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Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Isabela Cabral Cavichioli Pereira
Atividade da Catepsina D, Gastricsina, Pepsina e
Uropepsina Humanas sobre Substratos Sintéticos
relacionados à Calistatina Humana
Orientadora: Dra. Roseli Aparecida da Silva Gomes
Colaboradora: Profa. Profa. Dra. Lívia das Graças Vieito Lombardi Teodoro
Uberaba, Minas Gerais
2009
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Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Isabela Cabral Cavichioli Pereira
Atividade da Catepsina D, Gastricsina, Pepsina e
Uropepsina Humanas sobre Substratos Sintéticos
relacionados à Calistatina Humana
Monografia apresentada ao curso de Pós Graduação
Pós-Graduação em Patologia, subárea Patologia Clínica
da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Dra. Roseli Aparecida da Silva Gomes
Colaboradora: Profa. Profa. Dra. Lívia das Graças Vieito Lombardi Teodoro
Uberaba, Minas Gerais
2009
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iv
Este trabalho foi realizado com suporte financeiro das seguintes instituições:
Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM)
Fundação de Ensino e Pesquisa de Uberaba (FUNEPU)
Conselho Nacional de Pesquisas (CNPq)
Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES)
v
Dedico este trabalho aos meus pais,
José e Maristela,
ao meu irmão Antonio
e à minha tia Lucia.
vi
AGRADECIMENTOS
À Professora Roseli Aparecida da Silva Gomes, pelo auxílio na realização deste trabalho,
pelas importantes sugestões e pela confiança depositada em mim, me mostrando o caminho
da ciência e da pesquisa.
À Professora Lívia das Graças Vieito Lombardi Teodoro, pelo carinho com que me
acolheu e pela competência com que me orientou durante a graduação. Serei eternamente
grata pela atenção, dedicação e disponibilidade dispensadas em todos os momentos.
Aos funcionários do Laboratório de Pesquisas em Bioquímica, Geraldo Garcia de Freitas
Júnior e Marco Túlio Parollini, pelo auxílio na realização das técnicas, pelo dia a dia no
laboratório e sobretudo pela grande amizade.
À secretária da disciplina de Bioquímica e Biofísica pela disponibilidade e pelo agradável
convívio durante o decorrer deste trabalho.
Aos colegas pós-graduação pois juntos trilhamos uma etapa importante de nossas vidas.
Especialmente:
Aos meus pais, José Pereira Sobrinho e Maristela das Dores Cabral Pereira, e ao meu
irmão Antonio Pereira Neto, pelo apoio incondicional, mesmo estando longe, estiveram
sempre presentes, apoiando-me com muito amor e carinho, sem eles nada seria possível.
À minha tia Lúcia pelo grande incentivo e participação nos meus estudos desde minha
alfabetização, pela amizade, disponibilidade, paciência e pela dedicação de uma mãe.
À Deus por me abençoar e iluminar em todos momentos.
vii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..........................................................................................................16
1.1. Peptidases aspárticas................................................................................................16
1.1.1. Catepsina D...............................................................................................19
1.1.2. Pepsinas.....................................................................................................21
1.1.3. Uropepsina................................................................................................22
1.2. Serpinas....................................................................................................................23
1.2.1. Calistatina..................................................................................................23
2. JUSTIFICATIVA .......................................................................................................26
3. OBJETIVOS...............................................................................................................27
4. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................28
4.1. Purificação...............................................................................................................28
4.1.1. Catepsina D...............................................................................................28
4.1.1.1. Coleta e processamento do material biológico ......................................28
4.1.1.2. Cromatografia de afinidade 6-aminoexil Sepharose-Pepstatina A ........29
4.1.1.3. Cromatografia de afinidade Blue-Agarose ............................................29
4.1.1.4. Cromatografia de filtração em gel Superdex HR 75 10/30....................30
4.1.2. Gastricsina.................................................................................................31
4.1.2.1. Coleta e processamento do material biológico ......................................31
4.1.3. Pepsina......................................................................................................31
4.1.3.1. Coleta e processamento do material biológico ......................................31
4.1.4. Uropepsina................................................................................................31
4.1.4.1. Coleta e processamento do material biológico ......................................31
4.1.4.2. Etapas de purificação (comuns para gastricsina, pepsina e uropepsina)32
4.1.4.2.1. Cromatografia de troca iônica em DEAE-Bio Gel .............................32
4.1.4.2.2. Cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q HR 5/5................33
4.1.4.2.3 Cromatografia de filtração em gel Coluna Superdex
HR 75 10/30 ....34
4.2. Análises Químicas ...................................................................................................34
4.2.1. Determinação da concentração de proteínas.............................................34
4.2.1.1. Quantificação por determinação da absorbância em 280 nm ................34
4.2.1.2. Dosagem de proteínas pelo método colorimétrico.................................34
4.3. Caracterização físico-química..................................................................................35
viii
4.3.1. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS ..............................35
4.3.2. Coloração dos géis pela prata amoniacal..................................................36
4.3.3. Determinação da massa molecular aparente por eletroforese em gel de
poliacrilamida .................................................................................................................36
4.4. Determinação da atividade enzimática ....................................................................37
4.4.1. Substrato natural .......................................................................................37
4.4.1.1. Determinação da atividade proteolítica sobre hemoglobina bovina......37
4.4.2. Substratos sintéticos..................................................................................38
4.4.2.1. Determinação do pH ótimo....................................................................38
4.4.2.2. Determinação dos pontos de clivagem...................................................39
4.4.2.3. Determinação dos parâmetros cinéticos.................................................39
4.4.2.4. Ensaios de titulação do sítio ativo..........................................................41
5. RESULTADOS ..........................................................................................................42
5.1. Purificação...............................................................................................................42
5.1.1. Catepsina D de baço..................................................................................42
5.1.1.1. Extração .................................................................................................42
5.1.1.2. Cromatografia de afinidade 6-aminoexil Sepharose-Pepstatina A ........42
5.1.1.3. Cromatografia de afinidade Blue-Agarose ............................................43
5.1.1.4. Cromatografia de filtração em gel Superdex HR 75 10/30....................44
5.1.2. Gastricsina de suco gástrico......................................................................45
5.1.2.1. Extração .................................................................................................45
5.1.2.2. Cromatografia de troca iônica – DEAE Bio-Gel ...................................45
5.1.2.3. Cromatografia de troca iônica – Mono Q HR 5/5..................................46
5.1.3. Pepsina de estômago.................................................................................47
5.1.3.1. Extração .................................................................................................47
5.1.3.2. Cromatografia de troca iônica – DEAE Bio-Gel ...................................48
5.1.3.3. Cromatografia de troca iônica – Mono Q HR 5/5..................................49
5.1.3.4. Cromatografia de filtração em gel Superdex HR 75 10/30....................50
5.1.4. Uropepsina................................................................................................51
5.1.4.1. Extração .................................................................................................51
5.1.4.2. Cromatografia de troca iônica – DEAE Bio-Gel ...................................51
5.1.4.3. Cromatografia de troca iônica – Mono Q HR 5/5..................................52
5.2. Caracterização físico-química..................................................................................58
ix
5.2.1. Determinação do grau de pureza e da massa molecular por eletroforese em
gel de poliacrilamida ................................................................................................58
5.3. Determinação da atividade enzimática sobre os substratos sintéticos fluorogênicos
contendo a seqüência da calistatina humana...................................................................60
5.3.1. Determinação do pH ótimo.......................................................................60
5.3.2. Ensaios de titulação do sítio ativo.............................................................60
5.3.3. Determinação da atividade proteolítica.....................................................61
5.3.4. Cinética .....................................................................................................63
6. DISCUSSÃO..............................................................................................................73
7. CONCLUSÕES..........................................................................................................78
8. RESUMO....................................................................................................................79
9. ABSTRACT................................................................................................................80
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................81
11. ANEXOS..................................................................................................................89
11.1. ANEXO 1...................................................................................................89
11.2. ANEXO 2...................................................................................................90
11.3. ANEXO 3...................................................................................................91
11.4 ANEXO 4....................................................................................................94
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Gráfico da cromatografia de afinidade 6-aminoexil Sepharose-Pepstatina
A (Sigma)........................................................................................................................43
Figura 2. Gráfico da cromatografia de afinidade Blue-Agarose (Bio-Rad) ...................44
Figura 3. Gráfico da cromatografia de filtração em gel Superdex HR 75 10/30 (Sistema
FPLC, Pharmacia)........................................................................................................45
Figura 4. Gráfico da cromatografia de troca iônica em resina DEAE Bio Gel (Bio-
Rad) ............................................................................................................................46
Figura 5. Gráfico da cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q HR 5/5 (Sistema
FPLC, Pharmacia)........................................................................................................47
Figura 6. Gráfico da cromatografia de troca iônica em resina DEAE Bio Gel (Bio-
Rad) .............................................................................................................................48
Figura 7. Gráfico da cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q HR 5/5 (Sistema
FPLC, Pharmacia)........................................................................................................49
Figura 8. Gráfico da cromatografia de filtração em gel Superdex HR 75 10/30 (Sistema
FPLC, Pharmacia)........................................................................................................50
Figura 9. Gráfico da cromatografia de troca iônica em resina DEAE Bio Gel (Bio-
Rad) .............................................................................................................................52
Figura 10. Gráfico da cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q HR 5/5 (Sistema
FPLC, Pharmacia)........................................................................................................53
Figura 11. Eletroforeses em gel de poliacrilamida contendo SDS .................................58
Figura 12. Curva de calibração do padrão de massas moleculares e determinação da massa
molecular aparente das enzimas .....................................................................................59
Figura 13. Análise dos fragmentos resultantes da clivagem do substrato Abz-Ala-Ile-Ala-
Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp pela pepsina por cromatografia de fase reversa em HPLC 61
Figura 14. Análise de aminoácidos dos produtos de clivagem do substrato
Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp pela pepsina utilizando cromatografia de
fase reversa em HPLC ....................................................................................................61
Figura 15. Análise da inibição pela Pepstatina A da uropepsina com o substrato Abz-Ala-
Ile-Lys-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp por cromatografia de fase reversa em HPLC.....61
Figura 16. Hidrólise pela catepsina D dos substratos Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp ........................................65
xi
Figura 17. Hidrólise pela catepsina D dos substratos Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp.........................................66
Figura 18. Hidrólise pela gastricsina dos substratos Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp ........................................67
Figura 19. Hidrólise pela gastricsina dos substratos Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp.........................................68
Figura 20. Hidrólise pela pepsina dos substratos Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-
Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp................................................69
Figura 21. Hidrólise pela pepsina dos substratos Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-
Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp ................................................70
Figura 22. Hidrólise pela uropepsina dos substratos Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp ........................................71
Figura 23. Hidrólise pela uropepsina dos substratos Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp.........................................72
xii
ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1. Locais de clivagem da calistatina humana pela catepsina D humana e pela
calicreína humana...........................................................................................................74
xiii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Tabela de purificação da catepsina D humana................................................54
Tabela 2. Tabela de purificação da gastricsina humana .................................................55
Tabela 3. Tabela de purificação da pepsina humana ......................................................56
Tabela 4. Tabela de purificação da uropepsina humana.................................................57
Tabela 5. Titulação dos sítios ativos enzimáticos com o inibidor pepstatina A.............60
Tabela 6. Parâmetros cinéticos para hidrólise de substratos sintéticos com a seqüência do
centro reativo da calistatina humana pelas peptidases aspárticas humanas....................64
xiv
LISTA DE ABREVIAÇÕES
∆F....................................................................................................Variação de fluorescência
°C....................................................................................................................Grau centígrado
µm.........................................................................................................................Micrômetro
µg..........................................................................................................................Micrograma
µL.............................................................................................................................Microlitro
µM............................................................................................................................Micromol
Abz...............................................................................................................Ácido o-benzóico
AHMHA.................................................................Ácido 4-amino-3-OH-6-metil-heptanóico
Ala................................................................................................................................Alanina
Arg..............................................................................................................................Arginina
BK..........................................................................................................................Bradicinina
cDNA......................................................................Ácido desoxiribonucleico complementar
cm...........................................................................................................................Centímetro
Da..................................................................................................................................Dalton
DEAE...............................................................................................................Dietilaminoetil
Eddnp............................................................................................Etilenodiaminodinitrofenol
g………………....……………………………………………………………………Gramas
Gln...........................................................................................................................Glutamina
h........................................................................................................................................Hora
HPLC....................................................................Cromatografia líquida de alta performance
Ile.............................................................................................................................Isoleucina
k
cat
..................Velocidade máxima de catálise quando a enzima está saturada pelo substrato
K
m
.......................................................................................................Constante de Michaelis
L........................................................................................................................................Litro
LBK...............................................................................................................Lisil-bradicinina
Leu...............................................................................................................................Leucina
Lys..................................................................................................................................Lisina
M.....................................................................................................................................Molar
mg............................................................................................................................Miligrama
mL...............................................................................................................................Mililitro
MLBK..............................................................................................Metionil-lisil-bradicinina
xv
mm............................................................................................................................Milímetro
mRNA....................................................................................Ácido ribonucléico mensageiro
N...................................................................................................................................Normal
ng...........................................................................................................................Nanograma
nm.........................................................................................................................Nanômetros
PG.....................................................................................................................Prostaglandina
PGA.................................................................................................................Pepsinogênio A
PGC.................................................................................................................Pepsinogênio C
pH.....................................................................................................Potencial hidrogeniônico
Phe........................................................................................................................Fenilalanina
PMSF...................................................................................Fluoreto de fenilmetilsulfonil
PSA...................................................................................................Persulfato de amônio
q.s.p................................................................................................Quantidade suficiente para
Rf...................................................................................................................Relativo à frente
RNA...........................................................................................................Ácido ribonucleico
S.................................................................................................................................Substrato
SDS....................................................................................................Dodecil sulfato de sódio
Ser..................................................................................................................................Serina
TEMED..................................................................................N-N-N-N tetrametilenodiamina
UV........................................................................................................................Ultra-violeta
V......................................................................................................................................Volts
Val..................................................................................................................................Valina
V
máx
..........................................................................................................Velocidade máxima
λ
Ex
....................................................................................Comprimento de onda de excitação
λ
Em
......................................................................................Comprimento de onda de emissão
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Peptidases Aspárticas
O Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia
Molecular (NC-IUBMB) recomenda o termo peptidase como um termo geral para todas as
enzimas que hidrolizam ligações peptídicas. A maioria das peptidases são exopeptidases,
que clivam aminoácidos terminais das cadeias polipeptídicas, ou endopeptidases que
clivam internamente. As endopeptidases são classificadas de acordo com seu mecanismo
catalítico em endopeptidases aspárticas, cisteíno endopeptidases, endopepidases
glutâmicas, metaloendopeptidases, serino endopeptidases, treonino endopeptidases,
endopeptidases mistas e endopeptidases de tipo catalítico desconhecidas (BARRETT,
RAWLINGS e WOESSNER, 2004; MEROPS [merops.sanger.ac.uk]).
A família das peptidases aspárticas A1 inclui a maioria das endopeptidases
aspárticas encontradas no organismo humano e é composta de enzimas mecânica e
estruturalmente relacionadas encontradas em uma grande variedade de espécies
(BARRETT, RAWLINGS e WOESSNER, 2004). Fazem parte desta família as peptidases
aspárticas gástricas (pepsina, gastricsina e quimosina) (TANG et al 1959, MILLS e TANG
1967), lisossomais (catepsina D), renais (renina), fúngicas (penicilopepsina) (TANG e
WONG, 1987), retrovirais (KAY e DUNN, 1990), entre outras. Quase todas as enzimas
desta família atuam em pH ácido (TANG e WONG, 1987) e são inibidas pelo inibidor
específico pepstatina A, um inibidor competitivo, que se liga fortemente aos resíduos do
sítio ativo da enzima (MARCINISZYN et al, 1976). Além disso, essas enzimas também
clivam preferencialmente ligações peptídicas localizadas entre dois resíduos de
aminoácidos hidrofóbicos (POWERS, HARLEY e MYERS, 1977) e apresentam,
17
caracteristicamente, um centro ativo altamente conservado, o qual possui dois resíduos de
ácido aspártico participando do mecanismo catalítico (PEARL e BLUNDELL, 1984;
COOPER et al, 1990; revisto por DUNN 2002).
As peptidases aspárticas humanas têm sido de grande interesse para as pesquisas
médicas e farmacêuticas pela sua ocorrência em muitos tecidos, fluidos biológicos e seu
papel em várias doenças. Alguns exemplos são a hipertensão (SCHALES 1942), a
maturação do vírus da imunodeficiência humana (KAY e DUNN, 1990), associação com
algumas doenças degenerativas, como a doença de Alzheimer (MORI et al, 1992), na
formação de úlceras gástricas (TANAKA et al, 1991), em neoplasias (CAPONY et al,
1989; SPYRATOS et al, 1989; THORPE et al, 1989; TANDON et al, 1990), concluindo
que inibidores para estas enzimas são muito investigados por serem potenciais agentes
terapêuticos (revisto por COOPER 2002).
Estudos cristalográficos dessa classe enzimática mostram três regiões
estruturalmente distintas: um domínio N-terminal, um domínio C-terminal, os quais são
ligados através de um interdomínio de folhas β que consiste de seis vertentes antiparalelas
formadas por ambos os domínios C e N terminais. Cada domínio contribui com um resíduo
de acido aspártico que constituem o sítio ativo, o que faz com que as enzimas desta classe
tenham um sítio ativo bem definido (KAY, 1985; ANDREEVA, BOCHKAREV e
PECHIK, 1995; CANDURI et al, 2001). Análises de resolução atômica do sítio catalítico
de peptidase aspártica sugerem que o sítio catalítico seja carregado negativamente, ou seja,
os resíduos de ácido aspártico se encontram ionizados e evidenciam a possível ligação de
um dipeptídeo à enzima. Isto é consistente com a descrição de que as peptidases aspárticas
podem ser inibidas por peptídeos pequenos (ERSKINE et al, 2003).
As similaridades estruturais a as homologias de sequências das peptidases
aspárticas parecem indicar que os membros desta família são tridimensionalmente
18
semelhantes e têm um mecanismo catalítico comum para a hidrólise dos substratos.
Entretanto estas enzimas apresentam algumas peculiaridades em relação a sua localização
celular e subcelular, a seu mecanismo de ativação, a seu pH ótimo e a sua estabilidade.
Pepsina, gastricsina e renina são enzimas secretórias, enquanto a catepsina D está
localizada nos lisossomos e a catepsina E tem localização endossomal (YAMAMOTO
1995; DUNN et al, 1986).
As peptidases aspárticas têm ação reconhecida na liberação de peptídeos com
atividade biológica. HIAL, KEISER e PISANO (1976a) e HIAL, KEISER e PISANO
(1976b) demonstraram que a uropepsina humana clivava a molécula do cininogênio
liberando metionil-lisil-bradicinina (MLBK) quando a urina era coletada pH ácido. Os
autores mostraram também que a adição do inibidor Pepstatina A a urina coletada causava
diminuição dramática nos níveis do peptídeo MLBK. GUIMARÃES et al (1976), por sua
vez, demonstraram que e a incubação da pepsina porcina com o cininogênio humano levou
a liberação de um peptídeo cuja análise de aminoácidos sugeria ser a MLBK. A liberação
de peptídeos ativos do tipo cininas pelas peptidases aspárticas foi posteriormente estudada
por GOMES et al (1996), que demonstraram que a pepsina gástrica humana atuando sobre
seqüências sintéticas baseadas na estrutura do cininogênio liberava MLBK-serina, a qual
possui ação biológica semelhante às outras cininas. Este peptídeo é também liberado a
partir da ação da uropepsina humana sobre os mesmos substratos, segundo demonstrado
por TEODORO et al, 1999. GOMES et al (1997) purificaram outra enzima da família das
peptidases aspárticas a partir da córtex renal humana, a qual também atuava sobre o
cininogênio e sobre seqüências sintéticas baseadas na estrutura do cininogênio, liberando
MLBK.
19
1.1.1. Catepsina D
A atividade proteolítica em extratos de tecidos em presença de pH ácido foi descrita
por HEDIN em 1904 e após isso o termo catepsina, da palavra grega digestão, foi
introduzido para definir as enzimas que tinham esta atividade (WILSTÄTTER e
BAMANN, 1928 apud MINAROWSKA et al, 2008). Dentre as catepsinas, a catepsina D é
uma endopeptidase de localização intracelular, lisossomal e endossomal com ampla
distribuição em todos os tecidos dos mamíferos (TALLAN, JONES e FRUTON, 1952; DE
DUVE et al, 1955; PRESS, PORTER e CEBRA, 1960). Entretanto esta enzima tem sido
detectada no meio extracelular em várias condições patológicas (POOLE et al, 1976;
CAPONY et al, 1989).
A principal função descrita da catepsina D é o catabolismo proteico no interior dos
lisossomos (DEAN, 1975). Outros efeitos fisiológicos incluem o processamento de
hormônios, de antígenos, de neuropeptídeos (revisto por FUSEK e VETVICKA, 2005), e
ainda sua participação na morte celular programada (BRIOZZO et al, 1988; revisto por
BENES, VETVICKA e FUSEK, 2008) e na remodelação tecidual (WOESSNER e
SHAMBERGER, 1971; IOACHIM 2008). As pesquisas a respeito dessa enzima
mostraram sua importância como um biomarcador específico de algumas doenças (revisto
por FUSEK e VETVICKA`, 2005).
Assim como outras peptidases, a catepsina D humana é sintetizada como pré-pro-
enzima que após subseqüentes processamentos proteolíticos se torna enzima ativa. A
primeira clivagem remove o peptídeo sinal e produz a pro-catepsina D ainda no retículo
endoplasmático rugoso. A pro-enzima é processada no compartimento entre o retículo
endoplasmático e complexo de Golgi, onde uma N-acetilglucosamina fosfotransferase
reconhece proteínas solúveis destinadas aos lisossomos e fosforila resíduos de manose. Os
20
resíduos fosforilados são reconhecidos pelos receptores de manose 6-fosfato, os quais
direcionam as enzimas da via secretória para a via endocítica. A catepsina D também pode
migrar para os lisossomos através de um mecanismo independente dos receptores de
manose 6-fosfato em certas linhagens celulares (RIJNBOUTT et al, 1991). No lisossomo, a
pro-enzima é processada com a remoção de 44 resíduos de aminoácidos da extremidade N-
terminal, liberando a enzima ativa constituída por uma única cadeia de massa molecular
relativa de 44 kDa. A cadeia da catepsina D pode ser clivada em cadeia leve (15 kDa) e
cadeia pesada (30 kDa) (YONEZAWA et al, 1988; FUJITA et al, 1991). A clivagem
ocorre numa região de processamento que aparece como uma inserção na sequência do
gene da catepsina D e é removida durante a maturação da enzima, modelo que tem sido
proposto para região de processamento da enzima humana (YONEZAWA et al, 1988;
revisto por FUSEK e VETVICKA, 2005; ZAIDI et al, 2008).
O mecanismo comum catalítico, sua ótima ação catalítica em pH baixo e o alto
nível de similaridade das estruturas primária e terciária são as razões pelas quais a
catepsina D pertence à família A1 das peptidases aspárticas (revisto por FUSEK e
VETVICKA, 2005). Porém através de estudos estruturais e cinéticos foi observado que o
sítio ativo da catepsina D humana é maior e mais hidrofóbico quando comparado com
outras peptidases aspárticas. Mudanças no subsítio S
2
(Met
287
para Glu ou Gln) levaram a
catepsina D a hidrolisar eficientemente substratos contendo Arg ou Lys na posição P
2
,
indicando que S
2
é um subsítio crítico para o controle da especificidade enzimática
(SCARBOROUGH e DUNN 1994).
21
1.1.2. Pepsinas
O suco gástrico de vertebrados contém peptidases aspárticas que são responsáveis
pela ampla digestão de proteínas da dieta, as quais são classificadas em quatro grupos,
baseados em propriedades enzimáticas e imunoquímicas: pepsina A, pepsina B, pepsina C
ou gastricsina, e quimosina. Pepsina A, pepsina B e gastricsina são encontradas no suco
gástrico de adultos vertebrados, enquanto a quimosina é encontrada exclusivamente em
neonatos (revisto por RICHTER, TANAKA e YADA 1998).
Os zimogênios da pepsina, os pepsinogênios, são estáveis em pH neutro, mas são
convertidos para a forma ativa em pH abaixo de 5,0. Esta ativação, provavelmente ocorre
devido a interações entre resíduos básicos no pró-segmento, presente na forma inativa, e
resíduos ácidos localizados no centro ativo da própria enzima. Depois da ingestão do
alimento, os zimogênios são liberados no suco gástrico e sofrem conversão para sua forma
ativa. Em pH abaixo de 5,0, os resíduos de ácido aspártico no centro ativo se tornam
protonados, o que rompe as interações eletrostáticas entre o pró-segmento e o restante da
enzima, liberando o pró-segmento (revisto por RICHTER, TANAKA e YADA 1998). A
dependência de pH e as constantes cinéticas da ativação intramolecular são similares às
propriedades cinéticas da hidrólise péptica e, portanto postula-se que a ativação
intramolecular ocorre no mesmo sítio ativo onde são processados os substratos (AL-
JANABI et al, 1972).
Segundo revisto por COOPER EM 2002, as úlceras pépticas são agravadas pela
exposição ao ácido secretado e à pepsina. Por isso, há um potencial significativo para
inibidores da pepsina que poderiam ser utilizados como antiácidos no tratamento de úlceras
pépticas.
22
1.1.3. Uropepsina
Uma peptidase aspártica capaz de liberar metionil-lisil-bradicinina-serina (MLBK-
Ser), denominada uropepsina, foi isolada a partir da urina humana (TEODORO, 1999), e
caracterizada do ponto de vista físico-químico e estrutural através de análise
cristalográfica. Esta enzima apresentou identidade estrutural de 99% com a pepsina
gástrica humana, com apenas uma modificação na posição 291, na qual um resíduo de
leucina é substituído por um de valina (AZEVEDO Jr et al, 2001; CANDURI et al, 2001;
CANDURI et al, 1998; PDB id: 1flh, depositada em 14/08/2000).
Os zimogênios da pepsina, os pepsinogênios, são proteínas de baixa massa
molecular e existem sob duas formas: o pepsinogênio A (PGA) e o pepsinogênio C (PGC),
moléculas com 52% de homologia de seqüência proteica e negativamente carregadas em
pH fisiológico. O PGA está presente em grandes quantidades na urina de indivíduos
saudáveis enquanto o PGC está quase ausente (TEN KATE et al 1989). Segundo TEN
KATE et al (1989), o pepsinogênio é livremente filtrado pela membrana basal glomerular,
e a secreção tubular desta proteína não contribui para sua presença na urina. A alta
concentração do PGA na urina se deve a sua baixa afinidade pelos fosfolipídeos da
membrana da célula tubular conseqüente ao menor conteúdo de aminoácidos carregados
positivamente presentes nesta isoforma. Isto leva a uma baixa taxa de reabsorção tubular, o
que torna seu clearance elevado (TEN KATE et al, 1988; TEN DAM et al, 1991).
NAKAHAMA et al (1995) mostraram que em indivíduos com insuficiência renal
aumentam os níveis de pepsinogênio urinário com a progressão da disfunção renal. Apesar
do reconhecimento da presença do pepsinogênio na urina humana, não se sabe se este
pepsinogênio está sendo filtrado a partir do plasma ou se tem origem em células
localizadas no rim, ainda é motivo para futuros estudos.
23
1.2. Serpinas
As serpinas (ser
ine proteinase inhibitors) são uma superfamília de inibidores de
serino-peptidases presentes no plasma. Sabe-se que as serino-peptidases estão envolvidas
na fagocitose, na coagulação, na ativação do complemento, na fibrinólise e na liberação de
peptídeos ativos. Portanto, para muitos, a primeira função das serpinas é a regulação de
eventos proteolíticos associados com uma variedade de vias bioquímicas, sendo assim, um
requerimento crítico na manutenção da homeostase (POTEMPA, KORZUS e TRAVIS,
1994; CHAO, CHAI e CHAO, 1996).
1.2.1. Calistatina
A calistatina é um inibidor de serino-peptidase (serpina), sintetizada principalmente
no fígado e rapidamente secretada na circulação. É uma glicoproteína ácida que foi
purificada do plasma humano e tem uma massa molecular em torno de 58 kDa. O
mecanismo de interação da calistatina com a calicreína envolve uma reação inicial
reversível, seguida da formação de uma ligação covalente entre a enzima e o inibidor.
Posteriormente ocorre clivagem da calistatina entre os resíduos P
1
-P
1
’ (Phe
388
-Ser
389
),
sendo que um dos fragmentos resultantes permanece ligado ao sítio ativo da enzima,
atuando como um pseudo-substrato, ocupando o local do centro ativo onde ocorreria
ligação com substratos (CHAO et al, 1996; CHAO, CHAI e CHAO, 1996). A alta
seletividade da calistatina pela calicreína tissular é atribuída ao par Phe
387
-Phe
388
nos
resíduos P
2
-P
1
do centro reativo. A seqüência de aminoácidos da calistatina humana tem
uma identidade de 44-46% com outras serpinas como a α1-antiquimotripsina, α1-
antitripsina e o inibidor da proteína C (CHEN et al, 2000).
24
A expressão da calistatina já foi mostrada em diferentes órgãos, incluindo rim,
aorta, fígado, pâncreas, estômago, cólon, testículos e próstata. Esta localização é
concomitante com a calicreína tissular e o cininogênio (CHAO et al, 1996; CHEN et al,
1995). WOLF et al (1998) demonstraram a presença de mRNA para calistatina em
pâncreas e glândulas salivares humanas e nestes mesmos sítios foi detectado mRNA para
calicreína tissular, o que sugere regulação local de atividade pela calistatina (WOLF et al,
1999). Além de inibir a calicreína tissular outra função da calistatina é causar uma potente
vasodilatação. Decréscimos na calistatina podem resultar na redução da capacidade de
vasodilatação renal e causar ou agravar a hipertensão (CHAO et al, 1997). Estudos
utilizando análise proteômica de animais submetidos à hipóxia mostraram que há
diminuição na expressão da calistatina no rim e desenvolvimento de hipertensão arterial,
sugerindo que há diminuição no efeito vasodilatador direto da calistatina durante a hipóxia
(THONGBOONKERD et al, 2002). Outras ações diretas da calistatina são a estimulação
da formação da neoíntima e a inibição da angiogênese e do crescimento tumoral (CHAO e
CHAO, 2004; MIAO et al, 2002, 2003).
Substratos sintéticos com supressão intramolecular de fluorescência, contendo a
seqüência dos aminoácidos do sítio reativo da calistatina, ....Thr-Phe-Ala-Lys
386
-Phe
387
-
Phe
388
-Ser
389
-Ala
390
-Gln-Thr-Asn-Arg-His...., foram clivados na ligação P
1
-P
1
’ (Phe-Phe)
no seu sítio reativo pela peptidase aspártica catepsina D e os melhores substratos foram
aqueles que apresentaram modificações na posição P
2
(PIMENTA et al 2001). PIMENTA
et al (2000, 2001) demonstraram que a clivagem da calistatina pela catepsina D, resulta em
pequenos fragmentos, sendo que a clivagem ocorreu próximo ao centro reativo da
calistatina, sendo que a ligação Phe-Phe foi a primeira a ser clivada. Além do mais a
enzima também foi capaz de clivar entre os aminoácidos Phe-Ser presentes no centro
reativo, nos primeiros 15 minutos de digestão. Dessa forma, a acidificação do meio
25
extracelular por células tumorais (GRIFFITHS, 1991; SILVER, MURRILLS e
ETHERINGTON, 1988; MONTCOURRIER et al, 1997), por exemplo, poderia resultar na
ativação da catepsina D e degradação da calistatina, o que aumentaria a liberação de
cininas e melhoraria o suprimento sanguíneo, o que é um evento essencial na progressão
do tumor (WU, AKAIKE e MAEDA, 1994; INAMURA e BLACK, 1994).
Visto a importância das peptidases aspárticas em vários processos fisiológicos e
patológicos e a importância da posição P
2
nos substratos, neste trabalho nós utilizamos
como substratos seqüências de aminoácidos em torno do sítio reativo da calistatina, Abz-
Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, e substratos com uma modificação na posição
P
2
Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp (Lys→Ala), Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp (Lys→Leu) e Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
(Lys→Ser), com objetivo de caracterizar a ação da catepsina D, gastricsina, pepsina e
uropepsina humanas sobre a calistatina e seus derivados.
26
2. JUSTIFICATIVA
As peptidases aspárticas são enzimas proteolíticas que atuam sobre seqüências
polipeptídicas, clivando ligações entre aminoácidos hidrofóbicos. A calistatina humana é
um inibidor natural da calicreína tissular que possui na região de seu centro reativo, ligação
peptídica com esta característica (....Phe
387
-Phe
388
...). Já foi demonstrado em trabalhos
prévios realizados em nosso laboratório que a uropepsina, tem a capacidade de clivar a
ligação peptídica no centro reativo da calistatina, o que foi verificado através da utilização
de substratos sintéticos com a seqüência deste inibidor. Dada a importância da regulação
de processos fisiológicos e fisiopatológicos relacionados às ações da calicreína tissular e
das aspartil peptidases, propomos um estudo para avaliar o papel de alterações na posição
P
2
de análogos da calistatina. Portanto, neste estudo pretendemos utilizar alguns substratos
sintéticos contendo modificações nesta região da molécula da calistatina, com a finalidade
de ampliar o estudo a respeito da ação de enzimas da classe das peptidases aspárticas sobre
esses substratos, utilizando como modelo a catepsina D, a pepsina, a gastricsina e a
uropepsina.
27
3. OBJETIVOS
1. Purificar até a homogeneidade a catepsina D de baço, a pepsina de estômago, a
gastricsina do suco gástrico e a uropepsina humanas;
2. Caracterizar as ações das enzimas sobre substratos sintéticos contendo seqüência
interna da calistatina, identificando seu ponto de clivagem;
3. Determinar os parâmetros cinéticos utilizando os substratos sintéticos (K
m
, k
cat
e
k
cat
/K
m
) e analisar comparativamente os parâmetros entre as diferentes enzimas.
28
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Purificação
As enzimas foram purificadas a partir de baço humano (catepsina D), suco gástrico
humano (gastricsina), estômago humano (pepsina) e urina humana (uropepsina), utilizando
protocolos empregados em nosso laboratório (GOMES et al, 1996; 1997), após aprovações
do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal do Triângulo Mineiro
(UFTM) (Anexo 1).
4.1.1. Catepsina D
4.1.1.1. Coleta e processamento do material biológico
A enzima foi isolada a partir de um baço obtido junto ao Serviço de Verificação de
Óbitos do Hospital de Clínicas da UFTM. Inicialmente a cápsula foi retirada por raspagem
manual e o parênquima (334g) foi fragmentado e triturado em liquidificador com tampão
de extração Glicina-HCl 0,01 M (Synth), pH 3,5; contendo fluoreto de fenilmetilsulfonil
(PMSF) 0,8 mM (Sigma); tetrationato de sódio 4,5 mM (Sigma); metoxietanol 300 mL
(Reagen); ácido etilenodiamino tetra-acético dissódico (Na
2
EDTA) 10 mM (Berzog) e
azida de sódio 3 µM (Merck), em um volume de aproximadamente 5 vezes o volume do
baço triturado. A mistura foi deixada sob agitação constante em câmara fria por 24 horas e
o pH foi acertado para 3,5 com HCl 6 N (Merck). Logo após foi centrifugado a 27.216 x g
a 6
o
C em centrífuga Eppendorf (modelo K 80), por 30 minutos e o sobrenadante foi
filtrado em gaze. Um total de 830 mL de sobrenadante filtrado contendo 1,84 g/mL de
proteínas foi utilizado na etapa seguinte de purificação.
29
4.1.1.2. Cromatografia de afinidade 6-aminoexil Sepharose-Pepstatina A (Sigma)
O sobrenadante (extrato bruto 830 mL) foi aplicado em uma coluna de vidro
medindo 20 x 2,5 cm preenchida com 75 mL da resina Sepharose-Pepstatina A hidratada.
Em seguida foi aplicado tampão de eluição Glicina-HCl 0,01 M (Synth), pH 3,5, contendo
NaCl p.a. 1M (Nuclear); PMSF 0,2
µM (Sigma); tetrationato de sódio 0,6 µM (Sigma);
Na
2
EDTA 1,3 µM (Berzog) e azida de sódio 3 µM (Merck). Frações de aproximadamente
10 mL foram coletadas em coletor automático de frações (marca Advantec, modelo SF
2120) até que a concentração de proteínas de cada fração, determinada em 280 nm em
espectrofotômetro Micronal (modelo B582), fosse menor que 0,05. Em seguida foi feita a
eluição do material ligado a resina com tampão Tris 0,1 M (Nuclear), pH 8,5, contendo
NaCl p.a. (Nuclear) 0,5 M.
Frações de aproximadamente 6 mL foram coletadas em coletor automático
(Advantec, modelo SF 2120). O teor de proteínas foi determinado em 280 nm em
espectrofotômetro Micronal (modelo B582). A determinação da atividade proteolítica foi
determinada utilizando solução de hemoglobina bovina (ANSON & MIRSKY, 1932)
detalhada no Anexo 2.
As alíquotas com atividade proteolítica foram reunidas e dialisadas contra tampão
fosfato de sódio (Merck) 0,1 M, pH 7,0, contendo azida de sódio 3 µM (Merck),
empregando sistema de ultrafiltração Amicon
®
(modelo 8400), e membrana YM10
(Diaflo
®
) e o volume foi concentrado até 20 mL.
4.1.1.3. Cromatografia de afinidade Blue-Agarose (Bio Rad)
Nesta etapa foi utilizada uma coluna de vidro (50 x 1,0 cm), preenchida com 125
mL de resina Blue-Agarose hidratada, equilibrada com 1 litro de tampão fosfato de sódio
(Merck) 0,1 M, pH 7,0, contendo azida de sódio 3
µM (Merck). Alíquotas de 2 mL do
30
material proveniente da etapa anterior foram depositadas no topo da resina, e em seguida
foi aplicado tampão fosfato de sódio (Merck) 0,1 M, pH 7,0, contendo azida de sódio 3
µM
(Merck). Frações de aproximadamente 2 mL foram coletadas em coletor automático
(marca Advantec, modelo SF 2120) e teor de proteínas foi determinada em 280 nm em
espectrofotômetro (Micronal, modelo B582). A determinação da atividade proteolítica foi
feita utilizando solução de hemoglobina bovina (ANSON & MIRSKY, 1932).
As alíquotas que apresentaram maior atividade proteolítica sobre hemoglobina
bovina foram reunidas e dialisadas contra tampão fosfato de sódio (Merck) 0,1 M, pH 7,0,
contendo NaCl p.a. (Nuclear) 0,5 M, empregando sistema de ultrafiltração Amicon
®
(modelo 8400), e membrana YM10 (Diaflo
®
) e concentradas para um volume final de 5
mL.
4.1.1.4. Cromatografia de filtração em gel Superdex
TM
HR 75 10/30 (Sistema FPLC,
Pharmacia
)
As frações com atividade proteolítica obtidas na etapa cromatográfica anterior
foram submetidas à cromatografia de filtração em gel utilizando coluna Superdex
TM
75
10/30 em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) Pharmacia
®
. O volume de
amostra aplicado em cada cromatografia foi 0,5 mL eluída com tampão fosfato de sódio
0,1 M, pH 7,0, contendo NaCl p.a. (Nuclear) 0,5 M, com fluxo de 1,0 ml por minuto.
A cada etapa de cromatografia foram feitas eletroforeses em gel de poliacrilamida
contendo duodecil sulfato de sódio (SDS) das frações que apresentaram maior atividade na
enzimática com hemoglobina bovina.
31
4.1.2. Gastricsina
4.1.2.1. Coleta e processamento do material biológico
A enzima foi obtida a partir de suco gástrico obtido junto ao Serviço de Endoscopia
do Hospital de Clínicas da UFTM. Este suco gástrico foi centrifugado a 27.216 x g a 6
o
C
em centrífuga Eppendorf (modelo K 80), por 10 minutos para retirada do muco, o
sobrenadante filtrado em gaze, totalizando um volume de 50 mL com 0,86 mg/mL de
proteína, que foi submetido às etapas de purificação.
4.1.3. Pepsina
4.1.3.1. Coleta e processamento do material biológico
A enzima foi obtida a partir de um estômago humano obtido junto ao Serviço de
Verificação de Óbitos do Hospital de Clínicas da UFTM. A mucosa gástrica foi raspada e
triturada em presença de tampão de extração Glicina-HCl 0,01 M (Synth), pH 3,5;
contendo PMSF 0,8 mM (Sigma); tetrationato de sódio 4,5 mM (Sigma); Na
2
EDTA 10
mM (Berzog) e azida de sódio 3 µM (Merck). Em seguida o pH foi reduzido para 1,5, com
HCl 6 N (Merck), para ativação do pepsinogênio. O extrato foi centrifugado a 86.016 x g a
5
o
C em centrífuga Eppendorf (modelo K 80) por 30 minutos. O sobrenadante foi filtrado
em gaze dobrada, o pH elevado de 1,5 para 4,9 com NaOH p.a. (Nuclear) 1 M e submetido
às etapas cromatográficas.
4.1.4. Uropepsina
4.1.4.1. Coleta e processamento do material biológico
A urina de indivíduos do sexo masculino com idade variando entre 18 a 50 anos foi
coletada nas dependências do Laboratório de Bioquímica (Departamento de Ciências
Biológicas desta instituição) em frasco Erlenmeyer com capacidade para 5 L contendo 10
32
mL de HCl (Merck) 6,0 N. o material coletado foi mantido em câmara fria até que o
volume de urina fosse suficiente para o início de uma purificação. A cada cinco litros de
urina coletada foi feita diálise contra água e o volume concentrado para 150 mL em
sistema de ultrafiltração Amicon
®
(modelo 8400) com capacidade para 300 mL, utilizando
membranas YM10 (Diaflo
®
). Após a concentração a urina foi dialisada contra tampão
acetato de sódio p.a. (Merck) 0,01 M pH 4,9 e todo o material foi novamente concentrado
para um volume final de 50 mL, o qual apresentou 0,42 g/mL de proteínas.
4.1.4.2. Etapas de purificação (comuns para gastricsina, pepsina e uropepsina)
4.1.4.2.1. Cromatografia de troca iônica em DEAE-Bio Gel (Bio Rad)
Nesta etapa foi utilizada uma coluna de vidro (50 x 2,5 cm), preenchida com 80 mL
de resina DEAE-Bio Gel hidratada. A amostra concentrada de cada enzima foi depositada
lentamente no topo da resina, e em seguida foi aplicado tampão acetato de sódio p.a.
0,01 M pH 4,9. As frações de aproximadamente 10 mL foram coletadas em coletor
automático de frações (Advantec, modelo SF 2120) e o teor de proteínas determinado em
280 nm em espectrofotômetro Micronal (modelo B582).
Em seguida foi feito o gradiente de NaCl, empregando-se 250 mL de tampão
acetato de sódio p.a. 0,01 M, pH 4,9, contendo NaCl p.a. 0,1 M (tampão A) e 250 mL de
tampão acetato de sódio p.a. 0,01 M, pH 4,9, contendo NaCl p.a. 0,8 M (tampão B), os
quais foram misturados gradativamente sob agitação constante, utilizando copo formador
de gradiente (Bio Rad Gradiente Former modelo 395). O gradiente variou de 0,1 M a 0,8
M do tampão B. Nesta segunda fase foram coletadas frações de aproximadamente 6 mL
em coletor automático de frações (Advantec, modelo SF 2120). O teor de proteínas das
frações coletadas foi determinado em 280 nm em espectrofotômetro Micronal (modelo
33
B582). A determinação da atividade proteolítica foi feita utilizando solução de
hemoglobina bovina (ANSON & MIRSKY, 1932).
As alíquotas com maior atividade proteolítica foram reunidas e dialisadas contra
tampão fosfato de sódio p.a. (Merck) 0,05 M, pH 6,0, empregando sistema de ultrafiltração
Amicon
®
(modelo 8400), e membrana YM10 (Diaflo
®
), até um volume aproximado de 20
mL.
4.1.4.2.2. Cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q HR 5/5 (Sistema FPLC,
Pharmacia
)
O material dialisado e concentrado obtido na etapa anterior foi submetido à
cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q HR 5/5, utilizando sistema FPLC (Fast
Protein Liquid Chromatography) Pharmacia
®
. Foram aplicados 2,0 mL da amostra em cada
cromatografia. Para o gradiente de concentração salina foram utilizados tampões fosfato de
sódio p.a. (Merck) 0,05 M pH 6,0 (tampão A) e fosfato de sódio p.a. (Merck) 0,05 M pH
6,0, contendo NaCl p.a. (Nuclear) 1,0 M (tampão B), com fluxo de 0,5 mL por minuto.
Foram coletadas 108 frações de 0,25 mL em cada cromatografia resultando em um volume
total de 8 mL por fração, em coletor de frações Pharmacia
®
(modelo LKB FRAC-200). O
teor de proteínas foi determinado em 280 nm em espectrofotômetro Micronal (modelo
B582) e a determinação da atividade proteolítica foi feita utilizando solução de
hemoglobina bovina (ANSON & MIRSKY, 1932).
As alíquotas com maior atividade proteolítica foram reunidas e dialisadas com
tampão fosfato de sódio p.a. 0,05 M, pH 6,0, NaCl p.a. (Merck) 0,5 M, empregando
sistema de ultrafiltração Amicon
®
(modelo 8400), e membrana YM10 (Diaflo
®
), até um
volume aproximado de 10 mL.
34
4.1.4.2.3. Cromatografia de filtração em gel em Coluna Superdex
TM
HR 75 10/30
(Sistema FPLC, Pharmacia
) – utilizada somente para a pepsina
As frações dialisadas e concentradas na etapa cromatográfica anterior foram
submetidas à cromatografia de filtração em gel utilizando-se coluna Superdex
TM
75 10/30
utilizando sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) Pharmacia
®
. O volume de
amostra aplicado em cada cromatografia foi 0,5 ml e a eluição foi feita com tampão fosfato
de sódio p.a. 0,05 M, pH 6,0, contendo NaCl p.a. (Nuclear) 0,5 M, com fluxo de 1,0 ml por
minuto.
A cada etapa de cromatografia foram feitas eletroforeses em poliacrilamida
contendo SDS das frações que apresentaram maior atividade enzimática.
Os tampões utilizados em todas as cromatografias foram filtrados a vácuo em
membrana de nitrato de celulose de porosidade 0,2 µm (Sartorius).
4.2. Análises Químicas
4.2.1. Determinação da concentração de proteínas
4.2.1.1. Quantificação por determinação da absorbância em 280 nm
As concentrações de proteínas de todas as frações recolhidas nas etapas
cromatográficas foram determinadas em 280 nm em espectrofotômetro Micronal (modelo
B582).
4.2.1.2. Dosagem de proteínas pelo método colorimétrico (LOWRY et al, 1951)
As concentrações de proteína das frações reunidas com atividade proteolítica após
cada etapa cromatográfica foram determinadas utilizando-se 0,1 mL da amostra e 1,0 mL
da uma solução de trabalho de Lowry, preparada antes do uso (Anexo 2). A mistura foi
35
mantida em temperatura ambiente durante 10 minutos e a seguir foi adicionado 0,2 mL do
reativo de Folin-Ciocalteu (Merck) diluído (1:2) em água deionizada. As leituras das
absorbâncias foram feitas em 650 nm em espectrofotômetro Micronal modelo B582. As
concentrações foram determinadas utilizando-se uma curva padrão de albumina bovina
submetida à mesma reação, com as seguintes concentrações: 5 µg/ml; 10 µg/ml; 20 µg/ml;
40 µg/ml; 50 µg/ml; 70 µg/ml; 80 µg/ml e 100 µg/ml. As concentrações de proteínas das
amostras foram determinadas por interpolação gráfica em papel milimetrado.
4.3. Caracterização físico-química
4.3.1. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (LAEMMLI, 1970)
A cada etapa de purificação foi feita eletroforese em gel de poliacrilamida contendo
SDS (LAEMMLI, 1970) para estimativa do grau de pureza da enzima e na última etapa
para determinação da massa molecular aparente. O gel de resolução preparado a 13% foi
distribuído entre duas placas de vidro com espaçadores de 1,5 milímetro de espessura.
Após a polimerização deste gel, um gel de empilhamento a 4% foi adicionado sobre o gel
de resolução e um pente (molde) para formação de canaletas foi colocado até a
polimerização do gel. Após a polimerização do gel de concentração o pente foi retirado, as
canaletas lavadas com água Milli-Q e o gel foi acoplado a um sistema de eletroforese
vertical marca Bio Rad modelo Mini Protean
II. As amostras diluídas em tampão de
amostra foram fervidas durante 5 minutos e centrifugadas por 2 minutos e em seguida
aplicadas às canaletas. Em uma das canaletas foi aplicada uma mistura de padrões de
massa molecular Sigma, contendo soroalbumina bovina (65.000 Da), ovoalbumina (45.000
Da), anidrase carbônica (29.000 Da) e lactalbumina (14.200 Da). A corrida foi feita em
voltagem constante de 120 V utilizando fonte Bio-Rad, modelo 1000/500.
36
4.3.2. Coloração dos géis pela prata amoniacal (TUNÕN & JOHANSON, 1984)
Após a corrida o gel foi colocado em soluções pré-fixadoras 1 (durante 1 a 4 h) e 2
(durante 2 h), lavado em água Milli-Q e colocado em solução de glutaraldeído (Reagen)
25% diluído na proporção de 1:2 em água, durante 45 minutos e em seguida lavado 3 vezes
em água Milli-Q, 15 minutos cada vez. Em seguida o gel foi colocado em solução de prata
amoniacal, na qual permaneceu durante 30 minutos. Após este tempo o gel foi lavado em
água Milli-Q e colocado em solução reveladora até que as bandas proteicas adquirissem
coloração desejada. Neste momento a solução reveladora foi substituída pela inativadora
onde o gel permaneceu durante 2 horas no mínimo. Depois de revelado o gel foi colocado
em solução de secagem por 2 horas. Para registro as eletroforeses foram fotografadas e
posteriormente secas entre folhas de celofane.
Os reagentes utilizados para preparo dos géis de poliacrilamida e para coloração
dos géis estão descritos no Anexo 3.
4.3.3. Determinação da massa molecular aparente por eletroforese em gel de
poliacrilamida
Após a coloração e secagem do gel de poliacrilamida, foi feita a medida das
distâncias correspondentes à migração do tampão da amostra, demarcada pelo azul de
bromofenol e as medidas das distâncias correspondentes à migração das bandas dos
padrões e da amostra. Para determinação da massa molecular aparente foi feita a
determinação do Rf. Os valores obtidos correspondentes aos padrões foram plotados em
papel semilog com os valores de massa molecular no eixo das ordenadas e os valores dos
Rf no eixo das abscissas. Em seguida o valor do Rf da amostra foi plotado e encontrou-se o
valor da massa molecular aparente das enzimas.
37
4.4. Determinação da atividade enzimática
4.4.1. Substrato natural
4.4.1.1. Determinação da atividade proteolítica sobre hemoglobina bovina (ANSON &
MIRSKY, 1932).
A atividade proteolítica foi feita utilizando-se 0,25 mL de tampão formiato de
amônio 1 M (Herzog), pH 3,1 (BARRETT, 1967), 0,25 mL de uma solução de
hemoglobina bovina 8% em água Milli-Q (Anexo 2) e 0,20 mL da amostra contendo a
enzima. A mistura foi incubada a 37
o
C durante 15 minutos a 1 hora dependendo da
enzima.
Após a incubação foi adicionado 1 mL de ácido tricloroacético (Merck) 3% a cada
tubo. A mistura foi agitada em agitador tipo vórtex (Phoenix modelo AT 56ª) e mantida em
congelador por 5 minutos. A seguir os tubos foram centrifugados a 1.643 x g durante 15
minutos em centrífuga Olidegf cz (modelo DC4000). Um mL do sobrenadante obtido foi
misturado a 2,0 mL de NaOH p.a. 0,5 M (Nuclear) e 0,4 mL do reativo de Folin-Ciocalteau
(Merck) diluído (1:2) em água deionizada. Após desenvolvimento de cor, as absorbâncias
foram determinadas em 650 nm em espectrofotômetro Micronal (modelo B582).
As atividades enzimáticas foram estimadas através de uma curva padrão obtida a
partir de solução de tirosina (Merck) 0,1 mg/mL com as seguintes concentrações: 20 µg/mL,
40 µg/mL, 50 µg/mL, 70 µg/mL, 80 µg/mL, 100 µg/mL, 120 µg/mL, 150 µg/mL, 200 µg/mL
e 250 µg/mL. Os resultados foram obtidos por interpolação gráfica em papel milimetrado e
expressos em microgramas de tirosina por mililitro por hora (µg tirosina x mL
-1
x h
-1
).
38
4.4.2. Substratos sintéticos
Os substratos sintéticos utilizados foram Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-
Eddnp, Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, sendo o radical Abz o ácido
orto-amino benzóico e o radical EDDnp o N-[2,4-dinitrofenol]-etilenodiamino. Os substratos
foram sintetizados e gentilmente fornecidos pelo Departamento de Biofísica da Escola
Paulista de Medicina (UNIFESP). Foi preparada uma solução estoque a 1,0 mg/mL diluindo-
se os substratos em 20 µL de dimetilformamida (Nuclear) e completando-se o volume com
água Milli-Q (Marca Millipore, Simplicity).
4.4.2.1. Determinação do pH ótimo
A determinação do pH ótimo foi feita incubando-se as enzimas purificadas com os
substratos em tampões com valores de pH que variaram de 4,0 a 8,0 com intervalos de 1,0
unidade de pH (4,0 e 5,0: acetato de sódio 0,2 M, Chemco; 6,0: fosfato monobásico de sódio
0,2 M, Synth; 7,0 e 8,0: tris 0,2 M, Nuclear). As incubações foram feitas em cubeta
termostatizada e sob agitação contínua, na proporção de 1,89 mL de tampão, 100 µL de cada
substrato na concentração de 1 mg/mL e 10 µL da enzima. As leituras de fluorescência foram
feitas em espectrofluorômetro Hitachi (modelo F2000), durante 50 minutos, com registro a
cada 10 minutos, empregando comprimento de onda de excitação de 320 nm e de emissão de
420 nm. A variação de fluorescência por minuto (∆
f
/minuto) encontrada para cada valor de
pH foi dividida por um fator do ácido benzóico para cada pH e os resultados foram expressos
em µmol/litro/minuto.
39
4.4.2.2. Determinação dos pontos de clivagem
As enzimas purificadas foram incubadas com os substratos sintéticos e os fragmentos
liberados foram analisados em HPLC de fase reversa, em coluna octadecilsilano (C18)
Lichrospher-Hibar 100 RP-18 (Merck) medindo 5,0 x 125 mm com partículas de 4,0 µ de
diâmetro, conectada a um sistema de duas bombas injetoras modelo LC9A (Shimadzu).
Alíquotas de 100 µl da mistura de incubação foram submetidas a um gradiente de acetonitrila
(Merck) contendo ácido trifluoracético (Carlo Erba) em uma concentração final de 0,1%.
Como solvente A foi utilizada acetonitrila a 20% em água deionizada e como solvente B,
acetonitrila a 100%, sendo que o fluxo foi de 1 mL por minuto. A detecção dos produtos de
hidrólise foi feita em 214 nm por um detector de luz UV/visível modelo SPD 6AV
(Shimadzu), acoplado em série com um detector de fluorescência modelo RF535 (Shimadzu),
utilizando comprimento de onda de excitação de 320 nm e de emissão 420 nm. O registro foi
feito através de um registrador modelo CR4A Chromatopac (Shimadzu). Também foram
feitas incubações dos substratos com as enzimas purificadas e com seu inibidor específico a
Pepstatina A.
4.4.2.3. Análise de aminoácidos pelo método da pré-derivatização (BURBACH et al,
1982)
Foi feita análise dos aminoácidos dos fragmentos liberados da incubação das enzimas
com os substratos fluorogênicos. Os fragmentos fluorescente e não fluorescente resultantes
foram recolhidos em frascos separados, liofilizados, reconstituídos com água deionizada e
colocados em ampolas. A cada ampola acrescentou-se 0,05 ml de ácido clorídrico/ácido
propiônico (Sigma) (50:50) 4,0 N, as ampolas foram lacradas e colocadas em estufa a 110
o
C
durante 24 horas para hidrólise. Em seguida as ampolas foram abertas e secas à vácuo.
Depois de secas, adicionou-se 0,2 ml de tampão borato de sódio (Merck) 0,1 M pH 9,1. Os
40
reagentes utilizados na pré-derivatização dos aminoácidos foram: tampão borato (Merck) 0,1
M pH 9,1 com 10 µl de β-mercaptoetanol (Merck) (reagente 1) e tampão borato de sódio
(Merck) 0,1 M pH 9,1 ao qual foram adicionados 5,0 mg de o-phtalaldeído (Merck)
previamente dissolvidos em 1,5 ml de etanol (Merck) (reagente 2). A coluna utilizada foi
octadecilsilano (C18) Lichrocart-hibar 15542 medindo 4,0 x 125 mm com partículas de 4,0 µ
de diâmetro (Merck) em sistema HPLC (Shimadzu). Foi feito gradiente utilizando como
solvente A, citrato de sódio 0,1 M (Mallinckrodt), ácido bórico 0,1 M, pH 6,5, contendo
metanol LiChrosolv
®
20% e como tampão B, metanol 100%. Como padrão foi utilizado
padrão de aminoácidos Sigma.
4.4.2.4. Determinação dos parâmetros cinéticos
Os parâmetros K
m
, k
cat
e k
cat
/K
m
foram determinados para cada um dos substratos,
utilizando tampão acetato de sódio p.a. 0,2 M pH 4,5 e cubeta termostatizada a 37
o
C em
espectrofluorômetro Hitachi, modelo F2000. A incubação foi feita durante 60 minutos,
com registro aos 5, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos (λ
Ex
320 nm; λ
Em
420 nm). A
quantidade de substrato variou de 10 µL até 160 µL, utilizando volume fixo de enzima (10
µL).
A constante de Michaelis (K
m
) e a velocidade máxima (V
máx
) foram deduzidas das
velocidades de catálise medidas com diferentes concentrações de cada substrato. As
velocidades da reação sobre concentrações crescentes de cada um destes substratos foram
medidas através da formação do produto da ação enzimática, verificada por fluorimetria.
Foram feitas leituras fluorimétricas aos 5, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos e a variação de
fluorescência (∆
f
/minuto) foi medida para cada uma das diferentes concentrações do
substrato, determinando-se, portanto a velocidade de formação do produto final da reação
enzimática. Em seguida foi feito um gráfico no qual os valores das concentrações
41
crescentes de substrato [S] foram plotados no eixo X e os valores das velocidades de
reação (µmol de produto formado) foram plotados no eixo Y (gráfico de Michaelis-
Menten). Foi feito também um gráfico de 1/[S] no eixo X e 1/V no eixo Y ou gráfico duplo
recíproco de Lineawever-Burk, para facilitar a visualização dos parâmetros e determinação
da K
m
e de V
máx
por interpolação gráfica. Esses dados foram plotados no programa
Enzifitter (Sigma).
Os valores de Km das enzimas variam amplamente e dependem de cada substrato e
das condições de incubação (pH, temperatura e força iônica). A constante de Michaelis
(K
m
) indica a “afinidade” da enzima pelo substrato e tem dois significados: é a
concentração de substrato na qual 50% dos centros ativos estão ocupados ou a
concentração de substrato que fornece metade da V
máx
. O parâmetro k
cat
é a velocidade
máxima de catálise quando a enzima está saturada por S, ou seja, é o número de renovação
da enzima (“turnover number”), e pode ser calculado dividindo-se a V
máx
pela
concentração molar da enzima. A relação k
cat
/K
m
fornece a eficiência catalítica da enzima.
Quanto maior a relação k
cat
/K
m
, mais rápida é a conversão de substrato em produto
(SEGEL, 1993).
A concentração dos substratos utilizados em cada um dos pontos da cinética foi
determinada em micromolar (µM) através de análise de fluorescência da hidrólise total de
cada substrato pela pepsina gástrica após incubação a 37
o
C, de volumes diferentes dos
mesmos de 5 em 5 minutos até que se obtivesse uma fluorescência constante (Abz-Ala-Ile-
Lys-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, com concentração final de 0,64 a 3,41 µM; Abz-Ala-Ile-
Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, 0,47 a 2,52 µM; Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp, 0,84 a 4,46 µM; Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, 0,51 a 2,72
µM). Os cálculos da concentração foram feitos dividindo-se os valores da variação da
42
fluorescência pelo coeficiente de extinção molar para o ácido benzóico (1.489,17 em
comprimento de onda de 420 nm).
4.4.2.5. Ensaios de titulação do sítio ativo
Um parâmetro utilizado para titulação do sítio ativo enzimático é a inibição por
moléculas específicas. Neste trabalho foi utilizado o inibidor Pepstatina A (Isovaleril-Val-
Val-AHMHA-Ala-AHMHA, Sigma), um hexapeptídeo semelhante ao estado de transição
dos substratos normais (MORISHIMA et al, 1970). Foram feitas incubações de 20, 30, 40,
50, 60, 70, 80 e 90 µL do inibidor a 1,5 x 10
-7
mol/L e 10 µL do inibidor a 1,5 x 10
-6
mol/L, durante 40 minutos com 10 µL das enzimas em pH 4,5, com 140 µL de cada um
dos substratos. Por fim foram feitas análises da atividade enzimática por fluorimetria,
segundo descrito anteriormente. Os resultados foram plotados em papel milimetrado, para
cada uma das enzimas em forma de uma função decrescente de absorbância, na qual o eixo
Y representou a velocidade de reação em µM de produto formado por segundo e o eixo X a
concentração do inibidor em µM. A titulação dos sítios ativos enzimáticos foi determinada
com base nesta interpolação gráfica e calculada de acordo com KNIGHT, 1995.
43
5. RESULTADOS
5.1. Purificação
5.1.1. Catepsina D de baço
5.1.1.1. Extração
O extrato bruto obtido a partir de um baço (334 g) totalizou um volume de 830 mL,
que continha 1.527,2 mg (1,8 mg/mL) de proteínas e uma atividade específica de 35,8 µg
de tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
, como está mostrado na tabela de purificação
(Tabela 1).
5.1.1.2. Cromatografia de afinidade 6-aminoexil Sepharose-Pepstatina A (Sigma)
Nesta etapa de purificação foram coletadas 100 frações de 10 mL. Foi feita
atividade proteolítica sobre hemoglobina bovina 8% (ANSON e MIRSKY, 1932) e o perfil
cromatográfico está apresentado na Figura 1. As frações com atividade proteolítica foram
reunidas e continham 7 mg de proteínas em 180 mL (0,04 mg/mL) e atividade específica
de 1.929 µg tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
. O rendimento nesta etapa de purificação
foi de 24,8 %.
44
5.1.1.3. Cromatografia de afinidade Blue-Agarose (Bio Rad)
Na cromatografia de afinidade Blue-Agarose foram coletadas 50 frações de 2,0 mL
em cada cromatografia resultando em um volume final de 12 mL por fração. Foi feita
atividade proteolítica sobre hemoglobina bovina 8% (ANSON e MIRSKY, 1932) e as
frações com atividade foram reunidas e continham 0,6 mg de proteína em 60 mL (0,01
mg/mL) e atividade específica de 2.244 µg tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
(Figura 2).
O rendimento nesta etapa de purificação foi de 2,5 % (Tabela 1).
Figura 1. Cromatografia de afinidade 6-aminoexil Sepharose-Pepstatina A (Sigma) do extrato bruto
de baço. As proteínas foram eluídas em tampão Tris p.a. 0,1 M, pH 8,5, NaCl p.a. 0,5 M, e frações de
10 mL foram coletadas. Foi feita determinação da concentração de proteínas em 280 nm e atividade
proteolítica utilizando hemoglobina bovina 8% como substrato.
Absorbância 280 nm Atividade Proteolítica 650 nm
Frações utilizadas na etapa cromatográfica seguinte
■
45
5.1.1.4. Cromatografia de filtração em gel Superdex
TM
HR 75 10/30 (Sistema FPLC,
Pharmacia
)
Na cromatografia de filtração em gel foram coletadas 60 frações de 0,5 mL em
cada. Foi feita atividade proteolítica sobre hemoglobina bovina 8% (ANSON e MIRSKY,
1932) com detecção de um único pico de atividade, segundo mostrado na Figura 3. As
frações com maior atividade foram reunidas e continham 0,1 mg de proteína em 11 mL
(0,009 mg/mL). A atividade específica foi de 3.060 µg tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
.
O rendimento nesta etapa de purificação foi de 0,6 % (Tabela 1).
Figura 2. Cromatografia de afinidade Blue-Agarose (Bio Rad) equilibrada e eluída com tampão
fosfato de sódio p.a. 0,1 M, azida de sódio 3 µM, pH 7,0. Foi feita determinação da concentração de
proteínas em 280 nm e atividade proteolítica utilizando hemoglobina bovina 8% como substrato.
Absorbância 280 nm Atividade Proteolítica 650 nm
Frações utilizadas na etapa cromatográfica seguinte
■
46
5.1.2. Gastricsina de suco gástrico
5.1.2.1. Extração
A purificação iniciou-se a partir de 50 mL de suco gástrico, que apresentou 43 mg
(0,9 mg/mL) de proteínas e uma atividade específica de 65,2 µg de tirosina x mg de
proteína
-1
x hora
-1
, como está mostrado na tabela de purificação (Tabela 2).
5.1.2.2. Cromatografia de troca iônica – DEAE Bio-Gel (Bio Rad)
Nesta etapa de purificação durante a primeira eluição foram coletadas 50 frações de
10 mL. Durante o gradiente foram coletadas 65 frações de aproximadamente 8 mL. Foi
feita atividade proteolítica pelo método de ANSON e MIRSKY (1932) com hemoglobina
bovina 8%. O perfil cromatográfico está apresentado na Figura 4. As frações com atividade
Figura 3. Cromatografia de filtração em gel Superdex
TM
HR 75 10/30 (Sistema FPLC, Pharmacia
)
equilibrada e eluída com tampão fosfato de sódio p.a. 0,1 M, pH 7,0, NaCl p.a. 0,5 M,. Foi feita
determinação da concentração de proteínas em 280 nm e atividade proteolítica utilizando
hemoglobina bovina 8% como substrato. Absorbância 280 nm Atividade
Proteolítica 650 nm Frações da catepsina D com atividade
■
47
proteolítica foram eluídas em 40 % do tampão B. Estas frações reunidas continham 1 mg
de proteína em 23 mL (0,04 mg/mL) e atividade específica de 113,5 µg tirosina x mg de
proteína
-1
x hora
-1
. O rendimento nesta etapa de purificação foi de 40,3 %.
5.1.2.3. Cromatografia de troca iônica – Mono-Q HR 5/5 (Sistema FPLC,
Pharmacia
)
Na cromatografia em coluna Mono-Q foram coletadas 108 frações de 0,25 mL em
cada cromatografia resultando em um volume total de 8 mL por fração. Foi feita atividade
proteolítica sobre hemoglobina bovina 8% (ANSON e MIRSKY, 1932) com detecção de
um único pico de atividade que foi eluído em 20% de tampão B (Figura 5). As frações com
maior atividade foram reunidas, continham 0,04 mg de proteína em 7 mL (0,006 mg/mL) e
Figura 4. Cromatografia de troca iônica em resina DEAE Bio Gel (Bio-Rad) do suco gástrico. As
proteínas foram eluídas com um gradiente linear de NaCl p.a., que variou de 0,1 a 0,8 M em tampão
acetato de sódio p.a. 0,01 M, pH 4,9, e frações de 6 mL foram coletadas. Foi feita determinação da
concentração de proteínas em 280 nm e atividade proteolítica utilizando hemoglobina bovina 8%
como substrato. Absorbância 280 nm Atividade Proteolítica 650 nm
Gradiente de NaCl Frações utilizadas na etapa cromatográfica seguinte
■
Gradiente 0 a 100% de B
0,1M
0,8M
Gradiente de NaCl
48
atividade específica de 198,3 µg tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
. O rendimento nesta
etapa de purificação foi de 0,3 % (Tabela 2).
5.1.3. Pepsina de estômago
5.1.3.1. Extração
A mucosa gástrica processada e misturada ao tampão de extração apresentou
367,2 mg em 360 mL (1 mg/mL) de proteínas e uma atividade específica de 185 µg de
tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
, como está mostrado na tabela de purificação (Tabela
3).
Figura 5. Cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q HR 5/5 (Sistema FPLC,
Pharmacia) equilibrada com tampão fosfato de sódio p.a. 0,05 M, pH 6,0. Os picos foram
eluídos com gradiente de NaCl p.a. que variou de 0,0 a 0,5 M e de 0,5 a 1 M, a um fluxo de 0,5
mL/minuto. Absorbância 280 nm Atividade Proteolítica 650 nm
Gradiente de NaCl Frações da gastricsina com atividade
■
0 M
1 M
Gradiente de NaCl
49
5.1.3.2. Cromatografia de troca iônica – DEAE Bio-Gel (Bio Rad)
Nesta etapa de purificação durante a primeira eluição foram coletadas 100 frações
de 10 mL. Durante o gradiente foram coletadas 88 frações de 6 mL. Foi feita atividade
proteolítica pelo método de ANSON e MIRSKY (1932). O perfil cromatográfico está
apresentado na Figura 6. As frações com atividade proteolítica foram eluídas em 40% do
tampão B. Estas frações reunidas continham 1,6 mg de proteínas em 180 mL (0,009
mg/mL) e atividade específica de 755,6 µg tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
. O
rendimento nesta etapa de purificação foi de 1,8 %.
Figura 6. Cromatografia de troca iônica em resina DEAE Bio Gel (Bio-Rad). As proteínas foram
eluídas com um gradiente linear de NaCl p.a., que variou de 0,1 a 0,8 M em tampão acetato de sódio
p.a. 0,01 M, pH 4,9, e frações de 6 mL foram coletadas. Foi feita determinação da concentração de
proteínas em 280 nm e atividade proteolítica utilizando hemoglobina bovina 8% como substrato.
Absorbância 280 nm Atividade Proteolítica 650 nm
Gradiente de NaCl Frações utilizadas na etapa cromatográfica seguinte
Gradiente 0 a 100% de B
0,1 M
0,8 M
Gradiente de NaCl
■
50
5.1.3.3. Cromatografia de troca iônica – Mono-Q HR 5/5 (Sistema FPLC,
Pharmacia
)
Na cromatografia em coluna Mono-Q foram coletadas 108 frações de 0,25 mL em
cada cromatografia resultando em um volume final de 8 mL por fração. Foi feita atividade
proteolítica sobre hemoglobina bovina 8% com detecção de um único pico de atividade
que foi eluído em 40% de tampão B (fosfato de sódio p.a. 0,05 M, contendo NaCl p.a. 1,0
M, pH 6,0), segundo mostrado na Figura 7. As frações com maior atividade foram reunidas
continham 0,1 mg de proteína em 40 mL (0,003 mg/mL) e atividade específica de 1.863,2
µg tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
. O rendimento nesta etapa de purificação foi de
0,3% (Tabela 3).
Figura 7. Cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q HR 5/5 (Sistema FPLC,
Pharmacia) equilibrada com tampão fosfato de sódio p.a. 0,05 M, pH 6,0. Os picos foram
eluídos com gradiente de NaCl p.a. que variou de 0,0 a 0,5 M e de 0,5 a 1 M, a um fluxo de 0,5
mL/minuto. Absorbância 280 nm Atividade Proteolítica 650 nm
Gradiente de NaCl Frações utilizadas na etapa cromatográfica seguinte
■
0 M
1 M
Gradiente de NaCl
51
5.1.3.4. Cromatografia de filtração em gel Superdex
TM
HR 75 10/30 (Sistema FPLC,
Pharmacia
)
Na cromatografia de filtração em gel foram coletadas 60 frações de 0,5 mL em
cada. Foi feita atividade proteolítica sobre hemoglobina bovina 8% (ANSON e MIRSKY,
1932) com detecção de um único pico de atividade, como mostra a Figura 8. As frações
com maior atividade foram reunidas continham 0,04 mg de proteína em 40 mL (0,001
mg/mL) e atividade específica de 2.108 µg tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
. O
rendimento nesta etapa de purificação foi de 0,1 % (Tabela 3).
Figura 8. Cromatografia de filtração em gel Superdex
TM
HR 75 10/30 (Sistema FPLC, Pharmacia
)
equilibrada e eluída com tampão fosfato de sódio p.a. 0,1 M, NaCl p.a. 0,5 M, pH 7,0. Foi feita
determinação da concentração de proteínas em 280 nm e atividade proteolítica utilizando
hemoglobina bovina 8% como substrato. Absorbância 280 nm
Atividade Proteolítica 650 nm Frações da pepsina com atividade
■
52
5.1.4. Uropepsina
5.1.4.1. Extração
A cada 5 litros coletados a urina foi dialisada e concentrada para um volume final
de 50 mL. Este material concentrado apresentou 84 mg de proteína em 200 mL
(0,4 mg/mL) de proteínas e uma atividade específica de 65,8 µg de tirosina x mg de
proteína
-1
x hora
-1
, como está mostrado na tabela de purificação (Tabela 4).
5.1.4.2. Cromatografia de troca iônica – DEAE Bio-Gel (Bio Rad)
Nesta etapa de purificação durante a primeira eluição foram coletadas 40 frações de
10 mL. Durante o gradiente foram coletadas 60 frações de 8 mL. Foi feita atividade
proteolítica pelo método de ANSON e MIRSKY (1932). O perfil cromatográfico está
apresentado na Figura 9. As frações com atividade proteolítica foram eluídas em 60% do
tampão B. Estas frações reunidas continham 5,3 mg de proteínas em 25 mL (0,2 mg/mL) e
atividade específica de 87,4 µg tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
. O rendimento nesta
etapa de purificação foi de 8,3 %.
53
5.1.4.3. Cromatografia de troca iônica – Mono-Q HR 5/5 (Sistema FPLC,
Pharmacia
)
Na cromatografia em coluna Mono-Q foram coletadas 108 frações de 0,25 mL em
cada cromatografia resultando em um volume total de 8 mL por fração. Foi feita atividade
proteolítica sobre hemoglobina bovina 8% (ANSON e MIRSKY, 1932) com detecção de
um único pico de atividade que foi eluído em 40% de tampão B, segundo mostrado na
Figura 10. As frações com maior atividade foram reunidas e continham 0,2 mg de proteína
em 17 mL (0,01 mg/mL). A atividade específica foi de 196,2 µg tirosina x mg de proteína
-1
x hora
-1
. O rendimento nesta etapa de purificação foi de 0,8 % (Tabela 4).
Figura 9. Cromatografia de troca iônica em resina DEAE Bio Gel (Bio-Rad) da urina dialisada e
concentrada. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de NaCl p.a., que variou de 0,1 a
0,8 M em tampão acetato de sódio p.a. 0,01 M, pH 4,9, e frações de 6 mL foram coletadas. Foi feita
determinação da concentração de proteínas em 280 nm e atividade proteolítica utilizando
hemoglobina bovina 8% como substrato. Absorbância 280 nm Atividade Proteolítica
650 nm Gradiente de NaCl Frações utilizadas na etapa cromatográfica seguinte
Gradiente 0 a 100% de B
0,1M
0,8M
Gradiente de NaCl
■
54
Figura 10. Cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q HR 5/5 (Sistema FPLC,
Pharmacia) equilibrada com tampão fosfato de sódio p.a. 0,05 M, pH 6,0. Os picos foram
eluídos com gradiente de NaCl p.a. que variou de 0,0 a 0,5 M e de 0,5 a 1 M, a um fluxo de 0,5
mL/minuto. Absorbância 280 nm Atividade Proteolítica 650 nm
Gradiente de NaCl Frações da uropepsina com atividade
0 M
1 M
Gradiente de NaCl
■
55
Tabela 1. Tabela de purificação da catepsina D humana
ETAPAS
PROCEDIMENTO
PROTEÍNA
(mg)
ATIVIDADE
ESPECÍFICA
(µg tirosina x
mg de proteína
-1
x hora
-1
)
ATIVIDADE
TOTAL
(g tirosina x
hora
-1
)
FATOR DE
PURIFICAÇÃO
RENDIMENTO
(%)
1 Material Bruto 1.527,2 35,8 54,7 1,0 100
2 Pepstatina A 7,0 1.929 13,5 53,9 24,8
3 Blue-Agarose 0,6 2.244 1,3 62,7 2,5
4 Filtração Superdex 75 0,1 3.060 0,3 85,5 0,6
55
56
Tabela 2. Tabela de purificação da gastricsina humana
ETAPAS
PROCEDIMENTO
PROTEÍNA
(mg)
ATIVIDADE
ESPECÍFICA
(µg tirosina x
mg de proteína
-1
x hora
-1
)
ATIVIDADE
TOTAL
(g tirosina x
hora
-1
)
FATOR DE
PURIFICAÇÃO
RENDIMENTO
(%)
1 Material Bruto 43 65,2 2,8 1 100
2 DEAE Bio Gel 1 113,5 1,1 1,7 40,3
3 Mono Q HR 5/5 0,04 198,3 0,01 3,0 0,3
56
57
Tabela 3. Tabela de purificação da pepsina humana
ETAPAS
PROCEDIMENTO
PROTEÍNA
(mg)
ATIVIDADE
ESPECÍFICA
(µg tirosina x
mg de proteína
-1
x hora
-1
)
ATIVIDADE
TOTAL
(g tirosina x
hora
-1
)
FATOR DE
PURIFICAÇÃO
RENDIMENTO
(%)
1 Material Bruto 367,2 185 68 1 100
2 DEAE Bio Gel 1,6 755,6 1,2 4,1 1,8
3 Mono Q HR 5/5 0,1 1.863,2 0,2 9,9 0,3
4 Filtração Superdex 75 0,04 2.108 0,08 11,39 0,1
57
58
Tabela 4. Tabela de purificação da uropepsina humana
ETAPAS
PROCEDIMENTO
PROTEÍNA
(mg)
ATIVIDADE
ESPECÍFICA
(µg tirosina x
mg de proteína
-1
x hora
-1
)
ATIVIDADE
TOTAL
(g tirosina x
hora
-1
)
FATOR DE
PURIFICAÇÃO
RENDIMENTO
(%)
1 Material Bruto
84 65,8 5,5 1 100
2 DEAE Bio Gel
5,3 87,4 0,5 1,3 8,3
3 Mono Q HR 5/5
0,2 196,2 0,04 3 0,8
58
59
5.2. Caracterização físico-química
5.2.1. Determinação do grau de pureza e da massa molecular por eletroforese em gel de
poliacrilamida
A eletroforese em gel de poliacrilamida a 13% contendo SDS corada pela prata
mostrou uma banda única para catepsina D, gastricsina, pepsina e uropepsina (Figura 12)
sendo que suas massas moleculares foram estimadas em 29.000 Da, 31.000 Da, 39.000 Da e
38.000 Da respectivamente (Figura 13).
Figura 11. Eletroforeses em gel de poliacrilamida a 13% contendo SDS, em condições não redutoras e
coradas pela prata amoniacal.
I. Em (a) padrão de massa molecular (Soroalbumina bovina, 65.000 Da; Ovoalbumina, 45.000 Da;
Anidrase carbônica, 29.000 Da; Lactalbumina, 14.200 Da, Sigma), em (b) uropepsina pós Mono-Q.
II. Em (c) padrão de massa molecular (Soroalbumina bovina, 65.000 Da; Ovoalbumina, 45.000 Da;
Anidrase carbônica, 29.000 Da; Lactalbumina, 14.200 Da, Sigma), em (d) catepsina D pós Filtração
Superdex 75, em (e) pepsina pós Filtração Superdex 75 e em (f) gastricsina pós Mono-Q.
a b
65.000
45.000
29.000
14.200
c d e f
(I)
65.000
45.000
29.000
14.200
(II)
60
Figura 12. Curvas de calibração de massas moleculares dos padrões mostrados na figura 11 e
determinação da massa molecular aparente das enzimas.
Massa molecular estimada das enzimas
Padrões de massa molecular
Rf: relativo à frente
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1.000
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
60.000
70.000
80.000
90.000
37.000
29.000
45.000
65.000
Rf
Massa molecular em Da
Rf da uropepsina
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1.000
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
60.000
70.000
80.000
90.000
30.000
29.000
45.000
65.000
Rf
Massa molecular em Da
Rf da pepsina
Rf da gastricsina
Rf da catepsina D
38.000
61
5.3. Determinação das atividades enzimáticas sobre os substratos sintéticos
fluorogênicos contendo a seqüência da calistatina humana
5.3.1. Determinação do pH ótimo
O pH ótimo das atividades enzimáticas sobre os substratos Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp, Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp foi 4,5 para todas as
enzimas.
5.3.2. Ensaios de titulação do sítio ativo
Para cada uma das enzimas purificadas determinou-se a titulação dos sítios ativos
enzimáticos com o inibidor específico Pepstatina A (Isovaleril-Val-Val-AHMHA-Ala-
AHMHA, Sigma).
Tabela 5. Titulação dos sítios ativos enzimáticos com o inibidor pepstatina A
Enzima Enzima ativa (nM)
Catepsina D 0,022
Gastricsina 0,016
Pepsina 0,006
Uropepsina 0,056
62
5.3.3. Determinação da atividade proteolítica e análise de aminoácidos
Os resultados da análise dos produtos de incubação da enzima pepsina humana com
os substratos sintéticos contendo a seqüência baseada no centro reativo da calistatina, Abz-
Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
estão mostrados nas Figuras 14 e 15. Segundo observado pelos experimentos todas as enzimas
testadas clivam a ligação peptídica entre os dois resíduos de fenilalanina em todos os
substratos. Ainda, de acordo com a Figura 16, vimos que a clivagem ocorreu exclusivamente
devido à ação das peptidases aspárticas, já que, na presença de pepstatina A o substrato não
foi clivado.
Tempo de retenção (min)
(b)
(a)
(a)
(b)
A214
0 2 4 6 8 10 12 14
Unidades arbtrárias de
fluorescência
Figura 13. Análise dos fragmentos resultantes da clivagem do substrato Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp pela pepsina em pH 4,5 empregando cromatografia de fase reversa em HPLC utilizando coluna
octadecilsilano (C18) Lichrocart-hibar 15542 (Merck). (a) análise em UV e (b) detecção de fluorescência.
Tempo de retenção (min)
(a)
(b)
63
Fluorescência
(a)
(b)
Unidades arbitrárias de fluorescência
Figura 15. Análise por cromatografia de fase reversa em HPLC utilizando coluna octadecilsilano
(C18) Lichrocart-hibar 15542 (Merck) do produto de incubação do substrato Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp com a uropepsina em pH 4,5, em ausência (a) ou presença (b) do inibidor
pepstatina A.
Tempo de retenção (min)
Figura 14. Análise de aminoácidos dos produtos de clivagem do substrato Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-
Gln-Eddnp pela pepsina em pH 4,5, utilizando cromatografia de fase reversa em HPLC utilizando coluna
octadecilsilano (C18) Lichrocart-hibar 15542 (Merck). (a) fragmento fluorescente e (b) fragmento não
fluorescente.
(a)
Unidades arbtrárias
de fluorescência
0
5
15
10
20 25
30
Ser
Ser
Ala
Glu
Arg
Phe
Phe
Ile
(b)
Tempo de retenção (min)
64
5.3.4. Cinética
Os dados cinéticos, K
m
, k
cat
e k
cat
/K
m
para os substratos com as diferentes enzimas
estão mostrados na Tabela 6.
A menor eficiência catalítica para todas as enzimas, com valores em média, de 3 a 5
vezes menores de k
cat
/K
m
,
foi para o substrato que apresentou a modificação lisina para
leucina na posição P
2
.
Para a catepsina D o substrato com maior valor de k
cat
/K
m
foi o que apresentou a
modificação de lisina para alanina. Os valores de k
cat
/K
m
para o substrato com a sequência
original e o substrato com a modificação de lisina para serina não apresentaram diferença
significativa para o valor de k
cat
/K
m
do substrato com substituição lisina para alanina para esta
enzima.
Para as outras enzimas, gastricsina, pepsina e uropepsina o substrato com maior valor
de k
cat
/K
m
foi o substrato com a sequência original, sendo que este substrato e o substrato com
a modificação de lisina para alanina não apresentaram diferenças significativas para os
valores de k
cat
/K
m
. Os valores de k
cat
/K
m
para o substrato com a modificação de lisina para
serina foram duas vezes menores para a gastricsina e pepsina, enquanto que para a uropepsina
este valor não foi significativamente diferente em relação aos valores obtidos para o substrato
com a sequência original.
Os gráficos da cinética enzimática estão nas Figuras de 16 e 17 para a catepsina D, 18
e 19 para a gastricsina, 20 e 21 para a pepsina, 22 e 23 para uropepsina.
65
Tabela 6. Parâmetros cinéticos para hidrólise de substratos sintéticos fluorogênicos com a
seqüência do centro reativo da calistatina humana pelas peptidases aspárticas humanas
Enzimas Sequência do Abz-
peptídeo-EDDnp
K
m
(
µ
µµ
µ
M)
k
cat
(s
-1
)
k
cat
/K
m
(
µ
µµ
µ
M x s
-1
)
AIKFFSRQ 0,600 4,36 7,27
Catepsina D AIAFFSRQ 0,487 5,05 10,37
AILFFSRQ 1,180 3,04 2,58
AISFFSRQ 1,070 8,32 7,77
AIKFFSRQ 0,650 12,72 19,57
Gastricsina AIAFFSRQ 0,568 7,6 13,38
AILFFSRQ 0,700 3,76 5,37
AISFFSRQ 0,648 5,68 8,76
AIKFFSRQ 0,986 12,82 13,00
Pepsina AIAFFSRQ 0,698 5,89 8,44
AILFFSRQ 0,540 1,62 3,00
AISFFSRQ 1,220 6,33 5,19
AIKFFSRQ 0,717 4,77 6,65
Uropepsina AIAFFSRQ 0,597 3,18 5,33
AILFFSRQ 0,730 1,97 2,70
AISFFSRQ 0,575 2,58 4,49
A: Ala, alanina; F: Phe, fenilalanina; I: Ile, isoleucina; K: Lys, lisina; L: Leu, leucina; Q: Gln, glutamina; R:
Arg, aginina; S: Ser, serina.
66
Figura 16. Hidrólise, pela catepsina D, na presença de tampão acetato de sódio p.a. 0,2 M, pH 4,5,
dos substratos:
(a): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
(b): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
Concentração da enzima: 0,022 nM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
V (
µ
M/s)
[S] (
µ
M)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
[S] µM
V (µM/s)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1/V ( s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0
4
8
12
16
20
1/V ( s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
67
Figura 17. Hidrólise, pela catepsina D, na presença de tampão acetato de sódio p.a. 0,2 M, pH 4,5,
dos substratos:
(a): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
(b): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
Concentração da enzima: 0,022 nM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
0,11
0,12
0,13
V (
µ
M/s)
[S]
µ
M
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
V (µM/s)
[S] µΜ
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
0
4
8
12
16
20
24
28
32
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
68
Figura 18. Hidrólise, pela gastricsina, na presença de tampão acetato de sódio p.a. 0,2 M, pH 4,5, dos
substratos:
(a): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp
(b): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp
Concentração da enzima: 0,016 nM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
V (µM/s)
[S] µM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
V (
µ
M/s)
[S]
µ
M
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0
10
20
30
40
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
69
Figura 19. Hidrólise, pela gastricsina, na presença de tampão acetato de sódio p.a. 0,2 M, pH 4,5, dos
substratos:
(a): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp
(b): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp
Concentração da enzima: 0,016 nM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
V (
µ
M/s)
[S]
µΜ
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
V (
µ
M/s)
[S]
µ
M
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
4
8
12
16
20
24
28
32
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
0
4
8
12
16
20
24
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
70
Figura 20. Hidrólise, pela pepsina, na presença de tampão acetato de sódio p.a. 0,2 M, pH 4,5, dos
substratos:
(a): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
(b): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
Concentração da enzima: 0,006 nM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
V (
µ
M/s)
[S]
µ
M
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0,00
0,01
0,02
0,03
V (
µ
M/s)
[S]
µ
M
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0
10
20
30
40
50
60
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0
2
4
6
8
10
12
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
71
Figura 21. Hidrólise, pela pepsina, na presença de tampão acetato de sódio p.a. 0,2 M, pH 4,5, dos
substratos:
(a): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
(b): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp
Concentração da enzima: 0,006 nM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
0,000
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
0,009
V (
µ
M/s)
[S]
µΜ
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,00
0,01
0,02
0,03
V (
µ
M/s)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
30
60
90
120
150
180
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
72
Figura 22. Hidrólise, pela uropepsina, na presença de tampão acetato de sódio p.a. 0,2 M, pH 4,5, dos
substratos:
(a): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp
(b): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp
Concentração da enzima: 0,056 nM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
V (µM/s)
[S] µM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
V (
µ
M/s)
[S]
µ
M
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0
2
4
6
8
10
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0
2
4
6
8
10
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
73
Figura 23. Hidrólise, pela uropepsina, na presença de tampão acetato de sódio p.a. 0,2 M, pH 4,5, dos
substratos:
(a): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp
(b): Gráfico de Michaelis-Menten e duplo-recíproco de Lineweaver-Burk Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-
Ser-Arg-Gln-Eddnp
Concentração da enzima: 0,056 nM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
V (µM/s)
[S] µΜ
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
0,11
0,12
V (
µ
M/s)
[S]
µ
M
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1/V (s
-1
)
1/[S] (M
-1
)
0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
0
2
4
6
8
10
12
14
1/V (s
-1
)
1/[S] (M-1)
74
6. DISCUSSÃO
A família das peptidases aspárticas apresenta uma grande identidade estrutural e
homologia de sequências, indicando que todos os membros desta família apresentam uma
conformação tridimensional similar e, portanto deveriam operar através de um mecanismo
catalítico comum na hidrólise de seus substratos. Entretanto, diferenças substanciais na
especificidade do substrato, pH ótimo e estabilidade são observados entre as aspartil
peptidases. Como a fenda do sitio catalítico é estendida e permite a acomodação de pelo
menos sete aminoácidos do substrato, a ligação secundária tem um importante efeito na
eficiência catalítica de um número de enzimas (FRUTON 1970; HOFMAN e HODGES 1982;
BLUM et al, 1985). As diferenças em especificidade e, portanto, em atividade nos vários
valores de pH podem ser dependentes da natureza das cadeias laterais dos aminoácidos que
ocupam os subsítios nessas enzimas (DUNN et al, 1986).
Neste estudo purificamos as enzimas catepsina D, gastricsina, pepsina e uropepsina
humanas até a homogeneidade. No processo de purificação houve a nítida diferença entre a
catepsina D e as demais enzimas, gastricsina, pepsina e uropepsina. Essa diferença se deve ao
fato da primeira etapa cromatográfica, a de afinidade, utilizada para a catepsina D utilizar um
pH mais alto, o qual causa uma perda da atividade das outras enzimas de acordo com testes já
utilizados em nosso laboratório.
As ações sobre substratos sintéticos com seqüências baseadas na seqüência interna do
inibidor de serino-peptidase, a calistatina, próximo ao seu centro reativo (Abz-Ala-Ile-Lys-
Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, Abz-Ala-Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, Abz-Ala-Ile-
Leu-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp e Abz-Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp), foram
investigadas com as enzimas purificadas.
75
PIMENTA et al (2000) demonstraram que a catepsina D, foi capaz de clivar a
sequência da calistatina humana preferencialmente entre os resíduos Phe-Phe da região do
centro reativo da molécula. Os autores mostraram que no substrato Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-
Ser-Arg
-Gln-EDDnp a presença de um resíduo de serina na posição P
1
’ e de um resíduo de
arginina na P
2
’ resultou num melhor substrato para peptidases aspárticas. Além disto, foi
observado que a enzima também cliva a ligação Phe-Ser, local de clivagem da calicreína
tissular (Esquema 1).
PIMENTA et al (2001) utilizaram várias modificações em torno da sequência do sítio
reativo da calistatina Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp e concluíram que a
posição P
2
foi o resíduo mais crítico para a hidrólise do substrato pela catepsina D. Ainda
neste estudo a eficiência catalítica da catepsina D em hidrolisar os substratos entre os resíduos
de Phe-Phe foi significativamente aumentada pelo alongamento do peptídeo na extremidade
C-terminal, o que indicou que além da posição P
2
, outras interações do sítio ativo estendido
da catepsina D com o sítio reativo da calistatina deveriam compensar, por exemplo, o efeito
desfavorável do resíduo de lisina na posição P
2
. Nossos resultados mostraram que todas as
enzimas hidrolisam todos os substratos utilizados, sendo que a clivagem ocorreu entre os
aminoácidos Phe-Phe, assim como observado na literatura (DUNN et al, 1986; FILIPPOVA
et al, 1996; PIMENTA et al, 2000; GOMES et al, 2003). Em nossos estudos observamos
Lys
Phe Phe Ser Ala
Catepsina D
Calicreína
humana
Esquema 1. Locais de clivagem da calistatina humana pela catepsina D humana e pela calicreína humana.
Esta seqüência está localizada em ....Thr-Phe-Ala-Lys-Phe
387
-Phe
388
-Ser
389
-Ala-Gln-Thr-Asn-Arg-His....
da calistatina humana. Modificado de CHAO, CHAI, CHAO (1996).
76
ainda que as atividades enzimáticas foram totalmente inibidas pela pepstatina A, reforçando
que esta atividade foi decorrente da ação de peptidases aspárticas.
A substituição do resíduo de lisina na posição P
2
por resíduos de serina e alanina não
afetou significativamente a atividade hidrolítica, como observado pelos valores das constantes
catalíticas (k
cat
/K
m
). Entretanto a presença de um resíduo de leucina nesta posição reduziu
significativamente a atividade catalítica para todas as enzimas utilizadas. Esses dados
mostram que resíduos hidrofóbicos na posição P
2
interferem na interação da enzima com o
substrato. Como se pode observar nos dados cinéticos, os valores de k
cat
/K
m
para este
substrato foram, em média, de três a cinco vezes menores do que os valores obtidos para os
outros substratos.
Nos dados obtidos por PIMENTA et al (2001), o resíduo de leucina na posição P
2
favoreceu a atividade catalítica da catepsina D em relação àquele peptídeo que continha o
resíduo de lisina na mesma posição, o que não foi observado em nossos experimentos, tanto
para a catepsina D, quanto para as outras peptidases. SCARBOROUGH et al (1993)
utilizando sequências em torno de Lys-Pro-Ala-Lys-Phe*Nph-Arg-Leu, observaram que
resíduos hidrofóbicos em P
2
melhoraram a atividade catalítica da catepsina D. Por outro lado,
os substratos utilizados por estes autores continham outros resíduos de aminoácidos que
poderiam interagir com os subsítios da enzima, visto que a catepsina D apresenta uma fenda
catalítica estendida e extremamente hidrofóbica quando comparada com outras aspartil
peptidases.
As enzimas gastricsina, pepsina e uropepsina mostraram melhores constantes cinéticas
para a hidrólise do substrato com a sequência original da calistatina (lisina na posição P
2
),
sendo a gastricsina a enzima que mostrou melhor eficiência catalítica. A substituição em P
2
por alanina resultou numa discreta diminuição de atividade catalítica para estas enzimas.
Entretanto, esta modificação foi mais favorável à ação da catepsina D, superando a atividade
77
catalítica observada sobre o substrato com a sequência original. Este achado está em
concordância com os dados de PIMENTA et al (2001) que mostraram que o resíduo de
alanina na posição P
2
favoreceu a atividade catalítica.
Diante dos resultados obtidos em nosso trabalho e naqueles descritos na literatura é
nítida a preferência de aspartil peptidases pela hidrólise de ligações entre resíduos
hidrofóbicos. Pela análise dos parâmetros cinéticos obtidos com a hidrólise dos substratos, é
evidente que modificações na posição P
2
do centro ativo da calistatina desempenham papéis
importantes na interação e no processo catalítico das peptidases aspárticas. A influência do
caráter do resíduo substituído para o resíduo hidrofóbico foi a mesma para todas as enzimas
utilizadas, porém quanto aos outros resíduos isso não foi observado, apesar das enzimas
pertencerem à mesma classe.
Os dados apresentados aqui servem para auxiliar nosso entendimento das interações
proteína-ligante e sua especificidade de tais interações, quando observadas por meio de
substituições de resíduos, tanto nos substratos quanto na molécula da enzima, em estudos
estruturais (BALDWIN et al, 1993) e cinéticos (SCARBOROUGH et al, 1993). Isto poderia
auxiliar no desenvolvimento de inibidores específicos que podem ter utilidade em análises
laboratoriais e até para uso in vivo. Visto que as peptidases aspárticas desempenham papel
crucial em várias doenças, sendo que o desenvolvimento de compostos terapêuticos
específicos (inibidores) e a síntese de compostos úteis (substratos) no diagnóstico clínico-
laboratorial trazem perspectivas para o tratamento de algumas condições patológicas.
Do ponto de vista fisiológico, apesar das aspartil peptidases e das calicreínas
apresentarem atividades máximas em pHs distintos, há concomitância da ação destas enzimas
em determinadas faixas de pH, o que permitiria uma ação simultânea potencializando a ação
da calicreína.
78
7. CONCLUSÕES
1. Quatro peptidases aspárticas foram purificadas a partir do baço humano (catepsina D),
do estômago e suco gástrico humanos (pepsina e gastricsina, respectivamente) e da urina
humana (uropepsina) através de etapas cromatográficas;
2 A incubação das peptidases aspárticas humanas com peptídeos sintéticos com
supressão intramolecular de fluorescência baseados na seqüência do centro reativo da
calistatina humana mostrou que as enzimas hidrolisam esta seqüência entre resíduos de
fenilalanina;
3. Os parâmetros cinéticos obtidos mostraram que o substrato com modificação de lisina
para leucina na posição P
2
, foi o pior para todas as enzimas, apresentando a menor relação
k
cat
/K
m.
O substrato com a sequência original apresentou o melhor k
cat
/K
m
para a pepsina,
gastricsina e uropepsina. No entanto, para a catepsina D, o melhor k
cat
/K
m
foi observado no
substrato com modificação de lisina para alanina na posição P
2
;
4. Visto a importância das aspartil peptidases em algumas condições patológicas, estudos
estruturais e cinéticos auxiliam no entendimento das interações proteína-ligante e suas
especificidades, o que pode resultar no desenvolvimento de compostos terapêuticos
específicos e a síntese de compostos úteis no diagnóstico clínico-laboratorial.
79
8. RESUMO
As enzimas catepsina D, pepsina, gastricsina e uropepsina pertencem ao grupo das
peptidases aspárticas, as quais têm um centro ativo altamente conservado com dois resíduos
de ácido aspártico que participam do mecanismo catalítico. Essas peptidases são sintetizadas
na forma de pró-enzimas, atuam em pH ácido, clivam entre dois aminoácidos hidrofóbicos e
têm sua atividade anulada pela pepstatina A.
A calistatina é um inibidor de serino-peptidases (serpina) que forma complexos com a
calicreína tissular e inibe sua atividade. A calistatina humana tem dois resíduos de
aminoácidos hidrofóbicos (Phe-Phe) em seu centro reativo e isto sugere que a calistatina
possa ser clivada, neste local, pelas peptidases aspárticas envolvidas no estudo.
Neste estudo as quatro enzimas forma purificadas e analisadas suas atividades sobre
substratos sintéticos com a seqüência do centro reativo da calistatina Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp e com três substratos com modificações na posição P
2
: Abz-Ala-Ile-
Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp e Abz-Ala-
Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp. Os parâmetros cinéticos obtidos com a hidrólise dos
substratos demonstraram que para todas as enzimas o substrato com menor valor de k
cat
/K
m
foi aquele que apresentou a mudança de lisina para leucina. Já o substrato com maior relação
k
cat
/K
m
para a catepsina D foi o que continha a substituição de lisina para alanina. Para as
outras enzimas, gastricsina, pepsina e uropepsina o substrato com maior valor de k
cat
/K
m
foi o
que apresentou a sequência original (lisina na posição P
2
).
Em conclusão, pela análise dos parâmetros cinéticos obtidos com a hidrólise dos
substratos, é evidente que modificações na posição P
2
do centro ativo da calistatina
desempenham papéis importantes na interação e no processo catalítico das peptidases
aspárticas. Além disso, a ação destas enzimas clivando e inativando a calistatina poderia
resultar em uma maior ação da calicreína tissular.
80
9. ABSTRACT
The enzymes catepsin D, gastricsin, pepsin and uropepsin belong to the aspartic
peptidase family that has a highly conserved active center with two residues of aspartic acid
that participate of the catalytic mechanism. These peptidases are synthesized as pro-enzymes,
exert their actions in acid pH, cleave peptic bonds between hydrophobic amino acid residues
and are inhibited by Pepstatin A.
Kallistatin is a serine peptidase inhibitor (serpin) that forms complexes with tissue
kallikreins and inhibits its activity. Human kallistatin has two hydrophobic residues of amino
acid (Phe-Phe) in its reactive center loop and this suggests that kallistatin may be cleaved by
aspartic peptidases in this place.
In this study we purified the four enzymes and analyzed its activity on synthetic
substrates with the sequence of the reactive center loop of kallistatin Abz-Ala-Ile-Lys-Phe-
Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp and three substrates with modifications at the P
2
position: Abz-Ala-
Ile-Ala-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp, Abz-Ala-Ile-Leu-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp e Abz-
Ala-Ile-Ser-Phe-Phe-Ser-Arg-Gln-Eddnp. The kinetic parameters obtained with the hydrolysis
of the substrates showed that substrate with the lower value of k
cat
/K
m
for all enzymes was
those with modification lysine to leucine. The substrate with highest k
cat
/K
m
for the catepsin D
was that contains the modification lysine to alanine. For the other enzymes, gastricsin, pepsin
and uropepsin was the substrate with the original sequence (lysine at P
2
position).
In conclusion, it was clear from the analysis of the kinetic parameters for hydrolysis of
these substrates that the modifications at the P
2
position play significant roles in the
interaction and catalytic processes of aspartic peptidases on the kallistatin reactive-center
loop. Moreover, purified human enzymes interact cleaving and inactivating kallistatin and
possibly help kallikrein in your best function.
81
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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70. Spyratos F., Maudelonde T., Brouillet J.P., Brunet M., Defrenne A., Andrieu C.,
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76. Ten Dam, M.A.G.J.; Zwiers, A.; Crusius, J.B.A.; Pals, G.; Van Kamp, G.J.;
Meuwissen, S.G.M.; Donker, A.J.M.; Tem Kate, R. W. Tubular reabsorption of
pepsinogen isozymogens in man studied by the inhibition of tubular protein
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77. Ten Kate, R.W.; Zwiers, A.; Moons, W.M.; Slegers, J.F.; Donker, A.J.; Meuwissen,
S.G. Handling of human pepsinogens by the isolated rat kidney: evidence for a high
glomerular sieving coefficient. Renal Physiology and Biochemistry, v. 12, n. 1, p.
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78. Ten Kate, R.W., Pals G., Pronk, J.C., Bank, R.A., Eriksson, A.W., Donker, A.J.M.,
Meuwissen, G.M. Renal handling of pepsinogens A and C in man. Clinical Science,
v. 75, p. 649-54, (1988)
79. Teodoro, L.G.V.L. Purificação e caracterização de uma cininogenase ácida na
urina humana. 1999. 83 f. Dissertação (Mestrado em Patologia, Área de
Concentração Patologia Clínica) – Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro,
Uberaba (1999)
80. Thongboonkerd, V.; Gozal, E.; Sachleben, L.R.; Arthur, J.M.; Pierce, W.M.; Cai, J.;
Chão, J.; Bader, M.; Pesquero, J.B.; Gozal, D.; Klein, J.B. Proteomic analisys reveals
alterations in the renal kallikrein pathway during hypoxia-induced hypertension. The
Journal of Biological Chemistry, v. 277, p. 34708-34716 (2002)
88
81. Thorpe S.M., Rochefort H., Garcia M., Freiss G., Christensen I.J., Khalaf S., Paolucci
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Biophysical Methods, v. 9, n. 2, p. 171-179 (1984)
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of tissue kallikrein and kallistatin in human blood vessels. Journal of Histochemistry
and Cytochemistry, v. 47, p. 221-228 (1999)
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87. Yamamoto K. Cathepsin E and cathepsin D: biosynthesis, processing and subcellular
location. Advances in Experimental Medicine and Biology, v. 362, p. 223-9 (1995)
88. Yonezawa S., Takahashi T., Wang X.J., Wong R.N., Hartsuck J.A., Tang J. Structures
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Chemistry, v. 263 (31), p. 16504-16511 (1988)
89. Zaidi N., Maurer A., Nieke S., Kalbacher H. Cathepsin D: a cellular roadmap.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 376 (1), p. 5-9 (2008)
89
11. ANEXOS
11.1. ANEXO 1
- Número de protocolo de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) para a enzima
catepsina D humana: 324; data 21/10/2002;
- Número de protocolo de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) para a enzima
gastricsina humana: 0126; data 27/10/2000;
- Número de protocolo de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) para a enzima
pepsina humana: 023; data 24/03/2000;
- Número de protocolo de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) para a enzima
uropepsina humana: 776; data 21/03/2006.
90
11.2. ANEXO 2
Reagentes utilizados para determinação da concentração de proteínas pelo método de Lowry
(LOWRY et al, 1951)
Solução de trabalho:
Na
2
CO
3
(Ecibra) a 2% em NaOH (Synth)1,5 M...... 14,7 mL
C
4
H
4
KNaO
6
.4H
2
O (Merck)..................................... 0,15 mL
CuSO
4
.5H
2
O (Reagen) a 0,64% .............................. 0,15 mL
91
11.3. ANEXO 3.
Preparo dos reagentes e dos géis de poliacrilamida
Os géis foram polimerizados a partir da mistura adequada das seguintes soluções:
Solução de acrilamida:
Acrilamida (Merck)................................. 30,0 g
Bis-acrilamida (Sigma) ........................... 0,8 g
H
2
O deionizada q.s.p............................... 100 mL
Solução de dodecil sulfato de sódio a 2% (SDS):
SDS (Sigma)............................................ 2,0 g
H
2
O deionizada q.s.p............................... 100 mL
Solução de dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS):
SDS (Sigma)............................................ 10,0 g
H
2
O deionizada q.s.p............................... 100 mL
Solução de persulfato de amônio 10 % (PSA):
PSA (Sigma)............................................ 0,1 g
H
2
O deionizada q.s.p............................... 1,0 mL
(Preparado no momento do uso)
N-N-N-N-tetrametiletilenodiamina (TEMED) (Bio-Rad) Usado puro-10,0 µL
Gel de separação (13%)
Solução de acrilamida.............................................. 13 mL
Tampão tris-HCl (Merck) 0,9 M pH 8.8.................. 13 mL
H
2
O deionizada........................................................ 2 mL
SDS 2% (Sigma)...................................................... 1,5 ml
TEMED (Bio Rad)................................................... 10 µL
Persulfato de amônio (Bio Rad) 10 %..................... 0,15 mL
Gel de Concentração
Após a polimerização do gel de separação, foi preparado o gel de concentração:
Solução de acrilamida.............................................. 1,75 mL
Tampão tris-HCl (Merck) 0,5 M pH 6,8.................. 8 mL
H
2
O deionizada........................................................ 1,45 mL
SDS (Sigma) 10%.................................................... 0,1 mL
TEMED (Bio Rad)................................................... 10 µL
Persulfato de amônio (Bio Rad) 10%...................... 0,05 mL
92
Tampões utilizados
Tampão da amostra
Tampão tris-HCl (Merck) 2 M, pH 6,8....................................... 0,10 mL
Azul de bromofenol (Merck) 0,05% em água deionizada.......... 0,12 mL
Glicerol 60% (Reagen) ............................................................... 1,0 mL
β-Mercaptoetanol (Merck).......................................................... 0,3 mL
SDS (Sigma) 10%....................................................................... 0,6 mL
Tampão de corrida
Tris-hidroximetilaminometano (Merck).................. 3,02 g
Glicina (Reagen)...................................................... 14,4 g
SDS (Sigma)............................................................ 1 g
H
2
O deionizada q.s.p ............................................... 1000 mL
Soluções utilizadas na coloração
Pré-fixador 1
Metanol (Merck)...................................................... 500 mL
Ácido acético (Reagen)............................................ 70 mL
H
2
O deionizada........................................................ 430 mL
Pré-fixador 2
Metanol (Merck)...................................................... 100 mL
Ácido acético (Reagen)............................................ 100 mL
H
2
O deionizada........................................................ 800 mL
Solução de prata amoniacal
(a). NaOH (Synth) 0,5 N.......................................... 5 mL
NH
4
OH (Reagen) 14,8 M ........................................ 0,7 mL
H
2
O deionizada........................................................ 380 mL
(b). Nitrato de prata (Merck) ................................... 0,1 g
H
2
O deionizada........................................................ 20 mL
A solução (b) foi lentamente adicionada à solução (a). Caso ocorresse precipitação
durante a adição da solução (b), adicionava-se hidróxido de amônia puro lentamente até o
desaparecimento do precipitado. Este procedimento foi repetido até a adição de toda a solução
(b).
93
Solução reveladora
H
2
O deionizada........................................................ 100 mL
Formaldeído 37% (Merck) ...................................... 100 µL
Ácido cítrico 2,3 M (Qeel)....................................... 25 µL
Solução inativadora
H
2
O deionizada........................................................ 100 mL
Ácido acético (Reagen)............................................ 1 mL
Solução de secagem do gel
Glicerol (Merck)...................................................... 1 mL
Ácido acético (Reagen)............................................ 10 mL
Metanol (Merck)...................................................... 40 mL
H
2
O deionizada q.s.p ............................................... 100 mL
94
11.4. ANEXO 4
Obtenção da hemoglobina bovina
Sangue bovino foi colhido a vácuo em frascos contendo solução anticoagulante na
proporção de 100 mL de solução para 300 mL de sangue. A solução anticoagulante foi
preparada da seguinte maneira:
Ácido cítrico (Qeel)................................................. 0,47 g
Citrato de sódio (Mallinckrodt) ............................... 1.32 g
Glicose (Reagen) ..................................................... 1,47 g
H
2
O deionizada q.s.p ............................................... 100 mL
Assim que o sangue foi colhido o conteúdo dos frascos foi misturado e centrifugado a
1.207 x g durante 30 minutos a 4
o
C em centrífuga preparativa refrigerada. O sobrenadante foi
retirado e o sedimento lavado com solução de NaCl 0,9%, centrifugado a 1.207 G durante 30
minutos a 4
o
C, quantas vezes fosse necessário para que o sobrenadante se mostrasse límpido e
incolor. Foi feita hemólise do sedimento com água deionizada a 4°C e o material obtido,
constituído basicamente de hemoglobina foi congelado e liofilizado em liofilizador Edwards
(modelo L5KR). A hemoglobina obtida foi preparada na concentração de 8% em água
deionizada para uso em testes de atividade proteolítica.
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