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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA
LABORATÓRIO DE GENÉTICA DO COMPORTAMENTO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Análise de QTL com estudo de genes candidatos
para comportamentos relacionados à
emocionalidade e ao consumo de etanol usando
um modelo genético composto pelas linhagens de
ratos Lewis e SHR
Geison de Souza Izídio
Florianópolis, Março de 2009.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA
LABORATÓRIO DE GENÉTICA DO COMPORTAMENTO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Análise de QTL com estudo de genes
candidatos para comportamentos
relacionados à emocionalidade e ao
consumo de etanol usando um modelo
genético composto pelas linhagens de
ratos Lewis e SHR
Geison de Souza Izídio
Tese apresentada como requisito parcial à
obtenção do título de Doutor ao Curso de
Pós-graduação em Farmacologia da
Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientador:
Prof. Dr. André de Ávila Ramos
Florianópolis, Março de 2009.
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3
“Os ideais são como as estrelas, você não conseguirá tocá-las com suas mãos.
Mas como os marinheiros nas águas desertas, elas podem guiá-lo, e, seguindo as
estrelas, você chegará ao seu destino”.
Carl Sagan (1934-1996)
4
“À minha família, especialmente a minha primeira sobrinha Giulia de Souza Izídio
do Prado”.
In memorian de Arildo e Mário Alves de Souza.
5
AGRADECIMENTOS
Gostaria aqui de registrar meus mais sinceros agradecimentos a algumas
pessoas que possibilitaram a conclusão de mais esta etapa da minha vida. De
antemão, peço desculpas aos possíveis esquecidos desta lista.
Ao meu grande orientador e amigo prof. André de Ávila Ramos. Agradeço por
ele ter aberto a porta de seu laboratório para mim 9 anos atrás. Desde então,
aprendi que ser doutor é muito mais do que escrever este manuscrito ou cursar
disciplinas em um programa de pós-graduação. Ser doutor é saber pensar e
raciocinar em todos os momentos da vida; é saber ensinar e passar
conhecimento para o mais humilde ou para mais pretensioso e, também,
aprender com eles. Espero um dia ter a chance de igualá-lo em sabedoria para
provar que ele foi um grande mestre.
As minhas parceiras do dia a dia no laboratório e colegas de pós-graduação
Elayne e Thaíze. Saibam que sem vocês o caminho seria muito mais árduo.
Tenho certeza que levaremos esta amizade pro resto de nossas vidas.
As “minhas” queridas alunas de iniciação científica Lígia Fhurmann Gonçalves
de Oliveira e Letícia Costa de Oliveira. Em uma profissão onde provavelmente
estaremos de volta algum dia a docência, vocês me proporcionaram uma
grande alegria, aprender a ensinar. Não posso descrever como foi
recompensador ver o brilho do conhecimento despertando em vocês. A
motivação final para concluir este trabalho, com certeza, se deve muito a
vocês.
Aos atuais colegas de laboratório Gabriela, Gustavo e Jonatas, pela amizade e
6
os bons momentos juntos. A grande ajuda nas tarefas diárias, especialmente
na manutenção dos animais e laboratório, não será esquecida.
As antigas colegas de laboratório, Ana Paula, Fabrícia, Francine, Janaína,
Mariana, Natália, Thaís, que hoje seguem seus caminhos em outros
laboratórios ou áreas de trabalho. Obrigado pela ajuda na realização deste
trabalho e os bons momentos de convivência.
A Dra. Silvana Chiavegatto, que não poupou esforços para fazer nossa
colaboração científica render resultados excelentes. A oportunidade de
conhecer outro laboratório, sem dúvida, me fez crescer muito. Com certeza,
levarei comigo na carreira científica as coisas boas que aprendi com você.
Ao Dr. Leandro Vendruscolo, que além da grande amizade, contribuiu muito na
minha formação pessoal e científica ao longo de todo este doutorado.
A Dra. Ilíada Rainha de Souza, que tantas vezes cedeu espaços em seu
laboratório ou ensinamentos nos passou, demonstrando que a interação entre
laboratórios pode elevar muito o nível da pesquisa que realizamos.
A minha namorada Carolina, por estar sempre ao meu lado em todos os
momentos, de alegrias ou de dificuldades. A ajuda em alguns procedimentos
ou nos momentos de redação tornou-a uma pessoal igualmente importante na
realização deste trabalho. Agradeço, também, a toda a sua família por me
acolher e me apoiar em todos estes anos.
Obrigado aos meus pais Nilson e Elisete. Seus atos conscientes e
inconscientes me tornaram um cientista. Nunca irei esquecer daquele pesado
livro sobre alguns mistérios da humanidade na prateleira onde eu não podia
alcançar. Nascia ali, mais um homem da ciência.
7
A toda minha grande família, especialmente, aos meus irmãos Juliana,
Gustavo e Tatiana, as minhas avós Bárbara e Olinda, e meu cunhado Rogério,
por todo o apoio e torcida para que tudo desse certo.
A todos os meus amigos e amigas do Programa de Pós-graduação em
Farmacologia.
Aos professores do Departamento de Farmacologia da UFSC, que trabalham
em favor de uma universidade pública, gratuita e de qualidade. Em especial
aos professores Antônio de Pádua Carobrez e Reinaldo Naoto Takahashi, que
acompanharam toda minha trajetória na ciência desde minha banca de
conclusão de graduação até a banca de doutorado. Seus conselhos foram
muito valiosos ao longo deste período.
Aos funcionários do Departamento de Farmacologia da UFSC. Em especial a
Diana, que sempre prestativa me auxiliou ao longo de todos estes anos nas
questões burocráticas.
Aos professores Drs. Ana Lúcia Brunialti Godard, Antônio de Pádua Carobrez,
Mário Pedrazzoli Neto, Reinaldo Naoto Takahashi, Silvana Chiavegatto e
Thereza Christina Monteiro de Lima, por terem aceitado o convite para
participar da avaliação deste trabalho e contribuir com melhorias para com o
mesmo.
Ao meu grande amigo Bruno Rodrigo Gonçalves, que tanto me ensinou
nesta vida e que hoje não se faz mais presente.
Ao apoio financeiro do CNPq, sem o qual esta etapa não teria sido completada.
8
RESUMO
IZÍDIO, Geison Souza Análise de QTL com estudo de genes candidatos para
comportamentos relacionados à emocionalidade e ao consumo de etanol usando
um modelo genético composto pelas linhagens de ratos Lewis e SHR. Florianópolis,
2009. 1p. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Programa de Pós Graduação em
Farmacologia, Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientador: André de Ávila Ramos
Os ratos das linhagens isogênicas Lewis (LEW) e spontaneously hipertensive rats
(SHR) diferem em uma série de aspectos comportamentais, incluindo a
emocionalidade e o consumo de etanol. Um estudo prévio de QTL (locus para
características quantitativas) identificou, em sub-linhagens LEW e SHR francesas,
uma região genômica (Ofil1) fortemente associada à locomoção central no campo
aberto (CA). Deste modo, neste estudo, utilizando sub-linhagens LEW e SHR
brasileiras, nós realizamos uma primeira análise de QTL para comportamentos
relacionados à emocionalidade e ao consumo de etanol seguida de uma segunda
análise, somente em fêmeas, para comportamentos relacionados à ansiedade,
considerando as fases do ciclo estral. Além disso, nós utilizamos a abordagem de
genes candidato para avaliar o potencial envolvimento de dois genes (Snca e
Tac1r) com o QTL Ofil1. Os resultados mostraram que Ofil1 está presente nos
machos das sub-linhagens LEW e SHR brasileiras. Além dele, foram encontrados
quatro outros QTL significativos e seis sugestivos, influenciando comportamentos
relacionados à ansiedade nos testes do CA e da caixa branca/preta (CBP) e o
consumo de etanol. Em fêmeas, foram encontrados 10 QTL sugestivos e nenhum
9
significativo. A segunda análise de QTL demonstrou que as fases do ciclo estral
parecem influenciar a expressão de Ofil1, pois somente as fêmeas em diestro-
proestro apresentaram efeito sugestivo de Ofil1. Além disso, a análise por ciclo
revelou dois QTL significativos nas fêmeas em diestro-proestro e um nas fêmeas
em estro-metaestro. Na abordagem de genes candidatos, os animais LEW, mais
“ansiosos”, tiveram maiores níveis de expressão do gene da α-sinucleína (Snca),
no hipocampo, quando comparados aos animais SHR. Um polimorfismo
encontrado na posição +562 deste gene parece estar associado ao
comportamento de aproximação do centro do CA. Por fim, o metilfenidato (MFD),
uma droga que atua no sistema dopaminérgico, aumentou a esquiva de ambas as
linhagens do centro do CA, sugerindo que mecanismos dopaminérgicos estão
envolvidos neste comportamento. Estes resultados confirmam a presença de Ofil1
nas sub-linhagens LEW e SHR brasileiras, sugerindo que ele não apresenta um
efeito pleiotrópico sobre a emocionalidade e o consumo de etanol. A expressão
deste QTL parece ser condicionada por fatores ligados ao ciclo estral em fêmeas.
Diversos outros QTL foram encontrados ao longo do cromossomo 4 para
comportamentos do CA, CBP e consumo de etanol, confirmando a importância
deste cromossomo na busca de genes relacionados à emocionalidade e ao
consumo de etanol. O gene da α-sinucleína parece estar envolvido na regulação
do comportamento de esquiva do centro do CA. O experimento farmacológico com
o MFD sugere que a baixa ativação dopaminérgica pode diminuir a locomoção
central, corroborando o papel da α-sinucleína neste comportamento.
10
ABSTRACT
IZÍDIO, Geison Souza. QTL analysis and candidate genes approach to emotionality
and alcoholism-related behaviors using a genetic model of rats, Lewis and SHR
strains.
Several studies show significant comorbidity between anxiety, depression and
ethanol abuse, in both pre-clinical and clinical studies, although the neurobiological
basis of this process remains uncertain. The influence of genetic factors is
commonly demonstrated for these behavioral traits. The inbred rat strains Lewis
(LEW) and Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) are known to differ for several
anxiety, depression and alcoholism-related behaviors, one of which (inner
locomotion in the open-field, OF) is strongly influenced by a locus on rat
chromosome 4 (named Ofil1). Thus, in this study, we aimed to identify quantitative
trait loci (QTL) on this same chromosome influencing different behaviors related to
the aforementioned human psychopathologies. Moreover, a second QTL analysis
was performed only with females considering their estrous cycle. Besides that, we
have investigated potential molecular and physiological links between two genes
localized in the Ofil1 region, Snca (α-synuclein) and Tac1r (NK1 receptor), and the
behavioral differences observed between LEW and SHR rats. The QTL analysis
revealed five significant loci on chromosome 4 in males. There were no significant
loci in females, but 10 loci reached suggestive threshold. The second QTL analysis
revealed that Ofil1 expression may be dependent on factors such as estrous cycle
in females. LEW rats were more fearful than SHR’s and also consumed higher
quantities of alcohol than SHR rats. α-synuclein mRNA and protein concentrations
were higher in the hippocampus, but not in the hypothalamus, of LEW rats. A novel
11
single nucleotide polymorphism identified in the α-synuclein gene between these
two rat strains was correlated with central locomotion in the OF, suggesting that
this nucleotide exchange might participate in the differential expression of α-
synuclein between LEW and SHR rats. Finally, methylphenidate elicited a
decrease in the approach towards the center of the OF, suggesting that this
behavior is regulated, at least in part, by dopaminergic mechanisms.
12
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ACP = análise de componentes principais.
ACTH = hormônio adrenocorticotrófico (adrenocorticotropic hormone).
ANOVA = análise de variância.
AVP = vasopressina (arginine vasopressin).
CA = campo aberto.
CBP = caixa branca/preta.
cDNA = DNA complementar.
cM = centimorgan.
CRF = hormônio de liberação de corticotrofinas (corticotrophin realeasing factor).
DNA = ácido desoxirribonucléico (deoxyribonucleic acid).
DSM-IV = Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (Diagnostic
and Statistical Manual of Mental Disorders).
ENU = Etil-Nitroso-Uréia (N-ethyl-N-nitrosourea).
F344 = Fischer.
GABA = ácido γ-aminobutírico (γ amino butyric acid).
HPA = hipotálamo-pituitária-adrenal.
i.p = intraperitonial.
LGC = Laboratório de genética do comportamento.
13
LCE = labirinto em cruz elevado.
LEW = Lewis.
LRS = Índice de verossimilhança estatística (likelihood ratio statistic).
M = molar.
MFD = metilfenidato.
mM = milimolar.
NAOH = hidróxido de sódio.
NMDA = N-metil-D-aspartato.
NPY = Neuropeptídeo Y
NR2b = subunidade 2b do receptor NMDA (N-methyl D-aspartate 2).
Ofil1 = locomoção central no campo aberto 1 (open field inner locomotion 1).
RGD = base de dados do genoma do rato (rat genome database).
RNA = ácido ribonucléico (Ribonucleic acid).
RNAm = RNA mensageiro (messenger ribonucleic acid).
RT-PCR = Transcrição reversa-Reação em cadeia da polymerase (Reverse
transcription-polymerase chain reaction).
SHR = ratos espontaneamente hipertensos (Spontaneously Hipertensive Rats).
SNC = sistema nervoso central.
SNP = polimorfismo de nucleotídeo único (single nucleotide polimorfism).
14
TBE = Tris-boro-EDTA.
TNF = teste do nado forçado.
µM = micromolar
QTL = Loci para características quantitativas (Quantitative trait loci).
WKY = Wistar-Kyoto.
5-HT = 5-hidroxitriptamina.
15
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estimativa da homologia genética entre as linhagens SHR, WKY, LEW
e F344 ao longo de todo o cromossomo 4.
Figura 2 – Abordagens que foram realizadas neste trabalho com o intuito de
avançar no conhecimento das bases biológicas de alguns transtornos psiquiátricos
humanos.
Figura 3 - O aparato comportamental do campo aberto que foi utilizado nos
experimentos.
Figura 4 - O aparato comportamental da caixa branca/preta que foi utilizado nos
experimentos.
Figura 5 - O Teste do nado forçado (visto de cima) que foi utilizado nos
experimentos.
Figura 6 - As caixas utilizadas nos experimentos de consumo espontâneo de
etanol.
Figura 7 - Genotipagem dos animais através de gel de agarose 3% contendo
brometo de etídeo.
16
Figura 8 - O aparato comportamental do labirinto em cruz elevado que foi utilizado
nos experimentos.
Figura 9 - Médias e erros padrão dos comportamentos calculados a partir da
análise de ratos LEW, SHR, F1 (LEW x SHR) e F2 (F1 x F1) machos e fêmeas.
Figura 10 - Mapa genético originado a partir dos dados genotípicos obtidos com
os 14 marcadores utilizados em todos os animais da população F2 neste estudo.
Figura 11 - QTL significativo encontrado para a locomoção central no CA na
análise de ligação com os 97 machos F2 LEW/SHR (modelo livre).
Figura 12 - Os outros quatro QTL significativos encontrados na análise de ligação
com os 97 machos F2 LEW/SHR (modelo livre).
Figura 13 - Os cinco QTL significativos encontrados na análise de ligação com os
97 machos F2 LEW/SHR (modelo livre) ao longo do cromossomo 4.
Figura 14 - Os cinco QTL independentemente mapeados no cromossomo 4 do
rato para: preferência por 10% de etanol nas linhagens P e NP; locomoção central
no CA nas linhagens LEW e SHR; preferência por 5% de etanol nas linhagens
HEP e WKY; níveis de corticosterona nas linhagens LEW e F344 e locomoção
central no CA nas linhagens LEW e SHR no presente estudo.
17
Figura 15 - Comportamento das fêmeas F2 no teste do CA e da CBP segundo as
diferentes fases do ciclo estral.
Figura 16 - Os dois QTL sugestivos encontrados para a locomoção central no CA
na análise de ligação com as 43 fêmeas no Diestro-proestro ou com as 53 fêmeas
no Estro-metaestro.
Figura 17 - A análise de ligação realizada com todas as 192 fêmeas incluindo as
diferentes fases do ciclo estral.
Figura 18 - Locomoção central (a) e total (b) no campo aberto com animais LEW e
SHR.
Figura 19 – Quantidade de RNAm do gene Snca da α-sinucleína (a) e do gene
Tac1r do receptor Nk1 (b) no hipocampo e hipotálamo dos ratos LEW e SHR.
Figura 20 - Entradas nos braços (fechados e abertos) e porcentagem de tempo
nos braços abertos do LCE, locomoção em ambos os compartimentos (branco e
preto) e porcentagem de tempo gasto no compartimento branco dos ratos LEW e
SHR.
Figura 21 - Consumo (g/kg/dia) e preferência de etanol oferecido como livre-
escolha com água nas concentrações de 2, 4, 6 e 10% dos ratos LEW e SHR.
18
Figura 22 - Locomoção central, locomoção periférica e defecação no CA dos
genótipos possíveis nos ratos machos F2 no SNP encontrado na posição +562 do
gene da α-sinucleína (CC, CT e TT).
Figura 23 - Locomoção central e total no CA; tempo nos braços abertos e
entradas nos braços fechados do LCE nos animais machos e fêmeas das
linhagens LEW e SHR tratados com salina ou metilfenidato.
Figura 24 - Preferência por sacarina ou quinino nos animais machos e fêmeas das
linhagens LEW e SHR tratados com salina ou metilfenidato.
Figura 25 - Ingestão de etanol 10%, em machos LEW e SHR tratados com salina
ou metilfenidato, oferecido como livre-escolha com água.
Figura 26 - Ingestão de etanol 10%, em fêmeas LEW e SHR tratadas com salina
ou metilfenidato, oferecido como livre-escolha com água.
Figura 27 - Os cinco primeiros cromossomos do rato e sua homologia com os
cromossomos humanos e dos camundongos.
Figura 28 - Regiões genômicas associadas com o fenótipo, na primeira análise
de QTL.
19
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - As seqüências nucleotídicas (5’-3’) dos pares de primers (forward e
reverse) para cada um dos 14 marcadores moleculares utilizados na genotipagem
dos animais.
Tabela 2 - Médias e erros padrão dos comportamentos calculados a partir da
análise de ratos LEW, SHR, F1 (LEW x SHR) e F2 (F1 x F1) machos e fêmeas.
Tabela 3 - Herdabilidade (h
2
) de quatro traços fenotípicos calculados a partir da
análise de ratos LEW, SHR, F1 (LEW x SHR) e F2 (F1 x F1) machos e fêmeas.
Tabela 4 - Matriz de correlação originada a partir da análise de 13 variáveis
comportamentais nos testes do campo aberto, caixa branca/preta, nado forçado e
consumo de etanol em machos.
Tabela 5 - Matriz de correlação originada a partir da análise de 13 variáveis
comportamentais nos testes do campo aberto, caixa branca/preta, nado forçado e
consumo de etanol em fêmeas.
Tabela 6 - Análise de componentes principais de 13 traços fenotípicos medidos
nos 97 ratos machos da geração F2 LEW/SHR.
Tabela 7 - Análise de componentes principais de 13 traços fenotípicos medidos
nas 96 ratas fêmeas da geração F2 LEW/SHR.
Tabela 8 - QTL significativos identificados nos ratos machos na primeira análise
de QTL com os animais F2 LEW/SHR.
20
Tabela 9 - QTL sugestivos identificados nos ratos (machos e fêmeas) na primeira
análise de QTL realizada com os animais F2 LEW/SHR.
Tabela 10 - QTL significativos e sugestivos identificados nas ratas fêmeas no
diestro-proestro a partir da análise de ligação com os animais F2.
Tabela 11 - QTL significativos e sugestivos identificados nas ratas fêmeas no
estro-metaestro a partir da análise de ligação com os animais F2.
21
ARTIGOS E RESUMOS INTERNACIONAIS ORIGINADOS POR ESTE
TRABALHO:
IZÍDIO, G. S.; OLIVEIRA, L. C.; OLIVEIRA, L. F. G.; PEREIRA, E.;
WEHRMEISTER T. D.; RAMOS, A. QTL analysis to emotionality and alcoholism-
related behaviors using Lewis and SHR rat strains. Em preparação.
CHIAVEGATTO, S.; IZÍDIO, G. S.; MENDES-LANA, A.; ANEAS, I.; FREITAS, T.
A.; TORRÃO, A. S.; CONCEIÇÃO, I. M.; BRITTO, L. R. G.; RAMOS, A. Expression
of α-synuclein is increased in the hippocampus of rats with high levels of innate
anxiety. Molecular Psychiatry, no prelo, 2009.
VENDRUSCOLO, L. F. *; IZÍDIO, G. S. *; TAKAHASHI, R. N.; RAMOS, A. Chronic
methylphenidate treatment during adolescence increases anxiety-related behaviors
and ethanol drinking in adult spontaneously hypertensive rats. Behavioural
Pharmacology, v. 19, p. 21-27, 2008. * Os autores contribuíram igualmente para a
realização do trabalho.
IZÍDIO, G. S.; OLIVEIRA, L. F. G.; PEREIRA, E.; RAMOS, A. Identification of
quantitative trait loci affecting emotionality-related behaviors in rats chromosome 4.
The international journal of neuropsychopharmacology, v. 11, p. 273, 2008.
RAMOS, A.; IZÍDIO, G. S.; OLIVEIRA, F. B.; SILVA, F. M.; MELO, N. E. B.;
COSTA, A. P. R. Genetic and factorial analysis of behaviors related to anxiety,
depression and alcohol intake in an intercross between Lewis and SHR rats. 8
22
Annual Meeting of the internacional Behavioural and Neural Genetics Society,
Vancouver - British Columbia, 2006.
CHIAVEGATTO, S.; IZÍDIO, G. S.; MENDES-LANA, A.; ANEAS, I.; FREITAS, T.
A.; TORRAO, A. S.; RAMOS, A. Increased expression of alpha-synuclein in the
hippocampus of anxious-like inbred rats. Neuroscience, Atlanta, 2006.
23
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................27
1.1 Estresse ...........................................................................................................27
1.2 Ansiedade ........................................................................................................28
1.3 Alcoolismo.........................................................................................................30
1.4 Depressão.........................................................................................................31
1.5 Comorbidades...................................................................................................33
1.6 O uso de roedores na pesquisa biomédica .....................................................35
1.7 Testes Comportamentais .................................................................................37
1.8 Modelos Genéticos Animais ............................................................................39
1.8.1 Linhagens Lewis e SHR .....................................................................40
1.9 Estudos de QTL ...............................................................................................43
1.10 Busca de genes candidatos .......................................................................... 48
1.11 Hipóteses .......................................................................................................50
2. OBJETIVOS ......................................................................................................52
2.1.Objetivo geral....................................................................................................52
2.2.Objetivos específicos........................................................................................52
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................55
3.1 Animais ............................................................................................................55
3.2 Produção dos animais F2 ................................................................................55
3.3 Fenotipagem ....................................................................................................57
3.3.1 Campo Aberto (CA) ............................................................................57
3.3.2 Caixa Branca/Preta (CBP) .................................................................58
3.3.3 Teste do nado forçado (TNF) .............................................................60
3.3.4 Consumo espontâneo de etanol ........................................................61
3.4 Análise genética quantitativa ...........................................................................62
3.5 Matriz de correlação e ACP..............................................................................62
3.6 Genotipagem ...................................................................................................63
24
3.7 Géis de agarose e poliacrilamida .....................................................................66
3.8 Primeira análise de QTL ..................................................................................67
3.9 Segunda análise de QTL .................................................................................69
3.10 Indução do ciclo estral ...................................................................................69
3.11 Material biológico para análise de expressão gênica ....................................70
3.12 Extração de RNAm ........................................................................................71
3.13 Preparação dos primers para Real time-PCR ...............................................71
3.14 Síntese de cDNA ...........................................................................................72
3.15 Análise da expressão gênica ........................................................................73
3.16 Análise de SNP .............................................................................................74
3.17 Testes farmacológicos ..................................................................................75
3.18 Labirinto em Cruz Elevado (LCE) .................................................................75
3.19 Protocolo de consumo em livre escolha .......................................................77
3.20 Estatística ......................................................................................................77
4. RESULTADOS .................................................................................................80
5. DISCUSSÃO.....................................................................................................128
5.1 Primeira estratégia experimental ...................................................................129
5.2 Segunda estratégia experimental ..................................................................157
6. CONCLUSÕES................................................................................................168
7. REFERÊNCIAS............................................................................................... 171
8. ANEXOS ..........................................................................................................209
8.1 Campo Aberto (CA) .......................................................................................209
8.2 Caixa Branca/Preta (CBP) .............................................................................210
8.3 Labirinto em Cruz Elevado (LCE) ..................................................................211
8.4 Teste do nado forçado (TNF) .........................................................................211
8.5 Teste de consumo de etanol ..........................................................................212
8.6 Ciclo estral .....................................................................................................213
27
1. INTRODUÇÃO
1.1 Estresse
Durante o século XIX, o francês Claude Bernard postulou que um dos
aspectos mais característicos dos seres vivos seria a habilidade de manter a
constância do seu meio interno apesar das modificações no ambiente ao seu redor.
Posteriormente, Walter Bradford Cannon, um fisiologista norte americano, chamou
esta capacidade de “homeostase”, do grego homeo (similar) e stasis (estático)
(1929).
Em 1936, Hans Selye conceituou o termo estresse como sendo o conjunto de
respostas orgânicas, psicológicas e/ou comportamentais de um organismo frente a
um estímulo causador. Assim, o estresse seria causado por estímulos ambientais
(estressores) que estariam pondo em risco a homeostase interna do organismo. As
mudanças sofridas durante os eventos de estresse estariam principalmente
relacionadas à atividade do eixo HPA (hipotálamo-hipófise-adrenal), envolvendo a
ação de receptores glicocorticóides e mineralocorticóides, e teriam o objetivo de
adaptar o indivíduo à nova situação gerada pelo estímulo estressante (Selye, 1976;
Juruena et al., 2004).
Mais recentemente, Sterling e Eyer (1988) sugeriram que, na verdade, a
estabilidade do meio interno seria alcançada por meio da mudança e não da
constância, propondo assim, o termo alostasia para definir este conceito. Em 2003,
Goldstein sugere, então, que a alostasia tem por essência a regulação ao redor de
um estado aparente alterado e que depende da ativação de processos de adaptação
através de mediadores químicos, como catecolaminas, esteróides da adrenal e
citocinas.
28
O interesse pelo estudo dos mecanismos biológicos relacionados ao estresse
tem crescido à medida que são acumuladas evidências de seus efeitos prejudiciais
sobre a saúde e o bem estar de seres humanos e animais (Kudielka et al., 2004;
Swaab et al., 2005; Kajantie e Phillips, 2006; Luine et al., 2007). Por exemplo,
acredita-se hoje que os efeitos do estresse podem participar na indução de muitas
patologias diferentes como: problemas cardiovasculares (Bunker et al., 2003),
doenças infecciosas (Sheridan et al., 1998; Konstantinos e Sheridan, 2001) e
transtornos psiquiátricos, como aqueles relacionados à ansiedade (Lanfumey et al.,
2008), à depressão (Dranovsky e Hen, 2006) e ao alcoolismo (Heilig e Koob, 2007;
Clarke et al., 2008), sendo estes o foco do presente trabalho.
1.2 Ansiedade
A ansiedade, segundo o dicionário, é definida como: “atitude emotiva
concernente ao futuro; medo vago adquirido especialmente por generalização de
estímulos” (Michaelis, 2009). Como tal, ela se enquadra na categoria das emoções
que, possivelmente, já foram experimentadas por todos nós seres humanos diversas
vezes durante a vida. Em termos biológicos, podemos defini-la como um conjunto de
respostas fisiológicas (aumento da atividade do sistema nervoso autonômico,
taquicardia, sudorese) e comportamentais (aumento na vigília e na reatividade
comportamental; esquiva) aumentadas que, em conjunto, protegem um indivíduo
diante de uma situação potencialmente perigosa (File et al., 1993; Lang et al., 2000;
Adamec et al., 2001; Belzung e Griebel, 2001; Blanchard et al., 2001a, 2001b;
Dielenberg e McGregor, 2001; File, 2001).
Alguns pesquisadores sugerem que a ansiedade pode ser dividida em duas
categorias: “ansiedade estado” e “ansiedade traço”. Estas refletiriam,
29
respectivamente, as respostas de ansiedade aumentadas de um indivíduo em um
momento particular, na presença de uma situação provocadora; e a ansiedade
constante através do tempo, como uma característica permanente do indivíduo
(Lister, 1990). Entretanto, estas respostas consideradas normais de cada indivíduo
podem, na presença de fatores estressantes contínuos e de fatores de
predisposição genética, desencadear os transtornos de ansiedade. Segundo o DSM-
IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 1994), os transtornos de
ansiedade compreendem: a ansiedade generalizada, a fobia social, as fobias
específicas, o estresse pós-traumático, o transtorno de pânico e o transtorno
obsessivo-compulsivo. Existe uma estimativa de que cerca de 17% dos brasileiros
são afetados ao menos uma vez durante a vida por algum transtorno de ansiedade
(WHO, 2000). Igualmente, nos Estados Unidos, 19 milhões de pessoas adultas são
afetadas, sendo gastos mais de 42 bilhões de dólares por ano com tratamentos e
prejuízos causados por estes transtornos (Greenberg et al., 1999). Além destes
números colocarem os transtornos de ansiedade entre as psicopatologias de maior
incidência na população humana (Anagnostaras et al., 1999), sabe-se que estes
transtornos apresentam uma maior prevalência em mulheres do que em homens
(Essau et al., 2000; Bekker et al., 2007).
Diversos estudos vêm sendo realizados com o objetivo de se elucidar as
bases neurobiológicas dos transtornos de ansiedade. Uma das teorias
neuroanatômicas vigentes propõe um papel crucial da formação hipocampal nos
comportamentos relacionados à ansiedade (Gray e McNaughton, 2000), sendo que
evidências experimentais vêm demonstrando o papel desta estrutura cerebral nos
comportamentos relacionados aos transtornos de ansiedade (Bannerman et al.,
2004; Kalisch et al., 2006; Nascimento Häckl et al., 2007). Da mesma maneira o eixo
30
HPA também vem sendo implicado na patogênese destes transtornos, tornando,
assim, o hipotálamo uma área cerebral de grande interesse no campo de estudos da
ansiedade (Leonardo e Hen, 2006).
1.3 Alcoolismo
A palavra alcoolismo, segundo o dicionário, é definida como: “estado
patológico, resultante da ingestão habitual ou acidental de bebidas alcoólicas”
(Michaelis, 2007). Do ponto de vista científico, o alcoolismo é um tipo de abuso de
drogas que envolve uma dependência física e psicológica pela droga psicotrópica
etanol (Brady e Sonne, 1999; Ehlert et al., 2001). Ele pode ser definido como um
transtorno comportamental complexo, com fatores genéticos, psicossociais e
ambientais influenciando seu desenvolvimento e manifestações (Cloninger, 1987;
Rodd et al., 2007). Sabe-se que o etanol atua no sistema nervoso central (SNC)
como um depressor, através da facilitação da abertura dos canais de cloreto
acoplados aos receptores GABA, resultando em um decréscimo de tensão e na
inibição da ansiedade. Além disso, a exposição repetida ao álcool pode induzir
alterações comportamentais como sedação, sensibilização ou tolerância (aumento
ou diminuição, respectivamente, das respostas comportamentais produzidas pelo
álcool) e sinais de abstinência (ex. aumento de ansiedade). Estas alterações têm
sido consideradas fatores importantes para o desenvolvimento de dependência ao
álcool (Koob e LeMoal, 1997; Darbra et al., 2002).
Estima-se que, mundialmente, existam cerca de 2 bilhões de pessoas que
consomem algum tipo de bebida alcoólica e mais de 76 milhões de pessoas com
problemas relacionados ao uso abusivo dessa substância (WHO, 2004). Esta alta
prevalência do abuso de álcool impõe uma perda financeira estimada em 185
31
bilhões de dólares anuais somente nos EUA (Li et al., 2004), devido ao tratamento e
a mortalidade dos dependentes e à redução de produtividade das empresas e
indústrias.
Cloninger (1987) propôs uma classificação dos pacientes alcoolistas em dois
subtipos: o tipo 1, caracterizado por traços de personalidade ansiosa e pelo rápido
desenvolvimento de tolerância e dependência às propriedades ansiolíticas do álcool.
Estes alcoolistas teriam início tardio no vício e pouca complicação social,
apresentando, porém, maiores índices de ansiedade e depressão em comorbidade.
Este tipo seria mais presente em mulheres do que em homens. Já o tipo 2, seria
caracterizado por traços de personalidade anti-social e ingestão de álcool motivada
por seus efeitos eufóricos. Estes dependentes apresentariam um tipo de
personalidade que manifesta altos níveis de impulsividade, busca de novidade e
reduzida capacidade para evitar riscos. O tipo 2, contrariamente ao tipo 1, seria mais
presente em homens do que em mulheres (Cloninger, 1987). Apesar destes dados
que sugerem uma distribuição diferenciada do alcoolismo entre os dois sexos,
homens geralmente consomem mais álcool e tem uma maior prevalência de
alcoolismo do que mulheres (Harford et al., 1998; Dawson et al., 2005). Assim,
sugere-se que fatores ligados ao gênero são importantes na etiologia desta
patologia complexa.
1.4 Depressão
Como definido pelo DSM-IV (1994), a depressão é um transtorno
heterogêneo frequentemente manifestado com sintomas no nível psicológico,
comportamental e fisiológico. Os seus sintomas poderiam ser agrupados em duas
categorias: a) relativa à cognição, como, humor deprimido, culpa, desespero,
32
anedonia e b) relativa às funções somáticas, como a anorexia, insônia, retardo
psicomotor e perda de peso, entre outros (Borsini e Meli, 1988). Além destes
sintomas mencionados, há ainda o alto risco de tentativas de suicídio associadas
aos pensamentos de morte, que podem culminar com o próprio ato, que se
apresenta entre 15 e 30% dos casos de depressão maior (Graeff et al., 1999).
Atualmente, o transtorno afetivo da depressão constitui um importante problema de
saúde pública. Calcula-se, que 13 a 20% da população brasileira apresentam algum
sintoma depressivo em determinado momento da vida, e que 2 a 3% desta
população encontra-se hospitalizada ou com as atividades diárias prejudicadas
devido a esta doença afetiva (Graeff et al., 1999; WHO, 2000). Do mesmo modo,
alguns dados publicados sugerem que os índices de prevalência da depressão
chegam a cerca de 16% na população adulta dos Estado Unidos, com um gasto
estimado em 80 bilhões de dólares ao ano (Kessler et al., 2003; Greenberg et al.,
2003).
No entanto, apesar da gravidade deste transtorno, algumas vezes ele é sub-
diagnosticado e sub-tratado. Existe uma estimativa de que 50% a 60% dos casos de
depressão não são detectados pelo médico clínico. Muitas vezes, os pacientes
deprimidos também não recebem tratamentos suficientemente adequados e
específicos (McQuaid et al., 1999), o que contribui para a gravidade dos casos.
Assim, como nos transtornos de ansiedade e alcoolismo, fatores sexuais parecem
estar ligados ao desenvolvimento desta psicopatologia, pois se sabe que a maior
incidência de transtornos depressivos ocorre em mulheres (Piccinelli e Wilkinson,
2000; Kalia, 2005).
Estudos no campo da psiquiatria sugerem que a atividade do eixo HPA
apresenta grande importância na etiologia da depressão. Uma porcentagem
33
significante de pacientes têm mostrado concentrações aumentadas de cortisol (o
glicocorticóide endógeno em humanos) no plasma, urina e fluído cérebro-espinhal;
uma resposta de cortisol exagerada ao hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e um
alargamento das glândulas pituitária e adrenal (Barden et al., 1995; Nemeroff, 1996;
Juruena et al., 2004; Anisman et al., 2008; Bao et al., 2008). Além disso, alguns
trabalhos sugerem que os antidepressivos exercem ao menos parte dos seus efeitos
clínicos através da modulação de hormônios glicocorticóides (Holsboer, 2000).
Ainda, alguns resultados têm fornecido evidências de que durante a depressão
ocorre a disfunção de estruturas límbicas, incluindo o hipotálamo e o hipocampo,
resultando em hipersecreção de CRF (fator de liberação da corticotrofina) e AVP
(vasopressina), que induzem ativação da pituitária e adrenal (para revisão ver
Juruena et al., 2004).
1.5 Comorbidades
Diversos estudos vêm demonstrando uma forte associação dos transtornos
de ansiedade e depressão com o abuso de substâncias (Grant e Harford, 1995;
Merikangas e Swendsen, 1997; Nurnberger et al., 2004; Grant et al., 2004; Quello et
al., 2005). Alguns têm enfatizado que o consumo de substâncias de abuso causa
diretamente ansiedade, depressão, ou outros problemas mentais (Allan, 1995;
Schuckit e Hesselbrock, 1996), enquanto que outros estudos têm demonstrado que
são os transtornos psiquiátricos, como a ansiedade e a depressão, que podem levar
à dependência de algumas substâncias, através de tentativas de auto-medicação
(Cox et al., 1993; Kushner et al., 1994; 1996). Todavia, a maioria da literatura
existente ressalta a heterogeneidade destas relações bem como a possibilidade de
que influências em ambas as direções podem existir simultaneamente (Merikangas e
34
Gelernter, 1990; Merikangas et al., 1996; Wittchen et al., 1996; Kessler et al., 1997;
Swendsen e Merikangas, 1998). Em parte, a grande dificuldade de se encontrar um
mecanismo simples de comorbidade é devida aos seus numerosos subtipos e,
também, à heterogeneidade de cada uma das psicopatologias por si só. Isto, sem
dúvida, contribui para a grande dificuldade de se encontrar as bases biológicas das
comorbidades entre as diferentes psicopatologias.
Até o momento, diversos estudos foram realizados demonstrando que
existem taxas variáveis, mas que normalmente indicam uma alta comorbidade entre
ansiedade e depressão (Yerevanian et al., 2001). Por exemplo, sabe-se que mais de
85% dos indivíduos depressivos experimentam sintomas significativos de ansiedade
(Rihmer et al., 2001). Por outro lado, a grande maioria das pessoas com o transtorno
de ansiedade generalizada apresenta ao longo da vida ao menos algum outro
transtorno, sendo os relacionados à depressão os mais recorrentes (Massion et al.,
1993; Wittchen et al., 1994; Stein, 2001). Alguns pesquisadores até mesmo
assumem que é difícil definir se ansiedade e depressão são um único transtorno
misto ou dois transtornos diferentes eventualmente ocorrendo em comorbidade
(Rouillon, 1999). Nos modelos animais, existem trabalhos sugerindo uma possível
correlação entre os comportamentos relacionados à ansiedade e à depressão
(Hinojosa et al., 2006), sugerindo que os mecanismos neurobiológicos reguladores
destes comportamentos, ao menos em parte, podem ser comuns.
Diversos estudos também sugerem existir uma comorbidade clínica entre a
ansiedade e o alcoolismo (Regier et al., 1990; Schuckit, 1994; Greeley e Oei, 1999;
Pandey, 2003; Pandey et al., 2005). Por exemplo, existe uma hipótese de redução
de tensão que prediz que indivíduos normalmente ansiosos ou estressados (em um
estado sem droga), demonstram uma maior predisposição para consumirem etanol
35
(Conger, 1956; para revisão ver Cappell e Herman, 1972; Schuckit e Hesselbrock,
1994; Cornelius et al., 2003). Enquanto alguns estudos clínicos apontam para esta
possível correlação, existe alguma evidência de que o abuso crônico de etanol
precede os transtornos de ansiedade e não o contrário (Allan, 1995). Em roedores,
diversos experimentos foram realizados no intuito de se entender melhor esta
possível relação entre estas duas patologias. Alguns deles têm demonstrado uma
correlação positiva entre comportamentos relacionados à ansiedade e o consumo de
etanol, sugerindo uma ligação genética entre eles (Colombo et al., 1995; Spanagel
et al., 1995; Möller et al., 1997), enquanto outros mostram resultados contraditórios
(Tuominen et al., 1990; Viglinskaya et al., 1995; Fernández-Teruel et al., 2002;
Henniger et al., 2002; Izídio e Ramos, 2007).
1.6 O uso de roedores na pesquisa biomédica
Os animais não humanos são de grande importância para a pesquisa
biomédica. Dentre estes, os roedores assumem um papel de grande destaque, pois
muitas das manipulações necessárias para a elucidação de mecanismos genéticos,
bioquímicos ou fisiológicos envolvidos nas patologias são realizadas neles. Isto se
deve ao fato de que os roedores são também mamíferos e apresentam diversas
similaridades com os humanos como: plano de corpo, sistemas orgânicos e
mecanismos de regulação psicológica (Tecott, 2003). Além disso, análises
genômicas comparativas indicam que humanos e ratos/camundongos tiveram um
ancestral comum há aproximadamente 75 milhões de anos atrás, o que sugere uma
grande similaridade genética entre eles (Madsen et al., 2001; Murphy et al., 2001).
Dentre os roedores, o camundongo (Mus musculus) é o animal modelo
preferido pelos geneticistas, por razões práticas (custo mais baixo, facilidades de
36
armazenamento e de manipulação), históricas (maior conhecimento acumulado,
sendo o primeiro roedor com o genoma totalmente seqüenciado) (Gregory et al.,
2002) e metodológicas (produção de animais knock-out). Porém, o rato (Rattus
norvegicus), além de ser a espécie preferida na fisiologia e farmacologia, tem
ganhado maior atenção nos últimos anos entre os geneticistas, pois teve, entre
outras coisas, o seu genoma completamente seqüenciado (Nadeau, 1999; Rat
Genome Sequencing Project Consortium, 2004). Além disso, há um acúmulo de
conhecimento considerável em diversas áreas, inclusive com a possibilidade,
através de bancos de dados gênomicos, de se comparar regiões cromossômicas do
rato com as de humanos e camundongos.
O rato apresenta um genoma um pouco menor do que o dos humanos (2,75
bilhões de pares de bases e 21 cromossomos vs. 2,9 bilhões de pares de bases e
23 cromossomos; respectivamente) e um pouco maior do que o de camundongos
(2,6 bilhões de pares de bases e 20 cromossomos). Entretanto, todas as três
espécies apresentam cerca de 30 mil genes, sendo que 40% deles são muito
próximos em estrutura e função (Rew, 2004). Além disso, existem cerca de 1000
doenças hereditárias humanas documentadas atualmente, onde a participação
genética não é bem entendida, sendo que 75% delas têm genes análogos em ratos
(Rew, 2004).
Apesar da ansiedade e da depressão serem fenômenos essencialmente
humanos, respostas fisiológicas e comportamentais semelhantes têm sido descritas
em diversas espécies animais. Estas respostas parecem ser parte de um
mecanismo universal através do qual os organismos se adaptam a condições
adversas (Gross e Hen, 2004). Neste mesmo sentido, a ingestão de etanol por ratos
pode nos oferecer pistas acerca das bases biológicas do alcoolismo humano. Assim,
37
para que possamos desenvolver novos fármacos tão ou mais eficientes que os
atuais para o tratamento da ansiedade, da depressão ou do alcoolismo, ou mesmo
para que possamos aprender mais sobre a etiologia destes transtornos, torna-se
grande a importância dos testes comportamentais com animais não-humanos. De
fato, no campo de pesquisa psiquiátrica, existem diversos modelos de ratos e
camundongos já validados (Broadhurst, 1975; Plomin et al., 1990; Fujita et al., 1994;
Ramos et al., 1997; Driscoll et al., 1998; Liebsch et al., 1998; Brush et al., 1999;
Landgraf e Wigger, 2003; Ramos et al., 2003). Estes animais são testados em
diversos aparatos que induzem comportamentos de algum modo relacionados aos
transtornos humanos. Além disso, recentemente, algumas metodologias de animais
knock-out (Vicini e Ortinski, 2004), knock-in (Dawson et al., 2005), transgênicos
(George et al., 2008), linhagens recombinantes (Printz et al., 2003) e mutados
através de ENU (N-ethyl-N-nitrosourea) (Hoyne e Goodnow, 2006) têm contribuído
na investigação de genes importantes para funções cerebrais e transtornos mentais
humanos. Como milhares de genes foram identificados com o sequenciamento do
genoma humano (The International Human Genome Mapping Consortium, 2001;
Venter et al., 2001), as abordagens que relacionam genes com fenótipos específicos
têm ganhado força. Assim, por exemplo, genes como o Rgs2, um regulador da
proteína G, começam a ter suas participações na expressão de comportamentos
relacionados à emocionalidade desvendadas (Yalcin et al., 2004).
Devido ao exposto acima, fica clara, então, a grande importância de
desenvolvermos e estudarmos modelos genéticos animais para diferentes patologias
ou transtornos como, por exemplo, a ansiedade, a depressão e o alcoolismo.
1.7 Testes Comportamentais
38
Existem vários testes comportamentais descritos na literatura que tentam
medir comportamentos relacionados aos transtornos humanos em animais de
laboratório (Hall, 1934; File e Hyde, 1978; Crawley, 1981; Pellow et al., 1985;
Blanchard et al., 1990; Merali et al., 2003; Kalueff et al., 2008; Ramos et al., 2008).
Eles apresentam uma grande importância na triagem ou no desenvolvimento de
novas drogas ativas para os transtornos psiquiátricos humanos (Dawson e
Tricklebank, 1995).
Porém, quando diversos testes comportamentais são utilizados
simultaneamente em uma mesma população de roedores, raramente são
encontradas correlações estatísticas altas entre diferentes variáveis que deveriam
medir a mesma característica emocional (Ramos et al., 1997). Isto pode sugerir que:
(a) tais medidas não estão avaliando adequadamente uma dada característica
emocional (File, 1995), ou (b) diferentes testes comportamentais podem estar
avaliando diferentes tipos de emocionalidade, até mesmo com o envolvimento de
substratos biológicos distintos (Ramos e Mormède, 1998; Ramos, 2008).
Normalmente, os diferentes testes comportamentais expõem o animal, por uma
quantidade de tempo variável, a um ou vários estímulos aversivos enquanto o
observador faz a análise simultaneamente. Estes estímulos podem ser classificados
como físicos (temperaturas extremas, choques elétricos, privação de comida) ou
psicológicos (ambientes inéditos, áreas fortemente iluminadas, espaços abertos,
lugares altos) (File, 1995; Ramos e Mormède, 1998).
Para que um teste possa ser considerado um bom modelo comportamental,
ele deve permitir, entre outras coisas, a mensuração de respostas
quantitativas/qualitativas que respondam à aplicação de drogas específicas no
mesmo sentido que estas drogas atuam em humanos. Por exemplo, em um bom
39
modelo comportamental de ansiedade, drogas ansiolíticas (que reduzem a
ansiedade em humanos) devem aumentar a exploração do ambiente aversivo do
teste comportamental por parte dos animais, enquanto drogas ansiogênicas (que
aumentam a ansiedade em humanos) devem diminuir a exploração do mesmo
ambiente aversivo. Além disso, o modelo não deve responder a outras classes de
drogas (antipsicóticos, etc.; File, 1987). Segundo Willner (1986), a validade de um
modelo animal pode ser julgada por três critérios principais: (a) validade preditiva,
que é a capacidade de diferenciar entre drogas que são, ou não, clinicamente
eficazes na patologia humana em questão; (b) validade analógica ou por
semelhança, que é avaliada com base nas qualidades comportamentais e
farmacológicas cujas semelhanças com o transtorno humano podem ser
demonstradas; (c) validade teórica ou por homologia, onde os mesmos processos
psicobiológicos responsáveis pela etiologia e fisiopatologia dos sintomas clínicos
estejam atuando no modelo, que ocorre, por exemplo, nos estudos de auto-
administração de drogas (para revisão ver, van der Staay, 2006).
Basicamente, são reconhecidos dois tipos de testes comportamentais: (a) os
baseados em respostas não condicionadas (exploratórios, de consumo e de
comportamentos sociais) e (b) os baseados nos paradigmas de aprendizagem
animal ou no condicionamento (esquiva ativa condicionada, desamparo aprendido)
(Treit, 1985; Dawson e Tricklebank, 1995; Rodgers e Cole, 1995; Rodgers e Dalvi,
1997; Rodgers et al., 1997; Ramos e Mormède, 1998; Ramos e Mormède, 2006).
Nos anexos deste trabalho encontram-se descritos alguns modelos
comportamentais utilizados no presente estudo.
1.8 Modelos Genéticos Animais
40
Sabe-se que diferentes linhagens de ratos ou camundongos podem
responder de maneira diferente aos mesmos estímulos ambientais e que, então, a
comparação simultânea destas linhagens pode revelar correlações genéticas entre
diversas variáveis bioquímicas ou comportamentais (Ramos e Mormède, 1998).
Portanto, o estudo comparativo de modelos genéticos pode representar uma
ferramenta útil para o estudo dos mecanismos envolvidos nos transtornos
relacionados à ansiedade, a depressão e o alcoolismo (Trullas e Skolnick, 1993; Rex
et al., 1996). Estes modelos genéticos normalmente são compostos de duas
linhagens contrastantes que podem ser originados a partir de: (a) características que
se diferenciaram aleatoriamente por cruzamentos independentes realizados em
diferentes populações ou linhagens ou (b) a partir de uma seleção genética
bidirecional planejada sobre uma característica específica.
A primeira alternativa seguramente é mais rápida e menos trabalhosa, pois
usa linhagens já estabelecidas, porém, pode ser menos informativa do que a
segunda (Ramos e Mormède, 1998). No entanto, devemos estar atentos ao fato de
que nem sempre os genes importantes para a característica em estudo são
polimórficos (apresentam mais de uma forma) entre as linhagens que compõem o
modelo. Diversos estudos recentes têm demonstrado que linhagens isogênicas
(consangüíneas) de roedores que não tinham sido intencionalmente selecionadas
para características emocionais, podem constituir ferramentas interessantes no
estudo destas características (Crawley e Davis, 1982; Trullas e Skolnick, 1993;
Glowa e Hansen, 1994; Mathis et al., 1994; Armário et al., 1995; Guillot e
Chapoutier, 1996; Lahmame e Armário, 1996; Rex et al., 1996; Ramos et al., 1997).
1.8.1 Linhagens Lewis e SHR
41
A partir de um estudo com seis linhagens isogênicas de ratos, assim
chamadas porque apresentam um alto grau de homozigose entre seus indivíduos,
Ramos et al. (1997) propuseram um novo modelo genético animal para o estudo de
comportamentos relacionados à emocionalidade. Ele é composto de duas linhagens
de ratos, chamadas Lewis (LEW) e SHR (spontaneously hipertensive rats).
Posteriormente, estas duas linhagens se mostraram também um modelo genético
interessante no estudo de comportamentos relacionados ao alcoolismo (Da Silva et
al., 2004; 2005; Hinojosa et al., 2006; Vendruscolo et al., 2006a; Chiavegatto et al.,
2008).
A linhagem LEW foi originada a partir de cruzamentos consangüíneos de
ratos da linhagem Sprague-Dawley (Brimberg et al., 2007) realizados inicialmente
pela Dr. Margaret Lewis no começo do século XX. Segundo o “rat genome database”
(http://rgd.mcw.edu/) (RGD) são conhecidas atualmente mais de 15 sub-linhagens
de ratos LEW em todo o mundo. Os ratos LEW apresentam uma baixa atividade do
eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) em resposta ao estresse, quando
comparados à linhagem Fischer (F344) (Calogero et al., 1992; Sternberg et al.,
1992), sendo freqüentemente usados como modelo de doenças auto-imunes (Stohr
et al., 1999). Eles também são considerados importantes no estudo do abuso de
diferentes drogas, tais como cocaína (Kosten et al., 1994), morfina (Suzuki et al.,
1988a) e etanol (Suzuki et al., 1988b). Sabe-se que a linhagem LEW, quando
comparada com a linhagem SHR, vai pouco ao centro do CA, mostra uma rápida
saída do compartimento branco no teste da CBP e passa menos tempo nos braços
abertos e mais tempo nos braços fechados do LCE (Ramos et al., 1997; 1998; 2002;
Izídio et al., 2005a; b). Isto, aliado ao fato de que estas duas linhagens não diferem
em medidas consideradas como índices de locomoção geral nos mais variados
42
testes comportamentais, nos permite sugerir que, comparativamente, a linhagem
LEW tem um perfil de maior “ansiedade” em relação à outra linhagem deste modelo
genético. Além disso, a linhagem LEW apresenta uma maior imobilidade no TNF em
comparação à linhagem SHR, o que sugere que os ratos LEW têm um perfil
comportamental do tipo “depressivo” (Hinojosa et al., 2006). Nos estudos de
alcoolismo realizados com o modelo genético LEW/SHR, os resultados não apontam
para uma conclusão definitiva, ao menos em machos. As fêmeas LEW, em todos os
estudos realizados anteriormente, consumiram menores quantidades de etanol do
que as fêmeas SHR (Da Silva et al., 2004; Vendruscolo et al., 2006a). Entretanto,
em machos, algumas vezes os ratos LEW consumiram menos sendo que em outras
o contrário foi observado (Da Silva et al., 2004; 2005; Vendruscolo et al., 2006a;
Chiavegatto et al., 2008).
A linhagem SHR é composta de ratos que desenvolvem, a partir de certa
idade, hipertensão arterial, tendo sido também obtida através de cruzamentos
consangüíneos, envolvendo seleção genética, a partir da linhagem Wistar (Okamoto
e Aoki, 1963). Entretanto, uma população F2
originária de um cruzamento entre as
linhagens LEW e SHR, demonstrou que a pressão arterial parece não estar
associada aos comportamentos relacionados à ansiedade nestas linhagens (Ramos
et al., 1998). Sabe-se que os ratos SHR são mais sensíveis aos efeitos hipnóticos do
etanol e também consomem maior quantidade deste líquido, quando comparados
aos seus controles normotensos Wistar-Kyoto (WKY) (Khanna et al., 1990).
Contrariamente aos ratos LEW, que apresentam um hiporesponsividade no eixo
HPA, os ratos SHR exibem um aumento maior e mais prolongado nos níveis de
adrenalina e noradrenalina, freqüência cardíaca e pressão sanguínea em resposta a
43
situações estressantes, quando comparados a algumas outras linhagens (Kirby et
al., 1989; Hendley e Ohlsson, 1991).
A linhagem SHR também já foi sugerida como sendo um bom modelo para o
estudo de comportamentos relacionados ao déficit de atenção e de hiperatividade
(Mormède et al., 2002; Russell et al., 2005; Sagvolden et al., 2005) e ao abuso de
drogas (Vendruscolo et al., no prelo). Entretanto, os ratos SHR não diferem na
locomoção total do teste do campo aberto, quando comparados com ratos F344 e
Wistar (Paré, 1989). Quando comparados aos ratos LEW, os SHR aproximam-se
mais dos compartimentos aversivos de diferentes testes comportamentais,
independentemente do sexo (Ramos et al., 1997; 1998; 2002). Segundo o RGD,
existem atualmente mais de 25 sub-linhagens de ratos SHR.
Apesar da caracterização comportamental, farmacológica e bioquímica que
realizamos ao longo dos últimos anos, ainda existem dúvidas sobre o significado
psicológico real das diferenças comportamentais entre as linhagens LEW e SHR.
Por esta razão, é necessária uma melhor caracterização destas linhagens nos mais
variados aspectos, a fim de se elucidar vias bioquímicas, mecanismos biológicos ou
genes que estejam contribuindo para a expressão destes comportamentos
diferenciados entre elas. Com o melhor entendimento neurobiológico destes
comportamentos, nós poderemos entender melhor os transtornos relacionados à
emocionalidade em humanos e até mesmo desenvolver medicamentos mais
específicos e efetivos para cada um deles.
1.9 Estudos de QTL
Sabe-se que grande parte da variação fenotípica existente nas mais variadas
espécies é quantitativa (o que inclui as diferenças interindividuais na ansiedade,
44
humor e inteligência e na sensibilidade às drogas de abuso) e, portanto, dependente
do efeito de múltiplos genes polimórficos em interação com fatores ambientais.
Existe na literatura, desde o final da década de 80, uma metodologia descrita para
se mapear loci (regiões cromossômicas) de interesse para características
quantitativas. Esta metodologia é chamada de análise de QTL (quantitative trait loci)
e envolve o estudo genômico abrangente, podendo fornecer informações sobre
associações genéticas entre diversas características fenotípicas e, também,
informações que podem ajudar a elucidar os mecanismos moleculares moduladores
das características em estudo (Lander e Kruglyak, 1995; Complex Trait Consortium,
2003; Flint et al., 2005). Algumas estratégias que têm levado ao mapeamento de
QTL incluem retrocruzamentos ou intercruzamentos realizados com linhagens
isogênicas, recombinantes, congênicas ou consômicas (Wehner et al., 2001; Shalom
e Darvasi, 2002). Normalmente, um grande número de marcadores moleculares é
utilizado, sendo que eles devem estar bem espalhados ao longo de todo o genoma
do animal e também devem ser polimórficos nas linhagens parentais (Flint et al.,
1995). Diversos QTL encontram-se descritos para várias medidas comportamentais
de medo/emocionalidade, de atividade locomotora, de abuso, preferência ou
sensibilidade a drogas, ou ainda para algumas características fisiológicas (Flint et
al., 1995; Moisan et al., 1996; Caldarone et al., 1997; Bice et al., 1998; Carr et al.,
1998; Ramos et al., 1999; Fernandez-Teruel et al., 2002; Flint, 2003; Terenina-
Rigaldie et al., 2003b; Yalcin et al., 2004; Flint, 2005; Llamas et al., 2005; Bice et al.,
2006; Silva et al., 2007). Muitos destes estudos foram conduzidos utilizando-se
linhagens isogênicas de ratos/camundongos, assim chamados por apresentarem
uma alta homologia no DNA entre os indivíduos da mesma linhagem, devido à
grande taxa de endocruzamento.
45
Através do uso de uma população F2 proveniente de um intercruzamento
entre as linhagens isogênicas de ratos LEW e SHR, comercializadas na França,
Ramos et al., (1999) identificaram e mapearam, pela primeira vez, QTL para
comportamentos relacionados à emocionalidade em ratos. Um deles foi mapeado no
cromossomo 4 e afetava a locomoção central no teste do CA, uma medida
possivelmente relacionada à ansiedade (Nazar et al., 1997; Angrini et al., 1998; para
revisão ver Prut e Belzung, 2003). Este QTL, denominado inicialmente Ofil1 (open
field inner locomotion 1) e hoje chamado de Anxr16 segundo o rat genome database
(http://rgd.mcw.edu/) (RGD), era excepcionalmente forte, mas compreendia uma
região bastante grande do cromossomo 4 (aproximadamente 78 milhões de pares
de bases). Entretanto, o seu efeito foi somente observado em ratas F2 fêmeas que
eram netas de avós LEW, o que coincidiria com a maior prevalência de transtornos
de ansiedade em mulheres (Essau et al., 2000; Bekker et al., 2007). Além disso,
como comentado anteriormente, os ratos da linhagem LEW apresentam maior
esquiva das áreas consideradas aversivas (região central do CA) sendo assim
considerados os mais “ansiosos” no modelo genético LEW/SHR. Porém, na região
de Ofil1, os alelos LEW aumentavam a locomoção central nos animais F2, ao invés
de diminuí-la, como seria esperado (um efeito trangressivo).
Como sugerido por Lander e Kruglyak (1995), os resultados de um estudo de
mapeamento genético devem ser replicados para serem realmente considerados
válidos. Mormède et al. (2002), com uma técnica de seleção baseada em
marcadores moleculares, confirmaram a existência de Ofil1 utilizando o mesmo par
de linhagens do estudo original (LEW e SHR), apesar desta técnica não ter permitido
o remapeamento desta região cromossômica. Com uma técnica similar, Vendruscolo
et al. (2006a) corroboraram a importância de Ofil1 na locomoção central do CA e
46
estenderam os resultados, sugerindo uma possível participação deste QTL no
consumo de etanol. Próximo a esta região localizada no cromossomo 4 do rato,
outros três QTL foram mapeados em trabalhos independentes. O primeiro deles
influencia o consumo de etanol e foi encontrado em um estudo com as linhagens de
ratos P (alcohol-preffering) e NP (alcohol-nonpreffering) (Bice et al., 1998; Carr et al.,
1998). De modo interessante, estas duas linhagens diferem também no seu nível de
emocionalidade, com a linhagem que apresenta maior consumo de etanol (P), sendo
também a que apresenta maiores níveis de ansiedade/emocionalidade (Pandey,
2005). O segundo QTL também influencia o consumo de etanol e foi encontrado em
um estudo com as linhagens HEP (high-ethanol preffering line) e Wistar-Kyoto
(WKY) (Terenina-Rigaldie et al., 2003b). Além disso, estudos posteriores com estas
mesmas linhagens sugeriram que este QTL tem um efeito pleiotrópico, atuando não
somente no consumo de etanol, mas também em medidas de emocionalidade, como
a locomoção central no CA (Terenina-Rigaldie et al., 2003a). Finalmente, o terceiro
QTL foi encontrado em um estudo com as linhagens LEW e F344 para níveis de
corticosterona endógena (Potenza et al., 2004). Este conjunto de resultados
recentes sugere, portanto, que nesta região do cromossomo 4 do rato existem genes
importantes para características de medo/emocionalidade, estresse e consumo de
etanol. Porém, existem dúvidas sobre a posição dos picos de probabilidade, ou seja,
da localização exata dos quatro QTL mapeados nesta região, pois cada um deles foi
identificado utilizando-se diferentes marcadores moleculares e ratos de linhagens
diferentes (Ramos e Mormède, 2006). A figura 1
(http://rgd.mcw.edu/ACPHAPLOTYPER) demonstra a porcentagem de homologia,
ao longo do cromossomo 4 do rato, em quatro das sete linhagens utilizadas nos
estudos de QTL comentados anteriormente. Como pode ser visto, as linhagens SHR
47
e WKY apresentam uma alta homologia (60-80%), devido, provavelmente, à sua
recente ancestralidade. Já as linhagens LEW e SHR, usadas no presente trabalho,
apresentam uma homologia em torno de 20 a 40%.
Figura 1 - Estimativa da homologia genética entre as linhagens SHR, WKY, LEW e
F344 ao longo de todo o cromossomo 4.
Assim, no presente trabalho, um novo estudo de QTL foi realizado a partir do
intercruzamento das linhagens isogênicas de ratos LEW e SHR, de origem
brasileira. Basicamente, estas duas linhagens foram intercruzadas originando
animais F1 totalmente híbridos (onde 50% do material genético era proveniente de
cada uma das duas linhagens parentais). Estes animais F1 foram novamente
intercruzados produzindo animais F2 (ditos segregantes), nos quais foi realizada
uma análise de ligação genética através de marcadores moleculares de DNA do tipo
microssatélites, concentrados no cromossomo 4.
48
1.10 Busca de genes candidatos
Em uma tentativa de encurtar o longo caminho entre a identificação do QTL e
a descoberta do gene propriamente dito, por exemplo, através de técnicas
fastidiosas de clonagem posicional e produção de linhagens congênicas, podemos
avaliar genes candidatos que estejam já mapeados naquela região cromossômica e
que sejam relacionados à característica fenotípica em questão. Por exemplo, estes
genes podem ser avaliados comparativamente entre as linhagens parentais (as que
deram origem ao estudo de QTL) através: da análise de DNA (Sourthern Blot,
análise de SNP, seqüenciamento gênico), da expressão de RNA mensageiro
(RNAm) [Microarrays, Real-Time RT-PCR, Northern Blot, Total gene expression
analysis (TOGA)] ou da quantificação da forma final da proteína (Western Blot,
imunohistoquímica). Como o rato teve o seqüenciamento do seu genoma
recentemente concluído e novos genes foram identificados ao longo de todos os
cromossomos deste animal (Rat Genome Sequencing Project Consortium, 2004;
Rew, 2004), as abordagens de genes candidatos têm ganhado força recentemente.
Desta maneira, no presente trabalho, nós escolhemos dois genes localizados
nesta promissora região do cromossomo 4 do rato para avaliação segundo uma
abordagem de gene candidato. O primeiro deles foi escolhido a partir de evidências
obtidas no estudo de QTL, anteriormente comentado, com as linhagens P e NP
(Bice et al., 1998; Carr et al., 1998). Nele, um gene localizado na região do pico
máximo de probabilidade (LOD score mais alto) foi sugerido ser o provável
responsável pelo QTL para consumo de etanol (Liang et al., 2003). Este gene (Snca)
codifica para uma proteína de 140 aminoácidos chamada α-sinucleína. Ela é
expressa ao longo de todo o sistema nervoso central (SNC) e está em particular
abundância nos terminais pré-sinápticos (Mori et al., 2002), inibindo a tirosina
49
hidroxilase e levando assim a uma redução na síntese das catecolaminas, incluindo
a dopamina (Perez et al., 2002). Além disso, sugere-se que a α-sinucleína diminui a
atividade do transportador de dopamina (Wersinger et al., 2003; Wersinger e Sidhu,
2005), prejudicando a recaptação da mesma. Sabe-se que animais knock-out para a
α-sinucleína exibem menores respostas locomotoras à anfetamina (Abeliovich et al.,
2000), enquanto que animais transgênicos, que super-expressam a α-sinucleína,
apresentam sinais de prejuízo motor associado com um decréscimo nos níveis de
tirosina hidroxilase (Masliah et al., 2000). A α-sinucleína está presente em grande
abundância no hipocampo (Petersen et al., 1999; Adamczyk et al., 2005), que tem
participação conhecida nos transtornos de ansiedade (Bannerman et al., 2004;
Kalisch et al., 2006). Desta maneira, o conjunto disponível de resultados sugere que
a α-sinucleína pode diminuir a neurotransmissão dopaminérgica, apresentando,
assim, um possível efeito comportamental de interesse clínico.
O segundo gene (Tac1r) está mapeado no cromossomo 4 do rato na posição
~116Mb e codifica para um receptor da substância P, um mediador excitatório do
SNC. Ela é o neuropeptídeo mais abundante e melhor conhecido da classe das
neurocininas (família de peptídeos que têm em comum a seqüência carboxi-terminal
- Phe-Met-NH
2
). São conhecidos três sub-tipos de receptores onde a substância P
liga-se, sendo que o NK1 é o que apresenta maior afinidade por ela. Alguns
resultados recentes vêm sugerindo que a substância P, assim como seu receptor
NK1, pode estar envolvida na patofisiologia dos transtornos psiquiátricos, tais como
os de ansiedade e depressão (Kramer et al., 1998; Stahl, 1999; Saria, 1999; Varty et
al., 2002; Álvaro e Di Fabio, 2007). Por exemplo, Vendruscolo et al. (2003),
utilizando um antagonista dos receptores NK1, mostraram uma sensibilidade
diferente no comportamento das linhagens LEW e SHR no CA, após a administração
50
deste composto. Além disso, Pompei et al. (1997) já demonstraram uma menor
expressão do gene da substância P em ratos SHR quando estes foram comparados
aos seus controles normotensos (WKY). Devido à sua possível relação com os
transtornos psiquiátricos humanos e a sua localização no cromossomo 4 do rato,
próxima de Ofil1 (Ramos et al., 1999), o gene Tac1r passou a ser um alvo de grande
interesse para a abordagem de gene candidato nas linhagens LEW e SHR.
1.11 Hipóteses
Como comentado anteriormente, os ratos das linhagens isogênicas LEW e
SHR diferem para uma série de aspectos comportamentais, incluindo aqueles
relacionados à emocionalidade e ao consumo de etanol. Assim sendo, este modelo
genético pode ser útil no estudo de diferentes psicopatologias que podem,
eventualmente, estar associadas. Deste modo, baseado no que foi exposto
anteriormente, nós gostaríamos aqui de estabelecer algumas hipóteses iniciais que
foram testadas ao longo deste trabalho: 1) os diversos testes comportamentais aqui
utilizados não apresentariam os mesmos significados psicológicos para machos e
fêmeas; 2) o QTL Ofil1 estaria presente também em animais das sub-linhagens LEW
e SHR brasileiras, a exemplo das suas homólogas francesas, ao menos em fêmeas
F2 e possivelmente também em machos; 3) a região genômica do locus Ofil1
influenciaria diversos comportamentos ligados à emocionalidade e ao consumo de
etanol apresentando, assim, um efeito pleiotrópico; 4) a correlação entre os
comportamentos relacionados à ansiedade e ao consumo de etanol seria
significativa e positiva; 5) existiriam QTL’s influenciando outras medidas
comportamentais de emocionalidade além da locomoção central no cromossomo 4
do rato; 6) o ciclo estral das fêmeas F2 poderia afetar a expressão de Ofil1 (para
51
maiores detalhes ver anexos); 7) os genes da α-sinucleína e/ou do receptor NK1 da
substância P poderiam ser responsáveis pelos efeitos de Ofil1; 8) drogas
farmacológicas que atuam diminuindo a atividade do sistema dopaminérgico
poderiam aumentar a esquiva da área central nas linhagens LEW e SHR no CA,
corroborando o papel do gene da α-sinucleína nas diferenças comportamentais entre
as linhagens.
52
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Em vista de todas as evidências expostas ao longo da introdução e das
hipóteses mencionadas, nós pretendemos investigar a promissora região do genoma
do rato situada no cromossomo 4, através de diferentes estratégias experimentais. O
estudo foi basicamente dividido em duas etapas (ver Figura 2).
2.2 Objetivos específicos
A primeira estratégia experimental envolveu animais F1, F2, LEW e SHR com o
intuito de:
a) calcular a herdabilidade (ver metodologia para detalhes) de alguns fenótipos
exibidos nos testes do CA, CBP e TNF;
b) criar uma matriz de correlação e realizar uma análise de componentes
principais (ACP) para avaliar a semelhança ou o grau de correlação entre as
medidas dos diferentes testes comportamentais em machos e fêmeas (CA, CBP,
TNF e consumo de etanol);
c) realizar uma nova análise de QTL envolvendo, pela primeira vez,
comportamentos relacionados à ansiedade, à depressão e ao alcoolismo
simultaneamente (CA, CBP, TNF e consumo de etanol);
d) remapear, com maior precisão, a posição de Ofil1, com a adição de mais
marcadores e um maior número de animais;
e) confirmar a influência de Ofil1 nas sub-linhagens LEW e SHR brasileiras;
f) avaliar a influência do ciclo estral na expressão deste QTL em fêmeas.
53
Paralelamente ao desenvolvimento desta primeira etapa, nós avaliamos o
possível envolvimento de dois genes candidatos (α-sinucleína e receptor NK1), o
que chamamos de segunda estratégia experimental, que poderiam ser responsáveis
pelos efeitos comportamentais de Ofil1. Para tanto, nós realizamos:
g) testes comportamentais de ansiedade (CA) e consumo de álcool com as
linhagens LEW e SHR para melhor compreender as diferenças comportamentais
entre elas;
h) análise da expressão de RNAm do gene da α-sinucleína (Snca) e do
receptor NK1 da substância P (Tac1r);
i) avaliação de um polimorfismo no gene da α-sinucleína nas linhagens
parentais e em uma população F2 LEW/SHR segregante para testar a relação entre
este polimorfismo e alguns comportamentos (CA, CBP, TNF e consumo de etanol);
j) testes comportamentais (CA, LCE e consumo de etanol) e farmacológicos
utilizando a droga psicoestimulante metilfenidato (MFD), para corroborar o
envolvimento do sistema catecolaminérgico e do gene da α-sinucleína nas
diferenças entre os ratos LEW e SHR.
54
Figura 2 - Abordagens que foram realizadas neste trabalho com o intuito de avançar
no conhecimento das bases biológicas de alguns comportamentos relacionados à
emocionalidade e ao consumo de etanol.
55
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
A linhagem LEW utilizada neste estudo é originária da Harlan Sprague
Dowley Inc. (Indianápolis, IN), sendo obtida a partir da UNICAMP (Campinas, SP,
Brasil). Já a linhagem SHR é originária da Universidade de Harvard (Boston, MA)
sendo obtida a partir da UNESP (Botucatu, SP, Brasil). As colônias de ratos LEW e
SHR utilizadas neste estudo foram mantidas no laboratório de genética do
comportamento durante mais de 20 gerações sob um sistema de acasalamento
irmão/irmã, como recomendado para todas as linhagens consangüíneas.
Todos os animais utilizados foram desmamados e separados por sexo com
quatro semanas de idade e, após isso, foram mantidos em gaiolas de plástico
coletivas (cinco ratos/gaiola) (salvo exceções de experimentos específicos que
estarão descritos). Comida e água estavam disponíveis ad libitum, sob um ciclo
claro/escuro de 12: 12h (luzes acessas às 07h00min) com a temperatura sempre
mantida a 22 ± 2 °C. Os experimentos realizados em nosso laboratório estavam de
acordo com as normas locais de uso dos animais na pesquisa (CEUA/UFSC;
Protocolo PP00019 e 23080.002853/2006-32/UFSC).
Primeira estratégia experimental: Análise genética quantitativa
3.2 Produção dos animais F2
Devido a questões logísticas, os animais utilizados em cada uma das duas
análises de QTL realizadas neste trabalho foram sempre produzidos em dois ciclos
diferentes, que nós chamaremos aqui de primeiro e segundo grupo. Assim, para a
produção dos animais utilizados na primeira análise de QTL, cinco ratos SHR
machos e 5 ratas LEW fêmeas, de colônias isogênicas mantidas em nosso
56
laboratório, foram cruzados, gerando uma população híbrida F1. Desta, 12 machos e
12 fêmeas F1 foram acasalados, produzindo 50 machos e 46 fêmeas F2 (primeiro
grupo). Estes ratos F2 do primeiro grupo foram submetidos a uma bateria de testes
comportamentais (CA, CBP, TNF, consumo de etanol) descritos a seguir
(fenotipagem). Simultaneamente, foram avaliados nos mesmos testes
comportamentais, exceto os de consumo de etanol, animais das linhagens puras
LEW e SHR (10/linhagem/sexo) e da geração F1 (10/sexo), com o intuito de se
calcular um parâmetro genético chamado “herdabilidade”.
Em seguida, 12 machos e 12 fêmeas F1 foram novamente acasalados,
produzindo mais 47 machos e 50 fêmeas F2 (segundo grupo). Estes ratos F2 do
segundo grupo foram também testados na mesma bateria comportamental que os
ratos do primeiro grupo (CA, CBP, TNF, consumo de etanol).
Todos os animais (LEW, SHR, F1 e F2 de ambos os sexos) tinham 8 semanas
de idade no momento do teste do CA, nove na CBP e onze no TNF. Os animais F2
apresentavam 13 semanas de idade no momento do início dos testes de consumo
de etanol. Em todos os testes machos e fêmeas foram testados separadamente,
sendo que os machos foram sempre testados primeiro. Os testes comportamentais
foram todos realizados no período vespertino das 13h30min às 18h30min. Após a
conclusão dos testes comportamentais, todos os animais foram sacrificados e
amostras de tecidos foram recolhidas de cada animal para extração e análise
posterior de DNA (genotipagem).
Para a produção dos animais utilizados na segunda análise de QTL, que foi
realizada apenas com fêmeas representando as diferentes fases do ciclo estral, três
ratos SHR machos e três ratas LEW fêmeas, também das colônias isogênicas
mantidas em nosso laboratório, foram cruzados, gerando uma população híbrida F1.
57
Desta, 10 machos e 10 fêmeas F1 foram acasalados, produzindo 50 fêmeas F2
(primeiro grupo). Posteriormente, os animais F1 foram novamente acasalados,
produzindo mais 46 fêmeas F2 (segundo grupo). Cada fêmea da geração F2 (total
de 96 fêmeas) foi submetida, com 10 semanas de idade, ao CA. Terminado este
teste comportamental as fêmeas eram imediatamente conduzidas à CBP. Após
estes dois testes comportamentais as fêmeas foram submetidas à técnica do
esfregaço vaginal para avaliação da fase do ciclo estral (Hoar e Hickman, 1975).
3.3 Fenotipagem
3.3.1 Campo Aberto (CA)
O aparato (Figura 3) era feito de madeira coberta com fórmica impermeável
possuindo uma área de 100 x 100 cm, com o chão branco, dividido em 25
quadrados de 20 x 20 cm (linhas divisórias pretas), 9 quadrados formavam a área
central e 16 a área periférica; as paredes, também brancas, tinham 40 cm de altura.
A luminosidade utilizada durante os experimentos com os animais F2 foi de 7 Lux.
Cada rato foi colocado no centro do aparato, que era inédito para o animal, sendo
observado por 5 min. Os seguintes comportamentos foram registrados: número de
quadrados centrais (centro do aparato; sem paredes ao lado) e periféricos
(adjacentes às paredes) atravessados com todas as quatro patas e o número de
bolotas fecais depositadas. A partir destes dados foi então calculada a locomoção
total (número total de quadrados atravessados) e a porcentagem da locomoção total
que seria devida à locomoção central. Além disso, também foi registrado o tempo
gasto na área central do aparato. Após cada animal ser testado, o aparato era limpo
com esponja embebida em álcool 10% e seco com papel toalha. O comportamento
de cada animal foi gravado por uma câmera de vídeo posicionada acima do aparato,
58
o que permitia o esclarecimento de qualquer dúvida posterior. Além disto, o
monitoramento instantâneo possibilitava a retirada das medidas por um observador
treinado localizado em uma sala adjacente, através de um circuito fechado de TV.
Os métodos de limpeza e gravação foram os mesmos no teste da CBP.
Figura 3 - O aparato comportamental do campo aberto que foi utilizado nos
experimentos.
3.3.2 Caixa Branca/Preta (CBP)
O aparato (Figura 4) era feito de madeira coberta com fórmica e apresentava
dois compartimentos: um branco fortemente iluminado (~750 Lux), medindo
27x27x27 cm, cujo chão era dividido em 9 quadrados (9x9 cm); e outro preto
iluminado com luz vermelha de 40W, medindo 27(A) x18(C) x27(L) cm, cujo chão
era dividido em 6 quadrados (9x9 cm). Os dois compartimentos eram conectados
por uma pequena abertura de 7x7 cm. Diz-se que o compartimento preto é escuro,
pois o comprimento de onda vermelha é invisível ao rato, embora exista uma fraca
luminosidade advinda do compartimento branco (~20 Lux). Ambas as lâmpadas
estavam localizadas 30 cm acima do piso do aparato. Cada rato foi colocado no
centro do compartimento branco e observado por 5 min, sendo os seguintes
59
comportamentos registrados: latência para sair do compartimento branco; número
de quadrados atravessados com as quatro patas e o tempo gasto em cada
compartimento, além do número de transições entre os dois compartimentos (o que
inclui sair do preto, entrar no branco com as quatro patas e voltar para o preto). A
latência para sair do compartimento branco é considerada como o tempo que o
animal, ao ser colocado neste compartimento, leva para deixar o mesmo, indo para
o compartimento preto. O tempo gasto no compartimento branco não inclui esta
latência inicial.
60
Figura 4 - O aparato comportamental da caixa branca/preta que foi utilizado nos
experimentos.
3.3.3 Teste do nado forçado (TNF)
O aparato consistia em um cilindro de vidro (40 cm de altura; 18 cm de diâmetro)
contendo água limpa mantida sempre entre 25°C e 27°C em um nível de
aproximadamente 20 cm acima do fundo (Figura 5). A Iluminação na sala de testes
no momento da realização dos experimentos era de 7 lux Os animais foram
expostos a um pré-teste por 15 minutos e 24h depois, re-expostos novamente ao
aparato durante 5 minutos, onde foram registrados o tempo total de imobilidade e o
número de bolas fecais. O animal era considerado imóvel quando somente fazia
movimentos necessários para manter a cabeça fora da água. A mensuração do
comportamento foi registrada por um observador treinado sentado ao lado do
cilindro. Após a conclusão do teste, os animais eram secos com toalha em uma
gaiola separada antes de retornarem a sua gaiola de residência. A água utilizada
para a realização do teste era trocada entre cada animal.
61
Figura 5 - O Teste do nado forçado (visto de cima) que foi utilizado nos
experimentos.
3.3.4 Consumo espontâneo de etanol
Durante o protocolo de consumo, os animais permaneceram isolados em uma
gaiola plástica com tampa metálica medindo 21Ax28Cx19L cm, e cujo chão era
coberto por maravalha (Figura 6). A caixa permitia que os animais tivessem
movimentos livres e acesso ad libitum à ração e a uma ou duas garrafas de líquido,
conforme o caso. O protocolo de consumo espontâneo consistiu de: dois dias de
consumo de água (habituação), dois dias de etanol forçado (10%) e livre-escolha
entre etanol (2,5; 5; 10 e 20%) e água (2 dias para cada concentração com soluções
v/v). O consumo de líquido era medido a cada dois dias, sempre a partir das
18h00min, através da pesagem das garrafas. No período da pesagem os animais
permaneciam sem qualquer tipo de líquido para consumo. A cada dois dias as
garrafinhas eram trocadas de lado para evitar qualquer tipo de efeito da posição. O
peso dos animais foi medido a cada quatro dias, a partir do primeiro dia de etanol
forçado (10%) até o final do protocolo. Os dados são apresentados sob a forma de
62
consumo absoluto (ml), g de etanol/dia/kg do peso do corpo do animal, ou ainda de
preferência do animal por uma solução em relação ao consumo total de fluído
[(consumo da solução / consumo total de fluído) x 100].
Figura 6 - As caixas utilizadas nos experimentos de consumo espontâneo de etanol.
3.4 Análise genética quantitativa
O cálculo da média e do erro padrão dos animais para cada variável
comportamental foi realizado separadamente por grupo e por sexo. A herdabilidade
dos fenótipos foi calculada a partir da fórmula a seguir:
h
2
= {V F2 – [(V SHR + V LEW + V F1) / 3]} / V F2 ;
onde h
2
= herdabilidade e V = variância.
3.5 Matriz de correlação e ACP
Os resultados comportamentais dos animais F2 foram submetidos à análise de
correlação e de componentes principais (ACP), separadamente por sexo, com
mínimo eigenvalue igual a 1 e rotação Varimax raw. Basicamente, na análise de
63
correlação, é realizada uma estimativa da correlação entre as variáveis selecionadas
que são expressas por um coeficiente (r), que varia de -1 a +1. Já a ACP é um
método que tem por finalidade básica a redução de um grande conjunto de variáveis
originais em poucas variáveis virtuais (ortogonais entre si) a partir de combinações
lineares das variáveis originais. Todos os procedimentos da análise estatística foram
realizados com o uso do programa STATISTICA (Statsoft, Tulsa, OK, 2001).
3.6 Genotipagem
Após a fenotipagem comportamental, os animais foram sacrificados na câmara
de CO
2
para a retirada de amostras de fígado e baço. A partir destes, o DNA de
cada animal foi extraído com o kit comercial DNAzol (GibcoBRL), permanecendo
estocado em freezer -20C até o momento do uso. Basicamente, as amostras (cerca
de 0,5cm
2
) foram homogeneizadas com 1mL de kit DNAzol em um microtubo
eppendorf e depois centrifugadas (10.000g) por 10 minutos para separação por
gradiente. O sobrenadante (cerca de 800µL) foi transferido a outro microtubo e
misturado com 400µL de etanol gelado (100%). Esta solução foi centrifugada
(4.000g) por 3 minutos. Após isso, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi
resuspendido em 800µL de etanol gelado (75%). A solução foi, então, novamente
centrifugada (4.000g) por 3 minutos. O sobrenadante foi descartado e foram
novamente adicionados 800µL de etanol gelado (75%). Por fim, o etanol (75%) foi
descartado e o DNA que ficou no microtubo foi diluído em 250µL de NaOH (8mM) e
teve o pH corrigido para 8,0 com solução de hepes (0,1M). Este método de extração
proporcionava uma concentração final de DNA entre 10 e 100ng/µL. Foram testados
44 marcadores moleculares do tipo microssatélite localizados no cromossomo 4 do
rato, sendo que somente 24 foram polimórficos entre as linhagens parentais. Destes
64
todos, 14 foram escolhidos (média de mais de 1 marcador a cada 10cM) por se
distribuírem ao longo de todo o cromossomo e se localizarem nas regiões onde
haviam sido encontrados QTL’s prévios de interesse (Bice et al., 1998; Carr et al.,
1998; Ramos et al., 1999; Terenina-Rigaldie et al., 2003b; Potenza et al., 2004). O
DNA genômico foi então amplificado através de reação de PCR (polymerase chain
reaction) no termociclador (Px2 Thermal cycler), em relação aos 14 marcadores
(Tabela 1). A reação de PCR continha um volume de reação de 20µL, onde 5µL de
DNA genômico (concentrações variáveis de 10-100ng/µL) foi misturado com 5 µL de
cada primer (5 pmol), 0,4U de Taq polimerase (Promega) com 10µL de tampão 2X
(Promega). O programa da reação de PCR era constituído de: a) 1 ciclo de 96°C por
4 min; 38 ciclos de [92°C por 30s; 58-62°C (conforme o marcador) por 1 min; 72°C
por 31s] e 1 ciclo de 72°C por 4 min. Os produtos de PCR foram visualizados em gel
de agarose 3% contendo brometo de etídeo com o auxílio do transluminador ou em
gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de prata. Para cada marcador, os
tamanhos dos alelos do tipo LEW e SHR foram previamente determinados, para
posterior classificação genotípica dos ratos F2 de acordo com a presença de cada
um destes alelos (Figura 7). Os métodos de extração e genotipagem foram os
mesmos para os 193 animais F2 LEW/SHR (97 machos e 96 fêmeas) da primeira
análise de QTL, assim como para as 96 fêmeas F2 LEW/SHR da segunda análise
de QTL (ver a seguir).
65
Figura 7 - Genotipagem dos animais através de gel de agarose 3% contendo
brometo de etídeo. Da esquerda pra direita: um homozigoto Lewis, um homozigoto
SHR, quatro heterozigotos em seqüência (LEW-SHR) e um homozigoto SHR.
Tabela 1 - As seqüências nucleotídicas (5’-3’) dos pares de primers (forward e
reverse) para cada um dos 14 marcadores moleculares do tipo microssatélite
utilizados na genotipagem dos animais. Estas seqüências nucleotídicas foram
retiradas do RGD (http://rgd.mcw.edu/).
Marcador
Seqüência forward Seqüência reverse
D4MGH22 CCTGTCATGTTATTGATGATGATG GGTCACATGAAATTTGACCTCA
D4RAT151 TCAAAGGGTAGATGATGGAGTTT GGTGCAAATTCAGAGGCATT
D4RAT164 AACTGTGATACTTACCTTTTGGTGT TCCCTTCTTTGATGACCCTAA
D4WOX22 TCAGAAAAATTTAAATTGTATCTGTG
CCATATGCAAGTGTGGGTATC
D4RAT76 GTTAAGGAACCATGGGCTGA GTATGTTTCCTTCCTGCCCC
D4RAT173 CATGCAGGGACCTTTCCTAA TTTTGACTTCCTCCACCTGC
D4RAT40 CCACTGAGACCAAACAAGACC TCAAGGATGGATGGTCAAGTC
D4RAT131 ATGCCCGCGAGCTCATAC TGCCTGTACTGCTTTCAATCC
66
D4MGH27 TCCTTCACATACATGTGCATACC TGAGAAGGGCTGTCAGTGG
D4MIT16 TGCATAGTCAATTTATGTCTCACA TTGGCCTTTCTAGTAAACAGTGG
D4MGH6 GGGTCTTGTAGCATTTTTTAAAGC AGAACCAACTCCTAAACTCCTGC
D4RAT59 GCGGAATGATAGTTACTACGGC GCAGTGTGTTTGGGGTAGCT
D4MGH11 CTCAACGAACAGGTTTCATTATG AGAAGGGATGACAATTGGTACG
D4RAT206 GCAGGAAACAGTTTACTTCATGC AAGTAGTTGGCATGCGTGTG
3.7 Géis de agarose e poliacrilamida
Para a genotipagem dos animais foram utilizados o gel de agarose 3% ou o
gel de poliacrilamida 8% conforme a diferença entre o tamanho dos alelos nas
linhagens parentais. Basicamente, o gel de agarose consistia de 7g de agarose
(Promega) dissolvidas em 250mL de tampão TBE 0,5X. Esta mistura era levada ao
forno microondas e aquecida até a total dissolução do pó. Com o gel ainda líquido
eram adicionados 12,5µL de brometo de etídio para a visualização das bandas de
DNA. Esta mistura de gel era, então, depositada no recipiente apropriado por
aproximadamente 20 minutos para ocorrer a solidificação do gel. Em seguida, o gel
sólido era colocado em uma cuba de eletroforese e coberto com cerca de 700mL de
tampão TBE 0,5X. Depositava-se 7µL de DNA com corante (azul de bromofenol e
xilenocianol) em cada poço (no máximo 42 amostras por gel) que eram submetidos
a uma corrente elétrica variante e tensão fixa de 300V durante 40-70 minutos,
conforme o marcador utilizado.
Basicamente, o gel desnaturante de poliacrilamida 8% consistia de 63g de
uréia, 65mL de H2O destilada, 30mL de solução mãe (19 acrilamida / 1
bisacrilamida). Esta mistura era levada ao banho-maria a 56°C até a uréia ser
completamente dissolvida. Após o resfriamento da solução eram adicionados 7,5 ml
67
de tampão TBE 10X, 700µL de persulfato de amônio (10%) e 70µL de TEMED. O gel
era, então, aplicado entre as placas de vidro temperado (35 cm x 45 cm)
permanecendo em repouso durante ~1,5h até a completa polimerização. Após isso,
era realizada uma pré-corrida (~50mA) até a temperatura do gel atingir cerca de
50°C. As amostras de DNA, previamente desnaturadas no termociclador (95°C
durante 5 minutos), eram aplicadas no gel e submetidas a uma corrida de
aproximadamente 3h sob condições constantes de corrente elétrica (2100V; 45mA;
90W). Após a corrida o gel era levado a uma solução fixadora contendo etanol
100%, ácido acético P.A. e água destilada, permanecendo imerso nesta solução de
20 minutos à 24h. Em seguida, era adicionada 200mL de solução de nitrato de prata
1% e, após 20 minutos, a reação de coloração era interrompida retirando-se a placa
desta solução. O gel era lavado com água quente e levado a um recipiente contendo
uma solução reveladora (NaOH, água destilada e formaldeído) até as primeiras
bandas de DNA aparecerem.
3.8 Primeira análise de QTL
Os dados genotípicos foram analisados através do programa “QTX software for
complex trait analysis”, disponível gratuitamente na web (www.mapmanager.org).
Primeiramente, foi construído o mapa de ligação que forneceu a localização e a
distância em centimorgans (cM) entre todos os 14 marcadores moleculares do tipo
microssatélite utilizados. Basicamente, neste processo o programa avalia todos os
LOD de ligação entre os pares de marcadores distribuídos ao longo do cromossomo
com critério de p=0,05. O par com mais alto LOD score é posicionado no
cromossomo e em seguida o programa tenta fazer a ligação com os outros
marcadores (Distribute function). Após esta etapa, os dados fenotípicos foram
68
adicionados ao programa e a análise de QTL (interval mapping) foi realizada. Esta
utiliza os dados fenotípicos e genotípicos e revela as regiões do genoma mais
fortemente associadas às características fenotípicas de interesse. Tais regiões, que
co-variam com um dado traço fenotípico, são os QTL. No programa QTX, a análise
de ligação procura por QTL ao longo de todo o cromossomo a cada 1cM gerando
um “likelihood ratio statistic” (LRS) como medida de significância do QTL (Manly et
al., 2001). Quanto maior o valor de LRS, maior a probabilidade de que a região
genômica em questão afete o fenótipo de interesse. Este LRS pode ser interpretado
como um LOD score, porém enquanto o LOD é calculado a partir do logaritmo na
base 10 o LRS é calculado a partir do logaritmo na base 2, diferindo assim por um
fator de 4,6. Ou seja, para que um QTL em um estudo com animais F2 seja
altamente significativo é necessário um LRS de aproximadamente 19, enquanto nos
estudos utilizando retro-cruzamentos um LRS de aproximadamente 15 deverá ser
suficiente (Manly et al., 2001).
No presente estudo os limiares de significância ou sugestividade foram
estimados através do teste de permutação (nos modelos livre, aditivo ou dominante)
para cada fenótipo com a análise de 1000 permutações a cada 1cM. O teste de
permutação é uma abordagem mais geral para obter valores limiares de significância
que são ajustados a cada caso. Neste teste, varreduras (scan) genômicas são
repetidamente realizadas em versões embaralhadas dos dados originais para
estimar um limiar de significância que é apropriado para um conjunto de dados. No
geral, estes limiares definidos pelo teste de permutação se comparam bem com os
valores definidos por Lander e Kruglyak (1995), mas tendem a ser menos
conservadores. Assim, o uso de limiares baseados no teste de permutação pode
identificar mais QTL, sem colocar em perigo a significância estatística. Além disso, o
69
teste de permutação pode prover limiares válidos para situações fora do padrão,
quando, por exemplo, uma característica não segue a distribuição normal. Apesar de
que os valores de LRS sejam variáveis conforme cada medida comportamental,
neste estudo eles oscilaram em torno de 4 para QTL sugestivos e 11 para QTL
significativos no modelo livre e em torno de 2 para QTL sugestivos e 8 para QTL
significativos nos modelos dominante e aditivo.
Como os dados prévios (Ramos et al., 1999) sugerem que existam diferenças
sexuais importantes na expressão de Ofil1, a primeira análise de QTL neste trabalho
foi realizada separadamente por sexo.
3.9 Segunda análise de QTL
Na segunda análise de QTL, também foi utilizado o programa QTX, como
descrito anteriormente. Entretanto, nesta análise, foram utilizadas somente fêmeas
F2 LEW/SHR divididas em 2 categorias, segundo a fase do seu ciclo estral: diestro-
proestro (43 fêmeas) e estro-metaestro (53 fêmeas). Para isso, as fases do ciclo
estral foram induzidas com tratamento farmacológico (ver a seguir), a fim de se
garantir equilíbrio entre os diferentes grupos ao longo dos experimentos
comportamentais.
3.10 Indução do ciclo estral
Cada uma das 96 fêmeas F2 LEW/SHR utilizadas na segunda análise de QTL
foi injetada subcutaneamente (s.c.), na região dorsal do pescoço, com benzoato de
estradiol (Aventis parma, Suzano, Brasil) (10µg/0,1mL) e, 48h após, com
progesterona (Merck) (5mg/kg), em um volume de injeção de 1ml/kg. Ambas as
drogas foram diluídas em óleo de girassol. Este procedimento, devido à ordem
70
cronológica planejada, nos possibilitou ter fêmeas nas fases diestro-proestro ou
estro-metaestro em cada dia onde foram realizados testes comportamentais,
equilibrando os tratamentos. Os animais do grupo estro-metaestro foram testados
24h após a injeção de progesterona e os animais do grupo diestro-proestro foram
testados 96h após a injeção de progesterona. A confirmação da fase do ciclo de
cada fêmea foi realizada após os testes do CA e CBP através da técnica de
esfregaço vaginal. Basicamente, os animais foram imobilizados e, usando-se uma
ponteira de pipeta adaptada, introduziu-se, superficialmente, na cavidade vaginal da
rata cerca de 0,2mL de solução salina 0,9%. Após a lavagem da cavidade vaginal,
com a solução salina, o fluído foi retirado e colocado em lâmina de microscópio
limpa. Os esfregaços foram avaliados a fresco, sem coloração, e conduzidos sob
aumento de 10X e 40X, para observação das características celulares, de acordo
com o ciclo ovariano (Hoar e Hickman, 1975). Em caso de dúvida o processo era
repetido. Foram encontradas 14 fêmeas em diestro, 29 em proestro; 14 em estro e
39 em metaestro, que foram agrupadas nas duas categorias anteriormente citadas.
As doses e esquema experimental foram escolhidos baseados em estudos prévios
da literatura e experimentos piloto de nosso laboratório (Löfgren et al., 2006;
Mazzuco et al., 2008; Swithers et al., 2008; Uphouse et al., 2008).
Segunda estratégia experimental: Genes candidatos
3.11 Material biológico para análise de expressão gênica
15 machos LEW e SHR (7-8/linhagem) foram testados, às 9 semanas de
idade, no CA. Este experimento foi realizado no Instituto do Coração-SP (INCOR).
Os ratos, criados no LGC, foram enviados por via aérea ao INCOR uma semana
antes do início do experimento. O CA utilizado foi o mesmo descrito anteriormente,
71
exceto que ele apresentava iluminação de 80 lux no momento do experimento e o
piso era dividido em 36 quadrados ao invés de 25. Duas horas antes do momento do
teste, os animais foram isolados em gaiolas de plástico 12(A) x26(C) x15(L) cm para
evitar qualquer tipo de influência de um animal no comportamento do outro. Um dia
após a finalização do teste do CA, os animais foram sacrificados por decapitação e
tiveram seus hipocampos e hipotálamos retirados, sendo estes imediatamente
congelados em nitrogênio líquido e posteriormente transportados ao freezer -70ºC
para futura extração de RNAm. A expressão relativa dos genes codificadores da α-
sinucleína, Tac1R e ciclofilina (cyph) como gene controle, foi determinada através de
real-time RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) com o sistema
de detecção de seqüência ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Além destes, foram utilizados 8 animais LEW e SHR machos que foram testados no
LCE (descrito posteriormente) e CBP (descrito anteriormente) e 11 animais LEW e
SHR machos que foram testados no consumo de sacarina, quinino e etanol.
3.12 Extração de RNAm
As amostras de RNAm foram obtidas do hipocampo e do hipotálamo dos animais
LEW e SHR. O RNA total foi extraído através do uso de TRIZOL Reagent
(Invitrogen, São Paulo). A quantificação do RNA total obtido em solução aquosa foi
realizada no espectrofotômetro de luz UV nos comprimentos de onda de 260 e
280nm para a verificação de possíveis contaminações protéicas. Além disso, foi
realizada eletroforese em gel de agarose 1% comprobatória para observação das
bandas das subunidades 28 e 18 do RNA ribossômico.
3.13 Preparação dos primers para Real time-PCR
72
No presente estudo, todos os primers sense e antisense, específicos para os
genes avaliados (α-sinucleína, receptor NK1) foram desenhados com o auxílio do
Primer3 Software (http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi), a partir
do estudo das seqüências conservadas de cDNA desses genes, que estavam
disponíveis no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). Os primers foram
selecionados pelo tamanho (18-22 nucleotídeos), conteúdo de G/C
(Guanina/Citosina) ao redor de 50%, desenhados em diferentes éxons, quando
possível, para evitar contaminação com DNA genômico, temperatura de anelamento
entre 58-60ºC, tamanho do amplicon entre 50-150 nucleotídeos com maior
proximidade da terminação 3’ e especificidade utilizando-se a Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
3.14 Síntese de cDNA
A síntese do cDNA foi realizada através da reação de transcrição reversa
(RT) em um volume reacional de 20 µl que continha 2 µg de RNA total previamente
analisado, 20 mM de Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl
2,
10 mM de
DTT, 0,5 µg de oligo (dT)
,
0,5 mM de cada dATP, dGTP, dCTP, dTTP e 200 U da
enzima SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, São Paulo). A mistura de
RNA e oligo (dT) foi aquecida a 70ºC por 10 min e imediatamente colocada no gelo
para a adição dos demais componentes. Após isto, a reação foi incubada a 42ºC por
1 hora e interrompida pelo aquecimento a 70ºC por 15 min. O produto de cDNA foi
tratado com 2 U de RNase H (Invitrogen) a 37ºC por 20 min para remoção dos
templates de RNA, com posterior inativação da enzima por aquecimento a 70ºC por
15 min. As amostras foram armazenadas a -20ºC até o momento do uso.
73
3.15 Análise da expressão gênica
As reações de Real time PCR foram realizadas no ABI Prism 7700 Sequence
Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para cada reação
(equivalente a um poço da placa), utilizou-se um volume reacional de 20 µl contendo
1 µl de cDNA template (com concentração previamente definida através de curvas
de diluição), uma concentração final de 200 nM dos primers sense e antisense
específicos para cada gene (0,32 µl de cada primer), 10 µl do 2X SYBR Green PCR
Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), e água isenta de RNase (7,96 µl).
O 2X SYBR Green PCR Master Mix contém a AmpliTaq DNA Polymerase, o SYBR
Green Buffer, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), SYBR Green I e a referência
passiva, o corante fluorescente ROX. As reações foram incubadas a 95ºC por 10
min para a ativação da AmpliTaq DNA Polymerase, seguido de 50 ciclos de 15 seg a
95ºC, e 60 seg a 60ºC (extensão e coleta do sinal de fluorescência). Foram
utilizados controles negativos para cada gene ou para o normalizador através do
controle sem template (ausência de cDNA) e o controle sem amplificação (ausência
do par de primers). Todas as amostras dos diferentes grupos, incluindo os controles,
foram sempre processadas em triplicata na mesma placa. Após a reação do RT-
PCR, foi realizada uma curva de dissociação (melting curve) para cada corrida a
partir da análise da temperatura de dissociação (melting point -Tm) da dupla fita de
DNA. O ciclo de dissociação foi realizado através dos seguintes passos: (a)
aquecimento a 95ºC por 15 seg, (b) um decréscimo progressivo da temperatura de
95°C para 60°C e manutenção dessa temperatura por 20 seg, (c) um reaquecimento
(dissociação) progressivo (19 min e 59 seg) de 60°C para 95ºC, e manutenção da
temperatura de 95°C por 15 seg. Eventuais produtos de PCR que apresentaram
curvas de dissociação com picos de Tm abaixo do produto de PCR específico
74
(formação de dímeros de primer), ou ainda picos diversos com diferentes Tms ou
platôs (formação de produtos não-específicos) foram descartados.
3.16 Análise de SNP
Setenta e três ratos machos F2 LEW/SHR foram testados no CA, na CBP, no
TNF e em um teste de consumo de etanol (como descrito anteriormente). Após isto,
estes animais foram sacrificados e tiveram seus fígados e baços retirados para
extração de DNA a partir dos métodos descritos anteriormente. Este DNA foi então
diluído a 10ng/µL com o auxílio do espectrofotômetro. O SNP (single nucleotide
polymorphism) identificado para ratos LEW e SHR na posição +562 do gene da α-
sinucleína (Chiavegatto et al., 2008) foi determinado através da PCR seguida por
digestão com uma enzima de restrição (MboI). No procedimento, 50ng de DNA
genômico foram misturados com 5 pmol de cada primer e 0,4 U de Taq polimerase
(Promega) com 10µL de tampão 2X (Promega) em um volume de 20 µL de reação.
As condições da PCR foram: a) 1 ciclo de 96°C por 2 min; 38 ciclos (92°C por 30s;
61°C por 1 min; 72°C por 31s) e 1 ciclo de 72°C por 4 min. A seqüência dos primers
foi a seguinte: (forward) 5’-GATCTGCCCAGGTGTTCTTC-3’ e (reverse) 5’-
CACACAAGAGCCTGCTACCA-3’. Cada 10 µL do produto foi então incubado com 1
U da enzima de restrição MboI que corta especificamente no SNP, se este tiver um
nucleotídeo C presente na posição +562. Os produtos de digestão foram
visualizados em gel de agarose (2%) contendo brometo de etídio.
Na posição +562 do gene da α-sinucleína, os ratos LEW apresentam
naturalmente a base nitrogenada “C”, enquanto que os ratos SHR apresentam a
base “T”. Desta maneira, como os ratos F2 são originados de um cruzamento entre
LEW e SHR eles podem apresentar os genótipos CC, CT ou TT na posição +562.
75
3.17 Testes farmacológicos
Este experimento foi realizado com o intuito de corroborar o envolvimento do
gene da α-sinucleína e da baixa atividade do sistema dopaminérgico na esquiva da
área central do CA. Assim, do 23° ao 38° dia de idade os animais LEW e SHR (9 a
12 animais linhagem/sexo/tratamento) foram tratados com salina (NaCl 0,9%) ou
2mg/kg de metilfenidato (MFD) (Ritalina, Novartis) (dissolvido em salina, volume de
injeção de 5ml/kg) duas vezes ao dia (injeções as 9:00h e as 13:00h) (Para maiores
detalhes sobre a metodologia empregada ver o artigo Vendruscolo et al., 2008 nos
anexos). A média (± erro padrão) do peso dos animais SHR foi 35,7±1,4 e 37,3±1,3
g para machos no primeiro dia de tratamento; 93,5±2,5 e 93,5±2,6 g para machos no
último dia de tratamento; 31,7±1,2 e 32,2±0,7 g para fêmeas no primeiro dia de
tratamento; 79,4±1,8 e 79,1±1,4 g para fêmeas no último dia de tratamento (tratados
com salina e metilfenidato, respectivamente). Já para os animais LEW foi de
45,5±2,49 e 46,4±1,77 para machos no primeiro dia de tratamento; 110,3±460 e
112,3±4,50 para machos no último dia de tratamento; 45,2±2,43 e 45,22±2,77 para
fêmeas no primeiro dia de tratamento; 98,2±4,76 e 95,56±5,24 para fêmeas no
último dia de tratamento (tratados com salina e metilfenidato, respectivamente). Os
ratos foram desmamados aos 28 dias de idade e todos os testes comportamentais
foram realizados na idade adulta às 9-10 semanas de idade (4 semanas após o fim
do tratamento). Os animais foram submetidos ao CA (como anteriormente descrito),
ao LCE (descrito a seguir) e a um protocolo de livre escolha (também descrito a
seguir).
3.18 Labirinto em Cruz Elevado (LCE)
76
O aparato (Figura 8) era feito de madeira coberta com uma camada de
fórmica preta, apresentando quatro braços, sendo dois fechados e dois abertos,
distantes 52 cm do chão. Os dois braços fechados opostos (50 cm de comprimento x
10 cm de largura e paredes de 42 cm de altura) formavam uma cruz com os braços
abertos (50 cm de comprimento x 10 cm de largura sendo margeados por um
anteparo de 0,5 cm de altura e 0,1 cm de espessura para evitar a queda dos animais
do aparato). Na interseção entre os braços fechados e abertos havia uma plataforma
central medindo 13,5 x 10 cm que dava acesso a cada um dos quatro braços.
Durante a realização dos experimentos, a intensidade luminosa foi de 70 lux na
plataforma central. Cada rato foi colocado na plataforma central de frente para um
braço aberto e seu comportamento foi observado por 5 min. O número de entradas e
o tempo gasto (com as quatro patas) dentro de cada tipo de braço foram registrados
e a porcentagem de entradas nos braços abertos foi calculada em relação ao
número total de entradas.
Figura 8 - O aparato comportamental do labirinto em cruz elevado que foi utilizado
nos experimentos.
77
3.19 Protocolo de consumo em livre escolha
Um procedimento padrão para avaliar o consumo de sacarina (7,5mM),
quinino (2µM) e etanol foi utilizado (para detalhes ver Vendruscolo et al., 2006a) com
pequenas modificações. Após 5 dias de um período de habituação em caixas
plásticas individuais (como as descritas anteriormente), os animais (11/linhagem)
tiveram livre escolha entre duas garrafinhas contendo solução de sacarina (Vetec,
Rio de Janeiro) ou água durante 2 dias consecutivos. Cada dia as garrafinhas foram
pesadas, enchidas e tiveram sua posição modificada em um intervalo de 2h. Para o
consumo de quinino (ICN Biomedicals, Sólon, Ohio, EUA) o teste seguiu o mesmo
protocolo que para a sacarina. Na seqüência, os animais tiveram uma livre escolha
entre a água ou etanol 10% (v/v). As garrafinhas foram pesadas (e reenchidas se
necessário) a cada 2 dias durante o período total de 20 dias. Os dados estão
expressos em g de etanol/dia/kg do peso do corpo. Entre as soluções de sacarina,
quinino e etanol, os animais tiveram 2 dias só com água para beber e o peso do
corpo de cada animal foi medido ao menos uma vez a cada semana.
3.20 Estatística
Primeira estratégia experimental
Foram calculados a média e o erro padrão dos animais de cada genótipo e de
ambos os sexos (LEW, SHR, F1, F2) para cada variável comportamental. A
herdabilidade dos fenótipos foi calculada como descrito anteriormente. Os dados
comportamentais (CA, CBP, TNF) dos animais LEW e SHR de ambos os sexos
foram submetidos à ANOVA (análise de variância) de duas vias (linhagem e sexo).
78
A análise de correlação (de Pearson) foi realizada nos ratos F2 separadamente
por sexo para 13 variáveis comportamentais selecionadas nos testes CA, CBP, TNF
e consumo de etanol. O coeficiente (r), que varia de -1 a +1 está demonstrado
apenas para aquelas correlações que são significativas (p<0,05).
A ACP foi realizada também nos ratos F2 separadamente por sexo para as
mesmas 13 variáveis comportamentais da análise de correlação. A ACP teve
mínimo eigenvalue igual a 1 e foi submetida à rotação Varimax raw, como descrito
anteriormente. Apenas os valores maiores que [0,4] são mostrados dentro de cada
fator. Ambas as análises foram realizadas com o programa STATISTICA (Statsoft,
Tulsa, OK, 2001).
Os dados comportamentais das fêmeas submetidas ao CA e à CBP
considerando a fase do ciclo estral (diestro-proestro ou estro-metaestro) foram
submetidos ao teste-t de Student para amostras independentes.
Segunda estratégia experimental
Os dados comportamentais (CA, LCE, CBP, TNF e consumo de etanol) e da
expressão gênica através de real-time RT-PCR dos animais LEW e SHR machos
foram submetidos ao teste-t de Student para amostras independentes STATISTICA
(Statsoft, Tulsa, OK, 2001).
Na análise do polimorfismo na posição +562 do gene da α-sinucleína foi
utilizada a ANOVA de uma via para o fator “genótipo”, com o teste post hoc de
Duncan sendo utilizado para comparar as médias dos grupos.
Nos experimentos farmacológicos com a droga metilfenidato (CA, LCE,
consumo de sacarina e quinino) foi utilizada a ANOVA de três vias (linhagem, sexo,
79
tratamento). Já para o consumo de etanol foi utilizada a ANOVA de três vias de
medida repetidas (linhagem, tratamento, repetição) separadamente por cada sexo.
80
4-RESULTADOS
Primeira estratégia experimental
Os resultados dos testes comportamentais relacionados à emocionalidade (CA,
CBP, TNF) realizados com os animais LEW, SHR, F1 e F2 de ambos os sexos
encontram-se exibidos na Tabela 2 e Figura 9. Como mostrado na ANOVA de duas
vias realizada com as duas linhagens parentais e excluindo as gerações híbridas,
foram encontradas diferenças significativas (p<0,05) entre linhagens para todas as
medidas exceto a latência, a locomoção no compartimento preto e a defecação na
CBP. Em todos os casos, os ratos SHR se aproximaram mais dos compartimentos
aversivos do que os ratos LEW. Além disso, os SHR também foram os ratos que
passaram menor tempo em imobilidade no TNF (Tabela 2; Figura 9). Foram
encontradas também diferenças relacionadas ao sexo para todas as medidas exceto
a defecação no CA, CBP e TNF, a latência na CBP e o tempo de imobilidade no
TNF (Tabela 2; Figura 9). Em todos os casos, as fêmeas se aproximaram mais das
áreas aversivas do CA e CBP. Em machos, em diversos comportamentos, os
animais F1 ou F2 não foram intermediários em relação às médias dos ratos LEW ou
SHR, como se esperaria em uma herança aditiva. Enquanto isso, em fêmeas, os
ratos F1 ou F2 foram sempre intermediários entre as médias dos ratos LEW e SHR,
com exceção da variável tempo de imobilidade no TNF, sugerindo maior efeito de
aditividade e menor efeito de dominância neste sexo (Tabela 2).
81
Tabela 2 – Médias e erros padrão dos comportamentos calculados a partir da análise de ratos LEW, SHR, F1 (LEW x SHR) e F2
(F1 x F1) machos (esquerda) e fêmeas (direita).
Lewis machos
(n=10)
SHR machos
(n=10)
F1 machos
(n=10)
F2 machos
(n=97)
Lewis fêmeas
(n=10)
SHR fêmeas
(n=10)
F1 fêmeas
(n=10)
F2 fêmeas
(n=96)
Tempo no
centro CA
12,4±4,58 ** #
27,1±3,31
30,8±10,46
23,4±1,28
14,2±3,08 39,1±2,17 29,1±4,14 19,8±1,20
Defecação
CA
2,2±0,89 *
0,3±0,21
2,3±0,80
1,82±0,23
1,3±0,76 0±0 0±0 0,43±0,12
Latência
CBP
9,3±2,03
22,3±11,49
4,3±1,27
6,7±5,12
7,7±1,78 7,1±3,03 6,4±1,4 6,5±0,57
Tempo no
preto CBP
268±8,58 ** #
210,1±16,54
226,3±4,60
221,1±2,18
226,4±17,31 177,6±10,19 199,1±7,13 202,1±3,46
Transições
CBP
1,2±0,51 ** ##
2,9±0,59
3,5±0,22
3,7±0,70
3,4±1,02 5,7±0,33 5,6±0,4 4,8±0,18
Locomoção
branco CBP
8,9±2,58 ** ## 15,6±2,39 18,3±0,80 19,3±1,52 21±4,99 31,9±1,28 31±2,32 26,5±0,85
Locomoção
preto CBP
28,5±2,93 ##
26,8±3,04
28,2±1,53
27,0±1,26
41,6±3,70 37,7±2,10 37,3±1,07 33,5±0,83
Defecação 0,4±0,40 0±0 0±0 0,1±0 0±0 0±0 0±0 0±0
82
CBP
Defecação
TNF
6±0,42 **
2,7±0,52
5,3±0,79
4,76±0,19
4,9±0,59 3,2±0,70 3,8±0,51 4,5±0,22
A ANOVA foi realizada apenas para os animais das linhagens parentais (LEW e SHR). ** p<0,01; * p<0,05 e ## p<0,01; # p<0,05
efeito geral de linhagem e sexo, respectivamente. Legenda das variáveis: CA= campo aberto; CBP= caixa branca/preta; TNF=
teste do nado forçado.
83
0
7
14
21
28
(a)
LEW
SHR
F2F1
Fêmeas
Machos
**
##
Locomoção central
25
50
75
100
125
(b)
LEW
SHR
F2F1
Fêmeas
Machos
**
##
Locomoção periférica
0
16
32
48
64
80
(c)
LEW
SHR
F2F1
Fêmeas
Machos
**
##
Tempo gasto no branco (s)
100
150
200
250
300
(d)
LEW
SHR
F2F1
Fêmeas
Machos
**
Tempo de imobilidade (s)
Figura 9 – Médias e erros padrão dos comportamentos calculados a partir da
análise de ratos LEW, SHR, F1 (LEW x SHR) e F2 (F1 x F1) machos e fêmeas. (a)
locomoção central no CA; (b) locomoção periférica no CA; (c) tempo gasto no
compartimento branco da CBP e (d) tempo de imobilidade no TNF. A ANOVA foi
realizada apenas para os animais das linhagens parentais (LEW e SHR). ** p<0,01; *
p<0,05 e ## p<0,01; # p<0,05 efeito geral de linhagem e sexo, respectivamente.
Os resultados dos cálculos de herdabilidade de alguns comportamentos dos
testes do CA, CBP e TNF estão exibidos na Tabela 3. Este parâmetro pode variar de
0 até 1 e é definido como a proporção da variabilidade fenotípica que é explicada
pela variabilidade genética total. A característica mais herdável para os machos foi a
locomoção periférica no CA (69%) e, para as fêmeas, o tempo de imobilidade no
84
TNF (60%). Os machos também apresentaram uma alta herdabilidade para a
locomoção central no CA e tempo de imobilidade no TNF (ambos 66%). Em todos os
casos, a herdabilidade foi mais alta em machos do que em fêmeas.
Tabela 3 – Herdabilidade (h
2
) de quatro traços fenotípicos calculados a partir da
análise de ratos LEW, SHR, F1 (LEW x SHR) e F2 (F1 x F1) machos e fêmeas.
Locomoção
central no CA
Locomoção
periférica no CA
Tempo no
compart. branco
CBP (s)
Tempo de
imobilidade no
TNF (s)
h
2
machos 0.66 0.69 0.22 0.66
h
2
fêmeas 0.50 0.31 - 0.60
Legenda das variáveis: h
2
=herdabilidade; CA= campo aberto; Tempo no compart.
branco CBP= tempo no compartimento branco da caixa branca/preta; TNF= teste do
nado forçado.
Alguns resultados da matriz de correlação originada a partir da análise de
machos e de fêmeas F2 (Tabelas 4 e 5) encontram-se descritos abaixo. Em machos,
dentro de um mesmo teste, no CA a locomoção central se correlacionou
positivamente com a locomoção periférica (0,32); na CBP o tempo no compartimento
branco se correlacionou negativamente com o tempo no compartimento preto (-0,93)
e o tempo no compartimento preto negativamente com a locomoção no
compartimento branco (-0,86); o consumo de etanol forçado se correlacionou
positivamente com o consumo de etanol 10% (0,40); o consumo de etanol 2,5%
positivamente com o consumo de etanol 5% (0,49) e o consumo de etanol 5%
positivamente com o consumo de etanol 10% (0,67). Já em relação às correlações
encontradas entre diferentes testes, podemos destacar aquela entre a locomoção
85
central e a locomoção no compartimento branco (0,19); entre a locomoção periférica
e a locomoção no compartimento branco (0,28); entre o tempo no compartimento
branco e o consumo de etanol 5% (0,26); o tempo de imobilidade com o consumo de
etanol 2,5% (0,23) e entre a defecação no TNF e o consumo de etanol 5% (0,17)
(Tabela 4).
Em fêmeas, dentro de um mesmo teste, a locomoção central também se
correlacionou positivamente com a locomoção periférica (0,27); o tempo no
compartimento branco negativamente com o tempo no compartimento preto (-0,94) e
o tempo no compartimento preto negativamente com a locomoção no compartimento
branco (-0,80); o consumo de etanol forçado se correlacionou positivamente com o
consumo de etanol 5% (0,45) e o consumo de etanol 10% positivamente com o
consumo de etanol 20% (0,49) (Tabela 5). Em relação às correlações encontradas
entre diferentes testes, podemos destacar aquela entre a locomoção central e a
locomoção no compartimento branco (0,42); entre a locomoção periférica e a
locomoção no compartimento branco (0,41); e entre o tempo no compartimento preto
e a defecação no TNF (-0,21) (Tabela 5). Ao contrário de machos, em fêmeas não
houve correlação entre variáveis de consumo de etanol e medidas de
emocionalidade da CBP ou do TNF.
86
Tabela 4 - Matriz de correlação originada a partir da análise de 13 variáveis comportamentais nos testes do campo aberto,
caixa branca/preta, nado forçado e consumo de etanol. Foram utilizados 97 machos F2 LEW/SHR. Somente os coeficientes de
correlação (r) significativos são mostrados. Legenda das variáveis: CA = campo aberto; TNF = teste do nado forçado.
Locomoção
periférica
Defecação
no CA
Tempo no
branco
Tempo no
preto
Locomoção
no branco
Imobilidade
Defecação
no TNF
Etanol
forçado
Etanol
2.5%
Etanol 5%
Etanol 10%
Etanol 20%
Locomoção
central
0.32 0.16
-0.15 0.19
Locomoção
periférica.
-0.15 0.15 -0.15 0.28
Defecação no CA
-0.18 0.15 -0.18 -0.01 -0.03 -0.01
Tempo no branco
-0.93 0.84 0.33 0.26 0.08 -0.03
Tempo no preto
-0.86 -0.21 -0.23 -0.03
Locomoção no
branco
-0.15 0.16 0.18 0.02 0.06
Imobilidade
0.23 -0.00 0.08 -0.04
Defecação no TNF
0.05 0.17
Etanol forçado
0.37 0.34 0.40
Etanol 2.5%
0.49 0.47 -0.09
Etanol 5%
0.67 0.32
Etanol 10%
0.47
87
Tabela 5 - Matriz de correlação originada a partir da análise de 13 variáveis comportamentais nos testes do campo aberto,
caixa branca/preta, nado forçado e consumo de etanol. Foram utilizadas 96 fêmeas F2 LEW/SHR. Somente os coeficientes de
correlação (r) significativos são mostrados. Legenda das variáveis: CA = campo aberto; TNF = teste do nado forçado.
Locomoção
periférica
Defecação
no CA
Tempo no
branco
Tempo no
preto
Locomoção
no branco
Imobilidade
Defecação
no TNF
Etanol
forçado
Etanol
2.5%
Etanol 5%
Etanol 10%
Etanol 20%
Locomoção
central
0,27 0,36 -0,33 0,42
Locomoção
periférica.
0,28 -0,25 0,41
Defecação no CA
Tempo no branco
-0,94 0,79
Tempo no preto
-0,80 -0,21
Locomoção no
branco
Imobilidade
Defecação no TNF
Etanol forçado
0,29 0,45 0,34
Etanol 2.5%
0,34
Etanol 5%
0,31 0,25
Etanol 10%
0.49
88
O resultado da ACP para 13 medidas comportamentais selecionadas dos
quatro diferentes testes comportamentais realizados com os animais F2 encontra-se
exibido nas Tabelas 6-7. Os dados obtidos a partir da matriz de correlação foram
rotados (Varimax raw), sendo encontrados 5 fatores principais com eigenvalue maior
do que 1, explicando em conjunto 72% da variância total dos dados em machos e
67% em fêmeas.
Em machos, o primeiro fator, que correspondeu a 23% da variância total,
compreende apenas as medidas do teste da CBP: tempo e locomoção no
compartimento branco e tempo no compartimento preto. O segundo fator
compreende apenas medidas do consumo de etanol: consumo de etanol forçado e
consumo de etanol em livre-escolha a 5, 10 e 20%. O fator 3 contém todas as
medidas do teste do CA: locomoção central e periférica e defecação. Já o fator 4
correlacionou as medidas de consumo de etanol (consumo de etanol forçado e
consumo de etanol em livre-escolha 2,5%) com o tempo de imobilidade no TNF. Por
fim, o quinto fator foi representado apenas pela defecação no TNF (Tabela 6).
Em fêmeas, o primeiro fator, que correspondeu a 24% da variância total,
compreende medidas do teste da CBP (tempo e locomoção no compartimento
branco e tempo no compartimento preto) e a locomoção central no CA, indicando
que as fêmeas que se aproximaram mais do centro do CA também se aproximaram
mais da área branca da CBP. O segundo fator compreende apenas medidas do
consumo de etanol: consumo de etanol em livre-escolha a 10 e 20%. O fator 3
contém as outras medidas do consumo de etanol (consumo de etanol forçado e
consumo de etanol em livre-escolha a 2,5 e 5%) e a defecação no TNF. O fator 4
correlacionou as medidas do CA (locomoção central e periférica) com o tempo de
imobilidade no TNF, mostrando que as fêmeas que se aproximaram mais do centro
89
do CA também ficaram menos imóveis no TNF. Por fim, o quinto fator foi
representado pela defecação no CA (Tabela 7). Tais resultados sugerem que, em
fêmeas, há mais aspectos comuns entre os diferentes testes de emocionalidade do
que em machos.
90
Tabela 6 - Análise de componentes principais (ACP) de 13 traços fenotípicos medidos nos 97 ratos machos da geração F2
LEW/SHR. Escores maiores do que 0,4, produzidos por uma rotação Varimax raw, são mostrados para cada fator. CA = campo
aberto e TNF = testes do nado forçado.
Fator 1 Fator 2 Fator 3 Fator 4 Fator 5
Locomoção central (CA)
-0,72
Locomoção periférica (CA)
-0,71
Defecação (CA)
0,52
Tempo comp. branco (s)
0,95
Tempo comp. preto (s)
-0,96
Locomoção comp. branco
0,92
Tempo de imobilidade (TNF)
0,81
Defecação (TNF)
0,85
Etanol forçado (10%)
0,40 0,42
Etanol (2.5%)
0,64
Etanol (5%)
0,74
Etanol (10%)
0,87
Etanol (20%)
0,78
Variância total (%) 23 17 11 12 9
91
Tabela 7 - Análise de componentes principais (ACP) de 13 traços fenotípicos medidos nas 96 ratas fêmeas da geração F2
LEW/SHR. Escores maiores do que 0,4, produzidos por uma rotação Varimax raw, são mostrados para cada fator. CA = campo
aberto e TNF = testes do nado forçado.
Fator 1 Fator 2 Fator 3 Fator 4 Fator 5
Locomoção central (CA)
0,42 -0,52
Locomoção periférica (CA)
-0,43
Defecação (CA)
-0,94
Tempo comp. branco (s)
0,94
Tempo comp. preto (s)
-0,94
Locomoção comp. branco
0,89
Tempo de imobilidade (TNF)
0,78
Defecação (TNF)
0,44
Etanol forçado (10%)
0,62
Etanol (2.5%)
0,71
Etanol (5%)
0,76
Etanol (10%)
0,83
Etanol (20%)
0,78
Variância total (%) 24 12 13 10 8
92
O mapa genético produzido a partir da análise de ligação envolvendo todos os
289 animais F2 produzidos e os 14 marcadores moleculares utilizados encontra-se
exibido na figura 10. Os marcadores utilizados originaram um mapa de ligação de
111cM, se aproximando bastante dos 114cM (mapa FHH x ACL) ou dos 102cM
(mapa SHRSP x BN) que o RGD considera que o cromossomo 4 contenha. A ordem
de posicionamento entre os marcadores ao longo do cromossomo 4 gerada pelo
nosso estudo também confirma os dados publicados no RGD (http://rgd.mcw.edu/).
Segundo a base de dados do genoma do rato
(http://www.nih.gov/niams/scientific/ratgbase), o cromossomo 4 contém cerca de 187
megabases (Mb). Assim, os nossos marcadores cobriram toda a extensão do
cromossomo, pois o marcador mais proximal (D4MGH22) está mapeado na posição
de 4Mb e o mais distal (D4RAT206) na posição 182-186Mb*.
*A posição exata de D4RAT206 não está detalhada no RGD.
93
Figura 10 - Mapa genético originado a partir dos dados genotípicos obtidos com os
14 marcadores utilizados em todos os animais da população F2 neste estudo (289;
sendo 192 fêmeas e 97 machos). A linha vertical representa o cromossomo 4 onde
estão demonstradas as posições de cada marcador. As distâncias entre eles estão
representadas em centimorgans (cM). D4MGH22 é o marcador mais proximal e
D4RAT206 o mais distal, dentre os utilizados neste cromossomo.
Na primeira análise de QTL do cromossomo 4, foram encontrados cinco QTL
significativos (Tabela 8) e seis QTL sugestivos nos machos (Tabela 9). Estes cinco
94
QTL significativos influenciaram medidas de comportamentos relacionados à
ansiedade nos testes do CA e da CBP e do consumo de etanol. Destes cinco QTL,
quatro foram encontrados no modelo livre e um no modelo aditivo. O primeiro QTL
significativo no modelo livre (locomoção central no CA) foi encontrado próximo ao
marcador D4MGH27 e alcançou um LRS de 14,4 explicando 14% da variância total
(Figura 11). Este QTL, no entanto, parece apresentar dois picos distintos acima do
nível de significância (Figura 11), sugerindo que poderiam existir na verdade ao
menos dois QTL significativos para o mesmo comportamento neste cromossomo. O
segundo, para a defecação no CA, foi encontrado próximo ao marcador D4RAT76 e
alcançou um LRS de 14,5 explicando, também, 14% da variância total (Figura 12). O
terceiro, para a locomoção periférica, foi encontrado perto do marcador D4RAT131
no modelo aditivo, com LRS de 8,8 explicando 9% da variância total dos dados
(Tabela 8). O quarto QTL, afetou três comportamentos diferentes na CBP próximo
ao marcador D4MGH11: locomoção no compartimento branco, com um LRS de 14,3
no modelo livre explicando 14% da variância total; tempo gasto no compartimento
preto, com um LRS de 17,4 no modelo livre explicando 16% da variância total e
tempo gasto no compartimento branco, com um LRS de 10,4 no modelo dominante
explicando 10% da variância total (Tabela 8). Por fim, o quinto QTL significativo foi
encontrado no modelo livre no teste de consumo de etanol (consumo de etanol
forçado), próximo ao marcador D4RAT206, com um LRS de 10,8 e explicando 11%
da variância total (Figura 12). O QTL que influenciou os três diferentes
comportamentos na CBP está localizado na porção distal do cromossomo 4 e este
resultado pode sugerir que o (s) gene (s) que afetam estes comportamentos
diferentes sejam os mesmos (efeito pleiotrópico) (Figura 13).
95
Tabela 8 - QTL significativos identificados nos ratos machos na primeira análise de QTL com os animais F2 LEW/SHR.
Fenótipo Marcador
Localização
(cM)
LRS
(machos)
%
variância
F p Modelo L/L L/S S/S
Locomoção
central CA
D4MGH27
73 14,4 14 7,53 0,00092 livre
19,24±1,71 15,19±0,91 11,75±1,12
Defecação
CA
D4RAT76 48 14,5 14 7,59 0,00087 livre
2,73±0,46 0,91±0,25 2,29±0,44
Locomoção
periférica CA
D4RAT131
64 8,8 9 4,84 0,00998 aditivo
102,38±6,67
97,02±2,84 83,58±3,94
Locomoção
comp.branco
CBP
D4MGH11
104 14,3 14 7,46 0,00098 livre
23,38±1,18 16,90±1,00 18,56±1,61
Tempo comp.
branco CBP
D4MGH11
97 10,4 10 4,96 0,00896 dominante
55,90±4,12 37,0±3,73 43,19±5,52
Tempo
comp.preto
CBP
D4MGH11
103 17,4 16 9,15 0,00023 livre
203,10±4,66
233,15±4,52
221,96±6,29
Etanol
forçado
D4RAT206
110 10,8 11 5,59 0,00509 livre
20,92±1,78 15,40±0,80 18,18±1,08
Legenda das variáveis: CA= campo aberto; CBP = caixa branca/preta; comp.= compartimento; cM= centimorgan; LRS= likelihood
ratio statistic; L/L, L/S, S/S= genótipos dos animais segundo o marcador utilizado. No caso do QTL ser encontrado no intervalo
entre dois marcadores, os dados do marcador que tem o valor de p mais significativo está mostrado na tabela. Cada cor de linha
diferente representa um QTL, sendo que o encontrado para a CBP parece ser pleitrópico, pois influencia três diferentes medidas
comportamentais deste teste.
96
Tabela 9 – QTL sugestivos identificados nos ratos (machos e fêmeas) na primeira análise de QTL realizada com os animais
F2 LEW/SHR.
Fenótipo Marcador
Localização
(cM)
LRS F p Modelo L/L L/S S/S
Machos
Tempo no
centro CA
D4RAT206 110 2,9 1,56 0,21479 Aditivo
26,38±2,01 25,76±1,52 21,07±2,41
Consumo
Etanol 20%
D4RAT206 110 4,3 2,26 0,10996 Aditivo
4,13±0,47 3,47±0,28 3,03±0,31
Locomoção
comp. preto
CBP
D4MGH11 104 7,8 3,94 0,02271 Livre
29,48±1,57 24,56±1,09 28,04±1,42
Latência
CBP
D4MGH11 105 4,9 2,39 0,09710 Livre
8,24±1,09 5,59±0,67 6,44±0,98
Consumo
Etanol 2,5%
D4RAT164 39 4,7 2,34 0,10163 Livre
0,39±0.11 0,61±0,10 0,80±0,13
Consumo
Etanol 5%
D4RAT151 26-28 4,6
1,79
0,17197
Livre
0,66±0,09
0,68±0,10
0,98±0,19
Consumo
Etanol 10%
D4RAT151 27 7,8
3,13
0,04828
Livre
1,65±0,21
1,58±0,14
2,44±0,43
Consumo
Etanol 10%
D4MIT16 75 4,4 2,30 0,10572 Dominante
1,32±0,14 2,10±0,24
1,93±0.39
Defecação
TNF
D4MGH27 73 6,9 3,46 0,03537 Livre
4,40±0,36 5,25±0,27 4,13±0,40
97
Fêmeas
Locomoção
central CA
D4MGH27 74 5,0
2,44
0,09243
Livre
10,71±1,44
15,16±1,05
13,62±1,43
Consumo
Etanol 20%
D4MGH27 73-75 2,8
1,42
0,24612
Dominante
5,85±0,72
8,65±0,96
8,12±0,64
Defecação
CA
D4RAT76 48 5,1 2,53 0,08482 Livre
0,81±0,31 0,21±0,09 0,50±0,32
Tempo no
centro CA
D4RAT76 48 6,9 3,45 0,03600 Livre
16,92±2,09 22,62±1,74 15,89±2,08
Tempo no
centro CA
D4RAT59 87 6,4 3,19 0,04592 Livre
14,00±2,10 2,81±1,65 19,38±2,29
Locomoção
comp. preto
CBP
D4WOX22 43 3,4 1,66 0,19643 Livre
35,92±1,59 32,79±1,22 32,06±1,25
Locomoção
comp. preto
CBP
D4RAT59 87 6,1 3,04 0,05263 Livre
37,28±1,81 32,05±1,12 34,19±1,49
Tempo de
imobilidade
TNF
D4RAT151 20 2,6 1,48 0,23253 Dominante
248,30±8,87 232,24±6,81 224,91±10,53
Tempo de
imobilidade
TNF
D4RAT131 60-63 3,7 1,76 0,17825 Dominante
250,64±6,92 230,89±6,96 226,05±11,15
Defecação
TNF
D4MGH22 2-7 4,4
2,16
0,12131
Aditivo
4,94±0,37
4,44±0,35
3,68±0,32
6,88±1,00
8,25±0,87
9,78±1,57
98
Consumo
Etanol 20%
D4MGH22 8-11 3,0 1,48
0,23217
Dominante
Consumo
Etanol 5%
D4RAT173 52 2,6 2,10 0,12822 Aditivo
2,32±0,47 2,33±0,20 3,31±0,55
Locomoção
periférica CA
D4RAT40 56 4,9 2,42 0,09493 Livre
105,09±3,73 102,60±2,40 92,79±5,64
Legenda das variáveis: cM= centimorgan; comp.= compartimento; CA= campo aberto; CBP = caixa branca/preta; TNF = teste do
nado forçado; LRS= likelihood ratio statistic; L/L, L/S, S/S= genótipos dos animais segundo o marcador utilizado (L = Lewis e S =
SHR). No caso do QTL ser encontrado no intervalo entre dois marcadores, os dados do marcador que tem o valor de p mais
significativo está mostrado na tabela. Cada cor de linha diferente representa um QTL, ou seja, em casos onde mais de uma linha
apresente a mesma cor o efeito do QTL é considerado como sendo pleiotrópico.
99
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
sugestivo
significante
distância (cM)
alfa-sinucleína
Locomoção central
D4MGH22
D4RAT151
D4RAT164
D4WOX22
D4RAT76
D4RAT173
D4RAT131
D4MIT16
D4MGH27
D4RAT59
D4RAT206
D4MGH6
D4RAT40
D4MGH11
receptor NK1
Valores de LRS
Figura 11 - QTL significativo encontrado para a locomoção central no CA na análise
de ligação com os 97 machos F2 LEW/SHR (modelo livre). A posição aproximada
dos genes candidatos α-sinucleína e receptor NK1 estão demonstradas no gráfico.
Os nomes dos 14 microssatélites utilizados estão colocados no eixo X. O traço
pontilhado que corta a curva de QTL demonstra a estimativa do intervalo de
confiança de 96.8% através do método de drop-off. A análise com o método de
bootstrap sugere que podem existir outros 2 QTL (um a esquerda e outro a direita do
QTL principal) influenciando esta medida comportamental neste cromossomo.
100
Figura 12 - Os outros QTL significativos encontrados na análise de ligação,
modelo livre, com os 97 machos F2 LEW/SHR para a defecação no CA (a);
locomoção no compartimento branco da CBP (b); tempo no compartimento preto da
CBP (c) e consumo de etanol forçado 10% (d). Os limiares sugestivos e
significativos fornecidos pelo teste de permutação do programa QTX são
demonstrados em cada gráfico. OS QTL representados nas letras (b) e (c) estão
localizados na mesma região genômica e correspondem, provavelmente, a um único
QTL pleiotrópico que influencia três medidas comportamentais na CBP. No eixo x
estão representadas as distâncias em centimorgans e no eixo y os valores de LRS.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0
3
6
9
12
15
18
sugestivo
significante
distância (cM)
Defecação no CA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0
3
6
9
12
15
18
sugestivo
significante
distância (cM)
Locomoção no comp. branco CBP
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0
3
6
9
12
15
18
sugestivo
significante
distância (cM)
Tempo comp. preto CBP
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0
3
6
9
12
15
18
sugestivo
significante
distância (cM)
Etanol forçado (10%)
(a)
(b)
(d)(c)
101
Figura 13 – Mapa comparativo dos QTL significativos encontrados na análise de
ligação com os 97 machos F2 LEW/SHR (modelo livre) ao longo do cromossomo 4.
As linhas vermelha e verde representam QTL encontrados na mesma região
genômica que correspondem, provavelmente, a um único QTL pleiotrópico que
influencia três medidas comportamentais na CBP. A posição aproximada dos genes
candidatos α-sinucleína e receptor NK1 estão demonstradas no gráfico. Os nomes
dos 14 marcadores moleculares utilizados estão colocados no eixo X.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0
3
6
9
12
15
18
distância (cM)
alfa-sinucleína
tempo preto
locomoção central
defecação CA
etanol forçado (10%)
locomoção branco
D4MGH22
D4RAT151
D4RAT164
D4WOX22
D4RAT76
D4RAT173
D4RAT131
D4MIT16
D4MGH27
D4RAT59
D4RAT206
D4MGH6
D4RAT40
D4MGH11
Valores de LRS
receptor NK1
102
Nas fêmeas, nenhum QTL significativo foi encontrado nesta primeira análise de
QTL. Entretanto, ocorreram 10 QTL com efeito sugestivo afetando comportamentos
do CA, CBP, TNF e consumo de etanol. Destes, seis foram encontrados no modelo
livre, dois no dominante e dois no modelo aditivo (Tabela 9). Três deles aconteceram
em medidas que apresentaram significância nos machos (todos no CA): locomoção
central (máximo LRS=5,0 entre os marcadores D4MGH27-D4MIT16), locomoção
periférica (máximo LRS=5,0 no marcador D4RAT40) e defecação no CA (máximo
LRS=5,1 no marcador D4RAT76) (Tabela 9). Além disso, três deles apresentaram
efeito pleiotrópico: sobre a locomoção periférica e consumo de etanol 20%;
defecação e tempo no centro do CA; defecação no TNF e consumo de etanol 20%
(Tabela 9).
A Figura 14 representa a posição aproximada de cinco QTL
independentemente mapeados por diferentes autores no cromossomo 4 do rato
para: preferência por 10% de etanol nas linhagens P e NP (Bice et al., 1998);
locomoção central no CA nas linhagens LEW e SHR (Ramos et al., 1999);
preferência por 5% de etanol nas linhagens HEP e WKY (Terenina-Rigaldie et al.,
2003b); níveis de corticosterona nas linhagens LEW e F344 (Potenza et al., 2004) e
locomoção central no CA nas linhagens LEW e SHR (Izídio, presente estudo). As
posições físicas foram estimadas através da comparação dos dados originais da
análise de ligação e as coordenadas dos marcadores moleculares utilizados (em
pares de bases) a partir do RGD (http://rgd.mcw.edu/). Os QTL de Bice et al. (1998);
Ramos et al. (1999) e Terenina-Rigaldie et al. (2003b) têm seus dados originais em
LOD score e os dois QTL mais recentes têm os seus dados em LRS (Figura 14).
103
Figura 14 – Os cinco QTL independentemente mapeados no cromossomo 4 do rato
para: preferência por 10% de etanol nas linhagens P e NP (Bice et al., 1998);
locomoção central no CA nas linhagens LEW e SHR (Ramos et al., 1999);
preferência por 5% de etanol nas linhagens HEP e WKY (Terenina-Rigaldie et al.,
2003b) acima; e níveis de corticosterona nas linhagens LEW e F344 (Potenza et al.,
2004) e locomoção central no CA nas linhagens LEW e SHR (Izídio, presente
estudo) abaixo. Mb = megabases.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
distância (Mb)
Terenina
Bice
Ramos
Valores de LOD
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
0
3
6
9
12
15
distância (Mb)
Potenza
Izídio
Valores de LRS
104
Os resultados dos testes do CA com as fêmeas F2 segundo as fases do ciclo
estral estão representados na Figura 15. Ocorreu uma diferença significativa (p <
0,05) na locomoção central do CA, onde as fêmeas no diestro-proestro se
mostraram menos “ansiosas” por se aproximarem mais desta área aversiva.
Ocorreram também diferenças significativas na locomoção periférica (p < 0,01) e
locomoção total (p < 0,01), onde as fêmeas no diestro-proestro foram as que
apresentaram maiores índices de locomoção. Nenhuma diferença significativa
ocorreu nos comportamentos do teste da CBP (dados não mostrados).
Na análise de ligação com as fêmeas considerando as fases do ciclo estral
foram encontrados dois QTL significativos e cinco sugestivos nas fêmeas do diestro-
proestro (Tabela 10) e um QTL significativo e quatro sugestivos nas fêmeas do
estro-metaestro (Tabela 11). Este QTL significativo encontrado nas fêmeas do estro-
metaestro apresentou um efeito pleiotrópico, afetando quatro medidas
comportamentais do teste da CBP, sendo que duas delas alcançaram o limiar
significativo e duas o limiar sugestivo (Tabela 11). Entre estes, foram encontrados
dois QTL sugestivos para a locomoção central no CA. O primeiro, na análise de
ligação com as fêmeas no diestro-proestro (máximo LRS=6,0 no marcador
D4MGH27, explicando 13% da variância total) e o segundo com as fêmeas no estro-
metaestro (máximo LRS=5,3 no marcador D4RAT151, explicando 9% da variância
total) ambos no modelo livre (Figura 16).
Em tese, uma análise com maior número de animais F2 poderá fornecer
resultados mais fidedignos. Por esta razão, a figura 17 mostra o resultado da análise
de ligação para a medida locomoção central no CA com todas as 192 fêmeas deste
estudo (96 da primeira e 96 da segunda análise de QTL). Podemos observar que,
105
somando todas as fêmeas, o QTL para esta medida não alcança o limiar sugestivo
ou significativo (LRS máximo de 2,5 próximo ao marcador D4RAT173).
106
0
6
12
18
24
D-P E-M
*
(a)
Locomoção central
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
D-P E-M
(b)
Defecação no CA
0
25
50
75
100
D-P E-M
(c)
**
Locomoção periférica
0
30
60
90
120
D-P E-M
(d)
**
Locomoção total
Figura 15 - Comportamento das fêmeas F2 no teste do CA segundo as diferentes
fases do ciclo estral. * e ** p<0,01 e p<0,05; respectivamente (teste-t). D-P =
diestro-proestro, N = 43; E-M = estro-metaestro, N = 53.
107
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
7.5
distância (cM)
alfa-sinucleína
Diestro-proestro
Estro-metaestro
D4MGH22
D4RAT151
D4RAT164
D4WOX22
D4RAT76
D4RAT173
D4RAT131
D4MIT16
D4MGH27
D4RAT59
D4RAT206
D4MGH6
D4RAT40
D4MGH11
QTL Ofil1 machos
receptor NK1
Valores de LRS
Figura 16 - Os dois QTL sugestivos encontrados para a locomoção central no CA na
análise de ligação com as 43 fêmeas no diestro-proestro (linha escura) ou com as 53
fêmeas no estro-metaestro (linha picotada). Ambos foram achados utilizando-se o
modelo livre. A posição aproximada dos genes candidatos α-sinucleína e receptor
NK1 estão demonstradas no gráfico. Os nomes dos 14 marcadores moleculares
utilizados estão colocados no eixo X. O traço em negrito acima das curvas de QTL
demonstra o intervalo de confiança de 96.8% do QTL encontrado em machos para a
locomoção central no CA.
108
Tabela 10 - QTL significativos e sugestivos identificados nas ratas fêmeas no diestro-proestro a partir da análise de ligação com os
animais F2.
Fenótipo Marcador
Localização
(cM)
LRS
%
variância
F P Modelo L/L L/S S/S Significância
Locomoção
Central CA
D4MGH27
71 6,0 13 2,76
0,07528
Livre
20,83±3,21 13,95±1,56 18,20±2,12
Sugestivo
Defecação
CA
D4RAT151
12-14 14,3
28 6,21
0,00449
Livre
0,08±0,08 0,08±0,08 1,33±0,84
Significativo
Defecação
CA
D4RAT76 48 14,5
14 0,19
0,83076
Livre
0,18±0,13 0,25±0,25 0,40±0,40
Sugestivo
Locomoção
periférica CA
D4RAT131
64 8,8 9 3,23
0,04995
Livre
97,75±2,53 83,53±5,19 96,75±5,88
Sugestivo
Tempo no
Centro CA
D4MGH11
104 14,3
14 1,31
0,28008
Livre
32,13±3,50 39,59±4,48 29,30±6,50
Sugestivo
Locomoção
Total CA
D4MGH11
97 10,4
10 2,06
0,14035
Livre
115,75±3,36
100,29±6,19
109,30±8,26
Sugestivo
Tempo comp.
Preto CBP
D4RAT206
110 9,5 20 5,07
0,01087
Livre
248,77±5,63
229,11±5,44
250,73±4,95
Sugestivo
Locomoção
comp.preto
CBP
D4RAT206
110 9,9 21 5,10
0,01061
Dominante
36,62±2,54 28,74±1,44 28,36±2,29
Significativo
Tempo comp.
D4MGH6
78
5,7
12
2,89
0,06717
Dominante
47,62±6,63
33,38±3,36
34,22±5,37
Sugestivo
109
Branco CBP
Locomoção
comp.branco
CBP
D4MGH6 77 5,8 13 2,78
0,07428
Livre
19,92±1,81 15,81±1,04 18,89±1,34
Sugestivo
Legenda das variáveis: cM= centimorgan; comp.= compartimento; CA= campo aberto; CBP = caixa branca/preta; LRS= likelihood
ratio statistic; L/L, L/S, S/S= genótipos dos animais segundo o marcador utilizado (L = Lewis e S = SHR). No caso do QTL ser
encontrado no intervalo entre dois marcadores, os dados do marcador que tem o valor de p mais significativo está mostrado na
tabela. Cada cor de linha diferente representa um QTL, ou seja, em casos onde mais de uma linha apresenta a mesma cor o efeito
do QTL é considerado como sendo pleiotrópico.
110
Tabela 11 - QTL significativos e sugestivos identificados nas ratas fêmeas no estro-metaestro a partir da análise de ligação com os
animais F2.
Fenótipo Marcador
Localização
(cM)
LRS
%
variância
F P Modelo
L/L L/S S/S Significância
Locomoção
central CA
D4RAT151
24 5,3 9 2,45
0,09637
Livre
17,56±2,69 11,97±1,31 11,79±1,52
Sugestivo
Locomoção
comp.preto CBP
D4RAT151
87 9,7 17 3,97
0,02514
Livre
24,44±2,72 31,20±1,40 26,14±1,73
Sugestivo
Defecação
CA
D4RAT76 48 14,5
14 1,94
0,15488
Livre
1,17±0,75 0,18±0,18 0,95±0,47
Sugestivo
Locomoção
periférica CA
D4RAT131
64 8,8 9 0,42
0,66021
Livre
80,14±8,47 83,56±2,74 78,91±4,33
Sugestivo
Locomoção total
CA
D4RAT59 97 10,4
10
1,41
0,25384
Livre
86,71±10,70
99,04±3,83
91,14±4,08
Sugestivo
Tempo
comp.preto CBP
D4RAT206
109 8,9 15 4,18
0,02091
Livre
223,67±7,81
252,96±5,18
238,40±6,80
Sugestivo
Tempo comp.
Branco CBP
D4RAT206
110 15,2
25 8,02
0,00095
Livre
55,00±5,89 25,33±3,31 36,60±5,08
Significativo
Locomoção
comp.branco CBP
D4RAT206
110 13,3
22 7,35
0,00159
Livre
23,44±1,31 14,38±1,27 16,15±1,48
Significativo
Transições
CBP
D4RAT206
110
8,7
15
4,66
0,01397
Livre
4,22±0,32
2,50±0,29
3,10±0,37
Sugestivo
111
Legenda das variáveis: cM= centimorgan; comp.= compartimento; CA= campo aberto; CBP = caixa branca/preta; LRS= likelihood
ratio statistic; L/L, L/S, S/S= genótipos dos animais segundo o marcador utilizado (L = Lewis e S = SHR). No caso do QTL ser
encontrado no intervalo entre dois marcadores, os dados do marcador que tem o valor de p mais significativo está mostrado na
tabela. Cada cor de linha diferente representa um QTL, ou seja, em casos onde mais de uma linha apresenta a mesma cor o efeito
do QTL é considerado como sendo pleiotrópico.
112
Figura 17 - A análise de ligação realizada com todas as 192 fêmeas (incluindo
as diferentes fases do ciclo estral). Os nomes dos 14 marcadores moleculares
utilizados estão colocados no eixo X.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0
1
2
3
4
5
distância (cM)
D4MGH22
D4RAT151
D4RAT164
D4WOX22
D4RAT76
D4RAT173
D4RAT131
D4MIT16
D4MGH27
D4RAT59
D4RAT206
D4MGH6
D4RAT40
D4MGH11
sugestivo
Valores de LRS
113
Segunda estratégia experimental
Paralelamente à análise de QTL, nós investigamos dois genes candidatos
potenciais na região cromossômica em estudo que poderiam explicar os efeitos
de Ofil1. Para isso, primeiramente, os ratos LEW e SHR foram submetidos a
um teste do CA, onde os ratos LEW mostraram menor locomoção central
(p<0.001) (ou maior ansiedade/emocionalidade) (Figura 18a) e nenhuma
diferença quanto à locomoção total (p>0.05) quando comparados com os ratos
SHR (Figura 18b). Após isso, os ratos foram sacrificados e tiveram seus
cérebros retirados para a avaliação da expressão gênica através de real-time
RT-PCR. Os resultados revelaram que, no hipocampo, os ratos LEW
mostraram uma maior expressão do gene da α-sinucleína (p<0.05), medida a
partir da quantidade de RNAm transcrito, quando comparados aos ratos SHR
(Figura 19a). Já no hipotálamo a concentração do RNAm da α-sinucleína foi
similar em ambas as linhagens (Figura 19a). Nenhuma diferença significativa
foi encontrada, no hipocampo ou hipotálamo, na expressão do gene Tac1r
entre as linhagens LEW e SHR, apesar de haver uma tendência não
significativa no hipotálamo (Figura 19b). Estes resultados, em conjunto,
sugerem a participação do gene da α-sinucleína na regulação dos
comportamentos relacionados à ansiedade no modelo genético LEW/SHR. Por
esta razão, este gene foi escolhido, inicialmente, para dar seqüência à
abordagem de gene candidato.
114
SHR LEW
0
10
20
30
***
Locomoção central
SHR LEW
0
25
50
75
100
Locomoção total
(a)
(b)
Figura 18 - Locomoção central (a) e total (b) no campo aberto dos ratos LEW e
SHR (n=8/linhagem), *** p<0.001; teste-t.
115
Figura 19 - Quantidade de RNAm (normalizado em relação ao gene da
ciclofilina) do gene Snca da α-sinucleína (a) e do gene Tac1r do receptor Nk1
(b) no hipocampo e hipotálamo dos ratos LEW e SHR (7-8/linhagem). * p<0.05;
teste-t.
Hipocampo Hipotalamo
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SHR
LEW
*
(a)
Qtda de transcrito
(normalizado)
Hipocampo Hipotalamo
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SHR
LEW
(b)
Qtda de transcrito
(normalizado)
116
Além destes ratos utilizados no CA, outros ratos LEW e SHR machos
foram usados nos testes do LCE e CBP. Os ratos LEW mostraram menor
número de entradas e % de tempo gasto nos braços abertos do LCE (p<0,001
e p<0,05; respectivamente) em relação aos ratos SHR (Figura 20a). Entretanto,
o número de entradas nos braços fechados não diferiu entre as linhagens
(p>0,05) (Figura 20a). A locomoção e a % de tempo no compartimento branco
da CBP dos ratos LEW foi reduzida quando comparada aos ratos SHR
(p<0,001 para ambas) (Figura 20b). Neste mesmo sentido, a locomoção no
compartimento preto foi maior nos animais LEW (p<0,001) em comparação aos
animais SHR (Figura 20b). Nos três testes comportamentais de ansiedade, os
ratos LEW evitaram mais as áreas aversivas do que os ratos SHR. Em
seguida, nós avaliamos os ratos LEW e SHR em um protocolo de consumo de
etanol e substâncias controles. Nenhuma diferença entre ratos machos LEW e
SHR foi observada no consumo de sacarina e quinino em livre escolha; de
etanol forçado (10%) (dados não mostrados), ou de etanol a 2% e 4% em livre
escolha (p>0,05) (Figura 21a). Porém, os ratos LEW ingeriram mais etanol do
que os SHR, quando este foi oferecido em livre escolha nas concentrações de
6% (p<0,01) e 10% (p<0,01) (Figura 21a). Os animais LEW e SHR diferiram
também na preferência ao etanol em todas as concentrações (p<0,01), com a
diferença tendo o mesmo sentido dos dados de consumo absoluto (Figura
21b).
117
SHR LEW SHR LEW
0
2
4
6
8
***
Fechados
Abertos
Entradas nos braços
SHR LEW
0
10
20
30
40
*
% de tempo nos
braços abertos
SHR LEW SHR LEW
0
10
20
30
40
50
60
***
Preto
Branco
***
Locomoção
SHR LEW
0
5
10
15
20
***
% tempo no
compartimento branco
(a)
(b)
Figura 20 - Entradas nos braços (fechados e abertos) e porcentagem de tempo
nos braços abertos do LCE (a) Locomoção em ambos os compartimentos
(branco e preto) e porcentagem de tempo gasto no compartimento branco (b)
(n=8/linhagem), * p<0,05; *** p<0,001; teste-t.
118
0
1
2
3
4
5
6
2%
10%6%4%
SHR
LEW
**
**
Concentração (v/v)
Consumo de etanol [g/kg/dia]
0
25
50
75
2%
10%6%4%
SHR
LEW
**
**
**
**
Concentração (v/v)
Preferência ao etanol (%)
(a)
(b)
Figura 21 - Consumo (g/kg/dia) (a) e preferência (b) de etanol oferecido como
livre-escolha com água nas concentrações de 2, 4, 6 e 10% (11/linhagem), **
p<0,01 ANOVA de medidas repetidas seguido pelo post hoc de Duncan.
119
A possibilidade de que diferenças na seqüência do gene Snca poderiam
ser responsáveis pelas diferenças encontradas na expressão de RNAm da α-
sinucleína e no comportamento entre os ratos LEW e SHR foi investigada em
outro experimento. Desta maneira, uma população segregante de machos F2
LEW/SHR, a mesma utilizada na primeira estratégia experimental, foi testada
no CA, na CBP, no TNF e em um teste de consumo de etanol, como já descrito
anteriormente. Após isto, estes animais foram genotipados para um SNP
(single nucleotide polymorphism) identificado para ratos LEW e SHR na
posição +562 do gene da α-sinucleína na região 3’-UTR. É importante ressaltar
que este SNP foi descoberto no estudo de Chiavegatto et al. (2008). Nesta
posição, os ratos LEW apresentam naturalmente um nucleotídio com a base
nitrogenada “C”, enquanto que os ratos SHR apresentam a base “T”. Estudos
in vitro mostraram que este SNP alterou a eficiência de expressão de um gene
repórter em células PC12 de ratos, com o constructo que continha um C na
posição +562 (como nos ratos LEW) quase dobrando a expressão in vitro
(Chiavegatto et al., 2008).
Os resultados da locomoção central para os três possíveis genótipos
foram: 18,9 ± 1,9 CC (n=13); 15,9 ± 1,1 CT (n=36); e 12,9 ± 1,4 TT (n=24). A
ANOVA revelou um efeito significante de genótipo (F=3,38; p<0,05) com o teste
post hoc de Duncan mostrando que os ratos que carregam duas cópias do
alelo contendo o nucleotídeo C, apresentaram maiores níveis de locomoção
central do que os ratos contendo duas cópias do alelo T (p<0,01) (Figura 22a).
Estes dados confirmam o efeito do alelo proveniente dos animais LEW sobre o
aumento na locomoção central no CA. Além disto, os animais com o genótipo
CC apresentaram maiores índices de locomoção periférica do que os com o
120
genótipo TT (p<0,01) e os animais com o genótipo CT menor defecação no CA
em comparação com os outros genótipos (p<0,05) (Figura 22 b-c). Nenhum
efeito de genótipo para as medidas da CBP, do TNF, ou de
consumo/preferência ao etanol foram encontrados (p>0.05) (dados não
mostrados).
121
CC CT TT
0
6
12
18
24
(a)
**
Locomoção central
CC CT TT
0
30
60
90
120
**
(b)
Locomoção periférica
CC CT TT
0
1
2
3
4
*
(c)
Defecação
Figura 22 - Locomoção central (a), ** = p<0,01 CC em relação a TT.
Locomoção periférica (b), ** = p<0,01 CC em relação a TT. Defecação no CA
(c), * = p<0,05 CT em relação aos outros genótipos. CC, CT e TT são os
genótipos possíveis dos ratos machos F2 no SNP encontrado na posição +562
do gene da α-sinucleína. ANOVA seguido pelo post hoc de Duncan. (n=13 CC;
36 CT; 24 TT).
122
Por fim, ratos LEW e SHR de ambos os sexos foram submetidos a um
tratamento com o psicoestimulante MFD durante 16 dias seguidos no período
da adolescência (23-38 dias de idade) e testados com 9-10 semanas de idade.
Os resultados mostraram que o tratamento reduziu a locomoção central
(F=5,20; p<0,05) e total no CA (F=5,93; p<0,05), em ambas as linhagens e
sexos (Figura 23a). O fator sexo foi significativo na medida locomoção total no
CA (F=17,83; p<0,001). Além disso, ocorreram interações entre os fatores
linhagem e sexo nas medidas: locomoção central no CA (F=14,14; p<0,001) e
tempo nos braços abertos do LCE (F=5,30; p<0,05), com o teste post hoc de
Duncan mostrando que as fêmeas SHR apresentaram maiores níveis de
locomoção e tempo gasto do que todos os outros grupos; e entradas nos
braços fechados do LCE (F=6,27; p<0,05), com o teste post hoc de Duncan
mostrando que os machos SHR fizeram menos entradas do que todos os
outros grupos (Figura 23b). Houve também uma tendência ansiogênica da
droga no LCE (p=0,08), mostrando que o tratamento pode ser efetivo na
redução do tempo de permanência nos braços abertos (Figura 23b).
Entretanto, este ponto terá que ser avaliado novamente em experimentos
futuros.
123
Figura 23 - Locomoção central e total (a) no CA; tempo nos braços
abertos e entradas nos braços fechados do LCE (b) nos animais machos e
fêmeas das linhagens LEW e SHR tratados com salina ou metilfenidato.
(ANOVA 3-vias).
124
Para a preferência por sacarina, ocorreu um efeito do fator linhagem
(F=8,67; p<0,01), mostrando que os ratos SHR preferem mais esta substância
que os ratos LEW, independentemente do sexo avaliado (Figura 24). Nenhuma
diferença significativa foi encontrada na preferência por quinino (Figura 24). Por
fim, no consumo de etanol (10%) em machos ocorreu uma interação linhagem
x repetição (F=3,06; p<0,01), com o teste post hoc de Duncan mostrando que
os machos SHR consumiram mais etanol do que os LEW somente no primeiro
bloco de 2 dias (Figura 25). Em fêmeas, ocorreu um efeito geral da repetição
(F=10,46; p<0,001), com o teste post hoc de Duncan mostrando que as fêmeas
consumiram mais etanol no último bloco, independentemente da linhagem
(Figura 26). Também ocorreu um efeito geral de linhagem (F=21,52; p<0,001),
mostrando que as fêmeas SHR consumiram mais etanol do que as fêmeas
LEW em todos os blocos experimentais (Figura 26).
125
Figura 24 - Preferência por sacarina (acima) ou quinino (abaixo) nos animais
machos e fêmeas das linhagens LEW e SHR tratados com salina ou
metilfenidato. (ANOVA 3-vias).
70
80
90
100
Salina
Metilfenidato
M F
LEW SHR
linhagem=p<0.01
LEW SHR
Preferência por sacarina (%)
40
50
60
70
Salina
Metilfenidato
M F
LEW SHR LEW SHR
Preferência por quinino (%)
126
Figura 25 - Ingestão de etanol 10%, em machos Lewis e SHR tratados com
salina ou metilfenidato, oferecido como livre-escolha com água (ANOVA de 3
vias de medidas repetidas).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
5.5
6.5
7.5
SAL SHR
MPD SHR
SAL LEW
MPD LEW
linhagem x repetição=p<0.01
*
Consumo de etanol (g/kg/dia)
127
Figura 26 - Ingestão de etanol 10%, em fêmeas Lewis e SHR tratadas com
salina ou metilfenidato, oferecido como livre-escolha com água (ANOVA de 3
vias de medidas repetidas).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
SAL SHR
MPD SHR
SAL LEW
MPD LEW
linhagem=p<0.001
Consumo de etanol (g/kg/dia)
128
5-DISCUSSÃO
No presente trabalho, os ratos da linhagem LEW exibiram maiores níveis
de comportamentos relacionados à ansiedade e à depressão, pois eles
exploraram menos a área central do CA, os braços abertos do LCE, o
compartimento luminoso da CBP e apresentaram maior imobilidade no TNF,
quando comparados com os ratos SHR (Tabela 2; Figura 9). Estas diferenças
são condizentes com dados prévios publicados na literatura (Ramos e
Mormède, 1998; Izídio et al., 2005a; Hinojosa et al., 2006), demonstrando que
as diferenças fenotípicas entre estas linhagens são robustas e até mesmo
observadas em diferentes laboratórios e condições ambientais (Ramos et al.,
1997; Ramos et al., 2002; Vendruscolo et al., 2006; Chiavegatto et al., 2008), o
que faz deste par de linhagens uma importante ferramenta no estudo genético
da emocionalidade. Entretanto, alguns estudos já encontraram fatores
ambientais importantes que podem modificar ou anular a diferença
comportamental entre as linhagens LEW e SHR, sugerindo que o ambiente,
assim como os genes, apresenta um papel importante na gênese destas
diferenças (Izídio et al., 2005b). Do mesmo modo, estudos realizados com
estas linhagens, no campo de pesquisa do consumo de etanol, sugerem que os
resultados de consumo desta droga parecem ser dependentes de diferentes
fatores ambientais (Da Silva et al., 2004; Da Silva et al., 2005; Vendruscolo et
al., 2006; Chiavegatto et al., 2008). Assim, se por um lado o modelo genético
LEW/SHR possui grande utilidade na busca direta por genes que influenciam
comportamentos relacionados à emocionalidade, ele pode também ser útil na
busca de genes que interagem com o ambiente afetando comportamentos
129
relacionados à ansiedade e à ingestão de etanol. Por este motivo, as linhagens
LEW e SHR foram utilizadas neste estudo, que é composto basicamente de
duas estratégias paralelas.
Na primeira delas, algumas técnicas genéticas e comportamentais foram
empregadas no intuito de descobrir e/ou confirmar regiões genômicas
associadas aos comportamentos exibidos no CA, CBP, TNF e consumo de
etanol. Na segunda, alguns genes candidatos foram escolhidos com a intenção
de se encurtar o longo caminho entre a identificação de uma região genômica
importante e a descoberta do (s) gene (s) propriamente dito (s). Buscando
facilitar a interpretação dos dados, a discussão estará dividida entre estas duas
estratégias experimentais.
5.1 Primeira estratégia experimental
Nós produzimos, simultaneamente, quatro grupos genotípicos de
animais (LEW, SHR, F1 e F2) de ambos os sexos que foram testados em 3
diferentes testes comportamentais (CA, CBP, TNF), permitindo que se
calculasse a herdabilidade dos fenótipos exibidos (Tabela 3). Estes valores de
herdabilidade foram mais altos em machos do que em fêmeas. No estudo de
características quantitativas, uma das principais funções do cálculo da
herdabilidade é seu caráter preditivo. Entretanto, além do genótipo e de suas
interações epistáticas, a expressão de um fenótipo é dependente do ambiente
e da sua interação com o genótipo (Hunter, 2005; Caspi e Moffitt, 2006; Meyer-
Lindenberg e Weinberger, 2006). Assim, os valores mais altos de herdabilidade
em machos podem indicar que eles sofrem menos efeitos “ambientais”
(reatividade ao estresse, flutuações hormonais) sendo, portanto, mais
130
homogêneos do que as fêmeas, o que parece ser senso comum entre a
maioria dos pesquisadores. A maioria dos valores de herdabilidade ultrapassou
o valor de 0,5. Ou seja, os dados sugerem que mais de 50% da variabilidade
total existente nestas características comportamentais, ligadas à ansiedade e à
depressão, são influenciadas por fatores genéticos nas populações utilizadas.
Este dado reforça a importância dos genes na expressão dos comportamentos
relacionados à emocionalidade (Ramos e Mormède, 1998; Clèment et al.,
2002; Leonardo e Hen, 2006). Dentre todas as medidas, a locomoção central e
o tempo de imobilidade no TNF foram as variáveis que apresentaram os
maiores valores de herdabilidade (Tabela 3). Este resultado está de acordo
com Ramos et al. (1998) que, no estudo prévio com as linhagens LEW e SHR
de origem francesa, sugeriram a locomoção central como a medida
comportamental mais herdável (59%). É importante ressaltar, entretanto, que
mesmo em medidas comportamentais do CA, nem sempre valores altos de
herdabilidade são encontrados (Flint et al., 1995), ressaltando que os dados
não devem ser generalizados, pois eles dependem das condições ambientais
presentes no momento dos experimentos bem como dos genótipos envolvidos.
Considerando que estes fenótipos são características quantitativas e, portanto,
dependentes do efeito de múltiplos genes, uma herdabilidade de 50 % pode ser
considerada um valor alto, usualmente encontrado somente em estudos
envolvendo características morfológicas (Crusio, 2004). Portanto, as análises
posteriores de QTL deveriam fornecer resultados significativos, principalmente
para a locomoção central no teste do CA e para o tempo de imobilidade no
TNF.
131
Uma hipótese inicial deste trabalho era que os testes comportamentais,
bem como suas inter-relações, não apresentariam os mesmos significados
psicológicos entre os sexos. Alguns dados obtidos e comentados nos
parágrafos anteriores desta discussão sugeriram que esta hipótese pode ser
verdadeira. Mas, com o intuito de dissecar os diferentes componentes
emocionais envolvidos nos testes comportamentais e elucidar melhor esta
questão, nós utilizamos alguns métodos estatísticos. Assim, os mesmos
animais da geração F2 foram testados no CA, CBP e TNF e em um protocolo
de consumo de etanol. Após a finalização desta bateria de testes, algumas
medidas comportamentais (duas a três de cada teste mais cinco do consumo
de etanol) originadas com estes animais F2 foram utilizadas para a produção
de uma matriz de correlação e posterior ACP (Tabelas 4-7), separadamente
para cada sexo.
Os resultados da matriz revelaram algumas correlações intra e inter-
testes significativas que podem ser ressaltadas. Por exemplo, em ambos os
sexos, a locomoção central se correlacionou positivamente com a locomoção
periférica no CA (Tabela 4-5). Este resultado, a princípio, pode parecer
surpreendente, pois estas medidas deveriam medir componentes emocionais
diferentes (Fernández-Teruel et al., 2002). Contudo, resultados prévios da
literatura também sugerem que estas duas medidas podem compartilhar
significados psicológicos comuns, pois, afinal, ambas envolvem locomoção e
são coletadas quando o animal está sendo exposto a um ambiente inédito, que
deve provocar reações emocionais. Os ratos Floripa H e L, que foram
selecionados bidirecionalmente em nosso laboratório para a locomoção central
no CA, após 4 gerações apresentavam divergência também em relação à
132
locomoção periférica (Ramos et al., 2003). Outro ponto interessante a ser
comentado é que, originalmente, no CA somente se mensurava a locomoção
total dos animais (Hall, 1934). Como o ambiente do teste era inédito ao animal,
aquele que se locomovesse menos e defecasse mais era considerado o animal
mais “ansioso”. Parecia, portanto, que a locomoção geral no aparato era
influenciada por fatores emocionais, independentemente da região onde o rato
estivesse. Muitos anos depois, algumas evidências, principalmente
farmacológicas, começaram a sugerir que poderia existir uma distinção entre
os significados da locomoção central e periférica (para revisão ver Prut e
Belzung, 2003). Não é nossa intenção dizer que um único comportamento seja
uma medida pura de emocionalidade, pois assim como uma medida dita
emocional pode depender, entre outras coisas, da locomoção, a locomoção
também pode ser influenciada por diversos fatores motivacionais (Paulus e
Geyer, 1993). Mas, a tentativa de se separar as locomoções central e periférica
vai ao encontro da complexidade neurobiológica que rege estes
comportamentos e que pode nos levar, no futuro, a uma melhor compreensão
do significado real dos testes comportamentais. Entretanto, nossos dados
reforçam que, ao menos em parte e ao menos nestas populações, estas
locomoções têm um componente biológico e genético comum. As demais
correlações intra-testes foram mais ou menos óbvias, pois aconteceram entre
medidas que já têm, naturalmente, uma grande relação devido a fatores físicos
(tempo no compartimento branco com o tempo no preto) ou biológicos
(consumo de etanol 2,5% com o de 5%).
Em relação às correlações encontradas entre diferentes testes, as
correlações positivas entre a locomoção central e periférica no CA com a
133
locomoção no compartimento branco da CBP foram comuns aos animais de
ambos os sexos (Tabela 4-5). Assim como no CA, onde os animais que se
aproximam mais da área central e aversiva podem ser considerados os menos
ansiosos, na CBP, a aproximação do ambiente claro é considerada um índice
de baixa “ansiedade” (Crawley, 1981; Costall et al., 1989). Como estes dois
testes comportamentais são baseados na esquiva de áreas aversivas, é
razoável pensar que eles devem medir, ao menos em parte, uma mesma
dimensão emocional. De fato, uma grande quantidade de dados
comportamentais (Ramos et al., 1998; 2002; Izídio et al., 2005b)
farmacológicos (Chauoloff et al., 1997; Prut e Belzung, 2003) e genéticos
(Ramos et al., 2003; Henry et al., 2006) sugerem que o CA e a CBP podem
medir a mesma dimensão emocional. No entanto, quando os animais são
testados simultaneamente nestes dois aparatos, drogas ansiogênicas
aumentam a esquiva das áreas aversivas de ambos os testes, mas, ao
contrário, drogas ansiolíticas não apresentam efeito semelhante em ambos os
testes (Ramos et al., 2008). Ramos (2008) sugere que a estimativa da
variabilidade total compartilhada entre o CA e a CBP é de apenas 5,3%. Ou
seja, mesmo entre testes que supostamente deveriam medir comportamentos
relacionados à ansiedade, existem grandes diferenças que podem significar
que cada teste mede, em grande parte, uma dimensão emocional diferente
(Archer, 1973; Ramos e Mormède, 1998).
Outras correlações interessantes ocorreram entre medidas da CBP e do
TNF com consumo de etanol, somente em machos (Tabela 4). A correlação
positiva aqui encontrada entre comportamentos relacionados à baixa
ansiedade e ao alto consumo de etanol vai contra o exposto em parte da
134
literatura, pois os animais mais “ansiosos” deveriam ser os que consomem
maiores quantidades de etanol (Colombo et al., 1995; Spanagel et al., 1995;
Möller et al., 1997; Pandey, 2003; Pandey et al., 2005). Entretanto, este ponto é
controverso e os resultados não são conclusivos (Tuominen et al., 1990;
Viglinskaya et al., 1995; Fernández-Teruel et al., 2002; Henniger et al., 2002;
Vendruscolo et al., 2006; Izídio e Ramos, 2007). Porém, os animais mais
imóveis no TNF foram os que consumiram maiores quantidades de etanol,
apoiando a hipótese de comorbidade clínica entre alcoolismo e depressão
(Nurnberger et al., 2004; Quello et al., 2005; Cardoso et al., 2008) e
relacionando comportamentos de estresse com o consumo de etanol.
A ACP, assim como a matriz de correlação, foi realizada separadamente
para machos e fêmeas, com o intuito de se investigar se os testes e suas
relações apresentam os mesmos significados psicológicos entre os sexos
(Tabelas 6-7). O objetivo de uma ACP é utilizar as correlações entre muitas
variáveis originais, criando um pequeno número de índices virtuais (fatores)
que não são correlacionados entre si e explicam, portanto, diferentes
dimensões contidas nos dados originais (Manly, 1988). Ambas as análises
revelaram cinco fatores principais com limiar (eigenvalues) maior do que 1,
porém com diferenças importantes entre os sexos. Na ACP para as 13 medidas
comportamentais dos quatro diferentes testes realizados com os animais
machos F2, os cinco fatores representaram 72% da variabilidade total (Tabela
6). O fator 1, que representa a maior fatia da variabilidade total, está associado
principalmente com medidas relacionadas à ansiedade na CBP. O fator 2 é
representativo das medidas de consumo de etanol. O fator 3 representa as
medidas relacionadas à ansiedade do CA. O fator 4 representa um misto entre
135
o teste de “depressão” juntamente com o consumo de etanol forçado e de
etanol em livre escolha (2,5%) e, finalmente, o fator 5, que contribui com menos
de 10% da variabilidade total, é representado pela defecação no TNF. Os
resultados aqui encontrados apóiam a idéia de que o complexo conjunto de
comportamentos ligados à ansiedade/emocionalidade varia ao longo de duas
ou mais dimensões independentes (Archer, 1973; File, 1991; Cruz et al., 1994;
Ramos e Mormède, 1998), pois as medidas do CA e da CBP ficaram em
fatores diferentes. Além disso, múltiplos testes de emocionalidade (cada um
deles com seus particulares contextos aversivos), quando aplicados aos
mesmos grupos de animais, linhagens ou tratamentos farmacológicos,
freqüentemente produzem resultados conflitantes, indicando que cada teste
individual parece de fato se relacionar a uma dimensão distinta da reatividade
emocional (Archer, 1973; File, 1991; Trullas e Skolnick, 1993; Ramos e
Mormède, 1998). Dados recentes de nosso laboratório corroboram esta
hipótese, de que o CA e a CBP podem medir comportamentos emocionais
bastante distintos (Ramos, 2008).
Já em fêmeas, os cinco fatores encontrados após a ACP representaram
67% da variabilidade total (Tabela 7). O fator 1, que representa a maior fatia da
variabilidade total, está associado principalmente com medidas relacionadas à
ansiedade no CA e na CBP. O fator 2 representa medidas de consumo de
etanol, assim como o fator 3. Entretanto, o fator 2 representa a ingestão das
maiores concentrações, enquanto que o fator 3 tem as medidas de consumo de
etanol nas concentrações mais baixas, juntamente com a defecação no TNF e
o consumo de etanol forçado. Por fim, o fator 4 representa uma relação do CA
com o tempo de imobilidade no TNF e o fator 5, a defecação no CA.
136
Contrariamente ao encontrado em machos, os resultados da ACP em
fêmeas mostraram um fator misto entre medidas do CA e da CBP. Estes
resultados apontam para um significado psicológico distinto entre os dois sexos
para os mesmos testes comportamentais. Resultados semelhantes já foram
encontrados na literatura (Johnston e File, 1991; Kelly et al., 1999; Palanza,
2001; Beck e Luine, 2002). Além disso, as medidas de consumo de etanol
dividiram-se em dois fatores em fêmeas. Recentemente, tem sido sugerido que
fêmeas podem ser um modelo interessante na busca de regiões genômicas
que influenciam os comportamentos relacionados ao alcoolismo (Vendruscolo
et al., 2006a). Assim, diferenças na ingestão de diferentes concentrações de
etanol podem depender de genes ou mecanismos biológicos diferentes nos
animais deste sexo. O fator 4, de maneira interessante, replica um resultado já
previamente encontrado por nosso grupo (Hinojosa et al., 2006), relacionando
comportamentos do CA com o TNF, onde o animal que evita mais o centro do
CA é o que permanece mais tempo imóvel no TNF. Assim, nossa hipótese de
que os testes e suas relações não apresentariam os mesmos significados
psicológicos entre os dois sexos, pode ser parcialmente confirmada, pois
diferenças importantes na análise da matriz de correlação e na ACP foram
encontradas entre eles, com as fêmeas revelando um maior grau de
semelhança entre testes de emocionalidade (como o CA, a CBP e o TNF) do
que os machos.
Nossa segunda hipótese era que o QTL Ofil1 estaria presente ao menos
em fêmeas F2 LEW/SHR e, possivelmente, também em machos derivados das
sub-linhagens brasileiras, pois no trabalho de Ramos et al. (1999), este locus
afetava fêmeas derivadas de sub-linhagens LEW e SHR francesas. A primeira
137
análise de QTL realizada no presente estudo revelou cinco regiões
cromossômicas significativamente associadas com comportamentos
relacionados á ansiedade/emocionalidade e ao consumo de etanol. Mas este
resultado foi encontrado somente em machos, o que não corrobora totalmente
nossa hipótese inicial. A Tabela 8 demonstra que estas regiões afetam: a
locomoção central e a defecação no CA; a locomoção no compartimento
branco e o tempo no compartimento preto da CBP e o consumo de etanol
forçado, todos no modelo livre. No modelo aditivo, a locomoção periférica no
CA e no modelo dominante o tempo no compartimento branco da CBP também
forneceram QTL significativos. Destes todos, os três QTL mais significativos
foram encontrados no teste do CA e da CBP utilizando-se o modelo livre e,
com exceção daquele encontrado para a locomoção central (Ramos et al.,
1999), todos os outros são inéditos na literatura.
O resultado, a princípio surpreendente, de Ofil1 ter efeito em machos
neste estudo, pode ser parcialmente explicado através de alguns estudos já
publicados na literatura. Por exemplo, Mormède et al. (2002), através de uma
estratégia baseada em seleção por marcadores moleculares, já tinham
previamente sugerido que o efeito do QTL Ofil1 poderia ser encontrado nos
animais de ambos os sexos. Por outro lado, cabe ressaltar que Vendruscolo et
al. (2006a), com uma técnica parecida, sugeriram que este efeito seria mesmo
somente observado em fêmeas. Deste modo, podemos observar que a região
genômica em questão é realmente importante para os comportamentos
relacionados à emocionalidade e que, apesar da inconsistência em alguns
trabalhos, ela pode estar afetando os dois sexos. Entretanto, nenhum destes
138
dois trabalhos citados anteriormente utilizou uma técnica de mapeamento
genômico, como a que foi realizada no presente estudo.
A técnica de QTL nos dá a vantagem de repetir com mais fidelidade o
estudo original de Ramos et al. (1999). Além disso, nós utilizamos aqui o dobro
de animais do que este último, o que deve ter aumentado o poder de detecção
estatística de um QTL (Flint et al., 2005). Assim, nós não podemos descartar
que no estudo prévio de Ramos et al. (1999), a ausência do efeito do QTL em
machos possa se tratar de um resultado falso negativo e que, mesmo naquele
estudo, com um maior número de animais, os efeitos de Ofil1 seriam também
observados em machos. De fato, Crusio (2004) sugeriu que um baixo número
de animais utilizados em uma análise de QTL pode dificultar o aparecimento de
regiões associadas ao fenótipo, sendo que este problema torna-se ainda maior
para fenótipos com herdabilidade em torno de 10-25%, que é o valor
normalmente encontrado em estudos de características comportamentais.
Como visto na Tabela 8, o sentido do efeito dos alelos no QTL Ofil1 é
invertido, ou seja, os animais F2 que apresentam maior locomoção central são
os que têm alelos LEW nesta região genômica. O contrário é verificado com os
animais das linhagens puras, pois animais LEW são os que apresentam
menores índices de locomoção central (Ramos et al., 1997; Izídio et al.,
2005b). Este resultado, aparentemente contraditório, já era esperado, pois o
estudo prévio que identificou Ofil1 nestas linhagens já tinha relatado este efeito
(Ramos et al., 1999). Vários QTL de efeito contrário ao esperado têm sido
relatados na literatura (Caldarone et al., 1997; Wehner et al., 1997; Mogil et al.,
1997; Kóvacs et al., 1997; Moisan et al., 2002; Llamas et al., 2005; Silva et al.,
2007), sugerindo que este fenômeno não é raro. De fato, como estas
139
características são quantitativas, elas dependem de muitos genes diferentes e,
mesmo que uma linhagem apresente um fenótipo “alto”, ela poderá ter alguns
alelos “baixos” que vão contrabalançar a característica. Isto se torna ainda mais
comum quando o estudo é realizado com duas linhagens que não foram
previamente selecionadas para a característica em estudo, como é o presente
caso. Como neste estudo nós focamos no cromossomo 4 apenas, outros QTL
poderiam estar presentes ao longo do genoma onde alelos do tipo LEW
diminuiriam a locomoção central. Aliás, Ramos et al. (1999) já sugeriram que
no cromossomo 7 do rato existe um QTL que influencia comportamentos
relacionados à ansiedade e tem os alelos na população F2 indo no mesmo
sentido do verificado nas linhagens parentais. Estudos futuros, utilizando o
mesmo DNA já usado no presente estudo, poderão também verificar a
presença deste ou de outros QTL contribuindo para a locomoção central nas
populações LEW e SHR brasileiras ao longo de outros cromossomos.
O QTL Ofil1 pode também ser dependente de interações epistáticas com
outros loci. Como no nosso estudo o QTL foi detectado a partir do estudo de
uma população F2, nós não podemos descartar que esta região genômica
esteja mascarada por outros loci nas linhagens parentais. Além do mais, esta
hipótese é bastante provável, dada a influência excepcionalmente forte deste
QTL. A porcentagem de variância explicada por Ofil1 no estudo prévio de
Ramos et al. (1999) foi estimada em 50,4% da variabilidade total (com um lod
score de 7,22), o que o colocaria como um dos QTL mais fortes já encontrado
em ratos. Como pode ser observado na Figura 11, parecem existir dois picos
distintos para a locomoção central no CA. Entretanto, o intervalo de confiança
através do método de drop-off e o método de bootstrap não nos permitem, com
140
o número atual de animais, confirmar a existência de outro QTL significativo,
além de Ofil1, para a locomoção central no CA.
Se, por um lado, o efeito de Ofil1 em machos confirma e amplia os
dados a respeito desta importante região genômica na regulação de
comportamentos relacionados à emocionalidade, por outro, a falta de efeito de
Ofil1 em fêmeas levanta alguns questionamentos. Ramos et al. (1999)
mostraram em seu estudo prévio que o efeito de Ofil1 na locomoção central do
CA estaria presente somente em fêmeas netas de avós LEW, mas não nas
netas de avós SHR. Baseado nesta informação, no presente estudo, nós
utilizamos somente fêmeas LEW (que foram cruzadas com machos SHR) no
intercruzamento original que deu origem aos animais F1 e posteriormente aos
F2. Conseqüentemente, nós esperávamos que o QTL para a medida
locomoção central no CA fosse também, e principalmente, ser encontrado nas
fêmeas. Como já comentado, esta hipótese não se confirmou e alguns pontos
podem ser levantados para explicar a ausência deste QTL em fêmeas neste
estudo.
O primeiro deles, sugere que fatores ambientais idiossincráticos a cada
um dos estudos podem ter contribuído nas diferenças de expressão do QTL
(Chesler et al., 2002; van der Staay e Steckler, 2002; Würbel, 2002; Wahlsten
et al., 2003; Bell et al., 2006a; b). Por exemplo, em um importante trabalho,
Crabbe et al. (1999) mostraram que mesmo com grandes esforços para
padronizar o ambiente de laboratório ou a situação de teste, os resultados de
testes comportamentais entre diferentes laboratórios podem não ser
consistentes. Naquele estudo, as linhagens de camundongos A/J e
129/SvEvTac, quando comparadas uma com a outra, demonstraram maior ou
141
menor resposta locomotora para a cocaína, dependendo do laboratório onde
foram testadas, apesar dos fatores ambientais terem sido rigorosamente
controlados. Mesmo em humanos, mostrou-se que alguns genes podem
aumentar a prevalência de transtornos afetivos somente quando combinados
com contextos ambientais específicos (Caspi et al., 2003; Gordon e Hen,
2004). Assim, estes dados revelam que sutis variações ambientais não
controladas entre e dentro de laboratórios, podem influenciar estudos
comportamentais, farmacológicos e genéticos.
O segundo ponto é que podem existir divergências genéticas entre as
sub-linhagens LEW e SHR brasileiras e francesas. Estudos filogenéticos
recentes indicam que os animais LEW e SHR estão entre as linhagens com
maior diversidade genética entre as diferentes populações espalhadas pelo
mundo (The Star consortium, 2008). Ou seja, existem hoje mais de 15 sub-
linhagens de animais LEW e mais de 25 de SHR (Rat genome database,
2008). Acredita-se que a causa desta grande divergência genética pode ter
origem na distribuição dos animais para diferentes laboratórios antes deles
estarem completamente isogênicos. Além disso, ao longo das gerações, os
animais podem acumular mutações que os tornam diferentes das suas
populações originais de onde foram derivados. Por exemplo, alguns estudos
demonstram diferenças comportamentais entre sub-linhagens de ratos
provenientes de diferentes lugares (Glowa et al., 1994; Rex et al.,1996; Okuda
et al., 2002). Mesmo em sub-linhagens LEW e SHR, algumas diferenças no
campo de pesquisa do estresse já foram relatadas (Glowa et al., 1994; Stöhr et
al., 1999), alertando-nos para a importância deste fator. Ou seja, estas
observações indicam que, ao menos para algumas linhagens isogênicas, o uso
142
de diferentes sub-linhagens pode ter um efeito significativo no resultado e na
reprodutibilidade dos experimentos. Além disso, dados recentes de nosso
laboratório ainda não publicados, com linhagens semi-congênicas derivadas de
LEW e SHR, sugerem que a região de Ofil1 pode ser efetiva apenas em
machos.
Por fim, outro ponto que poderia ter causado a falta de efeito do QTL
Ofil1 nas fêmeas do presente estudo, são as influências de fatores hormonais.
Sabe-se que o ciclo estral das fêmeas tem influência nos comportamentos
relacionados à ansiedade no LCE (Mora et al., 1996), fazendo até mesmo com
que tratamentos farmacológicos tenham resultados ansiolíticos ou
ansiogênicos dependendo da fase em que as fêmeas são testadas (Díaz-Véliz
et al., 1997). Maguire et al. (2005) mostraram que as camundongas testadas no
LCE durante o diestro foram menos ansiosas do que aquelas testadas no estro,
sendo que este resultado poderia estar relacionado à super-expressão da
subunidade δ dos receptores GABAa no diestro destas fêmeas. Alguns
pesquisadores também sugerem que o ciclo estral das fêmeas pode influenciar
comparações comportamentais no teste do CA, e que estas influências
parecem ser genótipo-específicas (Meziane et al., 2007). Assim, a possível
influencia dos fatores hormonais na expressão de Ofil1 também foi investigada
neste trabalho e será posteriormente discutida nesta seção.
Como pode ser observado no estudo de Ramos et al. (1999), a parte da
curva significativa de Ofil1 compreendia uma grande região genômica
localizada entre os marcadores D4RAT37 e D4MGH11 (um intervalo de
aproximadamente 78Mb). No presente estudo, provavelmente, devido ao maior
número de animais F2 utilizados, a parte da curva que excedeu o limite de
143
significância foi reduzida para cerca de 38Mb (Figura 14). Entretanto, a
porcentagem da variância total explicada pelo QTL que era de 50,4% Ramos et
al. (1999) caiu para 14% no presente estudo. Apesar desta redução parecer, a
princípio, diminuir a importância de Ofil1, o valor de 14% ainda é considerado
alto. Por exemplo, Flint et al. (2005) revisaram diversos estudos de QTL para
fenótipos comportamentais e fisiológicos e demonstraram que a maioria deles
tem um pequeno efeito, contribuindo com aproximadamente 6% da variância
fenotípica total. De igual maneira, utilizando camundongos heterogêneos,
Valdar et al. (2006) identificaram 843 QTL para uma grande variedade de
fenótipos. Destes, apenas 10 tinham efeitos maiores do que 5%, enquanto que
109 apresentavam efeitos menores do que 2%.
A redução do tamanho da região genômica de Ofil1 nos proporcionou,
com a ajuda de algumas páginas disponíveis na internet, realizar a construção
de um mapa de homologia genética entre ratos, camundongos e humanos.
Estas comparações são importantes, pois o estudo de regiões ortólogas em
diferentes espécies poderá revelar genes com uma grande relevância na
etiologia dos transtornos humanos.
(http://www.rgd.mcw.edu/VCMAP/mapview.shtml,
http://www.informatics.jax.org/, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,
http://www.ensembl.org; http://ratmap.ims.u-tokyo.ac.jp/cgi-
bin/comparative_home.pl).
Desta maneira, podemos observar que a região genômica que contem o
intervalo de confiança de 96,8% do QTL Ofil1 do presente estudo (de 85Mb até
130Mb), está contida inteiramente no cromossomo 6 dos camundongos (55Mb
até 92Mb) e nos cromossomos 2, 3, 4 e 7 dos humanos. Estes dados são
144
condizentes com o que está publicado na literatura (Rat Genome Sequencing
Project Consortium, 2004; Figura 27).
Figura 27 - Os cinco primeiros cromossomos do rato (eixo x) e sua homologia
com os cromossomos humanos (coluna esquerda) e com os cromossomos do
camundongo (coluna da direita). O tamanho dos cromossomos está
representado em megabases (eixo y). A região de Ofil1 no cromossomo 4 está
marcada pelos traços pretos. A seta aponta o cromossomo 4 do rato. Figura
adaptada de Rat Genome Sequencing Project Consortium (2004).
Segundo o RGD (http://rgd.mcw.edu/), existem um total de 18 QTL
mapeados no genoma do rato e 20 no genoma do camundongo para
145
comportamentos relacionados à ansiedade. Destes todos, Ofil1 é o QTL com o
maior lod score (7,22) e o único que está mapeado no cromossomo 4 do rato.
Ainda segundo o RGD, três QTL para comportamentos relacionados à
ansiedade estão mapeados no cromossomo 6 do camundongo (o cromossomo
que corresponde a grande parte do cromossomo 4 do rato). Eles são
denominados Aaj2_m (Chr06: 7Mb; 4.9 cM); Aaj3_m (Chr06: 116Mb; 52.5 cM;)
e Axtq2_m (Chr06: 7Mb; 4.9 cM). Todos estes QTL foram mapeados para
comportamentos exibidos no CA ou na CBP (Singer et al., 2004; 2005). Porém,
estes QTL estão localizados na parte proximal do cromossomo 6 do
camundongo e fora do trecho correspondente ao intervalo de confiança de Ofil1
encontrado no presente estudo em ratos. Ou seja, aparentemente, os genes
responsáveis pelos QTL encontrados no cromossomo 6 de camundongos não
são os mesmos responsáveis pelos efeitos de Ofil1 em ratos. Na verdade, a
partir de alguns estudos publicados na literatura, podemos perceber que, em
camundongos, o cromossomo 1 é um forte candidato a conter genes que
afetem comportamentos relacionados à esquiva/aproximação do centro do CA
(Henderson et al., 2004; Yalcin et al., 2004; Singer et al., 2005; Willis-Owen e
Flint, 2006). Entretanto, esta região do genoma de camundongos não está
contida no cromossomo 4 em ratos (Figura 27).
Em humanos, diversos trabalhos já publicados encontraram regiões
genômicas que podem conter genes importantes para as psicopatologias
abordadas no presente estudo. Alguns destes localizam-se em regiões
homólogas ao cromossomo 4 dos ratos. Por exemplo, existe no cromossomo 2
de humanos um locus de predisponibilidade para o desenvolvimento de
depressão em mulheres (Zubenko et al., 2002). Ainda neste mesmo
146
cromossomo, outro locus de predisponibilidade para a comorbidade entre
depressão e alcoolismo já foi encontrado (Nurnberger et al., 2001). Do mesmo
modo, no cromossomo 4, um locus que influencia a tentativa de suicídio em
pacientes com depressão maior (Zubenko et al., 2004) e um outro relacionado
à ansiedade, também já foram mapeados (Middeldorp et al., 2008). No
cromossomo 7, existe um QTL, exclusivo de mulheres, para medidas de
depressão e ansiedade (Nash et al., 2004), confirmando a importância de
fatores ligados ao sexo na etiologia da ansiedade e da depressão. Além deste,
outros estudos já revelaram loci para a depressão (Nurnberger et al., 2001) e
transtorno de pânico (Middeldorp et al., 2008) no cromossomo 7. Por fim, no
cromossomo 3 um locus de susceptibilidade para transtornos bipolares
(Badenhop et al., 2002) e outro para o risco de agarofobia (Gelernter et al.,
2001) já foram descritos.
Nossa terceira hipótese era que a região genômica de Ofil1 influenciaria
comportamentos ligados à emocionalidade e ao consumo de etanol,
apresentando, assim, um efeito pleiotrópico. Esta hipótese se baseava no fato
de que Vendruscolo et al. (2006) já haviam sugerido uma possível participação
de Ofil1 nos comportamentos relacionados ao consumo de etanol. Além disso,
no cromossomo 4, próximo à região onde Ofil1 localiza-se, outros três QTL’s
para características relacionadas à emocionalidade e ao consumo de etanol
foram mapeados (Bice et al., 1998; Carr et al., 1998; Terenina-Rigaldie et al.,
2003a; Potenza et al., 2004). Contudo, como foi discutido anteriormente, os
comportamentos relacionados à ansiedade e ao consumo de etanol parecem
ser independentes nestes animais F2, não dando suporte a esta hipótese. Os
resultados da matriz de correlação demonstraram, apenas em machos,
147
algumas poucas correlações significativas entre os testes do CA-CBP e o
consumo de etanol. Na maioria dos casos, os animais menos ansiosos foram
os que beberam maiores quantidades de etanol, ou seja, uma correlação
negativa entre estes comportamentos. Além disto, na ACP, nenhuma medida
dos testes de “ansiedade” ficou no mesmo fator daquelas relacionadas ao
consumo de etanol.
Em relação a análise de QTL, na região genômica de Ofil1 não foram
encontrados QTL’s significativos para o consumo de etanol, apesar de que
alguns QTL sugestivos estão ali presentes. A Tabela 8 demonstra que o QTL
pleiotrópico significativo encontrado na CBP localiza-se perto do marcador
D4MGH11 e, perto dele, há um QTL para consumo de etanol forçado. Porém,
os outros QTL significativos não são pleiotrópicos, ou seja, não apresentam
efeitos simultâneos sobre diferentes medidas comportamentais. Desta maneira,
o conjunto de resultados indica que os genes que influenciam os
comportamentos relacionados à emocionalidade e ao consumo de etanol não
devem ser os mesmos. Ou ainda, em uma explicação alternativa, que o efeito
deles seja mais fraco sobre as medidas de consumo de etanol do que sobre as
medidas de ansiedade/emocionalidade.
A quinta hipótese desta primeira estratégia experimental, era que
existiriam QTL no cromossomo 4 do rato influenciando outras medidas
comportamentais de emocionalidade além da locomoção central no CA. Como
vemos nos resultados, outros quatro QTL significativos (além do Ofil1 para
locomoção central) foram encontrados em machos, sendo que todos eles são
inéditos em estudos com as linhagens LEW e SHR (Figura 11-12 e Tabela 8).
O primeiro deles influencia a defecação no CA. Sabe-se que o teste do CA foi
148
proposto originalmente por Calvin Hall (1934) proporcionando duas medidas de
emocionalidade, negativamente relacionadas, a locomoção e a defecação. Ou
seja, um animal mais “ansioso” no CA defecaria mais e se locomoveria menos
(Ramos e Mormède, 1998; Henderson et al., 2004; Hinojosa et al., 2006). Os
trabalhos publicados na literatura nem sempre corroboram esta visão (Archer,
1973), mas na atualidade, diversas outras medidas comportamentais são
obtidas em um teste do CA (Archer, 1973; Walsh e Cummins, 1976; Prut e
Belzung, 2003; Ramos e Mormède, 2006). Este QTL se localiza cerca de 20 cM
distante de Ofil1, mas está numa posição genômica muito próxima onde a α-
sinucleína está mapeada. Como vemos na Tabela 9, neste QTL os alelos dos
animais “ansiosos” LEW estão aumentando a defecação.
Alguns QTL já foram descritos para este medida comportamental. Por
exemplo, Flint et al. (1995), utilizando as linhagens de camundongos DeFries H
e L, sugeriram que os cromossomos 1 e 12 de camundongos conteriam regiões
genômicas importantes para a defecação no CA. Além deste, outros estudos
com estes mesmos camundongos sugeriram QTL nos cromossomos 1, 7, 14 e
X para esta medida comportamental (Turri et al. 2001a; b; Henderson et al.,
2004). Singer et al. (2005), utilizando um painel de linhagens com substituições
cromossômicas (derivadas das linhagens de camundongos A/J e C57BL/6J),
sugeriram que os cromossomos 6 e 17 também influenciariam a defecação no
CA. De maneira interessante, parte do cromossomo 4 em ratos corresponde ao
cromossomo 6 dos camundongos, sugerindo que alguns genes reguladores
desta característica podem estar presentes nas duas espécies. Entretanto,
poucos estudos relataram em ratos algum QTL para a defecação no CA. Por
exemplo, Fernández Teruel et al. (2002), utilizando as linhagens de ratos
149
Romanos High e Low Avoidance, identificaram QTL para defecação nos
cromossomos 3, 6, 19 e X.
O segundo QTL inédito encontrado no presente estudo influencia a
locomoção periférica no CA. Este QTL foi encontrado utilizando-se o modelo
aditivo e foi o QTL significativo com o menor LRS em machos. Nele, os alelos
dos animais LEW aumentam a locomoção dos animais F2 na área periférica do
aparato (Tabela 8). Tradicionalmente, esta medida comportamental é vista
como um índice de locomoção, mas como já discutido anteriormente, ela pode
ser mais complexa do que aparenta (Paulus e Geyer, 1993; Ramos et al.,
2003). No presente estudo, por exemplo, a locomoção periférica correlacionou-
se positivamente com a locomoção central, em ambos os sexos (Tabelas 4-5).
Alguns QTL já foram descritos para a atividade locomotora no CA em
camundongos. Por exemplo, Takahashi et al. (2008), utilizando linhagens
consômicas, mapearam um locus para atividade locomotora no CA no
cromossomo 6 de camundongos. Além deste, Turri et al. (2001a), utilizando os
camundongos DeFries H e L, também demonstraram QTL envolvidos com a
atividade locomotora no CA nos cromossomos 1, 4, 7, 12 e 15.
O terceiro QTL apresentou um efeito pleiotrópico sobre três medidas
comportamentais diferentes do teste da CBP. Neste QTL os alelos dos animais
LEW, contrariamente ao esperado, aumentam o tempo e a locomoção na área
branca e aversiva e diminuem o tempo gasto no compartimento preto (efeito
transgressivo) (Tabela 8). Estas medidas comportamentais são vistas como
índices de emocionalidade neste aparato. Assim, tradicionalmente, ratos ou
camundongos que estão menos “ansiosos” permanecem mais tempo no
compartimento branco e luminoso (Crawley, 1981; Costall et al., 1989; Izídio et
150
al., 2005b). Turri et al. (2001a), utilizando os camundongos DeFries,
identificaram quatro QTL para a atividade no lado escuro da CBP nos
cromossomos 1, 4, 12 e X. Neste mesmo estudo, os autores também
mapearam QTL nos cromossomos 1, 11, 14, 15 e 18 para o tempo e atividade
no compartimento luminoso (Turri et al., 2001a). Ainda com estas linhagens de
camundongos, já foram identificados QTL para a atividade e tempo gasto no
compartimento escuro nos cromossomos 1, 4, 14, 15, 18 e X (Henderson et al.,
2004), assim como, para o tempo gasto no compartimento branco nos
cromossomos 1, 4, 14, 15, 16 e 18 (Flint et al., 1995; Turri et al., 2001b). Estes
estudos citados anteriormente, também sugerem que o cromossomo 1 de
camundongos tem uma grande relevância para comportamentos relacionados
à ansiedade na CBP, assim como no CA (Henderson et al., 2004; Yalcin et al.,
2004; Singer et al., 2005; Willis-Owen e Flint, 2006).
Por fim, o quarto QTL inédito foi encontrado para o consumo de etanol
forçado (10%). Neste, os alelos LEW aumentaram o consumo de etanol nos
animais F2 (Tabela 8). Alguns QTL, ao longo do cromossomo 6 do
camundongo (correspondente ao cromossomo 4 em ratos), estão relatados na
literatura como afetando o consumo e a preferência por esta droga (Vadasz et
al., 2007; Hitzemann et al., 2008; Tabakoff et al., 2008). Entretanto, em ratos,
está descrito o QTL que talvez tenha a maior importância para o presente
estudo (Terenina-Rigaldie et al. 2003b). Naquele trabalho, os autores
encontraram um QTL significativo no cromossomo 4, próximo ao Ofil1, que
afetava a livre-escolha entre água e etanol (5%) em ambos os sexos. Ainda no
mesmo trabalho de Terenina-Rigaldie et al. (2003b), outro QTL afetando a livre-
escolha entre etanol 10% e água com efeito sugestivo foi encontrado no
151
cromossomo 4. O efeito deste QTL era invertido quando comparado com as
linhagens parentais. De maneira interessante, o QTL significativo e o sugestivo
estavam localizados aproximadamente na mesma região onde foi encontrado
Ofil1. Torna-se, então, importante relembrar que Terenina-Rigaldie et al.
(2003b) utilizaram as linhagens de ratos HEP e WKY. Sabe-se que os ratos
SHR derivam da mesma população de onde os ratos WKY surgiram e,
portanto, estas duas linhagens podem apresentar uma grande similaridade
genética. Além disso, outro trabalho do mesmo grupo mostrou diferenças
relacionadas à emocionalidade entre as linhagens HEP e WKY (Terenina-
Rigaldie et al., 2003a), sugerindo um pleiotropismo do QTL em medidas de
emocionalidade e consumo de etanol. Como visto e discutido no presente
estudo, a hipótese de uma ligação genética entre “ansiedade” e “alcoolismo”
não pode ser completamente corroborada.
Então, devido ao conjunto de dados expostos nos parágrafos anteriores,
podemos concluir que a quinta hipótese deste estudo foi confirmada, pois
realmente existem no cromossomo 4 dos ratos F2 derivados de LEW e SHR
alguns QTL para outras medidas comportamentais de emocionalidade, além da
locomoção central. Os diferentes QTL, encontrados na primeira parte do
presente estudo, podem ser, de forma resumida, representados na Figura 28.
152
Figura 28 – Regiões genômicas associadas com o fenótipo, na primeira
análise de QTL. A barra horizontal representa os 111cM do cromossomo 4
(0cM na esquerda e 111cM na direita). As regiões coloridas representam uma
estimativa da área que está acima do limite de significância para cada QTL
(modelo livre). Em azul, a defecação no CA; em verde, os dois picos para a
locomoção central; e em vermelho, uma grande região que contem os QTL
para tempo no compartimento preto e locomoção no compartimento branco da
CBP e consumo de etanol forçado.
Além dos QTL significativos, alguns outros com LRS (likelihood ratio
statistic) sugestivos também foram encontrados (Tabela 9). Segundo Flint et al.
(2005), são necessários centenas de animais F2 para se encontrar QTL de
efeito fraco (que contribuam com 5% do efeito genético). Neste estudo, foram
utilizados um total 193 animais F2 e, portanto, regiões genômicas contendo
genes de menor efeito podem não atingir níveis de significância. Contudo,
estas regiões são igualmente importantes, já que a natureza dos
comportamentos complexos é quantitativa e dependente de vários genes
(Complex Trait Consortium, 2003). De maneira interessante, quatro QTL nos
machos apresentaram o nível sugestivo para o consumo de etanol (2,5%)
próximo ao marcador D4RAT164; (5 e 10%) próximo a D4RAT151; (10%)
153
próximo a D4MIT16 e (20%) D4RAT206 (Tabela 9). De maneira interessante, a
região genômica onde está localizada o marcador D4RAT164 fica próxima ao
QTL encontrado no estudo de alcoolismo com os ratos P e NP (Carr et al.,
1998; Bice et al., 1998), sugerindo que o modelo LEW/SHR também pode
apresentar os mesmos genes que influenciam o consumo de etanol, apesar de
aparentemente eles não participarem da regulação de comportamentos
emocionais.
Como comentado brevemente acima, fatores hormonais poderiam ter
causado a ausência do efeito de Ofil1 em fêmeas (sexta hipótese). Deste
modo, nós produzimos e testamos mais 96 fêmeas F2 LEW/SHR para a
realização de uma nova análise de QTL, levando em conta a fase do ciclo
estral em que estas fêmeas estavam no momento do teste. Elas foram testadas
no CA e CBP, os dois testes comportamentais que apresentaram os QTL mais
significativos em machos, na primeira análise de QTL. Os resultados dos testes
comportamentais do CA e CBP sugerem que existem importantes diferenças
comportamentais nestes aparatos entre as fêmeas F2 que estavam em diestro-
proestro ou estro-metaestro. Podemos observar que as fêmeas no diestro-
proestro são as que exibem menores níveis de comportamentos relacionados à
ansiedade no teste do CA (Figura 15). Estes dados estão de acordo com os
comportamentos observados em alguns estudos e o sugerido papel da
progesterona nas ratas. Por exemplo, sabe-se que no proestro os níveis de
progesterona estão elevados (Zuluaga et al., 2005) e sugere-se que ela
apresente uma diminuição dos comportamentos relacionados à ansiedade nas
fêmeas (Díaz-Véliz et al., 1997; Frye e Wolf, 2002; Gómez et al., 2002). Além
disso, vemos a partir de dados publicados, que as fêmeas no proestro
154
demonstram uma redução nos comportamentos relacionados à ansiedade
(evidenciado pelo aumento de tempo gasto nos braços abertos do LCE) e à
depressão, devido a baixa imobilidade no TNF (Contreras et al., 1998; Frye et
al., 2000). Alguns estudos também sugerem que possa existir um baixo nível
de “ansiedade” no diestro, sendo que o resultado poderia estar relacionado à
super-expressão da subunidade δ dos receptores GABAa nesta fase (Maguire
et al., 2005).
Nós podemos observar, a partir da Tabela 10 e da Figura 16, que as
fêmeas nas fases diestro-proestro apresentam um QTL para a locomoção
central no CA na mesma região de Ofil1. Este QTL, apesar de ser apenas
sugestivo, também é transgressivo (alelos LEW aumentam a locomoção central
ao invés de diminuir) como Ofil1, o que reforça as chances de que se trate do
mesmo QTL dos machos e do mapeado por Ramos et al. (1999). De maneira
interessante, as fêmeas no estro-metaestro não apresentam este QTL para a
locomoção central na mesma região genômica. Sabe-se que o ciclo estral das
fêmeas tem duração de 4 a 5 dias e que a fase de maior duração temporal é o
diestro, que dura aproximadamente 57h (Hebel e Stromberg, 1986). Portanto,
em um estudo aleatório, onde nenhum controle do ciclo estral seja realizado,
existe uma maior probabilidade de que as fêmeas encontrem-se em diestro-
proestro (~69h de duração) do que em estro-metaestro (~33h de duração). A
ausência deste QTL em fêmeas na primeira análise de QTL deste estudo,
talvez possa ser explicada pela presença de diferentes fases do ciclo estral
naquela população ou da sincronia da maioria das fêmeas no estro-metaestro.
Como visto na figura 17, quando levamos em conta todas as fêmeas (primeira
e segunda análises de QTL juntas), sem considerar o ciclo estral, o QTL não
155
atinge nem ao menos o limiar sugestivo. Por outro lado, o aparecimento do
QTL para a locomoção central em fêmeas no estudo de Ramos et al. (1999),
poderia ser explicado pela provável presença de uma maioria de fêmeas em
diestro ou proestro o que pode, casualmente, não ter ocorrido aqui. Assim,
devido aos dados obtidos nesta segunda análise de QTL, a hipótese de que a
fase do ciclo estral poderia afetar a expressão de Ofil1 é, ao menos em parte,
corroborada. Entretanto, apesar das diferenças comportamentais e de
expressão de Ofil1 entre os grupos utilizados, podemos observar a partir das
tabelas 10 e 11, que em ambas as fases, na segunda análise de QTL, o efeito
de Ofil1 foi transgressivo, o que não ocorreu na primeira análise. Outros
estudos serão necessários para confirmar definitivamente a influência da fase
do ciclo sobre Ofil1 e até mesmo verificar se existe uma fase específica onde
os alelos provenientes dos animais LEW não aumentem a locomoção central. É
interessante observar que, dos três QTL significativos encontrados nas fêmeas
agrupadas por fase do ciclo estral, ao menos dois deles corroboram totalmente
resultados obtidos com os ratos machos e apontam a extremidade do
cromossomo 4, próximo a D4RAT206, como um importante e novo QTL para
emocionalidade medida na CBP em ratos, onde alelos LEW aumentam os
níveis de exploração do ambiente branco e aversivo.
Com o passar do tempo e com os avanços das técnicas e
procedimentos, o genoma está se tornando cada vez melhor caracterizado
possibilitando a identificação de QTL com menores efeitos. Por isso, o maior
desafio da genética moderna é agora passar da identificação de QTL, que são
regiões normalmente grandes, ao (s) seu (s) gene (s) ou até mesmo aos
nucleotídeos (QTN) responsáveis pelo QTL. Dos cerca de 2000 QTL
156
identificados até o momento em roedores, estima-se que somente 1% dos
genes tenham sido clonados (Willis-Owen e Flint, 2006), um número que
demonstra que ainda existe uma grande lacuna no caminho QTL-gene.
Entretanto, o emprego de diferentes estratégias complementares de pesquisa
com o intuito de estreitar a região do QTL de interesse é, na atualidade, muito
promissor. Por exemplo, pode-se utilizar a combinação de diferentes mapas
genéticos (Belknap e Atkins, 2001), a identificação de regiões sintênicas entre
roedores e humanos (Watanabe et al., 1999), a análise de haplótipos (DiPetrillo
et al., 2005), assim como a análise de micro-arrays que pode identificar
diferenças na expressão gênica em tecidos específicos (Chesler et al., 2005;
Letwin et al., 2006; Le Niculescu et al., 2007).
Assim, no presente momento, parecemos estar vivendo uma nova era
dentro da genética onde os conhecimentos gerados a partir de estudos de QTL
em roedores vêm sendo aplicados em humanos com o intuito de se aprofundar
o conhecimento de algumas patologias. Por exemplo, Yalcin et al. (2004)
identificaram um gene chamado Rgs2, um regulador da proteína G, que era o
responsável por um QTL localizado no cromossomo 1 do camundongo e que
afetava comportamentos relacionados à ansiedade. Posteriormente, Smoller et
al. (2008) demonstraram que este mesmo gene também está associado à
ansiedade humana. Outras tentativas vêm sendo realizadas a partir da
identificação de novos QTG (o gene responsável pelo efeito de um QTL) em
roedores. Contudo, a especificidade de cada um dos organismos envolvidos
(ratos, camundongos, humanos) e a divergência filogenética, ao menos
naqueles separados por um grande tempo evolutivo, torna estes estudos ainda
bastante desafiadores (Fullerton et al., 2008).
157
5.2 Segunda estratégia experimental
Como comentado brevemente no começo desta discussão,
paralelamente ao andamento da primeira estratégia experimental, foi realizada
uma outra abordagem com o intuito de se avaliar alguns genes que poderiam
explicar o efeito de Ofil1. Sabe-se que muitos genes contribuem para os
comportamentos relacionados à ansiedade, à depressão e ao alcoolismo.
Enquanto que a estratégia de análise de QTL define regiões genômicas
importantes, mas que podem conter diversos genes diferentes influenciando a
característica, outras abordagens têm ganhado força no sentido de se
descobrir quais são estes genes. Em uma destas abordagens, pode-se tentar
avaliar genes candidatos que estejam já mapeados naquela região
cromossômica e que estejam descritos na literatura como potencialmente
relacionados à característica fenotípica em estudo. Estes genes podem ser
analisados comparativamente entre as linhagens parentais (as que deram
origem ao QTL) através: da análise de DNA (Sourthern Blot, análise de SNP,
seqüenciamento gênico), da expressão de RNA mensageiro (RNAm)
(Microarrays, Real-Time RT-PCR, Northern Blot, Total gene expression
analysis (TOGA)) ou da quantificação da forma final da proteína (Western Blot,
imunohistoquímica).
No presente estudo, as linhagens LEW e SHR apresentaram diferenças
comportamentais nos testes do LCE e CBP, com a linhagem LEW sendo a
considerada mais “ansiosa” (Figura 18 e 20). Apesar da aparente solidez deste
modelo genético animal, alguma variabilidade entre diferentes estudos têm sido
observada. Por exemplo, diferenças entre as linhagens na % de entradas nos
158
braços abertos, um dos principais índices de ansiedade do LCE, foram
algumas vezes, mas não sempre, significativas em machos ou fêmeas,
dependendo do estudo (Ramos et al., 1997; 1998; 2002; Vendruscolo et al.,
2003). Nos testes de consumo de etanol, os resultados obtidos (Figura 21)
foram ao encontro da hipótese de uma comorbidade ou correlação positiva
entre “ansiedade” e “alcoolismo” (Stewart et al., 1993; Colombo et al., 1995;
Spanagel et al., 1995; Möller et al., 1997). Entretanto, este ponto é bastante
controverso, pois diversos estudos têm mostrado a falta desta correlação em
humanos e roedores (Tuominen et al., 1990; Viglinskaya et al., 1995;
Overstreet et al., 1997; Fernández-Teruel et al., 2002; Henniger et al., 2002; Da
Silva et al., 2004; 2005). Dentre estes Da Silva et al. (2004) e (2005) utilizaram
as linhagens LEW/SHR em testes de consumo de etanol, as mesmas que
foram estudadas aqui, e não encontraram a suposta correlação positiva
sugerida no presente estudo. Porém, existem diferenças significativas entre os
protocolos utilizados nestes diferentes estudos como: a duração do
experimento, as concentrações de etanol utilizadas, a presença de um período
de etanol forçado, a utilização de substâncias controles de sabor e o tipo de
gaiola utilizada para avaliação do consumo. Da mesma maneira, Suzuki et al.
(1988) mostraram um maior consumo de etanol em ratos LEW do que em ratos
F344, um resultado que foi o contrário do relatado por Taylor et al. (2006).
Estudos futuros deverão avaliar o papel dos fatores ambientais na regulação do
comportamento de ingestão de etanol nestas linhagens.
Diversos genes estão mapeados na região genômica de Ofil1 no
cromossomo 4 do rato e, destes todos, dois genes aparecem como potenciais
candidatos a explicar este QTL, o gene Snca e o Tac1r. O primeiro deles
159
(Snca) está localizado no braço longo do cromossomo 4 do rato, mais
precisamente na posição 90Mb, codificando para a proteína α-sinucleína. Esta
proteína é expressa ao longo de todo o sistema nervoso central (SNC) e está
em particular abundância nos terminais pré-sinápticos (Mori et al., 2002),
inibindo a tirosina hidroxilase e levando assim a uma redução na síntese de
catecolaminas, dentre elas a dopamina (Perez et al., 2002). Além disso,
sugere-se que a α-sinucleína diminui a atividade do transportador de dopamina
(Wersinger et al., 2003; Wersinger e Sidhu, 2005), levando a uma diminuição
de recaptação. Sabe-se que animais nocaute para a α-sinucleína exibem
menores respostas locomotoras à anfetamina (Abeliovich et al., 2000),
enquanto que animais transgênicos, que super-expressam a α-sinucleína,
apresentam sinais de prejuízo motor associado com um decréscimo nos níveis
de tirosina hidroxilase (Masliah et al., 2000). A α-sinucleína está presente em
grande abundância no hipocampo (Petersen et al. 1999; Adamczyk et al.,
2005), que tem participação conhecida nos transtornos de ansiedade
(Bannerman et al., 2004; Kalisch et al., 2006) e parece estar relacionada com a
etiologia do transtorno de parkinson (McGeer e McGeer, 2008). Apesar da
relação muitas vezes sugerida entre esta proteína e algumas patologias, o
conjunto disponível de resultados sugere que a α-sinucleína pode diminuir a
neurotransmissão dopaminérgica apresentando, assim, um possível efeito
comportamental de interesse clínico. Assim sendo, no presente estudo, nós
avaliamos o possível envolvimento da α-sinucleína, supondo que ela pode ser
um dos responsáveis pelos efeitos comportamentais de Ofil1.
O segundo gene (Tac1r) está mapeado no cromossomo 4 do rato,
codificando para o receptor NK1 da substância P. A substância P é o
160
neuropeptídeo mais abundante e melhor conhecido da classe das neurocininas
no SNC dos mamíferos. Juntamente com seu receptor NK1, a substância P
tem sido alvo de inúmeros estudos farmacológicos, pois existem evidências de
que ela esteja envolvida em processos de dor, inflamação, asma, enxaqueca,
memória e ansiedade (Teixeira et al., 1996; File, 1997; Wahlestedt, 1998;
Kramer et al., 1998; Nikolaus et al., 1999; Saria, 1999). Por exemplo, um
estudo, utilizando substância P injetada i.p indicou um efeito bifásico
(ansiolítico ou ansiogênico) dose-dependente sobre medidas comportamentais
no LCE (Hasenöhrl et al., 1998). O mecanismo pelo qual este neuropeptídeo
atua nas respostas comportamentais de emocionalidade ainda não é
completamente entendido, mas evidências indicam o envolvimento com as
monoaminas e/ou de ações diretas sobre estruturas cerebrais que controlam os
mecanismos emocionais, como a amígdala e o hipotálamo (Kramer et al., 1998;
Stahl, 1999; Saria, 1999). Um dos principais receptores da substância P é o
receptor NK1. Recentemente, alguns estudos têm sugerido que este receptor
possa estar envolvido nos mecanismos neurobiológicos da ansiedade (Varty et
al., 2002; Vendruscolo et al., 2003) e da depressão (Álvaro e Di Fabio, 2007).
Desta maneira, a sétima hipótese deste trabalho seria que os genes da
α-sinucleína ou do receptor NK1 da substância P poderiam estar entre os
responsáveis pelos efeitos de Ofil1. Nós observamos, a partir dos resultados
deste estudo, que os níveis de RNAm da α-sinucleína foram duas vezes maior
no hipocampo (Figura 19a) dos ratos LEW (“ansiosos”; Figura 18 e 20) quando
comparado com os SHR. Nenhuma diferença significativa foi encontrada nos
níveis de RNAm do receptor NK1 no hipocampo (p=0,13) e no hipotálamo
(p=0,05) dos animais LEW e SHR (Figura 19b). Este aumento na expressão
161
gênica do gene Snca foi acompanhado por um aumento de aproximadamente
50% na expressão da proteína α-sinucleína no hipocampo, mas não no
hipotálamo, dos ratos LEW em comparação aos ratos SHR (Chiavegatto et al.,
2008). O resultado negativo com o gene Tac1r não pode nos levar a descartar
totalmente a participação dele nos efeitos comportamentais de Ofil1, pois uma
expressão gênica similar não é, por exemplo, informativa a respeito de
possíveis polimorfismos na seqüência de aminoácidos entre as linhagens. Além
disso, os resultados sugestivos com este gene no hipotálamo podem indicar
uma relevância do mesmo nos comportamentos relacionados à emocionalidade
e ao consumo de etanol. No entanto, nós escolhemos, em um primeiro
momento, continuar com a avaliação do gene candidato Snca que se mostrou
mais promissor nos experimentos iniciais de expressão de RNAm.
De maneira interessante, Chiavegatto et al. (2008) encontraram um SNP
entre as linhagens LEW e SHR na região 3’ não transcrita (+562) do gene Snca
da α-sinucleína. Na atualidade, diversos SNP’s vem sendo descritos em
diferentes genes sendo que alguns podem alterar a expressão do gene (Liang
et al., 2003; Liang e Carr, 2006). Alguns experimentos in vitro sugerem que o
polimorfismo encontrado na posição +562 do gene Snca pode também alterar a
sua expressão. Por exemplo, Chiavegatto et al. (2008) testaram a substituição
da base nucleotídica C ou T na posição +562 do gene Snca em experimentos
de transfecção in vitro. Foram construídos plasmídeos carregando as
seqüências de LEW ou SHR nesta posição gênica. Os construtos foram
transfectados para células PC12 de ratos e a atividade da luciferase foi
comparada entre eles. O construto com a base nucleotídica C na posição +562
do gene Snca (ratos LEW) apresentou atividade da luciferase 91% maior do
162
que o construto com a base nucleotídica T (ratos SHR), um resultado que é
consistente com a maior expressão do gene Snca e da proteína α-sinucleína
no hipocampo dos animais LEW. Entretanto, não existiam indícios de que este
polimorfismo poderia estar influenciando o comportamento in vivo. Para melhor
elucidar esta questão, nós testamos uma população F2 LEW/SHR segregante
no CA, CBP e em um protocolo de consumo de etanol e genotipamos os
animais em relação a este SNP. Os resultados mostraram que os ratos que
continham 2 cópias do alelo com o nucleotídeo C (CC) apresentaram maiores
níveis de locomoção central no CA do que os ratos com duas cópias do alelo T
(TT) (Figura 22a). Além disso, os ratos com o genótipo CC também fizeram
mais locomoção periférica do que os ratos com o genótipo TT (Figura 22b).
Nenhum efeito de genótipo para as medidas da CBP ou de
consumo/preferência ao etanol foi encontrado (dados não mostrados). A
direção desta associação (os alelos C dos animais LEW aumentando ao invés
de diminuindo a locomoção central) é consistente com os estudos prévios
(Ramos et al., 1999; Vendruscolo et al., 2006) e com diversos outros trabalhos
da literatura (Caldarone et al., 1997; Wehner et al., 1997; Mogil et al., 1997;
Kóvacs et al., 1997; Moisan et al., 2002; Llamas et al., 2005; Silva et al., 2007)
que sugerem efeitos inversos de alguns alelos. Estes resultados in vivo
reforçam a hipótese de que o polimorfismo no gene Snca pode participar nas
diferenças comportamentais observadas entre animais LEW e SHR no CA. Por
outro lado, a falta de associação entre o SNP e o consumo de etanol sugere
que este polimorfismo não deve ser um bom candidato para explicar as
diferenças de consumo de etanol.
163
Como comentado anteriormente, a α-sinucleína parece ter um papel na
diminuição da atividade dopaminérgica. De acordo com isto, Chiavegatto et al.
(2008) demonstraram que a dopamina e seus metabólitos parecem estar
diminuídos no hipocampo dos ratos LEW, quando comparados com os SHR. A
razão entre os metabólitos da dopamina e a dopamina (um índice de
recaptação) foi ~2,3 vezes menor no hipocampo dos ratos LEW. No entanto,
isso não ocorre no hipotálamo, onde os níveis de dopamina e de recaptação
são iguais entre as linhagens.
Uma busca no WEB-QTL (www.genenetwork.org) revelou correlações
significativas (p<0,05) entre a expressão de RNAm da α-sinucleína no
hipocampo de linhagens recombinantes BXD de camundongos e diversos
fenótipos que podem estar ligados à emocionalidade. Por exemplo, a atividade
no CA em resposta ao etanol (r= -0,45); a atividade exploratória no holeboard
em resposta a cocaína (r= -0,61); a % de tempo gasto no compartimento claro
da CBP (r= -0,50) e a expressão do transportador de dopamina no nucleus
accumbens (r= -0,55). Todos estes resultados obtidos in silica reforçam o papel
potencial da α-sinucleína nos comportamentos relacionados à emocionalidade
através de mecanismos dopaminérgicos.
Assim, a totalidade destes resultados pode sugerir um modelo
explicativo para a participação, ao menos parcial, da α-sinucleína no
comportamento diferencial destas linhagens no CA. Ou seja, o polimorfismo
encontrado no gene da α-sinucleína, pode causar uma maior expressão deste
gene no hipocampo de ratos LEW, resultando em quantidades maiores da
proteína α-sinucleína. Esta pode estar envolvida na diminuição da recaptação e
liberação de dopamina no hipocampo dos animais LEW. Este papel condiz com
164
a atuação da α-sinucleína descrita na literatura (Perez et al., 2002; Wersinger
et al., 2003; Wersinger e Sidhu, 2005). Cabe ressaltar, que neste trabalho
apenas evidências associativas foram demonstradas e nós não apresentamos
experimentos que comprovem de fato, que aumentos de expressão da α-
sinucleína levam à diminuição da neurotransmissão dopaminérgica.
Além disso, como já comentado anteriormente, a estratégia da análise
de ligação utilizada neste estudo fornece grandes regiões genômicas
envolvidas com o comportamento. Antes de chegarmos ao QTG (quantitative
trait gene), diversos genes candidatos podem ser apontados como os
responsáveis pelo QTL. Por exemplo, além da α-sinucleína e do receptor NK1,
na região de Ofil1 encontram-se mapeados alguns genes interessantes:
Corticotropin realizing hormone receptor 2 (Crhr2) localizado na posição 84Mb;
glutamate receptor, ionotropic, delta 2 (Grid2) em 92Mb; interleukin 12 receptor,
beta 2 (Il12rb2) em 96Mb; glutamate receptor interacting protein 2 (Grip2) em
126Mb; thyrotropin releasing hormone (Trh) em 126Mb. De tal modo, com os
dados levantados pelo presente estudo, nós não podemos afirmar que os
efeitos de Ofil1 sejam devido ao gene Snca da α-sinucleína. Aliás, a
localização exata do pico de Ofil1 encontrado no presente estudo está em torno
de 129Mb, o que tornaria os genes Grip2 (proteína que interage com o receptor
AMPA do glutamato) e Trh (hormônio de liberação da tirotrofina) melhores
candidatos do que a própria α-sinucleína. No entanto, é interessante observar
que talvez exista outro QTL ligado a Ofil1, influenciando locomoção central no
CA (Figura 11). Estudos futuros poderão confirmar este novo QTL, para o qual
a α-sinucleína seria um bom gene candidato. Assim, a ligação encontrada entre
165
o SNP e a locomoção central pode ser um efeito do gene que corresponderia a
este segundo QTL.
Por fim, a última hipótese deste estudo era que tratamentos
farmacológicos que atuam diminuindo a atividade do sistema dopaminérgico
poderiam aumentar a esquiva da área central nas linhagens LEW e SHR no
CA, o que viria corroborar a hipótese de envolvimento do gene Snca da α-
sinucleína nos comportamento relacionados à ansiedade. Para avaliar esta
questão, foram realizados experimentos farmacológicos com a droga
dopaminérgica metilfenidato (MFD) utilizando os animais das linhagens puras
LEW e SHR. O MFD é um psicoestimulante que atua bloqueando o
transportador de dopamina, levando, em longo prazo e através de um
mecanimo regulatório, a uma diminuição na liberação de dopamina na fenda
sináptica (Robbins, 2002). Nossa hipótese baseava-se na premissa de que
uma baixa atividade do sistema dopaminérgico pode ser responsável, ao
menos em parte, pela alta esquiva da área central do CA. Assim, o tratamento
crônico com o MFD deveria aumentar a esquiva de regiões aversivas dos
testes comportamentais de ansiedade/emocionalidade dos ratos LEW e SHR,
ou ao menos dos ratos SHR, tornando-os semelhantes aos ratos LEW não
tratados. Neste caso, pretendíamos simular farmacologicamente em ratos SHR
o fenômeno que teria origem genética em ratos LEW.
Os resultados mostraram que os animais tratados com o MFD
apresentaram, como esperado, menores níveis de locomoção central e total no
CA quando comparados com os animais tratados com salina (Figura 23a). Esta
redução, no entanto, não foi dependente da linhagem utilizada. A influência
emocional do MFD foi específica no teste do CA (Figura 23a-b). Contudo, foi
166
observada uma tendência (p=0,08) de redução do tempo gasto nos braços
abertos do LCE em animais tratados com o MFD. A falta de efeito significante
do tratamento no teste de consumo de etanol sugere novamente que os
mecanismos reguladores dos comportamentos emocionais no CA são
diferentes daqueles envolvidos no consumo de etanol. Então, a provável
redução na liberação de dopamina causada pelo tratamento crônico com o
MPD, pode ter aumentado a esquiva do centro do CA e dos braços abertos do
LCE (em ambas as linhagens). Este resultado confirma nossa hipótese de que
parte da aversão do centro do CA seja regulada por mecanismos
dopaminérgicos, que, por sua vez, seriam mediados pelo gene Snca da α-
sinucleína.
Apesar dos resultados promissores com a α-sinucleína, o nosso estudo
de ligação (ver primeiro bloco experimental) sugere que ela esteja nos limites
máximos do intervalo de confiança (portanto longe do pico) do QTL Ofil1
encontrado para a locomoção central no CA (Figura 11). Todavia, podemos
perceber que para a locomoção central no CA, parecem existir mais de um
QTL ao longo do cromossomo 4, como visto pelos outros picos presentes na
região analisada. Sabe-se que o mapeamento fino (de resolução entre 1 e
5cM) exige mais eventos de recombinação para separar os genes que
governam os QTL ligados. Então, para verificar este ponto, nós utilizamos o
teste para cálculo de intervalos de confiança (bootstrap) de QTL (Visscher et
al., 1996). Este teste confirma que podem existir outros dois diferentes QTL
ligados neste mesmo cromossomo, sendo que apenas um deles alcançou o
limite de significância (pico em D4MGH27; ver Tabela 9). Os outros dois foram
apenas sugestivos (pico no D4RAT206 e pico no D4RAT164). Assim, apesar
167
da α-sinucleína não estar mapeada exatamente na região do pico de Ofil1 ela
está localizada no intervalo entre dois QTL que afetam a locomoção central no
CA. Conseqüentemente, caso seja confirmado que a α-sinucleína não é um
bom gene candidato para Ofil1 ela pode, ainda, ser um bom gene candidato
para explicar o QTL vizinho, menos significativo. Estratégias como a produção
de linhagens sub-congênicas no intervalo genômico em questão, poderão, em
breve, realmente responder se existem diferentes QTL ou genes ligados
influenciando a locomoção central nestes animais.
168
6-CONCLUSÕES
Na primeira estratégia experimental, os resultados confirmaram que os
ratos da linhagem LEW são, enquanto modelos experimentais, mais “ansiosos”
e “depressivos” quando comparados com os ratos SHR, pois eles exploraram
menos a área central do CA, os braços abertos do LCE, o compartimento
luminoso da CBP e apresentaram maior imobilidade no TNF. Diversas
evidências ao longo do trabalho sugeriram que os genes que regulam os
comportamentos emocionais no CA e o consumo de etanol podem não ser os
mesmos, ou apresentem apenas efeito parcial nas duas características. Nós
demonstramos que Ofil1 está presente nos machos das sub-linhagens LEW e
SHR brasileiras, confirmando a importância desta região genômica na
regulação de comportamentos relacionados à ansiedade. Além disso, com o
remapeamento, sugerimos que na verdade podem existir três diferentes QTL
influenciando a locomoção central no cromossomo 4, sendo que o gene da α-
sinucleína está dentro do limite de confiança de Ofil1. Pela primeira vez no
modelo genético LEW e SHR foram encontrados QTL para: defecação e
locomoção periférica no CA; locomoção e tempo no compartimento branco da
CBP e tempo no compartimento preto da CBP; e consumo de etanol forçado
(10%) no cromossomo 4 do rato. Também foram encontrados seis QTL
sugestivos em machos nos testes do CA, CBP, TNF e consumo de etanol. Em
fêmeas, Ofil1 parece ser influenciado por fatores ligados ao ciclo estral e,
talvez, por esta razão, na primeira análise de QTL não foram encontrados QTL
significativos, apenas 10 sugestivos. Entretanto, levando em conta a fase do
ciclo estral, três QTL significativos foram encontrados em fêmeas: dois no
169
diestro-proestro para defecação no CA e locomoção no compartimento preto da
CBP e um pleiotrópico no estro-metaestro influenciando tempo e locomoção no
compartimento branco da CBP.
Na segunda estratégia experimental, os animais da linhagem LEW
(considerados os mais “ansiosos”) tiveram maiores níveis de expressão do
gene da α-sinucleína (Snca), no hipocampo, quando comparados aos animais
SHR. Um polimorfismo encontrado na posição +562 deste gene parece estar
associado ao comportamento de aproximação do centro do CA. Por fim, o MFD
aumentou a esquiva de ambas as linhagens do centro do CA, corroborando
que uma baixa ativação do sistema dopaminérgico é, ao menos em parte,
responsável por uma maior esquiva do centro do CA. Este resultado apóia
farmacologicamente o possível papel da α-sinucleína no comportamento
diferencial entre as linhagens LEW e SHR no teste do CA.
Estudos futuros, como o aqui apresentado, aliados com experimentos
farmacológicos, sem dúvida representarão uma importante contribuição ao
conhecimento dos mecanismos neurobiológicos que modulam as diferentes
dimensões da resposta emocional. Tais estudos poderão possibilitar o
desenvolvimento de drogas com maior especificidade para os transtornos de
ansiedade humana.
No futuro, devido ao acúmulo de dados gerados através das abordagens
de QTL e de gene candidato, assim como das novas técnicas e recursos em
desenvolvimento, identificaremos a função e as relações de diversos genes,
assim como os RNAm e as proteínas envolvidas em um dado comportamento.
Com certeza, isto proporcionará uma análise comportamental em um nível
bastante avançado e o foco dos estudos deverá mudar da abordagem pontual
170
para as estratégias baseadas na análise das redes biológicas integradas
formadas por genes, RNAm e proteínas.
171
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8-ANEXOS
8.1 Campo Aberto (CA)
O teste do campo aberto (CA) é provavelmente o teste de
emocionalidade mais popular no mundo (Ramos, 2008). Ele foi desenvolvido
em 1934 por Calvin Hall e desde então, diversos trabalhos têm utilizado este
aparato para avaliar os efeitos de manipulações ambientais, de drogas e de
fatores genéticos sobre a emocionalidade de roedores. O aparato consiste de
uma arena cercada por paredes, onde o animal é colocado e pode explorá-lo
livremente por certa quantidade de tempo. Na literatura disponível sobre este
teste, encontramos freqüentemente diferenças na forma, cor, iluminação e
métodos de avaliação (Walsh e Cummins, 1976; Sternberg et al., 1992; Trullas
e Skolnick, 1993; Castanon e Mormède, 1994; Ossenkopp et al., 1994; Ramos,
2008). Algumas destas modificações na situação de teste podem prejudicar a
reprodutibilidade dos resultados obtidos e até mesmo mascarar efeitos
genéticos (Crabbe et al., 1999; Chesler et al., 2002; Wahlsten et al., 2003). Um
grande número de variáveis comportamentais pode ser medido no teste do CA
como: locomoção, defecação, congelamento, alisamento, exploração de pé,
vocalização, etc:. (Archer, 1973; Walsh e Cummins, 1976). Dentre estas
medidas, as duas mais comumente aceitas como medidas de emocionalidade
animal são: a locomoção e a defecação em resposta a um ambiente inédito
(Gray, 1979; Lister, 1990; Ossenkopp et al., 1994). Existem, ainda, outras
medidas no teste do CA, que nem sempre são consideradas em estudos de
emocionalidade (tempo e locomoção na área central e periférica), as quais são
obtidas a partir da distinção deste aparato em área central e área periférica
210
(Ramos e Mormède, 1998). A área central, como o próprio nome diz, é a área
que se localiza no centro do aparato, desprovida de paredes, sendo a área
periférica aquela adjacente às paredes do aparato e que permite a realização
de tigmotaxia por parte do animal. Considera-se, classicamente, que a área
central deste aparato seja a mais aversiva, pois drogas ansiolíticas tendem a
aumentar a locomoção e o tempo de permanência nesta área, enquanto drogas
ansiogênicas apresentam o resultado contrário (Gentsch et al., 1987).
Provavelmente, isto se deva a um conjunto de fatores como a neofobia e a
esquiva de regiões abertas, onde os roedores não possam realizar tigmotaxia
(movimento que o rato faz com as vibrissas no intuito de receber informações
sensoriais do meio) (Treit et al., 1993).
8.2 Caixa Branca/Preta (CBP)
Outro teste comportamental utilizado no presente estudo foi a caixa
branca/preta (CBP) (uma pequena caixa com dois compartimentos conectados:
um branco e fortemente iluminado e outro preto, somente com iluminação
vermelha), onde o rato é colocado, no centro do compartimento branco,
podendo então atravessar em direção ao compartimento preto ou permanecer
no branco. Considera-se, classicamente, que o nível de exploração do
compartimento branco e o número de transições entre os compartimentos
dependem do nível de “ansiedade” do animal (Crawley, 1981). Segundo
Crawley (1981), este teste possui algumas vantagens, como a rapidez e a
simplicidade do método, a reprodutibilidade dos resultados e o pequeno
tamanho do aparato. Ainda, a alta eficiência e a especificidade
psicofarmacológica para medir os efeitos comportamentais de agentes
211
ansiolíticos (benzodiazepinas, álcool e nicotina) e ansiogênicos (FG7142),
fazem deste teste um bom modelo para o estudo da ansiedade (Crawley, 1981;
Costall et al., 1989).
8.3 Labirinto em Cruz Elevado (LCE)
O labirinto em cruz elevado (LCE) é um dos modelos animais de
ansiedade mais utilizados e foi desenvolvido baseado na observação de que os
ratos evitam lugares abertos e elevados e que este comportamento de esquiva
é gerado pelo medo (Montgomery, 1955). Ele consiste em um labirinto em
forma de cruz com quatro braços, sendo dois abertos e dois fechados (com
paredes). De maneira simples, durante o teste o rato é colocado em uma
plataforma central (região de intersecção entre os quatro braços), podendo ali
permanecer ou dirigir-se a um dos braços (aberto ou fechado). Em um extenso
estudo, Pellow et al. (1985) validaram este teste através do uso de abordagens
farmacológicas, comportamentais e fisiológicas. Quando expostos ao LCE pela
primeira vez, um rato ou camundongo naïve apresentará sinais de conflito,
esquiva e fuga, sendo que o animal considerado como mais “ansioso” irá
menos vezes e permanecerá por menos tempo nos braços abertos e
desprotegidos do aparato. Esta esquiva aos braços abertos (região aversiva do
aparato) é diminuída através de drogas ansiolíticas clássicas e aumentada por
drogas ansiogênicas (Pellow et al., 1985; Lee e Rodgers, 1987; Lee e Rodgers,
1990; Rodgers et al., 1992; Handley e McBlane, 1993; Rodgers e Cole, 1994;
Rodgers e Cole, 1995).
8.4 Teste do nado forçado (TNF)
212
O TNF é um dos testes mais utilizados na avaliação de drogas
antidepressivas. Ele consiste em colocar o rato em um cilindro de vidro (40cm
de altura; 18 cm de diâmetro) contendo água limpa mantida entre 24°C e 26°C
(Porsolt et al., 1977; Borsini e Meli, 1988). Como ratos são bons nadadores o
animal é exposto a um pré-teste por 15 minutos, e 24h depois, exposto
novamente ao aparato durante 5 minutos, nas condições descritas acima.
Neste teste comportamental, registram-se medidas como: escalada, defecação
e mergulho. Porém, o tempo de imobilidade talvez seja a medida mais
representativa deste teste comportamental. Um alto tempo de imobilidade
neste teste é considerado com um índice comportamental relacionado à
depressão, sendo que o animal é considerado imóvel quando somente faz
movimentos necessários para manter a cabeça fora da água. Sabe-se que
drogas antidepressivas diminuem o tempo de imobilidade dos ratos neste teste
comportamental (Borsini e Meli, 1988; Cryan et al., 2005).
8.5 Teste de consumo de etanol
Existem na literatura diversos protocolos para se avaliar o consumo de
etanol em animais experimentais. As principais diferenças entre eles são: a
presença de períodos de adaptação, de substâncias controles, de consumo de
etanol forçado, de concentrações de etanol variadas, períodos de exposição
variados ao etanol e o tipo das gaiolas utilizadas para a realização dos
experimentos. Assim, nosso protocolo foi adaptado de acordo com o descrito
por Terenina-Rigaldie et al. (2003a). Ou seja, os ratos passam por uma fase de
habituação em gaiolas individuais, seguido de um período de consumo de
etanol forçado e um período de livre escolha entre água e etanol em
213
concentrações crescentes. Baseado no consumo em g/kg/dia de etanol ou na
preferência por esta solução, podemos inferir sobre fatores ligados a
predisposição ao consumo de etanol em ratos. Em roedores, as fêmeas
consomem maiores quantidades de etanol do que machos (Almeida et al.,
1998; Cailhol e Mormède, 2001; Cailhol e Mormède, 2002; Da Silva et al.,
2004, Izídio e Ramos, 2007) com sugerida participação de hormônios sexuais,
como por exemplo, o estradiol (Sandberg et al., 1982; Marinelli et al., 2003).
8.6 Ciclo estral
Recentemente, alguns pesquisadores têm atentado para a importância
do uso de fêmeas em baterias de testes comportamentais (Crawley e Paylor
1997; Voikar et al. 2001), mas, mesmo assim, esta é ainda uma prática rara.
Como já comentado anteriormente, um grande número de transtornos
neuropsiquiátricos ou alguns de seus sintomas específicos apresentam
diferenças inter-sexuais. Por exemplo, transtornos relacionados ao estresse,
tais como certos tipos de ansiedade ou depressão, têm sido observados mais
frequentemente em mulheres do que em homens (Frackiewicz et al. 2000;
Sandford et al. 2000).
Uma das principais razões da exclusão das fêmeas dos testes
comportamentais com animais experimentais é a flutuação hormonal que
ocorre durante o seu ciclo estral. Basicamente, os ratos pertencem a um grupo
de animais com ciclo estral curto (4-5 dias), onde ocorrem mudanças
fisiológicas no ovário, útero e vagina dependentes de cada uma das 4 fases
onde as fêmeas podem se encontrar (Hebel e Stromberg, 1986). Estas fases
são nomeadas proestro (~12h de duração), estro (~12h), metaestro (~21h) e
214
diestro (~57h) (Hebel e Stromberg, 1986). Uma técnica muito utilizada para se
determinar a fase do ciclo é a coleta de secreção vaginal para observação em
microscópio óptico. Resumidamente, nesta técnica três tipos de células podem
ser reconhecidas. As redondas e nucleadas são células epiteliais, as
irregulares e sem núcleo são as corneificadas e as pequenas e redondas são
os leucócitos. Assim, as fases apresentam algumas características típicas que
permitem a identificação: o diestro tem a predominância de leucócitos,
acompanhado de células epiteliais nucleadas e podendo conter células
corneificadas; o proestro tem predominância de células nucleadas, podendo
aparecer células corneificadas; o estro contem exclusivamente células
corneificadas; e o metaestro contem uma grande quantidade de leucócitos em
blocos ou dispersos, em menor quantidade do que no diestro, juntamente com
células corneificadas e nucleadas (Marcondes et al., 2002).
Alguns estudos vêm sugerindo que a flutuação hormonal causada pelo
ciclo estral pode alterar o comportamento das fêmeas. Por exemplo, Mora et al.
(1996) sugeriram que a exploração do LCE difere de acordo com a fase do
ciclo estral de ratas. Resultados similares também já foram encontrados no
teste do CA (Meziane et al., 2007). Mas a maioria destes estudos ainda foca
em fases pré-selecionadas do ciclo ao invés da avaliação de todas as fases.
Por exemplo, alguns trabalhos utilizaram fêmeas no estro e proestro (Gray e
Cooney 1982; Romeo et al., 2003; Ryan e Maier 1988; Sternberg et al., 1994)
ou estro, proestro e metaestro (Mogil et al., 2000), em detrimento do uso de
fêmeas em todas as quatro fases (Palanza et al., 2001; Plappert et al., 2005). A
explicação metodológica para esta preferência está baseada no grande número
amostral necessário para a comparação correta de todas as fases do ciclo
215
estral.
Sabe-se, também, que além de aspectos comportamentais, muitas
funções neurais são influenciadas por mudanças hormonais em ratas. Por
exemplo, alguns estudos têm demonstrado que o estradiol e a progesterona
exercem efeitos ansiolíticos (Díaz-Véliz et al., 1997; Frye e Walf, 2002; Gómez
et al., 2002). Assim, as diferenças comportamentais dependentes das fases do
ciclo estral das ratas constituem uma variável que deve ser levada em conta
em estudos envolvendo fêmeas. Isto poderá nos levar a uma melhor
compreensão dos mecanismos do comportamento animal assim como a uma
identificação de genes que afetam o comportamento e os transtornos
psiquiátricos e são dependentes de fatores sexuais.
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