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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Efeito da própolis verde na inflamação e
regeneração da córnea
LUIZ FERNANDO TARANTA MARTIN
Ribeirão Preto
2009
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LUIZ FERNANDO TARANTA MARTIN
Efeito da própolis verde na inflamação e
regeneração da córnea
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo para obtenção do Título de Doutor em
Ciências Médicas.
Área de Concentração: Mecanismos
Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e
Audio-Vestibular.
Orientador: Prof. Dr. Jayter Silva de Paula
Coorientador: Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia
Ribeirão Preto
2009
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Martin, Luiz Fernando Taranta
Efeito da própolis verde na inflamação e regeneração da
córnea. Ribeirão Preto, 2009.
105 p.: il.; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Oftalmologia.
Orientador: Paula, Jayter Silva de
1. Própolis verde; 2. Extrato vegetal; 3. Córnea; 4. Inflamação;
5. Regeneração.
Dedicatória
Aos meus pais, irmãos e esposa, pelo apoio e amor.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia, pela amizade e ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Jayter Silva de Paula, pela atenção, amizade, paciência e
perseverança.
Ao Prof. Dr. Antonio Augusto Velasco e Cruz, pela oportunidade.
Ao Prof. Dr. André Márcio Vieira Messias, pelo exemplo.
A Maria Cecília Onofre, pela solicitude.
Às técnicas de laboratório Rosângela Orlandin Lopes e Ana Maria Anselmi
Dorigan, pelo auxílio na parte histológica do experimento.
Ao amigo Mateus Freire Leite, pela competência na veiculação e formulação
dos colírios.
Ao Dr. Fernando Chahud, pela ajuda com as preparações imunohistoquímicas.
A Patrícia Modiano, Sheila Andrade de Paula, Márcia Clivati Martins e Aline
Turatti, pelo auxílio imprescindível na parte experimental.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
%- Porcentagem
=- Igual
>- Maior
>- Menor
±- Mais ou menos
®- Marca registrada
°C- Grau Celsius
EP- Erro padrão da média
EUA- Estados Unidos da América
g- Grama
h- Hora
HE- Hematoxilina e Eosina
M- Mega
mg- Miligrama
min- Minutos
mL- Mililitro
mm- Milímetro
mm²- Milímetro quadrado
P- Valor “p”
pH- Pontencial hidogeniônico
PV- Grupo Própolis Verde
VH- Grupo Veículo
x- Vezes
µm- Micrômetro
RESUMO
Objetivo: O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos de um
extrato de própolis verde brasileira nos processos de regeneração e inflamação
corneana. Métodos: Em ratos Wistar machos, foi feita uma lesão corneana
central superficial, com diâmetro de 1mm, usando bastões contendo nitrato de
prata. Foram utilizados 32 animais e a área da lesão foi fotografada nos tempos
0,12, 24, 48 e 120 horas. Com auxílio de um programa de imagem, foi feita a
medida da área lesada nos tempos referidos. Os ratos foram divididos em dois
grupos de 16 animais. O grupo própolis verde (PV) recebeu quatro gotas
diárias de colírio contendo microemulsão de própolis verde a 1%, enquanto o
grupo veículo (VH) recebeu quatro gotas diárias do mesmo colírio, porém sem
a própolis. A lesão foi repetida em 83 animais e a resposta inflamatória foi
medida através da contagem dos neutrófilos presentes na córnea. Para a
análise do padrão de migração neutrofílica, dois outros parâmetros foram
utilizados: a relação entre a contagem de neutrófilos no centro da lesão em
relação à contagem total de neutrófilos (centro/total) e a contagem no centro
em relação às das bordas da lesão (centro/bordas), nos tempos 12, 24, 48 e
120 horas. A regeneração também foi medida, com contagem do número de
mitoses na camada epitelial basal, através de marcação imunohistoquímica
com KI-67. Resultados: Diferenças significativas (P<0,05) foram encontradas
nas medidas de áreas dos grupos nos tempos de 12, 24 e 48 horas, com
valores menores no grupo PV. Não houve diferenças significativas nos tempos
0 e 120 horas. A contagem neutrofílica total mostrou valores significativamente
menores no grupo PV nos tempos de 24 e 48 horas (P<0,05). Não houve
diferença significante nos tempos de 12 e 120 horas. Os parâmetros
centro/total e centro/bordas não apresentaram diferenças em nenhum dos
tempos estudados. A contagem das células marcadas pelo KI-67 mostrou
diferenças nos tempos 12 e 24 horas (P<0,05), mas não no tempo 48h.
Conclusões: O uso tópico da própolis verde mostrou ação cicatrizante e anti-
inflamatória após lesão corneana induzida por álcali, mantendo o padrão de
migração neutrofílica.
Palavras-chave: Própolis verde, lesão por álcali, regeneração corneana,
inflamação corneana, KI-67.
ABSTRACT
Purpose: The aim of this study was to investigate the effects of Brazilian green
propolis, a widely used folk medicine, in cornea wound healing and
inflammation. Methods: 32 Wistar male rats had the center of their right
corneas treated with a silver nitrate applicator stick to produce a superficial
lesion of 1mm in diameter. The area of injury was photographed and measured
in times 0, 12, 24, 48 and 120 hours. Rats were divided in two groups. Group
green propolis (PV), which received topic application of eye drops containing
microemulsion of green propolis 1% and group vehicle (VH), which received the
same eye drops without propolis. Inflammatory response was measured in 83
rats by neutrophil count in the lesion area. Besides counting the total number of
neutrophils, two other parameters were used. The ratio of neutrofils in the
center of lesion compared to the total count (center/total) and compared to the
number of neutrophils found in the borders of the lesion (center/borders) in
times 12, 24, 48 and 120 hours. Regeneration was also assessed by
determining the number of mitosis in corneal basal layer, by
immunohistochemistry with KI-67. Results: A significant statistical difference
between groups was found in wounded area measures in times 12, 24 and 48
hours (P<0,05), with values considerably lower in group PV. No differences
were found in time 0h and after 120 hours both groups had injured areas
completely re-epithelized. Total neutrophil count showed no significant
differences in time 12h. In times 24 and 48 hours the number of neutrophils was
significantly reduced in group PV (P<0,05) and in time 120h there was no
statistical difference between groups. Neither ratio center/total nor
center/borders showed significant differences in any of the times studied. Count
of Immunohistochemistry marked cells showed statistical differences (P<0,05)
between VH and PV in times 12 and 24 hours, but not in 48 hours.
Conclusions: Topically applied green propolis reduced wound healing time and
the inflammatory response after alkali burn. Neutrophil migration pattern was
not altered by the use of eye drops.
Key words: Green propolis, alkali burn, cornea regeneration, cornea
inflammation, KI-67.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................12
1.1. Anatomia............................................................................................................13
1.2. Regeneração corneana......................................................................................17
1.3. Inflamação..........................................................................................................23
1.4. Modelos experimentais ......................................................................................24
1.5. Própolis ..............................................................................................................26
1.6. Uso oftalmológico...............................................................................................27
1.7. Própolis verde ....................................................................................................28
1.8. Justificativa.........................................................................................................30
2. OBJETIVOS......................................................................................................32
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................34
3.1. Desenho do estudo............................................................................................35
3.2. Lesão .................................................................................................................35
3.3. Colírios...............................................................................................................38
3.4. Grupos ...............................................................................................................39
3.5. Fotografias .........................................................................................................41
3.6. Medida da área lesada.......................................................................................43
3.7. Preparação histológica.......................................................................................44
3.8. Imunohistoquímica.............................................................................................47
3.9. Análise estatística ..............................................................................................50
4. RESULTADOS .................................................................................................51
4.1. Demonstração do modelo..................................................................................52
4.2. Análise da área da lesão....................................................................................53
4.3. Análise histológica da lesão...............................................................................56
4.3.1. Análise qualitativa da lesão.......................................................................56
4.3.2.Análise neutrofílica da lesão ......................................................................58
4.4. Migração neutrofílica..........................................................................................60
4.5. Imunohistoquímica.............................................................................................63
4.6. Compilação dos resultados................................................................................65
5- DISCUSSÃO.....................................................................................................66
5.1. Introdução ..........................................................................................................67
5.2. Modelo experimental..........................................................................................71
5.3. Regeneração......................................................................................................74
5.4. Inflamação..........................................................................................................77
5.5. Perspectivas.......................................................................................................80
6- CONCLUSÕES.................................................................................................82
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................84
8- ANEXO...........................................................................................................104
ANEXO DE PUBLICAÇÃO
1. INTRODUÇÃO
13
1.1. Anatomia
As lesões de córnea são frequentes e existe grande interesse em se
desenvolver novas medicações para seu tratamento. O uso da própolis, muito
difundido em medicina popular, mostrou ações promissoras em outros órgãos,
acelerando a regeneração dos tecidos e diminuindo sua reação inflamatória.
Neste estudo, uma variedade de própolis brasileira foi utilizada na forma de
colírio para o tratamento de lesões corneanas.
A córnea é a estrutura mais anterior do globo ocular e, por isso, a mais
susceptível a traumas e lesões. Sua integridade é fundamental para o
desempenho adequado das funções visuais e para a integridade do olho. Uma
breve introdução sobre a anatomia corneana é necessária para melhor
compreensão do presente trabalho.
A córnea é o tecido transparente e avascular que se assemelha a um
cristal de relógio e se localiza, na maior parte do tempo, em contato direto com
o meio externo. Horizontalmente, é algo elíptica, medindo cerca de 12mm. No
sentido vertical mede, em média, 11mm. Ela é composta de cinco camadas:
epitélio, cápsula de Bowman, estroma, membrana de Descemet e endotélio
(Reim, 1997), conforme representado na Figura 1.
Figura 1. Esquema mostrando uma córnea em corte transversal, com suas diversas
camadas (fonte: Unite for Site Organization – www.uniteforsite.org).
14
O epitélio é formado por cinco camadas celulares, de três diferentes
tipos: colunares basais, aladas poligonais e superficiais planas. As células
colunares basais são arredondadas, com núcleos ovais e se dispõem em uma
ou duas camadas, situadas imediatamente sobre a membrana basal epitelial
(MBE). São constantemente produzidas e migram até a superfície, originando
as células aladas poligonais. Essas, por sua vez, têm núcleos paralelos à
superfície, se distribuem em três camadas e se tornam mais planas à medida
que se aproximam da superfície corneana (Reim, 1997).
As células superficiais são as mais próximas do meio externo. Estão
dispostas em duas fileiras, possuem microvilosidades e não apresentam
queratinização. Alguns dias após sua formação, elas se desprendem das
células vizinhas, dispersando-se pelo filme lacrimal. Todas as células
corneanas aderem-se firmemente umas às outras por desmossomos e
interdigitações (Suzuki et al., 2003).
A cápsula de Bowman, segunda camada corneana, é uma zona acelular
situada sob o epitélio. Sua margem anterior é delimitada pela membrana basal
epitelial e o limite posterior é definido por suas próprias fibras colágenas. É
uma estrutura resistente a traumatismos e funciona como barreira à invasão de
microorganismos e células tumorais.
A terceira camada é o estroma corneano, responsável por 90% de toda
a espessura da córnea. É composta basicamente de fibras colágenas,
substância fundamental e células estromais. As fibras colágenas representam
cerca de 80% do peso seco da córnea e são, assim como as células estromais,
envolvidas pela substância fundamental, rica em mucopolissacarídeos. Nas
15
córneas edemaciadas, a substância fundamental aumenta de volume,
enquanto as fibras colágenas mantêm seu peso e tamanho.
A membrana de Descemet, com espessura de 10µm, é a quarta camada
corneana e cobre a porção posterior do estroma, separando-o do endotélio. Ao
contrário da membrana de Bowman, ela se descola do estroma com facilidade
e regenera-se rapidamente.
O endotélio humano é a camada corneana mais interna. Tem cerca de
5µm de altura e 20µm de largura e é formado por uma única camada celular,
contendo de 400.000 a 500.000 células. Suas células têm forma cúbica e
mostram grande atividade metabólica, notada pela presença de numerosas
mitocôndrias dentro de seus citoplasmas. Elas não se dividem ou regeneram e
a maior parte de seu intenso metabolismo é gasto com a função de executar a
retirada de água do estroma, mantendo-o num permanente estado de
desidratação.
O limbo esclero-corneal é uma zona vascularizada e semitransparente
de transição entre conjuntiva e esclera, por um lado, e a córnea, pelo outro.
Diversas particularidades ocorrem nessa região. O epitélio corneano, que
normalmente se continua com o da conjuntiva, é composto por 10 a 12
camadas celulares. O estroma perde sua transparência e as fibras colágenas
passam a apresentar variações de diâmetro, assumindo as características da
esclera. A cápsula de Bowman termina de forma circular, na margem central do
limbo, dando lugar a um tecido conjuntivo fibroso (Reim, 1997).
A córnea de ratos é semelhante à humana, tornando esses animais um
bom modelo experimental. Ela é uma estrutura avascular, composta por um
epitélio com aproximadamente cinco camadas celulares. Em sua base, existem
16
células colunares arredondadas, situadas imediatamente sobre a membrana
basal epitelial (MBE).
À medida que se aproximam da superfície, as células vão se tornando
mais alongadas, até tornarem-se achatadas na superfície. São constantemente
produzidas e renovadas, com a dispersão das células mais superficiais pelo
filme lacrimal, que, nesses animais, tem menos água e mais mucina do que a
córnea humana (Junior et al., 2003).
A superfície inferior das células epiteliais basais encontra-se firmemente
conectada à MBE e tal adesão tem papel fundamental na proteção do estroma,
já que os ratos não possuem cápsula de Bowman. Essa ligação é também
importante no estabelecimento da permeabilidade e das relações entre epitélio
e estroma, regulando a passagem de diversos íons, solventes e outras
substâncias (Takagi et al., 1994).
O estroma é a parte mais espessa da córnea, composta principalmente
por água e fibras colágenso, com componentes se assemelham aos da córnea
humana. O endotélio, por sua vez, é composto de uma única camada de
células hexagonais, medindo cerca de 20µm de largura e com espessura de 2
a 3µm. Sua densa lâmina basal, com 4µm de espessura, corresponde à
membrana de Descemet. As células endoteliais possuem numerosas
mitocôndrias arredondadas e estão fortemente conectadas, com citoplasmas
que se projetam para dentro das células adjacentes e zona ocludens na sua
parte apical (Yamasaki et al., 2001).
17
1.2. Regeneração corneana
A manutenção da integridade da superfície da córnea é considerada o
fator mais importante para conservar sua transparência e qualidades ópticas
(Kurpakus-Wheater et al., 2001; Lu et al., 2001). O epitélio corneano é parte
integrante da superfície ocular e está em constante renovação. Nesse
processo, as células epiteliais da superfície são constantemente liberadas no
filme lacrimal, sendo substituídas por células que migram das camadas basais
do epitélio. Estas são repostas por outras células basais, que se movimentam
do limbo em direção ao centro (Evans et al., 2005).
Em 1983, Thoft e Friend sugeriram a hipótese “X, Y e Z”, na qual X
representa a proliferação das células epiteliais basais; Y a proliferação e
migração centrípeta das células epiteliais límbicas; e Z, a perda celular epitelial
da superfície. Para manter um estado de equilíbrio, é necessário que X + Y
resultem em Z (Kinoshita et al., 1983; Thoft, 1983).
Estima-se que o epitélio humano seja completamente renovado a cada
uma a duas semanas (Hanna, 1960). Na vigência de lesões, com perda de
células corneanas, as mesmas iniciam o processo de regeneração,
deslocando-se para a região lesada até cobrir a ferida. Esse fenômeno tem
sido foco de numerosos estudos (Dua, 1998; Park, 1999; Lu et al., 2001; Evans
et al., 2005; Netto et al., 2005; Serrao, 2005).
A regeneração é ativada por citocinas, liberadas após as lesões, e o
primeiro evento estromal observado no processo de regeneração é a apoptose
de ceratócitos, que pode ser detectada por microscopia eletrônica cerca de
30min após a lesão (Wilson et al., 1996) e continua por um período de pelo
menos uma semana (Gao et al., 1997; Mohan, 2001).
18
Dentre as várias citocinas que tomam parte no processo regenerativo,
merece destaque a interleucina 1 (IL-1). A IL-1, em suas variedades alfa e
beta, não é detectada por imunocitoquímica nos ceratócitos de córneas sem
lesão. Entretanto, a exposição dos mesmos à IL-1, induz os próprios
ceratócitos a produzirem mais IL-1, via um “loop” autócrino. Esse é o motivo
pelo qual ela é encontrada nos ceratócitos e miofibroblastos de células lesadas
(West-Mays et al., 1995; Strissel et al., 1997; Strissel et al., 1997).
Os miofibroblastos, células caracterizadas pela presença de alfa-actina,
são gerados a partir dos ceratócitos e têm importante papel no processo de
regeneração, atuando na produção de fatores de crescimento, como fator de
crescimento de hepatócito (HGF) e fator de crescimento de ceratinócito (KGF),
colágeno, glicosaminoglicanas, colagenases e metaloproteinases (Girard et al.,
1991; West-Mays et al., 1995; Weng et al., 1997; Kaji et al., 1998; Jester et al.,
1999; Ye et al., 2000).
A IL-1 possui importantes efeitos nas células relacionadas ao processo
de regeneração. Foi mostrado que ela modula a apoptose de ceratócitos e
fibroblastos corneanos, além de ter efeito negativo na apoptose dos ceratócitos
e miofibroblastos originados durante a resposta estromal de regeneração
(Wilson et al., 1996).
Além disso, funciona como principal reguladora da produção de HGF e
KGF, ambos produzidos pelos ceratócitos (Weng et al., 1997), e de fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF), produzido pelos fibroblastos
corneanos. Tais mediadores atuam na interação entre epitélio e estroma,
regulando proliferação, motilidade e diferenciação de células epiteliais (Wilson
et al., 1994).
19
A IL-1 também modula a expressão de metaloproteinases, enzimas
envolvidas no processo de remodelamento de tecidos. Nos casos de lesão
corneana, a participação das metaloproteinases, enzimas do grupo das
colagenases, é importante para remodelar a matriz estromal corneana (Girard
et al., 1991; West-Mays et al., 1995; Strissel et al., 1997; Strissel et al., 1997).
A glândula lacrimal também atua no processo de reparação. Após a
lesão, vários fatores de crescimento que modulam a regeneração epitelial,
como HGF e fator de crescimento epidérmico (EGF), têm sua produção
aumentada pela glândula (Tervo et al., 1997; Wilson et al., 1999).
Com a apoptose dos ceratócitos presentes no estroma anterior, evento
que ocorre logo após a lesão, a glândula lacrimal passa a ser a principal fonte
de citocinas, que regulam a proliferação, migração e diferenciação das células
epiteliais. A ação da lágrima é essencial nas fases precoces da reparação, até
que miofibroblastos se multipliquem e repovoem o estroma anterior. Nas fases
seguintes, passa a atuar na modulação da reparação, regulando a
diferenciação e outras funções das células epiteliais (Wilson et al., 2001).
O processo de migração ocorre em três fases. Na primeira, iniciada
imediatamente após a lesão, as células epiteliais intactas na periferia da lesão
tornam-se achatadas e suas membranas emitem processos digitiformes
(filopodia) ou coraliformes (lamellipodia), que se estendem em direção à ferida
(Crosson et al., 1986). Nessas células, não há evidências de atividade mitótica.
Nas células epiteliais mais distantes das bordas lesadas, contudo, inicia-se
uma intensa atividade de mitose (Hanna, 1966; Cavanagh et al., 1979;
Cotsarelis et al., 1989; Lavker et al., 1991).
20
Na segunda fase, após o defeito epitelial ter sido recoberto por uma
única camada de células epiteliais, ocorre a proliferação das demais células
situadas na região lesada, resultando em um restabelecimento da espessura
epitelial normal. Contudo, nessa fase, as células epiteliais não completaram
seu estado de diferenciação e as adesões entre epitélio e MBE ainda não se
restabeleceram de forma definitiva.
Na última fase, algumas semanas após a lesão, as células epiteliais se
diferenciam e refazem a estrutura regular de camadas da fase pré-lesão,
tornando a superfície recoberta mais regular (Suzuki et al., 2003; Nishida,
2008).
A interação das células epiteliais com a MBE é fundamental no processo
de reparação, pois as células epiteliais migram sobre ela. É necessário, para
tanto, que as ligações das células com a MBE sejam diferentes daquelas
observadas em situação normal, em que existe forte adesão entre ambas as
estruturas. A presença da MBE facilita a migração e reduz o tempo de
cicatrização (Suzuki et al., 2003) e as adesões permanentes só serão formadas
quando não houver mais dano epitelial, processo que pode se prolongar por
meses após a lesão (Dua et al.,1994; Lu et al., 2002).
Nos casos de lesões corneanas profundas, com destruição da MBE, as
células epiteliais continuam capazes de migrar sobre a área lesada. Para tanto,
sintetizam fibronectina, uma glicoproteína de elevado peso molecular, que é
depositada sobre o estroma lesado, permitindo a adesão temporária das
células epiteliais no processo de migração (Fujikawa et al., 1981; Suda et al.,
1981).
21
Após o restabelecimento do epitélio, os ceratócitos gerados continuam
sofrendo apoptose, até o retorno a sua quantidade normal. As células
inflamatórias também sofrem apoptose e há indícios de que ambos os tipos
celulares passem por processo de necrose (Mohan, 2001). Os miofibroblastos,
por sua vez, retornam ao estado pré-lesão, sofrendo diferenciação em
ceratócitos e apoptose (Wilson et al., 2001).
A Figura 2 resume a seqüência de eventos que segue o trauma epitelial.
A adequada caracterização desses eventos, individualmente, permite uma
visão global da cascata da cicatrização corneana, facilitando seu entendimento
(Wilson et al., 2001).
22
Figura 2. Eventos da cascata da cicatrização corneana (Wilson et al., 2001).
23
1.3. Inflamação
Os mecanismos que envolvem a resposta inflamatória corneana são
processos complexos, que envolvem a superposição de diferentes tipos de
celulares e substâncias mediadoras (Dana, 2005; Li et al., 2006). Após a lesão
epitelial, ocorre a liberação de citocinas e quimiotaxinas pró-inflamatórias em
resposta à lesão, bem como a proliferação e migração de células inflamatórias
para o local lesado (O'Brien et al., 1998).
As células inflamatórias migram a partir dos vasos limbares e do filme
lacrimal (O'Brien et al., 1998; Wilson et al., 2001), progredindo até a área da
lesão. Os ceratócitos sob a área lesada rapidamente passam a sofrer apoptose
(Wilson, 1998) e, em poucas horas, os primeiros neutrófilos atingem a região
desepitelizada, migrando pela matriz extracelular do estroma corneano (Zhu,
1999; Lin et al., 2008).
Sua presença no local da lesão é importante, pois os neutrófilos são os
principais responsáveis pela limpeza (clearance) dos restos celulares dos
ceratócitos que sofreram apoptose e, junto com as demais células
inflamatórias, promovem a defesa da córnea contra patógenos que podem
invadir a área lesada (Wilson et al., 2001).
Além disso, atuam como moduladores da resposta imune, produzindo
diversas citocinas pró-angiogênicas, como fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF), fator de necrose tumoral (TNF), IL-1, IL-6 e IL-8 (Shaw et al.,
2003).
Em situações normais, a re-epitelização ocorre rapidamente (Zhao et al.,
2003), o número de neutrófilos retorna ao encontrado antes da lesão,
provavelmente através de apoptose (Savill, 1997), e os ceratócitos multiplicam-
24
se no estroma, sob a região reparada (West-Mays et al., 1997; Zieske et al.,
2001).
Os mediadores responsáveis pelo início e pela modulação do processo
inflamatório são diversos (Tran et al., 1996; Wilson et al. 2001; Li et al. 2006;
Biteman et al. 2007; McInnis et al. 2007; Saika, 2007; Pillai et al., 2008). Muitos
ainda estão em investigação e mesmo aqueles identificados e estudados há
mais tempo carecem da elucidação de suas ações.
1.4. Modelos experimentais
Ao longo dos anos, inúmeros modelos de lesão foram descritos e
utilizados para o estudo da regeneração e inflamação na córnea. Os modelos
animais utilizaram porcos, camundongos e outros animais, mas principalmente
ratos e coelhos.
As desepitelizações e as queimaduras com ácidos e álcalis são as
principais formas de se lesar a córnea, mas também podem ser usadas lesões
térmicas, radiação ultravioleta, infecção por vírus, toxinas bacterianas e fungos
e, mais recentemente, laser (Berjano et al., 2002; Choy et al., 2005; Flueckiger
et al., 2005; Kim et al., 2005; Cain al., 2006; Higaki et al., 2006; Sun et al.,
2007; McClellan et al., 2008; Suvas et al., 2008; Yavas et al., 2008).
Nos estudos envolvendo desepitelização corneana, a área a ter o
epitélio removido é previamente marcada e a desepitelização é feita
mecanicamente. Tais lesões são úteis principalmente nos estudos que
envolvem apenas regeneração, pois promovem uma inflamação da córnea
menor do que aquela observada nas infecções e nas lesões por álcalis (Green
et al., 1989; Viola et al., 1992; Reidy et al., 1994; Helena et al., 1997; Schwartz
25
et al., 1998; Stiebel-Kalish et al., 1998; Joussen et al., 2001; Song, 2004;
Margasiuk et al., 2005; Chang et al., 2008).
Nos estudos de inflamação corneana, pode ser feita injeção estromal de
substâncias conhecidas e sabidamente pró-inflamatórias, em dosagens
padronizadas. A inflamação gerada permite o estudo dos eventos relacionados
ao processo inflamatório, bem como o uso de novas substâncias para seu
tratamento (Pearlman et al., 1995; Pfister et al., 1998; Hall et al., 2001; Carlson
et al., 2007; Lin et al., 2007).
O principal modelo que permite o estudo associado de desepitelização e
inflamação é aquele no qual é feita uma lesão corneana cáustica, utilizando-se
álcalis na forma de cristais. Os cristais geralmente estão localizados na ponta
de bastões com diâmetros padronizados e a lesão é dada pelo contato dos
mesmos com a superfície corneana, gerando uma lesão epitelial e um estímulo
inflamatório (Hanif et al., 2003; Wenk, 2003; Wenk et al., 2003; Barros, 2007;
Aydin et al., 2008; Hurmeric et al., 2008).
Das substâncias presentes na ponta dos bastões, o nitrato de prata é a
mais comum e seu uso, combinado com nitrato de potássio, é amplamente
difundido nos trabalhos que têm como foco o estudo dos processos de
regeneração e inflamação da córnea (Mahoney, 1985; Sunderkotter et al.,
1991; Sonoda et al. 1998; Oshima et al., 2006; Erdurmus et al., 2007; Manzano
et al., 2007).
26
1.5. Própolis
A Própolis é uma resina complexa, produzida por abelhas. Sua
aparência física varia de acordo com numerosos fatores, sendo geralmente de
coloração amarelo-esverdeada e consistência elástica. Existem relatos de seu
uso desde a Idade Antiga, no Egito, onde era utilizada para embalsamar os
mortos (Pereira et al., 2002). A palavra tem origem grega, derivada de pro, “em
defesa”, e polis, “cidade”, fazendo alusão a seu uso na defesa das colméias.
As abelhas a utilizam para diversas finalidades, como selar aberturas
nas paredes das colméias e ninhos, evitar a entrada de intrusos e manter um
ambiente interno asséptico. Ela também é usada para a proteção de suas
pupas e ninfas (GhisalbertI, 1979).
Sua composição é variável, dependendo do clima, localização e
característica da fauna local. Os componentes principais são cera, resina e
substâncias voláteis. Os insetos secretam a cera, enquanto os outros dois
componentes são obtidos a partir de plantas, coletados através de secreções e
tecidos vegetais.
Na própolis podem estar presentes outros constituintes, como pólen e
aminoácidos (Gabrys et al., 1986; Marcucci, 1996). Até o momento, já foram
identificadas cerca de 500 substâncias na própolis de origem européia e 200 na
própolis brasileira (Marcucci, 1996; Bankova et al., 1999).
Há algumas décadas, o uso da própolis tornou-se comum,
especialmente na antiga União Soviética e nos países do Leste Europeu, para
o tratamento de afecções como otites externas e médias, faringite, rinite,
amidalite, asma e bronquite (Ivanov et al., 1973). Na Europa Ocidental, Japão e
América do Sul, a própolis só ganhou popularidade a partir da década de 80 e
27
atualmente o Japão é seu maior consumidor, importando preferencialmente a
própolis brasileira.
Na própolis européia típica, a chamada “própolis vermelha”, os principais
compostos ativos são os flavonóides. Já está bem estabelecido que tal perfil
químico deve-se ao fato de que abelhas européias coletam a resina de própolis
preferencialmente de uma espécie específica de pinheiro, a Populus nigra
(Maciejewicz, 2001). Nos trópicos, onde essa planta é raramente cultivada, as
abelhas buscam outros vegetais como fonte de matéria prima.
1.6. Uso oftalmológico
Apesar de ter seu uso popular difundido, pouos estudos descrevem o
uso da própolis vermelha nas diferentes estruturas oculares (Ivanov et al.,
1973; Mozherenkov, 1981; Popescu et al., 1986; Hepsen et al., 1999; Oksuz et
al., 2005; Nakajima et al., 2007; Onlen et al., 2007).
Seu efeito anestésico e reparador, já descrito em outros órgãos, foram
também observados na córnea (Paintz, 1979; Ozturk et al., 1999; Ozturk et al.,
2000).
Além disso, foram constatados efeitos relevantes na prevenção de
neovascularização corneana (Hepsen et al., 1999) e catarata senil (Orhan et
al., 1999), bem como no tratamento de uveítes (Ozturk et al., 1999) e infecções
estafilocócicas (Oksuz et al., 2005).
A própolis vermelha também mostrou efeitos na redução de danos
funcionais causados por lesões palpebrais e conjuntivais e efeito anti-
inflamatório em lesões corneanas induzidas por álcalis (Popescu et al., 1985;
Ozturk et al., 1999).
28
1.7. Própolis verde
Dentre os diversos tipos de própolis produzidas no Brasil, a verde é a
mais utilizada e comercializada. Em sua forma típica ela é dura, friável e pode
ser facilmente transformada em pó quando liofilizada. Tem odor agradável e
cor variando de verde-amarelado a verde-escuro, o que lhe confere o nome.
Ela pode ser produzida por diversas espécies diferentes de abelhas, das
quais merece atenção especial as do gênero Scaptotrigona. Comumente
conhecidas como “Tubí”, as abelhas da espécie Scaptotrigona bipunctata
(Figura 3) são nativas do país, distribuem-se por toda a região neotropical e
são produtoras de grandes quantidades de própolis.
Essas abelhas não têm como característica o comportamento social de
formar colméias, mas constroem seus ninhos em troncos de árvores junto com
outras abelhas de mesma espécie e são, acompanhadas das demais espécies
de abelhas nativas, as maiores responsáveis pela polinização no país. O fato
de não possuírem ferrão facilita sua criação em cativeiro, permitindo a
produção de uma própolis de ótima qualidade e em grandes quantidades.
Figura 3. À esquerda, ninho de abelhas Tubí em tronco de árvore. À direita, vista
frontal de uma Scaptotrigona bipunctata (imagens disponíveis, respectivamente, em
http://www.naturephoto-cz.eu/pic/sevcik/preview-scaptotrigona-sp.--hnizdo-vcel.jpg e
http://www.ib.usp.br/vinces/weblabs/abelhas/imagens/scaptotrigona%20vista%20fronta
l.jpg).
29
A própolis das abelhas Tubí possui, como principais fontes vegetais, a
Byrsonima sp., Acacia sp., Spermacoce latifolia, Spermacoce verticilata e
Acacia sp. e outros estudos têm demonstrado que as principais fontes vegetais
envolvidas na produção da própolis brasileira são a Araucaria heterophylla,
Clusia major, Clusia minor e espécies de Baccharis (Banskota et al., 1998).
Outras fontes menos frequentes seriam a Araucaria angustifolia, Eucalyptus
citriodora, Vernonia, Declenia, Hyptis, Myrcia, Schinus e Weinmania (Lopes et
al., 2003; Santos et al., 2003).
Dentre essas, merece destaque a Baccharis dracunculifolia, conhecida
no Brasil pelo nome “alecrim”. Análises de polens e estruturas de plantas
encontradas em amostras de própolis provenientes do cerrado brasileiro de
todo o país sugerem que as abelhas visitam e coletam resina de espécies
dessa planta (Bankova, 2000; Park, 2004).
A própolis proveniente do alecrim tem cor verde-escura e as abelhas
preferem coletar galhos e folhas jovens, contendo muita clorofila. As folhas
contêm pelos secretores, com óleos voláteis e aromáticos, de onde provem seu
aroma típico (Ferracini, 1995; Loayza, 1995).
Resultados com própolis verde em testes farmacológicos vêm
demonstrando atividade antimicrobiana (Bankova et al., 1995; Santos et al.,
2003; Orsi et al., 2005; Vural et al., 2007; da Silva Filho et al., 2008) e uma
gama variada de novos efeitos, como citotoxicidade (Banskota et al., 1998),
ativação e modulação do sistema imunológico (Murad et al., 2002; Lopes et al.,
2003; Orsi et al., 2005; Fischer et al., 2007) e antitumoral (Frenkel et al., 1993;
Messerli et al., 2008).
30
Um grande entusiasmo caracteriza os dias atuais no que se refere ao
uso da própolis para as mais diversas finalidades. A indústria de alimentos vem
utilizando extrato de própolis verde em solução glicólica como complemento
alimentar e sua associação com mel gradualmente vem substituindo o uso do
mel tradicional.
Seu uso popular é tão amplo quanto o da própolis européia e pode ser
encontrada em vários produtos fitoterápicos, como antigripais e expectorantes,
bem como na indústria de cosméticos, na composição de cremes dentais,
pomadas, sabonetes e xampus.
O interesse em quantificar os componentes da própolis brasileira levou
ao desenvolvimento de métodos de cromatografia líquida de alto desempenho
(HPLC) para a análise dos componentes fenólicos de extratos de própolis
verde e Baccharis dracunculifolia, permitindo a quantificação de 10
componentes fenólicos, o que representa um grande passo para a
padronização e o controle de qualidade dos extratos (de Sousa et al., 2007; de
Sousa et al., 2009).
1.8. Justificativa
As lesões corneanas são frequentes e respondem por grande parte dos
atendimentos oftalmológicos de urgência. Dados da Organização Mundial de
Saúde (OMS) enquadram as opacidades corneanas no rol das principais
causas de cegueira em todo o mundo (http://www.who.int/
mediacentre/factsheets/fs282/en).
As queimaduras por álcalis representam uma das formas mais sérias de
lesão e podem causar graves danos à superfície ocular e todo o segmento
31
anterior do olho, culminando com perda visual irreversível (Matsuda, 1973;
Matsuda, 1973; Ormerod et al., 1989; Wagoner, 1997). Poucos casos são
resolvidos com transplantes, mas mesmo nesse tipo de tratamento extremo as
taxas de rejeição atingem cerca de 90% (Yamada et al., 2003).
Múltiplas facetas interferem com o processo de regeneração desse tipo
de lesão, resultando na formação de cicatrizes opacas e erosões recorrentes.
Até o momento, muitas abordagens vêm sendo estudadas, com variáveis
níveis de sucesso, mas os resultados finais permanecem insatisfatórios
(Cejkova et al., 1989; Paterson et al., 1994; Pfister et al., 1997; Chang et al.,
1998).
A própolis verde, conhecida por seu poder regenerativo e anti-
inflamatório, pode contribuir para o tratamento das lesões corneanas,
especialmente as causadas por álcalis. O estudo de seus efeitos na córnea,
além de promover uma melhor compreensão de suas ações, abre
possibilidades para a futura identificação de novos princípios ativos.
Recentemente, a indústria oftalmológica passou a utilizar derivados de
extratos vegetais na composição de alguns colírios, como Higilcer®, Dinill® e
Visionom®, que contêm hidrolato de hamamelis e hidrolato de camomila. A
própria própolis já se faz presente em colírios aprovados para uso veterinário
(Queraprop® e Oftamel®).
Tal fato chama atenção para a possibilidade do uso de medicações
fitoterápicas tendo como base os próprios extratos, sem a necessidade do
isolamento de todos os seus componentes.
2. OBJETIVOS
33
O presente estudo tem por objetivos:
Verificar a validade do modelo experimental utilizado para o estudo da
regeneração corneana;
Comparar a regeneração corneana, após lesão química, entre animais
controles e tratados com colírio de extrato de própolis verde;
Comparar o processo inflamatório corneano e o padrão de migração
neutrofílica, após lesão química, entre animais controles e tratados com
colírio de extrato de própolis verde;
Quantificar e comparar, nos mesmos animais, a proliferação celular da
camada corneana epitelial basal.
3. MATERIAL E MÉTODOS
35
3.1. Desenho do estudo
Estudo experimental, realizado no Departamento de Patologia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
(FMRP-USP). Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando entre 200g e
250g. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Patologia,
em ambiente climatizado, num total de quatro animais por caixa, com livre
acesso a água e ração. A pesquisa foi previamente aprovada pela Comissão
de Ética em Experimentação Animal (CETEA), conforme certificado em anexo
(anexo A).
3.2. Lesão
Os animais foram anestesiados com Ketamina, na dosagem de
0,1mL/100g, e Xilazina, 0,07mL/100g (Parke-Davis, EUA) injetados por via
intramuscular, na coxa direita, em uma única aplicação.
Após 15 minutos da anestesia, foi feita a avaliação clínica da sedação,
testando-se estímulos táteis e dolorosos. Constatada ausência de respostas,
os animais foram submetidos a exame oftalmológico na lâmpada de fenda,
para diagnóstico de lesões pré-existentes. Os ratos que tiveram qualquer tipo
de alteração corneana diagnosticada foram retirados do experimento.
Nos animais sem lesões, foi instilada uma gota de colírio anestésico
(Proximetacaína 1%, Laboratórios Alcon, Brasil), sobre a córnea direita, com a
finalidade de reforçar a analgesia ocular e evitar o fechamento das pálpebras
no momento da lesão.
Para a determinação do centro corneano, foi utilizado um compasso
cirúrgico oftalmológico (Incol Produtos Oftalmológicos, Brasil). O diâmetro da
36
córnea foi medido, de limbo a limbo, e a altura da corneana foi medida
utilizando-se a distância do limbo à projeção do ápice corneano, conforme
representado na Figura 4. A distância do limbo ao ponto corneano central foi
calculada pelo Teorema de Pitágoras, dada pelo resultado da raiz quadrada da
soma dos quadrados das medidas do raio e da altura corneana.
Figura 4. Determinação do ápice corneano para a centralização da lesão, levando-se
em consideração as medidas da altura corneana e a metade da medida do diâmetro
.
Depois de calculada a distância do limbo ao centro da córnea, o
compasso cirúrgico foi ajustado com tal medida. A ponta de uma das hastes do
compasso foi corada com azul de metileno líquido (ADV Laboratórios Ltda.),
enquanto a outra extremidade foi posicionada sobre o limbo. Utilizando o azul
de metileno, foi feita uma pequena marca sobre o ponto central da córnea. A
confirmação pôde ser feita checando-se a distância do centro corneano ao
limbo nas regiões temporal, superior, nasal e inferior.
37
Em seguida, foi colocado sobre a córnea um instrumento especialmente
desenvolvido para o experimento, constituído de uma haste metálica com um
aro de teflon em uma das extremidades. O aro possuía abertura de 5mm de
diâmetro em sua parte central, mesma medida do diâmetro da ponta dos
bastões utilizados na lesão (Figura 5).
Com a marca de azul de metileno colocada no centro da circunferência
do aro, o instrumento, além de auxiliar na centralização e padronização da
lesão, também contribuiu para estabilizar os olhos dos animais no momento do
procedimento.
Para se realizar a queimadura química na córnea, foram utilizados
bastões constituídos de uma haste plástica e uma ponta contendo 75% de
nitrato de prata e 25% de nitrato de potássio (Graham-Field Inc, Hauppauge,
NY). Os bastões foram utilizados apenas uma vez e descartados em seguida.
A Figura 5 ilustra o descrito.
Figura 5. A. Fotografia mostrando um bastão utilizado para a lesão, com haste
plástica amarelada e ponta acinzentada, dentro do aro de teflon, de coloração azul-
clara, situado na ponta de uma haste metálica. B. Aro de teflon colocado sobre a
córnea e bastão passando pelo orifício do aro, no momento da lesão.
A
B
38
A ponta dos bastões foi mantida em contato com a região central da
córnea direita de cada animal por dois segundos, produzindo uma lesão de
1mm de diâmetro e atingindo, na profundidade, a camada epitelial e o estroma
corneano superficial.
Após 10 segundos, a região foi lavada com 10mL de solução salina. Em
seguida, foi instilada uma gota de colírio de fluoresceína e os animais, ainda
sob efeito da anestesia, foram fotografados, devolvidos às suas caixas e
levados ao biotério do Departamento de Patologia, onde permaneceram em
ambiente climatizado e com livre acesso a água e alimento.
3.3. Colírios
O colírio de própolis foi preparado na Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da USP de Ribeirão Preto, através da solubilização de extrato
seco de própolis verde a 1,0%, na forma de microemulsão, com partículas de
30nm em uma mistura composta por polietilenoglicol-6-caprilato/caprato,
poligliceril-6-dioleato, glicerídeos caprilato/caprato (10,0%) (Mackaderm
MicroExpress – McIntyre, EUA), cloreto de benzalcônio (0,01%) e água
destilada deionizada 100% por sistema MilliQ (Millipore, EUA).
A amostra de própolis verde utilizada foi obtida no Laboratório de
Biologia e Genética de Abelhas do Departamento de Genética da Faculdade de
Medicina da USP de Ribeirão Preto. Proveniente de uma região de cerrado em
Barra do Corda, no estado do Maranhão, a amostra foi obtida através da coleta
da própolis produzida pelas abelhas Tubí.
O colírio controle continha apenas o veículo utilizado no colírio de
própolis e foi obtido pela mistura de polietilenoglicol-6-caprilato/caprato,
39
poligliceril-6-dioleato, glicerídeos caprilato/ caprato (10,0%) (Mackaderm
MicroExpress – McIntyre, EUA), cloreto de benzalcônio (0,01%) e água
destilada deionizada 100%, por sistema MilliQ
.
Após a preparação, ambos os colírios possuíam pH de 6,35 e eram
soluções hidrofílicas, dado o diâmetro das partículas emulsionadas. Eles foram
filtrados por membrana filtrante de 0,22µm (Millipore, EUA) e, posteriormente,
acondicionados em frascos de colírios de polietileno. A manipulação foi
realizada em ambiente estéril, em câmara de fluxo laminar, previamente
irradiado por luz ultravioleta (MiniFlow – Marconi, EUA) e todo o material
utilizado foi previamente autoclavado a 121ºC, por 15 minutos.
3.4. Grupos
Para a medida da regeneração da lesão, 32 animais foram divididos em
dois grupos: grupo controle, com 16 animais, tratado com colírio contendo
apenas veículo (VH); e grupo tratado, com o mesmo número de animais, no
qual foi usado colírio de própolis verde (PV). Houve morte de apenas um
animal, no grupo VH, entre os tempos de 24 e 48 horas (Tabela 1).
Tabela 1: Número de animais utilizados para a medida da área nos grupos VH
(tratados com colírio de veículo) e PV (tratados com colírio de própolis verde), nos
tempos estudados.
TEMPOS VH PV
0h
16 16
12h
16 16
24h
16 16
48h
15 16
120h
15 16
40
Para a análise da inflamação, 83 animais foram divididos em dois
grupos, VH e PV. Cada um dos grupos foi dividido em cinco subgrupos,
definidos segundo o tempo decorrido desde o momento da lesão. Os animais
foram mortos com 12 horas, 24 horas, 48 horas e 5 dias (120 horas). Houve
morte de quatro animais. Os números iniciais e finais de animais em cada
subgrupo são mostrados na Tabela 2.
Tabela 2: Número de animais utilizados para a contagem neutrofílica nos grupos VH
(tratados com colírio de veículo) e PV (tratados com colírio de própolis verde) e seus
subgrupos, nos tempos estudados. Entre parêntesis, número final de animais
utilizados, nos subgrupos em que houve mortes.
Tanto nos animais utilizados para a análise da regeneração, quanto
naqueles usados para a realização da contagem neutrofílica, foram instiladas
gotas de colírio de 6/6 horas. Os grupos PV receberam colírio preparado com
extrato de própolis, administradas com auxílio dos frascos de colírios estéreis,
com volume total de 4mL e média de 43µL por gota.
O grupo controle recebeu gotas de colírio contendo o mesmo veículo, de
mesmas características físico-químicas dos colírios de extrato de própolis
verde, porém sem a presença do extrato.
Para a instilação dos colírios, os ratos foram individualmente retirados de
suas caixas e imobilizados. Nesse momento, uma gota foi pingada diretamente
TEMPOS VH PV
12h
10 (9) 10 (9)
24h
11 11
48h
11 10 (9)
120h
10 10 (9)
41
sobre a córnea direita de cada animal. Após permanecerem imobilizados por 5
segundos, para garantir o contato da medicação com a superfície corneana, os
ratos foram colocados, um a um, em uma nova caixa, a fim de se evitar a
instilação de mais de uma gota num mesmo animal.
3.5. Fotografias
Para a avaliação da regeneração corneana, os animais foram levados a
exame em lâmpada de fenda (Zeiss, modelo 2114), com máquina fotográfica
digital acoplada (Sony, Cybershot 5.1 Mpixels) por meio de um adaptador
óptico (D.F. Vasconcelos). No dia programado para a morte, os animais, após
anestesia, foram posicionados lateralmente em um suporte adaptado à
lâmpada de fenda.
O suporte, constituído de uma base acrílica e de um fixador auricular
bilateral não-traumático, foi especialmente desenhado e construído para a
fixação dos animais na lâmpada de fenda. Seu uso foi fundamental para a
padronização das fotografias, já que permitiu manter constante a distância e a
altura dos olhos lesados em relação à lâmpada de fenda (Figura 6).
Figura 6. A. Lâmpada de fenda, conectada a máquina fotográfica digital através de
sistema óptico. B. Animal anestesiado, posicionado sobre o suporte acrílico
(transparente), imobilizado através do fixador auricular (dourado).
A
B
42
Para a demarcação da área de córnea lesada, foi instilada uma gota de
colírio de fluoresceína e, em sequência, uma gota de soro fisiológico para se
retirar o excesso. A fluoresceína, que funciona como um corante de áreas
desepitelizadas, permitiu a identificação dos limites da lesão, evidenciando a
perda epitelial. Seu uso também foi importante para diferenciar os limites das
regiões desepitelizadas daqueles demarcados por depósitos de nitrato de
prata, presente nos bastões utilizados na lesão.
Sob a pálpebra inferior, foi colado um papel adesivo milimetrado, de
10mm, indicando o número do animal, seu grupo e o tempo decorrido desde a
lesão. Em seguida, a córnea foi fotografada (Figura 7).
Figura 7. A. Fotografia em aumento de 10 vezes da lâmpada de fenda, mostrando
uma córnea com 24 horas de lesão. A área desepitelizada encontra-se evidenciada
pelo colírio de fluoresceína e o papel milimetrado identifica o grupo, o tempo e o
número do animal. B. Mesma córnea, fotografada com aumento de 16 vezes.
Foram tiradas duas fotografias de cada animal, ambas utilizando luz azul
com filtro de cobalto, nos aumentos de 10 e 16 vezes, tomando-se o cuidado
de manter o alinhamento da luz da lâmpada de fenda com a região corneana
central. O alinhamento foi garantido com o auxílio de uma pinça oftalmológica,
A B
43
impedindo a rotação do olho. A marcação milimétrica dos adesivos foi utilizada
como parâmetro de referência na análise digital da medida das lesões.
3.6. Medida da área lesada
As fotografias foram armazenadas em um cartão de memória digital,
acoplado à máquina fotográfica, e levadas para análise em um computador,
com auxílio de um programa específico para execução de medidas digitais
(Image J - 1,33u, NIH, EUA). Foram utilizadas preferencialmente as fotografias
com maior aumento, que permitiram uma melhor delimitação da área lesada,
impregnada pelo corante.
Para se fazer as medidas, foi estabelecida, no programa, uma escala de
conversão, passando as informações das imagens digitais de pixels para
milímetros. Neste estudo, utilizamos fotografias de 3 Mpixels.
Para se ajustar a escala, foi definida uma distância conhecida no
adesivo milimetrado e, em seguida, feita sua medida em pixels. Uma vez feita a
conversão de pixels para milímetros, os mesmos passos foram repetidos em
cada uma das fotos analisadas.
O programa permitiu o ajuste dos contornos para a delimitação das
bordas lesadas. Finalizada essa tarefa, a área foi automaticamente calculada e
as informações, em milímetros quadrados, armazenadas em um banco de
dados para análise posterior.
44
Figura 8. A. Fotografia do mesmo animal da figura 6, com área lesada marcada pelo
corante de fluoresceína e distância conhecida ajustada, através do adesivo
milimetrado. B. Área lesada, no mesmo animal, com contornos delimitados (aumento
de 16x em ambas as fotos).
3.7. Preparação histológica
No dia programado para a coleta das córneas, os animais foram
anestesiados e levados novamente ao exame na lâmpada de fenda. Após
serem fotografados, ainda sob efeito da anestesia, os animais foram mortos
utilizando-se uma câmara de gás carbônico, localizada no biotério do
Departamento de Patologia. Depois de constatada a morte, foi feita a retirada
dos globos oculares, no centro cirúrgico do mesmo biotério.
Toda a conjuntiva bulbar do globo ocular direito foi inicialmente
dissecada, garantindo acesso ao espaço periorbitário. A dissecção se estendeu
aos músculos oculares e ao espaço retro-orbitário, expondo a esclera até a
identificação do nervo óptico, seu isolamento e secção. Foram preservadas
uma parte da conjuntiva bulbar temporal e do músculo reto lateral, no intuito de
fornecer reparo anatômico para a identificação da região limbar, além de
suporte para a manipulação dos globos no momento da preparação histológica.
A B
45
Imediatamente após a retirada do globo, foi feita uma incisão
longitudinal, com lâmina de bisturi número 11, na região escleral posterior,
próxima ao nervo óptico, com a finalidade de permitir a passagem do fixador
(formalina tamponada 10%) para a região intraocular.
Os olhos foram então colocados em frascos identificados, contendo
fixador, onde permaneceram por um período de 48 horas. Passado esse
tempo, foram levados ao centro cirúrgico do laboratório para serem cortados e
processados.
Com auxílio de lâmina de bisturi número 11, a córnea foi dividida em
metades simétricas. A incisão corneana foi prolongada, com auxílio de tesoura
cirúrgica delicada, até a região escleral, dividindo todo o globo em duas partes
semelhantes. O cristalino foi então retirado e os dois fragmentos resultantes
foram imediatamente imersos em etanol 70%.
As amostras passaram então por desidratação progressiva, em banhos
com concentrações crescentes de etanol. Foi feita diafanização e preparação
de blocos de parafina, segundo técnica clássica. As metades dos globos foram
posicionadas nos blocos de parafina, com a face corneana previamente
cortada voltada para baixo.
A partir dos blocos foram feitos cortes seriados, utilizando-se um
micrótomo manual, com montagem de um a cada três cortes (American Optical
820). A espessura dos cortes foi de 5µm e os mesmos foram montados sobre
lâminas de histologia e corados com Hematoxilina e Eosina (HE), segundo
técnica clássica.
À microscopia óptica, a lesão pôde ser identificada com o aumento de
100 vezes, através da observação da região de perda epitelial e estromal. O
46
aumento de 400 vezes permitiu a identificação e contagem dos neutrófilos. Foi
realizada a contagem manual de 4 a 6 cortes por animal.
A área da lesão foi dividida em 5 campos microscópicos. Foram
contados os campos central e periféricos, estes últimos coincidentes com a
borda da lesão. Os campos intermediários foram descartados. Os dados de
contagem neutrofílica foram analisados levando-se em consideração a
contagem no campo central (centro), a média dos dois campos periféricos
(bordas) e a soma dos três campos (neutrófilos totais). Na comparação
entre os grupos de mesmo tempo de evolução, a análise foi feita utilizando-se
as médias dos grupos.
Para o estudo da migração neutrofílica, utilizou-se a análise da
proporção dos valores médios da região central em relação àqueles obtidos da
média das bordas (centro/bordas) e em relação à média do número total de
neutrófilos (centro/total).
Figura 9. Fotomicrografia de uma córnea com 12 horas de lesão, em um animal do
grupo PV (tratado com colírio de própolis), mostrando a lesão central acastanhada,
com perda do epitélio e de parte do estroma superficial adjacente. As circunferências
representam, esquematicamente, os campos histológicos. Dos cinco campos
representados, a contagem foi feita no central e nos das extremidades, mostrados em
azul-escuro. Os campos intermediários, em azul-claro, foram desprezados. (HE 100x).
47
3.8. Imunohistoquímica
Para a quantificação histológica da regeneração tecidual, foi feita
preparação imunohistoquímica para a identificação da proteína KI-67. Tal
proteína está presente nas fases celulares relacionadas ao processo de
multiplicação celular e, principalmente, nas células em mitose. Sua ausência
nas células em estado de repouso, permite diferenciá-las daquelas que
encontram-se em processo de proliferação.
Utilizando-se os mesmos blocos de parafina, as lâminas foram cortadas,
conforme previamente descrito, e incubadas em uma estufa a 60°C, por 1 hora.
A seguir, passaram por um processo de hidratação e retirada da parafina,
permanecendo 10 minutos em xilol aquecido e 20 minutos em xilol a
temperatura ambiente. Seguiram-se dois banhos com álcool 100%, um com
álcool 95%, um com álcool 80% e um com álcool 70%. Foram, então, lavadas
com água corrente e, finalmente, com água destilada. A partir desse momento
foram mantidas úmidas.
A recuperação antigênica foi feita com desnaturação em calor úmido,
mediante incubação dos cortes em solução tampão (citrato, pH 6,0) e aquecida
(Taça de Coplin), adequada para o anticorpo usado. Foi feito banho sorológico
por 40 minutos, mantendo-se temperatura regular, entre 96 e 98 graus Celsius.
Após, a solução permaneceu 20 minutos em temperatura ambiente.
A fase de bloqueio da peroxidase endógena foi feita colocando-se as
lâminas em uma bandeja e lavando-as com PBS (Phosphate Buffered Salin)
por 3min. Os cortes foram então incubados com peróxido de hidrogênio a 3%,
por 10min e à temperatura ambiente, e lavados duas vezes com PBS por 3min
e duas vezes com TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20), por 3min.
48
Para o bloqueio dos anticorpos inespecíficos foi preparada uma solução
de leite desnatado a 3% (Molico, Nestlé) com Tris-HCl (trometamina, pH 7,6) e
Tween 0,05% (Sigma, EUA). Foi feita uma diluição de 1:50 com soro normal
de cavalo. O período de incubação foi de 10min, em temperatura ambiente.
A ligação do anticorpo específico foi feita pingando-se o anticorpo
primário já diluído, na proporção de 1:200. Foi utilizado anticorpo KI-67 (clone
MM1, Novocastra, Newcastle Upon Tyne, Reino Unido). A incubação durou 2
horas e foi feita em temperatura ambiente. Após, as lâminas foram lavadas
com TBST, por 4min, três vezes consecutivas.
A ligação do anticorpo secundário (NovoLink, Novocastra, Newcastle
Upon Tyne, Reino Unido) foi realizada 30min após. O período de incubação foi
de 30min, em temperatura ambiente, e as lâminas foram lavadas com TBST
por 4min, três vezes consecutivas.
Secas, as lâminas foram contracoradas com HE e levadas a microscópio
óptico. No aumento de 400 vezes, foi feita a contagem manual do número total
de células na camada corneana epitelial basal, em cinco campos adjacentes.
Segui-se a contagem, nos mesmos campos, do número de núcleos marcados
pela coloração (Figura 10).
49
Figura 10. Fotomicrografia de lâmina de imunohistoquímica para identificação de KI-
67, em animal do grupo VH 12h (tratado com colírio de veículo por 12 horas). As setas
indicam as células marcadas.
A análise da expressão de KI-67 foi realizada no mesmo número de
animais utilizados para a contagem neutrofílica (Tabela 2), através da relação
entre o número de células marcadas e o número total de células presentes na
camada basal. Por fim, foi obtido o índice de positividade, através do cálculo do
número de células marcadas em relação ao total de 1000 células
aleatoriamente selecionadas, pela fórmula descrita abaixo:
IP = Número de células positivas x 100
1.000 células aleatórias
50
3.9. Análise estatística
Os dados foram organizados em tabelas e gráficos, utilizando-se
ferramentas convencionais de estatística descritiva, através de média ± erro
padrão. A análise comparativa dos resultados foi realizada com teste U Mann-
Whitney, através do programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad software Inc.,
2007), sendo considerada evidência de significância com P menor que 0,05.
4. RESULTADOS
52
4.1. Demonstração do modelo
As fotografias propiciaram uma análise precisa da área da lesão.
Nas córneas lesadas houve deposição de nitrato de prata, proveniente dos
bastões utilizados. Tais depósitos apresentavam coloração acinzentada e
brilho metálico, ficando mais evidentes nas primeiras 12 horas, quando
ocupavam toda a área de perda epitelial. Com o passar do tempo,
passaram a uma coloração mais fosca e enegrecida e, com 24 horas,
deixaram de ser coincidentes com os limites da área lesada, concentrando-
se em algumas regiões isoladas da lesão.
As fotografias abaixo exemplificam as lesões encontradas nos
diversos tempos estudados.
Figura 11. Fotografias de lesões corneanas nos diversos tempos estudados, em
diferentes animais. A. Fotografia tirada imediatamente após a lesão. B. Lesão
após 12 horas. C. Após 24 horas. D. Após 48 horas.
A
B
C
D
53
4.2. Análise da área de lesão
Observou-se que os animais tratados (grupo PV) apresentaram uma
diminuição mais acelerada da área desepitelizada, medida em mm², que
aqueles do grupo VH (Figura 12).
Figura 12. Fotografias das lesões corneanas nos diversos tempos do estudo,
comparando o grupo controle, tratado com colírio de veículo (VH, fotos da coluna da
esquerda) com o tratado com colírio de própolis verde (PV, coluna da direita). A e B.
Fotos tiradas imediatamente após a lesão. C e D. 12 horas após a lesão. E e F. 24
horas após a lesão. G e H. 48 horas após a lesão.A média das medidas de área
lesada foi semelhante entre os dois grupos no tempo zero, com fotos tiradas
imediatamente após a realização da lesão (0,0389 ± 0,0017 e 0,0342 ± 0,0014, nos
grupos VH e PV, respectivamente).
F E
C
A
B
C
D
F
E
H
G
54
Após 12 horas, houve diferença estatisticamente significativa entre os
grupos (0,0291 ± 0,0012 e 0,0160 ± 0,0030, para VH e PV, respectivamente).
No tempo de 24 horas, as diferenças observadas entre os grupos foram ainda
maiores (0,0163 ± 0,0021 no grupo VH e 0,0076 ± 0,0022 no grupo PV).
Depois de 48 horas de lesão, ainda foram observadas diferenças
significativas entre os dois grupos (0,0075 ± 0,0009 e 0,0031 ± 0,0007, para os
grupos VH e PV, respectivamente) e, no tempo de 120 horas, o epitélio se
apresentou refeito, com ausência de lesões em ambos os grupos. A Tabela 3
mostra as médias das medidas de área (em mm²), o erro padrão e a
significância estatística da comparação entre os grupos e o Gráfico 1 traz a
representação em barras de tais valores. Não são apresentados os resultados
após 120h de lesão, já que os animais de ambos os grupos apresentaram
cicatrização completa do epitélio.
Tabela 3. Distribuição das médias das medidas de área (em mm² ± erro padrão), nos
diversos tempos, nos os dois grupos estudados.
TEMPOS VH PV P
0h
0,0389 ± 0,0017 0,0341 ± 0,0014
0,1978
12h
0,0291 ± 0,0012 0,0160 ± 0,0030
0,0032
24h
0,0163 ± 0,0021 0,0076 ± 0,0022
0,0007
48h
0,0075 ± 0,0009 0,0031 ± 0,0007
0,0019
120h
0,00 0,00 -------
55
VH 0h PV 0h VH 12h PV 12 h VH 24h PV 24h VH 48h PV 48h
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Grupos
Áreas (mm
2
)
0 12
2
4
4
8 120
0
20
40
60
80
100
120
VH
PV
Tempo (h)
Área (%)
Gráfico 1. Distribuição da área média da lesão de córnea nos grupos VH (tratado com
colírio de veículo) e PV (tratado com colírio de própolis verde), em todos os tempos
estudados, com exceção de 120h.
O Gráfico 2 representa a redução, em porcentagem, da área lesada,
para ambos os grupos.
Gráfico 2. Redução da área lesada em relação à área inicial, expressa em
porcentagem, para o grupo VH (tratado com colírio de veículo) e PV (tratado com
colírio de própolis verde).
56
4.3. Análise histológica da lesão
4.3.1. Análise qualitativa da lesão
Na região lesada, observou-se perda do epitélio corneal e do estroma
superficial. O exame das lâminas em microscópio óptico permitiu a
identificação da área de lesão e de seus limites. A impregnação de parte do
nitrato de prata proveniente dos bastões tornou ainda mais evidente o local
lesado.
Nas adjacências da lesão, bem como no estroma sob a área lesada,
houve acúmulo de grande quantidade de células, percebidas no aumento de
100 vezes. A identificação das mesmas, feita com mais facilidade no aumento
de 400 vezes, permitiu constatar a presença predominantemente de neutrófilos,
mas também de outras células, como macrófagos e linfócitos. Contudo, foi
observado predomínio de neutrófilos.
No tempo de 12 horas pôde ser constatada a perda da camada epitelial
e de parte do estroma superficial, com necrose local e deposição de prata
originária dos bastões na região lesada. Foi notada desorganização do arranjo
das lamelas colágenas estromais, acúmulo de células inflamatórias,
especialmente nas bordas lesadas, e grande edema estromal.
Após 24 horas de lesão, foi notada redução do edema estromal e
diminuição do depósito de prata. As lamelas estromais apresentaram-se mais
organizadas e as células inflamatórias passaram a se acumular
preferencialmente no centro da lesão.
O tempo de 48 horas mostrou achados semelhantes ao de 24h, com
celularidade preferencialmente central. Contudo, houve grande redução da
57
área epitelial e do estroma superficial lesados, associados com diminuição do
edema e reorganização do padrão de lamelas do estroma.
No tempo de 120h, foi observada epitelização completa da lesão, com
ausência de edema e retomada do padrão estromal em praticamente todas as
lâminas. As células inflamatórias, em menor quantidade que nos outros
tempos, passaram a se distribuir igualmente nas regiões correspondentes ao
centro e bordas anteriormente lesados.
Figura 13. Microfotografia de um corte histológico da córnea de um animal do grupo
VH (tratado com colírio de veículo), com 12h de lesão. Observar área de necrose
superficial no centro da lesão, com ausência de epitélio, infiltrado inflamatório e
material escurecido nas camadas mais superficiais, compatível com impregnação pela
prata. HE – 100x.
Figura 14. Microfotografia do mesmo corte histológico, mostrando em detalhe a
presença de edema, debris celulares, desorganização da distribuição das lamelas
colágenas estromais e moderada quantidade de neutrófilos. HE- 400x.
58
4.3.2. Contagem neutrofílica
A contagem do número total de neutrófilos nas lâminas coradas com HE
não mostrou diferença significante entre os grupos VH e PV no tempo de 12
horas (150,44 ± 8,98 e 150,33 ± 10,82, para VH e PV, respectivamente).
No tempo de 24 horas, foi observada diferença estatisticamente
significativa na comparação do número de neutrófilos entre os grupos VH e PV
(448,55 ± 21,71 no grupo VH e 354,73 ± 9,66 no grupo PV). A significância
estatística também foi notada na comparação das contagens entre os grupos
no tempo de 48 horas (408,00 ± 16,47 e 326,70 ± 13,29, para VH e PV,
respectivamente). Deve-se ressaltar que as maiores diferenças entre as
contagens dos dois grupos foram observadas no tempo de 24 horas.
No tempo de 120 horas, as contagens neutrofílicas voltaram a não
apresentar diferenças significativas entre os grupos (82,18 ± 19,99 e 56,91 ±
9,95, para os grupos VH e PV, respectivamente). Os resultados são mostrados
na Tabela 4.
Tabela 4. Distribuição das médias da contagem do número total de neutrófilos
(número de células por córnea) nos diversos tempos do estudo, no grupo VH (tratado
com colírio de veículo) e PV (tratado com colírio de própolis verde).
TEMPOS VH PV P
12h
150,44 ± 8,98
150,33 ± 10,82
1,0000
24h
448,55 ± 21,71 354,73 ± 9,66 0,0006
48h
408,00 ± 16,47 326,70 ± 13,29 0,0014
120h
82,18 ± 19,99 56,91 ± 9,95 0,3752
59
12h 12h 24h 24h 48h 48h 120h 120h
0
100
200
300
400
500
VH
PV
Tempo (h)
Número de Neutrófilos
O Gráfico 3 traz a representação em barras da contagem neutrofílica
dos grupos VH e PV, em cada um dos tempos estudados. O Gráfico 4 mostra a
representação linear desses valores.
Gráfico 3. Distribuição da média da contagem do número total de neutrófilos nos
tempos estudados, em gráfico de barras, para o grupo VH (tratado com colírio de
veículo) e PV (tratado com colírio de própolis verde).
Gráfico 4. Distribuição da média da contagem do número total de neutrófilos nos
tempos estudados, em curva linear, para o grupo VH (tratado com colírio de veículo) e
PV (tratado com colírio de própolis verde).
12 24
4
8 120
0
200
400
600
VH
PV
Tempo (h)
Número de Neutrófilos
60
0 12
2
4
4
8 120
0
20
40
60
80
100
0
100
200
300
400
500
Área VH (%)
Área PV (%)
Neutr. totais VH
Neutr. totais PV
Tempo (h)
Porcentagem
N° de neutrófilos
O Gráfico 5 correlaciona a área de regeneração, em porcentagem, com
o número total de neutrófilos, em valores absolutos, para ambos os grupos.
Gráfico 5. Correlação entre o percentual de área regenerada e o número total de
neutrófilos, em valores absolutos, para o grupo VH (tratado com colírio de veículo) e
PV (tratado com colírio de própolis verde), nos tempos estudados.
4.4. Migração neutrofílica
A análise da migração dos neutrófilos foi feita através de dois
parâmetros. O primeiro foi o cálculo da proporção entre o número de neutrófilos
presentes no centro da lesão e o número total de neutrófilos nos três campos
analisados. Tal relação foi denominada “centro/total” e serviu como medida
indireta da inflamação no centro da lesão e da velocidade de migração dessas
células, já que é sabido que os neutrófilos migram da região do limbo corneano
até a área lesada.
Abaixo, a Tabela 5 apresenta a relação centro/total. Na comparação
entre os grupos VH e PV, não se observou diferença estatisticamente
61
12 24
4
8 120
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
VH
PV
Tempo (h)
Contagem Centro/Total
significativa em nenhum dos tempos estudados. O Gráfico 6 traz a
representação da relação em ambos os grupos, com a comparação entre eles.
Tabela 5: Relação centro/total no grupo VH (tratado com colírio de veículo) e PV
(tratado com colírio de própolis verde), em todos os tempos estudados.
Gráfico 6. Proporção centro/total das médias das contagens neutrofílicas, no grupo
VH (tratado com colírio de veículo) e PV (tratado com colírio de própolis verde).
O segundo parâmetro foi dado pela proporção entre a contagem
neutrofílica no centro da lesão e a média da contagem nas bordas lesadas. Ele
foi denominado “centro/bordas” e também serviu como medida indireta da
TEMPOS VH PV
P
12h
0,23 ± 0,0120
0,26 ± 0,0078
0,0939
24h
0,36 ± 0,0043 0,39 ± 0,0163 0,1150
48h
0,36 ± 0,0045 0,41 ± 0,0219 0,1286
120h
0,48 ± 0,0247 0,47 ± 0,0352 0,3578
62
12
2
4
4
8 120
0
50
100
150
200
VH Centro
VH Bordas
Tempo (h)
Número de Neutrófilos
12
2
4
4
8 120
0
50
100
150
200
PV Centro
PV Bordas
Tempo (h)
Número de Neutrófilos
velocidade de migração dos neutrófilos envolvidos no processo inflamatório, já
que correlaciona a quantidade de células que atingiu o centro com aquela
presente na periferia da lesão.
Os Gráficos 7 e 8 apresentam as contagens neutrofílicas no centro e a
média das contagens nas bordas, nos grupos VH e PV, respectivamente.
Gráfico 7. Contagem do número de neutrófilos no centro e média das contagens nas
bordas da lesão, em todos os tempos do experimento, para o grupo VH (tratado com
colírio de veículo).
Gráfico 8. Contagem do número de neutrófilos no centro e média das contagens nas
bordas da lesão, em todos os tempos do experimento, para o grupo PV (tratado com
colírio de própolis).
63
12
2
4
4
8 120
0
1
2
3
VH
PV
Tempo (h)
Proporção Centro/Bordas
Na comparação da proporção centro/bordas entre VH e PV, não se
observou diferença significativa em nenhum dos tempos estudados. A Tabela 6
e o Gráfico 9 mostram esses resultados.
Tabela 6. Proporção centro/bordas no grupo VH (tratado com colírio de veículo) e PV
(tratado com colírio de própolis verde), em todos os tempos estudados.
TEMPOS VH PV P
12h
0,73 ± 0,0407 0,73 ± 0,0295 0,4363
24h
1,15 ± 0,0217 1,32 ± 0,1038 0,1150
48h
1,15 ± 0,0224 1,43 ± 0,1494 0,1286
120h
2,02 ± 0,224 2,03 ± 0,3596 0,3578
Gráfico 9. Curva linear da relação centro/bordas no grupo VH (tratado com colírio de
veículo) e PV (tratado com colírio de própolis verde), em todos os tempos do estudo.
4.5. Imunohistoquímica (KI-67)
Os ensaios imunohistoquímicos evidenciaram uma adequada marcação
de células epiteliais, primordialmente nas duas primeiras fileiras da camada
64
basal. A intensidade de coloração variou pouco nos diversos cortes histológicos
e, para a realização da contagem, optou-se por considerar as células epiteliais
francamente marcadas, apenas na primeira fileira da camada basal.
Após a contagem, a determinação do índice de positividade (IP) de cada
grupo se deu pelo cálculo da média da contagem celular de todos os cortes
estudados, em todos os animais do respectivo grupo. No tempo de 12 horas foi
observada a maior diferença de todos os tempos estudados (P<0,0001), com
valores de IP consideravelmente maiores no grupo PV (46,66 ± 0,02 no grupo
VH e 63,72 ± 0,02 para o grupo PV). O tempo de 24 horas também mostrou
diferença significativa entre os dois grupos (64,24 ± 0,02 e 74,15 ± 0,02, para
os grupos VH e PV, respectivamente), porém menor que o tempo anterior. O
tempo de 48 horas apresentou valores semelhantes entre os grupos, sem
diferenças estatisticamente significantes (61,74 ± 0,01 e 58,05 ± 0,02, para os
grupos VH e PV, respectivamente) (Tabela 7 e Gráfico 10).
Tabela 7. IP de células marcadas na camada basal da córnea pela coloração com KI-
67, no grupo VH (tratado com colírio de veículo) e PV (tratado com colírio de própolis
verde), nos três tempos estudados.
TEMPOS VH PV P
12h
46,66 ± 0,0150 63,72 ± 0,0199 <0,0001
24h
64,24 ± 0,0186 74,15 ± 0,0195 0,0067
48h
61,74 ± 0,0130 58,05 ± 0,0209 0,1412
65
Gráfico 10. Índice de positividade da marcação com KI-67 no grupo VH (tratado com
colírio de veículo) e PV (tratado com colírio de própolis verde), nos tempos estudados.
VH 12h PV 12h VH 24h PV 24h VH 48h PV 48h
0.2
0.4
0.6
0.8
VH
PV
Grupos
Células marcadas/Total
4.6. Compilação dos resultados
A Tabela 8 traz, em conjunto, os resultados do experimento
apresentados acima.
Tabela 8. Compilação das medidas de área, contagem total de neutrófilos, relação
centro/total, relação centro/bordas e IP para o grupo VH (tratado com colírio de
veículo) e PV (tratado com colírio de própolis verde), nos tempos estudados (*:
P<0,05).
Grupos Área
Total de
Neutófilos
Neutófilos
Centro/Total
Neutrófilos
Centro/Borda
Imuno
VH 0h 0,03894 -------------- ------------------ ------------------- --------------
PV 0h 0,03419 -------------- ------------------ ------------------- --------------
VH 12h 0,02919* 150,44 0,2393 0,7325 46,66*
PV 12h 0,01606* 150,33 0,2693 0,7396 63,72*
VH 24h 0,01638* 448,55* 0,3651 1,152 64,24*
PV 24h 0,00762* 354,73* 0,3927 1,321 74,15*
VH 48h 0,00753* 408,00* 0,3659 1,1565 61,74
PV 48h 0,00318* 326,70* 0,4108 1,439 58,05
VH 120h 0,00 82,18 0,4896 2,026 --------------
PV 120h 0,00 56,91 0,4728 2,030 --------------
5. DISCUSSÃO
67
5.1. Introdução
As lesões de córnea são frequentes e, pela própria anatomia do órgão,
estão entre as afecções oftalmológicas mais corriqueiras. A compreensão e o
tratamento de tais lesões e dos mecanismos que as acompanham são
fundamentais para a manutenção de uma boa saúde ocular e muitos esforços
vêm sendo feitos para o desenvolvimento de novas opções terapêuticas.
Este é o primeiro estudo da ação corneana da própolis verde. Sabe-se
que ela possui mais de duzentas substâncias diferentes em sua composição,
incluindo ácidos benzóicos, flavonóides e derivados do ácido cinâmico
(Bankova et al., 1995; Marcucci, 1995; Velikova et al., 2000; Orsi et al., 2005;
Salatino et al., 2005; Shimazawa et al., 2005; Nakajima et al., 2007; Barros et
al., 2008; de Sousa et al., 2009).
Enquanto a própolis vermelha tem a maioria de suas substâncias na
forma lipofílica, a própolis verde é rica em substâncias hidrofílicas, o que nos
levou a optar pela formulação de um extrato utilizando água destilada como
diluente, ao invés de etanol (Matsui et al., 2004; Shimazawa et al., 2005;
Nakajima et al., 2007).
O etanol é tóxico para as células epiteliais da córnea e o uso de extratos
alcoólicos poderia alterar a regeneração da área corneana lesada pelos
bastões de nitrato de prata (Marshall et al., 1981; Bolkova, 1983; Grutters et al.,
2002; Kim et al., 2002).
Os extratos aquosos, obtidos a partir da própolis verde, possuem ações
antioxidativas e inibitórias sobre certas enzimas, superiores àquelas
conseguidas com etanol. Eles são ricos em terpenóides e derivados dos ácidos
cumárico, cafeoilquínico e cinâmico e é provável que seus constituintes
68
apresentem efeitos sinérgicos (Miyataka et al., 1997; Miyataka et al., 1998;
Matsui et al., 2004; Nakajima et al., 2007).
A titulação utilizada, de 1%, é a de uso mais frequente nos estudos
envolvendo extratos vegetais. É sabido que a própolis vermelha causa dano às
células epiteliais corneanas de ratos quando em concentrações a partir de
7,81mg/mL (Vural et al., 2007). Assim, apesar de não haver estudos
específicos sobre a toxicidade corneal da própolis verde, a concentração de
0,01mg/mL, equivalente à titulação de 1%, é dotada de uma ampla margem de
segurança em relação às concentrações tóxicas observadas para a própolis
vermelha.
Acredita-se que as características da própolis verde e suas diferenças
em relação à vermelha provêm da variedade da flora brasileira e de suas
particularidades em relação à européia. Não se sabe exatamente quais as
plantas utilizadas na produção da própolis, inclusive na utilizada no
experimento, mas é provável que as abelhas Tubí coletem amostras de
diversas plantas, já que têm a característica de passarem a maior parte da vida
envolvidas com as atividades de polinização e produção de mel e própolis.
Não existem dados comparando os diversos tipos de própolis verde
existentes no país, já que poucas amostras tiveram suas substâncias
identificadas. As mais pesquisadas, provenientes de regiões do cerrado do
sudeste do país, provavelmente têm muitos componentes em comum com a
amostra utilizada no experimento, também produzida em uma região de
cerrado, no estado do Maranhão, e com incidência de tipos semelhantes de
plantas.
69
Dentre as diversas ações biológicas relacionadas à própolis verde,
podemos citar: antibacteriana, anti-inflamatória, antioxidativa, analgésica,
antimutagênica, antitumoral, imunomoduladora e regenerativa. Além disso, ela
apresentou efeitos sobre as formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi,
formas promastigotas de Leishmania braziliensis e no tratamento de úlceras
gástricas (Bankova et al., 1995; Shimazawa et al., 2005; Paulino et al., 2006;
Bufalo et al., 2007; Fischer et al., 2007; Barros et al., 2008; da Silva Filho et al.,
2008; Missima, 2008; Munari et al., 2008; Paulino et al., 2008; Pontin et al.,
2008).
Vários autores reportaram efeitos colaterais com o uso da própolis
vermelha. Os principais foram os efeitos alérgicos e, dentre as mais de
quinhentas substâncias encontradas na própolis vermelha, os ésteres do ácido
cafeico e as agliconas de flavonóides foram as mais alergênicas (Young, 1987;
Hashimoto et al., 1988; Hausen, 1988; Burdock, 1998; Callejo et al., 2001).
Tais componentes inexistem nas variedades tropicais da própolis e, até
o momento, estudos realizados com essas amostras mostraram ausência de
reações alérgicas e de outros efeitos colaterais (Rubio et al., 1999; Ledon et al.,
2002).
Recentemente, os extratos aquosos de própolis verde vêm sendo
testados em estudos oftalmológicos e alguns trabalhos mostraram ação
neuroprotetora em células ganglionares da retina, tanto em modelos usando
estímulos neurotóxicos e dano isquêmico (Shimazawa et al., 2005) quanto em
outros utilizando dano oxidativo (Nakajima et al., 2007). Vale ressaltar que tais
estudos foram inicialmente desenvolvidos in vitro, com células ganglionares de
70
ratos e porcos, e que os resultados se mantiveram nas investigações in vivo,
em ratos.
Os mecanismos fisiopatológicos pelos quais a própolis verde manifesta
suas ações também têm sido foco de atenção. Foi observado, nos dois
trabalhos citados acima, que seu uso reduziu tanto a morte neuronal quanto a
apoptose das células ganglionares. Além disso, reduziu a quantidade de
radicais livres, gerando proteção contra o estresse oxidativo induzido por
peroxidação lipídica.
A proteção dada pela própolis e seus componentes contra o estresse
oxidativo também foi foco de estudos em outros órgãos e os resultados
encontrados foram semelhantes, mostrando proteção contra a morte celular
causada pelas formas tóxicas derivadas do oxigênio (Tsai et al., 2006; Ozyurt
et al., 2007; Altug et al., 2008).
Em estudos levando em consideração o sistema imunológico, foi
observado que a própolis verde, além de estimular a produção de anticorpos,
aumenta a dispersão de macrófagos pelos tecidos. Apesar de importante, o
presente trabalho teve como foco o processo inflamatório agudo, envolvendo
principalmente células neutrofílicas.
Tais achados, entretanto, contribuem para uma melhor compreensão
dos mecanismos fisiopatológicos que envolvem a ação da própolis verde, mas
sua elucidação necessita de mais investigações (Tatefuji et al., 1996; Sforcin
et al., 2005).
71
5.2. Modelo experimental
A córnea é um ótimo órgão para estudo. Dada sua posição anatômica,
existe uma grande facilidade de abordagem de suas estruturas. Ela pode ser
examinada através de microscópios, lupas, lâmpadas de fenda, microscopia
confocal ou mesmo a olho nu, permitindo a realização de lesões ou injeção de
substâncias.
Apesar de a maioria dos estudos de lesão corneana utilizar coelhos,
fizemos opção por realizar o estudo em ratos. Os modelos de lesão em coelhos
geralmente utilizam poucos animais, dado sua dificuldade de obtenção e
manutenção.
Dentre as várias maneiras de se fazer a lesão corneana, a debridação
mecânica, o uso de álcool em variadas concentrações e o uso do hidróxido de
sódio são, juntamente com as lesões por nitrato de prata, as mais comuns (Oh,
et al., 2009; Lee et al., 2008).
Tais lesões são, geralmente, são mais superficiais. No caso específico
das lesões com NaOH, um papel poroso de formato circular embebido em
NaOH é colocado sobre a córnea e aí deixado por 60 segundos. Após a
retirada do papel, a córnea é lavada com soro fisiológico, deixando uma lesão
regular e arredondada (Chung, 1989; Chung et al., 1989; Chung et al., 1996;
Chung et al., 1998; Li et al., 1999; Kim et al., 2001; Liu et al., 2005).
As variações descritas na literatura em relação à concentração de
NaOH, o diâmetro do papel e o tempo de contato com a superfície corneana
são muitas, o que naturalmente gera diferença entre a profundidade
encontrada nas lesões (Ormerod et al., 1989; Girard et al., 1991; Du et al.,
2008; Kawamura et al., 2008; Rihawi et al., 2008; Wang et al., 2008). Além
72
disso, a quantidade de líquido presente nos poros do papel faz com que as
bordas lesadas sejam menos precisas do que com os bastões de nitrato de
prata, fato também observado nas lesões por álcool, já que os líquidos podem
se espalhar pelas adjacências das bordas.
O uso de ratos traz as facilidades de obtenção e manuseio, permitindo
estudos com um maior número de animais, o que é vantajoso quando se testa
a ação de uma nova droga e o uso de bastões com pontas sólidas para a lesão
contribui para que a mesma tenha uma dimensão definida e regular.
Outro ponto positivo do modelo é o fato de que ele possibilita o estudo
concomitante da regeneração e inflamação da córnea, enquanto os modelos de
desepitelização mecânica, que geram apenas efeito de remoção tecidual,
promovem uma inflamação de menor magnitude.
Os modelos de lesão corneana central por bastões de nitrato de prata já
são utilizados há algum tempo (Sunderkotter et al., 1991) e seu uso vem
aumentando consideravelmente ao longo dos anos (Mahoney, 1985; Sonoda et
al., 1998; Ogawa et al., 1999; Totan et al., 2001; Hanif et al., 2003; Wenk, 2003;
Wenk et al., 2003; Oshima et al., 2006; Zhang et al., 2006; Barros, 2007;
Carneiro et al., 2007; Erdurmus et al., 2007; Lai et al., 2007; Manzano et al.,
2007; Aydin et al., 2008; Hurmeric et al., 2008; Oshima et al., 2008).
Neste estudo, muitas precauções foram tomadas no sentido de se
executar uma lesão uniforme, de dimensões semelhantes entre os animais e
no exato centro corneano. As medidas com compasso e o uso do aro de teflon
foram usadas com essa finalidade.
Apesar disso, ocorreram pequenas diferenças na dimensão da área
lesada entre os animais, o que pôde ser constatado nas medidas de área
73
lesada inicial. Tais diferenças, insignificantes do ponto de vista estatístico,
provavelmente ocorreram devido a pequenas movimentações dos bastões ou
do aro, já que os animais permaneceram imóveis, sob efeito da anestesia
sistêmica e ocular.
A profundidade da lesão foi variável entre os animais. Ela atingiu toda a
espessura do epitélio corneano, chegando inclusive a ultrapassá-lo na maioria
dos casos, lesando também as camadas mais superficiais do estroma.
Essa foi uma desvantagem do modelo utilizado, já que a lesão da
membrana basal do epitélio pode atrasar o processo de regeneração, pois
promove interações diretas de mediadores entre epitélio e estroma, tornando o
processo de reparação mais intrincado e lento.
O exame na lâmpada de fenda em um suporte que manteve constante a
distância de foco permitiu a obtenção de fotografias padronizadas e a
identificação das bordas lesadas, bem como a avaliação longitudinal da
regeneração epitelial.
Nos estudos-piloto, antes da construção do suporte, as fotografias foram
tiradas posicionando-se os ratos sobre a bancada do laboratório, sem auxílio
da lâmpada de fenda. A análise foi feita com o próprio aumento digital da
máquina, mas as medidas trouxeram grandes diferenças entre si, já que no
momento das fotos a visibilização a olho nu não permitia fazer o correto
alinhamento do eixo central do olho com a lente da máquina fotográfica.
Apesar da melhora do padrão das fotos com o exame na lâmpada de
fenda, ainda era necessário segurar os animais na altura da objetiva do
aparelho, o que também impossibilitava o alinhamento da lesão. Após a
construção do suporte, com os animais estabilizados em uma distância
74
padronizada e com o auxílio de uma pinça oftalmológica, foi possível se obter
fotos com um preciso alinhamento da lesão corneana em relação à objetiva da
lâmpada de fenda.
No estudo da evolução da área cicatrizada, foi observado que o epitélio
refeito era diferente do epitélio íntegro fora da área lesada. Após se instilar o
colírio de fluoresceína, a área desepitelizada corava intensamente, mas foi
observado que a área recém-epitelizada também permitia a passagem do
corante, em menor grau, provavelmente pelo restabelecimento incompleto das
ligações entre as células.
A gota de solução salina, pingada logo após a fluoresceína, foi
importante para se retirar o excesso de corante, permitindo a diferenciação
entre o epitélio refeito e a área desepitelizada. Após alguns minutos, a
fluoresceína passava ao estroma, corando frustramente uma área extensa,
inclusive extrapolando os limites da área de lesão inicial e impossibilitando a
identificação das áreas com ausência de epitélio. Assim, seu uso, nos primeiros
minutos após sua instilação, foi de grande valia para a análise da área
5.3. Regeneração
No presente experimento, observamos tempos de regeneração
superiores a 48 horas. Apesar de não ter sido determinado o tempo exato de
fechamento de cada lesão provocada, é possível inferir que tenha sido mais
próximo de 48h do que 120h, já que o grupo VH apresentava, no tempo de
48h, 81% da lesão regenerada, enquanto o grupo PV apresentava 92% da área
lesada re-epitelizada. Tais achados são condizentes com a literatura, pois a
75
natureza e a profundidade da lesão provavelmente contribuíram para o tempo
de regeneração prolongado, especialmente no grupo VH.
A cascata de regeneração corneana envolve mecanismos de interação
entre epitélio, estroma e sistema imunológico. A apoptose dos ceratócitos,
mitose e migração epitelial, necrose de células estromais, proliferação de
ceratócitos, criação de miofibroblastos, deposição de colágeno e a infiltração
de células inflamatórias são algumas das várias etapas de tal processo, que é
mediado por citocinas derivadas das próprias células corneanas, imunes e da
glândula lacrimal (Wilson et al., 2001; Li et al., 2006).
A regeneração corneana é essencial para a manutenção de uma boa
visão e, evolutivamente, funcionou como pressão seletiva para que
persistissem indivíduos com regeneração rápida e eficaz. Para se ter uma idéia
da velocidade do processo, estudos de microscopia eletrônica mostraram que
se um rato for morto, tiver seu olho retirado e em seguida for feita uma lesão na
córnea antes de fixá-la, os ceratócitos anteriores apresentam condensação de
cromatina e outras alterações morfológicas relacionadas ao processo de
apoptose, primeiro evento na cascata de regeneração (Wilson et al., 2001).
O tempo de regeneração, contudo, depende de vários aspectos, como a
extensão, profundidade e mecanismo causador da lesão, idade e estado
imunológico do paciente, entre outros. As lesões causadas por trauma, como
as desepitelizações mecânicas utilizadas em alguns experimentos, tendem a
regenerar mais rapidamente do que aquelas causadas por álcalis.
Em ratos, a variabilidade no tempo anotado para a regeneração é muito
grande, segundo o mecanismo de lesão. As desepitelizações mecânicas
regeneram-se mais rapidamente, com tempo ao redor de 24 horas (Li et al.,
76
2006), enquanto aquelas causadas por álcalis podem levar até dez dias
(Yamada et al., 2003).
Tais diferenças se devem às particularidades existentes nas
queimaduras químicas, que envolvem diferentes tipos de mediadores
(Matsuda, 1973; Matsuda, 1973; Ishizaki et al., 1993; Daniels et al., 2003; Zhao
et al., 2003; Parks et al., 2004; Li et al., 2006) e geram uma resposta
inflamatória maior do que aquelas observadas nas córneas lesadas por
desepitelizações mecânicas (Planck et al., 1997; Zhao et al., 2000).
Nas lesões por álcalis, os neutrófilos e as demais células inflamatórias
liberam enzimas proteolíticas e desencadeadoras de oxidação, causando
degradação da matriz estromal e dificultando sua reorganização (Slansky et al.,
1969; Berman et al., 1980; Berman et al., 1983; Kao et al., 1986; Berman,
1993; Geerling et al., 1999; Yamada et al., 2003).
Além disso, essas lesões são mais profundas, podendo acometer a
membrana basal epitelial. Já foi demonstrado que a perda de tal estrutura faz
com que haja interações diretas entre epitélio e estroma corneano, causando
alterações e atraso no processo de regeneração (Matsubara et al., 1991;
Daniels et al., 2003; Daniels et al., 2003; Daniels et al., 2003; Stramer et al.,
2003; Fini, 2005; Gabison et al., 2008)
Uma crítica a ser levada em consideração é o fato de que, no presente
estudo, não foi feito um terceiro grupo, com a mesma lesão e seguimento,
porém sem uso de qualquer medicação. Como o número de ratos utilizados
aumentaria sobremaneira, foi optado por definir como foco do trabalho a
descrição dos efeitos da própolis verde, comparando-os apenas com os do
grupo VH.
77
O menor tempo de regeneração observado no grupo PV, nos tempos de
12, 24 e 48 horas, provavelmente está relacionado a uma associação dos
efeitos de seus componentes. Seus efeitos anti-inflamatório, antioxidante e pró-
mitótico foram descritos em vários estudos. É provável que, com a menor
migração neutrofílica observada, haja menor liberação de mediadores
inflamatórios, citocinas e enzimas proteolíticas, facilitando a regeneração da
matriz estromal.
A reposição das células epiteliais é feita a partir das mitoses que
ocorrem na camada epitelial basal, única camada do epitélio corneano capaz
de se reproduzir, e pelas mitoses ocorridas no limbo, onde células
indiferenciadas (stem cells) iniciam um processo de reprodução acelerada após
a detecção de uma lesão corneana (Sun, 1977; Schermer et al., 1986;
Cotsarelis et al., 1989; Lavker et al., 1991; Tseng, 1996; Boulton, 2004).
No presente estudo, não foi possível concluir se a motilidade das células
epiteliais estaria ou não aumentada, pois o próprio aumento na produção de
novas células epiteliais, detectado na camada basal epitelial pela
imunohistoquímica, poderia favorecer o processo de regeneração, diminuindo o
tempo de reparação da lesão. Não foi feita a análise específica da reprodução
celular na região do limbo, mas a análise qualitativa das lâminas marcadas com
KI-67 aponta para uma provável taxa de mitose aumentada em relação às
demais regiões corneanas.
5.4. Inflamação
A inflamação corneana e os distúrbios visuais secundários aos
processos inflamatórios são eventos comuns, que ocorrem com as
78
queimaduras químicas, infecções bacterianas, ceratites herpéticas e rejeições
de transplantes. O infiltrado inflamatório, o edema e a neovascularização
decorrentes da inflamação podem levar à opacificação irreversível da córnea
afetada e os neutrófilos que migram para a região acometida têm participação
fundamental na manutenção da transparência corneana (Sonoda et al., 2005).
Neste estudo, a medida indireta da inflamação, feita através da
contagem do número total de neutrófilos na região lesada, mostrou aumento
dessas células no tempo de 12 horas. Como a quantidade de neutrófilos na
córnea de ratos é pequena em situação normal (Brissette-Storkus et al., 2002;
Hamrah et al., 2002; Hamrah et al., 2003), podemos concluir que uma
importante migração neutrofílica ocorre nas primeiras 12 horas após a lesão e
que o efeito do colírio de própolis não reduz tal migração, já que não houve
diferença significativa entre os grupos.
No tempo de 24 horas, a contagem praticamente triplica no grupo VH e
atinge valores quase duas vezes e meia maiores no grupo PV. Os valores
anotados nesse tempo são os maiores para os dois grupos e a diferença entre
ambos leva a crer que o colírio de própolis tem efeito significativo na redução
da inflamação entre 12 e 24 horas após a lesão.
A ação do colírio provavelmente se mantém entre 24 e 48 horas, pois a
diferença estatisticamente significativa continua existindo entre os grupos.
Contudo, foi observado que as contagens neutrofílicas nos grupos VH e PV
variaram pouco em relação às respectivas contagens no tempo de 24 horas.
O tempo de 120 horas mostra valores de contagem neutrofílica
semelhantes nos dois grupos. É importante observar que, tanto no grupo VH
quanto no PV, há redução de aproximadamente 80% do número de células em
79
relação ao tempo de 48 horas, o que aponta para uma diminuição proporcional
na contagem neutrofílica dos grupos.
Assim, o pico de infiltração neutrofílica se deu com 24 horas e a ação da
própolis pôde ser observada nos tempos do experimento superiores a 12
horas, com maior redução do número de neutrófilos no tempo de 24 horas e
manutenção da diferença entre os grupos nos tempos seguintes.
Tais resultados são condizentes com a maioria dos achados da
literatura, nos quais o pico de contagem neutrofílica foi observado entre 18 e 24
horas (Wenk et al., 2003; Lin et al., 2007; Lin et al., 2008), apesar de
contrastarem com alguns trabalhos, nos quais o pico observado se deu 12
horas após a lesão (Li et al., 2006).
Em relação ao padrão de migração neutrofílica, o uso da própolis não
trouxe alterações importantes. Na análise dos parâmetros centro/total e
centro/bordas, foi observado que a quantidade de neutrófilos presentes no
centro e nas bordas da lesão não variou entre os grupos.
Tais resultados sugerem que a ação anti-inflamatória da própolis na
córnea preserva a velocidade de migração das células neutrofílicas envolvidas
no processo inflamatório. Possivelmente, a ação de seus componentes se dá
nos mecanismos de liberação de mediadores, como citocinas e outros
quimiotáxicos. Resultados semelhantes foram observados no estudo da ação
corneana anti-inflamatória de outras substâncias (Li et al., 2006; Biteman et al.,
2007; McInnis et al., 2007; Lin et al., 2008; Patil et al., 2008; Pillai et al., 2008).
80
5.5. Perspectivas
Os processos de inflamação e regeneração corneana são
interdependentes e o equilíbrio entre eles é fundamental para garantir, nos
casos de lesões, a adequada reparação epitelial, a melhora da inflamação e o
restabelecimento da transparência corneana.
Na clínica oftalmológica atual, o tratamento das desepitelizações de
córnea é feito com colírios lubrificantes, antibióticos tópicos ou pomadas
contendo antibióticos e vitaminas. Contudo, para o tratamento das inflamações,
os corticóides são a primeira escolha.
Além de seus conhecidos efeitos colaterais, como catarata e glaucoma,
tais drogas atrasam a regeneração das lesões de córnea (Chung et al., 1998).
Por esse motivo, nas lesões corneanas graves, como queimaduras por álcalis,
síndrome de Stevens-Johnson e disfunções límbicas, seu uso aumenta o risco
de infecções secundárias, aprofundamento da lesão para o estroma e
perfuração.
Uma regeneração lenta é normalmente acompanhada de muitos
sintomas oculares, como sensação de corpo estranho, fotofobia e
lacrimejamento. Nesses casos, o especialista se vê forçado a regular a dose da
medicação segundo avaliações clínicas freqüentes. O atraso da regeneração
posterga a retomada das atividades habituais pelo paciente, gerando limitação
em suas atividades corriqueiras e, frequentemente, a perda de vários dias de
trabalho.
A proposta deste estudo foi descrever a ação corneana de uma nova
droga, à base de um extrato vegetal, para uso no tratamento concomitante das
inflamações e desepitelizações corneanas. O extrato de própolis verde em
81
questão, na forma de colírio com concentração de 1%, se mostrou capaz de
acelerar a regeneração e reduzir a inflamação na córnea de ratos.
O isolamento e teste dos componentes da própolis verde têm sido foco
de estudos recentes em oftalmolgia. Até o momento, o ácido cafeico e seus
derivados mostraram os efeitos mais promissores, com ação antivasogênica,
neuroprotetora e antioxidativa na córnea, além de efeito protetor contra a
radiação ultravioleta em células conjuntivais (Keshavarz et al., 2009; Nakagima
et al., 2006; Ozguner et al., 2006; Totan et al., 2001).
Novos estudos poderão se seguir a este, contribuindo para o isolamento
de novas substâncias e a elucidação dos mecanismos de ação da própolis
verde e fica a expectativa de que suas ações possam ser, futuramente,
viabilizadas para aplicações clínicas.
6. CONCLUSÕES
83
O modelo experimental desenvolvido permite a avaliação da
regeneração corneana.
O colírio da amostra de própolis verde utilizada, na concentração de 1%,
reduz o tempo de regeneração corneana após lesão causada por álcali.
O número total de neutrófilos na córnea é reduzido pelo uso do colírio
em questão.
A aplicação tópica do colírio não altera o padrão de migração das
células neutrofílicas, mantendo as relações entre os neutrófilos
encontrados no centro e nas bordas das áreas lesadas.
A proliferação celular observada na camada epitelial basal da córnea
aumenta com o uso do colírio de própolis verde a 1%.
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8. ANEXO
105
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
ANEXO DE PUBLICAÇÃO
Effect of green propolis in the corneal inflammation and regeneration
Luiz Fernando Taranta Martin, Jayter Silva de Paula
Departament of Ophthalmology, Otorhinolaringology Head and Neck Surgery of Facult
of Medicine of Ribeirão Preto of Universit of São Paulo
2
ABSTRACT
Purpose: The aim of this study was to investigate the effects of Brazilian green
propolis, a widely used folk medicine, in cornea wound healing and inflammation.
Methods: 32 Wistar male rats had the center of their right corneas treated with a silver
nitrate applicator stick to produce a superficial lesion of 1mm in diameter. The area of
injury was photographed and measured in times 0, 12, 24, 48 and 120 hours. Rats were
divided in two groups. Group green propolis (PV), which received topic application of
eye drops containing microemulsion of green propolis 1% and group vehicle (VH),
which received the same eye drops without propolis. Inflammatory response was
measured in 83 rats by neutrophil count in the lesion area. Besides counting the total
number of neutrophils, two other parameters were used. The ratio of neutrofils in the
center of lesion compared to the total count (center/total) and compared to the number
of neutrophils found in the borders of the lesion (center/borders) in times 12, 24, 48 and
120 hours. Regeneration was also assessed by determining the number of mitosis in
corneal basal layer, by immunohistochemistry with KI-67. Results: A significant
statistical difference between groups was found in wounded area measures in times 12,
24 and 48 hours (P<0,05), with values considerably lower in group PV. No differences
were found in time 0h and after 120 hours both groups had injured areas completely re-
epithelized. Total neutrophil count showed no significant differences in time 12h. In
times 24 and 48 hours the number of neutrophils was significantly reduced in group PV
(P<0,05) and in time 120h there was no statistical difference between groups. Neither
ratio center/total nor center/borders showed significant differences in any of the times
studied. Count of Immunohistochemistry marked cells showed statistical differences
(P<0,05) between VH and PV in times 12 and 24 hours, but not in 48 hours.
Conclusions: Topically applied green propolis reduced wound healing time and the
3
inflammatory response after alkali burn. Neutrophil migration pattern was not altered by
the use of eye drops.
Key words: Green propolis, alkali burn, cornea regeneration, cornea inflammation, KI-
67.
4
Introduction
Corneal epithelium plays important roles in the maintenance of corneal function
and integrity. Prolonged corneal epithelial defects may cause corneal opacity,
neovascularization, bacterial infection, and visual loss. To prevent such complications,
corneal epithelial wounds must be re-epithelialized as quickly as possible.
Propolis (honeybee glue), a resinous product consisting of sap, bark and bee
excreta, accumulates in bee hives. It is currently used as a health food and for the
treatment of various ailments. Indeed, it has been shown to have a wide range of
biological activities, principally attributable to the presence of flavonoids (major
component; rutin, quercetin, galangin, etc.) (Isla, Nieva Moreno et al. 2001) and caffeic
acid phenethyl ester (CAPE) (Natarajan, Singh et al. 1996). Hence, the putative
therapeutic properties of propolis could be related to its antibacterial (Bankova,
Marcucci et al. 1996; Drago, Mombelli et al. 2000), anti-inflammatory (Mirzoeva and
Calder 1996), antioxidativa (Krol, Czuba et al. 1990; Scheller, Wilczok et al. 1990)
and/or tumoricidal (Matsuno, Jung et al. 1997; Chen, Weng et al. 2004) activities.
In total, at least 200 compounds have been identified in different samples of
propolis, with more than 100 being present in any given sample. These include: fatty
and phenolic acids and esters, substituted phenolic esters, flavonoids (flavones,
flavanones, flavonols, dihydroflavonols, chalcones), terpenes, ß-steroids, aromatic
aldehydes and alcohols, and derivatives of sesquiterpenes, naphthalene and stilbenes
(Bankova, Christov et al. 1995; Tatefuji, Izumi et al. 1996; Marcucci, Ferreres et al.
2000; Velikova, Bankova et al. 2000). Propolis has a variety of botanical origins, and its
chemical composition can also be variable. Baccharis dracunculifolia DC (Asteraceae),
a native plant from Brazil, is the most important botanical source of Brazilian propolis,
known as green propolis because of its color (Park, Alencar et al. 2002; Kumazawa,
5
Yoneda et al. 2003; Park, Paredes-Guzman et al. 2004; Salatino, Teixeira et al. 2005).
In recent years, green propolis has been widely studied because of its characteristic
chemical composition and biological activities (Marcucci, Ferreres et al. 2001). In many
countries Brazilian propolis is used extensively in foods and beverages with the aim of
maintaining or improving human health (Trusheva, Popova et al. 2006; Paulino, Abreu
et al. 2008; Pontin, Da Silva Filho et al. 2008). However, to our knowledge, this is the
first time its effect is studied in the cornea inflammation and wound healing.
Methods
Animals
All experimental procedures were approved by the Ethics and Animal
Experiments Committee at the University of Ribeirão Preto, São Paulo University and
conform to established guidelines.
Lesion
Wistar male rats 250–300 g were deeply anaesthetized with halothane (4%, in air), and
the centers of their right corneas cauterized with a silver nitrate applicator stick (75%
silver nitrate, 25% potassium nitrate; Graham-Field Inc, Hauppauge, NY). The
applicator was held in contact with the cornea for 2 s, producing a discrete grayish-
white lesion 1 mm in diameter. The cauterized eye was then rinsed several times with
room temperature saline. Rats recovered fully from anesthesia within a few minutes,
and exhibited no outward signs of distress.
6
Photographs
After lesion animals were taken to slit lamp examination. A drop of fluorescein
was used to the lesion. They were held in focus position by a fixation device commonly
used for stereotaxic surgical procedures and attached to a plastic basis for supporting the
animals (Fig 1). Photographs were taken in five time points: immediately after the
lesion was performed (time 0) and within 12, 24, 48 and 120 hours. Animals had a
paper sticked to the inferior eyelid, informing their group, number and time after lesion.
The paper also contained a rule of 1mm for posterior measurement of wounded areas
and conversion from pixels to millimeters.
In the slit lamp we used the cobalt blue light and the zoom of 16 times.
Photographs of 3 Mpixels were taken by a digital camera (Sony, Cybershot 5.1
Mpixels) connected to the slit lamp by an optic system (D.F. Vasconcelos, Brazil).
Images were taken from the digital camera to a computer and wound areas were
delimited and isolated by image software (Image J - 1,33u, NIH, USA).
Figure 1. Slit lamp with the fixation device, optic system and digital camera.
A
B
7
Eye drops
In this experiment we used a green propolis obtained from the Northeast region of
Brazil, State of Maranhão. This kind of propolis is produced by a species of bee called
Scaptotrigona sp, which spends most of its life producing honey and propolis and is
specially known for local people because its healing properties. It was obtained in its
dry form to maintain its properties.
In the Pharmacy University of Ribeirão Preto propolis was diluted in a solution of
polyethylene-6-caprylate/caprate, polyglyceryl-6-dioleate, glycerides caprylate/caprate
(10.0%) (Mackaderm MicroExpress - McIntyre), benzalkonium chloride (0.01%) and
distilled deionized water by MilliQ system (Millipore™). A microemulsion of green
propolis was prepared in the concentration of 1%. Another eye drop without green
propolis was prepared in the same way for using in the control group.
After preparation both medication were filtered in filtering membrane of 0,22µm
(Milipore™) and stored in eye drops polyethylene bottles. Eye drops manipulation was
made in sterile conditions, in a laminar flux camera irradiated with ultraviolet light
(MiniFlow – Marconi™). All the material used was previously sterilized in a
temperature of 121ºC, for 15 minutes.
Groups
Animals were divided in two groups. The green propolis group (PV) received eye drops
with the medication while the vehicle group (VH) received eye drops contained the
vehicle without green propolis. Drops were applied four times daily and animals were
sacrificed after 12, 24, 48 and 120 hours after lesion time.
8
Histology and Immunohistochemistry
On the day scheduled for collection of corneas, the animals were anesthetized
and taken to examination in the slit lamp. After being photographed, still under
influence of anesthesia, they were sacrificed in a carbon dioxide chamber and slides of
corneas were prepared. Histological cuts of 5µm were performed and preparations were
made using Hematoxilyn and Eosin, according to classic technique.
Slides were taken to optic microscope and were analyzed in 400 times
magnification. Three fields were used for cell counting. The center of the lesion was
determined and counting of neutrophils was performed in this area. Right and left
adjacent fields were excluded and the next fields were also analyzed, both in the right
and in the left borders of the lesion. The same procedure was repeated in another slide
for each animal.
For histological quantification of regeneration immunohistochemistry was made
using the identification of the KI-67 protein, present in the cell phases related to the
multiplication process.
The same paraffin blocks previously described went through a process of
hydration and removal of the paraffin. Antigen retrieval was performed by incubation
of slides in heated buffer solution (citrate, pH 6.0) suitable for the antibody used.
Endogenous peroxidase blocking was performed washing slides with PBS (Phosphate
buffered Salin) for 3min. They were then incubated with hydrogen peroxide 3% for 10
minutes at ambient temperature, and washed twice with PBS for 3 minutes and twice
with TBST (Tris-buffered Saline Tween-20) for 3min.
For blocking the nonspecific antibody a solution of skim milk in the
concentration of 3% was prepared (Molico, Nestle) using also Tris-HCl (tromethamine,
pH 7.6) and 0.05% Tween (Sigma, USA). A dilution of 1:50 with normal horse serum
9
was made. Binding of specific antibody was done by dripping the primary antibody
diluted in the proportion of 1:200. Antibody KI-67 was used (clone MM1, Novocastra,
Newcastle Upon Tyne, UK). Binding of secondary antibody (NovoLink, Novocastra,
Newcastle Upon Tyne, UK) was performed after 30min. After dried, slides were then
taken to an optical microscope, and the magnification of 400 times was used for
counting the number of marked corneal epithelial cells in the basal layer in five adjacent
fields.
Results
Wounded area
Digital analysis of the photographs with the wounded areas stained by
fluorescein was used to calculate the wounded area (Figs. 2 and 3). There was a
significant statistical difference between the two groups in times 12, 24 and 48 hours
(P<0,01). No differences were found in time 0h, confirming that a similar lesion was
made in both groups. After 120 hours of lesion all animals presented complete re-
epithelialization (Table 1).
Table 1. Distribution of area measurement (mm² ± standard error) in the different times
for both groups.
TIME VH PV P
0h
0,0389 ± 0,0017 0,0341 ± 0,0014
0,1978
12h
0,0291 ± 0,0012 0,0160 ± 0,0030
0,0032
24h
0,0163 ± 0,0021 0,0076 ± 0,0022
0,0007
48h
0,0075 ± 0,0009 0,0031 ± 0,0007
0,0019
120h
0,00 0,00 -------
10
Figure 2. Digital photographs of stained wounded areas of animals of both groups in all
times studied.
A
B
C
D
F
E
H
G
11
0 12
2
4
4
8 12
0
0
20
40
60
80
100
120
VH
PV
Time (h)
Area (%)
Figure 3. Percentage of wounded area reduction in both groups.
Neutrophil count
In the vicinity of the lesion and in stromal region under the injured area there was
accumulation of a considerable quantity of cells, seen in the microscope magnification
of 100 times. The identification of cells, performed in 400 times magnification found
the presence of other cells in the region of injury, as macrophages and lymphocytes, but
with predominance of neutrophils (Fig. 4).
Figure 4. A. Cornea photomicrograph of an animal of group VH, 12 hours after lesion.
It is possible to observe the accumulation of cells under the wounded area (HE - 100x).
B. Neutrophils under the area of lesion in the same animal (HE – 400x).
12
Neutrophils were identified and counted in both groups. No statistically
significant difference was found between groups after 12 hours of lesion. After 24 and
48 hours a significant difference was found (P<0,05), with differences more marked in
time 24 hours. After 120 hours of lesion neutrophil count showed no statistical
difference between groups (Table 2 and Figure 5).
Table 2. Distribution of averages of neutrophil count in both groups in the various times
studied.
TIME VH PV P
12h
150,44 ± 8,98
150,33 ± 10,82
1,0000
24h
448,55 ± 21,71 354,73 ± 9,66 0,0006
48h
408,00 ± 16,47 326,70 ± 13,29 0,0014
120h
82,18 ± 19,99 56,91 ± 9,95 0,3752
12h
2
4h
4
8h 120h
0
100
200
300
400
500
VH
PV
Time (h)
Number of neutrophils
Figure 5. Distribution of neutrophil count averages in linear curve.
13
0 12
2
4
4
8 120
0
20
40
60
80
100
0
100
200
300
400
500
Area VH (%)
Area PV (%)
Number of neutrophils VH
Number of neutrophils PV
Time (h)
Area (%)
Number of neutrophils
Figure 6. Correlation between healed area (in percentage) and neutrophil count in both
groups.
The analysis of neutrophil migration was performed by two parameters. The first
was the ratio between the number of neutrophils in the center of the lesion, counted in
the central histological field, and the total number of neutrophils counted in the three
fields examined. This ratio was called "center / total" and served as an indirect measure
of inflammation in the center of the lesion and the rate of migration of these cells, as is
well known that neutrophils migrate from the corneal limbus to the injured area. No
statistical difference was found between groups in the times studied (Table 3).
Table 3: Center/total parameter in both groups in the different times studied
TIME VH PV
P
12h
0,23 ± 0,0120
0,26 ± 0,0078
0,0939
24h
0,36 ± 0,0043 0,39 ± 0,0163 0,1150
48h
0,36 ± 0,0045 0,41 ± 0,0219 0,1286
120h
0,48 ± 0,0247 0,47 ± 0,0352 0,3578
14
The second parameter was the ratio between neutrophil count in the center and
in the borders injured. It was called "center/borders" and served as an indirect measure
of the migration speed of neutrophils involved in the inflammatory process, since it
correlates the number of cells that reached the center of the lesion with the number of
cells present in the periphery of the wounded area. No statistical difference was found in
the times studied (Table 4).
Table 4: Center/borders parameter in both groups in the different times studied
TIME VH PV P
12h
0,73 ± 0,0407 0,73 ± 0,0295 0,4363
24h
1,15 ± 0,0217 1,32 ± 0,1038 0,1150
48h
1,15 ± 0,0224 1,43 ± 0,1494 0,1286
120h
2,02 ± 0,224 2,03 ± 0,3596 0,3578
Immunohistochemistry (KI-67)
Immunohistochemical essays showed an adequate staining of epithelial cells,
primarily in the first two rows of the epithelial basal layer. The intensity of staining
varied little in different histological sections and for counting only cells marked frankly
in the first row were considered. After counting, the index of positivity (IP) was
calculated by the average of cell counts in all animals of each group.
A significant statistical difference was found between both groups in time 12
hours, with the index considerably higher in the group PV (P<0,0001). Time 24 hours
also showed a significant difference (P<0,01) and no difference was found in time 48
hours, as showed in Figure 7.
15
VH 12h PV 12h VH 24h PV 24h VH 48h PV 48h
20
40
60
80
Groups
KI-67 Positivity index
Figure 7. KI-67 positivity index in both groups.
Discussion
Cornea lesions are common. Because its external position, corneal surface
injuries are among the most frequent lesions of the eye. The understanding and
treatment of such injuries and the mechanisms that accompany them are critical to the
maintenance of good eye health and many efforts have been made to develop new
therapeutic options. To our knowledge, this is the first study to describe the effects of
green propolis in a cornea wound healing model.
Aqueous extracts obtained from green propolis have antioxidative properties and
inhibitory actions on certain enzymes, greater than those obtained with ethanolic
extracts. They are rich in terpenoids and derivatives of coumaric acid, caffeoylquinic
acid and cinnamic acid and its probable that its components have synergistic effects
(Miyataka, Nishiki et al. 1997; Miyataka, Nishiki et al. 1998; Matsui, Ebuchi et al.
2004; Nakajima, Shimazawa et al. 2007).
16
The concentration of 1% used is the most frequent in studies involving plant
extracts. It is known that red propolis cause damage to the corneal epithelial cells of rats
when in concentrations of 7.81 mg / mL (Vural, Polat et al. 2007). Thus, although there
are no specific studies on corneal toxicity of green propolis, the concentration of 1%
(0.01 mg / mL) is probably safe to corneal epithelium.
The pathophysiological mechanisms by which green propolis expresses its
effects have also been focus of attention. In the eye it was observed that its use reduced
both neuronal death and apoptosis of retinal ganglion cells (Shimazawa, Chikamatsu et
al. 2005; Nakajima, Shimazawa et al. 2007). Furthermore, it reduced the amount of free
radicals, generating protection against oxidative stress induced by lipid peroxidation.
Mechanical desepithelizations regenerate faster than those caused by alkali burn
(Yamada, Dana et al. 2003; Li, Burns et al. 2006). Such differences are due to
peculiarities of chemical burns, which involve different types of mediators (Ishizaki,
Zhu et al. 1993; Saika, Kobata et al. 1993; Daniels, Geerling et al. 2003; Zhao, Ma et al.
2003; Parks, Wilson et al. 2004), generate an inflammatory response greater than those
observed in mechanically injured corneas and triggers oxidation, causing degradation of
the stromal matrix (Berman, Manseau et al. 1983; Berman 1993; Planck, Rich et al.
1997; Geerling, Joussen et al. 1999; Zhao, Chen et al. 2000; Yamada, Dana et al. 2003).
In the present experiment, we observed that complete epithelization occurred
with more than 48 hours. Although the exact re-epithelization time was not determined,
it seems it was closer to 48 than to 120h, as the VH group had, in time of 48h, 81% of
lesions regenerated while the PV group had 92% of the injured area healed. These
findings are consistent with the literature findings cited above. The nature and depth of
the injury probably contributed to the prolonged time of regeneration, especially in the
VH group.
17
The replacement of epithelial cells is made from mitosis that occur in the basal
epithelial layer and the mitoses occurring in the limbus, where stem cells begin a
process of rapid reproduction after detection of a corneal lesion (Sun and Green 1977;
Schermer, Galvin et al. 1986; Cotsarelis, Cheng et al. 1989; Lavker, Dong et al. 1991;
Tseng 1996; Boulton and Albon 2004). In this study mitosis in the limbus were not
measured, but measurements in the corneal epithelial basal layer with KI-67 showed an
intense cell reproduction in the group PV, especially after 12 hours of lesion, suggesting
a mechanism of action that justifies the fact that wounds are more rapidly healed in the
group using propolis.
The indirect measure of inflammation by counting the total number of
neutrophils in the injured region showed an increase in the time of 12 hours. As the
number of neutrophils in the cornea of rats is small in normal situation (Brissette-
Storkus, Reynolds et al. 2002; Hamrah, Zhang et al. 2002; Hamrah, Liu et al. 2003), we
can conclude that a significant neutrophil migration occurs in the first 12 hours after
injury and that the effect of drops of propolis does not reduce this migration, since there
was no statistically significant differences between groups.
In the time of 24 hours, the counting almost tripled in the VH group and reached
values almost two and a half times higher in group PV. Values recorded at this time are
the highest for both groups and the difference between them suggests that the drops of
propolis have significant effect in reducing inflammation between 12 and 24 hours after
injury. In time of 48 hours differences still exist although they are not as marked as
times before. In time 120 hours there is a reduction of approximately 80% of cells
comparing to the time of 48 hours and no statistical differences are found between
groups.
18
These results are consistent with most findings in the literature, in which the
peak of neutrophil count was observed between 18 and 24 hours (Wenk and Honda
2003; Li, Rumbaut et al. 2006; Lin, Carlson et al. 2007; Lin, Jackson et al. 2008). The
use of propolis apparently did not change the pattern of neutrophil migration. When
analyzing the data of center/total and center/borders, it was observed that the quantity of
neutrophils present in the center and the borders of the lesion did not vary between
groups.
These results suggest that anti-inflammatory action of propolis preserves the
migration pattern of neutrophil cells involved in the inflammatory process. Possibly, the
action of its components is given in the mechanisms of mediators release such as
cytokines and chemotaxines. Similar results were observed in the study of corneal anti-
inflammatory action of other substances and further studies are needed to determine the
mechanisms by which green propolis exerts its effects (Li, Rumbaut et al. 2006;
Biteman, Hassan et al. 2007; McInnis, Britain et al. 2007; Lin, Jackson et al. 2008;
Patil, Bellner et al. 2008; Pillai, Beutelspacher et al. 2008).
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