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João Gustavo Corrêa Reis
ANÁLISE DE TRAQUÉIAS HUMANAS
ADULTAS PORTADORAS DE ESTENOSE PÓS-
INTUBAÇÃO: MORFOMETRIA E ESTUDO DA
MATRIZ EXTRACELULAR
ORIENTADORES: PROFESSOR MÁRIO ARY PIRES NETO
DEPARTAMENTO DE ANATOMIA – UFRJ
PROFESSOR RICARDO DE ARY PIRES
DEPARTAMENTO DE ANATOMIA – UFRJ
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas
2008
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ii
Análise de Traquéias Humanas Adultas Portadoras
de Estenose Pós-intubação: Morfometria e Estudo da
Matriz Extracelular
ALUNO: João Gustavo Corrêa Reis
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.
ORIENTADORES: PROFESSOR MÁRIO ARY PIRES NETO
DEPARTAMENTO DE ANATOMIA – UFRJ
PROFESSOR RICARDO DE ARY PIRES
DEPARTAMENTO DE ANATOMIA – UFRJ
Rio de Janeiro
Agosto
2008
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iii
Reis, João Gustavo Corrêa
Análise de traquéias humanas adultas portadoras de estenose pós-intubação: morfometria e
estudo da matriz extracelular / João Gustavo Corrêa Reis – Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de
Ciências Biomédicas, 2008.
xi, 60 f. : il. ; 31 cm
Orientadores: Mário Ary Pires Netto e Ricardo de Ary Pires
Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Instituto de Ciências Biomédicas, Programa de Pós-
graduação em Ciências Morfológicas, 2008.
Referências bibliográficas: f. 53-58
1. TRAQUÉIA – ANATOMIA & HISTOLOGIA. 2. ESTENOSE TRAQUEAL – PATOLOGIA. 3.
ESTENOSE TRAQUEAL – ETIOLOGIA. 4. INTUBAÇÃO INTRATRAQUEAL. 5. MATRIZ
EXTRACELULAR. 6. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS - MÉTODOS. 7. IMUNOISTOQUÍMICA -
MÉTODOS. 8. COLÁGENO – ANÁLISE. 9. ACTINAS – ANÁLISE. 10. ESTUDOS DE CASOS E
CONTROLES. 11. ADULTO. 12. CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS - TESE. I. PIRES NETTO, MÁRIO
ARY. II. PIRES, RICARDO DE ARY. III. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO,
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS, PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS. IV. TÍTULO.
iv
Esta dissertação foi desenvolvida no Laboratório da Unidade de
Neuroanatomia Topográfica, do Departamento de Anatomia, do Instituto
de Ciências Biomédicas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a
orientação dos professores Mário Ary Pires Neto e Ricardo de Ary Pires, e
no Laboratório de Patologia Celular, do Instituto de Ciências Biomédicas,
da Universidade Federal do Rio de Janeiro, a partir de amostras obtidas
no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Geral de Bonsucesso e de
informações de pacientes do Serviço de Broncoesofagolaringologia e
Cirurgia de Cabeça e Pescoço deste mesmo hospital.
v
Dedico este trabalho a meus pais pelo incentivo de sempre ao estudo, ao meu filho, que me
impulsiona a cada sorriso puro, e à minha esposa, sem a qual este projeto não teria sido
concluído.
vi
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores, professores Mário Ary Pires-Neto e Ricardo de Ary Pires pela
oportunidade de desenvolvimento desta pesquisa, pela compreensão e apoio nos momentos
difíceis e por terem acreditado no projeto de um cirurgião que, como a maioria, vai se
afastando do contato e estudo das ciências morfológicas.
À professora doutora Christina Maeda Takiya
pelo incentivo fundamental para a realização
desta pesquisa, por ter permitido a realização de parte da pesquisa no Laboratório de Patologia
Celular, além de sua contribuição fundamental durante o árduo processo de revisão desse
trabalho.
À secretária Alexandra e à técnica de laboratório Antônia Lima Carvalho, pela amizade e
disponibilidade com que participaram da execução deste trabalho.
A minha esposa, pelo amor e família que construímos juntos e pela sua participação
fundamental na execução deste trabalho.
Aos colegas do Serviço de Broncoesofagologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital
Geral de Bonsucesso pelo suporte técnico e amizade, durante a execução deste trabalho.
À técnica de patologia Diana, que foi uma das primeiras pessoas a me auxiliar na execução do
projeto.
vii
À Drª. Nilcimar Lourenço Miranda, Chefe do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital
Geral de Bonsucesso, por permitir a obtenção do substrato científico desta pesquisa e pelo
incentivo dispensado desde o primeiro contato de exposição do projeto inicial.
Ao Dr. Luiz Fernando Pires de Mello, Chefe do Serviço de Broncoesofagolaringologia e
Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Geral de Bonsucesso, pelo questionamento sobre a
etiopatogenia da estenose laringotraqueal, incentivando-me e sugerindo a idéia de linha de
persquisa, na qual está inserida esta pesquisa.
Ao Dr. Marcelo Lodi de Araújo, subchefe do Serviço de Broncoesofagolaringologia e
Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Geral de Bonsucesso, pelo apoio e permissão para
a realização deste trabalho com pacientes deste Serviço.
À Drª. Luíza Helena Urso Pitassi, amiga-irmã, pelos exemplos de caráter, de bondade, de
medicina e pesquisa de alto nível, nos quais me espelhei para persistir na luta de concretizar
uma dissertação em nosso país, com poucos incentivos governamentais e excesso de
burocracias.
Aos pacientes que participaram da pesquisa, pela colaboração e pela paciência dispensada.
viii
RESUMO
A causa benigna mais comum de estenose das vias aéreas em todas as faixas etárias é a
estenose traqueal pós-intubação. À medida que as Unidades de Terapia Intensiva são
ampliadas e que novos avanços tecnológicos são alcançados na Medicina, um número maior
de pacientes são submetidos a intubações traqueais, contribuindo para o aumento da
incidência desta patologia. A estenose traqueal é caracterizada pela obliteração do lúmen
deste órgão pela excessiva deposição de tecido conjuntivo e comprometimento da estrutura
cartilaginosa da traquéia. Nossa hipótese é que alterações na matriz extracelular e no processo
de reparo tecidual possam estar envolvidas no desenvolvimento desta doença. O presente
estudo tem como objetivos caracterizar a presença de colágeno, quantificando o percentual de
colágeno total e do tipo I, e identificar a presença de miofibroblastos em segmentos de
traquéias acometidas por estenose pós-intubação através de estudos histológico,
imunohistoquímico e histomorfométrico. A amostra foi composta por 10 segmentos de
estenose traqueal pós-intubação e 02 segmentos de traquéia normal (grupo controle), cujos
cortes histológicos foram submetidos à coloração com hematoxilina e eosina (H&E),
picrosirius e imunohistoquímica para actina alfa de músculo liso (α-sma) e colágeno tipo I
(col I). Os resultados encontrados revelam uma alteração da estrutura da parede traqueal de
pacientes com estenose pela intensa deposição de colágeno e presença de uma rede de
miofibroblastos. O acúmulo de colágeno total e do tipo I foi significativamente maior quando
comparado ao grupo controle (p<0,05). Na maioria dos casos de estenose traqueal, foi
verificada intensa marcação para colágeno tipo I com distribuição semelhante à obtida pelo
picrosirius no interstício e compactação aumentada das fibras colágenas. Foi observado um
aumento do número de vasos na lâmina própria e submucosa e a presença de células
alongadas, com núcleos alongados, reativas para actina alfa de músculo liso na lâmina
própria, submucosa e adventícia, independentemente do tempo de evolução da estenose. A
estenose traqueal humana pós-intubação é decorrente, principalmente, do espessamento
parietal, pela deposição excessiva de colágeno, com significativa participação do colágeno
tipo I, associado à degradação dos anéis cartilaginosos.
ix
ABSTRACT
The most frequent benign cause of airway stenoses in all age groups is post-intubation
tracheal stenosis. The increased use of assisted ventilation in intensive care units and the
considerable improvement in the conditions of managing patients with life-threatening
conditions are associated with a higher incidence of this pathology. Tracheal stenosis is
characterized by the obliteration of the tracheal lumen due to excessive deposition of
connective tissue and damage to tracheal cartilage. We hypothesize that alterations on the
extracellular matrix and on the wound healing process may be involved in the development of
this disease. The purpose of the present study is to charactherize the presence of collagen,
quantify the percentage of total collagen and collagen I and identify the presence of
myofibroblasts by histological, immunohistochemical and histomorfometric analyses of
segments of normal human trachea and segments of human trachea excised for repair of
tracheal stenosis after intubation injury. The sample consisted of 02 segments of normal
trachea and 10 segments of post-intubation tracheal stenosis. The sections were stained with
hematoxylin and eosin (H&E), picrosirius stain and underwent immunohistochemical staining
for α- smooth muscle actin (α-sma) and collagen I. The results showed structural alterations
of the tracheal wall of the segments of stenosis due to the intense deposition of collagen and
the presence of a myofibroblast network. The accumulation of total collagen and collagen I
was statistically significant (p<0,05). Intense collagen I staining and an increased density of
collagen fibers were identified in most of the specimens of stenosis similarly to the picrosirius
stain. The subepithelial tissue also showed an increased number of blood vessels and the
presence of spindled α-sma positive cells with elongated nuclei, independently of the time
course of the stenosis. Post-intubation tracheal stenosis is due mainly to the thickening of the
tracheal wall caused by excessive deposition of collagen, with significant accumulation of
type I collagen, associated with the destruction of the cartilaginous rings.
x
LISTA DE ABREVIATURAS
α-sma- actina alfa de músculo liso.
col I- colágeno tipo I.
H&E- hematoxilina e eosina .
MEC – matriz extracelular.
PS- picrosirius.
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- página 2.
Figura 2- página 5.
Figura 3- página 8.
Figura 4- página 15.
Figura 5- página 33.
Figura 6- página 35.
Figura 7- página 37.
Figura 8- página 39.
Figura 9- página 41.
Figura 10- página 43.
Figura 11- página 46.
Figura 12- página 48.
Figura 13- página 50.
Figura 14- página 53.
Figura 15- página 55.
Figura 16- página 57.
xii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 ANATOMIA DA TRAQUÉIA HUMANA 1
1.2 HISTOLOGIA DA TRAQUÉIA HUMANA 7
1.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE MATRIZ EXTRACELULAR E FIBROSE 10
1.4 CONSIDERAÇÕES SOBRE ESTENOSE TRAQUEAL 11
1.4.1 Conceito 11
1.4.2 Epidemiologia 12
1.4.3 Classificação 12
1.4.4 Fatores de risco 13
1.4.5 Etiologia 13
1.4.6 Histopatogenia da estenose traqueal 18
1.4.7 Propedêutica pré-operatória 21
1.4.8 Tratamento 22
2 OBJETIVOS 24
3 MATERIAIS E MÉTODOS 25
3.1 GRUPO AMOSTRAL 25
3.1.1 Critérios de seleção da amostra do grupo patológico 26
3.1.2 Critérios de seleção da amostra do grupo controle 26
3.1.3 Critérios de exclusão da amostra grupo patológico 26
3.1.4 Critérios de exclusão da amostra grupo controle 26
3.2 TÉCNICAS HISTOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA 26
3.2.1 Protocolo para coloração com hematoxilina e eosina 27
3.2.2 Protocolo para coloração com picrossirius (modificado para confocal) 27
xiii
3.2.3 Protocolo para imunohistoquímica para colágemo tipo I e actina alfa
de músculo liso 27
3.3 HISTOMORFOMETRIA 28
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA 29
4 RESULTADOS 30
4.1 ANÁLISE DESCRITIVA 30
4.2 HISTOMORFOMETRIA 45
4.2.1 Colágeno tipo I 45
4.2.2 Picrosirius 52
5 DISCUSSÃO 59
6 CONCLUSÕES 74
7 PERSPECTIVAS 75
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 76
ANEXO 83
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 ANATOMIA DA TRAQUÉIA HUMANA
A traquéia é a porção do trato respiratório localizada entre a laringe e os brônquios. É
um tubo membranoso e cartilaginoso. Estende-se da borda inferior da cartilagem cricóide, ao
nível da sexta vértebra cervical, até sua bifurcação em brônquios principais, ao nível da quinta
vértebra torácica (Olofsson, 1995). A traquéia humana é formada por 18-22 anéis em forma
de C (C-shaped) constituídos de cartilagem rígida anteriormente e lateralmente, e uma porção
membranosa posterior (Epstein, 2005). Assim, sua secção transversa se apresenta em forma
de D. Cada anel mede aproximadamente 4 mm de altura vertical, com 1mm entre os mesmos,
e aproximadamente 1mm de espessura (Breatnach et al., 1984).
Cada cartilagem é circundada por pericôndrio contínuo com tecido conjuntivo denso
irregular formando, assim, uma membrana fibrosa entre os anéis traqueais e a porção
membranosa posterior (Olofsson, 1995). As cartilagens apresentam uma superfície externa
reta e superfície interna convexa, e cada uma é revestida por tecido conjuntivo fibroso. A
parede posterior ou porção membranosa da traquéia apresenta duas camadas musculares que
conectam as extremidades posteriores das cartilagens traqueais. Os anéis traqueais são
similares, com exceção do primeiro e último. O primeiro anel é frequentemente contínuo com
a borda inferior da cartilagem cricóide, ao passo que o último, apresenta uma extensão que se
curva inferior e posteriormente para formar a ponta da carina (Breatnach et al., 1984).
O comprimento traqueal varia com a idade, sexo e raça (Allen, 2003). No adulto, o
comprimento médio é de 11cm, com variação de 10-13cm (Epstein, 2005). O diâmetro
interno varia amplamente na população em geral, com valores médios de 19mm no sexo
masculino e 16mm no feminino, sendo a dimensão antero-posterior um pouco maior que a
transversa (Breatnach et al., 1984).
2
FIGURA 1- Desenhos demonstrativos da anatomia da traquéia humana.
A- vista anterior global da traquéia, em toda sua extensão, com uma abertura em sua parede
anterior, demonstrando a estrutura tubular do órgão e seu revestimento mucoso; B- corte
transversal mostrando as camadas das paredes anterior, laterais e posterior do órgão.
3
4
A vascularização traqueal tem origem na artéria tireóidea inferior, nas artérias
subclávias, na artéria torácica interna direita e nas artérias brônquicas superior e média
(Armstrong e Netterville, 1995). Microscopicamente, pode-se observar o rico plexo vascular
submucoso. Anterior e lateralmente, este plexo é suprido por ramos dos vasos
intercartilaginosos e, posteriormente, o suprimento deriva de ramos de vasos esofágicos. È
importante salientar que os anéis cartilaginosos não possuem um suprimento sanguíneo
específico, recebendo sua nutrição através da difusão de nutrientes do plexo submucoso. Não
há plexos vasculares externos para suprir a cartilagem. Desta maneira, quando a mucosa
traqueal é comprimida por longos períodos de tempo, como, por exemplo, pela presença do
cuff ou tubo endotraqueal, a cartilagem se torna isquêmica, podendo originar cicatrizes e, em
última análise, estenose traqueal (Allen, 2003).
5
FIGURA 2- Desenho demonstrativo da irrigação arterial da traquéia humana.
A- demonstra as artérias que irrigam a traquéia e suas respectivas origens; B- demonstra a
microvascularização arterial do tecido subepitelial, a qual fornece suprimento ao tecido
cartilaginoso, que é avascular.
6
7
1.2 HISTOLOGIA DA TRAQUÉIA HUMANA
Histologicamente, a traquéia é revestida por epitélio cilíndrico pseudo-estratificado
ciliado que repousa sobre a membrana basal. Abaixo da membrana basal, está situada a
lâmina reticular, composta de colágeno tipo I e tipo III. A lâmina própria é a camada do tecido
subepitelial subseqüente à lâmina reticular, composta por tecido conjuntivo frouxo com fibras
elásticas. Profundamente a esta camada, encontra-se a submucosa, que contém tecido
conjuntivo frouxo e glândulas. Abaixo da submucosa, estão os anéis cartilaginosos, que
fornecem suporte anterior e lateral para a via aérea. A superfície posterior é formada por uma
membrana fibroelástica na qual a musculatura lisa é embutida. Estes músculos apresentam
predominantemente orientação transversal, mas alguns são longitudinais ou oblíquos. Este
músculo é denominado músculo traqueal e está envolvido na regulação do diâmetro traqueal
(Allen, 2003) (Ross, 2006).
8
FIGURA 3- Fotomicrografia de cortes histológicos da traquéia humana.
9
10
1.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE MATRIZ EXTRACELULAR E FIBROSE
A lâmina própria e a submucosa constituem o tecido subepitelial traqueal, composto
por tecido conjuntivo e glândulas seromucosas. O tecido conjuntivo é constituído de matriz
extracelular e de um limitado número de células espalhadas por ela. A matriz extracelular
(MEC) é o principal componente do tecido conjuntivo. È formada pela substância
fundamental amorfa, composta de glicosaminoglicanas, proteoglicanas e glicoproteínas
adesivas, e por fibras. Estas macromoléculas formam vários tipos de interação molécula-
molécula, molécula-fibra e molécula-célula dentro do tecido conjuntivo. A substância
fundamental amorfa é responsável pela resistência à compressão dos tecidos. As fibras, por
sua vez, fornecem resistência à tensão e elasticidade à matriz extracelular. São três, os tipos
de fibras presentes na MEC: fibras colágenas, reticulares e elásticas. As fibras colágenas são
as mais abundantes no tecido conjuntivo. Os diversos tipos de colágenos estão presentes em
regiões específicas do corpo humano e desempenham variadas funções. O colágeno I, tipo
mais comum de colágeno no organismo, forma fibras espessas e está presente no tecido
conjuntivo propriamente dito, tecido ósseo, dentina e cemento. O colágeno tipo II forma
fibras finas e é quase exclusivamente encontrado nas cartilagens hialina e elástica. O colágeno
tipo III está presente, em níveis variados, em quase todos os tecidos juntamente com o
colágeno tipo I (Gartner, 2003). Há vários outros tipos de colágeno, mas que não são
relevantes para esta dissertação. A deposição em excesso de componentes da MEC, incluindo
colágeno, resulta em fibrose, conceitualmente definida como crescimento excessivo,
endurecimento e/ou formação de cicatrizes em vários tecidos (Wynn, 2008).
A fibrose resulta, tipicamente, de um processo inflamatório crônico, caracterizado por
uma resposta imunológica que persiste por vários meses e, no qual inflamação, remodelação
tecidual e processo de reparo ocorrem simultaneamente. Apesar de fatores etiológicos e
manifestações clínicas diferentes, a maioria das patologias fibróticas crônicas têm em comum
11
um irritante/estímulo persistente que sustenta a produção de fatores de crescimento, enzimas
proteolíticas, fatores angiogênicos e citocinas fibrogênicas que, por sua vez, estimulam a
deposição de elementos do tecido conjuntivo, promovendo remodelação tecidual progressiva
e destruição da arquitetura normal do órgão. A injúria tecidual pode resultar de vários
estímulos, incluindo infecções, reações auto-imunes, toxinas, radiação e injúria mecânica. O
processo de reparo envolve duas fases distintas: uma fase regenerativa, na qual as células
lesadas são substituídas por células do mesmo tipo, e uma fase conhecida como fibrose ou
fibroplasia, na qual o tecido parenquimatoso normal é substituído por tecido conjuntivo.
Apesar de inicialmente benéfico, o processo de reparo torna-se patológico quando não é
corretamente finalizado, resultando em deposição substancial de componentes da matriz
extracelular e substituição do tecido normal por uma cicatriz permanente (Wynn, 2007). Em
algumas patologias como fibrose pulmonar idiopática, fibrose cardiovascular e na estenose
laringotraqueal, a fibrose e a intensa remodelação tecidual podem, em última instância, levar
ao colapso do órgão e até à morte.
1.4 CONSIDERAÇÕES SOBRE ESTENOSE TRAQUEAL
1.4.1 Conceito
Estenose (do grego sténosis) é o estreitamento de qualquer canal ou orifício. A
traquéia é uma estrutura tubular semi-rígida na qual a retração cicatricial concêntrica, parte do
processo de cicatrização normal, tende a estreitar seu lúmen (Lorenz, 2003).
A estenose traqueal pós-intubação é um tipo de estenose cicatricial definida como uma
diminuição progressiva e permanente do lúmen traqueal com substituição da parede tecidual
normal por um novo tecido, geralmente fibroso. Esta definição exclui estenoses traqueais não
12
cicatriciais, como as causadas por compressão extrínseca, edema ou tumores (Mandour et al.,
2003).
1.4.2 Epidemiologia
A causa benigna mais comum de estenose das vias aéreas em todas as faixas etárias é a
estenose traqueal pós-intubação, que ocorre em 1 a 4% dos pacientes após tratamento em
unidades de terapia intensiva (Lorenz, 2003).
1.4.3 Classificação
Freitag et al (2007) propuseram um método para classificação da estenose
traqueobrônquica, dividindo-a em dois grupos principais:
1- Estenoses estruturais:
• Tipo 1: estenoses causadas por lesões exofíticas intraluminais (tumores mailgnos,
benignos e tecido de granulação);
• Tipo 2: estenoses causadas por compressão extrínseca;
• Tipo 3: estenoses causadas por distorção ou arqueamento;
• Tipo 4: estenoses causadas por cicatrizes ( estenoses pós-intubação, queimaduras)
2- Estenoses dinâmicas ou funcionais:
• Tipo 1: estenoses benignas em forma de triângulo, causadas por danos à cartilagem e
malácia;
• Tipo 2: estenoses causadas por membrana posterior frouxa;
Após a classificação em um dos grupos principais, a estenose é subclassificada de acordo
com o grau, localização e zona de transição (Freitag et al., 2007).
13
1.4.4 Fatores de risco
Os fatores de risco incluem tamanho do tubo relativo ao tamanho da laringe/traquéia,
duração da intubação, movimento do tubo, intubação traumática e freqüência de intubações.
Além disso, fatores relacionados ao paciente tais como atividade do paciente, doenças
sistêmicas, hipoxia, episódios de hipotensão, infecções locais da laringe (Bassett, 1971; Grillo
e Donahue, 1996; Ahmad e Pahor, 2000) e capacidade de cicatrização também representam
importantes papéis (Yamada et al., 2001). Alguns autores consideram administração de
corticosteróides, sensibilidade do paciente aos materiais utilizados para intubação e agentes
químicos utilizados para esterilização do tubo, assim como reação idiossincrática, como
fatores colaboradores (Miller e Sethi, 1970; Hawkins, 1977; Grillo e Donahue, 1996). Outros
autores sugerem o papel do suco gástrico (Little et al., 1985; Jindal et al., 1994), como
confirmado em experimentos em cães. Evidências clínicas e experimentais sugerem que o
refluxo gastroesofágico pode representar papel no desenvolvimento ou exacerbação da
estenose.(Little et al., 1985). Traqueostomia prévia, intubação prolongada, radioterapia para
tumores laríngeos e orofaríngeos e história de intubação para cirurgias extra-laringotraqueais
encontram-se dentre os fatores de risco para estenose (Koshkareva et al., 2007).
1.4.5 Etiologia
As causas mais comuns de estenose traqueal mudaram nos últimos 100 anos, sendo o
trauma externo e a infecção, substituídos pelo trauma iatrogênico pós-intubação e
traqueostomia (Lorenz, 2003). Há várias etiologias para esta patologia: congênitas,
infecciosas, por injúrias químicas, auto-imunes e traumáticas, que incluem a intubação
endotraqueal ou intratraqual. Um tubo de ventilação assistida pode entrar em contato com
superfície interna da traquéia nas situações de intubação orotraqueal (por via bucal) ou naso-
traqueal (por via nasal) e de traqueotomia, que é a abertura cirúrgica confeccionada na parede
14
anterior da traquéia, através da qual é passado o tubo ou cânula de traqueostomia (figura 4). A
intubação endotraqueal pode causar uma ampla variedade de condições agudas e crônicas,
sendo a causa mais freqüente de estenose traqueal (Duncavage e Koriwchak, 1995; Grillo e
Donahue, 1996; Gavilan et al., 1998; George et al., 2005).
15
FIGURA 4- Foto de um tubo para intubação oro ou nasotraqueal e uma cânula de
traqueostomia.
A- tubo para intubação oro ou nasotraqueal com seta indicando o balonete ou cuff ; B- cânula
de traqueostomia com seta indicando balonete ou cuff.
16
17
Várias pesquisas foram desenvolvidas em modelos animais com a finalidade de se
explicar a etiologia da estenose pós-intubação. Há similaridades entre as lesões identificadas
em coelhos, cães e macacos, e as encontradas em humanos, mas até hoje a etiologia ainda não
foi totalmente elucidada (Way e Sooy, 1965; Miller e Sethi, 1970; Marshak et al., 1982; Little
et al., 1985; Charous et al., 1996; Nakagishi et al., 2005; Simpson et al., 2008). Acredita-se que
o processo se inicie a partir da presença de pressão mecânica direta exercida pelo balonete (ou
cuff) ou pelo corpo do tubo sobre a parede traqueal (Miller e Sethi, 1970; Bassett, 1971; Ching
et al., 1974; Weymuller, 1988; Grillo e Donahue, 1996; Spittle e Mccluskey, 2000). Os sítios
anatômicos mais comumente envolvidos são: porção posterior das pregas vocais, espaço
subglótico e os segmentos traqueais em contato com o cuff (Ahmad e Pahor, 2000).O cuff é o
agente agressor mais importante citado na literatura (Miller e Sethi, 1970; Ching et al., 1974;
Grillo e Donahue, 1996; Spittle e Mccluskey, 2000; Sarper et al., 2005).
O uso de cuffs de grande volume e baixa pressão reduz significativamente a ocorrência
de injúria (Ching et al., 1974; Brichet et al., 1999; Spittle e Mccluskey, 2000; Sarper et al.,
2005). Entretanto, mesmo com o uso de cuffs adequados, a estenose ainda pode ocorrer.
Stauffer e colaboradores (1981) observaram que 11% dos pacientes intubados com cuffs de
grande volume e baixa pressão desenvolveram estenoses no local do mesmo, comprometendo
de 10 a 50% do diâmetro traqueal. Procedimentos periódicos de esvaziamento-insuflação do
cuff não preveniram injúria traqueal em pacientes humanos (Miller e Sethi, 1970).
Com relação à pressão do cuff, esta deve ser a pressão mínima que permita contato
íntimo com a parede traqueal, sem obliterar o fluxo sanguíneo capilar (Miller e Sethi, 1970).
Foram observados danos graves à mucosa traqueal com o uso de pressões excessivas (Ching
et al., 1974). Uma pressão maior que 30mmHg excede a pressão perfusional da mucosa
capilar, causando isquemia mucosa, o que pode levar à ulceração e condrite da cartilagem
traqueal (Knowlson e Bassett, 1970).
18
A duração da pressão também é importante uma vez que a gravidade da injúria,
geralmente, está diretamente relacionada à duração da intubação. Alterações significativas
(ulcerações) ocorreram após somente 36 horas de permanência do cuff, com progressão para
destruição intensa após 2 semanas (Miller e Sethi, 1970). Erosões traqueais foram
identificadas em todos pacientes avaliados com 48-72horas de permanência do mesmo (Ching
et al., 1974). Há relato de estenose traqueal após 24 horas de intubação. Desta maneira,
qualquer paciente intubado pode ser considerado de risco para desenvolvimento desta
patologia (Yang, 1995). Porém, ao contrário da maioria dos autores, Staufer e colaboradores
(1981) não encontraram associação entre a duração da intubação endotraqueal e a gravidade
das injúrias laringotraqueais em autópsias.
Altas pressões do cuff, intubações prolongadas e intubações traumáticas podem
resultar em rouquidão, obstrução das vias aéreas por edema glótico ou subglótico e formação
de granulomas de intubação. Em processos de cicatrização mais exuberantes, o tecido de
granulação pode ocasionar vários graus de cicatrizes ou estenoses traqueais.
1.4.6 Histopatogenia da estenose traqueal
Estudos prévios mostram que o processo etiopatogênico da estenose pós-intubação se
inicia a partir da presença de pressão mecânica direta exercida pelo cuff ou pelo tubo sobre a
parede traqueal. (Miller e Sethi, 1970; Bassett, 1971; Ching et al., 1974; Weymuller, 1988;
Grillo e Donahue, 1996; Spittle e Mccluskey, 2000). Resultados em estudos animais e humanos
suportam o conceito de necrose por pressão que inicialmente causa erosões na mucosa traqueal
e se estende para camadas mais profundas e cartilagem (Miller e Sethi, 1970; Ching et al.,
1974). A necrose por pressão, característica dominante na patogênese da estenose, tem início
com as alterações inflamatórias sofridas pela mucosa. Pequenas ulcerações podem envolver o
pericôndrio, causando pericondrite seguida por condrite e necrose da cartilagem subjacente.
19
Com a continuação do processo destrutivo, a cicatrização tem início e tecido fibroso e de
granulação proliferam para dentro do lúmen traqueal. Como ocorre em todos os processos
cicatriciais, à medida que o tecido de granulação se move para dentro da ferida, a contração
fibroblástica causa retração concêntrica aproximando os bordos, diminuindo a área da cicatriz.
(Eliashar et al., 2000). A contração concêntrica da ferida causa a estenose, devido ao fato da
laringe e traquéia serem estruturas semi-rígidas.
Diversos trabalhos a respeito da estenose traqueal revelam etiopatogenia semelhante à
da estenose laríngea descrita a seguir. A ulceração é a lesão mais precoce ocasionada pelo
traumatismo do tubo traqueal, e é causada por dois mecanismos. O primeiro é a abrasão
mecânica da superfície da mucosa, resultando na perda ou destruição do epitélio. Infecção
secundária no local causa a chamada úlcera de contato. Devido ao fato do tubo endotraqueal
ser lubrificado, é pouco provável que a abrasão seja responsável por ulcerações extensas e
profundas. O segundo é a pressão contínua que o tubo exerce sobre a mucosa traqueal.
Quando esta pressão excede a pressão perfusional da mucosa capilar, ocorre isquemia seguida
de necrose e esfoliação da mucosa, com exposição do tecido conjuntivo subjacente.
Clinicamente, úlceras profundas, que atingem a cartilagem, são frequentemente observadas.
No processo de cicatrização, há uma tentativa de regeneração do epitélio na forma de
metaplasia escamosa, a qual parece ativamente envolvida no processo de re-epitelização. A
cicatrização das úlceras depende da condição do tecido de granulação e pode ocorrer de
quatro formas distintas. A primeira compreende a cicatrização primária e ocorre quando as
ulcerações são superficiais e pequenas, mantendo íntegra a membrana basal. O processo de
cicatrização envolve somente o epitélio, cuja regeneração se dá sobre a membrana basal. Há
pouca deposição de colágeno e formação de cicatriz. Este tipo de úlcera e de cicatrização tem
pouca importância clínica, uma vez que quase não são vistas macroscopicamente. A
regeneração é completa, sem nenhuma seqüela. A cicatrização secundária ocorre quando as
20
ulcerações são mais profundas e acometem o epitélio e o tecido conjuntivo. Envolve tecido de
granulação e subseqüente formação de tecido fibroso. A ferida é coberta por uma camada de
tecido de granulação ou, no mínimo, uma camada de fibrina antes do início da regeneração
epitelial. O tecido de granulação consiste de capilares, células inflamatórias, fibrócitos e fibras
colágenas. As células basais do epitélio sobrevivente às margens do defeito se espalham sobre
o tecido de granulação. Se o defeito for pequeno, pequena quantidade de tecido de granulação
é necessária para o preenchimento do mesmo. As células epiteliais migram das margens da
ferida e cobrem o tecido de granulação. O epitélio cobre a ferida e uma interação epitélio-
mesenquimal pouco conhecida, parece prevenir a proliferação excessiva de tecido de
granulação e deposição de tecido conjuntivo. Há desenvolvimento de uma nova membrana
basal sob o epitélio e re-estabelecimento do relacionamento normal entre o tecido epitelial e o
conjuntivo subjacente. Se, durante este processo houver falha no recobrimento do tecido de
granulação, o crescimento deste se torna exuberante, resultando na terceira forma de
cicatrização. Esta falha pode ser causada pela constante expansão e encurtamento da laringe e
traquéia nos movimentos de respiração e deglutição, movimento da cabeça e trauma pelo
tubo. O refluxo gastroesofágico também pode atuar nesta fase. Com ulceração extensa e
profunda pode haver exposição da cartilagem subjacente. A exposição da mesma age como
um corpo estranho, causando uma excessiva formação de tecido de granulação e deposição de
colágeno. A regeneração se faz com tecido de granulação firme e fibroso que pode ser plano
ou se tornar exuberante, elevado, causando vários graus de obstrução, sendo chamados de
granulomas de intubação. A maioria destas lesões se resolve sem seqüelas. Em alguns casos,
tornam-se tecido cicatricial fibroso. A fibrose é o estágio final do processo de cicatrização das
ulcerações e pode causar obstruções. As células inflamatórias diminuem gradualmente. Fibras
colágenas são secretadas pelos fibrócitos e ganham força no tecido de granulação. A retração
cicatricial resulta em um lúmen reduzido e irregular (Liu et al., 1995).
21
1.4.7 Propedêutica pré-operatória
A avaliação pré-operatória correta de parâmetros como extensão e localização da
estenose é extremamente importante para a obtenção de bons resultados cirúrgicos e redução
da morbidade dos procedimentos (Grillo e Donahue, 1996; Carretta et al., 2006). Além disso,
características essenciais como diâmetro e comprimento da estenose, distância da lesão
estenótica às cordas vocais, à carina traqueal e ao traqueostoma (se houver) também devem
ser avaliadas. A propedêutica deve incluir radiografia cervical, testes de função pulmonar,
broncoscopia flexível para diagnóstico preliminar (Quint et al., 1995; Carretta et al., 2006),
radiografia e tomografia linear da traquéia, além de fluoroscopia (Grillo e Donahue, 1996).
A broncoscopia rígida é o procedimento de escolha na avaliação de candidatos para ressecção
e reconstrução traqueal para estenose pós-intubação (Quint et al., 1995; Grillo e Donahue,
1996; Carretta et al., 2006). Este exame pode fornecer informações quanto ao grau de
maturação da estenose, ou seja, os estágios macroscópicos do processo de reparo tecidual:
presença de ulcerações macroscópicas, granuloma ou fibrose cicatricial. A tomografia
computadorizada (TC) helicoidal pode ser utilizada na avaliação auxiliar pré-operatória de
doenças associadas e no pós-operatório de pacientes submetidos a tratamento cirúrgico
(Carretta et al., 2006). Segundo Rea e colaboradores, este exame nem sempre fornece
informações adicionais à broncoscopia rígida (Rea et al., 2002). Entretanto, outros autores
afirmam que a TC helicoidal permite reconstrução multidimensional de alta qualidade,
permitindo avaliação detalhada da estenose traqueal (Quint et al., 1995; Muller, 2004).
22
1.4.8 Tratamento
O tratamento deve ser individualizado e selecionado de acordo com as características
do paciente, o local e severidade da estenose, e a função das pregas vocais. Depende
altamente da intensidade dos sintomas produzidos.
Há várias opções de tratamento para a estenose traqueal, dentre eles: injeção
intralesional de corticosteróides, remoção de tecido de granulação, dilatação com balões
(Nouraei et al., 2006) e dilatação com broncoscopia rígida (Rea et al., 2002).
O tratamento endoscópico a laser, apesar de altamente utilizado nos últimos 20 anos,
está associado com alto índice de re-estenose (Hueman e Simpson, 2005); pode causar danos
teciduais e, desta maneira, uma resposta inflamatória inevitavelmente ocorre acarretando
proliferação fibroblástica e recidiva da estenose (Simpson e James, 2006).
Tratamento anti-refluxo parece representar papel na redução de re-estenose, mas não a
previne totalmente (Yellon et al., 1998; Valdez e Shapshay, 2002).
A cirurgia aberta é o tratamento de escolha para estenose laringotraqueal (Grillo e
Donahue, 1996; Rea et al., 2002; Mandour et al., 2003; Ciccone et al., 2004). Dentre as
técnicas de cirurgia aberta, as principais são: ressecção traqueal/cricotraqueal com anastomose
término-terminal (Wolf et al., 2001) e reconstrução laringotraqueal às custas de enxertos
(Wolf et al., 2001; George et al., 2005). Se inflamação local ativa ou comprometimento do
estado geral do paciente contraindicarem a cirurgia, tratamento a laser assistido por
endoscopia e utilização de stent são alternativas viáveis (Rea et al., 2002; Mandour et al.,
2003; Ciccone et al., 2004).
Os métodos atualmente utilizados para tratamento da estenose tendem a fracassar
devido à formação de cicatrizes e re-estenose. Acredita-se que a modulação da cicatrização
23
tecidual pode prevenir a formação de cicatrizes e a necessidade de cirurgias futuras (Rahbar et
al., 2001). Há um risco inerente de re-stenose em todo tipo de tratamento, devido à
persistência do processo inflamatório crônico que causou a estenose inicial ou à intervenção
cirúrgica (Ingrams et al., 2000).
Desta maneira, pesquisadores têm testado drogas para tratamento da estenose tais
como Mitomicina C (Eliashar et al., 1999; Eliashar et al., 2004; Cincik et al., 2005; Hueman e
Simpson, 2005; Eliashar et al., 2006; Simpson e James, 2006; Ubell et al., 2006; Roh et al.,
2007), Halofuginona (Eliashar et al., 2006), e 5-fluoracil/triancinolona (Cincik et al., 2005),
potenciais fármacos que atuem na inibição do processo cicatricial, prevenindo a re-estenose e
melhorando os resultados do tratamento da estenose subglótica.
24
2 OBJETIVOS
Ao contrário da etiopatogenia frequentemente observada e descrita na literatura,
alguns pacientes desenvolvem estenose traqueal após intubações pouco traumáticas, com
manutenção de baixa pressão do cuff e por curtos períodos de tempo. Em contrapartida, há
pacientes que, mesmo submetidos à intubações traumáticas e/ou prolongadas, não
desenvolvem tal patologia. A justificativa para estas contradições pode estar relacionada a
fatores presentes na matriz extracelular. Considerando-se que há poucos estudos morfológicos
e morfométricos na literatura, o presente estudo tem como objetivos:
1. Avaliar, através de estudo histológico, segmentos de traquéias humanas acometidas por
estenose pós-intubação.
2. Avaliar, através de estudo imunohistoquímico utilizando anticorpos dirigidos contra actina
alfa de músculo liso e colágeno I, a presença de miofibroblastos e colágeno I em segmentos
de traquéias humanas acometidas por estenose pós-intubação.
3. Avaliar, através de estudo histomorfométrico, a deposição de colágeno total, corado com
picrosirius e de colágeno I, imunomarcado com actina alfa de músculo liso, em segmentos de
traquéias humanas acometidas por estenose pós-intubação.
25
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 GRUPO AMOSTRAL
As amostras foram obtidas a partir de blocos de parafina (de peças previamente
fixadas em formol a 10%) oriundos do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital
Geral de Bonsucesso (Rio de Janeiro-RJ). Foram selecionados 10 blocos de segmentos de
estenose traqueal humana pós-intubação a partir de levantamento retrospectivo de pacientes
submetidos à cirurgia de traqueoplastia no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e
Broncoesofagolaringologia do mesmo Hospital, durante o ano de 2004, os quais constituíram
o grupo patológico. A idade dos indivíduos deste grupo variou entre 23 e 46 anos, sendo 8
(oito) do sexo masculino e 2 (dois) do feminino. O tempo total mínimo de intubação
endotraqueal, ou seja, exposição ao tubo com cuff insuflado (tubo orotraqueal ou tubo
orotraqueal/cânula) foi de 8 dias e o tempo máximo de 90 dias. Dos 10 pacientes estudados, 8
foram submetidos a dilatações endoscópicas prévias ao tratamento cirúrgico aberto, 1 fez
apenas uso de stent e outro, por apresentar estenose severa com perda total do lúmen traqueal,
não foi submetido a nenhum tipo de tratamento prévio à cirurgia aberta. O grupo controle foi
constituído de 2 blocos de parafina de segmentos de traquéia normal, obtidos de peças
cirúrgicas de laringectomias totais realizadas para remoção de tumores de laringe durante o
ano de 2006. Foi utilizado o terceiro anél traqueal que é rotineiramente ressecado em bloco
único com a laringe como margem de segurança distal. Este grupo foi composto de 01 de
indivíduo do sexo masculino, com 81 anos de idade, e 01, do feminino, com 74 anos de idade.
Esta pesquisa está baseada nas normas de bioética para área de saúde da WMA
(World Medical Association) – declaração de Helsinque (1990) e do National Institute of
26
Health, USA e submetida ao Comitê de Ètica em Pesquisa Médica do Hospital Geral de
Bonsucesso (Rio de Janeiro-RJ) sob o número 11/08, tendo sido aprovada (anexo).
3.1.1 Critérios de seleção da amostra do grupo patológico
A- Indivíduos brasileiros de ambos os sexos.
B- Indivíduos portadores de estenose traqueal pós-intubação.
3.1.2 Critérios de seleção da amostra do grupo controle
A- Indivíduos brasileiros de ambos os sexos.
B- Indivíduos com traquéias normais submetidos à cirurgia de laringectomia total.
3.1.3 Critérios de exclusão da amostra grupo patológico
Os indivíduos foram considerados inadequados para o estudo quando apresentaram:
A- Co-morbidades que pudessem alterar a estenose traqueal.
B- Idade inferior a 18 anos.
3.1.4 Critérios de exclusão da amostra grupo controle
Os indivíduos foram considerados inadequados para o estudo quando apresentaram:
A- Co-morbidades que pudessem alterar a morfologia da traquéia.
B- Idade inferior a 18 anos.
C- Tabagismo.
3.2 TÉCNICAS HISTOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA
Os blocos foram seccionados em plano transversal, sendo obtidos cortes de 5 um de
espessura. Foram utilizados cortes dos blocos para coloração com hematoxilina e eosina
(H&E), com picrosirius (PS) e para estudo imunohistoquímico para colágeno tipo I (col I)
27
(anticorpo policlonal contra colágeno do tipo I, Novotec, França, cat. 20111) e para actina alfa
de músculo liso (α-sma), (Dakocytomation, USA, cat. M0851).
3.2.1 Protocolo para coloração com hematoxilina e eosina
Os cortes histológicos foram desparafinizados e hidratados. Foram então passados na
Hematoxilina de Harris por 8 minutos, lavados em água corrente por 10 minutos, passados em
álcool-clorídrico para diferenciação, seguindo-se de passagem em água destilada e na Eosina-
Floxina por 2 minutos. Os cortes foram novamente desidratados e clarificados, e montados
em bálsamo do Canadá ou Entellan.
3.2.2 Protocolo para coloração com picrosirius (modificado para confocal)
Após desparafinização e hidratação, os cortes histológicos foram lavados em água
destilada por 10 minutos, colocados em solução de ácido fosfomolíbdico por 1 minuto e na
solução de picrosirius por 90 minutos. Foram lavados em ácido clorídrico 0,01N durante 2
minutos, depois em álcool 70% durante 45 segundos. Os cortes foram desidratados,
clarificados e montados em bálsamo do Canadá ou Entellan.
3.2.3 Protocolo para imunohistoquímica para colágeno tipo I e actina alfa de músculo
liso
Resumidamente, após desparafinização e hidratação, os cortes foram submetidos à
digestão enzimática com hialuronidase 0,2% (hyaluronidase, Sigma Chemicals, St. Louis,
USA, cat. H2126) por 4 horas a 38
o
C para o colágeno I, e recuperação antigênica para a actina
alfa de músculo liso (α –sma), em banho-maria, através da utilização de tampão citrato (0,1M
pH 6,0) por 30 minutos. Foram realizadas lavagens das lâminas em solução tampão fosfato
salina (PBS), seguida de inibição da peroxidase endógena com solução de H
2
O
2
a 0,3% em
28
metanol por 15 minutos, e bloqueio das ligações inespecíficas dos anticorpos com o tecido
utilizando-se solução de PBS-BSA 5%. Os anticorpos foram incubados em câmara úmida, a
4
o
C por cerca de 16 horas, nas diluições de 1:500 (col I) e 1: 100 (α –sma), diluídos em
PBS-BSA 3% e soro normal de cabra a 1%. Após lavagens em (PBS), os cortes foram
incubados com anticorpo secundário conjugado a polímero e peroxidase (ENVISION-HRP da
Dakocytomation, cat. K4061), seguida da revelação da peroxidase através do substrato
cromógeno diaminobenzidina (DAB Liquid, Dakocytomation, cat. K3466), contracorados
com hematoxilina.
As lâminas foram estudadas em microscópio de luz Nikon. As áreas selecionadas de
cada lâmina foram fotografadas e capturadas utilizando-se o software Image-Pro Express.
3.3 HISTOMORFOMETRIA
A histomorfometria foi realizada usando um sitema de análise de imagem composto
por uma câmera digital (Evolution, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) acoplada a
microscópio de luz (Eclipse 600, NIKON). As imagens de alta qualidade (2048 X1536 pixels
buffer) foram capturadas através do programa Image Pro Plus 4.5.1 (Media Cybernetics). Um
único observador realizou a quantificação.
Foram capturadas 15 imagens de lâminas coradas pelo picrosirius e colágeno I
utilizando a lente objetiva de 40X aleatoriamente para obtenção de imagens das do tecido
subepitelial forma aleatória. Devido à grande homogeneidade da amostra foram realizadas 6
medidas/ caso, sendo obtido o percentual de densidade óptica de colágeno total (picrosirius) e
colágeno I.
29
3.4 ANÁLISE ESTATISTICA
A análise estatística foi realizada utilizando-se os softwares MedCalc 9.30 ( MedCalc
Corporation, Belgica) e SigmaStat 3.5 (SPSS Inc, USA). Para confecção dos gráficos, foi
utilizado o software SigmaPlot 10 (SPSS Inc, USA). Foi realizado teste estatístico
paramétrico (t de student).
30
4 RESULTADOS
4.1 ANÁLISE DESCRITIVA
Os espécimes do grupo controle apresentaram paredes finas (Figura 5 A), exibindo, na
porção anterior do anel traqueal, epitélio de revestimento do tipo colunar pseudo-estratificado
com células caliciformes, sem a presença de cílios (provavelmente pela idade avançada dos
pacientes e pelo contato do tubo endotraqueal com a mucosa traqueal durante a cirurgia de
laringectomia total pelo período de aproximadamente 2 a 3h), mas com as demais
características preservadas (Figura 5 B). O epitélio repousa sobre a membrana basal, seguida
da camada reticular, que se apresentou corada de forma intensa e homogênea pelo picrosirius,
havendo também uma intensa reatividade para o colágeno tipo I (Figura 5 C e D). A lâmina
própria, camada conjuntiva situada abaixo da camada reticular, apresentou-se constituída por
fibras conjuntivas dispostas de forma frouxa onde são observados capilares e linfócitos em
quantidade variável (Figura 5 E). A reatividade para o colágeno tipo I mostrou discreta
variação, exibindo fraca intensidade de expressão nas zonas em que as fibras colágenas se
apresentavam de forma dispersa, ou imunomarcação mais densa, nas regiões onde as fibras se
agrupavam em feixes mais espessos (Figura 5 F). Abaixo da lâmina própria situa-se a camada
submucosa, caracterizada pela presença de um tecido conjuntivo denso não modelado, com
glândulas mucosas e seromucosas, vasos sanguíneos e linfáticos, além de elementos linfóides
(Figura 5 E). Nesta camada, a coloração para picrosirius e a reatividade para o colágeno tipo I
também mostraram variação discreta, sendo mais intensa nas áreas ao redor das glândulas e
vasos, e de menor intensidade em áreas mais frouxas (Figura 5 G e H). A adventícia, na
parede antero-lateral, é constituída pelo tecido conjuntivo denso adjacente aos anéis
cartilaginosos. Na região posterior, a diferença consiste na presença de um tecido conjuntivo
denso situado entre as terminações posteriores dos anéis cartilaginos C-shaped (Figura 6 A).
Nota-se a presença de tecido muscular liso que constitui o tecido muscular traqueal (Figura 6
31
B). O tecido conjuntivo denso é constituído de fibras colágenas organizadas em feixes mais
compactos, dispostos em diferentes direções (Figura 6 C). A reatividade para o colágeno tipo
I se mostrou intensa, difusamente distribuída (Figura 6 D).
Nos espécimes obtidos de pacientes com estenose traqueal adquirida pós-intubação,
verificamos notável modificação da arquitetura da traquéia. Foi observado intenso
espessamento da parede traqueal. Na maioria dos casos, verificou-se uma hipertrofia e/ou
hiperplasia da submucosa e lâmina própria, constituindo um tecido pseudo-polipóide (Figura
7 A). Notou-se também a presença de metaplasia escamosa difusa do epitélio de revestimento
em 5 espécimes, enquanto que, em 3 outros, este padrão epitelial foi multifocal (Figura 7 B).
Foi observada ulceração superficial em 2 espécimes, nos quais o epitélio superficial estava
ausente, tendo sido substituído por fibrina (Figura 7 C e D). Subjacente à camada de fibrina,
havia tecido de granulação (Figura 7 C). O corte histológico de outro segmento de estenose
traqueal mostrou a presença de metaplasia escamosa do epitélio de revestimento, sendo que,
nas camadas abaixo do mesmo, verificou-se a presença de tecido conjuntivo bastante frouxo
(Figura 7 E). Neste caso, tanto a intensidade da coloração do colágeno pelo picrosirius (Figura
7 F), quanto a reatividade específica para colágeno tipo I, mostraram-se diminuídas, sem a
delimitação da camada reticular, havendo raras fibras colágenas (Figura 7 G e H). Nos
demais, a coloração com H&E mostrou um tecido subepitelial com difícil individualização
entre suas camadas (Figura 8 A). A reatividade para a coloração com picrosirius mostrou-se
difusa e homogênea, com intensidade de moderada a alta em toda a lâmina própria,
estendendo-se para a submucosa e adventícia (Figura 8 B). A reatividade exibida para
colágeno tipo I foi semelhante à do picrosirius no interstício (Figura 8 C). Não se observou
diferenciação entre a camada reticular e a lâmina própria, devido à compactação das fibras
colágenas e homogeneização da reatividade para colágeno tipo I nesta camada, assim como
entre ela e a submucosa (Figura 8 D).
32
A imunoexpressão para a actina-alfa de músculo liso, nas paredes anterior e laterais
dos espécimes normais, foi verificada somente nos pericitos da parede de capilares, células
musculares lisas da parede de vasos sanguíneos e nas células mioepiteliais glandulares (Figura
9 A, B e C ). Na porção posterior, foi observada reatividade para a actina-alfa de músculo liso
no tecido muscular, organizado em espessos feixes orientados longitudinalmente à luz
traqueal e presente na submucosa, entre as terminações posteriores do anel cartilaginoso
incompleto (C-shaped). Além destes, foram também observados feixes musculares lisos finos
na lâmina própria, reativos para este anticorpo (Figura 9 D).
Os cortes histológicos dos pacientes do grupo patológico exibiram um maior número
de vasos na lâmina própria e submucosa, vasos estes que apresentavam, por vezes, paredes
espessadas às custas de células positivas para actina-alfa de músculo liso (Figura 9 E e F). No
limite externo da parede muscular do vaso, notou-se uma irregularidade da camada muscular,
muitas vezes exibindo células que aparentemente se destacavam do mesmo (Figura 9 F e G).
O tecido subepitelial mostrou variados padrões de dispersão de células alongadas, com
núcleos alongados, reativas para actina-alfa de músculo liso. Em algumas porções dos anéis
estenosados, estas células foram observadas em menor quantidade na lâmina própria por entre
fibras colágenas e células inflamatórias, (Figura 9 G), assim como na submucosa e adventícia,
entre densos feixes colágenos (Figura 9 H). Em outras regiões destes espécimes, evidenciou-
se uma quantidade significativamente maior de células positivas para actina-alfa de músculo
liso, principalmente na submucosa, formando redes de células alongadas, mais frouxas em
algumas áreas (Figura 10 A) e de grande densidade em outras (Figuras 10 B e C). Na porção
posterior do anel cartilaginoso, observou-se o espessamento dos feixes musculares na
submucosa e na lâmina própria como também do músculo traqueal, na adventícia localizada
entre as terminações do anel C-shaped (Figura 10 D).
33
FIGURA 5- Fotomicrografia de cortes histológicos de traquéias do grupo controle.
A- parede traqueal fina, HE, aumento: 40x tamanho original; B- epitélio de revestimento do
tipo colunar pseudo-estratificado com células caliciformes, sem a presença de cílios (entre
setas), HE, aumento: 400x tamanho original; C- coloração homogênea da camada reticular
pelo picrosirius (setas), aumento: 100x tamanho original; D- intensa reatividade para col I na
camada reticular (setas), aumento: 100x tamanho original; E- lâmina própria exibindo tecido
conjuntivo frouxo (entre setas finas) e submucosa mostrando tecido conjuntivo denso não
modelado (setas largas), HE, aumento: 200x tamanho original; F- imunomarcação para col I
na lâmina própria, aumento: 400x tamanho original (entre setas); G- coloração da submucosa
pelo picrosirius (entre setas), aumento: 100x tamanho original; H-traquéia do grupo controle,
col I, aumento: 100x tamanho original.
34
35
FIGURA 6- Fotomicrografia de cortes histológicos de traquéias do grupo controle (porção
posterior do anel traqueal).
A- tecido conjuntivo denso situado entre as terminações posteriores dos anéis cartilaginos C-
shaped (seta), HE, aumento: 40x tamanho original; B- imunohistoquímica para α-sma
exibindo o tecido muscular traqueal (seta larga), as células mioepiteliais das glândulas
traqueais (seta fina longa) e parede de vasos sanguíneos (seta fina curta), aumento: 40x
tamanho original C- coloração com picrosirius exibindo fibras colagens em feixes compactos,
aumento: 40x tamanho original; D- reatividade para col I, aumento: 40x tamanho original.
36
37
FIGURA 7- Fotomicrografia de cortes histológicos de traquéias do grupo patológico.
A- espessamento subepitelial formando com o epitélio tecido pseudo-polipóide, HE, aumento:
40x tamanho original; B-metaplasia escamosa difusa do epitélio de revestimento (seta), HE,
aumento: 100x tamanho original; C- presença de fibrina (entre setas finas) e tecido de
granulação (entre setas largas), HE, aumento: 100x tamanho original; D- presença de fibrina
(entre setas), HE, aumento: 400x tamanho original; E- tecido de granulação (setas), HE,
aumento: 100x tamanho original; F- zona de granulação com marcação mais fraca e de menor
densidade para picrosirius (setas), aumento: 40x tamanho original; G- imunomarcação mais
fraca para col I, aumento: 40x tamanho original; H- imunomarcação mais fraca para col I,
aumento: 100x tamanho original.
38
39
FIGURA 8- Fotomicrografia de cortes histológicos de traquéias do grupo patológico.
A- tecido subepitelial mostrando difícil individualização entre suas camadas, HE, aumento:
40x tamanho original; B- tecido subepitelial exibindo coloração com picrosirius difusa e
homogênea, com intensidade de moderada a alta, aumento: 100x tamanho original; C-
reatividade para col I, no tecido subepitelial, semelhante à coloração pelo picrosirius,
aumento: 100x tamanho original; D- difícil diferenciação entre camada reticular e lâmina
própria , col I, aumento: 200x tamanho original.
40
41
FIGURA 9- Fotomicrografia de cortes histológicos de traquéias dos grupos controle e
patológico para visualização comparativa.
A- imunoexpressão para α-sma nas paredes de vasos (seta larga) e células mioepiteliais
glandulares (setas finas) de traquéia do grupo controle, aumento: 100x tamanho original; B-
imunoexpressão para α-sma nas paredes de vasos da lâmina própria, em traquéia do grupo
controle, aumento: 200x tamanho original; C- imunoexpressão para α-sma nas paredes de
vasos da submucosa (setas), em traquéia do grupo controle, α-sma, aumento: 200x tamanho
original; D- imunomarcação para α-sma em feixes espessos e organizados do tecido muscular
da submucosa (setas largas) e marcação de feixes musculares lisos finos na lâmina própria
(setas finas), em traquéia do grupo controle, aumento: 100x tamanho original; E- grande
número de vasos na lãmina própria e submucosa imunomarcados para α-sma em traquéia do
grupo patológico, aumento: 100x tamanho original; F e G- espessamento da parede de vasos
às custas de células α-sma positivas (setas largas e finas demonstrando a irregulaidade do
espessamento) em traquéia do grupo patológico, aumento: 200x tamanho original;H- presença
de células alongadas, com núcleos alongados, reativas para α-sma entre densos feixes
colágenos na submucosa e adventícia de traquéia do grupo patológico, aumento: 200x
tamanho original.
42
43
FIGURA 10- Fotomicrografia de cortes histológicos de traquéias do grupo patológico.
A- rede frouxa de células positivas para actina-alfa de músculo liso (entre setas), aumento:
200x tamanho original; B- rede densa de células positivas para actina-alfa de músculo liso
(entre setas), aumento: 40x tamanho original; C- rede densa de células positivas para actina-
alfa de músculo liso (entre setas), aumento: 200x tamanho original; D- espessamento de
feixes musculares na submucosa imunomarcdos para α-sma, aumento: 40x tamanho original.
44
45
4.2 HISTOMORFOMETRIA
4.2.1 Colágeno tipo I
Os resultados da histomorfometria dos cortes histológicos imunomarcados para
colágeno tipo I encontram-se representados nas figuras 12 e 13. A figura 11 mostra fotos
pareadas que permitem a observação da diferença visual acentuada da imunomarcação para
este colágeno entre cortes histológicos do grupo controle e do patológico.
46
FIGURA 11- Fotomicrografias pareadas evidenciando a diferença visual acentuada da
imunomarcação para col I entre cortes histológicos do grupo controle e do patológico.
A- reatividade para col I no tecido subepitelial em corte histológico de espécime do grupo
patológico, aumento: 40x tamanho original; B- tecido subepitelial em corte histológico de
espécime do grupo controle imunomarcado para col I , mostrando densidade
significativamente inferior (à presente no espécime do grupo patológico), aumento: 40x
tamanho original.
47
48
FIGURA 12- Representação gráfica dos percentuais de densidade de marcação para colágeno
tipo I de cada paciente.
49
50
FIGURA 13- Representação gráfica da média dos percentuais de densidade de marcação para
colágeno tipo I dos grupos patológico e controle. Houve diferença significativa entre os
grupos (p<0,05).
51
52
4.2.2 Picrosirius
Os resultados da histomorfometria dos cortes histológicos corados com picrosirius
encontram-se representados nas figuras 15 e 16. A figura 14 mostra fotos pareadas que
permitem a observação da diferença visual acentuada desta coloração entre cortes histológicos
do grupo controle e do patológico.
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FIGURA 14- Fotomicrografias pareadas evidenciando a diferença visual acentuada da
coloração com picrosirius entre cortes histológicos do grupo controle e do patológico.
A- coloração com picrosirius no tecido subepitelial em corte histológico de espécime do
grupo patológico, aumento: 40x tamanho original; B- tecido subepitelial em corte histológico
de espécime do grupo controle submetido ao mesmo corante, mostrando densidade
significativamente inferior (à presente no espécime do grupo patológico), aumento: 40x
tamanho original.
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FIGURA 15- Representação gráfica dos percentuais de densidade de coloração com
picrosirius de cada paciente.
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FIGURA 16- Representação gráfica da média dos percentuais de densidade de coloração com
picrosirius dos grupos patológico e controle. Houve diferença significativa entre os grupos
(p<0,05).
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59
5 DISCUSSÃO
A revisão da literatura mostra que, até o momento, poucos trabalhos a respeito da
histopatologia molecular e intersticial da estenose traqueal foram realizados. A estenose
adquirida que é teoricamente prevenível ou, ao menos reversível, ainda foi pouco elucidada.
A maior parte dos estudos sobre esta linha de pesquisa baseiam-se em análises de modelos de
estenose traqueal induzida em cobaias.
Miller e Sethi (1970) induziram lesões traqueais em cães com a finalidade de testar
tubos com ou sem cuff, além de um protocolo de insuflação e desinsuflação. Observaram
lesões ulceradas, exposição dos anéis cartilaginosos, necrose, tecido de granulação e um
animal desenvolveu estenose traqueal no grupo submetido à insuflação contínua do cuff, ao
passo que o grupo submetido à insuflação intermitente mostrou alterações mucosas mínimas
(Miller e Sethi, 1970).
Marshak et al (1982) desenvolveram um modelo canino de estenose subglótica
secundária à intubação prolongada. Os animais do estudo mostraram ulcerações, tecido de
granulação exuberante ao nível da subglote e traquéia, destruição dos anéis cartilaginosos,
além de um caso de estenose traqueal intensa (Marshak et al., 1982).
Charous et al (1996) propuseram um modelo canino de estenose subglótica para
investigação das características patofisiológicas da fibrose excessiva. Concluíram que a
injúria cartilaginosa é imprescindível para o desenvolvimento da estenose, uma vez que os
animais que sofreram somente injúria mucosa/submucosa não desenvolveram esta patologia
(Charous et al., 1996).
Eliashar et al (2000) também propuseram um modelo canino para pesquisa da estenose
laringotraqueal e observaram que todos os cães desenvolveram estenose no período de 12 a 14
dias, As alterações histopatológicas compreenderam ulcerações mucosas e tecido de
granulação em alguns animais e, em outros, presença de tecido conjuntivo altamente fibrótico
60
abaixo do epitélio ulcerado. A cartilagem apresentou necrose focal e alterações regenerativas
(Eliashar et al., 2000).
Jarmuz et al (2004) analisaram cortes histológicos de estenose traqueal em ratos e
encontraram tecido epitelial hipertrófico com rugosidades e perda dos cílios. O tecido
subepitelial apresentou espessura aumentada, aumento da vascularização e deposição de
tecido conjuntivo (Jarmuz et al., 2004).
Nakagishi et al (2005), por sua vez, propuseram um modelo de estenose das vias
aéreas em coelhos. A avaliação histológica das lesões estenóticas mostrou áreas de inflamação
com hiperplasia submucosa causada pela proliferação de fibroblastos e espessamento das
fibras colágenas, número aumentado de capilares e ulceração epitelial (Nakagishi et al.,
2005).
Roh et al (2006) desenvolveram um modelo de estenose subglótica adquirida em
coelhos.Observaram ulceração mucosa, inflamação e formação de tecido de granulação
durante a fase aguda dacicatrização, e colapso da cartilagem lesada, espessamento da
submucosa e fibrose em fase mais avançadas do processo de cicatrização. Os autores
chegaram à conclusão que a estenose depende da extensão da lesão cartilaginosa (Roh et al.,
2006).
Em outro estudo, Nakagishi et al (2008) mostraram fotomicrografias histológicas das
estenoses induzidas em coelhos, exibindo tecido de granulação denso composto de
fibroblastos em proliferação e espessas fibras colágenas, e concluíram que a hipertrofia
tecidual da submucosa foi a causa primária da estenose. Estas características patológicas
foram observadas em toda área da estenose, mas foram raramente detectadas na submucosa
normal (Nakagishi et al., 2008).
61
Estudos sobre alterações histopatológicas na estenose traqueal em humanos são
escassos. Miller e Sethi (1970) avaliaram estenose traqueal em segmentos de autópsia de
pacientes submetidos à intubação traqueal por períodos de 36h a 23 dias. Todos os pacientes
apresentaram lesões no local do cuff, sendo que o grau da injúria foi diretamente relacionado à
duração da intubação. Os achados histopatológicos compreenderam ulceração profunda com
destruição dos anéis cartilaginosos e proliferação de tecido de granulação (Miller e Sethi,
1970).
Bellon et al (1985) observaram que amostras de estenose traqueal humana
apresentaram lúmen diminuído pela aposição de tecido conjuntivo fibrilar com fibroblastos e
áreas hialinas. Espessas fibras colágenas penetravam profundamente nas áreas cartilaginosas,
as quais se apresentarm irregulares, reduzidas em tamanho e infiltradas com células parecidas
com fibroblastos, altamente diferente de condrócitos A análise histológica mostra lise das
áreas cartilaginosas, as quais se apresentam infiltradas por espessas fibras colágenas
intersticiais. (Bellon et al., 1985).
Papla et al (2003) examinaram amostras de traquéias humanas com estenose pós-
intubação e a análise histológica revelou considerável espessamento da mucosa e submucosa
e áreas freqüentes de lesões degenerativas da cartilagem (em alguns casos, pode-se notar
enrugamento da cartilagem resultante da contração cicatricial, o que claramente potencializou
a estenose do segmento). O espessamento resultou de um aumento marcante de tecido fibroso.
A mucosa, que é geralmente lisa, mostrou enrugamento, interpretado por alguns autores como
pólipos. Independentemente do período de tempo pós-intubação, a mucosa demonstrou
extensa ulceração, com áreas de epitélio ausentes. As margens das ulcerações apresentaram
metaplasia escamosa. A submucosa apresentou tecido de granulação com numerosos
capilares, considerável proliferação de fibras de tecido conjuntivo, hialinização e infiltrado
inflamatório contendo, principalmente neutrófilos e raros linfócitos e plasmócitos.
62
Jarmuz et al (2004) realizou análise histológica de amostras de traquéias humanas com
estenose as quais exibiram tecido subepitelial espessado com deposição de tecido conjuntivo e
tecido de granulação vascularizado, e epitélio em vários estágios de reparo, observando-se
metaplasia escamosa progredindo para o epitélio basal, e, finalmente o retorno do epitélio
ciliado. Um importante achado foi que mesmo com a volta do epitélio respiratório normal, a
submucosa permaneceu hipertrófica (Jarmuz et al., 2004).
Estudo de Karagiannidis et al (2006) revelou que as amostras de estenose traqueal
humana estudadas mostraram alta deposição de matriz extracelular e fibrose, mas quase
nenhuma proliferação subepitelial. Apesar do trauma de intubação ter ocorrido semanas ou
meses antes da obtenção das amostras, observou-se metaplasia e alta proliferação da camada
basal do epitélio (Karagiannidis et al., 2006).
Nossos resultados da avaliação histopatológica dos espécimes humanos obtidos de
pacientes com estenose traqueal adquirida pós-intubação, mostram notável modificação da
arquitetura da traquéia. Observamos exuberante metaplasia escamosa difusa do epitélio de
revestimento na maioria dos espécimes e, ulceração, em outras amostras. Foi observado
intenso espessamento da parede traqueal pela hipertrofia e/ou hiperplasia da submucosa e
lâmina própria, constituindo o que denominamos de tecido pseudopolipóide. A coloração com
H&E mostrou um tecido subepitelial com difícil individualização entre suas camadas. Não se
observou diferenciação entre a camada reticular e a lâmina própria, devido à compactação das
fibras colágenas. Os cortes histológicos dos pacientes do grupo patológico também exibiram
uma maior vascularização da lâmina própria e submucosa. Observamos também, como
descrito na literatura, destruição dos anéis cartilaginosos traqueais. No entanto, a análise das
cartilagens não foi desenvolvida como foco principal do nosso trabalho. Apesar de haver
poucos estudos imunohistoquímicos da cartilagem na estenose traqueal humana, estes já
forneceram informações mais detalhadas sobre a distribuição do colágeno na matriz
63
cartilaginosa, do que as obtidas a respeito da fibrose subepitelial na mesma patologia. Além
disso, para a realização da análise imunohistoquímica para colágeno I na cartilagem traqueal
seria necessária a utilização de outro protocolo que permitisse um preparo enzimático
adequado para o tecido cartilaginoso, o que esclarece a razão pela qual não houve
imunomarcação para colágeno I neste tecido em nossos espécimes. Com a técnica por
picrosirius, observamos uma coloração de padrão regular ao longo da cartilagem em todos os
espécimes de ambos os grupos, provavelmente relacionada à presença de colágeno I e II na
cartilagem hialina.
O desenvolvimento da estenose está associado a danos ao epitélio traqueal seguido de
edema e inflamação. Estes eventos são acompanhados de uma resposta tecidual caracterizada
por afluxo de fibroblastos para o local da lesão, aumento da deposição de matriz extracelular e
fibroproliferação, resultando em estenose da via aérea (Jarmuz et al., 2004). De acordo com a
literatura, os danos ao epitélio traqueal são principalmente causados pela pressão do cuff ou
tubo na parede da traquéia (Miller e Sethi, 1970; Bassett, 1971; Ching et al., 1974;
Weymuller, 1988; Grillo e Donahue, 1996; Spittle e Mccluskey, 2000). Miller e Sethi (1970)
relatam que todos os pacientes de seu estudo apresentaram lesões no local do cuff, sendo que
o grau da injúria foi diretamente relacionado à duração da intubação (Miller e Sethi, 1970). Os
dados retrospectivos dos pacientes a partir dos quais obtivemos as amostras avaliadas em
nossa pesquisa estão em concordância com os fatores etiopatogênicos descritos na literatura.
Dentre os pacientes estudados, 30% permaneceram em UTI apenas sob intubação orotraqueal
(com presença do tubo de intubação, que contém o cuff , na laringe/traquéia) enquanto que
70% foram mantidos parte deste período com o tubo orotraqueal e parte subseqüente com
cânula portex com cuff insuflado (traqueotomia). Todos os pacientes da amostra estudada
apresentaram estenose em áreas de contato com o tubo e/ou cânula, mas nenhum dos
pacientes traqueotomizados apresentou estenose no orifício da taqueotomia ou de sua cicatriz.
64
O tempo total mínimo de intubação endotraqueal, ou seja, exposição ao tubo com cuff
insuflado (tubo orotraqueal ou tubo orotraqueal/cânula) foi de 8 dias e o tempo máximo de 90
dias. Não dispomos de informações quanto ao tipo de cuff utilizado, à realização de
protocolos de desinsuflações periódicas do cuff ou de controle pressório do mesmo, bem
como à presença de co-morbidades tais como infecção traqueal, uso de corticosteróides e
refluxo gastroesofágico patológico.
Sabe-se que há duas apresentações da estenose traqueal em diferentes períodos da
história natural desta patologia. A fase precoce da estenose traqueal é caracterizada por
ulceração mucosa e pericondrite, seguida da formação de um tecido de granulação exofítico
(Marshak et al., 1982; Supance et al., 1982) Ulcerações, com presença de tecido de
granulação subjacente, foram observadas principalmente em pacientes nos quais o período de
tempo entre a intubação e a ressecção do segmento estenosado foi curto (12-18 semanas), mas
estas características também foram encontradas após um longo intervalo de tempo (30
semanas) (Papla et al., 2003). A ausência de ulcerações na maioria dos pacientes de nosso
grupo patológico, deve-se, provavelmente, ao maior tempo de evolução da doença dos
mesmos, uma vez que o tempo médio entre a intubação e a cirurgia para remoção do
segmento com estenose foi de 38 semanas. Além disso, assim como descrito por Papla et al
(2003), observamos predominância de fibrose e escasso infiltrado inflamatório nos pacientes
com intervalo de tempo longo entre o aparecimento da estenose e sua ressecção. A
predominância da fibrose caracteriza a fase tardia da estenose traqueal, que surge com a
progressão da cicatrização. O tecido de granulação é gradualmente substituído por um tecido
fibrótico maduro “firme” e a ferida se contrai, trazendo à tona a clássica figura da cicatriz
madura (Marshak et al., 1982; Supance et al., 1982).
Na prática clínica, a maioria dos pacientes com estenose traqueal pós-intubação
apresentam cicatrizes maduras com mínima evidência de inflamação presente. Estes pacientes
65
relatam tipicamente um episódio de intubação em um passado relativamente distante. O
encaminhamento de pacientes durante a fase fibroinflamatória ativa da injúria traqueal, que
ocorre dentro de semanas após a extubação, é pouco comum (Nouraei et al., 2006). Este fato
foi observado em nosso estudo, visto que o período de tempo entre o surgimento da lesão e o
primeiro atendimento especializado dos pacientes com estenose traqueal avaliados variou de
01 a 25 meses, sendo que a maioria deles receberam o primeiro atendimento especializado
com mais de 03 meses de progressão da doença.
Estudos imunohistoquímicos em amostras de estenose humana são ainda mais
escassos do que os realizados por técnicas de colorações histológicas. Mankarious et al (2002)
analisaram somente a cartilagem traqueal, através de análise imunohistoquímica. Os autores
investigaram os níveis de colágeno tipos I e II nas áreas de fratura da cartilagem traqueal e
observaram perda de colágeno tipo I e agrecana nas áreas de comprometimento severo dos
anéis cartilaginosos, indicando que no mínimo uma destas duas moléculas é responsável por
sua integridade estrutural. A cartilagem remanescente apresenta alguma capacidade
regenerativa, demonstrada por pequenas áreas de deposição de agrecana e colágeno tipo II
localizadas próximas às áreas de maior comprometimento dos anéis, mas é pequena em
comparação com o grau de dano. Não foi identificado nenhum colágeno tipo I novo nos anéis
cartilaginosos, o que indica que, apesar da intensa reação anti-inflamatória, os fibroblastos
não depositaram colágeno tipo I como observado em outros tecidos em cicatrização
(Mankarious et al., 2002).
Jarmuz et al (2004) realizaram análise imunohistoquímica para actina alfa de músculo
liso em amostras de estenose traqueal humana. A análise imunohistoquímica dos tecidos
mostrou novelos de células positivas para este marcador no tecido subepitelial. As células
apresentaram uma aparência maior e mais arredondada em comparação com os fibroblastos
estreitos, afilados fibroblastos adjacentes (Jarmuz et al., 2004).
66
Karagiannidis et al (2006) relataram a diferenciação de fibroblastos subepiteliais em
miofibroblastos, indicada pela marcação positiva de actina alfa de músculo liso nestas células
observada através da análise imunohistoquímica (Karagiannidis et al., 2006).
Realizamos, em nosso estudo, análise imunohistoquímica para actina alfa de músculo
liso e para colágeno tipo I. Observamos a presença de variados padrões de dispersão de
células alongadas, com núcleos alongados, reativas para actina alfa de músculo liso no tecido
subepitelial dos espécimes com estenose. Em algumas porções do tecido subepitelial dos
anéis estenosados, estas células, os miofibroblastos, foram observados em menor quantidade
na lâmina própria, por entre fibras colágenas e células inflamatórias, assim como na
submucosa e adventícia. Em outras regiões destes espécimes, evidenciou-se uma quantidade
significativamente maior de miofibroblastos, principalmente na submucosa, formando redes
de células alongadas, mais frouxas em algumas áreas e de grande densidade em outras. A
proliferação persistente e abundante de miofibroblastos nestas lâminas provavelmente
corresponde à presença de mecanismos de ativação contínua destas células, ainda não
elucidados.
Em relação à imunomarcação para colágeno tipo I, nas amostras de estenose traqueal,
observou-se o predomínio de um padrão com expressão aumentada para colágeno tipo I,
compondo um tecido subepitelial fibrótico denso com menor distinção entre suas camadas,
devido à compactação das fibras colágenas e homogeneização da reatividade para este tipo de
colágeno. A lâmina reticular dos cortes histológicos do grupo controle exibiu expressão
intensa e homogênea pela marcação de colágeno tipo I. Os colágenos tipo I e III apresentam a
propriedade de ligação cruzada e apresentam força de tensão significativa (Doolin et al.,
1998). Assim, acreditamos que a forte marcação corresponda a feixes mais compactos de
colágeno I que conferem uma base mais firme ao epitélio e também represente uma faixa de
resistência superficial, protetora para o conjuntivo subjacente. A coloração por picrosirius
67
mostrou padrão semelhante à imunomarcação para colágeno tipo I em todas as lâminas do
grupo patológico.
Há, na literatura, escassos estudos sobre colágeno em traquéias humanas. Bellon et al
(1985), por meio de estudos bioquímicos, encontraram grandes diferenças na distribuição dos
tipos de colágeno entre amostras normais e estenosadas de traquéias humanas. Demonstraram
que a parede anterior da traquéia contém praticamente todo colágeno tipo II e que, no curso da
estenose, a porcentagem deste colágeno é diminuída em mais de 50%, ao passo que a
porcentagem de colágeno tipo I aumenta em 5 vezes. Mostraram também que há poucas
alterações na parede posterior, somente um limitado aumento de colágeno tipo III. Além
disso, demonstraram que, na amostra obtida do paciente com maior duração da doença, parece
haver maior quantidade de colágeno tipo I, o que está de acordo com os nossos resultados.
Este autor ainda afirma que a substituição do colágeno tipo II por colágeno tipo I na estenose
traqueal é um caso peculiar de tecido conjuntivo inflamado, que fornece exemplo de um
mecanismo de substituição de colágeno tipo II por tipo I na presença de doença inflamatória.
O melhor exemplo conhecido deste mecanismo é o da artrite reumatóide (Bellon et al., 1985).
Porém, julgamos esta afirmação imprecisa uma vez que, naquele estudo, a cartilagem e o
tecido subepitelial foram analisados em conjunto por métodos bioquímicos de todas as
camadas da parede traqueal, e não separadamente como seria adequado para tal afirmação.
Julgamos que o aumento de colágeno tipo I é decorrente da fibrose subepitelial, e, a
diminuição de colágeno tipo II, deve-se aos danos à cartilagem provocados pelo processo
inflamatório da estenose. Além disso, naquele estudo, a amostra de estenose estudada foi
pequena, contendo somente dois espécimes.
Não encontramos, na literatura, estudos morfométricos da marcação dos colágenos
pela coloração com picrosirius e da imunomarcação para colágeno tipo I em traquéias
humanas. A análise estatística dos dados morfométricos de nossa amostra demonstrou que
68
todos os espécimes de estenose traqueal apresentaram percentuais de densidade óptica de
áreas coradas com picrosirius e imunomarcadas para colágeno tipo I superiores aos do grupo
controle. Tanto o percentual médio de densidade para picrosirius, quanto o de imunomarcação
para colágeno tipo I, mostraram superioridade estatisticamente significativa do grupo
patológico (p < 0,05), sendo a diferença deste grupo para o grupo controle menor na
coloração com picrosirius. A significativa superioridade dos percentuais de densidade das
fibras colágenas do grupo patológico sobre o grupo controle comprova, numericamente, os
resultados descritivos das alterações histopatológicas, quais sejam: hiperplasia/hipertrofia do
tecido subepitelial pela excessiva deposição de colágeno (mostrada pela coloração com
picrosirus), às custas, principalmente, de intensa deposição de colágeno tipo I (mostrada pela
análise imunohistoquímica para colágeno tipo I ), contribuindo para o desenvolvimento da
estenose traqueal pós-intubação.
A maioria dos autores afirma que a deposição de matriz extracelular é um dos eventos
mais importantes no desenvolvimento da estenose traqueal (Liu et al., 1995; Jarmuz et al.,
2004; Karagiannidis et al., 2006). Nossos achados de um aumento significativo de colágeno
tipo I na lâmina própria e na submucosa são evidências da importância da matriz extracelular
(MEC) no processo. Observamos alta deposição de MEC e fibrose, mas pouca proliferação
celular subepitelial na maioria dos espécimes do grupo patológico. No entanto, verificamos a
presença de proliferação moderada em um paciente e, proliferação marcante, com formação
de uma rede densa de miofibroblastos, em outro paciente deste grupo. Estes dados estão em
concordância com o estudo de Karagiannidis et al (2006) que também mostrou alta deposição
de matriz extracelular e fibrose, mas quase nenhuma proliferação celular subepitelial. Estes
autores acreditam que esta proliferação ocorra em um estágio precoce da patogênese, estes
observaram a estenose em fase tardia (Karagiannidis et al., 2006).
69
Estudo de Jarmuz et al (2004) sugere que a injúria traqueal estimula a liberação de
fatores que promovem a transformação de fibroblastos traqueais em miofibroblastos (Jarmuz
et al., 2004). Os miofibroblastos foram descobertos em tecido de granulação como células
híbridas de fibroblastos e células de musculatura lisa. Ultraestruturalmente, apresentam tanto
elementos contráteis, observados em células de musculatura lisa, quanto retículo
endoplasmático rugoso bem desenvolvido encontrado em fibroblastos (Gabbiani et al., 1971).
Atualmente, a microscopia eletrônica fornece meios precisos de identificação destas células,
através da observação de várias características estruturais - retículo endoplasmático rugoso
proeminente, miofilamentos periféricos de musculatura lisa e junções fibronexus – observados
dentro do contexto morfológico de células fusiformes e positivas para actina alfa e
fibronectina na análise imunohistoquímica (Eyden, 2008). As junções fibronexus são contatos
extensos célula-matriz, os quais se encontram ausentes nos fibroblastos do tecido conjuntivo
normal (Eyden, 2005). Acredita-se que os miofibroblastos não sejam componentes dos
tecidos normais, com exceção do ligamento periodontal e testículos, mas células que surgem
em condições patológicas como fibrose, tecido de granulação, estroma tumoral e feridas
(Eyden, 2008).
Em relação à origem dos miofibroblastos, a visão tradicional é que estes se originam
de células mesenquimais quiescentes, residentes nos tecidos circundantes. A principal célula
implicada nesta origem são os fibroblastos, mas acredita-se que pericitos, células musculares
lisas e, até mesmo o endotélio, possam ser suas precursoras. (Ronnov-Jessen et al., 1995). Há,
na literatura, outros mecanismos alentados para explicar a origem dos miofibroblastos.
Células circulantes derivadas da medula óssea, também chamadas de fibrócitos, seriam
capazes de povoar tecidos normais, tecido de granulação, áreas de fibrose e estroma tumoral
(Quan et al., 2004; Wynn, 2008). A transformação ou transição epitélio-mesenquimal assim
como a transformação ou transição endotélio-mesenquimal são outros mecanismos propostos
70
para a origem destas células (Eyden, 2008; Wynn, 2008). São necessários, entretanto, novos
estudos sobre estas teorias para a confirmação ultraestrutural e imunohistoquímica das
mesmas (Eyden, 2008). Até o presente momento, nenhuma proteína do citoesqueleto permite
discriminação confiável entre miofibroblastos e células musculares lisas (Hinz, 2007). Há
estudos promissores para a identificação dos miofibroblastos baseados na expressão de
caderinas, que são proteínas de adesão específicas (Hinz e Gabbiani, 2003). Os mecanismos
de indução de diferenciação, ativação e apoptose dos miofibroblatos ainda não foram
totalmente elucidados. A diferenciação destas células é induzida por estímulos mecânicos,
como o mecanismo de mecano-regulação, baseado na diferenciação de fibroblastos em
miofibroblastos pela presença de estresse mecânico (Tomasek et al., 2002; Junker et al.,
2008) e pela atuação de estímulos solúveis, como o fator de crescimento tecidual beta-1
(TGF-β1) e outras citocinas, sobre fibroblastos e outras células precursoras (Hinz et al.,
2007). O TGF-β1 promove o desenvolvimento dos miofibroblastos pela indução da expressão
de actina alfa (Desmouliere et al., 1993; Tomasek et al., 2002), de proteínas da MEC (Werner
e Grose, 2003) e de proteínas do citoesqueleto, as quais constroem o aparato contráctil destas
células (Malmstrom et al., 2004). São ativados por uma variedade de mecanismos, incluindo
sinais parácrinos derivados de linfócitos e macrófagos, fatores autócrinos secretados pelos
próprios miofibroblastos, e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), produzidos
por organismos patogênicos que interagem com recptores de reconhecimento dos fibroblastos
(Wynn, 2008). Os miofibroblastos participam ativamente da produção de componentes da
matriz extracelular, tais como tenascina, fibronectina e colágeno, além de serem responsáveis
pela síntese de enzimas envolvidas na degradação da matriz (Lorena et al., 2002). Apresentam
síntese de colágeno mais alta que os fibroblastos, especialmente dos colágenos tipo I e III
(Evans et al., 2003). Desta maneira, a deposição de componentes da matriz do tecido
conjuntivo na parede traqueal pelos miofibroblastos pode influenciar o futuro
71
desenvolvimento da estenose (Jarmuz et al., 2004). Em relação ao processo de cicatrização,
além de estarem envolvidas na produção de matriz extracelular, sugere-se que estas células
também participem da contração tecidual. Na remodelação tecidual fisiológica, como na
cicatrização da derme, a atividade contrátil dos miofibroblastos é finalizada quando o reparo é
concluído; a expressão de actina alfa de músculo liso diminui e os miofibroblastos
desaparecem por apoptose (Desmouliere et al., 1995). Na cicatrização patológica, entretanto,
a atividade dos miofibroblastos persiste e acarreta deformação tecidual, como, por exemplo,
nas cicatrizes hipertróficas após queimaduras e na fibrose hepática (Desmouliere et al., 2003).
Acreditamos que a pressão mecânica exercida pelo cuff ou tubo na parede traqueal
possivelmente acarretou no aparecimento de uma rede de miofibroblastos na traquéia de
pacientes com estenose pós-intubação. A origem destes miofibroblastos provavelmente está
associada ao mecanismo de mecano-regulação, como descrito na literatura (Tomasek et al.,
2002; Junker et al., 2008), e também à presença de ulcerações provocadas pelo trauma
contínuo do cuff ou tubo na parede traqueal. Estas ulcerações dão início ao processo
inflamatório com liberação de mediadores solúveis que atuam sobre as células precursoras
dos miofibroblastos, como descrito por Hinz et al (Hinz et al., 2007).
Em nossos espécimes de estenose traqueal, observamos uma maior vascularização da
lâmina própria e submucosa, com vasos de paredes espessadas às custas de células positivas
para actina-alfa de músculo liso e apresentando frequente irregularidade da camada muscular,
muitas vezes exibindo células que aparentavam se destacar da mesma. Acreditamos que estas
células positivas para actina-alfa de músculo liso e que aparentavam se destacar da parede dos
vasos possam também ser indícios da origem dos miofibroblastos encontrados no tecido
subepitelial, de acordo com a teoria da diferenciação miofibroblástica a partir de pericitos das
paredes vasculares (Ronnov-Jessen et al., 1995). A modificação da parede de vasos
sanguíneos, capilares, vênulas e arteríolas em relação ao componente reativo actina-alfa de
72
músculo liso também pode refletir um processo de desdiferenciação da parede e migração de
células positivas para este marcador, como citado na literatura (Eyden, 2008; Wynn, 2008).
A população de miofibroblastos encontrada no tecido subepitelial de todos os nossos
espécimes de estenose traqueal está provavelmente relacionada à deposição em excesso de
colágeno na traquéia de pacientes com estenose pós-intubação. A deposição excessiva de
colágeno total, demonstrada pela coloração com picrosirius, e a deposição excessiva de
colágeno tipo I, demonstrada pela análise imunohistoquímica, estão em concordância com os
dados da literatura, que relatam que os miofibroblastos apresentam síntese de colágeno mais
alta que os fibroblastos, especialmente dos colágenos tipo I e III (Evans et al., 2003).
A estenose traqueal é resultado de um processo de cicatrização patológico. O processo
de cicatrização normal é composto por três fases: inflamatória, proliferativa e de maturação. O
reparo tecidual normal nas últimas duas fases é atingido através de um processo coordenado
no qual o equilíbrio entre a síntese e a destruição da matriz é mantido (Correa et al., 1999). Na
estenose traqueal este delicado equilíbrio é perdido. Os estímulos e os mediadores que
direcionam o reparo tecidual não são corretamente extintos e há formação de uma “cicatriz
hipertrófica” na região subglótica, levando à obstrução das vias aéreas superiores (Eliashar et
al., 2006). Supõe-se que pacientes que desenvolvem estenose das vias aéreas apresentam uma
resposta inflamatória distinta da habitual, com diferente perfil dos mediadores inflamatórios
(Branski et al., 2005). A modulação da resposta tecidual da traquéia è considerada o fator
chave no desenvolvimento da doença (Jarmuz et al., 2004).
Nossos resultados também demonstram que a estenose traqueal pós-intubação parece ser
resultado de um desequilíbrio da reparação local, tendo em vista que, associado ao tecido de
granulação verificado nos casos mais recentes, nota-se o aparecimento de inúmeros
miofibroblastos que permanecem in loco em tempos mais tardios. É importante relatar que
encontramos miofibroblastos no tecido subepitelial de todos os espécimes do grupo
73
patológico analisados, inclusive naqueles com maior tempo de evolução da doença. Assim,
supomos que haja algum fator/fatores que impeça/impeçam a apoptose destas células,
impedindo a finalização do processo de reparo. A atividade contínua dos miofibroblastos foi
responsável pela deposição de matriz extracelular, principalmente de colágeno tipo I,
acarretando em hipertrofia/hiperplasia da submucosa. Além disso, devido à sua atividade
contrátil, estas células participam do processo de contração dos tecidos traqueais. Como a
traquéia é uma estrutura tubular semi-rígida, a contração tecidual tende a estreitar seu lúmen.
Esta contração, associada à deposição em excesso de matriz extracelular, contribui para o
desenvolvimento da estenose traqueal.
Acreditamos que, semelhante ao que é conhecido para alguns tipos de fibrose, a
estenose traqueal parece ser um processo que se auto-perpetua levando ao aumento
progressivo da deposição de colágeno nas paredes da traquéia.
.
74
6 CONCLUSÕES
1- Na estenose traqueal humana pós-intubação, há marcante aumento da espessura
parietal pela presença de frequente metaplasia escamosa do epitélio e exuberante fibrose
subepitelial.
2- O espessamento parietal na estenose traqueal humana pós-intubação é decorrente
principalmente da fibrose exuberante, pela deposição excessiva de matriz extracelular, às
custas de espessas fibras colágenas, com marcante participação do colágeno tipo I, formando
um tecido subepitelial denso, de difícil diferenciação entre sua camadas.
3- O presente estudo não encontrou correlação proporcional entre o tempo de doença e
os danos causados à arquitetura parietal da traquéia.
4- A histomorfometria das lâminas de estenose coradas com picrosirius e
imunomarcadas para colágeno tipo I comprova a excessiva deposição de colágeno total e a
maior compactação das fibras colágenas, com marcante deposição de colágeno tipo I,
confirmando os achados das análises descritivas histológica e imunohistoquímica.
5- O aumento da deposição de colágeno na estenose traqueal humana está relacionado à
presença e ativação persistentes dos miofibroblastos, encontrados no tecido subepitelial de
todos os espécimes de estenose traqueal pós-intubação, mesmo naqueles com maior tempo de
evolução da doença.
6- A estenose traqueal humana pós-intubação é decorrente, principalmente, do
espessamento parietal da traquéia associado à degradação dos anéis cartilaginosos .
75
7 PERSPECTIVAS
1- São necessários novos estudos para avaliação dos fatores que contribuem para o
aumento da deposição da MEC e/ou degradação mesma, como,por exemplo, o papel das
metaloproteinases no processo de reparo tecidual de lesões traqueais pós-intubação .
2- Acreditamos que haja um componente genético que contribua para um processo de
reparação tecidual patológico, uma vez que, na prática clínica, observa-se a presença de
cicatrização cutânea hipertrófica e/ou quelóides em vários pacientes portadores de estenose
pós-intubação. Talvez o estudo genético dos miofibroblastos traqueais e cutâneos destes
pacientes possa auxiliar na elucidação dos mecanismos patogênicos destes processos
patológicos, o que poderia permitir a identificação de indivíduos com predisposição a estas
patologias, além de ajudar no desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas.
76
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gastric juice, corticosteroids, and peptide growth factors in a porcine model. Laryngoscope,
v.108, n.6, Jun, p.854-62. 1998.
83
ANEXO
Folha de aprovação do comitê de ética em pesquisa do Hospital Geral de Bonsucesso-Rio de
Janeiro-RJ
84
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