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“Análise de correlação entre eventos de hipermutação e
carga viral em pacientes infectados pelo vírus da
imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1)”
São Paulo
2009
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
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“Análise de correlação entre eventos de hipermutação e
carga viral em pacientes infectados pelo vírus da
imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1)”
São Paulo
2009
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina para obtenção do Título de Mestre
em Ciências.
Orientador: Prof Dr Luiz Mario Ramos Janini
Co-orientador: Prof Dr. Ricardo Sobhie Diaz
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LIMA, Mariana Leão de
Análise de correlação entre eventos de hipermutação e carga viral em
pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1)./
Mariana Leão de Lima. São Paulo, 2009
95f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina.
Programa de Pós-graduação em Ciências Básicas em Doenças Infecciosas
e Parasitárias
Título em Inglês: Correlation between hypermutation and viral load in
patients infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).
1. HIV-1 2. Imunidade Inata 3. Carga Viral 4. Hipermutação
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS
Chefe do Departamento: Prof. Angelo Amato Vincenzo de Paola
Mariana Leão de Lima
Dissertação de Mestrado
“Análise de correlação entre eventos de hipermutação e carga viral em
pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1)”
Banca examinadora:
Prof. Dr. Celso Granato
Prof
ₐ
Dra. Cecília Araripe Sucupira
Prof
ₐ
Dra. Shirley Komninakis
Se alguém duvidar de ti, dizendo que não amas
E pelos erros teus julgar o teu viver
Não desanimes, não,
Deus vê teu coração.
A menor intenção de ser melhor já é amor,
Desde um sorriso a um olhar, sim é amor.
Se à imagem e semelhança do Amor fostes criado
Então dos teus atos o mais sincero e natural é o teu amar.
(Walmir de Alencar)
DEDICATÓRIAS
empre penso que a Ciência, com todo o conhecimento que trouxe e traz, é uma forma de elevar o espírito
humano à contemplação da Verdade e de construir a esperança. Desejo encontrar na prática científica
também essa essência porque a Ciência, a meu ver, tem sentido enquanto permanecer enraizada no
Humanismo e na Ética mas nunca quando estiver arvorada no lucro, no utilitarismo, na dominação, na
segregação e no desrespeito à Vida... seguem os nomes a quem este trabalho é dedicado:
Ao bom Deus porque é meu fundamento. Ele me deu e coragem para acreditar na Ciência como meio de ajudar o
outro e como meio tangível de senti-Lo.... e porque foi graças ao Amor para conduzir cada experimento e à
vocação (do latim, ‘vocare’ – chamado) para a Ciência com a qual Ele me presenteou, que tive garantida a
fecundidade dos pensametos, a persitência diante dos resultados e a sabedoria neste estudo para melhorá-lo,
construí-lo e terminá-lo. Aqui está: o mestrado da Mariana é um dom de Deus.
A Mãe de Deus, especialmente sob o título de Mãe Rainha e Vencedora Três Vezes Admirável de Schöenstatt,
que me cativou, protegeu e educou todos os dias. Este projeto foi escrito inteiro no Santuário situado à Rua Dr.
Diogo de Faria 251 daqui de São Paulo, e desde sua origem foi consagrado a Ela.
Aos meus amados pais, Márcia Leão de Lima e Manoel Apdo. de Lima, porque são as pessoas mais
preciosas que conheço. Me deram tudo que eu precisei: amor, exemplo e coragem. Pela nobreza
natural de ambos, por serem um comigo, por serem minha família e meus heróis.
Estas letras
grandes representam a minha especial gratidão. Quero sempre me esforçar para ser digna deles.
A minha querida avó Aparecida, que sem entender de teorias e experimentos me deu conselhos sobre a vida, as
pessoas e o mundo; pelo acompanhamento próximo, cuidadoso e carinhoso de todas as minhas atividades;
Ao meu querido avô José (in memorian) porque partiu mas ficou morando no meu coração. A música que ele
sempre insistiu para que eu tocasse, muitas vezes, me ajudou em aulas e discursos...
A todos os estudantes e funcionários do laboratório
- por cada ensinamento, cada sorriso, cada sinal de acolhida
e cada dia possibilidade de amadurecimento que me deram. Por terem abertura e por permitirem que eu me
realizasse junto deles enquanto aluna, enquanto profissional e enquanto pessoa. Termino sem qualquer mancha
ou qualquer desentendimento – esse é um dos meus maiores troféus aqui. E estes são eles, a quem agradeço e
admiro:
A Maria Clara, por me acompanhar como amiga mais fiel, companheira e cúmplice de experimentos, ideais e
desafios, por me mostrar diversos pontos de vista de maneira leve e simples, por ser uma das melhores pessoas
que já conheci em toda minha vida e por ter uma nobreza, magnanimidade e percepção de mundo únicas.
Ao Wagner Alkmin, porque foi meu primeiro e sempre amigo. Com toda paciência e cordialidade me ensinou
muito, ajudou a me orientar, concluiu comigo e foi presente como grande amigo e conselheiro;
S
A Elizabeth Cavalieri, pela confiança que depositou em mim... pela proximidade e pela abertura de coração...
por todas as conversas e experiências de vida compartilhadas; pela sinceridade que lhe é tão natural e que a
torna única e insubstituível!
A Daniela Teixeira, pela sensibilidade e profundidade de captar o mundo, pela força humana e pelo grande
tesouro de sua amizade... por me deixar estar próxima e por se fazer imensamente próxima e especial;
A Juliana Galinskas, pelo dom que tem de despertar nas pessoas o que elas têm de melhor... pela generosidade,
pela pureza, pela afabilidade e pela presença sempre tão construtiva no nosso meio;
Ao Jean Zukurovi, porque tem coração de menino. Por todas as tantas ajudas e análises computacionais... mas
principalmente, pela convivência tão agradável e tão recompensadora, pelas dezenas de sorrisos que causou-me
intencionalmente por seu jeito divertido;
Ao Rodrigo Moura, porque sabe unir a alegria à inteligência, pelo menino excelente que é, pelo altruísmo;
A Michele Camargo, por sua maneira coerente e ponderada de agir, por sua consciência de grupo, por sua
notável capacidade de liderança dentro do laboratório e pela sagacidade;
A Érika Fusuma, por sua luta para ser sempre uma pessoa melhor, pela sinceridade, pela personalidade firme e
decidida e pela coragem de assumir suas convicções – são dignas de reconhecimento;
A Carla Teixeira, pela atitude companheira, pela visão aguçada e clara, pelas opiniões e observações únicas
sobre os acontecimentos. Pela coragem e pela postura;
Ao Rodrigo Cortes, pela praticidade e pela maneira autêntica de ser; pela capacidade de decisão e de formação
de opinião;
A Celina Moraes, pela presença próxima, pela vocação para conversar, por toda a experiência que traz consigo e
que é muito rica;
Ao Rafael Gonçalves, pela doçura e educação, pela cordialidade, pelo exemplo de pessoa e de amigo que é, pelo
caráter correto e por sua maneira de agir;
A Alessandra, pela presença amiga, pelo esforço e pelo companheirismo;
Ao Alexandre, pela irreverência, pela sinceridade e pela naturalidade - principalmente pela abertura de coração;
A Shirley Komninakis,
por todas as correções e por todos os conselhos sobre a pesquisa e sobre o trabalho. Pelo
exemplo de esforço e de capacidade;
A Márcia Schontag,
pela sensibilidade, pela expressividade, pela capacidade de decisão, por todas as palavras
meigas e construtivas que pronuncia e pela simplicidade;
A Silvana Esposito, por sua especial afabilidade, pela capacidade de se mostrar próxima, pela grande força de
vontade e pela disponibilidade;
A Camila Maurício, pela autenticidade, pelo espírito lutador e conquistador, pela jovialidade;
A Edsel Moraes, pela sinceridade, pela leveza e pela liberdade com que age; pela personalidade transparente;
Ao Michel Soane, pela naturalidade e pela capacidade;
A Juliana Magagnato, pela mansidão, pela tranqüilidade e pela abertura de coração;
A Fernanda, à Samantha, ao Lucas, à Joice, ao Fernando, ao Diogo, à Thais, à Eliane e Lúcio que chegaram
neste laboratório quando eu já estava saindo, e por quem tenho imenso respeito, carinho e alegria por conhecer.
A Roberta Martini, Jaqueline dos Santos e Luana Escajadillo, por serem minhas irmãs de caminhada nos ideais
de pureza de coração e de alma, por significarem para mim exemplos de jovens fortes, conscientes e dignas.
À Ariana Moraes, que mesmo nem sempre estando fisicamente próxima ou mesmo quando silenciava e somente
sorria foi imensamente presente e me ensinou muito... pelo ser humano interiormente belo, corajoso, nobre e
único que é;
A Renata Tonelli, por acreditar e por zelar por mim no meu novo lugar de trabalho quando eu mais precisei:
pela confiança, pela ternura, pela acessibilidade, pela maneira de agir e pela paciência. Um obrigada muito
especial a ela porque fez e faz a diferença muitas vezes nos meus dias;
Às meninas que moraram comigo na Rua Marselhesa, 29, pela convivência construtiva, pela maneira fraterna e
autêntica de cada uma, pelas boas companias durante as refeições, finais de semana, manhãs e madrugadas... se
a maneira mais eficiente de conhecer alguém é conviver sob o mesmo teto.... “foi extremamente gratificante
conhecê-las e poder participar da vida de cada uma” – particularmente Juliana Bueno, Priscila Brandoli e
Raquel Cassado – porque estas escreveram comigo parágrafos importantes de confiança, sinceridade,
cumplicidade e me deram a oportunidade tangível de averiguar que somos capazes de sermos melhores a cada dia
– em diferentes sentidos.
Às queridas Irmãs do Santuário da Mãe Rainha por me darem muitos votos de confiança e por acolherem em
sua casa quando eu cheguei na cidade de São Paulo. A cada uma minha imensa gratidão e reconhecimento. Por
tudo o que me ensinaram, pelas pessoas que são, pelas escolhas que fazem, pelo mundo melhor que constroem e
pelo reflexo vivo de Nossa Senhora que elas são... Particularmente Ir Franciane, Ir Theomaris, Ir Diná, Ir
Nilza, Ir Lourdes Maria, Ir M Isabel Cristina, Ir Rosa Maria, Ir Patrícia, Ir Caroline, Ir Daniele; Ir Euzania;
Ao meu querido orientador Mario Janini, que me aceitou como aluna de mestrado e criou muitas vezes portas
para que eu pudesse entrar, aprender e atuar; por me encorajar a prosseguir, por ensinar-me com visão clara e
objetiva de cientista e por dividir comigo seus tantos conhecimentos; Ele é meu Pai da Ciência e tenho grande
orgulho de “descender” dele. Descobri nele também um bom amigo com quem posso conversar, rir, fazer planos e
trabalhar muito!
Ao meu querido co-orientador Ricardo Sobhie Diaz, por cada valorosa participação com sugestões na execução
do projeto e pela cordialidade e simpatia de todas as vezes; pelas palavras de incentivo e de confiança.
Ao Charlys Costa, por toda eficiência e perspicácia com que agiu em favor desse projeto, por toda ajuda
logística, por todas as opiniões e indicações; pela amizade conquistada que significa para mim um presente;
Á Mara Stort, por tratar com igual dedicação dos assuntos buracráticos e do trato humano. Pela paciência,
boa-vontade e ponderação de sempre;
Ao Wancler Alencar, pela presença leve, amiga e desprendida. Pela alegria natural, pelo senso de humor e de
responsabilidade que moram nele;
À Cecília Sucupira, pela capacidade de decisão, por todo cuidado com cada situação, pela pessoa que é, pela
postura e assertividade;
Aos pacientes cujas amostras de sangue me possibilitaram o desenvolvimento desse trabalho – eu gostaria muito
de devolver a generosidade em benefício para a saúde de cada um;
À Disciplina de Infectologia e à Escola Paulista de Medicina
, que autorizaram que eu usasse as dependências
físicas do Laboratório de Retrovirologia e a merecida credibilidade do nome para respaldar meu aprendizado;
À FAPESP
, por garantir suporte financeiro e por cobrar resultados;
A todas as pessoas que eu conheci e que somaram riqueza na minha historia de vida porque sem elas aprender
técnicas e interpretá-las não teria nunca o mesmo sentido.
__________________________________________________________________RESUMO
INTRODUÇÃO: A substituição monótona de bases G → A no genoma do HIV-1 é
observada desde a década de 1990, entretanto, apenas recentemente esse efeito foi atribuído às
APOBECs (apolipoprotein B editing catalytic polypeptide) da imunidade inata.
As APOBECs celulares atuam na deaminação de citidina a uridina na fita de DNA viral de
polaridade negativa e esse efeito é verificado como excesso de adeninas na fita complementar de
DNA viral resultante do processo de transcrição reversa.
A presença de hipermutações ocasiona perda da capacidade replicativa da partícula do HIV-1 e
pode levar populações virais à extinção. Estudos in vitro demonstraram o efeito antiretroviral das
APOBECs3 baseados, principalmente, na verificação de hipermutação. Por outro lado, estudos
sistemáticos in vivo são escassos e os dados da literatura são controversos com relação ao efeito
da hipermutação no genoma das subpopulações de HIV-1 e na dinâmica da infecção.
OBJETIVOS: Este estudo objetivou avaliar os efeitos da hipermutação em pacientes HIV-
positivos não tratados correlacionando a freqüência de hipermutação com a carga viral. A carga
viral é um importante indicador biológico de replicação do HIV-1 e clínico de progressão para a aids.
Assim sendo, foi testado se a presença de hipermutação tem efeito protetor no controle da infecção
natural pelo HIV utilizando como parâmetro de apoio a carga viral plasmática do HIV-1 nas 157
amostras de pacientes não tratados testadas para detecção de hipermutação. A integrase constitui
um hot spot de hipermutação no genoma viral.
MÉTODOS: Foi realizada PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar um fragmento
de 582 pares de bases do gene da integrase e o produto de PCR foi visualizado em gel de agarose
com HA-Yellow. O corante HA-Yellow retarda a migração eletroforética de um produto de PCR
proporcionalmente ao conteúdo de bases A da sequência. Nosso método de análise foi validado
com base em sequências de clones e calibrado em acordo com os resultados gerados pelo
programa Hypermut (disponível em
http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/
hypermut.html
). A análise dos dados realizou-se com base na estatística de K-means que
permitiu agrupar as amostras clínicas de acordo com sua distância de migração no gel de
agarose com HA-Yellow.
RESULTADOS:
Foi observada hipermutação em 31,2% (n=49/157) destas amostras e
houve associação entre presença de hipermutação e maiores níveis de viremia (P=0,02, teste de
Mann-Whitney). Adicionalmente, a presença de hipermutação não apresentou associação com
menores níveis de linfócitos T CD4 positivos (P=0,06, Teste de Mann-Whitney), nem ao gênero ou à
etnia.
CONCLUSÕES: Os valores de carga viral detectados em cada indivíduo refletem a
quantidade de partículas virais filtradas pelo processo de hipermutação e o substrato da
hipermutação é a replicação viral. Assim sendo, nós constatamos que amostras clínicas com
altos níveis de replicação viral exibiram o fenômeno de hipermutação mais frequentemente. Em
resumo, a detecção de variantes provirais de HIV-1 portando hipermutação correlacionou-se
com maiores níveis de carga viral nos pacientes avaliados. Assim sendo, concluímos que a
hipermutação, fenômeno bioquímico de substituições G para A no HIV-1, é um processo
pervasivo e está associada com níveis mais elevados de replicação viral.
Palavras- Chave: HIV-1, APOBEC, imunidade inata, carga viral, hipermutação
________________________________________________________________________ABSTRACT
INTRODUCTION: Monotonous G-to-A bases replacement in HIV-1 genome is observed
since the 1990s, however, this effect was only recently associated with APOBECs
(apolipoprotein B editing catalytic polypeptide) of the innate antiviral defense.
Intracellular APOBECs operate in deamination of cytidine to uridine bases on the minus
strand of HIV-1 DNA and its effect is seen as an excess of adenine in the positive strand of viral
DNA resulting from reverse transcription. Hypermutation causes loss of fitness in HIV-1
populations, rendering then non-viable replicant competent viruses and extinction. In vitro
studies showed the effect of antiretroviral APOBECs3 based mainly on proving hypermutation.
Furthermore, systematic studies in vivo are scarce and literature data are controversial
regarding to the hypermutation effects on the HIV-1 subpopulations genome and in the
infection´s dynamics.
PURPOUSE: This study aimed to evaluate the effects of hypermutation in naïve HIV-
positive patients to correlate hypermutation frequency and viral load. The viral load indicates
biological replication of HIV-1 and clinical progression to aids. It was hypothesized whether
hypermutation had a protective effect in the control of natural HIV infection. Viral load was the
supporting measure to asses hypermutation in 157 samples of untreated HIV-patients tested.
Integrase is hot spot of hypermutation in viral genome.
METHODS: PCR was used to amplify 582bp integrase gene fragment and PCR
product was visualized in a HA-Yellow agarose gel. HA-Yellow dye retards electrophoretic
migration of the PCR product proporcionally the amount of A bases in the sequence. Our
analysis method was validated with clones sequences and calibrated according to the results of
the Hypermut software (available on
http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/ HYPERMUT/
hypermut.html
).
RESULTS: Data analysis of hypermutation was performed with K-means test and
clinical samples were grouped according to their migration distance in the agarose gel with HA-
Yellow. Hypermutation was observed in 31,2% (49/157) of these samples and it was found an
association between the presence of hypermutation and higher viremia values (p = 0.02, Mann-
Whitney Test). Additionally, the presence of hypermutation was neither associated with the
status of the patient's CD4 T lymphocytes (p = 0.06, Mann-Whitney Test) nor gender, nor etnicy.
CONCLUSIONS: Viral load detected values in each individual reflects the amount of
viral particles filtered through the hypermutation process and the substrate of hypermutation is
viral replication. So, we found that clinical samples on high viral replication levels exhibited
hypermutation phenomena more frequently. In summary, the detection of proviral variants of
HIV-1 carriers of hypermutation correlated with higher levels of viral load in patients and we
conclude that hypermutation, the biochemical phenomena of G-to-A bases replacement, is a
pervasive process and it is associated with higher HIV-1 replication levels.
Key-words: HIV-1, APOBEC, innate immunity, viral load, hypermutation
“Análise de correlação entre eventos de hipermutação e carga viral em pacientes
infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1(HIV-1)”
Índice
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 6
3 METODOLOGIA ................................................................................................... 7
3.1 SELEÇÃO DA CASUÍSTICA ........................................................................................... 7
3.2 EXTRAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO (DNA) DO HIV-1 ................................................... 8
3.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ........................................................... 9
3.4 DETECÇÃO DO PRODUTO AMPLIFICADO ................... Erro! Indicador não definido.
3.5 DETECÇÃO DE HIPERMUTAÇÃO .................................. Erro! Indicador não definido.
3.6 CLONAGEM DO PRODUTO DA PCR ............................. Erro! Indicador não definido.
3.6.1 REAÇÃO DE LIGAÇÃO .................................................................................... ...15
3.6.2 TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS QUIMIOCOMPETENTES POR CHOQUE
TÉRMICO ............................................................................................................................ 16
3.6.3 PCR PARA VERIFICAÇÃO DA TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA ................. 18
3.7 PURIFICAÇÃO DOS PLASMÍDEOS ............................................................................. 18
3.8 PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR AMPLIFICADOS ...................................... 19
3.9 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO ................................. Erro! Indicador não definido.
3.9.1 PRECIPITAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQÜENCIAMENTOErro! Indicador não definido.
3.9.2 ANÁLISE DOS RESULTADOS DO SEQÜENCIAMENTOErro! Indicador não definido.
3.10 PADRONIZAÇÃO DA DETECÇÃO DE HIPERMUTAÇÃO COM PCR EM TEMPO
REAL ......................................................................................................................................26
4 RESULTADOS ................................................................................................... 29
4.1 PADRONIZAÇÃO DA PCR ........................................................................................... 29
4.2 TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA POR CHOQUE TÉRMICOErro! Indicador não definido.
4.3 DETECÇÃO DE HIPERMUTAÇÃO EM GEL DE AGAROSE COM HA-YELLOWErro! Indicador n
4.4 SEQUENCIAMENTO DOS CLONES UTILIZADOS COMO CONTROLES .................. 37
4.5 ANÁLISE DOS CLONES COM BASE EM GÉIS FOTODOCUMENTADOSErro! Indicador não d
e
4.6 CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DOS CLONES SEQÜENCIADOSErro! Indicador não definido
.
4.7 IDENTIFICAÇÃO DA HIPERMUTAÇÃO A PARTIR DAS FOTOS DOS GÉIS DE
AGAROSE COM HA-YELLOW ........................................................ Erro! Indicador não definido.
4.8 COMPARAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS DO HYPERMUT E K-MEANS ................ 47
4.9 ANÁLISE DAS AMOSTRAS CLÍNICAS COM BASE EM GÉIS
FOTODOCUMENTADOS ............................................................................................................. 49
4.10 ESTUDO DA CASUÍSTICA E DOS DADOS GERADOS .............................................. 57
4.11 CORRELAÇÃO ENTRE PRESENÇA DE HIPERMUTAÇÃO E NÍVEIS DE CARGA
VIRAL ERRO!
INDICADOR NÃO DEFINIDO.
4.12 REAÇÃO DE PCR EM TEMPO REAL .................... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
4.13 ANÁLISE FILOGENÉTICA DOS CLONES PRODUZIDOSERRO! INDICADOR NÃO
DEFINIDO
.
5 DISCUSSÃO....................................................................................................... 75
6 CONCLUSÕES ................................................................................................... 89
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Figura esquemática das atividades propostas para o estudo “Análise de Correlação
entre eventos de hipermutação e carga viral em amostras de pacientes infectados pelo vírus da
imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1)”......................................................................................7
Figura 2: Localização dos iniciadores externos e internos no genoma da seqüência de guia do
HXB-2 do HIV-1. A seta vermelha indica a localização do fragmento gerado na primeira fase da
PCR e a seta azul indica a localização do fragmento gerado na segunda fase da PCR..............9
Figura 3: Calibração do método de detecção de hipermutação com sistema de gel com HA-
Yellow. À esquerda abaixo, o produto de PCR de 297pb da região da protease do HIV-1 foi
submetido a gel de agarose 1%. À direita, os mesmos fragmentos foram submetidos a gel de
agarose com HA-Yellow e a sequenciamento. Observou-se que à medida que se verifica uma
menor migração do produto amplificado por PCR segue-se um aumento proporcional do
conteúdo AT da seqüência..........................................................................................................25
Figura 4: Obtenção da Temperatura de Melting numa curva de temperatura em função da
emissão de fluorescência e a derivação desta curva..................................................................28
Figura 5: Padronização da PCR para detecção de fragmento da integrase do HIV-1. Acima
estão representadas diferentes combinações de iniciadores externos e abaixo estão
representadas as concentrações finais de Cloreto de Magnésio na primeira etapa da
PCR.............................................................................................................................................29
Figura 6: Detecção de Hipermutação em Gel de agarose com HA-Yellow de PCR de fragmento
da integrase do HIV-1 sob concentrações crescentes de Cloreto de Magnésio. A detecção de
hipermutação nas amostras AJB, A2 e A3 foi otimizada com o aumento da concentração final
de Cloreto de Magnésio..............................................................................................................31
Figura 7: Padronização da Primeira Etapa da PCR. Experimento utilizando PCR Touch Down
para detecção de fragmento da integrase do HIV-1 em concentrações crescentes de MgCl
2
.....................................................................................................................................................32
Figura 8: Gel de agarose com HA-Yellow contendo os clones com diferentes níveis de
hipermutação para seleção dos controles de nível de hipermutação a serem utilizados para
avaliação das amostras clínicas. As setas vermelhas indicam os clones escolhidos: B190D,
A3IVaE e A4aP, como, respectivamente, controle normal, controle com nível intermediário de
hipermutação e controle hipermutado.........................................................................................33
Figura 9: Padronização da quantidade de produto de PCR aplicado no gel com HA-Yellow. O
gel colocado à esquerda resulta de aplicação de 5,0µL de DNA amplificado, enquanto que o da
direita resulta da aplicação de 2,0µL de DNA amplificado..........................................................36
Figura 10: Detecção de fragmento da integrase do HIV-1 de amostras clínicas em gel de
agarose. A seta vermelha representa o tamanho esperado do produto da
PCR.............................................................................................................................................36
Figura 11: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento de 582pb da integrase do HIV-1 dos clones obtidos da amostra 35789 do paciente
99 e do clone hipermutado (C. Hipermutado) utilizado como controle nas corridas
eletroforéticas das amostras clínicas..........................................................................................42
Figura 12: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento de 582pb da integrase do HIV-1 dos clones obtidos da amostra 35789 do paciente
99 e do clone hipermutado (C. Hipermutado) utilizado como controle nas corridas
eletroforéticas das amostras clínicas..........................................................................................42
Figura 13: Medida da posição de cada sequência no gel. Foram definidas regiões de
referência iguais para cada sequência com o item do Analyze/Gels/Select Lane do menu
principal. A seguir, foi utilizado o item Analyze/Gels/Plot lanes para gerar um gráfico
proporcional à intensidade do sinal luminoso na região. O ponto de máxima luminosidade foi
então escolhido como a posição da sequência a ser
analisada.....................................................................................................................................46
Figura 14: Detecção de hipermutação em fragmento de 582 pares de bases da integrase do
HIV-1 de amostras clínicas em gel de agarose com HA-Yellow das amostras clínicas de 1 a 12
e análise estatística.....................................................................................................................51
Figura 15: Detecção de hipermutação em fragmento de 582 pares de bases da integrase do
HIV-1 de amostras clínicas em gel de agarose com HA-Yellow das amostras clínicas de 14 a
25 e análise estatística...............................................................................................................51
Figura 16: Padronização
Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da
amplificação de fragmento de 582 pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas
25 a 36 e análise estatística. A seta vermelha da foto do gel indica amostra com presença de
subpopulações virais com diferentes níveis de hipermutação....................................................52
Figura 17: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento da integrase de 582 pares de bases do HIV-1 das amostras clínicas 40 a 49 e
análise estatística........................................................................................................................52
Figura 18: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento de 582 pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 50 a 61 e
análise estatística........................................................................................................................53
Figura 19: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento de 582 pares de bases da integrase do HIV-1 de amostras clínicas variadas e
análise estatística........................................................................................................................53
Figura 20: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento de 582 pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 76 a 87 e
análise estatística........................................................................................................................54
Figura 21: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento de 582 pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 94 a 101 e
análise estatística........................................................................................................................54
Figura 22: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento de 582 pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 102 a 112 e
análise estatística........................................................................................................................55
Figura 23: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 113 a 124 e análise estatística...........55
Figura 24: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 125 a 136 e análise
estatística....................................................................................................................................56
Figura 25: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 137 a 146 e análise
estatística....................................................................................................................................56
Figura 26: Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de
fragmento da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 151 a 158 e análise
estatística....................................................................................................................................57
Figura 27: Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de
Melting dos clones não hipermutados 35789_27 e tabela contendo a descrição dos picos e do
intervalo que contém a curva de Melting do principal pico. TM=83º C [79,5-88º C]...................66
Figura 28: Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de
Melting dos clones hipermutados 35789_04 e tabela contendo a descrição dos picos e do
intervalo que contém a curva de Melting do principal pico.TM=81,5 [77,5-
84,5].............................................................................................................................................67
Figura 29: Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de
Melting do clone mais hipermutado 35789_28 e tabela contendo a descrição dos picos e do
intervalo que contém a curva de Melting do principal pico. TM= 75,5 [63,5-80º C]....................68
Figura 30: Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de
Melting do clones 35789_04, 35789_09, 35789_10 e 35789_26 e tabela contendo a descrição
dos picos e do intervalo que contém a curva de Melting de cada clone. Notar o deslocamento
das curvas de Melting para a esquerda à medida em que os clones testados exibem maiores
níveis de hipermutação...............................................................................................................68
Figura 31: Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de
Melting da amostra clínica 31522. Notar dois picos principais correspondendo a duas
subpopulações virais com diferentes níveis de hipermutação. A tabela que contém a descrição
dos picos e o intervalo que contém a curva de Melting discrimina dois picos principais(embora
só o primeiro aparece destacado) ao invés de um como é característico dos clones................70
Figura 32: Regressão linear mostrando como o conteúdo A+T determina a temperatura de
Melting de uma sequência (R
2
=0,998)........................................................................................71
Figura 33: Árvore filogenética gerada no software Mega 4.0 com modelo de neighboor
joining..........................................................................................................................................74
Figura 34: Gráfico mostrando as transições (verde) em relação às transversões (azul) na
árvore filogenética gerada para os clones da amostra 35789. As transversões se mantém
relativamente constantes, enquanto que as transições são determinantes para a configuração
da topologia da árvore.................................................................................................................74
Figura 35: Perfil da freqüência de hipermutação ao longo do genoma do HIV-1 considerando-
se os tratos polipurínico central e 3’............................................................................................77
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Caracterização das sequências amplificadas da região da integrase de clones da
amostra 35789 e dos clones-controles A4aP, a3IVaE e B190D com relação à composição
nucleotídica eTemperatura de Melting...................................................
..................................43
Tabela 2: Comparação dos dados obtidos no software Hypermut e na análise dos géis por K-
means em relação à classificação dos clones da amostra 35789 do paciente 99 e dos clones de
referência (B190D, A4aP e A3IVaE) ...........................................................................................48
Tabela 3:
Compilação de dados gerais dos casos de pacientes HIV-positivos e classificação
dos mesmos quanto à presença de hipermutação considerando-se o critério de máxima
verossimilhança (I) ou alfa fixo = 0,01 (II)..................................................................................
58
Tabela 4: Estatística descritiva dos casos de pacientes HIV-positivos que compõem a
casuística
..................................................................................................................................61
Tabela 5: Estatística descritiva dos casos de pacientes HIV-positivos que compõem a
casuística segundo a classificação em presença ou ausência de detecção de
hipermutação..................................................................................
.........................................63
ÍNDICE DE QUADROS
Quadro 1: Iniciadores empregados na detecção do fragmento da integrase do HIV-1..11
Quadro 2:
Constituintes da reação e perfil de ciclagem da PCR empregada na detecção
de fragmento da integrase do HIV-1...............................................................................12
Quadro 3: R
eação de ligação que produz o plasmídeo TOPO TA com o inserto de
interesse.....................................................................................................................................16
Quadro 4:
Constituintes da reação e perfil de ciclagem da PCR empregada na reação
de sequenciamento de fragmento da integrase do HIV-1.................................................22
Quadro 5:
Constituintes da reação e perfil de ciclagem da PCR em Tempo Real
empregada na detecção de fragmento da integrase do HIV-1.......................................29
Quadro 6:
Conteúdo GC e AT de seqüências dos principais subtipos brasileiros em
comparação com o e dos clones gerados nesse estudo................................................34
1
1 INTRODUÇÃO
Desde os primeiros relatos de aids
1
e da identificação do HIV-1
2
, o entendimento da
imunopatogenia desse vírus e conhecimentos relacionados vêm sendo reunidos para
melhoria racional das estratégias de tratamento. As elevadas taxas de mutação verificadas
ao longo do genoma do HIV-1 são atribuídas à atuação da enzima transcriptase reversa
viral
(Reverse Transcriptase – RT)
3, 4
de maneira que a extensa variabilidade genética do
HIV-1 resulta da taxa intrínseca de incorporação incorreta de nucleotídeos por genoma por
ciclo, somada a números elevados de ciclos replicativos virais por dia. Adicionalmente,
com relação à diversidade viral, num indivíduo não tratado, verifica-se a coexistência
temporal e espacial de uma distribuição de variantes do HIV-1, as quasispécies
5
Diferentes técnicas detectaram a hipermutação ao longo do genoma do HIV-1 in
vitro
6
bem como em células mononucleares de sangue periférico de indivíduos infectados
pelo vírus
7
. A hipermutação é detectada no HIV-1 como o acúmulo de substituições
monótonas de guanina por adenina (G → A) ao longo do genoma viral.
O cDNA
sintetizado a partir da transcrição reversa viral (fita de polaridade negativa) sofre, ao longo
de sua extensão, a deaminação de bases citidina a uridina
8
por ação das APOBECs
(apolipoprotein B editing catalytic polipeptide) celulares e, à medida que a fita
complementar (fita de polaridade positiva) é sintetizada, observa-se a fixação de mutações
G → A no DNA pré-integrativo e DNA proviral.
A perda do conteúdo informacional genômico, observada a partir do efeito deletério
da hipermutação em proteínas com função enzimática e estrutural, pode levar à extinção
populações e ou subpopulações virais. Sabe-se também que o excesso de uridinas ao
2
longo do DNA viral ocasiona a degradação do mesmo por ação de nucleases celulares
9
e,
ainda nesse contexto, suspeita-se que precursores dos produtos da transcrição reversa
contendo muitas substituições do tipo G → A podem ser mais propensos a iniciação
inespecífica da síntese de DNA
10
. Assim sendo, por mais de um mecanismo, a
hipermutação pode levar partículas virais ao colapso.
Dentre as proteínas da grande família das APOBECs, as APOPBECs3,
notadamente APOBEC3G e APOBEC3F relacionam-se à atividade antiretroviral. Essas
enzimas são empacotadas junto dos vírions nascentes e ocasionam perda da capacidade
replicativa e inviabilização da nova partícula viral devido a acúmulo de fenótipos defectivos
e mutações deletérias ou atuam durante transcrição reversa, na edição do DNA viral
recém-sintetizado
11,
12
. As enzimas APOBEC3G e APOBEC3F não exercem modificação
no genoma celular porque atuam no citoplasma
13
.
O fator de infectividade viral (virion infectiviy factor – vif) é uma fosfoproteína básica
do HIV de aproximadamente 23kDa produzida em estágios tardios da replicação que se
relaciona à patogênese viral in vivo através de modulação positiva da infectividade.
Em estudos com partículas de HIV-1 defeituosas para a expressão do gene Vif foi
descrita restrição significativa dos eventos do ciclo biológico viral que sucedem à entrada e
à integração ao genoma hospedeiro e de incapacidade de estabelecimento de novas
infecções
14, 15
. Além destes, estudos posteriores mostraram que partículas mutantes de
HIV-1 com deleção da atividade de vif eram suscetíveis à atividade antiviral da enzima
APOBEC3G, entretanto, na presença de vif, a ação da APOBEC3G era superada
16
.
Em partículas de HIV-1 deficientes para vif, a APOBEC3G é incorporada aos
vírions nascentes, ocasionando altas taxas de hipermutação e acúmulo de fenótipos
3
defectivos em fases críticas do ciclo replicativo viral
17
. Por outro lado, posteriormente,
estudos mais detalhados demonstraram que vif forma um complexo com APOBEC3G
marcando-a para ubiquitinação via proteossoma, e que de maneira muito semelhante esse
evento também ocorre com a APOBEC3F
18,19
, mas não com a APOBEC3B
28
. Assim
sendo, apesar de a hipermutação ser um fenômeno prevalente
7
e que funciona como fator
de restrição antiretroviral, seus efeitos podem se restringir devido às interações funcionais
entre APOBECs3 e vif.
Atualmente, a partir de repetições dos ensaios com vif e APOBEC3G, discute-se a
possibilidade de que o efeito antiretroviral da APOBEC3G possa ser atribuído não
somente à sua função enzimática de edição do DNA, mas talvez também a uma outra via
ou domínio que justifique suas propriedades antivirais além da atividade citidina
deaminase
20,21,22
. Este mesmo achado também se deu com relação à
APOBEC3F
23
,
reforçando o argumento de que possa existir um modelo alternativo para explicar a
atividade antiviral das APOBECs3 que extrapole a propriedade de edição genômica.
Apesar da interação destrutiva da proteína acessória vif do HIV-1 para com a
maioria das APOBECs celulares, o efeito da hipermutação no genoma viral é notável e o
entendimento mais aprofundado do processo possibilitaria, inclusive, delineamento de
possíveis alvos terapêuticos.
Dada a dificuldade de se desenvolver vacinas anti-HIV devido à diversidade viral
24
,
estratégias alternativas tem sido avaliadas. Mais recentemente tem sido observado um
interesse crescente na pesquisa da imunidade inata em estudos de HIV.
A determinação dos níveis replicação do HIV-1 pela carga viral funciona como um
dos melhores indicadores clínicos conhecidos para monitoramento do paciente HIV-
4
positivo. Já está bem estabelecido que a contagem de células CD4+ e a carga viral podem
funcionar como parâmetros preditivos para a progressão para a aids
25
. Diversos estudos
que investigam a importância de fatores antivirais utilizam como referência a carga viral
dos pacientes reforçando o argumento de que a carga viral pode ser considerada também
um indicador biológico da replicação do HIV-1
26
.
Como dito anteriormente, as APOBECs representam um obstáculo para a
replicação viral e constituem um dos fatores da imunidade inata contra o HIV. A ação
antiviral das APOBECs, representada pelos níveis de hipermutação encontrados nos
genomas virais, pode ser correlacionada com a carga viral de pacientes em uma
população. Por isto este estudo sistemático populacional e viral se justifica e seus
resultados fornecem respaldo para avaliação da relevância clínica e biológica das
APOBECs na progressão da doença.
Recentemente um estudo tentou relacionar níveis de expressão de RNA
mensageiro da APOBEC3G e APOBEC3F com a carga viral, mas não encontrou
correlação significativa entre estes dois parâmetros
27
. Entretanto, outro estudo também
recentemente publicado encontrou correlação entre hipermutação e menores valores de
carga viral
28
.
Uma análise englobando maior número de amostras pode esclarecer essa
possível relação entra carga viral e hipermutação. O estudo de Pace e colaboradores fez
análise de hipermutação em 127 indivíduos não tratados. Neste estudo, a partir do
sequenciamento completo do genoma do HIV-1, os autores encontraram prevalência de
seqüências hipermutadas em 9,4% (12/127) dos pacientes, com redução média de 0,7 log
nos valores de viremia nesses indivíduos em relação àqueles que não apresentaram
5
seqüências hipermutadas. O estudo de Pace restringiu o número de amostras utilizadas
porque utilizou sequenciamento completo do genoma do HIV-1 como ferramenta
indicadora da presença de hipermutação. O estudo aqui proposto permitiu avaliar um
número maior de amostras através da identificação desse evento com corantes
reveladores de hipermutação
29
e iniciadores direcionados a seqüências curtas do genoma
(fragmento da integrase do HIV-1), que funcionam como hot spots para hipermutação.
Ainda levando-se em consideração o estudo de Pace e colaboradores, ressalta-se
que o grupo populacional analisado era composto, em sua maioria, por caucasóides
infectados predominantemente por subtipo B do HIV-1. Por outro lado, a população
brasileira apresenta constituição étnica heterogênea e pode conter diferentes variantes
genéticas dos genes celulares, inclusive dos genes que codificam as APOBECs, de
maneira que polimorfismos genéticos podem resultar na produção de APOBECs com
possível atividade enzimática diferenciada. Em um estudo publicado por Ping An e
colaboradores
30
foi avaliada a influência de polimorfismos da APOBEC3G na progressão
para a aids, correlacionando o genótipo 186R/R, presente em americanos de origem
africana, com progressão rápida para a aids. Estes dados sustentam ainda evidências de
que populações com histórias etnogeográficas diferentes podem sofrer efeitos genéticos
distintos no contexto da infecção pelo HIV-1 devido a polimorfismos populacionais.
Além de diversidade étnica populacional, no Brasil já foi descrita a coexistência de
diversos subtipos do HIV-1
31
, inclusive recombinantes
32
. Nesse sentido, um estudo
sistemático populacional e viral constitui-se uma ferramenta para auxiliar o entendimento e
a validação dos efeitos da hipermutação no contexto da infecção pelo HIV-1.
6
2 OBJETIVOS
Correlacionar os níveis de hipermutação com a carga viral em uma população de
indivíduos infectados pelo HIV-1 não submetida a tratamento com drogas
antiretrovirais
7
3 METODOLOGIA
Segue-se um fluxograma (Figura 1) com o delineamento geral do projeto para
melhor entendimento da descrição metodológica.
Figura 1. Esquema das atividades propostas para o estudo “Análise de Correlação entre eventos de
hipermutação e carga viral em amostras de pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo
1 (HIV-1)”
3.1 SELEÇÃO DA CASUÍSTICA
Durante o período que compreende outubro de 2006 até março de 2007 foram
triadas amostras de pacientes HIV-positivos para compor a casuística do estudo, a partir
de uma lista de pacientes obtidas da Rede Nacional de Carga Viral, do ponto executor do
Laboratório de Retrovirologia. Foram selecionados os pacientes maiores de 18 anos que
8
nunca haviam sido submetidos a tratamento com antiretrovirais na ocasião em que a
amostra foi colhida. Salienta-se que o momento de infecção não foi utilizado como critério
de seleção para estes pacientes, entretanto, mesmo indivíduos com infecção mais recente
já haviam atingido o set point da infecção, no qual ocorre a estabilização da viremia. Ao
final da etapa de triagem, das amostras de “papa leucocitária” (buffy coat) do arquivo
biológico do Laboratório de Retrovirologia, foram resgatadas e analisadas 200.
Adicionalmente, o prontuário de cada paciente foi avaliado e foram reunidos dados
adicionais como: contagem de linfócitos T CD4 positivos (n
º de células/mm
3
) na ocasião
da amostra, coloração da pele/etnia e sexo do paciente.
3.2 EXTRAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO (DNA) DO HIV-1
As amostras de “papa leucocitária” (buffy coat) armazenadas a – 80ºC foram
submetidas ao protocolo de extração do DNA com o QIAamp DNA Blood Mini Kit (Quiagen
Inc. Santa Clarita, CA, EUA).
Resumidamente, em tubo 1,5 mL foram transferidos 200 μL da “papa leucocitária”
adicionado de 20 μL de protease e 200 μL de solução tampão de lise (AL). Essa mistura
foi homogeneizada no vortex e incubada a 56
o
C por 10 minutos em termobloco para
liberação do DNA genômico. A presença do tampão de lise (AL) propicia à solução baixo
pH e essa condição, associada à adição de etanol absoluto (200µL), permite a adsorção
do DNA à coluna de sílica quando a mistura é centrifugada a 16.000 rpm (1 minuto). Com
o DNA ligado à malha da sílica, sucedem-se lavagens e centrifugações sucessivas para a
remoção de hemácias, proteínas e outras moléculas não-DNA com os tampões AW1
9
(500µL, 1 minuto de centrifugação a 16.000rpm, por duas vezes) e AW2 (500µL, 3 minutos
de centrifugação a 16.000rpm, por uma vez). Para finalizar, o DNA é eluído em 100 μL de
solução tampão com pH alcalino e baixa concentração de sais (Elution Buffer) e
armazenado em tubo cônico de 1,5mL a –20
o
C.
3.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A detecção do fragmento da integrase do HIV-1 foi realizada em duas etapas
distintas. Na primeira etapa, as amostras foram submetidas à amplificação de segmento
de 738 pares de bases. Seguiu-se uma segunda etapa de PCR (nested-PCR) para
amplificação de segmento de 582 pares de bases, interno ao obtido na reação anterior
para amplificação do produto gerado na primeira etapa de PCR (Figura 2).
Figura 2. Localização dos iniciadores externos e internos no genoma da seqüência de guia do HXB-2 do
HIV-1. A seta vermelha indica a localização do fragmento gerado na primeira fase da PCR e a seta azul
indica a localização do fragmento gerado na segunda fase da PCR.
A hipermutação não é um evento aleatório ao longo do genoma do HIV-1. As
regiões próximas dos tratos polipurínicos central e 3’ são as regiões em que este evento
10
ocorre em nível máximo, decrescendo à medida que se observam as regiões à jusante (5’)
das mesmas
33,34
. A região gênica escolhida para amplificação foi a integrase do HIV-1
porque representa um hot spot de hipermutação (próxima ao trato polipurínico central).
Além disso, a integrase caracteriza-se por ser uma região conservada entre os diferentes
subtipos virais, subtraindo a interferência de outras mutações não relacionadas e
aumentando muito a qualidade dos dados obtidos. Os iniciadores foram obtidos com base
na publicação HIV Sequence Compendium 2001 (disponível em http://hiv-web.lanl.gov
).
Os iniciadores externos foram especialmente desenhados para aumentar a
sensibilidade da PCR para detecção de seqüências hipermutadas e estão relacionados no
QUADRO 1. Esses pares de iniciadores externos contém intencionalmente sítios-alvo de
hipermutação (base G seguida de outra base G - alvo da APOBEC3G, e base G seguida
de base A - alvo da APOBEC3F).
O par de iniciadores externos normais apresenta seqüência de bases equivalente
àquela descrita no HXB-2, anelando em regiões sem hipermutação. Por outro lado, o par
de iniciadores externos degenerados apresenta degenerações nos sítios onde é possível
ocorrer hipermutação e o par de iniciadores externos hipermutados apresenta todas as
possibilidades de hipermutação convertidas em sítios hipermutados, anelando
especificamente em regiões altamente hipermutadas. A reação padrão utilizada neste
estudo utiliza mistura de iniciadores externos degenerados e externos hipermutados na
razão 1:1. Por outro lado, para a segunda etapa da PCR, os iniciadores internos não
necessariamente contêm sítios de hipermutação. Em resumo, o fragmento de integrase
amplificado para esse estudo conferiu à PCR grande sensibilidade para detecção de
hipermutação porque permitiu a análise de um pequeno trecho do genoma do HIV que
11
funciona como hot spot para hipermutação e utilizou para a análise das seqüências
geradas um corante revelador de hipermutação, o HA-Yellow.
QUADRO 1 –Iniciadores empregados na detecção do fragmento da integrase do HIV-1.
INICIADORES (SEQÜÊNCIA 5´-3´)
LOCALIZAÇÃO
NO HXB-2
TM
(ºC)
C
ONTEÚDO
GC (%)
N
º SÍTIOS DE
HIPERMUTAÇÃO
HIV INTEGRASE – primeira reação
EXTERNO NORMAL SENSO
EXTERNO NORMAL ANTI-SENSO
GCTTTGCAGGATTCGGGATTAG
GTTCAGCCTGATCTCTTACCTGTCC
4002-4023
4716-4740
56,2
52,0
50,0
58,7
5
7
HIV INTEGRASE – primeira reação
EXTERNO DEGENERADO SENSO
EXTERNO DEGENERADO ANTI-SENSO
GCTTTGCARRATTCRRRATTAG
GTTCAGYYTGATYTYTTAYYTGTYC
4002-4023
4716-4740
47,6-56,2
48,3-58,7
38,6
38,0
5
7
HIV INTEGRASE – primeira reação
EXTERNO HIPERMUTADO SENSO
EXTERNO HIPERMUTADO ANTI-SENSO
GCTTTGCAAAATTCAAAATTAG
GTTCAGTTTGATTTTTTATTTGTTC
4002-4023
4716-4740
47,6
48,3
27,3
24,0
5
7
HIV INTEGRASE - segunda reação
INTERNO SENSO
INTERNO ANTI-SENSO
AGTGAATCAGAGTTAGTCAATCAAATAAT
CCCTACAACCCACAAAGTCAA
4091-4114
4653-4673
53,1
55,0
27,6
47,6
2
0
As concentrações finais dos reagentes utilizados para uma reação (50μL) na
primeira etapa da PCR foram: Tampão 1X (200mM Tris-HCl pH 8,4 e 500mM KCl), MgCl
2
4,0mM, dNTP 0,4mM, iniciadores externos 0,6 pmoL e Taq DNA polimerase 0,025 U.
Como dito anteriormente, a primeira etapa da PCR utiliza mistura de iniciadores
externos: iniciadores externos degenerados e iniciadores externos hipermutados. Como a
temperatura ótima de anelamento da mistura de iniciadores externos é difícil de ser
determinada empiricamente, escolheu-se a utilização da PCR touch down para minimizar
a formação de produtos inespecíficos. Neste caso, foi padronizada temperatura inicial de
anelamento de 49ºC, decrescendo de 0,5ºC/ ciclo durante os 9 primeiros ciclos até atingir
12
45ºC, a temperatura de anelamento que se mantém durante os 26 ciclos que completam a
reação (QUADRO 2).
O termociclador em que a primeira etapa de PCR foi padronizada é o Eppendorf
Mastercycler® Gradient (Eppendorf AG, Hamburg, Alemanha).
Depois de completa a primeira etapa da PCR, foram transferidos 5,0μL desse
produto amplificado para a segunda etapa da PCR (nested-PCR) que utilizou os
iniciadores internos na composição da reação. O perfil de ciclagem da segunda etapa da
PCR está nos Quadros 1 e 2. As concentrações dos reagentes utilizados para uma reação
(50 μL) na segunda etapa da PCR foram: Tampão 1X (200mM Tris-HCl pH 8,4 e 500mM
KCl), MgCl
2
3,5mM, dNTP 0,4mM, iniciadores externos 0,6 pmoL e Taq DNA polimerase
0,025 U (QUADRO 2). O termociclador utilizado na padronização da segunda etapa foi o
ABI 9700 (Applied Byosistems, CA, EUA).
Ressalta-se que em ambas as etapas de PCR foi utilizada água deionizada como
controle negativo e que, até que fossem produzidos controles próprios para esse estudo
com diferentes níveis de hipermutação, foi utilizado o controle-padrão do Laboratório de
Retrovirologia: plasmídeos purificados do clone HXB2 do HIV-1.
QUADRO 2 - Constituintes da reação e perfil de ciclagem da PCR empregada na
detecção de fragmento da integrase do HIV-1.
ETAPA DA PCR COMPOSIÇÃO DA REAÇÃO (1X) PERFIL DE CICLAGEM
HIV – INTEGRASE primeira reação
Tampão 1x (Tris-Cl 28mM pH 8,4 / KCl 70mM), MgCl
2
4,0mM, dNTP 0,4 mM, DNA polimerase (Taq) 0,025U
e cada iniciador 0,6pM.
94°C – 7’(1x); 94°C –30”, 49
a 45°C–45”, 72°C–55’’ (9x);
94°C –30”, 45°C–45”, 72°C–
55’’ (26x); 72°C-7’(1x)
HIV – INTEGRASE Segunda reação
Tampão 1x (Tris-Cl 28mM pH 8,4 / KCl 70mM), MgCl
2
3,5mM, dNTP 0,4 mM, DNA polimerase (Taq) 0,025U
e de cada iniciador 0,6 pM.
94°C–7’(1x);94°C–30”,
53°C–45”, 72°C–50’’ (35x);
72°C-7’(1x)
13
3.4 DETECÇÃO DO PRODUTO AMPLIFICADO
Para verificar a presença do produto amplificado do gene da integrase do HIV-1 foi
realizado o fracionamento eletroforético. O produto da PCR foi submetido a eletroforese
em gel de agarose 1% em Tampão TBE 0,5X (Tris-Borato-EDTA, Invitrogen Carlsbad CA,
EUA), corado com o intercalante GelRed™ 10000X em água (Biotium, Inc.Qiagen,
Alemanha). Foram utilizados 5,0μL do produto de nested-PCR e 2,0 μL de tampão de
carregamento (40% de sacarose; 0,25% de azul de bromofenol) para a corrida
eletroforética, que realizou-se no tempo de 45 minutos, a 100 Volts e 100mA. Para
averiguar-se a especificidade da PCR, a determinação do tamanho do produto amplificado
se deu em comparação com um marcador de peso molecular padrão de 100 bp
(Invitrogen, BRL, Gaithersburg, MD, EUA).
O gel de agarose foi visualizado em exposição a radiação ultravioleta (320 nm) e
fotografado utilizando-se o fotodocumentador Geldoc-it TS Imaging Systems BioImaging
(UVP, Cambridge, CA, EUA).
3.5 DETECÇÃO DE HIPERMUTAÇÃO
Ligantes seqüência-específicos de DNA retardam a mobilidade eletroforética de
fragmentos de DNA de tamanhos semelhantes e composição distinta porque aumentam o
coeficiente de fricção das seqüências a que se ligam durante uma eletroforese,
ocasionando migração diferenciada proporcionalmente à quantidade de ligante que
interage com a seqüência-alvo.
14
O corante HA-yellow (Resolve-It Kit - Vector Laboratories, Burlingname, CA, USA)
contém bisbenzimida (Hoechst 33258 ou 2·-[4-hidroxifenil]-.5-[4-metil-1-piperazinil]-2,5·-bi-
1H-benzimidazol) ligada covalentemente ao polietilenoglicol. A bisbenzimida tem afinidade
por bases adeninas (A) e timinas (T) do genoma, intercalando-se nessas regiões. Devido
ao alto peso molecular resultante do composto HA-Yellow, em que a bisbenzimida está
peguilada, seqüências de DNA com maior conteúdo genômico de adeninas são retardadas
numa corrida eletroforética proporcionalmente ao conteúdo de adeninas que as constitui.
A preparação do gel de agarose contendo HA-Yellow procedeu de maneira
semelhante à de um gel de agarose convencional - gel de 1% de agarose em TBE 0,5 X
(TBE: 0,89 M Tris; 0,89 ácido bórico e 0,02 M EDTA pH 8,0). Depois de aquecida e
liquefeita a solução de agarose em TBE 0,5 X, o corante HA-Yellow foi adicionado em
concentração de 9μL/ mL de gel depois que a solução de agarose teve o pH ajustado para
7,5 e temperatura de cerca de 65ºC. Quando o gel estiver solidificado, 2,0 μL do produto
da segunda etapa da PCR misturado a 2,0 μL de tampão de carregamento (40% de
sacarose; 0,25% de azul de bromofenol) são aplicados no gel, que corre em cuba
eletroforética por 2h30 min a 80V em tampão TBE 0,5X. Ressalta-se que em géis com HA-
Yellow não são utilizados marcadores de peso molecular. Após a corrida, as bandas foram
reveladas a partir exposição a luz ultravioleta (320nm) porque o corante HA-Yellow emite
fluorescência ou, quando foi necessária melhor visualização das bandas, o gel foi
colocado numa solução de brometo de etídio (0,5μg/mL) em água destilada por 30
minutos e depois fotografado utilizando-se o fotodocumentador Geldoc-it TS Imaging
Systems BioImaging (UVP, Cambrige, CA, EUA).
15
3.6 CLONAGEM DO PRODUTO DA PCR
Foram escolhidas algumas amostras clínicas (B190, AJB e amostra 35789 do
paciente de índice 99 deste estudo) que apresentaram padrões de hipermutação variáveis
para clonagem e sequenciamento. O objetivo desse procedimento foi produzir diferentes
clones para validar o método de detecção de hipermutação com o corante HA-Yellow
dentro desse estudo e produzir controles com níveis de hipermutação diferentes que
serviriam como parâmetros para a classificação das amostras clínicas.
A clonagem de um fragmento de PCR consiste na ligação entre o produto de PCR e
um vetor bacteriano que possa ser selecionado por alguma característica fenotípica e na
posterior inserção desse vetor em uma célula competente (transformação) para replicação
do respectivo fragmento.
3.6.1 REAÇÃO DE LIGAÇÃO
Para a reação ligação foi utilizado o vetor TOPO TA
®
(Invitrogen) seguindo-se as
recomendações estabelecidas pelo fabricante. TOPO TA é um vetor recombinante que
possui um gene de resistência à ampicilina e um gene que codifica para a enzima β-
galactosidase. Além disso, inicialmente linearizado, o TOPO TA possui numa das
extremidades uma cauda politiminada que atrai o fragmento fresco (recente) de PCR e, na
outra extremidade, um resíduo de tirosina cujo grupamento fosfato fornece energia para a
ligação fosfodiéster entre o vetor e o fragmento amplificado na PCR.
Na reação de ligação, o fragmento de integrase do HIV-1 amplificado na PCR foi
inserido no vetor Topo TA. Procedeu-se a reação (QUADRO 3) adicionando 1,0μL de
16
solução salina (NaCl 200mM, MgCl
2
10mM), 1,0μL de vetor TOPO TA (10ng/μL)
previamente descongelado em gelo, 0,5-4,0μL de produto fresco de PCR e água estéril
para completar o volume final de 6,0μL da reação. Essa solução permaneceu por 5
minutos a temperatura ambiente e depois foi mantida em gelo até a etapa da
transformação.
O QUADRO 3 apresenta a reação de ligação que produz o plasmídeo TOPO TA com o
inserto de interesse.
REAÇÃO DE LIGAÇÃO COMPOSIÇÃO DA REAÇÃO (1X) PROCEDIMENTO
HIV-1 – INTEGRASE
Vetor TOPO (DNA plasmidial 10ng/μL) 1,0μL
Solução salina (NaCl 200mM, MgCl
2
10mM)) 1,0μL
Amostra (produto fresco de PCR ) 0,5 -4,0μL
Ág
ua Estéril para completar o volume final
__________
Volume Final 6,0μL.
Depois de 5 minutos a temperatura
ambiente, a solução é incubada em
gelo até a transformação.
3.6.2 TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS QUIMIOCOMPETENTES POR CHOQUE TÉRMICO
Alguns vials contendo bactérias quimiocompetentes foram gentilmente cedidos para
a execução desse procedimento pelo Departamento de Biologia Celular da Universidade
Federal de São Paulo, situado à Rua Botucatu 862, 8º andar. Ao microtubo contendo as
bactérias quimiocompetentes previamente descongeladas em gelo foram adicionados 2,0-
3,0µL do DNA plasmidial. Inicialmente, os microtubos contendo solução composta de
bactérias e os diferentes plasmídeos foram transferidos para um suporte com gelo, onde
foram mantidos por 30 minutos. Após essa etapa, os microtubos foram transferidos para
um termobloco previamente aquecido a 42ºC durante 1 minuto e, em seguida, esses
microtubos foram novamente colocados no suporte com gelo por 2 minutos. O choque
térmico ocasionou mudança de permeabilidade na parede bacteriana, permitindo que os
17
plasmídeos contendo os insertos de interesse fossem internalizados pela bactéria
competente.
Após esse procedimento, imediatamente, adicionou-se 400,0µL de meio SOC
(Invitrogen) à solução contendo as bactérias transformadas, sucedendo-se a incubação
das mesmas em estufa a 37ºC por 1 hora. Posteriormente, a solução foi distribuída em
duas placas contendo meio LB, ampicilina (50µg/mL), IPTG (20μg/mL) e X-GAL
(40μg/mL), com aproximadamente metade do volume total da solução em cada uma das
placas, para incubação em estufa a 37
o
C por 18-24 horas. Ressalta-se que, devido ao
delineamento do vetor TOPO TA, quando o fragmento amplificado na PCR se insere,
impede a expressão da enzima β-galactosidase. A enzima β-galactosidase degrada o
substrato X-Gal num produto de coloração azulada. Numa placa, as colônias azuladas
sintetizavam a enzima β-galactosidase porque continham o vetor vazio (sem o inserto) e
as colônias que continham o inserto eram as brancas e não degradavam, portanto, o
substrato X- Gal.
Verificado o crescimento de colônias bacterianas nas placas, algumas colônias
brancas de cada placa foram selecionadas para crescer em 50,0mL de caldo TSB (Merck
KGaA, Darmstadt, Alemanha) ou LB contendo ampicilina 50,0µg/mL (Sigma). Os tubos
falcon (50,0mL) contendo a cultura bacteriana foram mantidos em um agitador (MODELO)
a 37ºC com rotação moderada (aproximadamente 200rpm) por 18-24 horas. Após
observação do crescimento dos clones no caldo pela análise da turbidez do meio, uma
alíquota de 1mL foi retirada para a realização de uma PCR confirmatória da transformação
e outra alíquota de 850,0µL de cada garrafa, adicionada de 150,0µL de glicerol 10% para
serem estocadas a - 80 ºC.
18
3.6.3 PCR PARA VERIFICAÇÃO DA TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
As alíquotas de 1,0mL com cada transformante foram centrifugadas por 15 minutos
a 4,0
o
C e 6000rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado formado foi
ressuspenso em 50,0µL de água deionizada. A mistura foi aquecida em termobloco a
100
o
C por 10 minutos para lise da parede bacteriana e liberação do material genético.
Posteriormente, 5,0µL do lisado foram utilizados como amostra para a PCR confirmatória
da transformação.
A PCR confirmatória foi realizada em duas etapas, seguindo o protocolo e o perfil
de ciclagem descritos anteriormente no QUADRO 1. As amostras que se revelaram
positivas para o fragmento da integrase do HIV-1 foram submetidas a corrida eletroforética
em gel de agarose contendo HA-Yellow e, dentre essas, algumas foram selecionadas para
sequenciamento.
3.7 PURIFICAÇÃO DOS PLASMÍDEOS
Os transformantes positivos na PCR confirmatória da transformação foram
purificados utilizando-se o HiYield™ Plasmid Mini Kit (Real Biotech Corporation, Calgary,
AB, Canadá) de acordo com as instruções do fabricante.
Foi retirada uma alíquota de 10,0mL do caldo de crescimento bacteriano turvo.
Esse conteúdo foi transferido para um tubo falcon (15,0mL) para centrifugação por 15
minutos a 6000rpm e 4,0ºC. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em
400,0µL de tampão PD1. A solução foi vortexada por 5 segundos em velocidade média
19
e recebeu adição de 400,0µL de tampão de lise alcalina PD2. Depois de
homogeneizada por inversão manual (10 vezes), a solução foi neutralizada pela adição
de 600,0µL de tampão PD3. O composto viscoso formado foi separado do tampão que
continha o DNA plasmidial por centrifugação a 14000rpm por 3 minutos. O
sobrenadante foi coletado e transferido para uma coluna de sílica na qual passou por
nova centrigação a 8000rpm por 30 segundos. Adicionou-se volume de 400,0µL do
tampão de lavagem W1 buffer, seguindo-se uma etapa de centrifugação idêntica à
ultima. Posteriormente descartou-se o conteúdo retido no tubo coletor, e acrescentou-
se volume de 600,0µL do segundo tampão de lavagem – Wash Buffer – A solução foi
novamente centrifugada a 8000rpm por 30 segundos. Para secagem completa da
coluna de sílica, procedeu-se uma centrifugação adicional em velocidade máxima por 2
minutos. Ao final, o volume de 50,0µL de tampão de eluição (Elution Buffer) foi pipetado
no centro da coluna para ser incubado por 2 minutos e centrifugado por 2 minutos em
velocidade máxima para eluição do DNA plasmidial num microtubo de 1,5mL. Os
plasmídeos purificados foram quantificados no GeneQuantpro (Amersham Pharmacia
Biotech AB, Cambridge, England) a 260nm.
3.8 PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR AMPLIFICADOS
Os produtos da PCR de algumas amostras amplificadas do gene da integrase do
HIV-1 que foram escolhidas para sequenciamento foram purificados utilizando-se o kit
ChargeSwitch PCR Clean-Up Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), conforme instruções do
fabricante.
20
O kit de purificação de produto de PCR remove sais, iniciadores, dNTPs e outros
reagentes não ácido-nucléicos. A tecnologia dos beads magnéticos para purificação do
ácido nucléico é carga-dependente e é determinada pela solução-tampão em que estão os
beads. Em condições de baixo pH, os beads magnéticos têm uma carga positiva e se
ligam ao ácido nucléico. Proteínas e outros contaminantes não se ligam e são retirados na
presença do tampão de lavagem. Para eluir o ácido nucléico, a carga na superfície é
neutralizada pelo aumento de pH para 8,5 a partir de tampão de eluição com baixa
concentração de sais.
Resumidamente, em tubos cônicos de 1,5 mL foram transferidos 50,0 μL do produto
de PCR e adicionados 50,0μL do tampão de purificação (N5) e 10,0μL dos beads
magnéticos. A solução foi homogeneizada cuidadosamente para não ocasionar a
formação de bolhas. Os tubos foram então incubados em temperatura ambiente por 1
minuto para permitir a ligação dos beads ao produto da PCR. Seguidamente, os tubos
foram colocados na Magna Rack diante de um ímã por 1 minuto ou até que se formasse o
precipitado. Sem remover os tubos da frente do ímã, o sobrenadante de cada um foi
descartado. Posteriormente, os tubos foram removidos da frente do ímã para adição de
150μL de tampão de lavagem (W12), com homogeneização para dissolver o precipitado e
cuidado de não formar bolhas. Os tubos foram colocados novamente na Magna Rack em
frente ao ímã por 1 minuto ou até formação de novo precipitado e o sobrenadante foi
novamente descartado, sem remover os tubos da frente do ímã. O procedimento de
lavagem foi repetido. Por fim, foram adicionados 40μL do tampão de eluição (E5) e a
solução foi homogeneizada até dissolver o precipitado. Os tubos foram incubados em
temperatura ambiente por 1 minuto e colocados na frente do ímã por 1 minuto ou até que
21
se formasse o precipitado. Posteriormente, sem remover os tubos da frente do ímã, o
sobrenadante contendo o produto purificado da PCR foi cuidadosamente transferido para
tubos estéreis, armazenados a – 20ºC.
Após obter o produto de purificação, foi realizado novo fracionamento eletroforético em de
agarose (1% em TBE 0,5 X) com 2,0μL de tampão de carregamento (40% de sacarose;
0,25% de azul de bromofenol) e 5,0μL do produto purificado. Para a comparação do peso
molecular dos fragmentos amplificados foi utilizado um marcador padrão de peso
molecularde 100 bp - Low DNA Mass Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).
3.9 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
A reação de seqüenciamento de alguns clones para o gene integrase do HIV-1
realizou-se utilizando os iniciadores interno senso: 5’-AGT GAA TCA GAG TTA GTC AAT CAA
ATA AT-3’ (localizado na posição 4091 – 4114 do HXB2) e interno anti-senso: 5’-CCC TAC
AAC CCA CAA AGT CAA- 3’ (localizado na posição 4653 – 4673 do HXB2), seguindo as
especificações do kit Amersham Biosciences DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing
Kit (Piscataway, EUA). As concentrações dos reagentes e as condições da reação de
seqüenciamento apresentam-se reunidas no QUADRO 4.
A reação de seqüenciamento foi aplicada em uma placa de 96 poços, sendo que
cada reação conterá 6,0μL amostra (produto de PCR purificado, diluído ou não em água
RNA free q.s.p.) Assim sendo, o volume de cada amostra para essa solução foi definido
por meio da quantificação realizada através da sua comparação visual com um padrão de
massa molecular Low DNA Mass Ladder (200,0mL, 4,0mL/appl - Invitrogen, Califórnia,
22
USA) em gel de agarose pós-purificação. Objetivou-se que cada amostra a ser
seqüenciada tivesse concentração de aproximadamente 40,0ng de DNA e por isso,
quando necessário, a amostra foi diluída.
A solução final (mix, tampão, iniciador e
amostra) totalizou 15,0 μL por reação.
As reações foram submetidas à ciclagem em termociclador ABI 9700 (Applied
Biosystems, CA, EUA) nas condições resumidas pelo QUADRO 4:
QUADRO 4 - Constituintes da reação e perfil de ciclagem da PCR empregada na reação
de sequenciamento de fragmento da integrase do HIV-1.
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO COMPOSIÇÃO DA REAÇÃO (1X) PERFIL DE CICLAGEM
HIV-1 – INTEGRASE
Terminator Ready Reaction Mix (Terminator Ready
Reaction Mix : dNTPs, ddNTPs, AmpliTaq DNA
polimerase, MgCl
2
, tampão Tris-HCl) 2,0 μL, Tampão
4,0 μL, iniciador interno (0,2 pMol) 3,0 μL
94°C – 20’’; 50°C –15”, 60°C–1’
(25x)
Durante esta reação o iniciador se liga à seqüência complementar da fita de DNA
e os nucleotídeos são incorporados de acordo com a fita molde. Ocorre tanto a
incorporação dos nucleotídeos livres não-marcados, quanto a de nucleotídeos marcados
com fluorescência. Os nucleotídeos marcados são chamados de nucleotídeos de
terminação, pois, cada vez que um nucleotídeo de terminação é incorporado, a leitura da
fita molde é interrompida, gerando um fragmento de tamanho respectivo ao local onde o
nucleotídeo de terminação foi incorporado. Ao final da reação são gerados fragmentos de
tamanhos diferentes. Para eliminar os resíduos (sobras de inciadores, ddNTPs, alguns
sais, entre outros), os produtos gerados nessa reação foram precipitados (Reação de
Precipitação) e, posteriormente, submetidos a separação eletroforética e análise por um
23
seqüenciador automático modelo ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Byosistems,
CA, EUA).
3.9.1 PRECIPITAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQÜENCIAMENTO
Ao final da reação de seqüenciamento, como já dito, são gerados fragmentos de
tamanhos diferentes e existe sobra de iniciadores, dNTPs, alguns sais, entre outros.
Procedeu-se a precipitação para eliminar esses resíduos.
Foram adicionados 90,0μL de etanol 70% ao produto da reação sequenciamento,
sucedendo-se mistura do mesmo em agitador automático e breve centrifugação. Após
incubação por 15 minutos sob condição de temperatura ambiente e ausência de luz, esse
produto foi centrifugado a 4000rpm por 45 minutos a 20
o
C. O resultado dessa centrifugação
foi a formação de um botão (pellet) que continha o produto do sequenciamento precipitado.
O sobrenadante foi desprezado. Adicionou-se 150,0μL de etanol 70%, submetendo o
produto a uma segunda etapa de mistura em agitador automático e centrifugação a
4000rpm por 15 minutos a 20
o
C para formação de botão (pellet) mais purificado e
desprendimento de resíduos. Após retirada do sobrenadante, o produto precipitado foi
colocado no termociclador a 94
o
C por cerca de 3 minutos, descoberto, para secagem
completa do botão (pellet).
As amostras precipitadas foram ressuspendidas em 15,0μL de formamida HiDye e
centrifugadas a 200rpm por 1 minuto a 20
o
C. A seguir, foram denaturadas a 95
o
C por 3
minutos e introduzidas no seqüenciador automático ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
(Applied Byosistems, CA, EUA) para separação eletroforética.
24
3.9.2 ANÁLISE DOS RESULTADOS DO SEQÜENCIAMENTO
A edição e análise dos fragmentos seqüenciados foram feitas utilizando-se o
software Seqüencher 4.5 (Genes Code Corporation, EUA), que permite a criação de uma
seqüência consenso entre as seqüências de nucleotídeos geradas pelos iniciadores senso
e anti-senso.
Posteriormente, as seqüências de nucleotídeos obtidas foram alinhadas por meio do
programa Clustal X (THOMPSON et al., 1997) e foram cortadas para terem o mesmo
comprimento com o software BioEdit 7.0 para então serem submetidas ao software
HyPermut (acessível na base de dados Los Alamos - http://hiv-web.lanl.gov/content/
index), específico para análise dos níveis de hipermutação das seqüências obtidas.
Em estudo publicado em 2001, Janini e colaboradores
7
validaram a técnica de
detecção de hipermutação em gel com HA-Yellow utilizando sequenciamento do
fragmento da protease do HIV-1 de clones. A Figura 3 demonstra como o
sequenciamento permite estabelecer um equivalente de hipermutação ao padrão de
migração de um produto amplificado por PCR em gel de agarose com HA-Yellow. As
sequências geradas por PCR da região da protease do HIV-1 foram submetidas a
fracionamento eletroforético em gel normal de agarose e depois a gel de agarose com HA-
Yellow. A partir do sequenciamento e do alinhamento das seqüências, o gradiente de
hipermutação obtido no gel de agarose com HA-Yellow foi confirmado como sendo função
do conteúdo AT da seqüência, e os parâmetros que foram aplicados às amostras clínicas
25
também foram estabelecidos. Assim, foi demonstrado que quanto menor a migração do
produto de PCR amplificado, maior o conteúdo AT dessa seqüência.
Figura 3. Calibração do método de detecção de hipermutação com sistema de gel com HA-Yellow. À
esquerda abaixo, o produto de PCR de 297pb da região da protease do HIV-1 foi submetido a gel de
agarose 1%. À direita, os mesmos fragmentos foram submetidos a gel de agarose com HA-Yellow e a
sequenciamento. Observou-se que à medida que se verifica uma menor migração do produto amplificado
por PCR segue-se um aumento proporcional do conteúdo AT da seqüência.
Foram selecionados clones para serem utilizados como controles em cada corrida
eletroforética para avaliação das amostras clínicas. Foram obtidas as sequências
nucleotídicas dos clones utilizados como controles - controle normal, (B190D), controle de
nível intermediário de hipermutação (A3IVaE) e controle hipermutado (A4aP) - as
sequências alinhadas e de mesmo comprimento (em número de pares de bases) foram
analisadas no software Hypermut (acessível em
http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/
HYPERMUT/hypermut.html). Para cada teste realizado, este software infere um valor que
26
corresponde ao resultado de um Teste Exato de Fisher que compara uma amostra
controle (determinada pelo próprio analista e que deve conter o menor índice de
substituições G para A possível) a uma ou mais amostras. O algoritmo deste software
normaliza o número de substituições do contexto da hipermutação (substituições G para
A) em relação a outras substituições não-específicas e ao tamanho da sequência
nucleotídica.
Uma vez que o software Hypermut corroborou a classificação inicial dos clones
utilizados como controles hipermutado (A4aP) e normal (B190D) nos géis de agarose com
HA-Yellow, procedeu-se um estudo para encontrar um correspondente estatístico que
relacionasse o deslocamento de cada amostra clínica no gel em relação ao deslocamento
dos clones controles, reproduzindo os resultados do Hypermut. A resolução estatística das
imagens se deu a partir do teste de análise de variância (ANOVA) de K-means que
permitiu inferir se cada amostra seria agrupada como normal ou hipermutada. Esta
metodologia estatística foi validada a partir de outros 20 clones sequenciados (clones da
amostra 35789 do paciente 99) e possibilitou, ao final, discriminar de forma inequívoca
uma amostra segundo seu padrão de deslocamento como pertencente ao mesmo
grupamento do padrão de clone hipermutado ou ao mesmo grupamento do padrão de
clone normal.
3.10 PADRONIZAÇÃO DA DETECÇÃO DE HIPERMUTAÇÃO COM PCR EM TEMPO REAL
A PCR em Tempo Real (PCR Real Time) une a metodologia de PCR convencional
a um sistema que monitora, por detecção de fluorescência, a quantidade de produto
27
amplificado durante o curso da reação. Nesta metodologia, a fluorescência emitida por
sondas ou corantes é diretamente proporcional à quantidade de produto formado. Assim
sendo, o monitoramento da cinética de amplificação da PCR permite que sejam realizadas
mensurações quantitativas relativas ou absolutas do ácido nucléico presente em uma
amostra.
O SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) é um dos
corantes intercalantes mais utilizados na PCR em Tempo Real. Ele é inespecífico e tem
por característica a emissão de fluorescência (~560nm) quando ligado na dupla fita, mas
não na fita simples, de DNA. A fluorescência emitida pelo SYBR Green é proporcional ao
número de fitas duplas de DNA em uma reação.
Ainda na PCR em Tempo Real, depois que a fase amplificação do ácido nucléico se
completa, são coletados os dados para o cálculo da Temperatura de Melting. Nesta etapa,
a temperatura é gradualmente aumentada e a fluorescência é medida em função da
temperatura. Quando é atingida uma temperatura suficiente para ocasionar a separação
das fitas duplas de DNA amplificadas numa reação, o corante intercalante se desliga e a
fluorescência emitida cai abruptamente. Graficamente, neste ponto forma-se um ângulo
(slope) que corresponde à temperatura de dissociação da sequência. Esta temperatura,
referida como Temperatura de Melting (TM), indica que 50% das fitas de produto
amplificado estão dissociadas e é determinada como o máximo valor da primeira derivada
negativa da curva de Melting
35
, como apresentado na Figura 4.
28
Figura 4. Obtenção da Temperatura de Melting numa curva de temperatura em função da emissão de
fluorescência e a derivação desta curva.
Adicionalmente, sabe-se que uma das limitações do SYBR Green é que esse
corante se liga a quaisquer DNA de fita dupla, inclusive a produtos inespecíficos ou
dímeros de iniciadores formados durante a PCR. A análise da Curva de Melting permite
que as seqüências não específicas sejam excluídas da análise por acusarem diferentes
temperaturas de dissociação distintas das da seqüência específica.
Uma seqüência hipermutada tem diminuído seu conteúdo GC e tem, portanto,
temperatura de dissociação diminuída em relação a uma seqüência normal (QUADRO 6).
Por isso a análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real pode distinguir
seqüências hipermutadas de seqüências não hipermutadas com base na temperatura de
dissociação destas seqüências.
O produto da primeira etapa de PCR de alguns plasmídeos purificados e algumas
amostras clínicas bem como os clones gerados foram submetidos a análise por PCR em
Tempo Real seguindo o protocolo descrito no Quadro 5.
29
QUADRO 5 - Constituintes da reação e perfil de ciclagem da PCR Em Tempo Real
empregada na detecção de fragmento da integrase do HIV-1.
PCR EM TEMPO REAL COMPOSIÇÃO DA REAÇÃO (1X) PERFIL DE CICLAGEM
HIV-1 – INTEGRASE
SYBR Green PCR Master Mix (1x) 12,5μL, iniciador
interno senso (10,0pM) 1,0μL, iniciador interno anti-
senso (10,0pM) 1,0μL, água deionizada 5,5μL, Amostra
5,0μL
95°C – 10’ (1x); 95ºC -15’’,
54ºC-40’’, 72ºC-30’’ (40X);
95°C –1’ (1x); 54ºC-1’ (1x);
54-80°C (0,5º/ciclo)–10’’ (80x)
4 RESULTADOS
4.1 PADRONIZAÇÃO DA PCR
Na padronização da PCR para detecção do fragmento de integrase do HIV-1, foram
testados os diferentes pares de iniciadores externos individualmente na primeira etapa da
PCR e o par de iniciadores internos na segunda etapa. Posteriormente, foi observado que
a mistura de iniciadores externos degenerados com iniciadores externos hipermutados
(proporção de 1:1) na primeira etapa da PCR resultava em bandas bem definidas (Figura
5). Essa mistura de iniciadores e a proporção dos mesmos na reação foram adotadas para
os experimentos que se sucederam.
Figura 5:Padronização da PCR para detecção de fragmento da integrase do HIV-1. Acima estão
representadas diferentes combinações de iniciadores externos e abaixo estão representadas as
concentrações finais de Cloreto de Magnésio na primeira etapa da PCR.
30
A primeira etapa da PCR é crítica para detecção de seqüências hipermutadas,
principalmente porque os iniciadores dessa etapa tem sítios hipermutados e determinam a
especificidade dessa reação em amplificar possíveis seqüências com essa característica.
De acordo com a Figura 5, a alteração na concentração final do cloreto de magnésio
aparentemente não produziu grande efeito sobre a qualidade da banda amplificada no gel
de agarose, entretanto, quando as mesmas amostras foram submetidas a fracionamento
eletroforético em gel com corante revelador de hipermutação, HA-Yellow, seguiu-se uma
maior detecção de seqüências hipermutadas nas amostras de maior concentração final de
magnésio (4,0mM) na primeira etapa da PCR. Assim sendo, uma das informações mais
relevantes obtidas nos testes de padronização da PCR para amplificação de fragmento da
integrase do HIV-1 foi que a detecção de seqüências hipermutadas é dependente da
concentração de magnésio da primeira etapa da PCR. O cloreto de magnésio utilizado na
PCR tem função de estabilizar as fitas de DNA e de facilitar a atividade da enzima
polimerase. Nesse sentido, proporcionalmente à medida que a concentração final do
magnésio foi aumentada (de 3,0 para 4,0mM) na primeira etapa da PCR, seguiu-se uma
melhor a capacidade de detecção de hipermutação no gel com HA-Yellow (Figura 6).
31
Figura 6. Detecção de Hipermutação em Gel de agarose com HA-Yellow de PCR de fragmento da integrase
do HIV-1 sob concentrações crescentes de Cloreto de Magnésio. A detecção de hipermutação nas amostras
AJB, A2 e A3 foi otimizada com o aumento da concentração final de Cloreto de Magnésio.
A padronização da PCR para fragmento da integrase do HIV-1 foi finalizada com a
eliminação da presença de produtos inespecíficos. A mistura de iniciadores externos com
diferentes temperaturas de anelamento trouxe como conseqüência a dificuldade de
otimização de uma temperatura de anelamento ótima para a reação. A diminuição do
tempo de extensão de 2 minutos para 55 segundos e a utilização da PCR touch down
(primeira etapa da PCR) permitiu minimizar a presença de bandas espúrias (Figura 7). A
ausência de bandas inespecíficas permite qualidade dos resultados na avaliação do
produto de PCR em gel com HA-Yellow porque exclui possíveis confusões com as bandas
específicas.
32
Figura 7: Padronização da Primeira Etapa da PCR. Experimento utilizando PCR Touch Down para detecção
de fragmento da integrase do HIV-1 em concentrações crescentes de MgCl
2
4.2 TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA POR CHOQUE TÉRMICO
Antes de a transformação bacteriana ser feita por choque térmico, foi feita a tentativa
por eletroporação, mas a eficiência do ensaio foi muito pequena. Com o emprego do
choque térmico em linhagens de E.Coli DH5α quimiocompetentes, foi possível a utilização
de diversas amostras para obtenção de clones com diferentes níveis de hipermutação.
Os clones que, em gel com HA-Yellow, apresentassem níveis diferentes de
hipermutação foram seqüenciados para validação da técnica. O produto de PCR (582pb)
dos clones dos paciente referido como B190 e os do paciente 99 da amostra 35789
produzidos foram submetidos a fracionamento eletroforético em gel de agarose com HA-
Yellow.
Foram selecionados também 3 clones obtidos a partir de outras amostras para que,
validada a técnica, esses clones fossem utilizados como parâmetro para cada gel com
corante HA-Yellow durante a análise do nível de hipermutação das amostras clínicas. Os
clones escolhidos foram: A4aP (mais hipermutado), A3IVaE (intermediariamente
hipermutado) e B190D (não hipermutado).
33
Figura 8. Gel de agarose com HA-Yellow contendo os clones com diferentes níveis de hipermutação para
seleção dos controles de nível de hipermutação a serem utilizados para avaliação das amostras clínicas. As
setas vermelhas indicam os clones escolhidos: B190D, A3IVaE e A4aP, como, respectivamente, controle
normal, controle com nível intermediário de hipermutação e controle hipermutado.
Além disso, como apresentado na Figura 9, os clones B190H e B190D
evidenciaram diferentes mobilidades e foram selecionados para avaliações adicionais
neste estudo. Conhecendo-se que o corante revelador de hipermutação HA-Yellow liga-se
a adeninas e timinas inespecificamente ao longo da seqüência com a qual está em
contato, foi questionado se pequenas diferenças observadas entre as amostras que
migram mais no gel com HA-Yellow (amostras “não hipermutadas”) poderiam refletir a
diversidade genética intrínseca do subtipo viral com o qual o paciente foi infectado. Se
assim fosse, seria alargado o limiar de caracterização do grupo do grupo das amostras
“não hipermutadas”, considerando-se o conteúdo AT intrínseco dos diferentes subtipos
virais. Foram avaliados os conteúdos GC e AT do mesmo fragmento de integrase do HIV-
1 comparando os clones B190 D e B190H desse estudo com seqüências de HIV-1
brasileiras dos subtipos mais comuns da epidemia brasileira (B, C e F) disponíveis no
Gene Bank. O QUADRO 6 mostra a composição nucleotídica de cada seqüência.
34
QUADRO 6. Conteúdo GC e AT de seqüências dos principais subtipos brasileiros em
comparação com o e dos clones gerados nesse estudo
AMOSTRA SUBTIPO CONTEÚDO GC (%) CONTEÚDO AT (%)
BREPM1040
U52953
01BR087
B190D (
clone normal)
B190H (
clone hipermutado)
B
C
F
Dado ausente
Dado ausente
63,6
62,2
62,6
61,3
27,6
37,4
37,8
37,8
38,7
72,4
A partir dos resultados obtidos por essa análise foi demonstrado que a distribuição AT/ GC
na região da integrase do HIV-1 (da posição 4091-4673 do HXB-2) não varia
significativamente entre os diferentes subtipos virais, de maneira que pequenas variações
nas seqüências “não hipermutadas” não devem refletir a diversidade viral. Assim sendo,
embora o conteúdo A+T das sequências analisadas seja semelhante, as amostras clínicas
poderão ser seqüenciadas e subtipadas para responder melhor à questão que sugere que
possa existir algum subtipo mais vulnerável ao processo de hipermutação. Por outro lado,
uma vez que o conteúdo A+T dos diferente subtipos virais não deve ocasionar as
variações observadas no gel de agarose com HA-Yellow, outras mutações que não se
relacionam à atividade citidina deaminase das APOBECs celulares pode ser responsável
pela variação de migração observada entre diferentes amostras. Melhor explicando, a
menor variação interamostral no número de sítios de ligação do corante HA-Yellow pode
ser observada numa corrida eletroforética em gel de agarose com esse corante.
Entretanto, o corante HA-Yellow não se liga a quaisquer bases purínicas adenina do
genoma, mas requer um contexto tetranucleotídico específico de afinidade do corante:
AATT, AAAA> TAAT, ATAT> TTAA, TATA.
Assim sendo, os contextos AATT e AAAA têm
maior afinidade pelo corante que TAAT e ATAT, os quais, por sua vez, têm maior
35
afinidade com o corante que TTAA e TATA. Assim sendo, acredita-se que outras
mutações dos provírus, que em nada se relacionam com a hipermutação, possam também
ocasionar as pequenas variações entre amostras visualizadas no gel de agarose com HA-
Yellow.
4.3 DETECÇÃO DE HIPERMUTAÇÃO EM GEL DE AGAROSE COM HA-YELLOW
Para a detecção de hipermutação, todas as vezes, antes de um produto de PCR ser
submetido a fracionamento eletroforético em gel de agarose com HA-Yellow, esse produto
passou por triagem em gel de agarose convencional para avaliação da qualidade do
material amplificado.
Considera-se ainda que algumas amostras biológicas não puderam ser amplificadas
por PCR. Essas amostras apresentaram-se degradadas devido ao tempo de arquivamento
e/ou de condições eventualmente inadequadas de coleta ou de conservação e foram
excluídas do estudo.
Inicialmente, foi observado que amostras com bandas muito fortes em gel de
agarose, quando corridas em gel com HA-Yellow eram de difícil classificação porque
apresentavam “arraste”. Assim sendo, para bandas mais fortes no gel de agarose utilizou-
se 2,0µL de produto de PCR, enquanto que para as bandas mais fracas, foram utilizados
5,0µL de amplificado. A Figura 9 mostrou como a diminuição da quantidade de produto de
PCR aplicado no gel com HA-Yellow reduziu a quantidade de arraste das amostras de
bandas fortes e melhorou a definição de posição para classificação das mesmas no gel.
36
Figura 9: Padronização da quantidade de produto de PCR aplicado no gel com HA-Yellow. O gel colocado à
esquerda resulta de aplicação de 5,0µL de DNA amplificado, enquanto que o da direita resulta da aplicação
de 2,0µL de DNA amplificado.
Algumas bandas que apareceram fracas no gel de agarose, não apareceram no
respectivo gel com HA-Yellow e foram momentaneamente descartadas. Salienta-se que
ao final dos experimentos será feita a tentativa de resgate das amostras que não
amplificaram adequadamente.
Por outro lado, mesmo com a reação padronizada, houve o aparecimento de
bandas espúrias (~300bp) discretas em algumas amostras, mas estes produtos
inespecíficos não se confundiram com as bandas de interesse no gel com HA-Yellow (ver
Figura 10).
Figura 10. Detecção de fragmento da integrase do HIV-1 de amostras clínicas em gel de agarose. A seta
vermelha representa o tamanho esperado do produto da PCR.
37
4.4 SEQUENCIAMENTO DOS CLONES UTILIZADOS COMO CONTROLES
O sequenciamento dos clones demonstrou a especificidade da reação, confirmando
que o fragmento amplificado na PCR correspondia à região de interesse (produto de
582pb da integrase do HIV-1, posição 4091 a 4673 no HXB-2).
Em trabalhos publicados anteriormente, o sequenciamento corroborou a hipótese
de que a diferença de migração de bandas de clones ou amostras clínicas em géis com
HA-Yellow correlaciona-se com os respectivos níveis de hipermutação dessas
seqüências
7
. Assim sendo, após reproduzirem seu perfil de deslocamento em diferentes
corridas eletroforéticas, estes clones foram escolhidos como indicadores dos diferentes
níveis de hipermutação (Figura 8).
Uma vez que foram obtidas as sequências nucleotídicas dos clones utilizados como
controles - controle normal, (B190D), controle de nível intermediário de hipermutação
(A3IVaE) e controle hipermutado (A4aP) - as sequências alinhadas e de mesmo
comprimento (em número de pares de bases) foram analisadas no software Hypermut
(acessível em
http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html) como
mostra a figura abaixo. Para cada teste realizado, o software infere um valor que
corresponde ao resultado de um Teste Exato de Fisher que compara uma amostra
controle (determinada pelo próprio analista e que deve conter o menor índice de
substituições G para A possível) a uma ou mais amostras. O algoritmo deste software
normaliza o número de substituições do contexto da hipermutação (substituições G para
A) em relação a outras substituições não-específicas e ao tamanho da sequência
nucleotídica.
38
Tendo em vista que o software Hypermut corroborou a classificação inicial dos
clones utilizados como controles hipermutado (A4aP) e normal (B190D) nos géis de
agarose com HA-Yellow, procedeu-se um estudo para encontrar um correspondente
estatístico que relacionasse o deslocamento de cada amostra clínica no gel em relação ao
deslocamento dos clones controles, reproduzindo os resultados do Hypermut. A resolução
estatística das imagens se deu a partir do teste de análise de variância (ANOVA) de K-
means que permitiu inferir se cada amostra seria agrupada como normal ou hipermutada.
Esta metodologia estatística foi validada a partir de outros 20 clones sequenciados (clones
da amostra 35789 do paciente 99) e possibilitou, ao final, discriminar de forma inequívoca
uma amostra segundo seu padrão de deslocamento como pertencente ao mesmo
grupamento do padrão de clone hipermutado ou ao mesmo grupamento do padrão de
clone normal.
Adicionalmente, como já foi dito, foram obtidas e avaliadas 20 sequências de clones
obtidos a partir da amostra 35789 do paciente 99 e estas sequências foram utilizadas para
validação da metodologia de análise das imagens dos géis de agarose com HA-Yellow
fotodocumentados.
Segue-se o alinhamento de todos os clones seqüenciados do estudo:
>B190D_NORMAL
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGTTAGTAGTGGAATCAGGAAAGTGCTATTTCTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGAAG
AACATGAAAAATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAACCTACCGCCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGTTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCC
ATGCATGGGCAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACCTAGAAGGAAAAGTTATCATAGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAG
TTATTCCAGCAGAAACAGGGCAAGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAATAATACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCTGTAATACAGTT
AAGGCCGCCTGTTGGTGGGCA-GGGATCAAGCAGGAAT
>A3IVaE_INTERMEDIARIA
CTGGCATGGGTACCAGCGCACAAAGGAATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGTCAGTACTGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAGATAAAGCCCAAGAAG
AACATGAGAAATATCACAGTAATTGGAGGGCGATGGCCAGTGATTTTAACCTGCCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGC
CATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAACTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAATTATCCTGGTAGCAGTCCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAA
GTTATTCCAGCAGAGACAGGGCAGGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGGAGATGGCCAGTAAAAACAGTACACACAGACAATGGCCCCAATTTCACCAGTAATACAG
TTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCA-GGGATCAAGCAGGAAT
>A4aP_HIPERMUTADA
CTGGCATAAGTACCAGCACACAAAAAAATTAAAAAAAATAAACAAGTAAATAAATTAGTCAGTACTGAAATTAAAAAAGTACTATTTTTAAATAAAATAAATAAGGCCCAAAAAAAGC
ATAAAAAATATCACAGTAATTAAAAAGCAATAGCTAGTAATTTTAACTTGCCACCTATAATAGCAAAAAAAATAGTAGCTAGCTGTAATAAATGCCAGCTAAAAAAAAAAGCCATGCT
39
TG-ACCAGTA-ACGGTATTCCAAAAATATGGCAGGTTAATTGTACACCCTTAAAAA-
AAAAATTATCCTAGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTAAATATATAAAAGCAAAAGTTATTCCAGCAGAGACAGGGCAAGAAACAGCATATTTTCTCTTAAAATTAGCAGAAAAATGGCC
AGTAAAAACAATACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACAGTTAAGGCCGCCTGTTAATGGGCG-AAAATCAAGCAAGAAA
>35789_01
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAAATAAACTAGTCAGTCATGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAAGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAGCAAAAAGGAGAAGC
CATGCATGGACAAGTAGTCTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAATTATCCTGGTAGCAGTACATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAA
GTTATTCCAGCAGAGACAGGACAAGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAATACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGGT
TAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCG-GGGATCAAGCAGGAAT
>35789_02
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAACTAGTCAGTCACGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAAGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAGCAAAAAGGAGAGGC
CATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAATTATCCTGGTAGCAGTACATGTAACCAGTGGATATACAGAAGCAGAG
GTTATTCCAGCAGAGACAGGACAAGAAACAGCATATTTTCTCTTAAAATTAGCAGGGAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGG
TTAAGGCCGCCTGTTGGTAGGCA-GGAATAAAGCAGGAAT
>35789_04
CTGGCATGAGTACCAGCACACAAAAAAATTAAAAAAAATAAACAAGTAAATAAACTAGTCAGTCATAAAATCAAAAAAGTACTATTTTTAAATAAAATAAGTAAAGCCCAAAAAAAAC
ATAAAAAATATCACAATAATTTAAAAGCCATAGCTAGTAATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAAAAATAGTAGCCTGCTGTAATAAATGTCAGCAAAAAAAAAAAGCCATGCA
TGAACAAGTAAACTGTAGTCCAGAAATATAGCAGCTAAATTATACACACTTAAAAAAAAAAATTATCCTAGTAGCAGTACATGTAGCCAGTGAATATATAAAAGCAGAAGTTATTCC
AGCAGAGACAGAACAAAAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGAAAAATAGCCAGTAAAA-
CAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCAGTTAAGGCCGCCTGTTAGTAAGCAAGAAATCAAGCAAAAAA
>35789_05
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAACTAGTCAGTCATGGAATCAGAAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAAGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAACAAAAAGGAGAAGCC
ATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAATTATCCTGGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAG
TTATCCCAGCAGAAACAGGACAAGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGGTT
AAGGCCGCCTGTTGGTGGGCG-GAAATAAAGCAGGAAT
>35789_06
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAACTAGTCAGTCATGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAAGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAGCAGAAAGGAGAGGC
CATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAATTATCCTAGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAA
GTTATCCCAGCAGAAACAGGACAAGAAACAGCGTACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGG
TTGAGGCCGCCTGTTGGTAGGCA-GGAATAAAGCAGGAAT
>35789_08
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGAATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTGGTCAGTGCTGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGAAG
AACATGAGAAATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAACCTACCACCTGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGGGAAGC
CATGCATGGACAAGTAGACTGTAGCCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCTTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAA
GTAATTCCAGCAGAGACAGGGCAAGAAACAGCATACTTCCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACAG
TTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCG-GGGATCAAGCAGGAAT
>35789_09
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAACTAGTCAGTCATGGAATCAGGAAAGTACTATTTCTAGATGGAATAAGCAAAGCCCAAGAAG
AACATGAAAGATATCACAATAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTGGCATACCACCTGTAATAGCCAAAGAAATAGTGGCCAGCTGTGATAAATGTCAGTTAAAAGGAGAAGCC
ATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAATTATCCTGGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAG
TTATTCCAGCAGAGACAGGACAAGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAGTTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGGT
TAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCG-GGAATAAAACAGGAAT
>35789_10
CTGGCATAAGTACCAGCACACAAAAAGATTAGAAGAAATAAACAAGTAGATAAACTAGTCAGTCATAGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATAGAATAAGTAAAGCCCAAGAAGA
ACATGAGAGATATCACAATAATTAGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAGCAAAAAGGAGAAGCCA
TGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGAAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAAGAAAAGTTATCCTAGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTAGATATATAAAAGCAAAAGTT
ATTCCAGCAAAGACAGAACAAAAAACAGCATATTTTCTCTTAAAATTAGCAGAAAAATAGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGGTTAAA
GCCGCCTATTAGTAAGCA-AAAATAAAGCAGAAAT
>35789_13
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAACTAGTCAGTCATGGAATCAGAAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAAGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCCGTGATAAATGTCAACAAAAAGGAGAAGC
CATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAAAAAAAAAAATTATCCTGGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAA
GTTATCCCAGCAGAAACAGGACAAGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGG
TTAAAGCCGCCTATTAGTAAGCA-AAAATAAAGCAGAAAT
>35789_15
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAACTAGTCAGTCATGGAATCAGAAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAAGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTCCTGTGATAAATGTCAACAAAAAGGAGAAGCC
ATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAATTATCCTGGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAG
TTATCCCAGCAGAAACAGGACAAGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGGTT
AAGGCCGCCTGTTGGTGGGCG-GAAATAAAGCAGGAAT
>35789_17
CTGGCATGAGTACCAGCACACAAAAAAATTAAAAAAAATAAACAAGTAAATAAACTAGTCAGTCATAAAATCAAAAAAGTACTATTTTTAAATAAAATAAGTAAAGCCCAAAAAAAAC
ATAAAAAATATCACAATAATTTAAAAGCCATAGCTAGTAATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAAAAATAGTAGCCTGCTGTAATAAATGTCAGCAAAAAAAAAAAGCCATGCA
TGAACAAGTAAACTGTAGTCCAGAAATATAGCAGCTAAATTATACACACTTAAAAAAAAAAATTATCCTAGTAGCAGTACATGTAGCCAGTGAATATATAAAAGCAGAAGTTATTCC
AGCAGAGACAGAACAAAAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGAAAAATAGCCAGTAAAA-
CAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCAGTTAAGGCCGCCTGTTAGTAAGCAAGAAATCAAGCAAAAAA
>35789_21
CTGGCATAAGTACCAGCACACAAAGAGATTAGAAGAAATGAACAAGTAAATAAACTAGTCAGTCATAGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATAGAATAAGTAAAGCCCAAGAAGA
ACATGAGAAATATCACAATAATTAAAGAGCAATGGCTAGTGATTTTGGCATACCACCTGTAATAGCCAAAGAAATAGTGGCCAGCTGTGATAAATGTCAGTTAAAAGGAAAAGCCA
TGCATAGACAAGTAGACTGTAGTCCAAGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAAGAAAAATTATCCTAGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTAGATATATAGAAGCAGAAGTT
40
ATCCCAGCAGAGACAGGACAAGAAACAGCATATTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCAGTTAA
GGCCGCCTGTTAGTAGGCA-GGAATAAGCAAGGAAT
>35789_25
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAACTAGTCAGTCATGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAAATGGAATAAGTAAAGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGGGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAGCAAAAAGGAGAAGC
CATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAATTATCCTGGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAG
GTTATTCCAGCAGAGACAGGACAAGAAACAGCATATTTTCTCTTAAAATTAGCAGGGAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGG
TTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCG-GGAATAAAGCAGGAAT
>35789_26
CTGGCATAAGTACCAGCACACAAAGAGATTAGAAGAAATGAACAAGTAAATAAACTAGTCAGTCATAGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAGGCCCAAGAAGA
ACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAGGTAAAAGGAGAAGCC
ATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTA-
AAAAAAAAATTATCCTAGTAGCAGTACATGTAGCCAGTGAATATATAAAAGCAGAAGTTATTCCAGCAGAGACAGAACAAAAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGAAAAAT
AGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCAGTTAAGGCCGCCTGTTAGTAAGCA-GAAATCAAGCAAAAAT
>35789_27
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGTCAGTCATGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAGGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAGGTAAAAGGAGAAGC
CATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAGTTATCCTGGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAA
GTTATTCCAGCAGAGACAGGACAAGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGG
TTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCG-GGGATCAAGCAGGAAT
>35789_28
CTGGCATGAGTACCAGCACACAAAAAAATTAAAAAAAATAAACAAGTAAATAAACTAGTCAGTCATAAAATCAAAAAAGTACTATTTTTAAATAAAATAAGTAAAGCCCAAAAAAAAC
ATAAAAAATATCACAATAATTAAAAAGCCATAGCTAGTAATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAAAAATAGTAGCCTGCTGTAATAAATGTCAGCAAAAAAAAAAAGCCATGC
ATGAACAAGTAAACTGTAGTCCAGAAATATAGCAGCTAAATTATACACACTTAAAAAAAAAAATTATCCTAGTAGCAGTACATGTAGCCAGTGAATATATAAAAGCAGAAGTTATTC
CAGCAGAGACAGAACAAAAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGAAAAATAGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCAGTTAAGGCC
GCCAGTTAGTAAGCAAGAAATCAAGCAAAAAT
>35789_30
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAACTAGTCAGTCATGGAATCAGAAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAAGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCAATGACTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAGCAAAAGGGAGAAGC
CATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAATTATCCTGGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAA
GTTATTCCAGCAGAGACAGGACAAGAAACGGCGTACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCAG
TTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCG-GGAATAAAGCAGGAAT
>35789_31
CTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGGATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGTCAGTCATGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAAGTAAGGCCCAAGAAG
AACATGAGAGATATCACAATAATTGGAGAGCCATGGCTAGTGATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCTGCTGTGATAAATGTCAGGTAAAAGGAGAAGC
CATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAGTTATCCTGGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAA
GTTATTCCAGCAGAGACAGGACAAGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGACGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCGG
TTAAAGCCGCCTGTTGGTGGGCG-GGAATAAAGCAGGAAT
>35789_33
CTGGCATGAGTACCAGCACACAAAAAAATTAAAAAAAATAAACAAGTAAATAAACTAGTCAGTCATAAAATCAAAAAAGTACTATTTTTAAATAAAATAAGTAAAGCCCAAAAAAAAC
ATAAAAAATATCACAATAATTAAAAAGCCATAGCTAGTAATTTTAACATACCACCTGTGGTAGCTAAAAAAATAGTAGCCTGCTGTAATAAATGTCAGCAAAAAAAAAAAGCCATGCA
TGAACAAGTAAACTGTAGTCCAGAAATATAGCAGCTAAATTATACACACTTAAAAAAAAAA-
TTATCCTAGTAGCAGTACATGTAGCCAGTGAATATATAAAAGCAGAAGTTATTCCAGCAGAGACAGAACAAAAAACAGCATGCTTTCTCTTAAAATTAGCAGAAAAATAGCCAGTAA
AAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCAGTTAAGGCCGCCTGTTAGTAAGCA-GAAATCAAGCAAAAAT
>35789_35
CTGGCATAAGTACCAGCACACAAAGAGATTAGAAGAAATGAACAAGTAAATAAACTAGTCAGTCATAGAATCAGGAAAGTACTATTTTCAGATAGAATAAGTAAAGCCCAAGAAGA
ACATGAGAAATATCACAATAATTAAAGAGCAATGGCTAGTGATTTTGGCATACCACCTGTAATAGCCAAAGAAATAGTGGCCAGCTGTGATAAATGTCAGTTAAAAGGAAAAGCCA
TGCATAGACAAGTAGACTGTAGTCCAAGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAAGAAAAATTATCCTAGTAGCAGTGCATGTAGCCAGTAGATATATAGAAGCAGAAGTT
ATCCCAGCAGAGACAGGACAAGAAACAGCATATTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTGCAGTTAA
GGCCGCCTGTTAGTAGGCA-GGAATAAAGCAGGAAT
41
4.5 ANÁLISE DOS CLONES COM BASE EM GÉIS FOTODOCUMENTADOS
Em trabalhos publicados anteriormente, foi comprovado através de sequenciamento
que o corante HA-Yellow retarda a migração de produto de PCR proporcionalmente ao
conteúdo A+T da sequência de DNA amplificada. Assim sendo, a diferença de
deslocamento de bandas de mesmo comprimento (em número de nucleotídeos) numa
corrida eletroforética em gel de agarose com HA-Yellow correlaciona-se com os diferentes
conteúdos A+T destas sequências ou, no que interessa a este trabalho, com os níveis de
hipermutação de uma amostra.
O sequenciamento dos clones utilizados como controles na análise das amostras
clínicas, bem como dos clones do paciente 99 da amostra 35789, demonstrou a
especificidade da reação (produto de 582Pb da integrase do HIV-1, posição a no HXB-2) e
as sequências geradas foram estudadas.
As Figuras 11 e 12 demonstram a reprodutibilidade das corridas eletroforéticas em
gel de agarose com HA-Yellow dos clones gerados a partir da amostra 35789 e a
caracterização destas sequências com relação à composição nucleotídica e Temperatura
de Melting sumarizada na Tabela 1. Adicionalmente, ressalta-se que ocorre saturação do
fluoróforo HA-yellow nas sequências com os maiores níveis de hipermutação (clones 04,
17 e 28 e clone “controle hipermutado”).
42
Figura 11. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento de 582pb
da integrase do HIV-1 dos clones obtidos da amostra 35789 do paciente 99 e do clone hipermutado (C.
Hipermutado) utilizado como controle nas corridas eletroforéticas das amostras clínicas.
Figura 12. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento de 582pb
da integrase do HIV-1 dos clones obtidos da amostra 35789 do paciente 99 e do clone hipermutado (C.
Hipermutado) utilizado como controle nas corridas eletroforéticas das amostras clínicas.
43
TABELA 1. Caracterização das sequências amplificadas da região da integrase de clones da amostra 35789 e
dos clones-controles A4aP, a3IVaE e B190D com relação à composição nucleotídica eTemperatura de Melting.
CLONE % A (número) % T (número) % G (número) % C (número) Conteúdo A + T
T Melting da Sequência (°C)
35789_01 37,27 (186) 21,24 (106) 24,85 (124) 16,63 (83) 58,52 (292) 80,91
35789_02 37,47 (187) 20,84 (104) 25,05 (125) 16,63 (83) 58,32 (291) 80,99
35789_04 48,70 (243) 21,04 (105) 13,63 (68) 16,63 (83) 69,74 (348) 76,30
35789_05 38,08 (190) 20,84 (104) 24,45 (122) 16,63 (83) 58,92 (294) 80,74
35789_06 37,27 (186) 20,84 (104) 25,25 (126) 16,63 (83) 59,00 (296) 81,07
35789_08 36,76 (185) 21,30 (107) 24,63 (124) 16,36 (82) 58,63 (294) 81,04
35789_09 37,27(186) 20,84 (104) 25,25 (126) 16,63 (83) 58,12 (290) 81,07
35789_10 43,49 (217) 21,24 (106) 19,04 (95) 16,23 (81) 64,73 (323) 78,36
35789_13 40,28 (201) 20,64 (103) 22,24 (111) 16,83 (84) 60,92 (304) 79,92
35789_15 38,08 (190) 20,84 (104) 24,25 (121) 16,83 (84) 58,92 (294) 80,74
35789_17 48,70 (243) 21,04 (105) 13,63 (68) 16,63 (83) 69,74 (348) 76,30
35789_21 41,28 (206) 21,24 (106) 21,24 (106) 16,23 (81) 62,53 (312) 79,26
35789_25 36,87 (184) 21,24 (106) 25,65 (128) 16,23 (81) 58,12 (290) 81,07
35789_26 41,97 (209) 21,29 (106) 20,28 (101) 16,47 (82) 63,25 (315) 78,96
35789_27 36,27 (181) 21,44 (107) 26,05 (130) 16,23 (81) 57,72 (288) 81,23
35789_28 49,00 (245) 20,80 (104) 13,60 (68) 16,60 (83) 69,80 (349) 76,28
35789_30 37,25 (187) 21,12 (106) 25,10 (126) 16,14 (81) 58,37 (293) 80,81
35789_31 36,87 (184) 21,24 (106) 25,65 (128) 16,23 (81) 58,12 (290) 81,07
35789_33 48,19 (240) 21,29 (106) 13,86 (69) 16,67 (83) 69,48 (346) 76,41
35789_35 41,20 (206) 21,00 (105) 21,20 (106) 16,40 (82) 62,20 (311) 79,32
C. Hipermutado (A4aP) 46,98 (233) 22,38 (111) 14,52 (72) 16,13 (80) 69,35 (344) 76,46
C. Normal (B190H) 37,20 (186) 21,80 (109) 25,20 (126) 15,60 (78) 59,00 (295) 80,63
C. Intermediário (A3IVaE) 36,47 (182) 21,04 (105) 25,45 (127) 17,03 (85) 57,52 (287) 81,32
4.6 CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DOS CLONES SEQÜENCIADOS
As sequências dos clones utilizados como controle nos géis das amostras clínicas,
bem como o conjunto de 20 clones obtido da amostra 35789 do paciente 99 foram
submetidas a uma série de análises com o objetivo de validar uma metodologia capaz de
distinguir amostras hipermutadas de amostras não hipermutadas utilizando um critério que
integrasse o resultado que o software Hypermut fornece ao deslocamento foto
documentado de uma amostra num gel. O Hypermut é uma ferramenta disponível no site
do Laboratório de Los Alamos, como dito anteriormente, que tem sido utilizada para inferir
44
a classificação de uma sequência com relação ao seu nível de hipermutação. Por isso,
objetivou-se proceder de maneira que imagem foto documentada pudesse ser interpretada
com o mesmo algoritmo utilizado pelo Hypermut, que é uma ferramenta regularmente
utilizada na avaliação de hipermutação. A comparação com o Hypermut mostrou ser esta
uma boa opção para a validação da análise.
Para proceder esta etapa do estudo, foram reunidas as corridas eletroforéticas em
gel de agarose com HA-Yellow foto documentadas dos referidos clones e suas respectivas
sequências nucleotídicas alinhadas.
4.7 IDENTIFICAÇÃO DA HIPERMUTAÇÃO A PARTIR DAS FOTOS DOS GÉIS DE
AGAROSE COM HA-YELLOW
A partir de estudos da bioquímica de ligação entre uma sequência de DNA e o
corante HA-Yellow, e do conhecimento que o este corante se liga a domínios A+T do DNA
com diferentes afinidades (AATT, AAAA> TAAT, ATAT> TTAA, TATA), observa-se que
uma sequência com altos níveis de hipermutação e, consequentemente maior conteúdo
AT, pode sofrer saturação de HA-Yellow. Portanto, pode-se concluir que as sequências
hipermutadas são mais susceptíveis às ligações químicas com o corante HA-Yellow e,
assim, deslocam-se mais lentamente no gel de agarose. Desta forma é possível que
diferentes seqüências com diferentes conteúdos AT quando submetidas ao gel de agarose
com HA-Yellow possam formar dois clusters (grupamentos) distintos, um contendo as
sequências hipermutadas, com menor deslocamento, e outro contendo as sequências
normais, com maior deslocamento.
45
Para identificar tais clusters, foi necessário primeiramente identificar a posição de
cada sequência no gel. O software Image J do Ministério da Saúde dos EUA (disponível
em http://rsb.info.nih/gov/ij
) permitiu esta caracterização.
Quando corantes são adicionados ao produto de PCR numa corrida eletroforética,
pressupõe-se que o ponto ou a região de maior intensidade luminosa é o ponto em que o
material amplificado se concentra. Assim sendo, o software Image J foi ajustado para
localizar o pico mais intenso de fluorescência de cada banda e mensurar, a partir dele, o
deslocamento amostral. A Figura 13 ilustra à esquerda a foto documentação de um gel de
agarose com HA-Yellow com amostras clínicas e à direita, como o software Image J
identifica e mensura o deslocamento de uma amostra. Nota-se que, quanto maior o nível
de hipermutação de uma amostra, mais deslocado para a esquerda o pico de mostra (a
amostra clínica de número 3, por exemplo, nesta foto documentação é a mais hipermutada
e tem o pico mais deslocado para a esquerda em relação às amostras 1, 2 e 4). Por outro
lado, subpopulações virais com diferentes níveis de hipermutação são representadas no
gel de agarose com HA-Yellow com uma mancha mais espalhada ou mesmo com a
formação de duas bandas distintas. Assim sendo, a quantidade de picos identificada pelo
Image J também representa uma medida de diversidade da sequência viral amplificada (a
amostra 2, por exemplo, tem um único pico, enquanto que a amostra 1 pode ser
caracterizada por dois picos).
46
Figura 13: Medida da posição de cada sequência no gel. Foram definidas regiões de referência iguais para cada
sequência com o item do Analyze/Gels/Select Lane do menu principal. A seguir, foi utilizado o item Analyze/Gels/Plot
Lanes para gerar um gráfico proporcional à intensidade do sinal luminoso na região. O ponto de máxima luminosidade foi
então escolhido como a posição da sequência a ser analisada.
Há vários métodos estatísticos para a identificação de grupamentos ou clusters,
implementados por diversos programas para computadores. Entretanto, no caso deste
estudo, uma vez que é conhecido o número de clusters (dois: hipermutado e não
hipermutado) e uma sequência de referência em cada cluster, o método mais adequado
para proceder a análise dos géis foi o de K-means. Este método é, na verdade uma
ANOVA invertida. Enquanto na ANOVA, tem-se dois ou mais clusters e deseja-se saber se
eles provém ou não de uma mesma população, no K-means, sabe-se que os dados
provém de populações diferentes e pergunta-se quais dados pertencem a cada uma das
populações. Para isso, então, dividem-se os dados sucessivamente em todas as possíveis
duplas de clusters e escolhe-se aquela que fornece o melhor resultado para a ANOVA. No
caso deste estudo, os deslocamentos são ordenados e é conhecido que as distâncias
47
menores formarão um cluster e as maiores outro. Com relação à escolha do valor alfa que
determina o erro tipo I da estatística, escolheu-se o alfa de máxima verossimilhança para a
fim de minimizar o erro embutido na análise. Neste critério, ao invés de ser determinado
um valor de alfa fixo, este valor é definido para cada amostra e é sempre o menor valor
possível. Os resultados detalhados serão apresentados mais a frente nas figuras de 14 a
26.
4.8 COMPARAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS DO HYPERMUT E K-MEANS
A fim de validar o processo de classificação deste estudo, para os clones dos quais eram
conhecidas as sequencias, compararam-se os resultados inicialmente obtidos pelos
cálculos de K-means obtidos a partir dos géis com aqueles fornecidos pelo Hypermut. Os
resultados obtidos na comparação entre o Hypermut e a análise dos géis de agarose com
HA-Yellow com os cálculos de ANOVA K-means foram resumidos na Tabela 2 abaixo. Os
valores listados na coluna que se refere aos resultados do Hypermut correspondem ao
valor probabilístico (p) que o programa fornece – neste caso, a amostra avaliada é
considerada hipermutada quando p<0,05. Por outro lado, os resultados listados como
referentes ao HA-Yellow foram apresentados qualitativamente. Salienta-se que a
classificação “borderline” traduz valores próximos mas superiores aos valores
determinados no critério de máxima verossimilhança considerado para as análises.
48
TABELA 2. Comparação dos dados obtidos no software Hypermut e na análise dos géis por K-means em relação à
classificação dos clones da amostra 35789 do paciente 99 e dos clones de referência (B190D, A4aP e A3IVaE)
SEQUÊNCIA RESULTADO
HYPERMUT (P)
RESULTADO HA-YELLOW COMENTÁRIOS
B190D_NORMAL N/A Não hipermutada Referência de normalidade
35789_01 0,9790 Borderline
35789_02 0,9618 Não hipermutada
35789_04 6,99E-11 Hipermutada
35789_05 0,9123 Borderline
35789_06 0,9387 Borderline
35789_08 0,7402 Borderline
35789_09 0,9955 Borderline
35789_10 1,78E-4 Hipermutada
35789_13 0,4467 Borderline
35789_15 0,9123 Não hipermutada
35789_17 6.99E-11 Hipermutada
35789_21 3,26E-03 Hipermutada
35789_25 0,9387 Não hipermutada
35789_26 3,50E-03 Hipermutada
35789_27 0,9872 Não hipermutada
35789_28 1,58E-11 Hipermutada
35789_30 0,9618 Não hipermutada
35789_31 0,9639 Borderline
35789_33 4,80E-12 Hipermutada
35789_35 2,40E-03 Borderline
A3IVaE_INTERMEDIÁRIA 0,9858 Borderline
A4aP_HIPERMUTADA 1,00E-16 Hipermutada Referência de hipermutada
A partir da análise da tabela, comparando-se os valores fornecidos pelo Hypermut
aos valores obtidos a partir da análise do gel de agarose com HA-Yellow segundo a
análise de ANOVA K-means, nota-se claramente uma correspondência entre as
classificações dos dois métodos, que possibilitou a validação da metodologia de K-means.
Como dito anteriormente, o cálculo realizado de K-means considerou um alfa (erro
tipo 1) de máxima verossimilhança e resultou em análises bastante estringentes cuja
clusterização maximizou a significância do teste ANOVA. Neste sentido, em alguns
momentos a análise das imagens parece ser mais conservadora que a do Hypermut. Por
outro lado, se fosse considerada uma significância de 1% (que é estatisticamente
aceitável), o teste com o gel de agarose com HA-Yellow tornar-se-ia menos conservador
(dados não reportados na tabela). Contudo, não há amostras sequenciadas em
49
quantidade suficiente para que a comparação forneça a melhor indicação do valor
estatística alfa e por isso, visando a garantia do resultado obtido, foi utilizado o critério de
máxima verossimilhança para todas as análises com amostras clínicas. Assim sendo, os
“borderlines” foram classificados como normais e a metodologia para análise dos géis de
agarose com HA-Yellow foi validada com a ANOVA K-means. Portanto, a utilização do
critério de máxima verossimilhança resultou em uma classificação igual ou mais rígida que
a do Hypermut. Concluindo, a associação dos resultados de análise de hipermutação
pelos métodos Hypermut e K-means demonstrou que os clones (04, 10, 17, 21, 26, 28, 33,
35) são realmente hipermutados, validando a associação entre estas análises.
4.9 ANÁLISE DAS AMOSTRAS CLÍNICAS COM BASE EM GÉIS FOTODOCUMENTADOS
Com relação às amostras clínicas, considerando a qualidade de amplificação, de
um número inicial 200 amostras, 157 (78,5%) puderam ser avaliadas com segurança pelos
géis de agarose com HA-Yellow. A casuística avaliada foi, ao final, composta por 157
pacientes acompanhados nos ambulatórios ou unidades de internação da Universidade
Federal de São Paulo, sendo 70 mulheres e 87 homens.
Como dito anteriormente, as imagens foto documentadas de géis de agarose com
HA-Yellow foram processadas com o software Image J e, para cada corrida eletroforética
(cada corrida eletroforética era composta, em média, por 15 amostras clínicas e por três
clones controles da reação) foi corrigido e calculado o deslocamento amostral em reação
ao ponto de partida e em relação ao deslocamento dos clones controles hipermutado e
normal, resultando num valor estatístico p (F) que inferia se a referida amostra pertencia
50
ao grupo populacional do clone hipermutado ou se esta pertencia ao grupo populacional
do clone normal. O critério utilizado para definir o ponto de corte do método K-means de
ANOVA utilizado foi o de máxima verossimilhança e, assumido este critério, quando
obteve-se p<0,05, a amostra foi considerada hipermutada.
Assim sendo, os resultados apresentados a seguir tomam por base dados gerados
os quais já haviam sido apresentados em relatórios anteriores, correspondendo às
Figuras 14 a 26 que apresentam as imagens foto documentadas de corridas
eletroforéticas em gel de agarose com HA-Yellow do produto de 582 pares de bases
amplificado por PCR das amostras clínicas. Ao lado destes dados, estarão dispostas
tabelas que contém os cálculos que mostram a estatística obtida para o deslocamento
amostral e que foram realizados para cada amostra em cada corrida eletroforética. Na cor
verde estarão listadas as amostras que se tem certeza pertencerem ao grupo das
sequências hipermutadas; as amostras listadas em laranja pertencem a um grupo que é
considerado hipermutado quando se considera um alfa de 0,01 mas que, pelo critério da
máxima verossimilhança são consideradas não hipermutadas; e em vermelho estão
listadas as amostras que se têm certeza que estão alocadas no grupo de sequências não
hipermutadas. Como referido anteriormente, cada gel (representado por uma corrida
eletroforética) foi corrigido e analisado como um universo amostral independente onde
para cada amostra representativa deste gel foi calculada uma medida de deslocamento
em relação ao ponto de partida e aos controles de referência, de maneira que os
resultados obtidos representam um valor que permite alocar cada amostra como
pertencente ao grupo de sequências do clone hipermutado ou ao grupo de sequências do
51
clone normal, como validado anteriormente. Abaixo seguem as fotodocumentações de
cada corrida eletroforética seguida de uma tabela representativa dos cálculos de K-means.
Figura 14. Detecção de hipermutação em fragmento de 582 pares de bases da integrase do HIV-1 de
amostras clínicas em gel de agarose com HA-Yellow das amostras clínicas de 1 a 12 e análise estatística.
Figura 15. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento de 582
pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 14 a 25 e análise estatística.
52
Figura 16. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento de 582
pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 25 a 36 e análise estatística. A seta vermelha
da foto do gel indica amostra com presença de subpopulações virais com diferentes níveis de hipermutação.
Figura 17. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento da
integrase de 582 pares de bases do HIV-1 das amostras clínicas 40 a 49 e análise estatística.
53
Figura 18. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento de 582
pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 50 a 61 e análise estatística.
Figura 19. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento de 582
pares de bases da integrase do HIV-1 de amostras clínicas variadas e análise estatística.
54
Figura 20. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento de 582
pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 76 a 87 e análise estatística.
Figura 21. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento de 582
pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 94 a 101 e análise estatística.
55
Figura 22. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento de 582
pares de bases da integrase do HIV-1 das amostras clínicas 102 a 112 e análise estatística.
Figura 23. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento da
integrase do HIV-1 das amostras clínicas 113 a 124 e análise estatística.
56
Figura 24. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento da
integrase do HIV-1 das amostras clínicas 125 a 136 e análise estatística.
Figura 25. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento da
integrase do HIV-1 das amostras clínicas 137 a 146 e análise estatística.
57
Figura 26. Gel de agarose com HA-Yellow ilustrando os resultados da amplificação de fragmento da
integrase do HIV-1 das amostras clínicas 151 a 158 e análise estatística.
4.10 ESTUDO DA CASUÍSTICA E DOS DADOS GERADOS
Os resultados obtidos com a análise das amostras clínicas dispostas nos géis de agarose
com HA-Yellow fotodocumentados, em conjunto com os dados gerais anteriormente
reunidos para caracterização da casuística, estão sumarizados na tabela 3. Para efeito de
uma observação mais abrangente do resultado gerado, embora as análises estatísticas
finais foram feitas a partir do critério de máxima verossimilhança (reportado na tabela
como “presença de hipermutação I”), nesta tabela, como na nos cálculos que analisaram
as amostras clínicas, foram destacadas as amostras que seriam consideradas
hipermutadas caso o critério escolhido fosse o menos estringente, com alfa 0,01
(reportado na tabela como “presença de hipermutação II”).
58
TABELA 3. Compilação de dados gerais dos casos de pacientes HIV-positivos e classificação dos mesmos quanto à
presença de hipermutação considerando-se o critério de máxima verossimilhança (I) ou alfa fixo = 0,01 (II).
ÍNDICE
INICIAIS SEXO
COR DA
PELE
DATA DE
NASCIMENTO
IDENTIFICAÇÃO
DA AMOSTRA
CARGA
VIRAL
PRESENÇA DE
HIPERMUTAÇÃO I
PRESENÇA DE
HIPERMUTAÇÃO II
CD4
1 R.J.P. M parda 20-jun-70 20651 900000
NÃO SIM
48
2 F.B.A. F parda 22-jun-72 38677 13400
NÃO NÃO
611
3 M.C.B. F branca 24-nov-64 36306 26100
SIM SIM
483
4 M.A.S. F ausente 13-mai-74 34172 4350
NÃO SIM
679
5 G.B.L. F parda 18-set-47 14026 80
NÃO SIM
1437
6 J.A.A. M branca 16-out-61 10152 91
NÃO SIM
213
7 C.R.M. M branca 10-nov-61 11522 650000
SIM SIM
60
8 M.F.P. F branca 07-out-79 11942 12000
NÃO SIM
189
9 G.S.A. F parda 24-dez-77 13860 190000
SIM SIM
11
10 M.O.S.S. F branca 23-mai-57 15713 15000
NÃO NÃO
706
11 A.C.M.O. F branca 20-jun-78 14337 170000
SIM SIM
188
12 M.S.S.L. F parda 04-dez-75 11443 590000
SIM SIM
81
13 G.F.S. F parda 12-jun-50 12056 7600
NÃO NÃO
373
14 A.C.S. M branca 03-mai-62 17304 39000
SIM SIM
460
15 F.M.C.C. M branca 29-set-58 14090 17000
NÃO NÃO
630
16 A.A.P. M parda 23-jun-46 15605 38000
SIM SIM
364
17 F.F.S. M parda 17-jan-69 3381 38000
NÃO NÃO
154
18 A.M.O. M branca 20-jun-47 11838 15000
SIM SIM
494
19 R.R.S. F parda 06-mai-72 14886 29000
SIM SIM
400
20 A.C.P.S. F negra 02-ago-74 26685 7100
NÃO NÃO
638
21 O.S.M.J. M branca 10-set-51 2771 320000
NÃO SIM
167
22 Z.C.J. M branca 14-jan-68 32527 18900
SIM SIM
619
23 M.A.L. F branca 26-dez-66 27094 160000
SIM SIM
57
24 W.O.S. M parda 21-ago-67 24466 750000
NÃO NÃO
163
25 E.S.M. F parda 14-set-96 3179 120000
NÃO NÃO
5
26 A.P.F.F. F branca 01-fev-76 14284 11000
NÃO NÃO
367
27 F.C.C.A. M branca 01-nov-66 3348 1800000
SIM SIM
21
28 R.G.N. M parda 02-jun-76 38157 235000
SIM SIM
88
29 C.A.A. M branca 14-jun-71 34714 712000
SIM SIM
204
30 E.C.S. M parda 27-out-65 28620 4410
NÃO SIM
567
31 J.A.C. M branca 22-jun-59 36711 279000
SIM SIM
92
32 I.O.P. M branca 27-nov-58 11527 720000
NÃO SIM
132
33 P.T.R.A. M branca 13-out-68 13872 18000
SIM SIM
819
34 E.P.S. M branca 13-mar-70 12192 42000
NÃO NÃO
11
35 E.M.D. F parda 27-set-73 18661 280000
NÃO SIM
162
36 R.L.P. M branca 28-dez-58 11447 520000
NÃO NÃO
449
37 V.A.S. F branca 02-jul-78 18279 230000
SIM SIM
137
38 P.C.L.B. M ausente 02-mar-60 2653 4800
NÃO NÃO
752
39 D.M.S. M parda 21-jun-74 3339 1500000
NÃO NÃO
154
40 J.A.B.F. F branca 24-nov-67 30632 23200
NÃO NÃO
300
41 E.S. F negra 30-out-63 26742 1400000
NÃO NÃO
97
42 G.R.L. M parda 02-out-70 22561 29000
NÃO NÃO
951
43 A.M.R. F branca 07-mar-63 28981 649000
NÃO SIM
386
44 G.S. M parda 13-jan-61 23019 530000
SIM SIM
114
45 N.F.M. M branca 29-jan-57 22699 860000
SIM
SIM
176
46 E.L.S.M. F parda 18-set-67 2298 31000
NÃO
SIM
308
59
ÍNDICE
INICIAIS SEXO
COR DA
PELE
DATA DE
NASCIMENTO
IDENTIFICAÇÃO
DA AMOSTRA
CARGA
VIRAL
PRESENÇA DE
HIPERMUTAÇÃO I
PRESENÇA DE
HIPERMUTAÇÃO II
CD4
47 R.S.N. F parda 11-set-66 30368 10600
NÃO NÃO
683
48 J.B. M parda 21-fev-64 34579 36200
NÃO NÃO
655
49 L.C.F.S. M negra 17-mar-78 29958 52800
NÃO NÃO
294
50 N.A.M.R. F branca 09-mai-60 29435 79700
NÃO NÃO
983
51 V.L.S.P. F parda 16-set-60 22437 47000
NÃO NÃO
474
52 G.R.X. M branca 28-abr-77 30643 26400
NÃO NÃO
116
53 R.P.A. M parda 03-nov-72 18768 8900
SIM SIM
425
54 B.F.A. M negra 04-fev-55 31522 102000
NÃO NÃO
284
55 J.C. M branca 18-set-52 1990 25000
NÃO NÃO
489
56 V.P.C. M parda 05-fev-67 26098 360000
SIM SIM
208
57 I.N. F branca 14-jul-76 44888 25900
NÃO SIM
541
58 J.T.R. F branca 24-abr-52 1992 300000
SIM SIM
4
59 A.A.S.F. M parda 04-out-64 32708 833 EXCLUÍDA EXCLUÍDA 563
60 R.P.M. M branca 27-ago-74 32534 1980000
SIM SIM
363
61 N.S.M. F branca 06-mar-56 22896 3500
SIM SIM
124
62 M.A.P. F parda 15-set-67 22828 250000
NÃO NÃO
63
63 G.M.F.J. F negra 15-out-76 24661 28900
SIM SIM
773
64 B.L.T.R.C. F parda 08-jan-83 22746 9700
NÃO NÃO
937
65 S.F.F.G. F parda 28-mai-62 26928 140000
NÃO NÃO
90
66 A.E.G. M branca 18-nov-60 30699 76900
NÃO NÃO
235
67 V.C.S. F branca 10-jan-72 21341 80
NÃO NÃO
770
68 V.E.M M branca 18-mai-75 18194 16000
NÃO NÃO
210
69 E.V.S. M parda 20-fev-58 11445 220000
NÃO NÃO
86
70 R.H. F parda 29-jan-77 12256 380000
NÃO NÃO
183
71 I.T.A. F branca 20-out-67 34608 8670
NÃO NÃO
483
72 M.R.B. M parda 07-fev-82 31411 5760
NÃO NÃO
382
73 P.A.P. F parda 06-jun-70 22048 2500
NÃO NÃO
151
74 P.A.F. M negra 10-nov-63 31005 63200
NÃO NÃO
151
75 M.A.P.R.L. M branca 21-out-46 21955 1400000
NÃO NÃO
45
76 N.P.M. F branca 01-mar-72 26026 16000
NÃO SIM
287
77 N.C. F parda 17-abr-63 32094 471
NÃO NÃO
250
78 O.O.G. F branca 10-jul-77 34807 25200
SIM SIM
543
79 S.A.O.A. F branca 03-abr-65 37712 81300
NÃO SIM
40
80 G.R.S. M branca 08-nov-70 37706 49700
NÃO NÃO
126
81 L.A.B. M branca 23-abr-52 23505 71000
SIM SIM
341
82 R.S.S. F parda 28-jun-72 22677 200000
NÃO SIM
2
83 L.C.P.S. M parda 24-ago-70 34349 68500
NÃO NÃO
24
84 R.L. F parda 16-mai-64 46999 6930
SIM SIM
508
85 M.L.A.N. M branca 25-mar-57 18224 720000
NÃO SIM
256
86 W.B.G. M branca 10-jan-60 24392 411000
NÃO NÃO
43
87 A.R.S. M negra 11-jul-67 20806 160000
NÃO NÃO
167
88 B.H.S.S. F negra 22-out-55 8664 6800
NÃO NÃO
831
89 V.A.A. M branca 05-nov-62 11598 77000
NÃO NÃO
198
90 V.R.C. F branca 10-set-66 18537 26000
NÃO NÃO
769
91 E.B. M branca 28-mai-67 11718 120000
NÃO NÃO
206
92 J.J.M.S. M parda 8/mar/71 72793 7604
NÃO NÃO
556
93 A.C.V. F branca 25-nov-79 68720 400
NÃO NÃO
556
60
ÍNDICE
INICIAIS SEXO
COR DA
PELE
DATA DE
NASCIMENTO
IDENTIFICAÇÃO
DA AMOSTRA
CARGA
VIRAL
PRESENÇA DE
HIPERMUTAÇÃO I
PRESENÇA DE
HIPERMUTAÇÃO II
CD4
94 L.M.J. F parda 07-ago-68 10081 61000
NÃO NÃO
305
95 F.I.F.L. M branca 18-set-72 13642 67000
NÃO NÃO
585
96 P.R.S. M branca 08-fev-68 14633 80
NÃO SIM
590
97 L.A.P. F parda 04-set-73 18212 2900
SIM SIM
718
98 F.T.S. M parda 18-ago-80 35530 6620
SIM SIM
664
99 A.S.C. M parda 01-nov-62 35789 200000
SIM SIM
69
100 A.R.C. F branca 08-jun-62 36011 7000
NÃO NÃO
358
101 R.F.L.C. F branca 04-abr-74 21294 71000
NÃO NÃO
243
102 E.I.S. M negra 21-abr-74 11220 110000
SIM SIM
38
103 A.B.F. M branca 07-set-64 20063 550000
SIM SIM
26
104 R.T. F branca 11-set-66 20521 80
NÃO SIM
377
105 A.S. F branca 01-out-74 11519 24000
NÃO SIM
684
106 M.A. M branca 20-jul-66 19153 110000
SIM SIM
15
107 C.I.O. F branca 13-set-59 10086 1200000
NÃO NÃO
45
108 J.C..C. M branca 19-mar-62 13802 400000
SIM SIM
139
109 R.D. M branca 18-mai-59 17751 2200
NÃO NÃO
775
110 J.A. M negra 07-abr-61 11772 1200000
NÃO NÃO
67
111 M.S.G.J. M branca 10-dez-62 35773 111000
SIM SIM
143
112 J.A.A.E. F parda 31-out-63 20625 80
NÃO NÃO
669
113 A.A.S. F parda 26-set-78 61811 12700
SIM SIM
622
114 J.A.C. M parda 27-jun-42 61147 1130000
SIM NÃO
40
115 N.C.L.N.L. M parda 26-abr-70 11720 54000
NÃO NÃO
377
116 S.F.L. F parda 22-ma1-82 67657 30100
NÃO NÃO
280
117 J.M.N.C. M parda 30-out-71 10206 54000
SIM SIM
335
118 R.S. M parda 19-fev-85 65566 4060
SIM SIM
406
119 R.S.O. F parda 10-jan-70 21485 48000
SIM SIM
326
120 M.A. F branca 24-dez-78 36130 62700
NÃO NÃO
736
121 C.A.E.L. M parda 30-mai-64 66619 27300
NÃO NÃO
1229
122 W.P.S. M parda 01-fev-78 50871 26700
NÃO NÃO
549
123 A.S. M branca 24-fev-51 60681 58300
NÃO NÃO
307
124 J.B.J.B. M parda 23-jun-75 68284 3120
NÃO NÃO
553
125 M.C.B. M branca 25/out/78 64714 19200
NÃO SIM
467
126 R.M.S. M branca 16-jun-66 64274 41400
SIM SIM
895
127 A.C.D. F branca 05-dez-54 64174 48200
NÃO SIM
412
128 D.P.S. F branca 30-out-57 65639 1910
SIM SIM
787
129 D.G.S. M branca 01-fev-84 65638 400
NÃO SIM
515
130 J.M.C. M branca 06-ago-75 71772 17500
SIM SIM
397
131 E.T.O.S. F parda 09-nov-61 68675 5830
SIM SIM
623
132 J.S.P. M parda 11-dez-56 24320 24500
NÃO SIM
252
133 R.A. M parda 16-ago-74 67773 37300
NÃO SIM
465
134 E.H. M parda 14-abr-80 71194 36200
NÃO NÃO
425
135 P.S.C. M negra 17-nov-76 60807 11600
NÃO SIM
697
136 I.U.N.O. F branca 01-jan-68 57656 23800
NÃO NÃO
774
137 F.W.P.D. M parda 30-abr-73 69443 25200
NÃO NÃO
337
138 C.L.F.S. F branca 26-jan-72 15441 1300
NÃO SIM
627
139 F.A.E. M branca 26-mai-75 14699 1200000
SIM SIM
11
140 R.M.S. M parda 24-jul-70 33186 62700
NÃO NÃO
748
61
ÍNDICE
INICIAIS SEXO
COR DA
PELE
DATA DE
NASCIMENTO
IDENTIFICAÇÃO
DA AMOSTRA
CARGA
VIRAL
PRESENÇA DE
HIPERMUTAÇÃO I
PRESENÇA DE
HIPERMUTAÇÃO II
CD4
141 M.A.S. F branca 19-jul-69 14694 83000
SIM SIM
147
142 F.M.G. F branca 04-dez-80 15361 24000
NÃO SIM
328
143 S.P.L. F parda 25-nov-72 15404 670
NÃO NÃO
890
144 C.G.A. F branca 25-nov-64 11053 1500000
NÃO SIM
26
145 S.O. F parda 02-jun-72 15463 290000
NÃO SIM
85
146 L.B.N. M branca 12-ago-73 16471 320000
SIM SIM
14
147 E.F.P.S. F parda 21-dez-70 11726 80
NÃO NÃO
492
148 C.R.M. M branca 05-nov-51 19993 440000
NÃO SIM
13
149 A.O.A. F branca 27-jul-73 14623 80
NÃO NÃO
525
150 L.C.S. M parda 11-fev-57 15743 540000
NÃO SIM
202
151 A.R.B. M negra 15-mar-76 32315 57000
NÃO SIM
178
152 M.A.L.F. F branca 03-fev-72 18241 410000
NÃO NÃO
28
153 S.L.M. M branca 05-jun-63 23440 6700
NÃO SIM
494
154 E.R.S. M branca 13-jan-79 29305 527000
NÃO NÃO
41
155 L.A.Q. M branca 12-set-53 26612 8300
NÃO NÃO
312
156 C.J.G. M branca 07-jan-59 29692 19000
NÃO NÃO
533
157 P.S.A. M branca 25/9/1957 23696 220000
SIM SIM
533
158 J.C.S. F parda 01-dez-65 31115 287000
NÃO NÃO
582
Adicionalmente, a Tabela 4 descreve os grupos de pacientes de maneira geral e a
Tabela 5 caracteriza estes mesmos dados segundo a classificação das amostras em
hipermutadas ou não hipermutadas proposta neste estudo.
TABELA 4. Estatística descritiva dos casos de pacientes HIV-positivos que compõem a casuística.
SEXO
MULHERES: 70 (44,6%)
HOMENS: 87 (55,4%)
CARGA VIRAL
MÉDIA: 214.270±378.583
MEDIANA: 41.400
MÁXIMO: 1.980.000
MÍNIMO: 80
Distribuição normal
p=0,02
Kolmogorov-Smirnov
CD4
MÉDIA: 366±279
MEDIANA: 328
MÁXIMO: 1.437
MÍNIMO: 2
Distribuição normal
p=0,054
Kolmogorov-Smirnov
COLORAÇÃO DA PELE
BRANCOS: 82 (52%)
NEGROS:12 (7,6%)
PARDOS:61 (38(%)
AMOSTRA HIPERMUTADA
SIM: 49 (31,2%)
NÃO: 108 (68,7%)
62
TABELA 5. Estatística descritiva dos casos de pacientes HIV-positivos que compõem a casuística segundo a
classificação em presença ou ausência de detecção de hipermutação.
ANÁLISE DESCRITIVA SEGUNDO A CLASSIFICAÇÃO DE PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE HIPERMUTAÇÃO
PACIENTES EM QUE HOUVE
DETECÇÃO DE HIPERMUTAÇÃO
SEXO CARGA VIRAL CD4 COLORAÇÃO DE PELE
Homens
18(36,74%)
Média
285.782±437.662
Média
308 ±256
Brancos: 29 (59,1%)
Mulheres Mediana Mediana Negros: 2 (4,1%)
31(63,26%) 110.000 208
Pardos: 18 (36,8%)
PACIENTES EM QUE NÃO HOUVE
DETECÇÃO DE HIPERMUTAÇÃO
SEXO CARGA VIRAL CD4 COLORAÇÃO DE PELE
Homens:
56 (51,9%)
Média
181.825±343.618
Média
393±285
Brancos: 53 (49,0%)
Mulheres: Mediana Mediana Negros: 10 (9,2%)
52 (48,1%) 30.550 347
Pardos: 43 (39,8)
A detecção de hipermutação se deu em 49/157 (~31,2%) das amostras avaliadas, sendo
que 29/157 (18,5%) apresentaram simultaneamente subpopulações virais com níveis
diferentes de hipermutação.
A casuística é constituída por 70/158 (44,6%) mulheres e 87/158 (55,4%) homens.
Considerando o gênero, a hipermutação foi detectada em 18/87 (20,7 %) dos homens e
31/70 (44,3%) das mulheres e não houve indícios de que a ocorrência da hipermutação
esteja associada ao sexo (Teste Qui-quadrado: P=0,079). A distribuição dos pacientes
segundo a coloração da pele foi de 82/157 (52,2%) de brancos, 12/157 (7,6%) de negros e
61/157 (38,9%) de pardos e em 2 pacientes esta informação não estava disponível. Com
relação à presença de hipermutação, houve detecção de hipermutação em 29/82 (35,4%)
dos de pele branca, 2/12 (16,7%) dos de pele negra e 18/61 (77,4%) dos de coloração
63
parda de pele. Foi detectada menor freqüência de hipermutação nos indivíduos de pele
negra em relação tanto aos de pele branca quanto aos de pele parda (respectivamente p =
0,001 e p=0,013 - Teste Qui-quadrado). Não foi detectada diferença com relação à
freqüência de hipermutação entre indivíduos de pele branca e parda (P=0,348 – Teste
Qui-quadrado).
A média da contagem de linfócitos T CD4 positivos nos pacientes em cujas
amostras foi detectada hipermutação foi de 308 (desvio-padrão 256) células/mm
3
e
mediana de 208 células/mm
3
,
enquanto que nas amostras em que a hipermutação não foi
detectada, a média do número de linfócitos T CD4 foi de 393 (desvio-padrão 285 )
células/mm
3
e mediana de 347 células/mm
3
. Foi observado que pacientes com maiores
níveis de hipermutação tiveram também menor média e mediana de linfócitos T CD4
positivos. Entretanto, não foi possível reunir um dado importante que seria a taxa de
queda dessas células ao longo do tempo e que permitiria uma avaliação mais abrangente
do status imunológico do paciente e que poderia informar mais consistentemente sobre o
efeito da hipermutação no progresso clínico-imunológica do paciente.
Como dito anteriormente, a carga viral plasmática do HIV-1 é indicador clínico de
progressão para a aids e biológico de replicação viral e foi o parâmetro de apoio mais
importante nesse estudo para caracterizar o status paciente infectado. A média da carga
viral dos pacientes em cujas amostras foi detectada hipermutação foi de 285.782 (desvio-
padrão 437.662) cópias/mL com mediana de 110.000 cópias/mL, enquanto que o valor
dessa variável para as amostras em que não foi detectada hipermutação foi de 181.825
(desvio-padrão 343.618) cópias/mL e mediana de 30.550 cópias/mL. Surpreendeu que as
64
amostras em que foi detectada hipermutação tiveram média e mediana de valores de
carga viral maiores que o de amostras em que este fenômeno não foi detectado.
4.11 CORRELAÇÃO ENTRE PRESENÇA DE HIPERMUTAÇÃO E NÍVEIS DE CARGA
VIRAL
O objetivo do presente estudo foi correlacionar a hipermutação aos níveis de carga
viral em pacientes infectados pelo HIV-1 não tratados a fim de inferir se a presença da
hipermutação influencia nos níveis de replicação viral. O número amostral e a natureza
dos dados pressupôs a utilização de um teste não paramétrico para a avaliação da
diferença entre as médias das variáveis quantitativas deste estudo.
Os achados experimentais mostraram que a média dos valores de carga viral dos
pacientes em cujas amostras clínicas foi identificada a presença de hipermutação superou
a média daqueles em que este fenômeno não foi detectado. O teste não-paramétrico de
Mann-Whitney confirmou que esta diferença é significativa (p=0,02).
A média da contagem de linfócitos CD4 positivos nos pacientes em cujas amostras
clínicas foi detectada hipermutação foi inferior, contudo, quando realizou-se o teste de
Mann-Whitney, percebeu-se a confirmação desta tendência, entretanto, a significância da
menor contagem de células CD4 em pacientes em cujas amostras foi detectada
hipermutação não foi confirmada (p=0,068).
4.12 REAÇÃO DE PCR EM TEMPO REAL
A análise da curva de Melting na PCR em Tempo Real permite a identificação de
uma seqüência conhecida a partir de sua respectiva temperatura de Melting, podendo
65
também distinguir seqüências de composição semelhantes com base na diferença de suas
temperaturas de dissociação. Os clones da amostra 35789 obtidos foram submetidos a
uma PCR em Tempo Real. Neste teste, confirmou-se a hipótese de que amostras
hipermutadas poderiam ser diferenciadas de amostras não hipermutadas com base na
análise da curva de Melting.
A Temperatura de Melting de uma sequência nucleotídica pode ser prevista
utilizando-se o software DNASTAR, no módulo EDIT2. Todas as sequências de clones
disponíveis da região da integrase foram avaliadas no software e foram mostradas na
Tabela 1.
Em diferentes ensaios com PCR em Tempo Real, a Temperatura de Melting das
amostras clonadas foi comparada com a Temperatura de Melting prevista pelo software
DNASTAR para cada sequência. Então corroborou-se que o intervalo que caracterizava a
Temperatura de Melting para cada clone (primeiros pontos de inflexão da curva de
dissociação) continha a temperatura prevista para a sequência no software DNASTAR. Foi
realizada uma triplicata para avaliar a reprodutibilidade dos resultados, confirmando o
dado obtido.
Com relação ao ajuste das condições de análise, o pico de maior intensidade de
fluorescência foi admitido como representativo da Temperatura de Melting de cada clone
avaliado. Adicionalmente, para a curva de quantificação da amplificação, foi estabelecido
um threshold a 10% da fluorescência máxima obtida. Somente as amostras que
apresentaram amplificação específica (superior ao threshold) foram utilizadas na análise e,
de maneira geral, amostras hipermutadas apresentaram amplificação menor.
Nas figuras abaixo estão representadas as curvas de Melting de diferentes clones para
66
que seja feita uma comparação dos diferentes picos de Temperatura de Melting nas
amostras com diferentes níveis de hipermutação. Nestas figuras pode ser observado,
tanto o pico de temperatura de Melting (TM) encontrado experimentalmente quanto o pico
previsto no software DNASTAR. Neste sentido, a Figura 27 apresenta o pico
característico da amostra mais hipermutada do conjunto de clones, a amostra 35789_27,
com temperatura de Melting de 83,0ºC. A Figura 28 apresenta o pico característico da
amostra 35789_04, que é hipermutada mas não tanto quanto o pico da Figura 29 que é
característico de uma amostra com nível elevadíssimo de hipermutação. Já a Figura 30
dispõe um grupo de amostras com níveis que diferentes de hipermutação e a Figura 31
apresenta o comportamento de uma amostra clínica com populações virais geneticamente
distinguíveis e tem dois picos. As linhas destacadas em azul representam os valores do
picos da Temperatura de Melting da sequência.
Figura 27. Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de Melting dos
clones não hipermutados 35789_27 e tabela contendo a descrição dos picos e do intervalo que contém a
curva de Melting do principal pico. TM=83º C [79,5-88º C].
67
Fig 28. Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de Melting dos
clones hipermutados 35789_04 e tabela contendo a descrição dos picos e do intervalo que contém a curva
de Melting do principal pico.TM=81,5 [77,5-84,5].
68
Fig 29. Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de Melting do clone
mais hipermutado 35789_28 e tabela contendo a descrição dos picos e do intervalo que contém a curva de
Melting do principal pico. TM= 75,5 [63,5-80º C].
Figura 30 Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de Melting do
clones 35789_04, 35789_09, 35789_10 e 35789_26 e tabela contendo a descrição dos picos e do intervalo
que contém a curva de Melting de cada clone. Notar o deslocamento das curvas de Melting para a esquerda
à medida em que os clones testados exibem maiores níveis de hipermutação.
69
Finalmente, a metodologia de PCR em Tempo Real permitiu discriminar sequências
hipermutadas, sequências menos hipermutadas e sequências normais a partir da
Temperatura de Melting, em que se observa que existe o deslocamento para a esquerda
do pico da Temperatura de Melting proporcionalmente ao aumento de nível de
hipermutação de uma sequência. A Figura 30 ilustra como ocorre a diferenciação dos
picos de Temperatura de Melting em função do nível de hipermutação das sequências.
Algumas amostras clínicas foram submetidas a PCR em Tempo Real. De maneira
geral, as amostras testadas exibiram um ou dois picos principais de Temperatura de
Melting e estes picos correspondiam à diversidade viral observada no gel de agarose com
HA-Yellow (Figura 18).
Seguem o alinhamento e a curva de Melting da amostra clínica 31522 da paciente
de índice 54 da casuística. A Temperatura de Melting prevista para esta sequência no
DNASTAR foi de 81,3º C, corroborando com o resultado obtido no arquivo gerado pelo
aparelho de PCR em Tempo Real que forneceu experimentalmente o valor de 81,5º C
para o mesmo parâmetro. Quando a amostra 31522 foi avaliada no Hypermut, obteve-se
um valor o qual, assim como nas análises dos géis, fez com a mesma fosse agrupada
junto das amostras não hipermutadas (p=0,78).
>31522
GGAAAGGGTCTATTCTGGCCATGGGTACCAGCACATAAAGGAATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGACAGTGCTGGAATC
AGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGAGGAACATGAGAAATATCACAATAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATT
TTAACCTGCCACCTGTGGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGTTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCCATGCATGGACAAGTAG
ACTGTAGTCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACACTTAGAAGGAAAAGTTATCCTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATA
TAGAAGCAGAAGTTATCCCAGCAGAGACAGGGCAGGAAACAGCATACTTTCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAA
TACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACTGTTAAGGCCGCCTGGTTGGTGGGCGGGGGATCAAGCAGGAATTTGGC
70
Fig 31. Análise da Curva de Melting por PCR em Tempo Real mostrando a Temperatura de Melting da
amostra clínica 31522. Notar dois picos principais correspondendo a duas subpopulações virais com
diferentes níveis de hipermutação. A tabela que contém a descrição dos picos e o intervalo que contém a
curva de Melting discrimina dois picos principais(embora só o primeiro aparece destacado) ao invés de um
como é característico dos clones.
Adicionalmente, notou-se que existia uma correção inversamente proporcional entre
Temperatura de Melting e conteúdo A+T das sequências. Os dados da Tabela 1 foram
plotados e submetidos a uma regressão linear (R
2
=0,998), demonstrando que o conteúdo
A+T deve determinar a correspondente Temperatura de Melting de uma sequência
(Figura 32).
71
Fig 32. Regressão linear mostrando como o conteúdo A+T determina a temperatura de Melting de uma
sequência (R
2
=0,998).
72
4.13 ANÁLISE FILOGENÉTICA DOS CLONES PRODUZIDOS
O padrão de hipermutação dos clones observado pelo sequenciamento, pelo gel de
agarose com HA-Yellow e pelo software Hypermut foi comparado com o padrão dessas
mesmas sequências obtido a partir de árvores filogenéticas.
Embora esses softwares de análise filogenética processam as informações considerando
as mutações como processos evolutivos e a hipermutação - que é um processo
bioquímico que ocorre num único ciclo replicativo do HIV-1 - não se enquadra nesta
definição, as árvores filogenéticas geradas nestes softwares podem contribuir para o
estudo quando analisadas à luz do próprio alinhamento das amostras seqüenciadas e à
luz dos dados gerados pelo Hypermut. A Figura 33 ilustra uma árvore filogenética
encontrada a partir da análise de Neighboor joining com os clones da amostra 35789 do
paciente 99. O clone 35789_27, cujo sequenciamento revelou que era o clone menos
hipermutado do conjunto, foi relacionado como grupo externo, ou no jargão da análise um
outgroup. Observou-se que da esquerda para a direita e da região mais inferior da árvore
para a superior configuram-se crescentes níveis de hipermutação dos clones. Uma vez
que as amostras utilizadas para construir esta árvore provém de clones, sabe-se que o
background de mutações não relacionadas à hipermutação é minimizado. É notável
também que quanto mais intenso o fenômeno da hipermutação mais longo será o
comprimento do ramo a partir da origem ou outgroup até o grupamento hipermutado visto
na Figura 33. Assim sendo, a suposição de que o crescente nível de hipermutação
ocasiona majoritariamente esta topologia de árvore observada pode ser confirmado pela
73
Figura 34 que, ao comparar os clones seguindo a sequência em que os mesmos se
distribuem na árvore, demonstra que é o crescente de transições (que englobam
substituições G<->A e C<->T que neste caso corresponde principalmente a mutações de
G para A) é o evento responsável pela configuração da árvore. Assim sendo, análises
filogenéticas de seqüências hipermutadas refletem o impacto ocasionado pelo número
excessivo de substituições G→A na própria topologia da árvore. Na Figura 34 deve ser
observado que as transversões (que englobam as substituições G<->T e A<->C) se
mantém relativamente constantes, enquanto que as transições são determinantes para a
configuração da topologia da árvore. Como também foi observado na Tabela 1, verifica-se
uma taxa de substituição elevada para G<->A. A Simulação de MonteCarlo poderia ser
empregada para avaliar o ponto de corte que identificaria quando as transições ocorrem
tão ao acaso quanto as transversões e quando as substituições G →A ocorrem a nível de
um processo específico e não aleatório. Este threshold poderá ser determinado quando for
reunido um conjunto maior de sequências de clones para serem analisadas. Assim sendo,
esta metodologia será avaliada posteriormente.
A figura abaixo apresenta uma árvore filogenética construída a partir da sequência de
clones do paciente 35789. Clones hipermutados, como os clones 28, 33, 4, 26, 10, 21 e
35, agruparam-se no canto superior direito, enquanto que clones normais, como 01, 05,
15, 31 e 25, preferencialmente, agruparam-se no canto inferior esquerdo da tabela,
próximos ao clone 27, que é o menos hipermutado do conjunto. Desta forma e neste
contexto de análise específico, pode-se visualisar a presença de hipermutação em uma
árvore filogenética e este dado foi demonstrado no diagrama da Figura 34.
74
Figura 33. Árvore filogenética gerada no software Mega 4.0 com modelo de neighboor joining.
Figura 34. Gráfico mostrando as transições (verde) em relação às transversões (azul) na árvore filogenética
gerada para os clones da amostra 35789. As transversões se mantém relativamente constantes, enquanto
que as transições são determinantes para a configuração da topologia da árvore.
75
5 DISCUSSÃO
O desbalanço nucleotídico que ocorre durante a fase de replicação celular foi
relacionado no passado como um possível evento que poderia ocasionar o fenômeno da
hipermutação. Durante a replicação do DNA celular existe aumento das concentrações de
dTTP em relação a dCTP e atribuiu-se a esse bias a probabilidade de inserção da base T
em detrimento da base C na fita de cDNA viral a qual é finalmente fixada na fita de
polaridade positiva na forma de mutações G → A, caracterizando a hipermutação. Além
disso, sempre era observado que o acúmulo de elevado número de mutações G → A não
era acompanhado do aumento de outras mutações. Quando experimentos tentaram
reproduzir as condições de hipermutação, ocorreu perda da especificidade das
substituições G → A, reforçando a hipótese de que a hipermutação era um fenômeno
bioquímico específico e independente da alta taxa de erro da enzima transcriptase reversa
viral. Mais recentemente este fenômeno foi atribuído às APOBECs celulares. Neste
sentido, o presente estudo reuniu experimentos cujo objetivo foi correlacionar a presença
de hipermutação aos níveis de carga viral em pacientes infectados pelo HIV-1 não
tratados. A partir da correlação proposta e da observação dos dados, objetivou-se uma
melhor compreensão dos efeitos da hipermutação in vivo sobre as populações do HIV-1,
dentre elas, sobre uma possível restrição a nível populacional viral ocasionada pela ação
das APOBECs celulares.
A validação da metodologia de classificação das imagens fotodocumentadas em gel
de agarose com HA-Yellow fundamentou os resultados obtidos na análise das amostras
clínicas e foi calibrado em concordância com o método que o software Hypermut utiliza. A
76
otimização da análise da posição das amostras se deu com base na utilização do software
Image J o qual ajustado para detectar o pico de maior intensidade luminosa da amostra e
para mensurar o deslocamento deste pico em relação ao ponto de partida. Foram feitas
correções de imagem para compensar a assimetria ocasionada pelo efeito do campo
elétrico no gel A utilização do método K-means de ANOVA permitiu que o padrão de
deslocamento de cada amostra fosse agrupado como pertencente ao cluster do clone
hipermutado (A4aP) ou como pertencente ao cluster do clone normal (B190D), utilizando-
se o critério de máxima verossimilhança, que confere à análise um mínimo erro embutido.
A partir do que é entendido sobre o mecanismo de ação clássico das APOBECs
celulares até o presente, acredita-se que o fenômeno da hipermutação ocorre em
contextos dinucleotídicos específicos do genoma do HIV-1 (GpA e GpG). Assim sendo,
mutações específicas do contexto dinucleotídico G → A no contexto GpG e GpA ocorrem
em proporções muito maiores que quaisquer outras na fita do DNA do HIV-1, por ação das
APOBECs celulares. Adicionalmente é preciso considerar também que ao longo dos
contextos dinucleotídicos do genoma viral, a ação das APOBECs celulares é polarizada
(Figura 35) e com relação a essa ação, foi demonstrado que a freqüência de
hipermutações no genoma do HIV-1 inicia-se ínfima próximo à região denominada PBS
(Primer Binding Site – região de ligação do primer - na qual se liga um RNA transportador
de lisina que serve como iniciador para a síntese do cDNA viral a partir do RNA do HIV-1)
e aumenta proporcionalmente à medida que se aproxima do trato polipurínico central. No
trato polipurínico central a freqüência de hipermutações cai abruptamente a valor nulo ou
quase nulo, mas volta a aumentar proporcionalmente à medida que se aproxima do trato
polipurínico 3’ do genoma viral, anulando-se de novo de maneira abrupta ao chegar nessa
77
região. Em resumo, a hipermutação é nula ou quase nula nos tratos polipurínicos central e
3’ e é máxima na posição 5’ imediatamente antes de cada trato e, quando analisada
quantitativamente, o perfil mutacional resultante das substituições G → A forma dois
triângulos eqüiângulos (Figura 35)
32,33
.
Figura 35. Perfil da freqüência de hipermutação ao longo do genoma do HIV-1 considerando-se os tratos
polipurínico central e 3
’.
33
Tomando-se por base esse conhecimento, as regiões virais que codificam para os
genes Integrase e Nef seriam as melhores candidatas para indicar a presença de
hipermutação porque se localizam imediatamente antes dos tratos polipurínicos central e
3’ viral, respectivamente. Entretanto, a região da integrase foi triada para ser a região-alvo
das análises porque é uma das regiões mais conservadas entre os diferentes subtipos do
HIV-1
36
.
Além disso, durante a etapa de padronização da metodologia de PCR para
amplificação da região da integrase do HIV-1, foi verificado experimentalmente que o
aumento da concentração final de cloreto de magnésio na primeira etapa de amplificação
do DNA (4,0mM) otimizou a detecção de seqüências hipermutadas no gel de agarose com
HA-Yellow sem alterar a especificidade da reação (Figuras 4 e 5). Além do ajuste
equacional de reagentes críticos, numa PCR, a especificidade de uma reação é, de
78
maneira também crítica, determinada pela sequência dos iniciadores. Sequências
hipermutadas possuem temperatura de anelamento menor que sequências normais
(Tabela 1) consequente ao maior conteúdo A+T das primeiras e assim, as substituições G
→ A, diminuem a homologia de sequências hipermutadas com iniciadores normais numa
PCR. A partir da utilização da mistura de iniciadores degenerados e hipermutados (na
proporção 1:1) (Figura 8) e da PCR touch down permitiu-se que, sem formação de
produtos inespecíficos, ocorresse o anelamento dos iniciadores nas sequências com
variados níveis de hipermutação, incluindo as sequências hipermutadas e, dessa forma, o
DNA total amplificado na PCR foi representativo de amplo espectro de
populações/subpopulações virais. Portanto, a utilização de um sistema metodológico
completo para detecção de hipermutação permitiu alta freqüência de recuperação de
sequências hipermutadas de proviroses nas amostras clínicas.
Neste sentido, em comparação com estudos anteriores publicados, como o de
Pace
28
e colaboradores ou o de Janini
32
e colaboradores, os resultados deste estudo
recuperaram seqüências hipermutadas em freqüência elevada (31,2% em comparação a
43,0% e 9,4%, respectivamente) e pode-se atribuir esses achados a, ao menos, dois
fatores: otimização da região genômica do HIV avaliada e refinamento no ajuste de
elementos da PCR, que juntos possibilitaram o desenvolvimento de um sistema completo
de detecção de hipermutação.
Outros trabalhos, por procurarem hipermutação no genoma inteiro do HIV-1 a partir
de sequenciamento podem ter subestimado a freqüência desse evento e outros ainda,
devido ao tipo de metodologia utilizada, não identificam populações/subpopulações
minoritárias que apresentassem esta característica. Adicionalmente, apesar de ser
79
conhecido que a hipermutação é um fenômeno específico e não aleatório que ocorre em
algumas proviroses de HIV-1 integradas no genoma hospedeiro, não existe ainda um
critério universal que defina numa região genômica a partir de quantas mutações G → A
tem-se um evento o qual seja ocasionado não pelo acaso e sim por algum fator
determinante (no caso, a ação das APOBECs celulares). Assim sendo, cada estudo até o
momento tem delimitado seus próprios valores e referências para diferenciar sequências
hipermutadas de sequências não hipermutadas, de maneira que discordâncias entre os
mesmos podem ocasionar diferenças na classificação amostral
37, 38, 39
. O critério de
classificação utilizado no presente estudo, embora calibrado por sequenciamento, não
permite descartar a possibilidade de falsos-positivos por ter considerado o critério de
máxima verossimilhança na análise dos géis de agarose com HA-Yellow
fotodocumentados. Assim sendo, foi detectada hipermutação em 31,21% (49/157) das
amostras avaliadas porque foi utilizado um critério bastante conservador de análise no que
diz respeito ao erro tipo I (alfa) considerado durante as análises estatísticas. O rigor da
máxima verossimilhança faz com que a probabilidade de falsos positivos seja mínima,
entretanto, este critério pode, eventualmente, desconsiderar algumas amostras positivas.
Para que houvesse maior possibilidade de discussão da freqüência de hipermutação
encontrada, tanto a Tabela 3 como as Figuras 14 a 26 trouxeram os resultados incluindo
também os cálculos com o valor de um outro alfa (0,01), fixo e menos conservador, que
possibilitaria incluir outras amostras no cluster de hipermutadas. De acordo com o alfa
0,01, o número de amostras clínicas em que seria detectada hipermutação seria de 82
(52,2%). Entretanto, este alfa incorre em maior possibilidade de falsos-positivos. Na
verdade, acredita-se que, biologicamente, o número preciso de amostras hipermutadas
80
está contido no intervalo destas duas análises – entre 49 e 82 (entre o alfa de máxima
verossimilhança e o erro de 0,01), contudo, optou-se neste momento por uma maior
rigidez analítica, inclusive porque o número de amostras hipermutadas reportado neste
estudo já é superior ao de outros estudos recentemente publicados. Assim sendo, todas
as análises estatísticas deste estudo procederam segundo critérios de máxima
verossimilhança.
Como dito anteriormente, em relação a outros trabalhos publicados, detectando
hipermutação em 43% da casuística, o estudo de Janini
7
e colaboradores utilizou também
uma metodologia de alta sensibilidade e reportou o a maior prevalência de hipermutação
da literatura. Entretanto, até hoje não existe um critério “padrão ouro” que permita
determinar com exatidão numa sequência a diferenciação entre o background de outras
mutações que ocorrem aleatoriamente ao longo do genoma do HIV-1 e as mutações
específicas relacionadas ao fenômeno da hipermutação.
O estudo aqui realizado encontrou prevalência de 32,31% de hipermutação nas
amostras estudadas e encontrou ainda uma correlação entre presença de hipermutação e
maiores níveis de replicação viral. Sobre a significância das populações/subpopulações
hipermutadas no conjunto que composto pelas partículas virais de um indivíduo infectado
pelo HIV-1, merece destaque o estudo publicado por Kieffer e colaboradores
37
que
analisou clones das regiões da protease e da transcriptase reversa do HIV-1 de oito
pacientes com carga viral indetectável sob esquema de HAART. Em seu estudo, Kieffer
demonstrou-se que genomas hipermutados são capazes de se integrar de maneira estável
nos cromossomos do hospedeiro. Além disso, no mesmo estudo foram apresentadas
evidências consistentes de que o fenômeno da hipermutação ocorre possivelmente em
81
todo indivíduo infectado pelo HIV-1, embora os clones hipermutados não sejam
dominantes no conjunto de partículas virais que ocorrem no paciente (pouco mais que 9%
neste estudo
40
e aproximadamente 20% no estudo de Gandhi e colaboradores
41
). Mesmo
considerando que o índice recuperado de partículas virais hipermutadas foi elevado no
estudo aqui realizado em relação a outros estudos, suspeita-se de que este evento deva
ser ainda mais prevalente do que se consegue detectar e é plausível considerar que a
hipermutação de fato possa ocorrer em todos os pacientes infectados pelo HIV-1 e que as
populações hipermutadas são inviáveis.
Por outro lado, tendo em vista a metodologia do presente estudo, que recuperou
proviroses hipermutadas em 32,21% das amostras clínicas, mesmo com um sistema
bastante sensível para rastreamento sistemático de hipermutação, que permitiu que as
variantes hipermutadas fossem separadas fisicamente das não hipermutadas no gel de
agarose com HA-Yellow, não houve detecção deste fenômeno na totalidade das amostras.
A partir o conceito de quasispécies, que admite as partículas do HIV-1 como um pool de
variedades relacionadas no tempo e no espaço, e considerando que as variantes que
compõem o pool estarão presentes no DNA viral extraído para PCR, pode-se especular
que a não detecção de variantes hipermutadas em todas as amostras pode dever-se à
própria variabilidade genética do HIV-1 intrapaciente. Por isso, não se pode descartar a
possibilidade de que exista uma limitação metodológica da técnica utilizada no estudo a
qual, apesar de altamente sensível, possa ter ainda subestimado a prevalência de
sequências hipermutadas de proviroses. Outros estudos postularam que nem todas as
proviroses hipermutadas são capazes de se integrar no genoma hospedeiro. Enzimas
celulares denominadas DNA glicosilases (e.g. UNG e SMUGs)
42
são associadas à
82
degradação de cDNA virais uracilados, embora esse mecanismo não esteja
completamente elucidado. Se de fato for efetivo o efeito destas enzimas de reparação do
DNA celular - ou mesmo de outras enzimas ainda não conhecidas ou cuja ação ainda não
foi compreendida - capazes de interagir com o DNA editado pelas APOBECs, esses
achados representam mais uma evidência de que a freqüência que a hipermutação pode
ser rastreada em métodos de detecção à partir do DNA hospedeiro pode ser inferior
àquela que ocorre no ambiente intracelular.Neste sentido, pode-se justificar que os
iniciadores utilizados podem não ter sido capazes de amplificar seqüências hipermutadas
de todas as amostras, embora elas existam.
Em última análise, se por um lado a otimização da detecção de hipermutação
favoreceu o aumento da sensibilidade da reação, dada a importante diversidade étnica da
população brasileira, não se pode descartar que de fato a população estudada exiba
níveis de hipermutação maiores que os de outras populações. Contudo não há outros
estudos sistemáticos na população brasileira que fizeram um levantamento da prevalência
de hipermutação no país. Suspeita-se que, embora a população alvo brasileira seja
geneticamente bastante diversificada e possa apresentar características próprias em
relação a outras populações mais homogêneas e de composição etnoracial diferente,
possivelmente a sensibilidade da metodologia de detecção foi crítica para o achado de
32,21% de prevalência de hipermutação, superior aos achados de outros estudos.
Com relação ao significado biológico dos resultados obtidos, ao contrário do que
era cogitado inicialmente, foi encontrada uma correlação direta entre maiores valores de
carga viral e a presença de hipermutação (p=0,02, Teste de Mann-Whitney) e ainda uma
83
tendência que o correlacionava a presença de hipermutação a menor número de linfócitos
T CD4 (p=0,068, Teste de Mann-Whitney).
A diferença da média da carga viral entre pacientes em que foi detectada a
hipermutação em relação àqueles em que este fenômeno não foi detectado foi da ordem
de 100.000, numa relação de 1,57:1 de carga viral quando se calcula a razão entre a
média de carga viral dos pacientes em que foi detectada hipermutação em relação à
média de carga viral dos pacientes em que não foi detectada hipermutação. Esta diferença
não deve ser desconsiderada.
Estudos anteriores encontraram resultados discrepantes no que diz respeito ao
possível papel das APOBECs no controle da replicação viral
37,43,44
. Sabe-se que a
conseqüência da hipermutação é a geração de partículas virais não viáveis. Embora
poucos estudos avaliaram o efeito da hipermutação no genoma do HIV-1 a nível
populacional, dados os resultados obtidos neste estudo, pareceu-nos que em situações de
maior atividade de replicação viral ocorreu um aumento concomitante de eventos de
hipermutação. Especula-se que, nestes momentos da infecção viral, uma vez que pode
ocorrer maior número de eventos de hipermutação, a detecção deste fenômeno nas
amostras é maximizada porque pode refletir uma maior participação da imunidade inata no
controle da infecção pelo HIV-1. Neste sentido, não se pode deixar de discutir a própria
dinâmica da infecção pelo HIV-1 – como foi discutido inicialmente, as APOBECs atuam
ocasionando hipermutação ao longo do genoma do HIV-1 e, bioquimicamente, as
substituições G→A ocorrem durante a transcrição reversa. Sabe-se também que vif, a
proteína viral que ocasiona degradação das APOBECs, é produzido tardiamente na
infecção. Tomando-se por base as duas afirmações anteriores, outras duas considerações
84
podem ser feitas: a primeira é que a hipermutação só pode ocorrer quando há replicação
viral. Para justificar a primeira consideração, pode-se citar dados gerados no nosso grupo
de pesquisa em que não foi evidenciada hipermutação em pacientes denominados
supressores de elite (exibem tanto carga viral indetectável quanto mantém elevado a
contagem de linfócitos T CD4 positivos). Uma vez que estes pacientes controlam a
replicação viral, parece lógica a evidencia de que os mesmos não exibam níveis
detectáveis de hipermutação. Assim sendo, a hipermutação ocorre na dependência de
replicação viral e pode ser também conseqüente da replicação viral. A segunda afirmação
considera temporalmente a relação entre vírus e célula hospedeira. A proteína vif é
expressa tardiamente no ciclo de replicação do HIV-1 e todas as vezes que uma partícula
viral encontra uma célula hospedeira não infectada, teoricamente, ainda não houve tempo
da partícula viral expressar vir. Assim sendo, por maiores que sejam os níveis de
replicação viral, numa célula, sempre haverá um momento em que a partícula viral será
exposta ao ambiente celular e às APOBECs celulares sem que temporalmente tenha tido
chances de expressar vif. E neste momento ocorre hipermutação e o genoma viral
hipermutado pode integrar-se ao DNA da célula hospedeira. Novamente, deseja-se
lembrar que para ocorrer o fenômeno da hipermutação é necessária a replicação viral.
Estas considerações parecem se adequar aos resultados do presente estudo.
A partir de uma análise mais detalhada dos achados de hipermutação nas amostras
clínicas, surgiu a possibilidade de discutir a origem da hipermutação e o entendimento da
mesma como um fator viral ou do hospedeiro. Observando resultados como os da Figura
21 nas amostras clínicas 98 e 99 em relação a 97 e a 95, por exemplo, inferiu-se evidência
de que a hipermutação é dependente de fatores virais porque algumas
85
populações/subpopulações virais são suscetíveis à hipermutação, enquanto outras não.
As amostras clínicas 98 e 99 apresentam dois tipos de subpopulações virais com níveis de
hipermutação distintos, enquanto que as amostras 95 e 97 apresentam
população/subpopulação viral com um nível único de hipermutação. Por outro lado, não se
pode deixar de considerar que a hipermutação também é um fator do hospedeiro. No
estudo de Ping An e colaboradores, foi identificada um polimorfismo de APOBEC que se
correlacionou o polimorfismo africano 186R/R associado a progressão rápida para a
aids
30
. Por outro lado, o controle da viremia pelos supressores de elite não se apresentou
relacionado à hipermutação
45
. Assim sendo, fatores virais e do hospedeiro estão
envolvidos na modulação da dinâmica da hipermutação e da ação das APOBECs
celulares.
Neste estudo, foi detectada uma menor prevalência de hipermutação em indivíduos
de pele negra em relação tanto aos de pele branca quanto aos de pele parda
(respectivamente p = 0,001 e p=0,013 - Teste Qui-quadrado) e não houve diferença
detectada de prevalência de hipermutação entre os indivíduos de pele branca e parda
(p=0,348 – Teste Qui-quadrado). Salienta-se que a classificação de cor da pele deveria
constituir um dado para avaliação dos efeitos da hipermutação nos diferentes tipos raciais
brasileiros, principalmente considerando-se a importância da miscigenação neste país.
Contudo, acredita-se que o dado “coloração da pele” não seja a atribuição mais adequada
para caracterizar a origem étnica dos pacientes do estudo. A afirmação anterior justifica-
se, inicialmente pela exclusão da etnia asiática, sendo os pacientes desse grupo alocados
junto dos de coloração de pele branca. Além disso, muitas vezes houve discordância entre
diferentes profissionais quanto à classificação de alguns desses dados no prontuário (e.g.
86
mulato ou negro para o mesmo paciente) e, ainda, o pequeno número amostral de
indivíduos de pele negra (12 indivíduos, sendo que em 10 não foi observada
hipermutação) encontrado neste estudo não permite que os resultados encontrados
possam ser considerados representativos. Assim sendo, seria necessário um maior
número amostral de indivíduos de pele negra para que este resultado pudesse ser
considerado significativo. Adicionalmente, considerando especialmente o Brasil, de fato, a
coloração da pele é não é um bom fator de predição da ancestralidade genômica
46
.
Por outro lado, sabe-se que linfócitos T CD4 positivos em repouso são resistentes à
infecção pelo HIV-1 e este efeito tem sido atribuído à presença de APOBECs
enzimaticamente ativadas devido à conformação de baixa massa molecular que se
apresentam especificamente nestas células
47
. Um estudo publicado recentemente realizou
a inibição da expressão de RNA mensageiro de APOBEC3G e esta inibição não favoreceu
a replicação do HIV-1 nestas células
48
. Considerando-se a complexidade do ambiente
celular, e a informação trazida por este manuscrito de que a atividade das APOBECs
celulares foi cogitada como não determinante no controle da replicação do HIV-1 em
linfócitos T em repouso, discute-se que outros fatores também podem atuar na restrição
ou na permissividade à replicação viral e que estes fatores não necessariamente
relacionam-se aos efeitos das APOBECs celulares ou da hipermutação.
De fato, a carga viral reflete não somente a taxa de replicação viral como também
valores absolutos que caracterizam uma população viral em um paciente. Assim sendo,
em níveis maiores ou menores, a carga viral observada reflete uma quantidade de
partículas já filtradas pela ação da hipermutação e das APOBECs celulares
87
A padronização da metodologia de PCR em Tempo Real para a avaliação de
sequências hipermutadas constitui uma ferramenta que corrobora a classificação obtida
por sequenciamento e pela análise dos géis de agarose com HA-Yellow (Tabela 2) os
quais, por sua vez, também estão em acordo com o software Hypermut. A comparação
dos picos de Temperatura de Melting das sequências dos diferentes clones e amostras
clínicas permitiu tanto diferenciar níveis de hipermutação entre diferentes sequências
(Figura 30) quanto distinguir, dentro de uma amostra, mais de um pico. Como observado
no gel de agarose com HA-Yellow (Figura 18, amostra 54), a detecção de mais de um
pico de Temperatura de Melting representa populações virais com níveis de hipermutação
diferenciados (Figura 31). Esta metodologia poderá ser aplicada como ferramenta
analítica para hipermutação com o mesmo grau de confiabilidade que o sequenciamento
ou a análise de clusterização em gel de agarose com HA-Yellow. Ainda com relação à
Tabela 2, observou-se que o clone 35789_21 (conteúdo A+T de 62,53%) corresponde à
primeira amostra classificada como hipermutada por ambas as metodologias (análise de
clusterização por K-means e software Hypermut) (Figuras 11 e 12). Tanto pela predição
obtida a partir do software DNASTAR quanto por dados experimentalmente obtidos em
ensaios de PCR em Tempo Real, esta amostra apresentou um pico de Temperatura de
Melting de 79,26ºC. Assim sendo, considerando-se a região da integrase do HIV-1 de
582pb amplificada neste estudo, pode-se inferir que, a partir de valores de Temperatura de
Melting iguais ou inferiores a 79,26ºC, certamente uma amostra será classificada como
hipermutada.
A obtenção de árvores filogenéticas de sequências de HIV-1 demonstrou ser útil na
visualização dos efeitos da hipermutação em sequências nucleotídicas, particularmente no
88
efeito que o acúmulo de transições (substituições G <->A) determina na topologia da
árvore. A disposição de cada amostra na árvore reproduziu o grau de hipermutação
correspondente da sequência.
Em resumo, a análise dos níveis de hipermutação em amostras clínicas de material
amplificado por PCR submetido a eletroforese gel de agarose com HA-Yellow revelou uma
freqüência de 31,21% por método de máxima verossimilhança e a presença de
hipermutação correlacionou-se com maiores níveis de carga viral (p=0,02 no Teste de
Mann-Whitney). Entendemos que as APOBECs exercem ação a nível celular na infecção
pelo HIV ocasionando perda do conteúdo informacional genômico do HIV-1 através da
geração de clones hipermutados. Este efeito, que constitui um mecanismo de imunidade
inata deletério contra partículas virais em todo curso da infecção, correlacionou-se a
maiores níveis de carga viral plasmática do HIV-1. Embora houvesse também uma
tendência de o número de linfócitos T CD4 positivos ser inferior nos pacientes em que foi
detectada a hipermutação, não foi considerada significativa (p=0,068 no Teste de Mann-
Whitney). Assim sendo, conclui-se que a hipermutação é um fenômeno prevalente e que
está correlacionado com níveis mais elevados de carga viral em pacientes brasileiros
infectados pelo HIV-1 não tratados.
89
6 CONCLUSÕES
• O sistema de detecção de hipermutação do presente estudo é bastante sensível
para recuperação de sequências provirais hipermutadas, possibilitando rastrear
essas variantes em 31,2% das amostras clínicas avaliadas;
• Não se pode excluir a hipótese de que todos os pacientes possuam sequências
hipermutadas e a de que a metodologia possa ter detectado falsos-negativos
devido à estringência das análises;
• A presença de sequências hipermutadas em uma amostra está correlacionada com
maiores níveis de carga viral plasmática do HIV-1 e, portanto, com maiores níveis
de replicação viral
• A presença de sequências hipermutadas em uma amostra não está correlacionada
com gênero, coloração da pele ou contagem de linfócitos T CD4 positivos;
• Os valores de carga viral mensurados num indivíduo infectado pelo HIV-1
representam o número de partículas virais resultante ou filtrado do processo de
hipermutação.
• É possível utilizar a metodologia de PCR em Tempo Real para distinguir
sequências hipermutadas de sequências normais com base na Temperatura de
Melting que as caracteriza. Para a região estudada (fragmento de 582pb da
integrase do HIV-1), valores de Temperatura de Melting inferiores a 79,26ºC
correspondem a amostras hipermutadas.
• Os efeitos da hipermutação em diferentes sequências podem ser visualizados em
uma árvore filogenética.
90
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