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QUALIDADE E IDENTIDADE DAS CACHAÇAS PRODUZIDAS NA
REGIÃO NORTE FLUMINENSE – RJ
LEANDRO MARELLI DE SOUZA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
NOVEMBRO/2008
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QUALIDADE E IDENTIDADE DAS CACHAÇAS PRODUZIDAS NA
REGIÃO NORTE FLUMINENSE – RJ
LEANDRO MARELLI DE SOUZA
“Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Produção Vegetal”
Orientadora: Karla Silva Ferreira
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
NOVEMBRO DE 2008
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QUALIDADE E IDENTIDADE DAS CACHAÇAS PRODUZIDAS NA
REGIÃO NORTE FLUMINENSE – RJ
LEANDRO MARELLI DE SOUZA
“Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Produção Vegetal”
Aprovada em 28 de novembro de 2008.
Comissão Examinadora:
Prof. José Benício Paes Chaves. Ph.D., Food Science – UFV
Prof. Luís César Passoni. D.Sc., Química – UENF
Prof
a
. Meire Lélis Leal Martins. Ph.D., Molecular Biology and Biotechnology – UENF
Prof
a
. Karla Silva Ferreira. D.Sc., Ciências e Tecnologia de Alimentos – UENF
(Orientadora)
iii
Dedico o presente trabalho aos
pingófilos, cachaçólogos e a todos que
apreciam a arte de viver e degustar
cachaça.
iv
A cachaça
A primeira queima a goela
Desce forte e vai rasgando,
A segunda refestela
Desce fresca e deslizando.
Desde os tempos do império
Que ela é muito apreciada,
Pobre “bebe” sem mistério
O rico a “toma” velada.
Nas festas de “gente boa”
Quase não se fala nela,
Mas na “moita” a tal patroa
É chegada na “amarela”.
Não conheço um brasileiro,
Mesmo cheio de chilique,
Que ignore o santo cheiro
De uma pura de alambique.
Tome pura ou com raiz,
O importante é o ritual
De passar pelo o nariz
Benza a Deus e “desce o pau”.
A danada sempre agrada,
Seja pura ou caipirinha
Dentre a todas destiladas,
Aprecio a tal branquinha.
O sabor que arde e queima
Tem aroma original,
E apesar de tanta teima
É preferência nacional.
A lenda diz que a primeira
Foi Jesus quem produziu
O que me reforça a crença
De que Deus é do Brasil.
Luiz Ângelo Vilela Tannus.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Pai Celestial, único dono e criador do universo, capaz de glórias e
graças;
A Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), pela oportunidade
de realização, fornecimento de bolsa de estudos e infra-estrutura necessária para
a realização do curso e do trabalho ora apresentado;
A FAPERJ, pela concessão dos recursos financeiros indispensáveis ao
projeto;
Aos produtores de cachaça da região Norte Fluminense, em especial ao
Paulo Sérgio, Bozó e Demétrio, pela parceria neste trabalho de pesquisa;
À Professora Karla Silva Ferreira, pela confiança em mim depositada e
competência na orientação;
Aos professores Luís César Passoni e Meire Lélis Leal Martins
, pela
co-orientação e valiosas dicas;
Ao Professor José Tarcísio Lima Thiébaut, pelo apoio na área de
estatística;
Aos funcionários Paulo Sergio Oliveira de Castro e Valdinéia Estephanele
Pinto, pela indispensável ajuda por eles prestada;
A todos os colegas que angariei no período do curso;
A Camila Aparecida Cardoso Podestá, amor da minha vida;
Aos meus amigos de muitas datas Lazaro, Lorena, Simone, Rosemary,
Prudenciana (Pupu), Ângela, Fernanda, Victor, e todos que acreditaram e
acreditam na minha amizade e companheirismo;
vi
Aos meus pais biológicos, João Batista de Souza e Elizabete Marelli de
Souza, pois nasci de bons pais;
Aos meus pais adotivos, Antônio Luiz Rodrigues Fingolo e Maria Lúcia
Pessanha Santos Fingolo, por tudo que fizeram e fazem por mim;
Aos meus irmãos, Luciano Marelli de Souza e Lídia Marelli de Souza;
Ao meu filho Vitor Monteiro de Souza, por ser um ótimo filho e um prêmio
para mim;
A Maurino Vasconcelos e Wilma Vasconcelos, pelas colaborações nos
momentos difíceis e o apoio no dia a dia, por mim e pela minha família;
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho.
vii
SUMÁRIO
INDICE DE TABELAS .......................................................................... X
INDICE DE FIGURAS ........................................................................ XII
RESUMO .......................................................................................... XIV
ABSTRACT ...................................................................................... XVII
1. INTRODUÇÃO .................................................................................. 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................. 4
2.1 Produção de cachaça
........................................................ 7
2.1.1 Matéria-prima ........................................................... 9
2.1.2 Colheita .................................................................. 13
2.1.3 Mo
agem, decantação e ajuste do °Brix ................. 14
2.1.4 Fermentação do mosto ........................................... 15
2.1.4.1 Propagação do fermento ............................... 23
2.1.4.2 Saccharomyces cerevisiae
na fermentação
alcoólica ............................................................................. 27
2.1.4.3 Processo fermentativo ................................... 29
2.1.5 Destilação do vinho ................................................ 29
2.1.6 Pós-
destilação do vinho ......................................... 30
2.2 Padrões de identidade e qualidade de aguardente ......... 32
3.
TRABALHOS ................................................................................. 36
TEORES DE COMPOSTOS ORGÂNICOS EM CACHAÇAS
PRODUZIDAS NA REGIÃO NORTE FLUMINENS -
RJ .................... 36
RESUMO .....................
.......................................................... 37
ABSTRACT ............................................................................ 37
viii
INTRODUÇÃO ...................................................................... 38
PARTE EXPERIMENTAL ...................................................... 39
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................. 44
CONCLUSÕES ..................................................................... 51
AGRADECIMENTOS ............................................................ 52
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................... 52
TEORES DE COBRE, ZINCO, FERRO, SÓDIO E POTÁSSIO EM
CACHAÇAS ........................................................................................ 54
RESUMO .............................................................................. 55
ABSTRACT ........................................................................... 55
INTRODUÇÃO ...................................................................... 56
MATERIAL E MÉTODOS ...................................................... 57
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................. 58
CONCLUSÕES ..................................................................... 62
AGRADECIMENTOS ............................................................ 62
REFERÊNCIAS ..................................................................... 63
COMPONENTES ORGÂNICOS E INORGÂNICOS AO LONGO DA
DESTILAÇÃO DO VINHO DO CALDO-DE-
CANA PARA PRODUÇÃO DE
CACHAÇA .......................................................................................... 65
RESUMO .............................................................................. 66
ABSTRACT ........................................................................... 66
INTRODUÇÃO ......................................................... 67
MATERIAL E MÉTODOS ........................................... 69
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................. 76
CONCLUSÕES ..................................................................... 88
AGRADECIMENTOS ............................................................ 89
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................... 89
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE LEVEDURAS DE ALAMBIQUES DO
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES ......................... 92
MATERIAL E MÉTODOS ...................................................... 93
ABSTRACT ........................................................................... 94
INTRODUÇÃO ...................................................................... 95
MATERIAL E MÉTODOS ...................................................... 96
RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................... 101
ix
CONCLUSÕES ................................................................. 110
AGRADECIMENTOS ........................................................ 110
REFERÊNCIAS ................................................................. 110
4. RESUMOS E CONCLUSÕES ................................................... 112
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................... 115
x
ÍNDICE DE TABELAS
TABELA – Diferença entre os períodos de maturação
de diferentes
variedades de cana de açúcar ......................................................... 11
TABELA – Principais vantagens da cana-de-ano-e-meio e
cana-de-ano ...................................................................................... 13
TABELA – Padrões de identidade da aguardente de cana-de-açúcar e da
cachaça ............................................................................... 33
TABELA – Limite para os congêneres estabelecidos pela legislação
brasileira .............................................................................. 33
TABELA – Limites máximos permitidos de contaminantes na cachaça
estabelecidos pela legislação brasileira .............................. 34
TABELA – Relação das amostras de cachaça analisadas, respectivas
indústrias e o critério de diferenciação ................................ 40
TABELA – Limites máximos e mínimos, composição físico-química, média
e desvio padrão dos componentes analisados ................... 44
TABELA – Número de amostras de cachaça das 30 analisadas que não
atendem aos parâmetros de identidade e qualidade proposto
pela Instrução Normativa N° 13 .......................................... 45
TABELA – Teores de minerais nas amostras de cachaça (mg.L
-1
de
cachaça) e o critério de diferenciação ................................. 59
TABELA – Caracterização morfológica das leveduras selecionadas e
avaliadas em meio sólido YP ............................................ 105
xi
TABELA – Crescimento das leveduras selecionadas em meio de cultura
contendo diferentes fontes de carbono na concentração
de 2 g% ........................................................................... 106
TABELA – Capacidade fermentativa das leveduras selecionadas em meio
de cultura líquido YP, contendo diferentes fontes de carbono
na concentração de 2 g% ............................................... 108
TABELA – Assimilação de fontes de nitrogênio pelas leveduras
estudadas ........................................................................ 108
TABELA – Crescimento das leveduras em diferentes temperaturas em
meio YP ........................................................................... 109
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA – Fluxograma do processo de produção de cachaça artesanal . 8
FIGURA – Colmos de cana-de-açúcar ................................................... 9
FIGURA – Estrutura química da molécula de sacarose ....................... 10
FIGURA – Ciclo de desenvolvimento da cana-de-ano-e-meio ............. 12
FIGURA – Ciclo de desenvolvimento da cana-de-ano ......................... 12
FIGURA – Esquema simplificado da formação de compostos em
processos fermentativos ..................................................... 16
FIGURA – Esquema da fermentação e da respiração ......................... 18
FIGURA – Vias básicas para a formação dos compostos do sabor durante
a fermentação ..................................................................... 19
FIGURA – Esquema de formação de alcoóis superiores nas leveduras
pela via de Ehrlich (catabólica) ........................................... 28
FIGURA – Cromatograma dos padrões obtidos por GC-FID em coluna
polar LM-100 ...................................................................... 42
FIGURA – Valores de grau alcoólico das diferentes amostras analisadas e
limite mínimo e máximo para um destilado ser considerado
cachaça, conforme Instrução Normativa N° 13 .................. 45
FIGURA – Estrutura química do furfural e do 5-hidroximetilfurfural ..... 47
FIGURA – Cromatograma típico de amostras de cachaça obtidos por GC-
FID em coluna polar LM-100 .............................................. 47
FIGURA – Alambique 1 ........................................................................ 70
FIGURA – Alambique 2 ........................................................................ 71
FIGURA – Alambique 3 ........................................................................ 72
xiii
FIGURA – Cromatograma dos padrões obtidos por GC-FID em coluna
polar LM-100 ...................................................................... 75
FIGURA – Cromatograma típico de amostra de cachaça obtidos por
GC-FID em coluna polar LM-100 ....................................... 77
FIGURA – Variação dos teores de acetaldeído durante a destilação .. 78
FIGURA – Variação dos teores de acetato de etila durante a destilação 79
FIGURA – Variação dos teores de 1-propanol durante a destilação ... 79
FIGURA – Variação dos teores de 1-butanol durante a destilação ...... 80
FIGURA – Variação dos teores de metanol durante a destilação ........ 81
FIGURA – Variação dos teores de etanol destilação............................ 82
FIGURA – Variação dos teores de iso-butanol durante a destilação ... 83
FIGURA – Variação dos teores de iso-amílico durante a destilação ... 83
FIGURA – Variação dos teores de 1-hexanol durante a destilação ..... 84
FIGURA – Variação dos teores de ácido acético durante a destilação 85
FIGURA – Variação dos teores de cobre durante a destilação ............ 87
FIGURA – Variação dos teores de zinco durante a destilação ............ 87
FIGURA – Variação dos teores de ferro durante a destilação ............. 88
FIGURA – Colônias de leveduras isoladas em meio sólido YP ......... 101
FIGURA – Crescimento da levedura isolada (por número) em meio Agar
Lisina (A) e Meio Agar YP (B) .......................................... 103
FIGURA – Porcentagem de leveduras isoladas crescidas em condição de
estresse ............................................................................ 104
xiv
RESUMO
SOUZA, LEANDRO MARELLI, Biólogo D.Sc.; Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro. Novembro de 2008, Qualidade e identidade das
cachaças produzidas na região Norte Fluminense – RJ; Professor Orientador:
Karla Silva Ferreira; Professor Conselheiro: Luís César Passoni e Meire Lélis Leal
Martins.
Este estudo foi dividido em quatro ensaios. Nos dois primeiros, fez-se a
quantificação dos compostos orgânicos etanol, metanol, 1-propanol, 1- butanol,
iso-butanol, álcool iso-amílico, acetato de etila, acetaldeído, ácido acético, furfural,
5-hidroximetilfurfural e acroleina, e dos minerais cobre, zinco, ferro, sódio e
potássio, em trinta amostras pertencentes a dezesseis produtores de cachaças
associados da Cooperativa dos Produtores de Cachaça e Derivados da Cana-de-
Açúcar do Norte Fluminense – COOPCANF, comparando os resultados com os
padrões de identidade e qualidade estabelecidos pela legislação vigente. Das
trinta amostras analisadas, 63,3% delas apresentaram não conformidade com a
legislação nacional em pelo menos um dos componentes orgânicos analisados.
Deste total, o grau alcoólico real, com 30,0% das amostras abaixo do mínimo
permitido, e a soma dos compostos 5-hidroximetilfurfural e furfural, também com
30,0% das amostras acima do máximo permitido, foram os parâmetros com
maiores índices de irregularidades. O ácido acético e 1-butanol apresentaram
teores acima do máximo permitido em 13,3% e 10,0% das amostras,
respectivamente. Os compostos metanol e acroleína, assim como, álcoois
superiores, não atenderam à conformidade em 3,3% das amostras. Todas as
amostras apresentam níveis de acetaldeído e acetato de etila dentro do limite
permitido pela legislação. Já para os componentes inorgânicos, 46,7% estavam
xv
com teores de cobre acima do limite máximo permitido. Houve presença de zinco
em todas as amostras analisadas e 75,0% apresentaram ferro. Aproximadamente,
60,0% continham sódio e em 25,0% detectou-se potássio. Em um terceiro ensaio,
com a finalidade de conhecer a composição química do destilado durante a
destilação do vinho da cana-de-açúcar, foram quantificados diversos compostos
em diferentes frações do destilado coletadas ao longo de 160 minutos de
destilação. Os resultados indicam que os teores de acetaldeído, acetato de etila,
1-propanol e 1-butanol são mais elevados nos primeiros momentos da destilação.
O metanol foi detectado em (78 ± 4,9)% das amostras estudadas, com presença
distribuídas de forma linear ao longo de todo o período de destilação. Já os
compostos etanol, iso-butanol e álcool iso-amílico possuem teores menores na
fase final da destilação, com uma queda linear significativa ao longo do tempo. De
forma inversa, os teores de 1-hexanol e ácido acético foram mais elevados na
fase final da destilação. Os elementos cobre, zinco e ferro foram detectados em
todas as frações estudadas, com valores médios variando, em mg por litro de
amostra, entre 3,55 a 54,66 para cobre, 0,07 a 0,51 para zinco e 0,05 a 0,70 para
ferro. No quarto ensaio, um estudo foi realizado com o objetivo de isolar leveduras
nativas em mostos de fermentação de dois alambiques, a fim de selecionar
aquelas com propriedades apropriadas para a produção de cachaça. Das 130
colônias que foram isoladas, apenas 25 foram capazes de crescer em uma
concentração de etanol de 10,0%. Destas, 10 que apresentaram melhores
crescimentos, foram selecionadas e submetidas à caracterização morfológica e
bioquímica. Todas as seis colônias isoladas da destilaria BZ apresentaram
resultados incompatíveis com a espécie Saccharomyces cerevisiae, de acordo
com a fonte de carbono estudada, enquanto que todas as quatro colônias da
destilaria PS (PS13, PS36, PS43 e PS46) apresentaram resultados, que foram
compatíveis com a espécie Saccharomyces cerevisiae. Entretanto, de acordo com
os resultados do teste de fermentação de carboidratos, das dez colônias
estudadas, apenas as colônias PS36, PS43 e BZ32 apresentaram características
compatíveis com a espécie Saccharomyces cerevisiae. Em relação ao teste de
assimilação de nitrogênio, todas as leveduras avaliadas apresentaram
características similares a S. cerevisiae. Com base nestes resultados, concluiu-se
que apenas duas estirpes isoladas (PS36 e PS43) apresentaram resultados
bioquímicos compatíveis com a espécie S. cerevisiae e para uma identificação
xvi
mais precisa das estirpes selecionadas é necessário aumentar a quantidade de
fontes de carbono estudas, ou utilizar técnicas de biologia molecular.
xvii
ABSTRACT
SOUZA, LEANDRO MARELLI, Biólogo D.Sc.; Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro. Novembro 2008. Quality and identity of the “cachaça”
(sugar cane spirit) produced in the North part of Rio de Janeiro state. Professor
Adviser: Karla Silva Ferreira. Committee members: Luís César Passoni e Meire
Lélis Leal Martins.
This study was divided in four rehearsals. In the first two, it was made the
quantification of the compositions organic ethyl alcohol, methyl alcohol, n-propyl
alcohol, n-butyl alcohol, isobutyl alcohol, isoamyl alcohol (mixture of 2-methyl-butyl
and 3-methyl-butyl), ethyl acetate, acetaldehyde, acetic acid, furfural, 5-hydroxy-
methylfurfural and acrolein, and of the minerals copper, zinc, iron, sodium and
potassium, in thirty samples belonging to sixteen producing of “cachaça” (sugar
cane spirit) associated of the Cooperative of the Producing of “Cachaça” and
Derived of the Sugar-cane of the North part of Rio de Janeiro state–COOPCANF,
comparing the results with the identity patterns and quality established by the
effective legislation. Of the thirty analyzed samples, 63.3% of them presented no
conformity with the national legislation in at least one of the analyzed organic
components. Of this total one, the real alcoholic degree, with 30.0% of the
samples below the allowed minimum, and the sum of the compositions 5-hydroxy-
methylfurfural and furfural, also with 30.0% of the samples above the allowed
maximum, were the parameters with larger indexes of irregularities. The acetic
acid and n-butyl alcohol presented contents above the maximum allowed in 13.3%
and 10.0% of the samples, respectively. The compositions methyl alcohol and
acrolein, as well as, superior alcohols, didn't assist to the conformity in 3.3% of the
samples. All of the samples present acetaldehyde levels and ethyl acetate inside
xviii
of the limit allowed by the legislation. Already for the inorganic components, 46.7%
were with copper contents above the allowed maximum limit. There was presence
of zinc in all of the analyzed samples and 75.0% presented iron. Approximately,
60.0% contained sodium and 25.0% potassium was detected. In a third rehearsal,
with the purpose of knowing the chemical composition of the distilled during the
distillation of the wine of the sugar-cane, were quantified several composed in
different fractions of the distilled collected along 160 minutes of distillation. The
results indicate that the acetaldehyde contents, ethyl acetate, n-propyl alcohol and
n-butyl alcohol are higher in the first moments of the distillation. The methyl
alcohol was detected in (78 ± 4.9)% of the studied samples, with distributed
presence in a lineal way along the whole distillation period. Already the
compositions ethyl alcohol, isobutyl alcohol and isoamyl alcohol (mixture of 2-
methyl-butyl and 3-methyl-butyl) possess smaller contents in the final phase of the
distillation, with a significant lineal fall along the time. Of inverse form, the contents
of n-hexanol alcohol and acetic acid were higher in the final phase of the
distillation. The elements copper, zinc and iron were detected in all of the studied
fractions, with medium values varying, in mg for liter of sample, between 3.55 to
54.66 for copper, 0.07 to 0.51 for zinc and 0.05 to 0.70 for iron. In the fourth
rehearsal, a study was accomplished with the objective of isolating native yeasts in
musts of fermentation of two stills, in order to select those with appropriate
properties for the production of white rum. Of the 130 colonies that were isolated,
only 25 were capable to grow in a concentration of ethyl alcohol of 10.0%. Of
these, 10 that presented better growths, were selected and submitted to the
morphologic and biochemical characterization. All the six isolated colonies of the
distillery BZ presented incompatible results with the species Saccharomyces
cerevisiae, in agreement with the source of carbon studied, while all the four
colonies of the distillery PS (PS13, PS36, PS43 and PS46) presented results,
which were compatible with the species Saccharomyces cerevisiae. However, in
agreement with the results of the test of carbohydrate fermentation, of the ten
studied colonies, just the colonies PS36, PS43 and BZ32 presented compatible
characteristics with the species Saccharomyces cerevisiae. In relation to the test
of assimilation of nitrogen, all of the appraised yeasts presented similar
characteristics to S. cerevisiae. With base in these results, it was ended that only
two isolated ancestries (PS36 and PS43) presented compatible biochemical
xix
results with the species S. cerevisiae and for a more necessary identification of the
selected ancestries it is necessary to increase the amount of sources of carbon
study, or to use techniques of molecular biology.
1
1. INTRODUÇÃO
Com o descobrimento do Brasil, Portugal trouxe a cana-de-açúcar,
originária da Ásia Meridional, sendo introduzida em solos brasileiros, entre 1532 e
1548. O solo fértil e o clima quente e úmido permitiram o rápido desenvolvimento
da cultura, marcando o início de uma atividade que iria se transformar em grande
fonte de riqueza para Portugal (Mutton e Mutton, 2005).
No princípio, a cana-de-açúcar era a matéria-prima para a produção do
açúcar, melado, rapadura e melaço. O açúcar foi a base da economia e do
comércio internacional brasileiro por muito tempo, caracterizando um dos ciclos
de desenvolvimento do País: o ciclo da cana-de-açúcar (Maia e Campelo, 2006).
O caldo-de-cana que “azedava” (vinho da cana) não servia para a produção de
açúcar (Mutton e Mutton, 2005), porém, quando submetido à destilação,
resulta em um líquido transparente, brilhante e ardente, se ingerido. No principio
foi chamado água ardente e depois, pinga, cana, caninha e, finalmente,
cachaça. Bebida dos mestiços, negros e índios, dos brancos, dos primeiros
brasileiros (Maia e Campelo, 2006).
A cachaça reina como nome típico e exclusivo da bebida nacional, única, feita no
Brasil, com graduação alcoólica de 38 a 48 graus e características sensoriais
peculiares (Brasil, 2005).
Atualmente, o mercado brasileiro movimenta um volume de,
aproximadamente, 1,4 bilhões de litros de cachaça (MAPA, 2008). Em 2007 foram
exportados 9,0 milhões de litros, gerando uma arrecadação de, aproximadamente
13,8 milhões de dólares (BRASIL, 2008).
2
No Brasil, esse destilado – que pode ser produzido artesanalmente ou em
escala industrial – ocupa a segunda posição da bebida alcoólica mais apreciada,
ficando atrás, somente, da cerveja. O PIB do setor é de cerca de US$ 500
milhões, estima-se que existam mais de quatro mil marcas registradas no
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA, e mais de 30 mil
produtores em todo país, gerando aproximadamente 400 mil empregos diretos e
indiretos (MAPA, 2008).
Como conseqüência do aumento da produção, surgiu uma demanda
técnica e científica, desde a da cultura da cana-de-açúcar até o engarrafamento
da cachaça. Muitos estudos e pesquisas foram feitos na área de fermentação do
caldo de cana-de-açúcar e muitos foram os conhecimentos adquiridos quanto à
extração do caldo, purificação, fermentação, desinfecção, técnicas de destilação,
busca de leveduras apropriadas e selecionadas (Lima, 2001).
As características fisiológicas das espécies de leveduras isoladas do
mosto fermentado têm grande relevância na compreensão dos mecanismos
envolvidos na colonização do mosto e na determinação das condições ótimas
para se manter uma fermentação saudável (Pataro et al., 2002). Dessa forma, a
seleção do fermento é considerada uma das medidas que podem contribuir para
melhoria do processo de fabricação de cachaça. O uso desta técnica, na maioria
das vezes, aumenta a produtividade do alambique e melhora a qualidade do
produto final, principalmente em relação aos teores de acidez e concentração de
alcoóis superiores, visto que as leveduras selecionadas podem apresentar maior
tolerância ao etanol, à temperatura e apresentar outras características positivas
para a fabricação da cachaça (Pataro et al., 2002).
Além da fermentação, a destilação é uma etapa importante na produção
de cachaça, sendo responsável por muitos dos caracteres sensoriais da bebida.
O mosto fermentado ou vinho possui uma composição bastante complexa. Sob o
ponto de vista da volatilidade, têm-se os constituintes de natureza volátil e fixa. Os
voláteis são representados pela água, álcool etílico, aldeídos, ésteres, alcoóis
superiores, ácido acético etc., enquanto que os fixos são extratos do mosto e as
células de leveduras e bactérias (SEBRAE, 2004).
Muitos dos componentes voláteis são oriundos de reações que ocorrem
durante os processos de fermentação, destilação e durante o armazenamento em
3
barris de madeira (Dias, 2006). Alguns destes são tóxicos, fazendo com que a
cachaça esteja submetida à legislação nacional (Brasil, 2005) de responsabilidade
do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Este estabelece
a composição química, os requisitos de qualidade e a concentração máxima
permitida de contaminantes, como cobre e carbamato de etila. Os padrões
de identidade e qualidade, estabelecidos pela legislação, com seus respectivos
limites têm a finalidade de padronizar a cachaça e proteger a saúde
do consumidor. Essa padronização é essencial para que a bebida atenda
aos padrões internacionais de qualidade e seja aceita pelo mercado
externo, proporcionando condições de abertura e manutenção do mercado de
exportação (Miranda et al., 2007).
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
Os dados históricos sobre bebidas alcoólicas são imprecisos, sendo difícil
saber quando foram obtidas as primeiras bebidas alcoólicas fermentadas, embora
haja citações sobre seu uso antes da era cristã. As descrições mais exatas são de
autores árabes, do século X, supondo-se que eles tenham criado os termos álcool
e alambique (Lima, 2001).
Os alambiques foram os primeiros aparelhos de destilação.
A denominação alambique é de origem grega, “Ambix”, e significa um
recipiente quadrado com uma pequena abertura. Os árabes alteraram o nome
para “Ambic” (Dias, 2006) e descobriram os equipamentos de destilação
semelhantes aos que são usados atualmente, com condensador, capitel e
caldeira, a alquitara (SEBRAE, 2001) e, provavelmente, sua cultura difundiu os
conhecimentos da destilação nas várias regiões da Europa (Crispim, 2000).
A destilação é uma técnica muito antiga e era utilizada, séculos antes de
Cristo, por chineses, indianos, egípcios, gregos e romanos. Nesta época, estas
culturas produziam um líquido, posteriormente denominado de álcool pelos
árabes, cuja finalidade era a produção de medicamentos e perfumes (Dias, 2006).
Os gregos registraram o processo de obtenção da ácqua ardens (a água que
pega fogo, água ardente, al kuhu). Na Idade Média, a água ardente foi
para as mãos dos alquimistas, que atribuíam a ela propriedades místico-
medicinais (SEBRAE, 2001). A origem da alquimia, no século III a.C., é atribuída
aos árabes (Maia e Campelo, 2006). Depois, foi levada para a Europa e difundiu-
se por todo o mundo. Transformou-se, assim, em água da vida (a Eau de Vie),
que passou a ser receitada como elixir da longevidade (SEBRAE, 2001).
5
Foi no século XVII, após a obtenção do primeiro destilado a partir de
grãos, que o consumo de bebidas destiladas passou a fazer parte dos hábitos do
homem (Cleto, 1997). Nesta época, na Europa, as bebidas destiladas passaram a
ser denominadas “espíritos”, sendo o álcool (produto de várias destilações do
vinho) o “spiritus mundi” (Maia e Campelo, 2006) e a tecnologia de produção das
bebidas alcoólicas espalhou-se. Na Itália, o destilado de uva fica conhecido como
grappa. Na Escócia, o Uísque, destilado da cevada sacarificada. Na Rússia, a
vodka, de centeio. Na China e Japão, o saque, de arroz. Em Portugal, destilado
do bagaço de uva, a bagaceira (Lima, 2001).
Com o descobrimento do Brasil, Portugal trouxe a cana-de-açúcar,
originária da Ásia Meridional entre 1532 e 1548, sendo introduzida em solos
brasileiros em 1532 por Martim Afonso de Souza, na Capitania de São Vicente,
atual cidade de São Paulo (Mutton e Mutton, 2005). Três anos depois, por Duarte
Coelho, na Capitania de Pernambuco e em 1540 por Pedro de Góes, na Capitania
da Paraíba do Sul, hoje região pertencente à cidade de Campos dos Goytacazes
e adjacências, Estado do Rio de Janeiro (Maia e Campelo, 2006). O solo fértil e o
clima quente e úmido permitiram o rápido desenvolvimento da cultura, marcando
o início de uma atividade que iria se transformar em grande fonte de riqueza para
Portugal (Mutton e Mutton, 2005).
A princípio, os portugueses tentaram utilizar a população nativa (“índios”)
no trabalho braçal. Como não obtiveram sucesso, decidiram recorrer à mão-de-
obra africana, já utilizada em outras colônias européias. Imensos contingentes de
africanos foram trazidos para o Brasil. O açúcar produzido por escravos nos
“engenhos” foi a base da economia e do comércio internacional brasileiro por
muito tempo, caracterizando um dos ciclos de desenvolvimento do País: o ciclo da
cana-de-açúcar (Maia e Campelo, 2006).
O caldo de cana que “azedava” (vinho da cana) não servia para a
produção de açúcar e era deixado nos cochos para o consumo dos animais. Após
algum tempo, este fermentava produzindo um líquido com cheiro diferente (aroma
frutado), que aguçou a curiosidade dos escravos (Mutton e Mutton, 2005). Estes,
logo perceberam que ao aroma agradável se associava um sabor etílico e um
efeito embriagador, permitindo por momentos, esquecer a nostalgia e as
condições subumanas em que viviam (Maia e Campelo, 2006).
6
O vinho fermentado, submetido à destilação, resultava em um líquido
transparente, brilhante e ardente, se ingerido. Considerando-se que parecia com
água, optou-se por chamá-la água ardente. Outro nome que lhe foi atribuído foi
cachaça, por ser originado do caldo fermentado da cana (cagaça), que em
espanhol era conhecida como cachaza. E, considerando-se que, durante a
destilação, o líquido pingava, surgiu o nome pinga. Tipicamente brasileira, é
conhecida, também, por abrideira, água que gato não bebe, água de setembro,
branquinha, caninha, mata bicho, meu consolo, perigosa, sumo de cana, teimosa,
uca, purinha, dentre muitos outros nomes. (Mutton e Mutton, 2005).
Dados históricos indicam o início da produção de cachaça no Brasil, por
volta de 1600, no município de Parati, Estado do Rio de Janeiro. Neste mesmo
período, a cachaça torna-se símbolo da resistência da cultura brasileira contra a
dominação portuguesa e, também, dos ideais inconfidentes, daí um dos motivos
do grande número de engenhos no Estado de Minas Gerais (MAPA, 2008). Mas,
somente por volta de 1876 é que o francês Luiz Pasteur demonstrou as bases
científicas do mecanismo da transformação dos açúcares em álcool sob a ação
da levedura, em ausência de oxigênio. Após os estudos de Pasteur, o processo
de fermentação conseguiu novos avanços quando Mëlle e Boinot (1930-40)
desenvolveram o processo revolucionário de recuperação do levedo por
centrifugação (Crispin, 2000).
As indústrias de cachaça até 1945 eram rurais e rudimentares, não
havendo padrões de qualidade do produto. A produção doméstica aumentou
bastante e desde então o processo de produção vem sendo aperfeiçoado e
melhorado, o que tem acarretado melhorias no rendimento, produtividade e
qualidade do produto final (Pataro et al., 2002). Hoje, a produção de cachaça
ocorre, principalmente, em micro, pequenas e médias empresas, que são grande
fonte geradora de empregos e renda (ABRABE, 2008).
O mercado de cachaça no Brasil tem passado por recentes
transformações, representada, principalmente, por uma certa elitização do
consumo e por uma busca crescente de qualidade (Estanislau et al., 2002).
Atualmente, o mercado brasileiro da cachaça movimenta um volume de,
aproximadamente, 1,4 bilhões de litros de cachaça (MAPA, 2008). Em 2007 foram
exportados 9,0 milhões de litros, gerando uma arrecadação de, aproximadamente
13,8 milhões de dólares (BRASIL, 2008).
7
No Brasil, esse destilado – que pode ser produzido artesanalmente ou
em escala industrial – ocupa a segunda posição da bebida alcoólica mais
apreciada, ficando atrás, somente, da cerveja. O PIB do setor é de cerca de US$
500 milhões, estima-se que existam mais de quatro mil marcas registradas no
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA, e mais de 30 mil
produtores em todo país, gerando, aproximadamente, 400 mil empregos diretos e
indiretos (MAPA, 2008).
Como conseqüência do aumento da produção, surgiu uma demanda
técnica e científica, desde a da cultura da cana-de-açúcar até o engarrafamento
da cachaça. Muitos estudos e pesquisas foram feitos na área de fermentação
do caldo de cana-de-açúcar e muitos foram os conhecimentos adquiridos
quanto à extração do caldo, purificação, fermentação, desinfecção, técnicas
de destilação, busca de leveduras apropriadas e selecionadas, e outros
parâmetros (Lima, 2001).
De acordo com Malta (2006), têm-se percebido ações voltadas para
tornar a produção de cachaça mais eficiente e articulada, uma vez que
historicamente ela se caracteriza como bastante pulverizada e com elevado índice
de informalidade. Destas iniciativas, existem o Programa Brasileiro de
Desenvolvimento de Aguardente de Cana (PBDAC), o Programa Especial de
Exportações (PEE), o Programa dos Novos Pólos para Exportação (PNPE) e a
Rede Mineira de Tecnologia da Cachaça (RTMC).
2.1 – Produção de cachaça
A produção de cachaça artesanal envolve várias etapas. Deve-se
examinar todo o processo, apontando os principais aspectos a serem observados,
a fim de obter em cada uma de suas etapas, os melhores resultados,
objetivando inserir no mercado um produto final
de qualidade
comprovada (Estanislau et al., 2002).
A Figura – 1 ilustra o fluxograma da produção da cachaça. A cana-de-
açúcar depois de colhida e transportada para a indústria é moída e separado o
bagaço. O caldo bruto é submetido a uma côa por passagem em peneiras,
decantado para separação do bagacilho e diluído para ajuste do Brix. O caldo de
cana-de-açúcar pronto para fermentar é denominado mosto. O mosto é colocado
8
para fermentar na presença do fermento, normalmente o “pé-de-cuba”. Depois de
terminada a fermentação do mosto, o caldo é chamado de vinho. O vinho, depois
de sedimentado é destilado. Durante a destilação, são separadas frações de
“cabeça”, “coração”, “cauda” e vinhaça. A fração “coração”, denominada de
cachaça, pode ser armazenada ou envelhecida e, posteriormente, engarrafada e
comercializada.
Figura 1 - Fluxograma do processo de produção de cachaça artesanal.
Colheita da cana e pré-limpeza
Transporte
Recepção e limpeza da cana
Moagem
Bagaço Caldo Bruto
Aproveitamento para
alimentação animal
Caldeira ou fornalha Filtração e decantação
Diluição para ajuste do °Brix
Fermentação
Destilação
Separação das frações
CaldaCabeçaCoraçãoVinhaça
Coluna de destilação para produção
de álcool ou enriquecimento do
vinho para Bidestilação
Cachaça
Armazenamento ou
envelhecimento
Envase
Fertirrigação
9
2.1.1 – Matéria-prima
A cana-de-açúcar, Saccharum spp. (Figura 2), apresenta seus colmos
(cana) constituídos de fibras (8% - 14%) e caldo (86% - 92%). As fibras, que
correspondem ao bagaço da cana, compõem-se, essencialmente, de 50% de
celulose, 25% de hemicelulose e 25% de lignina. O caldo contém 74% a 80%
de água e 20% a 26% de sólidos. A fração sólida é constituída por 97% de
açúcares e o restante é formado por pequenas quantidades de inúmeras
substâncias orgânicas e inorgânicas (Maia e Campelo, 2006). O açúcar
predominante é a sacarose (Barbosa-Filho, et al., 2000), um dissacarídeo
composto de duas subunidades de monossacarídeos, uma alfa-glicose e uma
beta-frutose, ligadas em uma união 1,2 (o carbono 1 da glicose liga-se ao carbono
2 da frutose, formando uma ligação α para a glicose e β para frutose) chamada
ligação glicosídica (Raven et al., 2001). A Figura 3 apresenta a estrutura química
de uma molécula de sacarose.
Figura 2 – Colmos da cana-de-açúcar.
Classificação botânica:
Divisão: Embryophita siphonogama
Subdivisão: Angiospermae
Classe: Monocotyledoneae
Ordem: Glumiflorae
Família: Poaceae
Gênero: Saccharum
10
Figura 3 - Estrutura química da molécula de sacarose.
Atualmente há cerca de trinta e duas espécies conhecidas e catalogadas.
Entretanto, as mais conhecidas ou importantes, em virtude de suas utilizações no
trabalho de melhoramento genético são: Saccharum officinarum L., Saccharum
spontaneum L., Saccharum sinense Roxb, Saccharum barberi Jesw e Saccharum
robustum Jesw. As diversas espécies de cana-de-açúcar conhecidas atualmente
têm origens diferentes. As espécies S. officinarum e S. robustum
são originárias
da Oceania (ilha de Nova Quiné). As espécies S. spontaneum e S. barberi
da Ásia, provavelmente da Índia e a espécie S. sinense da China. Todas
as variedades de cana-de-açúcar, hoje cultivadas em todo o mundo para fins
industriais (açúcar, álcool ou cachaça), são híbridas envolvendo duas ou mais
espécies diferentes (Andrade, 2006).
No ano de 2006, foi realizado um estudo por alunos da Universidade
Estadual do Norte Fluminense (UENF) em parceria com a Cooperativa
dos Produtores de Cachaça e derivados da cana-de-açúcar do Norte
Fluminense (COOPCANF). Por meio de questionários, foi possível identificar que
de toda a área destinada à plantação de cana-de-açúcar, 56,5% é ocupada pela
variedade RB72-454, seguida pela variedade SP79-1011 com 20,2%. Indicando a
preferência dos produtores por estas duas variedades. Depois destas encontram-
se as variedades SP80-1842 e CB45-3 com cerca de 6% cada. Também, são
encontradas as variedades RB73-9735 e RB8540 com menos de 2% da área total
plantada. Observa-se que em 10%, aproximadamente, da área plantada, a
variedade de cana-de-açúcar é desconhecida.
11
A escolha das variedades de cana-de-açúcar deve ser feita levando em
consideração o período médio de maturação das variedades, condições
climáticas e de solo (Silveira et al., 2002).
Se um produtor de cachaça pretende alambicar no período de
maio a novembro/dezembro, ele deve plantar variedades que apresentem
três tipos de maturação: precoce, média e tardia. A maturação é o processo
fisiológico de transporte e armazenamento da sacarose nas células dos
colmos (Silveira et al., 2002). Pode-se indicar a este produtor uma distribuição das
variedades em: 20% para as precoces, 60% para as médias e 20% para as
tardias. Na Tabela 1 encontram-se as principais diferenças entre o período de
colheita (maturação) das diferentes variedades de cana-de-açúcar,
exemplificando algumas delas.
Tabela 1 – Diferença entre os períodos de maturação de diferentes
variedades de cana-de-açúcar
Maturação
Período ótimo de colheita Variedades
Precoce
Adequadas para serem processadas
no início da safra, entre os meses de
maio e junho.
RB 76-5418, SP80-
1842,
RB 835054
Média
Indicadas para processamento no
meio da safra, entre julho a
setembro.
RB92-8064, SP 79-
1011,
RB85-5536
Tardia
Adequadas para o final da safra,
entre outubro e novembro.
RB 72-454, RB 78-
5148,
RB 72-454, SP79-
2313,
SP 71-1406
A época de plantio pode variar de uma região para outra. Na Região
Nordeste do Brasil, tem-se uma única época de plantio que vai de junho a
setembro (épocas das chuvas), sem uso de irrigação. Visando atender às
necessidades climáticas da cultura, na Região Centro-Sul do Brasil, as condições
que permitem o plantio sem irrigação ocorrem nas seguintes épocas:
12
Janeiro a março, obtendo-se a chamada cana-de-ano-e-meio;
Outubro a novembro, obtendo-se a cana-de-ano.
Em qualquer caso, após o corte, o ciclo da soca é de doze meses.
A Figura 4 ilustra o ciclo de desenvolvimento da cana-de-ano-e-meio e a
Figura 5 da cana-de-ano.
Figura 4 – Ciclo de desenvolvimento da cana-de-ano-e-meio. Fonte: Andrade,
2006.
Figura 5 – Ciclo de desenvolvimento da cana-de-ano. Fonte: Andrade, 2006.
13
As principais vantagens da cana-de-ano-e-meio e cana-de-ano estão
descritas na Tabela 2.
Tabela 2 – Principais vantagens da cana-de-ano-e-meio e cana-de-ano
Época de plantio Vantagens
Cana-de-ano-e-meio
• Maior número de meses para o crescimento
vegetativo, garantindo maior produção;
• Melhor distribuição da mão-de-obra, pois o plantio e
a colheita não coincidem;
• Melhor controle de plantas daninhas;
• Menores problemas fitossanitários;
• Possibilidade de rotação com culturas de ciclo curto;
• Melhor escoamento da colheita.
Cana-de-ano
• Produção mais rápida do primeiro corte;
• Melhor brotação das socas;
• Corte ocorre durante o período de condições
climáticas favoráveis.
Fonte: Andrade, 2006.
2.1.2 – Colheita
Segundo Oliveira et al., (2005) a cana-de-açúcar deve ser cortada bem
rente ao solo, quando madura, e na quantidade suficiente para moagem do dia.
Saber o momento de colher a cana-de-açúcar, também, é importante, e existem
técnicas que auxiliam a estabelecer a época certa da colheita. A cana-de-açúcar é
considerada madura quando o °Brix estiver em 16% ou mais. Com um
sacarimetro portátil, deve-se calcular o Índice Médio de Maturação – IM, que é a
razão entre o °Brix da extremidade superior (ponta) e o da extremidade
inferior (base). Quando o IM estiver entre 0,8 a 1,0 a cana-de-açúcar está
14
madura. Se a razão for maior que 1,0 a cana-de-açúcar passou do ponto,
1
base
na
Brix
ponta naBrix
8,0 ≤≤
Após o corte, é extremamente importante que a cana-de-açúcar
permaneça o menor tempo possível exposta ao sol. A luz e o calor favorecem a
proliferação de bactérias, que aumentam a viscosidade do caldo, prejudicando
acentuadamente o rendimento da fermentação e a decantação do fermento (Maia
e Campelo, 2006).
2.1.3 – Moagem, decantação e ajuste de °Brix
A seção de moagem deve ser aberta, com piso resistente e impermeável,
que permita uma boa lavagem. Normalmente, o piso é de cimento, não muito liso,
para evitar que fique escorregadio e provoque acidentes. O uso de revestimento
com pedra é recomendado. Essa área, também, deve ser coberta, de
maneira a proteger a cana-de-açúcar dos efeitos negativos da ação do sol e da
chuva. Como o volume de cana-de-açúcar a ser moída é calculado a partir da
produção diária, a seção de moagem deve prever áreas para estocagem,
manuseio de matéria-prima, moenda, operação, filtração e decantação do
caldo (Oliveira et al., 2005).
A extração por moagem é a operação que permite dividir o colmo da
cana-de-
açúcar em duas frações: o caldo e o bagaço (Veiga, 2006). Logo
após a moagem da cana-de-açúcar, o caldo extraído atravessa uma tela fina,
destinada a reter partículas sólidas e resíduos de bagaço de diâmetros
maiores (Maia e Campelo, 2006). Em seguida, passa pelo decantador, onde deixa
as impurezas mais finas, tais como terra e bagacilho, prejudiciais à fermentação e
à qualidade da cachaça (Mutton e Mutton, 2005). Quanto ao decantador de caldo,
existem cálculos matemáticos para o seu dimensionamento. A passagem do
caldo pelo decantador deve ser de no máximo 20 minutos, para evitar que ocorra
a proliferação de microrganismos que o acompanham (Maia e Campelo, 2006).
A limpeza do caldo é importante pelos inconvenientes que a sujidade
promove, uma vez que agem como focos de contaminações, além da formação
de produtos indesejáveis para a qualidade da cacha
ça, por exemplo, o
furfural (Mutton e Mutton, 2005).
15
Depois de decantado, o caldo de cana-de-açúcar deverá passar por
tanques para ajuste do °Brix, antes de iniciar a fermentação nas dornas. Esta
indicação justifica-se, pois, a fermentação ideal ocorre quando a concentração de
açúcares está entre 14° e 16° Brix. Acima de 16° Brix é necessário diluir o caldo,
para garantir a estabilidade do fermento ao longo de todo o período fermentativo;
se não diluído pode acarretar fermentações mais lentas e freqüentemente
incompletas, acarretando perda de qualidade da cachaça (Veiga, 2006).
2.1.4 – Fermentação do mosto
O termo fermentação é derivado do verbo latim fervere, que
significa ferver, o que descreve a aparência da ação das leveduras no
mosto (Schwan et. al., 2006).
Todo processo de fermentação é
causado por microrganismos vivos, sejam bactérias, fungos ou
leveduras (Mutton e Mutton, 2005). A grande maioria dos organismos
fermentadores tem em comum o fato de metabolizar a fonte de carbono até o
piruvato e, deste, sintetizar outros compostos orgânicos, tais como ácido lático
(fermentação lática) etanol (fermentação alcoólica), ácido propiônico e
outros (Lehninger et al., 2000).
A fermentação alcoólica é o processo de oxidação anaeróbica parcial da
glicose. Os microrganismos mais comumente usados na fermentação alcoólica
são as leveduras, fundamentalmente a espécie Saccharomyces cerevisiae. Do
ponto de vista bioquímico, a fermentação consiste na conversão da hexose em
álcool. No caldo de cana-de-açúcar, estas hexoses, glicose e frutose, são obtidas
pela hidrólise da sacarose por meio da enzima invertase. No caso de sucos
extraídos de frutas, o açúcar predominante é a frutose. Durante o transporte para
dentro das células, essas hexoses são fosforiladas, iniciando a glicólise. A
glicólise está ilustrada na Figura 6, assim como rotas simplificadas de formação
do etanol e de outros compostos (Cunha, 2004). Pela via glicolítica, a glicose é
convertida em duas moléculas de piruvato por meio de dez reações catalisadas
por diferentes enzimas (Figura 6).
16
Figura 6 – Esquema simplificado da formação de compostos em processos
fermentativos. Fonte: Dias, 2001.
17
Em leveduras ocorre a formação de etanol a partir do piruvato por
duas etapas. A primeira consiste na sua descarboxilação para formar acetaldeído
e CO
2
. Esta reação é catalizada pela enzima piruvato descarboxilase. Na segunda
reação, o acetaldeído é reduzido a etanol por ação da enzima álcool
desidrogenase I (ADH1). O esgotamento da glicose ativa, nas leveduras, a
transcrição do gene da desidrogenase 2 (ADH2). A enzima ADH2 oxida o etanol a
acetaldeído, o qual é posteriormente convertido a acetato, passando então para
as etapas posteriores do ciclo de Krebs (Cambell, 2000; Tortora et al., 2000).
A Figura 7 ilustra o esquema da fermentação e da respiração. Quando
há o esgotamento da glicose é ativada a via representada pelas setas
pontilhadas (oxidação do etanol), seguindo para a via respiratória. Existem
dois tipos de enzima, a álcool desidrogenase (I e II), codificadas por genes
diferentes (em itálico). Todas as enzimas da via estão sublinhadas.
Além do álcool etílico e CO
2
, outros metabólicos são produzidos
durante a fermentação alcoólica, como glicerol, ácidos orgânicos (succínico,
acético, pirúvico e outros), alcoóis superiores, acetaldeído, acetoína, butilenoglicol
etc (Schwan et. al., 2006). Segundo Lima (2001), além das rotas que levam a
formação do etanol, rotas alternativas são utilizadas para a formação de materiais
necessários à constituição de biomassa (polissacarídeos, lipídeos, proteínas,
ácidos nucléicos e outros), além de produtos necessários à adaptação e
sobrevivência das leveduras (Figura 6).
No inicio da fermentação, quando o açúcar disponível para as leveduras
for a sacarose, esta é quase imediatamente hidrolisada à glicose e frutose pela
ação da enzima invertase. A maioria das linhagens de leveduras é glicofílica, ou
seja, fermenta a glicose em taxas mais rápidas que a frutose e outros
monossacarídeos (Schwan et. al., 2006). Em condições industriais, há desvio de
10% do açúcar consumido para a formação de produtos secundários (co-
produtos) da fermentação (Lima, 2001). Na Figura 8 encontram-se as vias básicas
para a formação dos componentes secundários ou compostos de sabor formados,
representando eventos que ocorrem durante a fermentação alcoólica. Estes
compostos pertencem às classes: aldeídos, ácidos, ésteres, alcoóis superiores,
terpenos, lactonas, furanos, pirazinas, dentre outros. Os teores destes compostos
na fermentação alcoólica são geralmente inferiores a 0,1%, existindo alguns em
quantidades menores ainda, inferiores a 0,001% (Maia, 1994).
18
Figura 7 – Esquema da fermentação e da respiração. Fonte: Cunha, 2004.
19
Compostos carbonílicos, tais como o diacetil e aldeídos, compõem a
fração mais volátil das bebidas alcoólicas (Oliveira, 2001). De modo geral, os
aldeídos com até 8 átomos de carbono têm aroma penetrante e geralmente
enjoativo, e são considerados indesejáveis em bebidas destiladas. O principal
aldeído associado à fermentação alcoólica é o acetaldeído (Maia, 1994). O
acetaldeído, junto com os 2-cetoácidos, são compostos chave nas reações
bioquímicas de produção de alcoóis fúsel a partir de aminoácidos e açúcares,
pelas leveduras. São formados dentro das células e então transferidos ao meio de
fermentação (Oliveira, 2001).
O acetaldeído é formado no penúltimo estágio da via glicolítica (Figura 7).
Além de ser reduzido a etanol, uma pequena parcela do acetaldeído produzida é
oxidada a ácido acético, reação esta influenciada pela concentração do etanol
presente (Macdonald et al., 1984 citado por Oliveira, 2001).
Figura 8 –
Vias básicas para formação dos compostos do sabor durante a
fermentação. Fonte: Berry, 1995; citado por Oliveira, 2001.
20
Segundo Yokoya (1995), outros aldeídos além do acetaldeído podem ser
obtidos, provavelmente, a partir da oxidação de alcoóis superiores provenientes
da degradação de aminoácidos gerados pela hidrólise de proteínas (Figura 9). O
furfural e o hidroximetilfurfural, aldeídos de presença rara em algumas cachaças,
são resultantes da decomposição química de carboidratos. Estes compostos
podem aparecer no caldo de cana-de-açúcar, quando a colheita da cana-de-
açúcar é precedida da queima da folhagem, o que acarreta a desidratação parcial
de uma pequena fração de açúcares presentes (Cardoso, 2006).
A desidratação parcial de pentoses produz o 2-furfuraldeído (furfural) e a
desidratação de hexoses leva a formação do 5-hidroximetil-2-furfuraldeído ou
hidroximetilfurfural (Novaes et al., 1974 citado por Oliveira, 2001). Estes
compostos, principalmente o furfural, podem ser formados, também, pela
pirogenação da matéria orgânica depositada no fundo de alambiques. A sua
formação é evitada pela destilação do vinho limpo, livre de substâncias orgânicas
em suspensão. Nas cachaças envelhecidas, o furfural pode ser oriundo da ação
de ácidos sobre pentoses e seus polímeros, como hemiceluloses (Yokoya, 1995).
Os ácidos orgânicos encontrados nas bebidas alcoólicas são importantes
sob vários aspectos. Primeiro, são componentes de um dos principais grupos do
sabor. Todos ácidos orgânicos têm o atributo da acidez em grau variado,
mas alguns têm suas características próprias de sabor. Por exemplo, o ácido
cítrico tem um sabor “ácido fresco”. Em segundo lugar, os ácidos diferem muito na
sua utilização metabólica por microrganismos, particularmente pelas bactérias
láticas; o ácido succínico não é facilmente metabolizado anaerobiamente,
enquanto o ácido málico e cítrico são prontamente metabolizados
anaerobiamente (Oliveira, 2001).
Entre os ácidos orgânicos, produtos secundários da fermentação
alcoólica, o ácido acético tem sido, quantitativamente, o principal componente da
fração ácida das aguardentes, expresso em acidez volátil (Cardoso et al., 2005).
O termo acidez volátil está completamente difundido, mas refere-se
a compostos que podem ser vaporizados com o álcool e água e coletados
no destilado, apesar de apresentarem ponto de ebulição mais alto do que a
água. Na acidez volátil das bebidas alcoólicas, além do ácido acético e
láctico, que são subprodutos normais da fermentação alcoólica, estão
presentes, também, os ácidos fórmico, butírico, propiônico, e outros
21
em quantidades ínfimas (Oliveira, 2001).
A produção de compostos que fazem parte da acidez volátil depende do
processo fermentativo, e o controle dos fatores: cepa da levedura utilizada,
pureza da fermentação, tempo, temperatura da fermentação, manejo do mosto e,
principalmente, higienização, são essenciais para minimizar a ocorrência dos
mesmos (Pereira et al., 2003).
Processos fermentativos realizados por culturas homogêneas de
leveduras produzem menor quantidade de acidez volátil quando comparados aos
processos naturais de fermentação. Por este motivo, fermentações alcoólicas
conduzidas em boas condições de higiene proporcionam a produção de cachaças
com acidez relativamente baixa (Lima e Nóbrega, 2004).
A acidez de uma cachaça é de grande importância, constituindo um fator
de qualidade, uma vez que, durante sua produção, os ácidos reagem com os
alcoóis presentes, aumentando a formação dos ésteres, que são um dos
constituintes responsáveis pelo aroma. No entanto, o excesso de acidez promove
sabor indesejado e ligeiramente “agressivo” na cachaça, depreciando a qualidade
da bebida (Cherubin, 1998). Altas concentrações de ácido acético provocam
sensações de ardor na garganta e odor de vinagre (Lima e Nóbrega, 2004). Tal
característica pode ser proveniente de fermentações alcoólicas contaminadas
com bactérias acéticas (Crispim, 2000).
A contaminação por bactérias acéticas e outras, pode ser atribuída à
contaminação da cana-de-açúcar ou do próprio mosto fermentativo, seja na
estocagem ou no próprio caldo, elevando, assim, a acidez e diminuindo o
rendimento da produção de etanol (Cardoso, 2006). O ácido acético é produzido
pela oxidação do acetaldeído (Berry, 1995).
A formação de ésteres, pelas leveduras, é extensamente discutida na
literatura. A Figura 8 ilustra, de forma resumida, as diversas rotas de formação
dos ésteres pelas leveduras. A quantidade de ésteres específicos produzidos é
dependente da abundância relativa dos alcoóis correspondentes e da acil-CoA
produzida pelas leveduras. Desde que a acetil-CoA e o etanol são os mais
abundantes, o acetato de etila é normalmente o éster predominante (Berry, 1995).
O acetato de etila é, também, formado por reações químicas durante o
armazenamento das bebidas alcoólicas. Parazzi et al., (2008) observaram um
aumento significativo nos teores de acetato de etila em função do tempo de
22
armazenamento. Tais incrementos ocorrem por meio de reações de esterificação,
entre alcoóis e ácidos carboxílicos durante o processo oxidativo (Cardoso, 2006).
O aroma típico, agradável, pungente e suave que a aguardente
adquire com o envelhecimento deve-
se, principalmente, à formação de
ésteres relativamente aromáticos, os quais contribuem para a formação do
buquê (Cardoso, 2006).
Segundo Lima et al. (2006), os principais alcoóis superiores produzidos
por leveduras são os alcoóis alifáticos, n-propanol, iso-butanol (2-metil-1-
propanol), álcool amílico ativo (2-metil-1-butanol) e álcool iso-amílico (3-metil-1-
butanol). De acordo com Gutierrez (1993), a formação de alcoóis superiores por
leveduras ocorre a partir do desvio do metabolismo dos aminoácidos, ocasião em
que o ceto-ácidos envolvido é descarboxilado a aldeído, com posterior redução,
por meio da enzima álcool desidrogenase, a álcool superior (Figura 8). A
formação de alcoóis superiores a partir dos aminoácidos ocorre através de
reações de desaminação e descarboxilação. Esse processo é conhecido como via
catabólica de Ehrlich (Figura 9).
Figura 9 – Esquema de formação de álcoois superiores nas leveduras pela via
de Ehrlich (catabólica). Fonte: Oliveira, 2001.
23
Os alcoóis com até cinco átomos de carbono apresentam odores
característicos (buquê) tradicionalmente associados com bebidas destiladas. Eles
são responsáveis diretos pelo odor da bebida, possuindo aromas característicos,
destacando-se os alcoóis amílico e propílico, e seus respectivos isômeros. Com o
aumento do número de carbonos, o aroma modifica-se substancialmente e os
alcoóis tornam-se oleosos, chamado óleo fúsel. Alguns deles lembram fortemente
o aroma de flores (Cardoso, 2006).
Os alcoóis fúsel têm um aroma característico e exercem uma grande
influência no sabor das bebidas destiladas, sendo indesejável sua presença
em cachaça. O termo fúsel refere-se ao gosto e aroma de queimado destes
alcoóis (Oliveira, 2001).
2.1.4.1 – Propagação do Fermento
A levedura utilizada no processo de fermentação deve apresentar
determinadas características que garantam o rendimento fermentativo. Entre as
características pretendidas, a cepa de levedura escolhida deverá apresentar alta
velocidade de fermentação, boa tolerância ao álcool, resistência à acidez e à
temperatura elevada e estabilidade genética (Mutton e Mutton, 2005).
A Grande maioria dos produtores de cachaça não trabalha com cepas
de leveduras isoladas, mas sim, com um grupo de cepas, normalmente,
conhecidas como “pé de cuba”. Na prática, os fermentos mais utilizados são:
fermentos naturais (selvagens), fermentos prensados, fermentos mistos e
fermentos secos (granulados). O fermento natural (selvagem) é constituído por
células de leveduras que já estão naturalmente adaptadas ao ambiente. Vivem na
superfície dos colmos da cana-de-açúcar. Pelo fato de não terem sofrido
alterações genéticas programadas ou melhoramentos, são chamadas leveduras
naturais, nativas ou selvagens (Schwan et al., 2006).
O inóculo natural, chamado “pé de cuba” é usualmente preparado
pelo método conhecido como fermento caipira, que consiste em uma mistura de
caldo de cana-de-açúcar não diluído, farelo de arroz, fubá ou farelo de soja,
com adição de suco de limão ou laranja azeda para abaixar o pH. São feitas
adições diárias de caldo de cana-de-açúcar no período de cinco a sete dias,
quando as leveduras estão se reproduzindo e o volume de massa celular está
24
aumentado (Ribeiro, 2002). Desta forma, o inóculo é obtido a partir da
fermentação espontânea dos microrganismos presentes no caldo da cana-de-
açúcar, nos equipamentos e nas dornas de fermentação. Nas fermentações
espontâneas, um grande número de espécies de microrganismos pode estar
envolvido, com predominância de Saccharomyces cerevisiae (Pataro et al., 2000).
Para que ocorra uma multiplicação vigorosa das células é necessário que
as exigências nutricionais das leveduras sejam supridas, permitindo assim a
reprodução e garantindo a viabilidade celular (Schwan et al., 2006). Dentre os
nutrientes requeridos pelas leveduras, e freqüentemente presentes na cana-de-
açúcar em quantidades insuficientes, encontram-se substâncias minerais e
algumas orgânicas. As substâncias orgânicas requeridas são as vitaminas e
ácidos graxos insaturados que são responsáveis pela manutenção da fisiologia
celular (Lima, 2001).
Além dos requerimentos nutricionais, fatores físico-químicos, a
concentração de substrato e a presença de microrganismos contaminantes
podem afetar a fermentação alcoólica, diminuindo a eficiência do processo
fermentativo ou a qualidade do produto final (Schwan et al., 2006). Por exemplo:
A) Aeração e agitação na fermentação alcoólica
Para preparação de culturas “starter” (ou inóculo) e no controle
da fermentação alcoólica, é importante considerar a função do oxigênio
no controle do metabolismo e crescimento da levedura (Henick-Kling, 1988 citado
por Malta, 2006). A levedura possui dois tipos de metabolismo celular: oxidativo e
fermentativo. O metabolismo oxidativo ocorre na presença de oxigênio, quando a
levedura oxida os carboidratos por respiração, estimulando, assim, sua
multiplicação intensa (Schwan et al., 2006). O metabolismo celular oxidativo
permite uma maior produção de biomassa, e a síntese de materiais de reserva,
como esteróis e ácidos graxos. Desta forma, a aeração é usada na
preparação de culturas “starter” quando uma quantidade maior de biomassa é
requerida (Henick-Kling, 1988 citado por Malta, 2006).
B) pH do mosto durante a fermentação alcoólica
Existe uma correlação entre acidez ionizável do mosto e a velocidade de
crescimento da levedura (Oliveira et al., 2005). A acidez ionizável de um meio
pode ser definida como sendo a concentração hidrogeniônica desse meio e essa
concentração hidrogeniônica efetiva de uma solução é expressa em termos de
25
pH (potencial hidrogeniônico), que para fins didáticos, considera-se a atividade de
H
+
como a própria concentração hidrogeniônica (Gomes, 2003). As leveduras
atingem seu ótimo crescimento entre pH 5,0 e 6,0. Para a produção de cachaça, o
pH do mosto durante a fermentação deve situar-se na faixa de 4,0 a 5,0. Uma
colheita cuidadosa, sem queimar a cana-de-açúcar, uma boa limpeza e diluição
do caldo, um acompanhamento da vitalidade do fermento e ajustamento da
quantidade do “pé-de-cuba”, são cuidados que, normalmente, suprem a
necessidade de correção do pH (Oliveira et al., 2005).
C) Temperatura nas dornas de fermentação
Pataro et al. (1998) estudaram o crescimento de 210 linhagens de
leveduras isoladas de uma indústria de cachaça de alambique do Estado
de Minas Gerais. A maioria das linhagens foi fisiologicamente adaptada às
condições ambientais observadas nas dornas de fermentação. Elas foram
capazes de crescer a 35
o
C, em meio contendo até 25% de glicose e em
concentração de 5 % (v/v) de etanol.
De modo geral, o crescimento das leveduras ocorre entre (20-30) ºC
e a fermentação na faixa (30-40) ºC. É importante que o produtor fique atento à
evolução do processo em sua própria fábrica. Existem centenas de cepas
distintas, que respondem de modo característico às peculiaridades de cada
região (Maia e Campelo, 2006). Stupiello e Horii (1981) afirmam que a reprodução
de células pode ocorrer em temperaturas máximas próximo a 38 ºC, havendo
inibição da multiplicação a 40 ºC e na presença de 8 a 9 % v/v de etanol.
D) Contaminantes durante extração e fermentação do caldo
Certa presença de bactérias no mosto é inevitável (a menos que o caldo
seja esterilizado, o que não é prática comum). Mas, se as bactérias nocivas
tiverem seu crescimento favorecido, podem comprometer seriamente a
fermentação, a composição química e as características sensoriais do mosto
fermentado e da cachaça (Maia e Campelo, 2006). As bactérias podem desviar os
açúcares usados pelas leveduras para outras vias metabólicas, resultando na
formação de diversos compostos como os ácidos lático, acético, fórmico e
butírico, os aldeídos e os ésteres. Estes, além de reduzirem o rendimento
alcoólico, provocam alterações nas propriedades sensoriais da cachaça, com
conseqüente depreciação do produto (Pataro et al., 2002).
26
As bactérias láticas podem se multiplicar ao final da fermentação,
utilizando o etanol como fonte de energia. No mosto, a presença dessas bactérias
é devido à sua resistência a altas temperaturas e baixos valores de pH. Isso
faz com que, ao final da fermentação, as bactérias láticas possam
produzir compostos secundários que irão aumentar os níveis de acidez da
cachaça (Pataro et al., 2002).
E) Fonte de Carbono na produção de cachaça
A concentração de açúcar no caldo de cana-de-açúcar deve ser diferente
nas duas etapas distintas do processo fermentativo. A primeira está relacionada
com a propagação das leveduras que é feita sob intensa aeração. Normalmente é
recomendado que o teor de açúcar não seja superior a (2-3) % (p/v), já que
concentrações mais altas prejudicam a respiração da célula, que é indispensável
para um crescimento eficiente. A segunda etapa está relacionada com
a fermentação propriamente dita, ou seja, a conversão de açúcar em etanol e
CO
2
. Nesta etapa, o teor médio de açúcar tolerado pela levedura é em torno de
15% (p/v). Este limite pode ser variável de acordo com a levedura e as demais
condições do processo fermentativo (Schwan e Castro, 2001).
O efeito “Crabtree” é descrito como o efeito repressor da atividade
respiratória pela glicose livre. Assim, cepas de S cerevisiae seriam “sensíveis”
à glicose, pois em concentrações de 100 a 200 mg/L já é iniciada a
fermentação (Maia, 2002). Devido à formação de etanol diminuir o rendimento em
biomassa, é necessário controlar a taxa de alimentação de açúcar, nas dornas de
propagação ou na preparação do “pé-de-cuba”, para minimizar a produção de
etanol. Desta forma, a concentração de açúcar é o parâmetro principal para
efetiva produção de massa celular de levedura (Miskiewicz e Kasperski, 2000).
F) Fonte de Nitrogênio na produção de cachaça
As leveduras geralmente podem sintetizar todos os aminoácidos e bases
nitrogenadas necessárias para seu crescimento celular a partir do íon amônio. O
crescimento é acelerado quando aminoácidos são disponibilizados no meio de
crescimento. Estes são utilizados na síntese de enzimas celulares e componentes
estruturais (Henick-Kling, 1988 citado por Malta, 2006). No entanto, Alves (1994)
descreve que a utilização de sulfato de amônio como fonte nitrogenada resulta em
maior acidez do meio, que embora possa favorecer o controle da contaminação
bacteriana (e conseqüente redução da formação de ácido lático e acético), causa
27
estresse à levedura, diminuindo a viabilidade e multiplicação.
A reprodução de cepas de S. cerevisiae varia em função do nível de
nutrientes encontrados na matéria-prima (caldo de cana-de-açúcar), e dentre
estes o nitrogênio é o que apresenta uma resposta mais significativa. A levedura
não assimila, instantaneamente, o nitrogênio quando adicionado na forma de
uréia ou sulfato de amônio (Pinotti, 1991 citado por Malta, 2006).
Jerônimo (2004) testou três fontes de nitrogênio protéico, dentre elas, um
isolado protéico de soja (denominado comercialmente de SUPRO 780 –
anteriormente denominado Samprosoy 90 LH produzido pela Bunge Alimentos),
obtendo uma boa multiplicação e viabilidade da levedura, propiciando assim,
melhor qualidade no fermento reciclado. Neste experimento, a viabilidade
manteve-se elevada até o final do experimento (6 reciclos), e a massa celular
produzida também. Segundo esta autora, o nitrogênio protéico original do caldo
de cana-de-açúcar foi praticamente todo consumido, o que significa estar em
forma assimilável pela levedura. Do ponto de vista nutricional da levedura, os
resultados deste trabalho mostram que o nitrogênio protéico presente no caldo é
insuficiente para suprir a nutrição da levedura durante o período de fermentação.
G) Fonte de Minerais na produção de cachaça
As leveduras exigem diversos minerais. Estes possuem função
importante no metabolismo celular, principalmente, devido à sua atuação
como co-fatores de várias enzimas (Stehlik-Tomas et al., 2004). Os íons metálicos
são vitais para todos os organismos, e desta forma, fontes destes íons têm papel
crucial na manutenção da homeostase. Todavia, quantidades excessivas
de alguns destes elementos, são tóxicos e podem causar danos às
células (Nelson, 1999 citado por Malta, 2006).
Segundo Lima (2001), a adição de sais minerais é vantajosa para corrigir
deficiências que o caldo de cana-de-açúcar normalmente apresenta. De um modo
geral, a adição não é feita em todo o volume do mosto, mas nos “pés-de-cuba”,
ou periodicamente, nas dornas de fermentação.
2.1.4.2 – Saccharomyces cerevisiae na fermentação alcoólica
As leveduras são tradicionalmente caracterizadas, classificadas e
identificadas por meio de características morfológicas e fisiológicas. Para a
28
identificação específica, estudos bioquímicos e de exigências nutricionais são
mais relevantes que traços morfológicos e sexuais, os quais são importantes na
determinação genérica. Diferenças na fermentação e assimilação de compostos
de carbono são critérios importantes na taxonomia e identificação de leveduras,
pois estes microrganismos apresentam uma variação na habilidade de
fermentação de açúcares. Alguns grupos apresentam fermentação vigorosa da
glicose como Kluyveromyces, Saccharomyces, Torulaspora e
Zygosaccharomyces, enquanto outros, como Lipomyces e Sterigmatomyces são
estritamente não-fermentativos. Normalmente, apresentam habilidades de
assimilar amônia, mas nem sempre de assimilar nitratos, nitritos, aminas ou
alguns aminoácidos. Muitos gêneros como Saccharomyces, Kluyveromyces,
Pichia e Debaryomyces, são caracterizados pela incapacidade de utilizar o nitrato,
enquanto que nos gêneros Hansenula, Pachysolen, Citeromyces e
Wickerhamiella, todas as espécies utilizam o nitrato. Entre as leveduras
imperfeitas podem ocorrer linhagens nitrato-positivo, como nos gêneros Cândida
e Trichosporon (Matienzo, 2002).
Métodos moleculares têm sido desenvolvidos recentemente com o
propósito de apresentar um único padrão de DNA fingerprinting, sendo eles: PCR
– Reação em cadeia da polimerase, PFGE – Eletroforese em gel de campo
pulsado, RAPD – DNA polimórfico amplificado ao acaso e RFLP – Polimorfismo
de tamanho de fragmento restrito. Entre estas técnicas, as mais utilizadas para
identificação de cepas de levedura estão: PCR e RFLP de DNA mitocondrial e
nuclear (Guimarães, 2005).
O gênero Saccharomyces vem tendo inúmeras mudanças taxonômicas
ao longo dos anos. Quando a primeira publicação sobre taxonomia de leveduras
foi realizada por Guilliermond, em 1912, o gênero Saccharomyces compreendia
46 espécies divididas em 06 grupos separados de acordo com a atividade
fermentativa sobre os açúcares. Em 1952, o número total de espécies
deste gênero foi reduzido a 30, uma vez que várias espécies foram agrupadas
como sinônimos em Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae
variedade elipsoideus, Saccharomyces carlsbergensis ou Saccharomyces
willianus, enquanto novas espécies foram introduzidas ao gênero. Entretanto,
várias outras divisões ocorreram e outras novas espécies foram descritas,
obtendo-se como resultado, em 1970, 41 espécies dentro do gênero
29
Saccharomyces (Walt e Yarrow, citados por Guimarães 2005). Atualmente, de
acordo com a última revisão taxonômica, 14 espécies são aceitas dentro do
gênero Saccharomyces (Guimarães, 2005).
2.1.4.3 – Processo Fermentativo
O ideal é que a fermentação se encerre no intervalo de 14 a 18 horas,
deixando 6 a 10 horas para as demais operações que acontecem dentro da dorna
de fermentação (decantação do fermento, separação do vinho, revigoramento do
“pé-de-cuba”), ficando, assim, todo o ciclo ajustado para ocorrer em um intervalo
médio de 24 horas (Maia e Campelo, 2006). Em geral, a fermentação pode ser
conduzida por três diferentes sistemas: “batelada-simples” (sistema descontinuo),
“batelada-alimentada” (sistema semicontínuo) e contínuo. Os produtores de
cachaça artesanal adotam, comumente, o sistema de “batelada-simples”, que
consiste em colocar o inóculo e todo o meio a ser fermentado na dorna de
fermentação. Após 24 horas, destila-se o vinho, inicia-se um novo ciclo,
utilizando-se para isso o inóculo que permanece na dorna de fermentação, o “pé-
de-cuba” (Pataro et al., 2002a).
O sistema batelada alimentada tem sido usado, atualmente, por alguns
produtores de cachaça. Este processo consiste na transferência do caldo de
cana-de-açúcar para a dorna já contendo as leveduras (“pé-de-cuba”),
lentamente, em um intervalo de 6 a 8 horas. Este sistema é mais eficiente
que a “batelada-simples”, quando o caldo é rapidamente transferido para a dorna
de fermentação, prejudicando a atuação das leveduras que compõem o “pé-de-
cuba” (Maia e Campelo, 2006).
2.1.5 – Destilação do vinho
A destilação consiste em aquecer um líquido até a fervura,
gerando vapores que, ao serem condensados, constituirão um novo
líquido, com teores mais altos dos componentes mais voláteis que o líquido
original (Mutton e Mutton, 2005). Ao estilar o vinho da cana-de-açúcar, contendo
aproximadamente 8,0% de etanol, obtém-se um novo líquido com teor alcoólico
cinco a seis vezes mais alto, a cachaça. Na fabricação artesanal, a destilação é
30
feita em alambiques. Durante a destilação o vinho é separado em 4 frações:
“cabeça”, “coração”, “cauda” e vinhoto. O “coração” é a fração que representa a
cachaça, normalmente comercializada (Maia e Campelo, 2006).
O alambique pode ter diversas configurações, mas os componentes
básicos são sempre: a panela onde se coloca o vinho a ser aquecido; a
coluna, situada acima da panela, que recebe os vapores do vinho e a alonga. A
alonga é ligada à parte mais alta da coluna, a partir da qual os vapores
são resfriados, até serem recolhidos na extremidade inferior, já no estado
líquido (Maia e Campelo, 2006).
Os aparelhos de destilação simples, os tradicionais alambiques, são
construídos, principalmente, de cobre e os destiladores de colunas de aço
inoxidável e cobre (Veiga, 2006). Mas, existem vários produtores de cachaça que
usam aparelhos de destilação produzidos com panela feita em aço inoxidável
contendo algumas peças em cobre, como o deflegmador e a serpentina, que
compõem a coluna do destilador (Crispim, 2000).
O cobre
metálico é insolúvel em água e em álcool. No entanto,
em contato com ar úmido, ocorre a formação de carbonato e hidróxido de
cobre que compõem o azinhavre (de cor azul-esverdeada). Esses
componentes se acumu
lam no interior da alonga, e especialmente dentro
da serpentina de resfriamento, sendo arrastados para a cachaça durante a
destilação (Maia e Campelo, 2006).
Os alambiques tradicionais são aquecidos por fogo direto, utilizando,
geralmente, o bagaço da própria cana-de-
açúcar na queima. O controle do
refluxo (“vômito do vinho”), porém, fica facilitado quando se emprega uma
caldeira, que efetua o aquecimento do vinho mediante vapor. Este vapor
atravessa uma espiral situada no fundo da panela. A panela é dotada de
dispositivo para controle de temperatura e vazão e a caldeira permite ajustar a
intensidade do aquecimento do vinho, dosando com precisão a quantidade de
calor requerida em cada etapa (Maia e Campelo, 2006).
2.1.6 – Pós-Destilação do vinho
Da destilação dos vinhos (caldo de cana-de-açúcar fermentado), obtém-
se um produto constituído basicamente por água, alcoóis, aldeídos, ácidos,
31
cetonas, ésteres, entre outros. Na sua composição média, predomina-se a
água (59%), o álcool etílico (40%), além de 1% de outros compostos, como:
acetaldeído, acetato de etila, propanol, butanol, isoamílico, amílico e, ácido
acético, conhecidos por compostos majoritários (estão presentes em maiores
concentrações), além dos minoritários (compostos sulfurados e nitrogenados).
Esta bebida, recém-destilada, apresenta-se incolor, com gosto ardente, agressivo,
sabor repugnante, além de buquê irregular, não sendo recomendado o seu
consumo imediato (Mutton e Mutton, 2005).
A bebida obtida pela destilação deve ser armazenada com a
finalidade de estabilização química, em recipientes de vidro, aço inox ou
madeira (Crispim, 2000).
Quando o armazenamento da bebida se dá
em recipientes de vidro ou
aço inox, diz que a mesma sofreu o processo
de maturação. A maturação corresponde a um período de armazenamento,
dois a seis meses, suficiente para suavizar (“amaciar”) o aroma e o sabor
da cachaça. Quimicamente, o efeito decorre da oxidação dos aldeídos
oriundos da fermentação e concentrados na destilação, principalmente o
acetaldeído (Maia e Campelo, 2006).
O envelhecimento consiste no armazenamento do destilado em
recipientes de madeira, de qualquer tipo (Mutton e Mutton, 2005). Durante o
envelhecimento, que deve ser feito em recipientes com capacidade não superior a
700 litros, ocorrem reações químicas e alterações físicas que conferem à bebida
qualidades (características) sensoriais que esta não possuía anteriormente. A
citação dos diferentes tipos de envelhecimento no rótulo da cachaça (Cachaça
Envelhecida, Cachaça Premium e Cachaça Extra Premium) só pode ser feito
em produtos cujo processo de envelhecimento tenha sido acompanhado e
certificado pela fiscalização do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
– MAPA (Botelho, 2006).
O uso das expressões “Prata”, “Clássica” ou “Tradicional” refere-se aos
produtos sem alteração visível na sua coloração após a destilação, que tenham
sido armazenados em recipientes de madeira ou não. Já a expressão “Ouro” é
dada para a cachaça que tenha sido armazenada em recipiente de madeira e com
alteração da sua coloração (Botelho, 2006).
Após a maturação ou envelhecimento, dependendo da opção do produtor,
a cachaça deverá ser padronizada por lotes e por safra. Por lote entende-
se
32
“a quantidade de um produto elaborado em um ciclo de produção, identificado
por número, letra ou a combinação de ambos, cuja característica é a
homogeneidade” (Botelho, 2006). A safra e o conjunto dos lotes idênticos
engarrafados a cada ano (Maia e Campelo, 2006).
Antes do engarrafamento, a bebida deve ser filtrada. A filtração consiste
na passagem do destilado obtido, após destilação, por filtros ou membranas, com
o objetivo de eliminar possíveis impurezas oriundas dos processos de
armazenamento, preparo dos lotes e homogeneização, dando ao destilado maior
limpidez, transparência e brilho, ou corrigir possíveis defeitos, como elevados
teores de cobre (Maia e Campelo, 2006; Mutton e Mutton, 2005).
O engarrafamento é a operação que consiste no acondicionamento da
aguardente em embalagens de volumes variáveis. Normalmente esse volume
varia de 600 a 1.000 mL, e a embalagem, geralmente, é de vidro. Este processo
pode ser manual ou mecânico, seguido do fechamento da garrafa com a tampa e
a colocação do rótulo com as características da bebida, local de produção, grau
alcoólico, identificação do produtor, entre outras informações. Comercializar a
cachaça engarrafada agrega valor ao produto (Mutton e Mutton, 2005).
2.2 – Padrões de identidade e qualidade de aguardente
A aguardente de cana e a cachaça estão submetidas à legislação
nacional (BRASIL, 2005), de responsabilidade do Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA), que estabelece os padrões de identidade e
qualidade destes produtos, conforme descritos nas Tabelas 3, 4 e 5.
33
Tabela 3 – Padrões de identidade da aguardente de cana-de-açúcar e da
cachaça
Limite
Componentes Unidade
Mínimo
Máximo
Graduação alcoólica de
aguardente
% em volume de álcool
etílico a 20
o
C
38 54
Graduação alcoólica de
cachaça
% em volume de álcool
etílico a 20
o
C
38 48
Sacarose, em açúcar refinado,
cristal, invertido ou glicose**
g.L
-1
6,0 30,0
Congêneres* mg.100mL
-1
álcool
anidro
200 650
Álcool metílico mg.100mL
-1
álcool
anidro
--- 20
Cobre mg.L
-1
--- 5
Carbamato de etila
µg.L
-1
--- 150
Partículas em suspensão
------ ausentes
ausentes
* Congêneres = (Acidez Volátil + Ésteres + Aldeídos + Furfural + Alcoóis Superiores).
** Acima de 6 g.L
-1
(seis gramas por litro) deve aplicar a palavra “adoçada” no rótulo.
Fonte: BRASIL, 2005.
Tabela 4 – Limites para os congêneres estabelecidos pela legislação
brasileira
Limite (mg.100
-1
mL de álcool anidro)
Componente
mínimo máximo
Acidez volátil, em ácido acético --- 150
Ésteres, em acetato de etila --- 200
Aldeídos, em acetaldeído --- 30
Furfural + Hidroximetilfurfural --- 5
Alcoóis superiores* --- 360
*Alcoóis superiores = soma dos alcoóis isobutílico (2-metil-propanol), isoamílicos
(2-metil-1-butanol e 3-metil-1-butanol) e n-propílico (1-propanol).
Fonte: BRASIL, 2005.
(resíduo sólido)
34
Tabela 5 – Limites máximos permitidos de contaminantes na cachaça
estabelecidos pela legislação brasileira
Contaminante Unidade Limite Máximo
Álcool metílico (metanol) mg.100 mL
-1
de álcool anidro 20
Carbamato de etila* µg.L
-1
da bebida 150
Acroleína (2-propenal) mg.100 mL
-1
de álcool anidro 5
Álcool sec-butílico (2-butanol)
mg.100 mL
-1
de álcool anidro 10
Álcool n-butílico (1-butanol) mg.100 mL
-1
de álcool anidro 3
Cobre mg.L
-1
da bebida 5
Chumbo µg.L
-1
da bebida 200
Arsênio µg.L
-1
da bebida 100
*entra em vigor a partir de julho de 2010.
Fonte: BRASIL, 2005.
A legislação brasileira admite uma concentração máxima de cobre de
5 mg/L (cinco miligramas por litro). O excesso de cobre pode ser tóxico devido à
afinidade do cobre com grupos S-H de muitas proteínas e enzimas. Sua presença
em excesso está associada a várias doenças, como a epilepsia, melanoma e
artrite reumatóide, bem como à perda do paladar (Sargentelli, 1996).
Apesar de a legislação permitir a presença de metanol na cachaça, até 20
mg.100 mL
-1
de álcool etílico anidro, o ideal é que esteja ausente, visto sua
toxidade para o organismo humano. Esse álcool é originado da degradação da
pectina, um polissacarídeo presente na cana-de-açúcar, cuja unidade
monomérica é o ácido galacturônico (Cardoso et al., 2005). As pectinas
naturais apresentam mais que 50% dos resíduos de ácido galacturônico
esterificados com metanol, os quais são liberados durante o processo de
fermentação (Raven et al., 2001). Os fatores que propiciam a formação do
metanol são: queima da cana-de-açúcar para colheita, uso de acrescentar frutas
ao caldo e limpeza inadequada do alambique, deixando resíduos de bagacilhos
nas paredes internas do mesmo (Maia e Campelo, 2006).
35
O metanol é absorvido e metabolizado pelo organismo humano da
mesma forma que o etanol. No organismo, o metanol é oxidado a ácido fórmico e
posteriormente a CO
2
, provocando uma acidose grave (diminuição do pH
sangüíneo), afetando o sistema respiratório e podendo levar ao coma e até
mesmo à morte (Cardoso et al., 2005). Um dos métodos de tratamento é utilizar
doses elevadas de etanol, porque este compete com o metanol pela álcool-
desidrogenase, impedindo a formação do aldeído e do ácido fórmico, que são os
responsáveis pela intoxicação. Os sintomas de intoxicação pelo metanol são:
cefaléia, vertigem, vômitos, dor intensa na porção superior do abdômen, dor nas
costas, dispnéia, agitação motora e visão embaçada (Cardoso, 2006).
Os aldeídos são produtos normais da fermentação
alcoólica (Yokoya, 1995), entretanto, a legislação estabelece um limite para
estas substâncias, visto acarretarem problemas relacionados com o
sistema nervoso central (Cardoso, 2006).
Os padrões de identidade e qualidade, estabelecidos pela legislação, com
seus respectivos limites têm a finalidade de padronizar a cachaça e proteger a
saúde do consumidor. Essa padronização é essencial para que a bebida atenda
aos padrões internacionais de qualidade (Miranda, et al., 2007).
36
3. TRABALHOS
TEORES DE COMPOSTOS ORGÂNICOS EM CACHAÇAS PRODUZIDAS NA
REGIÃO NORTE FLUMIENSE - RJ
Leandro Marelli de Souza
*
e Karla Silva Ferreira
Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego, 2000, 28013-602, Campos dos
Goytacazes – RJ.
Luís César Passoni, Alice Barreto Bevitori e Karen Vieira Melo
Departamento de Ciencias Químicas, Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego, 2000, 28013-602, Campos dos Goytacazes –
RJ.
Arivaldo Ribeiro Viana
Estação Experimental de Campos, Empresa de Pesquisa Agropecuária do Estado
do Rio de Janeiro, Avenida Francisco Lamego, 134, 28080-000, Campos dos
Goytacazes – RJ.
1
*e-mail: [email protected]
37
RESUMO
Este trabalho teve o objetivo de quantificar alguns compostos orgânicos nas
cachaças produzidas pelos cooperados da Cooperativa dos Produtores de
Cachaça e Derivados da Cana-de-Açúcar do Norte Fluminense, do Estado do Rio
de Janeiro. O álcool etílico foi quantificado por densimetria, após destilação. O
ácido acético, metanol, 1-propanol, 1-butanol, iso-butanol, iso-amílico, acetato de
etila e acetaldeído foram determinados por Cromatografia Gasosa (CG) e o
furfural, 5-hidroximetilfurfural e acroleína por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (HPLC). Das 30 amostras analisadas, 63,3% delas apresentaram não
conformidade com a legislação nacional em pelo menos um dos componentes
analisados. Deste total, o grau alcoólico real, com 30% das amostras abaixo do
mínimo permitido, e a soma dos compostos 5-hidroximetilfurfural e furfural,
também com 30% das amostras acima do máximo permitido, foram os
parâmetros com maiores índices de irregularidades. O ácido acético e 1-butanol
apresentaram teores acima do máximo permitido em 13,3% e 10% das amostras,
respectivamente. Os compostos metanol e acroleína, assim como, alcoóis
superiores, não atenderam a conformidade em 3,3% das amostras. Todas as
amostras estão com níveis de acetaldeído e acetato de etila dentro do limite
permitido pela legislação.
Palavras-chave: aguardente, alcoóis, bebida.
ABSTRACT
This work aimed to quantify some organic compounds in “cachaças” (sugar cane
spirit) produced by the cooperators from the North part of Rio de Janeiro state
“Cachaca” and Sugar-Cane Derivatives Producers Cooperative. The ethyl alcohol
was quantified by densimetry, after distillation. The acetic acid, methyl alcohol,
n-propyl alcohol, n-butyl alcohol, isobutyl alcohol, isoamyl alcohol (mixture of
2-methyl-butyl and 3-methyl-butyl), ethyl acetate and acetaldehyde were
determined by Gas Chromatography (GC) and the furfural, 5-hydroxy-
methylfurfural and acrolein by High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
38
From the 30 samples analyzed, 63.3% showed non-conformity with national
legislation regarding at least one of the analyzed components. From this total, the
real alcoholic degree – being 30% of the samples below the minimum permitted -
and the sum of 5-hydroxy-methylfurfural and furfural compounds - having 30% of
the samples above the maximum permitted – were the parameters with greater
irregularities rates. The acetic acid and n-butyl alcohol presented contents above
the maximum permitted level in 13.3% and 10% of the samples, respectively. The
methyl alcohol and acrolein compounds, as well as superior alcohols, did not show
conformity in 3.3% of the samples. All the samples present acetaldehyde and ethyl
acetate within the limit permitted by legislation.
Key-words: spirits, alcohols, beverages
INTRODUÇÃO
A produção de cachaça representa um importante segmento do setor
industrial brasileiro de bebidas, sendo a segunda bebida alcoólica mais apreciada
no Brasil, perdendo apenas para a cerveja. O PIB do setor é de cerca de US$ 500
milhões. Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA,
são produzidos, aproximadamente, 1,4 bilhões de litros de cachaça por ano no
Brasil.
1
Em 2007 foram exportados 9,0 milhões de litros, gerando uma
arrecadação de, aproximadamente, 13,8 milhões de dólares.
2
Existem mais de quatro mil marcas registradas no Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento e mais de 30 mil produtores em todo País,
gerando aproximadamente 400 mil empregos diretos e indiretos.
1
Dentre estas
empresas, destacam-se as micro, pequenas e médias empresas.
3
Durante a fermentação alcoólica ocorre formação de dois produtos
principais: álcool etílico e dióxido de carbono. Além desses, há, normalmente a
formação de pequenas quantidades de outros componentes, os quais recebem a
denominação de produtos secundários da fermentação alcoólica, tais como
ácidos carboxílicos, ésteres, aldeídos e alcoóis superiores.
4
A cachaça é regulamentada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA), por meio da Instrução Normativa N°13
5
. Tal Normativa
estabelece a composição química, os requisitos de qualidade e a concentração
39
máxima permitida de contaminantes, como cobre e carbamato de etila. Os
padrões de identidade e qualidade, estabelecidos pela legislação, com seus
respectivos limites têm a finalidade de padronizar a cachaça e proteger a saúde
do consumidor. Essa padronização é essencial para que a bebida atenda aos
padrões internacionais de qualidade e seja aceita pelo mercado externo,
proporcionando condições de abertura e manutenção do mercado de exportação,
6
além de proporcionar aceitação, no mercado interno, pelas classes de maior
poder aquisitivo, as quais exigem bebidas com maior controle de qualidade.
A região Norte do Estado do Rio de Janeiro se destaca pelo plantio de
cana-de-açúcar. Além da produção de açúcar e álcool por grandes usinas, há
vários produtores de cachaça. Grande parte deles são cooperados da
Cooperativa dos Produtores de Cachaça e Derivados da Cana-de-Açúcar do
Norte Fluminense (COOPCANF). Este estudo objetiva-se quantificar alguns
compostos orgânicos em cachaças produzidas por estes cooperados e avaliar
sua conformidade com os padrões de identidade e qualidade estabelecidos pela
legislação vigente.
PARTE EXPERIMENTAL
Amostras
Foram coletadas 30 amostras de volume variando entre 600 mL a
1000 mL de cachaça de dezesseis associados da Cooperativa dos Produtores de
Cachaça e Derivados da Cana-de-Açúcar do Norte Fluminense (COOPCANF) do
Estado do Rio de Janeiro que estavam produtivos ou que tinham produtos no
mercado, no segundo semestre de 2006 e primeiro semestre de 2007. As
amostras foram adquiridas por meio de compra no comércio de Campos dos
Goytacazes – RJ ou diretamente nos alambiques. O número de amostras de cada
Marca variou de uma a seis amostras, dependendo da existência de cachaças
com diferentes características na época da pesquisa. Na Tabela 1 estão descritas
as características de cada amostra.
40
Tabela 1 – Relação das amostras de cachaça analisadas, respectivas indústrias e
o critério de diferenciação
Indústria Amostras
Critério de diferenciação
1
Prata, armazenada por seis meses em reservatório de aço carbono.
2
Prata, armazenada por um ano em reservatório de aço carbono.
3
Prata, armazenada por dois anos em reservatório de aço carbono.
4
Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
5
Armazenada por dois anos em barril de cerejeira.
Marca 1
6
Armazenada por dois anos em barril de carvalho.
7
Armazenada por um ano em barril de carvalho e produzida em 2006.
8
Armazenada por dois anos em barril de carvalho e produzida em 2005.
Marca 2
9
Armazenada por dois anos em barril de carvalho e produzida em 2001.
10
Armazenada por uma semana em barril de balsamo.
11 Blend (safra 2006 com 2007) e armazenada em barril de balsamo.
12
Armazenada por quatro anos em barril de carvalho.
13
Armazenada em barril de carvalho (tempo não especificado).
Marca 3
(Orgânica)
14
Armazenada por dois anos em barril de carvalho.
15
Armazenada por quatro anos em barril de carvalho.
Marca 4
16
Armazenada por cinco anos em barril de carvalho.
17
Prata produzida em 2007.
18 Safra 2006, armazenada por um ano em barril (madeira desconhecida).
Marca 5
19 Envelhecida (madeira e tempo desconhecidos).
Marca 6 20
Prata produzida no ano de 2006.
Marca 7 21
Prata produzida no ano de 2006.
Marca 8 22
Armazenada em barris de balsamo e carvalho por tempo desconhecido.
Marca 9 23
Prata produzida no ano de 2006.
Marca 10 24
Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
Marca 11 25
Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
Marca 12 26
Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
Marca 13 27
Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
Marca 14 28 Envelhecida (madeira e tempo desconhecidos).
Marca 15 29
Prata produzida no ano de 2007.
Marca 16 30
Prata produzida no ano de 2002.
41
Reagentes e padrões
Os padrões metanol, etanol, 1-propanol, 1-butanol, iso-butanol,
iso-amílico, acetato de etila, acetaldeído e ácido acético foram de
grau cromatográfico (Fluka e Sigma) e
acroleína (Fluka), furfural e
5-hidroximetilfurfural (Chem service).
O reagente 2,4-dinidrofenilidrazina (Chem Service) foi purificado por três
sucessivas recristalizações em etanol. Os demais reagentes utilizados foram de
grau analítico (Merck e Sigma).
Metodologias analíticas
A quantificação do teor alcoólico real foi realizada por densimetria após
destilação, de acordo com o Manual de Métodos de Análises de Bebidas e
Vinagres do Ministério da Agricultura.
7
O ácido acético, metanol, 1-propanol, 1-butanol, iso-
butanol,
iso-amílico (3-metil-1-butanol + 2-metil-1-butanol), acetato de etila e acetaldeído
foram determinados diretamente, sem concentração prévia da amostra, por
cromatografia gasosa (GC = Gas Chromatography), usando cromatógrafo a gás
Shimadzu, modelo GC-17A, equipado com um detector de ionização em
chama (FID = Flame ionization detection) e separados em uma coluna capilar
polar LM-100, série CB (35 m x 0,25 mm x 0,25 µm). As temperaturas do detector
e do injetor foram fixadas em 250°C e o modo de injeção com divisão de
fluxo (split) de 1:25 com um volume de injeção de 1,00 µL da amostra (cachaça).
Todas as análises, tanto das curvas analíticas, quanto das amostras, foram feitas
em duplicatas, e quando apresentavam discrepância, em triplicatas. O fluxo do
gás de arraste na coluna (H
2
) foi de 1,0 mL/min. A temperatura da coluna
seguiu uma programação. O programa de temperatura utilizado na coluna foi:
35°C (isoterma de 7 min), 7°C/min até 90°C (isoterma de 5 min), e 15 °C/mim
até 120 °C (1,0 min).
As curvas analíticas foram preparadas contendo cinco pontos, nas
seguintes faixas de concentração, em mg.100 mL
-1
de álcool anidro:
acetaldeído (7,5 a 37,5), acetato de etila (50 a 250), metanol (5 a 25),
1-propanol (30 a 150), iso-butanol (30 a 150), 1-butanol (0,75 a 3,75),
42
iso-
amílico (30 a 150) e ácido acético (37,5 a 187,5) em meio
hidroalcoólico (etanol 40% v/v), procurando-se reproduzir as condições da matriz
analisada. Utilizou-se a regressão linear, plotando-se a relação área dos picos
dos padrões/área do padrão interno versus concentração. Os coeficientes de
correlação foram sempre bem próximos à unidade. O 4-metil-2-pentanol, grau
UV/HPLC foi o padrão interno usado.
O cromatograma dos padrões do acetaldeído, acetato de etila, ácido
acético, os alcoóis (metanol, etanol, 2-butanol, 1-propanol, iso-butanol, 1-butanol
e iso-amílico) e o padrão interno 4-metil-2-pentanol obtidos por cromatografia
gasosa (GC = Gas Chromatography), equipado com um detector de ionização em
chama (FID = Flame ionization detection) em uma coluna capilar polar LM-100 e a
identificação dos picos encontram-se na Figura 1.
Figura 1 - Cromatograma dos padrões obtido por GC-FID em coluna polar LM-100.
Os compostos acroleína, furfural e 5-hidroximetilfurfural foram
quantificados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC = High
Performance Liquid Chromatography) em Cromatógrafo Shimadzu (modelo
LC-10AD), com Injetor Shimadzu (loop de 20 µL), detector espectrofotométrico
UV-Visível, (modelo SPD-M10A) e coluna SUPELCOSIL
TM
LC-18 (5 micra),
43
com 250 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno. Todas as amostras e
fase móvel foram degaseificadas em lavadora ultra-sônica, marca Ultra Sonic
Cleaner. Aproximadamente, 1,0 mL de cada amostra, no momento da injeção, foi
filtrado em filtro PTFE para filtrações de solventes orgânicos, com 0,45 micra de
diâmetro de poro, marca Millipore. Todas as injeções, tanto das curvas analíticas,
quanto das amostras, foram feitas em duplicatas, e quando apresentavam
discrepância, em triplicatas, com um volume de injeção de 20 µL.
A fase móvel usada foi metanol:água. O metanol de grau UV/HPLC e a
água utilizada purificada pelo sistema Milli-Q (Millipore - Bedford, USA). O
gradiente de eluição empregado foi metanol:água (65:35 v/v) por 5 min,
metanol:água (85:15 v/v) em 10 min e metanol:água (65:35 v/v) em 15 min e o
fluxo de 1,0 mL.min
-1
. Os derivados foram quantificados a 365 nm e o tempo de
corrida foi de 15 min.
Os derivados carbonílicos da 2,4-dinidrofenilidrazina (2,4 DNPH) foram
obtidos conforme descritos anteriormente,
8
com modificações. Para cada um dos
padrões pesou-se 0,40 g de 2,4 DNPH, posteriormente, dissolvidos em ácido
sulfúrico concentrado (2,0 mL) e água destilada (3,0 mL). Nestas soluções foram
adicionados 0,10 g de cada padrão, dissolvido em etanol (15,0 mL). Os padrões
5-hidroximetilfurfural e acroleína, com pureza de 99,5% e furfural com 98,9%.
Este material foi centrifugado a 1800 RPM por 5,0 minutos e sobrenadante
descartado. O precipitado foi lavado com 5,0 mL de etanol absoluto e centrifugado
a 1800 RPM durante 5,0 minutos. Esse processo foi repetido por duas vezes.
Após a centrifugação, o precipitado foi deixado durante quatro dias
em temperatura de 30 ºC, dentro de um béquer coberto com filme plástico
com pequenos furos, para a evaporação do etanol. Este material foi diluído em
etanol-água (40:60 v/v) para o preparo da solução estoque de acroleína-DNPH,
furfural-DNPH e 5-hidroximetilfurfural-DNPH com concentração 1000 mg.L
-1
. As
curvas analíticas foram construídas usando-
se cinco pontos com faixa
de concentração de 5 a 25 mg.L
-1
. Para a análises destes compostos nas
cachaças, 4,0 mL de cada amostra foi colocada em tubo de ensaio de 50 mL,
adicionando-se 1,00 mL de solução 0,4% de 2,4-DNPH diluído em acetonitrila
e 50,0 µL de HClO
4
1,0 mol.L
-1
.
A solução resultante foi agitada e mantida à
temperatura ambiente por 40 minutos até a injeção no cromatógrafo.
44
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Tabela 2 são apresentados os valores máximos, mínimos, médio e
desvio padrão dos componentes detectados nas amostras de cachaça e na
Tabela 3 o número e porcentagem de amostras que não atendem aos parâmetros
de identidade e qualidade segundo a Instrução Normativa N° 13.
5
A Figura 2
ilustra o grau alcoólico das diferentes amostras analisadas.
Tabela 2 – Limites máximos e mínimos, composição físico-química, média e
desvio padrão dos componentes analisados
Limites*
Componentes Unidades
Mínimo
Máximo
Valor
máximo
1
Valor
mínimo
1
Valor médio ±
desvio padrão
Grau alcoólico
% em volume de
álcool etílico a 20
o
C
38 48 46,0 32,0 38,8 ± 2,7
Furfural+
hidroximetilfurfural
mg.100mL
-1
álcool
anidro
--- 5,0 9,5 1,1 4,2 ± 2,0
Acidez volátil, em
ácido acético
mg.100mL
-1
álcool
anidro
--- 150 186,3 N.D 98,8 ± 41,9
1-Butanol
mg.100mL
-1
álcool
anidro
--- 3,0 3,2 N.D 1,3 ± 0,9
Álcool metílico
(Metanol)
mg.100mL
-1
álcool
anidro
--- 20 28,9 N.D 5,7 ± 4,7
Alcoóis superiores**
mg.100mL
-1
álcool
anidro
--- 360 554,5 120,8 236,1 ± 82,7
Acroleína
mg.100mL
-1
álcool
anidro
--- 5 7,9 N.D 0,5 ± 1,5
Aldeídos, em
acetaldeído
mg.100mL
-1
álcool
anidro
--- 30 22,2 7,4 14,9 ± 3,4
Ésteres, em a
cetato
de etila
mg.100mL
-1
álcool
anidro
--- 200 170,8 27,4 58,5 ± 33,5
1
Média das duplicatas; (N.D) Não detectado.
*Limites estabelecidos pela Instrução Normativa N°13.
5
**Alcoóis superiores = soma dos alcoóis iso-butílico (2-metil-propanol), iso-amílicos (2-metil-1-
butanol e 3-metil-1-butanol) e n-propílico (1-propanol).
45
Tabela 3 – Número de amostras de cachaça das 30 analisadas que não
atendem aos parâmetros de identidade e qualidade proposto pela
Instrução Normativa N° 13
5
Componentes
Número de amostras
irregulares*
Porcentagem
Grau alcoólico real
9 30 %
Furfural+hidroximetilfurfural
9 30%
Ácido acético
4 13,3%
1-Butanol
3 10%
Metanol
1 3,3%
Alcoóis superiores**
1 3,3%
Acroleína
1 3,3%
Acetaldeído
- 0%
Acetato de etila
- 0%
*Amostras irregulares conforme Instrução Normativa N°13.
5
**Alcoóis superiores = soma dos alcoóis iso-butílico (2-metil-propanol), iso-amílicos
(2-metil-1-butanol e 3-metil-1-butanol) e n-propílico (1-propanol).
Grau Alcoólico Real
M
a
r
c
a
6
M
a
r
c
a
7
M
a
r
c
a
8
M
a
r
c
a
1
0
M
a
r
c
a
9
M
a
r
c
a
4
M
a
r
c
a
1
1
M
a
r
c
a
1
2
M
a
r
c
a
1
4
M
a
r
c
a
1
6
M
a
r
c
a
1
M
a
r
c
a
2
M
a
r
c
a
3
M
a
r
c
a
5
Marca 13
M
a
r
c
a
1
5
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
% em volume de álcool etílico a 20
o
C
Limite máximo Cachaças Limite mínimo
Figura 2 – Valores de grau alcoólico das diferentes amostras analisadas e limite
mínimo e máximo para um destilado ser considerado cachaça, conforme Instrução
Normativa N° 13.
5
46
Os estudos demonstraram a existência de nove amostras, 30%, com teor
alcoólico abaixo do aceitável pela legislação e apenas uma amostra apresentava
o teor real de etanol encontrado idêntico ao informado no rótulo (Marca 12).
Discrepância entre o teor real de etanol e o informado no rótulo das cachaças, na
maioria das vezes, ocorre por negligência do produtor. A principal delas é a
temperatura do destilado no momento da medida do grau alcoólico, que deve ser
de 20
o
C. Caso não seja possível ajustar a temperatura do destilado, o produtor
deve efetuar a correção da temperatura no momento da leitura usando tabelas de
conversão para 20
o
C.
9
Em um estudo investigando os parâmetros de qualidade em aguardentes
de cana produzidas no Estado da Paraíba, os autores descrevem uma não
conformidade em 20% das amostras estudadas, referente à graduação
alcoólica.
10
Outros estudos indicaram valores próximos a 10%.
6-11
A soma dos teores de furfural e 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) variaram
de 1,1 a 9,5 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro, sendo que nove amostras (30%)
continham teores acima do máximo permitido. Estudos detectaram teores
máximos de 8,8 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro para o composto furfural
em amostras de cachaça artesanal de cana não queimada.
12
Análises
de 31 amostras de cachaça pertencentes ao acervo do Laboratório de
Biotecnologia (Labiotec/Detal/UFC) continham teores máximos, em mg.L
-1
de
cachaça, próximos a 19,05 para o 5-HMF e 9,6 para furural.
13
A presença de furfural e 5-HMF em bebidas podem estar relacionadas à
queima do palhiço da cana-de-açúcar, à presença de açúcares residuais e de
bagacilhos. A temperatura elevada associada ao baixo pH do mosto
acarreta desidratação dos açúcares e hidrólise de polissacarídeos dos
bagacilhos (celulose, hemicelulose, pectina e outros) formando furfural e 5-HMF.
14
As pentoses, formam furfural como principal produto de degradação, enquanto as
hexoses formam 5-HMF (Figura 3). Outros fatores, como o envelhecimento da
bebida sob condições irregulares e a adição de caramelo, também, podem
contribuir para o aumento no teor destes componentes.
13-15
O cromatograma da Figura 4 ilustra os picos correspondentes
para acetaldeído, acetato de etila, ácido acético, os alcoóis (metanol, etanol,
1-propanol, iso-butanol, 1-butanol, iso-amílico) e o padrão interno 4-metil-2-
pentanol identificados em amostras de cachaças.
47
Figura 3 – Estrutura química do furfural e do 5-hidroximetilfurfural.
Figura 4 – Cromatograma típico de amostras de cachaça obtido por GC-FID em coluna
polar LM-100. As condições cromatográficas estão descritas em materiais e métodos.
A Instrução Normativa N° 13,
5
estabelece uma concentração máxima de
acidez volátil, em ácido acético de 150 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro. Neste
estudo, quatro amostras apresentaram teores de ácido acético
acima
do permitido, representando 13,3% das amostras analisadas. O teor máximo
encontrado em mg.100mL
-1
álcool etílico anidro
foi de 186,3 na amostra
15 (Marca 4). Outras amostras em excesso são: amostra 16 (160,8), 24 (165,2)
e 28 (165,2). Estudos usando amostras de cachaças da região Noroeste do Rio
Grande do Sul apresentam dados de acidez volátil de algumas amostras acima do
48
máximo estabelecido por lei.
16
Este estudo
16
descreve valores máximos, em
mg.100mL
-1
álcool etílico anidro, de 185,8 para cachaças produzidas na
microrregião de Cruz Alta e 180,0 para as amostras produzidas na microrregião
de Santa Rosa. Outras pesquisas utilizando noventa e quatro cachaças
comerciais
6
e investigações de compostos secundários em 45 diferentes
cachaças comerciais produzidas no Estado de Minas Gerais,
17
também,
apresentam resultados com amostras (8,5% e 6,7%, respectivamente) excedendo
o teor máximo permitido pela legislação vigente.
A acidez em cachaças pode ser devido à contaminação da cana-de-
açúcar ou do próprio mosto fermentado por bactérias acéticas (acetobacter), tanto
na estocagem da cana-de-açúcar quanto do próprio caldo.
4
A acidez volátil,
também, aumenta com o aumento do tempo de armazenamento da cachaça em
barris de madeira.
18
Estes autores
18
verificaram aumento na acidez volátil de 14,3
mg.100mL
-1
álcool etílico anidro em destilados após 36 meses de armazenamento
em barris de carvalho com capacidade para 250 L. Já outros trabalhos mostraram
que o descarte das frações dos destilados “cabeça” e “cauda”, especialmente da
última, reduz a acidez das aguardentes.
19-20
O 1-butanol e metanol são contaminantes de cachaça e,
conseqüentemente, não devem ser encontrados ou somente detectados em
valores baixos. A instrução Normativa N° 13 permite o valor máximo do 1-butanol
de 3,0 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro.
5
Três amostras apresentaram teores
acima do permitido, em mg.100mL
-1
álcool etílico anidro, mas muito próximos
do limite máximo. São elas: amostra 9 (3,1), amostra 15 (3,2) e amostra 21 (3,1).
Em 16,7% das amostras o teor de 1-butanol não foi detectado. O principal fator
para formação de 1-butanol em cachaças é a contaminação por bactérias
acetobutílicas durante o processo de fermentação. Esta contaminação pode ser
reduzida não deixando a cana-de-açúcar próxima a estábulos e locais de
ordenha.
21
O teor de metanol foi superior ao estabelecido pela legislação apenas na
amostra 24 (Marca, 10) com 28,9 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro. Nas demais
amostras, os teores detectados foram abaixo de 10 mg.100mL
-1
álcool etílico
anidro, correspondendo a 50 % do valor máximo permitido pela Instrução
Normativa N° 13.
5
Trabalhos atuais não têm detectado teores de metanol acima
49
do máximo permitido pela legislação.
12-16-18-22
Dentre estes, alguns resultados são
muito próximos ao encontrado no presente estudo.
22
O metanol presente na cachaça origina-se do metabolismo secundário
das leveduras. Os fatores que propiciam sua formação são a queima da cana-de-
açúcar no momento da colheita, o acréscimo de frutas ao caldo-de-cana durante a
fermentação e limpeza inadequada do alambique, deixando resíduos de
bagacilhos nas paredes internas do mesmo.
21
Os bagacilhos são ricos em
substâncias pécticas, polímeros de ácidos galacturônico com grau variável de
metoxilação.
23
A atuação de enzimas pécticas das leveduras liberam o metanol.
24
No organismo, o metanol é oxidado a ácido fórmico e posteriormente a CO
2
,
provocando acidose (diminuição do pH sangüíneo) e afetando o sistema
respiratório, podendo levar ao coma e até mesmo à morte.
23
O teor de metanol
em cachaças, também, pode estar relacionado com o material utilizado na
fabricação do alambique, sendo superior em aguardentes destiladas em
alambiques de cobre, quando comparados com alambiques de aço inox.
25
O limite máximo para os alcoóis superiores foi elevado de 300
26
para
360 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro,
5
permitindo o comércio de uma bebida
mais “encorpada”. Os valores dos alcoóis superiores foram obtidos pela soma dos
alcoóis iso-butílico (2-metil propanol), iso-amílicos (2-metil -1-butanol e 3-metil-1-
butanol) e propílico (1- propanol). Apenas a Marca 10 (amostra 24), excedeu ao
limite máximo permitido pela legislação atual, sendo que em todas as demais
cachaças os teores deste composto apresentavam-se dentro dos limites
estipulados pela legislação. Houve uma grande variação no teor de alcoóis
superiores (em mg.100mL
-1
álcool etílico anidro), com mínima de 120,8 e máxima
de 554,5 (Tabela 2). Estudos realizados por Miranda e colaboradores
6
detectaram
quatro amostras com os teores destes alcoóis fora do limite estabelecido pela
legislação em um universo de 94 amostras. Porém, Barcelos e colaboradores
27
não detectaram amostras irregulares, mas observaram diferença significativa
entre os teores detectados nas amostras do Sul de Minas (média de 176,6
mg.100mL
-1
álcool etílico anidro) quando comparados com as produzidas no Vale
do Jequitinhonha (média de 235,1 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro). Amostras
coletadas na Zona da Mata apresentam valores intermediários (média de 221,9
mg.100mL
-1
álcool etílico anidro).
50
A formação de alcoóis superiores é maior quando o fermento apresenta
atividade fraca, ocasionando demora no processo fermentativo.
28
As condições do
meio de fermentação, a temperatura e o teor alcoólico final do vinho são fatores
que interferem na concentração de alcoóis superiores em destilados.
27
Outras
variáveis, como a concentração de aminoácidos e pH do mosto, o intervalo de
tempo entre a fermentação e a destilação e o tempo prolongado de
armazenamento da cana-de-açúcar, também, interferem no teor de alcoóis
superiores.
29
A acroleína é extremamente tóxica por todas as vias de administração e
tem mostrado características mutagênicas, além de provocar irritação no trato
respiratório de animais e humanos.
15
Neste estudo, apenas a amostra 22 (com
7,9 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro) excedeu o limite permitido pela
legislação (Tabela 2). Nascimento e colaboradores
30
descrevem em seus
resultados um teor máximo de 0,7 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro. A produção de
acroleína pela transformação de 3-hidroxipropanal é comum em cidras e provoca
uma alteração indesejada, responsável pelo aroma de pimenta nas bebidas. Nos
vinhos, este metabolismo é associado à presença das bactérias
termofermentativas: Bacillus amaracrylus e Lactobacillus colinoides.
15
Os teores dos compostos acetaldeído e acetato de etila não excederam o
valor máximo permitido pela legislação
5
em nenhuma das amostras. Estes
resultados condizem com os estudos realizados com amostras de cachaças
produzidas na Região Noroeste do Rio Grande do Sul
16
e amostras coletadas em
diferentes unidades produtoras da região de Araras, Estado de São Paulo,
provenientes de destilação em colunas de fluxo contínuo.
18
Entretanto, em
noventa e quatro amostras de cachaças produzidas em diferentes Regiões
Brasileiras foram detectadas seis amostras com teores de acetato de etila acima
do limite permitido e dezesseis com excesso de acetaldeído.
6
Altos teores de
aldeídos nas cachaças podem ser indicação de oxidação espontânea ou devido à
atividade de bactérias contaminantes,
28
podendo influenciar negativamente o
sabor da aguardente por ocasionar aumento do sabor pungente das bebidas
alcoólicas.
31
Estudos indicam o aumento significativo nos teores de acetaldeído e
acetato de etila após 36 meses de envelhecimento em barris de madeira
18
.
Segundo estes autores
18
, recipientes de madeira transferem compostos
51
existentes em sua estrutura à bebida e que teores mais elevados de acetaldeído e
acetato de etila são indicativos de envelhecimento das cachaças. Estes dados
condizem com os resultados obtidos neste estudo, quando foi possível comparar
amostras com características diferentes, pertencentes a uma mesma Marca, as
armazenadas em barril de madeira por períodos mais longos, apresentavam
teores destes compostos superiores aos de amostras com menor tempo de
armazenamento.
Um outro fator importante na composição química das cachaças é o
material utilizado para fabricação do alambique. Nascimento e colaboradores
25
ao
estudarem a influência do material do alambique, detectaram maiores teores de
acetaldeído nas cachaças destiladas em alambiques de cobre. As aguardentes
destiladas nesse tipo de alambique apresentaram teores médios de aldeídos,
aproximadamente, 50 % superior as destiladas em alambique de aço inox.
CONCLUSÕES
Em relação aos atuais padrões de identidade e qualidade para a cachaça
estabelecidos na legislação brasileira, apenas 36,7% das amostras estão em
conformidade com a legislação
5
em todos os itens analisados. O grau alcoólico
real e a soma dos compostos 5-hidroximetilfurfural e furfural, foram os parâmetros
com maiores índices de irregularidades apresentados pelas amostras, em
seguida, encontra-se o ácido acético. Os alcoóis superiores (soma dos alcoóis
iso-butílico, iso-amílicos e propílico), o ácido acético e o acetato de etila foram os
componentes que apresentaram os maiores desvio padrão, refletindo as
dificuldades enfrentadas pelos produtores em garantir a qualidade e a
padronização da bebida em todas as etapas da produção. O alto índice de
amostras (63,3%) que revelaram em não conformidade com a legislação
5
em pelo
menos um dos componentes analisados compromete as exportações e dificulta o
crescimento do mercado interno da cachaça. A cachaça pertencente à Marca dez
se destacou em relação às demais amostras, por obter o maior índice de
irregularidade, com teores de ácido acético, metanol e alcoóis superiores acima
do limite máximo permitido e, ainda, teor alcoólico real abaixo do permitido.
52
AGRADECIMENTOS
A FAPERJ pelo Auxílio Pesquisa para a execução do projeto e bolsa do
doutorando, e aos produtores pelas amostras de cachaça cedidas.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2. http://aliceweb.desenvolvimento.gov.br, cessada em julho de 2008.
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Lavras, 2006, cap. 5.
5. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento; Instrução
Normativa N° 13, de 29 de junho de 2005. Publicado no D.O. U. de 30/6/2005.
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11. Vilela, F. J.; Cardoso, M. G.; Masson, J.; Anjos, J. P.; Cienc. Agrotec. 2007,
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12. Masson, J.; Cardoso, M. G.; Vilela, F. J.; Pimentel, F. A.; Morais, A. R.; Anjos,
J. P.; Cienc. Agrotec. 2007, 31, 1805.
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15. Azevêdo, L. C.; Reis, M. M.; Silva, L. A.; Andrade, J. B.; Quim. Nova 2007, 30,
1968.
53
16. Bogusz Junior, S.; Ketzer, D. C. M.; Gubert, R.; Andrades, L.; Gobo, A. B.;
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17. Pereira, N. E.; Cardoso, M. G.; Azevedo, S. M.; Morais, A. R.; Fernandes, W.;
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20. Boza, Y.; Horii, J.; B.CEPPA 2000, 18, 85.
21. Maia, A. B. R. A.; Campelo, E. A. P.; Tecnologia da Cachaça de Alambique,
Editora SEBRAE/MG; SINDBEBIDAS: Belo Horizonte, 2006.
22. Miranda, M. B.; Horii, J.; Alcarde, A. R.; Ciênc. Tecnol. Aliment. 2006, 26, 772.
23. Cardoso, M. G.; Campos, G. A.; Silva, R. A.; Santos, C. D.; Pinto, A. P. S.;
Silva, C. F.; PROEX/UFLA. Disponivel em http://www.editora.ufla.br, acessado
julho 2005.
24. Raven, P. H.; Evert, R. F.; Eichhorn, S. E.; Biologia Vegetal, 6° ed., Editora
Guanabara Koogan, 2001.
25. Nascimento, R. F., Cardoso, D. R., Lima Neto, B. S., Franco, D. W. Quim.
Nova 1998, 21, 737.
26. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento; Potaria N° 371,
de 18 de setembro de 1974. Publicado no D.O.U. de 19/09/1974.
27. Barcelos, L. V. F.; Cardoso, M. G. C.; Vilela, F. J.; Anjos, J. P.; Quim. Nova
2007, 30, 1009.
28. Yokoya, F.; Fabricação de aguardente de cana. Campinas: Campinas, 1995.
29. Crowell, E. A.; Amer. J. Eco. Viticul. 1961, 12, 111.
30. Nascimento, R. F.; Marques, J. C.; Lima Neto, B. S.; Keukeleire, D. D.;
Franco, D. W.; J. Chromatogr. 1997, 782, 13.
31. Oliveira, E. S. Tese Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, Brasil,
2001.
54
TEORES DE COBRE, ZINCO, FERRO, SÓDIO E POTÁSSIO EM CACHAÇAS
Leandro Marelli de Souza
1*
, Karla Silva Ferreira
1
e Luís César Passoni
2
1
Laboratório de Tecnologia de Alimentos. Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Av. Alberto Lamego, N° 2000, CEP 28013-
2
Laboratório de Ciências Químicas. Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro (UENF). Av. Alberto Lamego, N° 2000, CEP 28013-602, Campos
dos Goytacazes – RJ, Brasil. E-mail: [email protected]
55
RESUMO
A composição mineral pode servir como indicativo de contaminação da cachaça
durante e após a destilação. Com o objetivo de conhecer alguns aspectos da
qualidade da cachaça produzida na região Norte do Estado do Rio de Janeiro
foram determinados os teores de cobre, zinco, ferro, sódio e potássio em
cachaças produzidas pelos associados da Cooperativa dos Produtores de
Cachaça e Derivados da Cana-de-Açúcar do Norte Fluminense. Os teores de
cobre, ferro e zinco foram determinados por espectrofotometria de absorção
atômica e os de sódio e potássio por fotometria de chama. As amostras foram
preparadas com oxidação da matéria orgânica por via úmida. Das 30 amostras
estudadas, 46,7% estavam com teores de cobre acima do limite máximo permitido
pela legislação. Houve presença de zinco em todas as amostras analisadas e
75% apresentaram ferro. Aproximadamente, 60% das amostras continham sódio
e em 25% detectou-se potássio.
Termos para indexação: aguardente, análise de bebidas, absorção atômica,
fotometria de chama.
ABSTRACT
Mineral composition can serve as an indicative of “cachaça” (sugar cane spirit)
contamination during and after the destilation. Aiming to know some of the aspects
of “cachaça” quality produced in the northern region of Rio de Janeiro State, it has
been determined the contents of copper, zinc, iron, sodium and potassium in
“cachaças” produced by associates of Norte Fluminense “Cachaça” and Sugar-
Cane Derivatives Producers Cooperative. The copper, zinc and iron contents have
been determined by atomic absorption spectrophotometry, and the sodium and
potassium contents by flame photometry. The samples have been separated with
oxidation of organic matter through wet method. From the 30 studied samples,
46.7% has presented copper contents above the maximum limit allowed by
legislation. There has been zinc presence in all the samples analyzed and 75%
56
has presented iron. Approximately, 60% of the samples have contained sodium,
and potassium has been detected in 25% of them.
Key-words: aguardente, beverage analysis, atomic absorption, flame photometry.
INTRODUÇÃO
Cachaça é a denominação típica e exclusiva da aguardente de cana
produzida no Brasil, com graduação alcoólica de 38% a 48% v/v, a 20
o
C, obtida
pela destilação do mosto fermentado do caldo de cana-de-açúcar com
características sensoriais peculiares, podendo ser adicionada de açúcares até
seis gramas por litro, expressos em sacarose (BRASIL, 2005).
Na fabricação artesanal da cachaça, a destilação é feita em
alambiques. Os tradicionais alambiques são construídos, principalmente,
de cobre (Veiga, 2006), embora sejam encontrados, também, em aço
inoxidavel (SEBRAE, 2004). Existem, ainda, vários produtores que usam
aparelhos de destilação produzidos com panela feita em aço inoxidável contendo
algumas peças em cobre, como o deflegmador e a serpentina, que compõem a
coluna do destilador (Crispim, 2000).
Há indicações de que o cobre contribui para a obtenção de uma cachaça
de melhor qualidade, visto ser ele catalisador de certas reações químicas no
decorrer da destilação, sendo que, sua ausência no processo acarreta o
aparecimento de um odor desagradavel na bebida, proveniente de derivados de
enxofre, denominados sulfetos. Mas, também, destiladores feitos de cobre podem
acarretar a presença de sais de cobre na cachaça (SEBRAE, 2004).
Os sais de cobre são insolúveis em água e em álcool. No entanto, em
contato com ar úmido, ocorre a formação de carbonato e hidróxido de cobre,
componentes do azinhavre (de cor azul-esverdeada). Esses componentes
se acumulam no interior da alonga, e especialmente dentro da
serpentina de resfriamento, sendo arrastados para a cachaça durante a
destilação (Maia & Campelo, 2006). A legislação brasileira admite uma
concentração máxima de cobre de 5 mg.L
-1
de cachaça (BRASIL, 2005).
A presença de elevadas concentrações de cobre na cachaça é
indesejável e pode ser reduzida com assepsia adequada dos alambiques, após o
57
término diário do procedimento de alambicagem. Sua ingestão em excesso é
tóxica para o ser humano devido à afinidade com grupos S-H de muitas proteínas
e enzimas, acarretando várias doenças, por exemplo, epilepsia, melanoma, artrite
reumatóide e perda do paladar (Sargentelli et al., 1996).
A Instrução Normativa N° 13 estabelece limites máximos apenas para o
cobre, chumbo e arsênio (BRASIL, 2005). Mesmo não havendo limites
estabelecidos em legislação para os minerais ferro, zinco, sódio e potássio, sua
quantificação pode servir como indicativo de contaminação durante e após a
destilação. Com o objetivo de conhecer o perfil da cachaça produzida na região
Norte do Estado do Rio de Janeiro, em relação à sua composição mineral, foram
determinados os teores de cobre, zinco, ferro, sódio e potássio em cachaças
produzidas pelos associados da Cooperativa dos Produtores de Cachaça e
Derivados da Cana-de-Açúcar do Norte Fluminense (COOPCANF).
MATERIAL E MÉTODOS
Foram coletadas 30 amostras de volume variando entre 600 mL a
1000 mL de cachaça de dezesseis associados da Cooperativa dos Produtores de
Cachaça e Derivados da Cana-de-Açúcar do Norte Fluminense (COOPCANF) do
Estado do Rio de Janeiro, que estavam produtivos ou que tinham produtos no
mercado, no segundo semestre de 2006 e primeiro semestre de 2007. As
amostras foram adquiridas por meio de compra no comércio de Campos dos
Goytacazes – RJ ou diretamente nos alambiques. O número de amostras de cada
marca variou de uma a seis amostras, dependendo da existência de cachaças
com diferentes características na época da pesquisa. Na Tabela 1 estão descritos
os critérios de diferenciação de cada mostra.
Os teores de cobre, ferro e zinco foram determinados por
espectrofotometria de absorção atômica com chama de ar-acetileno em um
espectrofotômetro de absorção atômica, marca ZEISS, modelo AAS4. Os teores
de sódio e potássio por fotometria de chama em fotômetro de chama da
marca ANALYSER, modelo 910M. 10 mL de cada amostra, em triplicata, foram
levados para oxidação da matéria orgânica por via úmida usando “erlenmeyer”
de 250 mL, adicionando 5,0 mL de ácido nítrico e 1,0 mL de ácido perclórico.
58
Logo após, os frascos foram aquecidos em chapa aquecedora acoplado a um
exaustor (capela de exaustão), a temperatura de, aproximadamente, 180
o
C. Após
algum tempo, toda matéria orgânica foi completamente digerida, o que pôde ser
identificado pelos vapores exalados que passaram a exibir coloração branca.
Todo conteúdo dos frascos foi evaporado até restar, aproximadamente, 1,0 mL de
amostra que, posteriormente, foi levada para volume final de 50,0 mL com água
desmineralizada. Foram utilizados frascos de polietileno para acondicionamento
das amostras até o momento das análises.
As curvas de calibração dos minerais foram feitas a partir de soluções
estoque, próprias para absorção atômica, diluídas em água desmineralizada.
Todas as vidrarias utilizadas foram higienizadas com detergente neutro e
enxaguadas em água corrente, e posteriormente deixadas de molho em solução
ácida preparada com ácido clorídrico (0,1 mol e pH < 1,0) durante uma noite, em
seguida, enxaguadas três vezes com água desionizada.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os teores dos minerais detectados nas amostras de cachaça da Região
Norte Fluminense, bem como o critério de diferenciação pra cada amostra, estão
apresentados na Tabela 1.
59
1 – Teores de minerais nas amostras de cachaça (mg.L
-1
de cachaça) e o critério de diferenciação
Indústria Amostras Cobre* Zinco* Ferro* Sódio* Potássio* Critério de diferenciação
1 8,50
1
0,81 0,75 N.D.
N.D.
Prata, armazenada por seis meses em reservatório de aço carbono.
2 11,94
1
0,78 1,66 7,50 2,50 Prata, armazenada por um ano em reservatório de aço carbono.
3 4,88 0,28 0,48 N.D.
N.D.
Prata, armazenada por dois anos em reservatório de aço carbono.
4 10,78
1
0,48 0,23 5,00 N.D.
Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
5 6,44
1
0,14 1,86 N.D.
N.D.
Armazenada por dois anos em barril de cerejeira.
Marca1
6 4,49 0,02 0,23 5,00 N.D.
Armazenada por dois anos em barril de carvalho.
7 6,08
1
0,64 0,07 10,00 5,00 Armazenada por um ano em barril de carvalho e produzida em 2006.
8 1,71 0,11 4,44 5,00 N.D.
Armazenada por dois anos em barril de carvalho e produzida em 2005.
Marca 2
9 4,70 0,10 0,76 7,50 2,50 Armazenada por dois anos em barril de carvalho e produzida em 2001.
10 7,46
1
0,08 0,53 2,50 N.D.
Armazenada por uma semana em barril de balsamo.
11 7,11* 0,10 1,71 2,50 N.D.
Blend (safra 2006 com 2007) e armazenada em barril de balsamo.
12 3,42 0,10 0,47 2,50 N.D.
Armazenada por quatro anos em barril de carvalho.
13 3,03 0,16 1,65 7,50 2,50 Armazenada em barril de carvalho (tempo não especificado).
Marca 3
(Orgânica)
14 2,97 0,07 0,29 5,00 N.D.
Armazenada por dois anos em barril de carvalho.
15 7,21
1
0,32 3,43 2,50 N.D.
Armazenada por quatro anos em barril de carvalho.
Marca 4
16 6,87
1
0,19 3,11 N.D.
N.D.
Armazenada por cinco anos em barril de carvalho.
17 6,59
1
1,64 N.D.
N.D.
N.D.
Prata produzida em 2007.
18 5,75
1
0,55 0,09 N.D.
N.D.
Safra 2006, armazenada por um ano em barril (madeira desconhecida).
Marca 5
19 5,41
1
0,31 N.D.
N.D.
N.D.
Envelhecida (madeira e tempo desconhecidos).
Marca 6 20 6,59
1
1,65 N.D.
5,00 2,50 Prata produzida no ano de 2006.
Marca 7 21 4,80 0,17 0,79 7,50 2,50 Prata produzida no ano de 2006.
Marca 8 22 4,32 0,16 0,85 7,50 N.D.
Armazenada em barris de balsamo e carvalho por tempo desconhecido.
Marca 9 23 2,54 1,61 N.D.
N.D.
N.D.
Prata produzida no ano de 2006.
Marca 10 24 4,91 0,15 0,50 10,00 5,00 Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
Marca 11 25 1,99 0,16 N.D.
N.D.
N.D.
Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
Marca 12 26 2,54 0,13 0,20 10,00 N.D.
Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
Marca 13 27 2,44 0,10 N.D.
2,50
__
Prata sem identificação quanto ao ano de produção.
Marca 14 28 7,24
1
0,30 1,38 N.D.
N.D.
Envelhecida (madeira e tempo desconhecidos).
Marca 15 29 4,47 0,31 0,12 N.D.
N.D. Prata produzida no ano de 2007.
Marca 16 30 2,95 2,07 0,05 10,00 2,50 Prata produzida no ano de 2002.
Valor médio ± desvio
padrão (amostras)
5,34±2,48
0,46±0,56
1,07±1,17
6,05±2,8
3,13 ± 1,16
Limite máximo permitido
2
5,0 ---- ---- ---- ----
*Média das triplicatas; (N.D) Não detectado.
1
Concentração acima do limite máximo permitido pela Normativa N° 13 (BRASIL, 2005).
2
Apenas o cobre, dentre os minerais estudados, possui limite estabelecido pela Normativa N° 13 (BRASIL, 2005).
60
A Instrução Normativa N° 13 estabelece limite máximo de 5,0 mg.L
-1
de
cachaça, para o mineral cobre (BRASIL, 2005). Das amostras analisadas, 46,7%
apresentaram teores de cobre acima do limite máximo permitido. Percebe-se,
ainda, que mesmo entre as amostras de uma mesma Marca, nem todas
apresentaram teores de cobre acima do limite estabelecido pela legislação
vigente. Estas amostras diferem quanto à data de fabricação, tempo de
armazenamento e madeira utilizada.
Cavalheiro et al. (2003) ao estudarem a influência do envelhecimento no
teor de cobre em cachaças, concluíram que o processo de envelhecimento da
cachaça em tonéis de madeira pode promover uma redução de até 75,0% no teor
de cobre. Dentre as amostras da Marca 3, o teor mais elevado foi encontrado na
amostra recém-produzida, com teores bem inferiores, nas amostras armazenadas
por períodos de tempo maiores, em barris de madeira.
Garbin et al. (2005) estudando os níveis de cobre em amostras de
cachaça produzidas na região noroeste do Rio Grande do Sul, encontraram níveis
de cobre acima do permitido pela legislação em 25,0% das amostras provenientes
da microrregião Cruz Alta, 57,1 % para amostras adquiridas na microrregião
Santa Rosa e 60,0% para as da microrregião Três Passos. Do total das noventa e
quatro amostras de cachaça comerciais estudadas por Miranda et al. (2007), 15%
apresentaram teor de cobre acima do limite estabelecido e o valor máximo
quantificado foi de 12,0 mg.L
–1
.
Estudos realizados por Azevedo et al. (2003) e Labanca et al. (2006) em
amostras de cachaças produzidas no Estado de Minas Gerais indicam teores
de cobre acima do máximo permitido entre 6,0% a 7,0% do total de amostras
analisadas. Ambos descrevem em seus resultados que o cobre foi detectado
em todas as amostras estudadas. Nos resultados de Labanca et al. (2006),
os teores variaram, em miligrama por litro de amostra, entre 0,05 a 8,10, com
média de 2,30.
Atualmente existe maior preocupação por parte da maioria dos produtores
em diminuir a contaminação por cobre de suas cachaças, buscando atender as
exigências legais. Observa-se que a assepsia adequada dos alambiques, após o
término diário do procedimento de alambicagem, reduz consideravelmente os
teores de cobre nos destilados (Sargentelli et al., 1996). Lima & Nóbrega (2004)
ao avaliarem os parâmetros de qualidade em aguardentes de cana produzidas no
61
Estado da Paraíba descrevem que a separação das frações “cabeça”, “coração” e
“cauda”, nas destilações fazem parte dos diversos procedimentos que podem
controlar os níveis de cobre nas cachaças. Uma alternativa ainda pouco
conhecida e estudada a fim de diminuir a contaminação de cobre em cachaças, é
a utilização de carvão ativado. Segundo estudo realizado por Lima et al. (2006), o
carvão ativado mostrou-se eficiente na remoção do cobre, sendo 12,0 g.L
-1
de
carvão ativado e tempo acima de 60 minutos mais recomendado para uma
cachaça cujos teores de cobre estejam próximos a 9,0 mg.L
-1
.
A presença de alguns minerais não citados pela legislação podem ser
indícios de contaminação durante e após a destilação. Nascimento et al. (1999),
avaliaram o perfil de íons metálicos em sessenta e nove cachaças, sendo
dezesseis amostras tipo exportação, trinta e sete comercializadas no mercado
interno e dezesseis produzidas de forma artesanal. Os teores médios de zinco
foram 0,14 mg.L
-1
para as amostras tipo exportação, 0,15 mg.L
-1
para as de
mercado interno e 0,13 mg.L
-1
para as fabricadas artesanalmente. Estes dados
indicam teores médios inferiores ao encontrados neste trabalho, mas ambos
indicam a presença de zinco em todas as amostras analisadas.
O bronze é uma liga metálica de cobre e zinco e muito utilizado,
principalmente, em válvulas, tampas e peças moldáveis das usinas (Veiga, 2006).
Provavelmente, a fonte de zinco encontrada nas amostras se deve a estes
componentes, que fazem parte de destiladores e, muitas vezes, de embalagens
usadas no armazenamento a granel de cachaças.
Há certo interesse na quantificação do elemento ferro na cachaça, pois
este pode alterar as características sensoriais da bebida. Os teores de ferro
variaram de não detectável a 4,44 mg.L
-1
, com média de 1,07 mg.L
-1
de cachaça.
Uma amostra da Marca 2 e as duas amostras da Marca 4, apresentaram teores
bem acima da média geral, entre 3,11 a 4,44 mg.L
-1
de cachaça (Tabela 1).
Teores médios variando entre 0,11 a 0,35 mg.L
-1
de cachaça foram detectados
por Nascimento et al., (1999). As possíveis fontes deste mineral em cachaças são
as peças utilizadas no processo de destilação, engarrafamento e armazenamento.
Também, pode estar presente em embalagens usadas no armazenamento a
granel de cachaças.
Das trinta amostras analisadas, aproximadamente, 60% apresentaram
sódio. O teor mais elevado de sódio foi 10,0 mg.L
-1
. Quanto ao potássio, foi
62
detectado em apenas oito amostras, com um teor máximo de 5,0 mg.L
-1
de
cachaça.
Nascimento et al. (1999), em seus estudos, encontraram teores de sódio
médios de 10,20 mg.L
-1
em aguardente de cana tipo exportação, 6,72 mg.L
-1
em cachaças comercializadas no mercado interno e 3,87 mg.L
-1
para
cachaças produzidas artesanalmente. Para os teores de potássio, os valores
foram 8,64 mg.L
-1
nas exportadas, 3,05 mg.L
-1
nas comercializadas no mercado
interno e 5,07 mg.L
-1
nas produzidas de forma artesanal.
Possíveis fontes de sódio e potássio em cachaças são os equipamentos e
utensílios usados nos processos subseqüentes à destilação contaminados com
estes elementos. A assepsia dos tonéis de armazenamento, dos recipientes
utilizados na blendagem (mistura de destilados de diversas graduações
alcoólicas), dos equipamentos utilizados na filtragem, no envase e na embalagem
utilizados para comercialização, normalmente, são feitos com água não destiladas
e detergentes contendo sódio. Além disso, os vegetais contêm teores elevados de
potássio em sua constituição, de forma que os tonéis de madeiras mais novos
poderiam liberar potássio para as cachaças.
CONCLUSÕES
Das amostras analisadas, 46,7% apresentavam teores de cobre acima do
limite máximo permitido pela legislação. A presença dos minerais zinco, ferro,
sódio e potássio, detectados em algumas amostras indicam contaminações
durante e, ou após a destilação da cachaça. Estes dados indicam que os
produtores desta região necessitam de assistência técnica para melhorar a
tecnologia para produção de suas cachaças.
AGRADECIMENTOS
A FAPERJ, pelo Auxílio Pesquisa para a execução do projeto e bolsa do
doutorando; ao Professor Pedro H. Monnerat e ao técnico de nível superior José
63
Accacio da Silva, pela leitura dos teores de cobre, zinco e ferro das amostras; e
aos produtores pelas amostras de cachaça cedidas.
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64
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65
COMPONENTES ORGÂNICOS E INORGANICOS AO LONGO DA
DESTILAÇÃO DO VINHO DO CALDO-DE-CANA PARA PRODUÇÃO DE
CACHAÇA
Leandro Marelli de Souza
1
, Karla Silva Ferreira
1
, Luís César Passoni
2
,
1
Laboratório de Tecnologia de Alimentos. Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Av. Alberto Lamego, N° 2000, CEP 28013-
602, Campos dos Goytacazes – RJ, Brasil. E-mail: marelli@uenf.br
2
Laboratório de Ciencias Químicas. Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro (UENF). Av. Alberto Lamego, N° 2000, CEP 28013-602, Campos
dos Goytacazes – RJ, Brasil.
66
RESUMO
A destilação é uma etapa importante na produção de cachaça, sendo responsável
por muitas das características sensoriais da bebida. Com a finalidade de conhecer
a composição química do destilado durante a destilação do vinho da cana-de-
açúcar, foram quantificados diversos compostos em diferentes frações do
destilado coletadas ao longo de 160 minutos de destilação. Utilizou-se a
cromatografia gasosa na quantificação do etanol, metanol, 1-propanol, 1-butanol,
iso-butanol, iso-amílico, 1-hexanol, acetato de etila, acetaldeído e ácido acético e
os teores de cobre, ferro e zinco foram determinados por espectrofotometria de
absorção atômica. Os teores de acetaldeído, acetato de etila, 1-propanol e
1-butanol foram mais elevados nos primeiros momentos da destilação, e apenas,
o 1-butanol apresenta teores detectáveis após a primeira hora de destilação. O
metanol foi detectado em (78±4,9)% das amostras estudadas e observou-se que
ao longo da destilação, ocorreu uma redução progressiva dos teores de etanol,
iso-butanol e iso-amílico (2-metil-1-butanol + 3-metil-1-butanol), indicando um
perfil bem similar entre eles. A regressão linear ajuda a explicar esta similaridade,
indicando que ocorreu uma diminuição dos teores destes alcoóis ao longo da
destilação. Observa-se um incremento nos teores de 1-hexanol e ácido acético,
mostrando que maiores concentrações são encontradas na fase final da
destilação. Os minerais cobre, zinco e ferro foram detectados em todas as frações
estudadas, com valores médios variando, em mg.L
-1
de amostra, entre 3,55 a
54,66 para cobre, 0,07 a 0,51 para zinco e 0,05 a 0,70 para ferro.
Palavras-chave: aguardente, destilados, alcoóis, cromatografia, bebida.
ABSTRACT
Distillation is an important stage in “cachaça” (sugar cane spirit) production, being
responsible for many of the sensorial characteristics of beverage. Aiming to know
the distillate chemical composition during the sugar-cane wine distillation, it was
quantified several compounds from its different fractions, collected along its
160 minutes of distillation. A Gas Chromatography (GC) was used to quantify the
67
ethyl alcohol, methyl alcohol, n-propyl alcohol, n-butyl alcohol, isobutyl alcohol,
isoamyl alcohol (mixture of 2-methyl-butyl and 3-methyl-butyl), n-hexanol alcohol,
ethyl acetate, acetaldehyde and acetic acid; whereas the copper, iron and zinc
contents were determined by atomic absorption spectrophotometry. The
acetaldehyde, ethyl acetate, n-propyl alcohol, n-butyl alcohol were higher on the
first moments of distillation, and only the n-butyl alcohol presents detectable
contents after 1 hour of distillation. Methyl alcohol was detected in (78±4.9)% of
the studied samples and it has been observed that, along the distillation, a
progressive reduction of the ethyl alcohol, isobutyl alcohol and isoamyl alcohol
(mixture of 2-methyl-butyl and 3-methyl-butyl), indicating a very similar profile
among them. The linear regression helps to explain this similarity, by indicating
that a diminishment of these alcohols contents occurred along distillation. It has
been observed an increment of n-hexanol alcohol and acetic acid contents, which
shows that the greater concentrations are found on the final phase of the process.
The minerals copper, iron and zinc were detected in all the studied fractions,
having average values varied from, in mg.L
-1
of sample, between 3.55 and 54.66
for copper; 0.07 and 0.51 for zinc; and 0.05 and 0.70 for iron.
Key-words: aguardente, distillates, alcohols, chromatography, beverage.
INTRODUÇÃO
Ao destilar o vinho da cana-de-açúcar, obtém-se um novo líquido com
teor alcoólico cinco a seis vezes superior (Maia e Campelo, 2006). O mosto
fermentado ou vinho possui uma composição bastante complexa. Sob o ponto de
vista da volatilidade, têm-se os constituintes de natureza volátil e fixa. Os voláteis
são representados pela água, álcool etílico, aldeídos, ésteres, alcoóis superiores,
ácido acético etc., enquanto que os fixos são extratos do mosto e as células de
leveduras e bactérias. A água é o componente majoritário, em torno de 89% a
92% do vinho, e o álcool etílico, seu principal componente, representa de 5% a
8% em volume (SEBRAE, 2004). Outras substâncias estão presentes em
menores proporções, os componentes secundários, por exemplo, acetaldeído,
ácido succínico, ácido acético, ácido butírico, glicerina, furfural, alcoóis superiores,
entre outros. Os componentes secundários são oriundos de reações que ocorrem
durante os processos de fermentação, destilação e durante o arm
azenamento em
68
barris de madeira (Dias, 2006). Alguns destes são tóxicos e a legislação
brasileira (BRASIL, 2005) estabelece limites para eles visando à segurança ao
consumidor.
Durante o processo de destilação muitas reações ocorrem. Algumas
reações são conhecidas, como a hidrólise, esterificação, acetalização,
reações com o cobre, e produção de furfural, entre outras. Quando se aquece
uma mistura de substâncias líquidas, a proporção entre as moléculas de
cada substância que passa ao estado vapor é diferente da preexistente no
estado líquido (Maia e Campelo, 2006). Da condensação destes vapores,
obtém-se um produto líquido de composição diferente do líquido que o
originou (Crispin, 2000). No caso da fabricação da cachaça, o destilado deve ser
recolhido em um intervalo de 150 a 160 minutos. A separação das frações do
destilado em “cabeça”, “coração” (cachaça) e “cauda”, durante a destilação é de
fundamental importância na produção de cachaça. A fração “cabeça” é recolhida
nos primeiros minutos da destilação. Essa fração é a que contém o teor alcoólico
mais elevado, geralmente, acima de 60 °GL e representa cerca de 5% do volume
total do destilado. O “coração” é a cachaça propriamente dita e deve ser recolhido
por um tempo aproximado de 2 horas, representando 80% do volume total do
destilado. Os 15% restantes representam a fração final da destilação, a cauda,
geralmente com graduação alcoólica abaixo de 38°GL (Maia e Campelo, 2006).
No processo de destilação, o controle dos teores de componentes
secundários na cachaça está diretamente relacionado a características do
vinho a ser destilado, separação das frações durante a destilação, tipo do
destilador (alambique ou coluna), tamanho do destilador, temperatura gerada pela
fonte de aquecimento duração da destilação e limpeza do alambique (Dias, 2006).
Com a finalidade de quantificar componentes orgânicos e
inorgânicos com concentrações controladas pe
lo MAPA, em sua Normativa
n° 13 (BRASIL, 2005), esta pesquisa monitorou o processo de destilação do vinho
da cana-de-açúcar para produção de cachaça, em três diferentes alambiques,
durante 160 minutos de destilação, com amostras coletas em 23 pontos ao longo
da destilação, em tempos predeterminados.
69
MATERIAL E MÉTODOS
Foram monitoradas duas destilações, em três diferentes alambiques, que
diferiam com relação à fonte de alimentação de calor e ao tamanho e material
usado na fabricação das peças dos mesmos, conforme descrito abaixo.
Alambique 1: alambique composto de uma panela com capacidade
para 1000 L ligada a uma caldeira, que efetua o aquecimento do vinho mediante
vapor. Este vapor atravessa uma espiral situada no fundo da panela. A panela é
dotada de dispositivo para controle de temperatura e vazão e a caldeira permite
ajustar a pressão de vapor que irá aquecer o vinho. A panela, a espiral para
aquecimento a vapor dentro da panela e a coluna situada acima da panela, que
recebe os vapores do vinho, são constituídas de aço inoxidável. O aço inoxidável
é uma liga de ferro e cromo, podendo conter também níquel, molibdênio e outros
elementos, que apresenta propriedades físico-químicas superiores aos aços
comuns, sendo a alta resistência à oxidação atmosférica a sua principal
característica. Já a “alonga”, que se encontra ligada à parte mais alta da coluna, a
partir da qual os vapores são resfriados até serem recolhidos na extremidade
inferior no estado líquido, é toda de cobre. A Figura 1 ilustra o conjunto referente a
este alambique.
Alambique 2: alambique composto de uma panela com capacidade para
150 L aquecida por fogo direto produzido pela queima de madeira. Todos os
componentes do alambique (panela, coluna, alonga e as demais peças que
compõem o conjunto) são de cobre. A Figura 2 ilustra o conjunto referente ao
alambique 2.
Alambique 3: é idêntico ao segundo quanto à constituição das peças e
à fonte de calor, mas diferindo no tamanho da panela, que possui capacidade
para 500 L. A Figura 3 ilustra o conjunto referente a este alambique.
70
Figura 1 -
Alambique 1.
Legenda: (A) panela, (B) coluna, (C) preaquecimento do vinho
para próxima destilação, (D) condensador, (E) sistema
de corte do destilado.
71
Figura 2 - Alambique 2.
Legenda: (A) panela, (B) coluna, (C) alonga, (D) condensador.
A
B
C
D
72
Figura 3 - Alambique 3.
Legenda: (A) panela, (B) coluna, (C)
alonga,
(D) condensador.
A
B
C
D
73
Foram coletadas frações de 100 mL do destilado em cada um destes três
alambiques, em duas destilações efetuadas em diferentes dias. As amostras
foram coletadas em tempos predeterminados (0, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 40,
60, 80, 100, 120, 140, 144, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160 minutos), durante a
destilação. As coletas das amostras dos alambiques 1 e 2, foram realizadas no
segundo semestre de 2007 e as do alambique 3 no primeiro semestre de 2008.
Nestas amostras foi quantificado os componentes orgânicos etanol, metanol,
1-propanol, 1- butanol, iso-butanol, iso-amílico (3-metil-1-butanol + 2-metil-1-
butanol), 1-hexanol, acetato de etila, acetaldeído, ácido acético, e os inorgânicos
cobre, ferro e zinco.
Reagentes e padrões
Os padrões metanol, etanol, 1-propanol, 1-butanol, iso-butanol,
iso-amílico, 1-hexanol, acetato de etila, acetaldeído e ácido acético foram de grau
cromatográfico (Vetec, Nuclear e Sigma). Os demais reagentes utilizados foram
de grau analítico (Merck e Sigma).
Metodologias analíticas
Os compostos orgânicos foram determinados, sem concentração prévia da
amostra, por cromatografia gasosa (GC = Gas Chromatography), usando
cromatógrafo a gás Shimadzu, modelo GC-17A, equipado com um detector de
ionização em chama (FID = Flame ionization detection) e separados em uma
coluna capilar polar LM-100, série CB (35 m x 0,25 mm x 0,25 µm). As
temperaturas do detector e do injetor foram fixadas em 250°C e o modo de
injeção com divisão de fluxo (split) de 1:25 com um volume de injeção de 1,00 µL
da amostra (cachaça). Todas as análises, tanto das curvas analíticas, quanto das
amostras, foram feitas em duplicatas, e quando apresentavam discrepância, em
triplicatas. O fluxo do gás de arraste na coluna (H
2
) foi de 1,0 mL/min. A
temperatura da coluna seguiu uma programação. O programa de temperatura
utilizado na coluna foi: 35°C (isoterma de 7 min), 7°C/min até 90°C (isoterma
de 5 min), e 15 °C/mim até 120 °C (1,0 min).
74
As curvas analíticas foram preparadas contendo cinco pontos, nas
seguintes faixas de concentração, em mg.100 mL
-1
de álcool anidro:
acetaldeído (7,5 a 37,5), acetato de etila (50 a 250), metanol (5 a 25),
1-propanol (30 a 150), iso-butanol (30 a 150), 1-butanol (0,75 a 3,7
5),
iso-amílico (30 a 150), 1-hexanol (5 a 30) e ácido acético (37,5 a 187,5) em meio
hidroalcoólico (etanol 40% v/v), procurando-se reproduzir as condições da matriz
analisada. Utilizou-se a regressão linear, plotando-se a relação área dos picos
dos padrões/área do padrão interno versus concentração. Os coeficientes de
correlação foram sempre bem próximos à unidade. O 4-metil-2-pentanol, grau
UV/HPLC foi o padrão interno usado.
O cromatograma dos padrões do acetaldeído, acetato de etila, ácido
acético, os alcoóis (metanol, etanol, 2-butanol, 1-propanol, iso-butanol, 1-butanol,
iso-amílico e 1-hexanol) e o padrão interno 4-metil-2-pentanol obtidos por
cromatografia gasosa (GC = Gas Chromatography), equipado com um detector de
ionização em chama (FID = Flame ionization detection) em uma coluna capilar
polar LM-100 e a identificação dos picos encontram-se na Figura 4.
75
Figura 4 - Cromatograma dos padrões obtidos por GC-FID em coluna polar LM-100.
Os componentes inorgânicos foram determinados por espectrofotometria
de absorção atômica com chama de ar-acetileno em um espectrofotômetro de
absorção atômica, marca ZEISS, modelo AAS4. 10 mL de cada amostra, em
triplicata, foram levados para oxidação da matéria orgânica por via úmida usando
“erlenmeyer” de 250 mL, adicionando 5,0 mL de ácido nítrico e 1,0 mL de ácido
perclórico. Logo após, os frascos foram aquecidos em chapa aquecedora
acoplado a um exaustor (capela de exaustão), à temperatura de,
aproximadamente, 180
o
C. Após algum tempo, toda matéria orgânica foi
completamente digerida, o que pôde ser identificado pelos vapores exalados que
passaram a exibir coloração branca. Todo conteúdo dos frascos foram
evaporados até restar, aproximadamente, 1,0 mL de amostra que,
posteriormente, foi levada para volume final de 50,0 mL com água
76
desmineralizada. Foram utilizados frascos de polietileno para acondicionamento
das amostras até o momento das análises.
As curvas de calibração dos minerais foram feitas a partir de soluções
estoque, próprias para absorção atômica, diluídas em água desmineralizada.
Todas as vidrarias utilizadas foram higienizadas com detergente neutro e
enxaguadas em água corrente, e posteriormente deixadas de molho em solução
ácida preparada com ácido clorídrico (0,1 mol e pH < 1,0) durante uma noite, em
seguida, enxaguadas três vezes com água desionizada.
Nas análises dos resultados, considerou-se o planejamento estatístico de
Amostragem Simples ao Acaso (ASA). Aplicou-se o modelo linear de primeiro
grau a fim de estudar a tendência dos resultados. Verificou-
se a proporção
de resultados nulos de alguns compostos que apresentaram índices seqüenciais
de resultados com valores considerados zero e, fez-se um estudo de
correlações entre os teores de cobre e acetaldeído. Todas as análises foram
elaboradas utilizando o programa estatístico Software Analysis
and Experimentation Group (SAEG, 2005), em nível de probabilidade de erro (α)
de 5%.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O cromatograma da Figura 5 ilustra os picos correspondentes para
acetaldeído, acetato de etila, ácido acético, os
alcoóis (metanol, etanol,
1-propanol, iso-butanol, 1-butanol, iso-amílico e 1 hexanol) e o padrão interno
4-metil-2-pentanol identificados em amostras de cachaças.
77
Figura 5 – Cromatograma típico de amostras de cachaça obtido por GC-FID em coluna
polar LM-100. As condições cromatográficas estão descritas em materiais e métodos.
As Figuras 6, 7, 8 e 9 ilustram a variação dos teores de acetaldeído,
acetato de etila, 1-propanol e 1-butanol nas frações seqüenciais das destilações.
O ponto de corte da fração “cabeça”, realizado normalmente nestas indústrias,
está delimitado pela linha vertical de cor vermelha plotada nos gráficos.
Os teores destes compostos foram mais elevados nos primeiros
momentos da destilação, e a maioria não apresentou teores detectáveis após a
primeira hora de destilação, o que indicou que estes compostos são típicos da
fração do destilado de “cabeça”. Segundo Dias (2006), os produtos de “cabeça”
são compostos totalmente ou parcialmente solúveis no álcool, sendo destilado
quando o vapor contém alta concentração de álcool. Maia e Campelo (2006)
citam o acetaldeído e o acetato de etila como sendo os principais compostos
voláteis secundários da fração “cabeça”.
A análise de regressão linear foi significativa para os compostos
acetaldeído, acetato de etila e 1-propanol, em todas as destilações estudadas,
indicando uma queda linear nos seus teores. A investigação da proporção
78
dos
resultados considerados nulos indica a ausência do composto acetato
de etila em (65 ± 5)% das amostras analisadas, o acetaldeído não foi detectado
em (62 ± 4,5)%, 1-propanol em (60 ± 5)% e o 1-butanol em (69 ± 5)%.
Observa-
se uma queda média nos teores de acetaldeído, acetato de etila e
1-propanol próximos a 50% nos primeiros 12 minutos de destilação, conforme
ilustram as Figuras 6, 7 e 8.
Não houve homogeneidade nos teores de 1-butanol nas diferentes
frações do destilado. Porém, após 80 minutos de destilação, esse composto não
foi mais detectado, exceto no alambique 1 (Figura 9). A legislação atual permite
que esse contaminante esteja presente na fração “coração” do destilado na
concentração máxima de 3,0 mg.100mL
-1
álcool etílico anidro (BRASIL, 2005). O
principal fator para formação de 1-butanol nas fermentações alcoólicas é a
contaminação por bactérias acetobutílicas (Maia e Campelo, 2006).
Figura 6 – Variação dos teores de acetaldeído durante a destilação.
79
Figura 7 – Variação dos teores de acetato de etila durante a destilação.
Figura 8 – Variação dos teores de 1-propanol durante a destilação.
80
Figura 9 – Variação dos teores de 1-butanol durante a destilação.
Segundo Maia e Campelo (2006), o metanol é um composto típico do
destilado de “cabeça”. Estes dados divergem dos encontrados neste estudo, que
detectou o metanol ao longo da destilação, conforme ilustra a Figura 10.
Investigando a proporção de
resultados considerados nulos, foi observada
a ausência do composto metanol em (22 ± 4,9)% do total de observações,
indicando que este composto está presente na maioria das frações. De acordo
com Dias (2006), os compostos solúveis em água e álcool etílico, com ponto de
ebulição abaixo de 200 °C são destilados do começo ao fim da destilação. O
álcool metílico é solúvel tanto em água quanto em álcool etílico e seu ponto de
ebulição é 65,5 °C.
O metanol presente na cachaça origina-se a partir do metabolismo
secundário das leveduras que fazem a fermentação das bebidas alcoólicas. Na
cachaça, ele é formado principalmente quando não se tem o cuidado de separar,
por filtragem, os fragmentos da cana-de-açúcar que se originam no momento da
moagem (Crispim, 2000). Estes fragmentos, também conhecidos como
bagacilhos, são ricos em pectina. A pectina é um polissacarídeo cuja unidade
monomérica é o ácido galacturônico (Cardoso et al., 2005).
81
Figura 10 – Variação dos teores de metanol durante a destilação.
Ao longo da destilação, ocorre um abaixamento progressivo do
teor alcoólico do destilado, conforme ilustra a Figura 11. Segundo Maia e
Campelo (2006), uma boa destilação ocorre quando as primeiras frações do
destilado possuem um teor de etanol acima de 70 °GL e se encerra em um teor
abaixo de 20 °GL. Quando a eficiência é mais baixa, nota-se uma acentuada
redução no teor alcoólico do destilado de “cabeça”, acompanhada de um aumento
no teor alcoólico no destilado de “cauda”. A eficiência da destilação depende dos
critérios operacionais e da geometria do alambique, que determinam a eficiência
do refluxo dentro da coluna.
Um dos critérios operacionais é a intensidade da fonte de calor na panela
do alambique. Quanto menor for essa fonte, maior será o teor de etanol nas
primeiras frações, e as substâncias mais voláteis são mais destiladas; e
aumentando a intensidade da fonte de calor, ocorre menor teor de etanol no
destilado e, conseqüentemente, uma diminuição na destilação das substâncias
mais voláteis nas diferentes frações (Dias, 2006).
A regressão linear foi significativa para todos os alambiques estudados,
indicando que ocorre uma diminuição progressiva do teor de etanol ao longo da
destilação. O perfil de destilação dos alambiques tive comportamento similar,
entretanto, o alambique 2 aparentou ser o menos eficiente entre os três
estudados.
82
Figura 11 – Variação dos teores de etanol durante a destilação.
Observa-se que ao longo da destilação, ocorre um abaixamento
progressivo dos teores de iso-butanol e iso-amílico (2-metil-1-butanol + 3-metil-1-
butanol
), indicando um perfil bem próximo ao do etanol, conforme ilustram
as Figuras 12 e 13. Segundo Maia e Campelo (2006), os alcoóis superiores têm
afinidade semelhante pelo etanol e pela água. Por isso, saem ao longo de toda a
destilação, com um perfil de concentração semelhante ao do próprio etanol. Estes
dados condizem com os resultados encontrados neste estudo, onde a regressão
linear ajuda a identificar esta similaridade, pois, assim como ocorreu com o etanol,
ela foi significativa para todos os alambiques estudados, indicando que ocorre
uma diminuição progressiva do teor destes alcoóis ao longo da destilação.
Os teores de compostos extremamente voláteis, tais como os alcoóis
superiores, no destilado irão depender das condições do vinho do caldo de
cana-de-açúcar associado às condições de destilação (Dias, 2006). A formação
destes compostos é maior quando o fermento apresenta atividade
fraca, ocasionando demora no processo fermentativo (Yokoya, 1995), assim
como, as condições do meio de fermentação, a temperatura e o teor alcoólico
final do vinho (Barcelos et al., 2007). Outras variáveis, como a concentração de
aminoácidos e pH do mosto, tempo prolongado de armazenamento da cana-de-
açúcar, também, interferem no teor de alcoóis superiores (Crowell, 1961).
83
Figura 12 – Variação dos teores de iso-butanol durante a destilação.
Figura 13 – Variação dos teores de iso-amílico durante a destilação.
Os alcoóis com até cinco átomos de carbono apresentam odores
característicos (buquê) tradicionalmente associados com bebidas destiladas. Eles
são responsáveis diretos pelo odor da bebida e possuem aromas característicos,
com destaque para os álcoois amílico e propílico, e seus respectivos isômeros.
84
A Figura 14 ilustra a variação dos teores de 1-hexanol durante a
destilação. Observa-se um incremento positivo nos seus teores ao longo da
destilação, fato comprovado pela análise de regressão linear. Este composto é
um dos alcoóis com mais de cinco átomos de carbono encontrado em frações do
destilado da bagaceira, porém, Pintado et al., (2008) descrevem que
concentrações mais elevadas de 1-hexanol em bagaceira está relacionado com a
fração “cabeça”, decrescendo nas frações “coração” e “cauda”.
Do ponto de vista organoléptico é considerado um elemento negativo, por
possuir aromas desagradáveis (Cardoso, 2006). Junto com
outros óleos fúsel,
é responsável por muitas das dores de cabeça
e pela popular “ressaca”
em consumidores de destilados ou de vinho (Crispim, 2000). Com o aumento
do número de carbonos, o aroma é modificado e os alcoóis tornam-se
oleosos (Cardoso, 2006).
Figura 14 – Variação dos teores de 1-hexanol durante a destilação.
Entre os ácidos orgânicos, o ácido acético tem sido, quantitativamente, o
principal componente da fração ácida das aguardentes (Cardoso et al., 2005).
Observa-se um incremento positivo nos teores de ácido acético ao longo da
destilação, conforme Figura 15, comprovado pela regressão linear, indicando que
esse composto é volatilizado de forma mais acentuada na fase final da destilação.
85
Segundo Maia e Campelo (2006), dado ao seu caráter hidrofílico, o ácido acético
estabelece interações mais fortes com a água do que com o etanol. Porém, a
maior parte da acidez volátil do vinho da cana-de-açúcar não é transferida para
cachaça, permanecendo no vinhoto.
A acidez de uma cachaça é de grande importância, constituindo um fator
de qualidade, uma vez que, durante sua produção, os ácidos reagem com os
alcoóis presentes, aumentando a formação dos ésteres, que são um dos
constituintes responsáveis pelo aroma. No entanto, o excesso de acidez promove
sabor indesejado e ligeiramente “agressivo” na cachaça, depreciando a qualidade
da bebida (Cherubin, 1998). Altas concentrações de ácido acético provocam
sensações de ardor na garganta e odor de vinagre (Lima e Nóbrega, 2004).
Figura 15 – Variação dos teores de ácido acético durante a destilação.
As Figuras 16, 17 e 18 ilustram os teores de cobre, zinco e ferro durante a
destilação do vinho de cana-de-açúcar.
Ao Verificar a correlação entre os teores de ácido acético e cobre,
observou-se ser significativa apenas para o alambique 3, o mesmo ocorrendo
com a regressão linear, indicando um incremento positivo neste alambique. Este,
ainda, contém altos índices de cobre nas suas frações, chegando a teores
86
máximos próximos a 55 mg por litro de amostra, extremamente elevado, quando
comparado ao teor máximo permitido pela legislação brasileira, de 5,0 mg por litro
de amostra (BRASIL, 2005).
Segundo Boza e Horii (2000), os teores de cobre correlacionam com os
teores de acidez ao longo da destilação, sendo elevados, principalmente, na
fração “cauda” da destilação.
A assepsia adequada dos alambiques, após o término da
alambicagem, diariamente, reduz consideravelmente os teores de cobre nos
destilados (Sargentelli et al., 1996). Lima & Nóbrega (2004) ao avaliarem os
parâmetros de qualidade em aguardentes de cana produzidas no Estado da
Paraíba descrevem que a separação das frações “cabeça”, “coração” e “cauda”,
nas destilações fazem parte dos diversos procedimentos que podem controlar os
níveis de cobre nas cachaças. Boza e Horri (2000) indicam que separando a
fração “cauda” melhora-se a qualidade da cachaça pela redução de cobre e ácido
acético.
O excesso de cobre pode ser tóxico devido à afinidade do cobre com
grupos S-H de muitas proteínas e enzimas. Sua ingestão em excesso está
associada a várias doenças, como a epilepsia, melanoma e artrite reumatóide,
bem como à perda do paladar (Sargentelli, et al., 1996).
Nascimento et al. (1999) avaliaram o perfil de íons metálicos em sessenta
e nove cachaças, sendo dezesseis amostras tipo exportação, trinta e sete
comercializadas no mercado interno e dezesseis produzidas de forma artesanal
indicam a presença de zinco em todas as amostras analisadas.
O bronze é uma liga metálica de cobre e zinco muito utilizado,
principalmente, em válvulas, tampas e peças moldáveis das usinas (Veiga, 2006).
Provavelmente, a fonte de zinco encontrada nas amostras se deve a estes
componentes, que fazem parte de destiladores.
Há certo interesse na quantificação do elemento ferro na cachaça, pois
este pode alterar as características sensoriais da bebida. As possíveis fontes
deste mineral em cachaças são as peças utilizadas no processo de destilação.
87
Figura 16 – Variação dos teores de cobre durante a destilação.
Figura 17 – Variação dos teores de zinco durante a destilação.
88
Figura 18 – Variação dos teores de ferro durante a destilação.
CONCLUSÕES
Definindo criteriosamente os pontos de corte dos destilados de “cabeça”,
“coração” e “cauda”, o produtor ajusta a proporção dos componentes secundários
da cachaça.
Os compostos acetaldeído, acetato de etila, 1-propanol são mais
elevados nos primeiros momentos da destilação, podendo ser considerados
componentes secundários da cachaça, predominantemente, da fração “cabeça”.
Os teores de metanol encontram-se distribuídos de forma homogênea ao
longo de toda destilação. Observa-se que ocorre uma redução dos teores de
etanol, iso-butanol e iso-amílico (2-metil-1-butanol + 3-metil-1-butanol), com
teores menores nas últimas amostras coletadas ou fração “cauda” e os mais
elevados nas primeiras coletas, ou “coração”.
Observa-se um incremento nos teores de 1-hexanol e ácido acético, com
concentrações mais elevadas na fase final da destilação ou fração “cauda”.
Também, detectou-se uma correlação positiva entre o ácido acético e cobre, nos
destilados do alambique três.
89
Foi detectado cobre, zinco e ferro em todas as frações estudadas, com
teores bem superiores aos demais nas amostras coletadas no alambique três.
Aumentando o tempo de corte da fração “cabeça” e diminuindo o da
fração “cauda”, diminui-se o volume da fração “coração”, mas, também, reduz os
teores de basicamente todos os componentes estudados, exceto o metanol, zinco
e ferro.
AGRADECIMENTOS
A FAPERJ, pelo Auxilio Pesquisa para a execução do projeto e bolsa do
Doutorado, aos produtores Demétrio, Paulo Sérgio e Bozó pelas amostras de
cachaças cedidas. Ao Professor Pedro H. Monnerat e ao técnico de nível superior
José Acácio da Silva, pela leitura dos teores de cobre, ferro e zinco.
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92
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE LEVEDURAS EM ALAMBIQUES DO
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
Leandro Marelli de Souza
1*
, Meire Lélis Leal Martins
1
, Karla Silva Ferreira
1
,
1
Laboratório de Tecnologia de Alimentos. Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Av. Alberto Lamego, N° 2000, CEP 28013-
602, Campos dos Goytacazes – RJ, Brasil. e-mail: [email protected]
93
RESUMO
Durante a produção artesanal de cachaça, os produtores preparam receitas
próprias para o desenvolvimento da microbiota fermentadora, processo conhecido
como fermentação espontânea, pois é realizada pelos microrganismos que
acompanham o caldo e/ou equipamentos. Porém, o uso de leveduras
selecionadas, na maioria das vezes, aumenta a produtividade do alambique e
melhora a qualidade do produto final. Neste contexto, este estudo foi realizado
com o objetivo de isolar leveduras nativas em mostos de fermentação de dois
alambiques localizados no município de Campos dos Goytacazes –RJ, a fim de
selecionar aquelas com propriedades apropriadas para a produção de cachaça.
Das 130 colônias que foram isoladas, apenas 25 foram capazes de crescer em
uma concentração de etanol de 10%. Destas, 10 que apresentaram melhores
crescimentos, foram selecionadas e submetidas à caracterização morfológica e
bioquímica. Todas as seis colônias isoladas da destilaria BZ apresentaram
resultados incompatíveis com a espécie Saccharomyces cerevisiae, de acordo
com a fonte de carbono estudada, enquanto que todas as quatro colônias da
destilaria PS (PS13, PS36, PS43 e PS46) foram compatíveis. Entretanto, de
acordo com os resultados do teste de fermentação de carboidratos, das dez
colônias estudadas, apenas as colônias PS36, PS43 e BZ32 apresentam
características compatíveis com a espécie S. cerevisiae. Em relação ao teste de
assimilação de nitrogênio, todas as leveduras avaliadas possuem características
similares a S. cerevisiae. Com base nestes resultados, conclui-se que apenas três
estirpes isoladas apresentam resultados bioquímicos compatíveis com a espécie
S. cerevisiae e para uma identificação mais precisa das estirpes selecionadas é
necessário aumentar a quantidade de fontes de carbono estudas, ou utilizar
técnicas de biologia molecular.
Palavras-chave: aguardente, Saccharomyces cerevisiae, álcool, bebidas.
94
ABSTRACT
During the craft production of cachaça, the producers prepare own incomes for the
development of the yeasting microbiota, process known as spontaneous
fermentation, because it is accomplished by the microorganisms that accompany
the broth and/or equipments. However, the use of selected yeasts, most of the
time, increases the productivity of the still and improvement the quality of the final
product. In this context, this study was accomplished with the objective of isolating
native yeasts in musts of fermentation of two located stills in the municipal district
of Campos dos Goytacazes –RJ, in order to select those with appropriate
properties for the production of cachaça. Of the 130 colonies that were isolated,
only 25 were capable to grow in a concentration of ethanol of 10%. Of these,
10 that presented better growths, were selected and submitted to the morphologic
and biochemical characterization. All the six isolated colonies of the distillery
BZ presented incompatible results with the species Saccharomyces cerevisiae,
in agreement with the source of carbon studied, while all the four colonies of the
distillery PS (PS13, PS36, PS43 and PS46) were compatible. However, in
agreement with the results of the test of carbohydrates fermentation, of the ten
studied colonies, just the colonies PS36, PS43 and BZ32 present compatible
characteristics with the species S. cerevisiae. In relation to the test of assimilation
of nitrogen, all of the appraised yeasts possess similar characteristics to S.
cerevisiae. With base in these results, it is ended that only three isolated
ancestries present compatible biochemical results with the species S. cerevisiae
and for a more necessary identification of the selected ancestries it is necessary to
increase the amount of sources of carbon study, or to use techniques of molecular
biology.
key-Word: aguardente, Saccharomyces cerevisiae, alcohol, drinks.
95
INTRODUÇÃO
Um dos principais aspectos da produção artesanal de cachaça é a
preparação do fermento iniciador, que consiste na propagação da microbiota
fermentativa em uma mistura de caldo-de-cana com milho, arroz e/ou farinha de
soja.
O processo ocorre dentro da cuba de fermentação e pode durar de cinco
a 20 dias, até que a população de leveduras seja suficiente para iniciar o ciclo
fermentativo. As espécies de leveduras presentes neste “pé-de-cuba” variam de
região para região, sendo afetadas, principalmente, pelas variedades de cana-de-
açúcar utilizadas, as condições climáticas da região e as peculiaridades
operacionais de cada produtor (Ribeiro, 2002) e apresentam características
diferentes com relação à tolerância às condições ambientais durante o processo
fermentativo, desde a formação do “pé-de-cuba” até o final da fermentação
alcoólica (Pataro et al., 2002).
As características fisiológicas das espécies de leveduras isoladas no
mosto fermentado têm grande relevância na compreensão dos mecanismos
envolvidos na colonização do mosto e na determinação das condições ótimas
para se manter uma fermentação saudável (Pataro et al., 2002). Dessa forma, a
seleção do fermento é considerada uma das medidas que podem contribuir para a
melhoria do processo de fabricação de cachaça.
As linhagens de leveduras comumente empregadas na produção de
bebidas alcoólicas apresentam algumas limitações como: ineficiência na
fermentação do mosto, com baixa conversão dos carboidratos a etanol devido ao
excessivo crescimento da levedura e à sua inabilidade em fermentar todo o
açúcar presente no mosto; variações nas propriedades floculantes das leveduras;
baixa termoestabilidade, tolerância a etanol e pressão osmótica; contaminação da
fermentação por outros microrganismos (Hammond, 1995).
As leveduras envolvidas na fermentação do caldo de cana-de-açúcar
incluem, principalmente, os gêneros Saccharomyces, Kloeckera, Pichia,
Schizosaccharomyces, Debaryomyces, Kluyveromyces e diversas espécies
de cândida. A Saccharomyces cerevisiae
é a espécie de levedura
predominante (Schwan et. al., 2001) e a cachaça produzida pode apresentar
variações em algumas de suas características ao longo da safra e entre diferentes
96
safras em razão da microbiota envolvida no processo fermentativo. O uso de
linhagens selecionadas de S. cerevisiae, isoladas durante o processo de
fermentação do caldo de cana-de-açúcar na preparação do “pé-de-
cuba”,
tem evitado este problema. O uso desta técnica, na maioria das vezes, aumenta
a produtividade do alambique e melhora a qualidade do produto final,
principalmente em relação aos teores de acidez e concentração de alcoóis
superiores, visto que as leveduras selecionadas podem apresentar maior
tolerância ao etanol, à temperatura e apresentar outras características positivas
para a fabricação da cachaça (Pataro et al., 2002).
Este trabalho teve como objetivo isolar, selecionar e caracterizar
parcialmente leveduras nativas em mostos de fermentação de dois alambiques
localizados no município de Campos dos Goytacazes –RJ.
2.0 – MATERIAL E MÉTODOS
2.1 – Coleta de amostra para o isolamento das leveduras
Amostras de mosto em processo de fermentação foram coletadas em
duas destilarias de cachaça, identificadas como BZ e PS, localizadas no
Município de Campos dos Goytacazes, região Norte do Estado do Rio de Janeiro,
nos meses de Novembro de 2007 e Maio de 2008. Foram coletadas seis
amostras em diferentes pontos dentro de cada uma das dornas de fermentação
usando tubos de ensaio esterilizados. Dois pontos na superfície, dois no meio e
dois no fundo. Os tubos foram acondicionados em caixa de isopor com gelo e,
imediatamente, transportados até o Laboratório de Tecnologia de Alimentos da
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF. A
fermentação no momento da coleta estava em atividade, com média de oito a
doze horas de fermentação. Foi feito uma única coleta, em cada um dos
alambiques. Para o isolamento das leveduras, foi utilizada uma amostra composta
das coletas feitas em cada um dos alambiques.
97
2.2 – Métodos gerais utilizados nos experimentos
A esterilização dos materiais, meios de cultivo e soluções foram feitas
em autoclave PHOEMIX, modelo AV 75, a 1 atm de pressão e a 121
o
C
durante 20 minutos.
As incubações foram feitas em estufa microbiológica (BOD), Marca
Quimis, modelo Q – 315 D.
Os procedimentos de semeaduras dos microrganismos foram
realizados em fluxo laminar VECO, modelo HLFS - 12 (Departamento de
microbiologia, UENF).
A determinação espectrofotométrica foi efetuada em aparelho
espectrofotômetro UV/VIS Shimadzu modelo UV-1240 Mine (Departamento de
microbiologia, UENF).
2.3 – Meios de cultura utilizados
2.3.1 – Meio YP (meio básico)
O meio de cultura básico apresentou a seguinte composição:
Extrato de levedura ................................
1,0 g
Peptona .................................................
2,0 g
Agar .......................................................
2,0 g
Glicose ...................................................
2,0 g
Clorafenicol (0,1%) ................................
1,0 mL
Água destilada .......................................
qsq 100 mL
O meio foi esterilizado em autoclave a 121 °C, por 15 minutos e
posteriormente foi adicionada uma solução estéril de glicose (2% p/v).
Nos experimentos onde foi usado o etanol, o mesmo não sofreu nenhum
processo de esterilização e foi adicionado no momento do plaqueamento, com o
meio apresentando uma temperatura próxima a 55 °, medidos em um termômetro
Digital infravermelho com mira a laser, modelo Scan Temp 440.
98
2.3.2 – Meio sólido Agar Lisina
Agar .......................................................
2,0 g
Glicose ...................................................
2,0 g
Lisina .....................................................
0,056 g
Clorafenicol (0,1%) ................................
1,0 mL
Água destilada .......................................
qsq 100 mL
2.3.3 – Meio YNB (Yeast Nitrogen Base – DIFCO)
O meio Yeast Nitrogen Base (DIFCO Laboratories) foi preparado
conforme indicado pelo fabricante. As fontes de carbono utilizadas foram glicose,
sacarose, galactose, maltose, rafinose, manitol, lactose e xilose.
2.3.4 – Meio YCB (Yeast Carbon Base – DIFCO)
O meio Yeast Carbon Base (DIFCO Laboratories) foi preparado conforme
indicado pelo fabricante. As fontes de nitrogênio utilizadas foram nitrato de
potássio, nitrito de sódio e lisina.
Os meios descritos nos itens 2.2.3 e 2.2.4 foram preparados
separando-se a fonte de nitrogênio da fonte de carbono. Para isso, a fonte de
nitrogênio e de carbono foram dissolvidas em água destilada, separadamente,
usando erlenmeyer como recipiente. Na solução da fonte de carbono foram
acrescidos 2 g% de Agar para tornar o meio sólido e 1,0 mL de clorafenicol (0,1%)
em cada 100 mL de meio. Os frascos foram esterilizados em autoclave sob vapor
fluente durante 40 minutos e em seguida, assepticamente, procedeu-se à mistura
e posterior distribuição em placas estéreis.
Quando necessário o pH do meio de cultura foi corrigido para 5,5, com
solução de hidróxido de sódio 2 Molar.
2.4 – Isolamento das leveduras
Para o isolamento das leveduras, foi utilizada uma amostra composta do
mosto em processo de fermentação de cada destilaria. A amostra (25 mL) foi
diluída com 225 mL de solução salina (0,85%), usando cloreto de sódio PA, e em
99
seguida foram realizadas diluições em série destas amostras (10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
e 10
-6
). Para cada diluição foram empregadas três placas de Petri contendo o
meio sólido YP. No centro de cada placa foi semeada, assepticamente, 200 µL
que foi espalhado com auxílio de uma alça de Drigalski (espalhadores).
Posteriormente, as placas foram incubadas a 35 ºC durante 72 horas.
As colônias isoladas crescidas, com características macroscópicas e
microscópicas de levedura, foram semeadas, com auxílio de uma alça estéril, por
esgotamento em placas de Petri contendo meio sólido YP. As placas foram
colocadas novamente em estufa a 35 ºC durante 72 horas. Após repetir este
processo por mais cinco vezes, as colônias foram consideradas isoladas.
2.5 – Conservação das leveduras
As leveduras isoladas foram repicadas em tubo de ensaio contendo meio
sólido YP inclinado e mentidas a (5-7) ºC, até sua reativação para análises.
2.6 – Seleção das leveduras
2.6.1 – Teste de exclusão por meio sólido Ágar Lisina
As colônias isoladas foram semeadas em placas de Petri contendo meio
sólido YP e meio sólido Ágar Lisina. Posteriormente, as placas foram incubadas
em estufa a 35 ºC durante 72 horas.
2.6.2 – Teste de exclusão por estresse
As leveduras isoladas foram semeadas em placas de Petri contendo meio
sólido YP, colocadas em estufa a 30 °C, durante 12 horas. Após este período de
crescimento foi preparada uma suspensão de células de cada levedura com água
destilada estéril e realizada a leitura da turbidez a fim de se avaliar a
concentração celular. Em seguida, uma alíquota de 200 µL destas suspensões,
com densidade ótica em torno de 0,100 de absorbância a 650 nm, foi semeada
em placas de Petri contendo os meios estéreis a serem empregados nos testes
de exclusão por estresse.
100
As condições de estresse testadas no crescimento dos microrganismos
foram meio sólido YP contendo 8% (v/v) de etanol e 20% de glicose e meio sólido
YP contendo 10% (v/v) de etanol.
Primeiramente as leveduras foram crescidas em meio sólido YP contendo
8% (v/v) de etanol e 20% de glicose a 35 ºC durante 72 horas. As leveduras que
cresceram nestas condições foram então, transferidas para o meio sólido YP
contendo 10% (v/v) de etanol e incubadas a 35 ºC durante 72 horas.
2.7 – Caracterização parcial das leveduras isoladas e selecionadas
2.7.1 – Identificação morfológica
A morfologia colonial foi avaliada quanto ao tamanho, textura, cor,
superfície, borda e elevação.
2.7.2 – Teste de assimilação de fontes de carbono
Para este teste, uma alíquota de 200 µL, preparada como descrito na
secção 2.5.2, foi semeada em placas de Petri contendo meio Yeast Nitrogen Base
adicionado separadamente de cada uma das fontes de carbono a serem testadas,
todas na concentração de 2 g% (glicose, sacarose, maltose, galactose, manitol,
lactose e xilose). As placas foram incubadas em estufa a 30 ºC durante 72 horas
e posteriormente o crescimento das leveduras foi observado.
2.7.3 – Teste de assimilação de fontes de nitrogênio
Para este teste, uma alíquota de 200 µL, preparada como descrito na
secção 2.5.2, foi semeada em placas de Petri contendo o meio Yeast Carbon
Base adicionado separadamente, da fonte de nitrogênio a ser testada na
concentração de 2 g% (lisina, nitrato de potássio e nitrito de sódio). As placas
foram incubadas em estufa a 30 ºC durante 72 horas e, posteriormente, o
crescimento das leveduras foi observado.
101
2.7.4 – Teste de tolerância à temperatura
Para este teste as leveduras foram semeadas em placas de Petri
contendo o meio sólido YP e incubadas a temperaturas de 25 ºC, 37 ºC e 45 ºC
por 72 horas. Após este período foi observado o crescimento das colônias.
3.0 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 – Isolamento e seleção das leveduras
3.1.1 – Diferenciação das cepas Sacharomyces e não Sacharomyces
Em torno de 130 colônias de leveduras foram isoladas do mosto em
processo de fermentação das duas destilarias de cachaça. A Figura 1 mostra
colônias típicas de leveduras isoladas em meio YP.
Figura 1 – Colônias de leveduras isoladas em meio sólido YP.
102
As leveduras isoladas foram submetidas ao teste de exclusão por meio
sólido Agar Lisina a fim de diferenciar as leveduras Saccharomyces das não
Saccharomyces, visto que as leveduras do gênero Saccharomyces não se
desenvolvem quando cultivadas neste meio, enquanto as não Saccharomyces se
desenvolvem. Todas as leveduras isoladas não se desenvolveram no meio Agar
Lisina, o que sugere que as mesmas pertencem ao gênero Saccharomyces,
podendo ser ou não Saccharomyces cerevisiae. A Figura 2 mostra o resultado
observado com uma das colônias isoladas.
De acordo com Ceccato-Antonini e Silva (2000), são vários os meios
propostos para a detecção de leveduras contaminantes Saccharomyces ou não
Saccharomyces, entretanto, todos apresentam variações, o que demonstra que
para se conhecer melhor a presença de leveduras contaminantes durante o
decorrer de uma safra, o uso de um só meio diferencial não é o suficiente,
principalmente quando se trata de leveduras contaminantes pertencentes ao
gênero Saccharomyces.
Em um trabalho realizado por Heard e Fleet (1985) foi mostrado que o
crescimento de S. Saccharomyces foi inibido em meio Lisina, sendo que para
estirpes naturais o crescimento foi observado nas primeiras 48 h após a
incubação. O meio de Lisina, segundo Lin (1975), serve para distinguir colônias
visíveis, que se desenvolvem graças à presença de traços de nitrogênio no meio.
A grande maioria dos produtores de cachaça não trabalha com cepas
de leveduras isoladas, mas sim, com um grupo de cepas, normalmente
conhecidas como fermento. O fermento natural (selvagem) é constituído
por células de leveduras que já estão naturalmente adaptadas ao
ambiente (Schwan et al., 2006).
103
3.1.2 – Teste de exclusão por estresse
Durante a fermentação alcoólica, as células de leveduras não encontram
um ambiente fisiológico com condições ótimas, sendo expostas simultaneamente
e seqüencialmente a várias condições de estresse, sendo o osmótico e o
etanólico considerados os mais importantes (Querol et. al., 2003). Assim, as
leveduras isoladas foram cultivadas em meio contendo altas concentrações de
açúcar e álcool.
Todas as leveduras isoladas foram capazes de crescer quando a
quantidade de glicose do meio básico YP, que era de 2 g%, foi aumentada
para 20 g% e feita a adição de etanol para que a concentração fosse 8%.
Entretanto, quando se manteve a concentração de glicose de 2 g% e aumentou a
concentração do etanol para 10%, apenas 19,2 % das leveduras isoladas foram
capazes de crescer (Figura 3).
O crescimento de leveduras em meio contendo altas concentrações de
sacarose favorece a seleção de leveduras Saccharomyces cerevisiae que
possuem uma atividade invertásica bastante desenvolvida. Esta propriedade é
Com crescimento de colônias.
B A
Sem crescimento de colônias.
Figura 2 – Crescimento de colônias de levedura isolada (por número) em meio
Agar lisina (A) e meio Agar YP (B).
104
importante, uma vez que se presume que leveduras com atividade invertásica
possuem uma maior capacidade fermentativa (Pataro et. al., 1998).
Segundo Pataro et. al., (2000) a maioria das espécies de leveduras
isoladas de processos fermentativos artesanais, incluindo Saccharomyces
cerevisiae, são fisiologicamente adaptadas às condições observadas nas dornas
de fermentação. Elas são aptas a crescerem a 37ºC, em meio contendo 50% de
glicose e 8% de etanol.
0
20
40
60
80
100
YP 20% ETOH
Condições de estresse
Crescimento %
3.2 – Caracterização parcial das leveduras isoladas e selecionadas
A caracterização parcial foi realizada apenas com as leveduras isoladas
que apresentaram melhor crescimento no meio sólido YP adicionado de etanol
(10%). Apesar de ter havido crescimento de 25 leveduras selecionadas, optou-se
por fazer a caracterização das dez que apresentaram um crescimento destacado.
Figura 3 –
Porcentagem de leveduras isoladas crescidas em
condição de estresse.
NOTA:
YPG 20%: meio sólido YP
+ glicose 20 g% adicionado de 8%
etanol, temperatura 35 ºC, 72 horas
ETOH: meio sólido YP
adicionado de etanol (10%), temperatura
35 ºC, 72 horas.
105
3.2.1 – Caracterização morfológica
Os resultados obtidos com as 10 leveduras selecionadas estão
apresentados na Tabela 1. As colônias foram analisadas quanto à sua cor, ao
aspecto, tamanho, brilho e desenho de suas bordas e na seqüência foram
submetidas à análise de suas propriedades fisiológicas.
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 1, foi observado
que houve uma variação de tamanho entre as colônias de 1,0 mm a 5,0 mm,
sendo as menores aquelas estirpes denominadas PS (13, 36, 43 e 46). Todas as
colônias apresentaram uma cor branca, textura fosca e elevação convexa.
Entretanto, as estirpes PS apresentaram uma borda lisa e as estirpes BZ a borda
predominante foi rugosa.
Tabela 1 – Caracterização morfológica das leveduras selecionadas e avaliadas
em meio sólido YP
Estirpes Tamanho Textura Cor Superfície Borda Elevação
PS 13 1,0-2,0 mm fosca branca rugosa lisa convexa
PS 36 1,0-2,0 mm fosca branca lisa lisa convexa
PS 43 1,0-2,0 mm fosca branca lisa lisa convexa
PS 46 1,0-2,0 mm fosca branca rugosa lisa convexa
BZ 11 2,0-3,0 mm fosca branca rugosa rugosa convexa
BZ 31A 2,0-3,0 mm fosca branca lisa rugosa convexa
BZ 32 1,5-3,0 mm fosca branca lisa rugosa convexa
BZ 33 2,5-5,0 mm fosca branca lisa lisa convexa
BZ 33A 1,5-2,5 mm fosca branca rugosa rugosa convexa
BZ 34A 3,0-4,0 mm fosca branca rugosa rugosa convexa
Nota:
BZ (destilaria 1, coleta realizada em novembro de 2007).
PS (destilaria 2, coleta realizada em maio de 2008).
106
3.2.2 – Caracterização bioquímica
As 10 leveduras selecionadas foram submetidas ao teste de crescimento
em fontes de carbono e fermentação de carboidratos. A escolha das fontes de
carbono foi feita considerando os substratos que permitissem a exclusão de um
maior número de leveduras de outra espécie que não Saccharomyces cerevisiae.
Como critério de exclusão as leveduras foram submetidas à pelo menos quatro
fontes de carbono assimiladas pela levedura Saccharomyces cerevisiae (glicose,
sacarose, maltose e galactose) e uma fonte de carbono não assimilada (manitol
ou lactose). Os resultados encontram-se na Tabela 2.
Tabela 2 – Crescimento das leveduras selecionadas em meio de cultura
contendo diferentes fontes de carbono na concentração de 2 g%
Leveduras isoladas
Fonte de
carbono
testada
S.
cerevisiae
PS 13
PS 36
PS 43
PS 46 BZ 11 BZ 31A
BZ 32 BZ 33
BZ 33A
BZ 34A
Glicose
+ + + + + + + + + + -
Sacarose
+ + + + + + + + + + -
Maltose
+ + + + + + + + - + -
Galactose
+ + + + + + + + + + -
Manitol
- - - - - + + + + + -
Lactose
- - - - - + - - - + -
Xilose
- - - - - + - - + + -
NOTA:
BZ (destilaria 1, coleta realizada em novembro de 2007).
PS (destilaria 2, coleta realizada em maio de 2008).
+ (crescimento intenso na condição testada).
- (sem crescimento na condição testada).
S. cerevisiae: crescimento esperado para Saccharomyces cerevisiae.
107
Todas as colônias isoladas da destilaria BZ apresentaram resultados
incompatíveis com a espécie Saccharomyces cerevisiae, de acordo com a fonte
de carbono estudada. Já as colônias isoladas da destilaria PS apresentaram
resultados, que podem ser considerados compatíveis com a espécie
Saccharomyces cerevisiae. Entretanto, de acordo com os resultados do teste de
fermentação de carboidratos mostrados na Tabela 3, apenas as colônias PS36,
PS43 e BZ32, apresentaram características compatíveis com a espécie
Saccharomyces cerevisiae. As demais apresentaram comportamentos distintos e
provavelmente pertençam, também, a gêneros e/ou espécies diferentes. Para
uma identificação mais precisa, uma nova pesquisa deverá ser executada com
uma quantidade maior de fontes de carbono, ou utilizando técnicas de biologia
molecular.
Diferenças na assimilação e na fermentação de compostos de carbono
são critérios importantes na taxonomia e identificação de leveduras, pois estes
microrganismos apresentam uma variação diversificada na habilidade de
fermentação de açúcares. O carbono pode ser fornecido às leveduras na forma
de açúcar, aldeídos, sais de alguns ácidos orgânicos, glicerina ou etanol, e
ocasionalmente de alguma outra forma, dependendo do tipo da levedura. Ao
considerar os açúcares como fonte de carbono, é importante lembrar a diferença
que existe entre a capacidade de uma levedura em assimilar um açúcar e sua
capacidade de fermentar o mesmo açúcar (Prescott, 1962).
Segundo estudos de Vaughan-Martini e Martini (1993), as características
fisiológicas tradicionalmente consideradas importantes para separação de
leveduras fermentativas do gênero Saccharomyces, não podem ser utilizadas
para distinção entre espécies. Os testes de capacidade fermentativa separam
apenas as leveduras do gênero Saccharomyces dos gêneros não
Saccharomyces, não diferenciando espécies.
108
Tabela 3 – Capacidade fermentativa das leveduras selecionadas em meio de
cultura líquido YP, contendo diferentes fontes de carbono na
concentração de 2 g%
Levedura isolada
Fonte de
açúcar
testada
S.
cerevisiae
PS 13
PS 36
PS 43
PS 46 BZ 11 BZ 31A
BZ 32 BZ 33
BZ 33A
BZ 34A
Galactose
+ + + + - + + + - + +
Sacarose
+ + + + - - +w + - - -
Glicose
+ + + + + - +w + + + +
Lactose
- +w
- - - - +w - - - -
NOTA:
BZ (destilaria 1, coleta realizada em novembro de 2007).
PS (destilaria 2, coleta realizada em maio de 2008).
(+) forte: completo preenchimento do tubo de Durhan com gás, no prazo de 1 a 3 dias.
(+w) fraca: preenchimento parcial de gás.
(-) negativa.
Nenhuma das colônias de leveduras avaliadas (n=10) cresceu em relação
à assimilação de diferentes fontes de nitrogênio (nitrato de potássio, nitrito de
sódio e lisina). Estes resultados estão de acordo com o esperado para a espécie
Saccharomyces cerevisiae, como descrito na Tabela 4.
Tabela 4 – Assimilação de fontes de nitrogênio pelas leveduras estudadas
Levedura isolada
Fonte de
nitrogênio
testada
S.
cerevisiae
PS 13
PS 36
PS 43
PS 46 BZ 11 BZ 31A
BZ 32 BZ 33
BZ 33A
BZ 34A
Nitrato de
potássio
- - - - - - - - - - -
Nitrato de
sódio
- - - - - - - - - - -
Lisina
- - - - - - - - - - -
NOTA:
BZ (destilaria 1, coleta realizada em novembro de 2007).
PS (destilaria 2, coleta realizada em maio de 2008).
- (sem crescimento na condição testada).
S. cerevisiae: crescimento esperado para Saccharomyces cerevisiae.
109
Quando submeteram as leveduras a crescimento em diferentes
temperaturas e em meio sólido YP, observou-se que nenhuma das 10 colônias
testadas cresceu a 45 °C. Entretanto, quando foram empregadas temperaturas
de 25 °C e 37 °C foi observado crescimento de todas as cepas.
Guimarães (2005) ao isolar, identificar e selecionar cepas de leveduras
Saccharomyces cerevisiae para elaboração de vinhos descreve que somente
uma, das quinze cepas testadas, foi capaz de crescer à temperatura de 45 °C.
Porém, na temperatura de 25 °C e 37 °C foi observado crescimento de todas as
cepas.
A tolerância de leveduras à temperatura elevada vem sendo largamente
estudada. Altas temperaturas podem ocorrer não só durante o processo
de fermentação do caldo de cana-de-açúcar em unidades produtoras de
cachaça, mas principalmente, durante o processo de produção de biomassa e
secagem das leveduras, estágios requeridos para a preparação industrial de
leveduras (Folch-Mallol et al., 2004).
Temperatura
Levedura isolada
25 °C 37°C 45°C
PS 13 + + -
PS 36 + + -
PS 43 + + -
PS 46 + + -
BZ 11 + + -
BZ 31A + + -
BZ 32 + + -
BZ 33 + + -
BZ 33A + + -
BZ 34A + + -
NOTA:
BZ (destilaria 1, coleta realizada em novembro de 2007).
PS (destilaria 2, coleta realizada em maio de 2008).
+ crescimento intenso na condição testada.
- sem crescimento na condição testada.
Tabela 5 – Crescimento das leveduras selecionadas em diferentes
temperaturas em meio sólido YP
110
CONCLUSÕES
Das 130 colônias de leveduras isoladas a partir de fermentações
espontâneas, apenas 25 (19,2%) cresceram em meio sólido YP adicionado de
etanol (10%) e temperatura de 35 °C.
Os estudos não foram suficientes para afirmar que dentre as colônias
isoladas, alguma tenha perfil bioquímico compatível com a espécie
Saccharomyces cerevisiae, e características apropriadas para atender às
condições empregadas no processo artesanal de produção de cachaça.
AGRADECIMENTOS
A FAPERJ, pelo Auxílio Pesquisa para a execução do projeto e bolsa do
doutorando e aos produtores de cachaça Paulo Sérgio e Imivaldo (Bozó), pela
colaboração com as coletas realizadas.
REFERÊNCIAS
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isolamento de cepas de leveduras de processos industriais de fermentação
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Folch-Mallol,J.L., Garay-Arroyo, A., Lledías, F., Robles, A.A.C. (2004) La
respuesta a estrés en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Revista Latino
Americana de Microbiologia, 46 (1-2):24-46.
Guimarães, T.M. (2005)
Isolamento, identificação e seleção de cepas
de leveduras Saccharomyces cerevisiae para elaboração de vinho. Tese
(Mestre em Ciências Farmacêuticas) – Curitiba, PR. Universidade Federal do
Paraná – UFP, 101p.
Heard, G.M., Fleet, G.H. (1985) Growth of natural flora during the fermentation of
inoculated wines. Applied and Environmental Microbiology, 50:727-728.
111
Pataro, C., Gomes, F.C.O., Araújo, R.A.C., Rosa, C.A., Schwan, R.F., Campos,
C.R., Claret, A.S., Castro, H.A. (2002) Utilização de leveduras selecionadas
na fabricação da cachaça de alambique. Informe Agropecuário, EPAMIG,
Belo Horizonte, 23 (217):37-43.
Pataro, C., Guerra,J.B., Petrillo-Peixoto, M.L., Mendonca-Hagler, L.C., Linardi,
V.R., Rosa,C.A. (2000) Yeast communities and genetic polymorphism of
Saccharomyces cerevisiae strains associated with artisanal fermentation in
Brazil. Journal of Applied Microbiology, 89:24-31.
Pataro, C., Santos, A., Correa, S.R., Marais, P.B., Linardi, V.R., Rosa, C.A. (1998)
Physiological characterization of yeasts isolated from artisanal fermentation in
an aguardente distillery. Review Microbiology, Oxford, 29:104-108.
Prescott, S.C. (1962) Microbiologia industrial. 3. ed. Madrid: Aguilar, S.A.
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Querol, A., Fernández-Espinar, M.T., Olmo, M., Barrio, E. (2003) Adaptive
evolution of wine yeast. International Journal of Food Microbiology, 86:3-10.
Ribeiro, J.C.G.M. (2002) Fabricação Artesanal de Cachaça Mineira. 2 ed. Belo
Horizonte: O Lutador, 223 p.
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In: Cardoso, M.G. (ed.) Produção de aguardente de cana. 2° ed. Editora
UFLA – Universidade Federal de Lavras, Lavras – MG, p. 101-135.
Schwan. R.F., Castro, H.A. (2001) Fermentação alcoólica. In: Cardoso, M.G. (Ed.)
Produção de cachaça de cana-de-açúcar. Lavras: UFLA, p. 45-57.
Vaughan-Martini, A., Martini, A. (1993) A taxonomic key the genus
Saccharomyces. Systematic and Applied Microbiology, 16:113-119.
112
4. RESUMOS E CONCLUSÕES
Este estudo foi dividido em quatro ensaios. No primeiro, fez-se a
quantificação dos compostos orgânicos etanol, metanol, 1-propanol, 1- butanol,
iso-butanol, iso-amílico, acetato de etila, acetaldeído, ácido acético, furfural,
5-hidroximetilfurfural e acroleina. No segundo, analisaram os elementos cobre,
zinco, ferro, sódio e potássio. Ambos experimentos foram realizado utilizando
trinta amostras pertencentes a dezesseis produtores de cachaças associados da
Cooperativa dos Produtores de Cachaça e Derivados da Cana-de-Açúcar do
Norte Fluminense – COOPCANF e avaliaram os resultados conforme os padrões
de identidade e qualidade estabelecidos pela legislação vigente.
Observou-se no primeiro ensaio que o grau alcoólico real e a soma dos
compostos 5-hidroximetilfurfural e furfural, foram os parâmetros com maiores
índices de irregularidades apresentados pelas amostras, em seguida, encontra-se
o ácido acético. Os alcoóis superiores (soma dos alcoóis iso-butílico, iso-amílicos
e propílico), o ácido acético e o acetato de etila foram os componentes que
apresentaram os maiores desvio padrão, refletindo as dificuldades enfrentadas
pelos produtores em garantir a qualidade e a padronização da bebida em todas as
etapas da produção. O alto índice de amostras (63,3%) que revelaram em não
conformidade com a legislação
5
em pelo menos um dos componentes analisados
compromete as exportações e dificulta o crescimento do mercado interno da
cachaça.
Das amostras analisadas, nos segundo ensaio, 46,7% apresentavam
teores de cobre acima do limite máximo permitido pela legislação. A presença dos
minerais zinco, ferro, sódio e potássio, detectados em algumas amostras indicam
113
contaminações durante e, ou após a destilação da cachaça. Estes dados indicam
que os produtores desta região necessitam de assistência técnica para melhorar a
tecnologia para produção de suas cachaças.
Em um terceiro ensaio, com a finalidade de conhecer a composição
química do destilado durante a destilação do vinho da cana-de-açúcar, foram
quantificados diversos compostos em diferentes frações do destilado coletadas ao
longo de 160 minutos de destilação. As conclusões deste ensaio são:
Definindo criteriosamente os pontos de corte dos destilados de “cabeça”,
“coração” e “cauda”, o produtor ajusta a proporção dos componentes secundários
da cachaça.
Os compostos acetaldeído, acetato de etila, 1-propanol e 1-butanol são
mais elevados nos primeiros momentos da destilação, podendo ser considerados
componentes secundários da cachaça, predominantemente, da fração “cabeça”.
Os teores de metanol encontram-se distribuídos de forma homogênea ao
longo de toda destilação. Observa-se que ocorre uma redução dos teores de
etanol, iso-butanol e iso-amílico (2-metil-1-butanol + 3-metil-1-butanol), com
teores menores nas últimas amostras coletadas ou fração “cauda” e os mais
elevados nas primeiras coletas, ou “coração”.
Observou-se um incremento nos teores de 1-hexanol e ácido acético, com
concentrações mais elevadas na fase final da destilação ou fração “cauda”.
Também, detectou-se uma correlação positiva entre o ácido acético e cobre, nos
destilados do alambique três.
Foi detectado cobre, zinco e ferro em todas as frações estudadas. O teor
de cobre , com teores bem superiores aos demais nas amostras coletadas no
alambique três.
Aumentando o tempo de corte da fração “cabeça e diminuindo o da fração
“cauda”, diminui-se o volume da fração “coração”, mas, também, reduz os teores
de basicamente todos os componentes estudados, exceto o metanol, zinco e
ferro.
No quarto ensaio, um estudo foi realizado com o objetivo de isolar
leveduras nativas em mosto de fermentação de dois alambiques, a fim de
selecionar aquelas com propriedades apropriadas para a produção de cachaça.
Neste estudo, isolou-se 130 colônias de leveduras a partir de fermentações
espontâneas, onde, apenas 25 (19,2%) cresceram em meio sólido YP adicionado
114
de etanol (10%) e temperatura de 35 ºC. Os resultados deste ensaio, não foram
suficientes pra afirmar que dentre as colônias isoladas, alguma tenha perfil
bioquímico compatível com a espécie Saccharomyces cerevisiae, e
características apropriadas para atender às condições empregadas no processo
artesanal de produção de cachaça.
115
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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<http://www.abrabe.org.br/cachaca.php>. Acesso em 18 julho de 2008.
Alves, D.M.G. (1994) Fatores que afetam a produção de ácidos orgânicos bem
como outros parâmetros da fermentação alcoólica. Tese (Mestrado em
Microbiologia) – Piracicaba, SP. Escola Superior de Agricultura “Luiz de
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Aquino, F.W.B., Nascimento, R.F., Rodrigues, S., Casemiro, A.R.S. (2006)
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