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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
Estudo farmacológico
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do
dodo
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sobre a
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contratilidade
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da aorta isolada de rato
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da aorta isolada de rato
DIENIFFER PEIXOTO NEVES
FORTALEZA
2009
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DIENIFFER PEIXOTO NEVES
Estudo farmacológico
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do timol e carvacrol
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da aorta isolada de rato
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da aorta isolada de rato
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado Acadêmico em Ciências
Fisiológicas da Universidade Estadual
do Ceará como requisito parcial para
obtenção do grau de mestre em Ciências
Fisiológicas.
Orientador: Profº Dr. José Henrique Leal Cardoso
FORTALEZA
2009
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Dieniffer Peixoto Neves
Dieniffer Peixoto NevesDieniffer Peixoto Neves
Dieniffer Peixoto Neves
Estudo farmacológico do timol e carvacrol sobre a
contratilidade da aorta isolada de rato
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências
Fisiológicas da Universidade Estadual do Ceará como requisito parcial para
obtenção do grau de mestre em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em 9/04/09 Conceito Obtido: Satisfatório
Nota final: 10,0
Orientador: Profº Dr. José Henrique Leal Cardoso
BANCA EXAMINADORA
____________________________
Profª Drª Andrelina Noronha Coelho de Souza
Universidade Estadual do Ceará
____________________________
Prof
ª
Drª Crystianne Calado Lima
Universidade Estadual do Ceará
____________________________
Prof° Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães
Universidade Federal do Ceará
4
Agradecimentos
Ao meu orientador, Profº Dr. José Henrique Leal Cardoso, por todos os
inestimáveis ensinamentos e por despertar em mim o amor pela ciência. Obrigada
Professor Henrique, pela paciência, pelas oportunidades oferecidas e por acreditar e
confiar em mim, mesmo em momentos adversos.
Aos meus pais, Denizar Lauser Neves e Mara Eliane Peixoto Neves, pelo amor
incondicional e pelo exemplo de dignidade, respeito e educação. Pelo valioso apoio,
pelas palavras de incentivo e motivação que foram fundamentais nos momentos de
desistência. Não tenho palavras para agradecer por tudo o que vocês representam
na minha vida.
À minha irmã, Francielle Peixoto Neves, pela paciência e apoio durante toda esta
jornada.
Ao meu amigo Felipe Crescêncio Lima, que me acompanha desde o início da
graduação, me alegrando com sua amizade e companheirismo. Obrigada pelo apoio
e incentivo; por ter me dado oportunidades ímpares, entre as quais a chance de
participar do laboratório de eletrofisiologia.
À minha linda amiga Maria Diana Moreira Gomes que, com sua alegria e vontade
de viver, tornou a minha vida mais colorida. Obrigada pela amizade e cumplicidade,
pelas palavras de incentivo, por estar sempre ao meu lado em todos os momentos
da minha vida, sempre com muita paciência aguentando o meu mau humor.
Obrigada por você existir na minha vida, pelo carinho e atenção dispensados a mim.
À professora Drª Andrelina Noronha Coelho de Souza, pela atenção e sábios
ensinamentos e pela indispensável contribuição neste trabalho.
Ao professor Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães, pela gentileza em ceder algumas
drogas e, principalmente, por contribuir com sua experiência e sabedoria para
melhorar o meu trabalho.
5
Ao professor Dr. Saad Lahlou, pela dedicação e por aperfeiçoar o meu trabalho com
sua experiência e sabedoria.
Ao amigo e colega Pedro Militão de Albuquerque Neto, pela atenção e dedicação
no laboratório. Pela convivência e paciência.
Aos amigos Francisco Walber Ferreira da Silva e Kerly Shamyra da Silva Alves,
pela amizade, companheirismo e palavras de incentivo. Obrigada Kerly, pela
disposição e pelo tempo dispensado aos meus experimentos no setup intracelular.
Ao colega Francisco José Ferreira dos Santos (Franck), pela convivência e pela
dedicação com que cuida dos nossos animais.
Aos demais colegas do Laboratório de Eletrofisiologia, pela boa convivência.
À Universidade Federal do Ceará, pelo fornecimento dos animais utilizados
neste estudo.
À Deus, por permitir que eu alcance todos os meus objetivos e sonhos, por me dar
força e coragem para enfrentar todas as adversidades e obstáculos.
6
Apraz-me dedicar este trabalho às
pessoas mais importantes da minha vida,
meus pais Denizar Lauser Neves e Mara
Eliane Peixoto Neves.
7
Sumário
Página
Lista de Figuras 9
Lista de Tabelas 11
Lista de Abreviaturas 12
Resumo 14
Abstract 15
INTRODUÇÃO 16
CONSIDERAÇÕES GERAIS 16
ESTRUTURA E FUNÇÃO DO SISTEMA CARDIOVASCULAR 17
MÚSCULO LISO VASCULAR 18
Mecanismo de contração 18
PRODUTOS NATURAIS 24
Timol e Carvacrol 25
RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA 32
OBJETIVOS 34
MATERIAL E MÉTODOS 35
MATERIAL 35
Sais e fármacos 35
Soluções 35
Animais 36
MÉTODOS 36
Preparação in vitro 36
Medida das respostas mecânicas do músculo liso de aorta 37
Protocolos experimentais 38
8
Medida do potencial transmembrana 43
Tratamento estatístico 45
RESULTADOS 46
Efeito do timol e carvacrol sobre o tônus intrínseco da aorta isolada
em presença de endotélio.
46
Efeito inibitório do Timol e CVC sobre as contrações induzidas por
potássio em aorta isolada de rato com e sem endotélio.
48
Efeito inibitório do Timol e CVC sobre as contrações induzidas por
fenilefrina em aorta isolada de rato com e sem endotélio.
52
Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração sustentada de
potássio em aorta isolada de rato.
55
Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração sustentada de
fenilefrina em aorta isolada de rato e a influência do endotélio.
58
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração de fenilefrina
em aorta isolada mantida em meio isento de Ca
2+
.
62
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração induzida por
influxo de Ca
2+
em aorta despolarizada por potássio.
65
Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração sustentada por
ester de forbol na aorta isolada de rato sem endotélio mantida em
meio isento de Ca
2+
e em presença de tapsigargina.
68
Comparação dos efeitos de timol e carvacrol com o efeito do inibidor
de Rho cinase sobre a contração sustentada de potássio.
71
Efeito do timol e carvacrol sobre o potencial transmembrana da aorta
isolada de rato sem endotélio.
73
DISCUSSÃO 75
CONCLUSÃO 82
REFERÊNCIAS 83
9
Lista de Figuras
Figura Página
1.
Via de sinalização molecular envolvendo a contração do músculo
liso induzida por agonista ou por ativação de canais de Ca
2+
.
19
2.
Mecanismos envolvidos na regulação da fosforilação da rMLC. 23
3.
Lippia sidoides Cham.
26
4.
Estrutura molecular do timol e carvacrol. 27
5.
Representação esquemática do sistema utilizado para registro das
contrações.
38
6.
Esquema ilustrativo da série 1. 39
7.
Esquema ilustrativo da série 2. 40
8.
Esquema ilustrativo da série 3. 41
9.
Esquema ilustrativo da série 4. 41
10.
Esquema ilustrativo da série 5. 42
11.
Esquema ilustrativo da série 6. 43
12.
Esquema ilustrativo da série 7. 43
13.
Efeito do timol e carvacrol sobre o tônus basal de anéis de aorta em
presença de endotélio.
47
14.
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre as contrações induzidas
por potássio em aorta isolada de rato.
49
15.
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre as contrações induzidas
por fenilefrina em aorta isolada de rato.
53
16.
Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração mantida por
potássio em aorta isolada de rato.
56
17.
Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração mantida por
fenilefrina em aorta isolada de rato e a influência do endotélio.
60
10
18.
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração induzida por
fenilefrina em meio isento de Ca
2+
.
63
19.
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração induzida por
Ca
2+
em aorta isolada de rato despolarizada por potássio.
66
20.
Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração induzida por
ester de forbol em aorta isolada mantida em meio isento de Ca
2+
e
em presença de tapsigargina.
69
21.
Comparação dos os efeitos de timol e carvacrol com o efeito do
inibidor de Rho cinase sobre a contração sustentada de potássio.
72
22.
Efeito do timol e carvacrol sobre o potencial transmembrana da
aorta isolada de rato.
74
23.
Possíveis vias de sinalização envolvidas no efeito vasorrelaxante
do timol e carvacrol.
81
11
Lista de Tabelas
Tabela Página
I. Valores de CE
50
do efeito relaxante de timol e carvacrol. 51
12
Lista de Abreviaturas
[Ca
2+
]
i
Concentração intracelular de cálcio
0Ca
2+
Solução de Tyrode isenta de cálcio
ACh Acetilcolina
ANOVA Análise de variância
Ca
2+
Cálcio
CE
50
Concentração que produz 50% do efeito máximo
CPI-17 Proteína inibitória ativada por PKC
DAG Diacilglicerol
DBF 12,13-dibutirato de forbol
DMSO Dimetilsulfóxido
E- Anéis de aorta com endotélio removido
E.P.M. Erro padrão da média
E+ Anéis de aorta com endotélio intacto
EGTA
Ácido etileno-bis (β-amino-etil-éter)-N,N,N’,N’-tetracético
FE Fenilefrina
GTP Guanosina trifosfato
IP
3
Trifosfato de inositol
KCl
Potássio
kDa Quilo Dalton
L-NAME N
G
-nitro-L-arginina-metil-ester
MLCK Cinase da cadeia leve da miosina
MLCP Fosfatase da cadeia leve da miosina
MYPT1 Subunidade ligada à miosina
OELs
Óleo essencial de Lippia sidoides
OMS Organização Mundial de Saúde
PI3K-C2α Isoforma α da fosfatidilinositol 3-cinase de classe II
PIP
2
Bifosfato de fosfotidilinositol
PKC Proteína cinase C
PLC Fosfolipase C
PP1c Subunidade catalítica da MLCP
13
Rho-GEF Fator de troca do nucleotídeo guanina-Rho
RhoK Rho cinase
rMLC Cadeia leve regulatória da miosina
TM Tyrode modificado
14
Resumo
Timol e carvacrol são extraídos de alguns óleos essenciais de plantas dos gêneros
Origanum, Thymus e Lippia. Esses monoterpenóides apresentam, dentre outras
atividades biológicas, importante efeito relaxante no músculo liso. Este estudo visa
avaliar o efeito vasorrelaxante do timol e carvacrol em aorta isolada de rato e seus
possíveis mecanismos de ação. Foram utilizadas preparações de anéis de aorta
isolada mantidas em Tyrode modificado aerado, pH 7,4, a 37° C, para registro
isométrico das contrações musculares. Utilizaram-se também anéis de aorta isolada
mantidos em temperatura ambiente para registros eletrofisiológicos pela técnica do
microeletrodo intracelular. Em 1000 µM, o tônus foi aumentado de forma significante
somente pelo timol. Timol e carvacrol inibiram contrações de anéis de aorta
induzidas por KCl (60 mM) (CE
50
: 203,9±48,92 e 195,6±6,94 µM, respectivamente) e
por fenilefrina (FE, 0,1 µM) (CE
50
:115,2±18,47 e 105,5±13,90 µM, respectivamente).
Além disso, relaxaram de forma dependente de concentração preparações de anéis
de aorta pré-contraídas por KCl (80 mM) (CE
50
: 64,4±4,4 e 78,8±11,9 µM,
respectivamente) ou por FE (0,1 µM) (CE
50
: 106,4±11,3 e 145,4±6,0 µM,
respectivamente). Todos esses efeitos permaneceram inalterados pela remoção do
endotélio ou em presença de L-NAME. Em 1000 mM, timol e carvacrol relaxaram a
contração de KCl de forma similar ao relaxamento produzido pelo inibidor de Rho
cinase, Y27632. Em 400 µM, timol e carvacrol reduziram significativamente
contrações induzidas por CaCl
2
em meio isento de Ca
2+
. Em meio isento de Ca
2+
contendo EGTA (2 mM), a concentração de 1000 mM de timol e carvacrol aboliu
completamente a contração induzida por FE, bem como reduziu significativamente a
contração sustentada por dibutirato de forbol (1 µM). Em presença de tapsigargina (1
µM), a magnitude deste ultimo efeito relaxante foi aumentado. Entretanto, 1000 µM
de timol e carvacrol não alterarou o potencial de repouso das células de músculo liso
vascular. Em conclusão, timol e carvacrol induziram um relaxamento independente
do endotélio que parece ser mediado por mecanismos intracelulares. Estes
mecanismos envolvem provavelmente a liberação de Ca
2+
do retículo
sarcoplasmático e/ou a regulação da sensibilidade ao Ca
2+
do sistema contrátil do
músculo liso vascular.
Palavras-chave: Acoplamento excitação-contração; aorta isolada; carvacrol;
músculo liso; timol; vasorrelaxante.
15
Abstract
Thymol and carvacrol are extracted of essential oils obtained from various genera
such as Origanum, Thymus, and Lippia. The present study was undertaken to
assess the vasorelaxant effects of thymol and carvacrol in rat isolated thoracic aorta
and the putative mechanisms underlying these effects. Isolated aortic rings
preparations were maintained in aerated modified Tyrode solution, pH 7,4 at 27°C,
for isometric recordings of smooth muscle contractions. Eletrofisiologic recordings
were done in aortic rings preparations at room temperature through intracellular
microeletrode technique. At 1000 µM, thymol significantly increased the resting tonus
of vascular smooth muscle. Thymol and carvacrol inhibited contractions induced by
KCl (60 mM) (CE
50
: 203,9 ± 48,92 and 195,6 ± 6,94 µM, respectively) and by
phenylephrine (PHE, 0,1 µM) (CE
50
:115,2±18,47 and 105,5±13,90 µM, respectively).
Also, both terpenoids produced a concentration-dependent relaxation aortic ring
preparations pre-contracted by KCl (80 mM) (EC
50
value of 64.40±4.41 and
78.80±11.91 µM, respectively) or by PHE (0,1 µM) (IC
50
value of 106.40±11.37 and
145.40±6.07 µM, respectively). All these effects remained unaltered by vascular
endothelium removal and L-NAME presence. At 1000 µM, thymol and carvacrol
relaxed the KCl-induced contraction similarly to the relaxation produced by Rho
kinase inhibitor, Y27632. In Ca
2+
-free medium with EGTA (2 mM), thymol and
carvacrol, both at 1000 µM, completely abolished the phasic component of PHE-
induced contractions. At 400 µM, thymol and carvacrol significantly reduced the
CaCl
2
-induced contractions in a Ca
2+
-free medium. Furthermore, both thymol and
carvacrol (300 and 1000 µM) significantly reduced the contraction evoked by phorbol
dibutyrate (1 µM), an activator of protein kinase C. Magnitude of this inhibitory effect
was enhanced in the presence of the Ca
2+
pump inhibitor, thapsigargin (1 µM). At
1000 µM, neither thymol nor carvacrol altered the resting potential of vascular
smooth muscle cells. In conclusion, thymol and carvacrol induced an endothelium-
independent relaxation in rat isolated aorta. This effect seems mediated through an
intracellular mechanism probably involving a transduction pathway between Ca
2+
release from sarcoplasmic reticulum and/or regulation of the Ca
2+
sensitivity of the
contractile system of vascular smooth muscle.
Keywords: Carvacrol; Excitation-contraction coupling; Isolated aorta; Thymol;
Vasorelaxant
16
INTRODUÇÃO
C
ONSIDERAÇÕES GERAIS
A doença cardiovascular alcançou proporções epidêmicas causando mais de
17,5 milhões de mortes em 2005 representando 30% do total de óbitos no mundo
inteiro (World Health Organization, 2007). Destas mortes, 7,6 milhões foram
causadas por ataques cardíacos e 5,7 milhões devido a isquemias. Esta epidemia
reflete as profundas alterações na sociedade nas últimas décadas: industrialização,
crescimento econômico e mudança no estilo de vida como inatividade física, dieta
pouco saudável e tabagismo.
A hipertensão arterial representa um fator de risco independente, linear e
contínuo para morbidade e mortalidade por doença cardiovascular (Lewington et al.,
2002). A hipertensão apresenta custos médicos e socioeconômicos elevados,
decorrentes principalmente das suas complicações, tais como: doença vascular
encefálica, doença arterial coronariana e insuficiência cardíaca e renal. É um dos
principais problemas de saúde pública em razão de sua alta prevalência na
população adulta e produtiva. Entre os fatores de risco para mortalidade,
hipertensão arterial explica 40% das mortes por acidente vascular cerebral e 25%
daquelas por doença coronariana em países desenvolvidos (JNC VII, 2003)
No Brasil, a prevalência estimada de hipertensão é de 35% da população
acima de 40 anos. Isso representa em números absolutos um total de 17 milhões de
portadores da doença, segundo estimativa de 2004 do Instituto Brasileiro de
Geografia Estatística (IBGE). Estima-se que no ano de 2025, 29,5% da população
adulta no mundo terá hipertensão (Nesse et al., 2006).
Na maioria dos casos, a causa da hipertensão é desconhecida. Entretanto, a
sua prevalência sofre a influência de vários fatores, tais como idade, etnia, ingestão
de sal e álcool, sedentarismo, estilo de vida, estresse, fumo, peso corpóreo, fatores
da dieta e posição socioeconômica (Molina et al., 2003).
17
Em vista disso, a adoção de um estilo de vida saudável é fundamental para
diminuir a pressão arterial e, assim, reduzir a incidência de hipertensão (JNC VII,
2003). Isso inclui perda de peso, atividade física, redução do consumo de álcool,
dieta rica em frutas e legumes e redução no teor de sal e gordura dos alimentos.
Diversos estudos farmacológicos têm se intensificado objetivando a
descoberta de novos fármacos mais eficientes e efetivos, para que no futuro seja
possível atenuar o panorama de altas taxas de mortalidade pela doença
cardiovascular.
E
STRUTURA E FUNÇÃO DO SISTEMA CARDIOVASCULAR
O sistema cardiovascular é composto pelo coração e vasos sanguíneos. A
atividade do coração como bomba, garante suprimento sanguíneo e nutrientes para
o organismo, bem como remove toxinas através do fluxo sanguíneo. O coração
como bomba propulsora, é formado por duas bombas em série, que interagem com
a circulação pulmonar e circulação sistêmica propelindo fluxo unidirecional devido o
arranjo das válvulas cardíacas. O coração saudável é capaz de manter o débito
cardíaco em torno de 5 l/min (Kassab, 2006).
Os vasos sanguíneos possuem estrutura tubular em forma de camadas. A
camada mais interna, delgada, é constituída por células endoteliais; a média,
composta de células musculares lisas, capazes de produzir contração ou
relaxamento em resposta às substâncias vasoativas sintetizadas e liberadas pelas
células endoteliais e a camada mais externa, a adventícia, composta por tecido
fibroelástico denso. Embora a ejeção cardíaca seja intermitente, o fluxo sanguíneo
para os tecidos periféricos é contínuo devido à distensão e retração elástica da
parede das grandes artérias, que impulsionam o sangue durante o relaxamento
ventricular (Kassab, 2006).
O fluxo sanguíneo e a pressão arterial são determinados pela interação de
reflexos humorais e mecanismos de controle vascular. Neste último inclui-se a
resposta miogênica.
18
Em muitos órgãos as alterações na pressão de perfusão resultam somente
de pequenas alterações no fluxo sanguíneo e na pressão hidrostática. Esta
autoregulação constitui-se em um importante mecanismo que permite a perfusão
sanguínea de um determinado órgão variar com a sua demanda metabólica. Este
controle, conhecido como controle miogênico, contribui para a regulação do fluxo
sanguíneo em muitos leitos vasculares, incluindo o leito mesentérico, renal, cerebral
e circulação coronariana. A resposta miogênica é caracterizada pelo aumento ou
diminuição do diâmetro dos vasos em resposta ao aumento ou diminuição da
pressão transmural dos vasos. É mediado pelas células musculares lisas da parede
vascular independentemente do endotélio ou terminações nervosas. Canais
sensíveis a estímulos mecânicos podem ser os responsáveis pela despolarização
acompanhada da resposta miogênica no músculo liso vascular. Algumas doenças,
tais como, hipertensão e diabetes podem estar associadas com alterações na
resposta miogênica (Shubert e Brayden, 2005).
M
ÚSCULO LISO VASCULAR
Mecanismo de contração
A contração do músculo liso vascular é primariamente regulada pela
sinalização do cálcio (Ca
2+
) intracelular. Duas formas gerais de excitação iniciam a
contração dos músculos lisos. O início da contração pode ocorrer por uma
despolarização da membrana, denominado acoplamento eletromecânico, enquanto
que a ativação de receptores da superfície da membrana por agonistas é
denominada acoplamento farmacomecânico (Somlyo e Somlyo, 1968).
O componente elétrico da excitação do músculo liso é representado pelo
disparo de potenciais de ação ou por ativação de canais iônicos dependentes de
estiramento e ativação de canais de Ca
2+
operados por voltagem, permitindo, assim,
o influxo de Ca
2+
e, conseqüentemente, a contração (Fig. 1). Este aumento na
concentração do Ca
2+
intracelular ([Ca
2+
]
i
) pode ser incrementado por liberação de
Ca
2+
induzida por Ca
2+
dos estoques intracelulares. O tônus miogênico ou a
19
contração induzida por aumento de pressão de arteríolas e artérias de baixa
resistência depende do seu acoplamento eletromecânico (Hill et al., 2001).
Por outro lado, o acoplamento farmacomecânico envolve a ativação de
receptores da membrana para aumentar a [Ca
2+
]
i
tanto através da liberação de Ca
2+
dos estoques como por mecanismos mediados por sinalização que aumentam a
sensibilidade do aparato contrátil ao Ca
2+
. Por exemplo, a resposta ao Ca
2+
em
células musculares lisas pode ser modulada por receptores α-adrenérgicos. Tal
estimulação de receptores α-adrenérgicos associados a proteínas G
heterotriméricas pode ativar a fosfolipase C (PLC) para promover a hidrólise do
bifosfato de fosfotidilinositol (PIP
2
) a diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP
3
).
O IP
3
se desloca para o retículo sarcoplasmático onde se liga a receptores e
promove a liberação do Ca
2+
para o citosol (Ogut e Brozovich, 2003), enquanto o
DAG ativa diretamente a proteína cinase C (PKC) (Masuo et al.,1994) (Fig. 1).
Figura 1. Via de sinalização molecular envolvendo a contração do músculo liso induzida por
agonista ou por ativação de canais de Ca
2+
. Ca
2+
: cálcio; MLCK: cinase da cadeia leve da
miosina; MLCP: fosfatase da cadeia leve da miosina; PIP
2
: bifosfato de fosfotidilinositol
(Fonte: Hilgers e Webb, 2005).
Agonistas
(norepinefrina, angiotensina II,
entotelina, etc.)
Fosfolipase
C
trifosfato de
inositol
diacilglicerol
Ca
2+
retículo
sarcoplasmático
Canais de Ca
2+
operados por
voltagem
Calmodulina
(CaM)
MLCK
MLCP
rMLC fosforilada
+ actina
(contração)
rMLC
(relaxamento)
Ca
2+
Ca
2+
proteina
cinase C
Ca
2+
20
MLCK e contração dependente de Ca
2+
A proteína-alvo primária do aumento inicial do Ca
2+
intracelular é a
calmodulina (CaM), um membro da família das proteínas ligantes de Ca
2+
. A ligação
de quatro íons Ca
2+
à calmodulina causa uma alteração conformacional na sua
estrutura protéica permitindo, assim, uma interação subseqüente com a cinase da
cadeia leve da miosina (MLCK). Esta associação resulta na alteração
conformacional do complexo Ca
2+
-calmodulina-MLCK, deslocando a seqüência auto-
inibitória da MLCK para expor o sítio catalítico da enzima. Esta série de eventos leva
à ativação da MLCK e à fosforilação do aminoácido Ser19 da cadeia leve regulatória
da miosina (rMLC, 20 KDa). A rMLC fosforilada ativa a ATPase da miosina, promove
a interação entre actina e miosina, induz o ciclo das pontes cruzadas e, desta forma,
inicia a geração de força (Kamm e Stull, 1985a,b; Hai e Murphy, 1989). Logo, a
fosforilação da rMLC é o evento regulatório primário para o início da produção de
força nos músculos lisos.
MLCP e Sensibilidade ao Ca
2+
A contratilidade do músculo liso vascular não é apenas regulado pelo Ca
2+
intracelular, mas também por mecanismos independentes do Ca
2+
. Em adição à
ativação dependente de Ca
2+
da rMLC, o estado de fosforilação da rMLC é também
regulado pela fosfatase da cadeia leve da miosina (MLCP) (Somlyo e Somlyo, 2000;
Solaro, 2000) que remove o fosfato de alta energia da rMLC para promover o
relaxamento do músculo liso.
Uma das observações condutoras na caracterização da atividade da MLCP
foi a demonstração de que para uma dada [Ca
2+
]
i
, a força gerada foi variável
dependendo do método de ativação do músculo. De fato, foi observado que a
ativação por agonistas produziu uma força maior para uma dada [Ca
2+
]
i
, quando
comparada à despolarização (Rembold e Murphy, 1988). Em adição a isso, a
relação Ca
2+
/força também se altera durante o curso temporal da contração, visto
que a fase sustentada da contração é mantida por um nível relativamente menor de
[Ca
2+
]
i
. Quando uma contração maior é produzida para uma dada elevação de
21
[Ca
2+
]
i
, este fenômeno refere-se à sensibilidade do aparato contrátil ao Ca
2+
(Somlyo
e Somlyo, 1994).
Técnicas de clonagem de cDNA e purificação de proteínas demonstraram
que a holoenzima MLCP é um heterotrímero composto de uma subunidade alvo da
MLCP ligada à miosina (MYPT1) de aproximadamente 110 KDa, uma subunidade
catalítica (PP1c) de 37 KDa e uma pequena subunidade não catalítica de 20 KDa
(M20) cuja função é desconhecida (Fig. 2). Além de ancorar a MLCP aos filamentos
de miosina, a MYPT1 também aumenta a especificidade de substrato da MLCP e
regula a sua atividade enzimática (Hartshorne e Erdodi, 1998).
A atividade da MLCP pode ser regulada em três diferentes maneiras: 1)
dissociação da estrutura heterotrimérica; 2) efeito inibitório da fosforilação da MYPT1
e 3) inibição por proteínas inibitórias. A conformação heterotrimérica da MLCP e a
interação entre a MYPT1 e a miosina contribuem para aumentar a atividade da
MLCP em direção à rMLC. Portanto qualquer distúrbio nesta estrutura poderia
potencialmente reduzir a atividade da MLCP (Hirano, 2007). Embora um exemplo de
dissociação da MYPT1 e da PP1c durante a contração induzida por fenilefrina tenha
sido relatado, o papel fisiológico da dissociação de subunidades na regulação da
atividade da MLCP ainda deve ser elucidado (Hirano, Hirano e Kanaíde, 2004).
Por outro lado, experimentos mostraram que proteínas G ativadas estão
envolvidas na via de sinalização para a sensibilização ao Ca
2+
, porque o GTPγS, um
análogo não hidrolisável do GTP (guanosina trifosfato), aumentou a fosforilação do
rMLC e potencializou a contração (Kitazawa, Masuo e Somlyo, 1991). Experimentos
subseqüentes demonstraram que a pequena proteína G, RhoA, e seu efetor Rho
cinase (RhoK) possuem um importante papel na regulação da atividade da MLCP.
RhoA é uma proteína G monomérica cuja atividade é regulada pela ligação de um
GTP, uma transição facilitada pelo fator de troca do nucleotídeo guanina-Rho (Rho-
GEF) que permite a troca do nucleotídeo para ativar a RhoA-GDP em RhoA-GTP
(Schimidt e Hall, 2002). A RhoA-GTP ativada, se liga e ativa a Rho cinase, uma
serina/treonina cinase, a qual fosforila a MYPT1 e inibe a sua atividade,
promovendo, assim, o estado fosforilado da rMLC e aumentando a força de
contração (Kimura et al., 1996). A redução na atividade da MLCP devido à ativação
22
da RhoK foi atribuída à fosforilação de dois resíduos no terminal COOH da MYPT1:
Thr695 e Thr850 (Feng et al., 1999) (Fig. 2).
Outros mecanismos potenciais também foram propostos para a sensibilidade
ao Ca
2+
. A CPI-17 (17 KDa, proteína inibitória ativada por PKC) é uma pequena
proteína que serve como substrato tanto para a RhoK como para a PKC. Quando
fosforilada, a CPI-17 se liga à subunidade PP1c da MLCP para inibir a sua atividade
enzimática (Kitazawa et al., 2000). Assim, a sensibilização ao Ca
2+
pode envolver a
fosforilação da CPI-17 mediada por RhoK ou PKC para aumentar a fosforilação da
rMLC e prolongar a contração do músculo liso (Fig. 2).
Por outro lado, a proteína cinase II dependente de calmodulina promove o
relaxamento do músculo liso diminuindo a sensibilidade da MLCK ao Ca
2+
.
Adicionalmente, a proteína telocina (17 KDa) medeia a dessensibilização ao Ca
2+
através da ativação da MLCP em células de músculo liso, diminuindo a fosforilação
da MLCP e relaxando o músculo liso (Wu et al., 1998; Choudhury et al., 2004).
23
rMLC
rMLC
P
Contração
(MLCP inativa)
(MLCP ativa)
Via independente
do Ca
2+
(RhoK)
Via dependente do
Ca
2+
(MLCK)
Influxo
de Ca
2+
liberação
de Ca
2+
Figura 2. Mecanismos envolvidos na regulação da fosforilação da rMLC (cadeia leve
regulatória da miosina). [Ca
2+
]
i
: concentração intracelular de Ca
2+
; CPI-17: proteína inibitória
ativada por PKC; DAG: diacilglicerol; GPCRs: receptores acoplados à proteína G;
IP
3
:trifosfato de inositol; MLCK: cinase da cadeia leve da miosina; MLCP: fosfatase da
cadeia leve da miosina; MYPT1: subunidade alvo da MLCP ligada à miosina; M20:
subunidade não catalítica da MLCP; PI3K-C2α: isoforma α da fosfatidilinositol 3-cinase de
classe II; PKC: proteína cinase C; PLC: fosfolipase C; PP1c: subunidade catalítica do tipo 1
da MLCP; RhoGEF: fator de troca do nucleotídeo guanina-Rho; RhoK: Rho cinase; ZIPK:
proteína cinase de interação zipper (Fonte: Hirano, 2007).
24
P
RODUTOS NATURAIS
Desde a antiguidade, o homem depende da natureza para suas
necessidades básicas como alimentação, vestuário, condimentos, fragrâncias e
medicamentos. As plantas formaram a base de sofisticados sistemas de medicina
tradicional que existem há milhares de anos, entre os quais estão a indiana e a
chinesa, e continuam a fornecer novos remédios à humanidade (Gurib-Fakim, 2006).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), 80% da população
mundial, principalmente aqueles de países em desenvolvimento, dependem de
medicamentos derivados de plantas para tratamentos de enfermidades. Isso mostra
que os sistemas de medicina baseados em plantas continuam a ter um papel
essencial nos cuidados da saúde.
O interesse pela natureza como fonte de agentes quimioterápicos potenciais
ainda é muito grande. Os produtos naturais e seus derivados representam mais de
50% de todos os fármacos em uso clínico no mundo. Nos últimos quarenta anos,
pelo menos doze fármacos potentes foram extraídos de plantas incluindo a reserpina
e outros anti-hipertensivos e alcalóides tranqüilizantes (Rauwolfia serpentina);
pilocarpina para tratar glaucoma e xerostomia (Pilocarpus spp.); dois agentes
antineoplásicos (Catharanthus roseus e Taxus brevifolia); agentes laxativos (Cássia
sp.); salicilina, a fonte da aspirina (Salix alba) e os digitálicos, agentes cardiotônicos,
para tratar insuficiência cardíaca (Digitalis sp.) (Gurib-Fakim, 2006).
Alguns estudos demonstraram a atividade hipotensora de muitas plantas.
Entre essas plantas pode-se citar: Rauwolfia serpentina (Duke, 1985), Allium
sativum (alho) (Siegel et al., 1999), Olea europea (oliveira) (Zarzuelo, 1991),
Crataegus oxiacantha (crataegus) (Schussler, Holzl e Fricke, 1995; Kim, 2000),
Coleus forskohlii (falso boldo) (Dubey et al., 1981) e Nigella sativa (El Tahir, Ashour
e Al-Harbi, 1993). Além disso, algumas plantas aromáticas com atividade
hipotensora são nativas da região Nordeste do Brasil, como: Croton nepetaefolius, o
“marmeleiro-sabiá” (Lahlou, Leal-Cardoso e Magalhães, 2000); Alpinia zerumbet, a
“colônia” (Lahlou et al., 2003) e Ocimum gratissimum, a “alfavaca-cravo”
(Interaminense et al., 2007).
25
As plantas aromáticas são usadas desde tempos antigos por suas
propriedades preservativas e medicinais e por concederem aroma e sabor aos
alimentos. As propriedades farmacêuticas das plantas aromáticas são parcialmente
atribuídas aos óleos essenciais.
Os óleos essenciais das plantas medicinais são tipicamente constituídos por
um complexo de compostos químicos (principalmente de terpenos) que podem agir
individualmente, aditivamente ou sinergicamente para melhorar a saúde. Além de
serem utilizadas como agentes terapêuticos, as substâncias bioativas isoladas dos
óleos essenciais das plantas podem servir como moléculas protótipos para novos
compostos sintéticos e, também, como ferramentas para estudos fisiológicos.
Timol e Carvacrol
O timol e carvacrol são fenóis monoterpenóides biosintetizados em plantas a
partir do γ-terpineno e p-cimeno. Por isso, estes últimos estão sempre presentes em
óleos essenciais que contém timol e carvacrol. Além disso, intermediários
biosintéticos também podem estar presentes, como: terpinen-4-ol, álcool cumino e p-
cimen-8-ol (Baser e Demirci, 2007).
O timol é encontrado abundantemente no óleo essencial de Lippia sidoides
Cham. (Verbanaceae), o “alecrim-pimenta”, um exemplar típico do Nordeste
brasileiro (Fig. 3). Estudos anteriores demonstraram que o óleo essencial de
espécimes nativos do Nordeste brasileiro possui cerca de 60% de timol em sua
composição (Fontenelle et al., 2007). Além disso, o timol também é encontrado no
óleo essencial de alguns membros do gênero Thymus e Origanum, da família
Lamiaceae, como T. vulgaris (tomilho) e O. vulgare (orégano) (Hudaib et al., 2002).
O carvacrol, um isômero de posição do timol, é também encontrado no óleo
essencial de O. vulgare (Tian e Lai, 2006) bem como de outras espécies do mesmo
gênero como O. minutiflorum (Sarer, Pancali e Yildiz, 1996) e O. onites (Vokou,
Kokkimi e Bessiere, 1988), compondo valores acima de 92% do seus óleos
essenciais.
26
Figura 3. Lippia sidoides Cham.
Características físico-químicas
O timol, cuja nomenclatura química é 5-metil-2-(1-metiletil)-fenol possui
fórmula molecular C
10
H
14
O e peso molecular de 150,22 g/mol (Fig. 4a). Apresenta-se
em forma de cristais grandes translúcidos incolores ou brancos. Possui odor
aromático, semelhante ao tomilho, e paladar pungente com um leve efeito cáustico
sobre os lábios. É uma substância pouco solúvel em água, com coeficiente de
partição n-octonol/água 3,30. Seu ponto de fusão é 52°C, permanecendo líquido em
temperaturas consideravelmente mais baixas, enquanto que seu ponto de ebulição é
233°C.
O carvacrol é quimicamente denominado 2-metil-5-(1-metiletil)-fenol e possui
fórmula molecular C
10
H
14
O e peso de 150,22 g/mol (Fig. 4b). Apresenta-se em forma
líquida de coloração amarelo claro, cuja densidade é de 0,975 g/ml (20°C). O
carvacrol possui característica pungente e odor aromático, semelhante ao orégano,
27
bem como, pouca solubilidade em água. Seu ponto de fusão é de 2°C e seu ponto
de ebulição é de 234 – 236°C.
Figura 4. Estrutura molecular do timol (a) e carvacrol (b).
Utilidades na indústria
No ano de 1992, o timol foi avaliado pelo Comitê de Especialistas em
Substâncias Aromatizantes do Conselho Europeu. Desde então é permitida sua
adição em alimentos até um nível de 50 mg/kg e de 10 mg/kg em bebidas
(Carmona, 2002). No Brasil não há referência na legislação quanto ao uso dessa
substância em alimentos.
Os antioxidantes fenólicos de origem vegetal, categoria em que pode ser
incluído o timol, têm sido relacionados recentemente com a baixa mortalidade por
problemas cardíacos entre as pessoas que praticam dieta mediterrânea. O timol tem
sido usado na medicina humana para o tratamento tópico de problemas
dermatológicos, para realizar inalações em pessoas com problemas respiratórios e
para o cuidado dos dentes (Carmona, 2002).
O timol ainda é utilizado num produto chamado Apiguard®, patenteado pela
empresa Vita (Europe) Limited (Reino Unido), que é utilizado nas colméias para
combater o ácaro varoa. Esse produto apresenta-se na forma de gel, funciona como
uma esponja e o tamanho da sua malha aumenta ou diminui em função da
a
b
28
temperatura ambiente. Quando a temperatura aumenta, a volatilidade do timol
também aumenta e a malha do gel diminui, controlando assim a libertação do timol.
O timol também está presente na formulação das pastilhas Angino-Rub®, do
Laboratório Eurofarma, indicada para processos inflamatórios e dolorosos da boca e
garganta. O anti-séptico bucal Listerine®, marca da empresa Johnson & Johnson, é
uma mistura de componentes de óleos essenciais como timol, mentol, eucaliptol
(Torres, 2000).
Em 2002 na Espanha, foi patenteado um produto à base de timol para ser
diluído em água potável, para aliviar, curar ou prevenir doenças causadas pelo
Clostridium sp, em particular o Clostridium perfringes, no trato intestinal de animais
como aves e mamíferos. Esse produto leva ainda em sua formulação guaiacol,
eugenol e capsaicina (Aebi e Losa, 2002).
A Fundação Eroski, também espanhola, sugere que o timol e o carvacrol,
presentes em óleos essenciais de algumas plantas de uso medicinal e aromático,
poderiam ser empregados na indústria alimentícia por suas propriedades
antibacterianas (Montaner, 2004).
O carvacrol vem sendo estudado como antimicrobiano para a redução da
contagem de microorganismos viáveis em kiwi e extensão da fase de latência da
flora microbiana natural em melão fresco cortado (Serrano et al., 2005).
Uma mistura de carvacrol, timol e eugenol (25 µl de cada um), foi adicionada
em uma gordura estéril e aplicada em embalagens termoseladas com dois tipos de
filmes de permeabilidade diferentes contendo uva da variedade Aledo. Os resultados
mostraram que as uvas tratadas com essa mistura possuem retardos significativos
no processo de maturação e com menores perdas de firmeza, acidez e menor perda
de cor. A contagem de aeróbios mesófilos foram inferiores nas uvas tratadas,
demonstrando que essa mistura de componentes garantiu a segurança do produto
sem alterar a qualidade sensorial (Valverde et al., 2006).
29
Atividades biológicas e farmacológicas
Timol e carvacrol são conhecidos por sua atividade antimicrobiana de amplo
espectro a qual foi alvo de algumas investigações in vitro (Dorman e Deans, 2000;
Lambert et al., 2001) e in vivo (Adam et al., 1998; Manohar et al., 2001). Botelho e
colaboradores (2007) relataram que timol e carvacrol inibem efetivamente o
crescimento de patógenos orais como Streptococcus mutans e Candida albicans,
apresentando atividade antibacteriana e antifúngica e, desta forma, tornando-se
úteis para a manutenção da higiene oral pela redução do crescimento microbiano.
Ainda em 2007, Nostro e colaboradores demonstraram que o óleo essencial do
orégano e seus principais constituintes, timol e carvacrol, inibiram o crescimento de
biofilmes pré-formados de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis e
interferiram com a formação desses biofilmes durante o crescimento planctônico.
O óleo essencial de O. onites e seus principais constituintes, timol e
carvacrol, demonstraram uma potente atividade contra os protozoários Trypanosoma
brucei rhodesiense, Trypanosoma cruzii, Leishmania donovani e Plasmodium
falciparum (Tasdemir et al., 2006).
Estudos recentes também relataram atividade larvicida e ovicida do óleo
essencial de L. sidoides (OELs), timol e carvacrol contra larvas de Aedes aegypti e
contra larvas e ovos do nematódeo Haemonchus contortus (Carvalho et al., 2003;
Camurça-Vasconcelos et al., 2007).
O efeito anticarcinogênico dos monoterpenóides, timol e carvacrol, foi
relatado por He e colaboradores (1997). Seu estudo demonstrou que os
isoprenóides suprimiram a proliferação e promoveram o início da apoptose das
células do melanoma B16(F10) em camundongos. Além disso, mais tarde foi
descrito que o carvacrol possui atividade antiproliferativa in vitro e in vivo, bem como
atividade antiplaquetária ex vivo através da inibição da produção do tromboxano A
2
(TXA
2
) e expressão do receptor GP IIb/IIIa. Essa propriedade parece estar
relacionada à sua atividade antioxidante, haja vista a capacidade de inibição da
cicloxigenase plaquetária pelos agentes antioxidantes (Karkabounas et al., 2006).
30
Muitos óleos essenciais exibem atividade antioxidante e antiinflamatória
(Baratta et al., 1998; Burt, 2004). Fenóis monoterpenóides, como timol, carvacrol e
eugenol pertencem aos antioxidantes naturais mais ativos encontrados nos óleos
essenciais (Yanishlieva, 1999; Ruberto e Baratta, 2000). Com o uso do ensaio do
ácido aldeído/carboxílico, essas substâncias mostraram uma forte atividade
antioxidante inibindo a oxidação do hexanal em quase 100% por 30 dias na
concentração de 5 µg/mL (Lee et al., 2005). Sua atividade antioxidante foi
comparável aos antioxidantes conhecidos, α-tocoferol e hidroxitolueno butilado
(BHT). Monteiro e colaboradores (2007) compararam o OELs e timol com o eugenol
através do ensaio antioxidante de remoção do DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) e
concluiu que a atividade antioxidante do OELs é ligeiramente menor que a do timol,
portanto este composto pode ser responsável pela atividade antioxidante no OELs.
Em experimentos com células de hepatoma e de colo humano, células Caco-
2 e V79 de fígado de hamster, timol e cavacrol não foram capazes de danificar o
DNA. Ao contrário, estes compostos forneceram proteção contra danos induzidos
por peróxido de hidrogênio (Slamenova et al., 2007) . Isto sugere que timol e
carvacrol possuem um efeito protetor benéfico para o ácido nucléico das células.
Monteiro e colaboradores (2007) ainda comprovaram que o OELs (10 mg/Kg)
foi capaz de reduzir a inflamação aguda induzida por TPA (12-O-tetradecanoilforbol-
13-acetato) na orelha de camundongos de forma similar à indometacina, bem como
reduziu, em aproximadamente 54%, as lesões gástricas induzidas por etanol. Estas
atividades, antiinflamatória e gastroprotetora, foram associadas ao timol devido a
sua predominância (66,67%) no OELs.
Ainda com uma possível ligação à atividade antioxidante, foi descoberto que
timol, carvacrol e seus derivados, timoquinona e timohidroquinona, são capazes de
inibir a atividade da acetilcolinesterase (Jukic et al., 2007).
Timol e carvacrol foram capazes de ativar hTRPA
1
, o que se torna relevante
na explicação da sua propriedade pungente (Lee et al., 2008).
Sabe-se que o timol afeta a excitação e contração do músculo esquelético,
liso e cardíaco (Sakai et al., 1967), entretanto seu mecanismo de ação ainda não é
31
bem delineado. O que já foi relatado é que em concentrações submilimolares timol
evocou a liberação de cálcio (Ca
2+
) do retículo sarcoplasmático do músculo
esquelético (Palade et al., 1987), cardíaco (Szentandrássy et al., 2004) e liso
(Hisayama e Takayanagi, 1986) e de neurônios (Kostiuk et al., 1991). Em adição a
isso, Sárközi e colaboradores (2007) demonstraram que o timol e carvacrol foram
capazes de inibir a atividade da Ca
2+
-ATPase do retículo sarcoplasmático, bem
como de liberar Ca
2+
através da ativação do receptor de rianodina (RyR1) de
músculo esquelético incorporado em uma bicamada lipídica artificial.
Alguns estudos mostram que canais da membrana também são afetados por
esses terpenóides. Correntes de potássio foram suprimidas pelo timol (Magyar et al.,
2002) em cardiomiócitos de vários mamíferos. Timol e carvacrol suprimiram
correntes de cálcio do tipo L em cardiomiócitos de caninos e humanos. Essa
supressão foi influenciada pelos substituintes do anel benzeno dos terpenóides e o
efeito bloqueador dessas substâncias pode envolver interações com a maquinaria
de inativação do canal (Magyar et al., 2004).
Por outro lado, a ação direta do timol sobre as proteínas contráteis de células
cardíacas foi sugerida (Szentandrássy et al., 2004) e posteriormente confirmada por
Tamura e Iwamoto (2004). Neste estudo, foi reportado que o timol possui uma ação
peculiar sobre a miosina do músculo esquelético: potencializa a sua atividade
ATPase, mas reduz os parâmetros da cinética da contração.
O óleo essencial de Carum copticom relaxa eficazmente a traquéia de cobaia
e este efeito foi principalmente atribuído ao carvacrol. Alem disso, o efeito relaxante
não é promovido pela estimulação de receptores β
2
-adrenérgicos ou pela inibição de
receptores H
1
histaminérgicos (Boskabady, Ramazani e Tabei, 2003). Timol mostrou
uma influência agonista sobre os receptores α
1
-, α
2
-, e β-adrenérgicos do músculo
liso do estômago e da veia porta de cobaia. Esses efeitos foram registrados em
concentrações de 3x10
-7
a 2x10
-6
M. Em concentrações superiores a 10
-6
M, timol
apresentou efeito espasmolítico (Beer et al., 2007).
32
R
ELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
A importância dos produtos naturais é claramente enorme.
Aproximadamente 25% das drogas prescritas no mundo se originam de plantas,
desses compostos ativos 121 estão sendo usados atualmente. Das 252 drogas
consideradas básicas e essenciais pela OMS, 11% são exclusivamente de origem
vegetal e um número significante são drogas sintéticas obtidas de precursores
naturais. Entretanto, a maioria das plantas permanece inexplorada no que diz
respeito à sua atividade farmacológica (Mendelson e Balick, 1995).
Nas últimas décadas, a indústria farmacêutica tem demonstrado renovado
interesse na investigação de plantas como fonte para novas estruturas e para o
desenvolvimento de agentes fitoterápicos padronizados com eficácia comprovada,
segurança e qualidade. Esse interesse é justificado por diversas razões, a saber:
preferências dos consumidores por terapias naturais; preocupação em relação aos
efeitos colaterais das drogas sintéticas e a crença de que os produtos naturais sejam
inócuos; alto custo dos remédios sintéticos; e a falta de acesso da população pobre
ao tratamento farmacológico convencional (Calixto, 2000).
Com o aumento da expectativa de vida, as doenças crônicas, como a
hipertensão associada à prevalência do estilo de vida pouco saudável, têm se
tornado um problema de saúde comum e crescente. As doenças crônicas não
podem ser atribuídas a um único fator genético ou mudança ambiental, mas surgem
de uma combinação de fatores genéticos, ambientais e comportamentais (Kibertis e
Roberts, 2000). Para o tratamento de tais doenças, muitos fármacos causam
severos efeitos colaterais devido a sua seletividade e especificidade in vivo. Existem
muitos casos em que produtos naturais exercem múltiplos efeitos farmacológicos.
Esta multiação farmacológica se torna um pré-requisito prático para identificar
drogas altamente eficazes com múltiplas ações para o tratamento simultâneo dos
sintomas multifatoriais das doenças crônicas (Kimura, 2006).
Como foi mencionado anteriormente, o timol e carvacrol apresentam efeitos
farmacologicamente interessantes (ver revisão, Baser, 2008). Eles são uns dos
agentes naturais mais ativos com atividade antioxidante (Yanishlieva, 1999; Ruberto
e Baratta, 2000). Isso se torna de extrema importância, pois os mecanismos pelos
33
quais as patologias crônicas se desenvolvem, especialmente cânceres e doenças
cardiovasculares, envolvem a alteração oxidativa de muitas moléculas críticas
fisiologicamente (Laguerre, Lecomte e Villeneuve, 2007). Adicionalmente, timol e
carvacrol afetam a excitação-contração dos músculos liso, cardíaco e esquelético
(Sakai et al., 1967). Em um estudo com músculo liso traqueal de cobaia, a atividade
relaxante do óleo essencial de Carum copticom foi atribuída ao carvacrol
(Boskabady et al., 2003). O timol apresentou efeito espasmolítico dependente de
concentração em músculo liso de estômago e veia porta (Beer et al., 2007).
Entretanto, raros são os relatos na literatura que comprovem os efeitos do
timol e carvacrol em músculo liso vascular. Sendo o músculo liso vascular uma
estrutura importante na fisiopatologia das doenças cardiovasculares, entre elas a
hipertensão, torna-se, portanto, de grande necessidade a descoberta de novas
substâncias ativas neste músculo para a possível utilização como fármacos. Esses
fatos mostram a importância do estudo das ações do timol e carvacrol sobre o
músculo liso vascular.
34
OBJETIVOS
O
BJETIVO GERAL
Estudar o efeito do timol e carvacrol sobre a contratilidade do músculo liso
aórtico
O
BJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito próprio do timol e carvacrol sobre o tônus intrínseco do
músculo liso aórtico de rato.
Analisar o efeito do timol e carvacrol sobre o acoplamento eletromecânico e
farmacomecânico do músculo liso de aorta.
Estudar a influência do endotélio sobre o efeito inibitório do timol e carvacrol
em aorta isolada de rato.
Avaliar o efeito do timol e carvacrol sobre a contração dependente da via do
IP
3
.
Analisar a ação do timol e carvacrol sobre os componentes que promovem a
sensibilidade ao Ca
2+
das proteínas contráteis do músculo liso aórtico de rato.
Avaliar o efeito do timol e carvacrol sobre o potencial trasmembrana das
células musculares lisas de aorta isolada.
35
MATERIAL E MÉTODOS
M
ATERIAL
Sais e fármacos
Os sais utilizados no preparo das soluções fisiológicas foram de grau e
pureza analítica, obtidos da companhia Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). As
concentrações foram expressas em milimol/litro (mM).
O cloridrato de acetilcolina (ACh), o ácido etileno-bis (β-amino-etil-éter)-
N,N,N’,N’-tetracético (EGTA), o carvacrol, o dimetilssulfoxido (DMSO), o 12,13-
dibutirato de forbol (DBF), a fenilefrina (FE), o N
G
-nitro-L-arginna-metil-ester (L-
NAME), a tapsigargina, o timol e o Y27632 foram adquiridos da Sigma-Aldrich.
Soluções
A solução nutritiva de Tyrode modificada (TM) continha a seguinte
composição em mM: 136,0 NaCl; 5,0 KCl; 0,98 MgCl
2
; 0,36 NaH
2
PO
4
; 11,9 NaHCO
3
;
2,0 CaCl
2
e 5,5 Glicose. A solução nutritiva foi mantida constantemente aerada por
borbulhamento de ar, à temperatura de 37
°
C e o pH ajustado para 7.4 com HCl 1M
e/ou NaOH 1M.
O timol, carvacrol, DBF e tapsigargina foram dissolvidos diretamente em
DMSO (concentração final máxima de 0,2%) e, em seguida, diluídos em Tyrode. O
L-NAME e o Y27632 foram dissolvidos em água destilada.
A administração de todas as drogas foi feita de forma hipertônica, das quais
foram adicionados volumes específicos diretamente ao banho para atingir as
concentrações finais desejadas nas câmaras do banho de órgão isolado.
36
A solução isenta de cálcio ou “zero cálcio” (0Ca
2+
) foi produzida com a
omissão do CaCl
2
da solução de Tyrode e adição de 2 mM de EGTA. A solução de
0Ca
2+
nominal foi preparada apenas omitindo-se o CaCl
2
. Na solução isotônica de
KCl (80 mM), o NaCl foi substituído pela quantidade excedente de KCl.
Animais
Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus) albinos machos da linhagem
Wistar, pesando entre 200 a 300 gramas, mantidos com acesso a água e ração, “Ad
libitum”, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará – UFC.
Os animais foram tratados seguindo as recomendações de manuseio
bioético do Guia Internacional de Princípios para Pesquisa Biomédica Envolvendo
Animais, Suíça, e do livro “Princípios éticos na experimentação animal” do Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), Brasil.
M
ÉTODOS
Preparação tecidual
Os animais foram sacrificados por concussão cerebral, seguida por pesagem
e dissecação. Foi promovida a abertura da face ventral do tórax, seguida da
remoção dos pulmões e coração para a exposição da aorta. A aorta foi, então,
removida e transferida para uma placa de Petri contendo Tyrode, possibilitando o
manuseio para eliminação dos tecidos anexos e secção de segmentos transversos
circulares de 4 - 5 mm de comprimento. Para determinados experimentos, o
endotélio foi removido através de uma leve raspagem das paredes internas de cada
segmento de aorta.
37
Medida das respostas mecânicas do músculo liso de aorta
Estes segmentos de aorta foram montados em banho para órgão isolado,
com capacidade para 5 ml de Tyrode, o qual foi mantido com aeração contínua por
borbulhamento de ar, temperatura em 37
°
C e pH 7,4. Uma das extremidades da
preparação foi conectada a um transdutor de força do tipo “Strain Gage” (Grass
Instruments, modelo FT.03, Quincy, Mass, EUA), através de fixadores triangulares
de aço inoxidável ligados a fio de algodão, e a outra extremidade, a uma base fixa.
As respostas musculares mecânicas (geração de força ou relaxamento) foram
transformadas em sinal elétrico pelo transdutor. O transdutor estava conectado a um
amplificador diferencial (DATAQ, modelo PM-1000, USA) e este, à entrada de uma
placa conversora analógica digital (DATAQ DI-200) instalada em um computador
IBM Pentium. Os dados coletados foram convertidos em traçados e, assim,
armazenados em arquivos através do software WINDAQ versão 1,65 (DATAQ
Instrumentos, Inc. USA) para análise posterior (Fig. 5).
Após a montagem da preparação, os segmentos isolados de aorta foram
submetidos a uma tensão de estabilização de 1g e mantidos por um período de 1
hora, tempo necessário para a adaptação da preparação às novas condições. Ao
final da estabilização, considerou-se que a preparação atingiu seu tônus basal de
repouso.
38
Figura 5. Representação esquemática do sistema utilizado para registro das contrações.
Protocolos experimentais
Em todos os experimentos existiram preparações controles e experimentais
que foram submetidas aos mesmos protocolos e situações. As preparações controle
receberam somente o veículo DMSO diluído em solução de Tyrode em proporções
semelhantes às utilizadas nas preparações experimentais.
Todos os protocolos começaram com duas contrações subseqüentes
evocadas por 60 mM de KCl (K60) administrado direto ao banho através de solução
hipertônica para avaliar a viabilidade da preparação, a reprodutividade e integridade
da resposta biológica do ensaio. Somente experimentos com contrações
reproduzíveis foram utilizados. Em experimentos, cujo tecido teve seu endotélio
removido, foi administrado uma dose de ACh (10 µM), a fim de confirmar a ausência
do endotélio através do não relaxamento do tecido.
39
Para avaliar o efeito do timol e carvacrol, padronizou-se o protocolo de
adquirir o valor do parâmetro antes da exposição ao timol e carvacrol (controle
inicial), depois em presença dessas substâncias (experimental) e após lavagens
sucessivas com Tyrode até demonstrar-se a recuperação (controle posterior).
Curvas concentração-respostas foram obtidas pela exposição das
preparações a concentrações crescentes não-cumulativas das substâncias
contraturantes (KCl
e FE) adicionadas ao banho e mantidas por 10 minutos ou até
que se atingisse o platô da contração. As concentrações que provocam a contração
máxima e submáxima (que apresenta ~70 a 80% da resposta máxima) foram
determinadas através da análise da curva concentração-resposta de cada uma das
substâncias utilizadas.
Em protocolos de inibição e relaxamento da contratura de KCl e FE, foram
observadas as respostas do músculo e as alterações induzidas pela presença do
timol e carvacrol e, assim, determinadas as respectivas CE
50
.
Série 1: Efeito sobre o tônus intrínseco da aorta isolada de rato.
Com a finalidade de avaliar os efeitos do timol ou carvacrol sobre o tônus
muscular espontâneo da aorta em presença do endotélio, foram administradas
concentrações crescentes e cumulativas de timol (1, 3, 10, 30, 100, 300, 600 e 1000
µM) ou carvacrol (1, 3, 10, 30, 100, 200, 300, 400, 600 e 1000 µM) ao banho de
órgão isolado.
Figura 6. Esquema ilustrativo da série 1.
TM
1000
600
K60
K60
K60
K60
1
3
10
(...)
TM
Timol/Carvacrol
40
Série 2: Efeito inibitório sobre contrações induzidas por potássio e
fenilefrina em aorta isolada de rato.
Doses crescentes e não cumulativas (1, 3, 10, 30, 100, 200, 300, 400, 600 e
1000 µM) de timol ou carvacrol foram administradas ao banho cinco minutos antes
da exposição da aorta a substâncias contraturantes nas suas concentrações
submáximas, KCl (60 mM) ou FE (0.1 µM), para avaliar o seu efeito
antiespasmódico.
Figura 7. Esquema ilustrativo da série 2.
KCl/FE; Timol/carvacrol (µM); TM.
Série 3: Efeito relaxante sobre contrações induzidas e sustendas por
potássio e fenilefrina em aorta isolada de rato.
O efeito relaxante também foi avaliado, administrando-se concentrações
crescentes e cumulativas (1, 3, 10, 30, 100, 200, 300, 400, 600, 1000 e 2000 µM) de
timol ou carvacrol sobre uma contração evocada e mantida por KCl
(80 mM,
concentração que produz a resposta máxima) em preparações de aorta com
endotélio.
Timol ou carvacrol (nas concentrações anteriores) também foram
administrados sobre uma contração evocada e mantida por FE (0.1 µM) em
preparações de aorta com e sem endotélio. Em algumas preparações de aorta com
endotélio, o inibidor de óxido nítrico sintase (100 µM), L-NAME, foi adicionado 20
minutos antes da contração mantida por FE. Sobre o platô desta contração, foram
administradas as mesmas concentrações de timol ou carvacrol de forma crescente e
cumulativa.
K60
K60
K60
K60
1
3
600
1000
(...)
TM
41
Figura 8. Esquema ilustrativo da série 3.
KCl/FE; TM.
Série 4: Efeito inibitório de contrações induzidas por fenilefrina em meio
isento de cálcio.
Foram realizados, ainda, experimentos para avaliar os efeito do timol e
carvacrol no componente contrátil da FE (10 µM) que não depende de Ca
2+
extracelular, mas somente do cálcio liberado do retículo sarcoplasmático, pela via do
IP
3
. Inicialmente, contrações de FE (10 µM) em meio Tyrode foram induzidas, como
controle. Em seguida, a preparação foi exposta ao meio 0Ca
2+
contendo EGTA (2
mM) e, então, foram administradas concentrações (100 ou 1000 µM, em
preparações diferentes) de timol ou carvacrol. Após cinco minutos, foi promovida
uma contração por FE (10 µM). Em paralelo, como controle externo, foi promovida
uma contração por FE (10 µM) em meio 0Ca
2+
e em presença apenas do veículo
(DMSO) para comparação.
As concentrações, 100 e 1000 mM de timol ou carvacrol, foram escolhidas
por serem aquelas que induzem, respectivamente, uma inibição parcial significativa
e uma inibição total das contrações induzidas por FE.
Figura 9. Esquema ilustrativo da série 4.
Timol/carvacrol (µM); TM.
K60
K60
K60
K60
1 3 10 1000 2000
(...)
TM
Timol/Carvacrol
K60
K60
FE
K60
FE
FE
FE
FE
TM
TM
0Ca
2+
0Ca
2+
42
Série 5: Efeito sobre a reposição do cálcio.
Inicialmente, em meio com alta concentração de KCl isotônico (K80), isento
de Ca
2+
e contendo EGTA (2 mM), os estoques intracelulares de Ca
2+
foram
depletados por contrações repetidas de FE (10 µM). Estas contrações foram lavadas
também pela solução de K80 isotônico, isenta de Ca
2+
e contendo EGTA (2 mM).
Em seguida, ainda na presença de solução isotônica de KCl, porém com 0Ca
2+
nominal (sem EGTA), a preparação foi exposta a uma concentração (400 µM) de
timol ou carvacrol durante 5 minutos. Logo depois, uma curva concentração-
resposta de CaCl
2
(0,1-20 mM) foi realizada cumulativamente. A curva
concentração-resposta controle de CaCl
2
foi feita em paralelo.
Figura 10. Esquema ilustrativo da série 5.
Timol/carvacrol (µM); TM.
Série 6: Efeito sobre a contração induzida por éster de forbol em meio
isento de cálcio após depleção dos estoques.
A fim de analisar a atuação do timol e carvacrol sobre a via da PKC, foi
utilizado o dibutirato de forbol, um ativador de PKC, para induzir uma contração na
aorta isolada sem endotélio. Em meio 0Ca
2+
, sobre o platô da contração de DBF (1
µM), timol ou carvacrol foram aplicados na concentrações de 100, 300 ou 1000 µM,
em preparações diferentes.
Em experimentos similares, 30 minutos antes da contração induzida por
DBF, a preparação foi exposta à tapsigargina, um inibidor da bomba Ca
2+
-ATPase
do retículo sarcoplasmático. Então, sobre o platô da contração de DBF, uma
concentração única de timol (1000 µM) ou carvacrol (1000 µM) foi administrada.
K60
K60
FE
FE
K60
K60
CaCl
2
K80/0Ca
2
K80/0Ca
2+
/EGTA
0.1
0.3
0.3
1
10
20
TM
43
Figura 11. Esquema ilustrativo da série 6.
Timol/carvacrol (µM); TM.
Série 7: Efeito sobre a via da proteína Rho.
Para avaliar a atuação do timol e carvacrol pela via da Rho cinase, foi
promovida uma contração sustentada por solução isotônica de KCl (80 mM) e, sobre
o platô, foi administrado Y27632 (1 µM), um inibidor da proteína Rho cinase. Em
experimentos similares, timol ou carvacrol (1000 µM) foram administrados sobre a
contração de KCl (80 mM) para comparação com o efeito do Y27632.
Figura 12. Esquema ilustrativo da série 7. Y27632; Timol/carvacrol (µM); TM.
Medida do potencial transmembrana
Os registros eletrofisiológicos foram feitos utilizando a técnica do
microeletrodo intracelular, no modo de clampeamento de corrente (current clamp).
Neste modo, o valor da corrente injetada é fixado com a finalidade de medir as
variações de potencial advindo do sistema. Os potenciais transmembrana foram
obtidos através do uso de microeletrodos confeccionados com vidro do tipo
aluminossilicato (1,0 mm o.d., 0,68 mm i.d., WPI Corp., New Haven, CT, EUA),
apresentando resistências na faixa de 25 a 50 M
Ω. Foi utilizado um puxador de
micropipetas (modelo P-97, Sutter Instrument, Novato, CA, EUA), para a preparação
K60
K60
K80
K80
K60
K60
/
TM
K60
K60
DBF
K60
K60
0Ca
2+
TM
44
desses microeletrodos e, posteriormente, sua cavidade interna foi preenchida com
uma solução de KCl (3 mM). Esses microeletrodos foram conectados via um fio de
prata, revestido com uma fina camada de cloreto de prata, a um eletrômero (modelo
AXOCLAMP 2B, Axon Instruments, Foster City, CA, EUA). Este eletrômero possui
algumas saídas para o monitoramento dos sinais, onde foram conectados
osciloscópios: um para o monitoramento do V
m
e da corrente injetada (modelo
5111A, TEKTRONIX, Beaverton, OR, EUA) e outro para monitoramento da carga e
descarga do microeletrodo (modelo HM303-6, HAMEG Instruments, Mainhausen,
Alemanha). A aquisição dos registros eletrofisiológicos foi feita através do uso de
uma interface A/D (modelo DIGIDATA 1200, Axon Intruments, Foster City, CA, EUA)
controlada por um software (CLAMPEX, versão 6.0) e os dados armazenados em
computador.
Após a remoção dos tecidos conectivos, a aorta foi seccionada
transversalmente em segmentos cilíndricos (2 – 3 mm) que tiveram seu endotélio
removido. Logo depois, um segmento foi aberto longitudinalmente e transferido para
a câmara de acrílico, especialmente projetada para permitir a superfusão por Tyrode
modificado. A câmara foi montada em uma lupa (modelo College Stereo, MLW
Intermed, Schöneiche, Alemanha), para a fixação do tecido e observação dos
procedimentos de impalamento. A superfusão foi mantida por fluxo a favor da
gravidade, ajustado para 1,0-1,5 mL/min. A movimentação do microeletrodo e o
impalamento foram promovidos por um micromanipulador hidráulico (modelo MWO-
3, Narishige International Inc., Long Island, NY, EUA).
As soluções para a superfusão foram colocadas em frascos mariote e
conectadas à câmara por meio de cânulas e válvulas three-way, que permitiram a
troca de soluções com rapidez e sem descontinuidade de fluxo. As montagens das
conexões e frascos foram otimizadas de forma a reduzir as distâncias entre os locais
onde estavam as soluções e a câmara, com o intuito de diminuir o lapso de tempo
entre a abertura da válvula e o início da exposição do tecido às outras soluções.
Após o impalamento de uma célula, iniciou-se o registro do potencial
transmembrana durante cinco minutos em presença de solução de Tyrode, como
fase controle. Em seguida, a solução de Tyrode foi trocada por solução de timol ou
carvacrol na concentração de 1000 µM, registrando-se o potencial transmembrana
45
por cinco minutos. Finalmente, o tecido por exposto novamente à solução de Tyrode,
procedendo-se com a fase de recuperação, e registrou-se novamente o potencial
transmembrana por cinco minutos.
Tratamento estatístico
Os resultados foram expressos como média ± E.P.M. (n), onde n representa
o número de experimentos e E.P.M. é o erro padrão da média. Os gráficos foram
produzidos através do software Sigma Plot 8.0. Foi utilizado o software Sigma Stat
2.03 para as análises estatísticas nas quais foram considerados estatisticamente
significantes os resultados que apresentarem probabilidade de ocorrência da
hipótese nula menor que 5% (p < 0,05). Para comparação de dois grupos foi
realizado o teste t de Student pareado ou não pareado; para mais de dois grupos
experimentais, ANOVA seguido de técnica de contraste (testes paramétricos ou não
paramétricos), conforme apropriado. As CE
50
foram calculadas por interpolação
semilogarítmica e ajuste sigmóide através do software Sigma Plot 8.0, sendo
consideradas neste trabalho como a concentração da substância que é capaz de
produzir 50% do efeito máximo.
46
Resultados
Efeito do timol e carvacrol sobre o tônus intrínseco de aorta isolada em
presença do endotélio.
Neste protocolo, concentrações crescentes e cumulativas (1 – 1000 µM) de
timol ou carvacrol foram adicionadas sobre o tônus intrínseco da aorta isolada com o
endotélio preservado. A preparação controle, exposta somente ao veículo (DMSO),
não obteve variações significativas no seu tônus e alcançou como tensão máxima o
valor de 0,024 ± 0,03g (n = 6).
Conforme pode ser observado na figura 13, a exposição ao timol causou um
aumento do tônus basal de preparações de aorta a partir da concentração de 300
µM. O aumento do tônus na concentração de 1000 µM, cuja amplitude atingiu 0,09 ±
0,01g (n = 14), foi estatisticamente significante se comparado à preparação controle
(p < 0,05, two way ANOVA seguido de Holm-Sidak).
De forma similar, preparações de aorta expostas ao carvacrol (n = 6),
tiveram um ligeiro aumento do tônus basal, entretanto esse aumento não foi
estatisticamente significante em relação à preparação controle (p > 0,05, two way
ANOVA) em nenhuma das concentrações (Fig. 13).
47
Figura 13. Efeito do timol e carvacrol sobre o tônus basal de anéis de aorta em
presença de endotélio. Gráfico representativo das alterações induzidas pelo timol e
carvacrol no tônus basal de aorta com endotélio. Controle;
•
Timol;
Carvacrol. Os
valores estão expressos como média ± E.P.M. * p < 0.05 Timol vs. veículo (two way ANOVA
seguido de Holm-Sidak)
.
[µ
µµ
µM]
1 10 100 1000
10000
Tensão (g)
-0,1
0,0
0,1
0,2
Timol E+
Carvacrol E+
Controle
*
48
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre as contrações induzidas por
potássio em aorta isolada de rato com e sem endotélio.
Concentrações crescentes e não cumulativas (1-1000 µM) de timol ou
carvacrol foram adicionadas cinco minutos antes de contrações induzidas por KCl
(60 mM) em preparações com o endotélio preservado e não preservado. A amplitude
média das contrações de KCl (60 mM) em preparações controle com e sem
endotélio foi de 1,1 ± 0,08 e 1,1 ± 0,07, respectivamente. A exposição ao veículo
(DMSO) das preparações controle de aorta com e sem endotélio não alterou de
forma significativa a amplitude das contrações de KCl (Fig 14 a).
Em preparações com endotélio preservado, a adição de timol (1-1000 µM)
foi capaz de inibir completamente as contrações do músculo liso aórtico de forma
concentração-dependente, com CE
50
de 203,9 ± 48,92 µM (n = 10). Esta inibição foi
significante a partir da concentração de 100 µM (P < 0,05, one-way ANOVA seguido
de Holm-Sidak). Em preparações cujo endotélio foi retirado, a CE
50
foi de 171,2 ±
21,53 µM (n = 7). Não houve diferença estatística significante entre as CE
50
das
preparações com e sem endotélio expostas ao timol (Fig. 14 a, b; tabela 1).
Semelhantemente ao timol, o carvacrol (1-1000 µM) também apresentou
efeito antiespasmódico de forma concentração dependente e sua inibição foi
estatisticamente significante a partir da concentração de 100 µM (P < 0.05, one-way
ANOVA seguido de Holm-Sidak). Os valores de CE
50
obtidos foram 195,6 ± 6,94 (n
= 6) e 161,9 ± 11,70 µM (n = 7), respectivamente para preparações com e sem
endotélio. Não houve diferença estatística entre as CE
50
das preparações aórticas
com e sem endotélio expostas ao carvacrol (Fig. 14 a, c; tabela 1).
49
a
b
c
Timol [µ
µµ
µM]
1 10 100 1000 10000
% Contração de KCl (60 mM)
0
20
40
60
80
100
120
E+ (n = 10)
E- (n = 7)
*
Carvacrol [µ
µµ
µM]
1 10 100 1000
10000
% Contração de KCl (60 mM)
0
20
40
60
80
100
120
E+ (n = 6)
E- (n = 7)
*
10 min
0.5 g
Controle (TM + DMSO) Recuperação
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
30
100
300
600
1000
1
3
10
Timol (µM) Recuperação
30 100
200 300
400 600
1000
1
3
10
Carvacrol (µM)
Recuperação
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
K60
50
Figura 14. Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre as contrações induzidas por
potássio em aorta isolada de rato. a) Traçados de experimentos originais mostrando o
efeito inibitório de concentrações crescentes não cumulativas de timol e carvacrol sobre
contrações induzidas por KCl (60 mM) em preparações de aorta com endotélio. O primeiro
painel mostra o efeito do veículo em preparações controle, enquanto o segundo e terceiro
mostram o efeito inibitório do timol e carvacrol, respectivamente. TM (lavagem). b) Gráfico
representativo do efeito inibitório do timol sobre as contrações induzidas por 60 mM de KCl
no músculo liso aórtico com e sem endotélio.
•
E+ (com endotélio); E- (sem endotélio). c)
Gráfico representativo do efeito inibitório do carvacrol sobre as contrações induzidas por 60
mM de KCl no músculo liso aórtico com e sem endotélio.
E+ (com endotélio)
;
E- (sem
endotélio). As linhas contínuas representam o ajuste da função logística sigmoidal para os
valores do timol e carvacrol. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa
o número de experimentos. *, primeiro efeito significante (P < 0,05, one-way ANOVA
seguido de Holm-Sidak).
51
Tabela 1
Valores de CE
50
do efeito relaxante do timol e carvacrol em anéis de aorta de rato.
Nota: E+, aorta com endotélio intacto; E-, aorta com endotélio removido.*P < 0,05; **P < 0,001,
relaxamento do KCl vs. inibição do KCl; Os valores são expressos em µM (média ± E.P.M.).
Timol Carvacrol
Inibição do KCl
(Série 2)
E+
203,9 ± 48,92 195,6 ± 6,94
E-
171,2 ± 21,53 161,9 ± 11,70
Inibição da FE
(Série 2)
E+
115,2 ± 18,47 105,5 ± 13,90
E-
113,5 ± 20,65 165,1 ± 32,83
Relaxamento do KCl
(Série 3)
E+
64,4 ± 4,41* 78,8 ± 11,91**
Relaxamento da FE
(Série 3)
E+
106,4 ± 11,37 145,4 ± 6,07
E-
153,0 ± 20,04 137,2 ± 7,39
L-NAME
178,1 ± 17,49 169,7 ± 26,01
52
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre as contrações induzidas por
fenilefrina em aorta isolada de rato com e sem endotélio.
Verificou-se o efeito do timol e carvacrol sobre o acoplamento
farmacomecânico. Para isso, concentrações crescentes e cumulativas (1-2000 µM)
de timol ou carvacrol foram adicionados cinco minutos antes de contrações
induzidas por FE (0,1 µM) em preparações de aorta com e sem endotélio. A
amplitude média das contrações de FE foi 1,0 ± 0,10 g em preparações de aorta
com endotélio e 1,1 ± 0,09 g em preparações de aorta sem endotélio. Nas
preparações controle de aorta com e sem endotélio não houve alteração significativa
da amplitude das contrações pela exposição ao veículo (DMSO) (Fig 15 a).
Conforme pode ser verificado na figura 15a, o timol (1-2000 µM) foi capaz de
inibir completamente, de forma concentração-dependente (P < 0,001, one-way
ANOVA), as contrações induzidas por FE (0,1 µM) em aorta isolada com endotélio
presente e ausente. Em ambas as preparações, com e sem endotélio, essa inibição
foi significativa a partir da concentração de 30 µM (P < 0,05, one-way ANOVA
seguido de Holm-Sidak) (Fig. 15 b). Os valores de CE
50,
cujas diferenças não foram
estatisticamente significantes, foram
iguais a 115,2 ± 18,47 (n = 10) e 113,5 ± 20,65
µM (n = 10), respectivamente em preparações com endotélio intacto e removido
(tabela 1).
Similarmente ao timol, o carvacrol (1-1000 µM) inibiu completamente as
contrações induzidas por FE (0,1 µM), apresentando valores de CE
50
de 105,5 ±
13,90 (n = 6) e 165,1 ± 32,83 µM (n = 9) em preparações com e sem endotélio,
respectivamente. Essa inibição foi também significante a partir da concentração de
30 µM (P < 0,05, one-way ANOVA seguido de Holm-Sidak). Não houve diferença
estatística entre as CE
50
das preparações com e sem endotélio tratadas com o
carvacrol (Fig. 15 c; tabela 1).
53
1
3
10
30 100
200
300 400
600 1000
Timol (µM)
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
Recuperação
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
Controle (TM + DMSO)
Recuperação
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
30 100
200 300
400
600
1000
1
3
10
Carvacrol (µM)
Recuperação
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
FE
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
10 min
0.5 g
a
b
c
Timol [µ
µµ
µM]
1 10 100 1000
10000
% Contração de FE (0,1
µ
µ
µ
µ
M)
0
20
40
60
80
100
120
E+ (n = 10)
E- (n = 10)
*
Carvacrol [µ
µµ
µM]
1 10 100 1000
10000
% Contração de FE (0,1
µ
µ
µ
µ
M)
0
20
40
60
80
100
120
E+ (n = 6)
E- (n = 9)
*
54
Figura 15. Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre as contrações induzidas por
fenilefrina em aorta isolada de rato. a) Traçados de experimentos originais mostrando o
efeito inibitório de concentrações crescentes não cumulativas de timol e carvacrol sobre
contrações induzidas por FE (0,1 µM) em preparações de aorta com endotélio. O primeiro
painel mostra o efeito do veículo sobre as contrações de FE em preparações controle,
enquanto o segundo e terceiro mostram o efeito inibitório do timol e carvacrol,
respectivamente. TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito inibitório do timol
sobre as contrações induzidas por 0,1 µM de FE no músculo liso aórtico com e sem
endotélio. • E+ (com endotélio); E- (sem endotélio). c) Gráfico representativo do efeito
inibitório do carvacrol sobre as contrações induzidas por 0,1 µM de FE no músculo liso
aórtico com e sem endotélio. E+ (com endotélio); E- (sem endotélio). As linhas contínuas
representam o ajuste da função logística sigmoidal para os valores do timol e carvacrol. Os
valores estão expressos como média ± E.P.M; n representa o número de experimentos. *,
primeiro efeito significante (P < 0,05, one-way ANOVA seguido de Holm-Sidak).
55
Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração sustentada de potássio
em aorta isolada de rato.
Em anéis de aorta contendo endotélio, a administração de 80 mM de KCl
promoveu uma contração sustentada cuja amplitude média foi 1,256 ± 0,09 g.
Sobre platô da contratura induzida por KCl (80 mM), concentrações
crescentes e cumulativas (1-1000 µM) de timol ou carvacrol foram adicionados (Fig.
16 a). Timol e carvacrol foram capazes de relaxar totalmente a contração mantida
por KCl (80 mM) e este relaxamento foi dependente de concentração (P < 0,001,
one-way ANOVA). Além disso, o relaxamento foi significativo (P < 0,001, one-way
ANOVA seguido de Dunn) a partir da concentração de 30 µM (Fig 16 b). Os valores
de CE
50
de timol e carvacrol foram 64,4 ± 4,41 µM (n = 13) e 78,8 ± 11,91 µM (n =
10), respectivamente, e não diferiram significativamente (P > 0,05, Teste t de
Student não pareado) (tabela 1).
As preparações de aorta controle não tiveram suas respostas alteradas de
forma significativa pela exposição do veículo (DMSO) (Fig 16 a).
56
a
b
Timol (µM)
1 3
10
30
100
200
300
400
600
1000
2000
▲
K80
▲
K60
▲
K80
Controle(TM+ DMSO)
▲
K60
Carvacrol (µM)
1 3
10
30
100
200
300
400
600
1000
2000
▲
K80
▲
K60
Timol (µM)
1 3
10
30
100
200
300
400
600
1000
2000
▲
K80
▲
K60
Timol (µM)
1 3
10
30
100
200
300
400
600
1000
2000
▲
K80
▲
K60
▲
K80
Controle(TM+ DMSO)
▲
K60
Carvacrol (µM)
1 3
10
30
100
200
300
400
600
1000
2000
▲
K80
▲
K60
Carvacrol (µM)
1 3
10
30
100
200
300
400
600
1000
2000
▲
K80
▲
K60
10 min
0.5 g
10 min
0.5 g
[µ
µµ
µM]
1 10 100 1000
10000
% Contração de KCl (80 mM)
-20
0
20
40
60
80
100
120
Timol E+ (n = 13)
Carvacrol E+ (n = 10)
*
57
Figura 16. Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração mantida por
potássio em aorta isolada de rato. a) Traçados de experimentos originais mostrando o
efeito relaxante de concentrações crescentes cumulativas de timol e carvacrol sobre a
contração induzida por KCl (80 mM) em preparações de aorta com endotélio. Os painéis
superior, intermediário e inferior mostram o efeito do veículo (DMSO), timol e carvacrol,
respectivamente, sobre a contração mantida por KCl (80 mM) em aorta isolada com
endotélio. TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito relaxante do timol e carvacrol
sobre a contração induzidas por 80 mM de KCl no músculo liso aórtico com endotélio. •
Timol E+ (com endotélio); Carvacrol E+ (com endotélio). As linhas contínuas representam
o ajuste da função logística sigmoidal para os valores do timol e carvacrol. Os valores estão
expressos como média ± E.P.M. n representa o número de experimentos. *, primeiro efeito
significante (P < 0.001, one-way ANOVA seguido de Dunn).
58
Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração sustentada de
fenilefrina em aorta isolada de rato e a influência do endotélio.
Em preparações de aorta com endotélio preservado e não preservado, foram
induzidas e mantidas contrações por FE (0,1 µM). Sobre o platô dessas contrações,
foram adicionadas concentrações crescentes e cumulativas (1-2000 mM) de timol ou
carvacrol. Ambos foram capazes de relaxar totalmente e de forma concentração-
dependente (P < 0,001, one-way ANOVA) a contração mantida por FE em anéis de
aorta isolada com e sem endotélio. Em preparações controle, que receberam o
veículo DMSO, não houve nenhuma alteração significativa da resposta (Fig 16 a).
Em preparações cujo endotélio foi mantido, a média da contração de FE (0,1
µM) foi de 0,9 ± 0,22 g, valor medido sobre o platô da contração. A adição de timol
ou carvacrol sobre o platô provocou um relaxamento máximo para 8,2 ± 1,49 (n =
11) e 5,0 ± 7,12 % (n = 9) do controle, respectivamente (Fig 17 a, b, c). As CE
50
de
timol ou carvacrol foram de 106,4 ± 11,37 e 145,4 ± 6,07 µM, respectivamente.
Nesta preparação, não houve diferença estatística entre as CE
50
de timol ou
carvacrol (P > 0,05, teste t de Student não pareado) (tabela 1).
O mesmo efeito vasorrelaxante foi observado em preparações de aorta sem
endotélio pré-contraídas por FE (0,1 µM). Os valores de CE
50
para timol e carvacrol
foram 153,0 ± 20,04 (n = 10) e 137,2 ± 7,39 µM (n = 5), respectivamente. Timol e
carvacrol relaxaram totalmente a contração de FE cuja amplitude foi de 1,2 ± 0,15g
em anéis de aorta sem endotélio (Fig. b, c). Nesta preparação, não houve diferença
estatística entre as CE
50
de timol e carvacrol (P > 0,05, teste t de Student não
pareado) (tabela 1).
Com a finalidade de avaliar o papel do NO sobre o efeito do timol e
carvacrol, o inibidor de oxido nítrico sintase, L-NAME (100 µM), foi utilizado em
experimentos similares. Preparações de aorta com o endotélio preservado foram
expostas durante 20 minutos ao L-NAME (100 µM), previamente à contração por FE.
Sob estas condições, timol (1 - 2000 µM) ou carvacrol (1 - 2000 µM), adicionados
sobre o platô, relaxaram de forma dependente de concentração a contração
evocada por FE, com CE
50
de 178,10 ± 17,49 (n = 12) e 169,75 ± 26,01 µM (n = 6)
59
(Fig b, c). Estes valores não diferiram significativamente daqueles obtidos em
ausência do L-NAME (P > 0,05, teste t de Student não pareado) (tabela 1).
Em todas as preparações, o relaxamento foi significativo a partir da
concentração de 30 µM (P < 0,001, one-way ANOVA seguido de Dunn). Não houve
diferenças estatísticas entre as CE
50
das preparações tratadas por Timol, bem como
daquelas tratadas por carvacrol (P > 0,05, two way ANOVA) (tabela 1). Isto sugere
um efeito espasmolítico independente dos metabólitos relaxantes liberados pelo
endotélio.
60
a
b
c
10 min
0.5 g
10 min
0.5 g
Control e (TM + DMSO)
▲
FE
▲
K60
Timol (µM)
3 10
30
100
200
300
400
600
1000
2000
1
▲
FE
▲
K60
Carvacrol (µM)
3 10 30
100
200
300
400
600
1000
2000
1
▲
FE
▲
K60
Control e (TM + DMSO)
▲
FE
▲
K60
Timol (µM)
3 10
30
100
200
300
400
600
1000
2000
1
▲
FE
▲
K60
Carvacrol (µM)
3 10 30
100
200
300
400
600
1000
2000
1
▲
FE
▲
K60
Carvacrol [µ
µµ
µM]
1 10 100 1000
10000
%Contração de FE (0,1
µ
µ
µ
µ
M)
-20
0
20
40
60
80
100
120
E+ (n = 9)
E- (n = 5)
L-NAME (n = 6)
*
Timol [µ
µµ
µM]
1 10 100 1000
10000
% Contração de FE (0,1
µ
µ
µ
µ
M)
-20
0
20
40
60
80
100
120
E+ (n = 11)
E- (n = 10)
L-NAME (n = 12)
*
61
Figura 17. Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração mantida por
fenilefrina em aorta isolada de rato e a influência do endotélio. a) Traçados de
experimentos originais mostrando o efeito relaxante de concentrações crescentes
cumulativas de timol e carvacrol sobre contrações mantidas por FE (0,1 µM) em
preparações de aorta com endotélio. Os painéis superior, intermediário e inferior mostram os
efeitos do veículo (DMSO), timol e carvacrol, respectivamente, sobre a contração mantida
por FE (0,1 µM). TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito relaxante do timol
sobre a contração induzida por 0,1 µM de FE no músculo liso aórtico com endotélio intacto e
removido e em presença de L-NAME (100 µM). • E+ (com endotélio); E- (sem endotélio);
L-NAME. c) Gráfico representativo do efeito relaxante do carvacrol sobre a contração
mantida por 0,1 µM de FE no músculo liso aórtico com endotélio intacto e removido e em
presença de L-NAME (100 µM). E+ (com endotélio); E- (sem endotélio); L-NAME. As
linhas contínuas representam o ajuste da função logística sigmoidal para os valores do timol
e carvacrol. Os valores estão expressos como média ± E.P.M; n representa o número de
experimentos. *, primeiro efeito significante (P < 0.001, one-way ANOVA seguido de Dunn).
62
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração de fenilefrina em aorta
isolada mantida em meio isento de Ca
2+
.
Neste protocolo, preparações de aorta com endotélio, inicialmente expostas
à solução de tyrode, foram contraídas por FE (10 µM). Em seguida, as preparações
foram expostas ao meio isento de Ca
2+
contendo EGTA (2 mM) e, então, foram
adicionadas concentrações (100 ou 1000 mM) de timol ou carvacrol seguidas da
contração induzida por FE (10 µM).
Em preparações com endotélio intacto expostas à solução de tyrode, a
amplitude média da contração induzida por 10 µM de FE foi de 1,0 ± 0,06 g.
Enquanto isso, em meio 0Ca
2+
contendo EGTA (2mM), a FE (10 µM) induziu um
transiente fásico cuja amplitude foi de 0,3 ± 0,09 g (n = 5) (Fig 18 a).
A pré-exposição por 5 minutos da preparação de aorta a 1000 µM de timol (n
= 6) ou carvacrol (n = 6) aboliu completamente o componente fásico da contração
induzida por FE (P < 0.001, teste t de Student não pareado). Contrariamente,
quando timol (n = 5) ou carvacrol (n = 5) foram testados na concentração de 100
mM, nenhum efeito inibitório foi observado (Fig 18 a, b).
63
a
b
% Contração de FE (10
µ
µ
µ
µ
M)
0
20
40
60
80
100
120
FE (Tyrode)
FE (0Ca
2+
)
FE + Timol
FE + Carvacrol
**
**
100 µM 1000 µM
Ca
2+
-free
5 min
0.5 g
5 min
0.5 g
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
Recuperação0Ca
2+
Controle
TM
FE
FE
FE
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
Recuperação0Ca
2+
Timol 100 µM
TM
FE
FE
FE
0Ca
2+
Timol 1000 µM
FE
FE
FE
TM
Recuperação
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
0Ca
2+
Controle
FE
FE
FE
TM Recuperação
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
Recuperação
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
0Ca
2+
Carvacrol 100 µM
TM
FE
FE
FE
0Ca
2+
Carvacrol 1000 µM
FE
FE
FE
TM
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
Recuperação
64
Figura 18. Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração induzida por
fenilefrina em meio isento de Ca
2+
. a) Traçados de experimentos originais mostrando o
efeito inibitório das concentrações 100 e 1000 µM de timol e carvacrol sobre contrações
induzidas por FE (10 µM) em preparações de aorta com endotélio em Tyrode modificado e
em meio isento de Ca
2+
contendo EGTA (2 mM). TM (lavagem). b) Gráfico representativo
do efeito inibitório do timol e carvacrol (100 e 1000 µM) sobre a contração induzida por 10
µM de FE no músculo liso aórtico com endotélio exposto à Tyrode modificado e ao meio
isento de Ca
2+
contendo EGTA (2 mM). As colunas mostram a magnitude das respostas
contráteis fásicas induzidas por FE em anéis de aorta mantidas tanto em presença de Ca
2+
normal (2 mM, coluna hachurada) ou em meio isento de Ca
2+
com EGTA (2 mM) (coluna
branca). Os valores estão expressos como média ± E.P.M; n representa o número de
experimentos. **, timol ou carvacrol vs. contração induzida por FE em meio isento de Ca
2+
(P
< 0.001, teste t de Student não pareado).
65
Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração induzida por influxo de
Ca
2+
em aorta despolarizada por potássio.
Em preparações com endotélio intacto, os estoques intracelulares foram
depletados por repetidas contrações de FE (10 µM) em meio com KCl isotônico (80
mM), isento de Ca
2+
e contendo EGTA (2 mM) (dados omitidos nos traçados da
figura 19). Em seguida, ainda em solução com KCl isotônico (80 mM), porém com
0Ca
2+
nominal, concentrações crescentes e cumulativas de CaCl
2
(0.1-20 mM)
evocaram uma contração dependente de concentração (P < 0,001, one-way
ANOVA) que se tornou significante a partir da concentração de 0,3 mM (P < 0,05,
one way ANOVA seguido de Dunn) e atingiu a amplitude máxima (1,2 ± 0,10 g) em
20 mM (Fig. 19 a)
A adição prévia de 400 µM de timol (n = 7) ou carvacrol (n = 5) reduziu a
tensão da contração induzida por 20 mM de CaCl
2
para 34,5 ± 9,87 e 32,6 ± 5,25 %,
respectivamente (Fig. 19 b). Essas reduções foram estatisticamente significantes (p
< 0,05, two way ANOVA seguido de Holm-Sidak) se comparada ao controle. Os
efeitos promovidos por timol e carvacrol não foram diferentes estatisticamente (p >
0,05, two way ANOVA seguida de Holm-Sidak).
66
a
b
CaCl
2
(mM)
0,1 1 10 100
%Contração máxima de CaCl
2
0
20
40
60
80
100
120
Controle
Timol 400 mM
Carvacrol 400 mM
§
*
**
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Controle (TM + DMSO)
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Carvacrol 400 µM
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Timol 400 µM
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Controle (TM + DMSO)
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Controle (TM + DMSO)
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Carvacrol 400 µM
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Carvacrol 400 µM
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Carvacrol 400 µM
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Timol 400 µM
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Timol 400 µM
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
0.1
0.3 1 3 10 20
0.1
0.3 1 3 10 20
CaCl
2
Timol 400 µM
⁄
⁄⁄
⁄ ⁄
⁄⁄
⁄
▲
K60
K80/0Ca
2+
5 min
0.5 g
5 min
0.5 g
67
Figura 19. Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração induzida por Ca
2+
em
aorta isolada de rato despolarizada por potássio. a) Traçados de experimentos originais
mostrando o efeito inibitório de timol e carvacrol (400 µM) sobre a curva concentração
resposta de CaCl
2
(0,1 - 20 mM) em preparações de aorta com endotélio expostas a solução
isotônica de KCl (80 mM) isenta de Ca
2+
. Os painéis superior, intermediário e inferior
mostram o efeito do veículo (DMSO), do timol e carvacrol, respectivamente, sobre a curva
concentração resposta de CaCl
2
. TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito
inibitório do timol e carvacrol (400 µM) sobre a curva concentração resposta de CaCl
2
(0,1 -
20 mM) no músculo liso aórtico com endotélio.
•
Timol (400 µM); Carvacrol (400 µM). Os
valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa o número de experimentos. *e
**, primeiro efeito significante respectivamente para a curva controle e para as curvas
obtidas em presença de timol ou carvacrol (P < 0,05, one way ANOVA seguido de Holm
Sidak); §, timol ou carvacrol vs. controle (P < 0,001, two way ANOVA seguido de Holm-
Sidak).
68
Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração sustentada por éster de
forbol na aorta isolada de rato sem endotélio mantida em meio 0Ca
2+
e em
presença de tapsigargina.
Em preparações de aorta cujo endotélio foi removido endotélio, o ativador de
PKC, DBF (1 µM), promoveu uma contração lenta e sustentada em meio 0Ca
2+
contendo EGTA (2 mM). Após aproximadamente 20 minutos, a contração atingiu seu
platô cuja tensão foi 1,40 ± 0,17g (n = 6) (Fig 20 a).
A adição de timol (300 ou 1000 µM) sobre o platô relaxou significativamente
(P < 0,05, teste t de Student não pareado) a contração induzida por PDB para 80,6 ±
4.64 (n = 5) e 34,0 ± 10,99% (n = 8) do valor controle, respectivamente (Fig. 20 a, b).
Resultados similares foram observados com o carvacrol (300 ou 1000 µM), o qual
relaxou a contração de PDB para 78,3 ± 4,67 (n = 7) e 53,0 ± 9,90% (n = 6) do valor
controle, respectivamente (Fig. 20 a, b). Na concentração de 100 µM, tanto timol (n =
5) como carvacrol (n = 5) não foram capazes de relaxar a contração induzida por
DBF (P > 0,05, teste t de Student não pareado) (Fig. 20 a, b). Para confirmar a
ausência de efeito da concentração de 100 µM, esta foi adicionada ao platô da
contração induzida por 0,1 µM de DBF. Igualmente, 100 mM de timol (n = 5) e
carvacrol (n = 5) não foi capaz de relaxar a contração induzida por uma
concentração menor de DBF (dados não mostrados).
Na presença do inibidor da bomba de Ca
2+
do retículo sarcoplasmático,
tapsigargina (1 µM), a concentração de 1000 µM de timol ou carvacrol relaxou mais
efetivamente as preparações, reduzindo a contração induzida por PDB (1 µM) para
3,5 ± 2,67 e 10,7 ± 5,01% do controle (0,5 ± 0,13 g), respectivamente (Fig. 20 a, b).
69
a
b
%Contração de DBF (1
µ
µ
µ
µ
M)
0
20
40
60
80
100
120
140
Controle (DMSO)
Timol
Carvacrol
300 1000
100
Tapsigargina (1 µM)
1000 µM
[µM]
*
**
*
*
*
**
TM + DMSO
0Ca
2+
+ EGTA
Tapsigargina (1 µM)
K60
DBF
K60
DBF
Timol (1000 µM)
0Ca
2+
+ EGTA
Tapsigargina (1 µM)
K60
DBF
Carvacrol (1000 µM)
0Ca
2+
+ EGTA
Tapsigargina (1 µM)
5 min
0.5 g
Carvacrol 1000 µM
0Ca
2+
+ EGTA
K60
DBF
K60
DBF
Timol 1000 µM
0Ca
2+
+ EGTA
K60
DBF
TM + DMSO
0Ca
2+
+ EGTA
5 min
0.5 g
70
Figura 20. Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração induzida por ester
de forbol em aorta isolada mantida em meio isento de Ca
2+
e em presença de
tapsigargina. a) Traçados de experimentos originais mostrando o efeito inibitório timol e
carvacrol (1000 µM) sobre contrações sustentada por DBF (1 µM) em preparações de aorta
sem endotélio mantidas em meio isento de Ca
2+
contendo EGTA (2 mM) e em ausência
presença de tapsigargina (1 µM). TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito
inibitório do timol e carvacrol (100, 300 e 1000 µM) sobre a contração induzida por 1 µM de
DBF no músculo liso aórtico sem endotélio exposto ao meio 0Ca
2+
contendo EGTA (2 mM) e
em ausência e em presença de tapsigargina (1 µM). Os valores estão expressos como
média ± E.P.M. * P < 0,05; ** P < 0,001, timol ou carvacrol vs. DBF (teste t de Student não
pareado).
71
Comparação dos os efeitos de timol e carvacrol com o efeito do inibidor de
Rho cinase sobre a contração sustentada de potássio.
Em preparação de aorta isolada de rato com endotélio, foi promovida uma
contração por 80 mM de KCl (solução isotônica) cuja magnitude alcançou 1,1 ± 0,11
g.
A adição do inibidor de Rho cinase (1 µM), composto Y27632, relaxou de
forma estatisticamente significante (P < 0,001, teste t de Student pareado) a
contração de KCl (80mM) para 2,6 ± 5,83% do controle. De forma semelhante, a
adição de timol ou carvacrol, ambos na concentração de 1000 µM, sobre o platô da
contração induzido por KCl (80 mM) produziu um relaxamento para 8,4 ± 2,35 e -6,9
± 8,02 % do controle (Fig. 21).
Não houve diferenças estatísticas entre o relaxamento provocado pelo
composto Y27632 e aquele provocado por timol ou carvacrol (P > 0,05, teste t de
Student não pareado).
72
Figura 21. Comparação dos os efeitos de timol e carvacrol com o efeito do inibidor de
Rho cinase sobre a contração sustentada de potássio. Gráfico representativo da
comparação entre do efeito relaxante do Y26632 (1 µM) e do efeito da concentração de
1000 µM de timol e carvacrol sobre o potencial de repouso da aorta isolada de rato sem
endotélio. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa o número de
experimentos. *, P < 0.001; Y27632, timol ou carvacrol vs. KCl 80 mM (teste t de Student
não pareado).
% Contração de KCl (80 mM)
0
20
40
60
80
100
120
KCl 80 mM (n = 6)
Y27632 1 mM (n = 6)
Timol 1000 mM (n = 10)
Carvacrol 1000 mM (n = 11)
*
*
*
73
Efeito do timol e carvacrol sobre o potencial transmembrana da aorta isolada
de rato sem endotélio.
Em preparações de aorta sem endotélio, foi investigado o efeito do timol
(1000 µM) e carvacrol (1000 µM) sobre o potencial de membrana. Inicialmente
registro-se, durante cinco minutos, o portencial transmembrana em solução de
Tyrode. Em seguida, trocou-se a solução de Tyrode por uma solução (1000 µM) de
timol ou carvacrol, registrando-se o potencial transmembrana também por cinco
minutos. Timol (n = 7 células) não produziu nenhum efeito significativo (p > 0.05,
teste t de Student pareado) sobre o potencial de repouso (-2.7 ± 4.0 vs. -42.8 ± 6.1
mV em condições controle). Similarmente, este parâmetro permaneceu inalterado na
presença de carvacrol (-1.5 ± 2.2 vs. -43.5 ± 4.2 mV em condições controle, n = 8
células) (Fig. 22).
74
Figura 22. Efeito do timol e carvacrol sobre o potencial transmembrana da aorta
isolada de rato. Gráfico representativo do efeito da concentração de 1000 µM de timol (n =
7) e carvacrol (n = 8) sobre o potencial de repouso da aorta isolada de rato sem endotélio.
Os valores estão expressos como média ± E.P.M.
-
60
-
50
-
40
-
30
-
20
-
10
0
Controle
Timol 1000
µ
M
Carvacrol
1000
µ
M
Recuperação
+
-
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Potencial transmembrana (mV)
75
DISCUSSÃO
Até o presente momento, não existem relatos na literatura que demonstrem
o efeito vasorrelaxante do timol e carvacrol em aorta isolada de rato. Assim,
podemos inferir que os dados colhidos no presente estudo são originais. Entretanto,
existem relatos do efeito espasmolítico do timol em músculo liso de estômago e veia
porta de cobaia, em concentrações superiores a 10
-6
M (Boskabady, Ramazani e
Tabei, 2003), as mesmas utilizadas neste estudo. Além disso, ficou provado que o
óleo essencial de Carum copticom, cujo constituinte majoritário é o carvacrol, relaxa
completamente o músculo liso traqueal de cobaia (Beer et al., 2007).
Este estudo demonstrou, como principal achado, que timol e carvacrol
possuem efeito vasorrelaxante sobre a aorta isolada de rato. Este efeito foi
independente da integridade do endotélio vascular. Adicionalmente, o efeito de
ambos os isômeros foi capaz de interfeir tanto no acoplamento eletromecânico como
no farmacomecânico.
Pode-se levantar a hipótese de que os efeitos mediados por timol e carvacrol
estão relacionados aos seus possíveis efeitos tóxicos. Entretanto, duas linhas de
evidências não suportam esta hipótese: primeiro, nas condições experimentais deste
estudo, todas as respostas inibitórias e relaxantes dos dois isômeros foram
reversíveis; segundo, timol e carvacrol apresentam baixa toxicidade, com uma DL
50
de 980 e 910 mg/Kg do peso corporal, respectivamente, quando administrado via
oral a ratos (Jenner et al., 1964).
Efeito independente do endotélio
Furchgott e Zawadski (1980) descobriram que células endoteliais podem
liberar um potente fator relaxante chamado fator relaxante derivado do endotélio
(EDRF, do inglês endothelium-derived relaxing factor) que modula a resposta
vascular. A identidade química do EDRF é atualmente conhecida como NO (Ignarro
et al., 1987). O relaxamento da aorta de rato em resposta ao NO gerado pelo
endotélio, em resposta à estimulação por substâncias vasoativas ou liberado
espontaneamente a partir de doadores de NO, é mediado por um aumento de cGMP
76
na célula do músculo liso vascular como resultado da ativação da guanilato ciclase
(Andreopoulos e Papapetropoulos, 2000).
Neste estudo, foi investigado a possível participação do endotélio em
modular a ação do timol e carvacrol. Nossos experimentos demonstraram que os
dois compostos inibiram as contrações induzidas por KCl e FE em preparações com
endotélio intacto e em preparações cujo endotélio foi previamente removido (Fig. 14
e 15). Em ambas as preparações, estas inibições tiveram valores de CE
50
similares,
sem diferença significante estatisticamente (tabela 1). Corroborando com estes
resultados, timol e carvacrol relaxaram, de forma similar, contrações mantidas por
FE em preparações de anéis de aorta com endotélio intacto e em preparações
previamente tratadas por L-NAME, também com endotélio intacto (Fig. 17).
Em conjunto, estes resultados sugerem que os efeitos antiaspasmódico e
vasorrelaxante do timol e carvacrol são independentes da liberação de NO pelo
endotélio e que este não atua modulando a ação destes isômeros na célula do
músculo liso aórtico. Assim, timol e carvacrol possivelmente atuam interferindo na
atividade de componentes intracelulares, sugerindo-se uma ação miogênica.
Efeito sobre o tônus intrínseco
Adicionados cumulativamente, timol e carvacrol, nas concentrações de 1 a
600 µM, foram incapazes de alterar o tônus do músculo liso aórtico. No entanto, o
tônus foi aumentado sutilmente pela maior concentração (1000 µM), um efeito que
alcançou significância estatística somente para o timol (Fig. 13). Este efeito contrátil
pode estar relacionado à conhecida capacidade do timol e carvacrol de liberar Ca
2+
do retículo sarcoplasmático em preparações tanto de músculo liso (Hisayama e
Takayanagi, 1986), como de músculo cardíaco (Szentandrássy et al., 2004) e
esquelético (Palade et al., 1987) (Fig. 23, via IV).
Efeito sobre o acoplamento eletromecânico
O acoplamento eletromecânico é caracterizado pela despolarização do
potencial de repouso da membrana. Sabe-se que altas concentrações de potássio
no meio extracelular são capazes de induzir despolarização que, por sua vez, ativa
77
os canais de cálcio dependentes de voltagem, permitindo o influxo de Ca
2+
e o
aumento da [Ca
2+
]
i
. O Ca
2+
juntamente com a calmodulina, irá fosforilar a MLCK e,
assim, dar-se-á o inicio do ciclo das pontes cruzadas, promovendo a contração
(Somlyo e Somlyo, 1968).
No presente estudo, tanto timol como carvacrol inibiram contrações
induzidas por KCl (60 mM) com valores de CE
50
similares, demonstrando que ambos
são capazes de interferir no acoplamento eletromecânico com a mesma potência
farmacológica. Além disso, timol e carvacrol relaxaram preparações de anéis de
aorta pré-contraídas por 80 mM de KCl. Esta alta concentração de KCl no meio
extracelular despolariza a célula, trazendo seu potencial de membrana para
aproximadamente -20 mV (Quast, 1993), um valor muito próximo do potencial de
equilíbrio do K
+
. Essa despolarização ativa o canal retificador para fora de K
+
,
tornando pouco provável que qualquer agente possa deslocar o potencial
transmembrana do potencial de equilíbrio do K
+
. Assim, é improvável que o
relaxamento da contração induzida por KCl seja devido a uma hiperpolarização
causada pela ação do timol e carvacrol. Esta hipótese é reforçada pelo fato que
1000 µM de timol ou carvacrol, concentração que inibe completamente a contração
induzida por KCl, não foi capaz de alterar o potencial de repouso da célula muscular
lisa de aorta (Fig. 22).
Alguns estudos recentes demonstram que contrações induzidas por KCl
também ativam a proteína Rho cinase, induzindo, então, um aumento na
sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca
2+
no músculo liso vascular (Mita et al.,
2002; Rembold e Murphy, 1988). O mecanismo para a ativação da Rho é totalmente
dependente do Ca
2+
extracelular (Sakurada et al., 2003) e o aumento da [Ca
2+
]
i
ativa
a via de sinalização da PI3K-C2α de classe II (Wang et al., 2006), enzimas ubíquas
que regulam negativamente a atividade da MLCP através da ativação da Rho. Além
disso, Urban e colaboradores (2003) demonstraram que a Rho cinase não participa
do desenvolvimento inicial da força de contração, porém tem um papel essencial na
manutenção da força do platô da contração induzida por KCl.
Nossos resultados mostram maior potência farmacológica de timol e
carvacrol no relaxamento da contração sustentada por KCl do que na inibição da
78
contração induzida por KCl. Considerando a participação da Rho cinase na
manutenção do platô da contração, foi administrado o inibidor de Rho cinase,
Y27632 (1 µM), sobre a contração de KCl a fim de comparar seu efeito relaxante ao
do timol e carvacrol. Nossos resultados mostraram que Y27632 relaxou para
aproximadamente 2% a contração de KCl, valor similar aos valores de relaxamento
induzidos por timol e carvacrol na concentração de 1000 µM (Fig. 21). Estes
resultados sugerem que tanto timol quanto carvacrol, nestas condições, podem estar
atuando por mecanismos que envolvem a via da Rho cinase ativada (Fig. 23, via II).
Com isso, explica-se o efeito mais potente do timol e carvacrol em relaxar
contrações sustentadas por KCl do que inibí-las.
Efeito sobre o acoplamento farmacomecânico
No acoplamento farmacomecânico, através da ativação de receptores,
alguns agonistas promovem a contração do músculo liso vascular pelo aumento do
influxo de Ca
2+
, da [Ca
2+
]
i
e por induzir a sensibilidade ao Ca
2+
(Somlyo et al., 1999).
Vários estudos demonstram que a Rho funciona como um interruptor molecular que
modula a sensibilidade ao Ca
2+
das proteínas contráteis por regular negativamente a
MLCP em vários tipos de músculo liso, incluindo o vascular (Somlyo e Somlyo, 2003;
Hilgers e Webb, 2005; Loirand et al., 2006). Em adição a isso, agonistas de
receptores podem, também, ativar mecanismos de sensibilidade ao Ca
2+
que
envolvem a via de sinalização da PKC independentemente de aumento na [Ca
2+
]
i
(Kitazawa et al., 2000).
Timol e carvacrol também foram capazes de interferir no acoplamento
farmacomecânico, inibindo a contração induzida por FE bem como relaxando a
contração sustentada de FE. Sabe-se que a estimulação de receptores α
1
-
adrenérgicos promove a hidrólise do PIP
2
produzindo DAG e IP
3
. DAG ativa
diretamente a PKC, enquanto o IP
3
, por sua vez, ativa receptores no retículo
sarcoplasmático a fim de liberar Ca
2+
para o citoplasma (Suzuki et al., 1990).
Utilizando a FE como agonista vasoconstritor, foi investigada a ação
inibitória do timol e carvacrol sobre os canais de Ca
2+
do retículo sarcoplasmático
ativados por IP
3
(Fig 23, via I). Para isso, experimentos foram realizados em solução
de Tyrode isentas de Ca
2+
. Nestas condições, o desenvolvimento da tensão ativada
79
por FE resulta unicamente do Ca
2+
liberado após a ativação dos canais de Ca
2+
sensíveis a IP
3
. Nossos resultados mostram que a concentração de 1000 µM de
timol e carvacrol inibiu totalmente a contração transiente induzida por FE em meio
0Ca
2+
. Entretanto, a concentração de 100 mM, que é capaz de inibir de forma
significante a contração induzida por FE em solução de Tyrode, não obteve efeito
significativo algum em meio 0Ca
2+
(Fig. 18).
Com a finalidade de avaliar o efeito do timol e carvacrol sobre o componente
de sensibilidade ao Ca
2+
da contração, precisamente a via de sinalização da PKC
(Fig. 23, via III), foi utilizado DBF (1 µM), um ativador específico de PKC (Yanagita et
al., 1999). Em músculo liso de aorta isenta de endotélio e mantida em meio livre de
Ca
2+
contendo EGTA, DBF induziu uma contração lenta e sustentada. Timol e
carvacrol, na concentração de 1000 mM, relaxaram aproximadamente 66 e 47% a
contração de DBF, respectivamente; enquanto que na concentração de 300 mM,
ambos relaxaram aproximadamente 20 %. A concentração de 100 mM não produziu
efeito algum sobre a contração de DBF (Fig. 20). Neste caso, as concentrações de
1000 e 300 µM, tanto de timol como de carvacrol, não apresentaram a mesma
potência se comparadas ao protocolo de inibição da FE.
Entretanto, como em altas concentrações timol e carvacrol possivelmente
liberam Ca
2+
do retículo sarcoplasmático, seus reais efeitos relaxantes sobre a
contração de DBF poderiam estar sendo ocultados. Logo, foi feito um protocolo
similar, porém na presença de tapsigargina (Treiman et al., 1998), a fim de depletar
os estoques internos de Ca
2+
. Com a adição de tapsigargina, timol e carvacrol (1000
µM) relaxaram significativamente quase toda a contração de DBF, sugerindo que
ambos podem relaxar a contração mediada pela ativação da via da PKC (Fig. 20).
Adicionalmente, este resultado corrobora com o aumento do tônus basal,
possivelmente devido à liberação de Ca
2+
dos estoques internos, após administração
de altas concentrações de ambos os terpenóides, confirmando, portanto, este efeito
(Fig. 23, via IV).
Por conseguinte, o presente estudo mostra que timol e carvacrol são
capazes de relaxar e inibir contrações induzidas por KCl e FE de forma dependente
de concentração, interferindo, desta forma, em ambos os acoplamentos,
80
eletromecânico e farmacomecânico. Esta descoberta contrasta com um estudo
recente, o qual demonstra que o carvacrol não foi capaz de relaxar as contrações
induzidas por KCl e FE em aorta isolada de rato (Aydin et al., 2007). Esta
discrepância pode estar relacionada ao fato de que estes autores testaram apenas
uma concentração de carvacrol (10
-4
M), que na maioria dos nossos experimentos
foi a concentração limiar para a indução significativa do efeito vasorrelaxante.
Efeito sobre a contração induzida pelo influxo de Ca
2+
Timol e carvacrol inibiram, de forma similar, a contração induzida por CaCl
2
em anéis de aorta mantidas despolarizadas por K
+
, sugerindo que estes terpenóides
podem interferir na contração produzida pelo influxo de Ca
2+
através de canais de
Ca
2+
voltagem dependentes. Existem relatos que timol e carvacrol suprimiram
correntes de Ca
2+
do tipo L em cardiomiócitos ventriculares de caninos e humanos
(Magyar et al., 2004), entretanto é improvável que a supressão deste influxo de Ca
2+
possa estar envolvido nos efeitos vasorrelaxantes descritos no presente trabalho,
embora esta ação não possa ser completamente excluída.
Deve-se levar em consideração que timol e carvacrol reduziram, com
potências similares, contrações induzidas em anéis de aorta sob condições livres de
Ca
2+
tanto quanto inibiram os acoplamentos eletromecânico e farmacomecânico.
Logo, em conjunto, estes resultados nos permitem sugerir um sítio comum de ação
para timol e carvacrol em ambos os acoplamentos, como um efeito de inibição direta
sobre as proteínas contráteis (Fig. 23, via V).
81
Figura 23. Possíveis vias de sinalização envolvidas no efeito vasorrelaxante do timol e
carvacrol. I, via de sinalização do IP
3
; II, via de sinalização da proteína Rho; III, via de
sinalização da PKC; IV, liberação de Ca
2+
do retículo sarcoplasmático; V, proteínas
contráteis.
82
CONCLUSÃO
Timol e carvacrol possuem um efeito antiespasmódico e vasorrelaxante sobre a
aorta isolada de rato.
O efeito vasorrelaxante dos terpenoides, timol e carvacrol, sobre a aorta
isolada de rato é independente da modulação pelo endotélio, sugerindo-se uma
ação miogênica.
Timol e carvacrol são capazes de interferir com os dois acoplamentos:
eletromecânico e farmacomecânico.
O efeito vasorrelaxante do timol e carvacrol pode ser mediado por vias que
envolvem o IP
3
, a PKC e a Rho cinase.
Sugere-se que timol e carvacrol atuem relaxando o músculo liso da aorta
através de uma interação direta com as proteínas contráteis.
Timol e carvacrol, em altas concentrações, possuem ação espasmódica sobre
o tônus intrínseco da aorta isolada de rato, possivelmente devido à liberação de
Ca
2+
do retículo sarcoplasmático.
83
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