( PDF ) Desenvolvimento e aplicação de nanoestruturas a partir de xiloglucanas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

TATIANE AKEMI JÓ

DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE NANOESTRUTURAS A PARTIR DE

XILOGLUCANAS

CURITIBA

FEVEREIRO, 2009

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TATIANE AKEMI JÓ

DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE NANOESTRUTURAS A PARTIR DE

XILOGLUCANAS

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Ciências - Bioquímica,

Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular, Setor de Ciências Biológicas,

Universidade Federal do Paraná, como parte das

exigências para obtenção do título de Mestre em

Ciências.

Orientadora: Prof

. Dr

. Maria Rita Sierakowski

Co-orientador: Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas

CURITIBA

FEVEREIRO, 2009

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Aos meus pais, Francisco e Marina, por sua

imensa dedicação e apoio incondicionais, e

minhas irmãs, Mayra e Juliana.

AGRADECIMENTOS

Agradeço profundamente aos meus pais, Francisco e Marina, por todos os

ensinamentos de vida, paciência e dedicação em todos os momentos. E às minhas

irmãs, Mayra e Juliana, por compartilharem muitos momentos juntas.

Aos meus tios, Jugo e Tereza, e primos, Mariana e Eduardo, por terem me

acolhido em Curitiba e adotado como filha e irmã.

Meu agradecimento mais que especial ao meu querido Diogo, por toda sua

ajuda e compreensão; antes, durante e depois deste trabalho, dentro e fora do

laboratório, seja de perto ou de longe quando esteve do outro lado do oceano. Muito

obrigada por tudo!

À minha querida orientadora, Prof.ª Dr

. Maria Rita Sierakowski, pessoa

admirável. Agradeço pela confiança, oportunidade e dedicação em me orientar

desde a iniciação científica e pelo incentivo e estímulos científicos; e também pelo

carinho que tem por toda a Família Biopol.

À Prof.ª Dr

. Denise F. S. Petri, pela enorme colaboração, a qual contribuiu

para a definição do desenvolvimento deste trabalho, e ainda, por sua compreensão

e extrema dedicação ao atender as minhas dúvidas e sempre que precisei. E pelos

agradáveis dias em seu laboratório na USP. Obrigada pelas conversas e cafés.

Agradeço também aos seus alunos pela receptividade.

À Prof.ª Dr

. Leila M. Beltramini por sua colaboração e orientação nos

experimentos de dicroísmo, e também pelo seu esforço em me auxiliar durante as

estadas em São Carlos. E também às técnicas do laboratório, Andressa e Bel.

Ao Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas pelos seus ensinamentos e por me

conceder a oportunidade de iniciar no Biopol; e também pelas análises de

citotoxicidade. Agradeço também à Ana Paula, técnica do laboratório, da Univali.

Às Prof.ª Dr

. Maria Eugênia D. Noseda, Nadia Krieger, Agnes de P. Scheer e

Neoli Lucyszyn, por aceitarem o convite para a banca de mestrado e avaliarem o

meu trabalho contribuindo para melhorá-lo.

Aos inesquecíveis momentos científicos e de descontração com a Família

Biopol, a todos pela amizade, companhia e ajuda sempre que precisei. À Karolzinha

pelas grandes ajudas no reômetro, assim como a Íris que também ajudou nas

fluorescências e sempre me fazia rir. Ao Leandro que virou expert no tensiômetro, e

também me ajudou em muitos experimentos, e ainda por seu capricho no café. Ao

Clayton, sempre prestativo, por nossas discussões experimentais e ajuda na análise

dos (muitos) resultados. À Cris, pelas conversas e ajudas na bancada. À Milena que

nos deixou no Biopol, mas com certeza também fez parte de muitos acontecimentos

no laboratório. À Paulinha que entrou para o Biopol, pelos bons momentos no

laboratório e papos na hora do cafezinho. À Adriana (Lubambo), por trazer ao

laboratório sua alegria e animação, e ainda por compartilhar seus conhecimentos em

AFM.

À Fran pelas conversas, ajuda e companhia; e pela mãozinha e contribuição

valiosa quando estivemos na USP; e também à sua família, principalmente sua mãe,

Rosane, por abrirem sua casa quando fomos a Itajaí realizar parte dos

experimentos.

Meu agradecimento especial à Neoli, uma pessoa maravilhosa, exemplo de

pesquisadora e recentemente também como professora, alguém que com o passar

do tempo se tornou uma grande amiga. Obrigada pelas conversas, discussões

científicas e outras nem tanto, sugestões e por compartilhar sua experiência.

I would like to thank Dr. Prasad (Vadakkethonippurathu Sivankutty Nair

Prasad), from India, for the good and funny moments spent together at the lab. Also

for his effort on looking for TKP sample and sending it to our studies.

Às colegas que estiveram agitando o laboratório: Fran, Carlinha, Rosangela,

Manu e Prof.ª Dr

. Lucy Ono, pelos agradáveis momentos no Biopol.

Aos meus colegas da turma de mestrado pelos momentos de estudo, mas

também de descontração: Anelis, Arnaldo, Arquimedes, Carol, Dirce, Gustavo,

Juliana, Larry, Leandro, Michelle, Paulo, Ricardo, Tuca e Vivian.

Aos colegas e amigos da Bioquímica e da Química.

À Coordenação e ao Colegiado do curso de Pós-graduação em Bioquímica, e

à secretária, Marilza Doroti Lamour.

Ao Depto de Bioquímica e também ao Depto de Química da UFPR, e seus

professores, pela possibilidade de usufruir de seus equipamentos e estrutura.

Ao Depto de Física da UFPR, em especial ao Prof. Paulo César de Camargo

pelo acesso ao AFM, assim como aos demais professores do departamento.

À Central Analítica da USP pelas análises elementares.

Ao CME - Centro de Microscopia Eletrônica da UFPR.

Aos funcionários das Bibliotecas de Ciências Biológicas e Ciências Exatas e

Tecnologia.

Às grandes amizades de São Paulo e Curitiba que cultivo até hoje.

Ao CNPq, pela bolsa DTI e suporte financeiro através da REDE

NANOGLICOBIOTEC, os quais permitiram a aquisição dos equipamentos e o

desenvolvimento desse trabalho no BIOPOL; à CAPES e à Fundação Araucária pelo

apoio financeiro.

E, de modo geral, a todos que de maneira direta ou indireta me auxiliaram na

execução desta dissertação, meu sincero muito obrigada!

“Para nos tornarmos pessoas de mérito e de

valor, o que há de mais certo em nós é

confiarmos em nós mesmos."

(Michelangelo Buonarroti)

"Quero, um dia, dizer às pessoas que nada foi

em vão... Que o amor existe, que vale a pena

se doar às amizades e às pessoas, que a vida

é bela sim e que eu sempre dei o melhor de

mim... e que valeu a pena."

(Mário Quintana)

RESUMO

Xiloglucanas (XG) extraídas de sementes de Tamarindus indica (XGT) e Copaifera

langsdorffii (XGC) foram estudadas comparativamente a uma XG comercial de

sementes de tamarindo (TKP), com o objetivo de desenvolver materiais

nanoestruturados para a liberação prolongada de droga e a formação de filmes

finos. Análises de açúcar total quantificaram 89,5, 90,5 e 84,6% para XGC, XGT e

TKP, respectivamente. As XG extraídas apresentaram menor teor de proteínas, de

0,12 (XGC) e 0,53% (XGT), do que a TKP (1,25%). A razão molar identificada entre

as unidades de Glc: Xyl: Gal foi de 2,4:2,1:1 (XGC); 2,8: 2,3: 1 (XGT) e 2,4: 2,3: 1

(TKP), que foi similar às análises de RMN

C e

H. Apenas o teor de açúcar,

proteínas e a composição monossacarídica foram realizadas para TKP. A análise

por GC-MS da XGT e XGC parcialmente metiladas mostrou características similares,

mas a XGC tem mais ramificações devido à presença de mais terminações β-

-Gal.

Derivados oxidados de XG foram produzidos pelo reagente TEMPO (2,2,6,6-

tetrametilpiperidina-1-oxil). A partir da oxidação completa (100%) foi possível obter

derivados parcialmente oxidados de 30 e 60% (Tod30 e Tod60, para XGT e Cod30 e

Cod60, para XGC), os quais foram confirmados por colorimetria, cromatografia em

camada delgada e RMN

C. Os polissacarídeos modificados Cod100 e Tod30 (~γ

71,3 e 69,7 mN/m, respectivamente) foram capazes de diminuir a tensão superficial

da água (γ= 72,7 mN/m) e, também, após a oxidação alteraram a conformação da

cadeia polissacarídica para Tod60, como visto por dicroísmo circular. As amostras

nativas foram estudadas por meio de cromatografia de permeação em gel (GPC), e

apenas XGT e TKP apresentaram homogeneidade e comportamento monodisperso,

com valores de M

calculados como 6,53x10

e 8,03x10

, respectivamente. Análises

reológicas demonstraram que a XGT apresentou maior viscosidade intrínseca em

solução tampão fosfato (PBS) (609,4 mL/g) que a TKP (359,8 mL/g); e os valores

das constantes de Huggins sugeriram que o PBS foi um bom solvente.

Concentrações críticas por reologia e por GPC ficaram entre 1,2 - 1,4 g/L, porém

foram muito superiores às observadas por espectroscopia de fluorescência,

utilizando pireno como marcador fluorescente. A última levou à concentração de

agregação crítica (cac), como segue: XGT< Cod60< XGC< TKP< Tod60. Os

derivados 60% oxidados apresentaram melhor desempenho que os outros indicando

que polímeros carregados podem apresentar comportamentos diversos.

Conhecendo a cac e as características do marcador foi possível utilizar as XG como

materiais de revestimento e protetores de drogas. Na cac as amostras foram

visualizadas por AFM como agregados esféricos de, aproximadamente, 14 nm. A

observação de nanoagreagados levou à investigação da formação de filmes finos

dos polissacarídeos por meio da elipsometria e AFM. As amostras nativas foram

depositadas sobre wafers de Si e as oxidadas sobre wafers de Si amino-

funcionalizados sobre os quais foram imobilizadas a albumina bovina, a

concanavalina A e/ou as partículas de vírus da dengue. As adsorções forneceram

informações importantes sobre interações na interface carboidrato-proteínas, e

indicam as XG como potenciais polímeros para o desenvolvimento de biomateriais,

design de biosensores e dispositivos biotecnológicos, como por exemplo, kits para

diagnóstico rápido.

Palavras-chave: Xiloglucana. Tamarindus indica. Copaifera langsdorffii. Liberação in

vitro. Filmes finos. Vírus da dengue.

ABSTRACT

Xyloglucans (XG) extracted from Tamarindus indica (XGT) and Copaifera langsdorffii

(XGC) seeds were studied comparatively to a commercially available XG from

tamarind seed (TKP) with the aim to develop nanostructured materials to longer drug

release and thin films formation. Total sugar analysis amounted 89.5; 90.5 and

84.6% to XGC, XGT and TKP, respectively. The extracted ones showed lower

protein content, 0.12 (XGC) and 0.53% (XGT) than TKP (1.25%). They presented

Glc:Xyl:Gal molar ratios of 2.4:2.1:1 (XGC); 2.8: 2.3: 1 (XGT) and 2.4: 2.3: 1 (TKP),

in accordance with

C and

H –NMR data. Only sugar and protein contents and

monosaccharide composition were performed to TKP. The GC-MS analysis of the

partially methylated XGT and XGC showed similar features, but XGC has more

branches due to more β-

-Gal ends. Oxidized XG derivatives were produced by the

reactant TEMPO (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl). From the complete oxidation

(100%) it was possible to have the partially oxidized derivatives of 30 and 60%

(Tod30 and Tod60, for XGT and Cod30 and Cod 60, for XGC), which were confirmed

by colorimetric assay, thin layer chromatography and

C–NMR. The modified

polysaccharides Cod100 and Tod30 (~γ 71.3 and 69.7 mN/m, respectively) were able

to reduce the surface tension of water (γ=72.7 mN/m), and, also, to Tod changed the

polysaccharide chain conformation, as seen by circular dichroism. The native

samples were studied by means of gel permeation chromatography (GPC), only XGT

and TKP presented homogeneity and monodispersed behavior, with M

values

calculated as 6.53x10

and 8.03x10

, respectively. Rheological analysis

demonstrated that XGT presented higher intrinsic viscosity in phosphate buffer

solution (PBS) (609.4 mL/g) than TKP (359.8 mL/g), and the Huggins constant

values suggested that PBS was a good solvent. Rheological critical concentrations

and that determined by GPC were between 1.2-1.4 g/L, although were much higher

than those observed by fluorescence spectroscopy, using pyrene as fluorescent

probe. The last led to critical aggregation concentration (cac) as follow: XGT<

Cod60< XGC< TKP< Tod60. The 60% oxidized derivatives performed better than the

others denoting that charged polymers can present unlike behaviors. Knowing the

cac and the probe features it was possible to use this model applying the XG as

coating materials and drug protectors. At the cac the samples were visualized by

AFM, as spherical aggregates of about 14 nm. The nanoagregates observation led to

the investigation of thin films of polysaccharides by means of ellipsometry and AFM.

The native samples were deposited onto Si wafers and oxidized ones onto amino-

terminated Si wafers and onto them bovine serum albumin, concanavalin A and/or

dengue virus particles were immobilized. The adsorptions provided us valuable

informations about interaction on the carbohydrate-protein interface and indicated XG

as potential polymers for the development of biomaterials, biosensors design and

biotechnological devices, for example, diagnosis quick test kits.

Keywords: Xyloglucan. Tamarindus indica. Copaifera langsdorffii. In vitro release.

Thin films. Dengue Virus.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO OCTASSACARÍDEO

DE XILOGLUCANA........................................................................ 27

FIGURA 2 - Tamarindus indica: PARTES DA PLANTA (A), ÁRVORE E

TRONCO (B), FLORES (C) E VAGENS (D).... ............................. 28

FIGURA 3 - Copaifera langsdorffii: ARBUSTO (A), FLORES E FOLHAS (B),

MADEIRA E TRONCO (C E D), SEMENTES (E) E VAGENS (F) 28

FIGURA 4 - PERFIS PLASMÁTICOS EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE

ADMINISTRAÇÃO..........................................................................

FIGURA 5 - Camptotheca acuminata: ARBUSTO (A), FLORES E FOLHAS

(B) E SEMENTES (C).....................................................................

FIGURA 6 - ESTRUTURA QUÍMICA DA CAMPTOTECINA (CPT) EM SUAS

DUAS FORMAS DEPENDENTES DO pH, UMA FORMA

LACTÔNICA ATIVA EM pH ABAIXO DE 5 E UMA

CARBOXILADA INATIVA EM pH ALCALINO................................ 40

FIGURA 7 - ESTRUTURA DE ALGUNS DERIVADOS COMERCIALMENTE

DISPONÍVEIS OU AINDA EM FASE DE TESTES CLÍNICOS.

SÃO MOSTRADOS TAMBÉM A ESTRUTURA DA CPT

INDICANDO O SEU ESTEREOCENTRO 20-(S) E O

EQUILÍBRIO DINÂMICO ENTRE A FORMA LACTÔNICA E

CARBOXILÍCA............................................................................... 42

FIGURA 8 - EQULÍBRIO ENTRE O DNA E O COMPLEXO BINÁRIO DNA-

TOPOISOMERASE I (TOPO I); E ENTRE O COMPLEXO

BINÁRIO ENZIMA-DNA E O COMPLEXO TERNÁRIO

FORMADO COM A CAMPTOTECINA (CPT)................................ 43

FIGURA 9 - TOPOISOMERASE TIPO I “CORTA” UMA FITA DO DNA E A

TIPO II, A FITA DUPLA. A REAÇÃO CATALISADA POR AMBAS

ENVOLVE A QUEBRA TRANSITÓRIA DO DNA. DURANTE

ESTA REAÇÃO, A ENZIMA LIGA-SE COVALENTEMENTE AO

LOCAL DA QUEBRA POR LIGAÇÃO VIA FOSFOTIROSINA.......

FIGURA 10 - MODELO DE ELIPSÔMETRO MOSTRANDO O ESTADO DA

LUZ POLARIZADA SENDO REFLETIDA E DETECTADA PELO

DETECTOR.................................................................................... 47

FIGURA 11 - ILUSTRAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UM MICROSCÓPIO DE

FORÇA ATÔMICA E SEUS COMPONETES................................. 49

FIGURA 12 - RELAÇÃO DE FORÇAS QUE ATUAM ENTRE A AGULHA E

AMOSTRA, DE ACORDO COM AS DISTÂNCIAS QUE AS

SEPARAM...................................................................................... 50

FIGURA 13 - IMAGEM DE FITAS DE DNA QUE SERVEM DE REFERÊNCIA

PARA IMAGENS DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAS. O

DIÂMETRO DO DNA É DE 2 nm. ESTA AMOSTRA É USADA

PARA CONFERIR O FUNCIONAMENTO ADEQUADO DO

EQUIPAMENTO E ESTABELACER A EFICIENCIA DA ANÁLISE

DE IMAGENS DE JANELAS DE ATÉ 1,2 x 1,2 µm

......................

FIGURA 14 - IMAGEM POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA DO

SISAL NÃO-TRATADO (ESQUERDA) E TRATADO ATRAVÉS

DE BENZILAÇÃO (DIREITA)......................................................... 54

FIGURA 15 - FILME LÍQUIDO ESTICADO EM UM ARAME, SOB ESTADO DE

TENSÃO......................................................................................... 55

FIGURA 16 - REPRESENTAÇÃO DA GOTA COM OS EIXOS DE

COORDENADAS............................................................................

FIGURA 17 - TENSÕES SUPERFICIAIS E DO ÂNGULO DE CONTATO

ENTRE UMA GOTA E UMA SUPERFÍCIE

SÓLIDA............................................ 58

FIGURA 18 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA DETECÇÃO POR

DICROISMO CIRCULAR DA GLUCOSE, UM AÇÚCAR

SIMPLES........................................................................................ 59

FIGURA 19 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA POLARIZAÇÃO DA

LUZ. (A) LUZ PLANO POLARIZADA; (B) LUZ

CIRCULARMENTE POLARIZADA E (C) LUZ ELIPTICAMENTE

POLARIZADA................................................................................. 59

FIGURA 20 -

(A) ESPECTRO DE DICROÍSMO DE ESTRUTURAS α-HÉLICE

(VERMELHO), FOLHA β (AZUL) E HÉLICE TIPO POLIPROLINA

(AMARELO). (B) ESPECTRO DE DICROÍSMO DE

CARRAGENANAS (3 g/L, EM KCl 0,01 M, pH 7): λ- (LINHA

PONTILHADA) QUE TEM CONFORMAÇÃO AO ACASO E ι-

(LINHA CONTÍNUA) QUE TEM ESTRUTURA HELICOIDAL, À

TEMPERATURA AMBIENTE........................................................ 60

FIGURA 21 -

ESTRUTURA SECUNDÁRIA DE PROTEÍNAS: TODA EM α-

HÉLICE, TODA EM FOLHAS β, ESTRUTURAS DO TIPO α/β E

α + β.......................................................................................................... 61

FIGURA 22 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA DE DOIS

POLISSACARÍDEOS DE DIFERENTES CONFORMAÇÕES. (A)

ESTRUTURA DA AMILOSE EM SUA CONFORMAÇÃO MAIS

ESTÁVEL TEM SUA CADEIA CURVADA DEVIDO ÀS

LIGAÇÕES DO TIPO α-(1→4) QUE INDUZEM SUA

ESTRUTURA HELICOIDAL FORTEMENTE ENOVELADA, AO

INVÉS DE LINEAR COMO DA CELULOSE MOSTRADA EM (B)

COM UNIDADES DE GLUCOSE LIGADAS β-(1→4) QUE

ORDENAM AS CADEIAS EM DOIS SEGMENTOS PARALELOS 61

FIGURA 23 -

ESPECTRO DE RMN

H E INTEGRAÇÃO DA REGIÃO

ANOMÉRICA DE XGC (A) E XGT (B) EM D

O, A 70ºC: (a) α-

Xylp SUBSTITUÍDA, (b) α-Xylp NÃO SUBSTITUÍDA EM

TERMINAIS NÃO REDUTORES (c) SOBREPOSIÇÃO DE

TERMINAIS NÃO REDUTORES DE β-Galp E β-Glcp DA

CADEIA PRINCIPAL. DESLOCAMENTOS QUÍMICOS

EXPRESSOS EM ppm…….....................................................….. 89

FIGURA 24 -

ESPECTRO DE RMN (A):

C E (B):

H E INTEGRAÇÃO DA

REGIÃO ANOMÉRICA DA XILOGLUCANA COMERCIAL TKP,

EM D

O, A 70ºC. DESLOCAMENTOS QUÍMICOS

EXPRESSOS EM ppm.................................................................

FIGURA 25 -

ESPECTROS DE INFRAVERMELHO DURANTE

ACOMPANHAMENTO DO PROCESSO DE METILAÇÃO DA

XGC. AMOSTRA NATIVA (A) E METILADA (B)…………………..

FIGURA 26 -

ESPECTROS DE INFRAVERMELHO DURANTE

ACOMPANHAMENTO DO PROCESSO DE METILAÇÃO DE

XGT. AMOSTRA NATIVA (A) E METILADA (B)………………….. 91

FIGURA 27 -

ESQUEMA DA REAÇÃO DE OXIDAÇÃO COM O REATIVO

TEMPO SOBRE AS UNIDADES MONOSSACARÍDICAS DA

XILOGLUCANA DESTACADAS PELAS SETAS E CAIXAS EM

CINZA............................................................................................

FIGURA 28 -

FORMAS ESTRUTURAIS DO TEMPO (2,2,6,6-

TETRAMETILPIPERIDINA-1-OXIL): FORMA RADICALAR (1),

ÍON NITROSÔNIO (2) E FORMA REDUZIDA PARA UMA

HIDROXILAMINA (3).................................................................... 94

FIGURA 29 -

ETAPAS DA OXIDAÇÃO DE ÁLCOOL PRIMÁRIO COM

TEMPO, HIPOBROMITO E HIPOCLORITO DE SÓDIO.............. 94

FIGURA 30 -

VOLUME DA SOLUÇÃO (mL) DE NaOH (0,102 mol/L) EM

FUNÇÃO DO TEMPO DURANTE O PROCESSO DE

OXIDAÇÃO DE XGC (A) E XGT (B)............................................. 95

FIGURA 31 -

PERFIL DE ELUIÇÃO EM CROMATOGRAFIA EM CAMADA

DELGADA DAS AMOSTRAS PARCIALMENTE OXIDADAS

(60%) DE XG DE TAMARINDO (LINHA 3, TOD60) E

COPAIFERA (LINHA 4, COD60). PADRÕES NEUTROS (LINHA

1) E ÁCIDOS (LINHA 2) PARA

COMPARAÇÃO……...............................................……………….

FIGURA 32 -

ESPECTRO DE RMN

C DE XGC (C) E XGT (T) EM H

O, A 70ºC. DESLOCAMENTOS QUÍMICOS EXPRESSOS

EM ppm......................................................................................... 97

FIGURA 33 ESPECTRO DE RMN

C DE XILOGLUCANAS OXIDADAS DE

SEMENTES DE C. langsdorffii, EM H

O: D

O, A 70ºC: (a)

OXIDAÇÃO DE 30%, COD30; (b) 60%, COD60; (c) 100%,

COD100. DESLOCAMENTOS QUÍMICOS EXPRESSOS EM

ppm…………………………………………………………………….

FIGURA 34 - ESPECTRO DE RMN

C DE XILOGLUCANAS OXIDADAS DE

SEMENTES DE T. indica, EM H

O: D

O, A 70ºC: (a)

OXIDAÇÃO DE 30%, TOD30; (b) 60%, TOD60 (c) 100%,

TOD100. DESLOCAMENTOS QUÍMICOS EXPRESSOS EM

ppm…………………………………………………………………….

100

FIGURA 35 - REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA DETERMINAÇÃO DA

VISCOSIDADE INTRÍNSECA [η], EM mL/g, PARA A XGT (•) E

TKP (▲), A 25ºC. AS AMOSTRAS FORAM SOLUBILIZADAS

EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO (28 mM) CONTENDO

NaCl (123 mM), EM pH 7,4.......................................................... 102

FIGURA 36 - PERFIL CROMATOGRÁFICO DA XILOGLUCANA DE

SEMENTES DE C. langsdorffii (A), T. indica (B) e TKP (C) POR

DETECTORES DE ESPALHAMENTO DE LUZ A 90º (VERDE,

RALLS) E A 7º (PRETO, LALLS), E ÍNDICE DE REFRAÇÃO

(VERMELHO), EM mV, EM FUNÇÃO DO VOLUME DE

RETENÇÃO, EM mL.................................................................... 104

FIGURA 37 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA DISTÂNCIA PONTA

A PONTA E RAIO DE GIRAÇÃO................................................. 106

FIGURA 38 - ESPECTRO DE EMISSÃO DE FLUORESCÊNCIA DO PIRENO

EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO (28 mM) CONTENDO 123

mM DE NaCl, pH 7,4.................................................................... 107

FIGURA 39 - GRÁFICO DA RELAÇÃO ENTRE OS PICOS III/I DE EMISSÃO

DE FLUORESCÊNCIA EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO

DA XGC, EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO 28 mM

CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4........................................

108

FIGURA 40 - GRÁFICO DA RELAÇÃO ENTRE OS PICOS III/I DE EMISSÃO

DE FLUORESCÊNCIA EM FUNÇÃO DO TEMPO. XG EM

SUAS CONCENTRAÇÕES CRÍTICAS DE AGREGAÇÃO, EM

SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM

DE NaCl, pH 7,4: XGT (●), TOD60 (○), XGC (■), COD60 (□),

TKP (▲)........................................................................................ 110

FIGURA 41 - REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DO PERFIL CARACTERÍSTICO

DAS POSSÍVEIS ESTRUTURAS SECUNDÁRIAS

ANALISADAS POR DICROÍSMO CIRCULAR............................. 111

FIGURA 42 - GRÁFICO DE DICROÍSMO CIRCULAR DOS

POLISSACARÍDEOS, A 1 mg/mL EM TAMPÃO SALINO, A 5

(LINHA PONTILHADA), 25 (LINHA SÓLIDA) E 37ºC (LINHA

TRACEJADA). (A): XGC; (B): COD60; (C): XGT; (D):TOD60;

(E): TKP........................................................................................ 112

FIGURA 43 - GRÁFICO DA TENSÃO SUPERFICIAL EM FUNÇÃO DO

LOGARITMO DA CONCENTRAÇÃO DOS

POLISSACARÍDEOS (EM mg/mL), EM SOLUÇÃO TAMPÃO

FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4. (A):

XGC(●), COD30(♦), COD60(∆), COD100(○) E (B): TKP(■),

XGT(●), TOD30(♦), TOD60(∆), TOD100(○)..................................

114

FIGURA 44 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA

TOPOGRAFIA DE XGC SOBRE SILÍCIO EM SUA

CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl,

pH 7,4........................................................................................... 117

FIGURA 45 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA

TOPOGRAFIA DE XGT SOBRE SILÍCIO EM SUA

CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl,

pH 7,4........................................................................................... 117

FIGURA 46 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA

TOPOGRAFIA DE TKP SOBRE SILÍCIO EM SUA

CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl,

pH 7,4........................................................................................... 118

FIGURA 47 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA

TOPOGRAFIA DE COD60 SOBRE SILÍCIO EM SUA

CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl,

pH 7,4........................................................................................... 118

FIGURA 48 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA

TOPOGRAFIA DE TOD60 SOBRE SILÍCIO EM SUA

CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl,

pH 7,4........................................................................................... 119

FIGURA 49 - IMAGENS POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE

TRANSMISSÃO. (A): XGT AUMENTO DE 150.000X, (B): XGT

AUMENTO DE 500000X, (C): TOD60 AUMENTO DE 150000X,

(D): TOD60 AUMENTO DE 500000X, (E): TKP AUMENTO DE

150000X E (F): TKP AUMENTO DE 500000X. XG EM SUA

CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl,

pH 7,4...........................................................................................

120

FIGURA 50 - IMAGENS POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE

TRANSMISSÃO. (A): XGC AUMENTO DE 150000X, (B):

COD60 AUMENTO DE 150000X E (C): COD60 AUMENTO DE

500000X. XG EM SUA CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE

AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO 28 mM

CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4....................................... 121

FIGURA 51 - VIABILIDADE DAS CÉLULAS L929 EM CONCENTRAÇÃO DE

0,5 mg/mL (A) E 1,0 mg/mL (B) EXPOSTAS POR 24 HORAS

ÀS XG, UTILIZANDO COMO CONTROLES NEGATIVO O

TAMPÃO FOSFATO SALINO (PBS, pH 7,4) (CN) E O

SOLVENTE (S) E COMO CONTROLE POSITIVO (CP)

DIMETILSULFÓXIDO (DMSO). GRÁFICO REPRESENTADO

POR MÉDIA ± DESVIO PADRÃO (N=4)…………………………..

122

FIGURA 52 - GRÁFICO DA EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAMENTO DE

CAMPTOTECINA POR DIFERENTES XG: XGT (T. indica),

XGC (C. langsdorffii), TKP (COMERCIAL), TOD60 (XGT 60%

OXIDADA), COD60 (XGC 60% OXIDADA). VALORES DA

MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)…………………………………

123

FIGURA 53 - ESQUEMA DAS INTERAÇÕES ENTRE A CAMPTOTECINA

(CPT) E AS CADEIAS DE O-CARBOXIMETILQUITOSANA

(OCMCS)...................................................................................... 124

FIGURA 54 - ESPECTRO DE EMISSÃO DE FLUORESCÊNCIA DA

CAMPTOTECINA (CPT) SOLUBILIZADA APENAS EM

PBS/NaCl (PRETO) E EM SOLUÇÕES CONTENDO AS

DIFERENTES XG: XGT (T. indica, AZUL), XGC (C. langsdorffii,

VERMELHO), TKP (COMERCIAL, LARANJA), TOD60 (XGT

60% OXIDADA, ROSA), COD60 (XGC 60% OXIDADA,

VERDE)........................................................................................ 125

FIGURA 55 - GRÁFICO DA LIBERAÇÃO IN VITRO DE CAMPTOTECINA

(CPT) SOLUÇÃO CONTENDO DIFERENTES XG: XGT (T.

indica), XGC (C. langsdorffii), TKP (COMERCIAL), TOD60

(XGT 60% OXIDADA), COD60 (XGC 60% OXIDADA); E

AINDA, APENAS EM PBS/NaCl, pH 7,4. VALORES DA MÉDIA

DESVIO PADRÃO (N=2)…………………………………………. 125

FIGURA 56 - VALORES MÉDIOS DA ESPESSURA (D) DETERMINADOS

PARA A CAMADA DE ADSORÇÃO DE (A) XGT (■), TKP (○) E

XGC (∆) SOBRE SILÍCIO, EM pH 7.4 E (B) TOD60 (□) SOBRE

SILÍCIO AMINO FUNCIONALIZADOS, EM pH 4. AS LINHAS

PONTILHADAS SÃO GUIAS PARA VISUALIZAÇÃO.

VALORES DA MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)......................

127

FIGURA 57 - IMAGENS DE AFM DOS FILMES DE XG ADSORVIDAS

SOBRE SILÍCIO, EM pH 7,4. TKP (A, B, C), XGT (D, E, F) E

XGC (G, H, I). IMAGENS DE FASE (ESQUERDA),

TOPOGRAFIA (CENTRO) E AS ANÁLISES

CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL (DIREITA),

ÁREAS DE VARIANDO DE 2,5 X 2,5 A 2 X 2 µm

......................

128

FIGURA 58 - IMAGENS DE AFM DO FILME DE TOD60 ADSORVIDA

SOBRE SILÍCIO AMINO-FUNCIONALIZADO, EM pH 4.

IMAGENS DE FASE (ESQUERDA), TOPOGRAFIA (CENTRO)

E AS ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO

TRANSVERSAL (DIREITA), ÁREA DE 2 X 2 µm

.......................

129

FIGURA 59 - ESPESSURA MÉDIA (D) DA SOLUÇÃO DE BSA ADSORVIDA

EM: (A) TPK (●) E XGT (■) RECOBRINDO SUPERFÍCIE DE

SILÍCIO, EM pH 7,4 E (B) TOD60 (▲) RECOBRINDO

SUPERFÍCIE DE SILÍCIO AMINO-FUNCIONALIZADO, EM pH

4. AS LINHAS PONTILHADAS SÃO GUIAS PARA

VISUALIZAÇÃO. VALORES DA MÉDIA +

DESVIO PADRÃO

(N=2).............................................................................................

130

FIGURA 60 - IMAGENS DE AFM DA ALBUMINA, EM pH 5, IMOBILIZADA

SOBRE SILÍCIO RECOBERTO COM FILMES DE XG, EM pH

7,4. XGT (A, B, C), TKP (D, E, F) E TOD60 (G, H, I). IMAGENS

DE FASE (ESQUERDA), TOPOGRAFIA (CENTRO) E AS

ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL

(DIREITA), ÁREAS VARIANDO DE 2,2 X 2,2 A 2 X 2 µm

..........

132

FIGURA 61 - IMAGENS DE AFM DA CONCANAVALINA A (ConA), EM pH 5,

IMOBILIZADA SOBRE SILÍCIO RECOBERTO COM FILMES

DE XG, EM pH 7,4. XGT (A, B) E TKP (C,D). IMAGENS DE

TOPOGRAFIA E AS ANÁLISES CORRESPONDENTES À

SEÇÃO TRANSVERSAL, ÁREA DE 2 X 2 µm

...........................

133

FIGURA 62 - IMAGENS DE AFM DA CONCANAVALINA A (ConA), EM pH 5,

CONTENDO 50 mM DE MANOSE, IMOBILIZADA SOBRE

SILÍCIO RECOBERTO COM FILMES DE XG, EM pH 7,4. XGT

(A, B) E TKP (C, D). IMAGENS DE TOPOGRAFIA E AS

ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL,

ÁREA DE 2 X 2 µm

.....................................................................

134

FIGURA 63 - ESPESSURA MÉDIA (D) DO FILME OBTIDO PARA

DIFERENTES SOROTIPOS DO VÍRUS DA DENGUE (DENV-

1, 2 E 3) SOBRE XG NATIVAS, XGT E TKP, ADSORVIDAS

SOBRE SILÍCIO, pH 7,4; E XG OXIDADA, TOD60,

ADSORVIDA SOBRE SILÍCIO AMINO-FUNCIONALIZADO, EM

pH 4. VALORES DA MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)…....... 136

FIGURA 64 - IMAGENS DE AFM DO VÍRUS DA DENGUE (DENV-2), EM pH

7,2, ADSORVIDO SOBRE SILÍCIO RECOBERTO COM

FILMES DE XG, EM pH 7,4. XGT (A, B, C), TKP (D, E, F) E

TOD60 (G, H, I). IMAGENS DE FASE (ESQUERDA),

TOPOGRAFIA (CENTRO) E AS ANÁLISES

CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL (DIREITA),

ÁREA VARIANDO DE 2,5 X 2,5 A 2 X 2 µm

...............................

138

FIGURA 65 - IMAGENS DE AFM DO VÍRUS DA DENGUE (DENV-2), EM pH

7,2, ADSORVIDO SOBRE CONCANAVALINA A (ConA), EM

pH 5, IMOBILIZADA SOBRE FILME DE XG, EM pH 7,4. XGT

(A, B) E TKP (C, D). IMAGENS DE TOPOGRAFIA E AS

ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL,

ÁREA DE 2 X 2 µm

..................................................................... 139

FIGURA 66 - ÂNGULO DE CONTATO (■) DA ÁGUA SOBRE FILME

OBTIDO PARA DIFERENTES XG COMPARADO À

ESPESSURA (∆) DO FILME FORMADO SOBRE SILÍCIO. XGT

(T. indica), XGC (C. langsdorffii), TKP (COMERCIAL)………….. 141

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - VANTAGENS DAS FORMAS DE LIBERAÇÃO PROLONGADA 33

TABELA 2 - CLASSIFICAÇÃO DE ANTINEOPLÁSICOS…………………….. 37

TABELA 3 - DETERMINAÇÃO DE AÇÚCAR TOTAL, PROTEÍNAS E

UMIDADE DAS XILOGLUCANAS............................................... 87

TABELA 4 - COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DAS XILOGLUCANAS.. 88

TABELA 5 - ACETATO DE ALDITÓIS PARCIALMENTE METILADOS

DERIVADOS DAS XILOGLUCANAS EXTRAÍDAS DE

SEMENTES DE COPAIFERA (XGC) E TAMARINDO (XGT)..... 92

TABELA 6 - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM (m/m) DE OXIDAÇÃO

DAS XG POR MÉTODO COLORIMÉTRICO

COMPARATIVAMENTE À DETERMINAÇÃO

TITULOMÉTRICA.........................................................................

TABELA 7 - VALORES DE CONCENTRAÇÃO CRÍTICA (c*, g/L) PARA AS

AMOSTRAS DE XILOGLUCANA.................................................

101

TABELA 8 - VALORES DE MASSA MOLAR, POLIDISPERSÃO, RAIO DE

GIRO, RAIO HIDRODINÂMICO, VISCOSIDADE INTRÍNSECA

E CONSTANTE α DE MARK-HOUWINK PARA AS

AMOSTRAS DE XILOGLUCANAS

(1)

..........................................

105

TABELA 9 - VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE AGREGAÇÃO CRÍTICA

(mg/mL) DAS XG E SEUS DERIVADOS OXIDADOS

DETERMINADOS POR ESPECTROSCOPIA DE

FLUORESCÊNCIA, EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO (28

mM) CONTENDO NaCl (123 mM), EM pH 7,4........................... 109

TABELA 10 - VALORES DE LARGURA E ALTURA, EM nm, A PARTIR DE

IMAGENS DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA PARA

XG TESTADAS EM SUAS RESPECTIVAS

CONCENTRAÇÕES CRÍTICAS SOBRE SILÍCIO, EM

SOLUÇAO TAMPÃO FOSFATO (28 mM) CONTENDO NaCl

(123 mM), EM pH 7,4...................................................................

116

TABELA 11 - LIBERAÇÃO IN VITRO DE CAMPTOTECINA (CPT) POR

DIFERENTES XG: FRAÇÃO DE CPT APÓS 24 HORAS E

TEMPO PARA LIBERAÇÃO DE 50% DE CPT. VALORES DA

MÉDIA + DESVIO PADRÃO (N=2)………………………………... 126

TABELA 12 - VALORES DA ESPESSURA MÉDIA, EM nm,

DETERMINADOS POR ELIPSOMETRIA PARA A LECTINA

CONCANAVALINA A (ConA) SOBRE FILMES DE XG, E

TAMBÉM NA PRESENÇA DE MANOSE. VALORES DA

MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)………………………………... 133

TABELA 13 - VALORES DA ESPESSURA MÉDIA DE ADSORÇÃO, EM nm,

DETERMINADOS POR ELIPSOMETRIA, PARA O VÍRUS DA

DENGUE (DENV-1, 2 E 3) SOBRE FILMES DE XG. VALORES

DA MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)…………………………… 136

TABELA 14 - VALORES DA ESPESSURA MÉDIA DE ADSORÇÃO, EM nm,

DETERMINADOS POR ELIPSOMETRIA, PARA O VÍRUS DA

DENGUE (DENV-2) ADSORVIDO SOBRE CONCANAVALINA

A (ConA) IMOBILIZADA SOBRE FILME DE XG. VALORES DA

MÉDIA + DESVIO PADRÃO (N=4)……...................................... 139

LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIAÇÕES

α: constante α de Mark Houwink

20:

rotação da luz polarizada em graus, a 20°C

γ: tensão superficial

: tensão líquido-vapor

: tensão sólido-vapor

: tensão sólido-líquido

θ: ângulo de contato

rel

: viscosidade relativa

: viscosidade específica

red

: viscosidade reduzida

[η]: viscosidade intrínseca

: constante de Huggins

AFM: microscopia de força atômica, do inglês Atomic Force Microscopy

APS: 3-aminopropiltrimetoxisilano

BSA: albumina bovina, do inglês Bovine Serum Albumin

c: concentração

cac: concentração de agregação crítica

CCD: cromatografia em camada delgada

CD: dicroísmo circular, do inglês Circular Dichroism

CG: Cromatografia gasosa

ConA: Concanavalina A

CPT: camptotecina

DENV-: Vírus da dengue

DMSO: dimetilsulfóxido

dn/dc: constante que relaciona o índice de refração em função da concentração

ELISA: Ensaio por enzima ligada a anticorpo imobilizado, do inglês Enzime-Linked

ImmunoSorbent Assay

GPC: cromatografia de permeação em gel, do inglês Gel Permeation

Chromatography

HAS: Hemaglutininas sedimentadas

HDL: Hidróxido duplo lamelar

L: comprimento do caminho óptico, em dm

LALLS: espalhamento de luz laser em baixo ângulo, do inglês Low angle laser light

scattering

MET: microscopia eletrônica de transmissão

MEV: SEM: microscopia eletrônica de varredura

Monossacarídeos: Ara: arabinose

Gal: galactose (L)

GalA: ácido galacturônico

Glc: glucose (G)

GlcA: ácido glucurônico

Xyl: xilose (X)

: massa molar numérica média

: massa molar ponderal média

MTT: brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio

NA: número de Avogadro (NA = 6,02x10

)

OCMCS: O-Carboximetilquitosana

PBS: solução tampão fosfato

PBS/NaCl: solução tampão fosfato contendo cloreto de sódio

RALLS: espalhamento de luz laser em ângulo reto, do inglês Right angle laser light

scattering

: raio de giro

: raio hidrodinâmico

RI: índice de refração, do inglês Refractive index

RMN: ressonância magnética nuclear

RT-PCR: reação em cadeia da polimerase em tempo real, do inglês Real-Time

Polimerase Chain Reaction

SDD: Sistema Drug Delivery

Si: lâminas de silício

SFB: Soro Fetal Bovino

SFM: Microscopia de varredura por força, do inglês Scanning Force Microscopy

SPM: Microscopia de varredura por sonda, do inglês Scanning Probe Microscopy

STM: Microscopia de varredura por tunelamento, do inglês Scanning Tunneling

Microscopy

TCA: ácido tricloroacético, do inglês Trichloroacetic acid

TEMPO: 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil

TFA: ácido trifluoracético, do inglês Trifluoracetic acid

TKP: pó de semente de tamarindo, do inglês Tamarind kernel powder

VI: viscosidade intrínseca

VDW: forças de van der Waals

XG: xiloglucana

XGC: xiloglucana de Copaifera langsdorffii

XGT: xiloglucana de Tamarindus indica

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................25

1.1 Polissacarídeos ...................................................................................................25

1.2 Xiloglucanas ........................................................................................................26

1.3 Sistemas de liberação de drogas.........................................................................30

1.4 Agentes antineoplásicos......................................................................................36

1.4.1 Alcalóides ........................................................................................................ 38

1.4.1.1 Camptotecina e seus derivados.................................................................... 39

1.4.1.1.1 Aplicações clínicas e efeitos adversos ...................................................... 44

1.5 Formação de filmes finos de polissacarídeos......................................................45

1.6 Técnicas diferenciais para análise de polissacarídeos........................................47

1.6.1 Elipsometria..................................................................................................... 47

1.6.2 Microscopia de força atômica .......................................................................... 48

1.6.2.1 Microscopia de força atômica em modo não-contato ................................... 51

1.6.2.2 Microscopia de força atômica em modo de contato intermitente.................. 52

1.6.2.3 Aplicações da microscopia de força atômica................................................ 53

1.6.2.3.1 Estudo de biomoléculas............................................................................. 53

1.6.2.3.1.1 Análise de um polímero natural .............................................................. 54

1.6.3 Tensiometria e fenômenos de superfície......................................................... 55

1.6.4 Dicroísmo circular............................................................................................ 58

2 OBJETIVOS ...........................................................................................................62

2.1 Objetivo geral ......................................................................................................62

2.2 Objetivos específicos...........................................................................................62

3 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................64

3.1 Materiais ..............................................................................................................64

3.1.1 Albumina bovina .............................................................................................. 64

3.1.2 Concanavalina A.............................................................................................. 64

3.1.3 Partículas virais da dengue ............................................................................. 64

3.1.4 Fontes dos polissacarídeos ............................................................................. 65

3.1.4.1 Extração das xiloglucanas ............................................................................ 65

3.2 Modificação química dos polissacarídeos: oxidação seletiva com TEMPO

(2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil) ............................................................................66

3.3 Análises químicas das xiloglucanas ....................................................................67

3.3.1 Determinação de açúcar total e proteínas ....................................................... 67

3.3.2 Determinação de ácidos urônicos das amostras oxidadas.............................. 68

3.3.3 Determinação da composição monossacarídica ............................................. 68

3.3.3.1 Hidrólise com ácido trifluoracético ................................................................ 68

3.3.3.2 Redução, acetilação e análise por cromatografia gasosa ............................ 69

3.3.4 Metilação dos polissacarídeos......................................................................... 69

3.4 Métodos físico-químicos ......................................................................................70

3.4.1 Umidade .......................................................................................................... 70

3.4.2 Determinação da homogeneidade, massa molar e concentração crítica ........ 70

3.4.2.1 Refratometria diferencial............................................................................... 70

3.4.2.2 Cromatografia de permeação em gel ........................................................... 71

3.4.2.3 Determinação da concentração crítica por GPC/RI...................................... 71

3.4.3 Análises ópticas e espectroscópicas ............................................................... 72

3.4.3.1 Polarimetria................................................................................................... 72

3.4.3.2 Análise por espectrometria de infravermelho utilizando transformada de

Fourier ......................................................................................................... 72

3.4.3.3 Análise de ressonância magnética nuclear .................................................. 73

3.4.3.3.1 Análise de RMN de hidrogênio .................................................................. 73

3.4.3.3.2 Análise de RMN de carbono-13................................................................. 73

3.4.3.4 Análise por dicroísmo circular....................................................................... 74

3.4.3.5 Análise por espectrometria de fluorescência ................................................ 74

3.4.4 Análises de viscosidade .................................................................................. 75

3.4.4.1 Determinação da concentração crítica ......................................................... 75

3.4.4.2 Determinação da viscosidade intrínseca e da constante de Huggins........... 75

3.4.5 Análise de tensão superficial ........................................................................... 76

3.5 Métodos de imagem por microscopia ..................................................................77

3.5.1 Análise por microscopia de força atômica ....................................................... 77

3.5.2 Análises por microscopia de transmissão........................................................ 78

3.6 Ensaio bioquímico celular....................................................................................78

3.6.1 Análise de citotoxicidade dos polissacarídeos nativos e modificados ............. 78

3.6.1.1 Cultura de células......................................................................................... 78

3.6.1.2 Ensaio de citotoxicidade pelo teste MTT ...................................................... 79

3.7 Ensaio de liberação in vitro da droga...................................................................80

3.7.1 Preparo do complexo de encapsulamento polímero-droga ............................. 80

3.7.2 Análise de encapsulamento da droga.............................................................. 80

3.7.3 Liberação in vitro da camptotecina .................................................................. 81

3.8 Análise de adsorção de filmes de polissacarídeos sobre suporte sólido.............81

3.8.1 Elipsometria e análise dos filmes formados..................................................... 81

3.8.2 Preparo das lâminas de silício......................................................................... 82

3.8.3 Preparo dos filmes de polissacarídeo sobre lâminas de silício........................ 82

3.8.4 Preparo da solução de albumina sérica bovina ............................................... 83

3.8.5 Preparo da solução de partículas de vírus da dengue..................................... 83

3.8.6 Preparo da solução de lectina ......................................................................... 84

3.8.7 Interação de biomoléculas com os filmes de polissacarídeos ......................... 84

3.8.8 Ensaios de dessorção ..................................................................................... 85

3.8.9 Análise do ângulo de contato .......................................................................... 85

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................86

4.1 Obtenção das xiloglucanas nativas .....................................................................86

4.2 Caracterização química, físico-química e estrutural das xiloglucanas.................87

4.3 Modificação química da xiloglucana ....................................................................93

4.4 Análises reológicas das xiloglucanas ................................................................101

4.5 Análise de homogeneidade e da massa molar..................................................103

4.6 Análise de fluorescência....................................................................................107

4.7 Análise da conformação polimérica por dicroísmo circular................................110

4.8 Análise das xiloglucanas por tensão superficial ................................................113

4.9 Análises das partículas de xiloglucanas por técnicas de microscopia...............115

4.9.1 Análises por microscopia de força atômica ................................................... 115

4.9.2 Análises por microscopia eletrônica de transmissão ..................................... 119

4.10 Cultivo Celular .................................................................................................121

4.10.1 Avaliação da viabilidade celular................................................................... 121

4.11 Ensaio de liberação in vitro de camptotecina ..................................................123

4.12 Análise dos filmes de polissacarídeos por elipsometria e microscopia de força

atômica............................................................................................................127

4.13 Análise do ângulo de contato dos filmes .........................................................140

5 CONCLUSÕES ....................................................................................................142

REFERÊNCIAS.......................................................................................................143

ANEXOS .................................................................................................................175

1 INTRODUÇÃO

1.1 Polissacarídeos

Os polissacarídeos, biopolímeros naturais, têm sido apontados como uma das

mais importantes fontes renováveis de biomassa para uma ampla variedade de

avanços em materiais poliméricos, o que tem aumentado, na última década, o

interesse de cientistas, institutos de pesquisa e de indústrias (HEINZE et al., 2005).

São formados por ligações glicosídicas entre unidades monoméricas e podem ter

estrutura linear ou ramificada. Se for constituído de um único tipo de

monossacarídeo será um homopolissacarídeo; se dois ou mais tipos de

monossacarídeos são encontrados na composição, são chamados de

heteropolissacarídeos. Os polissacarídeos são, geralmente, compostos solúveis,

sem sabor e de alta massa molar (CONN; STUMPF, 1980).

Polissacarídeos endógenos de origem vegetal são reconhecidos como

ingredientes funcionais em alimentos (THARANATHAN et al., 1987;

THARANATHAN, 1995). Devido à sua variedade estrutural e diversidade constituem

um atrativo, seja em sua forma nativa ou modificada, em diversas áreas incluindo

aplicações em alimentos e outras (HEINZE et al., 2005), e são uma das mais

abundantes e diversificadas famílias de biopolímeros.

A sua estrutura primária varia em composição, seqüência, massa molar,

configuração anomérica, posição de ligações e densidade de carga, que podem dar

origem a infinitas formas de estruturas químicas e de conformação, as quais refletem

em variações de propriedades e de aplicações. As de interesse comercial são tão

diversas quanto o são esses materiais, cobrindo o espectro de produtos químicos

corriqueiros até especialidades químicas lucrativas para usos médicos e de alta

tecnologia (YALPANI, 1988). Como exemplo, as galactomananas e as xiloglucanas,

também denominadas de hidrocolóides, ocorrem freqüentemente em muitas

espécies vegetais.

1.2 Xiloglucanas

As xiloglucanas (XG) são carboidratos vegetais de importante interesse

industrial, já foram isoladas de azeitonas (VIERHUIS et al., 2001), farinha de soja

(HUISMAN et al., 2000), sementes de jojoba (HANTUS et al., 1997), maçã (LANG et

al.1992; RENARD; LEMUNIER; THIBAULDT, 1995; WATT et al., 1999;

THOMPSON; FRY, 2000), cotilédones de jatobá (KOOIMAN, 1960; LIMA et al.,

1993; BUCKERIDGE et al., 1997) copaífera (BUCKERIDGE et al., 1992; STUPP et

al., 2007) e tamarindo (RAO; SRIVASTAVA, 1973). Possuem função estrutural e de

reserva na parede celular e no endosperma de sementes de mono e dicotiledôneas

(HAYASHI et al.1987). Constituem cerca de 20-25% da parede celular primária de

angiospermas dicotiledôneas, 2-5% de gramíneas (angiosperma monocotiledônea)

e, aproximadamente, 10% da parede celular de cebolas (angiosperma

monocotiledônea) (HEINZE et al., 2005).

Em seu estado nativo, as XG estruturais estão fortemente associadas à

microfibrilas de celulose, principalmente através de ligações de hidrogênio, formando

uma rede de estrutura rígida (HAYASHI, 1989; 1994), sendo que essa capacidade

de associação com a celulose também pode ser afetada pelas unidades das

ramificações da cadeia (VINCKEN et al., 1995; LIMA; BUCKERIDGE, 2001),

contribuindo significativamente para a extensibilidade da parede celular primária

(BAUER et al., 1973; REID, 1985; HAYASHI et al., 1987; MACDOUGAL; FRY, 1991;

FEMENIA et al., 1999). Essa interação com a celulose pode estar relacionada às

unidades de fucose presentes na XG contribuindo para essa afinidade (MISHIMA et

al., 1998). Em estudos de modelagem molecular, Levy et al. (1991), sugeriram que a

presença de fucose nas XG de parede celular primária determina uma conformação

plana ao polímero, sendo responsável por esta capacidade de se ligar à celulose.

As xiloglucanas de sementes são compostas estruturalmente por uma cadeia

principal de glucana-β-(1→4) substituída em O-6 por unidades de α-

D-

xilose e por

unidades de β-

-galactose terminal na posição de O-2 das unidades de xilose

(ALBERSHEIM, 1976), como representado na figura 1. Arabinose é frequentemente

encontrada em xiloglucanas estruturais e de reserva (LIMA et al., 1995; YORK et al.,

1996; VINCKEN et al., 1997; WATT et al., 1999; BUSATO et al., 2001 JIA et al.,

2003; FREITAS et al., 2005). A composição monossacarídica e a proporção

monossacarídica, bem como o comportamento das XG, podem variar conforme a

espécie e a origem geográfica e sazonal do vegetal (FREITAS et al., 2005).

- (1-2)-

- Galp

- (1-6)-

- Xylp

- (1-4)-

- Glup

FIGURA 1 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO OCTASSACARÍDEO DE XILOGLUCANA

Exceto pela ausência de unidades terminais α-(1→2)-Fucp ligadas aos

grupos β-

-galactosil, há uma similaridade marcante entre XG de reserva em

sementes e as XG estruturais de paredes primárias de tecidos vegetais de

dicotiledôneas (HAYASHI, 1989). Foi observado por Reis et al. (1987) que as

xiloglucanas de sementes se acumulam de forma exclusiva e transitória nas paredes

dos tecidos dos cotilédones, protegidas por membranas finas, formando um

compartimento de reserva, fracamente associadas sendo, portanto, facilmente

extraídas com água.

As ramificações da cadeia desse polissacarídeo, provavelmente, contribuem

para a solubilização da cadeia principal e controlam, potencialmente, a sua

flexibilidade conformacional, o que é necessário para a ligação com a celulose. As

cadeias laterais também contribuem para a compreensão da estrutura e função das

xiloglucanas em parede celular primária (O’NEILL et al., 1989; HAYASHI et al.,

1994).

As XG, como polissacarídeos de reserva da parede celular, se acumulam,

predominantemente, nos tecidos dos cotilédones de algumas espécies como

tamarindo, Tamarindus indica (KOOIMAN, 1960), jatobá, Hymenaea courbaril

(BUCKERIDGE; DIETRICH, 1990), copaíba, Copaifera langsdorffii (BUCKERIDGE et

al., 1992), afzelia, Afzelia africana (REN, 2005) e jojoba, Simmondsia chinensis

(HANTUS et al., 1997).

A única fonte de xiloglucana explorada comercialmente é a de Tamarindus

indica (FIGURA 2), conhecido popularmente por tamarindo, é utilizada em alimentos

no Japão (REID; EDWARDS, 1995; SCHERBUKHIN; ANULOV, 1999). Sendo

também a mais estudada, seu uso regular iniciou-se em 1943 (RAO;

SRIVASTAVA, 1973), seguindo a seguinte classificação botânica:

Reino: Plantae

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopsida

Ordem: Fabales

Família: Fabaceae

Gênero: Tamarindus

FIGURA 2 - Tamarindus indica: PARTES DA PLANTA (A), ÁRVORE E TRONCO (B), FLORES (C) E

VAGENS (D)

FONTE: RAINTREE (2007), ZCE (2007)

FIGURA 3 - Copaifera langsdorffii: ARBUSTO (A), FLORES E FOLHAS (B), MADEIRA E TRONCO

(C E D), SEMENTES (E) E VAGENS (F)

FONTE: RAINTREE (2007)

XG de sementes de Tamarindus indica (GIDLEY et al., 1991) podem ser

utilizadas principalmente nas indústrias têxteis e alimentícias e ainda como adesivo

e agente emulsificante, em cosméticos, para preparar emulsões de óleos essenciais,

cremes de barbear e dentifrícios, em produtos farmacêuticos, como ligantes em

comprimidos e drágeas, em inseticidas, para emulsificar princípios ativos e óleos

minerais. Por possuir muitas propriedades similares às das pectinas, é usada em

tratamento de colite, diarréia, disenteria e outras desordens intestinais (RAO;

SRIVASTAVA, 1973).

A XG de tamarindo apresenta praticamente o mesmo padrão de ligações

glicosídicas de Hymenaea courbaril, espécie na qual a XG foi detectada e estudada

pela primeira vez por Kooiman (1960) e por Buckeridge e Dietrich (1990).

A Copaifera langsdorffii (Desf.) Kuntze, conhecida também por copaíba ou

pau d’óleo (FERRI, 1969) é uma árvore tropical de até 35 metros de altura que

cresce abundantemente por todo território brasileiro, tanto em áreas de cerrado

aberto como em áreas de floresta (ALMEIDA et al., 1998) e distribui-se do nordeste

da Argentina até a Venezuela (MACHADO, 1990), essa espécie segue a seguinte

classificação botânica:

Reino: Plantae

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopsida

Ordem: Fabales

Família: Fabaceae

Subfamília: Caesalpinioideae

Gênero: Copaifera

É um arbusto muito ramificado (FIGURA 3), apresenta folhas ovaladas, flor

pequena e pouco ramosa, tem fruto arredondado e achatado e semente de casca

preta e interior amarelado (FERRI, 1969).

A espécie de copaífera floresce durante o período de chuvas e dispersa suas

sementes na época seca (FREITAS; OLIVEIRA, 2002). As sementes de copaifera

são abundantemente produzidas (1 kg de frutos rende, aproximadamente, 1720

sementes, das quais a cada mil têm se 675,7 g com 10% de umidade) (GUERRA et

al., 2006). Mas, apesar disso, são pouco exploradas comercialmente e seus

constituintes, entre eles a xiloglucana, não são completamente descritos e

caracterizados (STUPP et al., 2007).

Em estudos de XG de sementes de copaifera crescidas em florestas e no

cerrado (BUCKERIDGE et al., 1992) encontraram-se importantes diferenças na

estrutura fina dos polissacarídeos dos dois biomas, propondo-se que essas

diferenças podem estar relacionadas aos possíveis efeitos ambientais durante a

biossíntese dos polissacarídeos. Os polissacarídeos das sementes de C. langsdorffii

crescidas em florestas contêm ligeiramente mais porções de galactose do que das

sementes colhidas do cerrado. Ambos, entretanto, dão origem a mais ramificações

de galactose do que XG de tamarindo, indicando diferenças significativas na

distribuição das unidades nas cadeias laterais e na distribuição das unidades

oligossacarídicas (BUCKERIDGE et al., 1992).

As xiloglucanas de sementes de T. indica e C. langsdorffii são compostas

pelas mesmas quatro unidades estruturais básicas XXXG, XLXG, XXLG e XLLG

(YORK et al., 1990; BUCKERIDGE et al., 1992; TINÉ et al., 2003).

As XG de sementes são freqüentemente empregadas para aumentar a

viscosidade das soluções, na formação de géis, na estabilização de emulsões ou

floculação de materiais dispersos, como quelantes, ligantes e impermeabilizantes.

Têm como características a biocompatibilidade, a biodegradabilidade, a capacidade

hidrofílica e a não toxicidade (SANDERSON, 1981; YALPANI,1987).

1.3 Sistemas de liberação de drogas

Estudos de liberação in vitro indicam que o polímero de XG é um promissor

veículo para administração por via oral de drogas irritantes ao trato gástrico, e

também considerado adequado para formulações mucoadesivas para obtenção de

melhor distribuição de drogas (COVIELLO et al., 2007).

Sistemas de liberação de drogas foram desenvolvidos para superar as

desvantagens das formas convencionais de administração. Os sistemas de liberação

modificados são principalmente usados para melhorar a eficácia dos fármacos e

para assegurar a adesão do paciente ao tratamento. O aumento da segurança e a

redução de efeitos adversos ajudaram a atingir esses objetivos (DESHPANDE et

al., 1996).

Para manter a droga na faixa terapêutica desejada com uma única

administração, sistemas de líberação modificada podem oferecer outros fatores

favoráveis, como distribuir a droga até locais específicos, estabilizar rapidamente o

metabolismo de drogas e aumentar o conforto para o paciente (JAIN, 2000; SINHA

et al., 2004). As principais vantagens dos dispositivos de liberação modificada

(sustentada, prolongada, controlada) consistem na tentativa da manutenção de

concentrações plasmáticas do fármaco em níveis terapêuticos, através de cinética

de liberação de ordem zero. Essas restringem as flutuações da dose administrada,

eliminando a necessidade das administrações frequentes (DÄR, 1981;

CAVALCANTI, 1999). Sistema de liberação prolongado é aquele que retarda e/ou

prolonga a liberação do fármaco e, portanto, seu efeito terapêutico. Liberação

controlada implica em predição e reprodutibilidade da cinética de liberação do

fármaco. Em outras palavras, formas de liberação prolongada disponibilizam o

fármaco por um longo tempo, enquanto que, sistemas de liberação controlados

tentam controlar as concentrações do fármaco, no tecido alvo (DESHPANDE et al.,

1996).

Segundo Veiga (1988), a terminologia dos medicamentos de liberação

controlada está cada vez mais ambígua e controversa, pois uma ampla variedade de

termos designa esses medicamentos. O termo liberação controlada denomina todas

as formas farmacêuticas que não liberam imediatamente o seu conteúdo, opondo-se

assim aos medicamentos clássicos ou convencionais de liberação rápida, conforme

a figura 4.

A forma farmacêutica clássica ou convencional (FIGURA 4, curva 1) destina-

se a liberar o fármaco no organismo, de modo que esse seja absorvido com rapidez

e completamente, caracterizado pelo aparecimento de um pico plasmático (VEIGA,

1988; ANSEL et al., 2000). Uma dose dupla (FIGURA 4, curva 2) representa um

perfil idêntico, mas com um pico mais elevado (VEIGA, 1988).

A forma farmacêutica de liberação controlada (FIGURA 4, curva 3) possui

uma dose do fármaco em uma quantidade superior ao normal, visando liberá-lo

inicialmente em uma quantidade que tenha efeito farmacológico, e após isso, fazer

com que seja liberado de forma a permitir a manutenção da concentração

plasmática aproximadamente constante, em que a velocidade de absorção seja igual

a da eliminação (cinética de liberação de ordem zero) durante um período de

tempo (VEIGA, 1988; AIACHE, 1992; ANSEL et al., 2000).

As formas de liberação prolongada (FIGURA 4, curva 4) são constituídas de

duas doses de fármaco: a primeira, chamada de dose inicial de liberação imediata,

libera uma quantidade suficiente para gerar uma ação ou um excesso que não

chega a causar dano no organismo; a segunda, chamada dose de manutenção,

libera o fármaco a uma velocidade que nem sempre é igual à de eliminação (VEIGA,

1988; AIACHE, 1992; ANSEL et al., 2000).

FIGURA 4 - PERFIS PLASMÁTICOS EM DIFERENTES CONDIÇÔES DE ADMINISTRAÇÃO

FONTE: VEIGA (1988)

Outras formas farmacêuticas contêm na mesma unidade mais que uma dose,

que serão liberadas em tempos diferentes. Trata-se das formas de liberação

repetida, obtendo-se uma curva (5, na FIGURA 4) idêntica às resultantes da

administração de doses consecutivas de um medicamento convencional. A grande

questão que se levanta nessas formas é a da determinação do intervalo de tempo

entre as diferentes liberações (VEIGA, 1988).

Na forma farmacêutica oral retard, ou de ação tardia (FIGURA 4, curva 6), a

liberação do fármaco da forma farmacêutica é retardada intencionalmente por algum

motivo até que atinja o meio intestinal. Alguns dos motivos para o uso dessa forma

retard baseiam-se no fato do fármaco ser destruído pelo suco gástrico ou de ser

muito irritante para a mucosa estomacal ou causar náuseas, ou ainda, de ser melhor

absorvido no intestino do que no estômago. Assim, o termo retard não proporciona

necessariamente uma ação prolongada, sendo destinado às formas farmacêuticas

gastro-resistentes ou entéricas, em que a liberação não se processa em função

do tempo, mas sim em função do local de absorção (VEIGA, 1988; ANSEL et al.,

2000).

O interesse voltado para o desenvolvimento das formas farmacêuticas de

liberação modificada é justificado pelas vantagens biofarmacêuticas e

farmacocinéticas que apresentam em relação às formas farmacêuticas

convencionais, algumas das quais se encontram relacionadas na tabela 1

(LONGER; ROBINSON, 1987; VEIGA, 1988; ANSEL et al., 2000).

TABELA 1 - VANTAGENS DAS FORMAS DE LIBERAÇÃO PROLONGADA

Farmacológica - manutenção do nível plasmático sem oscilações bruscas;

- diminuição dos efeitos colaterais;

- manutenção do nível plasmático de produtos com tempo de

meia vida biológico relativamente curto;

- evita níveis sub-terapêuticos;

- menor acúmulo do fármaco no organismo;

- proteção do fármaco de uma eventual degradação.

Adesão do paciente ao

tratamento

- comodidade ao paciente pela diminuição do número de

administrações diárias;

- diminuição de falhas por esquecimento.

Econômica - diminuição do custo total do tratamento (menor quantidade de

fármaco utilizado);

- diminuição de custos com transporte e armazenamento.

FONTE: Adaptação de LONGER; ROBINSON (1987)

Além das vantagens dessas formas farmacêuticas, devem ser considerados e

ponderados os seguintes inconvenientes:

• dificuldade ou impossibilidade de interromper rapidamente a ação

farmacológica do medicamento em caso de intoxicação grave ou de intolerância;

• risco de acúmulo do fármaco se a velocidade de eliminação for lenta.

Além disso, a reprodutibilidade e a eficácia da ação dependem da velocidade

de esvaziamento gástrico e da capacidade de absorção da mucosa intestinal e a

cinética de liberação depende da integridade da forma farmacêutica, acrescido do

fato de seu custo ser geralmente mais elevado que o das formas convencionais

(VEIGA, 1988).

Dependendo da droga de escolha, diferentes órgãos e tecidos podem sofrer

irritação ou dano pela ação não-específica de agentes citotóxicos (POWIS, 1991;

TIPTON, 2003). A otimização da ação farmacológica e redução do nível de

toxicidade tornam-se possíveis através do controle preciso do nível da droga e

sua localização no corpo (LANGER, 2001).

Das diferentes formas de dosagens já reportadas, os sistemas de nano e

microesferas de carreamento de drogas alcançam grande importância devido à

propriedade injetável, que pode evitar intervenções cirúrgicas inconvenientes para a

inserção de implantes (JAIN, 2000; SINHA et al., 2004). Como exemplo, uma das

aplicações típicas das nano e microesferas é a distribuição local de drogas

anticâncer. Devido ao tamanho relativamente grande das microesferas é possível

direcioná-las até tecidos-alvos via circulação sistêmica ou através da membrana

mucosa. Nanoesferas podem ser usadas para direcionamento passivo por via

sistema retículo endotelial para o fígado e células fagociticamente ativas (CHAWLA;

AMIJI, 2002; LITTLE, 2004).

Os critérios para o desenvolvimento de sistemas de distribuição de drogas

são freqüentemente baseados nas características físico-químicas e propriedades

farmacocinéticas da droga. As metodologias amplamente usadas para a produção

de nano e microesferas de polímeros incluem precipitação, diálise, evaporação de

solvente da emulsão, coacervação, spray drying e expansão rápida de soluções

supercríticas (JAIN, 2000; BERKLAND, 2001; SINHA et al., 2004). Entretanto, essas

técnicas ainda sofrem limitações, em particular, pelo uso de solventes orgânicos. A

existência de solventes orgânicos pode levar a perda ou diminuição da bioatividade

de algumas drogas. Além disto, muitos solventes são tóxicos, e mesmo uma baixa

exposição a quantidades mínimas pode levar a efeitos tóxicos residuais (LEES-

HALEY; WILLIAMS, 1997). Técnicas de formulação de nano e microesferas na

ausência de solventes orgânicos tóxicos são altamente desejáveis. Outras limitações

de algumas metodologias de preparo incluem o controle e distribuição do tamanho

das esferas e o rígido controle dos requisitos para as condições de preparo (JAIN,

2000; SINHA et al., 2004).

Estudos prévios sobre a liberação de drogas usando nanopartículas adotam

técnicas como espectrofotometria UV (GOVENDER et al., 1999; SOPPIMATH et al.,

2001; YANG et al., 2004) ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, do inglês

High performance liquid chromatography) (MADELINE; PEPPAS, 1999; FOSS et al.,

2004) para monitorar a concentração de droga liberada. Todas essas técnicas

requerem o uso de membranas de diálise ou centrifugação para isolamento das

nanopartículas da droga livre a fim de quantificar a liberação do fármaco.

Alguns exemplos indicam o uso potencial de xiloglucanas para uma ampla

variedade de aplicações com inúmeras vantagens sobre outros sistemas

macromoleculares (COVIELLO et al., 2007).

Como exemplo de aplicação, a xiloglucana de tamarindo foi proposta como

matriz em formulação de supositório para a liberação sustentada (ou controlada) de

indometacina (MIYAZAKI et al., 1998), e também foi testada para administração

intraperitoneal (SUISHA et al., 1998). Comparada à gelana e ao alginato, a

xiloglucana apresentou melhor desempenho, via oral, na administração de

cimetidina (MIYAZAKI et al., 2001a). Também já se investigou a administração

ocular de pilocarpina e timolol (BURGALASSI et al., 2000; MIYAZAKI et al., 2001b)

em géis de xiloglucana parcialmente degradadas com β-galactosidase, os quais se

mostraram mais efetivos, pois previnem a perda da droga pela drenagem ocular

(COVIELLO et al., 2007).

As XG também foram usadas como veículos para a liberação controlada de

formulações percutâneas de drogas antiinflamatórias não-esteroidais (TAKAHASHI

et al., 2002). Testes in vivo indicaram biodisponibilidade similar entre sistemas

contendo xiloglucanas e suspensões comerciais de paracetamol (MIYAZAKI et al.,

2003) e teofilina (MIYAZAKI et al., 2001c).

Mais recentemente, a formação de filmes finos de polissacarídeos sobre

superfícies sólidas também tem relevância acadêmica e tecnológica como, por

exemplo, em processos de estabilização coloidal (NAPPER, 1983) e no

desenvolvimento de biossensores e imunoensaios (CHIBATA et al., 1978; EGGINS,

1997).

Estudos têm sido feitos para desenvolver mecanismos de liberação

controlada e para a distribuição de drogas que são rapidamente metabolizadas ou

de difícil administração (LOPEZ et al., 2005) que, em geral, são sensíveis ao

ambiente fisiológico e devem ser protegidas com um veículo, geralmente polimérico,

como as XG. Os sistemas de liberação baseados no swelling controlado de

nanopartículas, como os nanogéis, satisfazem tal requisito (LOWMAN et al., 1999;

HORAK et al., 2001; MORISHITA et al., 2002) como, por exemplo, na melhora da

forma de liberação de agentes antineoplásicos durante os longos períodos de

tratamento.

1.4 Agentes antineoplásicos

A maioria dos antineoplásicos atua sobre células que estão no ciclo celular

que compreende as fases G

(pré-sintética), S (síntese celular), G

(pós-síntese) e M

(mitose), precedidas da fase G

. Há agentes que atuam dependentemente desse

ciclo, necessitando de proliferação celular para exercer seus efeitos citotóxicos,

sendo que alguns têm ação preferencial em uma fase específica do ciclo celular, os

chamados agentes dependentes do ciclo fase-específicos e outros são citotóxicos

em qualquer ponto do ciclo celular, os agentes dependentes do ciclo fase-não

específicos. Há ainda fármacos independentes do ciclo celular que agem sobre

células que estão fora desse ciclo. As associações medicamentosas com agentes

que atuam em diferentes fases parecem ter ação sinérgica no combate ao

crescimento e desenvolvimento do tumor (ROITHMANN, 1998).

Até recentemente o tratamento medicamentoso do câncer baseava-se

exclusivamente em drogas citotóxicas. Atualmente, agentes que induzem

diferenciação celular tornaram-se disponíveis, os quais incluem fatores de

crescimento celular e de transmissão de sinais intracelulares (THE LANCET

ONCOLOGY, 2000).

Há alguns princípios básicos da quimioterapia antineoplásica, sendo o

primeiro relativo ao fato de que cada dose de citostático destrói certa fração de

células leucêmicas e não certo número dessas. Essa resposta é proporcional à

concentração do agente antineoplásico. Logo, a capacidade de cura de uma

neoplasia é inversamente proporcional ao volume do nódulo inicial. O segundo

princípio é de que, após quimioterapia, o crescimento das células tumorais se faz na

mesma taxa de antes do tratamento. Logo, a cura depende da concentração efetiva

do agente antitumoral e do tempo a que as células são expostas. Assim, para obter-

se a cura, são necessárias múltiplas injeções de quimioterápicos, em dose que

possibilite que a taxa de destruição celular seja maior do que a da "repopulação" do

tumor. O objetivo da quimioterapia do câncer é reduzir a zero o número de células

neoplásicas (ROITHMANN, 1998).

Agentes antineoplásicos classificam-se por mecanismo de ação citotóxica

(agentes alquilantes e antimetabólitos), ação fisiológica (hormônios) ou origem

(produtos naturais). Agentes que não se enquadram nessas categorias são

classificados como miscelânea. A classificação geral dos antineoplásicos pode ser

vista a seguir na tabela 2.

TABELA 2 - CLASSIFICAÇÃO DE ANTINEOPLÁSICOS

Classe Tipo Droga

Mostardas nitrogenadas

Mecloretamina, Ciclofosfamida, Ifosfamida,

Melfalam, Clorambucil

Etileniminas e etilmelaminas

Tiotepa, Altretamina

Alquil sulfonato

Bussulfam

Nitrosuréias

Carmustina, Lomustina, Semustina,

Estreptozocina

Agentes

alquilantes

Triazenos

Dacarbazina, Temozolomida

Análogo do ácido fólico

Metotrexato

Antimetabólitos

Análogos das pirimidinas

5-Fluoruracil, Floxuridina, Idoxuridina,

Citarabina, Capecitabina, Azacitidina,

Gencitabina

Análogos das purinas

Mercaptopurina, Fludarabina, Tioguanina,

Pentostatina, Cladribina

Produtos

Naturais

Alcalóides da Vinca (antimitóticos)

Vincristina, Vimblastina, Vinorelbina, Vindesina

Taxanas (promovem micortúbulos) Paclitaxel, Docetaxel

Epipodofilotoxinas (complexação

com Topo II e DNA)

Etoposida, Teniposida

Análogos da camptotecina

(inibição de Topo I)

Irinotecan, Topotecan

Antibióticos Dactinomicina, Daunorubicina, Doxorubicina,

Valrubicina, Idarubicina, Epirubicina,

Mitoxantrona, Bleomicina, Mitomicina,

Plicamicina

Modificadores de resposta

biológica

Interferon-alfa, Interleucina-2

Enzimas L-asparaginase

Complexos de platina Cisplatina, Carboplatina, Oxaliplatin

Uréia substituída Hidroxiuréia

Derivado de metilidrazina Procarbazina

Supressor adrenocortical Mitotano (o,p’- DDD), Aminoglutetimida

Miscelânea

Inibidor da tirosina quinase Imatinib, Trastuzumab, Rituximab

FONTE: CALABRESI; CHABNER (2001)

Associação de múltiplos agentes antineoplásicos resulta em maior taxa de

resposta quando comparada a monoterapia. Para realizá-la, as drogas combinadas

devem ter (WANNMACHER, 2008):

• atividade antitumoral demonstrada em monoterapia;

• diferentes mecanismos de ação;

• toxicidades diferentes sobre tecidos normais;

• ausência de resistência cruzada.

Importante fator limitante da quimioterapia antineoplásica é a toxicidade das

drogas em tecidos sadios, especialmente os que têm taxa de proliferação rápida,

como medula óssea, epitélio gastrintestinal, folículos pilosos da pele e epitélio

germinativo. Assim, efeitos adversos mais freqüentes incluem mielossupressão,

náusea, vômito, diarréia, alopecia (queda de cabelos e pêlos) e diminuição da

fertilidade (WANNMACHER, 2008).

Dentre as classes de antineoplásicos a seguir é descrita a dos alcalóides, que

inclui a camptotecina e seus derivados.

1.4.1 Alcalóides

Alcalóides pertencem a um grupo diverso de moléculas de baixa massa molar

que contêm nitrogênio e são encontrados em, aproximadamente, 20% das espécies

de plantas. Muitos dos 16.000 alcalóides que têm estrutura descrita têm função de

defesa contra herbívoros, micróbios, vírus e plantas competidoras (WINK, 2003). A

potente atividade biológica de alguns alcalóides tem sido tradicionalmente explorada

pelo homem para caça, fins de guerra e tratamento de doenças (LORENCE;

NESSLER, 2004).

Alcalóides derivados de plantas atualmente em uso clínico incluem agentes

anticâncer como a camptotecina (CPT) e seus derivados, taxol, vincristina e

vinblastina, analgésicos como codeína e morfina, a colchicina para o tratamento de

gota, relaxante muscular como a (+)-tubocurarina, antiarrítmico ajmalicina, anti-

malárico quinina, potente emético emetina, antibiótico sanguinarina, sedativo

escopolamina, e como analgésico tópico a capsaicina (RASKIN et al., 2002). A

maioria dos alcalóides deriva dos aminoácidos fenilalanina, tirosina, triptofano lisina

e ornitina (LORENCE; NESSLER, 2004).

1.4.1.1 Camptotecina e seus derivados

O alcalóide pentacíclico altamente insaturado, 20-(S)-Camptotecina (CPT)

(FIGURA 6), foi isolado pela primeira vez por Monroe E. Wall e Mansukh C. Wani

(1966), a partir do extrato da Camptotheca acuminata (“Xi Shu” ou árvore da alegria,

FIGURA 5) da família Nyssaceae, nativa da China e Tibet, onde é extensamente

utilizada na medicinal tradicional chinesa.

FIGURA 5 - Camptotheca acuminata: ARBUSTO (A), FLORES E FOLHAS (B) E SEMENTES (C).

FONTE: A, B- SEEDMAN (2008); C- SICHUAN (2008).

A camptotecina e seus análogos, coletivamente chamados de camptotecinas,

já foram isolados de diversas espécies de plantas, como Camptotheca lowreyana e

Camptotheca yunnanensis (LI et al., 2002), Ervatamia heyneana (GUNASEKERA et

al., 1979), Nothapodytes foetida (AIYAMA et al., 1988), Merriliodendron megacarpum

(ARISAWA et al., 1981), Mostuea brunonis (DAI et al., 1999), Ophiorrhiza mungos

(TAFUR et al., 1976), Ophiorrhiza pumila (SAITO et al., 2001), Pyrenacantha

klaineana (ZHOU et al., 2000) e demonstram potente atividade antitumoral e

mecanismo único de ação por inibição da enzima DNA topoisomerase I (Topo I)

(CHAVAN et al., 2007). Os resultados promissores dos testes como agente

antitumoral em modelos animais levaram à avaliação clínica da camptotecina

(MOERTEL et al., 1972).

A molécula de CPT existe em duas formas dependendo do pH; uma forma

lactônica ativa (FIGURA 6, estrutura 1) em valores de pH abaixo de 5 e uma forma

carboxilada inativa em pH alcalino (FIGURA 6, estrutura 2) (FASSBERG; STELLA,

1992).

FIGURA 6 - ESTRUTURA QUÍMICA DA CAMPTOTECINA (CPT) EM SUAS DUAS FORMAS

DEPENDENTES DO pH, UMA FORMA LACTÔNICA ATIVA EM pH ABAIXO DE 5 E

UMA CARBOXILADA INATIVA EM pH ALCALINO

FONTE: Adaptado de LI et al. (2006)

Em pH fisiológico, a maior parte das moléculas de CPT existe em uma forma

carboxilada inativa, sendo a estabilidade da sua forma lactônica um fator crítico para

a atividade anticancerígena. Além disso, a abertura do anel E, em sua forma

carboxilada apresenta menor capacidade de difusão através da bicamada lipídica do

que a forma lactônica. Portanto, fatores que influenciam o deslocamento do

equilíbrio entre as forma lactônica-carboxilada da molécula de CPT são claramente

importantes para sua função (OPANASOPIT et al., 2006). Demonstrou-se que a

albumina sérica humana (HSA, do inglês, Human serum albumin) liga-se

preferencialmente com a forma carboxilada resultando em maior rapidez no

deslocamento do equilíbrio favorecendo a abertura do anel lactônico (MI; BURKE,

1994).

A labilidade do anel lactônico e a sua baixa solubilidade aquosa apresentam

muitos desafios para o desenvolvimento de drogas e sistemas drug delivery (SDD).

Vários tipos de SDD têm sido desenvolvidos a fim de reduzir a toxicidade sistêmica e

melhorar o efeito antitumoral aprimorando sua farmacocinética. Em SDD,

carreadores coloidais têm sido propostos para a efetiva administração de drogas

com problemas de toxicidade, baixa biodisponibilidade ou baixa solubilidade em

água. Tendo em vista as limitações da droga, a nanotecnologia pode fornecer

inovações neste campo, como, por exemplo, no desenvolvimento de nanoemulsões

e nanopartículas (SONVICO et al., 2006). Nanosistemas poliméricos ou lipídicos,

em diversos casos, melhoram a biodisponibilidade da droga, modificam a

farmacocinética ou protegem a droga encapsulada de ataque enzimático. Diversos

sistemas lipossomais foram aprovados ou estão sendo avaliados para aplicações

clínicas, especialmente para o tratamento do câncer (TORCHILIN, 2005).

Estudos anteriores mostraram que o anel lactônico da CPT foi protegido por

incorporação da droga em estruturas de bicamada lipídica como lipossomas

(LUNDBERG, 1998; CHOW et al.,2000; LIU et al., 2002), microesferas (ERTL et

al.,1999; KUMAR et al., 2001; TONG et al., 2003), por conjugação à polímeros

sintéticos (CONOVER et al., 1999; SINGER et al., 2000; QIU et al., 2003; DHARAP

et al., 2005; PARANJPE et al., 2005), nanohíbridos (TYNER et al., 2004) e micelas

poliméricas (YOKOYAMA et al., 2004; OPANASOPIT et al., 2004; 2005; UM et al.,

2005; WATANABE et al., 2006).

Nos últimos 20 anos, micelas poliméricas têm atraído interesse por causa do

seu potencial para a utilização em sistemas carreadores de drogas. O núcleo (ou

core) hidrofóbico serve de reservatório para drogas hidrofóbicas, enquanto as partes

hidrofílicas servem de interface entre o ambiente da fase aquosa e o domínio

hidrofóbico. A “casca” externa (ou shell) altamente hidratada das micelas poliméricas

pode inibir a agregação intermicelar de seus núcleos hidrofóbicos internos.

Conseqüentemente, as micelas poliméricas mantêm estabilidade aquosa

satisfatória, independentemente do alto conteúdo incorporado da droga hidrofóbica

dentro do núcleo. Além disso, uma micela polimérica de tamanho menor que 200 nm

reduz a captura não seletiva do sistema retículo endotelial e aumenta os efeitos de

permeabilidade e retenção (o chamado EPR effect ou enahanced permeability and

retention effects) (GREISH et al., 2003), nos locais onde tumores sólidos são o alvo.

Descrições anteriores revelam que drogas anticâncer como a adriamicina

(YOKOYAMA et al., 1994,1999), KRN550 (MATSUMURA et al., 1999), camptotecina

(YOKOYAMA et al., 2004; OPANASOPIT et al., 2004), trans-ácido retinóico

(KAWAKAMI et al., 2005), taxol (MIWA et al., 1998) e paclitaxel (ZHANG et al.,

2004) foram incorporadas com sucesso em micelas poliméricas e demonstraram alta

seletividade de entrega da droga a tumores sólidos. Nesse contexto, espera-se que

os SDD obtidos de biopolímeros apresentem vantagens quanto à biodegradação,

biocompatibilidade e não toxicidade (OPANASOPIT et al., 2006).

A descoberta de que o alvo celular primário da CPT é a enzima

topoisomerase I (Topo I) renovou os interesses nesse agente e levou à síntese de

análogos mais hidrossolúveis, pois a camptotecina apresenta baixa solubilidade

aquosa.

FIGURA 7 - ESTRUTURA DE ALGUNS DERIVADOS COMERCIALMENTE DISPONÍVEIS OU

AINDA EM FASE DE TESTES CLÍNICOS. SÃO MOSTRADOS TAMBÉM A

ESTRUTURA DA CPT INDICANDO O SEU ESTEREOCENTRO 20-(S) E O

EQUILÍBRIO DINÂMICO ENTRE A FORMA LACTÔNICA E CARBOXILÍCA

FONTE: Adaptado de LORENCE; NESSLER (2004)

Dois análogos denominados irinotecan (cloridrato, Camptosar

, Pfizer

Oncology) (NEGORO et al., 1991; KAWATO et al., 1991), para tratamento de

carcinoma colo-retal metastático, e topotecan (cloridrato, Hycamtin

GlaxoSmithKline) (KINGSBURY et al., 1991), para carcinoma ovariano metastático,

são comercializados como drogas anticâncer e outros estão sendo testados

(FIGURA 7).

A maioria dos derivados de CPT atualmente em desenvolvimento e em fase

de estudos clínicos são potentes inibidores de Topo I com exceção do irinotecan,

que é uma pró-droga que deve ser primeiramente convertida ao seu metabólito

ativo, o SN-38, por uma enzima conversora carboxiesterase (TAKIMOTO et al.,

1998).

Camptotecina (CPT) induz toxicidade celular por inibição da síntese de DNA e

RNA em células de mamíferos. Resumidamente, a inibição da síntese de RNA

resulta em cadeias de RNA mais curtas e é rapidamente reversível quando da

remoção da droga (ABELSON; PENMAN, 1972). A inibição da síntese de DNA, por

outro lado, é apenas parcialmente reversível após a remoção da droga. Outro efeito

proeminente é a fragmentação rápida e reversível do DNA celular em cultura de

células de mamíferos. Isso é realizado pela estabilização da ligação da Topo I ao

DNA, levando à fragmentação do DNA. A camptotecina liga-se ao complexo binário

DNA - Topo I e bloqueia especificamente a re-ligação da reação de quebra e re-

ligação da DNA Topo I de mamíferos (HATEFI; AMSDEN, 2002), constituindo o

complexo ternário mostrado na figura 8.

FIGURA 8 - EQULÍBRIO ENTRE O DNA E O COMPLEXO BINÁRIO DNA - TOPOISOMERASE I

(TOPO I); E ENTRE O COMPLEXO BINÁRIO ENZIMA-DNA E O COMPLEXO

TERNÁRIO FORMADO COM A CAMPTOTECINA (CPT)

FONTE: Adaptado de HORWITZ (1971); HERTZBERG (1989)

De acordo com o mecanismo de ação, CPT age ligando-se ao complexo DNA-

Topo I, levando a um acúmulo de quebras na fita de DNA durante a replicação,

finalmente causando morte da célula na fase S do ciclo celular. O complexo é

normalmente um intermediário transitório que está envolvido no relaxamento do

DNA durante um número crítico de processos celulares, incluindo a replicação,

transcrição, recombinação, reparo, constituição da cromatina e separação dos

cromossomos, processos geralmente rapidamente reversíveis na ausência de CPT

(HSIANG et al., 1985; 1989).

Estudos já realizados apóiam a interpretação que a Topo I é o único alvo

intramolecular de CPT, e que a sensibilidade celular a esta droga é dependente de

altos níveis de Topo I. O mecanismo exato pelo qual CPT estabiliza o complexo

binário covalente DNA-Topo I não é completamente compreendido, pois a droga age

como inibidor não-competitivo e liga-se apenas ao complexo binário transitório

(HORWITZ, 1971; HERTZBERG, 1989). CPT apresenta fraca ligação ao B-DNA

normal em condições fisiológicas, porém não se liga a Topo I sozinha (FAN, 1998).

Apesar da aparente ausência de afinidade da CPT com o DNA ou Topo I

isoladamente, sugere-se que a ligação com o complexo binário seja responsável

pela estabilização observada. Mesmo sendo a formação de uma ligação covalente

transitória entre o anel E aberto da CPT e o complexo DNA-Topo I, não há

evidências diretas da formação de uma ligação covalente. Então, CPT e seus

derivados ligam-se ao complexo binário covalente DNA-Topo I por processos não-

covalentes no local de clivagem do DNA ou próximo deste, indicando que

provavelmente ocorre a formação do complexo ternário (LI et al., 2006).

1.4.1.1.1 Aplicações clínicas e efeitos adversos

Além de agentes anticâncer, os inibidores de Topo I podem apresentar

atividade antiviral (TAKAHASHI et al., 1995). A atividade de Topo I está envolvida na

função de transcrição reversa do HIV. Priel et al.(1996) demonstraram que a inibição

da Topo I por CPT pode bloquear o desenvolvimento de malignidades retrovirais

induzidas em camundongos. Testes de atividade antitumoral e antiviral de

camptotecinas no tratamento de malignidades associadas ao HIV como o sarcoma

de Kaposi e linfoma estão em fase clínica. Vollmer-Haase et al. (1997) observaram

que em um paciente com leucoencefalopatia multifocal progressiva CPT demonstrou

atividade anti-infecciosa contra papovavírus JC. Em estudo de Clements et al.(1999)

foi demonstrado que a CPT não é capaz de inibir apenas o crescimento de células

endoteliais de maneira não-tóxica, mas que também pode inibir a angiogênese. Esta

observação demonstra que além de atividade tumoricida, CPT possivelmente tem

atividade antitumoral devido a sua atividade antiangiogênica, que pode apresentar

relevância clínica no tratamento de outras condições como a reestenose

psoríase

. A utilização de camptotecinas deve ser avaliada adicionalmente para o

tratamento de doenças não-malignas (TAKIMOTO et al., 1998).

Outra aplicação de CPT encapsulada em lipossomos foi recentemente

explorada (PROULX et al., 2001) contra a leishmaniose, que tem como principal

reservatório de parasitas os macrófagos do fígado e baço. Estes macrófagos têm

tendência de capturar os lipossomos, sendo esta então uma estratégia para o

acúmulo de drogas nestes tecidos para um tratamento mais eficiente.

Por causarem danos ao DNA, CPT e seus derivados são potencialmente

mutagênicos e podem induzir aberrações cromossômicas incluindo aumento na

troca das cromátides-irmãs, deleções e rearranjos gênicos (HASHIMOTO et al.,

1995). Sendo as camptotecinas associadas a um aumento no risco de malignidades

secundárias são necessários estudos contínuos, entretanto este risco não deve

deter o desenvolvimento e uso desta importante classe de agente antitumoral, sendo

indicado o cuidadoso monitoramento terapêutico dos pacientes quanto aos efeitos

adversos tardios das camptotecinas (TAKIMOTO et al., 1998).

1.5 Formação de filmes finos de polissacarídeos

Para a aplicação dos polissacarídeos no campo dos biomateriais, várias

estratégias são usadas para tornar o material utilizado biologicamente ativo. Um dos

métodos utilizado para a incorporação de biomoléculas em um biomaterial consiste

em direcioná-la diretamente na superfície de revestimento do material (CHLUBA et

al., 2001). A formação de filmes finos sobre superfícies sólidas tem grande

Reestenose: principal complicação cirúrgica após angioplastia que consiste em isquemia miocárdica

nos seis meses posteriores ao procedimento devido a redução igual ou maior que 50% da luz do vaso

sanguíneo (SANTOS FILHO et al., 2002).

Psoríase: erupção cutânea descamativa crônica caracterizada por hiperproliferação de

queratinócitos (GOODMAN et al., 1996)

importância tecnológica, como no desenvolvimento de biossensores (JELINEK;

KOLUSHEVA, 2004; DAVIS; HIGSON, 2005), imunoensaios (OSTROFF et al., 1998)

e em aplicações biomédicas, ao revestir e funcionalizar biomateriais, através da

deposição de proteínas (CARUSO et al., 1997), DNA ou outras nanopartículas no

filme fino formado (ZHANG et al., 2005). Filmes finos são importantes porque

permitem adsorver em seu interior moléculas de importância biológica, como

proteínas, peptídeos, lipopolissacarídeos e drogas.

Algumas estratégias para a obtenção de filmes finos podem ser adotadas,

sendo os exemplos mais conhecidos para a sua obtenção a deposição pelo princípio

de Langmuir-Blodgett (LB), a eletrodeposição e técnicas de automontagem (layer by

layer - LbL) (DECHER, 1997; DÚRAN; MATTOSO; MORAIS, 2006). Porém, podem-

se obter os filmes por simples imersão do suporte na solução de interesse, como no

caso deste trabalho. Assim como em todas as técnicas, uma etapa de lavagem é

necessária quando há deposição de soluções diferentes.

Proteínas podem integrar a arquitetura do filme sem haver necessariamente

uma ligação covalente com o polieletrólito. Um exemplo de proteína utilizada na

funcionalização desses filmes é a Concanavalina A (ConA). ConA é uma lectina

extraída de uma leguminosa de feijão de porco, com massa molar de

aproximadamente 100.000 Da, que apresenta 4 sítios iguais de ligação com

açúcares, especificamente

-manose e

-glucose (MACIEL et al., 2007). Outro

exemplo de proteína utilizada na adsorção de filmes finos é a albumina

(YAMPOLSKAYA; PLATIKANOV, 2006). Albumina sérica é a proteína mais

abundante na circulação sanguínea. É uma proteína globular, formada por uma

cadeia de polipeptídeo, com 585 aminoácidos, sendo essencial para manter a

pressão osmótica, para transportar hormônios, ácidos graxos, drogas e compostos

hidrofóbicos. O seu estudo pode ser usado como uma base para pesquisa em filmes

finos de modelos contendo multicamadas com biomoléculas adsorvidas, o que

fornece informações de aplicação, estabilidade e funcionalização de um biossistema

(CARUSO; MÖHWALD, 1999).

O processo de deposição e adsorção de materiais sobre um determinado

suporte pode ser avaliado por medidas elipsométricas, na qual é possível medir a

espessura do filme formado e análise por microscopia de força atômica que fornece

informações topográficas, e ainda por medidas de ângulo de contato para análise da

interação das soluções com o suporte (PEREIRA et al., 2008).

Algumas das técnicas utilizadas neste trabalho para o estudo dos

polissacarídeos são descritas a seguir.

1.6 Técnicas diferenciais para análise de polissacarídeos

1.6.1 Elipsometria

Elipsometria (AZZAM; BASHARA, 1987) consiste em medir a mudança do

estado de polarização da luz após a reflexão, a partir de uma superfície isotrópica

refletora. Um elipsômetro é um equipamento simples e sensível, que mede a

espessura de um filme fino a partir de uma única camada até várias camadas. Os

elipsômetros podem operar usando múltiplos ângulos e comprimentos de onda para

determinar a espessura do filme de uma maneira muito sensível, alcançando uma

escala de Ângstrons (Å).

FIGURA 10 - MODELO DE ELIPSÔMETRO MOSTRANDO O ESTADO DA LUZ POLARIZADA

SENDO REFLETIDA E DETECTADA PELO DETECTOR

FONTE: OSTROFF et al.(1998)

A figura 10 mostra os elementos básicos que compõem o elipsômetro: a luz

polarizada, dois polarizadores e um detector. A fonte de luz pode ser policromada

através de um filtro ou de um laser. A luz polarizada emitida interage com superfície

óptica e há um deslocamento de fase de ambos os componentes; paralelo e

Analisador

perpendicular do plano de incidência. A quantidade refletida depende das

propriedades ópticas do material de base, bem como da espessura e do índice de

refração dos filmes (OSTROFF et al.,1998). Y

]As mudanças de fase (∆) e de amplitude (ψ) da radiação após a reflexão são

medidas com relação à radiação incidente. Os parâmetros ∆ e ψ dependem do

comprimento de onda da radiação (λ), do ângulo de incidência (Φ), da espessura (d)

e do índice de refração (n) de um filme isotrópico e refletor, como mostra a equação

fundamental da elipsometria (AZZAM; BASHARA, 1987) (equação 1):

tan ψ e

i∆

= f (n,d, Φ e λ) (1)

Através da equação 1, das relações de Drude e Fresnel, de cálculos

interativos e matrizes de Jones (AZZAM; BASHARA, 1987) pode-se obter n e d

independentemente. Quando as espessuras das camadas são muito finas (~ 1 nm)

ou quando o contraste óptico não é suficiente para que d e n sejam obtidos

independentemente um do outro, então, usa-se o índice de refração fixo a partir de

dados da literatura ou do fabricante, e determina-se a espessura do filme (d

poli

1.6.2 Microscopia de força atômica

Microscopia de varredura por sonda (MVS ou SPM, do inglês Scanning Probe

Microscopy) é o nome genérico de uma família de microscópios que utiliza uma

sonda como forma de detecção de algumas grandezas físicas para estudar

propriedades de superfícies, sendo as principais a microscopia de varredura por

tunelamento (MVT ou STM, do inglês Scanning Tunneling Microscopy) através da

corrente de tunelamento (BINNIG et al., 1982) e os microscópios de varredura por

força (MVF ou SFM, do inglês Scanning Force Microscopy). O SFM pode ser usado

para medir muitos tipos de forças, incluindo as forças atrativas de van der Waals

(BINNIG et al., 1986; MCCLELLAND et al., 1987; MARTIN et al., 1987), forças

eletrostáticas (STERN et al., 1988; BUTT, 1991; BELAIDI et al., 1997), forças de

menisco (MATE et al., 1989; BINGGELI; MATE, 1995) e outras forças associadas

com forças friccionais, interfaciais de líquido/sólido ou líquido/gás (MATE et al.,

1987; BHUSHAN, 1995) ou forças de contato repulsivas (ALBRECHT; QUATE,

1987; GOODMAN; GARCIA, 1991). Cada uma dessas técnicas possui

características próprias para obtenção de imagens.

Assim como o STM, a microscopia de força atômica (MFA ou AFM, do inglês

Atomic Force Microscopy) é capaz de gerar imagens com resolução espacial

extremamente alta e nas três dimensões (FIGURA 11). Entretanto, o microscópio de

força atômica pode ser usado para estudar as superfícies de amostras, tanto a

eletricamente condutora como a não-condutora, não tendo, dessa forma, a limitação

do STM de obter imagens em superfícies condutoras ou semicondutoras

(HERRMANN, 1999).

FIGURA 11 - ILUSTRAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UM MICROSCÓPIO DE FORÇA ATÔMICA E SEUS

COMPONETES

FONTE: COSTA et al.(2002)

O microscópio de força atômica pode ser considerado como um híbrido entre

os equipamentos para medida da força em superfícies (SFA, do inglês Surface

Force Analysis) (ISRAELACHVILI, 1992) e um perfilômetro de superfície (TEAGUE

et al., 1982). O AFM pode operar no regime de trabalho conhecido como modo

contato, similar ao perfilômetro, mas com força de carga muito menor. Enquanto o

perfilômetro mede forças em torno de 10

-4

N, o microscópio de força atômica no

modo contato, possui uma faixa de medida que se estende de 10

-6

N a 10

-10

N e no

modo não-contato (modo este similar ao SFA) chega a medir forças da ordem de

-13

N (WEISENDANGER, 1994; FROMMER, 1996). O modo repulsivo propicia

imagens de maior resolução. O AFM pode obter imagem com uma resolução lateral

de 0,2 nm e uma resolução vertical menor que 0,01 nm. Além disso, o AFM atua em

uma ampla faixa de magnificação, que ultrapassa a 10

, isto é, partindo-se de uma

imagem atômica até o perfil de uma estrutura microscópica (ALBRECHT, 1989).

FIGURA 12 - RELAÇÃO DE FORÇAS QUE ATUAM ENTRE A AGULHA E AMOSTRA, DE ACORDO

COM AS DISTÂNCIAS QUE AS SEPARAM

FONTE: HERRMANN (1999)

Um dos pontos importantes da técnica de microscopia de força atômica é que

ela pode gerar imagens em diferentes condições, como amostra imersa em líquidos

(MARTI et al., 1987; WEISENHORN et al., 1990; THOMSON et al., 1996), a vácuo

(MEYER; AMER, 1988; HOWALD et al., 1993), em baixas temperaturas (KIRK et al.,

1988; ALBRECHT et al., 1992) e principalmente nas condições ambientais. A

vantagem inerente de se trabalhar em diferentes condições é a de realizar estudos

das propriedades de diversos materiais nas condições ideais. Por exemplo,

operando em líquidos, pode-se observar a dinâmica de reações químicas e de

processos biológicos no espaço real e no tempo com resolução molecular

(DRAKE et al., 1989; SHAO; YANG, 1995).

Vários tipos de forças contribuem para a deflexão de uma haste em um

microscópio de força atômica. A figura 12 ilustra de forma simplificada as forças

envolvidas, de acordo com a distância que separa a agulha da amostra.

Para dois corpos eletricamente neutros e não-magnéticos separados por uma

ou várias dezenas de nanômetros, pode se dizer que as forças de van der Waals

(VDW) usualmente dominam a interação entre eles (WEISENDANGER, 1994).

Essas forças são atrativas diminuindo a distância de separação entre os dois corpos

para a casa de fração de Angstrons, as forças que irão dominar serão as forças

repulsivas.

1.6.2.1 Microscopia de força atômica em modo não-contato

A técnica de não-contato explora outros níveis de interação de força. O

método se baseia na separação entre a agulha e a amostra, em torno de 10 a 100

nm. Nessa situação, somente forças de longo alcance interagirão; no caso, forças de

VDW, eletrostática e força de dipolo magnético. O método para a medida da

interação de força, no modo não-contato com AFM, é usualmente diferente do modo

contato, no qual a agulha, localizada na extremidade da haste, faz o suave “contato

físico” em escala atômica com a amostra. Ao invés do contato da ponta com a

amostra, ela é colocada para vibrar próximo da sua freqüência de ressonância pelo

uso de um elemento piezoelétrico (BINNING et al., 1986), e assim mudanças no

valor da freqüência de ressonância serão devidos às alterações da força de

interação agulha-superfície. O uso da propriedade de resposta em freqüência da

haste faz com que a relação sinal/ruído melhore. A força total entre a agulha e a

amostra, no regime de modo não-contato, geralmente está em torno de 10

-12

1.6.2.2 Microscopia de força atômica em modo de contato intermitente

O princípio de funcionamento do modo contato intermitente (“quasi non-

contact” ou “tapping mode”) é similar ao sistema de trabalho do não-contato, isto é, a

haste vibra, por intermédio de um piezoelétrico, próxima a sua freqüência de

ressonância.

A haste, juntamente com a agulha, é colocada bem próxima à amostra, até

que o deslocamento contínuo e controlado do “scanner” piezo faça com que a

agulha toque levemente a amostra. A amplitude de vibração da haste varia entre 20

e 100 nm, mas somente por um breve período do tempo total de vibração a agulha

“bate” na amostra.

FIGURA 13 - IMAGEM DE FITAS DE DNA QUE SERVEM DE REFERÊNCIA PARA IMAGENS DE

MOLÉCULAS BIOLÓGICAS. O DIÂMETRO DO DNA É DE 2 nm. ESTA AMOSTRA É

USADA PARA CONFERIR O FUNCIONAMENTO ADEQUADO DO EQUIPAMENTO E

ESTABELACER A EFICIENCIA DA ANÁLISE DE IMAGENS DE JANELAS DE ATÉ

1,2x 1,2 µm

FONTE: WEST (2004)

Essa técnica de microscopia vem sendo aplicada com bons resultados em

alguns tipos de amostras consideradas macias, como por exemplo, materiais

biológicos (FIGURA 13) e polímeros, porque, ao contrário do modo contato, que

devido à força lateral pode danificar a amostra, o modo contato intermitente elimina

essa influência. Quando comparado ao modo não-contato, a mesma se torna mais

efetiva por realizar imagens de grandes áreas que podem incluir maiores variações

na topografia da amostra (HERRMANN, 1999).

1.6.2.3 Aplicações da microscopia de força atômica

1.6.2.3.1 Estudo de biomoléculas

A estrutura de biopolímeros, principalmente proteínas e ácidos nucléicos, e

seus complexos supramoleculares (vírus, complexos proteínas/ácidos nucléicos

envolvidos em transcrição, tradução entre outros) contêm a informação que os

pesquisadores de biotecnologia, eletrônica e nanotecnologia necessitam para

realizar trabalhos com alta eficiência na escala atômica e molecular. Dentre os

biopolímeros, as proteínas têm sido os mais estudados do ponto de vista estrutural,

pois têm estrutura tridimensional altamente definida e singular, o que leva à

necessidade da determinação da estrutura de cada uma individualmente

(HERRMANN, 1999).

As técnicas que podem associar rapidez e resolução estão associadas às

técnicas microscópicas de alta resolução, como a microscopia eletrônica de

varredura (MEV ou SEM, do inglês Scanning Electron Microscopy). Essa técnica já

vem sendo usada nos estudos de algumas proteínas, principalmente as de grande

massa molar e as que apresentam estrutura quaternária. A principal dificuldade da

técnica SEM está na necessidade de recobrimento da amostra com material

condutor (CANTOR; SCHIMMEL, 1980; CAMPBELL; DWEK, 1984; HERRMANN et

al., 1997a). Com isso, o STM, e posteriormente o AFM, estão sendo usados no

estudo de proteínas. A principal vantagem do AFM sobre o STM é que pode ser

usado tanto em amostras condutoras quanto isolantes, como as proteínas

(HERRMANN, 1999).

Quando comparada às outras técnicas (microscopia eletrônica, difração de

raio X e espectrosocopia de RMN), a AFM permite explorar outras grandezas da

amostra, como topografia, rugosidade e dados tribológicos

(HERRMANN, 1999).

Tribologia: ramo da ciência e da tecnologia que estuda o atrito, o desgaste e a lubrificação.

1.6.2.3.1.1 Análise de um polímero natural

Técnicas da microscopia de varredura por força estão ajudando, através da

obtenção de imagens com alta resolução, a elucidar a estrutura das fibrilas e

microfibrilas em diferentes modos de tratamento químico (MATTOSO et al., 1999).

FIGURA 14 – IMAGEM POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA DO SISAL NÃO-TRATADO

(ESQUERDA) E TRATADO ATRAVÉS DE BENZILAÇÃO (DIREITA)

FONTE: MATTOSO et al.(1999)

Por microscopia de força atômica, Mattoso et al. (1999) observaram que a

imagem da fibra não-tratada de sisal (FIGURA 14, à esquerda) consiste em um

pacote de fibrilas orientadas longitudinalmente em direção à formação da fibra,

enquanto que após a reação de benzilação, por 30 minutos, observaram que a

morfologia da superfície da fibra de sisal (FIGURA 14, à direita) apresentou uma

estrutura fibrilar diferenciada. Essa mesma imagem discrimina o enovelamento, que

se constitui de uma interconexão de arranjos com uma formação globular, com a

mesma forma das fibrilas e a mesma magnitude da fibra de sisal não-tratada.

1.6.3 Tensiometria e fenômenos de superfície

O princípio fundamental dos fenômenos de superfície está relacionado com a

tendência dos líquidos se contraírem para adquirir a menor área possível. Pode ser

interpretada como uma força por unidade de comprimento que se opõe ao aumento

da superfície. Esta tendência à redução da superfície, que é demonstrada na forma

esférica de pequenas gotas, pode ser avaliada por um parâmetro que fornece uma

medida quantitativa, a tensão superficial. Em todos os fluidos, as moléculas

possuem tamanhos e formas definidas, e são livres para se moverem uma em

relação à outra e nos líquidos são mantidas perto uma da outra pela força de coesão

existente entre elas (ADAM, 1941; NETZ; ORTEGA, 2002).

Moore (1976) afirma que, em um sistema de um líquido em contato com seu

vapor, para aumentar sua área de interface, é necessário trazer moléculas do seu

interior para a superfície, de modo que se deve realizar um trabalho contra as forças

coesivas do líquido. Segue-se daí que a energia livre molar na região da superfície

de um líquido é maior do que no interior deste. Então, deve-se fornecer energia a

uma molécula do interior quando levada até a superfície (CASTELLAN, 1986).

Sendo assim, em 1805, Thomas Young mostrou que as propriedades mecânicas da

superfície podiam ser relacionadas às de uma membrana hipotética esticada sobre

uma superfície, a qual se encontra sob estado de tensão, como demonstrado na

figura 15.

FIGURA 15 - FILME LÍQUIDO ESTICADO EM UM ARAME, SOB ESTADO DE TENSÃO

FONTE: Adaptado de CASTELLAN (1986)

Para aumentar a área do filme de uma quantidade dA, deve-se realizar uma

quantidade proporcional de trabalho. A energia de Gibbs do filme aumenta de γ dA,

onde γ é a energia de Gibbs superficial por unidade de área. O aumento da energia

de Gibbs indica que o movimento do arame, de comprimento l, sofre a oposição

de uma força f ; se o arame se move de uma distância dx , o trabalho realizado é f dx.

A força que atua no arame em contato com o filme é a tensão superficial do líquido

(CASTELLAN, 1986) e pode ser calculada como:

f dx = γ dA (2)

Com este conceito, Young, e mais tarde independentemente Laplace, foi

capaz de deduzir explicitamente as condições para o equilíbrio mecânico numa

superfície curva geral entre duas fases, propondo o equilíbrio entre a força

gravitacional e a tensão superficial do líquido.

γ = mg (2πrf)

-1

(3)

Onde:

γ = tensão superficial, em N/m

m = massa, em kg

g = aceleração da gravidade, em m/s

r = raio da calota esférica da gota, em m

f = fator de correção

Esta equação, chamada de equação de Young – Laplace é o fundamento de

um dos métodos mais comuns para a determinação da tensão superficial, o método

da gota pendente (MOORE, 1976), muito utilizado, pois apresenta diversas

vantagens, tais como:

• não ser um método de contato e por isso, ser mais preciso;

• abranger uma ampla cobertura da superfície, a partir de vários segundos a

algumas horas, permitindo o estado de equilíbrio das camadas do material.

O perfil da gota é especificado em coordenadas X, Z, conforme se visualiza

na figura 16, sendo que uma vídeo-câmera é utilizada para fazer aquisição das

imagens que são transferidas a um computador para o cálculo do ângulo φ.

FIGURA 16 - REPRESENTAÇÃO DA GOTA COM OS EIXOS DE COORDENADAS

FONTE: ZHOLOB et al.(2007)

Outro método para analisar fenômenos de superfície é o método da gota

séssil, que mede o ângulo de contato entre uma gota de um líquido e uma superfície

sólida plana. O ângulo depende da relação entre as forças adesivas, que fariam a

gota se espalhar sobre a superfície, e as forças coesivas do líquido que querem

contrair a gota em uma esfera minimizando sua superfície. A partir da medida do

ângulo de contato é possível quantificar essa força adesiva da superfície, através do

trabalho das forças adesivas por unidade de área que nada mais é que a energia

livre superficial do material, caracterizando a amostra quanto a sua hidrofobicidade.

A equação de Young determina a relação entre as tensões superficiais

existentes com o ângulo de contato, como indicado na equação 4 e figura 17:

cos θ = γ

- γ

(4)

Onde:

= tensão líquido-vapor

= tensão superfície sólida-vapor

= tensão superfície sólida-líquido

θ = ângulo de contato

A equação de Young é estritamente aplicada a superfícies completamente

uniformes e planas (BACHMANN, 2000).

FIGURA 17 - TENSÕES SUPERFICIAIS E DO ÂNGULO DE CONTATO ENTRE UMA GOTA E UMA

SUPERFÍCIE SÓLIDA

FONTE: BACHMANN (2000)

Se uma gota de água é colocada em uma superfície hidrofóbica ou

parcialmente hidrofílica, ela não expande completamente. Assume uma forma que

depende da relação entre a energia livre das três superfícies envolvidas. O ângulo

formado entre as três fases é chamado de molhabilidade ou ângulo de contato

(FIGURA 17). Para ângulos de contato maiores que 45° o material é aqui

classificado como hidrofóbico e para ângulos de contato menores que esse valor, o

material é então classificado como hidrofílico (ALMEIDA, 2005).

1.6.4 Dicroísmo circular

As diferentes técnicas espectroscópicas utilizadas em biofísica para a análise

de biopolímeros cobrem diferentes intervalos do amplo espectro da radiação

eletromagnética, desde os raios-X até as microondas. Ondas eletromagnéticas com

energias mais baixas que os raios-X, correspondentes a comprimentos de onda

entre 1.000 e 7.000 Å, compõem a região do ultravioleta e visível. Essa radiação

interage com os elétrons de átomos e moléculas, promovendo-os para estados

excitados formando a base para os métodos espectroscópicos no UV-visível:

absorção óptica, fluorescência e dicroísmo circular (ITO, 2004).

Dicroísmo circular (CD) é uma técnica que permite determinar estruturas e

monitorar mudanças estruturais de biomoléculas (VENYAMINOV; YAND,1996).

Proteínas, carboidratos e ácidos nucléicos são macromoléculas quirais, ou seja, não

possuem plano de simetria e um centro de inversão, e, portanto são compostos

opticamente ativos que exibem sinal de CD. Dois enantiômeros de uma molécula

quiral exibem a mesma alteração no plano de polarização, porém, em direções

opostas. O CD detecta essa alteração através da diferença da absorção da luz

circularmente polarizada (FIGURA 19,B) à direita ou à esquerda (FIGURA 18) após

incidir sobre a amostra.

A luz é dita circularmente polarizada quando duas ondas, elétrica e

magnética, de mesma amplitude e freqüência são sobrepostas, porém apresentam

um deslocamento de um quarto de comprimento de onda uma em relação à outra,

resultando em um vetor do campo elétrico que gira em torno de um círculo, tanto em

sentido horário quanto anti-horário. Quando a amplitude das duas ondas não é

exatamente igual, o vetor do campo elétrico gira em sentido horário e anti-horário em

uma elipse, obtendo-se então uma luz elipticamente polarizada (FIGURA 19,C).

FIGURA 18 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA DETECÇÃO POR DICROISMO CIRCULAR

DA GLUCOSE, UM AÇÚCAR SIMPLES

FONTE: Adaptado de ISA (2007)

FIGURA 19 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA POLARIZAÇÃO DA LUZ. (A) LUZ PLANO

POLARIZADA; (B) LUZ CIRCULARMENTE POLARIZADA E (C) LUZ

ELIPTICAMENTE POLARIZADA

FONTE: Adaptado de AUTSCHBACH (2007)

FIGURA 20 - (A) ESPECTRO DE DICROÍSMO DE ESTRUTURAS α-HÉLICE (VERMELHO), FOLHA

β (AZUL) E HÉLICE TIPO POLI-PROLINA (AMARELO). (B) ESPECTRO DE

DICROÍSMO DE CARRAGENANAS (3 g/L, EM KCl 0,01M, pH 7): λ- (LINHA

PONTILHADA) QUE TEM CONFORMAÇÃO AO ACASO E ι- (LINHA CONTÍNUA)

QUE TEM ESTRUTURA HELICOIDAL, À TEMPERATURA AMBIENTE

FONTE: Adaptado de A – MILLES; WALLACE (2006); B - SCHOELER et al.(2006)

O perfil do espectro de CD (FIGURA 20) depende do seu conteúdo de

estrutura secundária, permitindo que sejam determinadas as proporções de α-

hélices, estruturas β, α + β, α/β e estruturas aleatórias ou ao acaso (random coil)

(BRAHMS; BRAHMS, 1980), no caso de proteínas (FIGURA 21) ou no caso de

carboidratos (FIGURA 22) estruturas do tipo hélice, como a amilose que apresenta

cadeia helicoidal, ou a celulose que é similar às estruturas β, pois suas cadeias

organizam-se paralelamente como “folhas” ou camadas.

FIGURA 21 - ESTRUTURA SECUNDÁRIA DE PROTEÍNAS: TODA EM α-HÉLICE, TODA EM

FOLHAS β, ESTRUTURAS DO TIPO α/β E α + β

FONTE: LEHNINGER; NELSON; COX (2006)

FIGURA 22 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA DE DOIS POLISSACARÍDEOS

DE DIFERENTES CONFORMAÇÕES. (A) ESTRUTURA DA AMILOSE EM SUA

CONFORMAÇÃO MAIS ESTÁVEL TEM SUA CADEIA CURVADA DEVIDO ÀS

LIGAÇÕES DO TIPO α-(1→4) QUE INDUZEM SUA ESTRUTURA HELICOIDAL

FORTEMENTE ENOVELADA, AO INVÉS DE LINEAR COMO DA CELULOSE

MOSTRADA EM (B) COM UNIDADES DE GLUCOSE LIGADAS β-(1→4) QUE

ORDENAM AS CADEIAS EM DOIS SEGMENTOS PARALELOS

FONTE: LEHNINGER; NELSON; COX (2006)

Stevens (1996) definiu que a vantagem desta técnica para a análise de

carboidratos é a obtenção da conformação absoluta, pois:

• distingue polímeros de cadeias desordenadas de hélices

• distingue oligômeros flexíveis de rígidos

• determina a distribuição da conformação das ligações

Informações importantes sobre o funcionamento de sistemas biológicos são

obtidas através da observação de fenômenos relacionados à mudança de estrutura

das macromoléculas e sua dinâmica conformacional através de espectroscopias de

absorção óptica, de fluorescência e o dicroísmo circular (ITO, 2004).

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

O objetivo geral deste trabalho foi a caracterização química e físico-química

de xiloglucanas nativas e oxidadas de sementes de copaífera e tamarindo e de

amostra comercial (tamarindo) para o desenvolvimento de nanoestruturas aplicadas

no encapsulamento de camptotecina e sua liberação in vitro, e ainda como filmes

finos para imobilização de biomoléculas.

2.2 Objetivos específicos

A partir do objetivo geral foram estabelecidas as seguintes etapas para a

realização deste trabalho:

• Extrair e purificar xiloglucanas de sementes de Tamarindus indica e Copaifera

langsdorffii e compará-las a uma xiloglucana comercial;

• Caracterizar as xiloglucanas quanto à composição, homogeneidade,

dispersão, agregação, massa molar, tamanho, conformação e estrutura;

• Modificar os polissacarídeos, por método químico como derivados oxidados;

• Avaliar a citotoxicidade dos materiais nativos e modificados;

• Caracterizar físico-quimicamente os polissacarídeos naturais e os modificados

por dicroísmo circular, polarimetria, tensão superficial, viscosidade intrínseca;

• Analisar por técnicas de microscopia o melhor sistema avaliado por

espectrofotometria de fluorescência;

• Desenvolver nanoesferas de polissacarídeos para o encapsulamento de

camptotecina;

• Caracterizar as nanoesferas por microscopia de força atômica e eletrônica de

transmissão;

• Comparar a eficiência dos sistemas testados em ensaio de liberação in

vitro;

• Análisar os polissacarídeos quanto à formação de filmes finos sobre

superfície sólida por elipsometria e microscopia de força atômica;

• Avaliar a alteração da superfície sólida recoberta com filme de polissacarídeo;

• Avaliar a adsorção de biomoléculas sobre os filmes de polissacarídeos, tais

como proteínas (albumina sérica bovina e a lectina concanavalina A) e

partículas virais (dengue)

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

3.1.1 Albumina bovina

A albumina bovina (BSA) adquirida comercialmente da Sigma, com o código

A3803, apresenta massa molar especificada de 66.000 g/mol, aproximadamente.

3.1.2 Concanavalina A

A lectina Concanavalina A (Con A), tipo IV, de Concanavalina ensiformis foi

adquirida comercialmente da Sigma, com o código C2010, com massa molar

especificada de aproximadamente 25.583 g/mol e ponto isoelétrico de 4,5-5,6.

3.1.3 Partículas virais da dengue

Os vírus da dengue foram cedidos pelo prof. Dr. Benedito A. L. Fonseca, do

Laboratório de Virologia Molecular, Departamento de Clínica Médica, Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto, USP - Ribeirão Preto, à Prof. Dr. Denise F. S. Petri do

Instituto de Química, USP - São Paulo, co-orientadora deste trabalho.

3.1.4 Fontes dos polissacarídeos

As xiloglucanas utilizadas foram extraídas dos cotilédones de sementes de

Tamarindus indica (denominada XGT), conhecido como tamarindo, proveniente do

comércio do Rio Grande do Norte, e de Copaifera langsdorffii (denominada XGC),

conhecida como copaifera, coletadas no Estado de São Paulo. Utilizou-se também

uma amostra comercial de pó de semente de tamarindo (TKP, do inglês Tamarind

kernel powder) cedido pela empresa Balasanka Mills da Índia.

3.1.4.1 Extração das xiloglucanas

As sementes selecionadas foram tratadas em água fervente para inativação

enzimática. Posteriormente procedeu-se a deslipidificação e despigmentação das

sementes descascadas que não estavam degradadas. Os lipídeos e pigmentos

foram removidos dos cotilédones por refluxo contínuo de éter etílico, em sistema

Soxhlet, por 6 horas, e mantidos a temperatura ambiente (25ºC) para evaporação do

solvente.

A obtenção das XG foi feita através de extração aquosa exaustiva a 25ºC a

partir das sementes previamente deslipidificadas e despigmentadas. Os cotilédones

foram triturados com água destilada, sob agitação mecânica. O extrato viscoso

resultante filtrado em malha dupla de nylon sendo, posteriormente, centrifugado a

7000 rpm, por 40 minutos, a 25ºC (Centrífuga 4K15C, Sigma). Ao material

sobrenadante adicionou-se 2 volumes de etanol 93,2ºGL para a precipitação da

xiloglucana que foi lavada com etanol, centrifugada e seca a 25ºC (FREITAS, 2003).

Executou-se a purificação dos polissacarídeos por duas maneiras para

posterior comparação de métodos. Primeiramente, a fim de obter amostras

clarificadas e translúcidas para realização de experimentos de RMN, as XG (1 g/L)

foram ressolubilizadas em água MilliQ (>18 mΩ; Millipore) sob agitação magnética e

purificadas através de membranas filtrantes Millipore com poros de 3; 0,8 e 0,22 µm.

Após a filtração os polímeros foram precipitados com etanol 93,2°GL e secos em

estufa a 40ºC.

Outro procedimento de purificação, a fim de remover proteínas, baseia-se

na adição de ácido tricloroacético (TCA) e resfriamento a 4ºC. Para precipitação do

complexo proteína-TCA, a mistura foi mantida por, aproximadamente, 18 horas sob

refrigeração, em seguida, centrifugada a 7000 rpm, por 20 minutos, a 20ºC e o

sobrenadante neutralizado até pH 6. Após isso, foi executada a diálise, a

concentração em rotaevaporador e a posterior precipitação com, pelo menos, 2

volumes de etanol (STAUB, 1965; CORDEIRO et al., 2005; ONOE et al., 2007;

ONWELUZO et al., 2002).

O método de purificação mais adequado foi estabelecido baseado naquele

que proporcionava maior rendimento com menor quantidade de proteínas.

A fim de se obter uma fração mais pura da amostra comercial (TKP) esta foi

solubilizada em água MilliQ, centrifugada a 7000 rpm, por 20 minutos, a 20ºC

(Centrífuga 4K15C, Sigma) e o sobrenadante foi precipitado em 2 volumes de

etanol. O resíduo da centrifugação foi ressolubilizado em água por mais 2 vezes

para repetição da precipitação etanólica. Em seguida, foi analisada quanto ao teor

de açúcar total, proteínas, umidade e composição monossacarídica, por CG e RMN.

3.2 Modificação química dos polissacarídeos: oxidação seletiva com TEMPO

(2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil)

Para a oxidação seletiva de álcool primário (CH

OH-6) a ácido, primeiramente

a amostra de xiloglucana de copaifera (7 g) foi solubilizada em 2 L de água

destilada. A solução foi resfriada a 3ºC sob agitação e atmosfera de nitrogênio. O

processo oxidativo foi realizado com a adição de 14,5 mL de hipoclorito de sódio

12% (v/v), 233 mg de brometo de sódio e 46,6 mg de reativo TEMPO (2,2,6,6-

tetrametilpiperidina-1-oxil). Durante o processo de oxidação, o tempo de reação e o

volume de solução aquosa de NaOH 0,1 M adicionados foram usados para

controlar o processo de derivatização. A adição da solução alcalina permitiu estimar,

por método titulométrico, a porcentagem de grupos ácidos formados e, também,

manter o pH do meio reacional próximo de 9,3. A reação foi interrompida pela adição

de NaBH

(16 mg por 0,1 mmol de OH primário), etanol e o pH ajustado para 8,0

com ácido clorídrico 2 M (DE NOOY et al., 1996; SIERAKOWSKI et al., 2000).

O produto da oxidação foi precipitado com 2 volumes de etanol 93,2 ºGL,

centrifugado e seco a 25ºC. Após secagem, as amostras (10 g/L) foram

ressolubilizadas em água Milli Q e dialisadas em sistema fechado contra água MilliQ

com sucessivas trocas, por 3 a 4 dias, a 20ºC. A diálise foi acompanhada por

condutivímetro (Analion modelo C 708).

A reação foi realizada da mesma maneira, seguindo as proporções, para a

xiloglucana de tamarindo. A partir da reação de oxidação total, estabeleceu-se os

volumes de solução de NaOH necessários para as oxidações parciais de 30 e 60%

das amostras de XG nativas.

3.3 Análises químicas das xiloglucanas

3.3.1 Determinação de açúcar total e proteínas

As determinações de açúcar total das xiloglucanas nativas foram realizadas

pelo método fenol-ácido sulfúrico segundo Dubois et al. (1956), utilizando-se o

espectrofotômetro Biospectro SP-220. As amostras foram solubilizadas em água

MilliQ, e foi utilizada como padrão uma solução de glucose, com leituras a 490 nm.

As proteínas foram determinadas pelo método de Bradford (1976), com

modificações. Para o preparo do reagente, diluiu-se o Coomassie Blue G (100 mg)

em 50 mL de etanol 93,2 ºGL. A essa solução adicionou-se ácido fosfórico 85% (100

ml) e completou-se o volume para 1 L com água MilliQ. Procedeu-se a leitura em

595 nm, 2 minutos após a mistura do reagente à solução de amostra, utilizando-se

um espectrofotômetro SHIMADZU, modelo UV-2401.

Realizou-se também análise elementar do tipo CHN em analisador modelo

2400CHN (Perkin Elmer), na qual se tem o percentual de carbono, hidrogênio e

nitrogênio, este último que pode ser convertido para a determinação do teor de

proteínas. Esta análise foi realizada na Central Analítica, no Instituto de Química da

Universidade de São Paulo (USP - São Paulo).

3.3.2 Determinação de ácidos urônicos das amostras oxidadas

Os ácidos urônicos produzidos na reação de oxidação das XG nativas foram

determinados pelo método do m-hidroxibifenil (BLUMENKRANTZ; ASBOE-HANSEN,

1973) comparativamente à curva-padrão de ácido galacturônico, a 520 nm, em

espectrofotômetro Biospectro SP-220.

A presença das unidades ácidas, ácido glucurônico e galacturônico, foi

detectada por cromatografia em camada delgada (CCD). Os derivados (1 mg/mL)

foram hidrolisados com ácido trifluoracético (TFA) 2 M, a 100ºC por 2 horas, e então

secos em rotaevaporador. Os hidrolisados foram analisados por CCD em sílica gel

(Merck), cuja fase móvel era constituída por acetato de etila: n-propanol: ácido

acético: água (4: 2: 2: 1, v/v). Os açúcares foram corados com orcinol- H

[orcinol 0,5% (m/v) em etanol: H

(19:1)] e então as placas foram aquecidas a

100ºC por 2 minutos, aproximadamente. Padrões de hexoses (glucose/Glc e

galactose/Gal) bem como de pentose (xilose/Xyl) e também ácidos urônicos (ácido

glucurônico/GlcA e galacturônico/GalA) foram eluídos paralelamente às amostras. A

análise por CCD foi realizada no Laboratório de Carboidratos de Algas Marinhas

(Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular/UFPR).

3.3.3 Determinação da composição monossacarídica

3.3.3.1 Hidrólise com ácido trifluoracético

Os polissacarídeos nativos (5 mg) foram solubilizados em 0,5 mL de água

MilliQ. Após a solubilização completa adicionou-se o mesmo volume de TFA 2 M

(ALBERSHEIM et al., 1967; SELVENDRAN; MARCH; RING, 1979; HARRIS et al.,

1995). Em seguida, as soluções foram mantidas a 100ºC por 5 horas. O ácido foi,

então, evaporado e o material lavado com água.

3.3.3.2 Redução, acetilação e análise por cromatografia gasosa

Os monossacarídeos resultantes da hidrólise foram reduzidos na presença de

boroidreto de sódio (NaBH

), à temperatura de 50ºC, por 12 horas. A reação foi

neutralizada pela adição de ácido acético diluído, e o excesso de íons sódio

retirados pela adição de resina catiônica (H

), seguida por filtração e secagem em

rotaevaporador. O resíduo foi então lavado com metanol, formando borato de

trimetila, que é co-evaporado com o metanol em excesso. Os alditóis secos foram

então acetilados em presença de piridina-anidrido acético (1:1, v/v), a 25ºC por

período de, aproximadamente 18 horas. A reação foi interrompida pela adição de

gelo, e a piridina residual retirada pela adição de sulfato de cobre e os acetato de

alditóis extraídos com clorofórmio (1 mL). Os produtos foram analisados por

cromatografia gasosa (CG ou GC, do inglês Gas Chromatography) (WOLFROM;

THOMPSON, 1963), em cromatógrafo Trace GC Ultra (Thermo Electron Corp.) com

detector de ionização em chama (250ºC) e injetor (280ºC), utilizando coluna capilar

OV-225 (0,25 µm) e nitrogênio como gás de arraste. As análises foram realizadas

inicialmente a 100ºC com um aumento de 60ºC/min até 220ºC, no Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular/UFPR.

3.3.4 Metilação dos polissacarídeos

Os polissacarídeos nativos foram metilados segundo o método de Ciucanu e

Kerek (1984). As amostras (20 mg) foram solubilizadas em 2 mL de DMSO, às quais

foram acrescentados 20 mg de NaOH em pó, seguido de agitação e posterior adição

de 0,1 mL de iodeto de metila, continuando-se a agitação. O processo descrito

acima foi repetido 3 vezes. Após, os sistemas foram neutralizados com ácido

acético e os polissacarídeos parcialmente metilados foram dialisados por 12 horas

contra água destilada. Todo o procedimento acima foi repetido até o

desaparecimento da banda de –OH em 3.400 cm

-1

, verificado por infravermelho. As

amostras parcialmente metiladas foram hidrolisadas com ácido sulfúrico 72%

(BOUVENG; LINDBERG, 1965; SELVENDRAN; MARCH; RING, 1979), reduzidas

com boroidreto de sódio deuterado (NaBD

), acetiladas e analisadas em

cromatógrafo gasoso VARIAN, modelo Saturn 2000R, 3800, acoplado a um

espectrômetro de massa VARIAN, modelo 2000R (tipo “ion trap”), utilizando coluna

capilar DB-23, marca J & W Scientific, inicialmente a temperatura de 50ºC, com

aumento de 40ºC/min até 210ºC, mantendo-se constante a partir desse valor,

utilizando hélio como gás de arraste. Análise realizada no Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular/UFPR.

3.4 Métodos físico-químicos

3.4.1 Umidade

O teor de umidade foi determinado em estufa a 105°C (ADOLFO LUTZ,

1985), no qual a perda de água foi avaliada de acordo com a perda de massa a

partir do material nativo em pó.

3.4.2 Determinação da homogeneidade, massa molar e concentração crítica

3.4.2.1 Refratometria diferencial

A análise do índice de refração (RI, do inglês Refractive Index) em função da

concentração fornece uma constante para cada polissacarídeo em estudo, o dn/dc,

uma constante que é utilizada no cálculo da massa molar.

O índice de refração foi determinado em refratômetro Viscotek (Malvern Co.,

Estados Unidos), modelo VE3580, utilizando-se concentrações entre 1,0 e 0,2

mg/mL de amostras solubilizadas em água MilliQ, filtradas em membranas com poro

de 0,45 e posteriormente 0,22 µm (Millipore). Foram injetados 100 µl de solução da

amostra a um fluxo de 0,6 ml/min tendo água MilliQ como fase móvel.

3.4.2.2 Cromatografia de permeação em gel

Seqüencialmente à extração, as soluções aquosas dos polissacarídeos a 1,0

mg/mL em água MilliQ foram filtradas através de membranas de acetato de celulose

com diâmetro médio dos poros de 0,45 e 0,22 µm (Millipore).

Foram injetados 100 µL de solução da amostra para cromatografia de

permeação em gel (GPC, do inglês Gel Permeation Chromatography), também

conhecida por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC, do inglês Size

Exclusion Chromatography), em cromatógrafo contendo colunas de polimetacrilato

PWxl (Tosoh, Japão) 6000, 4000 e 2500 conectadas em série com limites de

exclusão de 8 . 10

, 3 . 10

e 3 . 10

Da, respectivamente. As colunas encontravam-

se acopladas a um refratômetro diferencial Viscotek, modelo VE3580, e um detector

de espalhamento de luz laser, modelo 270 Dual Detector (Viscotek), baixo ângulo, a

7º (LALLS, do inglês Low Angle Laser Light Scattering) e ângulo reto, a 90º (RALLS,

do inglês Right Angle Laser Light Scattering) a 632,8 nm, como eluente foi utilizado

água MilliQ, com fluxo controlado de 1,0 mL/min. Utilizaram-se padrões de óxido de

polietileno (22K) e dextrana (70K) recém-preparados em água, ambos fornecidos

pela Viscotek. Os parâmetros foram calculados no software OmniSec que

acompanha o equipamento.

3.4.2.3 Determinação da concentração crítica por GPC/RI

A determinação da concentração crítica, referente ao limite de concentração

entre o regime semi - diluído e diluído, foi realizada utilizando-se parâmetros

determinados por GPC/RI, conforme a seguinte equação:

π . NA . R

(5)

Onde:

= massa molar ponderal media, em g/mol

NA = número de Avogadro (NA = 6,02 . 10

)

= raio de giro, em cm

3.4.3 Análises ópticas e espectroscópicas

3.4.3.1 Polarimetria

A rotação óptica específica das XG nativas foi determinada após solubilização

do polissacarídeo a 0,2% (2 g/L)

em solução tampão fosfato (28mM) contendo NaCl

(123mM). As análises foram realizadas em aparelho AUTOPOL III (Rudolf Research)

do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFPR.

A rotação óptica específica é dada pela equação (EWING, 1982):

[α]

= α

. 100/ L . c (6)

Onde:

= rotação da luz polarizada a 20°C, em graus

L = comprimento do caminho óptico, em dm (L = 1 dm)

c = concentração da solução, em g%

3.4.3.2 Análise por espectrometria de infravermelho utilizando transformada de

Fourier

As amostras de polissacarídeos (1 mg) nativos e parcialmente metilados

foram analisadas por FT-IR, em um espectrômetro BioRad – Excalibur series

(Departamento de Química, UFPR) utilizando pastilha de KBr (150 mg), na região

espectral de 4000 a 400 cm

-1

, com resolução de 2 cm

-1

utilizando Transformada de

Fourier.

3.4.3.3 Análise de ressonância magnética nuclear

As análises estruturais dos polissacarídeos nativos e oxidados por RMN de

hidogênio (

H) e carbono-13 (

C) foram realizadas em equipamento da marca

BRUKER, modelo DRX-400, série AVANCE, em tubo de 5 mm de diâmetro, em

água deuterada (D

O, 99,9%, Cambridge Isotope Laboratories Inc.). Todas as

análises foram realizadas a 70ºC e os deslocamentos químicos baseados no da

acetona, utilizada como padrão interno tanto para as análises de

C (δ 30,20 ppm)

quanto de

H (δ 2,224 ppm).

Estes experimentos foram realizados no Departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular da UFPR, e os dados obtidos foram analisados utilizando o

software que acompanha o equipamento ou MestReC versão 4.1.1.0.

3.4.3.3.1 Análise de RMN de hidrogênio

Para as análises de hidrogênio (RMN

H) promoveu-se a troca de hidrogênios

das hidroxilas por deutério e remoção das moléculas de água presente através da

solubilização das amostras em D

O, congelamento e liofilização. Este processo foi

repetido, no mínimo, 3 vezes.

Os espectros foram obtidos na freqüência base de 400,13 MHz, janela

espectral de 8250,8 Hz, intervalo de aquisição de 4 s, intervalo entre os pulsos de 1

s, sendo realizadas no mínimo 16 aquisições, com espectro de resolução de 16 K.

3.4.3.3.2 Análise de RMN de carbono-13

Para essas análises, as amostras foram solubilizadas em uma mistura H

O (8: 2). Os espectros de carbono-13 (RMN

C), desacoplados de

H, foram

obtidos na freqüência base de 100,61 MHz, janela espectral de 31750 Hz, intervalo

de aquisição de 0,6 s, intervalo entre os pulsos de 0,1 s, sendo realizadas no

mínimo 2000 aquisições, com espectros de resolução de 32 K.

3.4.3.4 Análise por dicroísmo circular

Os experimentos de dicroísmo circular (CD, do inglês Circular Dichroism)

foram realizados na faixa de 250-190 nm em espectropolarímetro Jasco J-815

(Jasco Instruments, Tokyo, Japão) com 16 médias de varreduras (TRINDADE et al.,

2006) utilizando cubeta de quartzo retangular de 1 mm de caminho óptico. As XG (1

mg/mL) foram solubilizadas em solução tampão salina (PBS/NaCl), pH 7,4

(FERRALI et al., 1997; CICCOLI et al., 1994) e analisadas a 5, 25 e 37ºC usando

banho termocirculante modelo TC-100 (Jasco), em modo contínuo. O espectro de

CD foi obtido em miligraus (MOREIRA et al., 1998; CAMPANA et al., 2002) e

utilizou-se o software do próprio equipamento e Origin 7.5 para o tratamento dos

dados.

Os ensaios foram efetuados no Instituto de Física da Universidade de São

Paulo - São Carlos (IF-USP/SC), com a colaboração e orientação da Prof

. Leila M.

Beltramini.

3.4.3.5 Análise por espectrometria de fluorescência

Para análise comparativa entre a capacidade de encapsulamento (AMIJI,

1995), os polissacarídeos nativos e os modificados foram solubilizados em

concentrações de 2,0 a 1x10

-3

mg/mL em solução de tampão fosfato (28 mM) com

123 mM de NaCl, pH 7,4 (CICCOLI et al., 1994; FERRALI et al., 1997). As diluições

foram analisadas em espectrofotômetro de fluorescência HITACHI – F4500

(Departamento de Química, UFPR) utilizando-se pireno como marcador (2 µM) em

metanol com cubeta de quartzo própria para fluorescência. O comprimento de onda

de excitação utilizado foi de 343 nm com varredura da emissão de 360 nm até 430

nm (AMIJI, 1995; MARTIN, 1999), a uma velocidade de 60 nm/min. A relação da

intensidade do pico III pelo pico I mostrou o efeito de agregação e/ou

encapsulamento do marcador e também pode determinar a concentração micelar

crítica e/ou concentração de agregação crítica (KALYANASUNDARAM; THOMAS,

1977; DUALEH; STEINER, 1990; AMIJI, 1995; AIPING et al., 2006).

3.4.4 Análises de viscosidade

3.4.4.1 Determinação da concentração crítica

A concentração crítica foi obtida graficamente através da relação do logaritmo

da viscosidade específica (η

) versus o logaritmo da concentração multiplicado pelo

parâmetro de recobrimento ([η]). Através da intersecção obtida entre as retas foi

possível identificar a transição do regime semi-diluído para diluído (WANG et

al.,1997).

3.4.4.2 Determinação da viscosidade intrínseca e da constante de Huggins

Para as análises reológicas, as XG nativas e modificadas foram solubilizadas

em concentração de 2 g/L, pernoite em tampão fosfato (28mM) contendo NaCl

(123m mM), pH 7,4 (CICCOLI et al., 1994; FERRALI et al., 1997). As análises foram

realizadas em reômetro Haake, modelo RheoStress 1 com sensor DG 43, com

manutenção da temperatura (25ºC) utilizando um banho termocirculante modelo DC

30 e um dispositivo de termostatização UTC, Thermo Electron Corporation, com

diluições nas concentrações de 80, 60, 40, 20 e 10% (DANIELS et al., 1970).

Primeiramente, a viscosidade relativa (equação 7) da amostra é obtida

comparativamente ao solvente, de acordo com a equação:

Viscosidade relativa: η

rel

= η

sol

/ η

(7)

onde η

é a viscosidade absoluta observada para a solução contendo a amostra.

Seguindo o cálculo obtem-se a viscosidade específica (equação 8):

Viscosidade específica: η

= (η

sol

- η

) / η

= η

rel

- 1 (8)

é adimensional e depende da concentração da amostra (c

Viscosidade reduzida: η

red

= η

/ c

(9)

A unidade da viscosidade reduzida é dada em cm

/g (CGI) ou m

/Kg (SI),

sendo mL/g e dL/g também muito difundidas na literatura.

Através do gráfico que representa a equação de Huggins (equação 10) foi

possível obter a viscosidade intrínseca [η] pela extrapolação da viscosidade reduzida

(η

red

) a uma concentração limite, tendendo a zero (c→0) (HUGGINS, 1942;

DANIELS, 1970).

Equação de Huggins: η

red

= [η] + k

[η]

c (10)

A constante de Huggins (k

) foi determinada através do coeficiente angular

que representa k

. [η]

3.4.5 Análise de tensão superficial

A análise da tensão superficial das XG foi feita utilizando tensiômetro

Dataphysics GmbH (Alemanha), modelo OCA 15+. Procedeu-se o método da gota

pendente e aproximações matemáticas de Laplace-Young (SONG; SPRINGER,

1996a; 1996b) calculadas pelo software SCA20 do próprio equipamento. Soluções

das amostras foram aspiradas com uma seringa de 500 µL (Hamilton, Suíça) e

gotejadas com um dispensador automático a fim de se determinar a forma da gota,

utilizando para isso o processamento computacional das imagens. Para a medida da

tensão interfacial líquido-vapor (γ

) utilizou-se agulha de 38,1 mm de

comprimento, 1,65 e 1,37 mm de diâmetro externo e interno, respectivamente. Os

resultados foram obtidos pela média de três medições.

3.5 Métodos de imagem por microscopia

3.5.1 Análise por microscopia de força atômica

Através das análises de AFM as soluções de XG consideradas como sendo o

melhor sistema de encapsulamento foram comparadas entre si. Cada polissacarídeo

foi solubilizado em solução tampão de acordo com a sua concentração crítica,

determinada por espectrometria de fluorescência. A solução foi depositada sobre

silício (100) mantendo-se o substrato imerso por 24 horas, a 20ºC e 40% de

umidade relativa do ar, de modo a formar uma fina camada de material disperso

para que fosse possível medir o tamanho das partículas. Foi utilizada a técnica de

modo dinâmico ou contato intermitente (“tapping mode”) em microscópio SPM

9500J3, SHIMADZU Corp. (Kyoto, Japão) a fim de observar a homogeneidade, o

tamanho das partículas, a presença de agregados e o valor da raiz quadrada média

da rugosidade da superfície (rms, do inglês root mean square roughness) a partir da

obtenção de dados topográficos. Foram obtidas ainda imagens de contraste de

fases e/ou amplitude com auxílio do software do próprio equipamento, SPM, modo

offline. A área de análise variou de 8 x 8 a 2 x 2 µm

Esta análise foi realizada no Departamento de Física da UFPR com a

colaboração do Prof. Paulo César de Camargo e da Dr

. Adriana F. Lubambo.

3.5.2 Análises por microscopia de transmissão

Depois de estabelecido o melhor sistema polissacarídico de encapsulamento

foi realizada análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET ou TEM, do

inglês, Transmission Electron Microscopy).

As soluções de XG foram preparadas em sua cac em solução tampão fosfato

salina. Após a deposição da amostra sobre telas de parlódio essas foram secas em

condições controladas de temperatura (20ºC) e umidade (40%).

Foi utilizado um microscópio eletrônico de transmissão JEOL-1200EX-II de

100 kV com capacidade de aumento de até 600 mil vezes associado a uma câmera

tipo CCD para a coleta das imagens. As análises foram realizadas no Centro de

Microscopia Eletrônica da UFPR.

3.6 Ensaio bioquímico celular

3.6.1 Análise de citotoxicidade dos polissacarídeos nativos e modificados

3.6.1.1 Cultura de células

As células utilizadas foram adquiridas do banco de células da Universidade

Federal do Rio de Janeiro (BCRJ- RJCB Collection). As células de fibroblasto L929

(linhagem não tumorogênica) são culturas secundárias extraídas do tecido conectivo

de adipócitos de camundongos (Mus musculus C3H/NA) machos com 100 dias de

vida (BCRJ CR020/ATCC CCL1).

As células foram crescidas em meio essencial de Eagle modificado por

Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma), 2 mM de

L-glutamina (Ajinomoto), 1% de aminoácidos não essenciais, 100 µg/mL de

penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina (Roche), em estufa a 37ºC, com 5% de

95% ar. O pH do meio foi mantido em 7,4. As amostras foram solubilizadas

em meio de cultura DMEM suplementado com L-glutamina e esterilizadas por

filtração em membranas (0,22 µm).

3.6.1.2 Ensaio de citotoxicidade pelo teste MTT

A citotoxicidade nas células foi determinada pelo teste MTT (3-[4,5-

dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio brometo) (Sigma). O MTT (sal de tetrazólio) é

convertido em sal de formazan pelas células vivas, formando uma coloração azulada

(MOSMANN, 1983).

As células L929 foram plaqueadas, em placas de 96 poços, a 2.10

células/poço e incubadas com 300 µL de meio DMEM suplementado com soro fetal

bovino a 10% (SFB) por 24 horas a 37ºC em 5% CO

. A fim de manter todas as

células em um mesmo estágio da divisão celular (G

), o meio DMEM com SFB foi

substituído por 180 µL de meio DMEM sem SFB e incubado por 1 hora a 37ºC em

5% CO

. Posteriormente, foram adicionados 20 µL das amostras autoclavadas

solubilizadas em água (1,0 e 0,5 mg/mL), do controle positivo (dimetilsulfóxido,

DMSO) e do controle negativo (PBS); que foram incubados por 24 horas a 37ºC em

5% CO

. Também foi realizado um controle adicional com o solvente (S) utilizado

para solubilizar as amostras (água). Após este tempo, retirou-se o meio e adicionou-

se 180 µl de DMEM sem SFB e 20 µL de MTT (5 mg/mL) estéril, em PBS, pH 7,4 a

fim de obter-se uma concentração final de 0,5 mg MTT/mL. Após 4 horas, o corante

não reativo foi removido por inversão e os cristais de formazan insolúveis formados

dissolvidos em 200 µL/poço de DMSO. A quantificação celular foi realizada a 570 nm

(INVITTOX/ERGATT/FRAME, 1990) em leitor de microplacas Asys Hitech (Reino

Unido). Os testes foram realizados em quadruplicatas. A viabilidade relativa das

células relacionadas ao controle sem as substâncias testes foi calculada como

absorbância da amostra teste/absorbância do controle negativo x 100 (BUSKÜHL,

2007) e expressa pela média +

desvio padrão. Esses experimentos foram efetuados

no Laboratório de Farmacologia in vitro da UNIVALI, com a colaboração com o Prof.

Rilton A. de Freitas.

3.7 Ensaio de liberação in vitro da droga

3.7.1 Preparo do complexo de encapsulamento polímero-droga

As soluções de XG foram preparadas, em duplicata, em concentração 25%

acima da cac correspondente, de acordo com observações experimentais de Aiping

et al.(2006), em PBS/NaCl, pH 7,4.

Após a solubilização da XG por período de 18 horas, sob agitação magnética,

adicionou-se 40% (m/m) de camptotecina (CPT) em relação à massa de XG contida

na solução, baseado em observações de Opanosopit (2006) e Watanabe (2006). A

mistura XG-CPT foi mantida sob agitação magnética por 48 horas e após,

centrifugada a 6000 rpm por 30 min, a 25ºC.

3.7.2 Análise de encapsulamento da droga

Após centrifugação, a solução foi analisada comparativamente a uma curva-

padrão de CPT solubilizada no mesmo solvente (PBS/NaCl) e diluída em solução

NaOH 1 M para dosagem do encapsulamento de CPT que foi realizada utilizando-se

o espectrofotômetro Biospectro SP-220 a 369 nm, em cubeta de quartzo com 1 cm

de caminho óptico.

Procedeu-se também análise de fluorescência para verificar o

encapsulamento da CPT nas cadeias da XG em espectrofotômetro de fluorescência

HITACHI – F4500 (Departamento de Química, UFPR) em cubeta de quartzo (1 cm

de caminho óptico) própria para fluorescência. O comprimento de onda de excitação

utilizado foi de 369 nm com varredura da emissão de 375 nm até 600 nm (LIU,

2005), a uma velocidade de 60 nm/min.

3.7.3 Liberação in vitro da camptotecina

O estudo de liberação in vitro foi realizado de acordo com o método de Xiong

et al. (2005) com adaptações de Aiping et al. (2006). Resumidamente, a solução de

XG-CPT (5 ml) foi colocada em membrana de diálise Inlab (Alamar Tecno Científica

Ltda, Diadema, SP), com limite de exclusão de 12000 a 16000 Da e porosidade

média de 2,5 nm (25 Å). A membrana vedada foi imersa em solução de tampão

fosfato (28 mM) com NaCl 123 mM em pH 7,4 (CICCOLI et al., 1994; FERRALI et

al., 1997). O sistema foi mantido sob agitação magnética, em banho-maria para

manutenção da temperatura a 37ºC. Em intervalos consecutivos de tempo pré-

determinados até 8h30 e por fim, após 24 horas do início do ensaio, volumes de

solução (3 mL) de fora da membrana foram coletados e analisados por

espectrofotometria UV-Vis a 369 nm, comparativamente à solução PBS/NaCl

(branco). O mesmo volume retirado foi reposto a fim de manter constante o volume

de solução do sistema e considerado no cálculo para a determinação da

porcentagem de liberação da droga, sendo o total de CPT encapsulada considerada

como 100% e as quantidades liberadas determinadas pela equação da reta obtida

da curva padrão.

3.8 Análise de adsorção de filmes de polissacarídeos sobre suporte sólido

3.8.1 Elipsometria e análise dos filmes formados

Para a análise da espessura dos filmes formados pelas XG nativas e

oxidadas testadas foram usados os seguintes índices de refração: Si n = 3,88

(BRANDRUP; IMMERGUT, 1996); SiO

n = 1,462 (BRANDRUP; IMMERGUT, 1996);

APS n = 1,424 (Fluka); BSA n = 1,52 (CARTER; HO, 1994). As medidas

elipsométricas foram realizadas em elipsômetro DRE-ELX02 (Ratzeburg, Alemanha)

equipado com um laser He-Ne (λ = 632,8nm), com ângulo de incidência ajustado em

70°. Tanto o preparo como as medidas por elipsometria e microscopia de força

atômica dos filmes foram efetuados no Instituto de Química da USP, em São

Paulo (IQ-USP/SP) sob co-orientação e colaboração da Profª. Denise F. S. Petri.

3.8.2 Preparo das lâminas de silício

Utilizou-se lâminas de silício (Si) recobertas com uma camada de SiO

nativo

fornecidas pela SiliconQuest (Estados Unidos), para a reação de silanização foi

utilizado 3-aminopropiltrimetoxisilano (APS) fornecido pela Fluka (Basel, Suíça).

Para adsorção dos polissacarídeos nativos foi utilizado silício puro recoberto

com SiO

e para as amostras oxidadas foram utilizadas lâminas de Si silanizadas.

As superfícies amino-funcionalizadas são obtidas a partir da reação de silanização

das lâminas de Si com APS (PETRI et al., 1999), sendo que primeiramente as

lâminas de silício foram limpas imergindo-as em uma mistura oxidativa contendo

: NH

: H

O, na proporção de 1: 1: 4 (v/v) a temperatura de 75ºC, durante 20

min. Depois desse período retirou-se as lâminas da mistura, lavando-as em água

destilada e secando-as com jatos de N

. Após serem limpas, as lâminas foram

mergulhadas em uma solução de APS em tolueno (1%, v/v) a 60ºC durante 20

segundos, sendo lavadas em seguida com tolueno puro, e secas com jatos de N

Através deste método, obteve-se uma monocamada amino-funcionalizada

homogênea covalentemente ligada à lâmina e silício (PETRI et al., 1999).

3.8.3 Preparo dos filmes de polissacarídeo sobre lâminas de silício

Foram preparadas soluções de XG em solução tampão salina (PBS/NaCl), pH

7,4 (CICCOLI et al., 1994; FERRALI et al., 1997) para ensaio de isoterma variando-

se a concentração de 0,05 a 2,0 mg/mL. Os filmes foram obtidos por imersão das

lâminas de silício, previamente lavadas e funcionalizadas, por período de 18 horas, à

temperatura ambiente (25ºC). Após incubação, as lâminas foram lavadas com água

e secas com jatos de nitrogênio e analisadas em elipsômetro e também por AFM.

Através da isoterma foi possível definir como sendo 1 mg/mL a

concentração para revestimento da superfície para posterior adsorção das

biomoléculas estudadas neste trabalho, como proteínas, lectinas e partículas virais.

3.8.4 Preparo da solução de albumina sérica bovina

A BSA (1 mg/mL) foi solubilizada em solução contendo NaCl 10 mM e variou-

se o pH (4,0; 4,5; 5,0; 5,2; 5,5; 6,0 e 7,4) para verificar qual a melhor condição para

adsorção sobre o filme de polissacarídeo.

3.8.5 Preparo da solução de partículas de vírus da dengue

Vírus como os da dengue, que tem sua via de transmissão e infecção limitada

pelo vetor são classificados como agentes de risco nível 2 de acordo com a

Instrução Normativa CTNBio nº 7, de 06.06.97, que também recomenda o manuseio

desses agentes em cabines de segurança biológica classes II A, II B 1, II B 2 ou II B

3 (BRASIL, 1997); sendo assim, os vírus atenuados foram preparados no

Laboratório de Virologia Molecular, da Universidade de São Paulo, em Ribeirão

Preto, que possui certificação de qualidade em biossegurança nível 2, sob o registro

CTNBio nº

003097, publicado em 11/11/1997.

Os vírus foram preparados, sob supervisão do Prof. Benedito A. L. Fonseca,

da seguinte maneira: Vírus da dengue tipo 1 (DENV-1; cepa Mochizuki), Vírus da

dengue tipo 2 (DENV-2; cepa New Guinea) e Vírus da dengue tipo 3 (DENV-3; cepa

H87) foram crescidos em células C6/36, cultivadas em meio L15 Leibowitz,

suplementado com 2% de soro bovino termo-inativado e com antibióticos (PEREIRA

et al., 2008). Os vírus foram adicionados para infectar as monocamadas de células e

foram incubados por uma hora a 28ºC, sendo agitados a cada 15 min. Os

sobrenadantes das culturas de células infectadas foram coletados após sete dias da

infecção, centrifugados, separados em várias alíquotas e congelados a -80ºC. Então,

a infecção viral foi determinada através de RT-PCR (do inglês, Real-time Polimerase

chain reaction), usando iniciadores sorotipos específicos (DE PAULA et al., 2002).

Para preparar altos títulos de vírus da dengue, o sobrenadante das culturas

infectadas foi concentrado no filtro de 100 kDa centrifugador Millipore Centricon®

(Amicon; Millipore).

As dispersões virais foram preparadas em uma concentração de 4 mg/mL, em

tampão fosfato, pH 7,2.

3.8.6 Preparo da solução de lectina

Concanavalina A (ConA) foi dissolvida em solução de NaCl 0,15 M, na

presença de MnCl

0,01 M e Cacl

0,01 M, sendo a concentração final de lectina de

0,2 mg/mL. O pH do meio foi ajustado para 5,0 pela adição de HCl 0,1 M.

3.8.7 Interação de biomoléculas com os filmes de polissacarídeos

Foi testada a capacidade de adsorção dos polissacarídeos sobre seu

respectivo substrato, silanizado no caso das amostras oxidadas, e sobre as XG

foram testadas a adsorção de BSA (18 horas, 25ºC), ConA (3 horas, 25ºC) e vírus

da dengue tipos 1, 2 e 3 (3 horas, 36ºC em estufa) para verificar afinidade entre as

interfaces XG-proteína, XG-lectina e XG-vírus; e nesta última, ainda para verificar se

há especificidade na adsorção dos diferentes sorotipos. Foi testada ainda a

adsorção da lectina e do vírus na presença de manose 50 mM, em solução, para

verificar a ligação entre o monossacarídeo e a lectina e, consequentemente, a

inibição da adsorção sobre o filme de xiloglucanas. Após as análises por

elipsometria, os filmes foram analisados por AFM em microscópio modelo PICO

SPM-LE (IQ-USP/SP) em modo dinâmico a fim de verificar a topografia e

homogeneidade do recobrimento do substrato (FUJIMOTO et al., 2002).

3.8.8 Ensaios de dessorção

Experimentos de dessorção foram feitos imergindo-se os substratos contendo

os polissacarídeos adsorvidos em água por 24 horas. Após este período, as

amostras foram retiradas da solução, lavadas com água, secas com jatos de N

caracterizadas por elipsometria comparativamente ao filme formado anteriormente.

3.8.9 Análise do ângulo de contato

A análise do ângulo de contato da interface líquido-sólido foi realizada

gotejando-se água MilliQ com um dispensador automático sobre silício recoberto por

filmes de XG de espessura previamente determinada por elipsometria.

Utilizou-se o tensiômetro Dataphysics GmbH (Filderstadt, Alemanha), modelo

OCA 15+ e seringa Hamilton de 500 µL com agulha de diâmetro interno 1,37 mm,

externo 1,65 mm e 38,1 mm de comprimento, à temperatura de aproximadamente

25ºC

Procedeu-se o método da gota séssil para a análise da interface líquido

(água) sólido (Si e Si recoberto com XG). Uma vídeo-câmera foi utilizada para fazer

aquisição de imagens, que foram transferidas a um computador, onde o próprio

software do equipamento calcula o valor do ângulo. Os valores da espessura do

filme e do ângulo de contato foram plotados utilizando o programa Origin 7.5.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Obtenção das xiloglucanas nativas

Após a extração e purificação por centrifugação, obteve-se, em relação às

sementes totais, um rendimento de 47 e 22% (m/m) para o polissacarídeo de

copaífera (XGC) e tamarindo (XGT), respectivamente. O baixo rendimento para a

XGT ocorreu devido à presença de sementes degradadas. Em geral, o rendimento é

de, aproximadamente, 51% (m/m) a partir das sementes (RAO; SRIVASTAVA,

1973), e em comparação com outras xiloglucanas de sementes, para a de

Hymenaea courbaril sem purificação obteve-se 42-45% (m/m) (LIMA, 1993 e

SOUZA-LIMA, 1997) e, aproximadamente, 17% (m/m) após a filtração (FREITAS,

2003); para Copaifera langsdorffii após filtração de 47% (m/m) (STUPP et al., 2008)

sendo, portanto, um bom rendimento o obtido para a XGC.

Após a purificação com TCA, obtiveram-se rendimentos de 36,6 e 17,1%

(m/m), em relação à massa de sementes, que foram maiores que com a filtração

consecutiva por membranas Millipore (poros 3; 0,8 e 0,22 µm), quando se obteve

24,8 e 6,6% (m/m), em relação à massa de sementes, respectivamente para XG de

copaifera e tamarindo, sendo a precipitação com TCA o método escolhido para a

remoção das proteínas. Após solubilização e precipitação com etanol a amostra de

tamarindo comercial (TKP) apresentou rendimento de 51% (m/m), em relação à

massa de pó de endosperma de semente de tamarindo moída.

As XG obtidas de sementes de diferentes espécies coletadas no Brasil,

denominadas XGC e XGT, foram comparadas entre si e, também, em relação à uma

obtida comercialmente, originária da Índia, referida como TKP, quanto a

composição química e em termos estruturais e físico-químicos, na tentativa de se

analisar a influência de diferenças em suas propriedades macromoleculares, bem

como quando em solução ou sobre suporte sólido.

4.2 Caracterização química, físico-química e estrutural das xiloglucanas

Nas dosagens de proteínas das amostras foram observadas porcentagens em

torno de 2% (m/m), o que levou à purificação das amostras com TCA. Na tabela 3

são apresentados o conteúdo de açúcar total, proteínas, umidade e rotação óptica

para as xiloglucanas de sementes de C. langsdorffii (XGC) e T. indica (XGT), após a

purificação por precipitação com TCA e, também, de TKP, após precipitação

etanólica. Todas apresentaram altos teores de açúcar total, mesmo antes do

tratamento com TCA (80,8 para XGC e 87,8% para XGT) e em torno de 89-90%

após o procedimento. Resultados similares foram obtidos para a XG de H. courbaril

estudada por Freitas (2003). Baixas porcentagens de proteínas, após precipitação,

foram observadas com ácido (TCA) ou com solvente orgânico (etanol). E valores

muito similares de umidade foram obtidos, sendo que a amostra comercial

apresentou maior teor (10,3%) em relação à massa seca de fibras após extração e

secagem em temperatura ambiente (25ºC), quando comparada às XG extraídas em

laboratório, quando se obteve 9,2 e 9,8% para copaífera e tamarindo,

respectivamente. Esses valores foram similares ao relatado por Guerra et al .(2006)

e menores do que o obtido por Martin (2003) (~15%) para a XG de jatobá (H.

courbaril).

TABELA 3 - DETERMINAÇÃO DE AÇÚCAR TOTAL, PROTEÍNAS E UMIDADE DAS

XILOGLUCANAS

%(m/m)

Amostras

Açúcar total

Proteínas

Umidade

[α

αα

α]

XGC Copaifera 89,5 0,12 9,2 +50,2

XGT Tamarindo

90,5 0,53 9,8 +61,3

TKP Comercial 84,6 1,25 10,3 n.a.

– Método de DUBOIS et al.(1956)

– Método de BRADFORD (1976)

– Método de ADOLFO LUTZ (1985)

n.a.: não analisado

Os valores de rotação óptica observados na tabela 3 foram baixos se

comparados aos obtidos para a XG de H. courbaril de +78 a +98 em análises

efetuadas por Freitas (2003). Os baixos valores indicaram uma menor exposição

das ligações α, pois provavelmente a solução tamponada utilizada favoreceu uma

conformação na qual essas ligações ficaram menos expostas na molécula.

Comparativamente a dosagem de proteínas pelo método de Bradford (1976),

verificou-se, por análise elementar do tipo CHN, que o percentual de nitrogênio (%N)

diminuiu após o tratamento com TCA em ambos os casos, passando de 1,55 para

0,75 no caso da XGT, de 1,6 para 0,36 na XGC, e para TKP precipitada em etanol

passou de 3 para 0,98, indicando, portanto uma diminuição no teor protéico. Mas é

possível que outros compostos com nitrogênio em sua estrutura também estivessem

presentes como contaminantes. Um exemplo disso ocorre nas cumarinas, que foram

relatadas no óleo extraído das sementes de copaíba (STUPP et al., 2008).

A composição monossacarídica foi obtida após hidrólise, redução e acetilação

das amostras, como mostrado na tabela 4. Os monossacarídeos presentes foram os

mesmos, porém com maiores conteúdo de arabinose na amostra de tamarindo e

maior grau de substituição por galactose em copaifera. Assim, observou-se uma

proporção monossacarídica para Glc: Xyl: Gal de, respectivamente, 2,4: 2,1: 1 para

XGC e 2,8: 2,3: 1 para XGT, enquanto que a amostra comercial, TKP, apresentou

relação 2,4: 2,3: 1. Observe-se que as unidades de Ara presentes como

contaminantes, provavelmente de resíduos da casca (ZAWADZKI-BAGGIO et al.,

1992), não foram consideradas para o cálculo da proporção monossacarídica do

polissacarídeo do endosperma.

TABELA 4 - COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DAS XILOGLUCANAS

Monossacarídeos (mol%)*

Amostras

Glc Xyl Gal Ara

XGC 43,2 38,3 17,8 0,7

XGT 44,1 36,8 15,9 3,3

TKP 39,6 37,4 13,0 6,6

* por GC, coluna OV-225, a 220ºC.

A análise de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (FIGURA 23) da

XGT e XGC permitiu confirmar a relação monossacarídica observada após a análise

dos derivados alditóis acetatos detectados por cromatografia gasosa.

Na região α-anomérica (δ 4,8 a 5,3 ppm) do espectro de hidrogênio

(FIGURA 23), foi possível observar dois sinais correspondentes a unidades α-

xilose substituída em δ 5,13 e de unidades terminais não redutoras em δ 4,94. Em

campo mais alto na região β-anomérica (δ 4,5 a 4,7), apareceram sobrepostos os

deslocamentos químicos de β-Galp e de β-Glcp da cadeia principal em δ 4,56 e

4,57, respectivamente. Deslocamentos similares foram observados para XG de

sementes de Hymenaea courbaril (LIMA et al., 1995; RECHIA et al., 1998) e

Tamarindus indica (YORK et al., 1993).

FIGURA 23 - ESPECTRO DE RMN

H E INTEGRAÇÃO DA REGIÃO ANOMÉRICA DE XGC (A) E

XGT (B) EM D

O, A 70ºC: (a) α-Xylp SUBSTITUÍDA, (b) α-Xylp NÃO SUBSTITUÍDA

EM TERMINAIS NÃO REDUTORES (c) SOBREPOSIÇÃO DE TERMINAIS NÃO

REDUTORES DE β-Galp E β-Glcp DA CADEIA PRINCIPAL. DESLOCAMENTOS

QUÍMICOS EXPRESSOS EM ppm

Realizou-se também a análise por RMN

C da amostra de XG comercial, na

qual foi possível observar os deslocamentos dos carbonos anoméricos (FIGURA

24,A) dos três monossacarídeos presentes na estrutura, cujos sinais aparecem em δ

104,3 (C-1 Galp), δ 102,3 (C-1 Glcp) e δ 98,8 (C-1 Xylp). Além disso, o espectro de

hidrogênio (FIGURA 24,B) apresentou os sinais referentes às unidades α-

-xilose

substituída (δ 5,14) e unidades de xilose terminais não redutoras (δ 4,95), e na

região β-anomérica, em δ 4,57, apareceram sobrepostos os deslocamentos

químicos de β-Galp substituinte e o de β-

-Glcp da cadeia principal.

A diferença na proporção monossacarídica Glc: Xyl: Gal encontrada na

análise dos alditóis acetato (2,4: 2,3: 1) e por RMN (1,8: 2: 1) pode estar relacionada

ao fato da derivatização a compostos acetilados ser uma técnica destrutiva,

enquanto que a análise por RMN apresenta natureza não-invasiva mantendo o

material intacto (AGRAWAL, 1992).

(A)

(B)

FIGURA 24 - ESPECTRO DE RMN (A):

C E (B):

H E INTEGRAÇÃO DA REGIÃO ANOMÉRICA DA

XILOGLUCANA COMERCIAL TKP, EM D

O, A 70ºC. DESLOCAMENTOS QUÍMICOS

EXPRESSOS EM ppm

As observações das análises por cromatografia gasosa e ressonância

magnética foram complementadas com as informações da análise por metilação, a

fim de melhor compreender as diferenças estruturais das xiloglucanas em relação

ao padrão de ligação e de substituição das unidades constituíntes.

O processo de metilação foi acompanhado por análises por infravermelho, e

os espectros são apresentados nas figuras 25 e 26.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

OH livre 3650-3584

OH ligado 3550- 3200

Número de onda (cm

-1

)

(A)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

1450-1378

Número de onda (cm

-1

)

% T

(B)

2962-2872

FIGURA 25 - ESPECTROS DE INFRAVERMELHO DURANTE ACOMPANHAMENTO DO

PROCESSO DE METILAÇÃO DA XGC. AMOSTRA NATIVA (A) E METILADA (B)

Com o processo de metilação observou-se que ocorreu aumento relativo do

estiramento axial de CH

próximo de 2962-2872 cm

-1

e deformação angular em

1450-1378 cm

-1

, em relação à banda de OH, por volta de 3400 cm

-1

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

OH livre 3650-3584

OH ligado 3550- 3200

Número de onda (cm

-1

)

(A)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

1450-1378

2962-2872

Número de onda (cm

-1

)

% T

(B)

FIGURA 26 - ESPECTROS DE INFRAVERMELHO DURANTE ACOMPANHAMENTO DO

PROCESSO DE METILAÇÃO DE XGT. AMOSTRA NATIVA (A) E METILADA (B)

A análise dos acetatos de alditóis parcialmente metilados por cromatografia

gasosa acoplada à detecção por espectrometria de massas é apresentada na tabela

5. Pelos derivados metilados e acetilados observou-se que ambas as XG

apresentaram uma cadeia principal celulósica constituída de unidades de glucose

ligadas (1→4), algumas das quais são substituídas em C-6 por unidades de xilose

que, por sua vez, podem estar ramificadas em C-2 por unidades terminais de

galactose.

TABELA 5 - ACETATO DE ALDITÓIS PARCIALMENTE METILADOS DERIVADOS DAS

XILOGLUCANAS EXTRAÍDAS DE SEMENTES DE COPAIFERA (XGC) E

TAMARINDO (XGT)

Amostras

(mol%)

O-metil

alditol*

Ligação Principais fragmentos (m/z)

XGC XGT

2,3,4-Me

-Xyl

(Xylp)1→

87,88,101,118,161 15,9 20,5

3,4-Me

-Xyl

→2(Xylp)1→

85,87,99,101,117,129,159,189 15,9 15,0

2,3,4,6-Me

-Gal

(Galp)1→

87,89,101,113,118,129,145,161,

205

16,3 12,0

2,3,4,6-Me

-Glc

(Glcp)1→

87,89,101,113,118,145,161,205 - 2,0

2,3,6 e/ou

2,3,4-Me

-Glc

→4(Glcp)1→

e/ou

→6(Glcp)1→

87,99,101,117,118,129,131,161,

189

13,5 7,3

2,3-Me

-Glc

→4(Glcp)1→

↑

85,101,118,127,159,201 33,4 40,2

2,3,5-Me

-Ara

(Arap)1→

87,101,118,129,161 5,1 3,2

* por GC-MS, coluna DB-23, a 210ºC

Analisando a tabela 5 foi possível observar uma pequena diferença na

quantificação da galactose, que substitui as ramificações de xilose, indicando que a

XGC é mais ramificada por apresentar mais terminais de Galp. Tipicamente, as XG

compreendem esqueletos de glucose β-

-(1→4)-ligadas com substituições a cada

três ou quatro unidades por xilopiranoses α-

-(1→6)- ligadas fornecendo a estrutura

tetrassacarídica fundamental para as xiloglucanas, XXXG, ou Xyl-Xyl-Xyl-Glc.

4.3 Modificação química da xiloglucana

A obtenção de derivados urônicos de XGC e XGT foi realizada de acordo com

a metodologia de oxidação com o reativo TEMPO (2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-

oxil). A reação ocorre seletivamente em CH

OH-6 das cadeias polissacarídicas,

transformando esse álcool primário em ácido carboxílico (COOH) e já foi descrita

como muito eficiente na oxidação de diferentes polissacarídeos (DE NOOY;

BESEMER; VAN BEKKUM, 1994; 1995; DE NOOY; BESEMER; VAN BEKKUM;

VAN DIJK; SMIT, 1996; RINAUDO; ROURE; MILAS; FROLLINI, 1998;

MUZZARELLI; MUZZARELLI; COSANI; TERBOJEVICH, 1999). Dessa forma, nos

polissacarídeos podem ocorrer, durante a reação, derivatizações no C-6 da

galactose e, também, no C-6 da glucose não substituída da cadeia celulósica

(FIGURA 27). Mas para a curva de quantificação durante a reação, pelo consumo de

solução de hidróxido de sódio, foram utilizadas apenas as unidades de galactose

nos cálculos das porcentagens teóricas de oxidação.

FIGURA 27 – ESQUEMA DA REAÇÃO DE OXIDAÇÃO COM O REATIVO TEMPO SOBRE AS

UNIDADES MONOSSACARÍDICAS DA XILOGLUCANA DESTACADAS PELAS

SETAS E CAIXAS EM CINZA.

O processo de oxidação seletiva de C-6 (álcool primário) se dá devido à

formação do íon oxidante nitrosônio (FIGURA 28, estrutura 2) a partir do reagente

radicalar orgânico TEMPO (FIGURA 28, estrutura 1). Durante a oxidação, o íon

nitrosônio é reduzido para uma hidroxilamina (FIGURA 28, estrutura 3).

FIGURA 28 - FORMAS ESTRUTURAIS DO TEMPO (2,2,6,6-TETRAMETILPIPERIDINA-1-OXIL):

FORMA RADICALAR (1), ÍON NITROSÔNIO (2) E FORMA REDUZIDA PARA UMA

HIDROXILAMINA (3)

FONTE: Adaptado de BRAGD et al.(2000)

FIGURA 29 - ETAPAS DA OXIDAÇÃO DE ÁLCOOL PRIMÁRIO COM TEMPO, HIPOBROMITO E

HIPOCLORITO DE SÓDIO

FONTE: Adaptado de BRAGD et al.(2000)

Durante o processo, se conduzido a pH menor que 9, pode ocorrer reação de

competição, devido à oxidação indesejada de grupos alcoólicos secundários pelo

hipoclorito e hipobromito (FIGURA 29). Utilizando valores mais altos de pH (9,2 a

9,5) e baixa temperatura, a seletividade é maior que 95% (DE NOOY; BESEMER;

BEKKUM, 1994; 1995).

A adição de NaOH foi utilizada para manter o pH do meio reacional em

aproximadamente 9,5, pH mais seletivo para a oxidação de álcoois primários, e

também para controlar o processo de derivatização. Na figura 30 tem-se a curva do

processo titulométrico em função do tempo de reação para a XG de copaifera

(FIGURA 30,A) e para a de tamarindo (FIGURA 30,B).

0 20 40 60 80 100 120

100

Volume de NaOH

(0,102 mol/L) (mL)

Tempo (minutos)

(A)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Volume de NaOH

(0,102 mol/L) (mL)

Tempo (minutos)

(B)

FIGURA 30 - VOLUME DA SOLUÇÃO (mL) DE NaOH (0,102 mol/L) EM FUNÇÃO DO TEMPO

DURANTE O PROCESSO DE OXIDAÇÃO DE XGC (A) E XGT(B)

Os rendimentos do processo de oxidação foram de 93,1 e 99,7% (m/m),

respectivamente, para XGC e XGT

Através dessas curvas de oxidação,

denominadas de total (Cod100 e Tod100), determinou-se então o volume de solução

de NaOH 0,1M a ser utilizado para obter oxidações parciais (30 e 60%, ex. Cod30 e

Cod60) das xiloglucanas.

O grau de oxidação também foi determinado por método colorimétrico

(BLUMENKRANTZ; ASBOE-HANSEN, 1973), utilizando para quantificação o ácido

galacturônico como padrão e amostras de XG nativas como controle, as quais

apresentaram percentagem zero nessa quantificação.

A análise do teor de ácidos urônico por método colorimétrico apresentada na

tabela 6 revelou que o grau de oxidação obtido é maior que os valores teóricos, das

curvas de titulação, indicando que a oxidação também ocorreu nas unidades de

glucose, no caso da XG de tamarindo, mesmo que a formação de ácido

galacturônico fosse mais favorecida, pelo fato que o C-6 das unidades de galactose

estariam mais expostas na cadeia polissacarídica. Sendo assim, mais acessíveis à

oxidação em relação às unidades de glucoses da cadeia principal (MARTIN, 2003).

As oxidações parciais de

C. langsdorffii

foram menos eficientes que o

esperado, visto que apresentaram grau de oxidação abaixo do cálculo teórico

(TABELA 6).

TABELA 6 - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM (m/m) DE OXIDAÇÃO DAS XG POR

MÉTODO COLORIMÉTRICO COMPARATIVAMENTE À DETERMINAÇÃO

TITULOMÉTRICA

Amostras

% (m/m) teórica

% (m/m) dosada*

Cod100

18,0 13,6

Cod60

10,8 12,4

Cod30

5,4 6,5

Tod100

14,0 23,9

Tod60

8,4 9,0

Tod30

4,2 5,5

* Método de BLUMENKRANTZ; ASBOE-HANSEN, 1973

Os produtos da reação de oxidação a 60% também foram analisados por

cromatografia em camada delgada (CCD, FIGURA 31). Essa metodologia utilizando

padrões de ácido glucurônico e galacturônico como referências, revelou que tanto as

unidades de galactose quanto as de glucose foram parcialmente convertidas em

seus respectivos derivados urônicos, gerando então, em relação às demais

unidades, pequenas porcentagens de galacturonato e glucuronato, respectivamente,

como observado em manchas claras que foram apenas levemente coradas.

FIGURA 31 - PERFIL DE ELUIÇÃO EM CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DAS

AMOSTRAS PARCIALMENTE OXIDADAS (60%) DE XG DE TAMARINDO (LINHA 3,

TOD60) E COPAIFERA (LINHA 4, COD60). PADRÕES NEUTROS (LINHA 1) E

ÁCIDOS (LINHA 2) PARA COMPARAÇÃO

A fim de melhor compreender as alterações estruturais causadas pela

modificação química das XG, após a derivatização foram realizadas análises de

ressonância magnética nuclear de carbono-13.

As figuras 32, 33 e 34 representam os espectros de RMN-

C para as

amostras de XG nativas, copaifera oxidada e tamarindo oxidada, respectivamente.

Os deslocamentos químicos, segundo Freitas (2003), Martin (2003) e York (1993),

foram expressos em ppm baseados no da acetona

30,2 utilizada como padrão

interno.

(C)

(T)

FIGURA 32 - ESPECTRO DE RMN

C DE XGC (C) E XGT (T) EM H

O: D

O, A 70ºC.

DESLOCAMENTOS QUÍMICOS EXPRESSOS EM ppm

No espectro mostrado na figura 32 das XG de copaifera (C) e tamarindo (T)

foi possível assinalar os deslocamentos da região dos C-anoméricos correspondente

-Gal

(

104,3),

-Glc

da cadeia principal (

102,3) e

α−

Xyl

(

98,8). Na região

em campo mais alto, pode-se observar um sinal de intensidade muito baixa para

ambas XG em

60,4 referente ao C-6 livre de

-D-Gal

e em

66,7 e 66,4 sinais

correspondentes ao C-6 substituído das unidades de

-D-Glc

substituídas por

unidades de Xyl

e por Xyl

-Gal

, respectivamente. O deslocamento referente ao C-

6 livre das unidades de glucose não substituída (

62) está sobreposto ao do C-5 de

xiloses substituídas (

61,7), e os sinais de C-5 de xilose não substituídas

apareceram em

61,3 e 61,1.

Observaram-se diferenças entre os espectros das XG nativas (FIGURA 32) e

suas diferentes porcentagens de oxidação: 30%, 60% ou 100% (FIGURA 33 e 34),

principalmente, em relação às unidades de galactose presentes no polímero.

Analisando os espectros das figuras 33 e 34 observou-se, com base nos

deslocamentos da XG nativa, a diminuição relativa da intensidade do sinal atribuído

às unidades de galactose (

104,3;

60,4) e, em alguns casos, também às de

glucose (

102,2), em relação ao sinal de unidades de xilose (

98,8;

61,7;

61,3;

61,1. Isto pode ser evidenciado na região de C-1, onde o deslocamento em

104,3

ppm referente ao C-1 de unidades de galactose nos derivados oxidados apresentou

uma diminuição da intensidade quando comparado ao da respectiva amostra nativa

(FIGURA 32). Pode-se observar, também, a redução da intensidade do sinal em

60,4 referentes ao C-6 livre das unidades de

-Gal. A diminuição das intensidades

relativas, tanto em C-1 como em C-6 de galactose, principal unidade-alvo dessa

reação, foi maior nos derivados de maior oxidação, ou em ordem 100% > 60% >

30%; com diminuição significativa quando o derivado foi oxidado totalmente

(~100%).

(a)

(b)

(c)

FIGURA 33 - ESPECTRO DE RMN

C DE XILOGLUCANAS OXIDADAS DE SEMENTES DE C.

langsdorffii, EM H

O:D

O, A 70ºC: (a) OXIDAÇÃO DE 30%, COD30; (b) 60%, COD60;

100

(a)

(b)

(c)

FIGURA 34 - ESPECTRO DE RMN

C DE XILOGLUCANAS OXIDADAS DE SEMENTES DE T.

indica, EM H

O:D

O, A 70ºC: (a) OXIDAÇÃO DE 30%, TOD30; (b) 60%, TOD60 (c)

100%, TOD100. DESLOCAMENTOS QUÍMICOS EXPRESSOS EM ppm

Nos espectros dos derivados oxidados (FIGURAS 33 e 34) observou-se o

aparecimento de um novo sinal em

103,5 que pode ser atribuído ao C-1 de

101

unidades de ácido urônico

(TEIXEIRA

et al.

, 2007) formados durante a reação,

tanto galacturonato quanto glucuronato. Não foi possível assinalar em campo mais

baixo, o deslocamento entre

174-180 referente à C-6 carboxílico dos derivados

urônicos formados. Dessa forma, através das análises de dosagem colorimétrica,

CCD e RMN

C (respectivamente, TABELA 6, FIGURAS 31 e 32 a 34) foi possível

observar que a derivatização ocorreu efetivamente.

4.4 Análises reológicas das xiloglucanas

Para análise das XG em solução, primeiramente, foi determinada a

concentração crítica (c*) para analisá-las em solução diluída e sem a influência de

interações polímero-polímero.

Determinou-se a concentração crítica (c*) para que

fosse possível o estudo das XG em solução diluída, e assim analisá-las no intervalo

de concentração onde a influência da agregação do polímero fosse desprezível

(FREITAS, 2003). Através do gráfico que relaciona logaritmo de

como uma

função do logaritmo de (C x [

]), ou parâmetro de recobrimento, foi possível

determinar a concentração crítica (TABELA 7) por reologia e, também, através do

cálculo (equação 5, página 71) utilizando valores de M

e R

TABELA 7 - VALORES DE CONCENTRAÇÃO CRÍTICA (c*, g/L) PARA AS AMOSTRAS DE

XILOGLUCANA

Método

Amostras

Cálculo com M

e R

(1)

Viscosimetria

(2)

XGT

1,38 1,3

TKP

1,48 1,2

(1)

-por GPC, Viscotek 270 Dual Detector

(2)

-em Reômetro Haake RS 1, sensor DG 43

Os valores encontrados por técnica reológica e por GPC (TABELA 7) foram

muito próximos, uma vez que a agregação macromolecular gerou uma menor

influência na viscosidade da solução pela técnica reológica, quando comparada à

técnica de GPC (WANG

et al.

, 2001). Uma vez tendo-se determinada a c*, fez-se a

determinação da viscosidade intrínseca ([

]) para as amostras, utilizando-se

102

concentrações até valores inferiores ao da c*. Na figura 35 tem–se a

representação gráfica da determinação da viscosidade intrínseca para as amostras

de XGT e TKP. Não foi possível determinar os parâmetros de c* e viscosidade

intrínseca para XGC, pois a amostra apresentou-se heterogênea, ou seja, possui

mais de uma família de macromoléculas com diferentes massas molares.

0,0004 0,0006 0,0008 0,0010 0,0012

300

400

500

600

700

800

red

(mL/g)

Concentração (g/mL)

FIGURA 35 – REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA DETERMINAÇÃO DA VISCOSIDADE INTRÍNSECA

[η], EM mL/g, PARA A XGT (•) E TKP (▲), A 25ºC. AS AMOSTRAS FORAM

SOLUBILIZADAS EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO (28 mM) CONTENDO NaCl

(123mM), EM pH 7,4

Os valores encontrados para a viscosidade intrínseca foram de 609,4 e 359,8

mL/g para XGT e TKP, respectivamente. E foram inferiores aos relatados por Wang

et al.

(1996) para

Detarium

de 890 mL/g, mas similares aos observados por Freitas

(2003) em seu estudo com XG de

Hymenaea courbaril

e de

Tamarinrus indica

. A

amostra comercial, porém, apresentou valor inferior que pode ser decorrência de

processo de extração. Pelo cálculo dos valores das constantes de Huggins

(HUGGINS, 1942) como sendo 0,28 (XGT) e 0,51 (TKP) pode-se considerar que o

solvente utilizado é favorável à interação polímero-solvente, quando 0,8< k

< 0,3, e

não para polímero-polímero.

Quando uma molécula entra em movimento, em um fluxo laminar, devido à

uma velocidade de cisalhamento aplicada, os diferentes segmentos da molécula

movem-se com velocidades diferentes. Isto se deve ao gradiente de velocidade

causado pelo fluxo. Essa influência do gradiente de velocidade, com fluxos mais

rápidos e mais lentos causa a rotação da cadeia polimérica. Os movimentos

103

rotacionais e translacionais das cadeias moleculares causam atrito entre a

molécula e o solvente do sistema em estudo, e provocam o aumento da viscosidade

do solvente. A viscosidade intrínseca ([

]), que se refere à viscosidade em

concentração infinitamente diluída, tendendo a concentração nula, refere-se ao

movimento rotacional e translacional de apenas uma única molécula no sistema

(FREITAS, 2003).

4.5 Análise de homogeneidade e da massa molar

A caracterização macromolecular é importante para o estudo das aplicações

de polissacarídeos, e para isto a cromatografia de exclusão de tamanho acoplada a

detectores de espalhamento de luz apresenta-se como uma técnica adequada para

o seu estudo em solução, pois é rápida e exige pouca quantidade de amostra. A

incerteza considerada é de 3-5% para a determinação da massa molar ponderal

média (M

) e 5-10% para o raio de giro (R

). Uma outra grande vantagem deve-se

ao fato de se obter em um único ensaio a distribuição da massa molar completa

(ROGER; AXELOS; COLONNA, 2000). As amostras foram analisadas após a

ultrafiltração quanto a homogeneidade e seu grau de polidispersão (M

) através

dos detectores de índice de refração e espalhamento de luz laser. Calculou-se

também as massas molares ponderal média (M

), baseada na fração em massa das

moléculas de determinada massa molar, e a numérica média (M

), baseada no

número de moléculas, a viscosidade intrínseca ([

]), os raios de giro (R

) e

hidrodinâmico (R

) e a constante

de Mark-Houwink. Primeiramente, calcularam-se

experimentalmente os valores de d

para as amostras, sendo de 0,120 para XGC

e XGT e de 0,147 para TKP.

Todas as XG eluíram em volumes de retenção entre 9 e 12 mL (FIGURA 36).

A amostra XGC apresentou um pico largo pelo detector de índice de refração (em

vermelho, FIGURA 36, A) sendo possível observar a presença de dois picos, porém

com perfil mais homogêneo pela presença de um pico nos detectores RALLS e

LALLS (em verde e preto, respectivamente, FIGURA 36,A). Tal perfil por RI pode

sugerir, por exemplo, a presença de polissacarídeos e de complexos polissacarídeo-

104

proteína, fato já observado para outros polímeros (TEIXEIRA et al., 2007;

IAGHER; REICHER; GANTER, 2002). As amostras XGT (FIGURA 36,B) e TKP

(FIGURA 36,C) apresentaram perfil homogêneo e polidisperso, sendo a

polidispersão mais acentuada para TKP (1,21) do que XGT (1,05). Esta

polidispersão pode interferir na discrepância dos valores de [

] encontrados por

técnica cromatográfica e por reologia.

FIGURA 36 - PERFIL CROMATOGRÁFICO DA XILOGLUCANA DE SEMENTES DE C. langsdorffii

(A), T. indica (B) e TKP (C) POR DETECTORES DE ESPALHAMENTO DE LUZ A 90º

(VERDE, RALLS) E A 7º (PRETO, LALLS), E ÍNDICE DE REFRAÇÃO (VERMELHO),

EM mV, EM FUNÇÃO DO VOLUME DE RETENÇÃO, EM mL

Os cálculos dos dados foram realizados no

software

que acompanha o

equipamento e são mostrados na Tabela 8, onde são mostrados os valores de

massa molar ponderal média (M

); massa molar numérica média (M

); grau de

polidispersão (M

); raio de giro (R

); raio hidrodinâmico (R

); viscosidade

intrínseca ([

]

) determinada pelo detector viscosimétrico acoplado ao sistema

cromatográfico, a viscosidade intrínseca reológica ([

]

) determinada

experimentalmente e a constante de Mark-Houwink (

). Esses dados foram obtidos

105

para as amostras de XG após a solubilização, por 18 horas em água, a 25ºC.

Durante a eluição, as colunas foram mantidas em forno a 30ºC.

TABELA 8 - VALORES DE MASSA MOLAR, POLIDISPERSÃO, RAIO DE GIRO, RAIO

HIDRODINAMICO, VISCOSIDADE INTRÍNSECA E CONSTANTE α DE MARK-

HOUWINK PARA AS AMOSTRAS DE XILOGLUCANA

(1)

Amostras

/ M

(2)

[η

ηη

η]

(3)

[η

ηη

η]

(3)

αα

(4)

(A,a)

1,98 . 10

1,96 . 10

1,01 96,48

60,26

707,4

n.c.

XGC

(A,b)

8,48 . 10

3,8 . 10

2,23 59,18

36,72

427,7

n.c.

XGT

6,53 . 10

6,19 . 10

1,05 57,32

33,19

360,5

609,4

0,13

TKP

8,03 . 10

6,65 . 10

1,21 59,94

41,07

592,9

359,8

0,44

(1)

- por GPC Viscotek 270 Dual Detector, colunas PWxl 2500, 4000 e 6000, a 30ºC

(2)

- raio em nm

(3)

- viscosidade em mL/g

(4)

- constante α de Mark-Houwink

n.c.: não calculado

As amostras solubilizadas em água apresentaram altos valores de M

e M

, o

que é condizente com valores da literatura observados para XG de sementes de

courbaril

(~1 . 10

) e

T. indica

(~1,1 . 10

) (FREITAS, 2003),

A. africana

(8,2 . 10

)

(REN

et al.

, 2005),

C. langsdorffii

(7,8 . 10

) (STUPP, 2007). Em seus estudos

Freitas (2003) observou que as dimensões de uma macromolécula em solução não

podem ser definidas de forma absoluta, porque a forma do novelo molecular altera-

se em função do tempo e das interações polímero e solvente. O tamanho molecular

varia de molécula para molécula, mesmo com estruturas e massas moleculares

idênticas. Portanto, pode ser definido somente em termos de propriedades médias

(ROBINSON; ROSS-MURPHY; MORRIS, 1982; GIDLEY

et al.

, 1991; ROGER,

AXELOS; COLONNA, 2000; LUCAS; SOARES; MONTEIRO, 2001; CHENG;

FRINGANT; RINAUDO, 2002). As dimensões de uma molécula enovelada em

solução dependerão das interações polímero-solvente. Quando existe uma boa

interação entre o polímero e o solvente, as moléculas de solvente penetram

facilmente no novelo polimérico, expandindo-o. Com isto, o tamanho molecular é

bem maior do que seria se o novelo estivesse encolhido. Por outro lado, se as

interações entre as moléculas do solvente e as do polímero não forem muito

eficientes, o novelo polimérico tende a ficar menor, porque a tendência das

moléculas do solvente em penetrar no novelo é menor (LUCAS; SOARES;

MONTEIRO, 2001).

106

FIGURA 37 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA DISTÂNCIA PONTA A PONTA E RAIO DE

GIRAÇÃO

FONTE: LUCAS; SOARES; MONTEIRO (2001)

O tamanho que uma macromolécula assume em solução diluída é

denominado volume hidrodinâmico. Os principais parâmetros que definem o

tamanho molecular de uma macromolécula linear em solução são:

•

Distância ponta a ponta ou extremo a extremo quadrática média (r

): Ela

representa o módulo do vetor que conecta duas pontas de uma cadeia polimérica

(FIGURA 37) (PETKOWICZ, 1998). O termo r é definido como a distância entre as

extremidades da cadeia e só é valido para macromoléculas lineares (LUCAS;

SOARES; MONTEIRO, 2001).

•

Raio de giro (s ou R

) corresponde a raiz quadrática média entre um

elemento do polímero e seu centro de gravidade (PETKOWICZ, 1998). Assim,

conforme observado na figura 37, o raio de giro (R

) corresponde à distância entre o

centro de gravidade (O) e os raios que encontram os fragmentos de massa da

macromolécula do novelo. O raio de giro fornece informações sobre as dimensões

globais da cadeia e depende da distância ponta a ponta. Macromoléculas

ramificadas apresentam várias extremidades de cadeia e, portanto, o seu tamanho

molecular só pode ser definido pelo raio de giração (LUCAS; SOARES; MONTEIRO,

2001).

Exceto o primeiro pico a eluir de XGC (FIGURA 36,A,a), todas as XG

apresentaram valores próximos de R

(~58 nm) e R

(~36 nm) (TABELA 8),

indicando que são moléculas de dimensões semelhantes, apesar da XGC

apresentar-se heterogênea constituindo-se de duas famílias de macromoléculas. Em

107

geral, se 0<

< 0,5 considera-se a molécula uma esfera, valores de 0,5<

< 0,8

é encontrado para conformações de cadeias flexíveis de conformação ao acaso

(

random coil

), enquanto que 0,8<

< 1,0 para moléculas rígidas em forma de bastão

ou alongadas (MOREIRA

et al.

, 2004; HARDING, 2005), portanto a XGT (0,13) pode

ser considerada uma esfera e a TKP (0,44), um polissacarídeo de cadeia flexível ao

acaso.

4.6 Análise de fluorescência

Sendo o pireno uma molécula hidrofóbica com baixa solubilidade em água

(aproximadamente 0,3

M), espera-se, preferencialmente, sua localização em

domínios hidrofóbicos de moléculas anfipáticas (DOWLING; THOMAS, 1990).

Como o espectro de emissão de fluorescência do pireno é sensível à

polaridade do meio no qual está disperso, e sabendo-se que a banda I, em 373 nm,

tem a sua intensidade aumentada na presença de solventes polares e a banda III,

em 383 nm tem sua intensidade aumentada em solventes apolares, a relação das

intensidades de fluorescência de duas bandas vibracionais denominadas III e I pode

servir como um sensor de hidrofobicidade (FIGURA 38).

360 370 380 390 400 410 420 430

III

383nm

)

Intensidade de Fluorescência

Comprimento de onda (nm)

373nm

)

FIGURA 38 - ESPECTRO DE EMISSÃO DE FLUORESCÊNCIA DO PIRENO EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO (28 mM) CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4

108

A relação entre essas duas bandas é alterada quando ocorrem mudanças na

polaridade do sistema onde a sonda está inserida, no caso de polímeros, podendo

indicar alterações conformacionais ocorridas na molécula. Dentre outros motivos,

essa metodologia tem sido empregada em estudos do comportamento polimérico

em solução (KALYANASUNDARAM; THOMAS, 1977; VIEIRA

et al.

, 2003).

Analisando a emissão de fluorescência da sonda de pireno, foi possível

construir um gráfico em função da concentração crescente do polímero (FIGURA 39)

onde se pode atribuir o valor da concentração crítica de agregação, chamada

cac

(AMIJI, 1995), como sendo a concentração onde a curva muda sua tendência linear.

0,01 0,1 1

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Relação picos III/I

Concentração (mg/mL)

C= 0,068 mg/ml

FIGURA 39 - GRÁFICO DA RELAÇÃO ENTRE OS PICOS III/I DE EMISSÃO DE FLUORESCÊNCIA

EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DA XGC, EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO 28

mM CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4

Construindo-se os gráficos de cada XG e seus derivados foi possível

determinar a

cac

, como mostrado na tabela 9. Analisando os valores obtidos

observa-se que os menores valores de

cac

correspondem as XG nativas na ordem:

XGT < XGC < TKP. Após a oxidação houve alteração no valor de

cac

indicando

alteração conformacional na cadeia ou ainda repulsão intercadeias devido a

derivatização a -COOH, o qual estará desprotonado em pH 7,4. Com a oxidação de

30% o valor de

cac

aumentou, diminuiu com a oxidação de 60% e aumentou

novamente com a oxidação total ou 100%, isso indica que, entre os derivados, o de

109

60% de oxidação é o mais indicado para processo de encapsulamento de

moléculas hidrofóbicas tais como o pireno.

TABELA 9 - VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE AGREGAÇÃO CRÍTICA (mg/mL) DAS XG E

SEUS DERIVADOS OXIDADOS DETERMINADOS POR ESPECTROSCOPIA DE

FLUORESCÊNCIA, EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO (28 mM) CONTENDO NaCl

(123 mM), EM pH 7,4

Amostras

Concentração crítica (mg/mL)

XGC

0,068

Cod30

0,113

Cod60

0,060

Cod100

0,383

XGT

0,038

Tod30

0,176

Tod60

0,162

Tod100

0,191

TKP

0,090

As amostras nativas e os derivados de 60% de oxidação foram testados ao

longo de 24 horas, medindo-se a emissão de fluorescência das soluções em tempos

determinados (FIGURA 40). Nos perfis obidos para as amostras apresentados na

figura 40, após 8 horas, a TKP apresentou um máximo de hidrofobicidade indicando

o tempo no qual houve máxima incorporação do pireno, enquanto que XGC

apresentou um máximo entre 6 e 8 horas; e as demais, XGT, Tod60 e Cod60,

apresentaram um máximo a partir de 4 horas mantendo-se estável até 8 horas, com

decaimento após 24 horas, quando a solução é mantida em repouso.

A partir do estudo da incorporação do pireno nas soluções poliméricas foi

possível estabelecer um modelo para a incorporação de drogas hidrofóbicas e

prosseguir os estudos de encapsulamento efetivo e de liberação

in vitro

segundo o

que foi proposto por Xiong

et al.

(2005).

110

0 5 10 15 20 25

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Tempo (horas)

Relação entre picos III/I

FIGURA 40 - GRÁFICO DA RELAÇÃO ENTRE OS PICOS III/I DE EMISSÃO DE FLUORESCÊNCIA

EM FUNÇÃO DO TEMPO. XG EM SUAS CONCENTRAÇÕES CRÍTICAS DE

AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE

NaCl, pH 7,4: XGT (●), TOD60 (○), XGC (■), COD60 (□), TKP (▲)

4.7 Análise da conformação polimérica por dicroísmo circular

Realizou-se então análise de dicroísmo circular (CD) para verificar se havia

alteração da conformação das cadeias das XG nativas após a oxidação,

especialmente a 60% por apresentar o menor valor de

cac

. Como mostrado na

figura 42 o espectro de CD foi analisado de 190- 250 nm, pois as bandas típicas de

polissacarídeos encontram-se na faixa de 194-240 nm (SYNYTSYA

et al.

, 2007).

Esta é uma técnica muito difundida para a análise de proteínas e estudos

quantitativos de suas estruturas secundárias, porém também foi utilizada para

estudos com carragenanas dos tipos

ι−

- (SCHOELER

et al.

, 2006) e também

(NICKERSON; PAULSON; HALLET, 2004) e ainda alginato (AL-KHOURI, 2003),

quitosana (SYNYTSYA

et al.

, 2007) e arabinogalactana-proteína de milho

(KILISZEWSKI

et al.

, 1992). Buffington

et al.

(1980) em estudos com

galactomananas, observaram que o espectro de CD demonstrou clara dependência

da razão Gal:Man. Os carboidratos, quando em solução, ao contrário das proteínas

que formam estruturas definidas, como

-hélice e folha

, freqüentemente existem

como cadeias desordenadas, tanto estendidas como colapsadas, estruturas em

hélice também podem ocorrer com um grande número de unidades ao longo do eixo

111

da hélice; os de cadeia curta podem ser flexíveis ou relativamente rígidos

(STEVENS, 1996).

A figura 41 mostra o perfil característico de cada conformação que a molécula

pode apresentar em solução. O perfil de

-hélice apresenta máximo em,

aproximadamente 193 nm e mínimos em 208 e 223 nm, enquanto que estruturas em

folha

, se antiparalelas, tem máximo em 198 nm e mínimo em 215 nm e, se paralela

um máximo acentuado próximo de 205 nm com leve mínimo em 220 nm. As voltas,

turns

, são caracterizadas por ampla abertura, de 200 a 220 nm, da banda positiva

com máximo em 210 nm e banda negativa na região abaixo de 190 nm. Estruturas

do tipo poli (L-prolina) e ao acaso (

random coil)

apresentam perfil bastante

semelhantes.

FIGURA 41 - REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DO PERFIL CARACTERÍSTICO DAS POSSÍVEIS

ESTRUTURAS SECUNDÁRIAS ANALISADAS POR DICROÍSMO CIRCULAR

FONTE: SANSOM (2002)

No presente trabalho, foram analisadas amostras purificadas a fim de reduzir

o efeito do teor de proteínas, pois estas podem influenciar o perfil do espectro. Os

resultados das análises são apresentados na figura 42 onde foi possível observar

pouca ou até nenhuma influência da temperatura na variação da conformação,

exceto na amostra XGT (FIGURA 42,C) que sofreu maiores alterações no espectro

na temperatura de 5ºC quando comparada a 25 e a 37ºC. Após a oxidação de 60%

(FIGURA 42,B), a amostra de XGC, que não apresentava perfil característico de

hélice ou folha, mantendo sua conformação ao acaso (

random coil

) como a amostra

nativa (FIGURA 42,A).

112

200 210 220 230 240

250

-4

-3

-2

-1

Comprimento de onda (nm)

CD (miligraus)

(A)

200 210 220 230 240 250

-4

-3

-2

-1

Comprimento de onda (nm)

CD (miligraus)

07/10/08

(B)

200 210 220 230 240 250

-4

-3

-2

-1

Comprimento de onda (nm)

CD (miligraus)

07/10/08

(C)

200 210 220 230 240 250

-4

-3

-2

-1

Comprimento de onda (nm)

CD (miligraus)

(D)

200 210 220 230 240 250

-4

-3

-2

-1

CD (miligraus)

Comprimento de onda (nm)

(E)

FIGURA 42 - GRÁFICO DE DICROÍSMO CIRCULAR DOS POLISSACARÍDEOS, A 1 mg/mL EM

TAMPÃO SALINO, A 5 (LINHA PONTILHADA), 25 (LINHA SÓLIDA) E 37ºC (LINHA

TRACEJADA). (A): XGC; (B): COD60; (C): XGT; (D):TOD60; (E): TKP.

A XGT nativa (FIGURA 42,C), a 5ºC, apresentou bandas diferenciadas em

relação às outras temperaturas, com máximo em 198 nm e mínimos em 208 e

aproximadamente, 220 nm, indicando a influência de estruturas em hélice, as quais

promovem máximos e mínimos típicos; porém a 25 e a 37ºC ocorreu um

deslocamento da região de máximo para ~202 nm e mínimo em 220 nm

113

correspondente à maior contribuição de estrutura ordenada do tipo folha

, em

maiores temperaturas, ou seja, indicando a extensão da cadeia. Após a oxidação

parcial (Tod60, FIGURA 42,D) essa estrutura se tornou fortemente distorcida por

estruturas

random coil

, em todas as temperaturas testadas, ou seja, não apresentou

perfil característico de nenhuma das conformações típicas.

A estrutura ordenada da XGT, que pode ter contribuições de hélice observada

a 5ºC e folha

a 25 e 37ºC, possivelmente influenciou a viscosidade em solução

(609,4 mL/g) que apresentou valor maior que a TKP (359,8 mL/g) que tem estrutura

ao acaso. Comportamento semelhante foi observado para outro carboidrato, as

carragenanas, que em solução (SCHOELER

et al.

, 2006) as da família

apresentaram conformação ao acaso e não foram capazes de formar gel e as da

família

- adotaram conformação em hélice, a temperatura ambiente, conferindo

uma alta viscosidade à solução aquosa.

Os resultados obtidos por CD estão de acordo com os observados por GPC.

Ambos indicaram que a XGT tem conformação ordenada e compacta, com

elementos em hélice e folhas

determinados por CD, e valor da constante

Mark-Houwink, sugerindo uma esfera. Já a TKP pôde ser definida como uma cadeia

flexível e de conformação ao acaso, tanto por CD como também por GPC.

4.8 Análise das xiloglucanas por tensão superficial

Visto que a análise conformacional dos polissacarídeos não demonstrou

alterações significativas entre as XG nativas e oxidadas, considerando a diferença

de valores de concentração de agregação critica determinados por fluorescência,

realizou-se estudo da alteração da tensão superficial, comparativamente a da água,

frente aos polímeros, para se verificar a influencia das cargas dos polieletrólitos

formados na oxidação.

114

0,01832 0,13534 1

71,5

72,0

72,5

73,0

XGC

Cod30

Cod60

Cod100

Concentração (mg/mL)

Tensão superficial,

(mN/m)

O= 72,7

(A)

0,01832 0,13534 1

69,5

70,0

70,5

71,0

71,5

72,0

72,5

73,0

(B)

TKP

XGT

Tod30

Tod60

Tod100

Tensão superficial,

(mN/m)

Concentração (mg/mL)

O= 72,7

FIGURA 43 - GRÁFICO DA TENSÃO SUPERFICIAL EM FUNÇÃO DO LOGARITMO DA

CONCENTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS (EM mg/mL), EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4. (A): XGC(●),

COD30 (♦), COD60 (∆), COD100 (○) E (B): TKP (■), XGT (●), TOD30 (♦), TOD60

(∆), TOD100 (○)

Na figura 43 foi possível observar a influência do aumento da concentração

do polímero provocando uma leve diminuição da tensão superficial quando

comparada com o valor de referência de 72,7 mN/m da água. A dependência da

tensão superficial em função da concentração também foi observada para

polissacarídeos de gomas, como a de

A. tortuosa

e a arábica, as quais provocam

uma redução muito mais acentuada da tensão superficial, respectivamente 42,6 e

46,9 mN/m (MUÑOZ

et al.

, 2007; HUANG; KAKUDA; CUI, 2001). Gomas

alimentícias tendem a alterar a tensão superficial até valores entre 65 e 45 mN/m

(GARTI

et al.

, 1999).

115

Dentre as amostras de copaifera, a oxidação de 100% (Cod100) diminuiu

a tensão até 71, 3 mN/m, porém foi menos significativa que Tod30 que, a 2 mg/mL,

apresentou tensão de 69,7 mN/m (FIGURA 43).

A partir dessa análise foi possível afirmar que as cargas presentes nos

eletrólitos gerados pela reação química com TEMPO foram capazes de alterar a

tensão superficial do líquido, adicionalmente à modificação da conformação da

molécula, como no caso da XGT analisada por CD, indicando que ambos os efeitos

podem influenciar na organização da cadeia e na determinação da

cac

4.9 Análises das partículas de xiloglucanas por técnicas de microscopia

4.9.1 Análises por microscopia de força atômica

A partir da determinação da concentração de agregação crítica (

cac

) por

técnica de fluorescência (TABELA 9) procedeu-se a análise de microscopia de força

atômica em modo dinâmico (contato intermitente) utilizando silício como substrato

para visualização de partículas e/ou agregados e fibras numa área de 2 x 2

como pode ser visto nas figuras 44 a 48, na seqüência XGC, XGT, TKP, Cod60 e

Tod60. Através do tratamento das imagens no próprio

software

do equipamento foi

possível determinar o tamanho aproximado (largura) de algumas partículas e sua

respectiva altura (TABELA 10). Obteve-se também o

rms

, que pode ser usado como

parâmetro de comparação da rugosidade da superfície.

As seções realizadas nas imagens obtidas indicaram que todas as amostras

formam nanopartículas ou nanoagregados, ou seja, pequenos corpos esféricos de

60 até 190 nm (TABELA 10). A largura média dessas partículas indicou que a XGC

tem capacidade de formar partículas de tamanhos mais distintos, variando de 60 a

190 nm e, portanto de alto

rms

(1,685), seguida de TKP (

rms

= 1,457 nm) e Cod60

(

rms

= 1,417 nm) que apresentaram tamanho médio de partículas muito próximo, 110

e 97,5, respectivamente. As amostras XGT e Tod60 apresentaram largura média de

96,7 e 75 nm, respectivamente.

116

TABELA 10 - VALORES DE LARGURA E ALTURA, EM nm, A PARTIR DE IMAGENS DE

MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA PARA XG TESTADAS EM SUAS

RESPECTIVAS CONCENTRAÇÕES CRÍTICAS SOBRE SILÍCIO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO (28 mM) CONTENDO NaCl (123mM), EM pH 7,4

Área: 2 x 2 µ

µµ

µm

rms (nm)

seção

Largura (nm)

Altura (nm)

TKP 1,457 A-B a

140 13,46

110 8,05

C-D a

80 3,61

XGC 1,685 A-B a

60 1,64

C-D a

100 4,54

110 4,30

E-F a

190 27,37

XGT 1,049 A-B a

80 2,75

140 13,41

C-D a

70 2,48

Cod60

1,417 A-B a

110 5,84

80 4,47

C-D a

60 2,29

140 14,67

Tod60

0,631 A-B a

90 6,00

C-D a

60 1,49

Os menores valores de

rms

indicaram uma superfície mais plana e lisa

(KOSAKA

et al.,

2005), sendo o

rms

, em ordem crescente: Tod60, XGT, Cod60, TKP

e XGC. Alturas de até, aproximadamente, 27 nm (TBAELA 10) foram observadas

para XGC (FIGURA 44) indicando partículas agregadas e, provavelmente,

sobrepostas, o que pode ser evidenciado também por análises de microscopia

eletrônica de transmissão (FIGURAS 49 e 50).

Analisando-se as imagens (FIGURAS 44 a 48) foi possível observar que a

morfologia das diferentes XG foram muito semelhante, sendo os polissacarídeos as

esferas mais claras em relação ao fundo da imagem.

117

FIGURA 44 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA TOPOGRAFIA DE XGC SOBRE

SILÍCIO EM SUA CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4

FIGURA 45 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA TOPOGRAFIA DE XGT SOBRE

SILÍCIO EM SUA CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4

E-F

[nm]

28.55

0.00

1.99 [um]

0.00

A-B

[nm]

3.21

0.00

2.00 [um]

0.00

C-D

[nm]

6.52

0.00

2.00 [um]

0.00

2.00 [um]

A-B

[nm]

15.89

0.00

1.99 [um]

0.00

C-D

[nm]

3.21

0.00

1.96 [um]

0.00

2.00 [um]

118

FIGURA 46 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA TOPOGRAFIA DE TKP SOBRE

SILÍCIO EM SUA CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4

FIGURA 47 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA TOPOGRAFIA DE COD60 SOBRE

SILÍCIO EM SUA CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4

A-B

[nm]

16.69

0.00

2.00 [um]

0.00

C-D

[nm]

4.70

0.00

1.99 [um]

0.00

2.00 [um]

C-D

[nm]

16.71

0.00

2.00 [um]

0.00

A-B

[nm]

8.34

0.00

2.00 [um]

0.00

119

FIGURA 48 - IMAGEM E REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS DA TOPOGRAFIA DE TOD60 SOBRE

SILÍCIO EM SUA CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO

TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE NaCl, pH 7,4

4.9.2 Análises por microscopia eletrônica de transmissão

Realizou-se análise de microscopia eletrônica de transmissão para verificar a

morfologia das partículas de XG. A análise revelou partículas esféricas de tamanhos

variáveis de 14 a 50 nanômetros aglomerados em “cachos” de forma muito similar

para todas as XG (FIGURAS 49 e 50). A presença desses agregados complementou

os dados obtidos por AFM que evidenciaram pequenos corpos esféricos de

tamanhos variados e alturas que podem justificar a presença de moléculas

sobrepostas.

As imagens obtidas para as XG foram semelhantes às observadas por Ribeiro

et al.

(2008) em seus estudos com XG de sementes de jatobá, porém em um

sistema revestindo um nanocompósito contendo enalapril e composto inorgânico,

HDL (hidróxido duplo lamelar). Similarmente, observaram-se partículas em escala

nanométrica de tamanhos variados e heterogêneos.

C-D

[nm]

2.14

0.00

2.00 [um]

0.00

A-B

[nm]

6.55

0.00

1.98 [um]

0.00

2.00 [nm]

120

FIGURA 49 - IMAGENS POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO. (A): XGT

AUMENTO DE 150000X, (B): XGT AUMENTO DE 500000X, (C): TOD60 AUMENTO

DE 150000X, (D): TOD60 AUMENTO DE 500000X, (E): TKP AUMENTO DE 150000X

E (F): TKP AUMENTO DE 500000X. XG EM SUA CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE

AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE

NaCl, pH 7,4

121

FIGURA 50 - IMAGENS POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO. (A): XGC

AUMENTO DE 150000X, (B): COD60 AUMENTO DE 150000X E (C): COD60

AUMENTO DE 500000X. XG EM SUA CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DE

AGREGAÇÃO, EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO 28 mM CONTENDO 123 mM DE

NaCl, pH 7,4

4.10 Cultivo Celular

4.10.1 Avaliação da viabilidade celular

A avaliação da citotoxicidade foi realizada para relacionar as atividades

citotóxicas das XG nativas e modificadas em linhagens de células de fibroblasto de

tecido conjuntivo de adipócitos de origem não tumoral (L929). Nessa análise com

MTT o objetivo foi verificar se ocorreu morte celular após 24 horas de contato entre

células e amostra, comparativamente a um controle negativo (PBS) e a um controle

positivo (DMSO).

122

Como observado na figura 51, a amostra Tod60 apresentou maior

redução da viabilidade celular dentre todas as amostras, quando testadas a 0,5

mg/mL, porém de forma não estatisticamente significativa em relação ao PBS,

utilizado como controle negativo, ou seja, não interferiu na viabilidade das células e,

portanto, praticamente 100% das células permaneceram viáveis.

100

120

140

Amostras a 0,5 mg/mL

Viabilidade celular (%)

(A)

100

120

140

Amostras a 1,0 mg/mL

Viabilidade celular (%)

(B)

FIGURA 51 - VIABILIDADE DAS CÉLULAS L929 EM CONCENTRAÇÃO DE 0,5 mg/mL (A) E 1,0

mg/mL (B) EXPOSTAS POR 24 HORAS ÀS XG, UTILIZANDO COMO CONTROLES

NEGATIVO O TAMPÃO FOSFATO SALINO (PBS, pH 7,4) (CN) E O SOLVENTE (S) E

COMO CONTROLE POSITIVO (CP) DIMETILSULFÓXIDO (DMSO). GRÁFICO

REPRESENTADO POR MÉDIA ± DESVIO PADRÃO (N=4)

Todas as amostras apresentaram viabilidade igual ou superior ao próprio

solvente utilizado (água), assim como ausência de efeitos citotóxicos significativos

em ambas as concentrações, indicando baixa citotoxicidade aguda, com CL

(concentração letal de 50% das células em estudo) superior a 1 mg/mL. Os perfis de

citotoxicidade, em geral, foram semelhantes para as duas concentrações utilizadas,

estatisticamente semelhantes ao controle negativo e maior que a viabilidade celular

para o controle positivo.

Em estudos já reportados na literatura, polissacarídeos de semente de

tamarindo foram demonstrados como não mutagênicos (SIVASWAMY

et al.,

1991) e

também não tóxicos ou carcinogênicos em camundongos (IIDA

et al

., 1978), e ainda,

a administração oral em ratos B6C3F

, tanto machos quanto fêmeas, revelou que

não houve alterações clínicas relacionadas ao tratamento, à taxa de sobrevivência,

ao consumo de água ou comida, dados hematológicos ou altertação de peso dos

órgãos, demonstrando que o polissacarídeo não é tóxico e nem carcinogênico em

dietas em longo prazo (SANO

et al

., 1996).

123

4.11 Ensaio de liberação in vitro de camptotecina

Após a derivatização das XG nativas (XGT e XGC) a polieletrólitos

parcialmente oxidados (Tod60 e Cod60), realizou-se ensaio de encapsulamento e

liberação

in vitro

da camptotecina (CPT) isolada, solubilizada apenas em solução

tampão salina (PBS/NaCl), e solubilizada em soluções contendo XG

comparativamente à XG comercial (TKP).

Primeiramente, as soluções de XG em solução tampão salina foram

preparadas, em seguida foi adicionado 40% (m/m) de camptotecina em relação à

quantidade de xiloglucana (OPANASOPIT, 2006; WATANABE, 2006).

Tam Cop TKP Tod60 Cod60

XGC

encapsulamento (%)

Amostras

XGT

FIGURA 52 - GRÁFICO DA EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAMENTO DE CAMPTOTECINA POR

DIFERENTES XG: XGT (T. indica), XGC (C. langsdorffii), TKP (COMERCIAL),

TOD60 (XGT 60% OXIDADA), COD60 (XGC 60% OXIDADA). VALORES DA

MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)

O sistema foi mantido sob agitação magnética por 48 horas, centrifugado e

dosou-se por UV-Vis a eficiência de encapsulamento para prosseguir a liberação

in vitro

. As XG apresentaram eficiência de encapsulamento entre 19 (Tod60) e

42% (XGT), como observado na figura 52.

Procedeu-se a liberação

in vitro

da camptotecina em solução tampão salina

e em soluções poliméricas contendo xiloglucanas em concentrações 25% acima

da sua concentração crítica de agregação (

cac

), estabelecida com base em

estudo de Aiping

et al.

(2006) que observaram que com O-carboximetilquitosana

(OCMCS) ocorreu maior eficiência de encapsulamento de camptotecina em

concentração um pouco maior que a

cac

encontrada para o polímero (FIGURA

124

53). Segundo o estudo, esse resultado se deve ao fato de que abaixo da

cac

embora não se formem agregados em solução, as interações hidrofóbicas e as

ligações de hidrogênio podem existir entre as cadeias poliméricas e a

camptotecina, devido ao caráter anfifílico do derivado OCMCS. Esse caráter

anfifílico pode ser encontrado também nos derivados oxidados da XG, e já foi

reportado anteriormente por Nishinari e Takahashi (2003) que mesmo a XG nativa

de semente de tamarindo apresentava um balanço entre o caráter hidrofílico e

hidrofóbico facilitando as interações intermoleculares e, conseqüentemente,

possibilitando o encapsulamento de moléculas hidrofóbicas em seu interior ou

núcleo, também denominado “

core

”. Aiping

et al .

(2006) justificaram que as

interações facilitaram a camptotecina a se dissolver na solução de OCMCS, e

ainda que, na

cac

, moléculas e drogas hidrofóbicas podem ser solubilizadas no

“

core

“ interno dos agregados. Entretanto, em concentrações muito acima da

cac

se formaram agregados muito mais compactos que captaram uma quantidade

muito menor da droga, demonstrando que não apenas os agregados, mas

também a cadeia isolada é capaz de aumentar a solubilidade da camptotecina,

uma molécula hidrofóbica.

FIGURA 53 - ESQUEMA DAS INTERAÇÕES ENTRE A CAMPTOTECINA (CPT) E AS CADEIAS

DE O-CARBOXIMETILQUITOSANA (OCMCS)

FONTE: adaptado de AIPING et al.(2006)

Para assegurar que as moléculas de camptotecina estavam realmente no

“

core

” das cadeias de xiloglucana, determinou-se o espectro de emissão de

fluorescência com excitação a 369 nm comparativamente com a camptotecina

apenas em solução tampão salina e em soluções com xiloglucana. Pelos

resultados, mostrados na figura 54, observou-se um deslocamento do máximo da

emissão de fluorescência da solução de camptotecina apenas em solução tampão

salina e em soluções contendo as xiloglucanas. Este deslocamento da emissão

125

pode ser explicado pela mudança de ambiente do fluoróforo de hidrofílico para

hidrofóbico (LIU; LI, 2005; LAKOWICZ, 1999; AIPING

et al.

, 2006) confirmando a

localização de camptotecina inserida nas cadeias das diferentes xiloglucanas.

400 450 500 550 600

Intensidade de fluorescência

Comprimento de onda (nm)

443,8 nm

440 nm

FIGURA 54 - ESPECTRO DE EMISSÃO DE FLUORESCÊNCIA DA CAMPTOTECINA (CPT)

SOLUBILIZADA APENAS EM PBS/NaCl (PRETO) E EM SOLUÇÕES

CONTENDO AS DIFERENTES XG: XGT (T. indica, AZUL), XGC (C. langsdorffii,

VERMELHO), TKP (COMERCIAL, LARANJA), TOD60 (XGT 60% OXIDADA,

ROSA), COD60 (XGC 60% OXIDADA, VERDE)

O ensaio de liberação

in vitro

demonstrou que, comparativamente a

camptotecina apenas em solução tampão salina, todos os sistemas contendo

xiloglucanas promoveram uma liberação mais lenta da droga de modo muito

semelhante (FIGURA 55).

0 100 200 300 400 500 600

100

PBS/NaCl

XGT

XGC

TKP

Tod60

Cod60

Liberação (%)

Tempo (min)

FIGURA 55 - GRÁFICO DA LIBERAÇÃO IN VITRO DE CAMPTOTECINA (CPT) SOLUÇÃO

CONTENDO DIFERENTES XG: XGT (T. indica), XGC (C. langsdorffii), TKP

(COMERCIAL), TOD60 (XGT 60% OXIDADA), COD60 (XGC 60% OXIDADA); E

AINDA, APENAS EM PBS/NaCl, pH 7,4. VALORES DA MÉDIA +

DESVIO

PADRÃO (N=2)

126

Na ausência de XG, a camptotecina foi rapidamente liberada, sendo

totalmente liberada (100%) após 210 minutos, ou seja, 3 horas e 30 minutos,

enquanto que as soluções contendo XG prosseguiram a liberação prolongada até

24 horas após o seu início (TABELA 11) quando ainda não havia sido liberada

toda a droga.

Analisando-se os dados da tabela 11, observou-se que aproximadamente

75% da droga foi liberada, mesmo após 24 horas de ensaio (FIGURA 55), sendo

que o tempo necessário para que metade de toda a droga encapsulada fosse

liberada era muito maior (pelo menos, 314 minutos) do que quando a camptotecina

foi solubilizada apenas no solvente (93 minutos).

TABELA 11 - LIBERAÇÃO IN VITRO DE CAMPTOTECINA (CPT) POR DIFERENTES XG:

FRAÇÃO DE CPT APÓS 24 HORAS E TEMPO PARA LIBERAÇÃO DE 50% DE

CPT. VALORES DA MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)

CPT saturada em

24h

(%)

50%

(min)

PBS

100* 93

XGT

75,7 + 12,6 314

XGC

78,6 + 8,8 314

TKP

73,2 + 0,4 350

Tod60

74,3 + 6,0 357

Cod60

75,9 + 10,4 350

(*) ocorreu 100% de liberação após 210 minutos.

Em média, as soluções de XG testadas prolongaram a liberação em 244

minutos, ou seja, quase 4 horas. Todos os sistemas contendo XG puderam ser

considerados eficientes para a liberação prolongada de camptotecina, sendo o

melhor sistema aquele contendo XGT, pois apresentou maior eficiência de

encapsulamento (42%) e liberação lenta em relação ao controle de camptotecina

apenas em solução tampão salina.

127

4.12 Análise dos filmes de polissacarídeos por elipsometria e microscopia

de força atômica

Para avaliar a interação entre as XG e proteínas, estudou-se a interface entre

elas através da formação de filmes finos por meio da elipsometria e microscopia de

força atômica, sendo que foram realizados experimentos similares para as

xiloglucanas de copaífera (XGC), tamarindo (XGT), comercial (TKP) e a xiloglucana

de tamarindo 60% oxidada (Tod 60). As amostras XGC, XGT e TKP foram

solubilizadas em tampão fosfato 28 mM em pH 7,4 contendo NaCl 123 mM e

mantidas em contato com o silício puro por, aproximadamente, 18 horas. A amostra

Tod60, que apresentou os melhores resultados dentre os materiais oxidados, foi

solubilizada em HCl pH 4 em solução contendo NaCl 10 mM e depositada sobre

silício amino-funcionalizado com APS (3-aminopropiltrimetoxisilano).

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

(A)

D (nm)

Concentração (mg/mL)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

(B)

D (nm)

Concentração (mg/mL)

FIGURA 56 - VALORES MÉDIOS DA ESPESSURA (D) DETERMINADOS PARA A CAMADA DE

ADSORÇÃO DE (A) XGT (■), TKP (○) E XGC (∆) SOBRE SILÍCIO, EM pH 7.4 E (B)

TOD60 (□) SOBRE SILÍCIO AMINO FUNCIONALIZADOS, EM pH 4. AS LINHAS

PONTILHADAS SÃO GUIAS PARA VISUALIZAÇÃO. VALORES DA MÉDIA +

DESVIO

PADRÃO (N=2)

O comportamento de adsorção das XG sobre superfície sólida (JO

et al.

2008) foi avaliado pela determinação da espessura (D) da camada adsorvida, por

elipsometria. A isoterma de adsorção desses polissacarídeos (FIGURA 56) mostrou

que a TKP foi a xiloglucana que apresentou uma maior adsorção no silício puro,

fornecendo a camada mais espessa (4,1 +

0,2 nm), quando comparada com as

outras XG, seus valores de espessura aumentaram continuamente em

concentrações crescentes do polissacarídeo, até 1,5 mg/mL, indicando a formação

128

de multicamadas ou adsorção de agregados. Assim como muitos outros

polissacarídeos, XG é hidrossolúvel, porém, individualmente, a macromolécula tende

a não se hidratar completamente, e conseqüentemente, agregados permanecem

presentes, mesmo em soluções muito diluídas (PICOUT

et al.

, 2003).

FIGURA 57 - IMAGENS DE AFM DOS FILMES DE XG ADSORVIDAS SOBRE SILÍCIO, EM pH 7,4.

TKP (A, B, C), XGT (D, E, F) E XGC (G, H, I). IMAGENS DE FASE (ESQUERDA),

TOPOGRAFIA (CENTRO) E AS ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO

TRANSVERSAL (DIREITA), ÁREAS VARIANDO DE 2,5 X 2,5 A 2 X 2 µm

A elipsometria fornece a espessura média dos filmes, mas não os detalhes

topográficos da camada adsorvida. Com isso a AFM se torna uma técnica

complementar ideal para a caracterização dos filmes formados.

129

As figuras 57A e B correspondem a imagens de fase e topografia,

respectivamente, obtidas para TKP adsorvida sobre silício e sua correspondente

análise da seção transversal (FIGURA 57C). A presença de grandes agregados

distribuídos sobre um filme homogêneo explica a tendência observada para o

crescente aumento da espessura (D) com a concentração de TKP. Tais agregados

podem já estar presentes na solução em equilíbrio com cadeias livres. Imergindo o

substrato de silício dentro da solução de TKP, agregados e cadeias livres adsorvem

sobre a superfície. O valor médio da espessura para XGT e XGC sobre o silício

aumentou com a concentração de XG até um patamar de 1,5 +

0,3 nm e 0,8 + 0,2

nm, respectivamente. Para ambos o patamar encontrou-se em 1 mg/mL. As figuras

57D e G revelaram a presença de pequenos grupos e minúsculas fibras adsorvidas

sobre o silício. Ligações de hidrogênio entre a superfície dos grupos silanol e dos

grupos hidroxila das XG provavelmente direcionaram a adsorção de XGT, XGC e

TKP sobre o substrato de silício (SIERAKOWSKI, 2002; 2007).

Enquanto os detalhes topográficos de XGT (FIGURA 57E, F) mostraram uma

camada uniforme com agregados espalhados sobre a superfície, os de XGC

(FIGURA 57H, I) evidenciaram grandes agregados isolados bem como densas

fibras.

FIGURA 58 - IMAGENS DE AFM DO FILME DE TOD60 ADSORVIDA SOBRE SILÍCIO AMINO-

FUNCIONALIZADO, EM pH 4. IMAGENS DE FASE (ESQUERDA), TOPOGRAFIA

(CENTRO) E AS ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL

(DIREITA), ÁREA DE 2 X 2 µm

Entre os derivados oxidados Tod60 foi escolhido para as etapas seguintes

devido à melhor deposição do filme e reprodutibilidade. A figura 56B mostra o valor

da espessura média (1,9 +

0,2 nm) determinada para a camada adsorvida sobre

substrato amino-funcionalizado, em pH 4 em função da concentração de Tod60. Por

130

AFM (FIGURA 58) observou-se a formação de uma camada muito mais

homogênea, constituída de esferas muito menores que as observadas no caso da

XG nativa (XGT, FIGURA 57D,E). Esses resultados, similarmente aos de XGT,

mostraram uma tendência de aumento contínuo da espessura com a concentração

da solução, indicando a agregação ou formação de multicamadas. Nesse caso,

interações eletrostáticas entre grupamentos amino da superfície, os quais estão

protonados em pH 4, e grupos carboxilatos pertencentes à cadeia de Tod60

puderam direcionar a adsorção (SIERAKOWSKI, 2002; 2007; FUJIMOTO, 2001;

MACIEL, 2007).

Pelo teste de dessorção, não ocorreu diminuição significativa na espessura do

filme, em análise por elipsômetro, portanto nenhuma das amostras dessorveu

quando em contato com água, por 24 horas, indicando que a adsorção das XG

sobre o silício foi irreversível.

Sendo os carboidratos uma parte essencial de sistemas de reconhecimento

biológico (JELINEK; KOLUSHEVA, 2004), testou-se a imobilização de proteínas, tais

como a BSA, a ConA e as presentes na superfície viral.

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5

(A)

D (nm)

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5

(B)

D (nm)

FIGURA 59 - ESPESSURA MÉDIA (D) DA SOLUÇÃO DE BSA ADSORVIDA EM: (A) TPK (●) E XGT

(■) RECOBRINDO SUPERFÍCIE DE SILÍCIO, EM pH 7,4 E (B) TOD60 (▲)

RECOBRINDO SUPERFÍCIE DE SILÍCIO AMINO-FUNCIONALIZADO, EM pH 4. AS

LINHAS PONTILHADAS SÃO GUIAS PARA VISUALIZAÇÃO. VALORES DA MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)

Para a imobilização de BSA comparativamente a XG comercial (TKP)

escolheu-se a XGT e, dentre as amostras oxidadas, a Tod60. Para o teste de

imobilização de proteína sobre os filmes de polissacarídeo solubilizou-se a BSA em

água contendo NaCl 10 mM e variou-se o pH.

131

A imobilização de BSA (1 mg/mL) sobre a camada de XGT em função da

variação do pH foi comparada com as superfícies recobertas com TKP, em pH 7,4 e

24 + 1ºC, como mostrado na figura 59A. No caso da adsorção de BSA sobre a

superfície recoberta com TKP observou-se uma curva típica em forma de sino, com

máximo em pH 6. Geralmente o máximo coincide com o pI da proteína

(SIERAKOWSKI

et al.

, 2002), que, nesse caso, é 5,5 (CARTER; HO, 1994). Esses

resultados indicaram que a superfície de TKP induziu alterações no potencial de

superfície da BSA ou poderia estar contaminada com outros componentes, como por

exemplo, outras proteínas, as quais poderiam se ligar a BSA por forças não-

eletrostáticas. Um suave máximo de adsorção no pI da BSA foi observado quando

uma camada de XGT foi usada como suporte para a proteína. No pI da BSA a

somatória das cargas é zero e a adsorção sobre superfícies não carregadas foi

favorecida (NORDE, 1989).

Imagens de AFM obtidas para a BSA sobre camadas de XGT e TKP, em pH

7,4 (FIGURA 60A,B e D,E, respectivamente) apresentaram-se muito semelhantes

entre si e os valores da espessura média por elipsometria e AFM mostraram-se

condizentes com as imagens que evidenciaram a presença de pequenos corpos

esféricos, os quais foram atribuídos à BSA, e o desaparecimento das pequenas

fibras previamente observadas na figura 57D, para XGT e dos grandes agregados

na figura 57A, para TKP. E ainda devido ao fato da superfície observada nas figuras

57D e E serem mais rugosas que aquela da figura 59 de acordo com valores de

rms

verificando-se que a adsorção da BSA sobre o filme de XGT provocou o

achatamento da superfície. As informações apenas da AFM não provaram que as

moléculas de BSA adsorveram sobre XG, mas complementaram os dados de

elipsometria que demonstraram um aumento na espessura da camada após a

adsorção da proteína (FIGURA 59).

A adsorção da BSA apresentou um comportamento muito peculiar quando

sobre filme de Tod60 (FIGURA 56G,H). A espessura de adsorção permaneceu

constante (D= 5,2 +

0,2 nm) na faixa de pH entre 4,0 e 5,2. Em pH maior que 5,2,

próximo do pI da BSA, a adsorção foi reprimida. Uma explicação razoável para esse

efeito considera a repulsão eletrostática entre os grupos carboxilatos presentes em

Tod60 e cargas negativas presentes na superfície da proteína, as quais resultaram

das condições de pH mais elevado.

132

FIGURA 60 - IMAGENS DE AFM DA ALBUMINA, EM pH 5, IMOBILIZADA SOBRE SILÍCIO

RECOBERTO COM FILMES DE XG, EM pH 7,4. XGT (A, B, C), TKP (D, E, F) E

TOD60 (G, H, I). IMAGENS DE FASE (ESQUERDA), TOPOGRAFIA (CENTRO) E

AS ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL (DIREITA),

ÁREAS VARIANDO DE 2,2 X 2,2 A 2 X 2 µm

Além da BSA, foi testada também a adsorção de ConA (concanavalina A), em

solução contendo Ca

e Mn

, pH 5, sobre os filmes de XG de tamarindo nativo e

comercial. A ConA é uma lectina que tem afinidade de ligação com unidades de

-manose e

-glucose, sendo os íons Ca

e Mn

necessários para esta

atividade. A ConA se dissocia em dímeros em pH 5,6 ou abaixo desse valor,

enquanto existe como tetrâmero em pH entre 5,8 e 7 e, acima formam-se agregados

(Sigma Aldrich, 2008).

133

TABELA 12 - VALORES DA ESPESSURA MÉDIA, EM nm, DETERMINADOS POR

ELIPSOMETRIA PARA A LECTINA CONCANAVALINA A (ConA) SOBRE

FILMES DE XG, E TAMBÉM NA PRESENÇA DE MANOSE. VALORES DA

MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)

XGT sobre Si, pH 7,4

TKP sobre Si, pH 7,4

0,73 + 0,01*

1,3 +

0,43*

ConA, pH 5

5,17 + 0,04 3,92 + 0,64

ConA, pH 5 + manose

4,12 + 0,3 4,89 + 0,49

*- espessura média dos filmes de polissacarídeo sobre silício (N=4)

Moléculas de ConA foram capazes de adsorver sobre filmes de XGT e TKP

(FIGURA 61) formando camadas de espessura média de 5,17 +

0,04 e 3,92 + 0,64

nm, respectivamente (TABELA 12), assim como já demonstrada a adsorção de

ConA e DAlt, lectina de

Dioclea altíssima

, sobre filmes de sistemas binários

contendo XG e alginato (PEREIRA

et al.

, 2008).

FIGURA 61 - IMAGENS DE AFM DA CONCANAVALINA A (ConA), EM pH 5, IMOBILIZADA SOBRE

SILÍCIO RECOBERTO COM FILMES DE XG, EM pH 7,4. XGT (A, B) E TKP (C,D).

IMAGENS DE TOPOGRAFIA E AS ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO

TRANSVERSAL, ÁREA DE 2 X 2 µm

As imagens e gráficos da topografia, por AFM, da camada adsorvida de ConA

sobre XGT (FIGURA 61A, B) e TKP (FIGURA 61C, D) mostraram que a superfície

134

ficou recoberta por pequenas esferas, em branco, com alturas de valores

próximos aos obtidos por elipsometria, de acordo com as seções transversais

(FIGURA 61B, D), evidenciando que os dímeros de ConA adsorveram sobre o

suporte de polissacarídeos, uma vez que suas dimensões corresponderam a 3,0 x

4,5 x 7,5 nm (REEKE

et al.

, 1975).

Para analisar a afinidade de ligação entre a lectina e XG pelo sítio de

reconhecimento de açúcares, testou-se a adsorção de ConA em solução com

manose (50 mM).

FIGURA 62 - IMAGENS DE AFM DA CONCANAVALINA A (ConA), EM pH 5, CONTENDO 50 mM

DE MANOSE, IMOBILIZADA SOBRE SILÍCIO RECOBERTO COM FILMES DE XG,

EM pH 7,4. XGT (A, B) E TKP (C, D). IMAGENS DE TOPOGRAFIA E AS ANÁLISES

CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL, ÁREA DE 2 X 2 µm

Verificou-se que o monossacarídeo não inibiu a adsorção sobre os filmes de

XGT e TKP (FIGURA 62) e, também não alterou significativamente a espessura da

camada adsorvida quando medida por elipsometria (TABELA 12), indicando que a

ligação lectina-XG ocorreu por sítio diferente daquele que tem afinidade por manose.

A elevada afinidade das lectinas a unidades de açúcares foi atribuída à organização

multivalente e espacial dos ligantes (MONSIGNY

et al.

, 2000).

135

Lectinas geralmente exibem forte ligação a carboidratos específicos

(glicanas) e essa propriedade tem sido amplamente explorada como base para o

design

de biosensores (JELINEK; KOLUSHEVA, 2004). Lectinas também exibem

elevado potencial em indústrias de biotecnologia, assim como na segurança de

alimentos, suas propriedades únicas de reconhecimento têm encontrado aplicações

promissoras na detecção de microorganismos e carboidratos como aditivos

alimentares. Dados já descritos sugeriram que o uso de algumas lectinas pode

fornercer um método alternativo simples e rápido para análise e

screening

bactérias (PATEL, 1992). Técnicas imunossupressoras baseadas em lectinas são

rotineiramente usadas para detectar patógenos e espécies virais que expressam

alguns carboidratos de superfície. Por exemplo, o método ELISA (do inglês,

enzime-

linked immunosorbent assay

) utilizando lectinas imobilizadas foi desenvolvido para a

detecção de vírus da imunodeficiência humana, o HIV (MAHMOOD; HAY, 1992).

A capacidade de adsorção de biomoléculas sobre os filmes de

polissacarídeos deste estudo motivou o teste de outras moléculas mais complexas,

como o vírus da dengue, já estudado por Pereira

et al.

(2008) em sistemas

XG/alginato. A dengue é um dos principais problemas de saúde pública no mundo. A

Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que entre 50 a 100 milhões de

pessoas se infectem anualmente, em mais de 100 países, de todos os continentes,

exceto na Europa. Cerca de 550 mil doentes necessitam de hospitalização e 20 mil

morrem em conseqüência da dengue (BRASIL, 2008). Então, devido a grande

importância em saúde pública, a busca de alternativas para o desenvolvimento de

kits de diagnóstico rápido para a dengue se torna uma interssante área de estudo.

Foram testados também três diferentes sorotipos do vírus da dengue (DENV-

1, 2 e 3), solubilizados em PBS pH 7,2, sobre filmes de XG, para verificar a afinidade

de algum dos sorotipos com os polissacarídeos ou a especificidade entre eles, e

ainda, testou-se a adsorção do vírus sobre a ConA imobilizada sobre as XG e sua

inibição na presença de manose (50 mM), pois a ConA tem afinidade de ligação por

açúcares e o vírus apresenta glicoproteínas (proteína E, do envelope viral) na sua

superfície. Os testes foram realizados em duplicata.

Os vírus DENV-1, DENV-2 e DENV-3 adsorveram sobre os filmes de XGT e

TKP formando espessuras médias entre 0,65 +

0,14 e 4,66 + 0,42, sendo que o

DENV-3 foi o que apresentou a adesão mais fraca (0,9 nm)

136

XGT TKP TOD60

D (nm)

Amostras

DENV-1

DENV-2

DENV-3

FIGURA 63 - ESPESSURA MÉDIA (D) DO FILME OBTIDO PARA DIFERENTES SOROTIPOS DO

VÍRUS DA DENGUE (DENV-1, 2 E 3) SOBRE XG NATIVAS, XGT E TKP,

ADSORVIDAS SOBRE SILÍCIO, pH 7,4; E XG OXIDADA, TOD60, ADSORVIDA

SOBRE SILÍCIO AMINO-FUNCIONALIZADO, EM pH 4. VALORES DA MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)

O gráfico da figura 63 mostrou que, os sorotipos 1 e 2 apresentaram maior

afinidade por dois dos polissacarídeos testados (TKP e XGT) quando comparados

com o polissacarídeo carregado negativamente, Tod60, que foi seletivo para o

sorotipo 2, pois apresentou espessura média negligenciável para o DENV-1 e nula

para DENV-3. Entretanto, de acordo com os valores apresentados na tabela 13,

houve maior afinidade entre o sorotipo 2 e TKP observando-se a formação de um

filme mais espesso, o que poderia ser esperado devido à formação de agregados de

TKP sobre o silício (FIGURA 57A) . As imagens de AFM do vírus da dengue sorotipo

2 sobre as XG nativa e oxidada são mostradas na figura 64.

TABELA 13 - VALORES DA ESPESSURA MÉDIA DE ADSORÇÃO, EM nm, DETERMINADOS

POR ELIPSOMETRIA, PARA O VÍRUS DA DENGUE (DENV-1, 2 E 3) SOBRE

FILMES DE XG. VALORES DA MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=2)

XGT em Si, pH 7,4

TKP em Si, pH 7,4

Tod60 em APS, pH 4

1,56 + 0,24*

2,0 +

0,56* 1,94 + 0,38*

DENV-1, pH 7,2

1,78 + 0,24 2,42 + 0,34 0

DENV-2, pH 7,2

3,2 + 0,09 4,66 + 0,42 2,42**

DENV-3, pH 7,2

0,65 + 0,14 1,31 + 0,02 0

*- espessura média dos filmes de polissacarídeo sobre Si ou Si-APS (N=6)

**- valor único (N=1)

Os agregados de XG sobre silício observados por AFM (FIGURA 57C, F)

apresentaram espessura que variavam entre 1 e 10 nm, aproximadamente, e após a

137

adsorção das partículas virais a espessura passou para valores entre 15 e 80

nm (FIGURA 64C,F), indicando sobreposição de mais de uma partícula viral, como

pode ser visto nas figuras 64A e D, onde a superfície foi completamente recoberta

por vírus.

Imagens de TEM obtidas para DENV-2 evidenciaram dois diâmetros típicos,

um de 50 nm, que compreende um centro mais eletrodenso de 30 nm e um

envelope lipídico, e outro de 14 nm, correspondentes à partícula viral e às partículas

de hemaglutinina sedimentadas (HAS), respespectivamente (LINDENBACH; RICE,

2003). Portanto, devem ser considerados vírus as partículas esféricas de diâmetro

próximo de 30 nm, já que o envelope lipídico provavelmente colapsa durante a

secagem; e as estruturas menores, que variam de 10 a 15 nm, podem ser atribuídas

às partículas de hemaglutinina sedimentadas (PEREIRA

et al.

, 2008).

A especificidade de adsorção entre DENV-2 e Tod60 pode estar relacionada a

diferenças nas glicoproteínas E (envelope) e M (membrana) (BOCK; GOODE, 2006)

deste sorotipo com os outros, visto que a proteína E é constituída por 3 domínios,

dentre os quais existem dois sítios potenciais para a ligação de carboidratos. Esses

resultados indicaram que a adesão das partículas de DENV-2 sobre Tod60 pode ser

mediada por (1) ligações de hidrogênio entre resíduos polares da proteína E e

grupos hidroxila presentes na cadeia da XG e (2) interações eletrostáticas entre

resíduos positivamente carregados da proteína E e grupos carboxílicos presentes no

derivado oxidado. O mesmo comportamento foi observado em interações entre

alginato e vírus da dengue (PEREIRA

et al.

, 2008), assim como polissacarídeos

negativamente carregados, como as carragenanas, podem formar superfícies

adequadas para a adsorção destes sorotipos, já que inibem a multiplicação viral em

células de mamíferos através do bloqueio da fusão celular (TALARICO; DAMONTE,

2007).

138

FIGURA 64 - IMAGENS DE AFM DO VÍRUS DA DENGUE (DENV-2), EM pH 7,2, ADSORVIDO

SOBRE SILÍCIO RECOBERTO COM FILMES DE XG, EM pH 7,4. XGT (A, B, C), TKP

(D, E, F) E TOD60 (G, H, I). IMAGENS DE FASE (ESQUERDA), TOPOGRAFIA

(CENTRO) E AS ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL

(DIREITA), ÁREA VARIANDO DE 2,5 X 2,5 A 2 X 2 µm

O sorotipo 2, que apresentou maior afinidade pelas XG, foi testado sobre

ConA imobilizada sobre filmes recobertos com XGT e TKP, sendo as espessuras

médias, por elipsometria, de 0,93 +

0,22 e 2,78 + 0,65, respectivamente (TABELA

14). As imagens topográficas obtidas para os vírus adsorvidos sobre ConA

imobilizadas sobre filmes de XG apresentaram aspecto semelhante, como visto na

figura 65. Foi possível observar estruturas grandes de 25 a 40 nm distribuídas sobre

a área analisada de 2 x 2

139

TABELA 14 - VALORES DA ESPESSURA MÉDIA DE ADSORÇÃO, EM nm, DETERMINADOS

POR ELIPSOMETRIA, PARA O VÍRUS DA DENGUE (DENV-2) ADSORVIDO

SOBRE CONCANAVALINA A (ConA) IMOBILIZADA SOBRE FILME DE XG.

VALORES DA MÉDIA +

DESVIO PADRÃO (N=4)

ConA, pH 5, sobre filme de

XGT em Si, pH 7,4

TKP em Si, pH 7,4

4,17 + 0,76

4,07 + 0,96

DENV-2, pH 7,2

0,93 + 0,22 2,78 + 0,65

DENV-2, pH 7,2 + manose

1,22 +

0,37

FIGURA 65 - IMAGENS DE AFM DO VÍRUS DA DENGUE (DENV-2), EM pH 7,2, ADSORVIDO

SOBRE CONCANAVALINA A (ConA), EM pH 5, IMOBILIZADA SOBRE FILME DE

XG, EM pH 7,4. XGT (A, B) E TKP (C, D). IMAGENS DE TOPOGRAFIA E AS

ANÁLISES CORRESPONDENTES À SEÇÃO TRANSVERSAL, ÁREA DE 2 X 2 µm

Por sua conhecida especificidade de ligação com a manose (LIS; SHARON,

1998), a ConA foi testada juntamente com os vírus e 50 mM de manose. Pelos

valores da tabela 14, foi possível concluir que essa concentração de manose pode

inibir a adsorção das partículas virais e até mesmo suprimir sua adesão ao filme,

sugerindo, então, que a interação vírus-ConA provavelmente ocorreu pelo

reconhecimento do sítio manose-ligante. Quando os sítios de ligação da lectina

estavam ocupados por manose, as proteínas E não foram capazes de reconhecer

esses sítios na superfície e não ocorreu a adesão.

140

As proteínas E e M estão inseridas na membrana do vírus e nos estágios

iniciais da infecção, especialmente a proteína E tem função muito importante por

conter um sítio de ligação ao receptor celular. O processo inicial da adesão viral à

célula torna-se, então, alvo de estudos para o desenvolvimento de estratégias

diagnósticas e investigação de novos materiais.

O estudo da interface carboidrato-proteína possibilita maior conhecimento

desse tipo de interação como uma alternativa para futuras aplicações efetivas

desses polissacarídeos como materiais promissores, principalmente para o

desenvolvimento de biosensores.

4.13 Análise do ângulo contato dos filmes

Após a determinação da espessura dos filmes de polissacarídeo sobre silício,

por elipsometria, analisou-se a alteração da hidrofilicidade/hidrofobicidade do

substrato a partir da capacidade das XG de modificar a superfície recoberta. A

molhabilidade do silício utilizando a água MilliQ, testada como controle, gerou ângulo

de 5º. O ângulo de contato sobre o filme recoberto com XGC resultou em 38º, o

menor valor entre as XG testadas, e 45º para XGT; além da modificação da

superfície, a alteração do ângulo de contato pode estar relacionada à espesurra do

filme formado (D), pois no caso de TKP, que gerou a camada mais espessa, foi

observado o maior ângulo de contato, 59º (FIGURA 65). E a superfície pode ser

considerada hidrofóbica e, portanto, ocorre menor adesão da água na superfície do

filme. Dessa forma, a orientação que a macromolécula adotou durante o processo

da adsorção sobre o suporte silício gerou um filme com superfície externa exposta a

outros processos mais hidrofóbico para o caso da TPK. Para a XGC se observou

que a presença de mais unidades laterais de galactose na estrutura do

polissacarídeo, as quais são responsáveis pela solubilização da XG e sua interação

com a água, na adsorção ficaram expostas para o lado externo do filme gerando a

maior hidrofilicidade dessa superfície.

141

XGC XGT TKP

Espessura (nm)

Ângulo de

contato (º)

Amostras a 1 mg/mL em tampão

FIGURA 66 – ÂNGULO DE CONTATO (■) DA ÁGUA SOBRE FILME OBTIDO PARA DIFERENTES

XG COMPARADO À ESPESSURA (∆) DO FILME FORMADO SOBRE SILÍCIO. XGT

(T. indica), XGC (C. langsdorffii), TKP (COMERCIAL).

142

5 CONCLUSÕES

A fim de desenvolver nanoestruturas para aplicações biotecnológicas, as

xiloglucanas de diferentes fontes foram caracterizadas química e físico-

químicamente para comparar a relação entre as estruturas e as aplicações. Com a

adição de função carboxílica, por modificação química, foi observada a capacidade

de alterar as características do sistema através de medidas por espectroscopia de

fluorescência, dicroísmo circular e tensão superficial. Conclui-se que as xiloglucanas

foram capazes de constituir nanoesferas que foram utilizadas para o

encapsulamento e para os ensaios de liberação

in vitro

da camptotecina, um

antineoplásico, sendo que o polissacarídeo extraído da semente de tamarindo foi

capaz de produzir um encapsulamento eficiente e de prolongar a liberação da droga.

Outra aplicação foi no desenvolvimento de filmes finos, na ordem de nanômetros,

recobrindo superfícies do silício. O recobrimento do substrato por xiloglucanas e

ainda a imobilização de albumina bovina, da concanavalina A e de partículas virais

ocorreu efetivamente, sendo que um dos tipos virais, DENV-2, apresentou maior

afinidade pelos nanofilmes de polissacarídeos neutros e especificidade pelo

derivado modificado por oxidação. Dessa forma, os resultados obtidos através da

interação na interface carboidrato-proteína sugeriram que esses biopolímeros

poderiam ser empregados como biomateriais, para o incremento de biosensores e

dispositivos biotecnológicos como, por exemplo, para a montagem de kits de

diagnóstico rápido para a dengue com custo reduzido.

143

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174

DOCUMENTOS CONSULTADOS

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Normas para

apresentação de documentos científicos, 2. Teses, Dissertações, Monografias

e Outros Trabalhos Acadêmicos.

2. ed. Curitiba: Editora UFPR, 2007.

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Normas para

apresentação de documentos científicos, 3. Citações e notas de rodapé.

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Curitiba: Editora UFPR, 2007.

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apresentação de documentos científicos, 4. Referências.

2. ed. Curitiba: Editora

UFPR, 2007.

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Normas para

apresentação de documentos científicos, 9. Redação e Editoração.

2. ed.

Curitiba: Editora UFPR, 2007.

175

ANEXOS

Artigos

•

Tatiane A. Jó; Denise F. S. Petri, Francine Valenga, Neoli Lucyszyn, Maria

Rita Sierakowski. Thin Films of Xyloglucans for BSA adsorption.

Materials

Science Engineering C

, v. 29, p. 631-637, 2009.

•

Edla M.A. Pereira, Maria Rita Sierakowski, Tatiane A. Jó, Renato A. Moreira,

Ana Cristina O. Monteiro-Moreira, Rafael F.O. França, Benedito A.L. Fonseca,

Denise F.S. Petri. Lectins and/or xyloglucans/alginate layers as supports for

immobilization of dengue virus particles.

Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces

, v. 66, p. 45-52, 2008.

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