Download PDF
ads:
VIVI
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Ciências Pneumológicas
Alexandra Flávia Gazzoni
Análise descritiva da histopatologia criptocóccica
Porto Alegre, 2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii2
Alexandra Flávia Gazzoni
Análise descritiva da histopatologia criptocóccica
Tese apresentada como requisito parcial para a
obtenção do título de Doutor em Ciências
Pneumológicas à Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Faculdade de Medicina,
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Pneumológicas.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Severo
Porto Alegre, 2009
ads:
ii3
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer
meio, convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Catalogação Biblioteca FAMED/HCPA
IV
“O#maior#infortúnio#do#homem#letrado,#não#é#quiçá#o#fato#de#ser#vítima#das#
intrigas,#a#inveja#dos#seus#colegas#e#o#ser#ver#desprezado#dos#homens#poderosos,#senão#de#
ser#ver#julgado#pelos#néscios”#
Voltaire
VV
À"MINHA"FAMÍLIA"
″QUE" FORÇA" É" ESTA," EU" NÃO" SEI," TUDO" O" QUE" SEI," É" QUE" EXISTE" E" ESTÁ"
DISPONÍVEL" APENAS" QUANDO" ALGUÉM" ESTÁ" NUM" ESTADO" EM" QUE" SABE"
EXATAMENTE"O"QUE"QUER,"E"ESTÁ"TOTALMENTE"DETERMINADO"A"NÃO"DESISTIR"
ATÉ"CONSEGUIR.″"
VIVI
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
Ao"meu"orientador"
“Inventor#é#um#homem#que#olha#para#o#mundo#em#torno#de#si#e#não#fica#satisfeito#
com#as#coisas#como#elas#são.#Ele#quer#melhorar#tudo#o#que#vê#e#aperfeiçoar#o#mundo.#É#
perseguido#por#uma#idéia,#possuído#pelo#espírito#da#invenção#e#não#descansa#enquanto#
não#materializa#seus#projetos”#
#
#
Alexander#Graham#Bell#
VI
IX
RESUMO
GAZZONI, AF. Análise descritiva da histopatologia criptocóccica. 2009 96f. Tese
(Doutorado)- Programa de Pós-graduação em Ciências Pneumológicas, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2009.
A identificação histopatológica dos agentes fúngicos é um método excelente de
diagnóstico, devido ao fato de que as estruturas são facilmente identificadas por meio das
técnicas histoquímicas. Até o momento, não dispõem-se de métodos aceitáveis para
quantificação da atividade da infecção. Esta investigação protocola um método de
estimativa para atividade biológica da criptococose através da determinação dos índice de
brotamentos e carminofílico do Cryptococcus. Objetivos: Descrever os aspectos
histopatológicos da criptococose através das técnicas histoquímicas básicas e especiais da
micologia. Métodos: Foram avaliados 33 pacientes com diagnóstico histopatológico prévio
da criptococose. Resultados: Houve predominância do sexo masculino. A idade variou
entre 10 a 81 anos, com média de 45,6 anos. A criptococose é doença definidora dos casos
de Aids, sendo considerado seu principal fator predisponente, seguido de transplantes. O
trato respiratório é o mais envolvido. O microrganismos tem tropismo para o sistema
nervoso central e apresenta disseminação para outros órgãos. Resultados falso-negativos é
reflexo da deficiência de material capsular. A mortalidade foi de 36%, sendo o maior índice
obervado até os 3 primeiros meses após o diagnóstico. A criptococose apresenta-se sob
duas formas, reativa e paucireativa. Na infecção reativa, os organismos foram menos
abundantes e predominantemente intracelulares aos histiócitos e às células gigantes. Na
infecção paucireativa, há um grande número de leveduras, que proliferam-se
extracelularmente e estão associadas a destruição do tecido afetado. Ambos infecções,
reativas e paucireativas mostraram grande variação no índice de brotamento. O índice
carminofílico foi menor nas infecção reativas, quando comparados a infecção paucireativa.
Discussão: A coloração de Hematoxilina-Eosina é usada para visualizar as alterações
estruturais das lesões, bem como da reação tecidual. A coloração da prata é a mais utilizada
para identificação dos organismos fúngicos como o Cryptococcus. A coloração de
VII
VIII
Mucicarmim de Mayer detecta a cápsula mucopolissacarídica circundante corada na cor
magenta. A coloração de FM oferece diagnóstico diferencial nos casos inconclusivos à
coloração de Mucicarmim de Mayer. A quantificação de IB e IC é uma escala útil na
interpretação da resposta inflamatória do hospedeiro e atividade biológica da criptococose.
Palavras-chaves: Padrão reativo. Infecção paucireativa. Coloração pela prata. Índice de
brotamento. Coloração de Mucicarmim de Mayer. Índice carminofílico. Coloração de
Fontana-Masson.
IX
ABSTRACT
GAZZONI, AF. Analisis descritiva of the cryptococcal histopatology. 2009 96f. Tese
(Doutorado)- Programa de Pós-graduação em Ciências Pneumológicas, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2009.
The histopathologic identification from the fungal agents that's a method excellent
of diagnostic, due the fact of what the structures são easily identified for histochemical
techniques. So far, there is no methods you accepted about to measurement of biologic
activity. This investigation aponta to an method of estimate of the activity biologic of
cryptococcal infection by determination of the Budding Index and Carminophilic Index of
the Cryptococcus. Objectives: Describes the histologic features of cryptococcosis by basic
and special histochemical techniques of mycology. Methods: Have been evaluated 33
patients with previous cryptococcosis histopathologic diagnostic. Results: There is an
predominance of the males. The age of the patients ranged from 10 to 81 years with a
median value 45,4 years. The HIV infection was the main risk factor for disease, followg of
transplants. The respiratory tract is the most frequently involved among the organ systems
organs. The false-negative latex test are due to capsular deficiency. The moratlity rate was
36%, The high rate of 50% was observed between of 1 to 3 months. The cryptococcal
infections is divided into two major histologic categories, reactive and paucireactive, based
upon the host reaction. In reactive infection, the organisms were lessa abundant and were
predominantly intracellular within histiocytes and giant cells. In paucireactive infection,
thre is large numbers of yeats in the lesions, cryptococci proliferate extracellarly within the
involved tissues, associated histologically with mucoid degeneration of the surrounding
tissue. Both reactice and paucireactive infections showed great variation in Budding Index.
The Carminophilic Inded was lower in the reactive infections, when compared with the
paucireactive infection. In this Carminophilic Index presented higher measurements..
Discussion: The Hematoxilin-Eosin stain is used to look for strucutural changes of the
infectd lesion, as well tissues reactions. The Gomori’s methenamine-silver stain is the more
commonly used in identificatifying these organisms. The mucicarmine stain detecting the
X
surrounding mucopolisacharides capsule of the magenta color. The Fontana-Masson
staining offers differential diagnostic. The determination of IB and IC is an scale that relied,
because it provides an interpretation of the host response and biological activity of the
cryptoccosis.
Key-words: Reactive pattern. Paucireactive infection. Grocott’s methenamine silver
stain. Budding index. Mucicarmine stain. Carminophilic index. Fontana-Masson stain.
XIXI/
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Distribuição e percentual dos sexos (n=33)..........................................................21!
Figura 2 - Distribuição das frequências de idade em intervalo de classe na amostra estudada
(n=33). ..................................................................................................................................22!
Figura 3- Fatores predisponentes para criptococose na amostra estudada (n=33). .............. 23!
Figura 4 – Visão perspectiva das condições predisponentes para criptococose (n=33).......23!
Figura 5 – Porcentagem da criptococose como primeira manifestação da Aids (n=13).....24!
Figura 6 – Órgãos acometidos submetidos ao diagnóstico histopatológico.........................25!
Figura 7 – Tipo de envolvimento na amostra estudada (n=33)............................................26!
Figura 8 – Potencial disseminação da criptococose na amostra avaliada (n=33)................. 26!
Figura 9 – Procedimentos para obtenção do espécime clínico submetidos a exame
histopatológico (n=36)..........................................................................................................27!
Figura 10 – Porcentagem de realização do Látex na amostra estudada (n=33). .................. 28!
Figura 11 – Frequência e porcentagem dos casos com e sem identificação de espécies
(n=33). ..................................................................................................................................28!
Figura 12 – Mortes por criptococose em intervalos de tempo (n=33). ................................30!
Figura 13 - Categoria paucireativa e reativa na criptococose...............................................33!
Figura 14 - Fibrose na criptococose. ....................................................................................33!
Figura 15 - Padrão inflamatório na criptococose. ................................................................34!
Figura 16 - Presença de halo na criptococose. .....................................................................34!
Figura 17 - Destruição total da arquitetura tecidual na criptococose. ..................................35!
Figura 18 - Tamanho do halo perinuclear na criptococose ..................................................37!
Figura 19 - Criptococose por fungo totalmente deficiente de cápsula. ................................ 37!
Figura 20 - Formas não-clássicas do Cryptococcus. ............................................................ 38!
Figura 21 - Cápsula corada na cor magenta pela coloração de MM. ...................................40!
Figura 22 - Coloração de Fontana-Masson na criptococose. ...............................................41!
Figura 23 – Quantificação de elementos fúngicos em fragmento pulmonar corado pelo
GMS, evidenciando-se o padrão correspondente ao escore +++. ........................................45!
Figura 24 - Índice carminofílico na criptococose reativa.....................................................45!
Figura 25 - Número de micro-organismos e IB por meio da coloração da prata. ................46!
Figura 26 - IC por meio da coloração de MM na criptocoocose paucireativa. ....................46!
XIIIXI/
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Finalidades e limitações das técnicas histoquímicas no diagnóstico da
criptococose..........................................................................................................................16!
Tabela 2 – Óbitos como conseqüência direta da criptococose na amostra estudada (n=33).
..............................................................................................................................................29!
Tabela 3 - Distribuição dos parâmetros histológicos revelados ao HE na criptococose,
Laboratório de Micologia, Santa Casa/Complexo Hospitalar, 1981-2009(n=33)................32!
Tabela 4 - Distribuição das características micromorfológicas reveladas pela coloração da
prata no Laboratório de Micologia, Santa Casa/Complexo Hospitalar, 1981-2009.............36!
Tabela 5 - Distribuição da quantificação dos elementos fúngicos realizados pela coloração
de GMS.................................................................................................................................36!
Tabela 6 – Frequência entre os caos e escala pela coloração de MM. .................................39!
Tabela 7 - Atividade biológica na criptococose reativa por meio de IB e IC.......................43!
Tabela 8 - Atividade biológica na criptococose paucireativa por meio de IB e IC.............. 44!
Tabela 9 - Características micromorfológicas das leveduras. ..............................................51!
XIIIIIXI/
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABTO – Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos
Aids – Síndrome da imunodeficiência adquirida
ED – Exame direto
FM - Fontana-Masson
GMS – Coloração pela prata
HE – Hematoxilina-Eosina
HIV – Vírus da imunodeficiência adquirida
IB – Índice de brotamento
IC – Índice carminofílico
LCR – Líquor cefalorraquidiano
MM – Mucicarmim de Mayer
OMS – Organização Mundial da Saúde
RBT – Registros Brasileiros de Transplantes
SNC – Sistema nervoso central
Obs.: Algumas abreviaturas, devido ao seu uso consagrado, foram mantidas de
acordo com o original na língua inglesa.
XIIIIIXI/
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................1!
2 JUSTIFICATIVA..............................................................................................................4!
3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 5!
3.1 GERAL............................................................................................................................5!
3.2 ESPECÍFICOS ...................................................................................................................5!
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS ........................................................................................... 6!
4.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO...........................................................................................6!
4.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO.................................................................................................6!
4.3 CASUÍSTICA....................................................................................................................6!
4.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ................................................................................................ 6!
4.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO ............................................................................................... 7!
4.6 ASPECTOS ÉTICOS...........................................................................................................7!
4.7 OBTENÇÃO DAS INFORMAÇÕES....................................................................................... 7!
4.8 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA..............................................................................................8!
4.9 DEFINIÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS VARIÁVEIS ............................................................8!
4.9.1 Idade, média de idade e sexo................................................................................8!
4.9.2 Definição do órgão acometido..............................................................................9!
4.9.3 Doença predisponentes.........................................................................................9!
4.9.4 Criptococose como doença definidora de Aids...................................................9!
4.9.5 Tipo de envolvimento.......................................................................................... 10!
4.9.6 Espécime clínico proveniente de:.......................................................................10!
4.9.7 Sorologia pelo teste de aglutinação das partículas de látex ............................10!
4.9.8 Definição das espécies do complexo Cryptococcus ........................................... 11!
4.9.9 Número de óbitos ................................................................................................ 11!
4.9.10 Hematoxilina-Eosina (HE)...............................................................................11!
4.9.11 Avaliação da Coloração pela prata (GMS).....................................................12!
4.9.12 Formas não-clássicas ........................................................................................12!
4.9.13 Avaliação do Mucicarmim de Mayer (MM)...................................................13!
4.9.14 Avaliação do Fontana-Masson (FM)...............................................................13!
4.9.15 Atividade biológica ...........................................................................................13
5.0 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................................14!
6 EMBASAMENTO TEÓRICO.......................................................................................15!
6.1 MICROMORFOLOGIA.....................................................................................................15!
6. 2 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL..................................................................................... 15!
6.2.1 Histopatologia...................................................................................................... 16!
!
II
6.3 DIFERENÇAS HISTOLÓGICAS ENTRE PACIENTES IMUNOCOMPROMETIDOS E
IMUNOCOMPETENTES .........................................................................................................18!
6.4 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL .........................................................................................19!
7 RESULTADOS................................................................................................................21!
7.1 POPULAÇÃO AMOSTRAL ...............................................................................................21!
7.2 PERFIL CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICO ................................................................................21!
7.3 PERFIL HISTOLÓGICO .................................................................................................... 30!
7.3.1 Coloração de Hematoxilina- Eosina..................................................................30!
7.3.2 Coloração pela prata ..........................................................................................35!
7.3.3 Coloração de Mucicarmim de Mayer ...............................................................38!
7.3.4 Coloração de Fontana-Masson .......................................................................... 41!
7.4 ATIVIDADE BIOLÓGICA.................................................................................................42!
7.4.1 Criptococose reativa e paucireativa .................................................................. 42!
8 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 47!
8.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE DADOS CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICOS ESTUDADOS .................... 47!
8.2 CONSIDERAÇÕES SOBRE A AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA ..........................................49!
8. 3 CONSIDERAÇÕES SOBRE ATIVIDADE BIOLÓGICA ..........................................................51!
9 CONCLUSÃO..................................................................................................................53!
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 54!
APÊNDICES ......................................................................................................................62!
ANEXOS .............................................................................................................................64
1
1 INTRODUÇÃO
A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica, predominantemente oportunística,
provocada pelo basidiomiceto naturalmente encapsulado do gênero Cryptococcus, o qual
tem como porta de entrada o sistema respiratório, possuindo um importante tropismo pelo
sistema nervoso central (SNC) (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Esta levedura causa
doença em humanos que varia desde a colonização assintomática pulmonar a meningite e
infecção disseminada (MITCHELL & PERFECT, 1995).
A infecção criptocóccica é causada por duas espécies distintas do complexo
Cryptococcus: Cryptococcus gattii, tipicamente encontrado em zonas climáticas tropicais e
subtropicais, usualmente causa doença em indivíduos aparentemente imunocompetentes,
enquanto presentes em fezes de pombos urbanos, Cryptococcus neoformans tem
distribuição mundial e comporta-se como uma comum infecção oportunística (BOVERS et
al., 2008; SEVERO, et al., 1998; SEVERO et al., 1999).
Especificamente, condições que predispõe a uma alteração na imunidade celular
associa-se a um aumento significativo do risco da doença, que incluem desordens
linfoproliferativa, transplantes de órgãos e naqueles receptores de terapia imunosupressiva
(PERFECT & CASADEVALL, 2002). A criptococose é a umas das mais comuns infecções
fúngicas oportunísticas em pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida (Aids)
– considerado o seu principal fator predisponente (MITCHELL & PERFECT, 1995). Neste
subgrupo, a infecção criptocóccica apresenta a altos índices de mortalidade, nos quais a sua
incidência é inversamente proporcional a contagem de linfócitos CD4. (KWON-CHUNG &
BENNETT, 1984; PERFECT & CASADEVALL, 2002).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que a taxa mundial das infecções
oportunistícas, causadas pelo Cryptococcus, tenha uma frequência média de 11% (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 1998) e que a criptococose cause provavelmente cerca de
5% de todas as mortes associadas ao HIV (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002).
Em regiões como os Estados Unidos, Europa, Austrália e América do Sul, a criptococose
acomete de 6 a 10% dos pacientes com Aids, enquanto no continente africano essa taxa
eleva-se para 15% a 35% (MITCHELL & PERFECT, 1995; WORLD HEALTH
2
ORGANIZATION, 1998). O índice de mortalidade global geralmente é elevado (TRILLES
et al, 2004). Segundo MITCHELL & PERFECT (1995), a mortalidade durante a terapia
inicial é de 10 a 25%, e em 12 meses eleva-se a 30 - 60%.
No Brasil, a estimativa da prevalência da criptococose em pacientes com HIV/Aids
é de 5%, necessitando de infraestrutura de suporte médio para diagnosticar e tratar a
infecção. Sem tratamento, a esperança de vida do paciente é provavelmente inferior a um
mês (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1998). A taxa de mortalidade entre pacientes
com criptococose, com ou sem doença predisponente, fica em torno de 40 a 66% (CALVO
et al., 1991; CÔRREA et al., 1999; PAPPALARDO & MELHEM, 2003)
Em relação ao HIV, a sua prevalência é elevada, sendo estimada no final de 2006,
pela OMS, que cerca de 40 milhões de pessoas estavam contaminadas com o HIV no
mundo, sendo 37 milhões de adultos. A mortalidade global está se elevando, sendo
estimada em 2.8 milhões no ano de 2002 para 6.5 milhões no ano de 2030 (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 2007).
No Brasil, a estimativa de adultos e crianças vivendo com HIV/Aids no período de
2003 a 2005 equivale a 620.000 pacientes em média, (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2006). Em 2007, a prevalência do HIV em adultos maiores que 15 anos
aumentou, apresentando índice de 454/100.000 habitantes. A estimativa da taxa de
mortalidade do HIV/Aids é 8%/100.000 habitantes ao ano, o que corresponde a
aproximadamente 15.000 óbitos no período (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2007).
Segundo PERFECT & CASADEVALL (2002), a criptococose ocorre em 2,8% dos
pacientes receptores de órgãos com um índice de mortalidade acima de 42%. Pacientes
submetidos a transplantes renais, hepáticos e pulmonares apresentam alto risco para a
doença, bem como as maiores prevalências. Conforme os Registros Brasileiros de
Transplantes (RBT) (2007), em comparação com o ano anterior, houve incremento nos
transplantes de pulmão (9%), de fígado (5%) e rim (3%). O estado do Rio Grande do Sul
(RS) coloca-se entre os principais estados, apresentando equipes transplantadoras ativas,
ocupando a primeira posição nos transplantes pulmonares (14 procedimentos); o segundo
lugar no transplante hepáticos (54 procedimentos), já nos transplantes renais, ocupa a
terceira posição com 168 procedimentos. No transplante renal, a causa infecciosa é
3
responsável por 50% dos óbitos; no transplante pulmonar apresenta porcentagem ainda
maior - 62%; já no transplante hepático ela corresponde a 45%. Conforme a Associação
Brasileira de Transplantes de Órgãos (ABTO) (2008), embora tenha havido crescimento
nas taxas de transplantes de órgãos em 2008, este foi inferior ao planejado e as medidas
para acelerar esse crescimento devem ser ampliadas.
Nesse contexto, a crescente taxa de prevalência dos casos de HIV/Aids no mundo e
no Brasil com a sua elevada taxa de mortalidade, bem como a era dos transplantes,
transformam as doenças oportunísticas, em especial a criptococose, em um importante alvo
de estudo.
4
2 JUSTIFICATIVA
Diante do aumento do número nos casos de infecções fúngicas motivado pelos
eventos imunossupressores descritos anteriormente, justifica-se o estudo:
1) A imersão dos fragmentos em formol causa morte dos elementos fúngicos,
restringindo-se o diagnóstico aos achados micromorfológicos e tintoriais da
histopatologia.
2) Investigação de um método para estimar a atividade biológica da criptococose
visto que, não existe métodos aceitáveis para quantificar a atividade da infecção.
5
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL
Descrever aspectos histopatológicos da criptococose através das técnicas de
colorações histoquímicas de Hematoxilina-Eosina (H&E), Coloração pela prata (GMS),
Mucicarmim de Mayer (MM), Fontana-Masson (FM).
3.2 ESPECÍFICOS
Levantar dados epidemiológicos dos casos de criptococose previamente
diagnosticados pelo exame anátomo-patológico.
Estabelecer o tipo de reação tecidual (reativa, paucireativa, sem reação;
granulomatosa, necrose, sarcóide, supurativa; existência ou ausência de halo;
presença de células inflamatórias como: macrófagos, linfócitos, eosinófilos,
neutrófilos, histiócitos, células epitelióides e célula gigante; presença de
fagocitose: disposição intracelular ou extracelular do elemento fúngico.
Determinar o aspecto tecidual histopatológico visualizado pela coloração pela
prata.
Descrever as características micromorfológicas oferecidas pela técnica de MM
como a presença de cápsula.,
Caracterizar a presença de aspectos histopatológicos proporcionados pela
técnica de FM, como o objetivo de avaliar a presença de melanina na parede
celular do elemento fúngico.
Determinar o índice de brotamento (IB) e índice carminofílico (IC) das
leveduras com a finalidade de estimar a atividade biológica da criptococose.
6
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS
4.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Trabalho descritivo que tem como caráter fundamental um estudo qualitativo de
uma série de casos de criptococose diagnosticados previamente por métodos histoquímicos.
4.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO
Na população de estudo incluíram-se todas as amostras da casuística que somaram
910 casos da doença, no período compreendido entre 1981 a 2009. Foram incluídos na
análise blocos de parafina provenientes do arquivo do Laboratório de Micologia da Santa
Casa-Complexo Hospitalar e do Laboratório Geyer, ambos na cidade de Porto Alegre-RS.
4.3 CASUÍSTICA
Avaliaram-se aspectos histopatológicos e retrospectivamente, os epidemiológicos,
de 33 casos previamente diagnosticados com criptococose. O estudo foi realizado no
período de janeiro de 2008 a março de 2009.
4.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
7
Os critérios de inclusão foi:
Ter diagnóstico histopatológico prévio de criptococose anterior a março de
2009.
4.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Os critérios de exclusão foram:
Não ter blocos de parafina disponíveis no Laboratório de Micologia, Santa
Casa-Complexo Hospitalar ou no Laboratório Geyer.
Não ter espécime clínico suficiente - incluso em blocos de parafina - para
confecção dos cortes seqüenciados e posterior realização das técnicas
histoquímicas.
4.6 ASPECTOS ÉTICOS
O estudo foi aprovado pelo Cômite de Ética em Pesquisa da Santa Casa-Complexo
Hospitalar (processo n° 1151/2006).
4.7 OBTENÇÃO DAS INFORMAÇÕES
As informações de cada paciente foram obtidas por meio da análise das fichas, bem
como do sistema eletrônico de dados do Laboratório de Micologia; e outras recuperadas
através da revisão dos prontuários médicos pertencentes a Santa Casa-Complexo
Hospitalar.
8
Posteriormente, as informações compuseram o Instrumento de coleta de dados
(Apêndice A) pertinentes ao estudo.
4.8 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA
No estudo foram confeccionadas 10 lâminas correspondentes a cada caso. Cada uma
delas foram coradas por meio de 4 técnicas histoquímicas: Hematoxilina-eosina (Anexo A)
(ARTAL, 2004; CHANDLER & WATTS, 1989; GAZZONI et al., 2008; LACAZ, 1998),
Coloração da prata (Anexo B) (BAKER & HAUGEN 1955; GAZZONI et al., 2008;
GROCOTT, 1955; KWON-CHUNG et al., 1981; LACAZ, 1998), Mucicarmim de Mayer
(Anexo C) (GAZZONI et al., 2008; LACAZ, 1998; LAZCANO et al., 1991; LAZCANO et
al., 1993) e Fontana-Masson (Anexo D) (GAZZONI et al., 2008; LACAZ, 1998).
As amostras, que continham mais de um bloco ou os casos, que possuíam mais de
um sítio infeccioso foram ambos analisados e também integraram o estudo.
Dessa forma, foram confeccionadas, coradas e analisadas um total de 1320 lâminas
correspondente aos casos da série.
Em casos especiais, foram realizadas colorações adicionais, resultando em uma
adição de 100 lâminas.
4.9 DEFINIÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS VARIÁVEIS
4.9.1 Idade, média de idade e sexo
4.9.1.1 Idade
9
Coletada como variável contínua, tomando como base a idade na data do
primeiro diagnóstico da criptococose.
A média de idade foi obtida através de cálculo adequado.
A idade foi apresentada através de gráficos de distribuição de frequência
utilizando-se intervalos de classes.
4.9.1.2 Sexo
Masculino
Feminino
4.9.2 Definição do órgão acometido
Determinação da porcentagem e do número de casos provenientes dos
diferentes sítios infecciosos acometidos.
4.9.3 Doença predisponentes
Definição dos fatores de risco.
Determinação do número de casos e da porcentagem das condições
predisponentes.
4.9.4 Criptococose como doença definidora de Aids
10
Definiu-se esta varíavel como desenvolver criptococose como primeira
manifestação oportunística de Aids.
4.9.5 Tipo de envolvimento
Caracterização de envolvimento como:
Pulmonar;
Extra-pulmonar;
Sistema Nervoso Central;
Extra-neural;
Disseminada;
Extra-pulmonar e extra-neural;
Definição do número de casos e da porcentagem.
4.9.6 Espécime clínico proveniente de:
Biópsia cirúrgica;
Necropsia;
Biópsia transbrônquica;
Punção por agulha fina;
4.9.7 Sorologia pelo teste de aglutinação das partículas de látex
11
Determinação da porcentagem e do número de casos relacionados a presença e
ausência do teste.
Derterminação de porcentagem de casos postivos e negativos.
4.9.8 Definição das espécies do complexo Cryptococcus
C. gattii;
C. neoformans;
Determinação do número de casos e da porcentagem das variedades
causadoras da infecção criptoccócica.
4.9.9 Número de óbitos
Determinação do casos e da porcentagem de óbitos.
Ocorrência de óbito em três pontos no tempo após o diagnóstico da
criptococose: 3 meses, 6 meses, 1 ano ou período superior a 1 ano.
4.9.10 Hematoxilina-Eosina (HE)
Categorias histológicas incluídas no estudo:
Reativa, paucireativa
12
Variáveis estudadas:
Granulomatosa com necrose, sarcóide ou supurativa;
Fibrose;
Presença ou ausência de halo disposto pericelular ao fungo;
Presença de células inflamatórias como: macrófagos, linfócitos, eosinófilos,
neutrófilos, células gigante e célula epitelióide;
Presença de fagocitose: fungo disposto intracelular ou extracelular;
4.9.11 Avaliação da Coloração pela prata (GMS)
Presença de espaço claro pericelular indicativo de presença de material
capsular.
Determinação da porcentagem e do número de casos positivos na técnica de
GMS.
Quantificação dos microrganismos (SCHWARTZ, 1988).
Determinação do índice de brotamento: consiste em 5 contagens de 100
microrganismos cada; a média das cinco contagem é expressada em um
número sem unidade (SCHWARTZ, 1988).
4.9.12 Formas não-clássicas
Definidas como:
Estruturas deficientes de cápsula;
Pseudo-hifa;
Estruturas semelhantes a tubo germinativo;
Formação de brotamentos em cadeia;
Determinação do número de casos com suas apresentações teciduais;
13
4.9.13 Avaliação do Mucicarmim de Mayer (MM)
Presença ou ausência de cápsula;
Determinação da porcentagem e do número de casos positivos pela técnica de
MM;
Determinação do índice carminofílico: consiste na contagem de 100
microrganismos com indicação dos escores (SCHWARTZ, 1988).
Escores:
25% ou menos: +
26% a 50%: ++
51% a 75%: +++
Superior a 75%: ++++
4.9.14 Avaliação do Fontana-Masson (FM)
Visualização da melanina presente na parede celular do elemento fúngico.
Determinação da porcentagem e do número de casos com presença de
melanina pela técnica de Fontana-Masson.
4.9.15 Atividade biológica
14
Quantificação de índice de brotamento (IB) e índice carminofílico (IC)
culminado da determinação da atividade biológica do Cryptococcus nas lesões reativas
e paucireativas.
5.0 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Neste estudo foi realizado o método de triangulação sequenciada (NEVES, 1996),
na qual há o uso ao mesmo tempo de métodos qualitativos e quantitativos. Dessa forma, os
resultados do método qualitativo serviram de base para o planejamento do emprego do
método quantitativo, complementando-os. A combinação da análise qualitativa e
quantitativa realizadas em três momentos tornou a pesquisa mais forte e reduziu os
problemas da adoção exclusiva de somente um desses grupos (MORSE, 1991)
A indicação dos testes estatísticos foi feitas com a colaboração e orientação do
Departamento de Matemática da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
A interpretação estatística foi feita pela própria pesquisadora com a colaboração da
disciplina de Bioestatística da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Para realização dos testes estatísticos foi utilizado o programa Pacote R, adotando-
se o nível de significância de 0,05 (α=5%).
Para verificar as seguintes relações: a) sexo e aparecimento da doença; b)
disseminação e espécies do Cryptococcus foi utilizado o Teste Binomial (não-paramétrico).
Para verificar a seguinte relação: a) presença ou não de fatores de risco e espécies
do Cryptococcus foi utilizado o Teste Exato de Fisher (não-paramétrico).
15
6 EMBASAMENTO TEÓRICO
6.1 MICROMORFOLOGIA
Microscopicamente, o agente fúngico apresenta-se como leveduras esféricas a ovais
com cápsula carminofílica circundante (GAZZONI et al., 2008) O envelope capsular é
altamente antigênico e considerado determinante da virulência deste microrganismo
(EDWARDS et al., 1967). As estruturas fúngicas variam de tamanho com 5 a 10 µm de
diâmetro e exibem brotamentos únicos ou múltiplos (PERFECT & CASADEVALL, 2002;
GAZZONI et al., 2009; LITMMAN & ZIMERMMAN, 1956).
As formas não-clássicas deste basidiomiceto são encontradas no exame direto (ED),
na histopatologia e em cultivos, e incluem: pseudo-hifa, brotamentos em cadeia, e
estruturas semelhantes a tubo germinativo, bem como elementos fúngicos desprovidos de
material capsular (GAL et al., 1986). Estas estruturas não-clássicas foram relatadas pela
literatura causando infecção em humanos e em modelos animais (ALFONSO et al., 1994;
BOTTONE et al., 1986; COX & TOLHURST, 1946; FREED et al., 1971; GAZZONI et al.,
2008; GAZZONI et al., 2009; GORDON, 1970; HEENAN et al., 1981; KIMURA et al.,
1998; LEVINSON et al., 1974; LURIE & SHADOMY, 1971; MILCHGRUB et al.1989;
,MOORE, 1946; NEILSON et al., 1981; NEILSON et al., 1987; PASCHOAL et al., 2007;
SCHWARTZ, 1988; SEVERO et al., 1981; SHADOMY & UTZ, 1966; SHADOMY &
LURIE, 1971; TORRES et al., 2005; WATTS & CHANDLER et al.1987., WILLIAMSON
et al., 1996).
6. 2 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O diagnóstico laboratorial da criptococose inclui métodos convencionais como a
microscopia (exame direto e histopatologia) (BOVERS et al., 2008; GAZZONI et al., 2008;
16
GAZZONI et al., 2009; GORDON & DEVINE, 1970; ÒHARA, 1986), usualmente
associados a soromicologia (pesquisa do antígeno capsular através do teste de aglutinação
das partículas de látex (BERLIN & PINCUS, 1989; BLOMMFIELD et al., 1963; HELOU
et al., 1999) e ao isolamento do microrganismo em cultivos (BERLIN & PINCUS, 1989;
BOVERS et al., 2008).
6.2.1 Histopatologia
A identificação histopatológica baseia-se nas características micromorfológicas do
Cryptococcus, sendo composta pelas técnicas histoquímicas básicas de hematoxilina-eosina
(H&E) e Coloração pela prata (GMS), bem como as técnicas especiais de mucicarmim de
Mayer (MM) e de Fontana-Masson (FM) (ARTAL, 2004; GAZZONI et al., 2008;
GAZZONI et al., 2009; GROCOTT et al., 1955; KWON-CHUNG, et al., 1981;
LAZCANO et al., 1991; LAZCANO et al., 1993; RO et al., 1987; SEVERO et al.,1981). A
Tabela 1 apresenta as finalidades e limitações destas técnicas histoquímicas.
Tabela 1 - Finalidades e limitações das técnicas histoquímicas no diagnóstico da criptococose.
Finalidades
Limitações
H&E
Reação tecidual
Não evidencia as estruturas fúngicas
GMS
Cora parede celular dos fungos
Complexidade no procedimento
Alto custo
MM
Cora envelope capsular
Insuficiente no diagnóstico de
Cryptococcus deficientes de cápsula
FM
Cora melanina na parede celular fúngica
Complexidade no procedimento
Alto custo
Fonte: Gazzoni et al., 2008
17
Segundo a Classificação de Schwartz, a criptococose é dividida em duas categorias
histológicas baseadas nas reações teciduais, reveladas ao HE (CASADEVALL &
PERFECT, 1998; SCHWARTZ, 1988). A categoria reativa - resultado de resposta imune
celular ativa - apresenta intensa resposta inflamatória composta por macrófagos, células
gigantes multinucleadas e linfócitos; as leveduras encontram-se intracelulares (fagocitadas)
(CASADEVALL & PERFECT, 1998; GAZZONI et al., 2008, SCHWARTZ, 1988).
A categoria paucireativa é resultado da falta de habilidade do hospedeiro em
desencadear a resposta inflamatória. A imunidade celular tem papel importante nos
mecanismos de defesa; na sua ausência os microrganismos proliferam-se extracelularmente
(CASADEVALL & PERFECT, 1998; SCHWARTZ, 1988 ). Portanto, as estruturas
exibem-se sob esta disposição e estão associadas a mínima ou ausente resposta inflamatória
e a destruição total da arquitetura tecidual (SCHWARTZ, 1988). Alguns estudos
fundamentam que a reação paucireativa indica mau prognóstico (CASADEVALL &
PERFECT, 1998).
A coloração da prata é largamente utilizada na pesquisa dos elementos fúngicos
tanto em cortes de tecido, quanto em esfregaços (GAZZONI et al., 2008). Observa-se
características morfológicas como parede celular e brotamentos, além de sugerir a presença
dos halos claros perinucleares circundantes aos micro-organismos. As lesões ativas contêm
numerosas estruturas fúngicas brotantes. Brotamentos únicos ou múltiplos com estreita
base são comuns. As formas micromorfológicas não-usuais são facilmente evidenciadas por
esta coloração (GAZZONI et al., 2009).
A coloração de MM é considerada um método específico de visualização do
envelope mucopolissacarídico do Cryptococcus (CHANDLER & WATTS, 1997;
GAZZONI et al., 2008, GAZZONI et al., 2009; PERFECT & CASADEVALL, 2002;
SEVERO et al., 1981). Através da coloração magenta da cápsula é possível diferenciar a
levedura de outros fungos similares em tamanho e forma (GAZZONI et al., 2008;
GAZZONI et al., 2009).
A coloração de FM evidencia a melanina presente na parede celular fúngica
(GAZZONI et al.,2008; PERFECT & CASADEVALL, 2002). Sua utilização fica restrita a
casos em que há resultados insuficientes na técnica de MM. Dessa forma, ela é considerada
18
a alternativa diagnóstica para casos de infecções por organismos deficientes de envelope
capsular mucopolissacarídico, morfologicamentes sugestivos de Cryptococcus (GAZZONI
et al., 2008).
6.2.1.1 Índice de brotamento e índice carminofílico
Caracteriza-se a atividade biológica do Cryptococcus através de uma escala
confiável desenvolvida para determinar o índice de brotamento (IB) e carminofílico (IC) da
levedura (CASADEVALL, 1998; SCHWARTZ, 1988). O IB é calculado através da
porcentagem de micro-organismos que exibem 1 ou mais brotamentos, sendo indicativo de
replicação in vivo (SCHWARTZ, 1988). O IC é calculado pela determinação da
porcentagem de micro-organismos com cápsula, corada pela técnica histoquímica de MM,
sendo indicativo de síntese capsular (CASADEVALL, 1998). A escala é potencialmente
útil na interpretação da resposta inflamatória do hospedeiro, prognóstico e atividade
biológica.
6.3 DIFERENÇAS HISTOLÓGICAS ENTRE PACIENTES IMUNOCOMPROMETIDOS E
IMUNOCOMPETENTES
As características histológicas da criptococose diferem entre indivíduos
imunocomprometidos e imunocompetentes - reflexo do grau da integridade da resposta
imune celular (JARVIS & HARRISON, 2008). Achados em pacientes imunocompetentes
variam de nódulos bem definidos a massas, apresentando infiltrado inflamatório
circundante ao local da lesão (JARVIS & HARRISON, 2008; SHIBUYA et al., 2001;
SHIBUYA et al., 2002). É marcante a presença de formação granulomatosa com
visualização de extensos infiltrados linfocitários e de células gigantes (BAKER, 1976;
GAZZONI et al., 2008; KERKERING et al., 1981).
19
Em contraste a resposta imunológica normal em pacientes imunocompetentes,
pacientes imunocomprometidos usualmente desenvolvem doença difusa (JARVIS &
HARRISON, 2008). Nestes, os achados compreendem-se na expansão dos septos
alveolares associados à agregação macrofágica, a ausência de granuloma e a destruição da
arquitetura tecidual (GAZZONI et al., 2009; SHIBUYA et al., 2002; SHIBUYA et al.,
2005). Características em pacientes HIV positivos são mais agudas, com a observação de
numerosas leveduras brotantes, sem a presença de inflamação significativa (JARVIS &
HARRISON, 2008).
6.4 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
A identificação histopatológica dos agentes fúngicos é um excelente método de
diagnóstico, devido ao fato de que as estruturas são facilmente detectadas através das
técnicas histoquímicas (GAZZONI et al., 2008; GAZZONI et al., 2009).
No Cryptococcus com cápsula íntegra, as características micromorfológicas são
diferenciadas e o diagnóstico é único, desde que os micro-organismos sejam usualmente
associados a mínima resposta inflamatória (CHANLDER & WATTS, 1997). No fungo
deficiente de cápsula, as características histológicas são bastante inespecíficas encontrando-
se em outras patologias de origem infecciosa (GAZZONI et al., 2008).
O uso das colorações especiais justifica-se pelo fato de que o Cryptococcus
mimetiza outros fungos leveduriformes devido a sua variável micromorfologia (TRAVIS et
al., 2002). O reconhecimento da cápsula pela coloração de MM é o primeiro passo para
distinguir a levedura de outros fungos similares em tamanho e forma (CHANDLER &
WATTS, 1997; GAZZONI et al., 2008; TRAVIS et al., 2002). A maior dificuldade ocorre
com micro-organismos deficiente de cápsula, pois eles confundem-se - devido ao seu
menor tamanho – com Histoplasma capsulatum, esférulas imaturas de Coccidioides
immitis, formas pequenas de Blastomyces dermatitidis e de Paracoccidioides brasiliensis,
Candida glabrata e Sporothrix schenckii (TRAVIS et al, 2002; GUTIERREZ et al, 1975;
HARDING et al., 1979; FARMER et al., 1973; LOVE et al., 1985). Nesses casos, a
20
coloração histoquímica especial de FM é utilizada proporcionando diagnóstico diferencial
entre as formas micromorfológicas não usuais do Cryptococcus e as estruturas fúngicas que
simulam esta levedura (GAZZONI et al., 2008; TRAVIS et al., 2002).
21
7 RESULTADOS
7.1 POPULAÇÃO AMOSTRAL
Participaram deste estudo 33 pacientes com diagnóstico prévio da criptococose por
meio de exame histopatológico
No que diz respeito ao perfil epidemiológico, todos os 33 pacientes foram incluídos
na análise. Dentre estes, 7 casos enquadraram-se em alguns dos critérios de exclusão. Por
sua vez, a descrição histopatológica realizou-se nos 26 casos restantes.
7.2 PERFIL CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICO
Figura 1- Distribuição e percentual dos sexos (n=33).
22
Figura 2 - Distribuição das frequências de idade em intervalo de classe na
amostra estudada (n=33).
Cada intervalo de classe apresenta limites mínimo e máximo.
Houve predominância do sexo masculino 85% (28 casos) sobre o feminino (15%, 5
pacientes). De acordo com o Teste Binomial, quando verificamos as diferenças entre a
variável sexo, a proporção de sexo masculino é significativamente diferente (p=0.0003241)
da proporção do sexo feminino. Estes dados indicam que a proporção de sexo masculino é
maior, sugerindo estar a criptococose relacionada ao sexo masculino nesta amostra. A
Figura 1 apresenta o percentual dos sexos na amostra estudada.
O intervalo 40 - 49 anos demonstrou maior freqüência - 12 entre os 33 pacientes. A
maioria - 37% - enquadraram-se neste intervalo. A média de idade foi 45,4 anos, com
variação de 10 a 81 anos. A Figura 2 demonstra a distribuição das freqüência de cada
intervalo de classe.
23
Figura 3- Fatores predisponentes para criptococose na amostra estudada (n=33).
DBOPC: Doença Bronco Pulmonar Obstrutiva Crônica; HIV: Vírus da
imunodificiência adquirida.
Figura 4 – Visão perspectiva das condições predisponentes para criptococose (n=33).
HIV: Vírus da imunodeficiência adquirida
24
A presença da infecção pelo HIV foi o principal fator de risco para a criptococose
(Figura 3) - sendo observada em 13 (39%) dos pacientes (Figura 4). Transplante, que
incluiram 4 renais e 2 pulmonares, ocupa o segundo lugar no estudo (17%) (Figura 3 e 4).
Entre os pacientes transplantados, o tempo médio de aparecimento da infecção fúngica foi
de 43,8 meses, com variação de 35 a 53 meses. Destaca-se a alta frequência de pacientes
sem fator identificável (Figura 3 e 4). A Figura 3 informa a frequência dos fatores
predisponentes no estudo. A Figura 4 apresenta o cenário em perspectiva das condições de
risco desta infecção fúngica.
Figura 5 – Porcentagem da criptococose como primeira manifestação da Aids (n=13).
Em seis dos 13 (46%) pacientes HIV positivos, a criptococose apresentou-se como
doença definidora da Aids. A Figura 5 demonstra a porcentagem entre os casos.
25
Figura 6 – Órgãos acometidos submetidos ao diagnóstico histopatológico.
Alguns pacientes demonstraram mais de um órgão acometido.
Permite-se verificar que o órgão acometido que apresentou maior frequência à
histopatologia foi o pulmão (20 casos), seguido de linfonodo (5), pele (3) e fígado (2).
Medula óssea, baço, SNC (Sistema Nervoso Central), língua e axila esquerda/parede
toráccica anterior apresentaram 1 casos cada. A Figura 6 revela o cenário dos sítios
acometidos tendo como base o espécime clínico submetido a histopatologia.
26
Figura 7 – Tipo de envolvimento na amostra estudada (n=33).
Alguns pacientes apresentaram mais do que um sítio infeccioso.
Figura 8 – Potencial disseminação da criptococose na amostra avaliada (n=33).
27
A Figura 7 permite-nos informar que o envolvimento pulmonar foi o tipo mais
frequente (21 casos), seguido de comprometimento do SNC (17 casos). Envolvimento
extra-pulmonar, extra-neural e extra-pulmonar/extra-neural revelaram 13, 15 e 6 casos
respectivamente.
A Figura 8 revela que 66% dos pacientes apresentaram doença disseminada,
revelando o SNC como principal sítio de disseminação (55% entre os 33 pacientes do
estudo).
Figura 9 – Procedimentos para obtenção do espécime clínico submetidos a exame
histopatológico (n=36)
Alguns pacientes apresentaram mais do que uma identifcação do fungo por meio da histopatologia.
Em relação a obtenção do espécime clínico, em 27 casos os fragmentos de tecido
foram provenientes de biópsia cirúrgica. O restante inclui, biópsia transbrônquica (1 caso),
punção por agulha fina (1 caso), punção lancetante (1 caso), mediastinoscopia (4 casos),
biópsia a ceú aberto (1 caso) e toracotomia (1 caso). A Figura 9 apresenta a distribuição dos
procedimentos utilizados para obtenção do espécime clínico.
28
Figura 10 – Porcentagem de realização do Látex na amostra estudada (n=33).
Sessenta e nove porcento (69%) dos casos apresentaram diagnóstico da criptococose
também pela sorologia. Entre estes, 16 (79%) pacientes apresentaram teste positivo e 7
(21%) demonstraram resultados negativos. A Figura 10 revela a porcentagem da realização
do látex na amostra analisada (n=33).
Figura 11 – Frequência e porcentagem dos casos com e sem identificação de espécies
(n=33).
29
Entre os 33 pacientes, 25 tinham teste diagnóstico para diferenciar as espécies do
complexo Cryptococcus. Destes, 19 casos foram identificados como C. neoformans e 6
casos como C. gattii. Oito casos não possuíram teste diagnóstico. A Figura 11 demonstra a
frequência e a porcentagem dos pacientes com e sem teste diagnóstico para discriminação
das espécies.
Verificou-se a relação existente entre as espécies do complexo Cryptococcus e a
possibilidade de disseminação da doença. De acordo com o Teste Binomial, a proporção de
ocorrência de doença disseminada por C. neoformans é significativamente diferente
(p=0.04139) da proporção de ocorrência de doença dissimenada por C. gattii. Estes dados
indicam que a proporção de doença disseminada por C. neoformans é maior nesta série
analisada.
Verificou-se a associação existente entre C. neoformans/C. gattii e
imunocompetente/imunocomprometido. De acordo com o Teste Exato de Fisher, a
condição neoformans/gattii é significativamente associada (p=0.008696) com a condição
imunocompetente/imunocomprometido. Estes dados indicam que a espécie neoformans
está associada a imunocomprometidos e que a espécies gattii apresenta evidências de estar
associada a imunocompetente nos casos estudados.
Tabela 2 – Óbitos como conseqüência direta da criptococose na amostra estudada (n=33).
Condição
Frequência/Porcentagem
Não óbito
21 (64%)
Óbito
12 (36%)
30
Figura 12 – Mortes por criptococose em intervalos de tempo (n=33).
Na série analisada (n=33), a taxa de mortalidade foi de 36% (12 pacientes). A
Tabela 2 revela a frequência e porcentagem dos óbitos.
O intervalo de 0 a 3 meses revelou índice equivalente a 50% (6 entre os 12
pacientes). Os intervalos 3 a 6 meses, 6 meses a 1 ano e 1 ano apresentaram taxa de
mortalidade igual a 6% (2), 9% (3) e 3% (1). A Figura 12 apresenta o número de óbitos por
intervalo de tempo.
7.3 PERFIL HISTOLÓGICO
7.3.1 Coloração de Hematoxilina- Eosina
De acordo com a tabela 3, verifica-se que 22 (61%) pacientes apresentaram padrão
histológico paucireativo (Figura 13A). O padrão reativo foi observado em 14 (39%) casos
31
(Figura 13B). Cryptococcoma, uma variante morfológica do padrão reativo esteve presente
em 3 (8%) destes 14 casos.
A criptococose apresentou-se sob duas formas: gelatinosa na maioria (24, 66%) e
granulomatosa (12, 34%). Padrões inflamatórios como necrose, sarcóide e supurativo foram
visualizado em 20 (56%), 14 (38%) e 2 (6%) casos, respectivamente. Áreas marginais de
fibrose foram presentes em 28 (77%) pacientes (Figura 14). Infiltrados inflamatórios foram
observados em 100% dos casos, sendo linfocitário o mais freqüente (31, 86%) (Figura
15A), seguido de macrofágico (5, 14%) e neutrofílico (4, 11%). Revelou-se células
epitelióides em 16 (44%) pacientes (Figura 15A). Detectaram-se células gigantes bem
definidas em 12 (33%) casos (Figura 15B). Por sua vez, as do tipo mal definidas foram
observadas em 3 (8%); todos estes apresentaram como condição predisponente a infecção
pelo HIV.
Em relação ao halo pericelular, a presença foi relatada em 23 (64%) (Figura 16A e
16B). A visualização desta característica morfológica é representativa de fungo com
cápsula íntegra. Logo, em 13 (36%) casos não detectou-se halo circundante, sendo
indicativo de fungo desprovido de envelope capsular. Quanto a disposição fúngica, 26
(78%) casos apresentaram localização extracelular, com elementos fúngicos dispersos pelo
tecido, ou ainda em locais isolados. Em 7 (19%) as estruturas fúngicas estavam dispostas
intracelulares às células gigantes (fagocitadas). Em três (8%) pacientes os agentes fúngicos
foram encontrados ora no interior dos fagócitos, ora dispersos pelo tecido. Visualizou-se
destruição da arquitetura tecidual em 6 (16%) casos (Figura 17).
32
Tabela 3 - Distribuição dos parâmetros histológicos revelados ao HE na criptococose,
Laboratório de Micologia, Santa Casa/Complexo Hospitalar, 1981-2009.
Parâmetro histológico
N
(%)
Paucireativa
Reativa
Cryptococcoma
22
14
3
(36%)
(64%)
(8%)
Gelatinosa
Granulomatosa
24
12
(66%)
(34%)
Necrose
Sarcóide
Supurativa
20
14
2
(56%)
(38%)
(6%)
Fibrose
28
(77%)
Células inflamatórias
Macrófagos
Linfócitos
Neutrófilos
Células gigante
Celúlas epiteliódes
Definidas
Mal definidas
5
31
4
12
3
16
(14%)
(86%)
(11%)
(33%)
(8%)
(44%)
Halo pericelular
Presença
Ausência
23
13
(64%)
(36%)
Disposição fúngica
Intracelular
Extracelular
Intracelular/Extracelular
7
25
3
(19%)
(72%)
(8%)
Destruição tecidual
6
(16%)
Alguns pacientes tem mais de um espécime clínico, positivo para criptococose, identificado por exame
histopatológico.
33
Figura 13 - Categoria paucireativa e reativa na criptococose.
A) Fragmento de linfonodo: paucireativa - ausência de células inflamatórias; B) Fragmento de
pulmão: reativa – presença de necrose e granuloma em paliçada.
Figura 14 - Fibrose na criptococose.
A
B
34
Figura 15 - Padrão inflamatório na criptococose.
Fragmento pulmonar: A) Células epiteliódes e infiltrado linfocitário; B) Célula gigante multinucleada
com leveduras fagocitadas no interior
Figura 16 - Presença de halo na criptococose.
A) Fragmento de língua apresentando estruturas com halo perinuclear de tamanho grande;
B) Fragmento pulmonar demonstrando estruturas com claro pericelular de tamanho pequeno.
A
B
A
B
35
Figura 17 - Destruição total da arquitetura tecidual na criptococose.
7.3.2 Coloração pela prata
Todos os casos foram positivos pela coloração da prata.
De acordo com a Tabela 4, características indicativas da presença de cápsula foi
observada em 28 (77%) casos. Detecção de cápsula íntegra com tamanho normal ocorreu
em 19 (52%) pacientes (Figura 18A). A observação de halos circundantes de tamanho
pequeno, sugerindo infecção por cepas deficientes de cápsula, foi detectada em 9 (35%)
casos (Figura 18B). Verificou-se que em 8 (22%) pacientes há ausência total de estrutura
mucopolissacarídica circundante, sugerindo presença da infecção por fungos totalmente
ausentes de envelope capsular (Figura 19).
Pseudo-hifa, cadeia de leveduras brotantes, elementos semelhantes a tubo
germinativo foram bem delineadas por esta coloração (Figura 20A, Figura 20B e Figura
20C; Tabela 4).
36
Tabela 4 - Distribuição das características micromorfológicas reveladas pela coloração da
prata no Laboratório de Micologia, Santa Casa/Complexo Hospitalar, 1981-2009.
Aspectos micromorfológicos
N
(%)
Cápsula mucopolissacarídica
Presença
Deficiência
Ausência total
19
9
8
52%
25%
22%
Formas não-clássicas
Pseudo-hifa
Cadeia de leveduras brotantes
Tubo germinativo
3
1
1
(8%)
(3%)
(3%)
A escala de quantificação fúngica nos cortes corados pela coloração pela prata
utilizada para quantificação do número de micro-organismos variou de + a ++++. O IB
calculado apresentou valor de 0 a 22. A tabela 5 expressa a distribuição da quantificação
dos elementos fúngicos.
Tabela 5 - Distribuição da quantificação dos elementos fúngicos realizados pela coloração de
GMS.
Escala
Ocorrência dos casos
+
4 (11%)
++
11 (30%)
+++
9 (25%)
++++
12 (33%)
37
Figura 18 - Tamanho do halo perinuclear na criptococose
A) Fragmento de linfonodo apresentando leveduras com halo claro perinuclear bem definido;
B) Fragmento da língua, mostrando leveduras com tamanho pequeno.
Figura 19 - Criptococose por fungo totalmente deficiente de cápsula.
.
Fragmento de linfonodo apresentando leveduras totalmente desprovidas de material capsular.
A
B
38
Figura 20 - Formas não-clássicas do Cryptococcus.
Fragmento de linfonodo em paciente HIV positivo. A) Pseudo-hifa; B) Estruturas semelhantes a tubo
germinativo; C) Cadeia de leveduras brotantes. As figuras A, B e C também apresentam formas usuais
com cápsula bem definida.
7.3.3 Coloração de Mucicarmim de Mayer
O cálculo do número de micro-organismos por meio da coloração de MM variou de
0 a ++++. O escore 0 esteve presente em 8 (22%) pacientes. Nestes, o diagnóstico da
criptococose foi considerado inconclusivo. Esses casos compreendem isolados clínicos
deficientes ou totalmente ausentes de cápsula. A Tabela 6 revela a distribuição dos casos e
dos escore. A Figura 21A mostra pseudo-hifa com material polissacarídico de tamanho
pequeno. A Figura 21B apresenta as leveduras com cápsula corada na cor magenta. A
Figura 21 C e D apresenta as leveduras em cadeia. A Figura 21E apresenta pesudo-hifa.
A
B
C
39
A quantificação do IC compreendeu-se em um intervalo de 0 a 4. Este é diretamente
proporcional a existência e ao tamanho do polissacarídico capsular corado pela cor
magenta.
Tabela 6 – Frequência entre os casos e escala pela coloração de MM.
Morfotipos
Escala
Distribuição dos casos
Sem cáspula
0
8 (22%)
Cáspular
+
10 (28%)
++
4 (11%)
+++
6 (17%)
++++
8 (22%)
40
Figura 21 - Cápsula corada na cor magenta pela coloração de MM.
A) Fragmento de baço apresentando levedura com cápsula pequena e pseudo-hifa corada na cor
magenta; B) Fragmento de lesão tumoral na axila esquerda mostrando Cryptococcus gattii com cápsula
grande intensamente corada; C e D) Cadeias de leveduras brotantes em lesõa tumoral da axila
esquerda; E e F)) Pesudo-hifa em biópsia de linfonodo.
A
B
C
D
E
F
41
7.3.4 Coloração de Fontana-Masson
Em 100% das amostras, n=36, a coloração de FM revelou-se positiva. A reação para
pigmentos de melanina na parede celular fúngica em todos estes casos apresentou
independência quanto a existência (Figura 22A) ou ausência (Figura 22B e Figura 22C) e
tamanho do polissacarídico capsular.
Figura 22 - Coloração de Fontana-Masson na criptococose.
A, B e C) Fragmentos de pulmão de 3 pacientes transplantados pulmonares.
A
B
C
42
7.4 ATIVIDADE BIOLÓGICA
7.4.1 Criptococose reativa e paucireativa
Na categoria reativa, os números de micro-organismos variaram de escassos (+) a
abundantes (++++). Estes casos apresentaram escore +++ (7 casos) como o mais freqüente
(Figura 23). A média do IB dos organismos foi 8,64 brotamentos (intervalo de 0 a 20). O
IC mostrou variação, apresentando quantificações baixas, sendo o escore mais freqüente o
+ (6 casos) (Figura 24A) . Quatro casos demonstraram IC igual a zero (Figura 24B).
A Tabela 7 revela a atividade biológica na criptococose reativa.
A categoria paucireativa houve predomínio dos escores mais altos. Nove casos
apresentaram o escore ++, seguido de 8 casos o escore ++++ (Figura 25). Logo, verifica-se
grande número de leveduras nas lesões, quando comparados a categoria reativa. A média
do IB foi 6,0 brotamentos (intervalo amplo de variação entre 0 a 22); em muitos casos
apresentou menos que 5% de formas brotantes. O IC mostra uma maior quantificação,
quando comparados a categoria reativa (Figura 26A, 26B, 26C, 26D). Nesta categoria,
muitos casos apresentaram alta quantificação de IB, os quais também revelaram alta
quantificação de IC.
A Tabela 8 apresenta a atividade biológica na criptococose paucireativa.
43
Tabela 7 - Atividade biológica na criptococose reativa por meio de IB e IC.
Casos
Espécime
clínico
Número de micro-
organismos
IB
IC
1
Pulmão
++++
15
0
2
Pulmão
+++
5
+
3
Pulmão
++
2
+++
4
Pulmão
+++
15
++++
5
Pulmão
++++
20
0
6
Pulmão
+++
15
0
7
Pulmão
+++
8
+
8
Pulmão
+
4
+
9
Pele
+++
3
+
10
Pulmão
++
2
++++
11
Pulmão
++++
12
+
12
Pulmão
++++
16
+
13
Pulmão
+++
4
0
14
Pulmão
+++
0
++++
44
Tabela 8 - Atividade biológica na criptococose paucireativa por meio de IB e IC.
Casos
Espécime clínico
Número de micro-organismos
IB
IC
1
Pulmão
++
2
++++
2
Pulmão
++
5
+
3
Pulmão
++
2
+++
4
Axila esquerda e
parede torácica anterior
++++
4
++++
5
Pulmão
++
7
++
6
Medula
++
2
++
7
Baço
+++
12
+++
8
Pulmão
++
2
0
9
Linfonodo
++
7
++++
10
Linfonodo
++++
4
+++
11
Língua
+
1
++
12
Pele
++++
1
0
13
Pele
++++
4
0
14
Pulmão
+++
3
+++
15
Pulmão
++
5
+++
16
Linfonodo
++++
3
0
17
Linfonodo
++++
19
++++
18
Linfonodo
++++
22
++++
19
Fígado
++++
0
+
20
Linfonodo
++
12
++
21
Fígado
+
0
+
22
Linfonodo
+
10
+
45
Figura 23 – Quantificação de elementos fúngicos em fragmento pulmonar corado pelo GMS,
evidenciando-se o padrão correspondente ao escore +++.
Figura 24 - Índice carminofílico na criptococose reativa.
A) Fragmento de linfonodo apresentando IC igual a 1; B) Fragmento de pulmão demonstrando
leveduras com IC igual a zero (resultado insatisfatório).
A
B
46
Figura 25 - Número de micro-organismos e IB por meio da coloração da prata.
Fragmento de pele: Número de organismos igual a ++++; IB igual a 6.
Figura 26 - IC por meio da coloração de MM na criptocoocose paucireativa.
Fragmentos de lesão tumoral na axila esquerda e parede toráccica anterior. A, B e D apresentam IC
igual a4; C demonstra IC igual a 4 e levedura brotante.
A
B
C
D
47
8 DISCUSSÃO
8.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE DADOS CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICOS ESTUDADOS
Como observado por outros autores (COLOM et al., 2001; DIAZ et al., 2005;
MIRZA et al., 2003), pacientes do sexo masculino foram predominantes no nosso estudo.
Na era da Aids, a criptococose acompanha a distribuição de sexo na infecção do HIV. Por
sua vez, o sexo masculino comporta-se como uma condição predisponente. No entanto,
com a feminização mundial da Aids, esta situação está sujeita a alterações. Em pacientes
sem Aids mantêm-se o predomínio de homens porém, em uma proporção menor.
A predominância da criptococose na terceira e quarta década de vida, coincide com
a média de idade, na qual a HIV é mais prevalente, o que corresponde a 39% dos nossos
pacientes. Ainda constituem os dois extremos de idade: o inferior, pacientes pediátricos
acometidos por C. gattii; e o superior, casos que demonstram condições clínicas da quinta e
sexta década de vida, como doenças oncológicas e transplantes. Um outro importante fator
predisponente associado é o uso de drogas imunossupressoras (GAL et al., 1986; JARVIS
& HARRISON, 2008).
De acordo com o MINISTÉRIO DA SAÚDE (1999), a criptococose ocorre como
primeira manifestação oportunista em cerca de 4,4% dos casos de Aids no Brasil. No nosso
estudo, o índice foi elevado, sendo esta característica observada em 46% da série.
O pulmão é a porta de entrada para a infecção fúngica, sendo o órgão mais
frequentemente envolvido. O envolvimento pulmonar varia desde infecção nodular
assintomática a síndrome de dificuldade respiratória grave (ARDS) (SUBRAMANIAN,
2005). Após a inalação do fungo, é desencadeada uma resposta imune, elemento que
determina o curso da infecção (CAMERON et al., 1991). O organismo apresenta uma
predileção especial para o SNC (neurotropismo), indicando disseminação fúngica via
hematogênica. Dependendo deste comprometimento revela-se os quadros da doença:
meningite, encefalite ou meningo-encefalite. A maioria dos casos apresentam-se como
meningite. Em um estudo no Brasil sobre complicações neurológicas em pacientes HIV
48
positivos, o Cryptococcus foi responsável por 12,9% delas. Manifestações extra-
pulmonares e extraneurais também são observadas, especialmente naqueles infectados pelo
HIV ou naqueles em terapia imunossupressora. Linfonodos (GAZZONI et al., 2009; WITT,
1987), mucosa oral (GAZZONI et al., 2009; SAMARANAYAKE, 1992), pele (DORA et
al., 2006; MOE et al., 2005; REVENGA et al. 2002), baço (CASADEVALL & PERFECT,
1998), fígado (GOLLAN et al., 1972; PROCKNOW et al., 1965) e medula (CASDEVALL
& PERFECT, 1998) também são sítios alvos da disseminação do Cryptococcus.
Entre os principais métodos de obtenção do espécime clínico está a biópsia
cirúrgica. Destaca-se nesta série a ausência de espécime clínico oriundos de necropsia.
A detecção do antígeno capsular do Cryptococcus pela aglutinação do látex é
realizada no sangue, urina, líquor (LCR) e lavado brônquico alveolar (LBA). Na prática
clínica, a detecção do antígeno é feita no LCR e no soro. Estes dois últimos são positivos
em mais de 90% dos pacientes com meningite criptocóccica. Testes negativos são reflexos
da deficiência de material capsular, já que o teste tem capacidade de detectar concentrações
de polissacarídeo capsular maiores que 10 ng/mL (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
O complexo de espécies Cryptococcus neoformans-Cryptococcus gattii apresenta
habilidade de crescimento a 37° C. As colônias revelam aspectos mucóides (dependendo do
tamanho da cápsula), de coloração que varia de branca a creme, dentro de 48-72 horas, após
cultivo em meios para fungos – SAB a 25° C e BHI a 37° C (MITCHELL & PERFECT,
1995). A discriminação entre as espécies do complexo está baseada na reação de coloração
quando do crescimento em canavanina-azul de bromotimol (CGB) (BOVERS et al., 2008).
À histopatologia as diferenças existentes entre estas espécies são sutis. Todos os casos
identificados como Cryptococcus gattii apresentaram IC igual a ++++, sugerindo que o
Cryptococcus gattii apresenta cápsula de tamanho maior, quando comparada ao
Cryptococcus neoformans. As lesões pela espécie gattii revelaram-se nodulares ou como
massas, ou ainda tumorais bem delimitadas e usualmente não associaram-se a disseminação
para vários órgãos do corpo, fator este associado ao C. neoformans (BOVERS et al., 2008;
SEVERO et al., 1999; SEVERO et al., 1998).
A mortalidade na criptococose é elevada. Sem tratamento a sobrevida é baixa.
Durante o curso terapêutico inicial 10-25% dos pacientes morrem, sendo a mortalidade de
30-60% no primeiro ano (POWDERLY, 1993). Os parâmetros clínicos e laboratoriais
49
preditores de morte durante a terapia inicial incluem alterações do estado mental, títulos
antigênicos no líquor superior a 1:1024 e contagem de linfócitos no líquor inferior a 20
células/µL (SAAG et al., 1992). A hipertensão diastólica, provavelmente reflexo da
hipertensão intracraniana, também está associada a morte precoce nestes doentes (FAN-
HARVARD P, 1992). A manutenção da infecção depende do estado imunológico do
hospedeiro, da forma da doença e do tratamento (GUIDELINE IN CRYPTOCOCCOSIS,
2008). Na nossa casuística, até os três primeiros meses o óbito ocorreu em 50% dos
pacientes. Aponta-se que a criptococose é uma doença fatal e aguda e que se não
diagnosticada e tratada adequadamente sua expectativa de vida é inferior a 3 mês.
8.2 CONSIDERAÇÕES SOBRE A AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
Várias colorações histoquímicas são empregadas na idenficação dos agentes
fúngicos. A coloração de HE é útil no rastreamento fúngico, na observação das alterações
estruturais das lesões, bem como das reações teciduais (GAZZONI et al.,2008).
Conforme estudos de BAKER (1976) e SCHWARTZ (1988), sobre associação entre
estado imune e achados histológicos, granulomas imunológicos associam-se a
imunocompetentes. Imunocomprometidos tendem a apresentar aspecto difuso, lesões
gelatinosas e reação paucireativa (SHIBUYA et al., 2005). É importante valorizar o estado
imunológico do paciente, já que o seu déficit condiciona o grau de resposta inflamatória.
Ainda há uma série de fatores que favorecem a observação das tais características teciduais
como: virulência, quantidade de células fúngicas e coexistência com outras enfermidades
(ARTAL, 2004).
A coloração pela prata é útil no estudo da micromorfologia fúngica (GAZZONI et
al., 2008). A quantificação de IB é realizada através desta coloração, indicando replicação
in vivo, o qual serve de base para a quantificação da atividade biológica da criptococose
(SCHWARTZ, 1988). Na casuística estudada, esta colorações identificou uma variação do
tamanho do espaço perinuclear sugestivo de cápsula.
50
As espécies de Cryptococcus raramente produzem pseudo-hifa (GAZZONI et al.,
2009). A ausência desta característica é um dos critérios propostos para a identificação do
Cryptococcus e um dos principais aspectos utilizados para diferenciar a criptococcose da
candidose (GAZZONI et al., 2009). Em uma revisão em pacientes com Aids, os autores
sugerem que a distinção entre o Cryptococcus e as espécies de Candida está baseada na
presença da cápsula do Cryptococcus, na forma esférica da levedura, pelos brotamentos em
estreita base e pela ausência de pseudo-hifa (GALL et al., 1986). No entanto, como
mostramos neste trabalho, características não-usuais como pseudo-hifa, cadeias de
leveduras brotantes e estruturas semelhantes a tubo germinativo, além elementos
leveduriformes deficiente de cápsula foram identificados durante a infecção. Essas
características são facilmente evidenciadas pelas técnicas especiais de GMS e MM (salvo
as estruturas desprovidas de material capsular pelo MM), realizada tanto em esfregaços
como em cortes de tecidos (GAZZONI et al., 2008; GAZZONI et al., 2009).
Entretanto, algumas colorações histoquímicas possuem seletividade a determinados
agentes fúngicos, sendo estas utilizadas para diagnóstico diferencial. O diagnóstico da
criptococose sustenta esta hipótese. A coloração de MM detecta a cápsula
mucopolissacarídica da levedura. Quantificação dos IC é realizada por meio desta
coloração, e indica síntese capsular in vivo, que juntamente com o IB formam a escala que
determina a atividade biológica da criptococose. Na coloração de FM, utilizada nos
resultados inconclusivos pelo MM, quando da infecção por Cryptococcus deficiente de
cápsula. Estas técnicas são específicas para o diagnóstico deste fungo e devem ser
utilizadas em associação ao HE e a coloração pela prata. Este protocolo de colorações
sustenta a distinção do Cryptococcus de outros organismos similares em tamanho e forma.
A tabela 9 apresenta as características morfológicas de algumas leveduras e de algumas
formas leveduriformes permitindo a comparação com a micromorfologia do Cryptococcus.
51
Tabela 9 - Características micromorfológicas das leveduras.
Organismos
Tamanho
Forma
Brotamentos
Pseudohypha/
Hifa
Núcleo
Parede
celular
Mucicarmine
stain
Coccidiodes
Esférulas-
Endosporos
2-5 µm
Esféricos
a ovais
Endosporos
Raros
Único
Grosseira
Negativo
Histoplasma
capsulatum
2-4 µm
Ovais
Raramente
com
brotamento
únicos
Não
Único
Grosseira
Negativo
Capsular
Positivo
Cryptococcus
2-20 µm
Esféricos
a ovais
Únicos ou
múltiplos
Formas não-
clássicas
Único
Desprovido*
de cáspula
Inconclusivo*
Candida SP
2-6 µm
Esféricos
a ovais
Únicos,
múltiplos,
cadeias
Usualmente
Único
Grosseira
Negativo
Candida
glabrata
2-5 µm
Esféricos
a ovais
Únicos
Ausente
Único
Grosseira
Negativo
*: Indicação para o uso da coloração de Fontana-Masson sustentando a hipótese de diagnóstico
diferencial; µm: micromêtros.
8. 3 CONSIDERAÇÕES SOBRE ATIVIDADE BIOLÓGICA
Nos 22 casos da infecção paucireativa estudados, todos demonstraram ausência de
células inflamatórias, bem como grande número de leveduras dispersas nos tecidos. Estas
52
informações indicam alteração na resposta imune celular. A maioria dos casos apresentam
altos ICs. Este dado suporta a hipótese de que os elementos fúngicos estejam viáveis nestas
lesões, já que há ausência de células inflamatórias e de fagocitose, que na sua presença
promoveriam a morte fúngica. Dessa forma, há uma relação inversa entre alta produção
capsular e menor intensidade da resposta inflamatória (CASADEVALL & PERFECT,
1998; PERFECT & CASADEVALL, 2002; SCHWARTZ, 1998).
O IB apresentou variação e muitos casos demonstraram menos que 5% de formas
brotantes, suportando o fato de que o IB é análogo ao índice mitótico das células dos
mamíferos, sendo indicativo da atividade divisional das leveduras (SCHWARTZ, 1988),
que por sua vez, variaram, mas que apresentou-se relativamente diminuída na infecção
paucireativa. Atividade criptocóccica nos tecidos é afetada pela grande carga fúngica, e que
após promoverem a destruição total da arquitetura tecidual, essa atividade divisional das
leveduras estabilizam-se (ARTAL, 2004; SCHWARTZ, 1988). Esta afirmação é
semelhante àquela presente na população fúngica nos cultivos. Muitos organismos
apresentam fase logarítmica de crescimento e após o pico, a densidade fúngica tende a se
equilibrar (SCHWARTZ, 1988).
Dos 14 casos da infecção reativa estudados, todos apresentaram resposta
granulomatosa caracterizada pela presença de células gigantes, variável infiltração
inflamatória e fibrose. Estas características demonstram-se em proporções variáveis.
Comparados a categoria paucireativa, as leveduras apresentaram-se intracelulares aos
histiócitos e células gigantes, consistente com resposta imune ativa e fagocitose efetiva. A
variação do IB e IC, influenciada pela intensidade e duração da resposta inflamatória,
determina a viabilidade e a atividade divisional das leveduras (CASADEVALL &
PERFECT, 1998; SCHWARTZ, 1988). Nesse contexto, a resposta granulomatosa associa-
se ao controle da infecção (SCHWARTZ, 1988; PERFECT & CASADEVALL, 2002). Os
quatro casos de IC igual a zero é reflexo da presença de fungos deficientes de cápsula, estes
demonstraram altas quantificações de IB. Há inviabilidade fúngica naqueles casos em que
há baixas quantificações de IC e IB.
53
9 CONCLUSÃO
Neste trabalho, descreveu-se os aspectos histopatológicos da infecção criptocóccica
através das técnicas básicas de HE e GMS, bem como das colorações especiais de MM e
FM. Além disso, comprovou-se a eficácia das colorações histoquímicas, que devem ser
utilizadas em conjunto.
No que diz respeito a atividade biológica da doença, a interpretação dos sítios
infecciosos pelas técnicas de GMS e MM, servem de base para quantificação dos índices de
brotamento e carminofílico. Estes índices são representativos da atividade divisional da
levedura e da síntese capsular do microrganismo, respectivamente. Dessa forma, estes
índices devem compor os laudos médicos, oferecendo informações adicionais, que
contribuem para o tratamento e manuntenção da infecção.
Nesse contexto, a histopatologia tranforma-se um dos principais métodos de
diagnóstico para identificação laboratorial da criptococose, quando da imersão dos
espécimes clínicos em formol.
54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. ALFONSO, F. ; GALLO, L.; WINKLER, B.; SUHRLAND, M.J. Fine needle
aspiration cytology of peripheral lymph node cryptococcosis. A report of three
cases. Acta Cytol., 38: 459-462, 1994.
2. ARTAL, E. M. Diagnóstico histopatológico de las micosis. Rev. Iberoam.
Micol., 212: 1-9, 2004.
3. BAKER, R. D. & HAUGEN, R. K. Tissue changes and tissue diagnosis in
cryptococcosis. Clin. Pathol., 25: 14-24, 1955.
4. BERLIN, L. & PINCUS, J. H. Cryptococcal meningitis. False-negative antigen
results and cultures in nonimmunosuppressed patients. Arch. Neurol., 46: 13 in
12-1316, 1989.
5. BLOMMFIELD, N.; GORDON, M.A.; ELMENDORF, D. F. Detection of
Cryptococcus neoformans antigen body fluids by latex particle agglutination.
Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 114: 64-67, 1963.
6. BOTTONE, E.J.; TOMA, M.; HOHANSSON, B.E.; WORNMSER, G.P. Poorly
encapsulated Cryptococcus neoformans from patients with AIDS. I: Preliminary
observation. AIDS Res., 2: 211-217, 1986.
7. BOVERS, M.; HAGEN, F.; BOEKHOUT, T. Diversity of the Cryptococcus
neoformans-Cryptococcus gattii species complex. Rev. Iberoam. Micol., 25: 4-
12, 2008.
8. CALVO, B.; BARTELETT, J. A.; GALLIS, H. A. Manifestations of pulmonary
cryptococcosis in patients with acquired immunodeficiency syndrome. Rev.
Infect. Dis., 13: 64-67, 1991.
9. CASADEVALL, A & PERFECT, J. R. Cryptococcus neoformans. 1.ed.
Washington: Asm Press, 1998.
10. CHANDLER, F.W.; WATTSS, J. C. Cryptococcosis. In: CONNOR, D. H.;
CHANDLER, F. W.; SCHWARTZ, D. A.; MANZ, H. J. LACK, E. E.; BARD,
J. K. UTZ, J. P. (eds). Pathologic of infectious disease. Stamford: Appleton &
Lenge Press, Cap. 160, 989-1001, 1989.
11. CAMERON, M. L.; BARTLETT, J. A.; GALLIS, H. A.; WASKIN, H. A.
Manifestions of pulmonary cryptococcosis in patients with acquired
immunodeficiency syndrome. Rev. Infect. Dis., 13: 64-67, 1991.
55
12. COLOM, M. F.; FRASÉS, S.; FERRER, C. Estudio epidemiológico de La
criptococose em España: primeiros resultados. Rev. Iberoam. Micol., 18: 99-
104.
13. CÔRREA, M. P. S.; OLIVEIRA, E. C.; DUARTE, R. R. B. S.; PARDAL, P. P.
O.; OLIVEIRA, F. M.; SEVERO, L. C.; Criptococose em crianças no Estado do
Pará, Brasil. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 32: 505-508, 1999.
14. COX, L. B. TOLHURST, J. C. Human tolurosis. Melbourne: University Press,
1946.
15. DIAZ, M. R.; BOEKHOUT, T.; KIESLING, T.; FELL, J. W.; Comparative
analysis of the intergenic spacer regions and population structure of the species
complex of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans. FEMS Yeasts Res., 5:
1129-2005.
16. DORA, J. M.; KELBERT, S.; DEUSTSCHENDORF, C.; CUNHA, V. S.;
AQUINO, V. R.; SANTOS, P. S.; GOLDANI, L. Z. Cutaneous cryptococcosis
due to Cryptococcus gattii in immunocompetent hosts: case report and reviwe.
Mycopathologia 161: 235-238, 2006.
17. EDWARDS, M. R.; GORDON, M.A.; LAPA, E. W.; GHIORSE, W. C.
Micromorphology of Cryptococcus neoformans. J. Bacteriol., 94: 766-777,
1967.
18. FAN-HARVARD, P.; YAMAGUCHY, E.; SMITH, S. M.; ENG, R.H. Diastolic
hypertension in AIDS patients with cryptococcal meningitis. Am. J. Med. 93:
347, 1992.
19. FARMER, S. G.; KOMOROWSKI, R. A. Histologic response to capsule-
deficient Cryptococcus neoformans. Arch. Pathol., 96: 383-387, 1973.
20. FREED, E. R. DUMA, R. J.; SHADOMY, J.; UTZ, J. P.Meningoencephalitis
due to hyphae-formingaa due to hyphae-forming Cryptococcus neoformans.
Am. J. Clin. Pathol., 55: 30-33, 1971.
21. GALL, A. A. KOSS, M.N.; HAWKINS, J.; EVANS S.; EINSTEIN, H.The
pathology of pulmonary cryptococcal infections in the acquired
immunodeficiency syndrome. Arch. Pathol. Lab. Med., 110: 502-507, 1986
22. GAZZONI, A. F.; PEGAS, K. L.; SEVERO, L. C. Histopathological techniques
for diagnosis cryptococcosis deu to capsule-deficient Cryptococcus: case report.
Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 41 (1): 76-78, 2008.
23. GAZZONI, A. F.; SEVERO, B. C.; BARRA, M. B.; SEVERO, L. C. Atypical
micromorphology and uncommon location of cryptococcosis: a histopathologic
56
study using special histochemical techniques (one case report).
Mycopathologia, 167: 197-2009, 2009.
24. GOLLAN, J. L.; DAVIDSON G. P.; ANDERSON, K. Visceral cryptcoccosis
without central nervous system or pulmonary involvement: presentation as
hepatitis. Med J. Aust., 1: 5469-471, 1972.
25. GORDON, M. A. & DEVINE, J. Filamentation and endogenous sporulation in
Cryptococcus neoformans. Sabouraudia 8: 227-234, 1970.
26. GROCOTT, R.G. A stain for fungi in tissue sections and smears using Gomori’s
methenamine-silver nitrate technic. Am. J. Clin. Pathol., 25: 975-979, 1955.
27. GUIDELINE in cryptococcosis. Uberaba: Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical, 2008.
28. GUTIERREZ, F.; FU, Y. S.; LURIE, H. Cryptococcosis histologically
resembling histoplasmosis. A light and electron microscopical study. Arch.
Pathol., 99: 347-352, 1975.
29. HARDING, S.A.; SCHELD, W.M.; FELDMAN, P.S.; SANDE, M. A.
Pulmonary infection with capsule-deficient Cryptococcus neoformans.
Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histol., 382: 113-118, 1979.
30. HEENAN, P.J.; DAWKINS, R.I. - Cryptococcosis and multiple squamous cell
tumors associated with a T-cell defect. Cancer, 47: 291-295, 1981.
31. HELOU, S.; ROBLES, A.M.; ARECHAVALA, A.; BIANCHI, M.I.;
NEGRONI, R. Criptococcosis respiratoria en pacientes VIH positivos. Rev.
Iberoam. Micol. 16: 126-129, 1999.
32. JARVIS, J. N. & HARRISON, T. S. Pulmonary cryptococcosis. Semin. Respir.
Crit. Care. Med., 29: 141-150 2008.
33. KERKERING, T. M.; DUMA, R. J.; SHADOMY, S.; VIRGINIA, R. The
evolution of pulmonary cryptococcosis. Ann. Intern. Med., 94: 611-616, 1981.
34. KIMURA, M.; FURUTA, T.; TERAMURA, K.; SATOU, T. Pseudohyphae of
Cryptococcus in a cytlogic specimen. Acta Cytol., 42: 817-818, 1998.
35. KWON-CHUNG, K. J. & BENNETT, J. E. Epidemiologic differences between
the two varieties of Cryptococcus neoformans. Am. J. Epidemiol., 120: 123-
140, 1984.
36. KWON-CHUNG, K. J.; HILL, W. B.; BENNETT, J. E. - New, special for
histopathological diagnosis of cryptococcosis. J. Clin. Microbiol., 13: 383-387,
1981.
57
37. LACAZ, C.S.; PORTO, E.; MARTINS, J.E.C.; HEINS-VACCARI, E.M.;
MELO. N.T.; Tratado de Micologia Médica. São Paulo, Sarvier, 1998.
38. LAZCANO, O. ; SPEIGHTS, V.O.; STRICKLER, J.G.; BILBAO, J. E.;
BECKER, J.; DIAZ, J. Combined histochemical stains in the differential
diagnosis of Cryptococcus neoformans. Modern. Pathol., 6: 80-84, 1993.
39. LAZCANO, O.; SPEIGHTS, V. O. JR.; BILBAO, J.; BECKER, J.; DIAZ, J.
Combined Fontana-Masson-Mucin staining of Cryptococcus neoformans. Arch.
Pathol. Lab. Med., 115: 1149, 1991.
40. LITTMAN, M. L.; ZIMMERMAN, L. E. Cryptococcosis. New York & London:
Grune & Stratton, 1956.
41. LEVINSON, D.J.; SILCOX, D.C.; RIPPON, J.W.: THOMSEN, S. - Septic
Arthritis due to nonencapsulated Cryptococcus neoformans with coexisting
sarcoidosis. Arthritis and Rheum., 17: 1037-1047, 1974.
42. LOVE, G. L.; BOYD, G. D.; GREER, D.L. Large Cryptococcus neoformans
isolated form brain abscess. J. Clin. Microbiol., 22: 1068-1070, 1985.
43. LURIE, H. I. SHADOMY, H. J. Morphological variations of a hypha-forming
strain of Cryptococcus neoformans (coward strain) in tissues of mice.
Sabouraudia, 9: 10-4.
44. MILCHGRUB, S.; VISCONTI, E.; AVELLINI, J. Granulomatous prostatitis
induced by capsule-deficient cryptococcal infection. J. Urol., 143: 365-366,
1989.
45. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Programa nacional de doenças sexualmente
trasnmissíveis. Ministério da Saúde, Brasília, DF, Ano I: 44, 1999.
46. MIRZA, S. A.; PHELAN, M.; RIMLAND, D.GRAVISS, E.; HAMILL, R.;
BRANDT, M. E. The changing epidemiology of cryptococcosis: an uddate from
population-based active surveillance in 2 large metropolitan areas, 1992-2000.
Clin. Infect. Dis., 36: 789-794, 2003.
47. MITCHELL, T. G. & PERFECT, J. R. Cryptococcosis in the era of AIDS-100
years after the discovery of Cryptococcus neoformans. Clin. Microbiol. Rev.,
8: 515-548, 1995.
48. MOE, K.; LOTSIKAS-BAGGILI, A.; KUPIEC-BANASIKOWSKA, A.;
KAUFFMAN, C.L. The cutaneous predilection of disseminated cryptococcal
infection in organ transplant recipiens. Arch. Dermatol., 141: 913, 2005.
58
49. MORSE, J. Approaches to qualitative-quantitative methodological triangulation.
Nurs. Res., 40(1): 120-132, 1991
50. MUKAE, H.; IWAMOTO, M.; KINOSHITA, A.; TAKASE, T.; MORI, N.;
ISHINO, T.; KOHNO, S.; YAMAGUCHI, K.; HIROTA, M.; HARA, K. A case
of sepsis and meningitis due to capsule-deficient Cryptococcus neoformans with
SIADH. Kansenshogaku Zasshi 63: 1206-1211, 1989.
51. NEILSON, J. B.; FROMTLING, R. A.; BULMER, G. S.; Pesudohyphal forms
of Cryptococcus neoformans: descreased survival in vivo. Mycopathologia, 73:
57-59, 1981.
52. NEILSON, J. B. IVEY, M. H.; BULMER, G. S. Cryptococcus neoformans:
pseudohyphal forms surviving culture with Acanthamoeba polyphaga. Infec.
Imm., 20: 262-266, 1978.
53. NEVES, J. L. Pesquisa qualitative – características, uso e possibilidades.
Cadern. Pesq. Adm., 1(3): 3-10, 1996.
54. POWDERLY, W.G. Cryptococcal meningitis and AIDS. Clin Infect. Dis., 17:
837-842, 1993.
55. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Core Health Indicators. WHO
statistical information system (WHOSIS). Genebra: Organização Mundial da
Saúde, 2007;
56. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Doenças oportunistas
relacionadas com o HIV. Actualização técnica. Genebra: Organização
Mundial da Saúde, 2002.
57. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Doenças oportunistas
relacionadas com o HIV. Actualização técnica. Genebra: Organização
Mundial da Saúde, 2007.
58. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Epidemiological fact sheets on
HIV/AIDS and sexually transmitted infections. Genebra: Organização
Mundial da Saúde, 2006.
59. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. O acesso aos medicamentos.
Atualização técnica. Genebra: Organização Mundial da Saúde, 1998.
60. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Ten statistical highlights on
global public health. Genebra: Organização Mundial da Saúde, 1998.
61. ÓHARA, M. Histopathologic diagnosis of fungal diseases. Infect. Control., 2:
78-84, 1986.
59
62. PAPPALARDO, C. S. M. M. & MELHEM, S. C. M.; Cryptococcosis: a review
of the brazilian experience for the disease. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo,
45: 299-305, 2003.
63. PASCHOAL, R. C.; MELHEM, M. S. C.; GUELLI, T.; SZESZS, M. W.
Atypical cryptococcus neoformans cells isolated from cerebrospinal fluid
samples. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 66: 78-80, 2007.
64. PERFECT, J.R.; CASADEVALL, A. - Cryptococcosis. Infect. Dis. Clin. N.
Am., 16: 837-874, 2002.
65. PROCKNOW, J J.; BENFIELD, J. R.; RIPPON, J. W. Cryptococcal hepatitis
presenting as surgical mergency. JAMA 191: 269-274.
66. REGISTROS BRASILEIROS DE TRANSPLANTS (São Paulo, SP). Edição
comemorativa. 10 anos dos Registros Brasileiros de Transplantes. São
Paulo. 2007
67. REGISTROS BRASILEIROS DE TRANSPLANTES (São Paulo, SP).
Aumento, menor que o planejado. São Paulo, 2008.
68. REVENGA, F.; PARICIO, J. F.; MERINO, F. J.; NEBREDA, T.; RAMÍREZ,
T.; MARTINEZ, A. M. Primary cutaneous cryptococcosis in an
immnucompetent host: case report and review of the literature. Dermatol., 204:
145-149, 2002.
69. RO, J.Y. LEE, S.S.; AYALA, A.G. Advantage of Fontana-Masson stain in
capsule-deficient cryptococcal infection. Arch. Pathol. Lab. Med., 111: 53-57,
1987.
70. SAAG, M.S.; POWDERLY, W.G.; CLOUD, G.A. NIAID Mycosis Study
Group an d the AIDS Clinical Trails Group: Comparison of amphotericin B with
fluconazol in the treatment of acute AIDS-associated cryptococcal meningitis.
N. Engl. J. Med 326: 83-89, 1992.
71. SAMARANAYAKE, L. P. Oral mycoses in HIV infection. Oral Surg. Oral
Med Oral Pathol., 73: 171-180, 1992.
72. SCHWARTZ, D.A. Characterization of the biological activity of Cryptococcus
infections in surgical pathology. The budding index and carminophilic index.
Ann. Clin. Lab. Sci., 18: 388-397, 1988.
73. SEVERO, L. C.; MATTOS OLIVEIRA, F.; LONDERO, A. T. Cryptococcosis
due to Cryptococcus neoformans var. gattii in Brazilian patients with AIDS.
Report of a three cases. Rev. Iberoam. Micol., 16: 152-154, 1999.
60
74. SEVERO, L. C.; LONDERO, A. T.; MARTINS, S.C.; REOLON, M.; GEYER,
R.G. Provável criptococose pulmonar causada por Cryptococcus neoformans
não-capsulado. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 23: 283-286, 1981.
75. SEVERO, L. C.; OLIVEIRA, F.M.; SILVA, V.B.; Diferenças clínicas,
epidemiológicas e ecológicas entre as duas variedades do Cryptococcus
neoformans. Rev. Médica Sta. Casa, 9: 1672-1686, 1998.
76. SHADOMY, H. J. LURIE, H. I. Histopathological observations in experimental
cryptococcosis caused by a hypha-producing strain of Cryptococcus neoformans
(coward strain) in mice. Sabouraudia, 9: 6-9, 1971.
77. SHADOMY, H.J.; UTZ, J. P. Preliminary studies on a hypha-forming mutant of
Cryptococcus neoformans. Mycologia, 58: 383-390, 1966.
78. SHIBUYA, K,; COULSON, W.F.; WOLLMAN, J.S.; WAKAYAMA, M.;
ANDO, T. et al. - Histopathology of cryptococcosis and other fungal infections
in patients with acquired immunodeficiency syndrome. Int. J. Infect. Dis., 5:
78-85, 2001.
79. SHIBUYA, K.; COULSIN, W.F.; NAOE, S. - Histopathologic of deep-seated
fungal infections and detailed examination of granulomatous response against
cryptococci in patients with acquired immunodeficiency syndrome. Jpn. J.
Med. Mycol., 43: 143-151, 2002.
80. SHIBUYA, K.; HIRATA, A.; OMUTA, J.; SUGAMATA, M.; KATORI, S.
Granuloma and cryptococcosis. J. Infect. Chemother., 11: 115-122, 2005.
81. SIGIURA, Y.; HOMMA, M.; YAMAMOTO, T.Difficulty in diagnosis chronic
meningitis caused by capsule-deficient Cryptococcus neoformans. J. Neurol.
Neurosurg. Psychiatry., 76: 1460-1461, 2005.
82. SUBRAMANIAN, S. D. M. Clinical manifestations and management of
cryptococcal infection. J. Postgrad. Med., 51: 21-26, 2005.
83. THE CENTER FOR FOOD SECURITY & PUBLIC HEALTH.
Cryptococcosis: torulosis, European blastomycosis, Busse-Buschke’s disease.
The Center for Food Security & Public Health, Iowa. 2005, p.1-7.
84. TRAVIS, W. D.; COLBY, T. V.; KOSS, M. N.; ROSADO-DE-
CHRISTENSON, M. L.; MULLER, N. L.; KING, T. E.; Lung Infections. In:
TRAVIS, W. D.; COLBY, T. V.; KOSS, M. N.; ROSADO-DE-
CHRISTENSON, M. L.; MULEER, N. L.; KING, T. E. (eds.). Non-neoplastic
disorders of the lower respiratory tract. Washington: American Registry of
Pathology, Cap. 8.p. 600-605, 2002.
61
85. TORRES, H.A.; PRIETO, V.G.; RAAD, I.I.; KONTOYIANNIS, D.P. - Proven
pulmonary cryptococcosis due to capsule-deficient Cryptococcus neoformans
does not differ clinically from proven pulmonary cryptococcosis due to capsule-
intact Cr. Neoformans. Mycoses, 48: 21-24, 2005.
86. WATTS, J. C. & CHANDLER, F.W. Infection by capsule-deficient cryptococci
(letter). Arch. Pathol. Lab. Med., 111: 688-689, 1987.
87. WILLIAMSON, J. D. SILVERMAN, J. F.; MALAK, C. T.; CHRISTIE, J. D.
Atypical cytomorphologic appearance of Cryptococcus neoformans. A report of
five cases. Acta Cytol., 40: 363-370, 1996.
88. WITT, D.; McKAY, D.; SCHWAN, L.; GOLDSTEIN, D.; GOLD, J. Acquired
immune deficiency syndrome presenting as bone marrow and mediastinal
cryptococcosis. Am. J. Med., 82: 149, 1987.
62
APÊNDICE A
FICHA DE COLETA DE DADOS HISTOPATOLÓGICOS
63
Nome:
Caso: __________ Cryptococcus Cn Cg
AP: Data:
Órgão: Fragmento de tecido:
Doença predisponente: ...................................................................
AIDS: Sim ( ) Não ( )
Transplante: Sim ( ) Não ( ) Órgão:_____________ Tempo: ______________
Outras: _________________________________________________________________
Envolvimento: Pulmão: Sim ( ) Não ( ) SNC: Sim ( ) Não ( )
Disseminada: Sim ( ) Não ( )
Biópsia: Peça cirúrgica: Autopsia:......................................
Cavitação: Calcificação: Fibrose:
Categorias histológicas: Reativa ( ) Paucireativa ( ) Sem reação: ( )
Granulomatosa: Necrose caseosa: ( ) Sarcóide: ( ) Supurativa: ( )
Gelatinosa: ( )
Halo: Presença: ( ) Ausência: ( )
Células inflamatórias: Macrófago: ( ) Célula Epitelióide: ( )
Linfócito: ( ) Célula Gigante: ( )
Eosinófilo: ( )
Neutrófilo: ( )
Histiócito: ( )
HE
Fagocitose: Cryptococcus intracelular: ( ) Cryptococcus extracelular: ( )
Número de microrganismos*:
GMS
Ìndice de brotamento:
Número de microrganismos*:
MM
Cápsula: Presença: ( ) Ausência: ( )
Índice carminofílico*:
(*:+/++/+++/++++)
FM
Melanina:
Cápsula: Presença. ( ) Ausência: ( )
FM/MM
Melanina:
Titulação do látex: Soro: Líquor: Urina:
Presença de formas atípicas: ________________________________________________
OBS.:____________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
________________________________________________________
64
ANEXO A –
HEMATOXILINA-EOSINA
65
Seqüência da coloração
Desparafinizar, alcoolizar e hidratar
Hematoxilina durante 10 minutos
Lavar em água corrente até azulecer os cortes
Diferenciar rapidamente em álcool-ácido
Lavar em água corrente, por 5 a 10 minutos
Lavar rapidamente em álcool a 95°
Eosina, por 1 a 2 minutos
Diferenciar em álcool a 95°
Desidratar, diafanizar e montar
Interpretação do teste
Núcleos em azul; citoplasmas, fibras colágenas, elásticas e neutrófilos em vermelho
(LACAZ et al., 2002).
66
ANEXO B -
MÉTODO DE COLORAÇÃO PELA PRATA (GMS)
67
Seqüência da coloração:
a) Desparafinar os cortes em estufa a 64°C por 5 min. e passar em álcoois: xilol - 10 min;
álcool 99 °GL - 1 min; álcool 96 °GL - 1 min; após água destilada, para hidratação por 10
min;
b) Ácido crômico 5%: num becker colocar ácido e esquentar até a temperatura de 64
°
C,
após colocar as lâminas dentro por 1 min;
c) Deixe as lâminas esfriarem e lavar com água destilada por 3 vezes;
d) Metabissulfito de potássio 1%: colocar no becker metabissulfito e as lâminas deixando-
as por 1 min;
e) Lavar lâminas com água destilada por 3 vezes;
f) Numa proveta colocar 30 ml de DMSO e em outra 50 ml de H
2
O dest , 4 ml de Borato e
50 ml de MSN. Misturar num becker ambas as soluções (somente quando for usar) e
colocar as lâminas dentro, esquentando até a temperatura de 74°C. Chegando a essa
temperatura, retire todas as lâminas e olhar lâmina controle no microscópio, caso esteja
com coloração boa prossiga, caso contrário, coloque novamente as lâminas na solução
deixando-as por mais 1 min, olhando novamente o controle no microscópio (repetir esta
etapa quantas vezes for necessário);
g) Lavar com água destilada (3 mudas);
h) Cloreto de ouro 0,1%: colocar num becker cloreto de ouro e as lâminas por 1 min;
i) Lavar as lâminas com água destilada por 3 vezes;
j) Tiossulfato de sódio 2%: num becker colocar tiossulfato e lâminas por 1 min;
l) Lavar com água destilada por 3 vezes;
m) Verde Claro (verde luz): num becker colocar verde luz lâminas de 1 min ;
m) Desidratação: álcool 96
°
GL-1 min; álcool 99
°
GL-1 min; xilol: 15 min ou mais (máximo
de 24h); Montar as lâminas com bálsamo do Canadá.
Interpretação do teste
Fungo: bem delineados em marom-negro;
Mucina: amarelo-acinzentado
Parte central das hifas - rosa antigo (marrom-negro)
Cor de fundo - verde claro, mas depende da cor de fundo que utilizar(LACAZ et al., 2002).
68
ANEXO C -
MÉTODO DE MUCICARMIM DE MAYER (MM)
69
Seqüência da coloração
a) Desparafinizar os cortes em esufa a 64° C por 5 min. e passar em álcoois: xilo- 10 min;
álcool 99° GL- 1 min; álcool 96° GL- 1 min; após água destilada, para hidratação por
10 minutos
b) Num becker colocar as lâminas coma mistura de 50mL da solução A com a B por 3 min
para corar;
c) Lavar em água corrente por 5 a 10 min
d) Colocar as lâminas num becker com a solução diluída de mucicarmim por 30 a 60 min
ou por mais tempo (controlar ao microscópio a coloração após 30 min
e) Lavar em água destilada
f) Num becker por a solução de amarelo de metanila a as lâminas por 1 min
g) Lavar em água destilada, após em álcool 95° GL
h) Desidratacão: por a lâminas em álcoois: álcool 96° GL- 1 min; álcool 99° GL- 1 min;
xilol: 15 min ou mais (máximo de 24 horas); montar as lâminas com bálsamo do
Canadá.
Interpretação do teste
Mucina: vermelho intenso a róseo; núcleos: escuros; fundo :amarelo.
Permite a diferenciação do Cryptococcus da maioria dos fungos com igual tamanho e
forma.
Usada para fungos que contêm cápsulas mucoplissacarídicas, pois os reagentes interagem
com a mucina presente nessas cápsulas, resultando numa coloração de rosa a vermelho
intenso, enquanto os núcleos coram-se em negro e demais estrututras em amarelo,
facilitando as formas lipocapsuladas( LACAZ et al., 2002).
70
ANEXO D -
MÉTODO DE FONTANA-MASSON (FM)
71
Sequência da impregnação
a) Desparafinizar, alcoolizar e hidratar
b) Líquido de Fontana durante duas horas a quente (56°C)
c) Lavar bem em água destilada e verificar a impregnação ao microscópio. Lavar
novamente em água destilada
d) Solução de Cajal sobre a lâmina durante dois minutos
e) Fixar em hipossulfito de sódio a 5% durante dois minutos
f) Lavar em água corrente durante 10 minutos
g) Coloracão de fundo pelo carmim ou pelo amarelo de metanila por 1 mim.
h) Desidratar, diafanizar e montar
72
ANEXO E-
ARTIGOS PUBLICADOS
73
74
75
76
77
78
79
80
81
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo