ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
Instituto de Ciências Exatas - Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Manoela Ruchiga Balesteros
DESENVOLVIMENTO E OTIMIZAÇÃO DE
METODOLOGIA PARA ANÁLISE DE ATRAZINA E
SEUS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA E
ELETROFORESE CAPILAR
Juiz de Fora
2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Manoela Ruchiga Balesteros
DESENVOLVIMENTO E OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA ANÁLISE DE
ATRAZINA E SEUS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO POR CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA E ELETROFORESE CAPILAR
Dissertação apresentada ao
Departamento de Química da
Universidade Federal de Juiz de Fora
como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do título de Mestre em
Química
Orientador: Prof. Dr. Marcone Augusto Leal de Oliveira
Co-Orientadora: Dra. Viridiana Santana Ferreira-Leitão
Juiz de Fora
2009
ads:
Balesteros, Manoela Ruchiga
Desenvolvimento e otimização de metodologia para análise
de atrazina e seus produtos de degradação por cromatografia
líquida de alta eficiência e eletroforese capilar.
134 f. :il.
Dissertação (Mestrado em Química)-Universidade Federal
de Juiz de Fora, Juiz de Fora, 2009.
1. Herbicidas. 2. Biodegradação ambiental. 3. Cromatografia
líquida de alta eficiência. 4. Eletroforese capilar de zona. I.
Título.
CDU 632.954
Dedico esta dissertação a minha avó e minha mãe que me
ensinaram a lutar por tudo na vida
Aos meus irmãos Bernardo e Elio e minha cunhada Fátima
pelo amor e a torcida
Minha sobrinha Laura por me mostrar a cada dia
como é bom viver
Ao meu marido Raphael por todo amor, carinho e
companheirismo dedicados a mim.
Amo vocês!
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Profº Marcone, muito obrigada pela confiança, respeito e
dedicação ao longo da minha vida científica.
A minha co-orientadora Viridiana Ferreira-Leitão, muito obrigada por toda
confiança, respeito, carinho e dedicação.
Aos colegas do GQAQ Adriana, Fernando, Vívian e Patrícia pelo carinho e
torcida.
A Maryane pela ajuda no trabalho por eletroforese capilar.
A Vanézia e a Carla pela amizade e acolhida.
As amigas Mara e Valéria pelo carinho, mesmo distante.
A todos da DCAP em especial, Lúcia, Michele, Ana Paula, Joice, Maria Alice,
Vânia e Adriene pelo incentivo e carinho.
A Lílian por toda ajuda nos ensaios de extração em fase sólida.
A Patrícia pelo companheirismo e ajuda nos trabalhos com o fungo Pleurotus
ostreatus.
A amiga Lívian que sempre me incentivou, ajudou e me levantou muitas
vezes.
A Débora, Cristiano e Ricardo por todo incentivo no início do trabalho.
A Andréa Mattos pelas contribuições durante o mestrado.
A Dra Irene Alleluia pelo incentivo no trabalho científico.
Ao Laboratório de Cogumelos Comestíveis do Setor de Microbiologia Agrícola
da UFLA – Universidade Federal de Lavras por ter gentilmente cedido o fungo.
As professoras Nádia e Cherrine por participarem da banca de qualificação e
por todas as contribuições.
A Dra. Claudete Kunigami por toda presteza e delicadeza nos ensaios de
cromatografia gasosa.
A Dra Edna Maria Oliveira e Maria Auxiliadora Mattos por participarem da
banca e por todas as colaborações.
A todos que contribuíram para o meu crescimento científico e moral.
Ao CNPq pela bolsa concedida.
MUITO OBRIGADA!
“No final tudo dá certo,
se ainda não deu certo
é porque não chegou o final”
Fernando Sabino
RESUMO
A atrazina é um herbicida muito utilizado em culturas de grande expressão
econômica como o milho e a cana-de-açúcar. Entretanto, sua ampla utilização pode
provocar o acúmulo deste herbicida, ou ainda dos seus derivados de degradação,
em matrizes ambientais, tais como solo e água. O presente estudo teve como
objetivo o desenvolvimento de metodologias para a análise de atrazina e derivados
por eletroforese capilar (EC) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e
aplicação destas metodologias na detecção e quantificação destes compostos na
degradação da atrazina pelo fungo Pleurotus ostreatus.
As melhores condições cromatográficas para análise de atrazina, simazina e
propazina por CLAE foram obtidas utilizando como fase móvel ACN/H
2
O 30/70
(v/v%), coluna analítica C18 150 x 4,6 mm 5 µm, fluxo de 1 mL/min, temperatura de
25 °C e detecção em 221nm. Antecedendo as análises por CLAE foram realizadas
extrações liquido-liquido com acetato de etila.
A análise de atrazina, desetilatrazina (DEA), deisoprilatrazina (DIA),
hidroxiatrazina (HA), desetildeisopropilatrazina (DEDIA), desetilhidroxiatrazina
(DEHA) e deisopropilhidroxiatrazina (DIHA) foi realizada por EC em meio não
aquoso. O eletrólito consistiu de Tris-HCl 100 mmol/L em ACN/MeOH 50/50 (v/v%),
com comprimento total do capilar de 48,5 cm (comprimento efetivo 40 cm), 25 °C,
+20 kV, 50 mbar/1s, detecção em 221 nm e tempo de análise de 9 min. Apesar de
ocorrer a coeluição de três compostos nesta separação (HÁ, DEHA, DEDIA), o curto
tempo de análise e uso de pequenos volume de solvente orgânico faz com que o
método seja utilizado de forma qualitativa na análise de atrazina e seus produtos de
degradação, indicando os possíveis compostos presentes. A análise destes
compostos por CLAE foi realizada utilizando-se como fase móvel ACN/Tampão
fosfato de sódio 5 mmol/L pH 7,2 em um gradiente de eluição, com um fluxo de 1
mL/min, temperatura de 25 °C, em 221 nm. Apesar do tempo de análise elevado (70
min), esta metodologia permite a quantificação de todas as triazinas estudadas.
Portanto as duas técnicas desenvolvidas podem ser utilizadas em conjunto, já que a
identificação dos compostos pode ser realizada por CE sem utilizar grandes volumes
de solventes orgânicos em um curto intervalo de tempo, e sua quantificação pode
ser realizada por CLAE.
A degradação promovida por P. ostreatus num período de 15 dias, gerou
majoritariamente o derivado DEA. A formação deste composto foi observada por
CLAE e confirmada por CG-MS, ratificando que as metodologias desenvolvidas no
presente trabalho podem ser utilizadas em matrizes aquosas complexas, apesar de
possuírem LODs superiores aos determinados pela legislação.
Palavras – chaves: Atrazina. Cromatografia líquida de alta eficiência. Eletroforese
capilar. Biodegradação.
ABSTRACT
Atrazine is an herbicide widely used on crops of major economic relevance as
corn and sugar cane. The widespread use of this herbicide can cause its
accumulation or contamination of environmental matrices. In addition, the
degradation products of atrazine also deserve attention. This study aims to develop
methodology for the analysis of atrazine and its derivatives by capillary
electrophoresis (CE) and high performance liquid chromatography (HPLC). Both
methodologies developed during the present work, HPLC and CE, were applied to
the detection and quantification of atrazine and its degradation products after
treatment using the white-rot fungus Pleurotus ostreatus.
The best chromatographic conditions for atrazine, simazine and propazine
analysis by HPLC were obtained using as mobile phase ACN/H
2
O 30/70 (v/v%), with
analytical column C18 (150 X 4.6 mm 5µm), flow of 1 mL/min, temperature at 25 °C
and detection at 221 nm . Liquid-liquid extractions with ethyl acetate were performed
before the HPLC analyses.
Analysis of atrazine, desetilatrazina (DEA), deisoprilatrazina (DIA),
hidroxiatrazina (HA), desetildeisopropilatrazina (DEDIA), desetilhidroxiatrazina
(DEHA) and deisopropilhidroxiatrazina (DIHA) was performed by CE in a non-
aqueous medium (NACE) . The electrolyte consisted of Tris-HCl 100 mmol/L in ACN
/ MeOH 50/50 (v/v%) with total capillary length of 48.5 cm (effective length of 40 cm)
Experimental conditions were: cartridge temperature at 25 ° C, voltage applied of +20
kV, injection of 50 mbar.1s, detection at 221 nm and the analysis time of 9 min.
Despite the co-elution of three compounds (HA, DEHA, DEDIA), due to the short time
of analysis and the use of small quantity of organic solvent, the method is very useful
for the screening of atrazine and its degradation products. The HPLC analysis of
these compounds was performed using as mobile phase ACN / sodium phosphate
buffer 5 mmol/L (pH 7.2) under gradient elution mode, flow of 1 mL/min, temperature
at 25 ° C and wavelength at 221 nm. Although the long time required for the analysis
(70 min), the methodology allows the quantification of all triazines compounds
studied. Therefore, the two methodologies developed can be used in a
complementary way, since that the compounds identification can be performed by
CE without using large volumes of organic solvents in a short time analysis; and their
quantification can be performed by HPLC.
The degradation promoted by P. ostreatus during a period of 15 days
generated predominantly the DEA derivative. The degradation product obtained was
detected by HPLC and confirmed by GC-MS, supporting that the methodologies
developed in this work can be used in complex aqueous matrices, successfully.
Keywords: Atrazine. High performance liquid chromatography. Capillary
electrophoresis. Biodegradation.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.1
Participação percentual dos estados brasileiros no valor das
vendas de defensivos agrícolas em 2006.
27
Figura 1.2
Participação percentual das classes de agroquímicos no valor
das vendas de defensivos agrícolas no Brasil em 2006.
28
Figura 1.3
Estrutura geral das s-triazinas. 31
Figura 1.4
Estrutura química da atrazina. 33
Figura 1.5
Estrutura química da simazina. 33
Figura 1.6
Estrutura química da propazina. 34
Figura 1.7
Processos de degradação mais utilizados por herbicidas. 36
Figura 1.8
Principais produtos de degradação da atrazina e seus
respectivos pKa.
37
Figura 2.1
Instrumentação de cromatografia líquida de alta eficiência. 49
Figura 2.2
Representação esquemática de um sistema de eletroforese
capilar.
51
Figura 3.1
Variação da atividade enzimática da HRP em meios contendo
solvente orgânico.
67
Figura 4.1
Espectros de absorção UV-Vis da atrazina, simazina e
propazina solubilizadas em ACN na concentração 0,150 µmol/L.
72
Figura 4.2
Fluxograma dos testes de extração realizados para as s-
triazinas.
73
Figura 4.3
Separação de uma mistura de padrões de simazina (1), atrazina
(2) e propazina (3) utilizando como fase móvel MeOH/H
2
O
60/40 (v/v), fluxo de 1 mL/min, volume de injeção 20 µL, coluna
Zorbax 300SB C18 em 221 nm. Os analitos foram preparados
na concentração de 33,3 mg/L.
75
Figura 4.4
Nomógrafo para modo reverso de eluição, com a comparação
da força de eluição dos dois solventes utilizados, ACN e MeOH.
76
Figura 4.5
Separação de uma mistura de padrões de simazina (1), atrazina
(2) e propazina (3) utilizando como fase móvel ACN/Tampão
77
50/50 (v/v), fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 20 µL,
coluna C18 em 221 nm. Os analitos foram preparados na
concentração de 33,3 mg/L.
Figura 4.6
Cromatogramas de misturas de padrões de Simazina (1),
Atrazina (2) e Propazina (3) utilizando como fase estacionária
coluna C18, fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 20 µL,
coluna C18 em 221 nm. Os analitos foram preparados na
concentração de 3,3 mg/L. As fases móveis utilizadas estão
descritas na tabela 4.3.
79
Figura 4.7
Cromatogramas de misturas de padrões de Simazina (1),
Atrazina (2) e Propazina (3) com diferentes proporções de fase
móvel ACN/Tampão, utilizando como fase estacionária coluna
C18, fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 20 µL em 221
nm. Os analitos foram preparados na concentração de 3,3
mg/L. As proporções de fase móvel utilizadas encontram-se na
tabela 4.4.
82
Figura 4.8
Curvas analíticas para atrazina, simazina e propazina. 87
Figura 5.1
Espectros na região do UV dos padrões de atrazina e
derivados. As varreduras foram realizadas com 0,150 µmol/L de
cada padrão solubilizados em tampão fosfato de sódio.
95
Figura 5.2
Espectros na região do UV dos padrões de atrazina e
derivados. As varreduras foram realizadas com 0,150 µmol/L de
cada padrão solubilizados em acetonitrila.
95
Figura 5.3
Cromatograma da separação de uma mistura de atrazina e
derivados por HPLC utilizando a coluna Zorbax 300SB com
gradiente de eluição linear 2 – 90% de ACN.
96
Figura 5.4
Cromatograma de uma mistura de padrões de atrazina e
derivados utilizando a coluna Shimpack, volume de injeção de
20 µL, fluxo de 1 mL/min, detecção a 221 nm com as condições
de eluição da tabela 4.2. Onde 1- DIHA; 2-DEDIA; 3-DEHA; 4-
DIA; 5-HA; 6-DEA e 7-atrazina com altas concentrações.
98
Figura 5.5
Procedimento de extração em fase sólida utilizando o cartucho
Oasis MCX.
100
Figura 5.6
Cromatograma de uma mistura de atrazina e derivados com os
solventes de condicionamento e o solvente de eluição com os
padrões.
101
Figura 5.7
Curvas analíticas de atrazina e seus produtos de degradação
sem extração.
104
Figura 6.1
Principais produtos de degradação da atrazina e seus
respectivos pKa.
110
Figura 6.2
Eletroferogramas da mistura de: atrazina e derivados. Utilizando
eletrólito: 100 mmol/L tampão Tris/HCl em ACN/MeOH (A)
0/100 (B) 25/75 e (C) 75/25 % (v/v), com comprimento total do
capilar: 48,5 cm (comprimento efetivo: 40 cm), ∅i: 75 µm, 25
°C, + 20 kV, 50mbar / 1s e detecção em 221 nm.
112
Figura 6.3
Eletroferogramas da mistura de padrões : (A) HA, DIA, A e
DEA; (B) DIHA, HA, DEHA, DIA, A e DEA e (C) DIHA, HA,
DEHA, DEDIA, DIA, A e DEA . Utilizando eletrólito: 100 mmol/L
tampão Tris/HCl em ACN/MeOH 50/50, comprimento total do
capilar: 48,5 cm (comprimento efetivo: 40 cm), ∅i: 75 µm, 25
°C, + 20 kV, 50mbar / 1s e detecção em 221 nm.
113
Figura 7.1
Cromatogramas com a degradação da atrazina e formação de
DEA. As condições da análise estão na tabela 5.1, foi utilizada
a coluna Shimpack C18, um volume de injeção de 20 µL e
detecção em 221 nm. (A) 5 dias de incubação, (B) 10 dias de
incubação e (C) 15 dias de incubação.
121
Figura 7.2
Foto do cultivo realizado após cinco dias de incubação. 122
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1
Propriedades da atrazina. 33
Tabela 1.2
Propriedades da simazina. 34
Tabela 1.3
Propriedades da propazina. 35
Tabela 4.1
Recuperações obtidas das s-triazinas nas diferentes
condições de extração.
74
Tabela 4.2
Planejamento de mistura utilizado no estudo para a
separação de uma mistura de atrazina, simazina e propazina.
77
Tabela 4.3
Fases móveis utilizadas na separação de atrazina, simazina e
propazina em um planejamento de experimentos.
78
Tabela 4.4
Fases móveis utilizadas na separação de atrazina, simazina e
propazina em uma otimização da separação com a fase
móvel ACN/Tampão.
81
Tabela 4.5
Cálculo da resolução entre os picos adjacentes para as
diferentes fases móveis testadas para misturas de 1mg/L com
fluxo de 1 mL/min, coluna C18 e detecção em 221 nm.
83
Tabela 4.6
Resolução dos pares adjacentes com fase móvel ACN/H2O e
ACN/Tampão para misturas de 1mg/L, utilizando coluna C18
e fluxo de 1 mL/min e detecção em 221 nm.
84
Tabela 4.7
Parâmetros cromatográficos obtidos para a separação das
triazinas nas melhores condições cromatográficas.
84
Tabela 4.8
Valores calculados para a falta de ajuste dos modelos. 88
Tabela 4.9
Valores de LOD e LOQ para simazina, atrazina e propazina. 89
Tabela 5.1
Gradiente de eluição para separação de atrazina e derivados
com a coluna shimpack.
97
Tabela 5.2
Parâmetros cromatográficos obtidos para a separação de
atrazina e derivados utilizando a coluna shimpack C18, com
fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 20 µL, detecção de
221 nm, e condições de eluição da tabela 5.1.
102
Tabela 5.3
Valores de F para as curvas analíticas de atrazina e
derivados.
105
Tabela 5.4
Valores calculados para LOD e LOQ dos padrões de atrazina
e derivados.
106
Tabela 5.5
Valores calculados de recuperação após a extração da
atrazina e derivados com cartucho Oasis MCX.
106
Tabela 6.1
Porcentagem de solvente orgânico utilizado em cada
experimento.
111
LISTA DE ABREVIATURAS
A
Atrazina
ABTS
2,2’-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-
sulfônico)diamônio
ACN
Acetonitrila
ANVISA
Agência nacional de vigilância sanitária
C18
octadecilsilano
CCD
Cromatografia em camada delgada
CG
Cromatografia gasosa
CLAE
Cromatografia líquida de alta eficiência
CLAE-FR
Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
CONAMA
Conselho nacional do meio ambiente
CZE
Eletroforese capilar de zona
DAD Diode array detector
DEA
Desestilatrazina
DEDIA
Desetildeisopropilatrazina
DEHA
Desetilhidroxiatrazina
DIA
Deisopropilatrazina
DIHA
Deisopropilhidroxiatrazina
EC
Eletroforese capilar
EFS
Extração em fase sólida
EtOH
Etanol
HA
Hidroxiatrazina
HRP Horseradish peroxidase
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
LOD
Limite de detecção
LOQ
Limite de quantificação
MEKC
Cromatografia eletrocinética micelar
MeOH
Metanol
MS
Espectrômetro de massa
NPD
Detector de nitrogênio e fósforo
P
Propazina
PIB
Produto interno bruto
PTFE
Teflon
S
Simazina
SDS
Dodecilsulfato de sódio
SINDAG
Sindicato nacional da indústria de produtos para defesa
agrícola
Tris
Tris(hidroximetil)amino metano
UFLA
Universidade Federal de Lavras
USEPA
United States Environmental Protection Agency
UV-Vis
Ultravioleta – visível
LISTA DE SÍMBOLOS
α
Retenção relativa
C
s
Concentração do analito
H
máx
Altura máxima do pico
H
mín
Altura da linha base
k’
Fator de retenção
pK
a
Constante de dissociação
r
Coeficiente de correlação
R
2
Coeficiente de determinação
R
s
Resolução
S
b
Desvio padrão da linha base
t’
R
Tempo de retenção ajustado
t
M
Tempo de eluição do soluto não retido
t
R
Tempo de retenção do soluto
V
Potencial aplicado
w
i
Largura da base do pico para o soluto i, em unidade de tempo
PREFÁCIO
A dissertação em questão teve como objetivo o desenvolvimento e otimização de
metodologias alternativas para a análise de atrazina e seus produtos de degradação
por cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar (CE).O texto está
composto de oito capítulos. O primeiro capítulo apresenta um breve histórico do uso
de herbicidas no Brasil, descreve algumas características da atrazina e outros
herbicidas triazínicos e analisa a degradação destes herbicidas com suas vantagens
e devantagens. O segundo mostra os fundamentos básicos gerais sobre
Cromatografia líquida de rápida eficiência e Eletroforese capilar e discussão
baseada em dados da literatura, de como é realizada a análise de atrazina e
derivados. O terceiro apresenta a parte instrumental e o preparo das amostras
analisadas. O quarto mostra o desenvolvimento de metodologia por CLAE para
determinação de atrazina, simazina e propazina. O quinto apresenta o
desenvolvimento de metodologia por CLAE para determinação de atrazina e
derivados bem como a otimização de metodologia de extração em fase sólida. O
sexto capítulo descreve o desenvolvimento de metodologia por EC para
determinação de atrazina e derivados. O sétimo capítulo descreve a aplicação do
método desenvolvido no capítulo 5 para análise dos produtos formados na
biodegradação de atrazina promovida pelo fungo Pleurotus ostreatus. O último
capítulo apresenta as considerações finais e os trabalhos futuros. O fluxograma a
seguir apresenta os métodos analíticos desenvolvidos.
ATRAZINA E
PRODUTOS DE
DEGRADAÇÃO
Determinação
por EC
Determinação
por CLAE
Análise por
CLAE
Biodegradação
Extração
ATRAZINA
SIMAZINA
PROPAZIN
A
Determinação
por CLAE
Extração
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E OBJETIVO
1.1 INTRODUÇÃO 26
1.1.1 Defensivos agrícolas no Brasil 26
1.1.2 Expansão de culturas no Brasil 28
1.1.3 Legislação 29
1.1.4 Herbicidas 30
1.1.5 Herbicidas triazínicos: atrazina, simazina e propazina 30
1.1.5.1 Atrazina 32
1.1.5.2 Simazina 33
1.1.5.3 Propazina 34
1.1.6 Produtos de degradação 35
1.1.7 Biodegradação 37
1.1.8 Enzimas 39
1.1.8.1 Enzimas oxidativas 39
1.1.8.1.1 Peroxidases 39
1.1.8.1.2 Oxidases 40
1.2 JUSTIFICATIVA 40
1.3 OBJETIVO 41
REFERÊNCIAS 42
2 PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE
ALTA EFICIÊNCIA E ELETROFORESE CAPILAR
2.1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) 46
2.1.1 Princípios e fundamentos 46
2.1.2 Instrumentação 48
2.2 ELETROFORESE CAPILAR (EC) 49
2.2.1 Princípios e fundamentos 49
2.2.2 Instrumentação 51
2.3 ANÁLISE DE PESTICIDAS 52
2.3.1 Análise de triazinas 52
2.3.1.1 Análise de triazinas por CLAE 53
2.3.1.2 Análise de triazinas por EC 53
REFERÊNCIAS 54
3 INSTRUMENTAÇÃO ANALÍTICA, MATERIAIS, REAGENTES
E SOLUÇÕES
3.1 INSTRUMENTAÇÃO 59
3.1.1 Equipamentos utilizados no Instituto Nacional de Tecnologia 59
3.1.1.1 Equipamento para Cromatografia líquida 59
3.1.1.2 Equipamento para Cromatografia gasosa 59
3.1.1.3 Espectrofotômetro UV-Vis 59
3.1.1.4 Equipamento para Extração em fase sólida 59
3.1.1.5 Equipamento para Extração líquido-líquido 60
3.1.2 Equipamento utilizado na Universidade Federal de Juiz de Fora 60
3.1.2.1 Eletroforese capilar 60
3.2 COLUNAS CROMATOGRÁFICAS 60
3.3 CAPILARES 61
3.4 CARTUCHOS PARA EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS) 61
3.5 CAPELA DE FLUXO LAMINAR 61
3.6 AUTOCLAVE 61
3.7 REAGENTES E SOLVENTES 62
3.7.1 Padrões 62
3.7.2 Reagentes utilizados para análise de atrazina, simazina e
propazina por CLAE
62
3.7.3 Reagentes utilizados para análise de atrazina e derivados por
CLAE
62
3.7.4 Reagentes utilizados para análise de atrazina e derivados por EC 63
3.7.5 Reagentes utilizados para análise de atrazina e derivados por CG 63
3.7.6 Reagentes utilizados nas reações de degradação enzimática com
HRP
63
3.7.7 Reagentes utilizados nas reações de degradação enzimática com 63
lacase
3.7.8 Reagentes utilizados nas reações de degradação enzimática com
o fungo Pleurotus ostreatus
64
3.8 SOLUÇÕES 64
3.8.1 Preparo de soluções utilizadas na separação de atrazina,
simazina e propazina por CLAE
64
3.8.2 Preparo de soluções utilizadas na separação de atrazina e
derivados por CLAE
65
3.8.3 Preparo de soluções utilizadas na separação de atrazina e
derivados por EC
66
3.8.4 Preparo de soluções para reações de biodegradação 66
3.8.4.1 Preparo de soluções para reações de degradação e determinação
da atividade enzimática da HRP
66
3.8.4.2 Preparo de soluções para reações de degradação e determinação
da atividade enzimática da lacase
66
3.8.4.3 Preparo de soluções para reações de degradação com o fungo
Pleurotus ostreatus
67
3.9 BIODEGRADAÇÃO DE ATRAZINA 67
3.9.1 Preparo do meio reacional para degradação de atrazina com HRP 67
3.9.2 Preparo do meio reacional para degradação de atrazina com
lacase
68
3.9.3 Preparo do meio reacional para degradação de atrazina com
Pleurotus ostreatus
68
REFERÊNCIAS 69
4 DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA
DETERMINAÇÃO DE ATRAZINA, SIMAZINA E PROPAZINA
POR CLAE
4.1 INTRODUÇÃO 71
4.2 OBJETIVOS 71
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 72
4.3.1 Seleção do comprimento de onda de máxima absorvância dos
analitos
72
4.3.2 Extração 73
4.3.3 Otimização de metodologia por CLAE para análise de atrazina,
simazina e propazina
75
4.3.3.1 Estudos preliminares 75
4.3.3.2 Otimização da fase móvel 80
4.3.3.3 Mudança de solvente aquoso 83
4.3.3.4 Avaliação da separação cromatográfica 84
4.3.4 Avaliação da metodologia 85
4.3.4.1 Curva analítica 85
4.3.4.2 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) 88
4.4 CONCLUSÃO 90
REFERÊNCIAS 91
5 DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA
DETERMINAÇÃO DE ATRAZINA E DERIVADOS POR CLAE
5.1 INTRODUÇÃO 93
5.2 OBJETIVO 93
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 94
5.3.1 Seleção do comprimento de onda de máxima absorvância para
análise de atrazina e derivados
94
5.3.2 Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e
derivados por CLAE
96
5.3.3 Extração em fase sólida 99
5.3.4 Avaliação da separação cromatográfica 101
5.3.5 Avaliação da metodologia 103
5.3.5.1 Curva analítica 103
5.3.5.2 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) 105
5.3.5.3 Recuperação 106
5.4 CONCLUSÃO 107
REFERÊNCIAS 108
6 DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA
DETERMINAÇÃO DE ATRAZINA E DERIVADOS POR EC
6.1 INTRODUÇÃO 110
6.2 OBJETIVO 110
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 111
6.3.1 Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e
derivados por EC
111
6.4 CONCLUSÃO 114
REFERÊNCIAS 115
7 BIODEGRADAÇÃO DA ATRAZINA
7.1 INTRODUÇÃO 117
7.2 OBJETIVO 117
7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 118
7.3.1 Reações de degradação da atrazina com a enzima HRP 118
7.3.2 Reações de degradação da atrazina com a enzima lacase 119
7.3.3 Reações de degradação da atrazina com o fungo Pleurotus
ostreatus
119
7.4 ANÁLISE DO EXTRATO DE DEGRADAÇÃO DA ATRAZINA POR
CG-MS
122
7.5 ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA REAÇÃO DE DEGRADAÇÃO DA
ATRAZINA COM O FUNGO PLEUROTUS OSTREATUS
123
7.6 CONCLUSÃO 123
REFERÊNCIAS 125
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS E TRABALHOS FUTUROS
8.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS 127
8.2 TRABALHOS FUTUROS 128
ANEXO A
Curriculum vitae 130
Capítulo 1
INTRODUÇÃO E OBJETIVO
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 26
1.1 INTRODUÇÃO
1.1.1 Defensivos agrícolas no Brasil
No Brasil o agronegócio ocupa uma posição de destaque na economia com
expressivos 25,11% do Produto Interno Bruto (PIB), sendo 17,85% proveniente da
agricultura e 7,26% proveniente da pecuária
1
. Este mercado anualmente movimenta
bilhões de dólares, contribuindo para o crescimento da economia. No cenário
mundial o Brasil ocupa uma posição relevante na produção de grãos como milho e
soja, e também merece destaque na produção de cana – de – açúcar.
Evitando-se as perdas e temendo escassez, foram desenvolvidas tecnologias
para serem utilizadas na agricultura. Atualmente, uma grande preocupação mundial
tem sido a segurança e a qualidade dos alimentos, que está relacionada à presença
ou não de contaminantes químicos ou microrganismos indesejáveis, assim como a
contaminação do meio-ambiente, principalmente no solo e na água.
Dentre as tecnologias desenvolvidas, as substâncias químicas controladoras
de pragas, as quais atacam culturas agrícolas e prejudicam colheitas, são as que
têm sido mais utilizadas. Muitos termos genéricos são usados para designar estas
substâncias químicas, como: fitossanitário, pesticida, praguicida, veneno, remédio,
agroquímico, defensivo agrícola e agrotóxico.
Conforme definição apresentada pela Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), defensivos agrícolas são:
Produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos,
destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e
beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção
de florestas nativas, de culturas florestais e de outros ecossistemas
e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja
alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da
ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as
substâncias e produtos empregados como desfolhantes,
dessecantes e estimuladores e inibidores de crescimento
2
.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 27
Cada agrotóxico possui uma definição específica de acordo com a sua
utilização, os acaricidas combatem os ácaros, os escorpionicidas combatem os
escorpiões, inseticidas combatem aos insetos, fungicidas combatem fungos, assim
como herbicidas combatem ervas daninhas.
Segundo o Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola
(SINDAG) no período de janeiro a outubro de 2008, constatou-se aumento de 31%,
nas vendas de defensivos agrícolas no Brasil, em relação ao mesmo período do ano
anterior, totalizando cerca de R$ 10 milhões
3
.
Desta forma, considerando-se o consumo entre os dez países que
representam 70% do mercado mundial de defensivos agrícolas, o Brasil aparece em
4º lugar no ranking
4
. Como pode ser observado na Figura 1.1, o emprego de
defensivos agrícolas nos Estados de São Paulo, Mato Grosso, Paraná, Rio Grande
do Sul, Minas Gerais, Goiás, representou no ano de 2006 80% do total utilizado no
País.
Figura 1.1 - Participação percentual dos estados brasileiros no valor das vendas de defensivos
agrícolas em 2006
4
.
Conforme apresentado na Figura 1.2, do total de defensivos agrícolas
consumidos no Brasil, 7,6% são acaricidas, 2,6% antibrotantes, reguladores do
crescimento, óleo mineral e espalhantes adesivos, 16,6% são fungicidas, 30,1% são
inseticidas e 43,1% são herbicidas
5
.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 28
Figura 1.2- Participação percentual das classes de defensivos agrícolas no valor
das vendas no
Brasil em 2006.
1.1.2 Expansão de culturas no Brasil
Em 2008, houve uma expansão na produção de algumas culturas, devido ao
aumento de interesse na exploração de novas matrizes energéticas. Uma das
culturas que teve um pronunciado crescimento foi a de cana-de-açúcar, devido ao
fato de haver uma demanda maior na produção de álcool combustível.
Atualmente o que vem aquecendo o mercado de álcool no país, é a
anunciada escassez de petróleo e a grande demanda de automóveis bi-combustível.
Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) a estimativa
para a produção da cana-de-açúcar em 2008 foi de 561,8 milhões de toneladas,
volume 9,3% superior a de 2007 (514,1 milhões de toneladas) e um aumento de
8,3% da área plantada em relação à /2007, quando foram plantados 6,7 milhões de
hectares de cana
6
.
O total de álcool exportado pelo Brasil até o final de junho de 2008, desde o
início da safra, cresceu 43,8% em relação à safra anterior, totalizando 1,1 bilhão de
litros. Apenas no mês de junho de 2008, as exportações atingiram 500 milhões de
litros, contra 390 milhões de litros em junho de 2007
7
.
Outros
Acaricidas
Fungicidas
Inseticidas
Herbicidas
2
,
60%
7
,
60%
16
,
60%
30
,
10%
43
,
10%
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 29
A produção mundial de álcool aproxima-se dos 40 bilhões de litros, dos quais
presume-se que até 25 bilhões de litros sejam utilizados para fins energéticos. O
Brasil responde por 15 bilhões de litros deste total
8
.
A presença de plantas daninhas pode interferir no processo produtivo de
cana-de-açúcar, competindo com a cultura pelos recursos do meio, principalmente
água, luz e nutrientes, podendo inibir a brotação da cana, e ainda, interferir na
produtividade final.
Existem vários métodos de controle de plantas daninhas. Devido à ineficiência
de outros métodos, e da grande quantidade de perdas, o controle de plantas
daninhas na lavoura canavieira reveste-se de importância em face das extensas
áreas cultivadas. Por esse fator territorial e pela eficácia dos herbicidas, o controle
químico, é amplamente utilizado na cultura canavieira
9
.
Com todo este aumento na produção de álcool, ocorrerá um aumento no
cultivo da cana-de-açúcar, o que acarretará um consumo significativo de herbicidas.
Estima-se que as vendas de agroquímicos para cana devem dobrar no país nos
próximos cinco anos, alcançando US$ 1 bilhão
10
.
1.1.3 Legislação
Um parâmetro que pode ser levado em consideração, como prioridade, é a
toxicidade dos compostos. Tal toxicidade depende principalmente de sua
concentração em água.
A Commission of the European Communities fixou como nível máximo de
pesticidas individuais 0,1 µg/L e para pesticidas totais 0,5 µg/L. Já a United States
Environmental Protection Agency (US EPA) estabeleceu para a atrazina em água
potável como 3 µg/L
11
.
O Conselho Nacional do Meio Ambiente – CONAMA – é o órgão que
regulamenta os limites de pesticidas em águas no Brasil. De acordo com a resolução
n° 357, de 17 de março de 2005, o limite máximo permitido para atrazina e simazina
em águas doces é de 2 µg/L
10
, já para a propazina, não existe legislação no Brasil
que regulamente seus limites.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 30
1.1.4 Herbicidas
São substâncias ou misturas das mesmas que tem como função, destruir,
reduzir ou mesmo prevenir o aparecimento de ervas daninhas ou outros tipos de
plantas que sejam indesejáveis. No Brasil as principais culturas que utilizam
herbicidas são: soja, milho, cana-de-açúcar, café, arroz, citros, feijão, algodão e
trigo.
Conforme apresentado na figura 1.2 os herbicidas são a classe de defensivos
agrícolas mais utilizados no Brasil. Este fato ocorre devido ao seu consumo em
culturas de grande expressão econômica, como cana-de-açúcar, soja e milho. Por
sua vez o forte crescimento da cultura de cana-de-açúcar se deve ao grande
interesse na produção de álcool combustível.
1.1.5 Herbicidas triazínicos: atrazina, simazina e propazina
Dentre as classes de herbicidas existentes as triazinas possuem maior
destaque compondo cerca de 30% da produção mundial
4
.
Os herbicidas triazínicos foram introduzidos no mercado há aproximadamente
40 anos e são aplicados em uma grande variedade de culturas para o controle de
ervas daninhas
12
. As triazinas possuem à sua capacidade de inibir a fotossíntese,
inibindo o fotossistema II.
As propriedades das triazinas simétricas (s-triazinas) foram descobertas em
1952, por um grupo de pesquisadores da Geigy, em Basiléia, na Suíça. As primeiras
aplicações em solo foram feitas em 1954, quando se observou sua ação sobre o
crescimento de plantas. A ação seletiva de tais compostos e suas propriedades
herbicidas foram citadas pela primeira vez em 1955
12
. Nos últimos anos as s-
triazinas tornaram-se um dos mais importantes grupos de herbicidas, sendo
utilizadas em culturas de grande expressão econômica, tais como cana-de-açúcar,
milho e sorgo.
Quanto ao aspecto químico, as s-triazinas são derivados nitrogenados
heterocíclicos, que apresentam átomos de nitrogênio simetricamente localizados e
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 31
substituições (R
1
, R
2
, R
3
) nas posições 2, 4 e 6. No caso das triazinas, o anel é
composto de átomos de nitrogênio e carbono. A Figura 1.3 apresenta a estrutura
geral das s-triazinas
13
.
NN
N
R
1
R
3
R
2
R
1
= -Cl, -SCH
3
, -OCH
3
R
2
, R
3
= -NHCH(CH
3
)
2
, -NH
2
C
2
H
5
Figura 1.3: Estrutura geral das s-triazinas.
A estabilidade das s-triazinas é menor quando comparada ao benzeno, uma
vez que o sistema de ligação π perfeitamente deslocalizado é interrompido pela
introdução dos átomos de nitrogênio no anel nas posições 1, 3 e 5. Ocorre então um
aumento da densidade eletrônica nestas posições e uma correspondente diminuição
da densidade eletrônica nas posições 2, 4 e 6. Desta forma, a substituição
nucleofílica nas últimas posições é facilitada. Todavia, a estabilidade
estereoquímica das s-triazinas é ainda muito grande e a persistência dos herbicidas
triazínicos e seus produtos de degradação no solo e na água é considerável,
podendo variar de alguns meses para os compostos originais há muitos anos para
os seus produtos de degradação, que são frequentemente mais tóxicos
13
.
A nomenclatura das s-triazinas, assim como suas principais propriedades são
determinadas principalmente pelo substituinte na posição 2 (R
1
). Sendo assim, as s-
triazinas podem ser divididas em três grupos: clorotriazinas (R
1
= -Cl), metoxitriazinas
(R
1
= -OCH
3
) e metiltiotriazinas (R
1
= -SCH
3
). Quando o substituinte na posição 2 é o
–Cl, -SCH
3
e -OCH
3
o nome comercial é terminado em -azina, -trina e -tona,
respectivamente.
Os herbicidas triazínicos são sólidos brancos cristalinos, fracamente básicos
que possuem baixa solubilidade em água, alta solubilidade em solventes orgânicos.
Eles são estáveis em fase sólida e em solução e possuem baixa pressão de vapor a
temperatura ambiente.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 32
Dentre os herbicidas triazínicos, a atrazina é o mais utilizado. Outros
herbicidas triazínicos muito utilizados pertencentes ao mesmo grupo da atrazina são
a simazina e a propazina.
A persistência das triazinas, ou outros herbicidas é bastante dependente do
meio onde este se encontra. Nos solos, a principal via de degradação é a atividade
microbiana, produzindo metabólitos dealquilados e/ou hidroxilados.
Um grande número de trabalhos envolvendo a atrazina têm sido publicado
14-
18
, todavia, na maioria dos casos não são incluídos os principais metabólitos.
1.1.5.1 Atrazina
A atrazina, nome comum para 2-cloro-4-etilamino-6-isopropilamino-s-triazina,
é um herbicida seletivo utilizado no controle pré e pós emergência* de plantas
invasoras de diversas culturas agrícolas, principalmente milho, sorgo e cana-de-
açúcar
19
. A figura 1. 4 apresenta a estrutura química da atrazina.
A atrazina atua de forma a inibir a fotossíntese das ervas daninhas. Estes
herbicidas causam inibição, ligando-se a proteína D1, no sítio em que se acopla a
plastoquinona “Qb”, impedindo o fluxo de elétrons entre os fotossistemas
38
. As
plantas sensíveis à atrazina sofrem clorose (amarelamento das folhas) a qual
conduz à necrose dos tecidos. Nas espécies tolerantes à atrazina, como é o caso do
milho, o herbicida é eficientemente metabolizado em formas não tóxicas
19
.
Segundo a Anvisa, a atrazina pertence a classe toxicológica III, pouco
tóxica
20
. A tabela 1.1 apresenta algumas propriedades desta substância.
* Aplicações pré-emergentes – são as aplicações realizadas antes do surgimento da erva daninha;
aplicações pós-emergente – são aplicações realizadas após a emergência das ervas daninhas,
porém antes que estas interfiram no desenvolvimento da cultura.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 33
Figura 1.4 - Estrutura química da atrazina.
Tabela 1.1- Propriedades da atrazina
21
Nome
Massa
molecular
(g/mol)
Solubilidade em
H
2
O (25 °C)
Ponto de fusão
(°C)
Toxicidade ¹
LD 50% (mg/Kg)
Atrazina 215,69 70 (mg/L) 171-174 1750
¹ - Dose Letal – LD
50
- dose de amostra que causa mortalidade de 50% dos organismos no tempo de
exposição e condições do teste
22
- via oral em camundongos.
1.1.5.2 Simazina
Simazina é o nome comum para a 2-cloro-4,6-etilamino-s-triazina, é um
herbicida utilizado exclusivamente na pré-emergência. No Brasil é muito utilizado
nas culturas de milho, cacau, café, citrinos e cana de açúcar. A figura 1.5 apresenta
a estrutura da simazina. A tabela 1.2 apresenta algumas propriedades deste
composto
21
.
Figura 1.5 - Estrutura química da simazina.
N
N
N
N
H
Cl
N
H
N
N
N
Cl
N
H
N
H
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 34
Tabela 1.2- Propriedades da simazina.
Nome
Massa
molecular
(g/mol)
Solubilidade em
H
2
O (25 °C)
Ponto de fusão
(°C)
Toxicidade ¹
LD 50% (mg/Kg)
Simazina 201,66 ------- 226-227 5000
1
- Estudos de toxicidade em ratos.
Assim como a atrazina, este composto age inibindo a fotossíntese das ervas
daninhas. Segundo a Anvisa, a simazina pertence a classe toxicológica III, pouco
tóxica
20
.
1.1.5.3 Propazina
Propazina é o nome comum para a 2-cloro-4,6-isopropilamino-s-triazina, é um
herbicida utilizado exclusivamente na pré-emergência. No Brasil é menos utilizado
que a simazina e atrazina. Não existe nenhum limite máximo de concentração de
propazina permitido por lei. A Figura 1.6 apresenta a estrutura química da propazina.
A tabela 1.3 apresenta algumas propriedades desta substância
21
.
N
N
N
N
H
Cl
N
H
Figura 1.6 - Estrutura química da propazina.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 35
Tabela 1.3- Propriedades da propazina.
Nome
Massa
molecular
(g/mol)
Solubilidade em
H
2
O (20 °C)
Ponto de
fusão (°C)
Toxicidade ¹
LD 50% (mg/Kg)
Propazina 229,71 8,6 mg/L 213 >5000
1
- Estudos de toxicidade em ratos.
Assim como a atrazina, este composto age inibindo a fotossíntese das ervas
daninhas.
1.1.6 Produtos de degradação
O mecanismo de degradação de um pesticida, em geral, baseia-se nas
características estruturais do composto, a partir da presença de grupos funcionais
reativos.
A degradação dos pesticidas pode ser via processos químicos, como
hidrólise, oxi-redução, substituição, eliminação, desalogenação e fotólise; por um
processo biológico ou ainda por processos combinados, onde mais de uma técnica
pode ser utilizada, podendo haver uma completa mineralização ou a formação de
metabólitos.
A figura 1.7 apresenta alguns processos de degradação de herbicidas mais
comuns.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 36
Figura 1.7 - Processos de degradação mais comuns e que podem ser utilizados na degradação de
herbicidas.
Os principais produtos de degradação da atrazina são compostos hidroxilados
e clorados. São eles: Desetilatrazina (2-cloro-4-amino-6-isopropilamino-s-triazina -
DEA), Deisopropilatrazina (2-cloro-4-etilamino-6-amino-s-triazina - DIA),
Desetildeisopropilatrazina (2-cloro-4,6-amino-s-triazina - DEDIA),
Desetilhidroxiatrazina (2-hidroxi-4-amino-6-isopropilamino-s-triazina - DEHA),
Deisopropilhidroxiatrazina (2-hidroxi-4-etilamino-6-amino-s-triazina DIHA) e
Hidroaxiatrazina (2-hidroxi-4-etilamino-6-isopropilamino-s-triazina - HA).
Os compostos clorados apresentam toxicidade semelhante à do composto
original, atrazina
23
.
A Figura 1.8 apresenta os principais produtos de degradação da atrazina
11
.
PROCESSOS DE DEGRADAÇÃO
Processos Biológicos
Processos Químicos
Enzimático
Anaeróbio Aeróbio
Processos Oxidativos
Avançados
Fenton
Ozonização
Fotocatálise
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 37
Figura 1.8 - Principais produtos de degradação da atrazina e seus respectivos pKa.
1.1.7 Biodegradação
A descontaminação dos solos e da água pode ser promovida por técnicas de
remediação que usualmente são de alto custo. Algumas tecnologias avançadas,
como o uso de sistemas biológicos de tratamento para reduzir ou destruir resíduos
perigosos são vistas como uma opção para as tecnologias convencionais de
descontaminação.
Um dos campos mais promissores da biotecnologia, visando o emprego dos
microrganismos, direciona-se para a remediação de locais contaminados devido ao
uso de defensivos agrícolas. Uma vez que microrganismos presentes em solos são
capazes de degradar e mineralizar pesticidas, pode-se desenvolver a técnica de
remediação biológica ou biorremediação de sítios contaminados empregando-se
microrganismos selecionados.
A biorremediação tem por objetivo inocular o solo com microrganismos com
capacidade de metabolizar os resíduos tóxicos presentes no ambiente. A
biorremediação vem sendo desenvolvida com o objetivo de explorar a diversidade
genética e a versatilidade metabólica destes microrganismos para a transformação
N
N
N
Cl
N
H
N
H
ATRAZINA
pKa 1,68
N
N
N
Cl
NH
2
N
H
N
N
N
N
H
NH
2
Cl
N
N
N
OH
NH
2
N
H
N
N
N
Cl
NH
2
NH
2
N
N
N
OH
N
H
NH
2
N
N
N
OH
N
H
N
H
DEA
p
Ka 1
,
3
HA
p
Ka 5
,
15
DIA
pKa 1,3
DEHA
p
Ka 4
,
75
DEDIA
p
Ka 1
,
5
DIHA
p
Ka 4
,
65
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 38
de contaminantes em produtos menos tóxicos que podem ser integrados nos ciclos
biogeoquímicos naturais. Estudos baseados no uso de microrganismos para
degradar compostos químicos são descritos freqüentemente na literatura, bem como
a degradação total ou parcial de pesticidas por populações de microrganismos
naturais presentes em solos
24
. Os maiores agentes envolvidos na degradação
biológica são as bactérias, os fungos e as algas.
A biodegradação microbiana tem enormes vantagens. Em primeiro lugar,
como os microrganismos estão presentes em todos os ambientes, o processo pode
ser realizado no próprio local. Em segundo lugar, é um processo que permite grande
desenvolvimento:
1- pela seleção de mutantes capazes de uma degradação mais eficiente;
2-pela engenharia genética, que permite a transferência de genes
responsáveis pela enzima de degradação a microrganismos já ambientados no
local
25
.
Alguns microrganismos como Rhodococcus corallinus
26
, Moraxella
(Branhamella), Penicillium stecki
27
, Pleurotus pulmonarius
28
, Phanerochaete
chrysosporium
29, 30
, Tulipa gesneriana
31
, Pseudomonas sp. Strain ADP
32
, Mycellia
sterilia INBI 2-26
33
foram utilizados na biodegradação das s-triazinas.
O gênero Pleurotus inclui espécies comestíveis e medicinais que pertencem
ao grupo do fungo da podridão branca que apresenta habilidade de produzir
enzimas ligninolíticas extracelulares como: lacase, duas peroxidades: manganês
peroxidase e aril-alcool oxidase que modificam ou degradam a lignina
33
.
Bending e colaboradores (2002) utilizaram nove espécies de fungo da
podridão branca para degradar atrazina e outros pesticidas. Foi utilizada degradação
em cultura líquida e os resultados obtidos após 42 dias foram mais satisfatórios para
os fungos Coriolus versicolor, Hypholoma fasciculares e Stereum hirsutum. Foram
realizados testes com Pleurotus ostreatus, e os resultados apresentaram redução de
15,5 % de atrazina no meio
34
.
Todos estes microrganismos metabolizam estes compostos xenobióticos
através de reações enzimáticas.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 39
1.1.8 Enzimas
Os tratamentos utilizados para remoção de poluentes recalcitrantes de água e
solos são, na maioria das vezes, divididos em tratamento físico-químico e tratamento
biológico. O tratamento enzimático está compreendido na fronteira entre estes dois,
pois não envolve diretamente o microrganismo, mas está baseado na ação de um
catalisador biológico, uma enzima, portanto com uma função catalítica específica.
1.1.8.1 Enzimas Oxidativas
Enzimas redox ou oxidoredutases (EC 1.11.1) catalisam as reações de óxido-
redução. Estão incluídas nesta classe as hidrogenases, oxidases, peroxidases e
hidroxilases (introduzem hidroxilas em moléculas insaturadas).
A Horseradish peroxidase (HRP) é a peroxidase vegetal mais conhecida e
estudada até o momento
35
. Utilizou-se a peroxidase de raiz forte HRP que é uma
enzima que oxida substratos orgânicos tendo o peróxido de hidrogênio como aceptor
de elétrons.
Outra enzima muito utilizada na degradação de xenobióticos é a lacase
proveniente do fungo Aspergilus oryzae.
1.1.8.1.1 Peroxidases
As peroxidases (EC 1.11.1.7) são enzimas que atuam na presença de
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), que age como aceptor de elétrons, resultando na
formação de água (H
2
O) e na oxidação de uma grande variedade de compostos,
segundo o esquema simplificado apresentado a seguir:
Doador + H
2
O
2
Doador oxidado + 2 H
2
O
Peroxidase
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 40
Estas enzimas podem ser encontradas em microrganismos, plantas e também
em mamíferos. Os nomes das peroxidases podem derivar de suas fontes
(horseradish, soybeans, peanut, tealeaf, lacto e mielo peroxidase); dos seus
substratos (bromo, cloro, lignina, manganês peroxidase), ou ainda de seu centro
ativo (heme peroxidase, vanádio peroxidase e peroxidases não metálicas)
36
.
Stiborova et al em 1991, promoveram a degradação da atrazina com a
enzima Horseradish peroxidase na presença de peróxido de hidrogênio, com a
adição de cloreto, brometo e iodeto. Apesar de não identificar o produto gerado, foi
observada a formação de uma segunda banda quando realizada a cromatografia em
camada delgada (TLC) após a reação enzimática. No trabalho não foi descrita a
atividade enzimática utilizada na reação
37
.
1.1.8.1.2 Oxidases
Na literatura, encontrou-se um estudo, em que foi realizada a degradação de
atrazina utilizando a lacase, uma enzima oxidativa proveniente do fungo Mycelia
sterilia INBI 2-26. O trabalho mostra, a degradação do herbicida, realizada com e
sem indutores, além de utilizar cepas que continham e não continham lacase. A
conclusão do trabalho mostra que a degradação da atrazina não possui
dependência com a atividade da lacase
32
.
1.2 JUSTIFICATIVA
Devido à ampla utilização de atrazina como defensivo agrícola em culturas de
crescente ascendência, faz-se necessário o desenvolvimento e otimização de
métodos analíticos de alta eficiência para a análise de tais substâncias.
Adicionalmente, o estudo da degradação destes compostos por microrganismos,
bem como enzimas isoladas surge como uma alternativa ambiental para
descontaminação.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 41
1.3 OBJETIVO
O objetivo do presente trabalho foi desenvolver metodologia analítica através
do uso de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar, para a
separação de triazinas e seus derivados de degradação.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 42
REFERÊNCIAS
1. PIB do Agronegócio Centro de Estudos Avançados em Economia Aplicada.
Disponível em :http://www.cepea.esalq.usp.br. Acesso em: 07 dez. 2008.
2. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br. Acesso em 08 dez. 2008.
3. Câmara temática de insumos agropecuários – Nov/2008. Disponível em:
<http://www.sindag.com.br/dados_mercado.php>. Acesso em 10 dez. 2008.
4. Ferreira, C. R. R. P. T.; Defensivos agrícolas: expectativas de vendas
menores em 2005. Instituto de economia agrícola. APTA. Secretaria de
agricultura e abastecimento. Disponível em: http://www.iea.sp.gov.br. Acesso em
15 out. 2006.
5. Instituto de economia agrícola– Defensivos Agrícolas: Rumo A Uma
Retomada Sustentável. Disponível em: <http://www.iea.sp.gov.br>. Acesso em
12 jun. 2008.
6. Safra 2008/09: redução das chuvas não melhora desempenho da lavoura de
cana. Disponível em <http://www.unica.com.br/>. Acesso em 28 jul. 2008.
7. Álcool - Etanol Brasileiro. Disponível em: <http://www.biodieselbr.com /energia/
alcool/etanol.htm>. Acesso em 28 jul. 2008.
8. Barela, J. F.; Seletividade de herbicidas para a cultura de cana-de-açúcar
(Saccharum app.) afetada pela interação com nematicidas aplicados no
plantio. 2006. Dissertação (Mestrado em Agronomia)–Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), Universidade de São Paulo, São Paulo,
2006.
9. Jornal O valor econômico, 19 set. 2007.
10. Disponível em: http://www.mma.gov.br. Acesso em 15 jan. 2009.
11. Barceló, D.; Hennion, M.C.; Trace determination of pesticides and their
degradation products in water. Techniques and instrumentation in analytical
chemistry, 1997, Ed. Elsevier, v.19, cap 1, p. 47-51.
12. Cabral, M.F.; Souza, D.; Alves, C.R.; Machado, S.A.S. Estudo do comportamento
eletroquímico do herbicida ametrina utilizando a técnica da onda quadrada.
Eclética Química, v. 28, n. 2, p. 41-47, 2003.
13. Almeida, F.S.; Rodrigues, B.; Guia de Herbicidas, Londrina, IAPAR, p.482, 1985
Apud, Pinto, G. M. F.; Jardim, I. C. S. F. Use of solid-phase extraction and high-
performance liquid chromatography for the determination of triazine residues in
water: validation of the method. Journal of chromatography A, v. 869, p. 463-
469, 2000.
14. Tonhi, E.; Collins, K. E.; Jardim, I.C.S.F.; Collins, C.H.; Fases estacionárias para
cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-RF) baseadas em
superfícies de óxidos inorgânicos funcionalizados. Qui. Nova, v. 25, n 4, p. 616-
623, 2002.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 43
15. Norrgran, J.; Bravo, R.; Bishop, A.M.; Retrepo P.; Whitehead R.D. ; Needhama,
L.L.; Barr D. B.; Quantification of six herbicide metabolites in human urine.
Journal of Chromatography B, v. 830, p. 185 –195, 2006.
16. Nascimento, P.C.; Rohlfes, A. L.B.; Bohrer, D.; Carvalho, L.M.; Pilau, E.J.; HPLC
based method using sample precolumn cleanup for the determination of triazines
and thiolcarbamates in hemodialysis saline solutions, Talanta, v. 65, p. 211-216.
2005.
17. Melo, L.F.C.; Collins, C.H.; Jardim, I.C.S.F; High – performance liquid
chromatographic determination of pesticides in tomatoes using laboratory-made
NH2 and C18 solid-phase extraction materials. Journal of Chromatography A,
v. 1073, p. 75-81, 2005.
18. Pinto, G.M.F.; Jardim, I.C.S.F Use of solid-phase extraction and high-
performance liquid chromatography for the determination of triazine residues in
water: validation of the method. Journal of Chromatography A, v. 869, p. 463-
469, 2000.
19. Prade, L.; Huber, R.; Bieseler, B., Structures of herbicides in complex with their
detoxifying enzyme glutathione S-transferase-explanation for the selectivity of the
enzyme in plants, Structure, p. 1445-1452, 1998, Apud, O herbicida atrazina,
disponível em: <http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=377>. Acesso em: 05 dez.
2008.
20. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br>. Acesso em: 18 dez. 2008.
21. The Merck Index, 12° edição, p. 147, 1996.
22. Costa, C. R.; Olivi, P.; Botta, C. M. R.; Espindola, E. L. G.; A toxicidade em
ambientes aquáticos: discussão e métodos de avaliação. Química Nova, v.31, p.
1820-1830, 2008.
23. Gevao, B.; Semple, K.T.; Jones, K.C.; Bond pesticide residues in soils: a review.
Environmental Pollution, v. 108, p. 3-14, 2000.
24. Biodegradação de Herbicidas e Biorremediação
Microrganismos degradadores do herbicida Atrazina. Disponível em:
<http://www.herbario.com.br/bot/toxicologia/biodegre.htm>. Acesso em: 12 jul.
2006.
25. Langenbach, T.; Biodegradação de xenobiontes: potencialidade e limites,
Apostila de microbiologia, c. 7. p.218.
26. Kodama, T.; Linxian,D.; Yoshida, M.; Yajima, M.;Biodegradatio of an s-triazine
herbicide, simazine; Jounal of molecular catalysis B: Enzimatic, v. 11, p. 1073-
1078, 2001. Apud A.M. Cook, R. Huetter, J. Agri. Food Chem. v.32 p. 581-585,
1984.
27. Kodama, T.; Linxian,D.; Yoshida, M.; Yajima, M.;Biodegradatio of an s-triazine
herbicide, simazine. Jounal of molecular catalysis B: Enzimatic, v. 11, p. 1073-
1078, 2001.
28. Pointing, S. B.; Feasibility of bioremediation by white-rot fungi; Appl. Microbiol.
Biotechnol, v. 57, p. 20-33, 2001. Apud Mougin C, Laugero C, Asther M, Dubroca
J, Frasse P.; Biotransformation of the herbicide atrazine by the white-rot fungus
Phanerochaete chrysosporium. Appl Environ Microbiol, v. 60, p. 705-708, 1994.
Capítulo 1 – Introdução e objetivo 44
29. Pointing, S. B.; Feasibility of bioremediation by white-rot fungi; Appl. Microbiol.
Biotechnol, v. 57, p. 20-33, 2001. Apud Masaphy S.; Levanon D.; Vaya, J.;
Henis, Y.; Isolation and characterisation of a novel atrazine metabolite produced
by the fungus Pleurotus pulmonarius, 2- chloro-4-ethylamino- 6- (1-
hydroxyisopropyl)amino-1,3,5-triazine. Appl. Environ. Microbiol., v.59, p.4342-
4346, .
30. Mashaphy, S.; Levanon, D.; Henis, Y.; Degradation of atrazina by the
lignocellulolytic fungus Pleurotus pulmonarius during solid-state fermentation.
Bioresourse technology, v. 56, p. 207-214, 1996.
31. Topal, A.; Adams, N.; Hodgson, E.; Kelly, S. L.; In vitro metabolism of atrazina by
tulip cytochrome P450. Chemosphere, v. 32, p. 1445-1451,1996.
32. Souza, L. M.; Sadowsky, M. J.; Wackett, L.P.; Atrazina Chlorohydrolase from
Pseudomonas sp. Strain ADP: Gene Sequence, Enzyme Purification, and Protein
Characterisation. Journal of bacteriology, v. 178, p. 4894-4900, 1996.
33. Vasil’chenko, L. G.; Khromonygina, V. V.; Koroleva, O. V.; Landesman, E. O.;
Gaponenko, V. V.; Kovaleva, T. A.; Kozlov Y. P.; Rabinovich, M. L.; Consumption
of Triazine herbicide atrazina by laccase-positive and laccase-negative strains of
soil fungus Mycelia sterilia INBI 2-26; Applied Biochemistry and Microbiology,
v. 38, p. 454-459, 2002.
34. Bending, G. D.; Friloux, M.; Walker, A.; Degradation of contrasting pesticides by
white rot fungi and its relationship with ligninolytic potencial. FEMS Microbiology
Letters, v. 212, p. 59-63, 2002.
35. Ribeiro, C. P. Estudo sobre a biooxidação do limoneno. 2007. Dissertação
(Mestrado em Ciências-Bioquímica). Instituto de Química, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.
36. Stajic, M; Persky, L.; Friesem, D.; Hadar, Y.; Wasser, S. P.; Nevo, E.; Vukojevic,
J.; Effect of different carbon and nitrogen sources on laccase and peroxidases
production by selected Pleurotus species. Enzyme and Microbial Technology,
v. 38, p. 65-73, 2006.
37. Stiborova, M.; Nachazelova, I.; Anzenbacher, P; Metabolism of xenobiotics in
plants Horseradish peroxidase catalyses N-dealkylation of the S-triazine
herbicide, atrazine. Biologia, 1991.
38. Disponível em: <http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/do/p_do58_4.htm>. Acesso 03
abr. 2009.
Capítulo 2
PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA E
ELETROFORESE CAPILAR
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 46
2.1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
2.1.1 Princípios e fundamentos
Cromatografia é um processo físico-químico de separação, no qual os
componentes a serem separados distribuem-se entre duas fases: fase estacionária e
fase móvel. A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido disposto sobre um
suporte sólido com grande área superficial. A fase móvel, que pode ser gasosa, líquida
ou ainda um fluido supercrítico, que percola pela fase estacionária, arrastando
seletivamente os diversos componentes da mistura
1
.
Dentre os modos de CLAE, estima-se que mais de 90% dos laboratórios de
análise espalhados pelo mundo utilizam pelo menos um método que aplica a
modalidade de CLAE em fase reversa (FR). Sistemas de CLAE-FR consistem de uma
fase estacionária de menor polaridade e uma fase móvel de maior polaridade,
enquanto a fase normal tem as polaridades invertidas em relação à primeira. A fase
móvel de maior polaridade possui algumas vantagens, tais como: uso de fases móveis
menos tóxicas e de menor custo, como metanol e água; fases estacionárias estáveis
de muitos tipos diferentes; rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel;
facilidade de empregar eluição por gradiente; maior rapidez em análises e boa
reprodutibilidade dos tempos de retenção
2
.
Na cromatografia líquida, existem dois modos de eluição, a eluição isocrática e a
eluição por gradiente. Na eluição isocrática somente um solvente, ou uma mistura de
solventes com composição constante é utilizada. Já a eluição por gradiente, que é
muito utilizada quando apenas um solvente ou uma mistura constante de solventes não
propicia a eluição de todos os analitos, é uma eluição com variação contínua ou
segmentada da composição do solvente para modificar a força eluente, ou seja, a força
necessária para arrastar o soluto pela coluna. Para eluir mais fortemente os solutos
retidos é necessário uma força eluente maior
3
.
Para avaliar a eficiência de uma separação cromatográfica é necessário
determinar alguns parâmetros. Os parâmetros mais comumente avaliados são o tempo
de retenção (t
R
) para cada componente, que é o tempo necessário, a partir da injeção
da mistura na coluna, para que o composto alcance o detector; tempo de retenção
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 47
ajustado (t’
R
), que é o tempo adicional necessário para o soluto percorrer o
comprimento da coluna, além do tempo necessário para o soluto, que não sofre
retenção (t
M
), percorrer o mesmo caminho.A equação 1 descreve o modo que se
calcula o tempo de retenção
3
.
MRR
ttt
−
=
' (equação 1)
O t
M
é determinado através da observação do primeiro pico encontrado no
cromatograma, ou seja, o tempo que do soluto não retido leva para percorrer o
comprimento da coluna.
Outro parâmetro analisado é o fator de retenção (k’). Este fator relaciona os
tempos de retenção relativos e o tempo do soluto não retido, demonstrando que quanto
mais um componente é retido pela coluna, maior é o seu fator de capacidade. O fator
de retenção pode ser calculado pela equação 2
3
.
M
MR
t
tt
k
−
=' (equação 2)
Onde:
t
R
= tempo de retenção do soluto.
t
M
= tempo de eluição do soluto não retido.
O valor ideal de k’ para evitar problemas relacionados à perturbação inicial da
linha base, a qual pode sobrepor a primeira banda e evitar excessivo alargamento da
banda e tempo de corrida muito longo é 1 < k’ < 10
4
.
Retenção relativa (α) é a razão entre os tempos de retenção ajustado. Quanto
maior a separação entre dois compostos, maior a retenção relativa. Este parâmetro
pode ser calculado através da equação 3
3
.
1
2
'
'
R
R
t
t
=
α
(equação 3)
Onde:
t’
R2
> t’
R1
de modo que
α > 1.
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 48
Este parâmetro define a seletividade do sistema cromatográfico. Quanto maior a
seletividade de retenção do composto, maior o valor de α. Um valor elevado de α
implica em uma boa separação se os picos forem estreitos. Os valores desejados para
α são 1,05 < α < 2,0
4
.
Resolução (R) é a diferença dos tempos de retenção e a largura das bandas de
dois analitos adjacentes; é uma medida quantitativa da habilidade da coluna em
separar os analitos 1 e 2. O parâmetro analisado pode ser determinado através da
equação 4
3
.
+
−
=
21
12
2
bb
RR
ww
tt
R
(equação 4)
Onde:
t
R1
e t
R2
são os tempos de retenção de dois picos adjacentes;
w
b1
e w
b2
são as larguras dos picos na base, em unidades de tempo.
O valor ideal de resolução entre os picos adjacentes é 1,5 < R < 20, isto permite
afirmar que os picos estão bem separados, e não apresentam um longo tempo de
análise.
2.1.2 Instrumentação
Um equipamento moderno de CLAE é equipado com um ou mais reservatórios
de vidro ou aço, cada um deles contendo os solventes que serão utilizados, uma
bomba capaz de gerar altas pressões, com velocidades de fluxos que podem variar de
0,1 a 10 mL/min, uma coluna geralmente constituída por tubos de aço inoxidável capaz
de resistir a altas pressões, sendo empacotadas com os mais variados tipos e
tamanhos de fase estacionária. Geralmente uma coluna de guarda é introduzida antes
da coluna analítica para aumentar sua duração por remoção, não somente de material
particulado e de contaminantes dos solventes, mas também de componentes da
amostra que se ligam irreversivelmente à fase estacionária. Um detector apropriado à
análise é acoplado a saída da coluna.
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 49
Um sistema com a instrumentação utilizada na separação por CLAE está
esquematizado na figura 2.1. Uma bomba de alta pressão bombeia o solvente ou uma
mistura destes, através do injetor onde a amostra está inserida. A amostra é levada em
direção a coluna analítica onde irá ocorrer a interação entre os analitos e as fases
móvel e estacionária. Em seguida os analitos são levados para o detector. Os
comandos para controle do equipamento, aquisição e tratamento dos dados são feitos
mediante a interface com o computador.
Figura 2.1 – Instrumentação de cromatografia líquida de alta eficiência.
2.2 ELETROFORESE CAPILAR (EC)
2.2.1 Princípios e fundamentos
A eletroforese capilar (EC) é uma técnica de separação baseada na migração
diferenciada de compostos neutros, iônicos ou ionizávies, através de uma solução de
eletrólito contida no interior de um tubo capilar (sílica fundida, teflon), mediante a
aplicação de um campo elétrico da ordem de kVolts/m
5,6
.
A
B
C
Conversor de sinal
Injetor
Detector
Bomba
Reservatório de eluente
(fase móvel)
Reservatório de descarte
Cromatograma
A + B + C
Coluna cromatográfica
C B A
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 50
Em EC, a separação é conduzida em tubos com dimensões que podem variar de
15 a 100 µm de diâmetro interno, e 50 a 100 cm de comprimento
7
.
O uso do capilar oferece muitas vantagens sobre os outros meios utilizados para
eletroforese (placas de gel, papel). Devido a fatores geométricos (a relação entre a
área superficial interna e volume é apreciavelmente grande), um capilar possibilita a
dissipação do calor, gerado pela passagem da corrente elétrica (efeito Joule). Além
disso, a alta resistência elétrica do capilar permite o estabelecimento de campos
elétricos elevados (100 a 500 V/cm), resultando em separações de alta eficiência
(geralmente excede 10
5
pratos), resolução inigualável e tempos de análise
apreciavelmente curtos. Outras vantagens da eletroforese capilar são: pequena
demanda de amostra, com volumes tipicamente da ordem de 1 a 10 nL, e a
possibilidade de injeção e detecção em fluxo.
Na eletroforese capilar é possível empregar diversos modos de separação, com
mecanismos e seletividade característicos. Dentre as metodologias mais utilizadas, as
que merecem maior destaque são: eletroforese capilar de zona (CZE), cromatografia
eletrocinética micelar (MEKC). Outra metodologia que vem sendo muito utilizada para a
separação de compostos com baixo pKa (ou valores aproximados) é a eletroforese
capilar em meio não aquoso (NACE).
A CZE é a técnica mais utilizada na separação por eletroforese, de compostos
iônicos ou ionizáveis.
Já a MEKC é utilizada normalmente na separação de compostos neutros. Utiliza-
se um surfactante aniônico acima da concentração micelar crítica, ou seja, para que
haja formação de micelas carregadas negativamente. Cada molécula neutra entra em
equilíbrio com a micela e o eletrólito, migrando então em diferentes tempos
3
.
A eletroforese capilar em meio não aquoso, é muito utilizada para a separação
de compostos que diferem levemente em suas mobilidades eletroforéticas. Alguns
compostos básicos possuem valores de pKa, referentes aos ácidos conjugados, muito
baixos e próximos. A determinação destes por CZE torna-se difícil, pois para torná-los
ionizados, deve-se utilizar um tampão com um baixo valor de pH, o que tornaria muito
pequeno ou nulo o fluxo eletrosmótico. Com a mistura de solventes não aquosos, as
características ácido-base destes compostos são modificadas, formando espécies
protonadas que são suscetíveis à migração quando aplicado o campo elétrico
8
.
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 51
2.2.2 Instrumentação
A CE possui uma instrumentação simples, o sistema contém fonte de alta
tensão, tubos capilares com dimensões de 15 a 100 µm de diâmetro interno e 50 a 100
cm de comprimento, eletrodos (geralmente de platina), um amostrador e um detector
apropriado. A Figura 2.2 apresenta um esquema geral para um aparelho de EC. Uma
fonte regulada, de alta tensão, é usada para estabelecer um campo elétrico ao longo
do capilar. Tais fontes podem, em geral, ser operadas a tensão constante e/ou
corrente constante, com valores típicos de voltagem no intervalo de 0 - 50 kV e
corrente, de 0 - 200 µA. O operador é protegido contra o contato com a alta voltagem
pela inclusão do sistema inteiro, ou pelo menos o terminal de voltagem, numa caixa de
acrílico, equipada com chaves de segurança. A fonte de alta tensão é conectada,
através de eletrodos de platina, a dois reservatórios da solução para completar o
circuito elétrico. Para minimizar efeitos térmicos, o capilar deve ser mantido à
temperatura constante. Há várias possibilidades para termostatização do sistema,
incluindo circulação de um líquido ou ar através de um cartucho contendo o capilar,
além do uso de ventiladores e fornos. Os comandos para controle do equipamento e
aquisição de dados são feitos mediante interface com computador
9
.
Figura 2.2 - Representação esquemática de um sistema de eletroforese capilar.
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 52
2.3 ANÁLISE DE PESTICIDAS
A rigorosa legislação existente no mundo para a determinação de pesticidas em
solos, águas, bem como outras matrizes, exige o desenvolvimento de novos métodos
analíticos sensíveis e seletivos capazes de fornecer resultados confiáveis frente aos
crescentes níveis de exigência e demanda.
Muitas técnicas analíticas têm sido utilizadas para análise quantitativa e
qualitativa de triazinas e seus produtos de degradação, entre elas, a cromatografia
gasosa (CG)
10-12
, cromatografia em camada delgada (CCD)
13
e métodos
eletroquímicos
14
.
A US EPA possui um método padrão para análise de triazinas (EPA 619)
15
, esta
análise é realizada por meios de cromatografia gasosa com detector de nitrogênio e
fósforo (NPD).
No entanto a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em fase reversa tem
demonstrado ser uma metodologia capaz de fornecer excelentes resultados na
separação destes compostos
16-18
, assim como a determinação por eletroforese capilar
(EC)
19-23
.
2.3.1 Análise de triazinas
Uma técnica cromatográfica muito utilizada na análise de atrazina e derivados é
a Cromatografia gasosa (CG). Nesta técnica, é possível analisar compostos que
possuem um caráter volátil. Entretanto, compostos hidroxilados como as
hidroxitriazinas, que não apresentam este caráter, não podem ser analisados
diretamente através desta técnica, para isto seria necessário uma etapa de
derivatização. Tendo em vista a pequena concentração do analito e o número de
etapas necessário para uma completa preparação da amostra, esta técnica não se
mostra tão viável a análise de atrazina e dos derivados propostos neste trabalho.
A técnica mais adequada encontrado na literatura para análise de atrazina e
derivados é a CLAE.
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 53
A EC é uma técnica relativamente nova, que está começando a ser utilizada
para análise de atrazina e derivados, o que propicia um cenário atrativo e com muitas
lacunas na literatura a serem preenchidas.
2.3.1.1 Análise de triazinas por CLAE
Para análise de atrazina e derivados, o método analítico mais utilizado de acordo
com a literatura, foi CLAE. Foi possível observar que muitos pesquisadores utilizam
como fase estacionária colunas C18
24-34
, ou seja, colunas cromatográficas com fase
reversa.
Alguns autores realizam a separação de seus analitos, que na maioria das vezes
são compostos de diferentes classes de pesticidas, utilizando acetonitrila (ACN) e água
(H
2
O). Outros realizam a separação com metanol (MeOH) e H
2
O.
Para manter um pH constante durante a separação, muitos autores adicionam a
fase móvel uma solução tampão. Isto confere ao cromatograma um perfil diferente, do
que quando se trabalha com H
2
O. A maior preocupação que se deve ter quando se
trabalha com uma solução tampão na fase móvel, é a concentração do mesmo, pois
excesso de eletrólitos pode causar precipitação de sais em todo o sistema como, por
exemplo, entupimento da coluna e prejudicar o bom funcionamento do aparelho.
2.3.1.2 Análise de triazinas por EC
Na literatura encontram-se descritos alguns trabalhos que utilizam EC para a
determinação de triazinas, sendo que a maior parte dos artigos utiliza MEKC para a
determinação destes herbicidas
35-39
. A CZE não se mostrou uma técnica capaz de
separar clorotriazinas
40
, porém quando adicionado um tensoativo catiônico, a
separação tornou-se possível
41
. A técnica que melhor separa as triazinas e derivados é
a técnica de eletroforese capilar em meio não aquoso. Alguns trabalhos encontrados na
literatura definem esta metodologia como a que melhor se aplica para compostos que
diferem levemente em suas mobilidades eletroforéticas
20,8
.
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 54
REFERÊNCIAS
1. Peres, T. B.; Noções básicas de cromatografia. Centro de pesquisa e
desenvolvimento ambiental-Instituto Biológico, São Paulo, v. 64, n. 2, p. 227-229,
jul./dez., 2002.
2. Tonhi, E.; Collins, K. E.; Jardim, I.C.S.F.; Collins, C.H.; Fases estacionárias para
cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-RF) baseadas em
superfícies de óxidos inorgânicos funcionalizados. Qui. Nova, v. 25, n. 4, p. 616-
623, 2002.
3. Harris, D. C.. Análise Química Quantitativa. 6° edição, p.661, Editora LTC, 2005.
4. Snyder, l. R.; Kirkland, J. J.. Introduction to modern liquid chromatography. 2°
edição, Editora John Wiley & Sons, 1979.
5. Bier, M., Electrophoresis- Theory, Methods and applications; Ed.; Academic Press
Inc.; New York, 1959, Apud Tavares, M. F. M.; Eletroforese capilar: conceitos
básicos. Quim. Nova, v.19, n. 2, p. 173,1996.
6. Deyl, A., Electrophoresis;, Ed.; J. Chromatogr. Lib., Vol. 18; Elsevier; Amsterdam,
1970, Apud Tavares, M. F. M.; Eletroforese capilar: conceitos básicos. Quim. Nova,
v.19, n. 2, p. 173,1996.
7. De Oliveira, M. A. L.; Análise de ácidos graxos em óleos e gorduras por
eletroforese capilar. 2003. Tese (Doutorado em Química)- Instituto de Química,
Universidade de São Paulo, 2003.
8. Carabias-Martinéz, R.; Rodríguez-Gonzalo, E.; Dominguez-Álvares, J.; Hernández-
Méndez, J.; Capillary zone electrophoresis in nonaqueous solvents in the presence
of ionic additives. Anal. Chemistry v.69, p. 4437-4444, 1997.
9. Tavares, M. F. M.; Eletroforese capilar: conceitos básicos. Quim. Nova, v.19, n. 2,
p. 173,1996.
10. Bagheri, H.; Khalilian, F.; Immersed solvent microextraction and gás
chromatography-mass spectrometric detection of s-triazine herbicides in aquatic
media. Analytica Chimica Acta, v. 537, p. 81-87, 2005.
11. Bruzzoniti, M. C.; Sarzanini, C.; Costantino, G.; Fungi; M.; Determination of
herbicides by Solid Phase Extraction gás chromatography-mass spectrometry in
drinking waters. Analytica Chimica Acta, v. 578, n. 2, p. 241-249, 2006.
12. Azevedo, D. A.; Gerchon, E.; Reis, E. O.; Monitoring of pesticides and polycyclic
aromatic hydrocarbons in water from Paraíba do Sul river, Brazil. J. Braz. Chem.
Soc, v. 15, p. 292-299, 2004.
13. Butz, S.; Stan, H. J.; Screening of 265 pesticides in water by thin-layer
chromatography with automated multiple development. Analytical Chemistry, v. 67,
p. 620-630, 1995.
14. Santos, L. B. O.; Abate, G.; Masini, J. C.; Developing a continuous flow-square wave
voltammetry method for determination of atrazina in soil solutions using the hanging
mercury drop electrode. J. Braz. Chem. Soc, v. 17, p. 36-42, 2006.
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 55
15. Disponível em http://www.caslab.com/EPA-Methods/PDF/619.pdf. Acesso em 02
dez. 2006.
16. Norrgran, J.; Bravo, R.; Bishop, A. M.; Retrepo, P.; Whitehead, R. D.; Needhama,
L. L.; Barr, D. B.; Quantification of six herbicide metabolites in human urine.
Journal of Chromatography B, v. 830, p. 185 –195. 2006.
17. Katsumata, H.; Kaneco, S.; Suzuki, T.; Ohta, K.; Determination of atrazine and
simazine in water samples by high performance líquid chromatography after
preconcentration with heat-treated diatomaceous earth. Analytica Chimica Acta, v.
577, n. 2, p. 214-219, 2006.
18. Prosen, H.; Zupancic-Kralj, L.; Marsel, J.; Optimization of an analytical procedure
for the determination of triazine herbicides in environmental samples. Journal of
Chromatography A, v. 704, p. 121-130, 1995.
19. Frias, S.; Sánchez, M. J.; Rodríguez, M. A.; Determination of triazine compounds in
ground water samples by micellar electrokinetic capillary chromatography. Analytica
Chimica Acta, v. 503, p. 271-278, 2004.
20. Carabias-Martinéz, R.; Rodríguez-Gonzalo, E.; Dominguez-Álvares, J.;
Hernández-Méndez, J.; Determination of Triazine herbicides in natural waters by
solidphase extraction and non-aqueous capillary zone electrophoresis. Journal of
Chromatography A, v. 869, p. 451-461, 2000.
21. Schmitt, Ph.; Garrison, A. W.; Freitag, D.; Kettrup, A.; Separation of s-triazine
herbicides and their metabolites by capillary zone electrophoresis as a function of
pH. Journal of Chromatography A, v. 723, p. 169-177, 1996.
22. Acedo-Valenzuela, M. I.; Galeano-Díaz, T.; Mora-Díez, N; Silva-Rodríguez, A.;
Determination of neutral and cationic herbicides in water by micellar electrokinetic
capillary chromatography. Analytica Chimica Acta, v. 519, p. 65-71, 2004.
23. Lin, C.; Liu, Y.; Yang, T., Wang, T.; Yang, C.; On-line concentration of s-triazine
herbicides in micellar electrokinetic capillary chromatography using a cationic
surfactant. Jounal Chromatography A , v. 916, p. 239-245, 2001.
24. Baranowska, I.; Barchan´ska, H.; Pacak, E.; Procedures of trophic chain samples
preparation for determination of triazines by HPLC and metals by ICP-AES methods.
Environmental Pollution, v. 143, p.206-211, 2006.
25. Norrgran,J.; Bravo, R.; Bishop, A.M.; Retrepo, P.; Whitehead, R.D.; Needhama,
L.L.; Barr, D.B.; Quantification of six herbicide metabolites in human urine. Journal
of Chromatography B, v. 830, p. 185 –195, 2006.
26. Abate, G.; Masini, J.C.; Sorption of Atrazine, Propazine, Deethylatrazine,
Deisopropilatrazine and Hydroxyatrazine onto Organovermiculite, J. Braz. Chem.
Soc, v. 16, n. 5, p. 936-943, 2005).
27. Nascimento, P.C.; Rohlfes , A.L.B; Bohrer, D.; Carvalho, L.M.; Pilau, E.J.; Hplc
based method using sample precolumn cleanup for the determination of triazines
and thiolcarbamates in hemodialysis saline solutions. Talanta, v.65, p. 211-216,
2005.
28. Baranowska, I.; Barchan’ska, H.; Pyrsz, A.; Distribution of pesticides and heavy
metals in trophic chain. Chemosphere, v. 60, p. 1590-1599, 2005.
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 56
29. Melo, L.F.C.; Collins, C.H.; Jardim, I.C.S.F.; High – performance liquid
chromatographic determination of pesticides in tomatoes using laboratory-made
NH2 and C18 solid-phase extraction materials. Journal of Chromatography A, v.
1073, p. 75-81, 2005.
30. Pinto, G.M.F.; Jardim, I.C.S.F; Use of solid-phase extraction and high-performance
liquid chromatography for the determination of triazine residues in water: validation
of the method. Journal of Chromatography A, v. 869, p. 463-469, 2000.
31. Vissef, T.; Vredenbregta M. J.; Hovea, G. J.; Jong, A. P. J. M.; Somsemb, G. W.,
Gradient elution liquid chromatography-infrared spectrometry at µg.L-1 level using
capillary column switching and addition of a make-up liquid: A preliminary study.
Analytica Chimica Acta, v. 342, p. 151-158, 1997.
32. Thomas, D.H.; Beck-Westermeyer, M.; Hage, D.S.; Determination of Atrazine in
water using tandem high-performance immunoaffinity chromatography and
reversed-phase liquid chromatography. Anal Chem., v. 66, p. 3823-3829, 1994.
33. Berg, M.; Muller, S.R.; Schwanenbach, R.P.; Simultaneous determination of
triazines including Atrazine and their major metabolites Hydroxyatrazine,
Desethylatrazine, and Deisopropylatrazine in natural waters. Anal. Chem, v. 67, p.
1860-1865, 1995.
34. Onnerfjord, P.; Barceló, D.; Emnéus, J.; Gorton, L.; Marko-Varga, G.; On-line
solid-phase extraction in liquid chromatography using restricted access pre-columns
for the analysis of s-triazines in humic-containing waters. Journal of
Chromatography A, v. 737, p. 35-45, 1996.
35. Frias, S.; Sánchez, M.J.; Rodríguez, M.A.; Determination of triazine compounds in
ground water samples by micellar electrokinetic capillary chromatography. Analytica
Chimica Acta, v. 503, p. 271-278, 2004.
36. Acedo –Valenzuela, M.I.; Galeano-Díazi, T.; Díez, N.M.; Silva-Rodriguez, A.;
Determination of neutral and cationic herbicides in water by micellar electrokinetic
capillary chromatography. Analytica Chimica Acta, v. 519, p. 65-71, 2004.
37. Lin, C.E.; Liu, Y.C.; Yang, T.Y.; Wang, T.Z.; Yang, C.C; On-line concentration of
s-triazine herbicides in micellar electrokinetic chromatography using a cationic
surfactant. Journal of Chromatography A, v. 916, p. 239-245, 2001.
38. Lin, C.E.; Hsueh, C.C.; Wang, T.Z.; Chiu, T.C.; Chen, Y.C.; Migration behavior
and separation of s-triazines in micellar electrokinetic capillary chromatography
using a cationic surfactant. Journal of Chromatography A, v. 835, p. 197-207,
1999.
39. Carabias-Martinez, R.; Rodriguez-Gonzalo, E.; Mufioz-Dominguez, A.I.;
Dominguez-Alvarez, J.; Hernández-Mendez, J.; Determination of triazine
herbicides in water by micellar electrokinetic capillary chromatography. Journal of
Chromatography A, v. 733, p. 349-360, 1996.
40. Schmitt, Ph; Garrison, A. W.; Freitag, D.; Kettrup, A.; Separation of s-triazine
herbicides and their metabolites by capillary zone electrophoresis as a function of
pH. Journal of Chromatography A, v. 723, p. 169-177, 1996.
41. Lin, C.E.; Wang, T.Z.; Huang, H.C.; Hsueh, C.C.; Liu, Y.C.; Capillary zone
electrophoretic separation of neutral species of chloro-s-triazines in the presence of
Capítulo 2 – Princípios básicos de cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar 57
cationic surfactant monomers. Journal of Chromatography A, v. 878, p. 137-145,
2000.
Capítulo 3
INSTRUMENTAÇÃO ANALÍTICA, MATERIAIS,
REAGENTES E SOLUÇÕES
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 59
3.1 INSTRUMENTAÇÃO
3.1.1 Equipamentos utilizados no Instituto Nacional de Tecnologia
3.1.1.1 Equipamento para Cromatografia líquida
Foi utilizado um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Shimadzu LC 10 AT,
equipado com detector UV-Vis, autoinjetor, programa de controle e aquisição dos
dados Class VP 6.1.
3.1.1.2 Equipamento para Cromatografia gasosa
A confirmação da estrutura química do produto de degradação foi realizada
em um cromatógrafo gasoso de alta resolução modelo série 6890N acoplado a um
detector seletivo de massas 5973N Hewlett-Packard (Agilent Technologies).
3.1.1.3 Espectrofotômetro UV-Vis
Para seleção do comprimento de onda de cada substância foi utilizado um
espectrofotômetro da marca HACH DR 4000 com varredura de feixe simples e
cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm.
3.1.1.4 Equipamento para Extração em fase sólida
As extrações foram realizadas com a cuba de extração da marca J.T. Baker e
uma bomba da marca Fanem LTDA.
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 60
3.1.1.5 Equipamento para Extração líquido-líquido
Para realização da extração líquido-líquido foi utilizado um banho de ultra-som
da marca Odontobrás modelo 2840 D.
3.1.2 Equipamento utilizado na Universidade Federal de Juiz de Fora
3.1.2.1 Eletroforese capilar
Foi utilizado um Eletroforese Capilar Agilent
CE, equipado com fonte de alta tensão (± 30 KV), detector DAD (diode array),
controle de temperatura no interior do cartucho por passagem de ar forçado,
programa de controle, aquisição e tratamento de dados ChemStation 6.0.
3.2 COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
Utilizou-se a coluna analítica octadecilsilano, Zorbax 300 SB-C18 150 x 4,6
mm, 5µm, equipada com uma coluna de guarda Zorbax 300 SB-C18 4,6 x 12,5 mm,
5
µm e a coluna Shimpack C18 (250 x 4,6 mm 4,6 µm) para a análise das triazinas
para análise por CLAE
Para análise por CG foi utilizada coluna analítica de sílica fundida 5% difenil e
95% dimetilpolisiloxano, HP 5 MS (30m X 0,25 mm d.i.) revestida com um filme de
0,25 µm.
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 61
3.3 CAPILARES
Utilizou-se capilar de sílica fundida com revestimento externo de polimida,
obtido da Polymicro Technologies (Phoenix, AZ, EUA), com dimensões do capilar de
75 e 50 µm de diâmetro interno (d.i.) e 375 µm de diâmetro externo (d.e.). A janela
de detecção foi feita por remoção da polimida, a 40 cm do início do capilar, para um
comprimento total de 48,5 cm.
3.4 CARTUCHOS PARA EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS)
Para a extração de atrazina, simazina e propazina foram utilizados cartuchos
de octadecilsilano, C18 (J. T. Baker), com capacidade de 3 mL.
As extrações de atrazina e derivados foram realizadas através de extração
em fase sólida com cartuchos Oasis MCX (Waters) com capacidade de 3 mL. Este
cartucho contém uma fase polimérica umidecível em água que possui dois modos de
retenção, troca iônica e fase reversa, tornando possível então uma completa
extração, já que os analitos possuem polaridades muito diferentes.
3.5 CAPELA DE FLUXO LAMINAR
Todas as manipulações com o fungo Pleurotus ostreatus foram realizados na
capela de fluxo laminar (Veco) equipada com lâmpada germicida UV.
3.6 AUTOCLAVE
Autoclave vertical modelo 103 Fabbe-Primar.
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 62
3.7 REAGENTES E SOLVENTES
3.7.1 Padrões
Os padrões de atrazina (A, 98,4% de pureza) e simazina (S, 99,0% de
pureza), deisopropilatrazina (DIA, 98,0% de pureza), desetilatrazina (DEA, 98,5% de
pureza), hidroxiatrazina (HA, 96,0% de pureza), desetildeisopropilatrazina (DEDIA,
95,7% de pureza), foram obtidos de Dr. Ehrenstorfer GmbH, o padrão propazina (P,
99,3% de pureza) desetilhidroxiatrazina (DEHA, 98,7% de pureza) e
deisopropilhidroxiatrazina (DIHA, 95,0% de pureza) foram obtidos de Riedel–de-
Haën.
3.7.2 Reagentes utilizados para análise de atrazina, simazina e propazina por
CLAE
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico ou espectroscópico,
acetonitrila (ACN) HPLC (Tedia) e metanol (MeOH) HPLC (Vetec), Acetato de sódio
(Merck), acetato de amônio (Isofar), ácido acético glacial (Hoechst Brasil), água ultra
pura produzida em laboratório (H
2
O), , acetato de etila HPLC (Ominisolv) e éter
etílico anidro (Tedia), hidróxido de sódio (Vetec).
3.7.3 Reagentes utilizados para análise de atrazina e derivados por CLAE
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico ou espectroscópico,
acetonitrila (ACN) HPLC (Tedia), ácido fosfórico (Vetec), hidróxido de amônio
(Merck), água ultra pura produzida em laboratório (H
2
O), fosfato de sódio
monobásico e fosfato de sódio dibásico (Merck), hidróxido de sódio (Vetec).
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 63
3.7.4 Reagentes utilizados para análise de atrazina e derivados por EC
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico ou espectroscópico,
acetonitrila (ACN) HPLC (Tedia) e metanol (MeOH) HPLC (Vetec), Acetato, ácido
clorídrico (HCl) (Vetec), água ultra pura (H
2
O), Tris (hidroximetil)amino metano p.a.
(Vetec).
3.7.5 Reagente utilizado para análise de atrazina e derivados por CG
Gás hélio ultra puro,foi utilizado como gás de arraste na análise por CG.
3.7.6 Reagentes utilizados nas reações de degradação enzimática com HRP
Para a degradação de atrazina com a enzima Horseradish peroxidase (HRP)
foram utilizados 2,4 diclorofenol (2,4 DCP) (Sigma), 4- aminoantipirina (4-AAP)
(Merck), fosfato de sódio monobásico e fosfato de sódio dibásico (Merck) e peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
) (Vetec).
A enzima HRP foi gentilmente cedida pela Toyobo do Brasil.
3.7.7 Reagentes utilizados nas reações de degradação enzimática com lacase
Para os estudos de degradação com a enzima lacase foram utilizados os
reagentes 2,2’-azino-bis (ácido 3etilbenzotiazolina-6-sulfônico) diamônio-98%
(ABTS) (Sigma), hidróxido de sódio (Vetec) e ácido succínico p.a. (Vetec). A enzima
lacase, proveniente do fungo Aspergilus orizae geneticamente modificado, foi
gentilmente cedida pela Novozyme.
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 64
3.7.8 Reagentes utilizados nas reações de degradação enzimática com o fungo
Pleurotus ostreatus
Para o preparo da solução nutritiva foram utilizados: CaCl
2
p.a. (Merck),
ZnSO
4
. 7H
2
O p.a. (Vetec), MgSO
4
. 7H
2
O p.a. (Merck), KH
2
PO
4
p.a. (Vetec), Uréia
p.a. (Reagen), (NH
4
)
2
SO
4
p.a. (Vetec), MnSO
4
. H
2
O p.a. (Carlo Erba), FeSO
4
. 7H
2
O
p.a. (Vetec) e CoCl
2
p.a. (Vetec).
O fungo Pleurotus ostreatus, mantido em ágar-aveia, foi gentilmente cedido
pelo Laboratório de Cogumelos Comestíveis do Setor de Microbiologia Agrícola da
UFLA – Universidade Federal de Lavras. O meio de cultura utilizado foi cultivado em
potato dextrose agar (pda) (Merck) e aveia em flocos finos (Quaker).
3.8 SOLUÇÕES
Todas as soluções utilizadas foram filtradas com um filtro de seringa com
membrana de Teflon (PTFE) de 0,45 µm (Millipore) e os solventes foram filtrados em
membranas de 0,45
µm (Millipore) utilizando um kit para filtração (Millipore) e uma
bomba a vácuo (Fysma).
3.8.1 Preparo de soluções utilizadas na separação de atrazina, simazina e
propazina por CLAE
Inicialmente foram preparadas soluções estoque de 100 mg/L de atrazina,
simazina, propazina em acetonitrila. A partir destas soluções foram preparadas
soluções intermediárias de 35 mg/L e 10 mg/L. Destas soluções, preparou-se
soluções de trabalho de 1 mg/L de cada composto.
Para construção das curvas analíticas foram preparadas soluções de 1, 3, 5,
8, 12 e 15 mg/L de atrazina, simazina e propazina.
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 65
Para a determinação do comprimento de onda de máxima absorvância dos
três compostos foi realizada uma varredura de 190 a 500 nm. Os compostos foram
solubilizados em acetonitrila. Soluções de atrazina, simazina e propazina foram
preparadas na concentração de 0,150 µmol/L.
Para escolha da fase móvel na separação de atrazina, simazina e propazina
utilizou-se solução tampão acetato de sódio 2,5 mmol/L pH 4,5.
3.8.2 Preparo de soluções utilizadas na separação de atrazina e derivados por
CLAE
Inicialmente foram preparadas soluções concentradas de atrazina e seus
produtos de degradação. A atrazina, DEA, DIA foram solubilizados em acetonitrila.
DIHA, DEHA e DEDIA foram solubilizados em 20% HCl 0,1 mol/L e 80% acetonitrila,
a HA foi solubilizada em 20% HCl 0,1 mol/L e 80% água ultra pura. A partir destas
soluções foram preparadas soluções de trabalho.
A curva analítica para HPLC foi preparada nas concentrações de 5,0, 10,0
15,0, 20,0 e 25,0 mg/L para atrazina; 1,20, 1,60, 2,00, 2,40 e 2,80 mg/L de DIA, DEA
e HA; 3,0, 6,0, 9,0, 12,0 e 15,0 mg/L de DIHA e DEDIA e 2,0, 5,0, 8,0, 11,0 e 14,0
mg/L de DEHA.
Para os cálculos de recuperação foram preparadas três soluções com o
terceiro ponto da curva analítica.
Por extração em fase sólida a eluição foi realizada com uma solução de
NH
4
OH a 4% em acetonitrila.
Para a determinação do comprimento de onda de máxima absorvância dos
compostos realizaram-se duas varreduras de 190 a 300 nm. Uma varredura foi
realizada solubilizando os compostos em acetonitila e outra varredura foi realizada
solubilizando os compostos em tampão fosfato pH 7,28 5 mmol/L. Soluções de cada
um dos compostos foram preparadas na concentração de 0,150 µmol/L.
Preparou-se uma solução tampão fosfato de sódio pH 7,28 na concentração
de 5 mmol/L que foi utilizada como fase móvel.
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 66
3.8.3 Preparo de soluções utilizadas na separação de atrazina e derivados por
EC
Preparou-se soluções na concentração de 10 mg/L de cada analito em ACN.
Foi preparado o tampão Tris-HCl em acetonitrila e metanol.
3.8.4 Preparo de soluções para reações de degradação
3.8.4.1 Preparo de soluções para reações de degradação e determinação da
atividade enzimática da HRP
Para as reações de degradação da atrazina com HRP foi utilizada solução
tampão fosfato 0,2 mol/L pH 6,0 para solubilizar a enzima, a qual foi filtrada e
estocada a 4°C.
Soluções de peróxido de hidrogênio 10 mmol/L, 4 aminoantipirina (4-AAP)
1,6mmol/L, 2,4-diclorofenol (2,4 DCP) 15 mmol/L e tampão fosfato 0,1 mol/L pH 7,0
também foram usadas nos ensaios com esta enzima.
3.8.4.2 Preparo de soluções para reações de degradação e determinação da
atividade enzimática da lacase
Para as reações de degradação da atrazina com a enzima lacase foi utilizado
tampão succinato de sódio pH 4,5 e o mediador ABTS 3 mmol/L.
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 67
3.8.4.3 Preparo de soluções para as reações de degradação com o fungo
Pleurotus ostreatus
Para as reações de degradação da atrazina com o fungo Pleurotus ostreatus,
foi preparada uma solução nutritiva em água destilada, com 1,4 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
,
2,0 g/L de KH
2
PO
4
, 0,1 g/L de uréia, 0,3 g/L de MgSO
4
. 7H
2
O, 0,3 g/L de CaCl
2
, 5,0
mg/L de FeSO
4
. 7H
2
O, 1,56 mg/L de MnSO
4
H
2
O, 2,0 mg/L de CoCl
2
e 1,4 mg/L de
ZnSO
4
.
A atrazina utilizada foi preparada em ACN na concentração de 726,20 mg/L,
enquanto que a solução de DEA foi preparada em ACN na concentração de 10
mg/L.
3.9 BIODEGRADAÇÃO DA ATRAZINA
3.9.1 Preparo do meio reacional para degradação de atrazina com HRP
Como a atrazina possui baixa solubilidade em água, optou-se por utilizar
meios reacionais contendo 35% de acetonitrila, conforme reportado por Ribeiro em
2007
1
, que descreve como sendo esta a melhor condição para a manutenção da
estabilidade da enzima HRP. As atividades remanescentes da HRP em meios
contendo solvente estão apresentadas na figura 3.1.
Figura 3.1 - Variação da atividade enzimática da HRP em meios contendo solvente orgânico
0
1
2
3
4
5
6
7
A
CN
25
%
ACN
3
5%
E
TOH
25
%
ETOH 35
%
Porcentagem de solvente orgânico no meio de reação
Atividade enzimática remanescente
(U/mL)
2 Horas
1 Hora
Tempo inicial
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 68
Meios reacionais foram testados utilizando esta proporção de solvente
orgânico, peróxido de hidrogênio, atrazina 10 mg/L e tampão fosfato pH 6,0.
Todas as reações foram realizadas na presença de controle. Um dos
controles continha atrazina, peróxido e tampão e o outro controle continha atrazina,
enzima e tampão, sempre nas mesmas proporções da reação.
3.9.2 Preparo do meio reacional para degradação da atrazina com a enzima
lacase
Foram realizados meios reacionais contendo 10 mg/L de atrazina, tampão
succinato pH 4,5, ABTS e enzima lacase pura e seus respectivos controles: sem a
enzima (apenas ABTS, tampão succinato e atrazina), sem o substrato atrazina
(ABTS, tampão succinato e enzima) e sem o mediador ABTS (tampão succinato,
atrazina e enzima).
3.9.3 Preparo do meio reacional para degradação de atrazina com Pleurotus
ostreatus
Na capela de fluxo laminar foi adicionado, a um erlenmeyer de 50 mL, um
volume adequado de solução padrão de atrazina para que em um volume final de 30
mL sua concentração final fosse de 10 mg/L. Esperou-se a completa evaporação do
solvente e posteriormente adicionou-se 30 mL de solução nutritiva. Homogeneizou-
se bem a solução.
A esta solução homogeneizada foram adicionados 3 discos de 6 mm do fungo
Pleurotus ostreatus crescido em ágar.
Foram realizados dois controles da incubação: um contendo atrazina e
solução nutritiva na mesma proporção da reação e outro contendo a solução
nutritiva e os 3 discos de 6 mm do fungo.
As incubações foram colocadas em uma estufa a 30 °C.
Capítulo 3- Instrumentação analítica, materiais, reagentes e soluções 69
REFERÊNCIAS
1. Ribeiro, Cristiano Porto. Estudo sobre a biooxidação do limoneno. 2007.
Dissertação (Mestrado em Ciências-Bioquímica) – Instituto de Química
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.
Capítulo 4
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA
DETERMINAÇÃODE ATRAZINA, SIMAZINA
E PROPAZINA POR CLAE
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 71
4.1 INTRODUÇÃO
Neste trabalho foi proposto o desenvolvimento de metodologia para
separação de atrazina, simazina e propazina por cromatografia líquida de alta
eficiência. Inicialmente utilizou-se a mistura de solventes MeOH/H
2
O.
Posteriormente, baseando-se na literatura, trocou-se a fase móvel por ACN/Tampão
acetato de sódio 2,5 mmol/L pH 4,5. Através do uso de um planejamento de
misturas investigou-se qual a melhor proporção da fase móvel a ser otimizada para a
separação das triazinas.
É importante lembrar que o uso prolongado de fase móvel composta de
tampão tende a diminuir o tempo de vida útil de uma coluna analítica. Portanto no
intuito de viabilizar a otimização, dois experimentos foram realizados contendo a
mesma proporção de ACN como solvente orgânico no modo isocrático. Um
experimento empregou a solução tampão e o outro água para compor a fase móvel,
sendo os resultados comparados em relação à resolução dos picos.
4.2 OBJETIVO
Desenvolver e otimizar metodologia analítica por meio de cromatografia líquida
de alta eficiência para a análise de atrazina, simazina e propazina.
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 72
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1 Seleção do comprimento de onda de máxima absorvância dos analitos.
Um estudo espectrofotométrico na região do ultravioleta e visível (UV-Vis) foi
realizado no intuito de selecionar o mais adequado comprimento de onda de
detecção, levando-se em consideração a melhor resposta de sinal para os diferentes
pesticidas investigados.
A Figura 4.1 apresenta o espectro de varredura UV-Vis dos herbicidas
atrazina, simazina e propazina. O comprimento de onda selecionado para a análise
foi o de máxima absorvância para todos os analitos. Portanto o valor utilizado foi o
de 221 nm
Figura 4.1 - Espectros de absorção UV-Vis da atrazina, simazina e propazina solubilizadas em ACN
na concentração 0,150 µmol/L.
Simazina
Pro
p
azina
Atrazina
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 73
4.3.2 Extração
Foram realizadas extrações líquido-líquido, com acetato de etila e éter etílico
e extração em fase sólida com cartucho octadecilsilano (C18) das triazinas do meio
reacional contendo triazina, peróxido de hidrogênio, tampão fosfato 0,2 mol/L pH 6,0
e enzima, para posterior comparação.
Para efetuar a extração líquido-líquido das triazinas do meio reacional, foram
realizadas três adições consecutivas de 1 mL de acetato de etila ou éter etílico,
levando-os ao banho de ultra-som por 10, 5 e 5 minutos respectivamente. Os
extratos obtidos após a extração foram analisados por CLAE.
Para a extração de atrazina, simazina e propazina com cartuchos C18, o
condicionamento foi realizado com metanol e acetato de etila.
A extração de atrazina, simazina e propazina com cartucho (C18) mostrou-se
eficaz na literatura, pois foram obtidos bons resultados de recuperação
1
.
Todos os extratos foram analisados por CLAE. Como é possível que haja
alguma interferência na análise devido ao solvente de extração (eluente), foi
realizada a concentração dos extratos, com N
2
, e posteriormente a ressuspensão
dos analitos com acetonitrila. A Figura 4.2 apresenta um fluxograma com as etapas
seguidas no estudo de extração.
Figura 4.2- Fluxograma dos testes de extração realizados para as s-triazinas.
Extração
Líquido-líquido
Líquido-líquido
concentrado
com N
2
Extração em
fase sólida
concentrado
com N
2
Acetato de etila
Éter etílico
Acetato de etila
Ressuspendido
com Acetonitrila
Metanol +
Acetato de Etila
Ressupendido
com Acetonitrila
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 74
Na extração líquido-líquido, optou-se por utilizar apenas o acetato de etila
como solvente de extração. Apesar de o éter etílico não absorver na região do
ultravioleta estudada, este possui uma alta pressão de vapor, ou seja, volatiliza
rapidamente, o que dificulta seu manuseio principalmente em pequenas
quantidades, considerando também a sua toxicidade.
Como o acetato de etila absorve na região UV estudada, podendo interferir na
identificação de novos picos, resolveu-se então realizar uma etapa de concentração
com N
2
e ressuspensão com acetonitrila. Para e extração com cartucho C18 o
mesmo procedimento foi realizado.
A recuperação para cada condição de extração realizada foi calculada e o
melhor resultado foi obtido para extração líquido-líquido. A recuperação de cada
composto está descrita na tabela 4.1.
A recuperação é a porcentagem calculada que expressa a quantidade de
analito recuperada em uma matriz fortificada após um procedimento de extração.
Pode ser determinada pela equação 1.
%100x
realmassa
obtidamassa
R = (equação 1)
Tabela 4.1- Recuperações obtidas das s-triazinas nas diferentes condições de extração.
Extração líquido-líquido
Atrazina Simazina Propazina
Recuperação(%)
82 69 86
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 75
4.3.3 Otimização de metodologia por CLAE para a análise de atrazina, simazina
e propazina.
4.3.3.1 Estudos preliminares
Alguns trabalhos descritos na literatura utilizam metanol ou acetonitrila como
solvente orgânico constituinte da fase móvel
2-4
. Em função disto realizou-se estudos
preliminares com o intuito de promover a separação de uma mistura de padrões
contendo atrazina, simazina e propazina utilizando–se como fase móvel MeOH/H
2
O
(60/40% v/v). A figura 4.3 apresenta o perfil de separação dos três compostos
analisados.
Figura 4.3 – Separação de uma mistura de padrões de simazina (1), atrazina (2) e propazina (3) por
CLAE utilizando como fase móvel MeOH/H
2
O 60/40 (v/v), fluxo de 1 mL/min, volume de injeção 20
µL, coluna Zorbax 300SB C18 e detecção em 221 nm. Os analitos foram preparados na concentração
de 33,3 mg/L. Experimento 1.
4 6 8 10 12 14 16 1
8
200 mAu
minutos
1
2
3
4 6 8 10 12 14 16 1
8
200 mAu
minutos
1
2
3
200 mAu
minutos
1
2
3
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 76
Entretanto os resultados obtidos não foram considerados satisfatórios, pois
observa-se instabilidade na linha base, picos largos e com baixa simetria e
resolução entre o par simazina e propazina menor que 1,5.
Uma vez que o uso de MeOH como constituinte da fase móvel não foi
satisfatório, um novo estudo foi proposto usando ACN como fase móvel. No entanto
para escolher uma proporção de partida da acetonitrila que tivesse uma força de
eluição próxima ao metanol, utilizou-se um nomógrafo como orientação, que é uma
tabela comparativa de forças de eluição para diferentes solventes. A Figura 4.4
apresenta um nomógrafo e suas respectivas forças de eluição para a acetonitrila e
metanol, quando estes estão dissolvidos em determinada proporção de água.
A fase móvel escolhida para comparação da separação de triazinas com
MeOH/H
2
O foi a fase móvel ACN/Tampão acetato de sódio 2,5 mmol/L pH 4,5. Este
tampão foi escolhido devido a grandes quantidades de trabalhos descritos na
literatura que o utilizam por tornar os picos dos analitos mais simétricos. Portanto
como o valor da força de eluição de cada solvente é apresentada de acordo com a
sua proporção em H
2
O, o valor encontrado da força de eluição para acetonitrila é um
valor aproximado.
Figura 4.4 - Nomógrafo para modo reverso de eluição, com a comparação da força de eluição dos
dois solventes utilizados, ACN e MeOH.
Em virtude da força de eluição, a porcentagem de acetonitrila escolhida para
iniciar os testes foi de ACN/Tampão acetato 50/50 (v/v). Um planejamento de
mistura foi realizado com o intuito de selecionar a fase móvel com a melhor resposta
para a separação dos analitos. A Tabela 4.2 apresenta o planejamento realizado.
60
50
60 70 80 90
403020
10 0
100
Acetonitrila (%)
Metanol
(
%
)
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 77
Tabela 4.2 - Planejamento de mistura utilizado no estudo para a separação de uma mistura de
atrazina, simazina e propazina.
A figura 4.5 apresenta uma separação de atrazina, simazina e propazina com
a fase móvel ACN/Tampão 50/50 (v/v).
Figura 4.5 - Separação de uma mistura de padrões de simazina (1), atrazina (2) e propazina (3) por
CLAE utilizando como fase móvel ACN/Tampão 50/50 (v/v), fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de
20 µL, coluna C18 e detecção em 221 nm. Os analitos foram preparados na concentração de 33,3
mg/L. Experimento 2.
Fase móvel
Experimento
ACN/Tampão 50/50
(v/v)
MeOH/H
2
O 60/40 (v/v)
1
0% 100%
2
100% 0%
3
50% 50%
4
67% 33%
5
84% 16%
6
33% 67%
7
16% 84%
246810
minutos
1
2
3
200 mAu
246810
minutos
1
2
3
200 mAu
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 78
As figuras 4.3, 4.5 e 4.6 apresentam os cromatogramas com as misturas de
fase móvel do planejamento realizado. Como pode ser observado, a fase móvel que
apresenta maior influência na separação é ACN/Tampão. Isto pode ser observado,
pois com o aumento da proporção de ACN/Tampão a variação dos perfis dos
analitos é bem significativa, já com o aumento da proporção da mistura MeOH/H
2
O
não há muita alteração no perfil do cromatogramas. Um outro motivo que levou a
escolha da fase móvel ACN/Tampão foi o tempo de análise, pode-se observar que
quanto maior a proporção de MeOH/H
2
O maior o tempo de análise. A Tabela 4.3
apresenta as proporções de fase móveis utilizadas na figura 4.6.
Tabela 4.3- Fases móveis utilizadas na separação de atrazina, simazina e propazina em um
planejamento de experimentos.
Experimento Fase móvel
A 16% ACN/Tampão/ 84% MeOH/H
2
O
B 33% ACN/Tampão/ 67% MeOH/H
2
O
C 50% ACN/Tampão/ 50% MeOH/H
2
O
D 67% ACN/Tampão/ 33% MeOH/H
2
O
E 84% ACN/Tampão/ 16% MeOH/H
2
O
Portanto a fase móvel escolhida para os estudos subseqüentes foi
ACN/Tampão.
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 79
Figura 4.6 - Cromatogramas de misturas de padrões de Simazina (1), Atrazina (2) e Propazina (3)
por CLAE utilizando como
fase estacionária coluna C18, fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 20 µL, coluna C18 e
detecção em 221 nm. Os analitos
foram preparados na concentração de 3,3 mg/L. As fases móveis utilizadas estão descritas na
tabela 4.3.
051015
0 5 10 15
0 5 10 15
0 5 10 15
0 5 10 15
4 mAu
4 mAu
4 mAu
4 mAu
4 mAu
minutos
minutos
minutos
minutos
minutos
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
ABC
DE
051015
0 5 10 15
0 5 10 15
0 5 10 15
0 5 10 15
4 mAu
4 mAu
4 mAu
4 mAu
4 mAu
minutos
minutos
minutos
minutos
minutos
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
ABC
DE
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 80
4.3.3.2 Otimização da fase móvel
Uma vez que os estudos preliminares apontaram a mistura ACN/Tampão
como a mais adequada para a separação de simazina, atrazina e propazina, um
novo estudo levando em consideração a variação da proporção ACN/Tampão
acetato de sódio pH 4,5, 2,5 mmol/L foi realizado.
As proporções investigadas variaram entre ACN/Tampão 70/30 (v/v) até
ACN/Tampão 30/70 (v/v), conforme descrito na tabela 4.4. Os cromatogramas da
figura 4.7 ilustram o perfil de separação das s-triazinas estudadas.
Como pode ser observado o aumento da proporção em tampão na fase
móvel aumenta a sua polaridade e favorece a separação.
A ordem de eluição pode ser explicada pela variação da polaridade dos
analitos, ou seja, compostos mais polares, possuirão menor afinidade pela fase
estacionária C18, saindo com tempos de retenção menores. Com isto, podemos
concluir que dos três compostos analisados até o momento, a ordem decrescente de
polaridade é a seguinte: simazina > atrazina > propazina. Essa afirmação pode ser
também confirmada por uma análise da estrutura química de cada substância.
Compostos com maior número de ramificações metil, possuem polaridades
menores, um exemplo disto é quando se compara a propazina e a simazina. Uma
observação que deve ser feita em relação a estas substâncias é o seu pKa, a
simazina possui pKa igual a 1,65; atrazina pKa 1,68 e propazina pKa 1,85; todos
abaixo de 2. Assim, no pH da fase móvel (4,5), todas as substâncias estão neutras.
Tabela 4.4 apresenta as fases móveis utilizadas na otimização da separação
de atrazina, simazina e propazina, ilustrada na figura 4.7.
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 81
Tabela 4.4 - Fases móveis utilizadas na separação de atrazina, simazina e propazina em uma
otimização da separação com a fase móvel ACN/Tampão.
Experimento Fase móvel
A 30/70 (v/v) ACN/Tampão
B 35/65 (v/v) ACN/Tampão
C 40/60 (v/v) ACN/Tampão
D 45/55 (v/v) ACN/Tampão
E 65/35 (v/v) ACN/Tampão
F 70/30 (v/v) ACN/Tampão
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 82
Figura 4.7 - Cromatogramas de misturas de padrões de Simazina (1), Atrazina (2) e Propazina (3) com diferentes proporções de
fase móvel ACN/Tampão, utilizando como fase estacionária coluna C18, fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 20 µL e detecção
em 221 nm. Os analitos foram preparados na concentração de 3,3 mg/L. As proporções de fase móvel utilizadas encontram-se na tabela
4.4..
0 5 10 15 20
6 mAu
minutos
0 5 10 15 20
6 mAu
minutos
05101520
minutos
6 mAu
1
2
3
0 5 10 15 20
0 5 10 15 20
minutos
6 mAu
1
2
3
0 5 10 15 20 25 30
6 mAu
minutos
1
2
3
1
2
3
minutos
6 mAu
0 5 10 15 20
6 mAu
minutos
0 5 10 15 20
6 mAu
minutos
0 5 10 15 20
minutos
6 mAu
1
2
3
0 5 10 15 20
0 5 10 15 20
minutos
6 mAu
1
2
3
0 5 10 15 20 25 30
6 mAu
minutos
1
2
3
1
2
3
minutos
6 mAu
A
B
D
F
C
E
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 83
Para a escolha da fase móvel mais eficiente na separação, foi realizado o
cálculo da resolução. O valor ideal para se ter de resolução entre os pares de picos
adjacentes é acima de 1,5, pois ocorre uma boa separação. A Tabela 4.5 apresenta
o valor da resolução para os pares adjacentes de analitos nas fases móveis
estudadas.
Tabela 4.5 - Cálculo da resolução entre os picos adjacentes para as diferentes fases móveis testadas
para misturas de 1mg/L com fluxo de 1 mL/min, coluna C18 e detecção em 221 nm..
Com os cálculos da resolução a melhor fase móvel a ser utilizada para a
separação e quantificação da simazina, atrazina e propazina é a fase móvel
ACN/Tampão 30/70 v/v, já que dentre as proporções testadas foi à única que
apresentou resolução acima de 1,5 para os três analitos estudados.
4.3.3.3 Mudança de solvente aquoso
Após determinar a proporção de cada solvente na fase móvel, resolveu-se
testar a troca do solvente aquoso tampão acetato de sódio pH 4,5 2,5 mmol/L, para
a água ultra pura, visto que o uso de sais durante prolongado tempo, diminui o
tempo de vida útil da coluna cromatográfica.
A Tabela 4.6 apresenta a comparação das resoluções entre os picos
adjacentes utilizando as fases móveis ACN/H
2
O e ACN/Tampão acetato.
Fase móvel Resolução Resolução
Simazina Atrazina Atrazina Propazina
30:70 (v/v) ACN:Tampão 1,614 2,796
35:65 (v/v) ACN:Tampão 0,882 1,101
40:60 (v/v) ACN:Tampão 0,798 0,945
45:55 (v/v) ACN:Tampão 0,785 1,143
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 84
Tabela 4.6-Resolução dos pares adjacentes com fase móvel ACN/H
2
O e ACN/Tampão para
misturas de 1mg/L, utilizando coluna C18 e fluxo de 1 mL/min e detecção em 221 nm.
Como a separação entre atrazina e simazina utilizando ACN/H
2
O 30/70 (v/v)
apresentou uma resolução maior, que em ACN/Tampão, e o uso de H
2
O é melhor
para a coluna analítica, esta fase móvel foi escolhida.
4.3.3.4 Avaliação da separação cromatográfica
A tabela 4.7 apresenta os valores de t
R
, k’, R e α para a separação da mistura
de atrazina, simazina e propazina, utilizando a coluna Zorbax C18 300SB, ACN:H
2
O
30:70 (v/v), fluxo 1 mL/min e detecção em 221 e 230 nm.
Tabela 4.7- Parâmetros cromatográficos obtidos para a separação das triazinas nas melhores
condições cromatográficas.
Triazina t’
R
k’ R α N/m
Simazina
1
2,61 1,74 1,91 (R
1,2
) 1,84 (α
1,2
) 1,4 x 10
4
Atrazina
2
4,80 3,20 2,03 (R
2,3
) 1,86 (α
2,3
) 0,9 x 10
4
Propazina
3
8,94 5,96 1,1 x 10
4
t
M
= 1,50 min.
N/m = números de patros teóricos por metro
O t
M
foi determinado através da observação do primeiro pico encontrado no
cromatograma.
Os valores encontrados para k’, R e α estão de acordo com os valores
encontrados para a literatura como ideais. Isso demonstra que há eficiência
aceitável para a eparação dos três compostos.
Fase móvel Resolução Resolução
Simazina Atrazina Atrazina Propazina
30/70 (v/v) ACN:Tampão
1,61 2,80
30/70 (v/v) ACN:H
2
O 1,91 2,03
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 85
4.3.4 Avaliação da metodologia
Apesar da metodologia analítica não ter sido validada, algumas figuras de
mérito para validação foram avaliados: curva analítica, sensibilidade, limites de
detecção, limite de quantificação e recuperação.
4.3.4.1 Curva analítica
A reta que melhor se ajusta à distribuição dos pontos para obtenção das
relações entre duas ou mais variáveis é expressa por y = f(x). Para a avaliação da
falta de ajuste do modelo a análise dos resíduos é fundamental. Logo, o
procedimento usual para avaliação do modelo começa pela análise dos desvios das
observações em relação à média global.
Supondo-se que a relação entre x e y é uma reta, o modelo que descreve
esta relação é:
y = b
1
x + b
0
(equação 2)
Onde:
y = resposta medida (sinal)
x = concentração
b
1
= inclinação da curva analítica (coeficiente angular)
b
0
= interseção com o eixo y, quando x = 0 (coeficiente linear)
Para quantificar a qualidade do ajuste das retas e verificar se os modelos são
lineares, calculam-se os coeficientes de determinação ou de explicação das retas
(R
2
).
O coeficiente de determinação (R
2
) é o quadrado do coeficiente de correlação
(r), que é a medida do grau de associação entre as variáveis x e y e também da
proximidade dos dados a uma reta. R² é chamado de variação percentual explicada
pelo modelo, quanto mais próximo de 1 estiver o valor de R², mais o modelo
consegue descrever a variação em y.
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 86
Os gráficos de resíduos também devem ser construídos para verificar se suas
distribuições são aleatórias. Este gráfico é obtido plotando-se no eixo x os valores
das concentrações reais adicionadas, e no eixo y os valores dos resíduos, que é a
diferença entre os valores encontrados e os valores calculados (pelo modelo) de
concentração de cada analito.
Um importante fator que deve ser calculado é a existência ou não da falta de
ajuste do modelo. Isto é calculado através do teste F. Só faz sentido utilizar o
modelo se ele se mostrar capaz de descrever satisfatoriamente o comportamento
dos valores experimentais. A validade do modelo e a significância estatística da
curva ajustada podem ser testadas por meio da Análise de Variância . Se o modelo
estiver bem ajustado, a média quadrática devida à falta de ajuste reflete apenas os
erros aleatórios, portanto deve ser aplicado o teste F que relaciona as variâncias dos
resíduos e das medidas encontradas
5
.
A figura 4.8 apresenta as curvas analíticas com seus respectivos resíduos e
os modelos de cada composto. Como pode ser observado, nem todos os modelos
apresentados são lineares.
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 87
y = -684,42x
2
+ 238375x - 68742
R
2
= 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
2 6 10 14 18
y = -140,35x
2
+ 213482x - 102930
R
2
= 0,9999
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
2 6 10 14 18
y = 184973x + 30893
R
2
= 0,9999
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0246810
ATRAZINA
PROPAZINA
SIMAZINA
mg/L
mg/L mg/L
mAu
mAu
mAu
y = -684,42x
2
+ 238375x - 68742
R
2
= 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
2 6 10 14 18
y = -140,35x
2
+ 213482x - 102930
R
2
= 0,9999
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
2 6 10 14 18
y = 184973x + 30893
R
2
= 0,9999
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0246810
ATRAZINA
PROPAZINA
SIMAZINA
mg/L
mg/L mg/L
mAu
mAu
mAu
Figura 4.8 – Curvas analíticas para atrazina, simazina e propazina.
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 88
Como pode ser observado, todos os compostos apresentam modelos com R²
> 0,999. O teste F para verificação da falta de ajuste foi calculado, e seus valores
encontram-se na tabela 4.8.
Tabela 4.8 - Valores calculados para o teste F.
Triazina F
calculado
F
tabelado
Atrazina
3,00 3,71
Simazina
3,77 6,95
Propazina
4,98 6,59
Com estes valores é possível afirmar que os compostos não possuem falta de
ajuste, e, portanto o modelo apresentado representa bem à reta..
4.3.4.2 Limite de detecção (LOD) e Limite de quantificação (LOQ)
É a menor concentração de analito presente na matriz que pode ser
detectada, independentemente do ruído, nas condições de ensaio. Pode ser
calculada através da relação sinal/ruído, conforme a equação 3.
min
3
HH
xCxS
LOD
máx
sb
−
=
(equação 3)
Onde:
S
b
= desvio padrão da linha base;
C
s
= a concentração do analito;
H
máx
= altura máxima do pico
H
min
= altura da linha base.
O limite de quantificação é a menor concentração do analito que pode ser
determinada com um nível aceitável de exatidão e precisão. Pode ser calculado da
mesma maneira que o limite de detecção, porém utilizando a relação 10:1 através da
equação 4.
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 89
min
10
HH
xCxS
LOQ
máx
sb
−
=
(equação 4)
Onde:
S
b
= desvio padrão da linha base;
C
s
= a concentração do analito;
H
máx
= altura máxima do pico
H
min
= altura da linha base.
A Tabela 4.9 apresenta os valores de LOD e LOQ obtidos em padrões de
atrazina, simazina e propazina.
Tabela 4.9 – Valores de LOD e LOQ para simazina, atrazina e propazina.
Os valores de LOD e LOQ encontrados apesar de serem baixos não
compreendem o valor de limite máximo permitido segundo a CONAMA para atrazina
e simazina (2 µg/L) em água doce. Para análise de amostras de água seria
necessária então uma etapa de pré-concentração da amostra.
Triazinas LOD (µg/L) LOQ (µg/L)
Atrazina
4,80 16,0
Simazina
7,53 25,1
Propazina
8,53 28,4
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 90
4.4 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste capítulo mostraram que foi possível desenvolver
um método rápido, simples e eficiente, utilizando cromatografia líquida de alta
eficiência em fase reversa para análise simultânea de atrazina, simazina e
propazina.
As condições cromatográficas foram otimizadas através do estudo da melhor
composição de fase móvel. A fase móvel ACN/H
2
O 30/70 (v/v) foi a que permitiu a
melhor separação cromatográfica, avaliada através da análise dos parâmetros
cromatográficos k’, α e R.
O comprimento de onda utilizado na determinação foi de 221 nm, pois
permitiu uma boa sensibilidade para as triazinas estudadas.
As recuperações obtidas para atrazina e propazina estavam em conformidade
com a faixa de recuperação aceitável para amostras ambientais que é de 80-110%,
segundo a norma EC/2002/657
6
, porém a simazina não se comportou como os
outros herbicidas, apresentando uma recuperação de 69%.
Capítulo 4 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina, simazina e propazina por CLAE. 91
REFERÊNCIAS
1. Pinto, G.M.F.; Jardim, I.C.S.F.; Use of solid-phase extraction and high-
performance liquid chromatography for the determination of triazine residues in
water: validation of the method. Journal of Chromatography A, v. 869, p. 463-
469, 2000.
2. Baranowska, I.; Barchan´ska, H.; Pacak, E.; Procedures of trophic chain
samples preparation for determination of triazines by HPLC and metals by ICP-
AES methods. Environmental Pollution, v. 143, p. 206-211, 2006.
3. Katsumata, H.; Kaneco, S.; Suzuki, T.; Ohta, K.; Determination of atrazine and
simazine in water samples by high performance líquid chromatography after
preconcentration with heat-treated diatomaceous earth. Analytica Chimica Acta,
v. 577, n. 2, p. 214-219, 2006.
4. Abate, G.; Masini, J.C.; Sorption of Atrazine, Propazine, Deethylatrazine,
Deisopropilatrazine and Hydroxyatrazine onto Organovermiculite. J. Braz. Chem.
Soc, v. 16, n 5, p. 936-943, 2005.
5. Pimentel, M. F.; Neto, B. B.; Calibração: uma revisão para químicos analíticos.
Química nova, v. 19, n. 3, 1996.
6. Norma EC/2002/657. Disponível em: <http://eur-lex.europa.eu>. Acesso em 03
abr. 2009.
Capítulo 5
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA
DETERMINAÇÃO DE ATRAZINA
E DERIVADOS POR CLAE
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 93
5.1 INTRODUÇÃO
Neste capítulo foi proposto o desenvolvimento de uma nova metodologia para
separação de atrazina e derivados por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE). Foram realizados testes com a coluna Zorbax utilizada no capítulo 4, porém
não foi obtido resultado satisfatório, tendo em vista este acontecimento, uma coluna
com um comprimento maior e mesma fase estacionária foi utilizada na separação.
Devido a grande diferença de polaridade dos compostos analisados, foi
utilizado o cartucho de extração Oasis MCX no pré-tratamento das amostras.
Nesta separação foi utilizado um gradiente de eluição com a fase móvel
contendo ACN e Tampão fosfato de sódio 5 mmol/L pH 7,2. Apesar do tempo de
análise elevado (70 min), esta metodologia permite a quantificação da atrazina e
seus produtos de degradação. A relevância no desenvolvimento deste método é a
identificação dos produtos de degradação de atrazina que podem estar presentes
em águas, solos ou até biocombustíveis.
5.2 OBJETIVO
• Desenvolver metodologia analítica por meio de cromatografia líquida de alta
eficiência para a análise de atrazina e derivados.
• Otimizar metodologia de extração em fase sólida para análise de atrazina e
derivados.
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 94
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.3.1 Seleção do comprimento de onda de máxima absorvância para análise de
atrazina e derivados.
Para a determinação do comprimento de onda de máxima absorvância dos
compostos foram realizadas duas varredura de 190 a 300 nm. Uma varredura foi
realizada solubilizando os compostos em acetonitila e outra varredura foi realizada
solubilizando os compostos em tampão fosfato 5 mmol/L pH 7,28.
Como a determinação de atrazina e derivados é mais complexa que
separação de atrazina, simazina e propazina, pois possui compostos com
polaridades muito diferentes, foi necessário utilizar eluição por gradiente. Como os
solventes para eluição escolhidos foram acetonitrila e tampão fosfato de sódio
5mmol/L pH 7,2; a determinação do comprimento de onda de máxima absorvância
também foi determinada nestes solventes.
As figura 5.1 e 5.2 apresentam os espectros UV-Vis de cada composto.
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 95
Figura 5.1- Espectros na região do UV dos padrões de atrazina e derivados. As varreduras foram
realizadas com 0,150 µmol/L de cada padrão solubilizados em tampão fosfato de sódio.
Figura 5.2- Espectros na região do UV dos padrões de atrazina e derivados. As varreduras foram
realizadas com 0,150 µmol/L de cada padrão solubilizados em acetonitrila.
Au
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,1
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 30
0
Au
nm
Tampão fosfato
DEDIA HA DEHA DIHA DIA DEA A
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
nm
DEDIA HA DEHA DIHA DIA DEA A
Au
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 96
De acordo com os resultados apresentados nas figuras 5.1 e 5.2, os
comprimentos de onda 221 e 230 foram selecionados para as análises por CLAE e
EC.
5.3.2 Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e
derivados por CLAE
Para a determinação de atrazina e derivados por CLAE, foi testado
inicialmente a mesma coluna analítica que foi utilizada na separação de atrazina
simazina e propazina, a coluna Zorbax 300 SB. Como estes compostos possuem
características muito diferentes entre si, foi testado um gradiente de eluição e não
uma eluição no modo isocrático.
O primeiro gradiente de eluição testado para a separação de atrazina e
derivados foi um gradiente de eluição linear com tampão fosfato 5 mmol/L pH 7,2 por
60 min de 2-90% de ACN com fluxo de 1 mL/min encontrado na literatura na
separação de atrazina e alguns produtos de degradação
1
. A figura 5.3 apresenta o
cromatograma de uma mistura de atrazina e derivados. Como pode ser observado,
não se pode afirmar nada a respeito da separação dos compostos.
Figura 5.3 - Cromatograma da separação de uma mistura de atrazina e derivados por CLAE
utilizando a coluna Zorbax 300SB com gradiente de eluição linear 2-90% de ACN.
0 10203040506070
200 mAu
minutos
0 10203040506070
200 mAu
minutos
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 97
Buscou-se na literatura outros gradientes de eluição que realizassem a
separação de atrazina e derivados. Para esta mistura de padrões proposta em
nosso trabalho nenhum artigo de separação por CLAE foi encontrado.
Encontrou-se um trabalho que realizava a separação de DIA, DEA,HA, e
atrazina utilizando uma coluna C8 e como fase móvel ACN/H
2
O (pH 7), neste
trabalho os autores utilizaram um gradiente de eluição iniciando com 85% de
tampão
2
. Em virtude deste trabalho, resolveu-se iniciar a separação com 90% de
tampão na fase móvel. Não foi obtido nenhum resultado satisfatório. A partir daí foi-
se aumentando a porcentagem inicial de tampão até que chegasse a 100% de
tampão na fase móvel como proporção inicial. Um gradiente linear foi testado de
100% a 30% de tampão em 60 minutos com 10 minutos de estabilização a fase
móvel inicial, totalizando em uma corrida de 70 minutos. Este gradiente não
apresentou uma boa separação, porém pode-se observar alguns picos. Outros
testes com fase móvel segmentada foram testadas até que se chegasse ao
gradiente de eluição que separasse todas as triazinas. A tabela 5.1 apresenta o
gradiente de eluição utilizado na separação.
Tabela 5.1 - Gradiente de eluição para separação de atrazina e derivados com a coluna shimpack,
volume de injeção de 20 µL, fluxo de 1 mL/min e detecção a 221 nm.
A figura 5.4 apresenta a separação de atrazina e derivados através do
método gradiente descrito na tabela 5.1.
Tempo (minutos) Acetonitrila (%) Tampão fosfato de sódio (%)
0 - 15
0 - 10 100 - 90
15 - 45
10 - 70 90 - 30
45 - 60
70 - 0 30 - 100
60 - 70
0 100
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 98
Figura 5.4 - Cromatograma de uma mistura de padrões de atrazina e derivados utilizando a coluna
Shimpack, volume de injeção de 20 µL, fluxo de 1 mL/min, detecção a 221 nm com as condições de
eluição da tabela 5.1. Onde 1- DIHA; 2-DEDIA; 3-DEHA; 4-DIA; 5-HA; 6-DEA e 7-atrazina na
concentração de 30 mg/L cada analito.
Estudos demonstram que o uso de tampão não influencia na ordem de
eluição, pois os compostos só estarão protonados em pH < 1,5, porém proporciona
uma melhora na simetria dos picos. A ordem de eluição está diretamente
relacionada à polaridade dos compostos. No início da separação os compostos mais
polares eluem com maior facilidade, devido ao fato de se iniciar a análise com uma
alta proporção do solvente mais polar. Conforme a polaridade é diminuida com o
aumento da proporção de ACN, os outros compostos são eluídos.
O efeito indutivo –I mais forte do íon OH
-
na posição 2 que o íon Cl
-
, gera um
aumento na densidade de carga no anel da triazina, em particular no átomo N das
posições 1 e 3, fazendo com que a espécie fique mais polar e com menor afinidade
pela fase estacionária. Porém os radicais C
2
H
5
e C
3
H
5
possuem efeito indutivo +I ,
doando carga para estabilizar o anel. Portanto a ordem de eluição não pode ser
m
e:
10 15 20 25 30 35 40 45
50 mAu
1
minutos
2
3
4
5
6
7
m
e:
10 15 20 25 30 35 40 45
50 mAu
1
minutos
2
3
4
5
6
7
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 99
explicada somente pelo substituinte do anel na posição 2 mas sim por todos os
radicais existentes.
5.3.3 Extração em fase sólida
Como os compostos possuem polaridades e características muito diferentes,
procurou-se na literatura um modo de extraí-los de um meio aquoso sem precisar
passar por várias etapas. Neste contexto, avaliou-se a extração em fase sólida
utilizando o cartucho Oasis MCX, que foi descrito pelo fabricante como excelente
cartucho para a extração e recuperação dos analitos propostos.
Este cartucho possui dois mecanismos de retenção, o primeiro por troca
iônica, ou seja, retendo compostos ionizados e o segundo por adsorção, já que
possui uma fase reversa (C18) que atrai compostos menos polares.
As etapas de condicionamento e eluição do cartucho estão descritas no
esquema da figura 5.5. Antes de iniciar a etapa de extração, a amostra foi
acidificada com ácido clorídrico (pH~1,5). Como pode ser observado, inicialmente
condiciona-se o cartucho com acetonitrila e água, posteriormente passa-se a
amostra pelo cartucho. Condiciona-se com ácido e posteriormente com acetonitrila
este eluato é chamado de solvente de condicionamento. Para a eluição, passa-se
acetonitrila com 4% (v/v%) de hidróxido de amônio, este eluato é chamado de
solvente de extração.
Por este cartucho ser de troca iônica, é necessário a adição de HCl após a
adição da amostra para ativar os sítios que por ventura não estejam ligados a
nenhum dos analitos. Já a segunda adição de ACN é para a retirada de qualquer
resíduo da amostra que tem ficado adsorvido no cartucho e evitar uma interferência
na análise por CLAE.
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 100
1- Acetonitrila
2- Água ultra pura
3- Amostra
4- HCl 0,1 mol/L
5- Acetonitrila
ELUIÇÃO
Acetonitrila (4% NH
4
OH)
CONDICIONAMENTO
Figura 5.5 - Procedimento de extração em fase sólida utilizando o cartucho Oasis MCX.
O procedimento de extração foi realizado conforme descrito pelo fabricante do
cartucho. A única modificação implementada foi a troca do solvente orgânico de
metanol para acetonitrila. Essa modificação foi realizada em virtude de se utilizar
acetonitrila como solvente dos padrões.
Foi observado que quando as triazinas foram extraídas juntas, os padrões
hidroxilados (DIHA, DEHA, HA) eram retidos completamente enquanto os outros
padrões não possuíam este mesmo perfil. Isto provavelmente ocorre devido ao fato
de ter sido adicionado a amostra antes de ser introduzida no cartucho, ácido
clorídrico suficiente para diminuir o pH tornando o meio. Como os compostos que
não são hidroxilados possuem um pKa muito baixo, eles podem não estar totalmente
protonados e portanto sofrem apenas a ação de adsorção e não de troca iônica no
cartucho de extração. Portanto ao extrair todos os compostos juntos, foi necessário
que todos estivessem em concentrações muito baixas, para que fossem retidos
completamente.
Quando as triazinas foram extraídas separadamente a concentração de
extração era maior.
A recuperação dos analitos foi calculada com valores de concentração dos
analitos do terceiro ponto da curva analítica após serem passados pelo cartucho de
extração. Como pode ser observado na figura 5.6 o cartucho de extração permite o
cálculo de recuperação para cinco compostos, já que os dois primeiros picos
coeluem e não é possível calcular a recuperação.
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 101
O cromatograma da figura 5.6 apresenta o perfil de eluição dos compostos no
solvente de extração, ou seja, no eluato e no solvente de condicionamento, todos
solventes utilizados para condicionar o cartucho (ACN, H
2
O, HCl, amostra). Como
pode ser observado, ocorre a passagem de padrão de atrazina pelo cartucho
quando a extração é realizada com uma mistura de todos os padrões em uma
concentração elevada.
Figura 5.6 - Cromatograma de uma mistura de atrazina e derivados com os solventes de
condicionamento e o solvente de eluição com os padrões.
Este resultado demonstra que a etapa de extração é uma das mais
importantes, já que as quantidades encontradas nas amostras não são elevadas.
5.3.4 Avaliação da separação cromatográfica
Assim como no capítulo 4, para avaliar a separação cromatográfica, alguns
parâmetros, como tempo de retenção ajustado (t’
R
), fator de retenção (k), resolução
10 15 20 25 30 35 40
condicionamento do cartucho padrões após a extração
10 mAu
minutos
10 15 20 25 30 35 40
condicionamento do cartucho padrões após a extração
10 mAu
minutos
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 102
(R) e retenção relativa (α) foram empregados. Eles foram calculados a partir de
valores extraídos dos cromatogramas.
A tabela 5.2 apresenta os valores de t
R
, k’, R e α para a separação da mistura
de atrazina e derivados no terceiro ponto da curva analítica, utilizando as condições
cromatográficas da tabela 5.1 com a coluna Shimpack C18, com um fluxo de 1
mL/min.
Tabela 5.2- Parâmetros cromatográficos obtidos para a separação de atrazina e derivados utilizando
a coluna shimpack C18 (250 x 4,6 mm, 4,6 µm ), com fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 20 µL,
detecção de 221 nm, e condições de eluição da tabela 5.1.
Triazina t’
R
K’ R α N/m
DIHA
1
11,22 3,56 0,67 (R
1,2
) 1,06 (α
1,2
) 1,1 x 10
5
DEDIA
2
11,90 3,78 3,75 (R
2,3
) 1,32 (α
2,3
) 2,6 x 10
5
DEHA
3
15,68 4,98 9,05 (R
3,4
) 1,54 (α
3,4
) 1,2 x 10
5
DIA
4
24,10 7,65 4,25 (R
4,5
) 1,13 (α
4,5
) 9,8 x 10
5
HA
5
27,20 8,63 1,53 (R
5,6
) 1,04 (α
5,6
) 7,0 x 10
5
DEA
6
28,25 8,97 11,49 (R
6,7
) 1,34 (α
6,7
) 5,5 x 10
5
A
7
37,73 11,98 2,6 x 10
5
t
M
= 3,150 min.
N/m= números de patros teóricos por metro.
Os valores encontrados para avaliar a eficiência da separação cromatográfica
foram satisfatórios, uma vez que estão quase todos em concordância com os
valores encontrados na literatura como valores ideais.
Os valores dos fatores de retenção obtidos encontram-se na faixa de 1 < k’<
20, os compostos não foram fracamente retidos ou demasiamente retidos na coluna.
Para retenção relativa apenas um composto não se encontra dentro do valor
desejado para uma excelente separação, o composto HA possui o valor de 1,04.
A resolução dos compostos foi calculada, e pode-se observar que apenas os
dois primeiros compostos eluídos não estão bem separados, pois possuem um valor
de resolução de 0,67, já os compostos HA e DEA que possuíram um valor abaixo do
esperado para α, possui um valor de 1,53 na resolução.
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 103
5.3.5 Avaliação da metodologia
5.3.5.1 Curva analítica
A figura 5.7 apresenta as curvas analíticas e os modelos ajustados de cada
composto. Como pode ser observado, nem todos os modelos apresentados são
lineares.
Como pode ser observado para dois compostos (DIHA e DEDIA) os modelos
não são lineares e sim quadráticos. Os gráficos de resíduos demonstram que todos
os compostos apresentam homocedasticidade, ou seja, apresentam uma
distribuição aleatória e não tendenciosa dos valores dos resíduos, que são a
diferença entre os valores encontrados e os valores calculados (pelo modelo) de
concentração de cada analito.
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 104
y = 273502x + 14455
R
2
= 0,99
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
11,5 22,5 3
y = 211850x - 38462
R
2
= 0,9974
0
10
20
30
40
50
60
4 9 14 19 24 29
y = 168386x + 7465,9
R
2
= 0,9919
0
1
2
3
4
5
6
11,522,53
y = 160385x + 12249
R
2
= 0,9927
0
1
2
3
4
5
11,522,53
y = 2026,9x
2
+ 56348x + 50872
R
2
= 0,9963
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
0 5 10 15
y = 1628,1x
2
+ 93059x + 14953
R
2
= 0,9959
0
5
10
15
20
0 5 10 15 20
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mAu
mAu
mAu
mAu
mAu
y = 103798x - 38278
R
2
= 0,9936
0
4
8
12
16
20
0 5 10 15 20
mg/L
mAu
mAu
y = 273502x + 14455
R
2
= 0,99
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
11,5 22,5 3
y = 211850x - 38462
R
2
= 0,9974
0
10
20
30
40
50
60
4 9 14 19 24 29
y = 168386x + 7465,9
R
2
= 0,9919
0
1
2
3
4
5
6
11,522,53
y = 160385x + 12249
R
2
= 0,9927
0
1
2
3
4
5
11,522,53
y = 2026,9x
2
+ 56348x + 50872
R
2
= 0,9963
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
0 5 10 15
y = 1628,1x
2
+ 93059x + 14953
R
2
= 0,9959
0
5
10
15
20
0 5 10 15 20
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mAu
mAu
mAu
mAu
mAu
y = 103798x - 38278
R
2
= 0,9936
0
4
8
12
16
20
0 5 10 15 20
mg/L
mAu
y = 103798x - 38278
R
2
= 0,9936
0
4
8
12
16
20
0 5 10 15 20
mg/L
mAu
mAu
Figura 5.7 - Curvas analíticas de padrões de atrazina e seus produtos de degradação sem extração utilizando a coluna Shimpack, volume de injeção
de 20 µL, fluxo de 1 mL/min, detecção a 221 nm com as condições de eluição da tabela 5.1
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 105
O teste F para os compostos com modelos lineares, portanto dois graus de
liberdade, apresentam como F
tabelado 3,9
= 3,86, já para os compostos que
apresentam modelos quadráticos o valor de F
tabelado 2,9
=4,26 . Os valores de F
calculado
para cada composto está descrito na tabela 5.3.
Tabela 5.3- Valores de F para as curvas analíticas de atrazina e derivados.
Composto F
calculado
F
tabelado
DEDIA
1,94 3,86
DIA
2,14 3,86
HA
0,55 3,86
DEA
1,31 3,86
A
0,65 3,86
DIHA
1,00 4,26
DEHA
0,91 4,26
Os valores de F estão todos abaixo dos valores tabelados, portanto não há
evidências de falta de ajuste para nenhum dos modelos descritos no intervalo de
confiança de 95%.
Nenhum dos modelos apresentam R² >0,999, porém os gráficos de resíduos e
o teste F para falta de ajuste através de análise de variância comprovam que os
modelos ajustados descrevem bem a curva analítica.
5.3.5.2 Limite de detecção (LOD) e Limite de quantificação (LOQ)
O cálculo do limite de detecção e limite de quantificação foi realizado de
acordo com as equações descritas no capítulo 4 ítem 4.3.4.2.
A tabela 5.4 apresenta os valores de LOD e LOQ calculados para a atrazina e
seus produtos de degradação.
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 106
Tabela 5.4 – Valores calculados para LOD e LOQ dos padrões de atrazina e derivados.
Triazinas LOD (µg/L) LOQ (µg/L)
DIHA
287 956
DEDIA
270 901
DEHA
274 914
DIA
85 283
HA
44 146
DEA
89 298
A
86 285
Os valores calculados para os limites de detecção e quantificação são
elevados tendo em vistas que as amostras que contem este herbicidas são amostras
ambientais. Para a atrazina o valor máximo permite para água doce é 2 µg/L, ou
seja, 43 vezes menor que o limite de detecção encontrado. Para que seja possível
uma análise de uma amostra real, seria necessária uma etapa de pré-concentração.
5.3.5.3 Recuperação
Pelos cromatogramas obtidos após a extração, não é possível observar os
dois primeiros picos (DIHA e DEDIA), o terceiro pico apresenta-se alargado. A tabela
5.5 apresenta os valores obtidos para recuperação.
Tabela 5.5 – Valores calculados de recuperação após a extração da atrazina e derivados com
cartucho Oasis MCX.
Triazina Recuperação (%)
DIHA
-
DEDIA
-
DEHA
-
DIA
91
HA
99
DEA
90
A
82
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 107
Os valores obtidos coincidem com o observado na figura 5.6. Os três
primeiros picos não apresentam um perfil desejado, não sendo possível portanto
calcular a recuperação . Os outros compostos apresentam recuperação dentro do
limite para recuperação de amostras ambientais segundo a norma EC/2002/657
3
que varia de 80 a 110%.
5.4 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste capítulo mostraram que foi possível desenvolver
um método eficiente utilizando cromatografia líquida de rápida eficiência em fase
reversa para análise simultânea de atrazina e DEA, DIA, HA, DEDIA, DEHA e DIHA.
As condições cromatográficas foram baseadas em estudos encontrados na
literatura, e as melhores condições determinadas no presente estudo foi uma fase
móvel contendo ACN/Tampão fosfato pH 7,2 5 mmol/L. Foi utilizado um gradiente
segmentado devido a diferença de polaridade dos compostos. A separação
cromatográfica foi avaliada através da análise dos parâmetros cromatográficos k’, α
e R.
A extração foi realizada com um cartucho de modo misto, pois possui dois
modos de retenção o que permite a extração de todos os compostos. Apesar de
todos os compostos serem extraídos nem todos os compostos podem ser
quantificados. A DIHA, DEDIA e DEHA não possuem um bom perfil de eluição após
a extração, não sendo possível calcular a recuperação.
Capítulo 5 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por CLAE. 108
REFERÊNCIAS
1. Carabias-Martinéz, R.; Rodríguez-Gonzalo, E.; Herrero –Hernandez, E.;
Sanchéz-San Román, F. J.; Flores, M. G. P.; Determination of herbicides and
metabolites by solid-phase extraction and liquid chromatography. Evaluation of
pollution due to herbicides in surface and groundwaters; Journal of
chromatography A, v. 950, p. 157-166, 2002.
2. Berg, M.; Muller, S.R.; Schwanenbach, R.P.; Simultaneous determination of
triazines including Atrazine and their major metabolites Hydroxyatrazine,
Desethylatrazine, and Deisopropylatrazine in natural waters, Anal. Chem., v. 67,
p. 1860-1865,1995.
3. Norma EC/2002/657. Disponível em: <http://eur-lex.europa.eu>. Acesso em: 03
abr. 2009.
Capítulo 6
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA
DETERMINAÇÃO DE ATRAZINA
E DERIVADOS POR EC
Capítulo 6 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por EC 110
6.1 INTRODUÇÃO
Neste capítulo foi proposto o desenvolvimento de uma nova metodologia para
separação de atrazina e derivados por eletroforese capilar. Foi utilizada a
eletroforese capilar em meio não aquoso, já que os pKas do compostos analisados
são muito baixos e próximos. Um sistema de eletrólito simples foi utilizado, com a
mistura de dois solventes orgânicos, apresentado um curto tempo de análise (~ 9
min). A relevância em se desenvolver o método é utilizá-lo como screening em
reações de degradação da atrazina, em conjunto com a análise por CLAE, tendo em
vista que esta é uma técnica que possui um longo tempo de análise.
A figura 6.1 apresenta as estruturas e os valores de pkas das triazinas
estudadas.
Figura 6.1 - Principais produtos de degradação da atrazina e seus respectivos pKa
6.2 OBJETIVO
• Desenvolver metodologia analítica por meio de eletroforese capilar para a
determinação de atrazina e derivados.
N
N
N
Cl
N
H
N
H
ATRAZINA
pKa 1,68
N
N
N
Cl
NH
2
N
H
N
N
N
N
H
NH
2
Cl
N
N
N
OH
NH
2
N
H
N
N
N
Cl
NH
2
NH
2
N
N
N
OH
N
H
NH
2
N
N
N
OH
N
H
N
H
DEA
p
Ka 1
,
3
HA
p
Ka 5
,
15
DIA
pKa 1,3
DEHA
p
Ka 4
,
75
DEDIA
p
Ka 1
,
5
DIHA
p
Ka 4
,
65
Capítulo 6 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por EC 111
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.3.1 Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e
derivados por EC
O fato dos compostos possuírem valores de pKa muito baixos, foram
decisivos na escolha do eletrólito de corrida. Na literatura foram encontrados alguns
trabalhos que realizavam a separação de atrazina e alguns derivados por MEKC
1-6
.
Nestes trabalhos, não era realizada a separação dos compostos propostos em
nosso trabalho. Um trabalho encontrado descrevia o uso de NACE na separação de
compostos com baixo pKa
7
. Resolveu-se então testar o tampão Tris-HCl, que é um
tampão simples e muito utilizado em eletroforese capilar, pois possui um pH ~ 8 em
uma mistura de solventes orgânicos na separação. Neste artigo, os autores
discutem que há mudança nas características ácido-base dos compostos, formando
espécies protonadas que são suscetíveis a migração quando submetidas a um
campo elétrico.
Os solventes orgânicos utilizados na separação foram MeOH e ACN, já que
os compostos são solúveis nestes dois solventes. A tabela 6.1 apresenta as
proporções dos solventes utilizadas para a solubilização do tampão Tris-HCl na
separação de atrazina e derivados por EC.
Tabela 6.1- Porcentagem de solvente orgânico utilizado em cada experimento.
O primeiro experimento apresentado não foi realizado, pois a ACN não
solubilizou o tampão Tris-HCl. Em todos os outros experimentos solubilizou-se
primeiro o tampão em MeOH e posteriormente adicionou-se a ACN.
Experimento Acetonitrila (%) Metanol (%)
1
100 0
2
75 25
3
50 50
4
25 75
5
0 100
Capítulo 6 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por EC 112
A figura 6.2 apresenta os eletroferogramas de uma mistura de atrazina e seus
derivados. Como pode ser observado, os experimentos 2, 4 e 5 apresentam muito
ruído na linha base.
Figura 6.2- Eletroferogramas da mistura de: atrazina e derivados. Utilizando eletrólito: 100 mmol/L
tampão Tris/HCl em ACN/MeOH (A) 0/100 (B) 25/75 e (C) 75/25 % (v/v), com comprimento total do
capilar: 48,5 cm (comprimento efetivo: 40 cm), ∅i: 75 µm, 25 °C, + 20 kV, 50mbar / 1s e detecção em
221 nm.
Os resultados para o experimento 3 (50/50 % (v/v) de ACN/MeOH) foram os
melhores resultados obtidos pois apesar da coeluição de algumas triazinas,é o que
possui o menor ruído na linha base. A figura 6.3 apresenta a separação de atrazina
e derivados com este eletrólito. Nestas condições, só é possível visualizar 5 picos,
isso ocorre devido a coeluição de três picos (HA + DEHA + DEDIA). Esta coeluição
051015
0 5 10 15
1 mAU
051015
1 mAu
1 mAU
min
min
min
A
B
C
051015
0 5 10 15
1 mAU
051015
1 mAu
1 mAU
min
min
min
A
B
C
1 mAU
051015
1 mAu
1 mAU
min
min
min
1 mAU
051015
1 mAu
1 mAU
min
min
min
A
B
C
Capítulo 6 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por EC 113
impossibilita a quantificação dos três compostos, porém permite supor a existência
de um dos três picos na análise.
Figura 6.3- Eletroferogramas da mistura de padrões: (A) HA, DIA, A e DEA; (B) DIHA, HA, DEHA,
DIA, A e DEA e (C) DIHA, HA, DEHA, DEDIA, DIA, A e DEA. Utilizando eletrólito: 100 mmol/L tampão
Tris/HCl em ACN/MeOH 50/50, comprimento total do capilar: 48,5 cm (comprimento efetivo: 40 cm),
d.i: 75 µm, 25 °C, + 20 kV, 50mbar / 1s e detecção em 221 nm.
Apesar da coeluição dos picos, a probabilidade de se encontrar em amostras
reais todos os compostos juntos é muito pequena. Os compostos geralmente
encontrados nas degradações da atrazina são os compostos DEA, DIA e HA. Para
estes compostos a metodologia desenvolvida se comporta bem, pois não há
coeluição.
HA
DIA
A
DEA
DIHA
HA+DEHA
DIA
A
DEA
6,5 7,5 8,5
DIHA
DIA
A
DEAHA+DEHA+DEDIA
4 mAU
6,5
7,0 7,5 8,0
8,5
9,0
minutos
Capítulo 6 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por EC 114
Uma grande vantagem da análise de atrazina e derivados por EC é que a
técnica permite a análise em um curto intervalo de tempo.
6.4 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste capítulo mostraram é necessário uma otimização
da metodologia desenvolvida para a análise de atrazina e derivados por EC, pois
existe a coeluição de três compostos.
Mesmo havendo coeluição a análise por EC pode ser utilizada como um
screening das reações de degradação de atrazina, para análise por CLAE, devido ao
curto de tempo de análise e ao simples eletrólito utilizado.
Capítulo 6 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de atrazina e derivados por EC 115
REFERÊNCIAS
1. Frias, S.; Sánchez, M.J.; Rodríguez, M.A.; Determination of triazine compounds
in ground water samples by micellar electrokinetic capillary chromatography.
Analytica Chimica Acta, v. 503, p. 271-278, 2004.
2. Acedo –Valenzuela, M.I.; Galeano-Díazi, T.; Díez, N.M.; Silva-Rodriguez, A.;
Determination of neutral and cationic herbicides in water by micellar electrokinetic
capillary chromatography. Analytica Chimica Acta, v. 519, p. 65-71, 2004.
3. Lin, C.E.; Liu, Y.C.; Yang, T.Y.; Wang, T.Z.; Yang, C.C.; On-line
concentration of s-triazine herbicides in micellar electrokinetic chromatography
using a cationic surfactant. Journal of Chromatography A, v. 916, p. 239-245,
2001.
4. Lin, C.E.; Hsueh, C.C.; Wang, T.Z.; Chiu, T.C.; Chen, Y.C.; Migration
behavior and separation of s-triazines in micellar electrokinetic capillary
chromatography using a cationic surfactant. Journal of Chromatography A, v.
835, p. 197-207, 1999.
5. Carabias-Martinez, R.; Rodriguez-Gonzalo, E.; Mufioz-Dominguez, A.I.;
Dominguez-Alvarez, J.; Hernández-Mendez, J.; Determination of triazine
herbicides in water by micellar electrokinetic capillary chromatography. Journal
of Chromatography A, v. 733, p. 349-360, 1996.
6. Zhang, S. H.; Yang, Y.Y.; Han, D. D.; Wang, C.; Zhou, X.; Zang, X.H.; Wnang,
Z.; Determination of triazinas hetrbicide residues in water samples by on-line
sweeping concentration in micelar electrokinetic chromatography. Chinese
Chemical Letters, v. 19, p. 1487-1490, 2008.
7. Carabias-Martinéz, R.; Rodríguez-Gonzalo, E.; Dominguez-Álvares, J.;
Hernández-Méndez, J.; Determination of Triazine herbicides in natural waters by
solidphase extraction and non-aqueous capillary zone electrophoresis. Journal
of Chromatography A, v. 869, p. 451-461, 2000.
Capítulo 7
BIODEGRADAÇÃO DA ATRAZINA
Capítulo 7 – Biodegradação da atrazina 117
7.1 INTRODUÇÃO
A degradação da atrazina pelo fungo Pleurotus ostreatus, foi avaliada através
da extração do produto de degradação formado, DEA e a análise destes compostos
por CLAE e a confirmação foi realizada mediante a utilização de CG-MS.
As enzimas HRP e lacase foram testadas na biodegradação da atrazina,
porém não foram obtidos resultados satisfatórios.
A relevância no desenvolvimento deste método de biodegradação é a
aplicação em amostras reais, como água e solo e posterior identificação e
quantificação.
7.2 OBJETIVO
• Desenvolver metodologia para degradação de atrazina utilizando enzimas ou
microrganismos.
• Utilizar metodologia desenvolvida para extração e análise por CLAE para
análise das reações de degradação da atrazina.
Capítulo 7 – Biodegradação da atrazina 118
7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
7.3.1 Reações de degradação da atrazina com a enzima HRP
Vários meios reacionais foram testados para a degradação da atrazina com a
enzima HRP, porém nenhum experimento apresentou resultados satisfatórios.
A atividade enzimática de HRP foi determinada sempre antes de cada
experimento e foi determinada através da reação de oxidação do 2,4 DCP na
presença da 4AAP que resulta na formação do composto corado
antipirilquinonimina. As reações foram realizadas em condições de velocidade inicial
e acompanhadas a 510 nm por 90 segundos. A concentração do produto
antipirilquinonimina foi calculada através do seu coeficiente de extinção molar a 510
nm ε = 18.500 M- 1cm
-1
. Uma unidade de atividade enzimática correspondeu a
formação de 1µmol do produto por minuto. A concentração da enzima foi expressa
em U/mL. As soluções de 2,4 DCP, 4-AAP, peróxido de hidrogênio e tampão fosfato
0,1 mol/L pH 7,0 foram preparadas de acordo com a metodologia descrita por
Ferreira-Leitão
1
.
Foi encontrado na literatura um trabalho de 1991, no qual os autores, após
adição de cloreto no meio reacional, mostram a degradação do herbicida atrazina
com a enzima HRP
2
. Esta metodologia utilizou extração líquido-líquido e
cromatografia em camada delgada como técnica analítica de separação. De acordo
com os autores, um produto mais polar dealquilado foi formado durante o processo
de degradação. Eles afirmam que sem a adição de um haleto a degradação não
ocorre.
Buscando-se resultados similares, foi realizado um experimento, no qual as
condições reacionais descritas no trabalho acima foram reproduzidas. No entanto,
utilizou-se 0,2 mmol/L de atrazina (solubilizada em metanol e em acetonitrila) e 10
U/mL de HRP, uma vez que a atividade da enzima e o solvente utilizado para
solubilizar o padrão não foram descritos.
Os resultados obtidos após o tempo descrito pelos autores foram
insatisfatórios, visto que não foi observado nenhum produto por cromatografia em
camada delgada e nem por meio de cromatografia líquida de alta eficiência. Tempos
Capítulo 7 – Biodegradação da atrazina 119
maiores de reação, em condições similares às anteriores, também foram testados
sem sucesso.
Como não foram obtidos resultados satisfatórios, resolveu-se testar então as
reações com a enzima lacase.
7.3.2 Reações de degradação da atrazina com a enzima lacase
A atividade enzimática de lacase foi medida sempre antes de cada
experimento e foi determinada através da reação de oxidação do ABTS, que resulta
na formação de um composto esverdeado. As reações foram realizadas em
condições de velocidade inicial e acompanhadas a 420 nm por 90 segundos. A
concentração do produto foi calculada através do seu coeficiente de extinção molar
a 420 nm ε = 18.000 M- 1cm
-1
. Uma unidade de atividade enzimática correspondeu a
formação de 1µmol do produto por minuto. A concentração da enzima foi expressa
em U/mL.
Como não foi obtido nenhum resultado satisfatório na degradação de atrazina
com a HRP, utilizou-se então a enzima lacase.
Novamente nenhum resultado satisfatório foi obtido, pois nenhum produto de
degradação da atrazina foi identificado.
7.3.3 Degradação da atrazina pelo fungo Pleurotus ostreatus
Alguns trabalhos apresentados na literatura descrevem a degradação da
atrazina por fungos da podridão branca
2
. Dentre estes fungos os mais utilizados são:
Phanerochaete chrysosporium e Pleurotus pulmonaris
3,4,5
.
Em 1994, pesquisadores descreveram a degradação de atrazina por
Phanerochaete chrysosporium, a qual produziu quatro metabólitos identificados
como HA, DEA, DIA e DEHA. Esta degradação foi realizada por fermentação
submersa de modo estático em um período de 16 dias. A caracterização das
Capítulo 7 – Biodegradação da atrazina 120
enzimas que participaram do processo de degradação, no entanto, não foi realizada
6
.
Já na degradação da atrazina com o fungo Pleurotus pulmonaris por
fermentação submersa sob agitação, não só os metabólitos foram identificados
(DEA, DIA, DEDIA e desetildeisopropilhidroxiatrazina), como a caracterização das
enzimas que participaram deste processo foi realizada. Esta caracterização foi
possível graças à adição de manganês no meio de cultura, o qual favoreceu a
transformação de atrazina, além de ser responsável pelo aumento da atividade das
oxidases e das peroxidases
7,8
.
Em um outro trabalho, pesquisadores estudaram a degradação de atrazina
pelo fungo Pleurotus ostreatus por fermentação submersa de modo estático. Eles
avaliaram a porcentagem remanescente de atrazina no meio reacional após 42 dias
de incubação. Entretanto, o metabólito formado não foi identificado nem a
caracterização da enzima responsável pela degradação descrita
3
.
Em nosso trabalho, no qual a degradação da atrazina foi realizada com o
Pleurotus ostreatus por cultivo de modo estático, a ação do fungo foi observada a
partir do quinto dia de cultivo, pois o meio encontrava-se esbranquiçado devido à
presença do micélio.
Na capela de fluxo laminar foi realizado o procedimento de extração e
posteriormente o extrato (no próprio solvente de eluição (ACN ( 4% NH
4
OH) foi
analisado no cromatógrafo líquido com a metodologia descrita na capítulo 5. O
extrato do cultivo após 5 dias de reação apresentou um pico no mesmo tempo de
retenção do metabólito desetilatrazina. Nos dois controles realizados não houve a
presença deste pico.
Após 10 dias de cultivo, o mesmo procedimento para análise por CLAE foi
realizado. Foi obtido o mesmo perfil de eluição para a reação com cinco dias, porém
foi observado um aumento na área referente a desestilatrazina, formada pela reação
de degradação.
Comportamento semelhante foi obtido após 15 dias de reação, indicando a
formação gradativa deste derivado.
A figura 7.1 apresenta o perfil de eluição da atrazina e do composto formado
após a degradação em 5, 10 e 15 dias com seus respectivos controles. No extrato
obtido no 15° dia, foi adicionado, padrão de desetilatrazina, e como pode ser
observado na figura há um aumento na área do pico formado após a degradação,
Capítulo 7 – Biodegradação da atrazina 121
indicando a presença de desetilatrazina. Apesar de não ter sido feita a quantificação
do produto formado, foi possível observar o aumento na área do pico do mesmo ao
longo do tempo.
Figura 7.1 - Cromatogramas com a degradação da atrazina e formação de DEA. As condições da
análise estão na tabela 5.1, foi utilizada a coluna Shimpack C18, um volume de injeção de 20 µL e
detecção em 221 nm. (A) 5 dias de incubação, (B) 10 dias de incubação e (C) 15 dias de incubação.
B
1500 1700 1900 2100 2300 2500
2 mAu
DEA
segundos
2 mAu
DEA
25 30 35 40 45
4 mAu
DEA
minutos
1500 1700 1900 2100 2300 2500
2 mAu
DEA
segundos
1500 1700 1900 2100 2300 2500
2 mAu
DEA
segundos
2 mAu
DEA
25 30 35 40 45
4 mAu
25 30 35 40 45
4 mAu
DEA
minutos
A
C
Reação atrazina com adição de padrão de DEA
Reação atrazina
Controle sem atrazina
controle sem fungo
segundo
Reação atrazina com adição de padrão de DEA
Reação atrazina
Controle sem atrazina
controle sem fungo
segundo
Reação atrazina com adição de padrão de DEA
Reação atrazina
Controle sem atrazina
controle sem fungo
Reação atrazina com adição de padrão de DEA
Reação atrazina
Controle sem atrazina
controle sem fungo
Reação atrazina com adição de padrão de DEA
Reação atrazina
Controle sem atrazina
controle sem fungo
segundo
Capítulo 7 – Biodegradação da atrazina 122
A figura 7.2 apresenta o crescimento do fungo no meio contendo atrazina.
Como pode ser observado o crescimento do fungo se dá na superfície. Portanto
quanto maior a superfície de contato entre atrazina e o fungo maior será a
degradação.
Figura 7.2 - Foto do cultivo realizado após cinco dias de incubação.
Para confirmar que o metabólito gerado após as reações com o fungo foi a
desetilatrazina, fez-se a análise do extrato por CG-MS.
7.4 ANÁLISE DO EXTRATO DE DEGRADAÇÃO DA ATRAZINA POR CG-MS
A análise do extrato obtido foi realizada no Laboratório de Química Analítica e
Metrologia Química, na Divisão de Química Analítica do Instituto Nacional de
Tecnologia.
Os resultados obtidos por CG-MS comprovam que há a formação de um pico
no mesmo tempo de retenção do padrão, e pode-se dizer que esta resposta
Capítulo 7 – Biodegradação da atrazina 123
corresponde a DEA, pois os fragmentos principais formados são os mesmos no
espectrômetro de massas. Isto também pode ser comprovado, pois na literatura
foram encontrados trabalhos que descrevem que o íon molecular da desestilatrazina
é 172 m/z
9,10
.
7.5 ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA REAÇÃO DE DEGRADAÇÃO DA ATRAZINA
COM PLEUROTUS OSTREATUS.
É bem descrito na literatura que o fungo Pleurotus ostreatus produz enzimas
como lacase e manganês peroxidase, mas não possui atividade para lignina
peroxidase
11
.
Por isso, embora testes prévios tenham demonstrado que a enzima lacase
comercial não degrada atrazina nas condições estudadas, experimentos para a
atividade desta enzima no meio reacional (fungo, solução nutritiva e atrazina) e no
controle (fungo e solução nutritiva) foram realizados.
Os resultados da atividade nos dois meios foram equivalentes, ou seja, muito
próximos. Isto indica que a atividade da lacase não diminui com a presença de
atrazina no meio.
7.6 CONCLUSÃO
Portanto, pode-se concluir que a utilização do fungo Pleurotus ostreatus na
degradação da atrazina mostrou-se bastante interessante, visto que ocorre a
formação de um de seus metabólitos principais.
Embora não se saiba se uma única enzima ou um complexo enzimático são
os responsáveis pela degradação da atrazina, sabe-se que a lacase comercial
proveniente do fungo Aspergilus orizae não é a capaz de degradar a atrazina. Os
métodos de extração e cromatografia líquida se mostraram bastante confiáveis, visto
a extensa complexidade da matriz.
Capítulo 7 – Biodegradação da atrazina 124
Embora os testes realizados tenham sido qualitativos, pode-se perceber que
com apenas 15 dias de reação já houve a formação de quantidades significativas do
metabólito uma vez que a detecção por espectrometria de massas não é tão
sensível.
A análise das reações por CG-MS confirmou a presença do metabólito DEA.
Capítulo 7 – Biodegradação da atrazina 125
REFERÊNCIAS
1. Ferreira-Leitão, V. S.; Oxidação de corantes fenotiazínicos por peroxidases
de Armoracia rusticana e de Phanerochaete chrysosporium. 2003. Tese
(Doutorado em Ciências – Bioquímica). Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Química.
2. Stiborova, M.; Nachazelova, I.; Anzenbacher, P; Metabolism of xenobiotics in
plants Horseradish peroxidase catalyses N-dealkylation of the S-triazine
herbicide, atrazine;Biologia, v. 46, p. 331-336, 1991.
3. Bending, G. D.; Friloux, M., Walker, A.; Degradation of contrasting pesticides by
white rot fungi and its relationship with ligninolytic potential; FEMS Microbiology
Letters, v. 212, p. 59-63, 2002.
4. Mandenbaum, R.; Sadowsky, M. J.; Wackett, L. P.; Microbial degradation of
s-triazine herbicides, Triazine Herbicides, Ed. Elsevier, Cap. 22, p. 301-328,
2008.
5. Pointing, S. B.; Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Appl. Microbiol.
Biotechnol, v. 57, p. 20-33, 2001.
6. Mougin, C.; Laugero, C.; Asther M.; dubroca, J.; Frasse, P.; Asther, M.;
Biotransformation of the herbicide atrazine by white rot fungus PHanerochaete
chrysosporium. Applied and environmental microbiology, v. 60, n. 2, p. 705-
708, 1994.
7. Masaphy, .; Levanon, D.; Vaya, J.; Henis, Y; Isolation and characterization of
novel atrazina metabolite produced by the fungus Pleurotus pulmonaris, 2-Chloro-
4-ethylamino-6-(1-hydroxyisopropil)amino-1,3,5-triazine. Applied and
environmental microbiology, v. 59, n. 12, p. 4342-4346, 1993.
8. Masaphy.; Levanon, D.; Henis, Y; Manganese-enhanced biotransformation of
atrazina by the white rot fungus Pleurotus pulmonaris and its correlation with
oxidation activity. Applied and environmental microbiology, v. 62, n. 10,
p.3587-3593, 1996.
9. Bruzzoniti, M. C.; Sarzanini, C.; Constantino, G.; Fungi, M.; Determination of
herbicides by Solid phase extraction gás chromatography-mass spectrometry in
drinking Waters. Analytica chimica acta, v. 578, p. 241-249, 2006.
10. Balduini, L.; Matoga, M.; Cavalli, E.; Seilles, E.; Riethmuller, D.; Thomassim,
M.; Guillaume, Y. C.; Triazinic herbicide determination by gás chromatography-
mass spectrometry in breast Milk. Journal of Chromatography B, v. 794, p. 389-
395, 2003.
11. T.; Honda, Y; Ha, H. ; Watanabe, T.; Kuwahara, M.; Isolation of cDNA and
genomic fragments encoding the major manganese peroxidase isozyme from the
white rot basidiomicete Pleurotus ostreatus. J. Wood Sci, v. 46, p. 230-233,
2000.
Capítulo 8
CONSIDERAÇÕES FINAIS
E TRABALHOS FUTUROS
Capítulo 8 – Considerações finais e trabalhos futuros 127
8.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste trabalho foi inicialmente desenvolvida uma metodologia por CLAE para
a determinação de atrazina, simazina e propazina em reações de degradação
enzimática. Três metodologias de extração foram testadas e a que apresentou
melhores resultados foi a extração líquido-líquido. A fase móvel otimizada consistiu
de ACN/H
2
O 30/70 (v/v%) de modo isocrático e tempo de análise é de 25 minutos.
Esta metodologia não se mostrou eficaz para a separação de atrazina e
derivados, portanto uma nova metodologia foi desenvolvida. Esta nova metodologia
consistiu de uma coluna C18 e uma fase móvel (ACN/Tampão fosfato) com eluição
por gradiente. O tempo de análise é elevado (70 minutos), porém uma completa
separação dos compostos é realizada. A metodologia desenvolvida é promissora
para a análise de atrazina e seus produtos de degradação em ensaios de
biodegradação.
Foi utilizada extração em fase sólida com um cartucho de extração Oasis
MCX, que apresentou recuperação acima de 80% para quatro analitos.
Uma metodologia por EC foi desenvolvida para análise de atrazina e
derivados. Os resultados preliminares obtidos mostram a coeluição de três
compostos e a separação dos outros quatro compostos em um curto tempo de
análise (9 minutos).
As duas metodologias desenvolvidas para análise de atrazina e derivados
podem ser utilizadas de forma complementar. A metodologia desenvolvida por EC
pode ser utilizada como um screening, pois pode indicar quais os possíveis
compostos podem estar sendo formados em um curto intervalo de tempo, além de
não utilizar grandes quantidades de solventes. Já a metodologia desenvolvida por
CLAE pode ser aplicada na identificação parcial e quantificação dos compostos
formados.
A degradação de atrazina pelo fungo Pleurotus ostreatus foi realizada,
apresentando como produto principal de degradação o composto DEA. Sendo o
produto detectado por CLAE e confirmado por CG-MS. Não foi realizado nenhum
estudo quantitativo de degradação.
Capítulo 8 – Considerações finais e trabalhos futuros 128
8.2 TRABALHOS FUTUROS
9 Otimização da metodologia desenvolvida por HPLC para determinação de
atrazina e derivados.
9 Otimização da extração em fase sólida para determinação por HPLC para
atrazina e derivados.
9 Otimização da metodologia desenvolvida por CE para análise de atrazina e
derivados.
9 Otimização das condições de cultivo para degradação da atrazina pelo fungo
Pleurotus ostreatus.
9 Determinação da atividade das enzimas (lacase, manganês peroxidase) nos
cultivos do fungo Pleurotus ostreatus na presença de atrazina.
Anexo A
Curriculum vitae
130
CURRICULUM VITAE
MANOELA RUCHIGA BALESTEROS
Solteira, brasileira, 27 anos
E-mail: [email protected]
Formação Acadêmica
Mestrado em Química pela Universidade Federal de Juiz de Fora. (03/2007-
04/2009) – Desenvolvimento e otimização de metodologia para análise de atrazina e
seus produtos de degradação por cromatografia líquida de alta eficiência e
eletroforese capilar.
Graduação em Bacharelado e Licenciatura em Química pela Universidade Federal
de Juiz de Fora. (2001-2006)
Experiência profissional
Bolsa de Desenvolvimento Tecnológico Industrial (DTI/CNPq) na Divisão de Meio
Ambiente do Instituto Nacional de Tecnologia. (2006 – Dias atuais)
Título do Projeto: Degradação enzimática de resíduos de herbicidas.
Iniciação Científica em Química Analítica.(2004 – 2005)
Título do projeto :Determinação de ácidos graxos livres em azeite de oliva por
eletroforese capilar.
131
Formação complementar
Cursos
9 Cromatografia Líquida com detecção UV, Fluorescência e MS. Fundamentos
e aplicações na indústria e análise ambiental. Instituto nacional de
Tecnologia, 4 h (2009).
9 Fluorescência e Difratometria de Raio-X. Fundamentos e aplicações na
aplicações na caracterização de materiais. Instituto Nacional de Tecnologia,
4h, (2009).
9 Segurança no Laboratório. Instituto Nacional de Tecnologia, 4h (2009).
9 Sistema de preparação de amostras com tecnologia de microondas.
Fundamentos e aplicações. Instituto Nacional de Tecnologia, 4h (2009).
9 Cromatografia de íons. Fundamentos, características e aplicações. Instituto
Nacional de Tecnologia, 4h (2009).
9 Avaliação do desenvolvimento científico e tecnológico do etanol combustível.
Instituto Nacional de Tecnologia, 2h (2009).
9 Treinamento de segurança aplicável a laboratório. Instituto Nacional de
Tecnologia, 16h (2008).
9 Microalga para a produção de biocombustíveis. Instituto Nacional de
Tecnologia, 2h (2008).
9 Avaliação de risco da exposição humana ao pesticida na dieta. Associação
Grupo de Analistas de Resíduos de Pesticidas,16h (2008).
132
9 Biodiesel: desafios atuais da produção e uso. Instituto Nacional de
Tecnologia,2h (2008).
9 Seminário de monitoramento de poluentes orgânicos persistentes (POP’s) no
Brasil. Instituto Nacional de Tecnologia,16h (2008).
9 Avaliação de toxicidade em efluentes, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, 4h (2007).
9 Impacto de Poluentes e Contaminantes Orgânicos no Meio Ambiente e na
Saúde e Metodologias Analíticas de Identificação e Quantificação, Instituto
Nacional de Tecnologia, 80h (2007).
9 Nanotecnologia no combate a turbeculose. Instituto Nacional de Tecnologia
,2h (2007).
9 Impactos de desenvolvimento sobre o meio ambiente e a saúde. Instituto
Nacional de Tecnologia, 2h (2007).
9 Introdução à cromatografia gasosa, Instituto Nacional de Tecnologia, 12h
(2007).
9 Estatística para laboratórios e ensaio de calibração. Rede de tecnologia do
Rio de Janeiro, 24h (2007).
9 I Seminário - Aplicações analíticas para o segmento ambiental. PerkinElmer
16h (2006).
9 Biocatálise no desenvolvimento de tecnologias limpas, Universidade Federal
de Juiz de Fora, 6h (2004).
133
9 Capacitação profissional em análise de macroelementos e microelementos
por espectrometria de absorção atômica e espectrometria UV/Visível,
Embrapa Gado de Leite, 4h (2003).
9 A Qualidade de medições em química analítica, Universidade Federal de Juiz
de Fora, 8h (2003)
Monitorias
9 Monitoria nas disciplinas Química analítica Qualitativa, Química analítica
Quantitativa e Química analítica II (2003/2004).
Participações em congressos
9 Avaliação da transformação enzimática de s-triazinas utilizando horseradish
peroxidase por clae. 14° Encontro Nacional de Química Analítica, João
Pesoa, PB, 2007.
9 Determinação de acidez em azeite de oliva por eletroforese capilar. 14°
Encontro Nacional de Química Analítica, João Pesoa, PB, 2007.
9 Análise Simultânea de Losartan associado a diuréticos por eletroforese
capilar. 13° Encontro Nacional de Química Analítica, Niterói, RJ, 2005.
9 Determinação de ácidos graxos livres em azeite de oliva por eletroforese
capilar. 11° Latin American Capillary Electrophoresis, Guarujá, 2005.
Idiomas
134
Inglês: leitura boa, conversação e escrita básica.(Em curso)
Espanhol: Compreensão escrita e oral básica.
Informática
Conhecimento dos aplicativos do Windows, domínio de Word, Power Point e
Internet, boa usuária de Origin e Excel.
Informações adicionais
Artigos
9 BALESTEROS, M. R. ; FARIA, A.F ; OLIVEIRA, M. A. L. . Determination of
losartan associated with chlorthalidone or hydrochlorothiazide in capsules by
capillary zone electrophoresis. Journal of the Brazilian Chemical Society, v.
18, p. 554-558, 2007.
9 BALESTEROS, M. R. ; Tavares, M. F. M. ; Polachini, F.C. ; Ribeiro, S. J. L. ;
Messaddeq, Y. ; OLIVEIRA, M. A. L. . Determination of olive oil acidity by CE.
Electrophoresis, v. 28, p. 3731-3736, 2007.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
