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Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental
ALTERAÇÃO DAS RESERVAS DE GLICOGÊNIO EM NÚCLEOS
HIPOTALÂMICOS DE RATOS SUBMETIDOS À MALNUTRIÇÃO PROTÉICA
DURANTE O PERÍODO NEONATAL
SEBASTIÃO SÉRGIO LIMA DOS SANTOS
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental da Universidade do Estado do Rio de
Janeiro para a obtenção do grau de Mestre
Rio de Janeiro
2009
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ii
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental
ALTERAÇÃO DAS RESERVAS DE GLICOGÊNIO EM NÚCLEOS
HIPOTALÂMICOS DE RATOS SUBMETIDOS À MALNUTRIÇÃO PROTÉICA
DURANTE O PERÍODO NEONATAL
SEBASTIÃO SÉRGIO LIMA DOS SANTOS
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental da Universidade do Estado do Rio de
Janeiro para a obtenção do grau de Mestre
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Neurobiologia do
Desenvolvimento do Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro, sob orientação do Dr. Frank Tenório
de Almeida Costa.
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Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental
Avaliado em ____de_______________de 2009 pela banca examinadora:
________________________________________
Profa. Dra. Olga Maria Martins Silva de Almeida
(IBRAG/UERJ)
________________________________________
Profa. Dra. Patrícia Cristina Lisboa da Silva
(IBRAG-UERJ)
________________________________________
Prof. Dr. Arthur Giraldi Guimarães
(CBB-UENF)
iv
FICHA CATALOGRÁFICA
Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou
parcial desta dissertação.
_______________________
Data
________________________________
Sebastião Sérgio Lima dos Santos
S237 Santos, Sebastião Sérgio Lima dos.
Alteração das reservas de glicogênio em núcleos hipotalâmicos de
ratos submetidos à malnutrição protéica durante o período neonatal /
Sebastião Sérgio Lima dos Santos. - 2009.
xiii, 56f. : il.
Orientador : Frank Tenório de Almeida Costa.
Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro,
Faculdade de Ciências Médicas. Pós-Graduação em Fisiopatologia
Clínica e Experimental.
Bibliografia: f. 36-54.
1. Desnutrição - Teses. 2. Glicogênio - Teses. 3. Hipotálamo - Teses. 4.
Lactação - Teses. I. Costa, Frank Tenório de Almeida. II. Universidade do
Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
CDU 613.24
v
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador e amigo, Frank Tenório de Almeida Costa por me
aturar desde a iniciação científica.
À Penha Cristina Barradas Daltro-Santos por dividir esse fardo com o
Frank.
Aos meus familiares por todo suporte. Minha mãe e meus irmãos vocês
são muito especiais.
Ao Tiagão que vem me acompanhando e amadurecendo comigo desde a
entrada na faculdade.
Aos meus companheiros de laboratório, Bruninha, Michael, Marcelo,
Claudinha, Marcelle, Alexandre, Everton, P.P., Léo, Bia, Luiz, Vivi, Mácia,
Fabio, Gabi, Andrea, Marquinhos e Olga.
Aos nossos colaboradores Anicet, Ive, Léo, Juarez, Cássia, Cristiane e
Dona Geni.
Ao Jorge pelo auxílio em atividades tanto no laboratório como fora dele.
À Amélia Gomes e Alex Christan Manhães; obrigado por terem apostado
em mim.
À Ângela Gadelha por ter me ajudado no percurso até o Mestrado.
Também fica meu agradecimento aos meus amigos do Cap, Raquel e
Paulo, Cláudia Valéria e todos os não citados, mas igualmente importantes.
À Intruder por ter resistido até o fim.
E especialmente a minha esposa multitarefa, que me ajudou muito até
mesmo sem perceber. Te Amo. T.A.
Obrigado a todos, e por fim e acima de tudo a Deus.
vi
RESUMO
O estado nutricional perinatal tem influência persistente sobre o
desenvolvimento neural e a função cognitiva. Em humanos e outros animais, a
malnutrição protéica durante o período perinatal acarreta alterações
permanentes, incluindo a síndrome metabólica na idade adulta. A alimentação
é modulada principalmente por fatores neuronais e hormonais que chegam ao
hipotálamo. As reservas de glicogênio hipotalâmicos são uma fonte de glicose
em altas demandas energéticas, como durante o desenvolvimento dos circuitos
neurais. Como alguns circuitos hipotalâmicos estão sendo formados durante o
período de lactação, focamos o estudo nos efeitos da desnutrição protéica,
durante os primeiros 10 dias de lactação, sobre as reservas de glicogênio em
núcleos hipotalâmicos envolvidos no controle do metabolismo energético.
Ratas grávidas foram aleatoriamente separadas individualmente em gaiolas e
alimentadas ad libitum com uma dieta normoproteíca (22% proteína). Após o
parto, cada mãe ficava com 6 filhotes machos. Durante os 10 primeiros o grupo
experimental recebia uma dieta isenta de proteína (D) e o grupo controle uma
dieta normoproteíca (C). Em P10 a marcação para as reservas de glicogênio
era muito intensa nos animais C no núcleo arqueado (ARC) e eminência média
(EM). Em P20 no animais C, as reservas eram menores em comparação com
P10. Os animais D apresentaram uma marcação menor do que os controles.
Após P45 foi difícil determinar diferença entre os grupos porque o as reservas
estavam diminuídas. Nós também mostramos que os tanicitos eram as células
que apresentavam reservas de glicogênio. Nossos dados reforçam que o
estado nutricional materno durante a lactação é crítico para a maturação
cerebral, pois a malnutrição materna resulta em menor marcação nas reservas
de glicogênio no hipotálamo, o que pode ser crítico para o estabelecimento da
circuitaria neural.
vii
ABSTRACT
Perinatal nutrition has persistent influences on neural development and
cognition. In humans and other animals protein malnutrition during the perinatal
period causes permanent changes, inducing to adulthood metabolic syndrome.
Feeding is mainly modulated by neural and hormonal inputs to the
hypothalamus. Hypothalamic glycogen stores are a source of glucose in high
energetic demands, as during development of neural circuits. As some
hypothalamic circuits are formed during lactation, we attempt to study the
effects of malnutrition, during the first 10 days of lactation, on glycogen stores in
hypothalamic nuclei involved in the control of energy metabolism. Female
pregnant rats were fed ad libitum with a normorprotein diet (22% protein). After
delivery each dam was kept with 6 male pups. During the first 10 days of
lactation dams from experimental group received a protein free diet and the
control group a normoprotein diet. By P10 glycogen stores were very high in the
arcuate nucleus and median eminence of control group. Glycogen stores
decreased during development. In P20 control animals, glycogen stores were
lower when compared to P10 control animals. Animals submitted to malnutrition
presented a staining even lower than control ones. After P45 it was difficult to
determine differences between control and diet groups because glycogen
stores were reduced. We also showed that tanycytes were the cells presenting
glycogen stores. Our data reinforce that maternal nutritional state during
lactation may be critical for neurodevelopment since it resulted in a low
hypothalamic glycogen store, which may be critical for establishment of
neuronal circuitry.
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AG - Ácido graxo
AGL - Ácido graxo livre
AgRP - Peptídeo relacionado a agouti
ARC - Núcleo arqueado
ATP - Trifosfato de adenosina
CART - transcrito regulado por cocaína e anfetamina
CCK - Colecistoquinina
CFS - Fluído cerebroespinhal
DAB - Diaminobenzidina tetraidroclorido
DMH - Hipotálamo dorso medial
EM - Eminênmcia média
EME - Eminência média externa
EMI - Eminência média interna
GFAP - Proteína ácida fibrilar de glia
GLP1 - Peptídeo similar ao glucagon
GLUT2 - Proteína transportadora de glicose 2
GS - Glicogênio sintase
IL - Interleucina
IGFI - Fator de crescimento similar à insulina 1
IGFII - Fator de crescimento similar à insulina 2
IMC - Índice de massa corporal
LH - Hipotálamo lateral
MBP - Proteína básica de mielina
MCP1 - Proteína 1 quimiotática de monócito
NPY - Neuropeptídeo Y
MSH - Hormônio estimulador de monócito
NTS - Núcleo do trato solitário
OCT - Meio ótimo para inclusão
ON - Óxido nítrico
P10 - Décimo dia de vida pós-natal
P11 - Décimo primeiro dia de vida pós-natal
P16 - Décimo sexto dia de vida pós-natal
P20 - Vigésimo dia de vida pós-natal
P45 - Quadragésimo quinto dia de vida pós-natal
PBS - Salina tamponada com fosfato
PE - Peri-ventricular
PPG - Proteína para glicogênio
POMC - Pro-opiomilanocortina
PVN - Núcleo paraventricular
PYY - Hormônio derivado de célula L
SNC - Sistema nervoso central
TG - Triglicerídeo
TNFα - Fator de necrose tumural α
VIP - Pepitídeo vasoativo intestinal
VMH - Núcleo hipotalâmico ventro-medial
WHO - Organização Mundial de Saúde
ix
ÍNDICE DE QUADROS
Quadro 1 - Critérios para diagnóstico de Sindrome Metabólica 6
Quadro 2 - Peso dos animais controle e dieta nas diferentes
idades estudadas ± desvio padrão 25
x
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Animais utilizados 19
Tabela 2 - Composição e modo de preparo da ração artesanal
utilizada 20
Tabela 3 - Composição das rações comercial e manipulada 21
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Representação esquemática do hipotálamo de rato 16
Figura 2 - Figura esquemática do hipotálamo de rato 26
Figura 3 - Reserva hipotalâmica de glicogênio em P10 e P20 27
Figura 4 - Reserva hipotalâmica de glicogênio em P45 28
Figura 5 - Reserva hipotalâmica de glicogênio e identificação
fenotípica de células gliais 29
Figura 6 - Reserva hipotalâmica de glicogênio em células
imunomarcadas com anticorpo anti-vimentina 30
Figura 7 - Reserva hipotalâmica de glicogênio em células
imunomarcadas com anticorpo anti-GLUT 2 30
xii
ÍNDICE
1. Introdução 1
1.1 - Fome e Desnutrição 1
1.2 - Programação Metabólica 2
1.3 - Obesidade e Síndrome Metabólica 4
1.3.1 - Controle da Fome e Saciedade 9
1.3.2 - Malnutrição Protéica e Hipotálamo 11
1.4 - Glicogênio 12
1.5 - Tanicitos 15
2. Objetivos 18
2.1 - Objetivo Geral 18
2.2 - Objetivos Específicos 18
3. Materiais e Métodos 19
3.1 - Animais 19
3.2 - Dieta 19
3.3 - Perfusão 21
3.4 - Criosecção 22
3.5 - Histoquímica do PAS 22
3.6 - Imunohistoquímica 23
3.7 - Terminologia 24
4. Resultados 25
4.1 - Desenvolvimento Ponderal 25
4.2 - Reservas de Glicogênio 25
5. Discussão 31
6. Conclusões 35
7. Referências Bibliográficas 36
Anexos 55
xiii
Anexo 1: Glycogen stores are impaired in hypothalamic nuclei
of rats malnourished during early life. Artigo submetido à revista
International Journal of Developmental Neuroscience 55
Anexo 2: Maternal malnutrition during lactation alters
gonadotropin-releasing hormone expression in the weaned male
pups. Artigo em colaboração com a Profa. Cristiane F Ramos,
submetido à revista Neuroscience Letters 56
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 - Fome e Desnutrição
A fome está intimamente relacionada com a dificuldade de acesso ou
falta de alimentos para contemplar a quantidade de energia requerida para a
manutenção do organismo e execução das atividades diárias de um indivíduo.
Já a desnutrição é resultado da inadequação quantitativa e/ou qualitativa
dietética ou de doenças como infecções que provem sinais clínicos
característicos (Monteiro, 1995; Sawaya e cols., 2003).
A avaliação do estado nutricional de crianças deve ser realizada
utilizando-se os indicadores peso e estatura para a idade (OMS, 1995).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), mais de um terço das
mortes infantis no mundo pode ser atribuída à desnutrição, sendo a pobreza a
causa central desta. Segundo estimativa da OMS, cerca de 178 milhões de
crianças no mundo têm retardo no crescimento decorrente de desnutrição
(OMS, 1995). Os dados da Pesquisa Nacional sobre Demografia de Saúde
(PNDS) do IBGE de 1996, complementam que as crianças são as mais
afetadas por desnutrição, variando entre 8,1 e 27,3% do total de crianças no
Brasil, dependendo da região (PNDS, 1996).
Já entre as mulheres, o índice de massa corporal (IMC) abaixo do valor
normal, ou seja, 18,5 Kg/m2, perfazem entre 10 a 19% na maioria dos países,
segundo a WHO. Tal problema se torna mais evidente em países da África
Sub-Sahariana e sudeste e centro-sul da Ásia, onde os valores se aproximam
de 20% (Onis e cols., 1993). No Brasil, em crianças menores de cinco anos, o
déficit severo de peso para altura, peso abaixo de 3 desvios-padrão, está em
torno de 3,5 % em paises em desenvolvimento (Monteiro, 1995).
Durante a segunda guerra mundial em 1940, os países baixos foram
invadidos por tropas alemãs as quais impuseram um embargo no transporte de
mercadorias e alimentos. Como resultado, no ano seguinte, ocorreu
racionamento de alimento com escassez de gêneros alimentícios para toda a
população. Esta recebia em torno de 1500Kcal/dia por volta de setembro de
1944. Como a produção local de alimentos era muito baixa, o embargo levou
rapidamente à falta de alimentos, resultando em fome principalmente nas
2
grandes cidades de Amsterdam, Rotterdam, Hague, Utrecht, Leiden e Haarlem.
Em fevereiro de 1945, os alimentos disponíveis eram pães, batatas,
beterrabas, sendo a oferta de alimento ainda menor, em torno de 1000
Kcal/dia. A fome teve seu pico nas 4 semanas anteriores à libertação que
ocorreu em maio de 1945 quando o avanço das forças aliadas separou
totalmente a região oeste do resto do território. Este período ficou conhecido
como o “inverno de fome” (Dutch famine) e resultou na morte de 20.000
pessoas por causas relacionadas à mesma. Há uma grande importância
acadêmica deste período para o entendimento dos efeitos da carência
nutricional sobre o desenvolvimento do individuo, principalmente por sua
precisão em termos de circunstância, tempo e severidade da mesma (Susser e
cols., 1998).
Processos fisiopatológicos semelhantes aos evidenciados pelos estudos
com sobreviventes do “inverno da fome holandês” provavelmente acometem à
população malnutrida do Brasil e do mundo.
1.2 - Programação Metabólica
A hipótese que postula que doenças crônicas na fase adulta possam ter
origem fetal ou pós-natal vem sendo corroborada em estudos epidemiológicos
como os do “inverno de fome holandês” e dados experimentais. Fatores
ambientais, principalmente nutricionais, durante os primeiros momentos da vida
tornam o individuo mais suscetível a doenças cardiovasculares e metabólicas
na fase adulta (Barker e cols., 1990; Barker e cols., 2002; Barker e cols.,
2005a; Barker, 2005b). Os primeiros achados dessa relação são de 1934 com
o trabalho de Kermack e colabores (1934), onde foi concluído que melhores
condições ambientais na infância resultam em menores taxas de mortalidade.
Uma série de mecanismos foi proposta para elucidar tal processo (para
revisão ver McMillen e Robinson, 2005). Hales e Barker (1992) sustentam a
hipótese do fenótipo poupador (thrifty phenotype), a qual sugere que o
ambiente fetal pobre induz uma resposta adaptativa que favorece o
desenvolvimento de alguns órgãos em detrimento de outros, alterando o
metabolismo pós-natal, com o intuito de aumentar a sobrevida em situações de
carência constante ou intermitente de nutrientes. Entretanto, tais adaptações
3
tornam-se prejudiciais quando o ambiente pós-natal é mais abundante em
nutrientes (Hales e Barker, 2001).
Esse conceito de adaptação embrionária, em resposta à situação
nutricional, resultando em consequências não reversíveis se encaixa
perfeitamente na definição de programação metabólica proposta por Lucas
(1991). Tal definição contempla ainda que, se um insulto ocorrer em uma janela
crítica do desenvolvimento, isto pode levar a alterações funcionais persistentes.
O termo impressão metabólica também tem sido usado para descrever o
fenômeno metabólico que relaciona o estado nutricional embrionário e/ou dos
primeiros momentos de vida com desfechos de saúde na fase adulta. Tal
processo é caracterizado por: i) susceptibilidade restrita a determinado período
no desenvolvimento, chamado de janela crítica ontogênica; ii) efeito persistente
até a fase adulta; iii) desfecho específico variável quantitativamente entre
indivíduos; iv) relação dose-dependente entre exposição e desfecho (Waterland
e Garza, 1999).
Uma segunda hipótese é a da plasticidade evolucionária (Barker, 2004).
Esta hipótese foi proposta com base no conceito de que um genótipo é capaz
de produzir mais de um estado fisiológico em resposta ao tipo de ambiente no
qual o indivíduo foi exposto. Essa capacidade é conhecida em diversos animais
e em processos fisiológicos e a influência materna em resposta a situação
ambiental pode ser notada nas gerações seguintes, não somente na prole
(Bateson e cols., 2004). Se um indivíduo for exposto durante o
desenvolvimento à alta oferta de alimentos, quanto melhor for a sua situação
nutricional na vida adulta melhor será sua saúde, porém se a situação
nutricional no desenvolvimento for pobre e tornar-se rica na fase adulta pior
será sua condição de saúde (Bateson e cols., 2004). A plasticidade
evolucionária estabelecida durante o desenvolvimento representa uma
vantagem adaptativa imediata, porém inapropriada em ambientes diferentes
em longo prazo (Gluckman e Hanson, 2004).
Um indicador do desenvolvimento fetal e do aporte nutricional para o
embrião é o peso ao nascer. O baixo peso ao nascer é definido quando a
criança apresenta massa corporal inferior a 2,5 kg (OMS, 1995). Outro
indicador é o tamanho para a idade gestacional, entretanto variáveis
importantes devem ser consideradas ao avaliar o desenvolvimento fetal, como
4
a influência genética sobre tais indicadores (Lee e cols., 2003). Está bem
estabelecido que o crescimento fetal é limitado pelo tamanho da mãe e sua
capacidade de ofertar nutrientes, fenômeno conhecido como coação materna
(Thame e Wilks, 1997). No entanto, grandes alterações nutricionais sofridas
pela mãe são repassadas em menor intensidade para o feto, pois a placenta
tem grande capacidade de ajustar o transporte de nutrientes (Harding, 2001).
Outro importante fator é a qualidade da alimentação materna, estudos
realizados em uma população relativamente bem nutrida mostraram que a
combinação de dieta rica em carboidratos durante o início da gravidez e pobre
em proteína no fim da gestação foi associada com baixo peso ao nascer e
placenta reduzida (Godfrey e cols., 1996; Godfrey e cols., 1997). Portanto,
existe uma forte correlação entre o estado nutricional materno e o fetal.
O tamanho ao nascer tem sido associado com a insulina, com o fator de
crescimento similar à insulina I e o II (IGFI e II) e com suas proteínas ligantes e
receptores do IGFII no plasma do cordão umbilical (Matsuda e cols., 1997). A
desordem na secreção ou ação da insulina pode justificar o rápido ganho de
peso (“catch up”) observado em jovens que tiveram restrições na fase fetal
seguida de alimentação normal na fase pós-natal. Ong e colaboradores (2000),
em um estudo de coorte, viram em uma população relativamente bem nutrida
que o rápido ganho de peso e baixo ganho de peso (“catch down”) ocorrem em
aproximadamente 30 e 25% dos indivíduos, respectivamente, sendo que o
restante continua no mesmo percentil de origem ao nascer. Os que
apresentaram rápido ganho de peso foram os com o menor peso e altura ao
nascer, que tinham pais altos e mães que apresentaram baixo peso ao nascer.
Segundo Karlberg e colaboradores (1995), aproximadamente 90% das crianças
que nasceram pequenas para a idade gestacional apresentavam algum
crescimento acelerado nos 6 primeiros meses de vida. Em comunidades ricas,
crianças com baixo peso ao nascer que apresentaram o rápido ganho de peso
cedo, tendem a ter aumento do IMC e da massa adiposa (Ong e cols., 2000).
1.3 Obesidade e Síndrome Metabólica
A obesidade é a doença metabólica mais comum no mundo, sua
prevalência tem aumentado nas ultimas décadas em todo o mundo (McClean e
5
cols., 2008). No Brasil, sendo mais incidente nas classes sociais com menor
renda, que também apresentam maiores taxas de desnutrição materno-infatil
(Monteiro e cols., 2004). Definida como “acúmulo de gordura excessivo ou
anormal que pode ser prejudicial à saúde”, estimativas da OMS declaram que
em 2015, o excesso de peso acometerá cerca de 2,3 bilhões de pessoas e
destas, 700 milhões de adultos serão obesos, o que representará
aproximadamente 10% da população mundial. (WHO, 2006). O método de
avaliação mais usado em trabalhos epidemiológicos e na prática clínica é o
Índice de Massa Corporal (IMC) que corresponde ao peso em quilogramas
sobre a altura em metros elevado ao quadrado. Para adultos, valores entre
18,5 e 24,9 Kg/m2 são considerados normais, entre 25 e 29,9 Kg/m2
sobrepeso e acima de 30 Kg/m2 obesidade. (para revisão ver Fomigueira e
Canton, 2004).
A obesidade é fator de risco para a Síndrome Metabólica (SM), que se
caracteriza pela ocorrência simultânea de anormalidades metabólicas como
intolerância a glicose, dislipidemia, hipertensão, podendo acarretar em
problemas individuais, como risco aumentado de doenças cardiovasculares e
diabetes, acidente vascular encefálico, alguns tipos de câncer e morte
prematura. (Valdez e cols; 1994; Chan e cols., 1994; Krauss e cols., 1998;
Rexrode e cols., 1997; Kurth e cols., 2002; Calle e Kaaks, 2004; Calle e cols.,
2003; Hu e cols., 2004; Lee e cols., 1993). Nos EUA, é estimado que cerca de
24% da população apresenta SM, e com o envelhecimento da população esse
valor deve elevar-se (Ford e cols., 2002). A síndrome metabólica é
diagnosticada em um indivíduo quando ao menos três dos cinco critérios a
seguir são encontrados: 1 obesidade abdominal avaliada pelo aumento na
circunferência do abdômen; 2 pressão arterial aumentada; 3
hipertrigliceridemia; 4 hiperglicemia; 5 redução no HDL colesterol (Quadro 1)
(ATPIII, 2001). Algumas alterações metabólicas como disfunção endotelial,
inflamação sistêmica, aumento no estresse oxidativo e estado pró-trombótico
também podem ser encontradas, mas não são critérios diagnósticos.
6
Quadro 1 - Adaptado de adult Treatment Panel III (2001)
Critérios para diagnóstico de Síndrome Metabólica
Glicemia de jejum ≥110 mg dl
-1
Circunferência da cintura
Homens > 102 cm
Mulheres > 88 cm
Trigliceridemia ≥ 150 mg dl
-1
HDL colesterol
Homens < 40 mg dl
-1
Mulheres < 50 mg dl
-1
Pressão sanguínea ≥ 130/85 mmHg
O Diabetes Mellitus (DM) compreende um grupo de desordens
metabólicas que convergem para um quadro comum de hiperglicemia, e
diversos tipos de DM já foram descritos. Dependendo de sua etiologia, fatores
como resistência a insulina, redução de secreção/produção de insulina, menor
captação de glicose, e/ou aumento na produção de glicose são responsáveis
pela hiperglicemia.
A classificação é baseada na sua patogenia: tipo 1 onde há destruição
das células β por ataque autoimune ou causa desconhecida, levando a
deficiência de insulina; tipo 2 compreende desordens caracterizadas por níveis
diferentes de resistência a insulina, alteração na secreção de insulina e
aumento na produção de glicose; defeitos genéticos na ação/secreção de
insulina; distúrbios metabólicos que levam a alteração na secreção de insulina;
endocrinopatias induzidas por fármacos; síndromes genéticas; e anormalidades
mitocôndriais.
O DM tipo 2 tem íntima relação com obesidade e a supernutrição crônica
associada à predisposição genética e ao sedentarismo, que levam a alterações
na sinalização de insulina. Tais alterações são resumidas em resistência a
insulina, que passa a não desempenhar de maneira efetiva seu papel como
hormônio associado à abundância de energia. Quando existe abundância de
energia proveniente da alimentação, em especial carboidratos, a insulina é
7
secretada em grandes quantidades para estimular seu armazenamento, no
caso da glicose, na forma de glicogênio no músculo e fígado principalmente, ou
convertida em ácidos graxos. (para revisão ver Deborah e cols., 2008).
A alteração na sensibilidade à insulina pode ser resultado do aumento da
massa adiposa. Em indivíduos magros, os adipócitos possuem uma grande
capacidade de sintetizar e armazenar triglicerídeos (TGs) durante a
alimentação, da mesma forma que oxidá-los e liberá-los durante o jejum
(Rosen e Spiegelman, 2006; Kalderon e cols., 2000). Dentro da célula, os
ácidos graxos são esterificados com a coenzima A para reduzir suas
propriedades detergentes e tóxicas, e são rapidamente oxidados na
mitocôndria. Nesses indivíduos a sensibilidade à insulina e captação de glicose
no músculo esquelético é normal. Em situação de hiperfagia indutora de
obesidade, com aumento da quantidade de calorias ingeridas e redução da
atividade física, os adipócitos aumentam devido ao acúmulo de triglicerídeos.
Em estágios iniciais, tais adipócitos continuam com atividade normal, mantendo
taxas de lipólise basais durante o jejum (Christianson e cols., 2007; Frayn e
cols., 1994). Os níveis de ácidos graxos livres aumentam e a sensibilidade
muscular a insulina se mantém. Nesse momento já começa a se estabelecer o
quadro de dislipidemia.
Conforme os adipócitos aumentam, sua habilidade como células
endócrinas se torna afetada (Qatanani e Lazar, 2007; Rajala e Scherer, 2003;
Kershaw e Flier, 2004). Nesse momento, moléculas que regulam indiretamente
o metabolismo de triglicerídeos (TG) e ácidos graxos (AG) estão alteradas,
como a Proteína 1 quimiotática de monócito (MCP1) e o Fator de Necrose
Tumoral alfa (TNF α). O adipócito hipertrofiado libera grandes quantidades de
MCP1 (Sartipy e Loskutoff, 2003), que atrai macrófagos para o tecido adiposo,
contribuindo para o estado pro-inflamatório em obesos (Curat e cols., 2004).
Macrófagos e adipócitos secretam nesse momento mais MCP1 e outras
citocinas inflamatórias como a interleucina 1 Beta (IL1β) e o TNFα. O resultado
sobre o adipócito é um aumento na lipólise e decréscimo na síntese de
triglicerídeos, favorecendo o aumento de AG livres no plasma. Que ao se
acumularem no tecido muscular esquelético, hepatócitos e células β na forma
de cadeias longas de ácidos graxos ligados a acil-CoA éstereficada (LC-CoAs)
8
desempenham papel de disruptor metabólico (Unger, 1995; Unger, 2002),
contribuindo então para a abertura do quadro de DM.
O DM e a dislipidemia são as principais comorbidades apresentadas por
pacientes com hipertensão arterial sistêmica, caracterizada por aumento
crônico da pressão arterial em repouso. No estudo populacional realizado em
Banbuí, cidade de Minas Gerais, foi observado que somente de 6% a 8% dos
hipertensos não apresentavam outras comorbidades. E de 31% a 42% dos
hipertensos, dependendo da faixa etária, apresentavam três ou mais fatores de
risco para acidente coronariano, sendo a dislipidemia e o DM os principais
(Barreto e cols., 2001).
O aumento do LDL-colesterol plasmático, um indicador de dislipidemia,
aumenta a expressão do receptor 1 de angiotensina (AT1) em células
musculares lisas do endotélio (Nickenig e cols., 1997), e da enzima conversora
de angiotensina (John, 1999). Essas duas alterações recorrentes da
dislipidemia favorecem a disfunção endotelial e o aumento no estresse
oxidativo (Nickenig e Harrison, 2002a, Nickenig e Harrison, 2002 b). Esse
aumento no estresse oxidativo associado ao estado pró-inflamatório do
individuo dislipidêmico e ou obeso favorecem o inicio do processo
arterosclerótico (para revisão ver Sposito, 2004), o ajuda a explicar a alta
incidência de acidentes cardiovasculares em indivíduos com SM.
Intervenções não farmacológicas como redução do sedentarismo, perda
de massa corporal, redução no consumo de sal e aumento no consumo de
alimentos ricos em potássio, vêm se mostrando eficientes em pacientes com
SM, (Appel, 2003). Estudos que utilizaram a dieta Dash, uma dieta escassa em
gorduras saturadas e rica em frutas, vegetais e micronutrientes, mostraram que
os indivíduos não hipertensos podem reduzir a pressão sistólica em 3,1 mmHg
e em hipertensos a queda pode chegar a 11,4 mmHg (para revisão ver Appel e
cols., 1997). Kwnowler e colaboradores (2002) em um estudo de coorte
mostraram que em indivíduos com intolerância à glicose a atividade física e a
perda ponderal de peso são intervenções eficientes compatíveis com o
tratamento farmacológico com a metformina.
9
1.3.1 - Controle da Fome e Saciedade
As primeiras evidências de controle hipotalâmico da fome vêm de
cirurgias experimentais (lesões) no hipotálamo lateral (LH) que acarretavam em
afagia. Já lesões experimentais no hipotálamo medial (DMH) geravam
hiperfagia e obesidade. Destes estudos surgiram os termos “Centro da fome” e
“Centro da Saciedade”. Tais termos foram contestados posteriormente, pois os
hiperfágicos com o tempo se estabilizavam em um novo peso superior ao pré-
cirúrgico e os afágicos, se alimentados forçadamente para prevenir a morte
atingiam um peso de equilíbrio abaixo do pré-cirúrgico e não morriam de fome
(Card e cols., 1999).
Se esses núcleos influenciavam, porém não determinavam por completo
o processo de fome-saciedade; outros processos deveriam estar envolvidos.
Thomas e Mayer (1968) relacionaram o tempo entre as refeições com a
quantidade de alimento ingerido, ou seja, se um animal comia muito, o intervalo
para a próxima refeição seria longo, mas um longo período de jejum não
determinava a quantidade de alimento a ser ingerido na próxima refeição. A
vista disso sugeriu-se que os outros processos envolvidos deveriam ser
periféricos.
Atualmente são conhecidos diversos sinais de saciedade: nervoso,
proveniente da cavidade oral, que leva informação através do núcleo do trato
solitário e do córtex gustatório; nervosos vagais, eferentes do estômago, que
assinalam o seu enchimento pela distensão da parede gástrica, repassando a
informação ao HL pelo núcleo do trato solitário; hormonal, pela secreção de
colecistocinina (CCK), liberado pelo estômago agindo sobre o núcleo do trato
solitário e área postrema, somando-se ao estímulo vagal. Outros exemplos de
hormônios são glucagon, leptina, neurotensina e a bombesina.
A palavra leptina é uma tradução da palavra grega leptos que significa
magro, e recebeu esse nome por causa do seu efeito anti-obesidade, primeira
função creditada a esse hormônio. A glicemia pós-prandial aumentada é um
potente estimulador da secreção de insulina e leptina. Esses hormônios
sinalizam a quantidade de energia acumulada no organismo. A leptinemia é
proporcional à massa de tecido adiposo, portanto funciona como um sinal de
10
“controle de estoque”. Esses hormônios reduzem o apetite por ação
hipotalâmica. (Cintra e cols., 2007).
O núcleo arqueado (ARC) tem papel fundamental no processo de
percepção, pois está localizado próximo à eminência média e essa região
apresenta alterações na barreira hematoencefálica (Broadwell e Brightman,
1976). Alguns hormônios periféricos como peptídeo YY (PYY) e peptídeo
similar ao glucagon 1(GLP1) são capazes de atravessar a barreira através de
mecanismos não saturáveis. (Nowak e cols., 2000; Kastin e cols., 2002),
entretanto outros sinais como leptina e insulina são transportados por
mecanismos saturáveis (Banks e cols., 1996; Banks, 2004). O ARC possui
duas populações primárias de neurônios, uma inibe a hiperfagia através da
secreção de pro-opiomilanocortina (POMC) e transcrito regulado por cocaína e
anfetamina (CART) (Elias e cols., 1998; Kristensen e cols., 1998), e a outra
estimula a ingestão através da sinalização de neuropeptídeo Y (NPY) e o
peptídeo relacionado a agouti (AgRP) (Broberger e cols., 1998; Hahn e cols.,
1998).
O NPY reflete o estado nutricional do indivíduo, os níveis RNAm de NPY
e sua secreção aumentam no jejum e decrescem após as refeições (Sanacora
e cols., 1990), assim como o AgRP (Swart e cols., 2002). Os neurônios NPY+
projetam-se para o núcleo paraventricular (PVN) ipsolateral (Bai e cols., 1985).
Injeções repetidas de NPY nesse núcleo levam a hiperfagia e obesidade
(Stanley e cols., 1986; Zarjevski e cols., 1993) e aumento na insulinemia e
cortisoloemia independente do aumento no consumo alimentar (Wynne e cols.,
2005).
O POMC é um precursor de melanocortinas, sendo o principal hormônio
estimulador de melanócitos (MSH), e também reflete o estado energético do
corpo. Durante o jejum os níveis de RNAm do POMC estão reduzidos e
aumentam com administração exógena de leptina ou alimentação (Schwartz e
cols., 1996). Receptores de MSH encontram-se no ARC, VMH e PVN (Harrold
e cols., 1999; Mountjoy e cols., 1994) e reduções na expressão (Fan e
cols.,1997; Lubrano-Berthelier e cols., 2003a; Lubrano-Berthelier e cols.,
2003b) ou polimorfismos (Argyropoulos e cols., 2002) levam à obesidade. O
AgRP atua como antagonista ao receptor MSH bloqueando a redução do
11
consumo de alimentos promovendo aumento no consumo alimentar. (Rossi e
cols., 1998).
O CART é co-expresso com o MSH no ARC (Elias e cols., 1998;
Kristensen e cols., 1998) e em situações de restrição alimentar há redução em
seus níveis de RNAm (Kristensen e cols., 1998). Esses neurônios projetam-se
para o HL e para PVN (Couceyro e cols., 1997).
Esses são os principais responsáveis pelo sistema de controle
hipotalâmico da fome e saciedade através dos núcleos ARC, VMH, PVN, HL e
DMH. Neurônios NPY/AgRP e POMC/CART positivos do ARC emitem
projeções para os núcleos PVN, HL e DMH. (Elias e cols., 1998; Elmquist e
cols., 1998; Kmiec., 2006). Quando temos um aumento da massa adiposa, a
leptina e a insulina estimulam os neurônios POMC no ARC que aumentam a
expressão e secreção de Αmsh no PVN e LH resultando em redução no
consumo alimentar. Esses hormônios periféricos também inibem os neurônios
NPY/AgRP+ no ARC que, ao deixarem de secretar estes peptídeos, reduzem a
inibição da via das melanocortinas favorecendo ainda mais a afagia. Porém,
com a redução de massa adiposa, temos redução de leptina e insulina, o que
gera o estímulo dos neurônios NPY/AgRP+, que antes estavam inibidos. Esses
neuropeptídeos estimulam a ingestão de alimentos diretamente e indiretamente
por inibir o receptor de Αmsh. A produção de melacortinas está reduzida, pois
os neurônios POMC+ estão inibidos nessa situação metabólica (Kmiec, 2006).
A partir desse equilíbrio dinâmico ocorre a manutenção da massa corporal.
1.3.2 - Malnutrição protéica e hipotálamo
Moura e colaboradores. (2002) utilizaram um modelo experimental onde
as ratas lactantes eram submetidas a uma dieta aprotéica durante os 10
primeiros dias de lactação. Após este período, estas ratas recebiam ração
comercial com o conteúdo padrão de proteínas. Os filhotes era então avaliados
em diferentes idades do desenvolvimento. Moura e colaboradores. (2002)
observaram então que os animais experimentais apresentaram maiores
leptinemia e insulinemia em P10, somente retornando aos níveis normais na
fase adulta em P60. Além disto, estes animais apresentaram maior
susceptibilidade ao desenvolvimento de SM. Em nosso laboratório utilizando o
mesmo protocolo de dieta, Marcelino e colaboradores (2004), observaram um
12
atraso na expressão da óxido nítrico sintase em alguns núcleos hipotalâmicos
envolvidos com o controle do metabolismo energético nos animais malnutridos.
A circuitaria hipotalâmica responsável pelo controle da fome e saciedade em
roedores ainda está se desenvolvendo em idades pós-natais precoces. As
projeções eferentes do ARC de fibras NPY/AGRP somente chegam aos
núcleos hipotalâmicos aferentes entre P11 e P16 (para revisão ver Grove e
Smith, 2003). Para formar adequadamente os circuitos neurais é de
fundamental importância a estabilização das sinapses e o óxido nítrico tem
importante participação na sinaptogênese durante o neurodesenvolvimento
(Gally e cols., 1990). Estes dados sugerem que a malnutrição possa estar
afetando o desenvolvimento dos circuitos neurais hipotalâmicos que poderiam
regular o metabolismo energético.
1.4 - Glicogênio
O glicogênio é um polímero ramificado relativamente grande de glicose
classificado como um polissacarídeo. As moléculas de glicose estão ligadas em
sua maioria pelos carbonos 1 e 4 de forma linear, e em geral existe a cada 8
moléculas uma ligação entre o 6º e o primeiro carbono, originando assim as
ramificações. Essa estrutura espacial favorece a solubilidade e permite a
liberação simultânea de mais moléculas de glicose.
O glicogênio, localizado no citoplasma, na forma de grânulos com
diâmetros variáveis entre 10 e 40 nm (Brown, 2004), é armazenado
principalmente no fígado e nos músculos esqueléticos, mas também é
encontrado em outros locais como no encéfalo. Representando entre 1 e 2%
do peso da musculatura esquelética, de 6 a 8% do fígado (Shulman e cols.,
1995) e somente 0,1% do cérebro. Por apresentar quantidade tão pequena no
cérebro, teve sua importância cerebral descartada, o que resultou em poucos
estudos.
No cérebro o glicogênio é armazenado em neurônios e células gliais em
concentrações que variam durante o desenvolvimento. Apenas certos
neurônios do tronco cerebral, plexo coróide e região ependimal contêm
glicogênio na fase adulta (Magistretti e cols., 1993). A maior parte do glicogênio
cerebral está localizada nos astrócitos (Cataldo e Briadwell, 1986),
13
principalmente nas áreas com maior densidade sináptica, sugerindo uma
relação com a atividade neuronal (Koizumi e Shiraishi, 1970a; Koizumi e
Shiraishi, 1970b; Phelps, 1972). Sua distribuição pelas regiões do cérebro não
é uniforme, por exemplo, estruturas na matriz cinzenta apresentam mais
glicogênio do que na branca (Duffy e cols., 1972; Koizumi, 1974; Swanson e
cols., 1989a).
A enzima glicogênio sintase (GS) está distribuída pelo cérebro, em maior
quantidade no cerebelo, hipocampo e bulbo olfatório. Sua expressão é
estimulada pelo peptídeo vasoativo intestinal (VIP) e noradrenalina (Pellegri e
cols., 1996; Sorg e Magsitretti, 1992) que estimulam a síntese de proteínas,
como a proteína para glicogênio (PPG) (Allaman e cols., 2000).
A PPG, abundante nos astrócitos, facilita a ligação da fosfatase 1 ao
glicogênio resultando na desfosforilação e ativação da GS (Allaman e cols.,
2000). A glicogênio fosforilase, também muito presente nos astrócitos, catalisa
a degradação de glicogênio (Ignácio e cols., 1990; Pfeiffer e cols., 2003)
apresentando-se na forma fosforilada ativa e desfosforilada inativa. Sua
fosforilação é controlada por fosforilases quinases e por ligação alostérica com
AMP e glicose, mostrando assim sensibilidade ao estado energético da célula
(para revisão ver Brown, 2004).
O aumento do glicogênio cerebral é estimulado por glicose, IGF-1, IGF-2,
insulina, glutamato, metionina, sulfoximina. (Magistretti e cols., 1999; Swanson
e cols., 1989; Baskin e cols., 1987; Daniel e cols., 1977; Hamai e cols., 1999).
O mais expressivo fator é a insulina, cuja concentração no parênquima cerebral
é menor do que no plasma, de onde é transportada via barreira
hematoencefálica por meio de transportadores específicos (Baskin e cols.,
1987; Banks e cols., 1997). Chesler e Himwich (1944), em seu trabalho em
cães com hipoglicemia induzida por insulina, mostraram que o glicogênio
reduziu-se primeiro nas áreas com maior taxa metabólica e que esta redução
depende mais da atividade metabólica do que dos níveis iniciais de glicogênio.
O mesmo foi mostrado em coelhos (Goncharova, 1957).
Choi (2003), utilizando a técnica espectroscopia por ressonância nuclear
magnética que permite a mensuração de glicose marcada incorporada ao
glicogênio cerebral sem a necessidade de matar o animal, mostrou depleção
do glicogênio cerebral em ratos anestesiados com hipoglicemia induzida, após
14
a glicose cerebral cair à zero. Quando a demanda por glicose excede a oferta
ao cérebro, o glicogênio começa a ser degradado e, caso exista uma
hipoglicemia crônica, a função cerebral reduz e lesões irreversíveis podem
ocorrer (Auer, 1986; Frier e Fisher, 1999). Whatley e colaboradores (1981)
observaram que culturas de neurônios apresentavam maior sobrevida na
presença de células gliais, sugerindo uma relação metabólica entre eles. Em
estudo subseqüente, Swanson e Choi (1993) determinaram que o estoque
astrocitário de glicogênio era vital para manutenção de neurônios em cultura e
não o número de astrócitos.
Cater e colaboradores (2001), em seu trabalho, incubaram fatias
organotípicas de hipocampo de ratos durante quatorze dias em meio com
30mM de glicose, quantidade suficiente para aumentar consideravelmente os
níveis de glicogênio. Após a retirada da glicose exógena, pelo período de uma
hora, não foi observado efeito significativo sobre os picos de atividade emitidos
pela população neuronal. Em preparações com nervo óptico isolado em meio
sem glicose, o glicogênio pode manter a atividade neural por 30 minutos em
ratos (Wender e cols., 2000). Os achados desses dois pesquisadores
contradizem Siesjö (1978) e Clarke e Sokoloff (1999) que afirmam que o
cérebro só se mantém por poucos minutos com a reserva de glicogênio.
Em casos de isquemia, onde a ausência de oxigênio é concomitante à de
glicose, o lactato oriundo da degradação do glicogênio não pode ser oxidado. E
nessa situação a função cerebral é mantida por pequenos períodos de tempo,
pois a eficiência da via anaeróbica é baixa em comparação com a via aeróbica
(Hansen, 1985). Baltan e colaboradores (2003) mostraram que a matriz branca
cerebral é mais resistente a anóxia que a cinzenta, e a energia produzida
anaerobicamente continua sendo insuficiente para manter a função celular por
longos períodos.
O glicogênio cerebral acumula-se durante o sono (Karnovsky e cols.,
1983). Em ratos o aumento chega próximo aos 70% em poucos minutos após
indução de sono de ondas lentas (Benington e Hellre, 1995). A explicação mais
plausível para esse fenômeno baseia-se nos transmissores que estimulam a
glicogênio fosforilase como noradrenalina e serotonina, pois como são
secretados em maior quantidade durante a vigília, é presumível que a
15
glicogenólise esteja mais estimulada durante esse período. Portanto, durante o
sono a glicogênese ocorre com mais facilidade (para revisão ver Brown, 2004).
1.5 - Tanicitos
Grande parte do volume celular do sistema nervoso central é composta
por células gliais. As glias participam de diversas funções durante o
desenvolvimento, como: migração neuronal; controle da extensão,
direcionamento, fasciculação e embainhamento de axônios; promoção da
sinaptogênese; secretção de fatores tróficos que modulam a proliferação e
diferenciação de neurônios e das próprias glias. E na fase adulta: manutenção
do microambiente; mediação entre endotélio e SNC; metabolismo de
neurotransmissores; e participação no sistema imunológico local.
Durante a formação do SNC, o tubo neural é formado por um epitélio
pseudoestratificado, onde os núcleos das células estão em diferentes níveis e
apresentam dois prolongamentos principais. O primeiro está voltado para o
lúmem do tubo, os futuros ventrículos e canal central da medula. O segundo
está voltado para a pia mater, meninges ou membranas que envolvem o
encéfalo ou medula espinhal. As células do tipo glial radial primordial que
durante o desenvolvimento atrofiam ou perdem o segundo tipo de
prolongamento e desenvolvem o primeiro, tornam-se células ependimárias, que
são cubóides ou colunares, constituindo uma monocamada que reveste os
ventrículos. (para revisão ver Carvalho e cols., 2005).
As glias radiais primordiais que perderam o primeiro tipo de
prolongamento e desenvolveram o segundo, tornam-se glias limitantes como
os astrócitos subpiais. Os astrócitos do parênquima cerebral são formados por
astrócitos subpias que desenvolveram um terceiro tipo de projeção que parte
do corpo celular e está relacionado com o contato neuronal.
Durante o período perinatal uma subpopulação de glia radial diferencia-se
em tanicitos, células que possuem funções fisiológicas similares a astrócitos e
glias radiais, mas morfologia, expressão de moléculas e outras funções
diferentes. Quatro subpopulações de tanicitos são distinguíveis: α1, α2, β1 e
β2. Tais subtipos expressam moléculas que conferem algumas funções
diferentes, como transportadores de glicose e glutamato; receptores de
16
neuropeptídeos e hormônios periféricos; fatores de crescimento;
prostaglandinas (para revisão ver Rodríguez e cols., 2005).
Os tanicitos β1 estão localizados na região lateral baixa do terceiro
ventrículo e são capazes de desenvolver processos que se conectam a
capilares e neurônios do ARC. Já os β2 localizam-se no assoalho do terceiro
ventrículo e suas projeções podem se conectar à superfície da pia mater ou
aos capilares da eminência média. A parte proximal desses tanicitos faz
contato com o fluido cérebro-espinhal do terceiro ventrículo e, ao mesmo
tempo, com as junções oclusivas presentes entre essas células, formam a
barreira da eminência média. Os tanicitos α1 e α2 estendem-se pela parede
lateral e dorsal do terceiro ventrículo e suas projeções conectam-se ao núcleo
VMH (Figura 1) (para revisão ver García e cols., 2003).
Figura 1 Representação esquemática do hipotálamo de rato. As células diretamente
identificadas são: 1) ependimócitos ciliados revestindo a parede rostral do terceiro ventrículo
(3V); 2) Tanicitos α1,2 localizados na região dorsal da parede lateral do 3V; 3) Tanicitos β1
localizados na região inferior da parede lateral do 3V; 4) Tanicitos β2 localizados na eminência
média (EM). Essas células formam a barreira eminência média-cerebroespinhal (Linha em
17
negrito). As projeções dos tanicitos β1 e β2 se conectam com os capilares porta-hipotalâmios da
EM e “pars tuberalis” (indicados com V-) que se caracterizam pela ausência de barreira
hematoencefálica. Existem evidências experimentais que tanicitos e neurônios da região inferior
da parede do 3V expressam glucoquinases, receptor do peptídeo 1 similar ao glucagon (GLP-1)
e canais de potássio sensíveis a ATP. Modificado de García e cols. (2003).
O transportador de glicose (GLUT2) e o canal de potássio sensível a ATP nas
células β da ilhota pancreática são considerados parte fundamental do
mecanismo de percepção dos níveis de glicemia (para revisão ver Schuit e
cols., 2001). Os tanicitos também expressam tais proteínas, o que levou
diversos autores a sugerirem que essas células possam ser responsáveis pelo
mecanismo no qual o hipotálamo percebe alterações na concentração de
glicose plasmática e do fluido cerebroespinhal do terceiro ventrículo (Alvarez e
cols., 1996; Thomzig e cols., 2001).
18
2. OBJETIVO
2.1 - Objetivo Geral
Avaliar os efeitos da desnutrição protéica durante um período restrito da
amamentação sobre as reservas de glicogênio no hipotálamo de ratos machos
Wistar.
2.2 - Objetivos Específicos
1) Avaliar as reservas de glicogênio no hipotálamo de ratos machos Wistar
durante o desenvolvimento pós-natal;
2) Comparar as reservas de glicogênio de ratos machos Wistar cujas mães
sofreram desnutrição protéica na fase de lactação com animais cujas
mães não sofreram desnutrição;
3) Identificar que tipo de célula glial possui reservas de glicogênio no
hipotálamo de ratos Wistar.
19
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Animais
Foram utilizados ratos albinos da cepa Wistar, criados no biotério de
animais do Depto de Farmacologia e Psicobiologia da Universidade do Estado
do Rio de Janeiro. As fêmeas foram alimentadas com ração comercial
(NUVILAB) ou ração manipulada. Após o nascimento, foi realizada a
identificação do gênero com base na distância urogenital por profissional
treinado. Somente ninhadas com seis ou mais animais foram utilizadas. Ainda
no primeiro dia de vida pós-natal, as ninhadas foram reduzidas para seis
animais, priorizando-se a manutenção dos machos. O grupo experimental (D)
recebeu uma dieta manipulada em nosso laboratório, isenta de proteínas, a fim
de estabelecer uma deficiência protéica. Já o controle recebeu dieta comercial
(C). Todos os animais tiveram livre acesso à ração e água, em temperatura
ambiente de 25 ºC, e ciclo claro e escuro de 12 horas (7:00-19:00).
Tabela 1 Número de animais utilizados (“n”) por de idade.
P10 P20 P30 P45 P60
C D C D C D C D C D
Animais 17 20 9 10 15 15 5 4 5 5
Total 37 19 30 9 10
3.2 - Dieta
As nutrizes do grupo experimental receberam dieta comercial (NUVILAB)
com 22% de proteínas, durante todo o período anterior ao parto, incluindo
gestação e desenvolvimento. A dieta manipulada isenta de proteína (Tabela 2)
era oferecida da data do parto até o décimo dia de vida da prole (P10), onde a
dieta normoproteíca era restabelecida. As dietas divergem basicamente no
percentual de proteínas e de carboidratos (Tabela 2), que estão aumentados a
fim de compensar calóricamente a ausência de proteínas.
20
Tabela 2 Composição e modo de preparo da ração artesanal utilizada (adaptado de Costa,
2000).
Ingredientes Mistura de sais
Aderogil
®
(vitamina D
3
e A) 2 ml Carbonato de Cálcio 87g
Complexo B 15 ml
Fosfato de potássio dibásico
123g
Vitamina K 1ml Fosfato de Cálcio 28g
Vitamina E 1m Sulfato de magnésio 32g
Vitamina C 5 ml Cloreto de sódio 49g
Vitamina B
12
1 ml Citrato férrico 2g
Ácido fólico 2 mg Iodeto de potássio 0,2g
Óleo de soja 50 ml Sulfato de manganês 0,2g
Mistura de Sais 32 g Sulfato de zinco 0,09g
Maisena 900 g Sulfato de cobre 0,09g
Misturar os sais e a Maizena
®
, reservar. Diluir as vitaminas no óleo
e acrescenta-los a mistura. Adicionar água destilada até dar o ponto
para formar o biscoito, para então assar.
21
Tabela 3 Composição das rações comercial e manipula (Adaptado de Costa, 2000).
Nutrientes Nutrilab Manipulada
Proteína 22% 0%
Carboidratos 72,6% 88,9%
Lipídeos 5,4% 11,1%
Kilocalorias 4,21 Kcal/g 4,05 Kcal/g
Vitamina A 12.000 Ui 11.000 Ui
Vitamina D
3
1.800 Ui 2.000 Ui
Vitamina E 30 mg 40 mg
Vitamina K
1
10 mg
Vitamina B1 5 mg 5 mg
Vitamina B2 9 mg 10 mg
Vitamina B6 7 mg 10 mg
Vitamina B12 20 mg 20 mg
Ácido Fólico 1 mg 2 mg
Biotina 1,5 mg 2,5 mg
Nicotinamida 50mg
Niacina 60 mg 60 mg
Ácido
Pantotênico
20 mg 25 mg
Ferro 50 mg 50 mg
Zinco 60 mg 58 mg
Cobre 10 mg 10 mg
Manganês 60 mg 50 mg
Cálcio 4207 mg
Potássio * 2765 mg
Sódio * 1226 mg
Magnésio * 606 mg
* dados não informados.
3.3 - Perfusão
A perfusão dos animais, somente machos, foi realizada entre as 9h e 11h
da manhã, a fim de evitar a influência circadiana sobre a reserva de glicogênio.
Primeiramente, os animais foram anestesiados com éter, tiveram sua caixa
toráxica aberta por remoção do gradil costal para exposição do coração. As
soluções da perfusão foram infundidas no ventrículo esquerdo por intermédio
de uma cânula. Uma incisão realizada no átrio direito permitia o escoamento do
sangue e das soluções após passarem pelo corpo. A primeira solução injetada,
uma solução salina 0,9%, visava à remoção do sangue do animal sem provocar
coagulação sanguínea. A segunda solução, tampão fosfato 0,1M pH7,4 com
22
4% de paraformaldeído, realizava a fixação dos tecidos. Posteriormente a
solução fixadora acrescida de sacarose a 10%, iniciava a crioproteção. A salina
foi injetada em temperatura fisiológica a fim de reduzir a vasoconstricção, e as
demais foram mantidas resfriadas a uma temperatura em torno de 4ºC durante
todo o processo de perfusão.
Ao término da perfusão, iniciava-se a dissecção do cérebro, para que
esse fosse mantido em uma solução fixadora acrescida de 10% de sacarose
por 1 hora a 4ºC e depois transferido para uma solução de tampão fosfato 0,1M
pH7,4 acrescido de sacarose a 20% durante a noite a 4ºC.
3.4 - Criosecção
A criosecção foi iniciada 22 horas após o fim da perfusão para que todas
as amostras fossem expostas ao mesmo tempo de crioproteção. Para realizar
a criosecção, cérebros foram aparados para serem cortados no plano coronal e
embebidos em meio de inclusão (OCT tissue tek). O cérebro era colocado em
recipientes de papel alumínio e cobertos com o OCT, para então serem
congelados em nitrogênio líquido e cortados entre 13 e 30 µm em um criótomo
a -25ºC. Os cortes foram recolhidos em lâminas gelatinizadas de modo seriado.
O atlas de Paxinos e Watson (1998) foi utilizado para auxiliar a identificação
das regiões do cérebro.
3.5 - Histoquímica do ácido periódico de Shiff
A técnica do ácido periódico de Shiff (PAS) desenvolvida por Rosenberg
e Dichter (1985) para detecção de glicogênio em cultura de células dissociadas
foi minimamente alterada para permitir sua utilização em fatias de tecido
cerebral de gambá por Barradas e colaboradores. (1989) e Cavalcante e
Barradas (1996).
Protocolo este utilizado em nosso trabalho. As lâminas foram
mergulhadas em etanol absoluto a -20ºC por 2 horas e, em seguida,
transferidas para solução de etanol 80% para serem reagidas pelo método
desenvolvido por Rosenberg e Dichter (1985): os cortes foram oxidados em
ácido periódico a 1% dissolvido em etanol 80% por 1h, em seguida as lâminas
23
foram lavadas em etanol 80% e coradas com fucsina básica a 1%.
Posteriormente, as lâminas foram desidratadas em concentrações crescentes
de etanol e clarificadas em xilol, quando então foram montadas usando
Entellan® como meio.
Protocolo para técnica PAS para glicogênio:
1- Álcool absoluto a -20ºC por 1h
2- Lavagem em álcool 80% por 1’
3- Periodato de Na 1% em álcool 70% por 1h
4- Lavagem em álcool 70% (2X) por 1’
5- Corar com fucsina de Rosenberg (no escuro) por 30’a 60’
6- Lavagem em álcool 80% por 1’
7- Álcool 90% por 3’
8- Álcool 95% por 3’
9- Álcool 90% por 3’
10- Álcool absoluto (2X) por 3’
11- Xilol PA (2X) por 3’
12- Montar com Entellan®
3.6 - Imunohistoquímica
Foram realizadas reações para imunoidentificação de Proteína Básica de
Mielina (MBP), Vimentina, Proteína Transportadora de Glicose 2 (GLUT2) e
Proteína Ácida Fibrilar de Glia (GFAP).
As lâminas com cortes adjacentes aos reagidos pela histoquímica (que
foram guardadas a -20ºC) foram lavadas com o tampão fosfato salina (PBS)
em pH 7,4 acrescido de Triton 0,3%. Em seguida, foram incubadas em soro
normal de cabra 10% (NGS) ou soro bovino 5% (BSA) em PBS pH 7,4 por 2h
em temperatura ambiente. As lâminas destinadas à reação contra MBP
passaram antes por metanol a -20ºC durante meia hora de forma a facilitar a
penetração do anticorpo, antes da lavagem com PBS Triton 0,3%. Após a
incubação com NGS ou BSA, as lâminas foram escorridas e os cortes
24
incubados com o anticorpo primário (anti-Vimentina, anti-MBP, anti-GLUT2 ou
anti-GFAP) por período de uma noite a 4ºC.
No dia seguinte as lâminas ambientavam por uma hora para então serem
lavadas em PBS. Depois foram incubadas por 1h em temperatura ambiente
(25ºC) com anticorpo secundário anti-IgG de camundongo (MBP e Vimentina),
anti-IgG de coelho (GFAP) ou anti-IgG de burro (GLUT2) conjugados a biotina.
As lâminas então foram lavadas novamente com PBS para então os cortes
serem reagidos com o último reagente, a extravidina conjugada com
peroxidase ou CY3 (cromógeno fluorescente) por uma hora.
A revelação dos cortes reagidos com extravidina conjugada a peroxidase
ocorria com o uso do 3,3’ diaminobenzidina tetraidroclorido (DAB). Depois de
lavadas em tampão fosfato 1M, pH 7,4 e água destilada as lâminas secavam
durante a noite. Posteriormente os cortes foram desidratados com
concentrações crescentes de álcool e clarificados em xilol. Ao final, as lâminas
foram montadas utilizando Entellan® como meio. Os cortes reagidos com
extravidina conjugada com CY3 foram lavados com PBS e as lâminas foram
montadas utilizando N-propilgalato como meio.
As lâminas foram observadas e fotografadas sob iluminação de campo
claro ou fluorescência em um microscópio Olympus RX40 (Tokyo, Japan).
3.7 - Terminologia
A identificação da citoarquitetura e a terminologia das áreas do
hipotálamo seguiram os critérios estabelecidos por Paxinos e Watson (1998)
para animais adultos.
25
4. RESULTADOS
4.1 - Desenvolvimento Ponderal
Neste estudo foi utilizado um total de 107 animais dos quais 50 animais
fizeram parte do grupo controle e 57 do grupo dieta. As idades estudadas
variaram entre P10 e P60 (ver Tabela 1 na metodologia). O modelo de
desnutrição utilizado provoca alterações em peso (Quadro 2) como visto em
nosso laboratório por Montanha-Rojas e colaboradores (2005). Os animais
submetidos à desnutrição possuem peso médio menor que os animais controle
até os 90 dias de vida.
Quadro 2 Peso dos animais controle e dieta nas diferentes idades estudadas ± desvio padrão
(Adaptado de Montanha-Rojas e cols., 2005).
4.2 - Reservas de Glicogênio
A técnica do PAS permite visualizar os grânulos de glicogênio presentes
no interior das células que são evidenciados pela coloração com a Fucsina de
Rosenberg. As reservas de glicogênio no hipotálamo de ratos apresentaram-se
extremamente evidentes nas regiões destacadas no esquema abaixo (Fig. 2)
as quais incluíram: núcleos periventricular (PE) e arqueado (ARC) e áreas do
hipotálamo dorso medial (DMH) e eminência média (EM).
P10 P20 P30 P45 P60 P90
Controle 24,97±1,47 49,46±3,57 96,03±1,80 143,94±2,19 239,57±13,40 391,14±22,86
Dieta 11,80±1,27 28,82±0,91 76,07±4,73 118,8±1,38 207,4±4,77 345,14±21,52
26
Figura 2 Figura esquemática de núcleos hipotalâmicos envolvidos com mecanismos de controle
de fome e saciedade onde são observados tanicitos com reservas de glicogênio. Em vermelho o
hipotálamo ventro medial (VMH); em verde o hipotálamo dorso medial (DMH); em azul o núcleo
arqueado (ARC); em amarelo o núcleo periventricular (Pe) e a eminência média interna (MEI) e
externa (MEE). Adaptado de Paxinos e Watson (1998).
A marcação para as reservas de glicogênio foi observada em corpos
celulares presentes na parede ependimária e em prolongamentos radiais que
deixam esta região penetrando o parênquima hipotalâmico (Fig. 3).
O padrão na distribuição de marcação do grupo submetido à malnutrição
(D) foi bastante semelhante ao observado no grupo controle (C) (Fig. 3).
Corpos celulares próximos à parede ependimária com prolongamentos que
penetravam regiões do ARC, EM e DMH, intensamente marcados podiam ser
observados em ambos os grupos de animais, no entanto, a marcação nos
animais submetidos a malnutrição (Fig. 3b) foi menos intensa quando
comparado aos animais do grupo controle (Fig. 3a) em P10.
Aos 20 dias pós-natal a marcação das reservas de glicogênio apresentou
menor intensidade em relação à P10 em ambos os grupos de animais. No
entanto, em P20 os animais D também apresentavam redução na marcação
quando comparados com o grupo controle. (Figs. 3c e 3d).
27
Figura 3 Reserva hipotalâmica de glicogênio em P10 e P20. Reserva hipotalâmica de glicogênio
nos animais controle (C) e malnutridos (D). C (a) apresenta mais marcação de glicogênio do que
D (b) em P10. Em P20 ambos apresentam redução da marcação das reservas de glicogênio
quando comparados a P10, no entanto, a diferença entre C (c) e D (d) permanece. Barra de
calibração =100µm.
A redução na marcação das reservas de glicogênio progride, em P30
ambos os grupos apresentam menor marcação em relação à P20, porém as
diferenças entre animais controle e malnutridos persistiram. Em P45 a redução
é muito expressiva, tornando a diferenciação entre C e D visualmente difícil
(Fig. 4). A distribuição da marcação das reservas de glicogênio nessa idade se
apresenta muito mais predominante na EM e a morfologia se mantêm em
ambos os grupos.
a b
c d
28
Figura 4 Reserva hipotalâmica de glicogênio em P45. Reserva hipotalâmica de glicogênio nos
animais controle (C) e malnutridos (D). Nesta idade as reservas estão restritas à eminência
média sendo muito raras em regiões como ARC ou DMH. A progressiva redução das reservas
de glicogênio dificulta a diferenciação entre C (a) e D (b) em P45, no entanto ainda há indicação
de menor intensidade de marcação em animais D. Barra de calibração =100µm.
De acordo com a literatura, o tipo de célula glial que, predominantemente,
apresenta reservas de glicogênio em diversas regiões do cérebro são os
astrócitos (para revisão ver Brown, 2004). Para identificação do tipo de célula
glial que contém as reservas de glicogênio observadas nos núcleos
hipotalâmicos DMH, ARC e EM foram realizadas, em cortes adjacentes aos
marcados para glicogênio, imunohistoquímica para GFAP, MBP e vimentina. O
tratamento com álcool e periodato utilizados na reação de identificação do
glicogênio, inviabiliza qualquer reação de imunohistoquímica, portanto não foi
possível realizar reação contra GFAP, MBP e vimentina nos mesmos cortes em
que o glicogênio foi marcado. E a imunohistoquimica prejudica a reação do
PAS por que expõem demasiadamente os cortes à água, o que dilui os
grânulos de glicogênio inviabilizando sua identificação. A marcação com
anticorpo anti-GFAP, uma proteína de filamento intermediário de citoesqueleto
presente em células da linhagem astrocitária, estava presente em corpos
celulares ventralmente ao terceiro ventrículo na EM. Sendo então, bastante
diferente da marcação das reservas de glicogênio do corte adjacente, que
estão evidenciadas em estruturas radiais na EM com corpos celulares na
camada ependimária. (Fig. 5b, c, e e f). A marcação com anticorpo anti-MBP,
uma proteína específica de células oligodendrogliais, está dispersa em diversos
núcleos hipotalâmicos, no entanto apresenta uma marcação sob a forma de um
feixe na região da eminência média interna (EMI), na região correspondente ao
a b
29
infundíbulo. Os cortes adjacentes mostram marcação para as reservas de
glicogênio em corpos celulares na parede ventricular e em prolongamentos
destas células presentes em regiões da EMI e na EME (Fig. 5 a, b, d e e).
Figura 5 Reserva hipotalâmica de glicogênio e identificação fenotípica de células gliais. As
marcações para MBP, Glicogênio e GFAP não parecem estar nas mesmas estruturas. MBP (a e
d) e GFAP (c e f) estão em estruturas espacial e morfologicamente distintas de onde se encontra
a marcação para glicogênio como observado (b e e) em cortes adjacentes. Em d, e e f, em maior
aumento, podemos notar que células positivas para MBP e GFAP estão presentes em
agrupamentos localizados ventralmente ao terceiro ventrículo (3V) (setas em d e f) e que não na
região com os corpos celulares marcados para reservas de glicogênio (setas em e) localizados
na camada ependimária da parede do 3V. * indica o terceiro ventrículo. Barra de calibração =
50µm.
A vimentina é uma proteína de filamento intermediário de citoesqueleto
presente em células da glia radial. Nos núcleos hipotalâmicos a vimentina está
presente em tanicitos, células gliais com características de astrócitos e glia
radial. A marcação com anti-vimentina revelou estruturas radias com corpos
celulares presentes na camada ependimária tanto no PE como na EM (Fig. 6a),
a distribuição desta marcação muito se assemelhava com a marcação para
reservas de glicogênio observadas nestas regiões (Fig. 6b). Esses dados
sugerem fortemente que as reservas de glicogênio estão prioritariamente em
tanicitos.
a b c
d e f
* * *
* * *
30
Figura 6 Reserva hipotalâmica de glicogênio em células imunomarcadas com anticorpo anti-
vimentina. Em a, microfotografia do hipotálamo de um rato em P20, marcada para glicogênio.
Em b, imunoidentificação de células positivas para vimentina. Notar que vimentina e glicogênio
estão aparentemente nas mesmas estruturas. (caixas em a e b). Barra de calibração = 100µm.
Objetivando comprovar estes resultados foi realizada a
imunohistoquímica com anticorpo anti-GLUT2 em cortes previamente reagidos
para revelação das reservas de glicogênio através da técnica de PAS (Fig. 7).
Durante a imunohistoquímica parte da marcação para as reservas de
glicogênio foi perdida nas lavagens, mas é notória a co-localização de GLUT2 e
glicogênio. Esse achado reforça consistentemente a presença de glicogênio em
tanicitos no hipotálamo.
Figura 7 Reserva hipotalâmica de glicogênio em células imunomarcadas com anticorpo anti-
GLUT 2. Em a, microfotografia do hipotálamo de um rato em P20 marcado para glicogênio. Em
b, o mesmo corte imunoreagido com anticorpo anti-GLUT2. Notar que várias células contendo
glicogênio são positivas para GLUT 2 (setas em a e b). Barra de calibração = 100µm.
a b
a b
31
5. DISCUSSÃO
Nossos resultados demonstraram marcação para reservas de glicogênio
em torno do terceiro ventrículo. Esta marcação preenchia os corpos celulares
presentes na camada ependimária e em prolongamentos destas células que
penetravam o parênquima hipotalâmico, principalmente ao nível dos núcleos
DMH, PE, ARC e na EM. Esta marcação apresentou redução em sua
distribuição e intensidade ao longo do desenvolvimento, sendo muito forte em
P10 e menos intensa em P45. Corroborando nossos resultados, alguns
estudos demonstraram que as reservas de glicogênio cerebral em ratos são
transitórias sendo reduzidas em animais adultos (Borke e Nau, 1984). Borke e
Nau (1984) utilizaram cortes ultrafinos de cérebro de ratos em diversas idades
pré e pós-natais. Para detectar o glicogênio foi realizada uma técnica baseada
também no PAS em diversos núcleos cerebrais como hipoglossal, núcleos
mesencefálicos, núcleo ambíguo e abducente, área motora facial e células do
corno ventral da medula. Nessas regiões todos os neurônios possuíam pelo
menos alguma reserva de glicogênio na primeira semana pós-natal, mas em
idades adultas não foi detectado glicogênio. Mais recentemente, tem sido
aceito que o glicogênio pode agir como uma fonte de energia em situações de
aglicemia mesmo em animais adultos e tem sido mostrado que as reservas de
glicogênio reduzem significativamente durante intensas descargas axonais em
estados normoglicêmicos. Brown e colaboradores (2005) mensuraram o tempo
de atividade em nervo óptico de rato sob estímulo de alta frequência em meio
normoglicêmico. Para definir se o glicogênio é utilizado nessa situação como
fonte extra de energia utilizaram o mesmo modelo experimental em presença
de um inibidor da degradação de glicogênio, a isofagomina, constatando então
uma redução temporal da atividade de nervos ópticos nesta preparação, em
resposta ao estímulo de alta freqüência. Assim sendo, concluíram que, o
glicogênio é utilizado em situações de alto requerimento energético mesmo em
uma situação normoglicêmica. Diversos outros estudos corroboram a hipótese
da utilização de reservas de glicogênio mesmo em situações normoglicêmicas
(Swanson e Choi, 1993) ou em resposta a um aumento da demanda energética
(Glip e cols., 2002). Swanson e Choi, (1993), observaram que neurônios em
cultura, mesmo em meio normoglicêmico, apresentam maior sobrevida na
32
presença de astrócitos, sugerindo que a reserva de glicogênio contido nestas
células sejam o fator responsável por esta maior sobrevida. Já em 1965,
Palladin demonstrou que o glicogênio acumulava-se no cérebro de ratos
durante o sono e era depletado na privação de sono ou durante a vigília. Em
estudos mais recentes, Gip e colaboradores (2002) avaliaram a quantidade de
glicogênio em ratos submetidos à privação de sono, observando uma redução
das reservas no cerebelo de ratos jovens, mas não no córtex, no entanto, em
animais mais velhos foi observado também de reservas de glicogênio corticais.
Nesse trabalho, também foram avaliadas as reservas de glicogênio em ratos
que receberam uma dose de um anestésico, o halotano, como resultado foi
demonstrado que todas as áreas apresentaram aumento nas reservas de
glicogênio. Da mesma forma que a anestesia também já havia sido observado
por Swanson (1992) que a hibernação também aumenta as reservas de
glicogênio. Portanto há fortes indícios de que o glicogênio é utilizado não só em
situações onde o suprimento de glicose está ausente ou baixo mas também em
situações onde o aumento de atividade cerebral requer uma fonte extra de
energia, servindo assim como fonte energética auxiliar. Brown (2007) sugere
que o glicogênio cerebral seja utilizado como meio de evitar bruscas alterações
no aporte energético para os neurônios, sendo degradado quando a atividade
neuronal aumenta.
Em roedores, alguns circuitos hipotalâmicos, como o neuropeptidérgico Y
que conecta o ARC com o PVN, ainda estão em formação em idades pós-
natais precoces. As projeções eferentes do ARC de fibras NPY/AGRP somente
chegam a todos os núcleos entre P11 e P16 e o processo até o
estabelecimento de toda a circuitaria somente termina na idade adulta (para
revisão ver Grove e Smith, 2003) Os processos de extensão dos neuritos,
formação e estabilização de sinapses podem demandar alguma fonte de
energia extra, em função do alto gasto metabólico. Desta forma, as reservas de
glicogênio devem ser importantes durante esse período sendo reduzidas e
menos necessárias na vida adulta.
Tem sido sugerido que os tanicitos, células bipolares que ligam o fluido
cerebroespinhal (CSF) aos capilares porta-hipotalâmicos e provavelmente
estão associado a eventos neuroendócrinos, também acumulam glicogênio
(Barradas e cols., 1989; Bestetti e Rossi, 1980). Tais células assemelham-se
33
às células da glia radial, apresentam corpos celulares na camada epêndimal e
seus prolongamentos estendem-se para o parênquima hipotalâmico. (para
revisão ver Rodríguez e cols., 2005). Uma das semelhanças com a glia radial é
a expressão de vimentina, uma proteína de filamento intermediário, porém
apresentam morfologia e características moleculares e funcionais únicas e
distintas. São descritas quatro subpopulações de tanicitos, α1,2 e β1,2. Eles
expressam diferencial de importantes moléculas funcionais como
transportadores de glicose e neurotransmissores (Shibata e cols., 1997;
Peruzzo e cols., 2000). García e colaboradores (2003) demonstraram, através
de imunocitoquímica, que, no hipotálamo, todas as subpopulações de tanicitos
expressam GLUT2, um transportador de glicose e frutose de baixa afinidade. A
maioria dos trabalhos aponta os astrócitos como detentores de glicogênio em
diversas regiões cerebrais (Brown e cols., 2004; Wender e cols., 2000; Choi e
cols., 2003; Cruz e Dienel, 2002). Nosso trabalho mostrou que células gliais
hipotalâmicas que contém reservas de glicogênio em ratos são os tanicitos já
que expressam o transportador de glicose presente somente em tanicitos em
núcleos hipotalâmicos, o GLUT 2 (Garcia e cols., 2003). As células com
marcação de glicogênio também apresentam vimentina, que nesse período
está presente em células gliais com morfologia radial como a glia de Bergmam
presente no cerebelo e tanicitos no hipotálamo (para revisão ver Rodrigues e
cols., 2005). Nós realizamos imunohistoquimica para outros marcadores gliais
como MBP e GFAP em seções adjacentes extremamente finas a fim de
identificar outras células que poderiam apresentar reservas de glicogênio. As
células positivas para GFAP ou MBP não apresentaram reservas de glicogênio
nesse horário. Para confirmar tal achado são necessários experimentos com
uso de microscopia eletrônica.
Reservas de glicogênio e tanicitos foram intensamente estudados no
passado (Prasannan e cols., 1963a, Prasannan e cols., 1963b). A expressão
de GLUT2 em tanicitos sugere que essas células em contato com neurônios
dos núcleos ventromedial e arqueado estão envolvidos na captação de glicose,
e como os tanicitos também expressam canais de potássio ATP-sensíveis tem
sido sugerido que eles possam perceber a concentração de glicose no fluido
cerebroespinhal e do plasma assim como células β pancreáticas onde esses
34
dois compostos são considerados parte fundamental do mecanismo de
percepção dos níveis de glicemia (para revisão ver Schuit e cols., 2001)
Nossos resultados mostram que há redução nas reservas hipotalâmicas
de glicogênio nos animais sofreram malnutrição durante os 10 primeiros dias
de lactação, cujas mães foram expostas a uma dieta isenta de proteína e
hiperglicidica. Patel e colaboradores (2000) sugeriram que o cluster enzimático
hepático pode estar alterado durante a lactação em animais malnutridos
expostos a dietas hipoproteicas ou aproteicas. Estas dietas podem provocar
modificações na taxa metabólica de diferentes nutrientes, de modo a aumentar
a metabolização de carboidratos durante o período de amamentação. A
redução nas reservas de glicogênio observada por nós pode ser causada por
uma menor disponibilidade de carboidratos para armazenamento nestes
animais pelo fato dos mesmos estarem sofrendo metabolismo hepático mais
intenso.
A malnutrição pode estar causando também a morte celular no
hipotálamo durante esse período, onde os neurônios estão demandando mais
fontes de energia para o desenvolvimento de novos circuitos, e os tanicitos
podem estar em sua capacidade máxima de suprir essa demanda.
Este trabalho demonstrou que animais submetidos à malnutrição protéica,
justamente no período em que vias hipotalâmicas envolvidas no controle do
metabolismo energético estão se formando, sofreram uma redução na oferta de
suprimento energético (por redução das reservas hipotalâmicas de glicogênio).
Em estudos anteriores observamos um atraso na expressão da óxido nítrico
sintase no hipotálamo de ratos submetidos a mesma dieta (Marcelino e cols.,
2004). Estas alterações podem levar a possíveis modificações na formação
destas vias de forma a gerar consequências que perdurem por toda vida do
animal.
35
6. CONCLUSÕES
1) Durante o desenvolvimento há redução nas reservas de glicogênio nos
núcleos hipotalâmicos ARC e EM;
2) As reservas de glicogênio nos núcleos ARC e EM do grupo D
apresentaram-se menores em comparação as do grupo C durante o
desenvolvimento;
3) Não foram observadas reservas de glicogênio em astrócitos ou em
oligodendrócitos nos núcleos estudados em nenhuma etapa do
desenvolvimento ou na vida adulta. De fato, as células gliais dos núcleos
ARC e EM que contêm glicogênio são os tanicitos.
36
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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55
ANEXO 1
Artigo submetido à revista International Journal of Developmental
Neuroscience. Glycogen stores are impaired in hypothalamic nuclei of rats
malnourished during early life.
56
ANEXO 2
Artigo em colaboração com a Profa. Cristiane F Ramos, submetido à revista
Neuroscience Letters. Maternal malnutrition during lactation alters
gonadotropin-releasing hormone expression in the weaned male pups.
Elsevier Editorial System(tm) for International Journal of Developmental
Neuroscience
Manuscript Draft
Manuscript Number:
Title: GLYCOGEN STORES ARE IMPAIRED IN HYPOTHALAMIC NUCLEI OF RATS
MALNOURISHED DURING EARLY LIFE
Article Type: Research Paper
Section/Category:
Keywords: maternal malnourishment; lactation; rat development; hypothalamus; tanycytes;
glycogen.
Corresponding Author: Dr. Frank Tenorio, Ph.D
Corresponding Author's Institution: Universidade do Estado do Riode Janeiro
First Author: Sebastião S Lima , MsC
Order of Authors: Sebastião S Lima , MsC; Maria Claudia Lima dos Santos, undergraduate
student; Marcelle P Sinder, undergraduate student; Anibal S Moura, PhD; Penha C Barradas, PhD;
Frank Tenorio, Ph.D
Manuscript Region of Origin:
Abstract: Perinatal nutritional status has a profound and persistent influence on neural development
and cognitive function. In humans and other animals, it has been shown that protein malnutrition
during the perinatal period leads to permanent changes, which in adulthood induces metabolic
syndrome. Weight gain and feeding are mainly modulated by neural and hormonal inputs to the
hypothalamus. Brain glycogen stores are present in hypothalamic nuclei and glycogen is now
recognized as a source of glucose in high energetic demands, as during development of neural
circuits. As some hypothalamic circuits are being formed during the lactation period, we attempt to
study the effects of proteic malnutrition, during the first 10 days of lactation, on glycogen stores in
hypothalamic nuclei involved in the control of energy metabolism. Female pregnant rats were
randomly housed in individual cages fed ad libitum with a normorprotein diet (22% protein). After
delivery each dam was kept with 6 male pups. During the first 10 days of lactation the dams of the
experimental group received a protein free diet (diet group) and the control group a normoprotein
diet. By P10 glycogen stores were very high in the arcuate nucleus and median eminence of the
control group. Glycogen stores decreased during development. In P20 control animals, glycogen
stores were lower in these regions when compared to P10 control animals and animals submitted
to malnutrition presented a staining that was even lower than the control ones in the same age.
After P45 it was very difficult to determine any differences between control and diet group because
glycogen stores were very reduced. We also showed that tanycytes were the cells presenting
glycogen stores in these animals. Our data reinforce the concept that maternal nutritional state
during lactation may be critical for brain maturation since maternal malnutrition resulted in a low
glycogen store stain in hypothalamus, which may be critical for the establishment of neuronal
circuitry.
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GLYCOGEN STORES ARE IMPAIRED IN HYPOTHALAMIC NUCLEI OF RATS
MALNOURISHED DURING EARLY LIFE
Lima, S.S., Lima dos Santos, M.C., Sinder, M.P., Moura, A.S., Barradas, P.C. and
Tenório, F.*
1. Depto. de Farmacologia e Psicobiologia.
2. Depto. de Ciências Fisiológicas
Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes - Universidade do Estado do Rio
de Janeiro - 20551-030 Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Running Title – glycogen in tanycytes of malnourished rats
Keywords – maternal malnourishment, lactation, rat development,
hypothalamus, tanycytes, glycogen.
*to whom correspondence should be addressed
[email protected]
Depto. de Farmacologia e Psicobiologia
Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Av. 28 de setembro, 87, fds, 5º andar
20551-030 Rio de Janeiro, RJ, Brasil
FAX: 55 21 25876808
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ABSTRACT
Perinatal nutritional status has a profound and persistent influence on neural
development and cognitive function. In humans and other animals, it has been
shown that protein malnutrition during the perinatal period leads to permanent
changes, which in adulthood induces metabolic syndrome. Weight gain and
feeding are mainly modulated by neural and hormonal inputs to the hypothalamus.
Brain glycogen stores are present in hypothalamic nuclei and glycogen is now
recognized as a source of glucose in high energetic demands, as during
development of neural circuits. As some hypothalamic circuits are being formed
during the lactation period, we attempt to study the effects of proteic malnutrition,
during the first 10 days of lactation, on glycogen stores in hypothalamic nuclei
involved in the control of energy metabolism. Female pregnant rats were randomly
housed in individual cages fed ad libitum with a normorprotein diet (22% protein).
After delivery each dam was kept with 6 male pups. During the first 10 days of
lactation the dams of the experimental group received a protein free diet (diet
group) and the control group a normoprotein diet. By P10 glycogen stores were
very high in the arcuate nucleus and median eminence of the control group.
Glycogen stores decreased during development. In P20 control animals, glycogen
stores were lower in these regions when compared to P10 control animals and
animals submitted to malnutrition presented a staining that was even lower than
the control ones in the same age. After P45 it was very difficult to determine any
differences between control and diet group because glycogen stores were very
reduced. We also showed that tanycytes were the cells presenting glycogen stores
in these animals. Our data reinforce the concept that maternal nutritional state
during lactation may be critical for brain maturation since maternal malnutrition
resulted in a low glycogen store stain in hypothalamus, which may be critical for
the establishment of neuronal circuitry.
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Perinatal nutritional status has a profound and persistent influence on neural
development and cognitive function. Similarly, classic epidemiologic studies of
survivors of Dutch famine of 1944-1945 suggest that perinatal nutrition influences
adult body mass index, often considered a proxy for body composition. More
recent evidence that links low birth weight to an increase risk of chronic diseases in
old age has generated renewed interest in preventive approaches initiated in the
perinatal period (see Waterland and Garza, 1999, for review). Fetal and neonatal
growth regulation is a complex interactive process controlled by genetic, nutritional
and environmental factors. The most influential factor during fetal and neonatal life
limiting growth potential is probably substrate supply (see: Patel et al, 2000, for
review). In humans and other animals, it has been shown that protein malnutrition
during the prenatal period leads to permanent changes, which in adulthood induce
impairment of blood pressure control, cholesterol metabolism, immunogenic
response, insulin secretion and glucose uptake, predisposing the organism to
obesity, vascular disease and diabetes mellitus (Barker, 1992, 1995; McKeigue,
1997; Ravelli et al, 1976).
Body weight gain is significantly lower in a model of restriction of nutrients during
lactation, as compared to the corresponding ad libitum-fed controls. Growth is also
reduced in animals fed a 10% protein diet as compared to those fed a 20% protein
diet (Mohan and Nasaringa Rao, 1983). Animals that suffer overnutrition or
undernutrition during lactation, also displayed a different pattern of weight gain,
increased in overnourished animals and decreased in undernourished ones
(Widdowson and McCance, 1963).
Weight gain and feeding are mainly modulated by neural and hormonal
inputs to the hypothalamus. The hypothalamic circuitry controlling appetite and
energy expenditure is complex and involves numerous neurotransmitter and
neuropeptide systems, many of which functioning in parallel to either increase or
decrease energy availability (Schwartz et al, 2000). Leptin, for example, is an
anorexigenic hormone being released by adipocytes in response to high glucose
blood levels (Frederich et al, 1995). Nitric oxide (NO) has been demonstrated to
play an important role in the regulation of food intake as an orexigenic molecule
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(Morley et al., 1995;1996). Squadrito et al (1994) reported that in food deprived
rats, a NOS inhibitor reduces food intake, indicating that NO plays a role in
hyperphagia induced by food deprivation. We also showed in a model of proteic
undernutrition in rats, during the first 10 days of lactation, that leptin levels (Moura
et al., 2002) and hypothalamic nitric oxide synthase expression (Marcelino et al.,
2004) were modified during development.
Glucose is the major energy source for the brain, under physiological
conditions. In cases of acute, intense regional metabolic requirements, glycogen
stores provide the demanded glucose (Lowry et al., 1964). Glycogenolisis is rapidly
activated by several different neurotransmitters and neuropeptides (Quach et al.,
1980, 1982; Magistretti et al., 1981, 1986; Cambray-Deakin et al., 1988a;
Subbarao and Hertz, 1990; Coopersmith and Leon, 1995; Sorg et al., 1995;
Eugenin et al., 1997), by glucose deprivation (Dringen and Hamprecht, 1992), by
physiological changes in extracellular potassium (Cambray-Deakin et al., 1988b;
Hof et al., 1988) and intracellular calcium concentrations (Ververken et al., 1982).
Besides the glycogen presence, it has been shown that during insulin-induced
hypoglycaemia in dogs, glycogen decreases in areas that present high metabolic
rate (Chesler and Himwich, 1944). Similar data has been shown in rats and rabbits
(Brown et al., 2003; Wender et al., 2000; Goncharova, 1957). Also, using nuclear
magnetic resonance spectroscopic, it has been shown that glycogen degradation
simultaneously occurs when glucose brain concentration is drastically reduced
(Choi et al., 2003).
Studies demonstrating the effect of starvation on glucose metabolism and
glycogenolisis in the brain also have been performed. Sagar et al. (1987), studying
the regional distribution of brain glycogen, observed that the highest levels were in
the cerebellum and the lowest ones in the striatum. Garriga and Cussó (1992)
determined glycogen levels, by a fluometrical analysis, in different brain areas,
including the cerebellum, striatum, hippocampus and hypothalamus, after
starvation in rats. They did not find significant differences between the studied
areas; five hours of fasting did not modify glycogen concentration in any region,
whereas after 24 hours glycogen levels decreased significantly in all regions,
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presenting the lowest values in all areas. After 48 hours of fasting, glycogen
contents were partially recovered but not reaching the control values.
In the adult brain of mammals glycogen stores are predominantly localized
in astrocytes (see, Brown and Ransom, 2007, for review), with smaller amounts
found in oligodendrocytes, endothelia, ependyma, and epithelial cells of the
choroid plexus. There is evidence, however, that some large neurons may also
contain glycogen (Phelps, 1972; Borke and Nau, 1984; Cataldo and Broadwell,
1986; Barradas et al., 1989; Cavalcante et al., 1996). However, Borke and Nau
(1984) observed that, in the rat, glycogen occurrence in neurons is transient lasting
only during normal postnatal development.
Glycogen stores, once believed to be important as an emergency source of
energy in cases of prolonged glucose deprivation is now recognized as a source
of glucose in high energetic demands, as during development of neural circuits
(Brown et al, 2004). As some hypothalamic circuits are being formed during
lactation period (Grove and Smith, 2003), we attempt to study the effects of proteic
malnutrition, during the first 10 lactation days, on glycogen stores in cells of
hypothalamic nuclei involved in the control of energy metabolism.
Material and Methods
Animals
Wistar male rats from our breeding colony with ages ranging from post-natal
day 10 to 90 (P10 to P90) were used. At least 5 animals from each age in both
groups were used. Female rats were mated and the pregnant dams were randomly
housed in individual cages at 23ºC on a 12h light/dark cycle. The dams were fed
ad libitum with a normoprotein diet (22% protein) during gestation. The use and
handling of experimental animals followed the principles described in the Guide for
the Care and Use of Laboratory Animals (Bayne, 1996). After delivery each
lactating dam was kept with 6 male pups during the whole lactation period
(Fishbeck and Rasmussen, 1987) and distributed in two groups. A total of 10
offsprings were used being 5 from lactating dams fed a normoprotein diet (22%
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protein) and 5 fed with a protein free diet (0% protein) during the first 10 days of
lactation. Thereafter, all dams were fed with a normoprotein diet. After lactation (21
days) the pups were separated from the mother and received the normoprotein diet
until being sacrificed. The groups were fed ad libitum and the diets were
supplemented with vitamins and minerals following the recommendations of the
American Institute of Rodent Nutrition Diet (Reeves et al., 1993).
Animals were anaesthetized with sodium pentobarbital (50mg/kg) and intracardially
perfused with 0.9% saline solution followed by 4% paraformaldehyde (PF) in
100mM phosphate buffer (pH 7.4) and then by the same fixative plus 10% sucrose
for cryoprotection. After dissection, the brains were immersed in 100mM phosphate
buffer containing 20% sucrose, overnight at 4º C. Coronal slices were made in
cryotome and kept in gelatinized slides.
Histochemical reaction for glycogen
Every other coronal sec
tion of 30μm were collected in gelatinized slides and
immersed in absolute ethanol at -20
C in a Coplin jar which was then transferred to
room temperature. After 1-2h, the sections were immersed into 80% ethanol and,
thereafter, treated by the method of Horobin and Kavill-Davies (1971) for glycogen
(periodic acid-Schiff – PAS) staining as modified by Rosenberg and Dichter (1985).
Briefly, the oxidation step was in 1% periodic acid in 70% ethanol over 1h, followed
by rinses in 80% ethanol and staining in 1% basic fuchsin dissolved in acid ethanol
(glacial acetic: 1 vol; 80% ethanol: 100 vols.) for 30-60 min. After staining, the
sections were rinsed in 80% ethanol, dehydrated, cleared in xylene, mounted in
Entellan® (Merck) and coverslipped. Sections were analyzed under light
microscopy using an Olympus BX 40 microscope. Image capturing was performed
with a cooled-charged-coupled device camera (Sony DXC 151A). Gray scale
images were taken using Adobe Photoshop software.
PAS stained sections from control and malnourished animals from all ages studied
were observed in regions from Bregma -2,12mm to -3,30 mm (Paxinos and
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Watson, 1998; Sherwood and Timiras, 1970) in a way that around 20 sections per
animal were observed.
Immunohistochemistry
In an attempt to characterize glycogen stained profiles we performed
immunohistochemistry reactions for some glial markers, glial fibrillary acidic protein
(GFAP - astrocytes), myelin basic protein (MBP- oligodendrocytes) and vimentin
(tanycytes). As PBS rinses could wash away the product of PAS reaction,
immunohistochemistry was performed in sections immediately adjacent to 13µm
thickness ones, previously stained for glycogen. After incubation in 5% bovine
serum albumin (BSA) supplemented with 0.3% Triton X-100 in phosphate-buffered
saline (PBS) for 2h, sections were incubated with the primary antibody diluted in
PBS (1:100, monoclonal anti-GFAP – Sigma; 1:100, monoclonal anti-MBP –
Serotec; 1:8, monoclonal anti-vimentin – Boehringer) overnight at 4ºC. After
several rinses in PBS, sections were incubated with the avidin-biotin-peroxidase kit
revealed using diaminobenzidine (DAB) as cromogen. Then the slides were
dehydrated and coverslipped. Control sections were immunoprocessed with the
secondary antibody in the absence of the primary antibodies.
As GLUT2 glucose transporter was pointed as an specific tanycyte marker in the
hypothalamus (Garcia et al, 2003), sections previously stained for glycogen were
incubated in 5% bovine serum albumin (BSA) supplemented with 0.3% Triton X-
100 in phosphate-buffered saline (PBS) for 2h. They were then incubated with the
primary antibody diluted in PBS (1:200, polyclonal anti-GLUT2 – SantaCruz)
overnight at 4ºC. After several rinses in PBS, sections were incubated for 1h at
room temperature (25ºC) with biotinilated donkey anti-goat IgG (SantaCruz),
washed several times with PBS and revealed with streptavidin conjugated with Cy3
(Zymed). Then the slides were rinsed in PBS and coverslipped using n-propyl-
gallate as mounting medium.
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Results
Animals from free protein dams showed a difference in body weight when
compared to control animals as previously demonstrated by our group (Marcelino
et al, 2004, Montanha-Rojas et al, 2005).
INSERT TABLE 1 - ABOUT HERE
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Our results showed staining for glycogen in radial structures leaving the ependymal
region and penetrating the hypothalamic parenchyma only in regions
corresponding to the arcuate nucleus (ARC) and median eminence (ME). By P10,
glycogen stores were very high in control animals (Fig. 1A) both in the ARC and
the ME. Animals submitted to protein malnutrition presented lower glycogen stores
in these areas (Fig. 1B). Glycogen stores decreased during development. In
control animal at P20, glycogen stores were lower in these regions when compared
to P10 control animals (Fig.1C, compare to fig. 1A) and animals submitted to
malnutrition presented a staining that was even lower than the control ones in the
same age (Fig.1D, compare to Fig 1C). By P30 glycogen stores continue to
diminish in control animals and malnourished animals presented lower glycogen
stores when compared to control animals at the same age (not shown). After P45
no differences between control and malnourished animals could be observed
because older animals presented a very low glycogen stores.
INSERT FIGURE 1 – ABOUT HERE
These structures containing glycogen stores resemble tanycytes. Very few
studies pointed tanycytes as glycogen storing cells (Cavalcante et al, 1996) but
astrocytes were elected to have this role by several authors (see: Brown and
Ransom, 2007, for review). To identify the cell types that presented glycogen
stores, we performed immunohistochemistry using antibodies against some glial
markers as MBP, GFAP and vimentin. GFAP and MBP staining were performed in
thin adjacent slices and no co-localization were detect between glycogen staining
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and immunostaining for these proteins (Fig.2). MBP staining was observed in the
median eminence ventrally to the third ventricle wall and in some small cell bodies
(Fig. 2 A and arrows in D), in a close adjacent session glycogen staining was
observed in radial profiles leaving the ventricular wall and some cell bodies in the
ependymal layer (Fig. 2 B and arrows in E), GFAP staining in a sequential session
was restricted to cell bodies dispersed in the ME and ARC (Fig. 2 C and arrows in
F).
INSERT FIGURE 2 – ABOUT HERE
Radial structures stained for glycogen in the ME (Fig. 3A) were also
immunoreactive for vimentin (Fig. 3B) which suggest that these cells were
tanycytes.
We also performed GLUT2 immunohistochemistry in a section previously
processed for glycogen histochemistry. GLUT2 immunostaining was observed in
all the profiles that stored glycogen (Fig. 4A, B), confirming that hypothalamic
glycogen stores are present in tanycytes. As expected, glycogen staining in this
sections was apparently lower than in other P20 control animals because
immunohistochemistry proceedings washed away some of the dying used to detect
glycogen.
INSERT FIGURES 3 AND 4 – ABOUT HERE
Discussion
We showed that glycogen stores diminished during development of the
hypothalamus, indeed, some works showed that glycogen stores in rats are
transitory, being reduced in adult animals (Borke and Nau, 1984). More recently it
has been accepted that glycogen can act as an emergency energy source to
support function during aglycaemia even in adult animals. It also has been shown
that glycogen content is significantly decreased during intense axonal discharge
under normoglycaemic conditions. Brown and Ransom (2007) demonstrated,
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using mouse optic nerve preparations, that an increase in energetic demand
imposed by a high frequency stimulus indeed, resulted in a decrease in glycogen
content even in normoglycemic concentrations of glucose. Palladin, 1965 showed
also that glycogen accumulates during sleep being depleted by sleep deprivation
and is mobilized during waking. Some hypothalamic circuits, like the neuropeptide
Y one from the ARC to the PVN, are still forming during post-natal ages (Grove
and Smith, 2003) and the extension of neurites, formation and stabilization of
synapses may demand an extra energy source as this circuitry maturates, so
glycogen may be needed during this period of development more than at adult life.
Indeed, we observed a reduction on glycogen stores as these circuits maturate and
this may be occurring because glycogen stores may not be as needed as during
formation of that neuropeptidergic circuit.
It has been suggested that tanycytes, bipolar cells that link the cerebrospinal
fluid (CSF) to the portal capillaries and may be associated to neuroendocrine
events, also accumulates glycogen (Barradas et al, 1989; Bestetti and Rossi,
1980). These cells resemble radial glial cells, presenting the cell body at the
ependimal layer and processes extending from it and penetrating the hypothalamic
parenchima (see Rodríguez et al, 2005, for review). They share some properties
with radial glia, as, for example, the expression of vimentin, an intermediary
filament, but display unique and distinct morphological, molecular and functional
characteristics. There have been described four subpopulations of tanycytes,
1,2
and
1,2
. They express differentially important functional molecules, such as
glucose and neurotransmiters transporters (García et al., 2003; Peruzzo et al.,
2000; Berger and Hediger, 2001; Shibata et al., 1997). Garcia et al. (2003) have
showed, by immunocytochemistry, that in the hypothalamus, both subpopulations
of tanycytes express GLUT2, a low-affinity transporter of glucose and fructose.
Our work showed that hypothalamic cells containing glycogen stores in rats were
tanycytes as the profiles containing glycogen observed by us also express vimentin
and the glucose transporter only present in tanycytes in hypothalamic nuclei,
GLUT2 (Garcia et al, 2003). Most of works pointed astrocytes as glycogen stores
in several brain regions (Brown et al., 2004; Wender et al., 2000; Choi et al., 2003;
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Cruz and Dienel, 2002). In the hypothalamus, as suggested by our results, only
tanycytes contain glycogen stores at postnatal ages examined. Profiles stained for
glycogen during development also presented vimentin, which in this period is
expressed only in glial cells with radial morphology as Bergman’s glia in the
cerebellum and tanycytes in the hypothalamus. We also performed
immunohistochemystry for other glial markers as MBP and GFAP in thin adjacent
sections in an attempt to identify whether other cells presented glycogen stores.
GFAP or MBP stained cells did not present glycogen stores staining. To make sure
of these results, electronic microscope experiments should by applied.
Glycogen stores and tanycytes were intensely studied in the past (Prasannan et al,
1963a,b). Moreover, recently tanycytes have regained importance because works
from Garcia et al (2003) suggested that these cells are involved in a glucose
sensing mechanism in the hypothalamus.
The expression of GLUT2 in tanycytes suggest that these cells contacting
ventromedial hypothalamic neurons and arcuate nucleus neurons are involved in
glucose uptake, as tanycytes also express ATP-sensitive K+ channels, it has been
suggested that they may sense CSF glucose concentrations.
Our results showed a reduction on glycogen stores in hypothalamic cells from
animals that suffered proteic malnutrition during the first 10 days of lactation. The
lactant mother was exposed to a non-proteic-high-carbohydrate pellet chow, Patel
et al (2000) suggested that hepatic enzymatic clusters can be altered during
lactation in undernourished animals exposed to these kind of diets by altering
metabolic rates of different nutrients in a way that carbohydrates become being
more metabolized during the suckling period. The reduction in glycogen stores
observed by us may be due to a less offer of carbohydrates to these animals.
Malnutrition could be also causing cell death in the hypothalamus during this period
as neurons demand more energy sources for development of new circuits and
tanycytes may be in its entire capacity to fulfill this demand.
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LEGENDS TO THE FIGURES
Figure 1 – Glycogen stores in the hypothalamus of control and malnourished
animals. At P10 control animals showed an intense staining in the arcuate nucleus
and median eminence (A). Malnourished animals presented a less intense staining
at that age (B). By P20 (C and D) both animals presented a reduction on glycogen
staining but in malnourished animals glycogen staining is still less intense (D).
Calibration bar: 100
m.
Figure 2 – MBP and GFAP immunostained cells do not localize with cells that
accumulate glycogen. Cells with glycogen stores (B and E) presented no co-
localization with MBP (A and D) or GFAP (C and F) immunostaining in adjacent
sections. In D, E and F, in a higher magnification, notice that MBP and GFAP
positive cells are present in some discrete clusters ventrally to the ventricular wall
(arrows in D and F) that not localize with cell bodies stained for glycogen (arrows in
E) present in the ependimal layer of the ventricular wall. * indicates third ventricle.
Calibration bar: 50
m
Figure 3 – Cells that stored glycogen in the median eminence localizes with
vimentin positive cells. In A, photomicrograph of hypothalamus of a P20 animal
stained for glycogen. Notice in B that the same cells were stained for vimentin
(Boxes in A and B). Calibration bar: 100
m.
Figure 4 – GLUT2 showed co-localization with glycogen stained profiles. In A,
photomicrograph of the hypothalamus of a P20 animal submmited to PAS
glycogen staining. In B, the same section was immunorreacted with an antibody
against GLUT2. Notice that every glycogen stained process presented GLUT2
immunoreactivity.
Calibration bar: 100
m.
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Figure(s)
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Table 1. Animals weights (g) in experimental groups.
P10
P20
P30
P45
P60
P90
Control 24,97 ± 1,47 49,46 ± 3,57 96,03 ± 1,8 143,94 ±
2,19
239,57 ±
13,4
391,14 ±
22,86
Diet 11,8 ± 1,27 28,82 ± 0,91 76,07 ±
4,73
118,8 ±
1,38
207,4 ±
4,77
345,14 ±
21,52
All data are presented as mean ± S.D. Data were analyzed by the paired Student’s t test and
the differences were significant in all ages.
Table(s)
Elsevier Editorial System(tm) for Neuroscience
Letters
Manuscript Draft
Manuscript Number: NSL-08-1470
Title: Maternal malnutrition during lactation alters gonadotropin-releasing
hormone expression in the weaned male pups' hypothalamus
Article Type: Research Paper
Keywords: hypothalamus; GnRH; malnutrition; lactation; estradiol
Corresponding Author: Sra cristiane fonte ramos, PhD
Corresponding Author's Institution: UERJ
First Author: cristiane fonte ramos, PhD
Order of Authors: cristiane fonte ramos, PhD; Sebastião S Lima, graduated;
Michael L Rocha, undergraduated; Bruna M Lotufo, undergraduated; Francisco J
Sampaio, PhD; Penha C Barradas, PhD
Abstract: The gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is the key hormone
regulating reproduction. Its feedback regulation is exercised by estradiol. The
early postnatal period is critical for sexual differentiation. Despite the fact
that malnutrition-related reproductive suppression in rats is a well-documented
phenomenon, we do not have preceding knowledge until now on how maternal
malnutrition affects the GnRH expression and estradiol serum concentrations of
weaned pups. Six pregnant Wistar rats were separated into three groups at
delivery with 6 pups each: control group (C) with free access to a standard diet
containing 23% protein; protein energy restricted group (PER) with free access
to an isoenergy and 8% protein diet; and energy-restricted (ER) group receiving
a standard diet in restricted quantities, which were calculated, according to
the mean ingestion of the PER group. At 21 days post partum the animals were
killed and the serum estradiol was evaluated by radioimmunoassay.
Immunohistochemistry for GNRH was performed. The serum estradiol concentration
was decreased in PER and ER groups compared with C (PER=34%, ER=19%; P<0.01) and
the staining of GNRH was restricted to arcuate nucleus and median eminence in C
while in PER and ER stained processes aligned with the third ventricle wall
(periventricular nucleus) were present. In conclusion, our data reinforce the
concept that maternal nutritional state during lactation is critical for sexual
maturation since maternal malnutrition resulted in a neuron migration delay
evidenced by an altered GnRH expression profile, probably in consequence to a
low estradiol serum levels.
Suggested Reviewers: John G Parnavelas PhD
[email protected].uk
Peter J Morgane
[email protected]
John Tonkiss
[email protected]v
Leny A Cavalcante
[email protected]
Roberto Lent
[email protected]
Giancarlo Panzica
giancarlo.panzica@unito.it
Iain J Clarke
[email protected]sh.edu.au
serge carreau
serge.carreau@unicaen.fr
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes
Departamento de Anatomia
Av. 28 de setembro, 87, 20550-030, Rio de Janeiro, Brasil
Tel: (021)25876499 Fax: (021) 25876121 [email protected]r
September, 26/2008
Neuroscience Letters
Editorial Office
525 B Street, Suite 1900
San Diego, CA 92101
USA
Tel +1-619-699-6791
Fax +1-619-699-6801
Editor-in-Chief: S. G. Waxman
Dear Dr. S. G. Waxman,
We would like to submit the manuscript “Maternal malnutrition during
lactation alters gonadotropin-releasing hormone expression in the weaned male pups’
hypothalamus” to The Neurosciences Letters.
In this paper we analyzed if maternal malnutrition during lactation alters the
expression of the gonadotropin-releasing hormone and its relation with the estradiol serum
levels.
We believe that the findings reported in the enclosed manuscript could be of
interest to the readers of
The Neurosciences Letters. I would like to add that this work has
not been, and will not be, submitted for publication elsewhere until the journal has reached
a decision on whether to publish the paper.
Sincerely yours,
Cristiane da Fonte Ramos, PhD
Associate Professor Anatomy Department
Roberto Alcantara Gomes Biology Institute
State University of Rio de Janeiro
Cover Letter
Maternal malnutrition during lactation alters gonadotropin-releasing hormone expression in
the weaned male pups’ hypothalamus.
Cristiane da Fonte Ramos
1
, Sebastião Sérgio Lima
2
, Michael Luis Martins Rocha
2
, Bruna
Messias Lotufo
2
, Francisco José Barcelos Sampaio
1
, Penha Cristina Barradas
2
, Frank
Tenório
2
.
1. Departamento de Anatomia, Unidade de Pesquisa Urogenital, Universidade do Estado do
Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
2. Departamento de Farmacologia e Psicobiologia, Universidade do Estado do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Number of text pages: 16
Number of figures and tables: 4
To whom correspondence concerning manuscript should be sent
Dr. Cristiane da Fonte Ramos
Urogenital Research Unit - UERJ
Av. 28 de Setembro, 87 – fundos – FCM – terreo
20551-030, Rio de Janeiro, RJ, BRAZIL
Fax: + 55 21 2587-6133; Phone: + 55 21 2587-6121
E-mail: [email protected]
Key words: hypothalamus, GnRH, malnutrition, lactation, estradiol
* Manuscript
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Abstract
The gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is the key hormone regulating
reproduction. Its feedback regulation is exercised by estradiol. The early postnatal period is
critical for sexual differentiation. Despite the fact that malnutrition-related reproductive
suppression in rats is a well-documented phenomenon, we do not have preceding
knowledge until now on how maternal malnutrition affects the GnRH expression and
estradiol serum concentrations of weaned pups. Six pregnant Wistar rats were separated
into three groups at delivery with 6 pups each: control group (C) with free access to a
standard diet containing 23% protein; protein energy restricted group (PER) with free
access to an isoenergy and 8% protein diet; and energy-restricted (ER) group receiving a
standard diet in restricted quantities, which were calculated, according to the mean
ingestion of the PER group. At 21 days post partum the animals were killed and the serum
estradiol was evaluated by radioimmunoassay. Immunohistochemistry for GNRH was
performed. The serum estradiol concentration was decreased in PER and ER groups
compared with C (PER=34%, ER=19%; P<0.01) and the staining of GNRH was restricted
to arcuate nucleus and median eminence in C while in PER and ER stained processes
aligned with the third ventricle wall (periventricular nucleus) were present. In conclusion,
our data reinforce the concept that maternal nutritional state during lactation is critical for
sexual maturation since maternal malnutrition resulted in a neuron migration delay
evidenced by an altered GnRH expression profile, probably in consequence to a low
estradiol serum levels.
Introduction
The decapeptide gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is the key hormone
regulating reproduction. It is synthesized in neurons in the preoptic area–anterior
hypothalamus (POA-AH) of rodent brains and released from neuroterminals in the median
eminence into portal capillary vessels leading to the anterior pituitary gland to regulate the
synthesis and release of LH and FSH. These peptides in turn travel through the general
circulation to the gonads, affecting the synthesis and secretion of steroid hormones.
Feedback regulation of GnRH neurons by estradiol plays important roles in the
neuroendocrine control of reproduction. Also, peripheral estradiol rather than local
aromatization of testosterone directly reflect the inhibitory tone exerted by estrogens on
gonadotropin release [12, 14].
The late embryonic/early postnatal period is the critical period for sexual
differentiation in mice [11]. Hypothalamic GnRH content increases steadily during
postnatal development and it has been reported that changes in GnRH biosynthesis, as
determined by messenger RNA (mRNA) and proGnRH peptide levels, also increase during
the postnatal period, through puberty [4].
Malnutrition during lactation alters a wide variety of endocrine systems of the
offspring, being characterized as a multifactorial disease whose alterations persist until the
adult life, a phenomenon called metabolic programming [9].
Regarding the reproductive system, it has been shown that adult animals submitted
to food restriction present an inhibition of both the maintenance and onset of reproductive
capability [3], reduction of luteinizing hormone (LH), follicle-stimulating hormone (FSH)
and testosterone serum concentrations and gonadotrophs morphological alterations that are
typical of those found in cells whose secretory activities are suppressed [6]
There are several papers showing that many of those alterations started during the
lactation time. Weaned pups whose mothers were malnourished during lactation present
low body weight, alterations in the testis structure, expression of aromatase, ER and AR
receptors in testis and in the serum leptin levels [8, 13, 18].
Despite the fact that malnutrition-related reproductive suppression in rats is a well-
documented phenomenon, we do not have preceding knowledge until now on how maternal
malnutrition affects the GnRH expression in the hypothalamus of weaned pups and its
relation with estradiol serum concentrations.
Materials and Methods
Animals
Wistar rats were kept in a room with controlled temperature (25±1
0
C) and an artificial
dark–light cycle (lights on from 0700 to 1900 h). Virgin female rats of 3 months of age
were caged with one male rat at a proportion of 2:1. After mating, determined by the
presence of a vaginal plug, each female was placed in an individual cage with free access to
water and food until delivery. The handling of the animals was approved by the Animal
Care and Use Committee of the Biology Institute of State University of Rio de Janeiro,
which based their analysis on the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, and
the study design was approved by the local Ethical Committee for the care and use of
laboratory animals.
Nutritional diet
The low-protein diet was prepared in our laboratory and its composition is shown in
Table 1. Vitamins and mineral mixtures were formulated to meet the American Institute of
Nutrition AIN-93G recommendation for rodent diets [15].
Experimental design
Six pregnant Wistar rats were separated at delivery into three groups: (C) control
group – with free access to a standard laboratory diet containing 23% protein; protein
energy restricted (PER) group – with free access to an isoenergy and protein-restricted diet
containing 8% protein; and energy-restricted (ER) group – receiving standard laboratory
diet in restricted quantities, which were calculated, every day, according to the mean
ingestion of the PER group and correspond to 60% of that consumed by the control group.
The PER group, in spite of having free access to diet, consume about 60% of that consumed
by the control group. In this way, the amount of food consumed in both ER and PER
groups was almost the same and was measured every day (data not shown).
Within 24 h of birth, excess pups were removed, so that only six pups were kept per
dam, because it has been shown that this procedure maximizes lactation performance. At
weaning (21 days post partum), seven male pups of each group were killed under thiopental
anesthesia (0.10 ml/100 g bodyweight) and perfused transcardially with 0,9% salin
followed by a solution of 4% paraphormaldehyde in phosphate buffer, 0.1M, pH7.4 and the
same solution plus 10% of sucrose always in the morning.
Immunohistochemistry: Brains were removed and kept in phosphate buffer plus
20% sucrose at 4
C, overnight. Coronal slices were made in cryostat and kept in gelatinized
slides. After washing in PBS 0.3% Triton X100, 0.1M, pH 7.4 and immunoblocking with
normal goat serum 10% in the same buffer for 2 hours at room temperature, slices were
incubated with a polyclonal anti-GnRH antibody (a gift from Dr. Benoit, Montreal)
overnight at 4ºC (1:4000 in PBS 0.3% triton X100, 0,1M, pH7.4). The day after, slices
were washed in PBS 0.1M, pH, 7.4 and incubated with an Alexa 488 conjugated secondary
antibody for 1 hour R.T. After washing in PBS slides were mounted in N-Propil-Galate and
coverslipped. Sections were analyzed under epiflurescence using an Olympus BX 40
microscope. Image capturing was performed with a cooled-charged-coupled device camera
(Sony DXC 151A). Gray scale images were taken using Adobe Photoshop software.
Steroid determinations: Blood was collected by cardiac puncture and the serum kept
at -20
0
C for subsequent determination of estradiol levels. The serum estradiol concentration
was determined by using specific RIA (ICN Pharmaceuticals, Inc, CA, USA). The intra-
and inter-assay variation coefficients were 6.4 and 5.9%. Sensitivity of the RIA was 0.8
pg/ml for estradiol
Statistical analysis: All results are expressed as mean ± S.E.M. Statistical analysis
was performed by one-way ANOVA followed by Student–Newman–Keuls test. Values of
P<0.05 were considered significant.
Results
Body weight: The body weight of pups whose mothers were subjected to a PER or
ER diets during lactation was significantly lower than that of controls from the first days of
life until the end of lactation (Fig. 1).
Hormone concentrations: The serum estradiol concentration was significantly
decreased in both PER and ER groups compared with controls (PER=34%, ER=19%;
P<0.01, Fig. 2).
GnRH profiles were detected by imunohistochemistry procedure: The staining
revealed radial processes of cells, leaving the third ventricle wall, and entering the
hypothalamic parenquima in the arcuate nucleus (ARC) and mediam eminence (ME). In
control animals these processes were restricted to these areas while in PER animals, stained
processes aligned with the third ventricle wall (periventricular nucleus) were present. ER
animals also presented stained processes in the periventricular region, staining in the ME
and ARC was similar to what was observed in C and PER animals (Fig. 3a, b).
Discussion
This study in agreement with the literature provides further evidence that early
malnutrition can lead to endocrine disruption [8, 18]. The reduction in body weight
observed in this study is in agreement with past results showing that maternal malnutrition
during lactation is associated with growth retardation [8].
The late embryonic/early postnatal period is the critical period for sexual
differentiation in mice [11]. Hypothalamic GnRH content increases steadily during
postnatal development [4]. However, maternal malnutrition during lactation seems to
disturb this differentiation process since there is a difference in the distribution of GnRH
stained processes in the periventricular nucleus of both malnourished groups.
Gonadal hormones were shown to influence brain development [16]. Henderson et
al [5] showed that, in mice, the medial-lateral and dorso-ventral cell migration that occurs
during development and differentiation of the POA-AH is dependent on sex steroids.
Testosterone and estrogen cause changes in cell number, density of axonal connections,
dendritic architecture and transmitter phenotype in the limbic-hypothalamic circuitry [10].
Also, peripheral estradiol levels rather than local aromatization from testosterone directly
reflect the inhibitory tone exerted by estrogens on gonadotropin release [14]. In this paper
both malnourished groups presented a low estradiol serum levels what could be responsible
for that misplaced GnRH stained profiles.
The reproductive system of mammals is very sensitive to the availability of energy
from an external environment. Acute changes in energetic status of animals affect the
hypothalamo-pituitary-gonadotropic (HPG) axis activity [2]. Leptin seems to have a crucial
role in the regulation of food intake at the CNS level and, moreover, modulates the release
of the LH, the principal regulator of reproductive processes [7].
It is known that leptin promotes the development of ARC projections to other
hypothalamic nuclei as the paraventricular nucleus (PVN) and lateral hypothalamic nucleus
(LH) [1]. We have showed previously that serum leptin levels in pups whose mothers were
submitted to protein or energy restricted diets is low during the first half of the lactation
period but increases significantly at the end of this period [17] So, we can not discard the
possibility that the alteration observed in the GnRH staining can be consequent to the
alterations in the serum leptin levels presented in both malnourished groups.
It is known that male and female offspring whose mothers were submitted to
protein or energy restricted diets present a delay on the onset of puberty [19]. It is possible
that the alteration observed here in the GnRH staining profile can be related to the delay on
the onset of puberty that occurs in these animals.
In conclusion, our data reinforce the concept that maternal nutritional state during
lactation is critical for sexual maturation since maternal malnutrition resulted in a neuron
migration delay evidenced by an altered GnRH expression profile, probably in consequence
to a low estradiol serum levels.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Robert Benoit (McGill University Health Centre) for
kindly providing the anti GnRH antibody. This work was supported by grants from the
National Council of Scientific and Technological Development (CNPq), Foundation for
Research Support of Rio de Janeiro (FAPERJ), Coordination for Improvement of Post-
Graduated Students (CAPES), and State University of Rio de Janeiro (UERJ–SR2), Brazil.
The authors declare that there is no conflict of interest that would prejudice the impartiality
of this scientific work.
References
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neurons that regulate feeding, Science (New York, N.Y 304 (2004) 108-110.
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axis: perspectives and mechanisms, Biology of reproduction 60 (1999) 216-222.
[3] C. Desjardins, M.J. Lopez, Environmental cues evoke differential responses in
pituitary-testicular function in deer mice, Endocrinology 112 (1983) 1398-1406.
[4] C.M. Dutlow, J. Rachman, T.W. Jacobs, R.P. Millar, Prepubertal increases in
gonadotropin-releasing hormone mRNA, gonadotropin-releasing hormone
precursor, and subsequent maturation of precursor processing in male rats, The
Journal of clinical investigation 90 (1992) 2496-2501.
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preoptic area/anterior hypothalamus of mice, Journal of neurobiology 41 (1999)
252-266.
[6] D.C. Herbert, Morphology of the mammotrophs and gonadotrophs in the anterior
pituitary gland of rats with protein-calorie malnutrition, The American journal of
anatomy 158 (1980) 521-531.
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regulating pathways in the hypothalamic regulation of body weight, Endocrine
reviews 20 (1999) 68-100.
[8] M. Leonhardt, J. Lesage, D. Croix, I. Dutriez-Casteloot, J.C. Beauvillain, J.P.
Dupouy, Effects of perinatal maternal food restriction on pituitary-gonadal axis and
plasma leptin level in rat pup at birth and weaning and on timing of puberty,
Biology of reproduction 68 (2003) 390-400.
[9] B.E. Levin, Metabolic imprinting: critical impact of the perinatal environment on
the regulation of energy homeostasis, Philosophical transactions of the Royal
Society of London 361 (2006) 1107-1121.
[10] M.D. Madeira, A.R. Lieberman, Sexual dimorphism in the mammalian limbic
system, Progress in neurobiology 45 (1995) 275-333.
[11] S.F. Pang, F. Tang, Sex differences in the serum concentrations of testosterone in
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Journal of endocrinology 100 (1984) 7-11.
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(2003) 1771-1778.
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[14] G. Raven, F.H. de Jong, J.M. Kaufman, W. de Ronde, In men, peripheral estradiol
levels directly reflect the action of estrogens at the hypothalamo-pituitary level to
inhibit gonadotropin secretion, The Journal of clinical endocrinology and
metabolism 91 (2006) 3324-3328.
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on the reformulation of the AIN-76A rodent diet, The Journal of nutrition 123
(1993) 1939-1951.
[16] R.B. Simerly, Wired for reproduction: organization and development of sexually
dimorphic circuits in the mammalian forebrain, Annual review of neuroscience 25
(2002) 507-536.
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food intake and body weight in rats whose mothers were exposed to malnutrition
during lactation, The Journal of nutritional biochemistry 13 (2002) 493.
[18] C.V. Teixeira, D. Silandre, A.M. de Souza Santos, C. Delalande, F.J. Sampaio, S.
Carreau, C. da Fonte Ramos, Effects of maternal undernutrition during lactation on
aromatase, estrogen, and androgen receptors expression in rat testis at weaning, The
Journal of endocrinology 192 (2007) 301-311.
[19] E. Zambrano, G.L. Rodriguez-Gonzalez, C. Guzman, R. Garcia-Becerra, L. Boeck,
L. Diaz, M. Menjivar, F. Larrea, P.W. Nathanielsz, A maternal low protein diet
during pregnancy and lactation in the rat impairs male reproductive development,
The Journal of physiology 563 (2005) 275-284.
Figure legends
Figure 1
Body weight of 21-day old rats whose dams were fed a diet with 23% of protein - control
group (C), a diet with 8% of protein - protein-restricted group (PER), or a diet with 23% of
protein but in restricted quantities - energy-restricted group (ER), during lactation period.
Values are given as mean
standard deviation of 7 animals per group.
Figure 2
Serum estradiol concentration of 21-day old rats whose dams were fed a diet with 23% of
protein - control group (C), a diet with 8% of protein - protein-restricted group (PER), or a
diet with 23% of protein but in restricted quantities - energy-restricted group (ER), during
lactation period. Values are given as mean
standard deviation of 7 animals per group. * p
< 0.01 vs. C.
Figure 3
Photomicrographs of the hypothalamus of P21 rats’ immunoreacted with an anti-GnRH
antibody. In control animals (A) GnRH immunostaining are present in ARC and ME. PER
animals (B) also presented immunostaining in ARC and ME but some stained process curse
along the periventricular nucleus. In ER animals (C) staining is similar to the one observed
in PER animals. Bars = 50
μm
Table-1: Composition of control and protein-energy restricted diets.
Control § Protein- Restricted
Ingredients (g/Kg)
Total protein
230.0 80.0
Corn starch 676.0 826.0
Soybean oil 50.0 50.0
Vitamin mix
†
4.0 4.0
Mineral mix † 40.0 40.0
Macronutrient composition (%)
Protein 23.0 8.0
Carbohydrate 66.0 81.0
Fat 11.0 11.0
Total energy (KJ / Kg) 17038.7 17038.7
The principal protein resources are soybean wheat, steak, fish and amino acids.
§ = Standard diet for rats (Nuvilab-Nuvital ltd., Paraná, Brazil).
The protein-restricted diet was prepared in our laboratory by using the control diet, with
replacement of part of its protein content with cornstarch. The amount of the latter was calculated
to replace the same energy content of the control diet.
† Vitamin and mineral mixtures were formulated to meet the American Institute of Nutrition AIN-
93G recommendation for rodent diets (Reeves et al.. 1993).
Table
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0
25
50
75
C
ER
PER
p<0.01 ER vs C
p<0.01 P ERvs C
Days
Body Weight (g)
Figure
C PER ER
0
25
50
75
100
*
*
Serum Estradiol (pg/mL)
Figure
Figure
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