocarbamatos 1940s-1960s 1,5-3,5 >8000
Ftalimidas 1950s-1960s <2,0 >22000
Clorotalonil 1964 0,75-1,25 >10000
Geradores de
Carbendazim
1960s 0,25-1,0 >15000
Dicarboxamidas 1970s 0,75 3500-10000
Triazóis (DMI) 1970s 0,125-0,25 >6200
Estrobilurinas 1990s 0,125-0,25 >5000
a
i.a., ingrediente ativo.
Tabela 2. Eficiências dos fungicidas estrobilurínicos contra algumas doenças consideradas
prejudiciais à produção agrícola [BARTLETT, 2002].
Eficiência
a
dos fungicidas
b
Doença (fungo)
AZ MC MN TF PC PR
Oídio da uva
(Uncinula necator)
*** *** NA *** NA ***
Sigatoca negra da banana
(Mycosphaerella fijiensis)
*** NA NA *** NA ***
Mancha reticular da cevada
(Helminthosporium teres)
*** ** NA *** *** ***
Septoriose do trigo
(Mycosphaerella graminicola)
*** ** NA *** *** ***
Ferrugem do trigo
(Puccinia recondita)
*** * NA ** *** ***
Queima-das-bainhas do arroz
(Rhizoctonia solani)
*** ** *** *** NA NA
Pinta-preta do tomateiro
(Alternaria solani)
*** ** NA *** NA ***
Míldio da videira
(Plasmopara viticola)
*** ** NA ** NA ***
Chaga Pythium da relva
(Pythium aphanidermatum)
*** ** ** ** NA ***
a
* Pouco eficiente; ** eficiência moderada; ***ótima eficiência; NA, não aplicável;
b
AZ: azoxistrobim; MC: metil-cresoxim; MN: metominostrobim; TF: trifloxistrobim; PC: picoxistrobim; PR:
piraclostrobim.
2.2 Fungicidas Inibidores da Desmetilação do Esterol
Os inibidores da biossíntese de esteróis (SBIs) constituem o maior e o mais importante
grupo de compostos já desenvolvidos para o controle de doenças fúngicas de plantas e
animais, exibindo, frequentemente, altíssima potência antifúngica. Eles controlam um amplo
espectro de doenças causadas por ascomicetos, basidiomicetos e deuteromicetos, não tendo
atuação sobre fungos como Pythium e Phytophthora, que não sintetizam esteróis. A grande
vantagem desse grupo de fungicidas sistêmicos é a dificuldade dos patógenos sensíveis se
tornarem resistentes. Os SBIs incluem compostos químicos estruturalmente muito
diversificados, dentre eles os triazóis, imidazóis, pirimidinas, morfolinas, piperazinas, entre
outros (figura 2), classificados em quatro classes distintas de acordo com o alvo-enzimático
que eles apresentam (tabela 3). Dentre elas, a classe dos inibidores da desmetilação de esteróis
(DMIs) é a que tem apresentado maior destaque. Estes compostos foram utilizados pela
primeira vez na década de 1970 e os primeiros representantes foram o triforine, triadimefon e
o imazalil. Desde então, mais de 30 DMIs foram utilizados na agricultura [FRAC, 2007;
RUSSEL, 2005; BRENDT, 1995], sendo os triazóis os mais importantes.
Figura 2. Alguns DMIs utilizados na agricultura.
Tabela 3. Classificação dos SBIs, alvos de inibição e seus compostos bioativos [Adaptado:
FRAC, 2007].
Classificação Enzima Alvo Grupo Químico Compostos comercializados
Piperazinas Triforine
Piridinas
Pirifenox
Pirimidinas
Fenarimol, nuarimol
Imidazóis
Imazalil, oxpoconazol,
pefurazoato, proclorar,
triflumizol
Classe I: DMIs C14-desmetilase
Triazóis
Azaconazol, bitertanol,
bromuconazol, ciproconazol,
difenoconazol, diniconazol,
epoxiconazol, etaconazol,
fenbuconazol, fluquinconazol,
flusilazol, flutriafol,
hexaconazol, imibenconazol,
ipconazol, metconazol,
miclobutanil, penconazol,
propiconazol, protioconazol,
simeconazol, tebuconazol,
tetraconazol, triadimefon,
triadimenol, triticonazol
Morfolinas
aldimorf
dodemorf
fenpropimorf
tridemorf
Piperidinas
fenpropidina
piperalina
Classe II: Aminas
(“Morfolinas”)
∆
14
-redutase e
∆
8
→∆
7
- isomerase
Espirocetal aminas espiroxamina
Classe III:
Hidroxianilidas
3-ceto reductase
Hidroxianilidas
fenexamida
Tiocarbamato piributicarbo
Classe IV Esqualeno epoxidase
Alilaminas
naftifina
terbinafina
Os DMIs atuam interrompendo a atividade de uma enzima do tipo citocromo P450 que
participa da desmetilação para biossíntese de esteróis em organismos vivos: a esterol 14α-
desmetilase [WYAND & BROWN, 2005; ALCAZAR-FUOLI et al, 2008], também
conhecida como CYP51, apesar de que em Saccharomyces cerevisiae ela também ser
denominada ERG11 [TROCHA et al, 1977]. Os genes responsáveis pela codificação da
CYP51 são os mais extensamente distribuídos de todos os membros da P450, sendo esta a
única família encontrada tanto em eucariotos quanto em procariotos [WATERMAN &
LEPESHEVA, 2005].
A CYP51 atua catalisando uma reação limitante que ocorre após a ciclização do
esqualeno para formar o lanosterol ou o cicloartenol na biossíntese de esteróis [YOSHIDA et
al., 2000] (figura 3). Trata-se de uma remoção oxidativa do grupo 14α-metil dos
intermediários na biossíntese para produzir intermediários insaturados.
Figura 3. Participação da CYP51 na biossíntese de esteróis de animais, fungos e plantas.
Esta é uma reação que ocorre em três etapas: primeiramente, o grupo 14-metil do
substrato é convertido ao 14-hidroxi-metil, depois ao 14-carboxaldeído e, finalmente, ao 14-
formil (figura 4), sendo eliminado como ácido fórmico com a concomitante introdução de
uma dupla ligação nas posições 14,15 do substrato [SHYADEHI et al., 1996].
Figura 4. As três etapas da reação de desmetilação no C14 catalisada pela CYP51
[WATERMAN & LEPESHEVA, 2005].
Para que ocorra a desmetilação, o substrato deve se posicionar próximo ao complexo
ferro-protoporfirínico IX (heme) presente na CYP51, para que este possa auxiliar as reações
redox que irão ocorrer durante a desmetilação [GUENGERICH, 1990; GUENGERICH &
MACDONALD, 1991]. Este complexo se encontra ligado à enzima por meio de uma ligação
coordenativa entre seu íon de ferro (III) e um resíduo de cisteína (figura 5). No momento em
que estas enzimas não estão ligadas a seu substrato, o heme se encontra coordenado com uma
molécula de água, com o ferro no estado de oxidação +3. [PODUST et al., 2004; WERCK-
REICHHART & FEYEREISEN, 2000].
Figura 5. Representação do heme ligado ao sítio ativo da CYP51 de M. tuberculosis na
ausência de um substrato [PODUST et al., 2004]. As esferas azuis representam os átomos de
nitrogênio do heme, que se encontram ligados ao ferro (em laranja). O enxofre do tiolato da
cisteína 394 (em amarelo) e uma molécula de água (em vermelho) servem como o quinto e
sexto ligantes para o ferro, respectivamente.
A atividade inibitória dos DMIs se deve ao fato de que estes fungicidas apresentam
um átomo de nitrogênio heterocíclico capaz de se complexar com o ferro do grupo heme
presente na CYP51, impedindo que o substrato se ligue ao sítio ativo da enzima.
Até 2005, eram conhecidas 64 sequências completas da CYP51 e a maioria delas
apresentaram atividade desmetilase em apenas quatro substratos: lanosterol, obtusifoliol,
eburicol e 24,25-diidrolanosterol [WATERMAN & LEPESHEVA, 2005]. A especificidade
da CYP51 por estes substratos é diferente entre os animais, plantas e fungos (figura 3). As
CYP51s de plantas apresentam atividade exclusiva em obtusifoliol levando à biossíntese de
fitoesteróis. Em animais, a via de esteróis leva ao colesterol, onde o 24,25-diidrolanosterol e o
lanosterol são os substratos da CYP51. Em fungos e leveduras, o ergosterol é o produto desta
via e os substratos da CYP51 são o eburicol e o lanosterol. Em bactérias, a função da CYP51
ainda é desconhecida na maioria dos casos. O único caso onde a função da CYP51 bacteriana
está esclarecida é em Methylococcus capsulatis onde múltiplas membranas intracelulares
estão presentes e a CYP51 participa na biossíntese de um dos componentes destas
membranas, o colesterol [JACKSON et al., 2002].
Em fungos, o ergosterol é o principal esterol da membrana plasmática, sendo
responsável pela manutenção da fluidez e da estabilidade da membrana [PARKS & CASEY,
1995]. Quando ocorre a inibição da CYP51, há depleção do ergosterol e o acúmulo do
precursor 14α-metilado, ocasionando mudanças na estrutura da membrana plasmática e
tornando-a mais vulnerável a vários danos, além de influenciar a atividade de muitas enzimas
de membrana [LUPETTI et al., 2002].
O fato dos DMIs apresentarem um alvo bem definido aliado com o uso intensivo
destes fungicidas têm levado ao desenvolvimento de resistência em muitos organismos
fitopatogênicos. O primeiro caso registrado foi com Erysiphe graminis f. sp. hordei em
cevada, dois anos após a introdução de triadimefon na Inglaterra, em 1978 [FeSBE]. A partir
de então, foi constatado o surgimento de resistência de vários fitopatógenos a estes fungicidas
na agricultura [COLLS et al., 2006; CLARK, 2006; PEREZ, et al., 2000; DÈLYE et al.,
1997]. Porém, a causa da resistência não parece estar relacionada ao desenvolvimento de
mutação no sítio-alvo, uma vez que as únicas espécies de fungos fitopatogênicos que
desenvolveram resistência no campo por algum tipo de mutação gênica na CYP51 foram
Uncinula necator [DÈLYE et al., 1997] e E. graminis [DÈLYE et al., 1998], cuja mutação
Y136F vem conferindo resistência ao triadimenol, o que sugere que outros mecanismos
bioquímicos estão envolvidos na resistência de fungos aos DMIs [GISI et al., 2000].
2.3 A Cultura do Morangueiro e a Mancha-de-Micosferela
O morango é uma fruta apreciada no mundo inteiro pelas qualidades nutritivas e sabor
atraente, consumida in natura, ou por múltiplas maneiras de processamento industrial
[REICHERT, 2003]. Os Estados Unidos é o maior produtor mundial, com cerca de 750 mil
toneladas, detendo também a maior produtividade. Países como Espanha, Japão, Polônia e
Itália compõem o rol dos maiores produtores mundiais [REICHERT & MADIAL, 2003].
No Brasil, a cultura do morango vem sendo desenvolvida desde o final do século
XVIII em jardins e hortas caseiras. A partir de meados do século XIX, a cultura passou a
ganhar importância econômica nos Estados de São Paulo e Rio Grande do Sul. A partir dos
anos 60, graças aos trabalhos de melhoramento genético surgiram as primeiras cultivares
nacionais, adaptadas, produtivas e com frutos de qualidade, dando à atividade um grande
impulso [CONTI et al., 2002; SANTOS & MEDEIROS, 2003; RADMANN et al., 2006].
Atualmente, o morango é, entre as pequenas frutas, a que tem maior área cultivada e
que está melhor adaptada, encontrando-se em regiões de clima temperado a subtropical. A
produção brasileira está estimada em 90 mil toneladas por ano, sendo plantada em uma área
aproximada de 3.600 ha. O cultivo está concentrado nos estados de Minas Gerais (41,4%),
Rio Grande do Sul (25,6%) e São Paulo (15,4%) [RIGON et al., 2005]. No estado do Rio de
Janeiro, a produção de morangos nos anos de 2006-2007 foi estimada em torno de 800
toneladas, representando menos de 1% da produção nacional neste período [MADAIL, 2008].
De acordo com dados da Empresa de Assistência Técnica e Extensão Rural (Emater), o
município de Nova Friburgo é o maior produtor de morangos do estado, responsável por 95%
da produção [RJTVGLOBO, 2005]. Normalmente, é plantado em áreas de 0,5 a 1,0 ha,
gerando empregos para três pessoas/ha/ano, com faturamento de R$ 26.000,00 por hectare.
Trata-se de uma importante atividade econômica, principalmente em pequenas propriedades
rurais que utilizam mão-de-obra familiar [RADMANN et al., 2006; DIAS et al., 2007].
O morangueiro (Fragaria xananassa Duch.) é suscetível à várias doenças e a maioria
delas é causada por fungos. A mancha-de-micosferela, causada pelo fungo Mycosphaerella
fragariae, é uma das mais importantes e frequentes doenças foliares do morangueiro nas
condições brasileiras de cultivo. A manifestação de sintomas foi observada em 100% dos 23
genótipos de morangueiro inoculados com o patógeno em um teste de suscetibilidade à M.
fragariae. Nenhuma cultivar de morangueiro apresenta resistência às raças fisiológicas
conhecidas deste patógeno [DELHOMEZ et al.,1995; RABELO & BALARDIN, 1997].
Dependendo da suscetibilidade da cultivar e das condições climáticas, este fungo pode
causar intensa redução da área fotossintética e sérios prejuízos à qualidade de frutos, com
danos na produção da ordem de 10 a 100% [TANAKA et al., 2005].
A doença se expressa inicialmente através de pequenas manchas foliares arredondadas
de coloração púrpura escura e com contornos definidos (figura 6). Com o crescimento das
lesões formam-se manchas circulares de 3 a 5 mm de diâmetro, centro necrosado, variando do
marrom claro ao branco, circundadas por um halo vermelho púrpura. Essas lesões podem
coalescer e atingir toda área foliar, culminando com a seca da folha. Os sintomas também
podem se manifestar em pecíolos, estolhos, cálices e frutos, porém a sua ocorrência é rara
[TANAKA, 2002].
Figura 6. Manchas foliares causadas por M. fragariae em morangueiros.
O controle químico constitui-se num importante método de controle da mancha de
micosferela. De maneira geral, recomendam-se aplicações de fungicidas protetores como
folpet, dodine, mancozeb, fluazinam e oxicloreto de cobre. Os fungicidas cúpricos e os
benzimidazóis promovem bom controle da mancha de micosferela, porém os fungicidas
cúpricos podem manchar os frutos, causando sua depreciação, enquanto que os benzimidazóis
não são efetivos contra algumas raças de M. fragariae [TÖFOLI & DOMINGUES].
Fungicidas com atividade específica, como os DMIs triazólicos (tebuconazole,
imibenconazole, metconazole e difenoconazole) e piperazínicos (triforine), têm se
demonstrado altamente eficazes no controle desta doença [TÖFOLI & DOMINGUES], sendo
que, geralmente, estes compostos são aplicados em alternância com fungicidas protetores
para que se evitem casos de resistência.
2.4 Interação Enzima-Ligante
Em geral, a ligação de um inibidor com a sua enzima-alvo envolve interações não-
covalentes fracas, e consequentemente, os efeitos produzidos são reversíveis. Por causa disto,
o inibidor se tornará inativo quanto mais rápido a sua concentração no fluido extracelular
decrescer. Algumas vezes, entretanto, há formação de uma ligação covalente e o efeito
produzido por um inibidor pode persistir e tornar-se irreversível [SILVERMAN, 1992].
Para se propor estruturas de novos inibidores que apresentem maior afinidade com o
sítio de sua enzima-alvo é importante ter a compreensão dos tipos de forças de interação que
ligarão estes inibidores à enzima. Um grande número de interações intermoleculares estão
envolvidas no processo de reconhecimento molecular enzima-ligante. Além da possibilidade
de formação de ligações covalentes, as interações típicas entre proteínas e ligantes são: (i)
ligações hidrogênio; (ii) forças de dispersão de London; (iii) interações iônicas entre
grupamento carregados; (iv) interações hidrofóbicas; (v) interações do tipo cátion-π; e (vi)
interações entre grupamentos aromáticos.
Ligação covalente
As ligações covalentes são de energia elevada, entre 77-88 kcal/mol. Na temperatura
usual dos sistemas biológicos (30-40°C), ligações que envolvem uma energia maior que 10
kcal/mol dificilmente são clivadas em processos não enzimáticos. Isso implica que complexos
ligante-enzima envolvendo ligações dessa natureza são raramente desfeitos, culminando com
uma inibição enzimática irreversível ou inativação do sítio enzimático.
Ligação hidrogênio
A ligação hidrogênio é um tipo de interação dipolo-dipolo formada entre o hidrogênio
de um grupo X-H, onde X é um átomo eletronegativo, e um átomo eletronegativo Y contendo
um par de elétrons disponível. A ligação hidrogênio só é significativa, em geral, quando
ocorre entre moléculas onde X e Y são N, O ou F. X desloca a nuvem eletrônica do
hidrogênio fazendo com que ele adquira uma carga parcial positiva, que passa a atrair o par de
elétrons disponível em Y. A interação é representada por uma linha pontilhada, XH---Y,
para indicar que a ligação entre X e H é mantida apesar da ligação entre H e Y também
ocorrer.
As ligações hidrogênio são as mais importantes interações não-covalentes existentes
nos sistemas biológicos, sendo responsáveis pela manutenção das conformações bioativas de
macromoléculas nobres como as hélices α e as folhas β de proteínas e interações purinas-
pirimidinas dos ácidos nucléicos [BARREIRO & FRAGA, 2001].
Forças de dispersão de London
Ocorrem na aproximação de moléculas apolares apresentando dipolos instantâneos e
dipolos induzidos. Em geral, essas interações são de fraca energia e ocorrem em função da
polarização transitória (dipolo instantâneo) entre as ligações de baixas polaridades ou
apolares, como ligações carbono-hidrogênio ou carbono-carbono, respectivamente. Essa
polarização se origina do movimento eletrônico que permite concentrações instantâneas de
elétrons em uma unidade molecular, que por sua vez induz uma polarização nos elétrons da
unidade molecular adjacente (dipolo induzido). A força atrativa resultante entre as unidades é
chamada força de dispersão (ou força de dispersão de London). Apesar de envolverem fracas
energias de interação, as forças de dispersão são de extrema importância para o processo de
reconhecimento molecular do ligante pelo sítio do enzima, uma vez que normalmente se
caracterizam por interações múltiplas que, somadas, acarretam contribuições energéticas
significativas [SILVERMAN, 1992].
Interações iônicas
Os grupamentos básicos das cadeias laterais da arginina, lisina e, em menor extensão,
histidina encontram-se protonados em um pH de 7,4 (pH fisiológico) e, consequentemente,
produzem sítios catiônicos. Já os aminoácidos com grupamentos ácidos, tais como a cadeia
lateral do ácido aspártico e glutâmico, encontram-se desprotonados nesse pH, formando sítios
aniônicos [SILVERMAN, 1992].
Nesse meio, os grupamentos dos ligantes e enzimas serão mutuamente atraídos, se
houver entre eles cargas opostas. Essa interação iônica pode ser efetiva a distâncias maiores
que aquelas requeridas em outros tipos de interação, podendo persistir por mais tempo.
Interações hidrofóbicas
Tal como as forças de dispersão, as interações hidrofóbicas são individualmente fracas
e, sendo governadas pelo aumento da entropia das moléculas de água que solvatam as
unidades hidrofóbicas. Normalmente, as cadeias hidrofóbicas, presentes tanto no sítio da
enzima como no ligante, encontram-se organizadamente solvatadas por camadas de moléculas
de água, que são liberadas ao ocorrer a interação entre o sítio e o ligante. Em vista do grande
número de subunidades hidrofóbicas presentes nos peptídeos e ligantes, essa interação torna-
se importante para o reconhecimento do ligante-enzima.
Interações cátion-π
ππ
π
A interação cátion-π é uma interação não-covalente entre grupamentos ou átomos
positivamente carregados e um sistema π [MINOUX & CHIPOT, 1999]. Essa interação,
observada em muitos sistemas biológicos, tais como o sítio de interação da acetilcolinesterase
e o da alquilamina desidrogenase [TSUZUKI et al., 2001], parece estar relacionada à presença
de um momento de quadrupolo em anéis aromáticos.
Inúmeras investigações experimentais e teóricas vêm sendo desenvolvidas com o
objetivo de caracterizar essas interações [FELDER et al., 2001]. Cálculos teóricos de energia
de ligação em sistemas cátion-benzeno e cátion-tolueno têm mostrado que, na fase gasosa, o
cátion se liga preferencialmente ao composto aromático e não à água. Desta forma, as cadeias
laterais dos aminoácidos Trp, Phe e Tyr, no vácuo, podem estabilizar uma carga positiva de
forma mais eficiente que a água.
Interações entre sistemas aromáticos
Este tipo de interação é conhecida como interação π− π e ocorre entre grupos
aromáticos de ligantes e de alguns aminoácidos. A intensidade desta interação depende da
distância e da orientação entre os grupos aromáticos. Quando os grupos estão em uma posição
aproximadamente paralela (face-a-face, empilhamento π) ou quando estão perpendiculares
entre si (na forma de T, empilhamento T) as intensidades destas interações parecem ser
maiores do que em outras orientações [SINNOKROT & SHERRILL, 2003].
2.5 Modelos Quantitativos de Interação
O processo de reconhecimento molecular enzima-ligante é dirigido por uma
combinação de efeitos entálpicos e entrópicos [BROOIJMANS & KUNTZ, 2003]. Estes
efeitos podem ser estimados através da energia livre de Gibbs da interação enzima-ligante
(
∆
G
int
) que, por sua vez, está diretamente relacionada à constante de inibição K
i
, a qual pode
ser medida experimentalmente,
i
KRTSTHG ln
intintint
=∆−∆=∆ (1)
onde
∆
H
int
é a entalpia de interação, T é a temperatura absoluta,
∆
S
int
é a entropia de interação
e R é a constante universal dos gases. O sinal positivo na equação (1) se deve ao fato de que a
constante medida, K
i
, é na realidade a constante de dissociação do complexo enzima-ligante.
Esta relação apresenta uma ponte entre o modelo teórico e a resposta biológica. As energias
livres de ligação devem ser estimadas se o que se deseja é uma predição quantitativa das
afinidades enzima-ligante, expressas nas medidas experimentais de K
i
, como parte do
processo de planejamento de ligantes, sejam eles fármacos ou agroquímicos.
A energia livre de interação pode ser obtida através de métodos teóricos, embora a
obtenção de estimativas muito precisas de
∆
G
int
envolva um custo computacional muitas
vezes proibitivo. Dois métodos, que utilizam simulações de dinâmica molecular utilizando um
campo de força molecular clássico, são geralmente utilizados para o cálculo de energia livre:
o método de perturbação de energia livre (FEP, Free Energy Pertubation) e o método de
integração termodinâmica (IT) [VAN GUNSTEREN et al., 1994; KOLLMAN 1993;
BROOKS et al., 1988]. Embora estes dois métodos sejam precisos, com erros de
aproximadamente 1 kcal/mol, o alto custo computacional envolvido limita esta utilização.
Outra metodologia bastante utilizada para a obtenção de energias livres de interação é
a chamada energia de interação linear (LIE, Linear Interaction Energy) [HANSSON et al.,
1998]. Os cálculos de energia livre com esta metodologia envolvem simulações de dinâmica
molecular somente nos estados inicial (ligante em solução) e final (complexo enzima-ligante),
podendo reduzir, desta maneira, o custo computacional associado às técnicas FEP e IT. A
idéia principal é considerar as contribuições polares em conjunto e não-polares
separadamente. A parte polar ou eletrostática pode ser tratada usando aproximação de
resposta linear, enquanto que a não-polar é calculada usando uma fórmula empírica calibrada
sobre um conjunto de dados experimentais,
(
)
(
)
livre
el
ligado
el
livre
LJ
ligado
LJ
VVVVG −+−=∆
βα
int
(2)
onde α é o fator empírico que surge das interações não-polares, β é o correspondente às
interações eletrostáticas e
V
representa os valores médios da energia de interação entre o
ligante e o meio circundante, tanto para o termo eletrostático (el) como para o termo de
Leonard-Jones (LJ). O método LIE tem sido aplicado com sucesso em sistemas complexos, o
que o torna um método eficiente e mais rápido para a determinação de energias livres de
interação, mas com um custo computacional suficientemente grande para torná-lo
praticamente inviável para estudos envolvendo várias dezenas ou centenas de ligantes.
A energia livre de interação de alguns complexos CYP51-inibidor, em água, tem sido
calculada de acordo com o método Mecânica Molecular/Superfície Poisson-Boltzmann
(MM/PBSA), proposto por Srinivasan e colaboladores [ZAMPIERI et al., 2007; BANFI et
al., 2006; SRINIVASAN et al., 1998]. De acordo com este método, o
∆
G
int
é calculado como:
STGEG
solvMM
∆−∆+∆=∆
int
(3)
∆E
MM
representa a variação da soma das energias de mecânica molecular das
moléculas sendo dividida nas contribuições das variações das energias eletrostática (∆E
EL
) e
van der Waals (∆E
VDW
).
VDWELMM
EEE ∆+∆=∆ (4)
O termo ∆G
solv
pode ser subdividido em dois termos de energia:
NPPBsolv
GGG ∆+∆=∆ (5)
∆G
PB
e ∆G
NP
são as componentes polares e não-polares da variação da energia livre de
solvatação, respectivamente.
Uma estratégia que pode ser mais efetiva é a construção de funções empíricas para o
cálculo de
∆
G
int
, que são específicas para uma determinada classe de proteínas ou para um
determinado alvo molecular específico. Estas funções reproduzem dados experimentais
associados à energia livre de ligação, assumindo que ela pode ser decomposta como uma
soma de diversas termos de energia independentes [AJAY & MURCKO, 1995], conforme
representado na pela equação
Gici
RT
G
K
lig
i
∆∑=
∆
=ln (6)
onde
∆
G
i
representa qualquer termo independente que irá contribuir para a energia livre de
ligação do complexo enzima-ligante e c
i
são os coeficientes ajustados empiricamente através
de um método de regressão múltipla. Apesar das limitações teóricas envolvidas ao se fazer
esta aproximação [WILLIAMS & WESTWELL, 1998], este método empírico tem fornecido
informações bastante úteis com custo computacional bem menor.
Modelos deste tipo podem conter uma série de fatores entálpicos e entrópicos, que
incluem termos que podem ser avaliados separadamente, tais como a entalpia associada a
interação do enzima-ligante, dessolvatação do ligante, restrições dos movimentos do ligante
após a ligação, incluindo rotações internas, entre outros. Embora muitos termos sejam
necessários para uma descrição completa da energia de interação, um número limitado de
termos pode ser suficiente para o caso de conjuntos de moléculas estruturalmente
semelhantes. Por exemplo, Oliveira e colaboradores obtiveram a seguinte função empírica de
correlação para inibidores da enzima fosfodiesterase 4 (PDE4) [OLIVEIRA et al., 2006],
(
)
38,4255,112,095,44012,0
int
2
int
−+∆++∆=∆
RBsolv
NHGG
(7)
onde ∆G
solv
está associado ao termo de solvatação do ligante, ∆H
int
à energia de interação
enzima-ligante e N
RB
ao número de ligações simples do ligante que são “congeladas” no
processo de ligação com a enzima; este último termo está associado às perdas entrópicas
envolvidas no processo de perda de liberdade conformacional destas ligações causada pela
interação enzima-ligante.
Os termos entálpicos envolvidos na interação entre o ligante e a enzima podem ser
calculados diretamente por vários métodos. Estes métodos basicamente diferem quanto à
natureza do campo de força, ou seja, do conjunto de funções de energia analítica e seus
parâmetros numéricos associados. Os campos variam desde totalmente empíricos, como os
utilizados pela mecânica molecular, até os puramente teóricos (métodos ab initio), passando
pelos chamados métodos semi-empíricos [JENSEN, 1999]. Na função empírica representada
pela equação 7, o termo ∆H
int
foi calculado após um processo de otimização utilizando
cálculos quânticos semi-empíricos de estrutura eletrônica. Isto é um indicativo da importância
de se utilizar campos de forças mais sofisticados, que possam descrever de forma mais
acurada as interações intermoleculares enzima-ligante (especialmente do tipo π- π e
empilhamento-T entre grupamentos aromáticos, particularmente importantes no sítio ativo
específico da PDE4).
Estudos demonstraram que a perda entrópica que ocorre durante a interação enzima-
substrato é determinada principalmente pelas restrições impostas à translação e as rotações
internas do ligante [SEARLE & WILLIAMS, 1992; SEARLE et al., 1992], o que está de
acordo com o ponto de vista qualitativo aceito para o processo. Searle e colaboradores
estimaram que, para cada rotação restrita como resultado da interação com a enzima, a perda
entrópica (T∆S a 300K) está entre -0,38 e -0,86 kcal/mol (-1,59 e -3,60 kJ/mol).
2.6 Determinação da Estrutura da CYP51
O principal método experimental para obter estruturas 3D de proteínas e complexos
proteínas-ligantes é a cristalografia de raios-X. Contudo, o uso desta técnica no estudo de
proteínas de membrana é complicado, uma vez que estas dificilmente podem ser purificadas e
cristalizadas.
Como os outros membros da superfamília P450, formas da CYP51 de eucariotos são
ligadas a membranas biológicas, enquanto que as dos procariotos são solúveis. Por esta razão,
a maioria das coordenadas de raios-X das P450s disponíveis em bancos de dados são aquelas
pertencentes a microorganismos procarióticos. Somente em 2003 foi publicada a primeira
estrutura cristalográfica de uma P450 integral de membrana [WILLIAMS et al., 2000].
Entretanto, até hoje nenhuma estrutura cristalográfica de uma CYP51 de membrana foi
disponibilizada em bancos de dados de proteínas.
O uso de métodos computacionais comparativos vem sendo bastante explorado na
busca de uma solução para resolver o problema da predição da estrutura 3D de enzimas. Com
a utilização de informações de estruturas proteicas já existentes, é possível fazer uma previsão
de como seriam algumas estruturas desconhecidas.
2.6.1 Modelagem por homologia
Atualmente, a ferramenta mais bem sucedida para a predição de estrutura 3D é a
modelagem por homologia, também conhecida como modelagem de proteínas baseada em
estruturas conhecidas (knowledge-based protein modeling) [BAJORATH et al., 1993;
JOHNSON et al., 1994; ROST & SANDER, 1996] ou modelagem comparativa. Esta
abordagem baseia-se em algumas conclusões gerais obtidas a partir de observações
acumuladas ao longo dos anos sobre a arquitetura de proteínas com estruturas determinadas
experimentalmente, dentre elas: [GRANT & RICHARDS, 1995]
a) Proteínas com sequências de aminoácidos semelhantes geralmente apresentam estruturas
tridimensionais semelhantes;
b) A homologia entre sequências de aminoácidos implica em semelhança estrutural e
funcional;
c) Proteínas de uma mesma família apresentam regiões interiores conservadas (muito
semelhantes) e regiões externas (laços) variáveis.
A modelagem da estrutura de uma proteína por homologia se baseia na relação
evolutiva entre as proteínas alvo e molde. Estruturas moldes em potencial são identificadas ao
se buscar por proteínas homólogas em bibliotecas contendo estruturas de proteínas
determinadas experimentalmente. De uma série de possíveis candidatos, a estrutura molde é
escolhida com base em vários critérios, tais como o nível de similaridade entre a sequência a
ser modelada e as sequências molde, a qualidade experimental da estrutura (resolução), a
presença de ligantes e cofatores, entre outros. Idealmente, a sequência alvo deveria ser
modelada por apenas um único molde de alta qualidade. Porém, em muitos casos as estruturas
moldes irão corresponder a somente um ou mais domínios estruturais distintos de uma
proteína [BORDOLI et al., 2009].
A modelagem por homologia consiste em quatro etapas principais (figura7): (i) a
seleção de estruturas de proteínas determinadas experimentalmente (molde), que apresentem
semelhança evolucionária com a proteína que se quer modelar (alvo); (ii) o alinhamento das
sequências das proteínas alvo e molde; (iii) construção do modelo; e (iv) avaliação da
qualidade do modelo construído [ARNOLD et al., 2008]. Este procedimento pode ser feito
iterativamente até ser obtido um modelo satisfatório.
Figura 7. As quatro etapas principais da modelagem por homologia [BORDOLI et al., 2009].
Estimar a exatidão da estrutura de uma proteína modelada é uma etapa crucial em todo
o processo, uma vez que ele irá determinar a sua possível aplicação. Como modelos de
Estrutu
ras conhecidas
(moldes)
Seleção do molde
Alinhamento
Molde-sequência alvo
Modelagem da
estrutura
Avaliação do modelo
construído
Modelo(s) de
homologia
Sequência alvo
homologia resultam de uma extrapolação estrutural guiada pelo alinhamento de sequências, a
porcentagem de identidade entre as sequências da proteína a ser modelada e do molde é
geralmente admitida como uma primeira avaliação da qualidade do modelo, uma vez que há
uma correlação direta entre o nível de identidade das sequências de proteínas e o desvio dos
átomos de Cα de seu cerne em comum [CHOTHIA & LESK, 1986]. Assim, quando a
porcentagem de identidade está abaixo de 30% o modelo obtido não é confiável. Com a
diminuição da identidade das sequências, os erros no alinhamento e a modelagem incorreta de
grandes fragmentos tornam-se a maior fonte de imprecisão do modelo [ROST, 1999].
A construção de modelos por homologia requer o uso de programas especializados em
realizar estas etapas, bem como acesso aos bancos dados de estruturas de proteínas. Dentre os
programas desenvolvidos para fazer estas tarefas, tem se destacado os disponíveis pelo
servidor Swiss-Model [SCHWEDE et al., 2003], que pode ser acessado livremente na rede
pelo site http://swissmodel.expasy.org. Este servidor facilitou a realização destas tarefas pelo
usuário, uma vez que ele foi o primeiro a permitir que elas fossem realizadas de forma
automatizada, integrando todas as etapas envolvidas na construção de modelos de proteínas
por homologia. No ano de 2002, este servidor efetuou mais de 120.000 pedidos de usuários
para modelos 3D de proteínas [SCHWEDE et al., 2003]. Serviços similares têm sido
desenvolvidos por outros grupos, tais como ModPipe [ESWAR et al., 2003], 3D-JIGSAW
[BATES et al., 2001] e M4T [FERNANDEZ-FUENTES et al., 2007].
2.6.2 Modelagem de proteínas da família citocromo P450
Quando a identidade entre a proteína de estrutura desconhecida e a proteína de
estrutura conhecida é baixa, como ocorre entre os membros da família citocromo P450, a
construção do modelo se torna uma tarefa difícil e a confiabilidade dos resultados depende
criticamente da precisão do alinhamento das sequências [JI et al, 2000].
A identidade da sequência dos aminoácidos das P450 é extremamente baixa, podendo
ser menor que 20%, sendo que somente três aminoácidos são absolutamente conservados
nestas proteínas. Contudo, a determinação de um crescente número de estruturas
cristalográficas tem demonstrado que esta variabilidade não afeta a alta conservação de sua
estrutura topográfica [GRAHAM & PETERSON, 1999]. As regiões com a maior conservação
estrutural se encontram no cerne da proteína, ao redor do grupo heme. Este cerne é formado
por um conjunto de quatro hélices (D, E, I e L), pelas hélices J e K, por dois conjuntos de
folhas β, e uma espiral conhecida como meander. Estas regiões compreendem (figura 8):
primeiro, o laço ligado ao heme, contendo a sequência Phe-X-X-Gly-X-Arg-X-Cys-X-Gly,
localizada na face proximal do heme, pouco antes da hélice L, com uma cisteína que serve
como um ligante para o íon ferro do heme absolutamente conservada; segundo, a sequência
conservada Gln-X-X-Arg na hélice K, também no lado proximal do heme; e finalmente, a
parte central da hélice I, contendo uma outra sequência, considerada como a assinatura da
P450: Ala/Gly-Gly-X-Asp/Glu-Thr-Thr/Ser [WERCK-REICHHART & FEYEREISEN,
2000].
Figura 8. Representação da face distal de uma P450 (CYP2C5). O grupo heme está em
laranja e o substrato em amarelo. A hélice I acima do heme está próxima ao sítio de ligação
do substrato. O laço de ligação do heme e o conjunto de resíduos conservado Gln-X-X-Arg
encontram-se atrás do heme. [REICHHART & FEYEREISEN, 2000]
A primeira estrutura cristalográfica de uma CYP51 solúvel foi obtida recentemente,
isolada de Mycobacterium tuberculosis [PODUST et al., 2001a]. A partir de então, alguns
estudos têm sido realizados para saber se esta estrutura é um bom modelo para formas
eucarióticas.
O alinhamento das sequências primárias de um grande número destas enzimas de
humanos e de bactérias demonstrou que aproximadamente 35 aminoácidos são conservados
[WATERMAN & LEPESHEVA, 2005]. Isto sugere que estes aminoácidos podem representar
o requisito mínimo para a atividade catalítica de uma esterol 14-α desmetilase e que a CYP51
de M. tuberculosis (CYP51MT) é um modelo para formas eucarióticas, porém não em todos
os casos [LEPESHEVA et al., 2003].
Gollapudy e colaboradores construíram um modelo da CYP51 de Aspergillus
fumigatus (CYP51AF) utilizando as coordenadas cristalográficas da cadeia peptídica da
CYP51MT como o ponto de partida, sobre a qual as cadeias laterais da CYP51AF foram
modeladas, exceto para os resíduos dos laços, que foram extraídos de fragmentos compatíveis
de outras enzimas [GOLLAPUDY et al., 2004].
De fato, uma característica de grande importância que faz com que proteínas com
sequências de aminoácidos não muito semelhantes se enquadrem dentro de uma família
proteica (como é o caso da CYP51) é que as diferenças mais pronunciadas aparecem
geralmente em regiões da superfície da proteína. Já os resíduos localizados no interior das
proteínas variam menos frequentemente. Isto significa que geralmente os resíduos
constituintes do interior protéico e, consequentemente, os elementos de estruturas secundárias
correspondentes, permanecem altamente conservados dentro de uma família de proteínas
homólogas [SANTOS FILHO, 2000].
O método utilizado por Gollapudy e colaboradores é conhecido como modelagem por
substituição quimérica. Neste método, os aminoácidos da estrutura cristalográfica de uma
enzima são substituídos pelos aminoácidos da enzima que se pretende modelar sem alterar a
estrutura topográfica da enzima, ou seja, os átomos que constituem a cadeia peptídica da
enzima modelada terão as mesmas posições relativas que os átomos da cadeia peptídica da
enzima molde. Ele pode ser utilizado quando há alta homologia entre a sequência dos
aminoácidos das enzimas envolvidas [ROSSELO et al., 2002] e quando estas pertencem a
uma mesma família, cuja conservação da estrutura topográfica é observada.
Apesar de, a princípio, este método não poder ser aplicado na modelagem da CYP51
na sua totalidade, devido à baixa homologia que estas enzimas apresentam entre si, a
substituição quimérica pode ser utilizada para construir modelos de algumas regiões
conservadas dentro da enzima. Quando o objetivo de se modelar uma enzima é realizar um
estudo das interações de seus ligantes com o sítio ativo, apenas algumas alterações na
estrutura do sítio se fazem necessárias. Como a região do sítio é a de maior conservação
dentro de uma família de proteínas, a modelagem por substituição quimérica pode ser feita
apenas nesta região.
Um modelo de CYP51 feito por substituição quimérica na região do sítio ativo foi
construído por Rossello e colaboradores para identificar as interações de existentes entre
alguns oxiconazóis sintetizados por seu grupo e a CYP51 de Candida albicans, onde apenas
12 aminoácidos foram substituídos nesta enzima [ROSSELLO et al., 2002].
Na modelagem por substituição quimérica, a sequência dos aminoácidos destas
enzimas deve ser alinhada utilizando-se algoritmos adequados e a enzima que apresentar
maior similaridade na sequência dos aminoácidos é que servirá como molde. Predições das
estruturas secundárias podem ser utilizadas para aperfeiçoar o alinhamento destas sequências
para que a exatidão do modelo seja aumentada [GOLLAPUDY et al., 2004]. A substituição
dos aminoácidos deve ser feita de maneira que a geometria dos resíduos conservados seja
preservada, enquanto que os resíduos trocados devem ficar em uma conformação que seja
energeticamente favorável.
Uma vez definido o arcabouço geral do modelo desejado, com a substituição dos
aminoácidos, parte-se para otimização da geometria do sistema. Interações desfavoráveis
entre átomos não ligados por ligações covalentes deverão ser minimizadas por meio de
cálculos de mecânica quântica ou dinâmica molecular.
2.7 Métodos de Química Computacional
A Química Computacional é geralmente utilizada quando um método de descrição
matemática aplicado à Química é suficientemente bem desenvolvido para que ele possa ser
automatizado para a implementação em um computador. Poucos aspectos da Química podem
ser computados exatamente, mas quase todos eles têm sido descritos por meio de esquemas
computacionais qualitativos ou aproximadamente quantitativos [YOUNG, 2001].
Dado um sistema molecular, ou seja, um conjunto de átomos ligados entre si, podemos
realizar sobre ele vários tipos de cálculos, cuja escolha irá depender do tipo de estudo a que
estamos nos propondo. Podemos dividi-los em dois grandes grupos genéricos: os métodos
clássicos, como a mecânica molecular, e os métodos quanto-mecânicos, como os métodos
semi-empíricos e ab initio.
2.7.1 Métodos Quanto-mecânicos
A mecânica quântica (MQ) tem como objetivo central a obtenção de soluções da
equação de Schrödinger independente do tempo (equação 8), para a determinação precisa de
propriedades de sistemas atômicos e moleculares. Na maior parte dos problemas de Química,
o que se pretende é calcular os valores possíveis da energia do sistema, E. Teoricamente, a
MQ pode predizer exatamente qualquer propriedade de um átomo ou molécula individual. Na
prática, as equações da MQ podem ser resolvidas com exatidão para sistemas de apenas um
elétron.
),,(),,(),,(
2
2
2
zyxEzyxzyxV
m
ψψ
=
−∇
−η
(8)
Nesta equação,
2
∇
é o Laplaciano, ħ é a constante de Planck dividida por 2
π
, m é a
massa da partícula, Ψ(x,y,z) é uma função de onda associada ao movimento da partícula,
V(x,y,z) é um operador associado à energia potencial e E é a energia total da partícula. Esta é a
equação de Schrödinger nas três dimensões (x,y,z) independente do tempo. A equação
independente do tempo é suficiente para resolver os chamados problemas estacionários, que
constituem muitos dos problemas de Química [ALCÁCER, 2007]. Todo o termo entre
colchetes representa os operadores de energia cinética e potencial e constitui um único
operador matemático, chamado hamiltoniano H. Assim temos,
)()( rErH
ψ
ψ
=
(9)
em que r representa o conjunto das três coordenadas do espaço.
Uma forma de simplificar a equação de Schrödinger é assumir a imobilidade dos
núcleos atômicos. A massa nuclear é varias vezes maior que a massa dos elétrons, fazendo
com que os elétrons se ajustem quase que instantaneamente a qualquer mudança de posição
nuclear. Esta aproximação é conhecida como aproximação de Born-Oppenheimer, que
permite separar a equação de Schrödinger em duas: uma para a parte eletrônica e outra para a
nuclear [BORN & OPPENHEIMER, 1927]. A equação eletrônica tem a forma
)()( rErH
elelelel
ψψ
= (10)
onde o operador hamiltoniano é
∑∑∑∑∑
= >= ==
+−
∇
−=
N
i
N
ij
ij
N
i
M
A
iA
A
N
i
i
rr
Z
H
11 11
2
1
2
(11)
Na última equação, Z
A
é o número atômico do núcleo A, r
ij
é a distância entre os
elétrons i e j, r
iA
é a distância entre o núcleo A e o elétron i; N e M indicam, respectivamente,
os números de elétrons e núcleos do sistema. O primeiro termo desta expressão é o termo da
energia cinética dos N elétrons, o segundo é o de energia potencial atrativa dos elétrons para
os núcleos e o terceiro termo corresponde às interações elétron-elétron. O termo que descreve
a energia cinética nuclear é zero e o termo de interação coulombiano entre núcleos é um
parâmetro que deve ser adicionado à energia eletrônica E
el
para produzir a energia total E do
sistema.
As soluções da equação de Schrödinger estão sujeitas à restrições importantes. Em
primeiro lugar, a função de onda
Ψ
tem de ser normalizável e, em segundo lugar, tem que ser
antissimétrica com respeito à permuta de dois elétrons quaisquer [ALCÁCER, 2007].
A equação de Schrödinger não pode ser resolvida exatamente para sistemas
multieletrônicos, mesmo com a aproximação de Born-Oppenheimer [ALCÁCER, 2007]. Uma
segunda complicação com espécies multieletrônicas é em relação ao spin. O spin é
caracterizado pelo número quântico s, sendo um efeito puramente relativístico. Como a
equação de Schrödinger é não relativista, inclusões adicionais que computem tal efeito na
forma da função de onda devem ser feitas. A combinação da função de onda espacial do
elétron com uma função de spin adequada produz a chamada função spin-orbital.
Método de Hartree-Fock
Diversos métodos têm sido desenvolvidos para a aproximação da solução da equação
de Schrödinger para sistemas de muitos elétrons. Dentre estes métodos, o mais popular é o
método de Hartree-Fock (HF) [POPLE & NESBET, 1954; ROOTHAAN, 1951;
ROOTHAAN, 1960]. Além de ser capaz de fornecer uma solução bem aproximada para o
problema de muitos elétrons, o método HF tem a vantagem de servir como base para outros
métodos: por um lado, os métodos semi-empíricos, onde aproximações adicionais são
incluídas com o propósito de reduzir o custo computacional; por outro, métodos onde à
solução HF são acrescentadas correções no sentido de aproximar a solução exata.
Se assumirmos que um sistema de N elétrons pode ser descrito como uma soma de N
sistemas de um elétron que se move num campo gerado pelos núcleos estacionários e num
campo médio resultante da distribuição espacial de todos os outros elétrons, o problema se
reduz ao problema de N elétrons independentes. A teoria de HF, nesta aproximação, obriga a
construção de funções spin-orbitais
χ
para cada elétron, que minimizem a energia do estado
fundamental do sistema (método variacional) [MORGON & COUTINHO, 2007].
Estas funções spin-orbitais devem fazer parte de uma função determinantal escolhida
de forma ótima, uma vez que uma função de onda
Ψ
o
que descreve um sistema de muitos
elétrons deve ser antissimétrica perante a troca de coordenadas de dois destes elétrons e a
antissimetria é uma característica dos determinantes. Este determinante é conhecido como
determinante de Slater [SLATER, 1929] e é escrito como
)()()(
)()()(
)()()(
!
1
21
22221
11211
NNNN
N
N
o
xxx
xxx
xxx
N
χχχ
χχχ
χχχ
ψ
Λ
ΜΜΜ
Λ
Λ
=
onde as funções spin-orbitais moleculares
χ
i
são funções das coordenadas espaciais e de spin
de um único elétron. Admitindo que os
χ
i
são ortonormais, o fator 1/ !N é uma constante de
normalização para
Ψ
o
[MORGON & COUTINHO, 2007]. As dependências com relação às
partes espacial e de spin das funções
χ
i
podem ser separadas escrevendo-se
)1()()(
11
αφχ
rx
pa
=
(12a)
ou
)1()()(
11
βφχ
rx
pa
=
(12b)
onde α e β são funções que representam os dois possíveis estados de spin e os
φ
i
são funções
somente das coordenadas espaciais de um elétron, chamadas orbitais moleculares (OM).
A maior diferença entre sistemas multieletrônicos e monoeletrônicos é a presença das
interações entre elétrons. O que se deseja é obter uma função de onda de menor energia para
um sistema multieletrônico mantendo a formulação spin-orbital individual. O problema é
encontrar uma solução que simultaneamente englobe todos os movimentos eletrônicos, bem
como o efeito que um elétron de um OM exerce no comportamento de um outro elétron em
um outro OM devido a estes movimentos eletrônicos.
A solução para este problema pode ser encontrada na equação de Hartree-Fock.
aaa
f
χεχ
= (13)
Nesta equação,
ε
a
corresponde a energia orbital e ƒ representa o operador de Fock.
Este operador estabelece uma dependência entre a equação de cada orbital com os outros
orbitais e também depende das soluções da própria equação, os spin-orbitais moleculares
χ
a
.
Sendo assim, as equações devem ser resolvidas de forma acoplada, através de aproximações
sucessivas (solução iterativa). Por isso, diz-se que o método HF é um método autoconsistente,
ou seja, no final do processo iterativo cada
χ
a
que é solução das equações de HF deve ser o
mesmo
χ
a
a partir do qual se obteve o operador de Fock [MORGON & COUTINHO, 2007].
A equação de HF pode ser resolvida numericamente para sistemas atômicos ou
moleculares com poucos elétrons, porém para sistemas maiores este tipo de solução não é
viável. Uma alternativa proposta por Slater, posteriormente formalizada por Roothaan, é
expandir a parte espacial
φ
dos spin-orbitais moleculares em termos de um conjunto de
funções de base conhecidas. Isto é feito escrevendo cada orbital molecular
φ
p
como uma
combinação linear de um conjunto de funções de base conhecidas [MORGON &
COUTINHO, 2007].
∑
=
=
k
v
vvpp
rCr
1
)()(
ϕφ
(14)
Os orbitais
φ
v
são as funções de base e frequentemente correspondem aos orbitais
atômicos. No caso da equação 14, existem k funções de base, onde nem todos os orbitais estão
ocupados por elétrons. O menor número de funções de base (conjunto de base mínimo) é
aquele que acomoda todos os elétrons da molécula. Cálculos acurados devem usar conjuntos
de funções de base maiores do que o mínimo. Para um dado conjunto de base e um dado
determinante de Slater, o melhor conjunto de coeficientes C
vp
é aquele para o qual a energia é
mínima, ou seja,
0=
∂
∂
vp
C
E
(15)
O objetivo é então determinar o conjunto de coeficientes que resulta na menor energia
do sistema.
Quando esta aproximação de combinação linear dos orbitais atômicos (Linear
Combination of Atomic Orbitals, LCAO) é aplicada na equação de Schrödinger “eletrônica”,
utilizando o método variacional, gera-se um conjunto de equações conhecidas como equações
de Hartree-Fock/Roothaan-Hall [MORGON & COUTINHO, 2007], convenientemente
escritas como uma equação matricial
SCEFC
=
(16)
onde E é a matriz diagonal que representa as energias dos orbitais,
S
é a matriz de
sobreposição (uma forma de representar como cada função de base se sobrepõe na outra),
F
é
a matriz de Fock, que corresponde à aplicação da aproximação orbital da forma de um
determinante de Slater ao hamiltoniano da equação de Schrödinger. Nesta última matriz estão
incluídas as energias cinética e potencial de cada elétron individual, as interações entre eles e
a matriz densidade (somatório dos quadrados dos coeficientes orbitais moleculares nos
orbitais moleculares ocupados). A resolução desse conjunto gera a solução das equações de
Hartree-Fock para as moléculas, o conhecido método HF.
Métodos semi-empíricos
Os métodos semi-empíricos de estrutura eletrônica moderna surgiram como uma das
maneiras encontradas para a redução do tempo computacional gasto, tanto no tratamento de
sistemas moleculares contendo uma grande quantidade de átomos quanto na obtenção de
propriedades que exigem um maior esforço computacional, tais como: propriedades
termodinâmicas, cinéticas, cálculos de superfície de energia potencial, entre outras. Assim,
estes métodos foram desenvolvidos com o intuito de serem capazes de tratar problemas
químicos, especialmente no que diz respeito a propriedades eletrônicas, e que estão fora, em
geral, da capacidade de cálculo se fossem tratados por métodos
ab initio
[MORGON &
COUTINHO, 2007].
Em geral, os métodos semi-empíricos limitam-se ao tratamento dos elétrons de
valência, não considerando explicitamente os elétrons do cerne, que contribuem muito menos,
em geral, para o comportamento das moléculas [ALCÁCER, 2007]. Existe uma grande
variedade de métodos semi-empíricos, nos quais se fazem várias aproximações adicionais de
modo a reduzir as dificuldades de cálculo e melhorar a precisão.
Estes métodos procuram resolver, de forma autoconsistente, as equações de Hartree-
Fock-Roothaan. Para isso, utilizam parâmetros, obtidos por ajuste numérico, ou derivados de
resultados experimentais para tornar mais rápida a resolução das equações. Na maioria das
vezes, utilizam um conjunto de base mínimo de valência, formado por funções do tipo Slater
(STO –
Slater type orbitals
), e fazem uso da teoria de orbitais moleculares para a construção
da função de onda molecular, construindo estes orbitais moleculares a partir do método
LCAO [MORGON & COUTINHO, 2007].
Os métodos semi-empíricos paramétricos compreendem uma classe de métodos
especialmente adaptados ao cálculo da energia de ligação. Eles se baseiam na escolha de
parâmetros empíricos, cuja escolha criteriosa permite compensar, em parte, erros associados à
energia de correlação (diferença de energia entre a energia exata – não relativística – de um
sistema e a energia de Fock). Apóiam-se nas teorias de Dewar, nas quais a parametrização é
feita de modo a dar valores corretos para as entalpias de formação padrão (em fase gasosa).
São selecionados conjuntos de átomos que pertencem a conjuntos razoáveis de moléculas,
cujas entalpias de formação padrão, geometria molecular e momento dipolar sejam
conhecidos experimentalmente. A determinação do melhor conjunto de parâmetros é feita por
minimização dos erros nos cálculos de entalpia de formação, geometria e momento dipolar
[ALCÁCER, 2007].
Como exemplos de métodos semi-empíricos, têm-se o MNDO (
Modified Neglect of
Diatomic Overlap
) [DEWART & THIEL, 1977], AM1 (
Austin Model
1) [DEWAR
et al.
,
1985], PM3 (
Parametric Method
3) [STEWART, 1989], o MNDO/d (
Modified Neglect of
Diatomic Overlap
, incluindo orbitais d) [THIEL & VOITYUK, 1992a; THIEL & VOITYUK,
1992b] e, mas recentemente, os métodos RM1 [ROCHA
et al.
, 2006] e PM6 [STEWART,
2007].
A extensão dos métodos semi-empíricos para metais de transição enfrentou uma série
de dificuldades: a escassez de dados de referência; a maioria dos compostos de metais de
transição são compostos de camada aberta (em alguns casos de interesse biológico, como
pode ocorrer no sistema heme); e é mais difícil resolver as equações do método
autoconsistente para metais de transição. Para muitas situações, os métodos para introduzir as
aproximações ainda não foram resolvidos satisfatoriamente. Finalmente, estudos preliminares
indicam que cálculos
ab initio
de alto nível para metais de transição não são úteis para gerar
dados de referência termoquímica, embora sejam úteis para gerar dados de geometrias
[MORGON & COUTINHO, 2007].
Dentre os métodos paramétricos que podem ser utilizados para tratar sistemas
contendo metais de transição, podemos citar o PM6, desenvolvido recentemente [STEWART,
2007]. Neste método, as entalpias de formação são mais bem representadas e as geometrias
apresentam um grande aumento da exatidão, quando comparados com outros métodos
paramétricos.
O PM6 introduz muitas modificações no termo de interação NDDO cerne-cerne e no
método de otimização paramétrico. Este novo modelo é um pouco melhor que o seu
predecessor, RM1. O erro médio entre as entalpias de formação, calculadas por este método,
em 1373 moléculas usadas como referência, compreendendo elementos relevantes
biologicamente, é apenas de 4,4 kcal/mol. O erro médio equivalente para outros métodos é:
RM1, 5,0; B3LYP 6-31G(d), 5,2; PM5, 5,7; PM3, 6,3; HF 6-31G(d), 7,4; e AM1, 10,0
kcal/mol. Estas comparações indicam que o PM6 apresenta melhor desempenho que métodos
com maior custo computacional, como o B3LYP [STEWART, 2007]. Além disso, Puzyn e
colaboradores aplicaram recentemente os métodos RM1 e PM6 no desenvolvimento de 10
modelos QSPR (correlação quantitativa estrutura-propriedade) e encontraram um desempenho
equiparável aos desenvolvidos com o método DFT (funcional B3LYP), utilizando conjuntos
de base bem mais sofisticados [PUZYN
et al.
, 2008].
2.7.2 Métodos de Mecânica Molecular
Nos métodos de mecânica molecular, também conhecidos como métodos de campo de
força, e energia eletrônica
E
e
é escrita como função paramétrica das coordenadas nucleares e
os parâmetros associados à função são obtidos experimentalmente ou por dados
computacionais. Baseiam-se no fato de que as moléculas são compostas de unidades
estruturalmente similares e, por esta razão, algumas propriedades podem ser transferidas de
uma molécula para a outra, tais como comprimentos de ligação, frequências vibracionais,
entalpias de formação, entre outras [JENSEN, 1999].
A energia do campo de força
E
FF
é escrita como a soma de termos, como por exemplo:
crosselvdwtorsangestFF
EEEEEEE +++++=
(17)
Nesta equação,
E
est
é a função de energia para estiramento de uma ligação entre dois
átomos,
E
ang
representa a energia necessária para o dobramento angular,
E
tors
é a energia
torsional necessária para a rotação ao redor de uma ligação,
E
vdw
e
E
el
descrevem dois tipos de
energias de interação entre átomos não ligados, de van der Waals e eletrostática,
respectivamente, e
E
cross
representa acoplamentos entre os três primeiros termos. Assim, dada
uma função de energia das coordenadas nucleares, as geometrias e as energias relativas
podem ser calculadas. Moléculas estáveis correspondem a um mínimo na superfície de
energia potencial, e eles podem ser localizados pela minimização da
E
FF
em função das
coordenadas nucleares [JENSEN, 1999].
Em um campo de força genérico, pode-se descrever a ligação entre dois átomos por
um oscilador harmônico simples,
∑
−=
ligações
Rest
rrKE
2)0()0(
)( (18)
onde a constante de força
)0(
R
K e a distância de equilíbrio do oscilador
)0(
r
dependem dos
átomos que estão participando da ligação e seus valores são obtidos de um conjunto de
moléculas escolhido como padrão. O ângulo
θ
entre três átomos também pode ser descrito
como um oscilador harmônico,
∑
−=
ângulos
Rang
KE
2)0()0(
)(
θθ
(19)
Os ângulos diedros
ω
são apropriadamente descritos por séries truncadas de Fourier,
∑
=
+=
1
)1cos(
n
ntors
nVE
ω
(20)
onde n descreve a periodicidade de uma rotação.
A interação eletrostática é dada pela expressão comum de Coulomb
∑
<
=
ji
ij
ji
el
R
qq
E
0
ε
(21)
onde
q
i
e
q
j
são as cargas de cada átomo,
R
ij
a distância entre eles e
ε
0
é a constante dielétrica.
A interação de van der Waals, associada aos impedimentos estéreos, pode ser descrita usando-
se potenciais adequados, como o potencial de Lennard-Jones, (equação 22) [HYPERCHEM,
1994].
−=
∑
<
6
)0(
12
)0(
ij
ij
ij
ij
ji
vdw
R
B
R
A
E
(22)
Um dado campo de força, em associação a um conjunto de parâmetros, define um
método específico de mecânica molecular. Muitos métodos estão disponíveis hoje em dia, a
maioria deles parametrizados para sistemas orgânicos, fornecendo ótimos resultados
qualitativos [ALLINGER, 1977; WEINER
et al
., 1984; BROOKS
et al
., 1983; JORGENSEN
& TIRADORIVES, 1988]. Os resultados serão tanto melhores quanto mais próxima estiver a
estrutura da molécula que está sendo estudada daquelas usadas como padrão.
Um exemplo de campo de força muito difundido é o MM2 [ALLINGER, 1977],
desenvolvido com o intuito de descrever pequenos sistemas orgânicos. Um outro exemplo,
aplicável principalmente a macromoléculas de interesse biológico, como proteínas e ácidos
nucléicos, é o AMBER [WEINER
et al.
, 1984].
A grande vantagem dos métodos de mecânica molecular é que, para sistemas onde
bons parâmetros estão disponíveis, é possível ter uma boa predição das geometrias, das
energias relativas e barreiras conformacionais de uma grande quantidade de moléculas em um
tempo mais curto que os outros métodos computacionais.
2.8 Modelos de Predição da Solubilidade em Água de Moléculas Orgânicas
A solubilidade em água de uma substância é uma propriedade molecular importante
que pode afetar profundamente sua atividade biológica. O conhecimento da solubilidade pode
ser crucial para o desenvolvimento de substâncias com propriedades de transporte adequadas.
A capacidade de se predizer a solubilidade de substâncias auxiliaria grandemente o processo
de desenvolvimento de moléculas bioativas. De fato, se a solubilidade pode ser estimada antes
de um composto ser sintetizado, a síntese de muitos compostos inadequados pode ser evitada.
Diversos métodos têm sido propostos para a predição da solubilidade. Eles geralmente
consistem de uma análise de regressão linear múltipla de vários descritores moleculares. Uma
classe de técnicas calcula a solubilidade aquosa utilizando propriedades físico-químicas tais
como coeficientes de partição, pontos de ebulição, pontos de fusão, ou volumes molares
(derivados da densidade do líquido) [YALKOWSKY, 1993]. Estes métodos requerem uma
quantidade suficiente de compostos purificados e resultados experimentais relevantes para
serem disponibilizados. Estes métodos não são aplicados a compostos que ainda não foram
sintetizados ou isolados e geralmente são utilizados para pequenos grupos de moléculas, o que
limita sua aplicação.
Outros métodos são baseados nas propriedades que não podem ser determinadas
experimentalmente, mas podem ser calculadas à partir das estruturas moleculares (área de
superfície molecular, volume molecular, etc.) [HUIBERS & KATRITZKY, 1998]. A
superioridade prática deste método em relação ao primeiro é que ele não requer o
conhecimento de qualquer dado experimental do composto cuja solubilidade está sendo
predita, pois todas as informações necessárias são calculadas diretamente utilizando os dados
da estrutura molecular. Contudo, estas propriedades e a solubilidade em água não estão muito
correlacionadas e as equações resultantes sempre requerem a adição de alguns termos de
correção.
Métodos de contribuição de grupos são baseados em uma compilação de aspectos
estruturais relevantes das moléculas [KLOPMAN,
et al.
, 1998]. Eles se diferenciam do
método anterior por estimar a solubilidade a partir de dados obtidos de unidades estruturais da
molécula, e não da molécula como um todo. Eles são particularmente adequados, pois, como
o método anterior, eles não requerem o conhecimento de qualquer dado experimental dos
compostos cuja solubilidade será predita. Em contrapartida eles requerem um grande número
de parâmetros. Eles deduzem a solubilidade dos compostos orgânicos pelo cálculo das
contribuições das propriedades estruturais relevantes.
Modelos de predição da solubilidade têm empregado a representação de estrutura
topológica desenvolvido por Kier e Hall, incluindo conectividade molecular e índices de
estado eletrotopológico de espécies atômicas (
atom-type E-state
) [ROSE, & HALL, 2002;
KIER & HALL, 1999]. Estes descritores estruturais podem ser utilizados isoladamente ou em
conjunto com outros descritores, tais como polarizabilidade e cargas atômicas parciais. Para
estes conjuntos, a construção de modelos quantitativos de estrutura-propriedade (QSPR)
utiliza técnicas de rede neural artificial (ANN) ou por mínimos quadrados parciais (PLS)
empregando um algoritmo genético (GA) para a seleção do descritor [CHENG & MERZ JR,
2003; TEKTO
et al.
, 2001].
Vários modelos foram desenvolvidos para serem utilizados como preditores da
solubilidade aquosa (expressa como log
WS
) e encontram-se disponibilizados em servidores e
programas [VOTANO, 2004]. Dentre os modelos, temos o programa CSlogWS desenvolvido
pela ChemSilico [CHEMSILICO © 2003], que utiliza técnicas de ANN e se baseia em três
descritores topológicos: (
i
) os descritores de
E-state
que codifica a acessibilidade dos elétrons
de cada átomo, que é o potencial de interações intermoleculares não covalente, calculados
para cada átomo individual e para grupos funcionais em uma molécula; (
ii
) os índices de
conectividade molecular
χ
e (
iii
) os índices formação
κ
, que representam aspectos globais da
forma molecular [CHEMSILICO © 2003].
3 OBJETIVOS
Como parte de um programa que visa o desenvolvimento de novos compostos com
aplicação agrícola, incluindo o controle de fungos fitopatogênicos, este trabalho apresentou os
seguintes objetivos:
a)
Construir um modelo de sítio ativo de uma CYP51, pertencente a um fungo
fitopatogênico, que possa contribuir para os estudos de predição da atividade de
compostos com potencial fungicida contra o causador da mancha de micosferela em
morangos (
Mycosphaerella fragariae
);
b)
identificar parâmetros teóricos que estejam associados com o processo de inibição
enzimática da
CYP51 de
fungos;
c)
estabelecer uma relação quantitativa entre estes parâmetros com a atividade inibitória de
uma série de fungicidas azólicos, com o intuito de se propor um modelo de predição de
atividade de outros compostos potencialmente ativos; e
d)
utilizar o modelo proposto para a predição de atividade antifúngica relativa de uma série
de novos compostos sintetizados pelo grupo de síntese de organofosforados da UFRRJ.
4 METODOLOGIA
4.1 Modelo Empírico Usado na Predição da Atividade Inibitória em CYP51
Dados de
IC
50
estão disponíveis para uma série de inibidores da CYP51 [KLOPMAN
E PTCHELINTSEV, 1993]. Esses dados foram usados para a construção de um modelo para
a determinação de valores de
IC
50
a partir de dados teóricos, similar às propostas
desenvolvidas por Wang e colaboradores no estudo de inibidores de proteína quinase C
[WANG
et al.
, 1994] e Oliveira e colaboradores no estudo de inibidores da fosfodiesterase 4
[OLIVEIRA
et al.
, 2006]. Os compostos que foram utilizados para construção do modelo de
inibidores da CYP51 estão listados na tabela 4.
Tabela 4.
Compostos utilizados para a construção do modelo de predição da atividade de
novos inibidores da CYP51 e suas respectivas atividades experimentais contra
Candida
albicans
[KLOPMAN & PTCHELINTSEV, 1993].
Estrutura R
1
R
2
R
3
R
4
IC
50
(µ
µµ
µmol/L)
E1
CF
3
H H H 103,45
E2
CF
3
H F H 60,05
E3
OCH
3
H CF
3
H 28,50
E4
H H CF
3
H 3,25
E5
F H F H 1,97
E6
CH
3
H F H 100,88
E7
F H H F 107,41
E8
H H H H 103,58
E9
CH
3
H H H 95,29
E10
H H SCH
3
H 90,18
E11
F H F F 35,46
E12
H H F H 26,01
E13
H F CF
3
H 84,19
E14
H H OCH
3
H 268,00
E15
H H OCF
3
H 0,56
A proteína CYP51 é uma enzima de membrana em fungos [XIAO
et al.
, 2004]. Se ela
interage com o inibidor na fase lipídica então o inibidor deve deixar a fase aquosa, dissolver-
se na fase lipídica para, a seguir, ligar-se à CYP51. A energia livre envolvida na interação do
inibidor com a enzima em fase lipídica é difícil de calcular, mas ela pode ser estimada em fase
gasosa. Para se usar os dados em fase gasosa, foram adotados os ciclos termodinâmicos
propostos por Wang e colaboradores [WANG
et al.
, 1994], representados pelos esquemas 1 e
2.
Esquema 1
E
(lipid)
+ I
(aq)
EI
(lipid)
E
(lipid)
+ I
(lipid)
∆
G
∆
G
1
∆
G
2
Esquema 2
E
(lipid)
+ I
(lipid)
EI
(lipid)
E
(g)
+ I
(g)
EI
(g)
∆
G
2
∆
G
3
∆
G
4
∆
G
5
∆
G
6
onde
E
representa a enzima,
I
um inibidor, e
EI
o complexo enzima-inibidor.
Seguindo as simplificações discutidas por Wang e colaboradores [WANG
et al.
,
1994], se o valor de
K
i
para o inibidor
B
é conhecido, o valor de
K
i
do inibidor
A
pode ser
calculado pela equação:
(
)
[
]
(
)
[
]
B
i
BBBAAAA
i
KRTSTHGSTHGKRT lnln
66
1
661
−∆−∆+∆−∆−∆+∆=
(23)
Apesar de valores de
K
i
não estarem disponíveis, eles podem ser considerados
proporcionais aos valores de
IC
50
e, portanto, a equação acima deve se manter válida para os
dados de
IC
50
, a menos de um fator multiplicativo.
Os valores do termo
∆
G
1
correspondem à energia livre associada com o processo de
transferência do inibidor da fase aquosa para a fase lipídica, porém estes valores não são
calculados diretamente. Assumindo que esta transferência seja um processo passivo, então a
eficiência com a qual o inibidor é transferido para a fase lipídica será determinada pela
hidrofobicidade do inibidor. A hidrofobicidade é uma função da solubilidade em água (
WS
)
de um composto, que pode ser estimada pelo programa CSlogWS desenvolvido pela
ChemSilico, disponível no sítio <http://www.chemsilico.com> [ChemSilico © 2003].
Os valores de
∆
H
6
correspondem aos valores das entalpias envolvidas para a formação
complexo enzima-inibidor, calculadas com base na seguinte reação:
Enzima-H
2
O + Inibidor Enzima-Inibidor + H
2
O
A presença da molécula de água foi usada para se manter o número e o tipo de pares
de elétrons de ambos os lados da reação (reação isodêsmica), minimizando-se os erros na
avaliação da entalpia de reação pelo método semi-empírico. As entalpias de reação entre os
inibidores e a CYP51 foram calculadas através da seguinte equação:
)(
22
int
IOHEOHIE
HHHHH ∆+∆−∆+∆=∆
−−
(24)
onde
int
H∆
é a entalpia envolvida na interação do inibidor com a enzima;
IE
H
−
∆
é a entalpia
de formação do complexo enzima-inibidor;
OH
H
2
∆
é a entalpia de formação da água;
OHE
H
2
−
∆
é a entalpia de formação do complexo enzima-água; e
I
H∆
é a entalpia de
formação do inibidor. As otimizações das estruturas foram feitas com o programa Mopac2007
[STEWART, 2007], utilizando-se o método semi-empírico PM6, buscando estruturas que
fossem otimizadas até a norma de gradiente inferior a 1,0 kcal/(Å ou rad). Todos os cálculos
foram feitos em computadores AMD Athlon (TM) XP 2600+ 1,92 GHz com 1GB de RAM.
Assumindo-se uma perda de entropia translacional semelhante para todos os
compostos avalidados, que têm estruturas bastante semelhantes, o termo entrópico
T
∆
S
6
foi
considerado como apenas proporcional ao número de ligações rotacionáveis
N
LR
que se
tornaram “congeladas” como resultado da interação do inibidor com o sítio ativo. Foram
escolhidos 11 compostos da tabela 4 para o desenvolvimento do modelo com uma variação de
IC
50
de 3 ordens de grandeza, conforme será detalhado nos resultados. Assim, a equação para
o cálculo de
IC
50
teria a forma:
43int2150
logln
cNcHcWScIC
LR
++∆+=
(25)
na qual os coeficientes
c
1
-c
4
podem ser determinados ajustando-se a equação aos valores
experimentais do ln
IC
50
através de uma análise por regressão múltipla; o último coeficiente
(c
4
) corresponde ao segundo termo entre colchetes da equação (23). Este equação propõe que
haja uma dependência linear entre a atividade e o log
WS
. Uma dependência quadrática entre
estas duas variáveis seria adequada nos casos em que valores intermediários de solubilidade
fossem os melhores para a atividade e não valores extremos. Neste caso, a equação para o
cálculo do
IC
50
passaria a ter a seguinte forma:
(
)
54int3
2
2150
logln
cNcHccWScIC
LR
++∆++=
(26)
4.2 Obtenção da Estrutura 3D da CYP51MT e Seleção de seu Sítio de Interação
Diversas estruturas cristalográficas de CYP51 de
M. tuberculosis
(CYP51MT) estão
disponibilizadas no
Protein Data Bank
(PDB). Foi escolhida a estrutura de código 1EA1
[PODUST
et al.
, 2001a], pois ela se encontra co-cristalizada com o fluconazol, um dos
inibidores que será utilizado neste estudo e que mais se assemelha aos inibidores listados na
tabela 4. A estrutura da enzima foi obtida no PDB como um arquivo em formato
pdb
,
contendo as coordenadas cartesianas para todos os átomos, exceto os hidrogênios.
A seleção do sítio de interação da enzima com o inibidor (fluconazol) foi feita com o
programa Rasmol 2.7 [BERNSTEIN
et al
., 1999]. Os átomos presentes neste sítio foram
selecionados dentro de um raio de 4,5 Å ao redor do fluconazol (identificado como tpf470),
utilizando-se o comando
“select within (4.5, tpf470)”
e gravando-se a seleção no formato
pdb
. Para que as estruturas do heme e todos os resíduos de aminoácidos selecionados
estivessem completas, editou-se essa primeira seleção para encontrar seus nomes e
numerações. Com essa informação, retornou-se ao programa Rasmol para ser feita a seleção
nominal dos constituintes do sítio e do fluconazol (tabela 5). Moléculas de água presentes
dentro do raio de seleção e alguns aminoácidos que estavam fora do raio de seleção, mas que
apresentaram algum tipo de interação importante com o heme, também foram considerados.
Essa seleção foi gravada em arquivo no formato
pdb
.
Tabela 5.
Constituintes do sítio selecionado da CYP51MT, usado nos cálculos.
Gln 72 Leu 100 His 392
Tyr 76 Phe 255 Cys 394
Phe 78 Ala 256 Met 433
Met 79 Gly 257 H
2
O 88
Phe 83 His 259 H
2
O 123
Arg 95 Thr 260 H
2
O 174
Arg 96 Leu 321 H
2
O 175
Met 99 Arg 326 Hem
a
460
a
Heme
4.3 Modelagem do Sito Ativo da CYP51 de Fungo Fitopatogênico
Nesta etapa foi modelada a estrutura tridimensional da CYP51 de um fungo
fitopatogênico utilizando duas metodologias distintas: uma envolvendo a modelagem por
homologia, utilizando o servidor Swiss-Model [SCHWEDE
et al.
, 2003]; e outra envolvendo
a substituição quimérica dos resíduos do sítio ativo da CYP51MT.
A busca da sequência primária dos aminoácidos da CYP51 do fungo foi feita no
servidor Swiss-Prot, pelo site http//www.expasy.ch/sprot, utilizando as palavras-chave
“
CYP51 Mycosphaerella
”. A sequência dos aminoácidos da CYP51 do fungo
M. fragariae
ainda não estava disponível. Este fungo será utilizado nos ensaios de atividade biológica dos
compostos organofosforados que estão sendo desenvolvidos pelo grupo de síntese de
organofosforados da UFRRJ. Por esta razão, foi feita a busca da enzima de um fungo que
pertencesse ao mesmo gênero desta espécie. A sequência escolhida tem o código de acesso
Q9P471, que corresponde a uma seqüência de aminoácidos de uma CYP51 de
Mycosphaerella
não-mutante [GISI
et al
., 2000]. Esta proteína pertence ao fungo
M.
graminicola
(CYP51MG), constituída de 540 aminoácidos e com o peso molecular calculado
em 52554 Da.
4.3.1 Modelagem por homologia
A sequência dos aminoácidos correspondentes a CYP51MG, encontrada no Swiss-Prot
(código Q9P471), foi enviada ao servidor Swiss-Model, utilizando o
“Swiss-Model
workspace”
. Nenhum molde específico foi enviado para a construção do modelo, pois o
próprio servidor faz a busca do molde mais adequado para a construção do melhor modelo.
O modelo construído (CYP51MG
H
) foi baseado na estrutura cristalográfica da CYP51
de
M. tuberculosis
co-cristalizada com o 4-fenil-imidazol (código de acesso no PDB: 1E9X)
[PODUST
et al.
, 2001a], havendo 27% de identidade entre as sequências das duas proteínas.
Como a estrutura modelada é desprovida de ligantes, foi necessário fazer a adição do
heme e de um inibidor, a fim de se identificar a região do sítio ativo no modelo. Para isso, as
estruturas CYP51MT (contendo o fluconazol) e CYP51MG
H
foram abertas no programa
Swiss-Pdb Viewer 3.7 [GUEX & PEITSCH, 1997] para sobrepô-las segundo as similaridades
das sequências primárias destas enzimas. Desta maneira, o heme e o fluconazol da CYP51MT
foram posicionados na região em que eles estariam presentes na CYP51MG
H
.
Estas estruturas sobrepostas foram salvas como um único arquivo em formato pbd.
Assim, foi possível criar um arquivo contendo as coordenadas cartesianas da CYP51MT,
CYP51MG
H
, do heme e do fluconazol. Este arquivo foi aberto em um editor de textos para
remover as coordenadas da CYP51MT, obtendo-se um modelo de CYP51MG
H
contendo o
heme e o fluconazol devidamente posicionados em seu sítio ativo.
A seguir, foi feito a seleção do sítio de interação deste modelo. A metodologia
utilizada foi idêntica àquela realizada na seleção do sítio da CYP51MT, apresentada no tópico
3.2. Os constituintes selecionados para o sítio de interação estão listados na tabela 6.
Moléculas de água foram adicionadas em regiões similares às presentes na CYP51MT.
Tabela 6.
Constituintes do sítio selecionado da CYP51MG
H
, usado nos cálculos.
Tyr 123 His 310 Phe 519
Phe 131 Ile 377 H
2
O
a
88
Glu 146 Ile 380 H
2
O
a
123
Gln 147 Arg 382 H
2
O
a
175
Met 306 His 476 Hem
b
460
Ala 307 Cys 478
Gly 308 Leu 518
a
Água (a numeração foi mantida conforme CYP51MT);
b
Heme
4.3.2 Modelagem por substituição quimérica
O alinhamento das sequências primárias das duas proteínas foi feito no programa
NCBI BLASTP 2.2.17 [ALTSCHUL
et al.
, 1997] pela rede de serviços BLAST
(
Basic Local
Alignment Search Tool
), disponível no sítio do Swiss-Prot. Estas sequências apresentam 27%
de identidade e 46 % de similaridade entre os aminoácidos, como representado na figura 9.
CYP51MG: 72 DPYKFFFSCREKYGDVFTFILLGKKTTVCLGTKGNDFILNGKLKDVNAEEIYSPLTTPVF 131
CYP51MT: 25 DPIGLMQRVRDECGDVGTFQLAGKQVVLLSGSHANEFFFRAGDDDLDQAKAY-PFMTPIF 83
* * ** *
CYP51MG: 132 GKDVVYDCPNSKLMEQKKFVKYGLTTSALQSYVTLIAAETRQFFDRNNPHKKFASTSGTI 191
CYP51MT: 84 GEGVVFDASPERRKE--MLHNAALRGEQMKGHAATIEDQVRRMIAD-------WGEAGEI 134
** **
CYP51MG: 192 DLPPALAELTIYTASRSLQGKEVREGFDSSFADLYHYLDMGFTPINFMLPWAPLPQNRRR 251
CYP51MT: 135 DLLDFFAELTIYTSSACLIGKKFRDQLDGRFAKLYHELERGTDPLAYVDPYLPIESFRRR 194
CYP51MG: 252 DYAQKKMSETHMSIIQKR-----RESKRANMRKTTSRCKYKDGN-AIPDKEIAHMMIALL 305
CYP51MT: 195 DEARNGLVALVADIMNGRIANPPTDKSDRDMLDVLIAVKAETGTPRFSADEITGMFISMM 254
CYP51MG: 306 MAGQHSSSATESWITLRLASRPDIQDELLQEQKDMLGVNADGSIKELTYANLSKLTLLNQ 365
CYP51MT: 255 FAGHHTSSGTASWTLIELMRHRDAYAAVIDELDELYG---DG--RSVSFHALRQIPQLEN 309
*** **
CYP51MG: 366 VVKETLCIHAPIHSILRKVKSPMPIEGTAYIIPTTHTLLAAPGTTSRMDEHFPDCLHWEP 425
CYP51MT: 310 VLKETLRLHPPLIILMRVAKGEFEVQG--HRIHEGDLVAASPAISNRIPEDFPDPHDFVP 367
* *
CYP51MG: 426 HRWDESPSEKYKHLSPTTALGSIAEEKEDYGYGLVSKGAASPYLPFGAGRHRCIGEQFAY 485
CYP51MT: 368 ARYEQPRQE-----------------------DLLNRWT---WIPFGAGRHRCVGAAFAI 401
* *
CYP51MG: 486 VQLQTITATMVRDFKFYNVDGSDNVVGTDYSSLFSRPLSPAVVKW 530
CYP51MT: 402 MQIKAIFSVLLREYEFEMAQPPES-YRNDHSKMVVQLAQPACVRY 445
*
Figura 9.
Alinhamento das estruturas primárias da CYP51 de
M. graminicola
(CYP51MG) e
M. tuberculosis
(CYP51MT). Os aminoácidos conservados estão destacados em azul; os que
apresentam características semelhantes, em cinza; os asteriscos indicam quais aminoácidos
que fazem parte do sítio de interação das duas proteínas, selecionados a partir de 4,5Å do
fluconazol, na estrutura CYP51MT.
A substituição dos aminoácidos do sítio ativo da CYP51MT pelos aminoácidos da
CYP51MG foi feita no programa Swiss-Pdb Viewer 3.7 [GUEX E PEITSCH, 1997],
utilizando-se a ferramenta “
mutate
”. A escolha da conformação das cadeias laterais dos
aminoácidos substituídos foi baseada no
“score”
fornecido pelo próprio programa. O
“score”
dá uma pontuação para as possíveis conformações dos aminoácidos dentro da enzima,
considerando os efeitos de repulsão de van der Waals e as ligações hidrogênio. Quanto menor
o
“score”
calculado para uma dada conformação de um aminoácido, maior a possibilidade de
ser esta a sua conformação dentro da enzima. Neste estágio, não houve modificação na
conformação dos aminoácidos que permaneceram conservados entre as duas proteínas.
A seguir, foram feitas as seleções nominais dos aminoácidos, das moléculas de água,
do heme e do fluconazol, presentes no sítio ativo da quimera, utilizando o programa Rasmol,
tomando como base a nova nomenclatura que os aminoácidos receberam após a mutação
(tabela 7).
Tabela 7.
Nomenclatura dos aminoácidos presentes no sítio ativo da CYP51MG após a
substituição de alguns resíduos da CYP51MT.
CYP51MT CYP51MG
CYP51MT CYP51MG
CYP51MT CYP51MG
Gln 72 Ala 72 Met 99 Lys 99 Leu 321 Ile 321
Tyr 76 Tyr 76 Leu 100 Phe 100 Arg 326 Arg 326
Phe 78 Leu 78 Phe 255 Met 255 His 392 His 392
Met 79 Thr 79 Ala 256 Ala 256 Cys 394 Cys 394
Phe 83 Phe 83 Gly 257 Gly 257 Met 433 Leu 433
Arg 95 Lys 95 His 259 His 259
Arg 96 Leu 96 Thr 260 Ser 260
4.4 Otimização dos Sítios CYP51MT e CYP51MG com o Fluconazol
Uma vez definida a estrutura do sítio ativo da CYP51MT e CYP51MG (com o
fluconazol) foi feito a otimização de suas geometrias. Uma vez que os arquivos fornecidos
pelo PDB contêm apenas as coordenadas cartesianas dos átomos pesados, fez-se necessário
inserir os átomos de hidrogênio nestas estruturas e fazer a conversão para coordenadas
internas, gerando um arquivo no formato de entrada do Mopac2007. Estas alterações foram
feitas pelo programa de conversões de arquivos BABEL [WALTERS & STAHL, 1996], em
ambiente DOS. Durante esta alteração, átomos de hidrogênio são inseridos nos átomos (C e
N) que tiveram sua ligação peptídica rompida ao serem selecionados para compor o sítio ativo
destas enzimas. Isso fez que o número de ligações se mantivesse constantes nestes átomos.
Os resíduos de histidina foram considerados na forma neutra enquanto que os resíduos
de arginina foram considerados protonados (forma catiônica), visto que os resíduos Arg95 e
Arg326, presentes na CYP51MT, parecem interagir com os carboxilatos do heme por meio de
uma interação iônica (figura 10).
Há resíduos de lisina no sítio ativo de CYP51MG; em solução, a lisina estaria
normalmente na forma protonada, mas dependendo do microambiente em que o resíduo se
localiza no interior da enzima, tanto a forma neutra quanto protonada são possíveis. Na
enzima ácido graxo amida hidrolase, por exemplo, foi demonstrado que um resíduo de lisina
do sitio ativo deve estar na forma neutra para iniciar o ciclo catalítico de hidrólise do substrato
[MCKINNEY e CRAVATT, 2003]; resíduos de lisina tanto na forma neutra quanto protonada
foram identificados por difração de neutrons na enzima D-xilose isomerase [KATZ
et al.
,
2006]. Assim, o resíduo Lys95 foi considerado protonado (com um grupo NH
3
+
-terminal),
pois assim também poderia fazer uma interação iônica com um carboxilato do heme, de modo
similar ao resíduo Arg95 de CYP51MT, mas o resíduo Lys99 foi avaliado tanto na forma
protonada quanto na forma neutra, ou seja, com um grupo NH
2
-terminal. O estado de
protonação deste resíduo poderia influenciar bastante os resultados obtidos, visto que esse
resíduo faz parte de uma importante região do sítio ativo que vai interagir com o único
grupamento dos triazóis que sofrerá modificação estrutural durante os estudos (o grupo
fenila). Por esta razão, foram criados dois modelos para a CYP51MG: um modelo com Lys95
protonada e a Lys99 desprotonada, CYP51MG
SQ1
; e outro com as duas lisinas protonadas,
CYP51MG
SQ2
.
Figura 10.
Sítio de ativo da CYP51MT. Moléculas de água e átomos de hidrogênio foram
omitidos. As cores representadas para os átomos são: nitrogênio, em azul; oxigênio,
Arg96
Met99
Arg326
Arg95
Cys394
Fluconazol
vermelho; carbono, branco; enxofre, amarelo; flúor, azul-claro. O ferro está sendo
representado pela esfera amarela. Os carbonos do inibidor (fluconazol) estão em ciano.
Propostas mecanísticas para a oxidação de substratos pela P450 sugerem que a carga
do íon ferro do heme antes da ligação dos substratos é de +2 [GUENGERICH, 1991;
WERCK-REICHHART & FEYEREISEN, 2000]. Como o resíduo Cys394, que atua como o
quinto ligante para o ferro, foi considerado desprotonado (forma aniônica) e o anel
protoporfirínico do heme apresenta dois substituintes carboxilato em sua estrutura (Figura 9),
a carga eletrônica total atribuída às estruturas CYP51MT, CYP51MG
SQ1
e CYP51MG
SQ2
foi
de +2, +1 e +2, respectivamente.
A definição do estado de
spin
do átomo de ferro foi baseada na geometria da estrutura
cristalográfica do heme da CYP51MT. Mudanças estruturais verificadas por métodos de
difração de raios-X demonstram que complexos heme penta-coordenado de Fe (II) sempre
apresentam configuração de alto spin (
24
2
gg
et
). Neste caso, o diâmetro do íon Fe (II) é maior
que o orifício central do anel porfirínico e, consequentemente, o Fe (II) encontra-se fora do
plano do anel. Quando o Fe (II) completa a hexa-coordenação e o complexo passa para a
configuração de baixo-spin (
6
2
g
t
), o íon Fe (II) reduz seu volume, movendo-se para dentro do
plano do anel [SHRIVER
et al.
, 1994]. Baseado nestas informações e analisando a geometria
do heme na CYP51MT (figura 10), os cálculos de otimização das geometria da CYP51 foram
feitos considerando-se o Fe (II) no estado de baixo-spin (neste caso, sem elétrons
desemparelhados).
Os átomos que compõe a ligação peptídica dos aminoácidos foram fixados no espaço.
Os átomos das cadeias laterais, de cada inibidor, das moléculas de água e todos os hidrogênios
foram mantidos livres durante a otimização. Os quatro átomos de carbono do heme
responsáveis por unir um anel pirrólico a outro também tiveram suas coordenadas fixadas
com o intuito de se evitar um possível deslocamento do heme (figura 11).
Figura 11.
Representação da estrutura do heme presente na CYP51. Os asteriscos indicam
quais carbonos tiveram suas posições “congeladas”.
Estas estruturas foram otimizadas com o programa Mopac2007, utilizando-se as
palavras-chave: “PM6 GRAD NOINTER NOLOG EF MMOK T=3D CHARGE=
n
GNORM=1”, onde
n
corresponde à carga resultante das estruturas.
4.5 Substituição dos Inibidores no Sítio Ativo da CYP51
Nesta etapa do estudo, foram utilizados inibidores estruturalmente semelhantes àquele
contido na CYP51MT, o fluconazol (tabela 4) [KLOPMAN E PTCHELINTSEV, 1993]. A
substituição foi feita diretamente pela alteração dos substituintes da fenila do composto
triazólico original, mantendo-se a conformação do restante da estrutura. Esta alteração foi
feita no programa Spartan ‘08 (Wavefunction Inc.), utilizando-se as coordenadas cartesianas
dos modelos da CYP51MT e CYP51MG.
Inicialmente, apenas os cinco primeiros compostos triazólicos da tabela 4 foram
modelados nos sítios da CYP51MT, CYP51MG
H
, CYP51MG
SQ1
e CYP51MG
SQ2
. Após a
otimização da geometria destes modelos, foi escolhido um dos três modelos da CYP51MG
para dar prosseguimento com a modelagem utilizando os demais compostos triazólicos da
tabela 4.
Para estes inibidores, os dados de
IC
50
que estão disponíveis foram determinados em
C. albicans
. Para que estes dados possam também ser aplicados nas espécies que estão sendo
estudadas neste trabalho, os inibidores deverão interagir de forma similar com o sítio ativo
destas espécies, ou seja, as diferenças entre sítios das espécies
C. albicans
,
M. tuberculosis
e
M. graminicola
não devem ser muito grandes.
O alinhamento das sequências dos aminoácidos destas espécies, feito no programa
NCBI BLASTP 2.2.17 [ALTSCHUL
et al.
, 1997], demonstrou que estas diferenças não são
muito grandes, principalemte entre
C. albicans
e
M. graminicola
(figura 12). Ao se fazer a
comparação dos aminoácidos pertencentes ao sítio ativo das espécies
M. tuberculosis
e
M.
graminicola
(baseado na seleção feita para a construção do modelo de sítio da CYP51MT,
tópico 4.2) com a espécie
C. albicans
, os valores de identidade encontrados foram em torno
de 58 e 63 %, respectivamente, sendo que, ao se considerar os aminoácidos com
características estruturais semelhantes entre
M. graminicola
e
C. albicans
, este valor sobe
para aproximadamente 84 %.
CYP51CA: 66 QPYEFFESCRQKYGDVFSFMLLGKIMTVYLGPKGHEFVFNAKLSDVSAEDAYKHLTTPVF 125
CYP51MG: 72 DPYKFFFSCREKYGDVFTFILLGKKTTVCLGTKGNDFILNGKLKDVNAEEIYSPLTTPVF 131
CYP51MT: 25 DPIGLMQRVRDECGDVGTFQLAGKQVVLLSGSHANEFFFRAGDDDLDQAKAY-PFMTPIF 83
* * ** *
CYP51CA: 126 GKGVIYDCPNSRLMEQKKFAKFALTTDSFKRYVPKIREEILNYFVTDESFKLKEKTHGVA 185
CYP51MG: 132 GKDVVYDCPNSKLMEQKKFVKYGLTTSALQSYVTLIAAETRQFFDRNNPHKKFASTSGTI 191
CYP51MT: 84 GEGVVFDASPERRKE--MLHNAALRGEQMKGHAATIEDQVRRMIAD-------WGEAGEI 134
** **
CYP51CA: 186 NVMKTQPEITIFTASRSLFGDEMRRIFDRSFAQLYSDLDKGFTPINFVFPNLPLPHYWRR 245
CYP51MG: 192 DLPPALAELTIYTASRSLQGKEVREGFDSSFADLYHYLDMGFTPINFMLPWAPLPQNRRR 251
CYP51MT: 135 DLLDFFAELTIYTSSACLIGKKFRDQLDGRFAKLYHELERGTDPLAYVDPYLPIESFRRR 194
CYP51CA: 246 DAAQKKISATYMKEIKSRRERGDIDPNRDLIDSLLIHSTYKDGV-KMTDQEIANLLIGIL 304
CYP51MG: 252 DYAQKKMSETHMSIIQKRRE-----SKRANMRKTTSRCKYKDGN-AIPDKEIAHMMIALL 305
CYP51MT: 195 DEARNGLVALVADIMNGRIANPPTDKSDRDMLDVLIAVKAETGTPRFSADEITGMFISMM 254
CYP51CA: 305 MGGQHTSASTSAWFLLHLGEKPHLQDVIYQEVVELL-KEKGGDLNDLTYEDLQKLPSVNN 363
CYP51MG: 306 MAGQHSSSATESWITLRLASRPDIQDELLQEQKDMLGVNADGSIKELTYANLSKLTLLNQ 365
CYP51MT: 255 FAGHHTSSGTASWTLIELMRHRDAYAAVIDELDELYG---DG--RSVSFHALRQIPQLEN 309
*** **
CYP51CA: 364 TIKETLRMHMPLHSIFRKVTNPLRIPETNYIVPKGHYVLVSPGYAHTSERYFDNPEDFDP 423
CYP51MG: 366 VVKETLCIHAPIHSILRKVKSPMPIEGTAYIIPTTHTLLAAPGTTSRMDEHFPDCLHWEP 425
CYP51MT: 310 VLKETLRLHPPLIILMRVAKGEFEVQG--HRIHEGDLVAASPAISNRIPEDFPDPHDFVP 367
* *
CYP51CA: 424 TRWDTAAAK-------ANSVSFNSSDEVDYGFGKVSKGVSSPYLPFGGGRHRCIGEQFAY 476
CYP51MG: 426 HRWDESPSEKYKHLSPTTALGSIAEEKEDYGYGLVSKGAASPYLPFGAGRHRCIGEQFAY 485
CYP51MT: 368 ARYEQPRQE-----------------------DLLNRWT---WIPFGAGRHRCVGAAFAI 401
* *
CYP51CA: 477 VQLGTILTTFVYNLR-WTIDGY-KVPDPDYSSMVVLPTEPAEIIW 520
CYP51MG: 486 VQLQTITATMVRDFKFYNVDGSDNVVGTDYSSLFSRPLSPAVVKW 530
CYP51MT: 402 MQIKAIFSVLLREYEFEMAQPPES-YRNDHSKMVVQLAQPACVRY 445
*
Figura 12.
Alinhamento das estruturas primárias da CYP51 de
C. albicans
(CYP51CA),
M.
graminicola
(CYP51MG) e
M. tuberculosis
(CYP51MT). Os aminoácidos conservados estão
destacados em azul; os que apresentam características semelhantes, em cinza; os asteriscos
indicam os aminoácidos que fazem parte do sítio de interação das duas proteínas,
selecionados a partir de 4,5 Å do fluconazol na estrutura CYP51MT.
Os compostos que estão sendo preparados pelo grupo de síntese de organofosforados
da UFRRJ para avaliar o seu potencial fungicida [BARBOZA, 2009] foram modelados na
CYP51MG. Estes compostos são estruturalmente diferentes do fluconazol (figura 13) e, por
esta razão, foi necessário usar um procedimento para determinar com quais aminoácidos essas
estruturas irão interagir mais provavelmente.
Figura 13.
Estruturas propostas para avaliação de potencial fungicida, testadas no modelo de
CYP51MG [BARBOZA, 2009].
Para isso, removeu-se primeiramente o inibidor que estava presente no modelo
CYP51MG. A seguir, desenhou-se no sítio ativo o fragmento das estruturas que compreende
os átomos pertencentes ao anel heterocíclico até o nitrogênio ligado ao fósforo, ligando-se o
heteroátomo da anel com o ferro do heme. Posteriormente, este modelo foi submetido à
otimização da sua geometria utilizando o método de mecânica molecular MMFF, fixando-se
todos os átomos pertencentes ao sítio ativo da CYP51MG, de maneira que apenas os átomos
do ligante sofressem alterações na sua geometria. Após a otimização da geometria foi
desenhado o restante da estrutura, seguindo-se uma reotimização.
O objetivo de se otimizar a geometria destas estruturas desenhando-as em partes é
permitir que o programa busque uma posição mais favorável para a interação de cada
fragmento da molécula do inibidor no interior do sítio ativo. Todas estas operações e cálculos
foram feitos no programa Spartan ‘08 [WAVEFUNCTION, Inc.]. Os modelos assim obtidos
tiveram a sua geometria otimizada no Mopac2007, utilizando o método semi-empírico PM6,
com o mesmo procedimento descrito anteriormente.
Série A
E16: R = etil;
E17: R = isobutil;
E18: R = isopropil;
E19: R = n-propil.
Série B
E20: X = O; R = n-propil;
E21: X = O; R = isopropil;
E22: X = O; R = n-butil;
E23: X = O; R = isobutil;
Série C
E24: X = S; R = n-propil;
E25: X = S; R = isopropil;
E26: X = S; R = n-butil;
E27: X = S; R = isobutil;
4.6 Modelagem dos Inibidores
A geometria inicial utilizada para a modelagem dos inibidores foi a mesma obtida
após a otimização dos complexos enzima-inibidor. O inibidor foi isolado utilizando o
programa Spartan ‘08 e submetido a otimização de sua geometria pelo programa Mopac2007,
utilizando-se o método PM6. As estruturas foram otimizadas até a norma de gradiente inferior
a 1 kcal/(Å ou rad).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Estudo Semi-empírico no Modelo do Sítio de Ativo da CYP51MT
O modelo do sítio ativo da CYP51 de
M. tuberculosis
, obtido à partir de seus dados
cristalográficos [PODUST
et al.
, 2001a], foi utilizado neste trabalho para avaliar a
possibilidade do uso do método do orbital molecular semi-empírico PM6, um método recente
e ainda pouco estudado. A geometria de compostos contendo elementos do grupo VIIIB (onde
o ferro está inserido) foi reproduzida razoavelmente utilizando o método PM6, incluindo a
geometria de certo tipo de heme (complexo ferro-porfirina) [STEWART, 2007], onde o ferro
se encontra tetracoordenado com o anel porfirínico. Porém, como no complexo cisteína-heme-
inibidor o átomo de ferro apresenta-se hexacoordenado, a geometria deste complexo poderia
ser mal reproduzida após a otimização.
Após a otimização da estrutura CYP51MT, com o fluconazol (E5) como ligante, foi
observado que a geometria do heme não sofreu grandes alterações quando comparada com a
geometria de sua estrutura cristalográfica (figura 14). As maiores diferenças são observadas
nas distâncias entre o átomo de ferro e o nitrogênio do anel triazólico e o enxofre de Cys394,
indicando que essas interações podem estar sendo superestimadas pelo método.
Figura 14.
Comparação entre as distâncias, em Å, de algumas ligações do heme da
CYP51MT após otimização com o método PM6 e as distâncias de referência (entre
parênteses) obtidas à partir de dados cristalográficos.
Como um segundo teste do método PM6, o modelo do sítio ativo da CYP51MT foi
utilizado para avaliar se os valores das entalpias calculadas para a interação CYP51MT-
inibidor poderiam ter alguma correlação com os valores de atividade inibitória (
IC
50
) sobre
uma CYP51, encontrados na literatura [KLOPMAN & PTCHELINTSEV, 1993]. Como neste
trabalho o que se pretende é realizar estudos em um modelo de CYP51 de um fungo
fitopatogênico, este teste foi feito utilizando-se apenas um grupo de 5 inibidores, mas com
boa variação de atividade. Os inibidores utilizados nesta etapa correspondem aos triazóis E1,
E2, E3, E4 e E5, listados na tabela 4. Os cálculos de entalpia de interação destes inibidores
foram feitos baseados na equação 24 e estão listados na tabela 8.
Tabela 8.
Entalpias de interação calculadas na formação do complexo CYP51MT-inibidor
(
∆
H
PM6
, kcal/mol) e a atividade inibitória experimental (
µ
mol/L).
Estrutura
∆
H
PM6
IC
50
a
E1
4,60 103,45
E2
-1,66 60,05
E3
-6,88 28,50
E4
-8,68 3,25
E5
-10,44 1,97
a
atividade determinada em Candida albicans [KLOPMAN & PTCHELINTSEV, 1993].
Comparando os valores de entalpia de interação dos complexos calculados após as
otimizações com os valores de
IC
50
(tabela 8), podemos observar que a entalpia tornou-se
mais favorável à medida que a atividade inibitória da CYP51MT pelos triazóis modelados foi
se tornando maior. De fato, há uma excelente correlação linear entre os dados experimentais e
teóricos (
R
= 0,995;
SD
=5,63).
Apesar de que a energia envolvida na interação entre enzimas e ligantes ser uma
combinação de termos entálpicos e entrópicos, nesta etapa apenas a entalpia de interação foi
suficiente para estabelecer uma ótima correlação com os valores experimentais. Isso pode
estar relacionado com o fato dos inibidores triazólicos utilizados serem estruturalmente
semelhantes, fazendo com que as perdas entrópicas decorrentes das restrições impostas
durante a ligação entre a CYP51MT e os inibidores não apresentem grandes diferenças entre
um inibidor e outro.
Embora o conjunto de dados usado neste teste seja limitado, a excelente correlação
encontrada entre a entalpia de interação teórica e os valores de IC
50
experimentais é um
indicativo de que o método do orbital molecular semi-empírico PM6 é uma ferramenta
adequada para a modelagem da interação de inibidores azólicos com o grupo heme da CYP51.
5.2 Construção do Modelo do Sítio Ativo de CYP51MG
Os modelos do sítio ativo de CYP51MG foram construídos utilizando duas
metodologias distintas. Na primeira delas foi modelada uma estrutura por homologia, pelo
servidor Swiss-Model, dando origem ao modelo CYP51MG
H
. O molde utilizado corresponde
à CYP51 de
M. tuberculosis
co-cristalizada com 4-fenil-imidazol (1E9X) [PODUST
et al.
,
2001a].
Geralmente, as P450s de uma mesma família apresentam um pouco mais que 40% de
identidade na sequência de seus aminoácidos [NELSON, 1999]. Essa identidade poderia
permitir a construção de um modelo com uma qualidade aceitável [ROST, 1999]. Porém, a
qualidade dos modelos obtidos por homologia depende também da distância evolucionária
entre as proteínas alvo e molde, ou seja, elas devem pertencer a uma mesma família e
apresentar semelhança funcional [BORDOLI
et al.
, 2009; GRANT & RICHARDS, 1995].
Contudo, na família CYP51, os níveis de identidade entre os aminoácidos podem cair
para valores bem inferiores à 40%, podendo ser menores que 22% [WATERMAN &
LEPESHEVA, 2005], o que compromete a qualidade dos modelos criados por homologia. O
modelo construído por homologia pelo Swiss-Model apresentou 27% de identidade entre seus
aminoácidos. Desta forma, este modelo pode não ser uma boa representação da estrutura 3D
desta proteína.
A segunda metodologia para a construção do modelo do sítio de interação da CYPMG
compreendeu a construção do modelo por substituição quimérica. A construção de um modelo
de CYP51 de
C. albicans
por esta metodologia já foi realizada uma vez por Rossello e
colaboradores para identificar as interações existentes entre o sítio ativo desta enzima e alguns
oxiconazóis [ROSSELLO
et al.
, 2002].
A estrutura topográfica do modelo criado por substituição quimérica (CYP51MG
SQ
) é
idêntica à estrutura topográfica da enzima molde (CYP51MT). Isso pode uma ser uma fonte
de aumento da inexatidão do modelo, uma vez que desvios topográficos são provocados
quando há diferenças entre as sequências das proteínas alvo e molde [CHOTHIA & LESK,
1986].
A sobreposição dos modelos criados por homologia e por substituição quimérica
demonstrou haver diferenças médias a altas entre estes modelos (figura 15). A diferença que
parece chamar mais a atenção é a presença do resíduo Glu146 no modelo criado por
homologia, uma vez que este aminoácido se encontra muito próximo ao grupo fenila dos
inibidores triazólicos, onde irão ocorrer as modificações estruturais destes inibidores. No
modelo feito por substituição quimérica, não há aminoácidos aniônicos nesta posição; há dois
resíduos de lisina, um pouco mais distantes (Lys95 e Lys 99). No sítio da CYP51MT, o
resíduo Arg95 ocupa essa região, fazendo uma interação do tipo cátion-
π
com o grupo fenila
(figura 10).
Figura 15.
Sobreposição dos modelos do sítio ativo da CYP51MG
SQ
(carbonos em cinza) e
CYP51MG
H
(carbonos em ciano).
O modelo construído por substituição quimérica sofreu uma diferenciação em dois
modelos: um com o resíduo Lys99 desprotonado, CYP51MG
SQ1
; e outro com o resíduo Lys99
protonado, CYP51MG
SQ2
, conforme abordado no tópico 4.4.
Os cálculos de entalpia de interação dos triazóis E1, E2, E3, E4 e E5 (tabela 4) com o
sítio ativo dos modelos de CYP51MG, construídos por homologia e por substituição
Glu146
Lys99
Lys95
Fluconazol
quimérica, foram determinados com a equação 24 e estão listados na tabela 9. São
apresentados também dados correspondentes da inibição da CYP51 disponíveis na literatura,
referentes à espécie
C. albicans
. A boa correlação obtida anteriormente entre os dados de
atividade contra esta espécie e os dados teóricos referentes à enzima de
M. tuberculosis
eram
sugestivos de que o sítio ativo da CYP51 de espécies diferentes interagiria de forma similar
com os compostos azólicos, independente da espécie considerada.
Tabela 9.
Entalpias de interação calculadas na formação dos complexos CYP51MG-inibidor
(
∆
H
PM6
, kcal/mol), para os diferentes modelos do sítio de interação da CYP51MG, e a
atividade inibitória experimental (
µ
mol/L).
Estrutura
∆
H
PM6
IC
50
a
CYP51MG
H
CYP51MG
SQ1
CYP51MG
SQ2
E1
-46,39 -23,16 -27,01 103,45
E2
-43,67 -20,51 -29,58 60,05
E3
-49,69 -24,70 -28,51 28,50
E4
-43,88 -28,94 -33,61 3,25
E5
-43,18 -24,15 -23,09 1,97
a
atividade determinada em C. albicans [KLOPMAN & PTCHELINTSEV, 1993].
Os valores de entalpia de interação CYP51MG-inibidor calculadas nestes modelos não
apresentaram uma boa correlação com os valores experimentais de atividade inibitória (
IC
50
).
Isso pode ter ocorrido por dois motivos: primeiro, a correlação não seria adequada, talvez
pelos sítios da CYP51 de
C. albicans
e de
M. graminicola
não apresentarem semelhança
suficiente; outra possível justificativa estaria relacionada com o fato de que a entalpia de
interação poderia não ser o único termo importante na predição da atividade inibitória destes
compostos contra enzimas de fungos.
Caso a última justificativa seja a principal responsável pela falta de correlação,
inclusões de outros termos de energia envolvidos na interação CYP51MG-inibidor poderiam
conduzir a uma equação empírica para a predição da atividade de outros compostos com
potencial inibitório. Considerações de outros termos de energia foram desenvolvidas por
Wang e colaboradores no estudo de inibidores de proteína quinase C [WANG
et al.
, 1994] e
Oliveira e colaboradores no estudo de inibidores da fosfodiesterase 4 [OLIVEIRA
et al.
,
2006].
Para desenvolver esta equação foi utilizado um número maior de inibidores. Como
demandaria muito tempo para se calcular a entalpia de interação destes inibidores com os três
modelos propostos para a CYP51MG, este estudo foi realizado com apenas um dos três
modelos.
A boa correlação existente entre os dados de atividade experimental e os dados
teóricos referentes à enzima de
M. tuberculosis
sugere que a entalpia de interação deve ser um
termo bastante significativo entre os fenômenos que se encontram associados à inibição da
CYP51. Desta forma, a escolha do modelo que seria utilizado para dar continuidade aos
estudos se baseou na correlação linear existente entre estas duas variáveis. Para os modelos
CYP51MG
H
, CYP51MG
SQ1
e CYP51MG
SQ2
os coeficientes de correlação linear encontrados
foram de -0,26, 0,60 e 0,08, respectivamente. Assim, o modelo CYP51MG
SQ1
demonstrou ser
o mais promissor para ser utilizado no desenvolvimento da equação empírica de predição.
5.3 Interações dos Triazóis com a CYP51MG
As interações dos triazóis com o modelo CYP51MG
SQ1
foram identificadas após as
otimizações da geometria do complexo CYP51MG
SQ1
-triazol. Os compostos classificados
como inibidores da CYP51 são caracterizados pela presença de grupos capazes de formar uma
ligação coordenativa com o íon ferroso do heme, o centro catalítico desta enzima. Este tipo de
interação é a mais importante para a atividade inibitória destes compostos. O 4-fenil-imidazol,
por exemplo, apesar de apresentar uma estrutura relativamente pequena, é capaz de se
acomodar prontamente no sítio ativo desta enzima, justamente, por fazer esta ligação
[PODUST
et al.
, 2001b]. Porém, a interação de inibidores desta enzima, com outras regiões
do sítio ativo pode melhorar suas atividades e, até mesmo, promover uma maior
especificidade para o organismo em que eles irão atuar.
As descrições à seguir estão representadas na figura 16.
Derivados de triazóis, como os que foram utilizados neste trabalho, apresentam um
nitrogênio heterocíclico, no anel triazólico, capaz de formar esta ligação coordenativa. Outros
dois “pontos de ligação” foram encontrados entre estes compostos e seu sítio de interação.
Uma molécula de água (174) serviu como um elo para promover a ligação entre a hidroxila
destes compostos com o carboxilato do heme. No modelo de CYP51MT, esta molécula de
água atua de maneira semelhante, porém unindo esta hidroxila com o resíduo Arg96,
positivamente carregado.
O outro ponto de ligação identificado também foi intermediado por uma molécula de
água (123). Esta molécula encontra-se associada ao oxigênio da cadeia peptídica de Met433
por uma ligação hidrogênio e seu oxigênio interage com um hidrogênio da cadeia lateral de
His259 e a um hidrogênio do anel triazólico não ligado ao ferro. O mesmo tipo de interação
foi observada no modelo de CYP51MT. Apesar do hidrogênio do anel triazólico estar ligado a
um átomo de carbono, a interação que ele faz com o oxigênio da água deve ser razoavelmente
forte, como se conclui pela distância entre os átomos. O caráter sp
2
do carbono aliado ao
efeito indutivo de seus nitrogênios vizinhos deve aumentar a carga parcial positiva (
δ
+
) do
hidrogênio. De fato, a carga parcial calculada para este hidrogênio, utilizando o método
Hartree-Fock com as funções de base do tipo 3-21G(*) com o programa Spartan ‘08
(considerando apenas o sistema aromático) foi de 0,276, maior que
a
carga parcial calculada
para um sistema aromático onde os nitrogênios sp
2
foram substituídos por átomos de carbono
(
δ
+
= 0,225) e mais próxima à carga parcial do hidrogênio de uma molécula de NH
3
(
δ
+
=
0,292), por exemplo.
Interações entre sistemas aromáticos foram observadas no grupo fenila dos triazóis e
no anel imidazol não-ligado ao ferro. O grupo fenila foi encontrado em uma posição
perpendicular à Phe83 (empilhamento T). No modelo da CYP51MT as interações parecem ser
um pouco mais fortes com este grupo: foram encontrados dois aromáticos interagindo de
forma semelhante (Phe83 e Phe255) e foi observada uma interação do tipo cátion-
π
com a
Arg96. No anel imidazol, foram encontradas interações em paralelo e perpendicular com os
aromáticos da His259 e Tyr76, respectivamente. A CYP51MT apresentou uma interação a
mais com a Phe78 (do tipo T). Interação com cadeias alifáticas próximas (Ile321, Leu433)
também foram observadas no modelo CYP51MG
SQ1
.
Apesar de ter sido observado um maior número de interações específicas entre os
inibidores triazólicos e o modelo de sítio da CYP51MT, foi observado que os valores das
entalpias de interação calculadas neste modelo foram menos favoráveis que as entalpias
calculadas modelo da CYP51MG
SQ1
(Tabelas 8 e 9). Na realidade, existem outros tipos de
forças que estão envolvidas nas interações entre os inibidores e as enzimas que, apesar de
envolverem fracas energias de interação, quando somadas acarretam contribuições energéticas
significativas, como as forças de dispersão de London [SILVERMAN, 1992].
A
B
Figura 16.
Representação das interações específicas encontradas entre os inibidores
triazólicos e os modelos da
A
) CYP51MG
SQ1
e
B
) CYP51MT após minimização. As
distâncias são dadas em Ångstrons (Å) e correspondem aos valores encontrados para o
fluconazol (E5).
5.4 Modelo Empírico de Predição da Atividade de Inibidores da CYP51MG
Apesar dos compostos utilizados nos cálculos de entalpia de interação apresentarem
grandes semelhanças estruturais (tabela 4), foi observado que os valores de entalpia
calculados e os valores de atividade experimentais não apresentam nenhuma correlação
(tabela 10). Mesmo eliminando-se os compostos que apresentam o
N
LR
diferente dos demais
(E3, E10, E14 e E15), ainda assim não foi possível a obtenção de uma boa correlação. Nos
dois casos, os valores de
r
2
foram inferiores à 0,1. Isto sugere que outros fenômenos
importantes, além da entalpia de interação, devem estar associados com o processo de
inibição da CYP51MG.
Os termos que foram considerados neste processo são os mesmos considerados na
equação 25 (
∆
H
int
,
N
LR
e o log
WS
). Se todos estes termos forem determinados teoricamente
com boa precisão e caso as considerações que foram feitas para se chegar a esta equação
estejam corretas, então a determinação dos coeficientes
c
1
-
c
4
desta equação pode nos conduzir
a um modelo para a predição da atividade de outros compostos. Estes termos foram
calculados para os inibidores da tabela 4 e estão listados na tabela 10, juntamente com os
dados de atividade experimental.
Tabela 10.
Valores de
IC
50
medidos experimentalmente (
µ
mol/L), energia de interação
calculada pelo PM6 (
∆
H
PM6
, kcal/mol), número de ligações rotacionáveis (
N
LR
) “congeladas”
durante a ligação e o log da solubilidade estimada em meio aquoso (log
WS
) dos inibidores
triazólicos utilizados neste trabalho.
Estrutura
IC
50
a
∆
H
PM6 b
N
LR
c
log
WS
d
1
103,45 -23,16 5 -1,90
2
60,05 -20,51 5 -1,71
3
28,50 -24,70 6 -2,35
4
3,25 -28,94 5 -2,36
5
1,97 -24,15 5 -2,25
6
100,88 -25,49 5 -2,75
7
107,41 -28,17 5 -2,26
8
103,58 -23,82 5 -2,82
9
95,29 -29,69 5 -3,00
10
90,18 -25,41 6 -3,37
11
35,46 -21,18 5 -2,02
12
26,01 -24,90 5 -2,55
13
84,19 -29,31 5 -2,12
14
268,00 -26,70 6 -2,91
15
0,56 -34,99 6 -2,60
a
atividade determinada em C. albicans [KLOPMAN & PTCHELINTSEV, 1993].
b
Calculada pela equação 24.
c
Determinado pela análise da estrutura otimizada.
d
Calculado com o programa CSlogWS (Chemsilico).
As perdas entrópicas associados a perdas nas rotações das ligações dos inibidores
foram determinados diretamente, pela observação das suas estruturas.
A análise por regressão múltipla dos termos calculados nos conduziu a uma equação
com uma correlação muito ruim com os valores do ln
IC
50
experimentais (
r
2
=0,29;
SD
=1,66).
Mesmo considerando a inclusão de um termo quadrático do log
WS
, como proposto por Wang
e colaboradores [WANG
et al.
, 1994] (equação 26), não houve melhoras consideráveis na
correlação entre os termos calculados e experimentais (
r
2
=0,33;
SD
=1,69). Após uma análise
sistemática da atividade prevista por esta correlação para cada composto, decidiu-se pela
eliminação de algumas estruturas na busca de uma melhor correlação. Ao se descartar a
contribuição dos compostos E1, E7, E10 e E13, foi obtida a equação (27), com uma boa
correlação (
r
2
=0,89;
SD
=0,81):
220,8757,0416,0)057,2(log439,5ln
6
int
2
50
++∆++=
LR
PM
NHWSIC
(27)
Apesar deste modelo não ter sido construido utilizando os dados dos termos calculados
de todos os inibidores da tabela 4, ele ainda envolveu a participação de compostos com uma
boa faixa de atividade (variação de 3 ordens de grandeza). Um ponto importante a se
considerar é que os valores de atividade experimentais que foram utilizados neste estudo
foram determinados contra
C. albicans
. As pequenas diferenças entre as sequências dos
aminoácidos da CYP51 desta espécie com a espécie que foi utilizada neste estudo (figura 12)
podem ter alterado a atividade de alguns compostos, em uns mais do que em outros, o que
poderia ter provocado uma correlação ruim ao se incluir todos os compostos.
Uma análise das contribuições dos três parâmetros utilizados neste modelo
demonstrou que a entalpia de interação é o termo que apresenta a maior influência na
atividade biológica dos compostos utilizados, sendo este o único termo que contribui para
reduzir o valor de ln
IC
50
, ou seja, para elevar a atividade (tabela 11). A segunda contribuição,
na maioria dos compostos, é devido a mudanças de entropia ocorridas durante a interação,
representadas pelas variações do
N
LR
.
Tabela 11.
Contribuição de cada termo variável da equação 27, ln
IC
50
medido
experimentalmente, ln
IC
50
calculado pela equação 27, e a diferença entre os valores de
∆
ln
IC
50
experimentais e calculados.
Estrutura [5,439(logWS+2,057)
2
] 0,416∆H
PM6
0,757N
LR
lnIC
50
exp
.
lnIC
50
calc
∆lnIC
50
1
a
0,13
-9,63 3,79 4,64 2,50 2,14
2
0,66
-8,53 3,79 4,09 4,13 -0,04
3
0,47
-10,28 4,54 3,35 2,95 0,40
4
0,50
-12,04 3,79 1,18 0,46 0,72
5
0,20
-10,05 3,79 0,68 2,16 -1,48
6
2,61
-10,60 3,79 4,61 4,01 0,60
7
a
0,22
-11,72 3,79 4,68 0,51 4,17
8
3,16
-9,91 3,79 4,64 5,26 -0,62
9
4,83
-12,35 3,79 4,56 4,48 0,08
10
a
9,37
-10,57 4,54 4,50 11,56 -7,06
11
0,008
-8,81 3,79 3,57 3,20 0,37
12
1,32
-10,36 3,79 3,26 2,97 0,29
13
a
0,02
-12,19 3,79 4,43 -0,17 4,60
14
3,95
-11,11 4,54 5,59 5,60 -0,01
15
1,60
-14,56 4,54 -0,58 -0,19 -0,39
a
Estruturas eliminadas para obtenção da correlação final (equação 27).
Apesar de o
N
LR
apresentar uma maior influência na atividade que o log
WS
, ele é um
termo que influencia muito pouco a discriminação dos compostos quanto à atividade, visto
que a sua variação entre um inibidor e outro é limitada. Por esta razão, mesmo ao se eliminar
este termo, foi obtido um modelo de predição com boa correlação (
r
2
=0,87;
SD
=0,84).
A aplicação desta equação na predição da atividade dos compostos triazólicos que
foram utilizados neste estudo reproduziu bem os valores de atividade experimentais, com
exceção dos compostos que foram eliminados (
r
=0,94;
SD
=0,63) (tabela 11 e figura 17).
-1 0 1 2 3 4 5 6
-1
0
1
2
3
4
5
6
r=0,94
SD=0,63
n=11
ln IC
50
calculado (nmol/mL)
ln IC
50
experimental (nmol/mL)
Figura 17.
Gráfico de correlação entre ln
IC
50
experimental e calculado.
Cabe ressaltar que o modelo construído foi baseado numa dependência quadrática
entre o log
WS
e o ln
IC
50
experimental. Um modelo de equação baseado na dependência linear
entre estas duas variáveis produziu uma equação com uma correlação mais fraca (
r
2
=0,71;
SD
=1,24). Esta dependência quadrática sugere que compostos muito hidrofóbicos ou muito
hidrofílicos não são ideais para se alcançar uma boa atividade. Isto está de acordo com a
proposta de que o inibidor deveria ser transferido da fase aquosa para a fase lipídica, onde ele
se ligaria à enzima. Caso o inibidor seja muito hidrofílico esta transferência seria dificultada.
Da mesma forma, se o inibidor for muito hidrofóbico, ele iria interagir fortemente com a
membrana lipídica, dificultando a sua transferência para a enzima. Este modelo prediz que a
solubilidade em água ideal que os inibidores devem apresentar produz um log
WS
equivalente
ao coeficiente
c
2
, ou seja, aproximadamente -2,06 (próxima à solubilidade do composto
11
).
5.5 Predição de Atividade Antifúngica de Compostos Organofosforados Sintetizados
pelo Grupo da UFRRJ
Alguns compostos sintetizados pelo grupo de síntese de organofosforados da UFRRJ,
coordenado pelo Prof. João Batista Neves da Costa, foram planejados como possíveis
inibidores da CYP51 [BARBOZA, 2009]. Estes compostos apresentam um anel
heteroaromático de 5 membros com um átomo (N, O ou S) capaz de se formar uma ligação
coordenativa com íon ferroso presente no heme, mas com um padrão molecular novo (figura
13).
Conforme descrito por Wang e colaboradores [WANG
et al.
, 1994], o
desenvolvimento da equação 26 (e, portanto da equação 27, obtida neste estudo), baseia-se na
suposição de que as moléculas sejam semelhantes, de forma que a energia livre associada à
passagem do inibidor da fase lipídica para a fase gasosa (
∆
G
4
), do complexo enzima/inibidor
da fase lipídica para a fase gasosa (
∆
G
5
) e as perdas entrópicas translacionais e rotacionais do
inibidor pela interação com a enzima sejam também semelhantes para todas as moléculas.
Como a série de compostos usada na obtenção da equação 27 e a série dos inibidores
propostos apresentam diferenças estruturais relevantes, a aplicação da equação aos inibidores
propostos não deve levar a resultados quantitativos da atividade prevista. Contudo, como as
estruturas propostas são semelhantes entre si, os erros associados com esta aplicação também
devem ser semelhantes para toda a série avaliada e, portanto, é razoável assumir que os
resultados obtidos devem se manter paralelos aos valores da atividade real dos inibidores
propostos. Desse modo, os resultados da aplicação direta da equação 27 aos novos inibidores
propostos da CYP51 podem ser considerados como um indicativo semi-quantitativo da
atividade inibitória comparativa destas estruturas, útil na discriminação da atividade potencial
da série de compostos proposta.
Os três termos cálculados para estes compostos estão listados na tabela 12. Como estes
compostos podem se apresentar como uma mistura diastereoisomérica, devido à dupla ligação
C=N da cadeia lateral do anel, as predições foram feitas para os dois diastereoisômeros.
Tabela 12.
Energia de interação calculada pelo método PM6 (
∆
H
PM6
, kcal/mol), número de
ligações rotacionáveis (
N
LR
) congeladas durante a ligação e o log da solubilidade estimada em
meio aquoso (log
WS
) dos compostos organofosforados utilizados neste trabalho. (Continua)
Isômero
Z
Isômero
E
Série Estrutura log
WS
a
N
LR
b
∆
H
PM6 c
∆
H
PM6 c
16
-1,22 6 -29,00 -29,11
17
-2,51 8 -26,23 -30,05
18
-1,48 6 -28,99 -32,99
A
19
-1,74 8 -26,83 -28,48
20
-2,19 8 3,82 3,49
21
-2,02 6 4,88 1,65
22
-2,79 10 5,81 1,39
B
23
-3,08 8 7,55 0,50
24
-2,43 8 7,36 12,17
25
-2,22 6 5,15 13,35
26
-2,97 10 11,15 15,71
C
27
-3,25 8 14,19 15,02
a
Calculado com o programa CSlogWS (ChemSilico)
b
Determinado pela análise da estrutura otimizada.
c
Calculada pela equação 24.
Nos cálculos realizados para a predição do log
WS
destes compostos com o programa
CSlogWS (ChemSilico) não é possível fazer a diferenciação entre um diastereoisômero e
outro. Porém, pelo fato da estrutura destes compostos apresentarem uma grande superfície, as
diferenças de solubilidade entre os diastereoisômeros não devem ser muito significativas.
Podemos observar pela tabela 12 que as interações entre estes compostos e a CYP51
foram bastante favoráveis para os organofosforados imidazólicos (Série A) e desfavoráveis
para os compostos furânicos e tiofênicos (Séries B e C). Na série A, as entalpias de interação
calculadas para estes compostos foram até mais favoráveis do que para alguns triazóis que
apresentam ótima atividade, como o E5 (fluconazol) e E4.
A principal causa desta redução entre uma série e outra está relacionada com a
mudança do átomo doador de elétrons (base de Lewis) para o íon ferroso (ácido de Lewis).
Comparando-se os compostos E17, E23 e E27, por exemplo, onde as maiores contribuições
das diferenças das entalpias de interação entre um composto e outro devem estar relacionadas
com as alterações no átomo doador do par de elétrons para o metal (as únicas alterações
estruturais ocorrem no anel), podemos observar que a entalpias de interação de E17, onde o
nitrogênio atua como doador, foram mais favoráveis que E23 (doador: oxigênio), e este mais
favorável que E27 (doador: enxofre). Isto está de acordo com a teoria proposta por Pearson
para a dureza-macieza de ácidos e bases de Lewis [JOLLY, 1976]. De acordo com esta teoria,
ácidos e bases de mesma dureza-macieza devem apresentar interações mais fortes. Nesta
proposta, o íon ferroso é classificado como ácido de Lewis do tipo limítrofe (
borderline
) e
deve apresentar uma interação mais forte com uma base do mesmo tipo. Apesar de não ter
sido encontrada a classificação das bases utilizadas neste sistema, as bases da série A são
aquelas que mais se aproximam desta classificação, por apresentarem características
semelhantes à piridina, classificada como limítrofe. A alteração do átomo ligante nesta
estrutura por oxigênio ou enxofre, deve tornar a dureza e a macieza maiores, respectivamente,
diminuinda a força de interação.
Isto é um bom indicativo de que o PM6 é um método semi-empírico adequado para a
descrição (pelo menos de forma qualitativa) dos aspectos eletrônicos envolvidos nas
complexação destes elementos com o átomo de ferro presente neste tipo de sistema, pois os
compostos utilizados neste trabalho até aqui (triazóis) não apresentaram variações estruturais
que tivessem alguma influência direta na interação ferro-inibidor.
Os compostos que se apresentaram como bons inibidores em potencial da CYP51MG
foram, principalmente, os diastereoisômeros
E
, o que já estava previsto ao se comparar os
valores da entalpia de interação dos dois diastereoisômeros, pois este é o único termo que
sofre variação entre os dois isômeros (tabela 12). O composto que apresentou maior atividade
relativa foi E18
E
com
IC
50
equivalente a 2,34
µ
mol/L.
Tabela 13.
Contribuição de cada termo variável da equação 27 e o ln
IC
50
predito pela
equação 27 para os compostos organofosforados.
Isômero Z Isômero E
Estrutura
[5,439(logWS+2,057)
2
] 0,757N
LR
0,416∆H
PM6
lnIC
50
calc
0,416∆H
PM6
lnIC
50
calc
16
3,81 4,54 -12,06 4,51 -12,11 4,46
17
1,12 6,06 -10,91 4,48 -12,50 2,89
18
1,81 4,54 -12,06 2,51 -13,72 0,85
19
0,55 6,06 -11,16 3,66 -11,85 2,97
20
0,10 6,06 1,59 15,96 1,45 15,82
21
0,007 4,54 2,03 14,80 0,68 13,46
22
2,92 7,57 2,42 21,13 0,58 19,29
23
5,69 6,06 3,14 23,10 0,21 20,17
24
0,76 6,06 3,06 18,10 5,06 20,10
25
0,14 4,54 2,14 15,05 5,55 18,46
26
4,53 7,57 4,64 24,96 6,53 26,86
27
7,74 6,06 5,90 27,92 6,25 28,26
É interessante avaliar como a combinação dos 3 termos da equação determina a
atividade. Em função da cadeia pequena dos seus grupos alquila, o composto mais ativo E18 é
um dos que apresentam o termo entrópico menos desfavorável, mas que é igual, por exemplo,
ao do composto E25, um dos menos ativos. O composto E25 apresenta inclusive um termo de
solubilidade mais favorável (mais próximo de zero) do que o do composto E18. É a entalpia
de interação muito mais favorável do composto E18, um derivado imidazólico, que determina
sua maior atividade prevista em comparação com a do composto E25, um derivado tiofênico.
Para cada série de compostos, a solubilidade dos organofosforados mostrou-se mais
favorável para a inibição da CYP51MG nos compostos que apresentaram grupos alquila com
três átomos de carbono: iso-propil, em E21 e E25; e n-propil, em E19. Cadeias laterais com
maior ou menor número de carbonos, como em E26 e E16, respectivamente, afetam
negativamente na atividade destes compostos. Comparando as série B e C, que apresentam os
mesmos padrões de substituição para os grupos alquila, observou-se também que a série B
apresentou o termo de solubilidade mais favorável devido à presença do oxigênio no anel
ligante.
Uma das causas da baixa atividade de alguns destes compostos que poderia ser
corrigida é o grande número de rotações livres existentes nestas substâncias e que são
“congeladas” durante a interação com a enzima. Propor inibidores que apresentam estruturas
com menor liberdade conformacional, por exemplo, através de estruturas cíclicas, minimizaria
os efeitos prejudiciais provocados pelas perdas entrópicas.
Desta forma, combinando-se as características estruturais dos organofosforados que
foram favoráveis para os três termos de energia envolvidos no processo de inibição, podemos
dizer que compostos contendo anel imidazólico (
∆
H
int
favorável) e com substituinte alquila
com três átomos de carbono com pouca liberdade rotacional (log
WS
e
N
RL
favoráveis) podem
ser uma boa proposta de estrutura com maior atividade. Estruturas que poderiam ser viáveis
de serem sintetizadas, combinando as características envolvento
∆
H
int
favorável e
N
RL
favoráveis, são representadas na figura 18.
NH
P
NH
R
O
NH
P
NH
R
O
N
HN
N
H
N
H
R =
Figura 18. Propostas de estruturas com as melhores características estruturais para a
atividade.
5.6 Interações Específicas dos Organofosforados com a CYP51MG
A descrição a seguir diz respeito às interações específicas identificadas entre os
organofosforados com o modelo de sítio da CYP51 de
M. graminicola
, após as otimizações
da geometria do complexo CYP51MG
SQ1
-organofosforado. Além da ligação coordenativa
existente entre os organofosforados e o íon ferroso, foi identificada uma ligação hidrogênio
com o sítio ativo da enzima, intermediada pela molécula de água H
2
O174, que se encontra
ligada ao carboxilato do heme.
Para os diastereoisômeros
Z,
esta molécula de água interage com o oxigênio do grupo
alcoxi do organofosforado (figura 19A), enquanto que para os diastereoisômeros
E
a interação
da água é feita com o oxigênio da fosforila (figura 19B).
A
C
B
Figura 19. Exemplo das interações encontradas entre os organofosforados e o sítio ativo da
CYP51MG
SQ1
. A) Representação esquemática da interação com o diastereoisômero
Z
da
estrutura E16 com o sítio, destacando-se as ligações hidrogênio; B) representação 3D da
interação com o diastereoisômero
Z
da estrutura E16, com o inibidor, o heme e o resíduo de
cisteína representados em bastões; demais resíduos e águas em linhas; e C) representação
esquemática da interação com o diastereoisômero
E
da estrutura E16 com o sítio, destacando-
se as ligações hidrogênio e D) representação 3D da interação com o diastereoisômero
E
da
estrutura E16, com o inibidor, o heme e o resíduo de cisteína representados em bastões;
demais resíduos e águas em linhas. As distâncias foram dadas em Å. As cores representadas
para os átomos são: nitrogênio, em azul; oxigênio, vermelho; enxofre, amarelo; hidrogênio,
branco; carbono, verde; ferro, em laranja. O complexo Cys394-heme-organofosforado estão
representados em bastão, com os carbonos em ciano.
As outras interações que ocorrem entre o sítio e os organofosforados ocorrem
principalmente entre grupos alifáticos e aromáticos com as cadeias laterais do grupo
fosforamidato dos organofosforados.
D
6 CONCLUSÕES
O método do orbital molecular semi-empírico PM6 demonstrou ser uma ferramenta
adequada para a modelagem dos complexos CYP51-inibidor, levando a uma boa descrição
dos aspectos estéreo-eletrônicos envolvidos na interação do sistema heme-inibidor, contendo
diferentes tipos de átomos ligantes para o íon ferroso.
O estudo mostrou que a entalpia de interação não é o único fenômeno importante a se
considerar no planejamento de novos inibidores da CYP51, como observado anteriormente
para outros sistemas enzimáticos. A solubilidade em água e as perdas entrópicas devidas às
restrições conformacionais dos inibidores também se encontram associados com o processo
de inibição, uma vez que, quando estes parâmetros foram considerados em uma única equação
foi possível obter um modelo que correlacionou bem os dados de atividades experimentais
com aqueles que foram calculados, o que pode funcionar para orientar a síntese de novos
inibidores.
A equação de predição proposta neste trabalho pode ser bastante útil para quantificar a
atividade de compostos que apresentam semelhanças estruturais com os triazóis que foram
utilizados no ajuste de seus coeficientes. Para compostos com diferenças estruturais maiores,
como os organofosforados utilizados neste trabalho, ela pode fornecer uma previsão relativa
entre quais compostos serão mais ou menos ativos.
Apesar de alguns organofosforados propostos terem apresentado interações favoráveis
com o sítio ativo da CYP51, o modelo de predição proposto demonstrou que a sua atividade
poderá ser bastante afetada devido às perdas entrópicas relacionadas com a grande quantidade
de ligações rotacionáveis que são “congeladas” após a sua interação com a enzima. Além
disso, é preciso considerar a solubilidade dos compostos que serão sintetizados, visto que
estruturas muito ou pouco solúveis em água poderão prejudicar a atividade destes compostos.
7 CONSIDERAÇÕES GERAIS
A inserção de dados experimentais de compostos com uma maior diferenciação
estrutural ao se fazer ajuste dos coeficientes da equação proposta neste trabalho poderá
aumentar sua aplicabilidade, de modo que os valores de atividade estimados sejam mais
próximos do valor real para uma maior diversidade de compostos.
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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